DE2837295A1 - Monofunktionelle psoralenderivate und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents
Monofunktionelle psoralenderivate und sie enthaltende arzneimittelInfo
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- DE2837295A1 DE2837295A1 DE19782837295 DE2837295A DE2837295A1 DE 2837295 A1 DE2837295 A1 DE 2837295A1 DE 19782837295 DE19782837295 DE 19782837295 DE 2837295 A DE2837295 A DE 2837295A DE 2837295 A1 DE2837295 A1 DE 2837295A1
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
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- C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
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Description
VON KREISLER SCHÖNWAID ΜΞΥΞΡ FISHOLD
FUES VON KREISLER KELLER SELTING
PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973
Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln
Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln
Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln
Dipl.-Ing. G. Selting, Köln
5 KÖLN 1
DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
25. August 1978 AvK/Ax
Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR)
13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly-sur-Seine,Frankreich
13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly-sur-Seine,Frankreich
Monofunktionelle Psoralenderivate und sie enthaltende Arzneimittel
11/0791
Telefon: (02 21) 2345 41 - 4 - Telex: 8882307 dopa d - Telegramm: Dompatent Köln
Die Erfindung betrifft das Gebiet der Behandlung von Hautkrankheiten, insbesondere eine neue chemische Verbindung
und Arzneimittelzubereitungen für die Behandlung der Psoriasis, nämlich Psoriasis punctata, Herpes
simplex und Mycosis fungoides, mikrobielles Ekzem, Akne und allgemein benigne und maligne Hautwucherungen.
Die Psoriasis ist eine ziemlich häufige Dermatose unbekannter Ätiologie. Sie ist durch rote, mehr oder
weniger breite, scharf begrenzte Flecken, die von zahlreichen trockenen, spröden Schuppen bedeckt sind,
gekennzeichnet.
Zur Heilung dieser Krankheiten wurde kürzlich ein Verfahren entwickelt, das darin besteht, daß gewisse
Furocumarine (gewöhnlich als Psoralene bezeichnet) entweder oral oder örtlich verabreicht werden. Von den
aktiven Furocumarinen wird 8-Methoxypsoralen, das nachstehend
und im allgemeinen als 8-MOP bezeichnet wird, am häufigsten in Verbindung mit Bestrahlung mit nahem ·-
Ultraviolettlicht (etwa 365 nm) verwendet. Diese Behandlung ist als PUVA-Therapie bekannt.
Mit dieser Methode werden gute Resultate erzielt, jedoch weist sie sehr große Nachteile auf. Einer der
ernstesten Nachteile ist die mögliche Gefahr weiterer Verwicklungen, z.B. Hautkrebs, obwohl Hautkrebs bei
Patienten, die mit Psoralen behandelt worden sind, bisher nicht beobachtet wurde. Dieser Aspekt muß berücksichtigt
werden, da die Psoralene sehr starke mutationsauslösende Stoffe sind und einige Versuche
an Mäusen ergeben haben, daß (nach örtlicher oder lokaler Anwendung) Tumore bei 100% der Mäuse erzeugt
wurden (A.C. Griffin, R.E. Hakim und J. Knox, J.Invest.
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Dermatol. 31 (1958) 289-295). Über ähnliche Ergebnisse
wurde auch von F. Urbach, J.Invest. Dermatol. 32 (1959)
373-378, berichtet. Ein vollständigerer Versuch wurde an zwei Abkömmlingen von haarlosen Mäusen (JKH, haarlos,
und HRS/J/Anc, haarlos) durchgeführt. D.D. Greebe, R.D. Ley und R.J. M.Fry berichteten hierüber in
Photochem, and Photobiol. 25 (1977) 269-276 und bestätigten die starke krebserzeugende Wirkung von 8-MOP
in Kombination mit UV-Strahlung. Ergänzende Ergebnisse betreffend diesen krebserzeugenden Charakter von 8-MOP
werden nachstehend genannt=
Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, Produkte zu finden, die die vorstehend genannten Krankheiten ohne
die genannten Nachteile zu heilen vermögen.
Zusätzlich können Verbrennung oder Blasenbildung der Haut, Dermatose, Magenreizung, Nausea, Nervosität,
Schlaflosigkeit und Depressionen bei durchschnittlichen Dosen von 8-MOP auftreten. Siehe beispielsweise
"The Merck Index", 7. Aufl. S. 670, und M.A. Pathak, D.M. Kramer und T.B. Fitzpatrick (1974) in "Sunlight
and Man", herausgegeben von M.A. Pathak, L.C. Harber,
M. Seiji, A. Kukita, University Press, Tokyo, S. 335 bis 368.
Die letztgenannte Veröffentlichung gibt an, daß die Fähigkeit, Hautgewebe zu sensibilisieren, ein einzigartiges
Merkmal des Psoralenmoleküls der Formel
zu sein scheint.
Ergänzend wurde festgestellt, daß Psoralen und rnethylsubstituierte
Psoralenderivate (Substitution an den 4,4'-, 5'- und 8-Stellungen) sich als äußerst wirksame
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·- fr -
Photosensibilisatoren erwiesen. Substitution durch Methylreste oder andere Reste an der 3-Stellung vermindert
jedoch die Fähigkeit zur Photosensibilisierung erheblich.
Beispielsweise wurde festgestellt, daß Verbindungen wie 3,5',8-Trimethylpsoralen, 3-Methylpsoralen,
3,4,5',8-Tetramethylpsoralen, 3,4-Dibenzo-5,8-dimethylpsoralen,
3,4-Cyclohexeno-5·,8-dimethylpsoralen und
3-n-Butyl-4,5'-8-trimethylpsoralen inaktiv sind oder
nur eine sehr schwache Photosensibilität auslösen. Insbesondere wurde ein Psoralenderivat, z.B. 3-Carboäthoxypsoralen,
auf Grund seiner fehlenden Fähigkeit zur Photosensibilisierung als vollständig inaktiv
bezeichnet (Tabelle 2, S. 342).
Es wurde die Ansicht geäußert, daß die sensibilisierende Wirkung (in vivo und in vitro) einiger Furocumarine
auf Photoreaktionen mit den Pyrimidinbasen von Nucleinsäuren- zurückzuführen sei.
Wie die vorstehende Formel erkennen läßt, haben beispielsweise Furocumarine vom Psoralentyp zwei photoreaktive
Stellen, die 3,4- und 4·,5'-Doppelbindungen.
Unter der Einwirkung von Licht der Wellenlänge 365 nm werden Monoaddukte mit Pyrimidinen gebildet, d.h. es
entstehen C.-Cycloadditionsprodukte mit der 5,6-Doppelbindung
von Pyrimidin (2-4). Ferner werden DNA-Vernetzungsbrücken nach mehreren Methoden einschließlich
des Schmelz- und Renaturationsverlaufs (melting and renaturation pattern) von behandelter DNA nachgewiesen.
Es wird angenommen, daß die 3,4- und 4·,5'-Doppelbindüngen
der Psoralenderivate beide an der Eildung von Vernetzungsbrücken zwischen Pyrimidinen von entgegengesetzten
DNA-Strängen beteiligt sind.
Bis vor wenigen Jahren wurde allgemein angenommen, daß die von Psoralenen hervorgebrachten hauptsächlichen
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photosensibilisierenden Effekte ihrer Fähigkeit, Vernetzungsbrücken
in zellulärer DNA zu bilden, zuzuschreiben seien (Cole R.S.: "Light-induced Cross-linking of
DNA in the Presence of a Furocoumarin", Biochem. Biophys. Acta (Amst.) 217 (1970) 30-39).
