DE3337207C2

DE3337207C2 -

Info

Publication number: DE3337207C2
Application number: DE3337207A
Authority: DE
Inventors: Francarosa Baccichetti; Franco Padova It Bordin; Carlo Trieste It Bragadin Monti; Francesco Padova It Carlassare; Mario Trento It Cristofolini; Francesco Dall'acqua; Adriano Guiotto; Giovanni Padova It Pastorini; Giovanni Trento It Recchia; Giovanni Rodighiero; Paolo Rodighiero; Daniela Padova It Vedaldi
Original assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Current assignee: Consiglio Nazionale delle Richerche CNR
Priority date: 1982-10-18
Filing date: 1983-10-13
Publication date: 1991-12-19
Also published as: GB2128997B; US5001147A; IT8284148A0; ES8608523A1; ATA370383A; AU559082B2; JPH0633269B2; ES526910A0; FR2534585B1; AU2014183A; CH662566A5; ZA837585B; JPS59104387A; CA1228860A; DE3337207A1; FR2534585A1; GB8327200D0; IT1165797B; AT384810B; GB2128997A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-Methylangelicinen (winkelförmigen Furocumarinen), die frei von Psoralenen (linearen Furocumarinen) sind, und derart gewonnene 6-Methylangelicine. Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von 6-Alkylangelicinen zur Herstellung von Arzneimitteln zur Anwendung bei der photochemischen Therapie von Psoriasis und von anderen Hauterkrankungen, die durch eine zelluläre Hyperproliferation gekennzeichnet sind, sowie bei der photochemischen Therapie von Vitiligo und von Alopecia aerata.

Es ist allgemein bekannt, daß die photochemische Therapie von Psoriasis, Mycosis fungoides und anderen Hauterkrankungen, die durch eine zelluläre Hyperproliferation gekennzeichnet sind, durch die kombinierte Aktion von Psoralenen (bifunktionellen linearen Furocumarinen) und langwelligem-ultravioletten Licht erfolgt; diese Therapie ist auch unter der Bezeichnung PUVA (Zusammensetzung aus "Psoralene"+"UV-A-Licht" (320-400 mm)) bekannt (vgl. Parrish u. a., New England Journal of Medicine - 291, 1207, (1974)).

Bei dieser Behandlung wird die Eigenschaft der Psoralene genutzt, die darin besteht, eine lichtschädigende, selektive Wirkung auf die zelluläre Haut-DNS zu haben.

Die proliferationshemmende Aktivität beruht auf den mono- und bifunktionellen Schädigungen der DNS (im zweiten Falle hängt dies mit den Querverbindungen zwischen den Strängen zusammen, die zwischen zwei Basen bestehen, welche zu zwei komplementären Strängen des Makromoleküls gehören), die auf zellulärer Ebene durch die Psoralene hervorgerufen werden.

Ein weiteres Merkmal der Psoralene besteht darin, daß sie eine Hautpigmentierung verursachen können; auch in diesem Falle wird die Wirkung dank der kombinierten Aktion der Psoralene und des langwelligen UV-A-Lichts erzielt. Diese Eigenschaft wird bei der Therapie von Vitiligo oder Leukoderma verwendet (vgl. A.M. El Mofty "Depigmentierung und Psoralene", Pergamon Press, Oxford (1968).

Die PUVA-Therapie kann entweder durch orale Verabreichung oder durch lokale Applikation von Psoralenen und nachfolgender Bestrahlung mit UV-A-Licht erfolgen.

Diese Therapie wird als die wirksamste Behandlungsmethode für einige Arten von Posoriasis, für die Anfangsstadien von Mycosis fungoides und für Vitiligo angesehen; nichtsdestotrotz wurde eine Anzahl von Nebenwirkungen verzeichnet, darunter das Risiko von Hautkrebs (vgl. R.S. Stern u. a., "Risiko von Hautkarzinomen bei Patienten, die einer photochemischen Therapie gegen Psoriasis mit oraler Verabreichung von Methoxalen unterzogen wurden", New England Journal of Medicine, 300, 852 (1979)), das Risiko einer leberschädigenden Wirkung (vgl. H. Tronnier u. a., "Photochemische Therapie in der Dermatologie, in "Photochemotherapie: grundlegende Technik und Nebenwirkungen", Berichte aus der Deutsch-Schwedischen Tagung über Photomedizin in Oberursel, BRD, S. 71, 23.-25. April 1975, Hrsg. E.G. Jung, Schattauer Verlag, Stuttgart-New York, 1976) und von grauem Star (vgl. S. Lerman u. a., "Methode zum Nachweis von 8-Methoxypsoralenen in der Linse des Auges", Science 197, 1287 (1977)). Diese Risikofaktoren treten bei der oralen Verabreichung von Psoralenen auf.

Darüber hinaus besteht das Problem der Phototoxizität der Haut, das sich bei lokaler Applizierung von Psoralenen als besonders schwerwiegend erweist. Tatsächlich ist allgemein bekannt, daß auch sehr geringe Dosierungen von Psoralenen (1-5 µg/cm²) durch Photoinduktion die Erscheinung eines schmerzhaften und lästigen Hauterythems beim Menschen und beim Meerschweinchen verursachen; nach einigen Tagen folgt auf dieses Erythem eine dunkle Pigmentierung (vgl. Pathak u. a., "Biologische Bestimmung von natürlichem und synthetischem Furocumarin (Psoralene)", J. Inv. Dermatol., 32, 509 (1959)).

Einige Studien über dieses Thema scheinen darauf hinzudeuten, daß die Phototoxizität der Haut hauptsächlich auf den durch Photoinduktion hervorgerufenen bifunktionellen Läsionen der Hautzellen-DNS durch die Psoralene beruht (vgl. F. Dall′Acqua u. F. Bordin, "Jüngste Erkenntnisse über die photobiologischen Eigenschaften von Furocumarinen in den molekularen Grundlagen von Hauterkrankungen", Hrsg. M.A. Pathak und P. Chandra, Plenum, NY im Druck); darüber hinaus scheinen die Ergebnisse anderer Studien darauf hinzuweisen, daß auch die gentoxische Wirkung (gemessen an der mutagenen Aktivität), mit der der krebserregende Effekt von Psoralenen eindeutig in Verbindung steht, zum größten Teil den Querverbindungen zuzuschreiben ist (vgl. L. Dubertret u. a., "Psoralene in der Kosmetik und in der Dermatologie", Hrsg. J. Cahn u. a., Pergamon Press, 1981, S. 245).

