CH678726A5 - - Google Patents

Description

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CH678 726 A5

Beschreibung

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Gebiet der organischen Chemie und betrifft insbesondere einen neuen Stoff, Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethyIaminomethyl-1-methyl-2-phenyI-thiomethylindoI-3-carbonsäure-Monohydrathydrogenchlorid, auf ein Verfahren zu seiner Herstellung und auf ein Arzneipräparat mit antiviraler interferoninduzierender und immunomodulierender Wirkung auf seiner Grundlage.

Stand der Technik

Zur Zeit wird der Suche und der Untersuchung von Arzneimitteln mit antiviraler interferoninduzierender und immunomodulierender Wirkung grosse Aufmerksamkeit geschenkt. Eine besonders grosse Aufmerksamkeit wird den Mitteln, Immunomodulatoren, gewidmet, die fähig sind, Immunreaktionen des Organismus, zu modulieren (zu stimulieren beziehungsweise zu hemmen).

Immunomodulatoren erhöhen die allgemeine Resistenz des Organismus, indem sie einen Einfluss auf spezifische Immunreaktionen und auf nichtspezifische Schutzfaktoren, darunter auf die Synthese von endogenem Interferon ausüben. Sie finden Anwendung für die Behandlung von Erkrankungen, in deren Pathogenese die Störungen des Immunstatus des Organismus, der primären und sekundären immundefizitären Zustände, einschliesslich bösartige Neubildungen, sowie chronische und rezidivierende Virusinfekte eine wichtige Rolle spielen.

Unter den nicht vielen synthetischen chemischen Präparaten, die als Immunmodulatoren zum Einsatzkommen, besonders aktiv und in der medizinischen Praxis umfassend angewendet wird, ist Levamisol (-) 2,3,5,6-Tetrahydro-6-phenyI-imidazo-/2,1-b/-thiazolhydrogenchlorid/. (M.D.Mashkovsky. Le-karstvennye sredstva-Arzneimittel -1987, (Moskau), «Meditsina», v. 2, S. 169-171).

Als Immunomodulator wird Levamisol bei der komplexen Therapie verschiedener Erkrankungen angewendet, die mit immundefizitärem Zustand zusammenhängen. Beschrieben wurde die Anwendung von Levamisol bei Behandlung schwerer rezidivierender Formen von Herpes-Virus-Infektionen. Levamisol, wie auch einige andere Immunomodulatoren, stimuliert die Synthese des Seruminterterons im Organismus. Titer des Interferons, das unter Einwirkung von Levamisol synthetisiert wird, übertrifft nicht 80 bis 160 Einheiten/ml in einer Zellkultur: 160 bis 320 Einheiten/ml im Blutserum von Mäusen und von 40 bis 80 Einheiten/ml im Blutserum von Menschen.

Levamisol ist jedoch sehr toxisch und kann verschiedene Nebenerscheinungen hervorrufen: Kopfschmerzen, Schlafstörungen, Erhöhung der Temperatur, Veränderung von Geschmacksempfindungen, Dyspepsieerscheinungen, Geruchsgallutinationen (Veränderung der Gerüche), allergische Hautreaktionen, grippeartige und neurologische Symptome.

Eine besonders gefährliche Nebenerscheinung, die bei der Therapie mit Levamisol als Immunomodulator auftreten kann, stellt die Agranulozytose, die Verringerung von neutrophilen Granulozyten unter 25%, dar. Deshalb soll man bei der Behandlung mit Levamisol systematisch Blutbildanalysen durchführen.

Gegenwärtig sind auch Präparate mit antiviraler Wirkung bekannt, die als Wirksubstanz Adamantan-Derivate enthalten, beispielsweise Remantadin (a-Methyl-1-adamantan-methyl-aminhydrogenchlorîd). /Mekhanismy antivirusnogo deistvia proizvodnykh adamantana - Mechanismus der Antiviruswirkung von Adamantan-Derivaten 1982, (Riga), «Zinatne», S. 25-29 und 129-141). Die genannten Präparate weisen Nebenwirkung auf Zentralnervensystem auf.

Darstellung der Erfindung

Die angemeldeten Verbindungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und Arzneimittel auf ihrer Grundlage sind neu und in Fachliteratur nicht beschrieben.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Verbindung zu entwickeln, die eine hohe antivirale interferoninduzierende und immunmodulierende Aktivität, eine niedrige Toxizität aufweist, keine Nebeneinwirkung hat, sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung zu entwickeln.

Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, dass eine neue Verbindung, Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethyI-amïnomethyl-1-methyl-2-phenylthiomethylindol-3-carbonsâure-MonohydrathydrogenchIorÎd folgender Formel geschaffen wird:

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CH2N(CH3)2

HOx-^

000C2H5

K

• HCl »3^0

OH2SC6H5 ^

CH.

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Die erfindungsgemässe Verbindung stellt ein kristallines Pulver von weisser Farbe mit grünlich-gelber Schattierung bis hellgelber Farbe mit grünlicher Schattierung, mit bitterem Geschmack, ohne Geruch dar. Der Schmelzpunkt ist nicht charakteristisch. Bei der Erhitzung innerhalb von drei Stunden bei einer Temperatur von 110 bis 120°C verliert ein Wassermolekül.

Der erfindungsgemässe Stoff ist schlecht in Wasser, Methanol, Äthanol löslich, ist nichthygroskopisch. Die Lösung aus 1 g Stoff in 1450 ml Wasser bei einer Temperatur von 25°C hat einen pH-Wert von 4,37 (potentiometrisch ermittelt).

UV-Spektrum einer 0,001%igen Lösung der erfindungsgemässen Verbindung in 95%igem Äthanol in einem Bereich von 230 bis 350 nm weist zwei Absorptionsmaxima bei 257+2 nm (1 g e 4,3) und bei 315±3 nm (1 g e 3,2) auf. IR-Spektrum hat Absorptionsbaden bei 3320 crcH (OH-Gruppe) und 1673 cm~i (C = O-Gruppe). Im Masse-Spektrum werden wenigintensive Peaks mit m/z 476/478 nachgewiesen, die dem Molekularion gehören. Das Verhältnis des Intensitätsgrades der Peaks 1476:1478 entspricht dem Vorliegen eines Bromatoms im Molekül. Das Spektrum wird durch intensive Peaks der Ionen (Mph S'H)+ (m/z 322/324). Ph S H+ (m/z 110) m/z 44 (CO2). Der Massespektrum ist instabil, da bei der Erhitzung eines Probestückes seine thermische Zersetzung zustandekommt.

Erfindungsgemäss besteht das Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Verbindung, Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1-methyl-2-phenylthiomethylindol-3-carbon-säure-Monohydrathydrogenchlorid darin, dass der Äthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethylindol-3-car-bonsäure mit einem Bromierungsmittel im Medium eines inerten organischen Lösungsmittels unter Kochen behandelt wird, das der entstehende Äthylester der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyI-1-methylindol-3-carbonsäure der Umsetzung mit Thiophenol in Gegenwart des Hydroxids eines Aikalimetalls beziehungsweise seines Alkoholats im Medium eines organischen Lösungsmittels ausgesetzt wird, der angefallene Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-1-methyl-2-phenylthiometylindoI-3-karbonsäure der Umsetzung mit einem aminomethylierenden Agens im Medium eines organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur von 65°C bis zum Siedepunkt des Reaktionsgemisches ausgesetzt wird, dann wird aus der anfallenden Base des Äthylesters der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1 -methyl-2-phenyIthiomethyIindol-3-car-bonsäure das Endprodukt ausgeschieden.

Als Bromierungsagens soll zweckmässigerweise Brom beziehungsweise N-Bromsukzinimid und als inertes organisches Lösungsmittel Chloroform, Dichloräthan beziehungsweise Kohlenstofftetrachlorid verwendet werden. Bei der Umsetzung des Äthylesters der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyl-1-methyl-indol-3-karbonsäure mit Thiophenol soll zweckmässigerweise als organisches Lösungsmitttel Methyl-, Äthyl- oder Isopropylalkohol verwendet werden.

Als aminomethylierendes Agens soll vorzugsweise ein Gemisch des Dimethylamins mit Formalin beziehungsweise Bis-Dimethylaminomethan verwendet werden.