Demzufolge wurde allgemein angenommen, daß es nicht möglich sein könnte, monofunktionelle, d.h. 3,4- oder
4',5f-substituierte Furocumarine plus UV-Strahlung für die Behandlung von Hautkrankheiten anzuwenden, da diese
Verbindungen keine Vernetzungsbrücken in DNA bilden.
Dies wurde durch üblicherweise angewandte Tests bestätigt, bei denen die Wirkung von Psoralenderivaten
auf Hautkrankheiten durch Beobachtung des Aussehens des Hauterythems nach Anwendung des Produkts plus
naher UV-Strahlung bewertet wurde. Das Fehlen eines Erythems galt als Beweis für- fehlende Aktivität. Tatsächlich
riefen einige der bekannten monofunktionellen Furocumarine kein Erythem hervor.
Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es möglieh
ist, monofunktionelle Derivate der Formel
(D
R2
worin R1 eine Carboxylgruppe der Formel -COOR3 oder
-CN ist, R2 für -H oder -CH3 und R3 für -H, -CH3 oder
-CH?-CH- steht, für die Behandlung von Hautkrankheiten
zu verwenden.
Von den Verbindungen, die dieser allgemeinen Formel entsprechen, ist das bevorzugte Psoralenderivat
3-Carboäthoxypsoralen (3-CPs), d°h. die Verbindung (I),
in der R1 für -COOCH2CH3 und R2 für H steht, ein
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- .fr-
photoaktives Produkt, das besonders gute Eigenschaften
bei der Behandlung von Hautkrankheiten, z.B. der Psoriasis oder der anderen vorstehend genannten Hautkrankheiten,
aufweist.
Die Erfindung umfaßt ferner neue Verbindungen der Formel
R2
in der R^. eine Carboxygruppe der Formel -COOR- oder
-Cn ist, R2 für -H oder -CH3 und R- für -H oder -CH3
steht.
Synthesen von Psoralenderivaten wurden bereits beschrieben, beispielsweise von Leonard R. Worden und Mitarb,
in Journal of Organic Chemistry 84 (Nr. 8), August 1969, S. 2311-2313.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Psoralen und ' seinen Derivaten wurde von Pierre Queval und Emile
Bisagni in Eur. J. Med. Chem - Chimica Therapeutica,
Mai-Juni 1974 - 9, Nr. 3, S. 335-340, beschrieben.
Das Verfahren zur Behandlung von Hautkrankheiten gemäß der Erfindung besteht darin, daß man eine wirksame
Menge einer Verbindung der Formel (I) oral oder örtlich verabreicht und den Patienten mit nahem UV-Licht
bestrahlt.
Es wurde nun gefunden, daß zur örtlichen Anwendung Salben oder Lösungen, die etwa 0,5 bis etwa 4% der
therapeutisch wirksamen Verbindung (auf Gewichtsbasis) enthalten, verwendet werden können. Bevorzugt werden
Konzentrationen von etwa 2% bis 4%. Insbesondere erwies
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sich eine Lösung oder Salbe, die etwa 2 Gew.-% der Verbindung enthält, als geeignet.
Alle üblicherweise verwendeten, dem Fachmann bekannten Träger oder Grundlagen können für die Lösungen oder
Salben gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele solcher Träger und Grundlagen werden von Schafer und
Mitarbeitern in Archiv, of Dermatology (1976) genannt.
Natürlich können die Verbindungen gemäß der Erfindung auch in andere Verbindungen, Lösungen oder Salben eingearbeitet
oder Duftstoffe, Farbstoffe oder Konservierungsmittel oder beliebige andere, üblicherweise verwendete
Verbindungen zugesetzt werden. Es ist ferner möglich, zwei oder mehr photosensibilisierende Mittel
zu kombinieren.
Für die orale Verabreichung werden Mengen zwischen etwa 1 mg und 2 mg pro kg des Körpergewichts des Patienten
besonders bevorzugt.
Wie bereits erwähnt, gehört zur Behandlungsmethode die Bestrahlung mit nahem UV-Licht mit einem Spektrum, das
die Wellenlänge 365 nm einschließt oder hauptsächlich daraus besteht. Wie nachstehend erläutert werden wird,
kann die kumulative Strahlendosis sehr hoch sein und
2 2
beispielsweise bis zu 10 J/cm oder 15 J/cm oder mehr
2 2
betragen. Eine Dosis von etwa -5 J/cm bis 15 J/cm führt bereits zu guten Ergebnissen, jedoch können auch
2
Dosen bis zu 20 J/cm kurzzeitig angewandt werden.
Dosen bis zu 20 J/cm kurzzeitig angewandt werden.
Es wurde bereits erwähnt, daß man allgemein der Ansicht war, daß die Bildung eines Erythems mit der therapeutischen
Wirksamkeit von Psoralenderivaten wie 8-MOP, die Vernetzungsbrücken in DNA zu bilden vermögen,
verknüpft ist.
Im Gegensatz hierzu wurde nun gefunden, daß die mono-
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funktionellen Derivate der Formel (I) nicht im geringsten - weder unmittelbar noch nachträglich oder verspätet
- ein Erythem hervorrufen. Keinerlei Hautschädigung wurde makroskopisch oder mikroskopisch bei
Patienten festgestellt. Es leuchtet dem Fachmann ohne weiteres ein, daß dies eine völlig einmalige Eigenschaft
für Verbindungen der Psoralengruppe ist. Außerdem umfaßt die Erfindung Verbindungen, die nicht die starke Gerbwirkung
zeigen, wie sie von 8-MOP hervorgebracht wird.
Unerwünschte kosmetische Nebenwirkungen sind somit nicht vorhanden. Diese Verbindungen sind somit von großem
Interesse, da sie im Gegensatz zu 8-MOP eine anschliessende Behandlung in kurzen Zeitabständen - beispielsweise
zweimal täglich - über längere Zeiträume ohne sonnenbrandartige Schädigungen der Haut gestatten. Kurze
Behandlungszwischenräume sind bei Verwendung von 8-MOP nicht angezeigt, da es heftige erythematöse Reaktionen
in der Haut verursachen kann.
Es ist ferner bekannt, daß ein Psoralenderivat wie 8-MOP
eine Verminderung der Zahl der Lymphozyten im zirkulierenden Blut im Verlauf einer Heilbehandlung hervorruft.
Bei Verwendung einer Verbindung (I) gemäß der Erfindung wurde eine solche Verringerung der Lymphozyten nicht
festgestellt.
Die überraschenden photosensibilislerenden Eigenschaften
der Verbindungen (I), auf denen die Erfindung beruht, werden bei Verwendung der Hefe Saccharomyces cerevisiae
erkennbar. Der biologische Test mit dieser Hefe erwies sich als besonders gut geeignet zum Nachweis der biologischen
Aktivität von neuen Chemikalien. Nachstehend werden die Daten gebracht, die dieses System betreffen.
Um die biologischen Wirkungen und die Heilung von Läsionen, die durch Verbindungen (I) gemäß der Erfindung
photoinduziert werden, zu ermitteln, wurden die Photo-
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reaktivität, die letalen und genetischen Wirkungen in
Hefe, die als eucariotisches Modellsystem von 3-CPs verwendet wurde, untersucht und mit denen von 8-MOP verglichen.
