DD248282A1

DD248282A1 - Mittel zur behandlung von hauterkrankungen und tumoren

Info

Publication number: DD248282A1
Application number: DD26808584A
Authority: DD
Inventors: Beate Roeder; Gerd Wischnewsky; Sabine Nicklisch; Hans Meffert; Edeltraut Slawatycki
Original assignee: Univ Berlin Humboldt
Priority date: 1984-10-08
Filing date: 1984-10-08
Publication date: 1987-08-05

Abstract

Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hauterkrankungen, insbesondere von Psoriasis, sowie zur Behandlung von verschiedenen Tumoren. Erfindungsgemaess werden pharmazeutische Zubereitungen, die als wirksame Substanz Phaeophorbid a oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze oder ein Gemisch dieser Stoffe enthalten, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- oder Traegerstoffen in eine geeignete Applikationsform ueberfuehrt.

Description

CH=CH

Phäopiiorbid a

Rc

Abb. 1: Strukturformel der Phorbide

Bei Kenntnis des Standes der Technik konnte diese spezifische Wirkung der erfindungsgemäßen Substanz nicht erwartet werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Phäophorbid a, b oder deren Salze oder ein Gemisch dieser Stoffe als Arnzeimittel. Für diese Verwendung sind Phäophorbide enthaltende pharmazeutische Zubereitungen von besonderem Interesse.

Es wurde gefunden, daß Phäophorbide enthaltende pharmazeutische Zubereitungen beim fotochemotherapeutischen Einsatz bei Bestrahlung mit Licht der Wellenlänge 370-680 nm eingesetzt werden können.

Die erfindungsgemäß verwendbaren Substanzen sind bekannt und lassen sich nach literaturbekannten Methoden aus Pflanzenmaterial gewinnen. Im gegebenen Fall wurde eine modifizierte Methode nach R.Willstätter und A.Stoll (in „Untersuchungen über Chlorophyll" [1913] Springer-Verlag) angewandt und das Phäophorbid aus den Blättern von 8-10 Tagen alten Pflanzen von Triticum aestivum gewonnen.

Zur Charakteristik des Präparaktes wurde die Beurteilung des Absorptionsspektrums genutzt. Chromatographisch gereinigtes Chlorophyll a (Vorreinigung nach E.Höxtermann: studia biophysica 72 [1978] Heft 3, S.203-204), das nach anschließender pc-Trennung auf Filtrak FN8, Laufmittel: Petroläther/Aceton (80/20) in Phäophorbid a überführt wurde, ergab ein qualitativ übereinstimmendes Absorptionsspektrum mit Phäophorbid a, das aus einem Pigmentrohextrakt gewonnen wurde.

Um eine eventuell vorhandene fotosensibilisatorische Wirkung durch als Verunreinigung enthalten sein könnende Cumarine auszuschließen, wurde eine dünnschichtchromatographische Untersuchung des Präparates auf Vorhandensein von Cumarinen durchgeführt.

Cumarine sind auf Dünnschichtchromatogrammen bereits in geringen Konzentrationen durch Fluoreszenz nachweisbar. Als Vergleichssubstanzen wurden in allen Fällen Umbelliferon und Scopoletin in ca. 0,5%iger methanolischer Lösung aufgetragen.

Es wurden drei verschiedene Trennbedingungen gewählt.

Schicht: Kieselgel GF 254 Typ 60 nach Stahl (7,5g in 15ml Wasser)

Platte: 20 x 20cm

Laufmittel: Toluol/Äther mit Eisessig ge.

nach Entwicklung besprühen mit 5% äthanol. KOH,

Betrachtung im UV-Licht.

(H.Wagner; S.BIadt; E.M.Zgainski: „Drogenanalyse — DC-Analyse von Arzneidrogen", Springer-Verlag, 1983, S. 145-152)

Schicht: Kieselgel GF 254Typ 60 nach Stahl (7,5g in 15ml Wasser)

Platte: 20 χ 20cm

Laufmittel: Benzol/Aceton (90/10)

nach Entwicklung besprühen mit 5% äthanol. KOH,

Betrachtung im UV-Licht

Schicht: Polyamid MN UV 254 (2,5g in 10ml Methanol)

Platte: 20 x 20cm

Laufmittel: Wasser/Methylethylketon/Methanol (40/30/30) nach Entwicklung besprühen mit 5% äthanol. KOH, Betrachtung im UV-Licht

(II. und III.: K. Egger: Pflanzliche Phenolderivate, in: E. Stahl, Dünnschichtchromatographie, Springer-Verlag, 1967, S. 655-673).