Bei der Verwendung des Gemisches des Dimethylamins mit Formalin als organisches Lösungsmittel setzt man Essigsäure ein, und die Aminomethylierung führt man bei einer Temperatur von 65 bis 75°C durch.

Bei der Verwendung von Bis-Dimethylaminomethan als aminomethylierendes Agens ist es zweckmässig, als organisches Lösungsmittel Dioxan zu verwenden und die Aminomethylierung beim Siedepunkt des Reaktionsgemisches durchzuführen.

Die Isolierung des Endproduktes führt man vorzugsweise durch Behandlung des Äthylesters der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1-methyl-2-phenylthiomethyl-indol-3-karbonsäure mit Salzsäure im Azetonmedium unter Sieden durch.

Die Ausbeute an Endprodukt, umgerechnet auf den Ausgangsäthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethyl-indoI-3- karbonsäure, beträgt von 44 bis 61 Masse%.

Die erfindungsgemässe Verbindung weist eine antivirale, interferoninduzierende und immunmodulierende Aktivität auf und stellt erfindungsgemäss einen Wirkstoff eines Arzneimittels mit virushemmender, interferoninduzierender und immunmodulierender Wirkung dar. Das beanspruchte Arzneipräparat kann in verschiedenen Arzneiformen, vorzugsweise in Form von Tabletten verwendet werden.

Erfindungsgemäss enthält das beanspruchte Arzneimittel in Form von Tabletten den Wirkstoff in ei-

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ner Menge von 0,1 bis 0,2 g je eine Tablette. Als pharmazeutische Trägersubstanz enthält das beanspruchte Arzneimittel eine Füllmasse: Stärke oder Puderzucker.

Bester Weg zur Ausführung der Erfindung

Das erfindungsgemässe Arzneimittel wurde in Versuchen an Tieren und in Kliniken an Menschen untersucht. Untersucht wurde die antivirale Aktivität des beanspruchten Arzneimittels gegenüber den Grippe-Viren vom A- und B-Typ in Versuchen an einer Zellkultur der Fibroplaste von Hühnerembryonen.

Das beanspruchte Präparat wurde in die Zellkultur in einer Dosis von 5 ng/ml zu verschiedenen Fristen vor und nach der Infizierung der Kultur mit dem Grippe-Virus mit dem Ziel der Untersuchung des Einflusses des Präparats auf die Ansammlung des infizierenden Virus in den Kulturzellen des Gewebes im Zeitraum einer Einzyklus-Infektion eingebracht.

In einer anderen Reihe von Experimenten wurde der Einfluss des beanspruchten Präparates auf die Reproduktion des Grippe-Virus in Abhängigkeit von der Zeit der Einbringung des Präparates vor und nach der Infizierung der Zellkultur, das heisst auf die Dynamik der Reproduktion des Grippe-Virus, ermittelt.

Die Prüfergebnisse haben ergeben, dass das beanspruchte Präparat seine virusinhibierende Aktivität zur Verringerung des Infektionstiters und zur Hemmung der plaquesbildenden Aktivität bei der Einzyklus-Infektion vorzugsweise zu den Terminen zeigt, die den früheren Etappen der Reproduktion des Grippe-Virus in den Zellen entsprechen: Adsorption, Penetration und möglich Deproteinisierung.

Virushemmende Wirkung des beanspruchten Präparates wurde im Vergleich zu dem bekannten Präparat, Remantadin, untersucht.

Das erfindungsgemässe Präparat übertrifft das Remantadin bei einer sehr umfassenden Palette der Antiviruswirkung, es zeigt einen ausgeprägten chemisch-therapeutischen Effekt gegenüber den Grippe-Viren vom A- und B-Typ in der Zellkultur und bei experimenteller Grippe-Pneumonie, die durch die Grippe-Viren vom A- und B-Typ hervorgerufen wird. Das Remantadin ist lediglich gegenüber dem Grippe-Virus vom A-Typ aktiv und gegenüber der Grippe vom B-Typ ist es nichtaktiv. Es entwickelt sich ausserdem die Resistenz des Grippe-Virus gegenüber dem erfindungsgemässen Präparat im Experiment bedeutend langsamer als gegenüber dem Remantadin.

Vergleichscharakteristik der virushemmenden Aktivität des beanspruchten Präparates und des Re-manfadins ist in der Tabelle 1 angeführt.

Experimentelle Untersuchung der Unschädlichkeit des beanspruchten Präparates zeigte, dass das Präparat bei der einmaligen Einführung per os wenig toxisch ist (LD50 für Mäuse beträgt 340 mg/kg, für Ratten- 3,000 mg/kg und für Meerschweinchen - 4,000 mg/kg).

Eine längere Anwendung des erfindungsgemässen Präparates per os in Dosen bis 100 bis 125 mg/kg für Ratten innerhalb von 6 Monaten und den Meerschweinchen innerhalb von 3 Monaten, in einer Dosis von 50 mg/kg den Kaninchen innerhalb von 2 Monaten und den Hunden in einer Dosis von 25 mg/kg innerhalb von 6 Monaten ruft keine pathologischen Änderungen bei den Tieren hervor, was auch durch klinische, hämatologische, biochemische und pathomorphologische Angaben bekräftigt wurde. Bei einer längeren Einführung des erfindungsgemässen Präparates in höheren Dosen können bei Tieren unspezifische dystrophische Veränderungen in parenchymatösen Organen entstehen. Das erfindungsgemässe Präparat weist keine lokalreizende Wirkung bei der Einführung per os auf, was durch hystologische Untersuchungen bekräftigt wurde.

Durchgeführt wurde die Untersuchung der allergisierenden Wirkung des beanspruchten Präparates an Meerschweinchen und an Kaninchen. Bei intrakutaner Einführung und bei wiederholten Hautapplika-tionen den Tieren übt das beanspruchte Präparat keine allergisierende Wirkung aus.

Das beanspruchte Präparat weist keine teratogene Aktivität auf. In einer für die schwangere Weibchen nichttoxischen Dosis von 250 mg/kg (auf das 20 bis 30fache die maximale Tagesdosis für einen Menschen übersteigende Dosis) ruft das Präparat keine Abweichungen im Embryogenese sowie bei der postnatalen Entwicklung von weissen Ratten hervor. Die komplexe Bewertung des Zustandes von Embryonen und des Nachwuchses der 1. Generation unter Hinzuziehung von mikroanatomischen, histologischen und physiologischen Testen, darunter Verhaltentesten, ermöglicht es, den Schluss zu machen, dass bei dem beanspruchten Präparat die teratogene Aktivität fehlt.

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Tabelle 1

Das erfindungsgemässe Präparat

Inhibiert die Reproduktion des Grippe-Virus vom A- und B-Typ in einer Zellkultur und in Hühnerembryonen.

Übt einen therapeutischen Effekt auf Grippe-Pneumonie bei Mäusen, die durch Viren vom A-undT-Typ hervorgerufen ist, aus.

Bei Passagen des Grippe-Virus vom Typ A in einer Zellkultur in Gegenwart des erfindungsgemässen Präparates während der 6 Passagen entsteht keine Resistenz des Virus gegenüber dem Präparat.

Weist keine virulizide Wirkung auf Grippe-Virus auf. Maximal verträgliche Konzentration für Zell-kultur, Fibroplasie eines Hühnerembryos beträgt 20 (ig/ml. LD50 für Mäuse beträgt bei der Einfüh-rung per os 340 mg/kg.

Remantadin

inhibiert die Reproduktion des Grippe-Virus vom Typ A in einer Zellkultur und in Hühnerembryonen. Gegenüber dem Virus vom Typ B ist nicht aktiv.

Übt einen therapeutischen Effekt bei Grippe-Pneumonie bei Mäusen, die durch den Grippe-Virus vom Typ A hervorgerufen ist und ist gegenüber dem Virus vom Typ B nicht aktiv.

Bei Passagen des Grippe-Virus vom Typ A in einer Zellkultur in Gegenwart des Remantadins entsteht die Resistenz gegenüber dem Präparat ab 2. bis 3. Passage.