Es wurde gefunden, daß bifunktionelle Furocumarine, z.B. Psoralen oder 8-MOP, in der Auslösung
nuklearer Rückmutationen (his~ zu His+) wenigstens
zehnmal wirksamer sind als monofunktionelle Furocumarine (z.B. 3-CPs oder Angelicin) plus Licht von 365 nm (nahes
UV-Licht) oder UV-Licht von 254 nm '(weites UV) allein.
Ein Vergleich bei der gleichen Überlebensrate (10%) ergibt, daß monofunktionelle Furcumarine sehr wirksam
"petite" Mutationen des Zytoplasmas auslösen. 3CPs ist die reaktivste Verbindung. Die vorstehend genannten
bifunktionellen Furocumarine sind weniger wirksam in der Auslösung von "petite" Mutationen des Zytoplasmas
als die monofunktionellen Furocumarine under den gleichen Bedingungen. Im Vergleich zu Psoralen ist 8-MOP weniger
reaktionsfähig.
Hinsichtlich der Schädigung von nuklearer DNA wurde demzufolge angenommen, daß monofunktionelle Schädigung
leichter reparabel sein kann als bifunktionelle Schädigung. Diese Beobachtung ist wichtig angesichts der
weitgehend anerkannten Wechselbeziehung zwischen mutagener Wirkung von Chemikalien und ihrer Fähigkeit,
einen kanzerogenen Prozeß auszulösen.
Verwendete Materialien und angewandte Methoden Hefestämme
Ein Wildstamm 211-laM (29) von Saccharomyces cereviseae
wurde verwendet. Die folgenden Mutanten wurden davon gewonnen: S24-12c rad o „« mit mangelnder Exzisionsreparation
und S25-13b rad,, ., der wahrscheinlich auf
einem Rekombinations-Reparationsweg blockiert wird (blocked in a recombinational repair pathway). Ein
Doppelmutant S 2057NL-24 rad,., „n - radQ ,, Klon B, wurde
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durch Tetrad-Analyse eines diploiden Heterozygoten
erhalten ( -5
— ) .
rad2-20 +
Medien, Kultivierung und Behandlunqsbedinqungen,
Bestrahlungsmethode;
. Die verwendeten Medien und angewandten Kultivierungsbedingungen werden von D. Averbeck, E. Moustacchi in
Biochim. Biophys. Acta 395 (1975) 393-404 beschrieben.
10 Zellen/ml in Kochsalzlösung (0,9% NaCl) wurden 30 Minuten mit den Testverbindungen bei einer Endkonzentration
von Io ug/ml in Gegenwart von 1,2% Äthanol behandelt. Eine kugelförmige Quecksilberhochdrucklampe
"Philips HPW 125 Edison" mit maximaler Leistung bei einer Wellenlänge von 365 nm wurde verwendet. Die durch
2 Aktinometrie gemessene Strahlungsdosis betrug 10 J/m
pro Sekunde. Die folgende Anordnung wurde verwendet:
10 ml AktinometerlÖsung (oder Zellsuspension, gewöhnlich
1 χ 10 Zellen/ml), die mit einem Magnetrührer kontinuierlich gerührt wurden, wurden bei Raumtemperatur in
einer offenen Petrischale von 10 cm Durchmesser aus einem Abstand von 10 cm vom Mittelpunkt der waagerecht
angeordneten Lampe bestrahlt. Eine 2 mm dicke Pyrexglasscheibe (20 χ 25 cm) wurde in die Mitte des Lichtstrahls
gestellt, um UV-Licht mit Wellenlängen unter 340 nm herauszufiltern. Überhitzung wurde entweder
durch einen stetigen Druckluftstrom zwischen Lampe und
Glas oder durch ein Pyrexglas-Vvasserfilter von 3 cm
Gesamtdicke verhindert. Eine kumulative Strahlendosis wurde auf die gleiche Probe zur Einwirkung gebracht.
Nach jeder Dosis wurden 0,1 ml bestrahlte Zellsuspension
entnommen und verdünnt, worauf aliquote Teile plattiert wurden.
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Biochemische Messung der Photobindunq von 3-CPs und
8-MOP an Nucleinsäuren
Diese Bestimmungen wurden in vitro und in vivo durchgeführt. Nach der Methode von Musago und Rodighiero
(Photochem. Photobiol. 11 (1970) 27-35) und Dall''Acqua u.Mitarb., Z. Naturf. 24b (1969) 667-671) wurden 3 ml-Proben
von filtrierter ("Millipore SM5") Kalbsthymus-DNA (Sigma, Typ I) in einer Konzentration von 0,1% in
Phosphatpuffer (pH 7,0, 0,1 Mol) bei 365 nm in Gegenwart
von mit Tritium markiertem 3-CPs oder 8-MOP in verschiedenen Konzentrationen bestrahlt. Die Dicke der bestrahlten
Probe betrug 1 mm. Nach der Bestrahlung wurde die Lösung um einen Faktor von 2 verdünnt, worauf NaCl bis
zu einer Endkonzentration von 1 Mol zugesetzt wurde.
Die DNA wurde mit 2 Raumteilen kaltem reinem Äthanol ausgefällt. Die Proben wurden über Nacht in der Kälte
bei -200C gehalten. Die Fällung wurde dann durch dreimaliges
Zentrifugieren mit 3 ml 70%igem Äthanol gewaschen und erneut in 3 ml Wasser gelöst. Die DNA-Gewinnung
wurde durch Bestimmung der optischen Dichte der Lösung bei 260 nm geprüft.
Die Radioaktivität eines aliquoten Teils (0,1 ml) dieser Lösung wurde in 5 ml Szintillationsgemisch (Nuclear
Enterprise, Ltd., Edinburgh, Schottland, Ne 250) gemessen.
Für die Bestimmungen in vivo wurden Zellen aus der stationären Phase des haploiden Wildstamms Nl23 in der
bereits beschriebenen Weise hergestellt. Eine Minute vor der Bestrahlung wurde eine gegebene Menge von radioaktiv
markiertem 3-CPs oder 8-MOP zu 2 ml Zellsuspension
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mit 5 χ 10 Zellen/ml gegeben. Die Endkonzentrationen von 8-MOP und 3-CPs sind nachstehend in den Tabellen 1 und 2 genannt.
mit 5 χ 10 Zellen/ml gegeben. Die Endkonzentrationen von 8-MOP und 3-CPs sind nachstehend in den Tabellen 1 und 2 genannt.
