DE2837295A1 - Monofunktionelle psoralenderivate und sie enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

VON KREISLER SCHÖNWAID ΜΞΥΞΡ FISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING

PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler + 1973

Dr.-Ing. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. Th. Meyer, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln

5 KÖLN 1

DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF

25. August 1978 AvK/Ax

Agence Nationale de Valorisation de la Recherche (ANVAR)
13, Rue Madeleine Michelis, Neuilly-sur-Seine,Frankreich

Monofunktionelle Psoralenderivate und sie enthaltende Arzneimittel

11/0791

Telefon: (02 21) 2345 41 - 4 - Telex: 8882307 dopa d - Telegramm: Dompatent Köln

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Behandlung von Hautkrankheiten, insbesondere eine neue chemische Verbindung und Arzneimittelzubereitungen für die Behandlung der Psoriasis, nämlich Psoriasis punctata, Herpes simplex und Mycosis fungoides, mikrobielles Ekzem, Akne und allgemein benigne und maligne Hautwucherungen.

Die Psoriasis ist eine ziemlich häufige Dermatose unbekannter Ätiologie. Sie ist durch rote, mehr oder weniger breite, scharf begrenzte Flecken, die von zahlreichen trockenen, spröden Schuppen bedeckt sind, gekennzeichnet.

Zur Heilung dieser Krankheiten wurde kürzlich ein Verfahren entwickelt, das darin besteht, daß gewisse Furocumarine (gewöhnlich als Psoralene bezeichnet) entweder oral oder örtlich verabreicht werden. Von den aktiven Furocumarinen wird 8-Methoxypsoralen, das nachstehend und im allgemeinen als 8-MOP bezeichnet wird, am häufigsten in Verbindung mit Bestrahlung mit nahem ·- Ultraviolettlicht (etwa 365 nm) verwendet. Diese Behandlung ist als PUVA-Therapie bekannt.

Mit dieser Methode werden gute Resultate erzielt, jedoch weist sie sehr große Nachteile auf. Einer der ernstesten Nachteile ist die mögliche Gefahr weiterer Verwicklungen, z.B. Hautkrebs, obwohl Hautkrebs bei Patienten, die mit Psoralen behandelt worden sind, bisher nicht beobachtet wurde. Dieser Aspekt muß berücksichtigt werden, da die Psoralene sehr starke mutationsauslösende Stoffe sind und einige Versuche an Mäusen ergeben haben, daß (nach örtlicher oder lokaler Anwendung) Tumore bei 100% der Mäuse erzeugt wurden (A.C. Griffin, R.E. Hakim und J. Knox, J.Invest.

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Dermatol. 31 (1958) 289-295). Über ähnliche Ergebnisse wurde auch von F. Urbach, J.Invest. Dermatol. 32 (1959) 373-378, berichtet. Ein vollständigerer Versuch wurde an zwei Abkömmlingen von haarlosen Mäusen (JKH, haarlos, und HRS/J/Anc, haarlos) durchgeführt. D.D. Greebe, R.D. Ley und R.J. M.Fry berichteten hierüber in Photochem, and Photobiol. 25 (1977) 269-276 und bestätigten die starke krebserzeugende Wirkung von 8-MOP in Kombination mit UV-Strahlung. Ergänzende Ergebnisse betreffend diesen krebserzeugenden Charakter von 8-MOP werden nachstehend genannt=

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, Produkte zu finden, die die vorstehend genannten Krankheiten ohne die genannten Nachteile zu heilen vermögen.

Zusätzlich können Verbrennung oder Blasenbildung der Haut, Dermatose, Magenreizung, Nausea, Nervosität, Schlaflosigkeit und Depressionen bei durchschnittlichen Dosen von 8-MOP auftreten. Siehe beispielsweise "The Merck Index", 7. Aufl. S. 670, und M.A. Pathak, D.M. Kramer und T.B. Fitzpatrick (1974) in "Sunlight and Man", herausgegeben von M.A. Pathak, L.C. Harber, M. Seiji, A. Kukita, University Press, Tokyo, S. 335 bis 368.

Die letztgenannte Veröffentlichung gibt an, daß die Fähigkeit, Hautgewebe zu sensibilisieren, ein einzigartiges Merkmal des Psoralenmoleküls der Formel

zu sein scheint.

Ergänzend wurde festgestellt, daß Psoralen und rnethylsubstituierte Psoralenderivate (Substitution an den 4,4'-, 5'- und 8-Stellungen) sich als äußerst wirksame

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·- fr -

Photosensibilisatoren erwiesen. Substitution durch Methylreste oder andere Reste an der 3-Stellung vermindert jedoch die Fähigkeit zur Photosensibilisierung erheblich.

Beispielsweise wurde festgestellt, daß Verbindungen wie 3,5',8-Trimethylpsoralen, 3-Methylpsoralen, 3,4,5',8-Tetramethylpsoralen, 3,4-Dibenzo-5,8-dimethylpsoralen, 3,4-Cyclohexeno-5·,8-dimethylpsoralen und 3-n-Butyl-4,5'-8-trimethylpsoralen inaktiv sind oder nur eine sehr schwache Photosensibilität auslösen. Insbesondere wurde ein Psoralenderivat, z.B. 3-Carboäthoxypsoralen, auf Grund seiner fehlenden Fähigkeit zur Photosensibilisierung als vollständig inaktiv bezeichnet (Tabelle 2, S. 342).

Es wurde die Ansicht geäußert, daß die sensibilisierende Wirkung (in vivo und in vitro) einiger Furocumarine auf Photoreaktionen mit den Pyrimidinbasen von Nucleinsäuren- zurückzuführen sei.

Wie die vorstehende Formel erkennen läßt, haben beispielsweise Furocumarine vom Psoralentyp zwei photoreaktive Stellen, die 3,4- und 4·,5'-Doppelbindungen. Unter der Einwirkung von Licht der Wellenlänge 365 nm werden Monoaddukte mit Pyrimidinen gebildet, d.h. es entstehen C.-Cycloadditionsprodukte mit der 5,6-Doppelbindung von Pyrimidin (2-4). Ferner werden DNA-Vernetzungsbrücken nach mehreren Methoden einschließlich des Schmelz- und Renaturationsverlaufs (melting and renaturation pattern) von behandelter DNA nachgewiesen. Es wird angenommen, daß die 3,4- und 4·,5'-Doppelbindüngen der Psoralenderivate beide an der Eildung von Vernetzungsbrücken zwischen Pyrimidinen von entgegengesetzten DNA-Strängen beteiligt sind.