Weist keine virulizide Wirkung auf Grippe-Virus. Maximal verträgliche Konzentrafion für die Zellkultur, Fibroplasie des Hühnerembiyos beträgt 20 iig/mI. LD50 für Mäuse beträgt bei der Einfüh-rung per os 340 mg/kg. ______

Das erfindungsgemässe Präparat weist keine mutagene Aktivität auf. Die Untersuchung wurde an einem Test-Objetä, Salmonella typhimurium unter Verwendung des erfindungsgemässen Präparates in Dosen von 50 bis 1000 mg je eine Scheibe durchgeführt.

Das beanspruchte Präparat wurde in Kliniken als therapeutisches virushemmendes Mittel bei Virus-Grippe vom Typ A und B1650 Patienten untersucht.

Das Präparat wurde per os zu je 0,2 g vier mal täglich innerhalb von 3 Tagen verordnet.

Klinische Untersuchungen des beanspruchten Präparates wurden im Vergleich zu Kontrollgruppen von Patienten durchgeführt, die die symptomatische Therapie bekamen. Die therapeutische Effektivität des beanspruchten Präparates gegenüber der Grippe vom Typ A und B kam in der Kürzung der Perioden des Fiebers, der Intoxikation und Katarrh-Erscheinungen sowie in der Kürzung der Erkrankungsdauer zum Ausdruck. Die therapeutische Effektivität des erfindungsgemässen Präparates wurde durch die Ergebnisse der serologischen Untersuchungen bekräftigt, nachweisbar verringert sich die Häufigkeit des Zuwachses von Antikörpern gegenüber den Grippe-Viren vom Typ A und B im Vergleich zu Kontrollgruppen der an der Grippe erkrankten Menschen, die die symptomatische Therapie erhalten haben. Das erfindungsgemässe Präparat beugt die Entwicklung der Komplikationen nach der Grippe und setzt wesentlich die Anzahl der Komplikation der chronischen Erkrankungen bei den die Grippe durchgemachten Menschen herab.

Klinische Untersuchungen zeigten die Unschädlichkeit der Anwendung des erfindungsgemässen Präparates : es wurden keine Nebenerscheinungen bei der Verwendung von Behandlungskursdosen von 1800 bis 3200 mg in keinem einzigen Fall sowohl bei der an der Grippe Erkrankten als auch bei gesunden Menschen (Freiwilligen) nachgewiesen.

Die Untersuchung der interferoninduzierenden Aktivität des erfindungsgemässen Präparates wurde in Versuchen in vitro (an einer primär-trypsinisierten Zellkultur der Fibroplaste des Hühnerembryos), in Versuchen in vivo an 340 weissen Mäusen (noninbred) mit einer Körpermasse von 18 bis 20 g und an 25 Freiwilligen (gesunde junge Leute beiden Geschlechts im Alter von 18 bis 30 Jahren) durchgeführt.

Zwecks Induzierung von Interferon in eine Zellkultur des Fibroplastes des Hühnerembryos wurden verschiedene Dosen des erfindungsgemässen Präparates mit 2%igem Diäthylaminoäthyl-dextran in einem Verhältnis 1:4 zu je 0,2 ml in jedem Reagensglas mit einer Zellen-Monoschicht eingebracht.

Die Inkubation der behandelten Zellen führte man bei einer Temperatur von 37°C innerhalb einer Stunde durch. Dann wurden die Zellen vom Präparat mit einem Medium Nr. 199 gewaschen und mit 1 ml Medium Nr. 199 ohne Zusatz von Rinderblutserum übergössen. In 8, in 24 und in 48 Stunden der Inkubation bei einer Temperatur von 37°C wurde die Kulturflüssigkeit gesammelt und auf das Vorliegen von Interferon in der Zeilkultur der Fibroplaste des Hühnerembryos mit einem Virus der venezuelischen Enzephalomyelitis in an sich bekannterWeise titriert.

Die Ergebnisse der Titrierung sind in der Tabelle 2 angeführt.

Als standardisiertes Vergleichspräparat wurde bei der Untersuchung der interferoninduzierenden Aktivität des erfindungsgemässen Präparates ein hochaktiver Induktor des Intereferons Zweispiralen-RNS des RF2-Phages (Zweispiralen-Ribonukleinsäure des RFg-Phages) eingesetzt.

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Tabelle 2

Interferoninduzierende Aktivität des erfindungsgemässen Präparates in der Zellkultur der Fibroplaste ei-nes Hühnerembryos

Präparat

Konzentration

Interferon-Titer (Einheiten/ml), in

pg/ml

8h

24 h

48 h

Erfindungsgemässes

10,0

80,0

160,0

40,0

Präparat

Erfindungsgemässes

20,0

640-1280

1280-2560

64-320

Präparat

Zweispiralen-RNS

100,0

0

160,0

wurde nicht unter desRFa-Phages

sucht

Zweispiralen-RNS

400,0

640-1280

1280-2560

640-320

desRFg-Phages

Die in der Tabelle 2 angeführten Ergebnisse ermöglichen es, die Schlussfolgerung zu machen, dass das erfindungsgemässe Präparat einen hocheffektiven Induktor des Interferons in der Zellkultur der Fibroplaste des Hühnerembryos darstellt. In einer Konzentration von 20 |xg/ml induziert das erfindungsgemässe Präparat das Interferon bereits in 8 Stunden (Titer = 640-1280 Einheiten/ml, maximaler Titer — 2560 Einheiten/ml wird in 24 Stunden ermittelt, in 48 Stunden sinkt der Titer des Interferons bis zu 320 Einheiten/ml).

Festgestellt wurde der dosisabhängige Effekt der Induktion des Interferons in der Zellkultur der Fibroplaste des Hühnerembryos unter dem Einfluss des beanspruchten Präparates. Die Konzentrationssenkung des beanspruchten Präparates auf das 2fache (bis 10 (ig/ml) führt zur Verringerung der Induktion des Interferons ungefähr auf das 8fache, die Dynamik bleibt die gleiche.

Vergleichende Untersuchung der Induktion des Interferons unter dem Einfluss des erfindungsgemässen Präparates und des hochaktiven Etalon-Induktors des Interferons der Zweispiralen-RNS des RF2-Phages ermittelte die Ausgangsdynamik der Induktion und die naheliegenden Titer des Interferons, die Zweispiralen-RNS des RF2-Phages brauchte man jedoch auf das 20fache mehr (400 ng/ml), eine Konzentration von 100 (ig/ml hat eine schwache Induktion des Interferons hervorgerufen.

Bei der nächsten Reihe von Experimenten wurde die Fähigkeit des erfindungsgemässen Präparates, das Interferon im Blutserum der Versuchstiere zu induzieren, untersucht.

Das erfindungsgemässe Präparat in Dosen von 250, 125 und 62,5 mg/kg wurde den Mäusen per os einmal (3 Gruppen von Tieren zu je 100 Stück) eingeführt, und in 16, 24, 48 und 72 Stunden erhielt man Blutserum, das man zum Titrieren des Interferons in einer überimpften Linie der L-Mäusezellen gegenüber dem Test-Virus der vesikulären Stomatitis verwendete. Einer Gruppe aus 20 Mäusen wurde das erfindungsgemässe Präparat ausserdem intraperitoneal in einer Dosis von 10 mg/kg einmal eingeführt, und in 24 Stunden erhielt man Blutserum, in dem auch der Titer des Interferons ermittelt wurde.

Die Prüfergebnisse sind in der Tabelle 3 angeführt.