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Tabel | le 1 | an DNA | 67.75 | mit 5 χ | Hefe in | |
Bindunq vor | ι 3-14C-3-CPs | 5030.5 | χ 10"8 Aiq | 10~8 U£ | ||
vivo.- Die | an Nucleinsäuren von | Dosis von cpm für μg 365 nm-Licht 108 DNA in Erg mm""2 Zellen χ 104 |
9409 | qemessen. | ||
DNA-Menqe pro Zelle wurde | - | 11386.5 |
3-CPs^g
χ 10-2 |
|||
und die Menge RNA pro Zelle mit 250 | 6.3 | 15 650.2 | 0.05 | Moleküle 3- CPs/με DNA ir14 χ 10 |
||
a) Bindunq | 12.6 | 15307 | 3.9 | 0.012 | ||
Dauer der Behand lung, Min. |
18.9 | 14248 | 5.7 | 0.92 | ||
5-60 | 25.2 | 16476 | 9 | 1.34 | ||
5 | 38.8 | 12.3 | 2.1 | |||
10 | 50.4 | 1285 | 12 | 2.8 | ||
15 | 75.6 | 7130 | 11 | 2.8 | ||
20 | an RNA | 11040 | 10 | 2.6 | ||
30 | - | 14170 | 2.3 | |||
40 | 6.3 | 18780 | 0.01 | |||
60 | 12.6 | 25380 | 0.056 | 0,0023 | ||
b) Bindunq | 18.9 | 29240 | 0.086 | 0.0130 | ||
5-60 | 25.2 | 31730 | 0.11 | 0.020 | ||
5 | 37.8 | 0.15 | 0.026 . | |||
10 | 50.4 | 0.20 | 0.034 | |||
15 | 75.6 | 0.23 | 0.046 | |||
20 | 0.25 | 0.053 | ||||
30 | 0.058 | |||||
40 | ||||||
cn |
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• | - -J* - | 2837295 | Dosis von 365 nm- Licht in erg mm~2 χ 104 |
- | cpm für 10» Zellen |
μg 8-ΜΟΡ/μί DNA o χ 10" Δ |
r Moleküle 8-MOP/ug DNA χ ΙΟ1** |
Tabelle 2 | - | 18.9 | 404.75 | 0.126 | 0.034 | ||
Bindung | von H-8-M0P an Hefe-Nucleinsäuren in vivo | 18.9 | 37.8 | 1161 | 0.36 | 0.10 | |
a) Bindung an DNA | 37.8 | 75.6 | 1474 | 0.46 | 0.13 | ||
Behand lungs- dauer, Minuten |
75.6 . | 113.4 | 2805 | 0.86 | 0.24- | ||
15-120 | 113.4 | 151.2 | 5582 | 1.72 | 0.48 | ||
15 | 151.2 | 5572 | 1.72 | 0.48 | |||
30 | b) Bindung an RNA | ||||||
60 | 15-120 | 3805 | 0.12 | 0.033 | |||
90 | 15 | 7400 | 0.228 | 0.064 | |||
120 | 30 | 12920 | 0,40 | 0.11 | |||
60 | 23580 | 0.73 | 0.20 | ||||
90 | 34150 | 1.05 | 0.29 | ||||
120 | 44060 | 1.36 | 0.38 | ||||
Je 2 ml Zellsuspension wurden mit Licht von 365 nm in
mehreren Dosen bestrahlt. Gleichzeitig wurden unbestrahlte Proben während der gleichen Zeiträume bebrütet. Unmittelbar
nach der Bebrütung und/oder Bestrahlung wurden die Proben zentrifugiert. Das Sediment wurde dreimal mit
5 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl) gewaschen. Das gewaschene Zellpellet wurde erneut in 1 ml Kochsalzlösung suspendiert.
Der Suspension wurde 1 ml 2n-NaOH zugesetzt, um die RNA zu hydrolysieren. Die Suspension wurde üßer
Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur bebrütet und dann
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-W-
auf Eis gekühlt, worauf 2 ml 50%ige TCA langsam zugesetzt
wurden. Die Proben wurden 20 Minuten auf Eis gelassen, worauf die ausgefällte DNA auf einer Glasfaserfilter—
scheibe (Whatman GP/A, 2,1 cm Durchmesser) abfiltriert wurde. In einigen Fällen wurde das FiItrat, das das sau—
relösliche Material enthielt, beiseite gestellt. Die Radioaktivität eines zu 5 ml NE250~Szintillationsgernisch
gegebenen aliquoten Teils wurde gemessen. Die Fällung wurde dreimal mit 5 ml 5%igem kaltem TCA und 5 ml
70%igem Äthanol gewaschen. Die Filter wurden dann getrocknet,
worauf die Radioaktivität in Zählrohren aus Kunststoff, die 5 ml Szintillationsgemisch .(NE-250) enthielten,
in einem Tricarb-Packard-Szintillationsspektrophotometer gemessen wurde.
Messung der Schmelz- und Reassoziationseigenschaften
von Hefe-DNA
Hefe-DNA wurde isoliert und in einem CsCl-Gradienten
gemäß Williamson u.Mitarb. (Biochim. Biophys. Acta 238
(1971) 369-374) gereinigt. Die Fraktionen, die die nukleare DNA enthielten, wurden zusammengegeben und
gegen 0,1-molaren Phosphatpuffer von pH 7 dialysiert.
Verschiedene Mengen DNA (1 bis 30 ijg/ml) wurden mit
Licht von 365 nm in mehreren Dosen in Gegenwart oder Abwesenheit von 8-MOP bzw. 3-CPs in verschiedenen Kon—
zentrationen bestrahlt. Nicht bestrahlte Proben von DNA
mit oder ohne die Arzneimittel wurden als Bezugsproben genommen. Die Schmelz- und Reassoziationseigenschaften
wurden mit dem Meßgerät und dem Computerprogramm von Reiss und Michel (Anal. Biochem. 62 (1974) 499-508)
bestimmt, wobei die gleichen Methoden, die von den Verfassern beschrieben wurden, angewandt wurden.
A. Photobindung von 3-CPs an Nucleinsäuren 1) In vitro
Das Bindungsvermögen von 3—CPs an native Kalbsthymus-
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DNA nach Bestrahlung bei 365 nm ist im Vergleich zu 8-MOP in den Tabellen 3 und 4 genannt.
14
14 -5
Die Konzentration von 3- C-3-CPs betrug 6 χ 10 Mol.
Behandlungs- Dosis von dauer, 365 nm- Minuten Licht in erg mm~2 χ 10* |
18.9 | cpm/ /ig D |
0-60 Bebrütung | 37.8 | 0.21 |
15 | 56.7 | 3.29 |
30 | 75.6 | 4.25 |
45 | Tabel | 4.30 |
60 | 3.10 | |
Ie 4 |
/i?
3-CPs/
,ug DNA
Bindungsausbeute 3-CPs-Moleküle/
Nukleotid
Nukleotid
0.009 χ 10~3 1/88 χ 103
0.14 χ 10"3 1/5.6 χ 103 0.18 χ 10"3 1/4.4 χ J.03
0.18 χ 10~3 1/4.4 χ 103 0.13 χ 10~3 1/6.1 χ 103
Die Konzentration von 3H-8-MOP betrug 7,5 χ 10~5 Mol.
Behandlungsdauer,
Minuten
Minuten
Dosis von cpm/ ug 8-MOP/ 365 nm- .ug DNA Ajg DNA
Licht in ' '
erg cm
-2
Bindungsausbeute, 8-MOP-Moleküle/ Nukleotid
0-180 Bebrütung
30 37.8
60 75.6
90 113.4
120 151.2
180 226.8
0.24 0.031 * 10"4 1/1.8 χ ΙΟ4
56.3 7.3 χ 10
95.7 12.4 χ 10
118.8 15.4 χ ΙΟ"4
95.7 12.4 χ 10
118.8 15.4 χ ΙΟ"4
-4
131.5 17.1 χ 10
-4
198.5 25.8 χ 10
-4
1/900
1/532
1/428
1/386
1/256
1/532
1/428
1/386
1/256
Die Bindung der beiden Furocumarine (nur bei den Kontrollproben
beobachtet), die während der gleichen Zeitintervalle wie die entsprechenden bestrahlten Proben im
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Dunkeln gehalten wurden, war gering (O bis 6O-Minuten
Bebrütung im Dunkeln, Tabelle 3; 0 bis 180 Minuten Bebrütung im Dunkeln, Tabelle 4).