Beide Vergleichssubstanzen zeigten in Konzentrationen von 0,5 bis 10ug eine deutliche Fluoreszenz.

Ein ungereinigter äthanolischer Ausgangsextrakt von Triticum aestivum zeigte keine Fluoreszenz. Ebenso konnte für Phäophorbid a — Präparat aus reinem Chlorophyll a und aus Pigmentrohextrakt (in Konzentration bis zu 2 χ 10~⁵M/l)— keine Fluoreszenz beobachtet werden.

Die hohe Empfindlichkeit des Nachweises macht es unwahrscheinlich, daß die Phäophorbid-Präparate Cumarine enthalten, zumal solche bereits im Rohextrakt nicht nachzuweisen waren.

Die Prüfung auf die genannten pharmakologischen Eigenschaften erfolgte nach prinzipiell aus der Literatur bekannten Methoden.

1. Im Selbstversuch wurde die fototoxische Wirksamkeit von Phäophorbid a in vito bestimmt. Unter Verwendung eines UVA/B-Brenners vom Typ NARVA UVS 40-2 (UVA-Kontinium und ca. 8% UVB) war die fototoxische Wirksamkeit bei 6 Probanden nach lokalem Aufbringen einer3,2 · 10"⁵M Lösung von Phäophorbid a in Glycerol gegenüberder Kontrolle ohne Phäophorbid a um den Faktor 3,2 bis 5,4 verstärkt.

2. Die Bestimmung der antipsoriatischen Wirksamkeit erfolgte an 7 Probanden mit einem chronisch-stationären Typ von Psoriasis, bei denen eine Dithranolkurzzeittherapie durchgeführt wurde. Dabei erfolgte keine interne Medikation. Für die Wirksamkeitsbestimmung wurden gleichgroße Einzelherde der Rückenhaut (Durchmesser ca. 2cm), jeweils im gleichen Stadium, ausgespart. Zur Testung wurde eine 3,2 10"⁵M Lösung von Phäophorbid a in Biowaschöl® mit einem Gehalt von 5% (w/v) Salicylsäure lokal aufgetragen. Zur UV-Bestrahlung wurden Leuchtstoffröhren vom Typ NARVA UVS40-2 benutzt. Zur Behandlung mit sichtbarem Licht wurde eine 300-Watt-Halogenlampe (400-800 nm) verwendet. Auf zwei der Einzel herde wurde einmal täglich an 10 aufeinanderfolgenden Tagen (exklusive Sonnabend/Sonntag) mit einem Pinsel die Testlösung aufgetragen. Die Bestrahlung mit sichtbarem- bzw. UV-Licht erfolgte 30 Minuten danach. Die UV-Bestrahlung begann mit 0,1 J/cm², die Belichtung mit U/cm². Bei jederfolgenden Bestrahlung wurde die Dosis um 10% gesteigert. Der dritte Einzelherd wurde ohne Vorbehandlung in gleicherweise UV-bestraht. Der vierte Einzelherd wurde nur mit der Testlösung behandelt und nicht bestrahlt. Zwischen den Behandlungen wurden die Einzelherde jeweils mit einem Aluminiumplättchen (Finn Chamber) abgedeckt.

Die Teststellen wurden vor jeder Behandlung nach der Methode von Weinstein u.a. (Arch. Dermatol. 177 [1981] 388) bewertet.

Dabei werden Erythem, Infiltrat und Schuppung jeweils in eine 4-Punkte-Skala eingeordnet. Die so ermittelte Psoriasis-Aktivität bewegt sich zwischen Werten von 0 (völlig rückgebildet) bis 9 (maximale Rötung, Infiltration und Schuppung). Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Wilcoxon-Test und dem Mann-Whitney-Test.

Aus Abb. 2 wird ersichtlich, daß sich die Psoriasis von der zweiten Behandlung ab nach Anwendung von Phäophorbid a und UV-oder sichtbarem Licht rascher zurückbildet als bei den Kontrollen.