Tabelle 3

Dynamik der Induktion des Interferons im Blutserum der Mäuse unter dem Einfluss des erfindungs-

gemässen Präparats

Präparat und Verfahren Dosis, Titer des Interferons (Einheiten/ml) in zur Einführung mg/kg

16 h

24 h

48h 72 h

Erfindungsgemässes

250

320-540

640-1280

320 160

Präparat (per os)

Erfindungsgemässes

125

640

320-640

640 160

Präparat (per os)

Erfindungsgemässes

62,5

320-640

640

160 40

Präparat (per os)

Erfindungsgemässes

10

wurde nicht

640-1280

wurde nicht unter

Präparat (interperito-

untersucht

sucht neai)

Blutserum der Mäuse

0

10-20

10-20

10-20 10-

ohneerfîndungsgemâs- 20 ses Präparat

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Die in der Tabelle 3 angeführten Ergebnisse zeigen, dass unter dem Einfluss des beanspruchten Präparates, das per os eingeführt wurde, die Induktion des Interferons im Blutserum der Mäuse zustandekommt. Der Effekt wird durch die Abhängigkeit von der jeweiligen Dosis charakterisiert und ist insbesondere in einem Bereich der Dosen von 250 bis 62,5 mg/kg, bezogen auf das Körpergewicht eines Tieres, ausgeprägt. Hohe Titer des Interferons (640 Einheiten/ml) zeigen sich im Blutserum der Mäuse in 16 Stunden und werden in 48 Stunden nachgewiesen. Das beanspruchte Präparat stimuliert die Induktion des Interferons auch bei der intraperitonealen Einführung.

Bei der mehrmaligen Einführung des beanspruchten Präparats mit dem Ziel der Induktion des Interferons tritt bei den Mäusen der Zustand der Hyporeaktivität auf, die in der Verringerung der Titer des Interferons im Blutserum zum Ausdruck kommt. Der Zustand der Hyporeaktivität ist eine kennzeichnende Erscheinung für Induktoren des Interferons.

Das beanspruchte Präparat als Induktor des Interferons übt prophylaktische Wirkung bei experimentellen Virus-Infektionen aus. Die prophylaktische Aktivität des Präparates wurde bei Grippe-Pneumonie der Mäuse, die durch intranasale Infizierung von Tieren mit dem Grippe-Virus vom Typ A (Bethezda) 63 (H2N2), vom Typ A (Aichi) (H3N2) hervorgerufen wird, und bei generalisierendem Herpes der Mäuse, der durch ihre intranasale Infizierung mit dem Herpes-Virus simplex des I. antigenen Typs Stamm Lz hervorgerufen wird, untersucht.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 angeführt.

Tabelle 4

Prophylaktische Wirkung des erfindungsgemässen Präparates bei experimentellen Virus-Infektionen

Grippe-Pneumonie der Mäuse

Dosis, mg/kg

Dauer und Verfahren der

Letalità

Senkung der

P

Einführung absolute

Anzahl der Tiere, [x]

%

Letalität, %

1

2

3

4

5

6

125

per os 24 und 6 Stunden vorder Infizierung

8/40

20

50

<0,01

62,5

per os 24 und 6 Stunden vorder Infizierung

8/40

20

SO

<0,01

31,2

per os 24 und 6 Stunden vor der Infizierung

12/40

30

40

<0,01

Kontrolle

28/40

70

—

(ohne Präparat)

Fortsetzung der Tabelle 4

Generalisierter Herpes der Mäuse

Dosis, mg/kg

Dauer und Verfahren der

Letalität

Verringerung

P

Einführung absoluteA

%

der Letalität, %

nzahl der Tiere [x]

7

8

9

10

11

12

30

peros

12/20

60

40

T"

O

o"

15

24 Stunden vor Infizierung

15/20

75

25

0,01

Kontrolle

20/20

100

—

(ohne Präparate)

[x] im Zähler—Anzahl der krepierten Tiere

[xl im Nenner-Anzahl der Mäuse in einer Gruppe

Das beanspruchte Präparat setzt bei der prophylaktischen Einführung 24 und 6 Stunden vor Infizierung per os in Dosen von 31,2 mg/kg bis 125 mg/kg den Tod der Mäuse vor Grippe-Pneumonie um 40 bis 50% im Vergleich zur Kontrolle herab. Die Einführung des beanspruchten Präparates in einer Dosis von 30 mg/kg per os einmal 24 Stunden vor der Infizierung schützt 40% der Tiere mit generalisierter Herpes-InfektionvorTod.

Die interferoninduzierende Aktivität des erfindungsgemässen Präparates wurde auch bei Menschen untersucht. Blutserum der Menschen, die die Tabletten des erfindungsgemässen Präparates (0,1 g) per

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os nach verschiedenen Schemata verabreicht bekamen, wurde auf das Vorliegen von Serum-Interfe-ron untersucht. Titrierung der Seren erfolgte nach einer allgemeingültigen Methodik, bei der man eine Kultur der diploiden Menschen-Zellen M-22 und Test-Virus der Enzephalomyokarditis der Mäuse verwendet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 angeführt.

Festgestellt wurde, dass die einmalige Einnahme des erfindungsgemässen Präparats in einer Dosis von 100 mg per os die Induktion des Seruminterferons in den Titern von 40 bis 80 Einheiten/ml bei 8 von 13 (61,5%) der freiwilligen Patienten hervorruft, und eine dreimalige Einnahme je 1 Tablette des erfindungsgemässen Präparates (300 mg) im Verlaufe eines Tages zu einer starken Erhöhung der Induktion des Interferons (Interferon wurde im Blutserum aller 12 freiwilligen Patienten (100%) in den Titern nachgewiesen, die 160 bis 320 Einheiten/ml erreichten) führte. Bei einer weiteren Vergrösserung der Dosis bis auf 600 mg innerhalb von 2 Tagen (je 3 Tabletten pro Tag) wurde eine starke Senkung der Induktion des Interferons beobachtet (der Interferon-Titer im Blutserum übertraf nicht 40 bis 80 Einheiten/ml).

Tabelle 5

Lfd. Nr. der Gruppe

Anzahl der Menschen in der Gruppe

Vorliegen des Interferons im Blutserum der Menschen

Nach einmaliger Einnahme des erfindungsgemässen Präparats an einem Tag (100 mg) Anzahl der Titer des positiven Interferons Antworten E/mi

Nach dreimaliger Einnahme des erfindungsgemässen Präparates an einem Tag (300 mg) Anzahl der Titer des positiven Interferons Antworten E/ml

Nach sechsmaliger Eln-name des erfindungsgemässen Präparats in 2 Tagen (600 mg)

Anzahl der Titerdes positiven Interferons Antworten E/ml

1.Gruppe

2. Gruppe

13 12

8

40-80

12

160-320 12

40-80

Die erzielten Ergebnisse zeugen von einer ausgeprägten interferoninduzierenden Aktivität des erfindungsgemässen Präparates bei Menschen bei seiner Einnahme per os. Maximale Menge des Interferons im Blutserum der Menschen wird nach der Einnahme von 300 mg des beanspruchten Präparates (je 100 mg dreimal täglich) ermittelt. Eine Vergrösserung der Dosis und der Dauer der Einnahme des beanspruchten Präparates führt zur Entwicklung des Zustandes der Hyporeaktivität bei den Menschen was durch eine starke Senkung der Trier des Seruminterferons charakterisiert wurde.

Untersucht wurde die immunomodulierende (immunstimulierende) Aktivität des beanspruchten Präparats.

Untersucht wurde der Einfluss des erfindungsgemäss vorgeschlagenen Präparates auf die Funktionen des Immunitätssystems.

Die Funktion der phagozytierenden Zellen unter dem Einfluss des erfindungsgemässen Präparates wurde bei geschlechtsrelfen Mäuseweibchen des Hybriden (CBA/C 57 BU)F untersucht.

Das Präparat führte man per os in einer Dosis von 125 mg/kg einmal und innerhalb von 5 Tagen einmal täglich ein. Als Vergleichspräparat wurde Levamisol verwendet, das man nach dem gleichen Schema in einer Dosis von 50 ng/je Maus einführte. Zu verschiedenen Terminen nach der Einführung der Präparate wurden bei den Mäusen peritoneale Makrophage ausgeschieden, deren Absorptionsfähigkeit nach der Absorption des neutralen Roten und quantitativ nach einer Eichkurve spektrophotometrisch (bei 530 nm) ermittelt wurde.

Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 angeführt.