Die Bindung von 3-CPs steigt schnell mit den Dosen bis
2
3780 J/m und erreicht ein Plateau und nimmt anschliessend mit steigenden Dosen ab. Das gleiche ist bei 8-MOP der Fall, jedoch wird die Sättigung bei einer höheren Dosis erreicht. Trotz der hohen Konzentration (0,1% DNA wurden verwendet) liegt ein Überschuß von Furocumarinmolekülen vor, d.h. bei den höchsten Dosen von Licht der Wellenlänge 365 nm werden nicht alle Moleküle gebunden. Die Photoreaktivität von 3-CPs-mit nativer DNA ist etwa fünfmal niedriger als die von 8-MOP, gerechnet für den Anfangsteil der Photoreaktion.
3780 J/m und erreicht ein Plateau und nimmt anschliessend mit steigenden Dosen ab. Das gleiche ist bei 8-MOP der Fall, jedoch wird die Sättigung bei einer höheren Dosis erreicht. Trotz der hohen Konzentration (0,1% DNA wurden verwendet) liegt ein Überschuß von Furocumarinmolekülen vor, d.h. bei den höchsten Dosen von Licht der Wellenlänge 365 nm werden nicht alle Moleküle gebunden. Die Photoreaktivität von 3-CPs-mit nativer DNA ist etwa fünfmal niedriger als die von 8-MOP, gerechnet für den Anfangsteil der Photoreaktion.
2) In vivo
Die Bindungsfähigkeit von 3-CPs und 8-MOP an Hefe-Nucleinsäuren
nach Behandlung mit Licht von 365 nm ist in den Tabellen 1 und 2 genannt. Bei den Vergleichsproben,
die 50 Minuten im Dunkeln bebrütet wurden, ist die Bindung mit DNA bei 3-CPs vernacBilässigbar (etwa 10%),
bei 8-MOP jedoch stark (etwa 35%). Bei den beiden Verbindungen ist jedoch die Bindung mit RNA im Dunkeln
verhältnismäßig stark (20% bei 3-CPs und 50% bei 8-MOP).
Diese Prozentsätze beziehen sich auf die Bindung bei Kontrollproben, bezogen auf die bei der niedrigsten
Strahlendosis erhaltene Bindung.
Die Bindung von 3-CPs mit DNA und RNA steigt linear mit den Strahlendosen von 365 nm-Licht bis 25,2 χ 10 J/m
und flacht sich dann ab. Unter den angewandten Bedingungen ist die an DNA gebundene Menge von 3-CPs ungefähr
die gleiche wie die an RNA pro Zelle gebundene Menge. Die Werte in den Tabellen 1 und 3 zeigen eindeutig, daß
3-CPs in vitro und in vivo an DNA bindungsfähig ist.
Diese Bindung ist in vivo stärker als in vitro.
909811/0791
Wenn Zellen mit einer äquimolaren Konzentration von
8-MOP behandelt werden, steigt die Bindung mit DNA und RNA linear im Bereich der angewandten Lichtdosen. Die
an RNA gebundene Menge von 8-MOP ist ungefähr fünfmal höher als die an DNA gebundene Menge pro Zelle. Wie bei
3-CPs ist die Bindung von 8-MOP an DNa in vivo viel stärker als in vitro.
Wichtig ist die Feststellung, daß 3-CPs sich viel wirksamer als 8-MOP an DNA bindet. Der Unterschied in der
Photoreaktivität mit DNA liegt innerhalb eines Faktors von 20. Die Photoreaktivität mit RNA differiert jedoch
um einen Faktor von 3,4.
Trotz der hohen Affinität von 3-CPs zu zellulärer DNA
ist die Überlebensrate noch verhältnismäßig hoch im Vergleich zu derjenigen für 8-MOP. Beispielsweise ergibt
eine Bestrahlung von 5 Minuten bei der angewandten Konzentration 10 Überlebende bei 3-CPs und 10 Überlebende
bei 8-MOP. Dies bedeutet bereits, daß die durch 3-CPs plus 365 nm-Licht hervorgerufenen Läsionen weniger
bedeutungsvoll für die Abtötung von Zellen sind als die durch 8-MOP plus Licht hervorgerufenen Läsionen.
3) Verlauf der durch Hitze ausgelösten Denaturierung
und Reassoziation von Hefe-DNA, die in vitro mit
3-CPs bzw. 8-MOP plus Licht von 365 nm behandelt
wird.
Die Vernetzungsbrückenbildung der beiden Furocumarine mit nativer Hefe-DNA wurde durch Messung des Denaturierungs-
und Renaturierungsverlaufs getestet.
Es wurde nachgewiesen, daß in Gegenwart von 8-MOP plus
365 nm-Licht eine Fraktion der DNA zur Renaturierung fähig ist= Im Gegensatz hierzu wurde eine solche Reassoziation
im Falle von 3-CPs wenigstens im angewandten Bereich der Dosen und Konzentrationen nicht festgestellt.
Da diese Fähigkeit zur Renaturierung als Anzeichen für
909811/0791
die Anwesenheit von Vernetzungsbrücken zwischen zwei DNA-Strängen gewertet wird, konnte die Schlußfolgerung gezogen
werden, daß 3-CPs plus 365 nm-Licht keine Vernetzungsbrücken in DNA hervorruft.
Nach der Molekülstruktur von 3-CPs reagiert dieses Molekül höchstwahrscheinlich mit DNA durch monofunktionelle
Bindung.
B. Wirkungen von 365 nm-Licht allein oder 3-CPs, Aufnahme und Entfernung des Arzneimittels.
Da hohe Dosen von 365 nm-Licht erforderlich sind, um eine abtötende Wirkung in Saccharomyces-Zellen in Gegenwart
von 3-CPs hervorzurufen, wurden die Wirkungen von
2 365 nm-Licht allein bei Strahlendosen bis zu 7500 J/m
gemessen. Es wurde nachgewiesen, daß im Bereich der für biologische Versuche angewandten Dosen Licht der Wellenlänge
von 365 nm allein nur eine geringe letale Wirkung hatte. Unter Berücksichtigung der Standardfehler der
überlebenden Fraktion {_+ 10%) und der Tatsache, daß ein
Teil der Lichtenergie vom Arzneimittel selbst aufgenommen wird, wurde die Wirkung des 365 nm-Lichts allein
bei den Versuchen außeracht gelassen. Bei den Wildzellen und radq .-Zellen ist die abtötende und zytoplasmatische
"petite" Induktion nach Behandlung mit 10 ug/ml 3-CPs
plus einer konstanten Dosis von 365 nm-Licht unabhängig von der Bebrütungszeit mit dem Arzneimittel vor der
Bestrahlung innerhalb der Grenzen der statistischen Schwankung. Eine Bebrütungszeit von einer Minute übte
bereits ungefähr die maximale Wirkung aus. Es wurde nachgewiesen, daß bei den angewandten Dosen von 365 nm-Licht
nach dem Waschen keine sensibilisierende Wirkung eintritt. Demzufolge wurde diese Verbindung im Dunkeln sehr lose
gebunden.
Die von der Anmelderin durchgeführten Versuche zeigten, daß 3-CPs lichtempfindlich ist und daher gegen Licht
909811/0791
geschützt werden muß. Tatsächlich liefern die'Dünnschicht-
und Papierchromatographie sowie Fluoreszenzspektren von belichtetem 3-CPs in wäßrigen Lösungen den
Beweis der Anwesenheit eines stark fluoreszierenden Photoprodukts mit den Merkmalen von 4',5'-Dihydropsoralen.