Um diese unerwünschten Nebenwirkungen der Psoralene auszuschalten, sind einige monofunktionelle Furocumarine vorgeschlagen worden, d. h. Furocumarine, die nur monofunktionelle Lichtschädigung der zellulären DNS hervorrufen können. Es wurde insbesondere vorgeschlagen, Angelicinderivate mit einer oder mehreren Alkyl-Gruppen zu verwenden, mit dem Ziel, sowohl die Fähigkeit, mit der DNS eine Photoreaktion einzugehen, als auch die proliferationshemmende Wirkung zu verstärken. Die Alkyl-Gruppen wurden insbesondere in den Positionen 4, 5, 4′ und 5′ eingeführt.

Diese erfindungsgemäß zur Herstellung von Arzneimitteln zu verwendenden 6-Alkylangelicine haben die folgende allgemeine Formel (1′)

wobei R Alkyl ist, R₁, R₂, R₃ und R₅ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind, R₆ Wasserstoff, Alkyl, Hydroxymethyl, Acetoxymethyl, Methoxymethyl sowie Aminomethyl, Alkylaminomethyl, Dialkylaminomethyl oder eine Gruppe mit der Formel

ist, wobei R₇ und R₈ gleichzeitig Wasserstoff, Methyl oder Ethyl sind, frei oder als Salz.

Die auf diese Weise erhaltenen Alkylangelicine haben auch im Dunkeln eine starke Affinität gegenüber DNS gezeigt; sie bilden einen molekularen Komplex mit dem Makromolekül und induzieren für die nachfolgende Bestrahlung auf eine selektive und sehr wirkungsvolle Art monofunktionelle Lichtschädigungen der DNS und weisen ebenfalls eine starke proliferationshemmende Aktivität auf.

Diese bekannten Alkylangelicine, und insbesondere die Methylangelicine, haben bei lokaler Applikation eine starke Wirkung bei der Therapie von Psoriasis gezeigt. Gleichzeitig können sie praktisch keine Phototoxizität der Haut hervorrufen; darüber hinaus wurde nachgewiesen, daß ihre genschädigende Wirkung im allgemeinen geringer ist als die von Psoralenen (vgl. US-PS 43 12 883).

Dennoch ergaben sich bei der Herstellung dieser Verbindungen durch chemische Synthese einige Schwierigkeiten bezüglich der Erreichung von Reinheitsgraden, die nicht nur für Laborversuche über ihre proliferationshemmende Aktivität, sondern insbesondere auch für ihre klinischen Tests akzeptabel sind. Eigentlich beginnt die Synthese dieser Alkylangelicine bei den geeigneten O-Prenyl-Umbelliferonen, also den O-Monoalkylallyl- oder den O-Dialkylallyl-Umbelliferonen, oder O-Acyl-Umbelliferonen bei denen die Alkyl- oder Acylgruppe in die 8-Stellung umgelagert wird (Claisen oder Fries). Eine derartige Umlagerung ist nicht eindeutig, da sie nicht nur in der 8-Stellung, sondern auch in der 6-Stellung vorkommt. Die 6-Prenyl-Zwischenprodukte, also die 6-Monoalkylallyl- oder die 6-Dialkylallyl-Zwischenprodukte, oder 6-Acyl-Zwischenprodukte bilden im Laufe der nachfolgenden Syntheseschritte Alkylpsoralene (d. h. lineare Furocumarine), welche Isomere von Alkylangelicinen sind.

Berücksichtigt man die Tatsache, daß Methylpsoralene sehr gut Strangquerverbindungen bei der DNS verursachen können, kann ihre Anwesenheit in den Angelicinen, auch wenn sie nur in Spuren vorhanden sind, die photobiologischen und phototherapeutischen Eigenschaften dieser Angelicine weitgehend verändern. Besonders die Methylpsoralene zeigen eine starke Haut-phototoxische Wirkung (vgl. Rhodighiero u. a., Il Farmaco, "Photochemische und photobiologische Eigenschaften von 4,5′-Dimethylpsoralenen", Edizioni Scientifiche, 36, 648, 1981; G. Caporale u. a., "Haut-photosensibilisierende Wirkung einiger Methylpsoralene", Experimentia 23, 985 (167)).

Aus diesen Gründen beinhaltet die Synthese der obengenannten Alkylangelicine ein gezwungenermaßen sorgfältiges, langwieriges und aufwendiges Verfahren zur Trennung der benötigten 8-Allyl-Zwischenprodukte oder der 8-Acylumbelliferone von den entsprechenden 6-Isomeren.

Bei dieser Erfindung wird dieses Problem anhand eines Herstellungsverfahrens von psoralenfreien 6-Methylangelicinen mit der Formel (1) gelöst,

wobei R₁, R₂, R₃ und R₅ unabhängig voneinander entweder Wasserstoff oder Alkyl sind, R₆ ist Wasserstoff, Alkyl, Hydroxymethyl, Acetoxymethyl, Methoxymethyl sowie Aminomethyl, Alkylaminomethyl, Dialkylaminomethyl oder eine Gruppe der Formel

wobei R₇ und R₈ gleichzeitig Wasserstoff, Methyl oder Äthyl sind, und zwar frei oder als Salz, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in an sich bekannter Weise ein 6-Methyl-umbelliferon-O-Derivat mit der Formel (2)

bei dem R, R₁, R₂, R₃ die vorstehend erwähnten Bedeutungen haben und bei dem R₄ ein Acylrest mit der Formel

-CO-R₉

ist, bei dem R₉ eine Alkylgruppe ist, nach Fries umlagert, oder ein Allylrest mit der Formel

-CHR₁₀-CH=CHR₁₁

ist, wobei R₁₀ und R₁₁ unabhängig voneinander entweder Wasserstoff oder Alkyl sind, nach Claisen umlagert, wobei man die Verbindungen der Formel (3)

bzw. der Formel (4)

erhält.