Es konnte festgestellt werden, daß unter den oben genannten Bedingungen mit der Testsubstanz eineantipsoriatische Wirksamkeit erzielt wurde, die derjenigen einer Zubereitung mit0,1%Dithranol und 5% Salicylsäure in Vaseline entspricht.

3. Die Überprüfung der antitumorösen Wirksamkeit von Phäophorbid a in vitro erfolgte an Ehrlich-Ascites-Carcinom-Zellen. Im Rahmen der Propagierung der Zellinie wurde von 2 Mäusen 7 TagenachintraperitonealerGabevonComljeTierfe Millionen Ehrlich-Ascites-Carcinom-Zellen/ml) die Ascites-Flüssigkeit mit einer sterilen Spritze aus dem ungeöffneten Bauchraum entnommen. Die Spritze wurde mit 5μΙ Heparin Natrium (5000I.E./ml) zur Entnahme vorbereitet. Die Ascites-Flüssigkeit enthielt 40 Millionen Zellen/ml. Die Testansätze bestanden aus jeweils 0,5,1,0 und 5,0^g Phäophorbid a/ml, 6 Millionen Zellen/ml und 0,2, 0,4 bzw. 1,0% und 94%igem, unvergälltem Ethanol als Lösungsvermittler. In einem Kontrollansatz wurde ebenfalls eine gleichartige Zellsuspension aber ohne Phäophorbid a in Petrischalen bestrahlt.

Von den Testansätzen wurden jeweils 10,0 ml entnommen und in Petrischalen (Durchmesser 9,0 cm) in einem Abstand von 10 bis 11 cm mit 2 Leuchtstoffröhren NARVA UVS 40/2 10 min. bestrahlt. Die bestrahlten Testänsätze wurden mit einer Injektionsspritze aufgezogen und jeweils 10 Tieren (ICR Mäuse, weiblich, Körpermasse 24,0 ± 1,0g) 0,2ml dieser Lösung intracutan ventral appliziert. Sieben Tage nach Applikation wurden die Tiere mittels Chloroform getötet und die an der Injektionsstelle gebildeten Tumore sorgfältig herauspräpariert und deren Feuchtgewichte auf einer Präzisionswaage ermittelt.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt, zusammen mit dem Ergebnis des Versuches, bei dem keine Applikation von Phäophorbid a erfolgte.

4'. Zur Überprüfung der antitumorösen Wirksamkeit von Phäophorbid a in vivo wurde dem gleichen Tiermaterial 0,2 ml einer Ehrlich-Ascites-Carcinom-Zellsuspension (6 Mio/ml) 24Std: nach der Rasur intracutan lateral appliziert. Nach 24Std. erhielten die Tiere 0,2ml/20,0g Körpermasse intraperitoneal Testsubstanz injiziert.

Unmittelbar danach wurden 10 Tiere aus 10cm Entfernung mit dem unter 5. bezeichneten UV Α-Brenner 10min bestrahlt. Diese Behandlung wurde alle 24Std. wiederholt. 8 Tage nach Gabe der Zellsuspension wurde das Tumorwachstum wie unter 5. beschrieben ermittelt.

Die eingesetzten Dosierungen und Ergebnisse sind Tabelle 2 zu entnehmen. Es ist ersichtlich, daß unter Einsatz von Phäophorbid a eine mit Cyclophosphamid vergleichbare antitumoröse Wirkung erreicht werden kann.

Die erfindungsgemäßen Substanzen können die üblichen Formulierungen, z. B. in ein oral verabreichbares Mittel, wie eine flüssige Zubereitung, Pulver, Granulat, Pillen oder Tabletten, in eine injizierbare und instillierbare Formulierung, in Kissen bzw. Briefchen sowie Stifte, übergeführt werden unter Verwendung inerter, nicht-toxischer pharmazeutisch geeigneter Trägerstoffe und Verdünnungsmittel.

Die erfindungsgemäßen Substanzen können ebenfalls eingearbeitet in Nahrungsmittel und Nahrungsmittelzusätze, Futter- und Futtermittelzusätze, Trinkwasser, Getränke u. a. Waren bzw. Gegenstände, die vom Körper des Menschen und Tieres aufgenommen werden.