Bis vor wenigen Jahren wurde allgemein angenommen, daß die von Psoralenen hervorgebrachten hauptsächlichen

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photosensibilisierenden Effekte ihrer Fähigkeit, Vernetzungsbrücken in zellulärer DNA zu bilden, zuzuschreiben seien (Cole R.S.: "Light-induced Cross-linking of DNA in the Presence of a Furocoumarin", Biochem. Biophys. Acta (Amst.) 217 (1970) 30-39).

Demzufolge wurde allgemein angenommen, daß es nicht möglich sein könnte, monofunktionelle, d.h. 3,4- oder 4',5^f-substituierte Furocumarine plus UV-Strahlung für die Behandlung von Hautkrankheiten anzuwenden, da diese Verbindungen keine Vernetzungsbrücken in DNA bilden.

Dies wurde durch üblicherweise angewandte Tests bestätigt, bei denen die Wirkung von Psoralenderivaten auf Hautkrankheiten durch Beobachtung des Aussehens des Hauterythems nach Anwendung des Produkts plus naher UV-Strahlung bewertet wurde. Das Fehlen eines Erythems galt als Beweis für- fehlende Aktivität. Tatsächlich riefen einige der bekannten monofunktionellen Furocumarine kein Erythem hervor.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, daß es möglieh ist, monofunktionelle Derivate der Formel

(D

^R2

worin R₁ eine Carboxylgruppe der Formel -COOR₃ oder -CN ist, R₂ für -H oder -CH₃ und R₃ für -H, -CH₃ oder -CH_?-CH- steht, für die Behandlung von Hautkrankheiten zu verwenden.

Von den Verbindungen, die dieser allgemeinen Formel entsprechen, ist das bevorzugte Psoralenderivat 3-Carboäthoxypsoralen (3-CPs), d°h. die Verbindung (I), in der R₁ für -COOCH₂CH₃ und R₂ für H steht, ein

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- .fr-

photoaktives Produkt, das besonders gute Eigenschaften bei der Behandlung von Hautkrankheiten, z.B. der Psoriasis oder der anderen vorstehend genannten Hautkrankheiten, aufweist.

Die Erfindung umfaßt ferner neue Verbindungen der Formel

^R2

in der R^. eine Carboxygruppe der Formel -COOR- oder -Cn ist, R₂ für -H oder -CH₃ und R- für -H oder -CH₃ steht.

Synthesen von Psoralenderivaten wurden bereits beschrieben, beispielsweise von Leonard R. Worden und Mitarb, in Journal of Organic Chemistry 84 (Nr. 8), August 1969, S. 2311-2313.

Ein anderes Verfahren zur Herstellung von Psoralen und ' seinen Derivaten wurde von Pierre Queval und Emile Bisagni in Eur. J. Med. Chem - Chimica Therapeutica, Mai-Juni 1974 - 9, Nr. 3, S. 335-340, beschrieben.

Das Verfahren zur Behandlung von Hautkrankheiten gemäß der Erfindung besteht darin, daß man eine wirksame Menge einer Verbindung der Formel (I) oral oder örtlich verabreicht und den Patienten mit nahem UV-Licht bestrahlt.

Es wurde nun gefunden, daß zur örtlichen Anwendung Salben oder Lösungen, die etwa 0,5 bis etwa 4% der therapeutisch wirksamen Verbindung (auf Gewichtsbasis) enthalten, verwendet werden können. Bevorzugt werden Konzentrationen von etwa 2% bis 4%. Insbesondere erwies

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sich eine Lösung oder Salbe, die etwa 2 Gew.-% der Verbindung enthält, als geeignet.

Alle üblicherweise verwendeten, dem Fachmann bekannten Träger oder Grundlagen können für die Lösungen oder Salben gemäß der Erfindung verwendet werden. Beispiele solcher Träger und Grundlagen werden von Schafer und Mitarbeitern in Archiv, of Dermatology (1976) genannt.

Natürlich können die Verbindungen gemäß der Erfindung auch in andere Verbindungen, Lösungen oder Salben eingearbeitet oder Duftstoffe, Farbstoffe oder Konservierungsmittel oder beliebige andere, üblicherweise verwendete Verbindungen zugesetzt werden. Es ist ferner möglich, zwei oder mehr photosensibilisierende Mittel zu kombinieren.

Für die orale Verabreichung werden Mengen zwischen etwa 1 mg und 2 mg pro kg des Körpergewichts des Patienten besonders bevorzugt.

Wie bereits erwähnt, gehört zur Behandlungsmethode die Bestrahlung mit nahem UV-Licht mit einem Spektrum, das die Wellenlänge 365 nm einschließt oder hauptsächlich daraus besteht. Wie nachstehend erläutert werden wird, kann die kumulative Strahlendosis sehr hoch sein und

2 2

beispielsweise bis zu 10 J/cm oder 15 J/cm oder mehr

2 2

betragen. Eine Dosis von etwa -5 J/cm bis 15 J/cm führt bereits zu guten Ergebnissen, jedoch können auch

2
Dosen bis zu 20 J/cm kurzzeitig angewandt werden.

Es wurde bereits erwähnt, daß man allgemein der Ansicht war, daß die Bildung eines Erythems mit der therapeutischen Wirksamkeit von Psoralenderivaten wie 8-MOP, die Vernetzungsbrücken in DNA zu bilden vermögen, verknüpft ist.

Im Gegensatz hierzu wurde nun gefunden, daß die mono-

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funktionellen Derivate der Formel (I) nicht im geringsten - weder unmittelbar noch nachträglich oder verspätet - ein Erythem hervorrufen. Keinerlei Hautschädigung wurde makroskopisch oder mikroskopisch bei Patienten festgestellt. Es leuchtet dem Fachmann ohne weiteres ein, daß dies eine völlig einmalige Eigenschaft für Verbindungen der Psoralengruppe ist. Außerdem umfaßt die Erfindung Verbindungen, die nicht die starke Gerbwirkung zeigen, wie sie von 8-MOP hervorgebracht wird.

Unerwünschte kosmetische Nebenwirkungen sind somit nicht vorhanden. Diese Verbindungen sind somit von großem Interesse, da sie im Gegensatz zu 8-MOP eine anschliessende Behandlung in kurzen Zeitabständen - beispielsweise zweimal täglich - über längere Zeiträume ohne sonnenbrandartige Schädigungen der Haut gestatten. Kurze Behandlungszwischenräume sind bei Verwendung von 8-MOP nicht angezeigt, da es heftige erythematöse Reaktionen in der Haut verursachen kann.

Es ist ferner bekannt, daß ein Psoralenderivat wie 8-MOP eine Verminderung der Zahl der Lymphozyten im zirkulierenden Blut im Verlauf einer Heilbehandlung hervorruft. Bei Verwendung einer Verbindung (I) gemäß der Erfindung wurde eine solche Verringerung der Lymphozyten nicht festgestellt.