Im Falle der Verbindung (3) wird dann mit Bromessigsäureethylester kondensiert, anschließend zur Säure hydrolisiert und daraufhin durch Essigsäureanhydrid und Natriumacetat cyclisiert, was ein 6-Methylangelicin mit der Formel (1) ergibt, bei dem R₅ Wasserstoff und R₆ eine Alkylgruppe ist. Eine analoge Reaktionsweise ist zur Herstellung von 3,4′-Dimethyl-6-ethyl-7′,8′-furocumarin (4,4′-Dimethyl-6-ethylangelicin) in I. Indian Chem. Soc. (1964), 641-642 beschrieben.

Im Falle der Verbindung (4) wird acetyliert, bromiert und in alkalischem Milieu cyclisiert, was zu einem 6-Methylangelicin mit der Formel (1) führt, wobei R₅ Alkyl und R₆ Wasserstoff oder Alkyl ist, oder, nachdem es davor ozonisiert und mit Wasserstoff und Katalysator in ein α,α-Alkyl-(8-cumarinyl)acetaldehyd reduziert worden ist, wird es in saurem Milieu cyclisiert, was zu einem 6-Methylangelicin mit der Formel (1) führt, bei dem R₅ Wasserstoff ist, und, wenn R₆ bei der Verbindung (1) Wasserstoff ist, wird es durch Behandlung mit Chlormethylmethyläther in das entsprechende 4′-Chlormethylangelicin überführt, was dann in die entsprechenden 4′-Hydroxymethyl-, 4′-Acetoxymethyl-, 4′-Aminomethyl-, 4′-Alkylaminomethyl-, 4′-Dialkylaminomethyl-, 4′-Aminoethoxymethyl- oder 4′-Dimethylaminoethoxymethyl oder 4′-Diethylaminoethoxymethyl-Derivate umgewandelt wird, und schließlich, um wasserlösliche Verbindungen zu erhalten, werden die Derivate, die die Aminogruppe enthalten, ob substituiert oder nicht, in die entsprechenden Hydrochloride überführt.

Die gemäß der Erfindung durch dieses Verfahren gewonnenen 6-Methylangelicine sind durch die allgemeine Formel (1)

gekennzeichnet, wobei R₁, R₂, R₃ und R₅ unabhängig voneinander entweder Wasserstoff oder Alkyl sind, R₆ Wasserstoff, Alkyl, Hydroxymethyl, Acetoxymethyl, Methoxymethyl sowie Aminomethyl, Alkylaminomethyl, Dialkylaminomethyl oder eine Gruppe mit der Formel

ist, wobei R₇ und R₈ gleichzeitig Wasserstoff, Methyl oder Ethyl sind, wobei die Verbindungen frei oder als Salz vorliegen.

Vorzugsweise werden die 6-Methylangelicine gemäß der Erfindung aus einer Gruppe ausgewählt, die 6-Methylangelicin, 6,5-Dimethylangelicin, 6,5′-Dimethylangelicin, 6,5,5′-Trimethylangelicin, 6,4,5′-Trimethylangelicin, 6,4-Dimethylangelicin, 6,4′-Dimethylangelicin, 6,5,4′-Trimethylangelicin und 6,4,4′-Trimethylangelicin, umfaßt.

Im wesentlichen werden die 6-Methylangelicine gemäß der vorliegenden Erfindung ausgehend von einem Umbelliferon gewonnen, bei dem die 6-Position bereits durch eine Methylgruppe substituiert ist; auf diese Art können die 7-Allyloxy- oder 7-Acyloxy-umbelliferon-Zwischenprodukte durch Umlagerung der Allyl- oder Acylgruppe nur die 8-Acylderivate bilden. Demnach ist die Anwesenheit von Psoralenen, auch nur von Spuren davon, während der nachfolgenden Syntheseschritte absolut ausgeschlossen.

Synthese der 6-Methylangelicine

Die vorliegende Erfindung ist nachfolgend anhand der untenstehenden Beispiele näher erklärt. Wenn nicht anders erwähnt, beziehen sich die Mengen- und Prozentangaben auf das Gewicht.

Beispiel 1

Eine Mischung von 2,4-Dihydroxytoluol (18,7 g), Monohydroxybernsteinsäure (18,7 g) und konzentrierter H₂SO₄ (37 ml) wurde gelinde erwärmt, bis die Gasentwicklung fast aufhörte. Die hochrote Reaktionsmischung wurde dann unter kräftigem Umrühren in kochendes Wasser (300 ml) gegossen und die Suspension weiter gerührt bis die gummiartige Masse, die sich anfänglich gebildet hatte, vollständig dispergiert war. Der feste Stoff wurde abfiltriert getrocknet und aus reinem Ethanol kristallisiert, wodurch man 6-Methyl-7-hydroxycumarin(1) (14,5 g; Schmelzpunkt 253-4°C mit Zers.) erhielt.

Beispiel 2

Auf eine ähnliche Weise wie im Beispiel 1 beschrieben, erhielt man ausgehend von 3,5-Dihydroxy-2-methyltoluol (9,6 g) das 5,6-Dimethyl-7-hydroxycumarin (II), kristallisiert aus Methanol (8,5 g; Schmelzpunkt 262°C mit Zers.)

Beispiel 3

Eine Lösung von 2,4-Dihydroxytoluol (10,0 g) in Essigester (12 ml) wurde in kleinen Mengen in konzentrierte H₂SO₄ (26 ml) gegossen und im Eisbad abgekühlt. Nach vollendeter Beimischung wurde der erhaltene feste Stoff abfiltriert, mehrmals mit Wasser neutral gewaschen, getrocknet und aus MeOH kristallisiert, wodurch man 4,6-Dimethyl-7-hydroxycumarin (III) (10,64 g; Schmelzpunkt 273°C) erhielt.