Die pharmazeutischen Zubereitungen können die erfindungsgemäßen Substanzen entsprechend ihrer Form und Art der Verabreichung in unterschiedlichen Mengen enthalten. So kann die Zubereitung beispielsweise etwa 0,001 bis etwa 99Gew.-%, bevorzugt etwa 0,01 bis etwa 90Gew.-%, an erfindungsgemäßen Substanzen enthalten.

Die Zusammensetzung bzw. Zubereitung kann zur Behandlung einer Reihe von Hauterkrankungen, insbesondere Psoriasis vulgaris, genutzt werden. Ebenso kann sie zur Behandlung eines breiten Bereichs von Tumoren verwendet werden. Beispiele von Tumoren sind Magenkrebs, enterischer Krebs, Lungenkrebs, Brustkrebs, Gebärmutterkrebs, oesophageater Krebs bzw. Speiseröhrenkrebs, Zungenkrebs, Oberkieferkrebs, bösartiger Kropf, Hautkrebs, Harnblasenkrebs, Krebs des Gallengangs, Krebs der Parotis bar OhrsDeicheldrüse. bösartiaes Mfilannm.

Die Dosis der erfindungsgemäßen Substanzen ist nicht besonders beschränkt. Sie kann entsprechend der Art des zu behandelnden Falls und der Art der Verabreichung in geeigneter Weise gewählt werden. Bei lokaler Applikation zur Behandlung von Psoriasis vu Igaris hat es sich als vorteilhaft erwiesen, je Tag eine Behandlung mit 3,2 · 10"⁵M Phäophorbid in Waschöl unter Zusatz von 5% Salicylsäure durchzuführen.

Zur Behandlung von Tumoren reichen normalerweise 5mg/kg Körpergewicht/Tag aus. Trotzdem kann es in beiden Fällen gegebenenfalls erforderlich sein, von den genannten Mengen sowohl nach oben als auch nach unten abzuweichen. Die normale Dosis beträgt etwa 1 ^g bis etwa 1 000/xg/kg Körpergewicht/Tag.

Tabelle 1

Gruppe (Pha-Dosis)

Körpermasse ing

ζ. Beginn z. Ende

Tumorgew, in mg Mittelw. Streuung

Hemmung des Tumorwachstums Mittelw. Streuung

EAC-Zellen	10	25,0 ±1,0	.η	29,0 ±1,0	Körpermasse ing	z.Ende	208,0	99,0	—	0	—
unbehandelt					ζ. Beginn					-53,0
nurUVA	5	25,0 ±1,0		26,0 ± 2,0			152,0	55,0	41,0	36,0
bestrahlt	10	24,0 ±1,0		25,0 ±1,0		26,0 ±1,0	232,0	91,0	59,0	60,0
0,5^g/ml	10	23,0 ±1,0	10	26,0 ± 2,0	22,0 ± 2,0		90,0	46,0		30,0
1,0//,g/ml	10	24,0+1,0		25,0 ±1,0		25,0 ± 2,0	62,0	17,0		11,0
5,0μg/ml			10		23,0 ±1,0
Abkürzungen	a
Ph a = Phäophorbid		EAC = Ehrlich-Ascites-Carcinom				24,0 ± 2,0			Hemmung des
	Tabelle 2	10		22,0 ± 2,0				Tumorwachst, in
Gruppe			25,0 ±1,0	Tumorgew.	in mg	Mittelw.
(Pha-Dosis)	10	22,0 ±1,0		Mittelw.	Streuung		%
			25,0 ±2,0			0	Streuung
nurUVA	10	21,Od= 1,0
bestrahlt			26,0 ±1,0	300,0	81,0	0	27,0
physiol.	10	21,0 ±2,0
NaCI-Lsg.		294,0	86,0		29,0
Cycloph.				55,0
40 mg/kg
i.p.+ UVA	134,0	30,0	14,0	10,0
Img/kg
Ph a+ UVA	258,0	98,0	52,0	22,0
5 mg/kg
Ph a+ UV A	144,0	44,0	40,0	14,0
10 mg/kg
PH a+ UVA	181,0	49,0	16,0

Abkürzungen Ph a = Phäophorbid a Cycloph. = Cyclophosphamid

Claims

Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Hauterkrankungen, insbesondere Psoriasis vulgaris sowie von verschiedenen Tumoren, dadurch gekennzeichnet, daß pharmazeutische Zusammensetzungen, die als wirksame Substanz Phäophorbid a oder b oder deren pharmazeutisch annehmbare Salze oder ein Gemisch dieser Stoffe enthalten, gegebenenfalls zusammen mit Hilfs- oder Trägerstoffen in eine geeignete Applikationsform überführt werden.