Die überraschenden photosensibilislerenden Eigenschaften der Verbindungen (I), auf denen die Erfindung beruht, werden bei Verwendung der Hefe Saccharomyces cerevisiae erkennbar. Der biologische Test mit dieser Hefe erwies sich als besonders gut geeignet zum Nachweis der biologischen Aktivität von neuen Chemikalien. Nachstehend werden die Daten gebracht, die dieses System betreffen.

Um die biologischen Wirkungen und die Heilung von Läsionen, die durch Verbindungen (I) gemäß der Erfindung photoinduziert werden, zu ermitteln, wurden die Photo-

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reaktivität, die letalen und genetischen Wirkungen in Hefe, die als eucariotisches Modellsystem von 3-CPs verwendet wurde, untersucht und mit denen von 8-MOP verglichen. Es wurde gefunden, daß bifunktionelle Furocumarine, z.B. Psoralen oder 8-MOP, in der Auslösung nuklearer Rückmutationen (his~ zu His⁺) wenigstens zehnmal wirksamer sind als monofunktionelle Furocumarine (z.B. 3-CPs oder Angelicin) plus Licht von 365 nm (nahes UV-Licht) oder UV-Licht von 254 nm '(weites UV) allein.

Ein Vergleich bei der gleichen Überlebensrate (10%) ergibt, daß monofunktionelle Furcumarine sehr wirksam "petite" Mutationen des Zytoplasmas auslösen. 3CPs ist die reaktivste Verbindung. Die vorstehend genannten bifunktionellen Furocumarine sind weniger wirksam in der Auslösung von "petite" Mutationen des Zytoplasmas als die monofunktionellen Furocumarine under den gleichen Bedingungen. Im Vergleich zu Psoralen ist 8-MOP weniger reaktionsfähig.

Hinsichtlich der Schädigung von nuklearer DNA wurde demzufolge angenommen, daß monofunktionelle Schädigung leichter reparabel sein kann als bifunktionelle Schädigung. Diese Beobachtung ist wichtig angesichts der weitgehend anerkannten Wechselbeziehung zwischen mutagener Wirkung von Chemikalien und ihrer Fähigkeit, einen kanzerogenen Prozeß auszulösen.

Verwendete Materialien und angewandte Methoden Hefestämme

Ein Wildstamm 211-laM (29) von Saccharomyces cereviseae wurde verwendet. Die folgenden Mutanten wurden davon gewonnen: S24-12c rad _o „« mit mangelnder Exzisionsreparation und S25-13b rad,, ., der wahrscheinlich auf einem Rekombinations-Reparationsweg blockiert wird (blocked in a recombinational repair pathway). Ein Doppelmutant S 2057NL-24 rad,., „_n - rad_Q ,, Klon B, wurde

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durch Tetrad-Analyse eines diploiden Heterozygoten

erhalten ( -5 — ) .

^rad2-20 ₊

Medien, Kultivierung und Behandlunqsbedinqungen, Bestrahlungsmethode;

. Die verwendeten Medien und angewandten Kultivierungsbedingungen werden von D. Averbeck, E. Moustacchi in Biochim. Biophys. Acta 395 (1975) 393-404 beschrieben.

10 Zellen/ml in Kochsalzlösung (0,9% NaCl) wurden 30 Minuten mit den Testverbindungen bei einer Endkonzentration von Io ug/ml in Gegenwart von 1,2% Äthanol behandelt. Eine kugelförmige Quecksilberhochdrucklampe "Philips HPW 125 Edison" mit maximaler Leistung bei einer Wellenlänge von 365 nm wurde verwendet. Die durch

2 Aktinometrie gemessene Strahlungsdosis betrug 10 J/m pro Sekunde. Die folgende Anordnung wurde verwendet:

10 ml AktinometerlÖsung (oder Zellsuspension, gewöhnlich 1 χ 10 Zellen/ml), die mit einem Magnetrührer kontinuierlich gerührt wurden, wurden bei Raumtemperatur in einer offenen Petrischale von 10 cm Durchmesser aus einem Abstand von 10 cm vom Mittelpunkt der waagerecht angeordneten Lampe bestrahlt. Eine 2 mm dicke Pyrexglasscheibe (20 χ 25 cm) wurde in die Mitte des Lichtstrahls gestellt, um UV-Licht mit Wellenlängen unter 340 nm herauszufiltern. Überhitzung wurde entweder durch einen stetigen Druckluftstrom zwischen Lampe und Glas oder durch ein Pyrexglas-Vvasserfilter von 3 cm Gesamtdicke verhindert. Eine kumulative Strahlendosis wurde auf die gleiche Probe zur Einwirkung gebracht. Nach jeder Dosis wurden 0,1 ml bestrahlte Zellsuspension entnommen und verdünnt, worauf aliquote Teile plattiert wurden.

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Biochemische Messung der Photobindunq von 3-CPs und 8-MOP an Nucleinsäuren

Diese Bestimmungen wurden in vitro und in vivo durchgeführt. Nach der Methode von Musago und Rodighiero (Photochem. Photobiol. 11 (1970) 27-35) und Dall''Acqua u.Mitarb., Z. Naturf. 24b (1969) 667-671) wurden 3 ml-Proben von filtrierter ("Millipore SM5") Kalbsthymus-DNA (Sigma, Typ I) in einer Konzentration von 0,1% in Phosphatpuffer (pH 7,0, 0,1 Mol) bei 365 nm in Gegenwart von mit Tritium markiertem 3-CPs oder 8-MOP in verschiedenen Konzentrationen bestrahlt. Die Dicke der bestrahlten Probe betrug 1 mm. Nach der Bestrahlung wurde die Lösung um einen Faktor von 2 verdünnt, worauf NaCl bis zu einer Endkonzentration von 1 Mol zugesetzt wurde.

Die DNA wurde mit 2 Raumteilen kaltem reinem Äthanol ausgefällt. Die Proben wurden über Nacht in der Kälte bei -20⁰C gehalten. Die Fällung wurde dann durch dreimaliges Zentrifugieren mit 3 ml 70%igem Äthanol gewaschen und erneut in 3 ml Wasser gelöst. Die DNA-Gewinnung wurde durch Bestimmung der optischen Dichte der Lösung bei 260 nm geprüft.

Die Radioaktivität eines aliquoten Teils (0,1 ml) dieser Lösung wurde in 5 ml Szintillationsgemisch (Nuclear Enterprise, Ltd., Edinburgh, Schottland, Ne 250) gemessen.

Für die Bestimmungen in vivo wurden Zellen aus der stationären Phase des haploiden Wildstam_ms Nl23 in der bereits beschriebenen Weise hergestellt. Eine Minute vor der Bestrahlung wurde eine gegebene Menge von radioaktiv markiertem 3-CPs oder 8-MOP zu 2 ml Zellsuspension

7
mit 5 χ 10 Zellen/ml gegeben. Die Endkonzentrationen von 8-MOP und 3-CPs sind nachstehend in den Tabellen 1 und 2 genannt.