Beispiel 4

Eine Mischung von 6-Methyl-hydroxycumarin (I) (14,5 g), wasserfreiem K₂CO₃ (5 g), Allylbromid (15 ml) und Aceton (100 ml) wurde 12 Stunden lang unter Umrühren unter Rückfluß erhitzt. Der feste Stoff wurde abfiltriert und mehrere Male mit Aceton gewaschen. Die Acetonlösung und die vereinigten Waschflüssigkeiten wurden bis zur Trockene konzentriert und der Rückstand aus MeOH kristallisiert, wodurch man 6-Methyl-7-allyl-oxycumarin (IV) (11,4 g; Schmelzpunkt 124-5°C) gewann.

Beispiele 5-6

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 4 beschrieben, erhielt man aus 5,6-Dimethyl-7-hydroxycumarin (II) (5,0 g) 5,6-Dimethyl-7-allyloxycumarin (V), kristallisiert aus MeOH (3,8 g; Schmelzpunkt 123°C).

Aus 4,6-Dimethyl-7-hydroxycumarin (III) (9,6 g) erhielt man 4,6-Dimethyl-7-allyloxycumarin (VI), kristallisiert aus MeOH (10,0 g; Schmelzpunkt 134°C).

Beispiel 7

Eine Lösung 6-Methyl-7-hydroxycumarin (IV) (11,4 g) in Diethylanilin (80 ml) wird 2 Stunden lang unter Zurückfluß erhitzt. Nach Abkühlen der Lösung wurde diese mit n-Hexan verdünnt (500 ml) und ergab einen Niederschlag, der durch Filtern abgefangen, mehrere Male mit n-Hexan gewaschen und aus EtOAc kristallisiert wurde, wodurch man 6-Methyl-7-hydroxy-8-allyl-cumarin (VII) (6,3 g; Schmelzpunkt 161-2°C) gewann.

Beispiele 8-9

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 7 beschrieben, erhielt man aus 5,6-Dimethyl-7-allyloxycumarin (V) (2,0 g) 5,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (VIII), kristallisiert aus EtOAc/Cyclohexan (1,2 g; Schmelzpunkt 169-70°C).

Aus 4,6-Dimethyl-7-allyloxycumarin (VI) (9,5 g) erhielt man 4,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (IX), kristallisiert aus EtOAc/Cyklohexan (6,2 g; Schmelzpunkt 179-80°C).

Beispiel 10

Um die Alkylangelicine mit einer Alkylgruppe an dem Furanring herzustellen wurden die 8-Allylcumarine acetyliert und bromiert, wodurch man 8-(2′,3′-Dibrompropyl)-Derivate erhielt, die anschließend mit Ethanol-KOH cyclisiert wurden, um die entsprechenden 5′-Methylangelicine zu gewinnen.

Auf diese Weise ließ man eine Mischung von 6-Methyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (VII) (6,3 g), wasserfreiem Natriumacetat (1,5 g) und Acetanhydrid (40 ml) eine Stunde unter Rückfluß kochen. Die Reaktionsmischung wurde vorsichtig mit Wasser (40 ml) verdünnt, 10 Min. unter Rückfluß gekocht und anschließend in Wasser (300 ml) gegossen, wodurch sich ein Niederschlag ergab, der abfiltriert und mehrere Male mit Wasser gewaschen wurde. Das trockene Produkt wurde aus MeOH kristallisiert und ergab 6-Methyl-7-acetoxy-8-allylcumarin (X) (6,1 g; Schmelzpunkt 110-11°C).

Beispiele 11-12

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 10 beschrieben, erhielt man ausgehend von 5,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (VII) (2,5 g) 5,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-allylcumarin (XI), kristallisiert aus MeOH (2,2 g; Schmelzpunkt 148-9°C);

Aus 4,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (IX) (3 g) erhielt man 4,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-allylcumarin (XII), kristallisiert aus MeOH (2,4 g; Schmelzpunkt 139-140°C).

Beispiel 13

Einer Lösung von 6-Methyl-7-acetoxy-8-allylcumarin (X) (7 g) in 100 ml Essigsäure wurde 50 ml Essigsäure die die stöchiometrische Menge Brom enthielt, bei Raumtemperatur tropfenweise beigemischt.

Nach Beendigung der Beimengung, wurde die Lösung 30 Minuten lang gerührt, das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft und der feste Rückstand aus MeOH kristallisiert, was das 6-Methyl-7-acetoxy-8-(2′,3′-dibrompropyl)cumarin (XIII) (6,8 g; Schmelzpunkt 154-5°C) ergab.

Beispiele 14-15

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 13 beschrieben, wurde aus 5,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-allylcumarin (XI) (2,6 g) 5,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-(2′,3′-dibrompropyl)cumarin (XIV) gewonnen, (2,1 g; Schmelzpunkt 168-9°C) kristallisiert aus MeOH.

Aus 4,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-allylcumarin (XII) (2,3 g) erhielt man 4,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-(2′,3′-dibrompropyl)cumarin (XV), kristallisiert aus MeOH (1,5 g; Schmelzpunkt 135-137°C).

Beispiel 16

Eine Lösung von 6-Methyl-7-acetoxy-8-(2′,3′-dibrompropyl)cumarin (XIII) (1,5 g) in 100 ml Ethanol mischte man eine 4% KOH-Ethanollösung bei, entsprechend einem Cumarin/KOH-Molverhältnis von 1 : 10. Man ließ die Mischung 80 Minuten lang im Dunkeln unter Rückfluß kochen, dann wurde sie abgeschreckt, mit H₂O (200 ml) verdünnt und mit verdünntem HCl angesäuert. Der dadurch erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, mit H₂O gewaschen, getrocknet und auf einer Silikagelsäule durch Eluierung mit CHCl₃ chromatographiert, wodurch man das 6,5′-Dimethylangelicin (XVI) erhielt, kristallisiert aus MeOH (0,52 g; Schmelzpunkt 175-6°C).