8

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15

20

25

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35

40

45

50

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Tabelle 6

Absorptionsfähigkeit (ng/Mio Zellen) peritonealer Makrophage zu verschiedenen Terminen nach der ein-maligen Einführung des erfindungsgemässen Präparates oder des Levamisols

Zeit nach der

Kontrolle

Levamisol

Erfindungsgemässes Präparat

Einführung

(Stärke)

1-Tag

20,8 ±3,8

24,2 ±4,5

27,7±3,5 (125± 17%)

(116±21%)

P<0,01

2. Tag

22,8 ±2,0

27,7 ±3,2

33,6 ±4,7 (147 ±20,6%)

(121 ±14%)

P<0,05

3. Tag

24,1 ±4,2

32,5 ±2,4

37,4±3,7{155±15%)

(135 ±9,9%)

P < 0,05

Anmerkung: in Klammem sind %%, gegenüber Kontrolle, angeführt Die Einführung des erfindungsgemässen Präparates oder des Levamisols übte keinen Einfluss auf die Anzahl der aus der Bauchhöhle auszuwaschenden Makrophage, stimulierte aber ihre Absorptionsfähigkeit. Zum 2. bis 3. Tag nach der einmaligen Einführung stieg die Absorptionsfähigkeit der Makrophage bei Mäusen, die das erfindungsgemässe Präparat verabreicht bekamen, bis auf 155%, bei Mäusen, die Levamisol verabreicht bekamen, bis auf 135% (p < 0,05) an.

Nach der täglichen Einführung der Präparate in den gleichen Dosen innerhalb von 5 Tagen blieb die Absorptionsfähigkeit der Makrophage auf derselben Ebene - 164±13% (p<0,05) bzw. 138±11% (p < 0,05) aufrechterhalten. Hierdurch stimuliert die Einführung des erfindungsgemässen Präparates in vivo die Absorptionsfähigkeit der Makrophage in einem grösseren Masse als die Einführung des Levamisols.

Der Einfluss des erfindungsgemässen Präparates auf die Antikörpergenese wurde vergleichsmässig mit dem Levamisol und mit der Zweispiralen-RNS des RF2-Phages untersucht, es wurden 2 Mäuse-Lini-en (GBA/C 57 Blß)F sowie Geschwulstträger-Tiere (Komedokarzinom, geimpft subkutan in die Hüfte) intakte und total 2 G bestrahlte verwendet.

Antikörpergenese wurde in Bezug auf Hammelerythrozyte bei der Immunisierung intraperitoneal in einer Dosis von 1 x 108 Zellen untersucht. In 5 Tagen nach der Immunisierung wurden die Tiere dekapitiert und man ermittelte den Gehalt an antikörperbildenden Zellen in der Milz nach Kaninheim-Methode. Die Versuchsergebnisse sind in der Tabelle 7 zusammengeführt.

Das beanspruchte Präparat erhöhte die Anzahl der antikörperbildenden Zellen bei verschiedenen Schemata der Einführung bis auf 167 bis 246%, das Levamisol und die Zweispiralen-RNS des RF2-Pha-ges in einem Bereich von 143 bis 170%.

Eine ausgeprägte immunstimulierende Wirkung gegenüber den bestrahlten Tieren wies nur das beanspruchte Präparat auf, dabei in dem grössten Masse bei der Einführung 3 Tage vor der Bestrahlung: Immunantwort gleich nach der Bestrahlung betrug 230% gegenüber Kontrolle. Das Levamisol bei diesen Tieren ist wenig effektiv, Zweispiralen-RNS des RF2-Phages ist nichteffektiv.

Das beanspruchte Präparat übte auch immunstimulierende Wirkung gegenüber den Geschwulstträ-ger-Tieren (vom 7. bis 17. Tag des Wachstums einer Geschwulst) nach einmaliger (Immunisierung in 3 Tagen) oder fünfmaliger täglicher Einführung aus. Das Levamisol und die Zweispiralen-RNS des RF2-Pha-ges sind in diesen Experimenten nichteffektiv.

Das beanspruchte Präparat wurde aktiv bei total bestrahlten Tieren, Geschwulstträgern, und übte eine ausgeprägte immunstimuüerende Wirkung sogar dann aus, wenn das Niveau der Antikörpergenese ungefähr auf das 50fache gegenüber den intakten Tieren herabgesetzt wurde. Das Levamisol wies auch eine immunstimulierende Wirkung gegenüber diesen Tieren auf: Zweispiralen-RNS des RF2-Phages war nichteffektiv.

Hierdurch weist das beanspruchte Präparat die Fähigkeit auf, die Antikörpergenese bei allen untersuchten Linien der Mäuse sowohl intakten als auch bestrahlten zu stimulieren, in seiner Effektivität übertrifft es die Vergleichspräparate, das Levamisol und die Zweispiralen-RNS des RF2-Phages.

Untersucht wurde der Einfluss des beanspruchten Präparates auf Reaktionen der Zellenimunität, die nach der Reaktion Transplantat gegen Wirt testiert werden.

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ao

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Tabelle 7

Vergleichsuntersuchung des Einflusses des erfindungsgemässen Präparates, des Levamisols und der Zweispiralen-RNS des RFa-Phages auf die Antikörpergenese (% gegenüber Kontrolle) bei intakten Mäu-sen, bei total bestrahlten (2 Gy), bei Geschwulstträgem und total bestrahlten (2 Gy) Geschwulstträgern

Tiergruppen (Mäuse)

Levamisol innerhalb von

Levamisol 5mal mit ei

Zweispiralen-RNS des

3 Tagen täglich nem Abstand von 5 Ta

RF2-Phages fünfmal

gen mit einem Abstand von

3 Tagen

1

2

3

4

Intakte

164±6,1

170±15,1x)

143±7,5X)

Total bestrahlte (2 Gy)

171 ±24,0

104±6,0

88 ±6,6

Geschwulstträger

14 ±23,0

91 ±14,0

74 ±31,0

Bestrahlte Geschwulst

86 ±35,0

402 ±12,5

92 ±21,0

träger

Fortsetzung der Tabelle 7

Erfindungsgemässes

Erfindungsgemässes

Erfindungsgemässes

Erfindungsgemässes

Präparat

Präparat innerhalb von

Präparat innerhalb von

Präparat in 5mal mit ei

3 Tagen täglich

5 Tagen täglich nem Abstand von 3 Ta

gen

5

6

7

8

246±6,0X)

141 ±13

192±14,0X)

167±12,3X)

230 ±12,0*'

129 ±19

181 ±11,3

96 ±20,0

211±10,0X)

99 ±19

154±6,5x)

110±11,0

175±24,6X)

121 ±25

128 ±28,5

250 ±21,5X)

Anmeikung:x* Unterschiede zur Kontrolle sind nachweisbar (p < 0,05)

Mäuse-Hybriden (CBA x C 57 BU) Fi, Männchen im Alter von 3 Monaten wurden in einer Dosis von 5 Gy bestrahlt. Ein lag nach der Bestrahlung führte man ihnen intravenös Lymphozyte ein, die aus mesenterialen Lymphoknoten der Eltern-Linie CBA im Alter von 3 Monaten in Konzentrationen von 1, 25, 2,5 und 5,0 Millionen Kariozyte gewonnen wurden, in Versuchsgruppen führte man gleich nach der intravenösen Einfuhrung der Lymphozyte peroral das erfindungsgemässe Präparat in einer Menge von 100 mg/kg Körpermasse, oder das Levamisol in einer Menge von 5 mg/kg Körpermasse in einer 2%igen Stärke-Lösung ein. Jede Gruppen zählte 15 Mäuse. 8 Tage nach der Bestrahlung wurden die Mäuse dekapi-tiert, ihre Milzen wurden fixiert und man berechnete die Anzahl der Kolonien mit einem Durchmesser nicht unter 0,2 mm.

Die erzielten Ergebnisse sind in der Tabelle 8 angeführt. Die Einführung allogener Lymphozyte in grossen Dosen (2,5 und 5,0 Millionen) führt in der Kontrolle zur Verringerung der Ausbeute an Milzkolonien und bei minimal verwendeter Dosis (1.25-106) erhöht etwas die Ausbeute an Milzkolonien. Die Einführung des erfindungsgemässen Präparates verringert beide zu beobachtende Abweichungen gegenüber den Kontrollwerten, wenn nur die Dosis der eingeführten Zellen nicht die grösste ist (5-106). Das Levamisol hat eine ähnliche, aber weniger ausgeprägte Wirkung. In dem Fall, wenn die allogene Lymphozyte nicht eingeführt werden, verringert das Levamisol ausserdem etwas die Ausbeute an Milzkolonien, das erfindungsgemässe Präparat weist keinen solchen Effekt auf.