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	Tabel	le 1	an DNA	67.75	mit 5 χ	Hefe in
Bindunq vor	ι 3-14C-3-CPs			5030.5	χ 10"8 Aiq	10~8 U£
vivo.- Die	an Nucleinsäuren von	Dosis von cpm für μg 365 nm-Licht 108 DNA in Erg mm""2 Zellen χ 104	9409		qemessen.
DNA-Menqe pro Zelle wurde	-	11386.5	3-CPs^g χ 10-2
und die Menge RNA pro Zelle mit 250	6.3	15 650.2	0.05	Moleküle 3- CPs/με DNA ir14 χ 10
a) Bindunq	12.6	15307	3.9	0.012
Dauer der Behand lung, Min.	18.9	14248	5.7	0.92
5-60	25.2	16476	9	1.34
5	38.8		12.3	2.1
10	50.4	1285	12	2.8
15	75.6	7130	11	2.8
20	an RNA	11040	10	2.6
30	-	14170		2.3
40	6.3	18780	0.01
60	12.6	25380	0.056	0,0023
b) Bindunq	18.9	29240	0.086	0.0130
5-60	25.2	31730	0.11	0.020
5	37.8	0.15	0.026 .
10	50.4	0.20	0.034
15	75.6	0.23	0.046
20	0.25	0.053
30		0.058
40
cn

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•	- -J* -	2837295	Dosis von 365 nm- Licht in erg mm~2 χ 104	-	cpm für 10» Zellen	μg 8-ΜΟΡ/μί DNA o χ 10" Δ	r Moleküle 8-MOP/ug DNA χ ΙΟ1**
	Tabelle 2		-	18.9	404.75	0.126	0.034
Bindung		von H-8-M0P an Hefe-Nucleinsäuren in vivo	18.9	37.8	1161	0.36	0.10
		a) Bindung an DNA	37.8	75.6	1474	0.46	0.13
	Behand lungs- dauer, Minuten	75.6 .	113.4	2805	0.86	0.24-
15-120	113.4	151.2	5582	1.72	0.48
15	151.2		5572	1.72	0.48
30	b) Bindung an RNA
60	15-120	3805	0.12	0.033
90	15	7400	0.228	0.064
120	30	12920	0,40	0.11
60	23580	0.73	0.20
90	34150	1.05	0.29
120	44060	1.36	0.38

Je 2 ml Zellsuspension wurden mit Licht von 365 nm in mehreren Dosen bestrahlt. Gleichzeitig wurden unbestrahlte Proben während der gleichen Zeiträume bebrütet. Unmittelbar nach der Bebrütung und/oder Bestrahlung wurden die Proben zentrifugiert. Das Sediment wurde dreimal mit 5 ml Kochsalzlösung (0,9% NaCl) gewaschen. Das gewaschene Zellpellet wurde erneut in 1 ml Kochsalzlösung suspendiert. Der Suspension wurde 1 ml 2n-NaOH zugesetzt, um die RNA zu hydrolysieren. Die Suspension wurde üßer Nacht im Dunkeln bei Raumtemperatur bebrütet und dann

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-W-

auf Eis gekühlt, worauf 2 ml 50%ige TCA langsam zugesetzt wurden. Die Proben wurden 20 Minuten auf Eis gelassen, worauf die ausgefällte DNA auf eine_r Glasfaserfilter— scheibe (Whatman GP/A, 2,1 cm Durchmesser) abfiltriert wurde. In einigen Fällen wurde das FiItrat, das das sau— relösliche Material enthielt, beiseite gestellt. Die Radioaktivität eines zu 5 ml NE250~Szintillationsgernisch gegebenen aliquoten Teils wurde gemessen. Die Fällung wurde dreimal mit 5 ml 5%igem kaltem TCA und 5 ml 70%igem Äthanol gewaschen. Die Filter wurden dann getrocknet, worauf die Radioaktivität in Zählrohren aus Kunststoff, die 5 ml Szintillationsgemisch .(NE-250) enthielten, in einem Tricarb-Packard-Szintillationsspektrophotometer gemessen wurde.

Messung der Schmelz- und Reassoziationseigenschaften von Hefe-DNA

Hefe-DNA wurde isoliert und in einem CsCl-Gradienten gemäß Williamson u.Mitarb. (Biochim. Biophys. Acta 238 (1971) 369-374) gereinigt. Die Fraktionen, die die nukleare DNA enthielten, wurden zusammengegeben und gegen 0,1-molaren Phosphatpuffer von pH 7 dialysiert. Verschiedene Mengen DNA (1 bis 30 ijg/ml) wurden mit Licht von 365 nm in mehreren Dosen in Gegenwart oder Abwesenheit von 8-MOP bzw. 3-CPs in verschiedenen Kon— zentrationen bestrahlt. Nicht bestrahlte Proben von DNA mit oder ohne die Arzneimittel wurden als Bezugsproben genommen. Die Schmelz- und Reassoziationseigenschaften wurden mit dem Meßgerät und dem Computerprogramm von Reiss und Michel (Anal. Biochem. 62 (1974) 499-508) bestimmt, wobei die gleichen Methoden, die von den Verfassern beschrieben wurden, angewandt wurden.

Ergebnisse

A. Photobindung von 3-CPs an Nucleinsäuren 1) In vitro

Das Bindungsvermögen von 3—CPs an native Kalbsthymus-

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DNA nach Bestrahlung bei 365 nm ist im Vergleich zu 8-MOP in den Tabellen 3 und 4 genannt.

Tabelle

14

Bindung von 3 - C -3-CPs an Kalbsthymus-DNA in vitro

14 -5

Die Konzentration von 3- C-3-CPs betrug 6 χ 10 Mol.

Behandlungs- Dosis von dauer, 365 nm- Minuten Licht in erg mm~2 χ 10*	18.9	cpm/ /ig D
0-60 Bebrütung	37.8	0.21
15	56.7	3.29
30	75.6	4.25
45	Tabel	4.30
60	3.10
	Ie 4

/i?

3-CPs/

,ug DNA

Bindungsausbeute 3-CPs-Moleküle/
Nukleotid

0.009 χ 10~³ 1/88 χ 10³ 0.14 χ 10"³ 1/5.6 χ 10³ 0.18 χ 10"³ 1/4.4 χ J.0³ 0.18 χ 10~³ 1/4.4 χ 10³ 0.13 χ 10~³ 1/6.1 χ 10³

Bindung von H-8-M0P an Kalbsthymus-DNA in vitro

Die Konzentration von ³H-8-MOP betrug 7,5 χ 10~⁵ Mol.