Beispiele 17-18

Auf eine ähnliche Weise wie im Beispiel 16 beschrieben, erhielt man ausgehend von 5,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-(2′,3′-dibromprpyl)cumarin (XIV) (1,07 g) 6,5,5′-Trimethylangelizin (XVII), kristallisiert aus MeOH (0,38 g; Schmelzpunkt 204-5°C).

Aus 4,6-Dimethyl-7-acetoxy-8-(2′,3′-dibrompropyl)cumarin (XV) (2,1 g) gewann man 6,4,5′-Trimethylangelicin (XVIII), kristallisiert aus MeOH (0,62 g; Schmelzpunkt 183°C).

Beispiel 19

Das nachfolgend beschriebene Verfahren wird zur Herstellung von 6-Methylangelicinen ohne Alkylgruppen an dem Furanring verwendet. Die 8-Allyl-Derivate der Cumarine (VII), (VII), (IX) wurden ozonisiert und dann reduziert, wodurch man die 8-Cumarinylacetaldehyde erhält, die anschließend mit 85% H₃PO₄ cyklisiert wurden.

Das 6-Methyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (VII) (1,7 g) wurde in Essigester (150 ml) gelöst und durch diese Lösung, die im Eisbad abgekühlt wurde, ein Strom ozonisierten Sauerstoff durchgeperlt, bis man 1,1mal die stöchiometrische Menge Ozon erreichte. Daraufhin wurde die Lösung sofort in Gegenwart von 10%igem Pd auf CaCO₃ (0,3 g) hydriert und die Mischung gerührt bis die schnelle Absorption von Wasserstoff aufhörte. Den Katalysator entfernte man durch Filtern, das Lösungsmittel wurde bei reduziertem Druck verdampft und der Rückstand mit 85%igem H₃PO₄ (60 ml) behandelt. Die Reaktionsmischung wurde daraufhin in ein thermostatisches Bad bei 100°C für 20 Minuten gelegt, gekühlt, mit H₂O (200 ml) verdünnt und mit CHCl₃ extrahiert. Aus der mit Na₂SO₄ getrockneten organischen Phase wurde das Lösungsmittel unter reduziertem Druck verdampft und der Rest auf einer Silikagel-Säule durch Eluierung mit CHCl₃ chromatographiert wodurch man das 6-Methylangelicin (XIX), kristallisiert aus MeOH (0,18 g; Schmelzpunkt 164-5°C) erhielt.

Beispiele 20-21

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 19 beschrieben erhielt man aus 5,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (VII) (2,0 g) das 6,5-Dimethylangelicin (XX), kristallisiert aus MeOH (0,21 g; Schmelzpunkt 219-20°C).

Aus 4,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-allylcumarin (IX) (3,2 g) erhielt man das 6,4-Dimethylangelicin (XXI), kristallisiert aus MeOH (0,42 g; Schmelzpunkt 150-1°C).

Beispiel 22

Um die 6-Methylangelicine mit einer Alkylgruppe in der 4′-Position an dem Furanring herzustellen, wurden die geeigneten Umbelliferone (I), (II), (III) acetyliert und die 7-Acetoxycumarine, die man auf diese Weise erhielt, wurden nach Fries umgelagert. Die 8-Acetyl-umbelliferone wurden in die Ethylester der 7-(8-Acetylcumarinyl)oxyessigsäuren überführt, die daraufhin hydrolisiert und cycklisiert wurden, wodurch man die gewünschten 4′-Methylangelicine gewann. Auf eine solche Weise ließ man eine Mischung aus 6-Methyl-7-hydroxycumarin (I) (10,0 g), Acetanhydrid (40 ml) und wasserfreiem AcONa (4,0 g) eine Stunde lang unter Rückfluß kochen. Der Reaktionsmischung mengte man vorsichtig das gleiche Volumen H₂O bei und ließ das Ganze 10 Minuten lang unter Rückfluß kochen. Die Mischung wurde mit H₂O (300 ml) verdünnt, abgekühlt und der Niederschlag abfiltriert, dann mehrere Male mit H₂O gewaschen, getrocknet und aus MeOH kristallisiert, was das 6-Methyl-7-acetoxycumarin (XXII) (10,0 g; Schmelzpunkt 147°C) ergab.

Beispiele 23-24

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 22 beschrieben, bereitete man aus 5,6-Dimethyl-7-hydroxycumarin (II) (5,0 g) 5,6-Dimethyl-7-acetoxycumarin (XXIII) kristallisiert aus MeOH (4,6 g; Schmelzpunkt 206°C).

Aus 4,6-Dimethyl-7-hydroxycumarin (III) (8,0 g) erhielt man 4,6-Dimethyl-7-acetoxycumarin (XXIV), kristallisiert aus MeOH (7,8 g; Schmelzpunkt 160-1°C).

Beispiel 25

Eine Mischung aus 6-Methyl-7-acetoxycumarin (XXII) (2,0 g), wasserfreiem AlCl₃ (4,4 g) und NaCl (2,0 g) wurde bei 160-170°C anderthalb Stunden lang erwärmt. Nach Abkühlen der Reaktionsmischung zersetzte man diese mit verdünntem HCl (50 ml), ließ sie 10 Minuten lang unter Rückfluß kochen, goß sie in H₂O (200 ml) und extrahierte sie mit EtOAc. Die getrocknete organische Phase (Na₂SO₄) ergab bei Verdampfung des Lösungsmittels einen Rückstand, der aus MeOH kristallisiert wurde, was zum 6-Methyl-7-hydroxy-8-acetylcumarin (XXV) (1,1 g; Schmelzpunkt 170°C) führte.

Beispiel 26-27

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 25 beschrieben, erhielt man aus 5,6-Dimethyl-7-acetoxycumarin (XXIII) (3,0 g) 5,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-acetylcumarin (XXVI), kristallisiert aus EtOAc (0,95 g; Schmelzpunkt 216-8°C).