Als Folge der Bildung eines oder mehrer solcher Photoprodukte stellte die Anmelderin eine Abnahme
der photobiologischen Aktivität von 3-CPs fest, wenn es vorher dem Licht ausgesetzt wird.
Es wurde ferner nachgewiesen, daß 3-CPs sich in vitro und in vivo (Tabellen 1 und 3) unter der Einwirkung von
Licht der Wellenlänge 365 nm an DNA bindet. Die Wirksamkeit dieser Bindung erweist sich in vivo als höher
als in vitro trotz der Tatsache, daß die Konzentration von DNA in jug/ml in vitro höher ist. Die Bedingungen
sind jedoch nicht streng vergleichbar, da anzunehmen ist, daß die Konfiguration und örtliche Konzentration
von DNA eine wichtige Rolle spielen. Ferner wird eine Stoffwechselaktivierung nicht völlig ausgeschlossen.
Ebenso wie andere photoaktive Furocumarine bindet sich
3-CPs nicht nur an DNA, sondern auch an RNA (Tabelle 3). Für 8-MOP macht die Photoreaktivität mit RNA 61 bis 87%
derjenigen mit DNA aus. Demzufolge ist auf molarer Basis die Photoaffinität von 3-CPs zu DNA viel höher als zu
RNA. Dieses Merkmal unterscheidet 3-CPs deutlich von 8-MOP, Psoralen und Angelicin.
Um die Photoaffinitäten von 3-CPs und 8-MOP zu DNA zu
vergleichen, müssen die folgenden Punkte berücksichtigt werden:
a) Furocumarine einschließlich 8-MOP binden sich bekanntlich
spezifisch an Pyrimidine. Aus der Struktur von 3-CPs läßt sich mit ziemlicher Sicherheit annehmen,
daß dieses Molekül in der gleichen Weise reagiert.
b) Die Gesamtzahl von Pyrimidinen pro haploides Hefe-
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- eer -
genom beträgt 2,1 χ 10 .
Bei einer Dosis von 18,9 χ 103 J/m2 und 5,10~5 Mol 8-MOP
oder 3-CPs werden 0,5 χ 10 Moleküle 8-MOP oder 10,5 χ 10 Moleküle 3-CPs an DNA pro Zelle gebunden. Im
Durchschnitt beträgt das Bindungsverhältnis 1 Molekül 8-MOP über 42 Pyrimidinbasen und 1 Molekül 3-CPs über
2 Pyrimidinbasen. Für 8-MOP ist dieses Verhältnis wahrscheinlich
zu niedrig geschätzt, da eine Fraktion der 8-MOP-Moleküle als Vernetzungsbrücken gebunden wird und
ein Verhältnis von 1 über 30 die tatsächliche Bindung wahrscheinlicher widerspiegelt. Im Vergleich zu 8-MOP
ist die Photoaffinität von 3-CPs zu DNA auffallend hoch. Im Vergleich zu 8-MOP wird etwa 15mal mehr 3-CPs an DNA
gebunden. Es sind jedoch noch andere Beispiele einer solchen hohen Photoreaktivität unter den Furocumarinderivaten
bekannt. Beispielsweise ist 4,5',8-Trimethylpsoralen
in vitro etwa 12mal reaktionsfähiger mit DNA als 8-MOP. Wenn diese Verbindung in vivo eine höhere
Photoreaktivität als in vitro hat, wie hier für 8-MOP und 3-CPs nachgewiesen, liegt die für 3-CPs in vivo
gefundene Photoreaktivität sicherlich im gleichen Bereich,
DNA, die Vernetzungsbrücken von Strang zu Strang enthält, zeichnet sich durch die Fähigkeit aus, sich nach
Denaturierung durch Hitze bei langsamem Abkühlen wieder zu naturieren. Fehlende Vernetzungsbrückenbildung ist
wenigstens in dem bei den Versuchen der Anmelderin angewendeten Bereich von'Dosen an der Unfähigkeit zu
erkennen, DNA, die vorher mit 3-CPs und 365 nm-Licht behandelt worden ist, zu renaturieren. Dies steht im
Gegensatz zu 8-MOP. 3-CPs weist demzufolge nur monofunktionelle Eigenschaften auf.
Bei den biologischen Versuchen zur Ermittlung der Aktivität von 3-CPs zeigen die Kontrollproben, daß der
Beitrag des 365 nm-Lichts allein zur Abtötung der Zellen
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vernachlässigbar ist. Es ist unwahrscheinlich, daß die geringe letale Wirkung bei Wildzellen auf durch 365 nm--Licht
induzierte Pyrimidindimere zurückzuführen istt da
a) ein für UV-Licht empfindlicher Mutant mit fehlender
Exzision, rad« 2n>
für 365' nm-Licht bis zu Dosen von
25,2 χ 103 J/m2 unempfindlich ist;
b) die hier angewandten Lichtdosen viel niedriger sind, als sie zur Induktion von Pyrimidindimeren bei
Escherichia coli erforderlich sind.
Andere bekannte Wirkungen von nahem UV-Licht, z.B. die Hemmung der Proteinsynthese in Hefe, können diese
Abtötung erklären.
In Saccharomyces wird 3-CPs ebenso leicht wie 8-MOP
aufgenommen und ausgewaschen. Unterschiede, die in den letalen Wirkungen der beiden Arzneimittel festgestellt
werden, sind nicht auf Unterschiede in der Aufnahme und Ausscheidung, sondern auf verschiedene Photoreaktivitäten
der beiden Arzneimittel zurückzuführen.
Für eine gegebene Überlebensrate folgt die doppelt logarithmische Darstellung der Konzentration von 3-CPs
in Abhängigkeit von der 365 nm-Lichtdosis einer linearen Funktion für Wildzellen und radg_4· Hieraus geht hervor,
daß es keine Reziprozität zwischen der Strahlendosis und der Konzentration des Arzneimittels für die Abtötung
der Zellen gibt. Eine Verminderung der Konzentration des Arzneimittels um einen Faktor von 10 beispielsweise
erfordert keine Steigerung der Lichtdosis um den gleichen Faktor, um eine gleiche Abtötungswirkung hervorzurufen.
Mit anderen Worten, der Wirkungsgrad der Aktivierung des Arzneimittels durch Licht steigt, wenn die
Konzentration vermindert wird. Bei hoher Konzentration von 3-CPs ist dies höchstwahrscheinlich entweder auf die
einen Abschirmeffekt hervorrufende Absorption des 365 nm-Lichts durch die ungebundenen i-ioleküle des Arz-
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neimittels und/oder auf die Bildung von photobiologisch inaktiven 3-CPs-Photoprodukten (siehe oben) zurückzu- ·
führen. Da der dosismodifizierende Faktor für rad„ .
(im Vergleich zum Wildtyp) konstant ist, kann die höhere Lichtempfindlichkeit des Mutanten nicht durch
einen Unterschied in der physikalischen Wechselwirkung zwischen Licht und Arzneimittel erklärt werden.