Behandlungsdauer,
Minuten

Dosis von cpm/ ug 8-MOP/ 365 nm- .ug DNA Ajg DNA Licht in ' '

erg cm

-2

Bindungsausbeute, 8-MOP-Moleküle/ Nukleotid

0-180 Bebrütung

30 37.8

60 75.6

90 113.4

120 151.2

180 226.8

0.24 0.031 * 10"⁴ 1/1.8 χ ΙΟ⁴

56.3 7.3 χ 10
95.7 12.4 χ 10
118.8 15.4 χ ΙΟ"⁴

-4

131.5 17.1 χ 10

-4

198.5 25.8 χ 10

-4

1/900
1/532
1/428
1/386
1/256

Die Bindung der beiden Furocumarine (nur bei den Kontrollproben beobachtet), die während der gleichen Zeitintervalle wie die entsprechenden bestrahlten Proben im

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Dunkeln gehalten wurden, war gering (O bis 6O^-Minuten Bebrütung im Dunkeln, Tabelle 3; 0 bis 180 Minuten Bebrütung im Dunkeln, Tabelle 4).

Die Bindung von 3-CPs steigt schnell mit den Dosen bis

2
3780 J/m und erreicht ein Plateau und nimmt anschliessend mit steigenden Dosen ab. Das gleiche ist bei 8-MOP der Fall, jedoch wird die Sättigung bei einer höheren Dosis erreicht. Trotz der hohen Konzentration (0,1% DNA wurden verwendet) liegt ein Überschuß von Furocumarinmolekülen vor, d.h. bei den höchsten Dosen von Licht der Wellenlänge 365 nm werden nicht alle Moleküle gebunden. Die Photoreaktivität von 3-CPs-mit nativer DNA ist etwa fünfmal niedriger als die von 8-MOP, gerechnet für den Anfangsteil der Photoreaktion.

2) In vivo

Die Bindungsfähigkeit von 3-CPs und 8-MOP an Hefe-Nucleinsäuren nach Behandlung mit Licht von 365 nm ist in den Tabellen 1 und 2 genannt. Bei den Vergleichsproben, die 50 Minuten im Dunkeln bebrütet wurden, ist die Bindung mit DNA bei 3-CPs vernacBilässigbar (etwa 10%), bei 8-MOP jedoch stark (etwa 35%). Bei den beiden Verbindungen ist jedoch die Bindung mit RNA im Dunkeln verhältnismäßig stark (20% bei 3-CPs und 50% bei 8-MOP). Diese Prozentsätze beziehen sich auf die Bindung bei Kontrollproben, bezogen auf die bei der niedrigsten Strahlendosis erhaltene Bindung.

Die Bindung von 3-CPs mit DNA und RNA steigt linear mit den Strahlendosen von 365 nm-Licht bis 25,2 χ 10 J/m und flacht sich dann ab. Unter den angewandten Bedingungen ist die an DNA gebundene Menge von 3-CPs ungefähr die gleiche wie die an RNA pro Zelle gebundene Menge. Die Werte in den Tabellen 1 und 3 zeigen eindeutig, daß 3-CPs in vitro und in vivo an DNA bindungsfähig ist. Diese Bindung ist in vivo stärker als in vitro.

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Wenn Zellen mit einer äquimolaren Konzentration von 8-MOP behandelt werden, steigt die Bindung mit DNA und RNA linear im Bereich der angewandten Lichtdosen. Die an RNA gebundene Menge von 8-MOP ist ungefähr fünfmal höher als die an DNA gebundene Menge pro Zelle. Wie bei 3-CPs ist die Bindung von 8-MOP an DNa in vivo viel stärker als in vitro.

Wichtig ist die Feststellung, daß 3-CPs sich viel wirksamer als 8-MOP an DNA bindet. Der Unterschied in der Photoreaktivität mit DNA liegt innerhalb eines Faktors von 20. Die Photoreaktivität mit RNA differiert jedoch um einen Faktor von 3,4.

Trotz der hohen Affinität von 3-CPs zu zellulärer DNA ist die Überlebensrate noch verhältnismäßig hoch im Vergleich zu derjenigen für 8-MOP. Beispielsweise ergibt eine Bestrahlung von 5 Minuten bei der angewandten Konzentration 10 Überlebende bei 3-CPs und 10 Überlebende bei 8-MOP. Dies bedeutet bereits, daß die durch 3-CPs plus 365 nm-Licht hervorgerufenen Läsionen weniger bedeutungsvoll für die Abtötung von Zellen sind als die durch 8-MOP plus Licht hervorgerufenen Läsionen.

3) Verlauf der durch Hitze ausgelösten Denaturierung

und Reassoziation von Hefe-DNA, die in vitro mit

3-CPs bzw. 8-MOP plus Licht von 365 nm behandelt wird.

Die Vernetzungsbrückenbildung der beiden Furocumarine mit nativer Hefe-DNA wurde durch Messung des Denaturierungs- und Renaturierungsverlaufs getestet.

Es wurde nachgewiesen, daß in Gegenwart von 8-MOP plus 365 nm-Licht eine Fraktion der DNA zur Renaturierung fähig ist= Im Gegensatz hierzu wurde eine solche Reassoziation im Falle von 3-CPs wenigstens im angewandten Bereich der Dosen und Konzentrationen nicht festgestellt. Da diese Fähigkeit zur Renaturierung als Anzeichen für

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die Anwesenheit von Vernetzungsbrücken zwischen zwei DNA-Strängen gewertet wird, konnte die Schlußfolgerung gezogen werden, daß 3-CPs plus 365 nm-Licht keine Vernetzungsbrücken in DNA hervorruft.

Nach der Molekülstruktur von 3-CPs reagiert dieses Molekül höchstwahrscheinlich mit DNA durch monofunktionelle Bindung.

B. Wirkungen von 365 nm-Licht allein oder 3-CPs, Aufnahme und Entfernung des Arzneimittels.

Da hohe Dosen von 365 nm-Licht erforderlich sind, um eine abtötende Wirkung in Saccharomyces-Zellen in Gegenwart von 3-CPs hervorzurufen, wurden die Wirkungen von

2 365 nm-Licht allein bei Strahlendosen bis zu 7500 J/m gemessen. Es wurde nachgewiesen, daß im Bereich der für biologische Versuche angewandten Dosen Licht der Wellenlänge von 365 nm allein nur eine geringe letale Wirkung hatte. Unter Berücksichtigung der Standardfehler der überlebenden Fraktion {_+ 10%) und der Tatsache, daß ein Teil der Lichtenergie vom Arzneimittel selbst aufgenommen wird, wurde die Wirkung des 365 nm-Lichts allein bei den Versuchen außeracht gelassen. Bei den Wildzellen und rad_q .-Zellen ist die abtötende und zytoplasmatische "petite" Induktion nach Behandlung mit 10 ug/ml 3-CPs plus einer konstanten Dosis von 365 nm-Licht unabhängig von der Bebrütungszeit mit dem Arzneimittel vor der Bestrahlung innerhalb der Grenzen der statistischen Schwankung. Eine Bebrütungszeit von einer Minute übte bereits ungefähr die maximale Wirkung aus. Es wurde nachgewiesen, daß bei den angewandten Dosen von 365 nm-Licht nach dem Waschen keine sensibilisierende Wirkung eintritt. Demzufolge wurde diese Verbindung im Dunkeln sehr lose gebunden.