Aus 4,6-Dimethyl-7-acetoxycumarin (XXIV) (3 g) erhielt man 4,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-acetylcumarin (XXVII), kristallisiert aus MeOH (1,05 g; Schmelzpunkt 236-7°C).

Beispiel 28

Eine Mischung aus 6-Methyl-7-hydroxy-8-acetylcumarin (XXV) (1,8 g) und Bromessigester (3 ml) wurde in Aceton (50 ml) aufgelöst und in Gegenwart von wasserfreiem K₂CO₃ 3 Stunden lang unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlen wurde der feste Stoff abfiltriert und das Lösungsmittel bei reduziertem Druck verdampft. Der Rest wurde aus EtOAc/Cyklohexan kristallisiert, und der Ethylester der 7-(6-Methyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXVIII) (1,7 g; Schmelzpunkt 88-9°C) erhalten.

Beispiele 29-30

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 28 beschrieben wurde aus 5,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-acetylcumarin (XXVI) (1,4 g), der Ethylester der 7-(5,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXIX) gewonnen, die aus EtOAc/Cyklohexan kristallisiert wurde (0,8 g; Schmelzpunkt 109°C).

Aus 4,6-Dimethyl-7-hydroxy-8-acetylcumarin (XXVII) (3,2 g) erhält man den Ethylester von 7-(4,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXX), kristallisiert aus EtOAc/Cyklohexan (2,2 g; Schmelzpunkt 96-7°C).

Beispiel 31

Der Ethylester der 7-(6-Methyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXVIII) (1,8 g) wurde in einer Wasser-Methanollösung (1/1) von 5%igem KOH (70 ml) aufgelöst und die Lösung 15 Minuten lang im Dunkeln unter Rückfluß gekocht. Nach Abkühlung und Ansäuerung mit verdünntem HCl, wurde die Lösung mit H₂O (200 ml) verdünnt und der feste Niederschlag durch Filtern gewonnen, getrocknet und aus EtOAc/Cyklohexan kristallisiert, was die 7-(6-Methyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXXI) (1,1 g; Schmelzpunkt 196-7°C) ergab.

Beispiele 32-33

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 31 beschrieben, wurde aus dem Ethylester der 7-(5,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXIX) (1,7 g) die 7-(5,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXXII) gewonnen, kristallisiert aus MeOH (1,3 g; Schmelzpunkt 219-20°C).

Aus dem Äthylester der 7-(4,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXX; 1,9 g) erhielt man die 7-(4,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXXIII), kristallisiert aus EtOAc (1,35 g; Schmelzpunkt 184-6°C).

Beispiel 34

Man ließ eine Mischung aus 7-(6-Methyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXXI; 3,7 g), wasserfreiem AcONa (3 g) und Acetanhydrid (30 ml) eine Stunde lang unter Rückfluß kochen. Unter diesen Bedingungen wurde die Verbindung (XXXI) cyklisiert und dabei fast vollständig decarboxyliert. Der Mischung mengte man vorsichtig H₂O (30 ml) bei und ließ dann das Ganze abermals 10 Minuten unter Rückfluß kochen. Die abgekühlte Reaktionsmischung wurde mit H₂O (300 ml) verdünnt, durch NaHCO₃-Zugabe alkalisch gemacht und die Suspension mit EtOAc mehrere Male extrahiert. Aus der getrockneten organischen Phase (Na₂SO₄) ließ man das Lösemittel verdampfen und den Rückstand aus MeOH kristallisieren, wodurch man 6,4′-Dimethylangelicin (XXXIV) (2,1 g; Schmelzpunkt 156-7°C) erhielt.

Beispiele 35-36

Auf eine ähnliche Weise wie in Beispiel 34 beschrieben gewann man aus der 7-(5,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (XXXII) (2,2 g) das 6,5,4′-Trimethylangelicin (XXXV), kristallisiert aus MeOH (1,15 g; Schmelzpunkt 229°C).

Aus der 7-(4,6-Dimethyl-8-acetylcumarinyl)oxyessigsäure (CCCIII; 1,7 g) erhielt man das 6,4,4′-Trimethylangelicin (XXXVI), kristallisiert aus MeOH (0,85 g; Schmelzpunkt 201-2°C).

Untersuchung der pharmakologischen Eigenschaften der 6-Alkylangelicine

Die gemäß der Erfindung erhaltenen 6-Alkylangelicine stellen gegenüber den bekannten Alkylangelicinen einen nennenswerten technischen Fortschritt dar, und dies sowohl bezüglich ihrer therapeutischen Sicherheit, da sie absolut frei von Psoralenen sind, als auch bezüglich der Einfachheit ihrer Gewinnung.

In der Tat gewährleistet das absolute Fehlen von Psoralenen, daß die proliferationshemmende Wirkung nur monofunktionellen DNS-Läsionen zuzuschreiben ist, und gleichzeitig ermöglicht es die Erhaltung der Verbindung anhand eines schnelleren, einfacheren, weniger aufwendigen und wirksameren Verfahrens.

Fähigkeit der 6-Alkylangelicine, mit DNS eine Photoverbindung einzugehen

Die 6-Alkylangelicine weisen eine starke Affinität gegenüber DNS im Dunkeln auf, wobei sich molekulare Zwischenkomplexe bilden; darüber hinaus verbinden sich die durch Bestrahlung mit DNS verbundenen 6-Methylangelicine sehr stark mit dem Makromolekül und verursachen somit nur monofunktionelle Läsionen (Tabelle I).

Proliferationshemmende Wirkung der 6-Alkylangelicine bei präklinischen Versuchen

Die 6-Alkylangelicine zeigen eine starke proliferationshemmende Wirkung bei Ehrlich-Ascites-Tumorzellen (Tabelle II) und auf der Haut von Mäusen bezüglich ihrer hemmenden Wirkung auf die DNS-Synthese (Tabelle III). Diese Verbindungen können praktisch keine Phototoxizität auf der Haut bei Albino-Meerschweinchen hervorrufen (Tabelle II).