Vorstehend wurde dargelegt, daß die Zellen durch ein bifunktionelles Mittel wie 8-MOP stärker photosensibilisiert
werden als durch monofunktionelle Verbindungen wie 3-CPs oder Angelicin. Die Überlebensraten von 3-CPs
und 8-MOP unterscheiden sich durch einen Faktor von 6,
während die Photoreaktivität der beiden Arzneimittel mit DNA in vitro um den Faktor 4,8 (Tabelle 3) und in
vivo um den Faktor 15 differiert (siehe ooen). Mit anderen Worten, die Resistenz gegen die abtötende Wirkung
von 3-CPs im Vergleich zu derjenigen von 8-MOP ist viel höher, als aus der Photoreaktivität zu erwarten wäre.
Dieser Unterschied ist höchstwahrscheinlich auf die Anwesenheit von Vernetzungsbrücken in mit 8-MOP plus
365nm-Licht behandelten Zellen und darauf zurückzuführen, daß Monoadditionen sehr wirksam wiederhergestellt
werden. Tatsächlich wurde kürzlich an Escherichia coli nachgewiesen, daß dieser letztgenannte Typ von Läsionen
leicht behoben wird.
Vorstehend wurde dargelegt, daß 8-MOP und 3-CPs eine
verhältnismäßig geringe Photoaffinität zu RNA haben.
Angelicin bindet sich bekanntlich ebenso gut an DNA und RNA. Dies bedeutet, daß bei gleichen Konzentrationen der
drei Arzneimittel und gleichen Lichtdosen eine geringere Zahl von Angelicinmolekülen im Vergleich zu 8-MOP oder
3-CPs an DNA gebunden wird. Da die Größe der Schädigung von genetischem Material geringer ist, ist bei Angelicin
mit einer höheren Überlebensrate zu rechnen.
Der Unterschied in der Form der Überlebenskurven für
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die drei Verbindungen ist im Augenblick schwierig zu erklären. Die gezeigte Exponential-Überlebenskurve für 3-CPs
scheint jedoch kein allgemeines Merkmal von monofunktionellen Furocumarinen zu sein.
Eine synergistische Wechselwirkung zwischen dem von
rad- und rad» bestimmten Reparationsweg ist für Läsionen,
die durch 3 CPs plus 365 nm-Licht hervorgerufen werden,
festzustellen. Dies steht im Gegensatz zu 8-MOP, für das
eine additive Wechselwirkung gefunden wurde. Dies wurde dahingehend gedeutet, daß sie auf die"Reparation von
zwei verschiedenen Substraten, d.h. die Monoaddukte und die Vernetzungsbrücke, zurückzuführen sei. Der Synergismus,
der für durch 3-CPs plus Licht hervorgerufene Schädigungen festgestellt worden ist, läßt erkennen,
daß die beiden Reparationswege auf einen einzigen Läsionstyp einwirken, bei dem es sich höchstwahrscheinlich
um die induzierten Monoaddukte handelt.
Bei Agair-Halteversuchen (AHR) wurde nachgewiesen, daß
ein Stamm mit fehlender Exzision unfähig ist, eine Dunkelreparation von sowohl durch 3-CPs als auch 8-MOP verursachte
Schaden vorzunehmen. Ein Stamm mit mangelnder Rekombination hat eine verringerte Fähigkeit zur Reparation
von durch 3-CPS plus 365 nm-Licht verursachte Schaden. Hieraus ergibt sich, daß der Exzisions-Reparationsweg
bei Zellen vom Wildtyp und bei rad9_4-Zellen bei
AHR-Versuchen für beide Verbindungen wesentlich ist. Bei Wildzellen wird die gleiche Kinetik von AHR für 3-CPs,
8-MOP, Angelicin und Psoralen beobachtet. Dies bedeutet,
daß ein Läsionstyp,der gewöhnlich durch diese vier Verbindungen hervorgerufen wird (Monoaddukte), der Heilung
durch "agar-holding" (agar-holding recovery) unterliegt.
Ein systematischer In-vivo-Versuch wurde durchgeführt,
um eine mögliche kanzerogene Wirkung von Psoralen und bifunktionellen Psoralenderivaten wie 8-MOP mit 3-CPs
zu vergleichen.
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Diese Versuche wurden auf der Haut von Homozygot-Albinomäusen des Stamms XVII nc/Z (Institut du Radium
Orsay) durchgeführt, die ein besonders niedriges Verhältnis von spontanem Hauttumor (weniger als 0,05%)
aufweisen.
Für die Versuche wurden Gruppen von je 40 Mäusen, männlich und weiblich, verwendet.
Nach chronischer örtlicher Anwendung von Psoralen auf beide Ohren mit anschließender Bestrahlung mit UV-Licht
der Wellenlänge 365 nm zeigten die Tiere starke Kutanreaktionen
wie Erythem mit anschließender starker chronischer Entzündung, der sogar eine Nekrose"von mehr
oder weniger bedeutenden Teilen der behandelten Gewebe folgte.
Die Entwicklung von Tumoren auf den Ohren ist dosisabhängig. Nach 24 Anwendungen (kumulative Dosis
4,5 χ 105 J/m2) entw
Tumor auf den Ohren.
Tumor auf den Ohren.
5 2
4,5 χ 10 J/m ) entwickelten nur 3% der Tiere einen
4,5 χ 10 J/m ) entwickelten nur 3% der Tiere einen
Nach 115 örtlichen Anwendungen von Psoralen, auf die in jedem Fall eine Bestrahlung von 10 Minuten folgte
(kumulative Dosis 2,07 χ 10 J/m ) , entwickelten 100% der Tiere einen Tumor, wobei 50% der Tiere Tumore an
beiden Ohren hatten.
Die gleiche, mit 3-CPs durchgeführte Behandlung, d.h.
115 Anwendungen auf die beiden Ohren, 30 Minuten Ruhe und 10 Minuten Bestrahlung, ergab weder ein Erythem
noch eine Hautentzündung noch einen Tumor. Weder eine makroskopische noch eine mikroskopische Reaktion wurde
während der Beobachtungsdauer von 450 Tagen festgestellt, Kein Tier starb. 3-CPs wurde ferner intraperitoneal
getestet (36 Injektionen von je 0,4 mg über einen Zeitraum von 7 Wochen). Alle Tiere blieben am Leben ohne
jede Gewichtsabnahme oder andere Zeichen von Toxizität.
Da die klinische orale Dosis etwa 0,6 mg/kg beträgt,
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stellt die Dosis von 0,4 mg für die Mäuse etwa die 30fache Dosis dar, die üblicherweise dem Menschen
verabreicht wird.
Der wesentliche Vorteil der Verbindungen (I), insbesondere von 3-CPs, ist aus den vorstehenden Ergebnissen
eindeutig erkennbar.
I. Für Versuche mit 3-CPs an Patienten, die an Psoriasis litten, wurde diese Verbindung wie folgt hergestellt:
Ein Gemisch von 0,162 g (1,00 mMol) S-Forrnyl-G-hydroxybenzofuran,
hergestellt nach der Methode von L.R.Worden u.Mitarb. (Journal of Organic Chemistry, 84, Nr. 8,
August 1963, S. 2311-2313), und 2,0 ml absolutem Äthanol wurde zur Auflösung des Benzofurans erwärmt, worauf
0,18 ml (1,2 mMol) Diäthylmalonat und 0,03 ml Piperidin zugesetzt wurden, wobei Rotfärbung eintrat. Das Reaktionsgemisch
wurde 15 Minuten am Rückfluß erhitzt und der Abkühlung überlassen, worauf das Produkt kristallisierte.
Durch Filtration wurden 0,216 g (84%) orangefarbene Plättchen vom Schmelzpunkt 151 bis 152°C erhalten.