Hierdurch normalisiert die Einführung des erfindungsgemässen Präparates unter den Bedingungen einer induzierten Reaktion Transplantat gegen Wirt die proliferative Aktivität der «Erfolgszellen» und ihre Fähigkeit, eine lebensfähige Kolonie sowohl im Falle der Hemmung (bei grossen Dosen von Lymphozyten) als auch im Falle der Stimulation (geringere Dosen von Lymphozyten) zu erzeugen. In seiner Effektivität übertrifft das beanspruchte Präparat das bekannte Präparat Levamisol.

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RH

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Tabelle 8

Einfiuss des angemeldeten Präparates und des Levamisols auf die Inaktivierung von Stamm-Zellen mit allogenen Lymphozyten

Präparat

Anzahl der einzuführenden Lymphozyten x 10®

Einführung der Präparate per os

Anzahl von Milzendo-kolonien (M±m)

Kontrolle

5,0

-

0,3 ±0,1

Kontrolle

2,5

-

0,9 ±0,3

Kontrolle

1,25

-

4,1 ±0,6

Kontrolle

—

-

2,2 ±0,5

Angemeldetes Präparat

5,0

+

0,3 ±0,1

Angemeldetes Präparat

2,5

+

1,6 ±0,2

Angemeldetes Präparat

1,25

+

2,5 ±0,4

Angemeldetes Präparat

—

+

2,2 ±0,4

Levamisol

5,0

+

0,7±0,2

Levamisol

2,5

+

1,1 ±0,2

Levamisol

1,25

+

2,3 ±0,5

Levamisol

-

+

1,1 ±0,3

Es wurde der Einfluss des beanspruchten Präparates als immunstimulierendes Mittel auf das Wachstum einer überimpften Geschwulst und auf thermische Beschädigung der Haut untersucht

Man untersuchte den Einfluss des beanspruchten Präparates auf das Wachstum des Sarkom-45, das subkutan in die rechte Hüfte der geschlechtsreifen Rattenmännchen der Wistar-Linie geimpft wurde. Das erfindungsgemässe Präparat wurde intragastrisch in Form einer Suspension in einer 1%igen Stärke-Lösung in einer Dosis von 125 mg/kg innerhalb von 5 Tagen täglich in zwei Wochen nach der Geschwulst-Impfung eingeführt. Den Kontrolltieren wurde lediglich die Stärke-Lösung eingeführt. Die Dynamik des Wachstums der Geschwulst kontrollierte man durch die zu Lebzeiten ausgeführten Messungen des Volumens. Bei einer Beobachtung innerhalb von zwei Monaten wurden die Hemmung des Geschwulstwachstums in einer Gruppe (10 Tiere), die das erfindungsgemässe Präparat verabreicht bekamen, festgestellt.

Hierdurch übt das erfindungsgemässe Präparat eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum einer soliden überimpften Experimentalgeschwulst vielleicht indirekt durch die Stimulierung der immunologischen Reaktivität aus.

Die Ergebnisse der Prüfungen sind in der Tabelle 9 angeführt.

Die Untersuchung des Einflusses des erfindungsgemässen Präparats auf thermische Beschädigung der Haut hat die Fähigkeit des beanspruchten Präparats aufgedeckt, eine wärmeschützende Wirkung zu erweisen und die thermische Beschädigung der Haut zu vermindern.

Untersucht wurde der Einfluss des beanspruchten Präparats auf den immunologischen Status der Menschen.

Beobachtet wurden junge gesunde Leute (Freiwillige) im Alter von 18 bis 30 Jahren (25 Personen).

Über den Zustand des immunologischen Status urteilte man nach der Untersuchung der T-Zellen-Im-munität: Zustand der Lymphozyte im peripheren Blut, absoluter und relativer Gehalt an T-Zelien (Jondal-Methode): nach dem Zustand der Stabilität der Rezeptoren an der Oberflächenmembrane der Lymphozyte.

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Tabelle 9

Einfluss des erfindungsgemässen Präparates (125 mg/kg täglich innerhalb von 5 Tagen) auf das Wachstum des Saikom-45 bei Ratten

Zeit nach der Wachstum einer Geschwulst, cm3

Uberimpfung ohne Einführung des erfindungs- Einführung des erfindungs-

der Geschwulst gemässen Präparates gemässen Präparates

1 Monat

11,9 ±0,86

8,2 ±1,4

p < 0,05

1 Monat

35 ±3,4

21 ±3,9

10 Tage

p < 0,05

1 Monat

59 ±5

38 ±7,5

16Tage

p < 0,05

2 Monate

70,1 ±2,6

39,9 ±9,7

p < 0,05

Unter dem Einfluss unterschiedlicher Dosen des erfindungsgemässen Präparats wurde der immunologische Status der gesunden jungen Leute ohne vorherige antigene Stimulierung und bei einem vakzina-len Grippe-Infekt untersucht, den man durch die Vakzination der Grippe-Vakzine vom Typ A intranasal bei einer Verdünnung 1:1 In einem Volumen von 1,0 ml anregte.

Die Untersuchung erfolgte mit Doppel-BIind-Kontrolle, man verwendete neben den Tabletten des erfindungsgemässen Präparats auch ein ähnlich aussehendes Plazebo. Die Ergebnisse wurden statistisch bearbeitet.

Die erzielten Ergebnisse zeugen davon, dass das erfindungsgemässe Präparat bei einmaliger Einnahme von 100 mg per os und bei einer Tagesdosis von 300 mg (je 100 mg dreimal täglich) die Anzahl der T-Po-pulation nicht verändert, führt aber zur Veränderung der Rezeptor-Bindung mit der Oberflächenmembrane der Lymphozyte, die innerhalb von 14 Tagen (Beobachtungsdauer) aufrechterhalten bleibt.

Die in einem Tag nach der Einführung des erfindungsgemässen Präparats durchzuführende Vakzination beeinflusste nicht den Charakter der Veränderungen der Rezeptor-Bindung mit der Membrane der Lymphozyte.

Die Veränderung der Oberflächeneigenschaften der Membrane der Lymphozyte unter der Einwirkung des beanspruchten Präparats beeinflusst wahrscheinlicherweise die Veränderung der funktionalen Eigenschaften dieser Zellen, die eine verstärkte Funktion des Immunitätssystems verursacht, wovon der von uns zu beobachtende Schutzeffekt des beanspruchten Präparats gegenüber der Entwicklung eines Grippe-Infekts zeugt. Das erfindungsgemässe Präparat beugt die Entwicklung von Komplikationen nach der Grippe vor und setzt wesentlich die Frequenz des Wiederaufflackerns chronischer Erkrankungen bei den die Grippe durchgemachten Patienten herab.

Die Ergebnisse der durchgeführten Prüfungen zeigen, dass das beanspruchte Präparat unschädlich ist, bei den Patienten gut verträglich ist, den therapeutischen Effekt bei der Grippe vom Typ A und B erweist, beugt die Entwicklung von Komplikationen nach der Grippe und das Wiederaufflackern von chronischen Erkrankungen nach der Grippe vor. Das beanspruchte Präparat ist ausserdem ein effektives Interferonogen und Immunostimulator, das aber keine toxische und Nebenwirkungen auf den Organismus hat. Das beanspruchte Präparat kann als Immunostimulator, darunter bei sekundären immundefizitä-ten Zuständen, darunter bei Strahlen- und Thermostrählentherapie onkologischer Patienten sowie bei chronischen und rezidivierenden Virus-Infektionen, empfohlen werden.

Das erfindungsgemässe Präparat wird zur ein- bis zweimaligen Verwendung innerhalb einer Woche und während der ganzen Dauer der spezifischen antineoplastischen Therapie empfohlen. Einmalige Dosis beträgt von 300 bis 400 mg (etws 250 mg/m2), die Dosis für die ganze Dauer der Behandlung (Behandlung onkologischer Patienten dauert von 1 bis 2 Monaten) beträgt von 3 bis 6 g des beanspruchten Präparats.