Die von der Anmelderin durchgeführten Versuche zeigten, daß 3-CPs lichtempfindlich ist und daher gegen Licht

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geschützt werden muß. Tatsächlich liefern die'Dünnschicht- und Papierchromatographie sowie Fluoreszenzspektren von belichtetem 3-CPs in wäßrigen Lösungen den Beweis der Anwesenheit eines stark fluoreszierenden Photoprodukts mit den Merkmalen von 4',5'-Dihydropsoralen. Als Folge der Bildung eines oder mehrer solcher Photoprodukte stellte die Anmelderin eine Abnahme der photobiologischen Aktivität von 3-CPs fest, wenn es vorher dem Licht ausgesetzt wird.

Es wurde ferner nachgewiesen, daß 3-CPs sich in vitro und in vivo (Tabellen 1 und 3) unter der Einwirkung von Licht der Wellenlänge 365 nm an DNA bindet. Die Wirksamkeit dieser Bindung erweist sich in vivo als höher als in vitro trotz der Tatsache, daß die Konzentration von DNA in jug/ml in vitro höher ist. Die Bedingungen sind jedoch nicht streng vergleichbar, da anzunehmen ist, daß die Konfiguration und örtliche Konzentration von DNA eine wichtige Rolle spielen. Ferner wird eine Stoffwechselaktivierung nicht völlig ausgeschlossen.

Ebenso wie andere photoaktive Furocumarine bindet sich 3-CPs nicht nur an DNA, sondern auch an RNA (Tabelle 3). Für 8-MOP macht die Photoreaktivität mit RNA 61 bis 87% derjenigen mit DNA aus. Demzufolge ist auf molarer Basis die Photoaffinität von 3-CPs zu DNA viel höher als zu RNA. Dieses Merkmal unterscheidet 3-CPs deutlich von 8-MOP, Psoralen und Angelicin.

Um die Photoaffinitäten von 3-CPs und 8-MOP zu DNA zu vergleichen, müssen die folgenden Punkte berücksichtigt werden:

a) Furocumarine einschließlich 8-MOP binden sich bekanntlich spezifisch an Pyrimidine. Aus der Struktur von 3-CPs läßt sich mit ziemlicher Sicherheit annehmen, daß dieses Molekül in der gleichen Weise reagiert.

b) Die Gesamtzahl von Pyrimidinen pro haploides Hefe-

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- eer -

genom beträgt 2,1 χ 10 .

Bei einer Dosis von 18,9 χ 10³ J/m² und 5,10~⁵ Mol 8-MOP oder 3-CPs werden 0,5 χ 10 Moleküle 8-MOP oder 10,5 χ 10 Moleküle 3-CPs an DNA pro Zelle gebunden. Im Durchschnitt beträgt das Bindungsverhältnis 1 Molekül 8-MOP über 42 Pyrimidinbasen und 1 Molekül 3-CPs über 2 Pyrimidinbasen. Für 8-MOP ist dieses Verhältnis wahrscheinlich zu niedrig geschätzt, da eine Fraktion der 8-MOP-Moleküle als Vernetzungsbrücken gebunden wird und ein Verhältnis von 1 über 30 die tatsächliche Bindung wahrscheinlicher widerspiegelt. Im Vergleich zu 8-MOP ist die Photoaffinität von 3-CPs zu DNA auffallend hoch. Im Vergleich zu 8-MOP wird etwa 15mal mehr 3-CPs an DNA gebunden. Es sind jedoch noch andere Beispiele einer solchen hohen Photoreaktivität unter den Furocumarinderivaten bekannt. Beispielsweise ist 4,5',8-Trimethylpsoralen in vitro etwa 12mal reaktionsfähiger mit DNA als 8-MOP. Wenn diese Verbindung in vivo eine höhere Photoreaktivität als in vitro hat, wie hier für 8-MOP und 3-CPs nachgewiesen, liegt die für 3-CPs in vivo gefundene Photoreaktivität sicherlich im gleichen Bereich,

DNA, die Vernetzungsbrücken von Strang zu Strang enthält, zeichnet sich durch die Fähigkeit aus, sich nach Denaturierung durch Hitze bei langsamem Abkühlen wieder zu naturieren. Fehlende Vernetzungsbrückenbildung ist wenigstens in dem bei den Versuchen der Anmelderin angewendeten Bereich von'Dosen an der Unfähigkeit zu erkennen, DNA, die vorher mit 3-CPs und 365 nm-Licht behandelt worden ist, zu renaturieren. Dies steht im Gegensatz zu 8-MOP. 3-CPs weist demzufolge nur monofunktionelle Eigenschaften auf.

Bei den biologischen Versuchen zur Ermittlung der Aktivität von 3-CPs zeigen die Kontrollproben, daß der Beitrag des 365 nm-Lichts allein zur Abtötung der Zellen

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vernachlässigbar ist. Es ist unwahrscheinlich, daß die geringe letale Wirkung bei Wildzellen auf durch 365 nm--Licht induzierte Pyrimidindimere zurückzuführen ist_t da

a) ein für UV-Licht empfindlicher Mutant mit fehlender Exzision, rad« ₂n> für 365' nm-Licht bis zu Dosen von

25,2 χ 10³ J/m2 unempfindlich ist;

b) die hier angewandten Lichtdosen viel niedriger sind, als sie zur Induktion von Pyrimidindimeren bei Escherichia coli erforderlich sind.

Andere bekannte Wirkungen von nahem UV-Licht, z.B. die Hemmung der Proteinsynthese in Hefe, können diese Abtötung erklären.

In Saccharomyces wird 3-CPs ebenso leicht wie 8-MOP aufgenommen und ausgewaschen. Unterschiede, die in den letalen Wirkungen der beiden Arzneimittel festgestellt werden, sind nicht auf Unterschiede in der Aufnahme und Ausscheidung, sondern auf verschiedene Photoreaktivitäten der beiden Arzneimittel zurückzuführen.