Tabelle I

Bindungsparameter von Komplexen aus 6-Alkylangelicinen und DNS und Geschwindigkeitskonstante ihrer Photoreaktionen mit dem Makromolekül

Tabelle II

Photobiologische Eigenschaften von 6-Alkylangelicinen

Tabelle III

Verhinderung der epidermalen DNS-Synthese bei lebenden Mäusen nach topischer Applikation (50 µg/cm²) der Verbindung und UV-A-Bestrahlung (9 J/cm²)a)

Fähigkeit zur Verursachung einer dunklen Hautpigmentierung beim Menschen

Die 6-Alkylangelicine sind in der Lage, eine dunkle Pigmentierung der Haut beim Menschen hervorzurufen, ohne aber dadurch bei therapeutischen Dosierungen Erytheme zu verursachen (Tabelle IV).

Tabelle IV

Ergebnisse der topischen Photochemotherapie unter Anwendung von 6-Alkylangelicinen bei Psoriasis-Patienten

Toxizität der 6-Alkylangelicine

Die 6-Alkylangelicine zeigen eine geringe Toxizität, geringer als die von 8-MOP (8-Methoxypsoralen), dem am häufigsten verwendeten Arzneimittel für die PUVA-Therapie. Die in Methylzellulosesuspension verabreichten 6,4′-Dimethylangelicine zeigen zum Beispiel eine akute Toxizität, die sich durch nachstehende Werte darstellen läßt, ausgedrückt in LD₅₀ bei Mäusen: per intraperitoneum 0,75 g/kg (0,3 g/kg für 8-MOP)
per os < 2 g/kg (0,75 g/kg für 8-MOP)

Therapeutische Wirkung der 6-Alkylangelicine

Die genschädigende Wirkung der 6-Alkylangelicine, im Sinne der mutationserregenden Wirkung, ist viel geringer als bei 8-MOP (Tabelle V).

Tabelle V

Mutationserregende Wirkung von 6-Alkylangelicinen bei E. coli WP2-uvr A bei Bestrahlung mit UV-A-Lichta)

Die therapeutische Wirksamkeit der zwei 6-Alkylangelicine, d. h. des 6,4′-Dimethylangelicins und des 6,4,4′-Trimethylangelicins, die aufgrund ihrer proliferationshemmenden Aktivität, ihrer geringen genschädigenden Wirkung und ihrer nicht vorhandenen Haut-Phototoxizität bei Meerschweinchen unter den verschiedenen neuen Verbindungen ausgewählt wurden, wurde dadurch getestet, daß man ihre Fähigkeit maß, Psoriasisläsionen bei verschiedenen Patienten zu heilen (siehe Tabelle IV).

Um eine vergleichende Bewertung zu ermöglichen, wurde auch die Wirksamkeit von 8-MOP (8-Methoxypsoralen), dem am häufigsten verwendeten Präparat für PUVA-Behandlungen, unter denselben Versuchsbedingungen getestet.

Bei den behandelten Patienten wurden verschiedene 4×4 cm große Bereiche der befallenen Haut verwendet:

a) Im ersten Bereich wurde eine Ethanollösung (0,1% W/V) der untersuchten Verbindung so lange appliziert, bis man eine Konzentration von 5 µg/cm² erreichte. Daraufhin ließ man sie durch die Körperwärme (oder durch einen warmen Luftstrom) verdampfen. Nach 20 Minuten wurde der Bereich mit einer Niederdruck-Quecksilber-Fluoreszenzlampe des Typs PUVA WALDMANN SYLVANIA F 15 T 8 bestrahlt, die ein Hochleistungs-UV-A-Licht ausstrahlte.
Die Bestrahlungsdosen bewegten sich zwischen 2,5 und 13 J/cm²; insbesondere betrug die Anfangsdosis 2,5 J/cm² und wurde allmählich bis auf 13 J/cm² je nach Hauttoleranz erhöht.
b) Auf einen zweiten Hautbereich wurde eine Ethanollösung von 8-Methoxypsoralen (8-MOP) bis zu einer Konzentration von 5 µg/cm² appliziert und der Bereich auf identische Weise wie unter Punkt a) beschrieben, bestrahlt.
c) Ein dritter Bereich wurde auf dieselbe Weise behandelt wie in a) beschrieben, jedoch nicht mit UV-A-Licht bestrahlt.
d) Ein vierter Bereich wurde wie in a) bestrahlt, dabei verwendete man dieselbe Dosis UV-A-Licht, jedoch keinerlei Verbindung.

Die Behandlung mit den zwei 6-Methylangelicinen wurde im allgemeinen 5mal in der Woche für 2 oder 3 Wochen weitergeführt. Eine gute Heilung der Psoriasisläsionen war im allgemeinen nach 9 Behandlungen zu beobachten, während im Falle der 8-MOP, der Heilungsgrad bei gleicher Behandlung eindeutig geringer war (ca. 80%). Hinzu kommt, daß erschien, daß die 6-Methylangelicine auf keinen Fall Hauterytheme verursachen konnten, selbst bei den Patienten, die unter Behandlung mit 8-MOP eine schwere phototoxische Reaktion aufgewiesen hatten.

Der mit den Angelicinderivaten behandelte Bereich bei dem keine Bestrahlung erfolgt war, zeigte keine Besserung, während der allein mit UV-A-Licht behandelte Bereich eine sehr geringe Besserung aufwies.

Während die 6,4′-Dimethylangelicine eine eindeutige dunkle Pigmentierung des behandelten Bereichs verursachten, schwächer jedoch als die unter denselben Bedingungen durch 8-MOP hervorgerufene, schien das 6,4,4′-Trimethylangelicin aktiver zu sein.

Die proliferationshemmenden Wirkungen wurden durch histologische Untersuchungen von Biopsieprüflingen der getesteten Bereiche kurz nach der Behandlung oder einen Monat später nachgewiesen.