Die Ergebnisse der Untersuchung der Pharmakokinetik des markierten beanspruchten Präparats -C1* zeigen, dass das Präparat schnell ausgeführt wird, was es ermöglicht, seine eventuelle Kumulation Im Organismus nicht zu befürchten.

Der Wirkstoff des erfindungsgemässen Präparats, Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethyl-aminomethyt-1-methyl-2-phenylthiomethyIindol-3-carbonsäure-MonohydrathydrogenchIorid wird wie folgt gewonnen.

Athylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethyiindol-3-carbonsäure behandelt man mit einem Bromierungs-agens im Medium eines inerten organischen Lösungsmittels unter Kochen.

Als Bromierungsagens verwendet man vorzugsweise Brom beziehungsweise N-Bromsukzinimid und als inertes organisches Lösungsmittel Chloroform, Dichloräthan oder Kohlenstofftetrachlorod. Der an12

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fallende Äthylester der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyI-1-methylindoI-3-carbonsäure wird mit Thiophenol in Gegenwart des Hydroxids eines Alkalimetalls oder seines Alkoholats im Medium eines organischen Lösungsmittels umgesetzt.

Als Hydroxid eines Alkallmetalfs verwendet man Ätzkali, Ätznatron, oder die Reaktion wird in Gegenwart des Natriumalkohqlats durchgeführt. Als organisches Lösungsmittel verwendet man vorzugsweise in dieser Stufe Methyl-,. Äthyl- oder Isopropylalkohol.

Der gewonnene Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-1-methyl-2-phenylthiomethylindoI-3-carbonsäure lässt man mit einem aimonomethylierenden Agens (Bis-dimethyl-aminomethan oder mit einem Gemisch des Dimethylamins mit Formalin) im Medium eines organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur von 65°C bis zum Siedepunkt der Reaktionsmasse umsetzen.

Die Aminomethylierung mit Bis-dimethylaminomethan führt man zweckmässigerweise im Dioxan unter Sieden durch. Die Ausbeute an Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethyIaminoniethyl-1-methyl-2-phenyIthiomethylindol-3-carbonsäure beträgt 70%.

Bei der Verwendung eines Gemisches von Dimethylamin mit Formalin für die Aminomethylierung soll zweckmässigerweise als organisches Lösungsmittel Essigsäure eingesetzt werden, dabei wird die Reaktion bei einer Temperatur von 65 bis 75°C durchgeführt. Die Senkung der Reaktionstemperatur verlangsamt die Prozessführung, ihre Steigerung verursacht die Verharzung der Masse. Die Ausbeute an Äthylester der 6-Brom-5-hydroxydimethylaminomethyl-1-methyl-2-phenylthiomethyIindol-3-carbonsäure beträgt in dieser Stufe 85%.

Man isoliert das Endprodukt durch Zusatz einer ätherischen Lösung des Wasserstoffchlorids der Lösung der angefallenen Base im Azeton aus. Vorzugsweise soll die Isolierung des Endproduktes durch Behandlung der angefallenen Base mit Salzsäure im Azeton-Medium unter Sieden erfolgen. Die Prozessführung erfolgt nach folgendem Schema:

i

CHj

Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden nachstehende Beispiele für die Realisierung des Verfahrens zur Herstellung der beanspruchten Verbindung angeführt.

Beispiel 1

Einer Lösung aus 110 g (0,4 Mol) Äthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethylindol-3-carbonsäure in 1200 ml Kohlenstofftetrachlorid setzt man unter Vermischen 127,8 g (0,8 Mol) Brom unter Sieden zu. Die Reaktionsmasse wird abgekühlt und der ausgefallene Niederschlag wird abgefiltert.

Man erhält 150,7 (87%) Äthylester der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyI~1-methylindoI-3-carbonsäu-re in Form eines kristallinen Pulvers weisser Farbe, bei Erhitzung löslich in einem niederen Alkohol, Chlorkohlenstoff, wasserunlöslich, Schmelzpunkt von 179 bis 180°C.

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Gefunden, %: C 41,50 H 3,50 Br36,97 CisHisB^NCU.

Berechnet, %: C 41,60 H 3,49 Br 36,90.

Einer Lösung aus 52,1 g (0,93 Moi) Ätzkali in 1300 mi Methanol bei Raumtemperatur und unter Vermischen setzt man 34,1 g (0,31 g Mol) Thiophenol und dann 135 g (0,31 Mol) Äthylester der 5-Azetoxy-6-brommethyl-1 -methylindol-3-carbonsäure zu.

Das Gemisch lässt man bei Raumtemperatur innerhalb von 3 Stunden stehen, dann neutralisiert man mit verdünnter Essigsäure, der ausgefallene Niederschlag wird abgefiltert und mit Wasser gewaschen.

Man erhält 125,6 g (96,4%) Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-1-methyI-2-phenylthiomethyIindoI-3-carbonsäure in Form eines kristallinen Pulvers von gelber Farbe, unter Erhitzen löslich im niederen Alkohol, Äthylazetat, unlöslich in Wasser, Schmelzpunkt von 196-197°C (aus Äthylazetat).

Gefunden, %: C 54,14 H 4,24 CmHiaBrNOaS.

Berechnet, %: C 54,30 H 4,32.

Den 125 ml Essigsäure setzt man unter Vermischen und Kühlen 56 ml (0,385 Mol) 33%ige Dimethylamin-lösung zu und dann 12,6 ml (0,165 Mol) 37,7%ige Formalinlösung zu. Der hergestellten Lösung setzt man 61,3 g (0,146 Mol) Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-1-methyl-2-phenylthiomethylindol-3-carbonsäure zu. Die Reaktionsmasse vermischt man bei einer Temperatur von 65 bis 75°C innerhalb von 30 Minuten. Die sich bildende Lösung wird abgekühlt und mit Etznatronlösung neutralisiert. Der ausgefallene Niederschlag wird abgeschieden und mit Wasser gewaschen.

Man erhält 59,9 g (85,1%) Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyI-l-methyl-2-phenylthîomethylindôl-3-carbonsâure in Form eines kristallinen Stoffes mit weisser Farbe, unter Erhitzung löslich in Azeton, Azetonitril, Dioxan, niederem Alkohol, unlöslich in Wasser. Schmelzpunkt von 127 bis 128°C (aus Azetonitril).

Gefunden, %: C 55,53 H 5,35 N 6,01 CaaHasBrNaOaS.

Berechnet, %: C 55,34 H 5,29 5,87.

Einer Lösung aus 47,1 g (0,0986 Mol) Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethyiaminomethyI-1-me-thyl-2-phenyIthiomethylindoI-3-carbonsäure in 280 ml Azeton setzt man unter Vermischen und Sieden 11 ml (0,1282 Mol) konzentrierte Salzsäure zu. Die Reaktionsmasse wird abgekühlt, der Niederschlag abgeschieden und aus dem Gemisch Azeton-Methanol umkristallisiert.

Man erhält 45,1 g (86%) Endprodukt, Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyi-1-me-thyl-2-phenylthiomethyIindol-3-carbonsäure des Monohydrat-Hydrogenchlorids.

Gefunden, %: C 49,57 H 5,30 Br 14,98 CI 6,54 S 5,89 N 5,30 H20 3,28 C22H28BrCIN204S.

Berechnet, %: C 49,67,- H 5,31 ; Br 15,02 CI 6,67 N 5,27; S 6,03; H20 3,38.

Die Ausbeute an Endprodukt, umgerechnet auf Ausgangsäthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethylindol-3-carbonsäure, beträgt 61,38%.

Beispiel 2

Die Prozessführung erfolgt analog der in Beispiel 1 beschriebenen mit Ausnahme dessen, dass bei der Herstellung des Äthylesters der 5-Azetoxy-6-Brom-2-brommethyl-1-methylindol-3-carbonsäure der Prozess im Chloroform zustandekommt, dabei wird das genannte Produkt in einer Ausbeute von 79,3% ausgeschieden, Schmelzpunkt beträgt von 167 bis 169°C.

Die Ausbeute an Endprodukt beträgt 55,95%, berechnet auf Äthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethyIin-dol-3-carbonsäure. Das Produkt ist dem in Beispiel 1 beschriebenen identisch.