Durch zweimalige Umkristallxsation eines kleinen Teils aus Methanol für die Analyse wurden lange orangefarbene
Nadeln vom Schmelzpunkt 153 bis 154°C erhalten.
Berechnet für c 14 H 10 o 5 65,12 3,90
Gefunden: 65,04 4,22
Die Wirksamkeit des in dieser Weise hergestellten 3-CPs wurde an 10 Patienten mit gewöhnlicher Psoriasis, die
2
200 bis 400 cm Haut bedeckte, untersucht.
200 bis 400 cm Haut bedeckte, untersucht.
Herstellung von l%iger 3-CPs-Salbe; 1 g 3-CPs wurde zu
einem sehr feinen Pulver gemahlen und dann in 70 g "HYDROCERINE" (handelsübliches Produkt, hersteller ROC)
bei 700C dispergierto Bei 700C wurden 29 ml Wasser zuge-
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setzt, wobei eine Wasser-in-Öl-Emulsion gebildet wurde.
Die Salbe hatte somit die folgende Zusammensetzung:
Hydrocerin 70%
Wasser 29%
3-CPs 1%
Ein Konservierunasmittel, z.B. Methyl-p-hydrobenzoat,
konnte in einer Menge von 0,1% zugesetzt werden. Ein solches Konservierungsmittel wurde vorzugsweise dem
Wasser vor der Zugabe des Wassers zum "Hydrocerin" zugesetzt.
Wenn die Psoriasis-Läsionen stark verhornt waren, wurden sie vorher beispielsweise mit salicylhaltiger Vaseline
gereinigt oder bestrichen.
Bei allen Patienten wurde die das 3-CPs enthaltende Salbe auf alle Läsionen mit Ausnahme von einer aufgebracht,
um die spezifische Wirkung und nicht die Placebowirkung" nachzuweisen.
Die Bestrahlung erfolgte mit UV-Licht einer Wellenlänge
2 von 365 nm in einer Dosis von etwa 5 J/cm bei jeder
.Einzelbehandlung unter Anwendung der üblichen PUVA-Therapie.
Es wurde festgestellt, daß 3-CPs langsamer wirkt als
8-MOP. Da jedoch 3-CPs kein Erythem und keine Hautentzündung verursachte, war es möglich, täglich zwei
Behandlungen vorzunehmen oder sogar die Strahlendosis
bis auf 20 J/cm zu steigern.
Mit vier Anwendungen pro Woche wurde die Heilung in
etwa 20 bis 40 Wochen erzielt.
Mit zwei Anwendungen pro Tag wurde die Heilung nach 20 bis 40 Behandlungen erreicht. Als Dauerbehandlung
war es möglich, 2 Behandlungen pro Woche bis zu 1 Anwendung pro Monat bei einem Durchschnitt von einer
Anwendung pro Woche vorzunehmen.
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- 2f -
IM
Ho Ein gleicher Versuch wurde unter Verwendung von
3-Cyano-psoralen (R1 = -CN, R2 = -H) durchgeführt.
1,62 g Formyl-5-hydroxy-6-benzofuran wurden in 30 ml
Äthanol gelöst. 1,47 g Äthylcyanacetat und 400 mg Piperidin wurden zugesetzt, worauf 30 Minuten am Rückfluß
erhitzt wurde.
Nach Kühlung, Filtration, Trocknen, Umkristallisation aus Acetonitril und anschließender Sublimation unter
einem Druck von 13 mbar wurden gelbe Mikrokristalle vom Schmelzpunkt 259°C erhalten»
Berechnet für C12H5NO3: 68,24 2,37 6,63
Gefunden: 67,91 2,54 6,78 ·
NMR (CDCl3) S H-4 9,08 ppm
I.R. (in KBr) V-C EN= 2210 cm"1
I.R. (in KBr) V-C EN= 2210 cm"1
III. Ein gleicher Versuch wurde durchgeführt, wobei jedoch 3-Carbomethoxypsoralen (R- = -H, R- = -CH.,)
verwendet wurde.
1 g Formyl-5-hydroxy-6-benzofuran (hergestellt nach der
Methode von L.R. Worden u.Mitarb. "J. Org. Chem.," 84,
S. 2311-2313, und Po Queval und E. Bisagni, Eur.J.Med.
Chem. Chim. Ther.) wurden in 20 ml Äthanol gelöst. Nach
Zugabe von 200 mg Piperidin wurde das Gemisch 30 Minuten am Rückfluß erhitzt. -
Der nach Abkühlung erhaltene Feststoff wurde trocken filtriert und aus einer geringen Menge Äthanol umkristallisiert,
wobei gelbe Nadeln vom Schmelzpunkt 191-192°C erhalten wurden.
Elementaranalyse: | 3°5: | C | 3 | H |
Berechnet für C._H, | 63,94 | 3 | ,30 | |
Gefunden: | 8,86 | 63,87 | ,47 | |
NMR (DMSO) S H-4: | ppm | |||
9098 1 1/0791
I.R. (in KBr) V-C = O : 1745 und 1695 cm"1.
IV. Ein gleicher Versuch wurde unter Verwendung von S-Carboäthoxy-e-methylpsoralen (R2 = -CH--, R- =
-CHp-CH-), das nach der genannten Methode von P.Queval
und E. Bisagni, Eur. J. Med. Chem., hergestellt worden war, durchgeführt.
Schmelzpunkt 188°C.
I.R.: 1^-C = 0 (Ester), 1730 cm"1; Ό -C = 0 α-Pyron:
1750 cm"1; V-C=C 1620 und 1590 cm"1.
V. Um die Wirkung der Verbindungen gemäß der Erfindung mit Verbindungen von analoger Struktur
/R2 = -H; R3 = -C-(CH3J3-/
zu vergleichen, wurde Psoralen-3-t-butylcarboxylat
nach der oben genannten Methode hergestellt und aus Cyclohexan umkristallisiert.
Schmelzpunkt: 162 | - 164°C. | 67 | C | 4 | H |
ElernentaranaIyse: | 66 | ,12% | 4 | ,93% | |
Berechnet: | ,94% | ,97% | |||
Gefunden: | |||||
Diese Verbindung erwies sich als inaktiv.
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Claims (4)
1.J Monofunktionelle Psoralenderivate der Formel
•J
in der R1 für -COOR- oder -CN, R9 für -H oder -CH1.
und R3 für -H, -CH3 oder-CH2CH3 steht.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R1 für COOR,
oder -CN, R2 für -H oder -CH3 und R3 für -H oder -CH3
steht.
3. Arzneimittelzubereitung für die Behandlung von Hautkrankheiten, enthaltend eine therapeutisch wirksame
Menge wenigstens eines monofunktionellen Psoralenderivats nach Anspruch 1 und 2.
4. Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa o,5 bis 4 %, vorzugsweise
etwa 1 bis 2 % des Psoralenderivats enthält.
90981 1 /0791
OR/G/NAL INSPECTED
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FR2521999B1 (fr) * | 1982-02-25 | 1984-05-25 | Inst Nat Sante Rech Med | Pyrido (3',4' : 4,5) furo (3,2-g) coumarines ou pyrido (3,4-h) psoralenes, obtention, applications en cosmetologie et a titre de medicaments, et compositions cosmetiques et pharmaceutiques les contenant |
IT1169415B (it) * | 1983-05-09 | 1987-05-27 | Jean Jacques Goupil | Prodotti medicinali contenenti un derivato del psoralene |
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