Für eine gegebene Überlebensrate folgt die doppelt logarithmische Darstellung der Konzentration von 3-CPs in Abhängigkeit von der 365 nm-Lichtdosis einer linearen Funktion für Wildzellen und rad_g_₄· Hieraus geht hervor, daß es keine Reziprozität zwischen der Strahlendosis und der Konzentration des Arzneimittels für die Abtötung der Zellen gibt. Eine Verminderung der Konzentration des Arzneimittels um einen Faktor von 10 beispielsweise erfordert keine Steigerung der Lichtdosis um den gleichen Faktor, um eine gleiche Abtötungswirkung hervorzurufen. Mit anderen Worten, der Wirkungsgrad der Aktivierung des Arzneimittels durch Licht steigt, wenn die Konzentration vermindert wird. Bei hoher Konzentration von 3-CPs ist dies höchstwahrscheinlich entweder auf die einen Abschirmeffekt hervorrufende Absorption des 365 nm-Lichts durch die ungebundenen i-ioleküle des Arz-

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neimittels und/oder auf die Bildung von photobiologisch inaktiven 3-CPs-Photoprodukten (siehe oben) zurückzu- · führen. Da der dosismodifizierende Faktor für rad„ . (im Vergleich zum Wildtyp) konstant ist, kann die höhere Lichtempfindlichkeit des Mutanten nicht durch einen Unterschied in der physikalischen Wechselwirkung zwischen Licht und Arzneimittel erklärt werden.

Vorstehend wurde dargelegt, daß die Zellen durch ein bifunktionelles Mittel wie 8-MOP stärker photosensibilisiert werden als durch monofunktionelle Verbindungen wie 3-CPs oder Angelicin. Die Überlebensraten von 3-CPs und 8-MOP unterscheiden sich durch einen Faktor von 6, während die Photoreaktivität der beiden Arzneimittel mit DNA in vitro um den Faktor 4,8 (Tabelle 3) und in vivo um den Faktor 15 differiert (siehe ooen). Mit anderen Worten, die Resistenz gegen die abtötende Wirkung von 3-CPs im Vergleich zu derjenigen von 8-MOP ist viel höher, als aus der Photoreaktivität zu erwarten wäre. Dieser Unterschied ist höchstwahrscheinlich auf die Anwesenheit von Vernetzungsbrücken in mit 8-MOP plus 365nm-Licht behandelten Zellen und darauf zurückzuführen, daß Monoadditionen sehr wirksam wiederhergestellt werden. Tatsächlich wurde kürzlich an Escherichia coli nachgewiesen, daß dieser letztgenannte Typ von Läsionen leicht behoben wird.

Vorstehend wurde dargelegt, daß 8-MOP und 3-CPs eine verhältnismäßig geringe Photoaffinität zu RNA haben. Angelicin bindet sich bekanntlich ebenso gut an DNA und RNA. Dies bedeutet, daß bei gleichen Konzentrationen der drei Arzneimittel und gleichen Lichtdosen eine geringere Zahl von Angelicinmolekülen im Vergleich zu 8-MOP oder 3-CPs an DNA gebunden wird. Da die Größe der Schädigung von genetischem Material geringer ist, ist bei Angelicin mit einer höheren Überlebensrate zu rechnen.

Der Unterschied in der Form der Überlebenskurven für

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die drei Verbindungen ist im Augenblick schwierig zu erklären. Die gezeigte Exponential-Überlebenskurve für 3-CPs scheint jedoch kein allgemeines Merkmal von monofunktionellen Furocumarinen zu sein.

Eine synergistische Wechselwirkung zwischen dem von rad- und rad» bestimmten Reparationsweg ist für Läsionen, die durch 3 CPs plus 365 nm-Licht hervorgerufen werden, festzustellen. Dies steht im Gegensatz zu 8-MOP, für das eine additive Wechselwirkung gefunden wurde. Dies wurde dahingehend gedeutet, daß sie auf die"Reparation von zwei verschiedenen Substraten, d.h. die Monoaddukte und die Vernetzungsbrücke, zurückzuführen sei. Der Synergismus, der für durch 3-CPs plus Licht hervorgerufene Schädigungen festgestellt worden ist, läßt erkennen, daß die beiden Reparationswege auf einen einzigen Läsionstyp einwirken, bei dem es sich höchstwahrscheinlich um die induzierten Monoaddukte handelt.

Bei Agair-Halteversuchen (AHR) wurde nachgewiesen, daß ein Stamm mit fehlender Exzision unfähig ist, eine Dunkelreparation von sowohl durch 3-CPs als auch 8-MOP verursachte Schaden vorzunehmen. Ein Stamm mit mangelnder Rekombination hat eine verringerte Fähigkeit zur Reparation von durch 3-CPS plus 365 nm-Licht verursachte Schaden. Hieraus ergibt sich, daß der Exzisions-Reparationsweg bei Zellen vom Wildtyp und bei rad₉_₄-Zellen bei AHR-Versuchen für beide Verbindungen wesentlich ist. Bei Wildzellen wird die gleiche Kinetik von AHR für 3-CPs, 8-MOP, Angelicin und Psoralen beobachtet. Dies bedeutet, daß ein Läsionstyp,der gewöhnlich durch diese vier Verbindungen hervorgerufen wird (Monoaddukte), der Heilung durch "agar-holding" (agar-holding recovery) unterliegt.

Tierversuche in vivo und Toxizitätsuntersuchunqen

Ein systematischer In-vivo-Versuch wurde durchgeführt, um eine mögliche kanzerogene Wirkung von Psoralen und bifunktionellen Psoralenderivaten wie 8-MOP mit 3-CPs zu vergleichen.

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Diese Versuche wurden auf der Haut von Homozygot-Albinomäusen des Stamms XVII nc/Z (Institut du Radium Orsay) durchgeführt, die ein besonders niedriges Verhältnis von spontanem Hauttumor (weniger als 0,05%) aufweisen.

Für die Versuche wurden Gruppen von je 40 Mäusen, männlich und weiblich, verwendet.

Nach chronischer örtlicher Anwendung von Psoralen auf beide Ohren mit anschließender Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 365 nm zeigten die Tiere starke Kutanreaktionen wie Erythem mit anschließender starker chronischer Entzündung, der sogar eine Nekrose"von mehr oder weniger bedeutenden Teilen der behandelten Gewebe folgte.

Die Entwicklung von Tumoren auf den Ohren ist dosisabhängig. Nach 24 Anwendungen (kumulative Dosis 4,5 χ 10⁵ J/m²) entw
Tumor auf den Ohren.

5 2
4,5 χ 10 J/m ) entwickelten nur 3% der Tiere einen

Nach 115 örtlichen Anwendungen von Psoralen, auf die in jedem Fall eine Bestrahlung von 10 Minuten folgte (kumulative Dosis 2,07 χ 10 J/m ) , entwickelten 100% der Tiere einen Tumor, wobei 50% der Tiere Tumore an beiden Ohren hatten.