Beispiel 3

Die Prozessführung erfolgt analog der in Beispiel 1 beschriebenen mit Ausnahme dessen, dass bei der Herstellung des Äthylesters der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyl-1-methyIindoI-3-carbonsäure der Prozess im Dichloräthan zustandekommt, dabei wird das genannte Produkt in einer Ausbeute von 63,5% ausgeschieden, Schmelzpunkt beträgt von 167 bis 168°C.

Die Ausbeute an Endprodukt beträgt 46,07%, berechnet auf Äthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethyl-indoI-3-carbonsäure.

Das Produkt ist dem in Beispiel beschriebenen ähnlich.

Beispiel 4

Einer Lösung aus 44 g (0,16 Mol) Äthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethyIindol~3-carbonsäure in 560 ml Kohlenstofftetrachlorid setzt man 64 g (0,36 Mol) N-Bromsukzinimid zu und das Gemisch kocht man innerhalb von 6 Stunden. Aus der heissen Lösung wird das Sukzinimid abgefiltert und mit heissem Kohlenstofftetrachlorid gewaschen. Nach einer teilweisen Eindampfung des Filtrats im Vakuum und nach der Kühlung wird der Niederschlag abgeschieden und aus Isopropanol umkristallisiert. Man erhält 43,4 g (62,7%) Äthylester der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyl-1-methylindol-3-carbonsäure, Schmelzpunkt beträgt von 179 bis 180°C.

Im weiteren erfolgt die Prozessführung analog Beispiel 1. Die Ausbeute an Endprodukt beträgt 44,24%, das Produkt ist dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich.

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Beispiel 5

Die Prozessführung erfolgt analog der in Beispiel 1 beschriebenen mit Ausnahme dessen, dass bei der Herstellung des Äthylesters der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethyl-aminomethyl-1-methyI-2-phenylthio-methylindol-3-carbonsäure die Aminomethylierung wie folgt zustandekomrnt:

einer Lösung aus 76,4 g (0,18 Mol) des Äthylesters der 6-Brom-5-hydröxy-1-methyl-2-phenyIthiomethyl-indol-3-carbonsäure in 470 ml Dioxan setzt man 50 ml (0,36 Mol) Bis-dimethylaminomethan zu. Die Reaktionsmasse wird innerhalb von 3 Stunden gekocht, abgekühlt und mit 3 bis 4 Volumen Wasser verdünnt. Die ausgefallenen Kristalle werden abgeschieden, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 60,1 g (70%) Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1-methyl-2-phenylthiomethylindol-3-carbonsäure, der Schmelzpunkt beträgt von 125 bjs 126°C.

Im weiteren erfolgt die Prozessführung analog Beispiel 1.

Die Ausbeute an Endprodukt beträgt 50,49%, berechnet auf Ausgangsäthylester der 5-Azetoxy-l,2-dimethylindol-3-carbonsäure. Das Produkt ist dem in Beispiel 1 beschriebenen ähnlich.

Beispiel 6

Die Prozessführung erfolgt analog der in Beispiel 1 beschriebenen mit Ausnahme dessen, dass bei der Herstellung des Äthylesters der 6-Brom-5-hydroxy-1-methyl-2-phenyIthiomethyIindol-3-carbonsäu-re der Prozess im Äthanol in Gegenwart des Natriumäthylats durchgeführt wird. Das Produkt wird in einer Ausbeute von 96,8% ausgeschieden, der Schmelzpunkt beträgt von 196 bis 197°C.

Die Ausbeute an Endprodukt, berechnet auf den Ausgangsäthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethylin-dol-3-carbonsäure, beträgt 59,4%.

Beispiel 7

Die Prozessführung erfolgt analog der in Beispiel 1 beschriebenen mit Ausnahme dessen, dass bei der Herstellung des Äthylesters der 6-Brom-5-hydroxy-1-methyl-2-phenylthiomethylindol-3-carbonsäu-re der Prozess im Isopropanol in Gegenwart von Atznatron zustandekommt. Das Produkt wird in einer Ausbeute von 94,5% ausgeschieden, der Schmelzpunkt beträgt von 196 bis 197°C.

Die Ausbeute an Endprodukt, berechnet auf den Ausgangsäthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethylin-dol-3-carbonsäure, beträgt 56,7%.

Gewerbliche Verwertbarkeit

Der erfindungsgemässe Stoff, Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1-methyl-2-phenyIthiomethylindol-3-carbonsäure des Monohydrat-Hydrogenchlorids weist eine antivirale, interferoninduzierende und immunomodulierende Aktivität auf und stellt den Wirkstoff eines Atzneipräparates mit antiviraler interferoninduzierender und immunomodulierender Wirkung dar.

Claims (12)

Patentansprüche

1. Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1 -methyl-2-phenyIthiomethylindol-3-car-bonsäure des Monohydrat-Hydrogenchlorids folgender Formel:

cooc2h5

•hcx«h2o ch2 sc6H5

2. Verfahren zur Herstellung von Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyl-1-methyI-2-phenylthiomethylindoI-3-carbonsäure des Monohydrat-Hydrogenchlorids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Äthylester der 5-Azetoxy-1,2-dimethylindol-3-carbonsäure mit einem Bromie-rungsagens im Medium eines inerten organischen Lösungsmittels unter Sieden behandelt wird, der entstehende Äthylester der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyl-1-methylindol-3-carbonsäure mit Thiophenol

CH2N(CH5)2

15

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

CH 678 726 A5

in Gegenwart des Hydroxids eines Alkalimetalls beziehungsweise seines Alkoholats im Medium eines organischen Lösungsmittels umgesetzt wird, der gewonnene Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-1-methyl-2-phenylthiomethylindol-3-carbonsäure mit einem Aminomethylierungsagens im Medium eines organischen Lösungsmittels bei einer Temperatur von 65°C bis zum Siedepunkt des Reaktionsgemisches umgesetzt wird, dann aus der anfallenden Base, dem Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethylaminomethyI-1-methyl-2-phenylthiomethylindoI-3-carbonsäure, das Endprodukt isoliert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man als Bromierungsagens Brom beziehungsweise N-Bromsuccinimid verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man als inertes organisches Lösungsmittel Chloroform, Dichloräthan beziehungsweise Kohlenstofftetrachlorid verwendet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Umsetzung des Äthylesters der 5-Azetoxy-6-brom-2-brommethyl-1-methylindol-3-carbonsäure mit Thiophenol als organisches Lösungsmittel Methyl-, Äthyl- oder Isopropylalkohol verwendet werden.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Aminomethylierungsagens ein Gemisch des Dimethylamins mit Formalin beziehungsweise mit Bis-dimethylaminomethan verwendet wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verwendung des Gemisches des Dimethylamins mit Formalin als organisches Lösungsmittel Essigsäure eingesetzt wird, wobei die Aminomethylierung bei einer Temperatur von 65 bis 75°C durchgeführt wird.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 2 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Verwendung des Bis-dimethylaminomethans als organisches Lösungsmittel Dioxan eingesetzt wird, wobei die Aminomethylierung beim Siedepunkt des Reaktionsgemisches durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des Endproduktes durch Behandlung des Äthylesters der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethy!aminomethyi-1-methyl-2-phenyl-thiomethylindol-3-carbonsäure mit Salzsäure im Medium des Acetons unter Sieden erfolgt.

10. Arzneipräparat mit antiviraler, interferoninduzierender und immunomodulierender Wirkung, das einen Wirkstoff und eine pharmazeutische Trägersubstanz enthält, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff Äthylester der 6-Brom-5-hydroxy-4-dimethyIaminomethyl-1-methyl-2-phenyIthiomethyIindol-3-carbonsäure des Monohydrat-Hydrogenchlorids nach Anspruch 1 enthält.

11. Arzneipräparat nach Anspruch 10 in Form von Tabletten, dadurch gekennzeichnet, dass es den Wirkstoff in einer Menge von 0,1 bis 0,2 g je nach Tablette enthält.

12. Arzneipräparat nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass es als pharmazeutische Trägersubstanz Stärke beziehungsweise Puderzucker enthält.

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