Die starke Wirkung der gemäß dieser Erfindung hergestellten 6-Alkylangelicine, die sich in der Hemmung der epidermalen DNS-Synthese bei Mäusen nach oraler Verabreichung ausdrückt (siehe Tabelle VI), ermöglicht es, diese Verbindungen auch bei oraler Verabreichung beim Menschen und UV-A-Bestrahlung als wirksam zu erachten.

Folgende pharmakologische Zusammensetzungen können für die orale Verabreichung der 6-Alkylangelicine verwendet werden:

Kapseln
6-Alkylangelicin (Arzneimittel)
30 mg
Milchzucker (Verdünner)	70 bis 120 mg
Mg-Stearat (Gleitmittel)	1 bis 1,5 mg
Na-Laurylsulfat (Netzmittel)	1,5 mg

enthalten in einer üblichen harten oder weichen Gelatinekapsel.

Tabletten
6-Alkylangelicin (Arzneimittel)
30 mg
Milchzucker (Verdünner)	240 mg
Mg-Stearat (Gleitmittel)	2 mg
Maisstärke (Sprengmittel und Gleitmittel)	60 mg
Mikrokristalline Zellulose (Gleitmittel und Sprengmittel)	10 mg
Polyvinylpyrrolidon (Bindemittel)	3%
Na-Laurylsulfat (Netzmittel)	3 mg

eine oder mehrere Tabletten oder Kapseln je nach Körpergewicht, Alter und Geschlecht des Patienten, zur oralen Applikation zwei Stunden vor der Bestrahlung.

Tabelle VI

Hemmung der epidermalen DNS-Synthese bei Mäusen "in vivo" nach oraler Verabreichung der Verbindung (250 mg/kg) und UV-A-Bestrahlung (9 J/cm²)a)

Claims

1. 6-Methylangelicine der allgemeinen Formel wobei R₁, R₂, R₃ und R₅ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind, R₆ Wasserstoff, Alkyl, Hydroxymethyl, Acetoxymethyl, Methoxymethyl sowie Aminomethyl, Alkylaminomethyl, Dialkylaminomethyl oder eine Gruppe mit der Formel ist, wobei R₇ und R₈ gleichzeitig Wasserstoff, Methyl oder Ethyl sind, frei oder als Salz.

2. 6-Methylangelicine gemäß Anspruch 1, bestehend aus 6-Dimethylangelicin, wobei das zweite Methyl in der 3-, 4-, 5-, 4′- oder 5′-Stellung ist.

3. 6,5,5′-Trimethylangelicin (XVII).

4. 6,4,5′-Trimethylangelicin (XVIII).

5. 6,5,4′-Trimethylangelicin (XXXV).

6. 6,4,4′-Trimethylangelicin (XXXVI).

7. Verfahren zur Herstellung der 6-Methylangelicine gemäß Anspruch 1, indem man in an sich bekannter Weise

a) ein 6-Methylumbelliferon-O-derivat der allgemeinen Formel (2) wobei R₁, R₂, R₃ die vorstehend genannten Bedeutungen haben und R₄ ein Acylrest mit der Formel-CO-R₉ist, wobei R₉ ein Alkyl ist, nach Fries umlagert, wobei man eine Verbindung der allgemeinen Formel (3) erhält, in der R₁ bis R₉ die angegebenen Bedeutungen haben, diese Verbindungen mit Bromessigester kondensiert, anschließend zur Säure hydrolisiert und dann durch Acetanhydrid und Natriumacetat cyclisiert, wodurch man ein 6-Methylangelicin mit der allgemeinen Formel (1) erhält, wobei R₅ Wasserstoff und R₆ eine Alkylgruppe ist, oder
b) eine Verbindung der allgemeinen Formel (2) in der R₄ ein Allylrest ist, mit der Formel -CHR₁₀-CH=CHR₁₁wobei R₁₀ und R₁₁ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind, nach Claisen umlagert, wobei man Verbindungen der allgemeinen Formel (4) erhält,
- α) diese acetyliert, bromiert und in alkalischem Medium cyclisiert, wodurch man ein 6-Methylangelicin der allgemeinen Formel (1) erhält, wobei R₅ Alkyl und R₆ Wasserstoff oder Alkyl ist, oder
- β) diese erst ozonisiert und mittels Wasserstoff und Katalysator zum α,α-Alkyl(8-cumarinyl)acetaldehyd reduziert und anschließend in saurem Medium cyclisiert, wodurch man 6-Methylangelicine der allgemeinen Formel (1) erhält, wobei R₅ Wasserstoff ist,
und, wenn R₆ der Verbindung (1) Wasserstoff ist, die Verbindung (4) durch eine Behandlung mit Chlormethylmethylether in das entsprechende 4′-Chlormethylangelicin überführt, das daraufhin in die entsprechenden 4′-Hydroxymethyl-, 4′-Acetoxymethyl-, 4′-Aminomethyl-, 4′-Alkylaminomethyl-, 4′-Dialkylaminomethyl- oder 4′-Aminoethoxymethyl- oder 4′-Dimethylaminoethoxymethyl oder 4′-Diethylaminoethoxymethyl-Derivate überführt wird und schließlich, um wasserlösliche Verbindungen zu erhalten, die Derivate substituiert oder solche, die die Aminogruppe enthalten, in die entsprechenden Hydrochloride überführt.

8. Verwendung der 6-Alkylangelicine der allgemeinen Formel (1′), wobei R Alkyl ist, R₁, R₂, R₃ und R₅ unabhängig voneinander Wasserstoff oder Alkyl sind, R₆ Wasserstoff, Alkyl, Hydroxymethyl, Acetoxymethyl, Methoxymethyl sowie Aminomethyl, Alkylaminomethyl, Dialkylaminomethyl oder eine Gruppe mit der Formel ist, wobei R₇ und R₈ gleichzeitig Wasserstoff, Methyl oder Ethyl sind, frei oder als Salz, zur Herstellung von Arzneimitteln, zur Verwendung bei der Photochemotherapie von Psoriasis und von anderen Hauterkrankungen, die durch zelluläre Hyperproliferation gekennzeichnet sind, sowie von Vitiligo und Alopecia aerata.