Hierzu 1 Seite Zeichnung

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellu ng ei nesArnzeimittels zur Behandlung von Hauterkrankungen, inbesondere von Psoriasis, sowie zur Behandlung von verschiedenen Tomoren. Anwendungsgebiet ist die Humanmedizin.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es ist bekannt, daß Hauterkrankungen (beispielsweise Psoriasis vulgaris) durch den Einsatz der PUVA-Therapie behandelt werden können (J. A. Parrish u.a.: N. Engl. J. Med. 291 [1974] pp. 1 207-1 211). Dabei wird als Wirkungsprinzip der Ablauf fotodynamischer Prozesse genutzt. Als Sensibilisatoren werden Psoralene, insbesondere 8-Methoxypsoralen(8-MOP) eingesetzt. Eine Verstärkung dertherapeutischen Wirkung wird durch die zusätzliche Gabe von aromatischem Retinoid(Tigason) erzielt. (C. E.Orfanos: Retonoids. Advance in Basic Research and Therapy. Springer-Verlag, Berlin—Heidelberg—New York 1981). Die relevanten fotochemischen Prozesse werden in beiden Fällen durch UVA-Bestrahlung (320-400 nm) ausgelöst. Als Nachteile dieser bekannten Mittel sind die Strahlenbelastung der Patienten sowie die aufwendige Gewinnung von Psoralenen und Retinoid zu nennen.

Es ist bekannt, daß Porphyrine wirksame Fotosensibilisatoren sind. Insbesondere Porphyrine der Hämgruppe sind auf ihre fotosensibilisatorischen Eigenschaften hin gut untersucht (T.lto: Photochem. Photobiol. 34 [1981] pp.521-524; j. Moan u.a.: Photochem. Photobiol. 37 [1983] pp. 599-604). Zur Lokalisierung bzw. Behandlung "von verschiedenen Tumoren wird z.B. das Hämatoporphyrinderivat genutzt (W. J. M. van der Putten, M.J.C. van Gemert: Phys. Med. Biol.28 [1983] pp. 663-638; R.W.Henderson u.a.: Br. J. exp. Path. 61 [1980] pp.345-349). Weiterhin sind die antitumoröse Wirkung von Coproporphyrin III (Patent DE OS 2809093) und Protoporphyrin (US-Patent 4393071) bekannt. Die Gewinnung deraktiven Komponenten beinhaltet in beiden Fällen ein aufwendiges Verfahren.

Ebenso ist die fotosensibilisierende Wirkung von Phäophorbid a bekannt (S.Kimura, Y.Takahashi: J. Nutr. Sei. Vitaminol. 27 [1981] pp. 52-527). Die Nutzung dieses Faktes zu therapeutischen Zwecken ist den Verfassern jedoch nicht bekannt.

Ziel der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines Mittels zur Behandlung von Hauterkrankungen, u.a. Psoriasis, sowie verschiedener Tumore unter Herabsetzung der Nebenwirkungen. Dabei sollte der Einsatz des möglichst nichttoxischen Mittels als fotosensibilisator mit sichtbarem Licht (400-700 nm) realisiert werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Aufgabe der Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Herstellung eines Arnzeimittels zur Behandlung von Hauterkrankungen, insbesondere Psoriasis vulgaris sowie von verschiedenen Tumoren.

Überraschenderweise wurde gefunden, daß Phorbide sowie deren Salze und Gemische der Strukturformel (flehe Abb. 1), insbesondere jedoch Phäophorbid a pharmakologisch wertvolle Eigenschaften besitzen und als wirksamne Bestandteile von pharmazeutischen Zubereitungen für die Behandlung von Hauterkrankungen, insbesondere der Psoriasis, und als Mittel zur Behandlung von Tumoren eingesetzt werden können.