Die gleiche, mit 3-CPs durchgeführte Behandlung, d.h.

115 Anwendungen auf die beiden Ohren, 30 Minuten Ruhe und 10 Minuten Bestrahlung, ergab weder ein Erythem noch eine Hautentzündung noch einen Tumor. Weder eine makroskopische noch eine mikroskopische Reaktion wurde während der Beobachtungsdauer von 450 Tagen festgestellt, Kein Tier starb. 3-CPs wurde ferner intraperitoneal getestet (36 Injektionen von je 0,4 mg über einen Zeitraum von 7 Wochen). Alle Tiere blieben am Leben ohne jede Gewichtsabnahme oder andere Zeichen von Toxizität.

Da die klinische orale Dosis etwa 0,6 mg/kg beträgt,

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stellt die Dosis von 0,4 mg für die Mäuse etwa die 30fache Dosis dar, die üblicherweise dem Menschen verabreicht wird.

Der wesentliche Vorteil der Verbindungen (I), insbesondere von 3-CPs, ist aus den vorstehenden Ergebnissen eindeutig erkennbar.

Beispiele

I. Für Versuche mit 3-CPs an Patienten, die an Psoriasis litten, wurde diese Verbindung wie folgt hergestellt:

Ein Gemisch von 0,162 g (1,00 mMol) S-Forrnyl-G-hydroxybenzofuran, hergestellt nach der Methode von L.R.Worden u.Mitarb. (Journal of Organic Chemistry, 84, Nr. 8, August 1963, S. 2311-2313), und 2,0 ml absolutem Äthanol wurde zur Auflösung des Benzofurans erwärmt, worauf 0,18 ml (1,2 mMol) Diäthylmalonat und 0,03 ml Piperidin zugesetzt wurden, wobei Rotfärbung eintrat. Das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten am Rückfluß erhitzt und der Abkühlung überlassen, worauf das Produkt kristallisierte. Durch Filtration wurden 0,216 g (84%) orangefarbene Plättchen vom Schmelzpunkt 151 bis 152°C erhalten. Durch zweimalige Umkristallxsation eines kleinen Teils aus Methanol für die Analyse wurden lange orangefarbene Nadeln vom Schmelzpunkt 153 bis 154°C erhalten.

ElernentaranaIyse: C H

Berechnet für ^c ₁₄ ^H ₁₀ ^o ₅ 65,12 3,90 Gefunden: 65,04 4,22

Die Wirksamkeit des in dieser Weise hergestellten 3-CPs wurde an 10 Patienten mit gewöhnlicher Psoriasis, die

2
200 bis 400 cm Haut bedeckte, untersucht.

Herstellung von l%iger 3-CPs-Salbe; 1 g 3-CPs wurde zu einem sehr feinen Pulver gemahlen und dann in 70 g "HYDROCERINE" (handelsübliches Produkt, hersteller ROC) bei 70⁰C dispergierto Bei 70⁰C wurden 29 ml Wasser zuge-

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setzt, wobei eine Wasser-in-Öl-Emulsion gebildet wurde. Die Salbe hatte somit die folgende Zusammensetzung:

Hydrocerin 70%

Wasser 29%

3-CPs 1%

Ein Konservierunasmittel, z.B. Methyl-p-hydrobenzoat, konnte in einer Menge von 0,1% zugesetzt werden. Ein solches Konservierungsmittel wurde vorzugsweise dem Wasser vor der Zugabe des Wassers zum "Hydrocerin" zugesetzt.

Wenn die Psoriasis-Läsionen stark verhornt waren, wurden sie vorher beispielsweise mit salicylhaltiger Vaseline gereinigt oder bestrichen.

Bei allen Patienten wurde die das 3-CPs enthaltende Salbe auf alle Läsionen mit Ausnahme von einer aufgebracht, um die spezifische Wirkung und nicht die Placebowirkung" nachzuweisen.

Die Bestrahlung erfolgte mit UV-Licht einer Wellenlänge

2 von 365 nm in einer Dosis von etwa 5 J/cm bei jeder .Einzelbehandlung unter Anwendung der üblichen PUVA-Therapie.

Es wurde festgestellt, daß 3-CPs langsamer wirkt als 8-MOP. Da jedoch 3-CPs kein Erythem und keine Hautentzündung verursachte, war es möglich, täglich zwei Behandlungen vorzunehmen oder sogar die Strahlendosis

bis auf 20 J/cm zu steigern.

Mit vier Anwendungen pro Woche wurde die Heilung in etwa 20 bis 40 Wochen erzielt.

Mit zwei Anwendungen pro Tag wurde die Heilung nach 20 bis 40 Behandlungen erreicht. Als Dauerbehandlung war es möglich, 2 Behandlungen pro Woche bis zu 1 Anwendung pro Monat bei einem Durchschnitt von einer Anwendung pro Woche vorzunehmen.

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- 2f -

IM

Ho Ein gleicher Versuch wurde unter Verwendung von 3-Cyano-psoralen (R₁ = -CN, R₂ = -H) durchgeführt.

1,62 g Formyl-5-hydroxy-6-benzofuran wurden in 30 ml Äthanol gelöst. 1,47 g Äthylcyanacetat und 400 mg Piperidin wurden zugesetzt, worauf 30 Minuten am Rückfluß erhitzt wurde.

Nach Kühlung, Filtration, Trocknen, Umkristallisation aus Acetonitril und anschließender Sublimation unter einem Druck von 13 mbar wurden gelbe Mikrokristalle vom Schmelzpunkt 259°C erhalten»

Elernen taranaIyse: C H N

Berechnet für C₁₂H₅NO₃: 68,24 2,37 6,63 Gefunden: 67,91 2,54 6,78 ·

NMR (CDCl₃) S H-4 9,08 ppm
I.R. (in KBr) V-C EN= 2210 cm"¹

III. Ein gleicher Versuch wurde durchgeführt, wobei jedoch 3-Carbomethoxypsoralen (R- = -H, R- = -CH.,) verwendet wurde.

1 g Formyl-5-hydroxy-6-benzofuran (hergestellt nach der Methode von L.R. Worden u.Mitarb. "J. Org. Chem.," 84, S. 2311-2313, und Po Queval und E. Bisagni, Eur.J.Med. Chem. Chim. Ther.) wurden in 20 ml Äthanol gelöst. Nach Zugabe von 200 mg Piperidin wurde das Gemisch 30 Minuten am Rückfluß erhitzt. -

Der nach Abkühlung erhaltene Feststoff wurde trocken filtriert und aus einer geringen Menge Äthanol umkristallisiert, wobei gelbe Nadeln vom Schmelzpunkt 191-192°C erhalten wurden.

Elementaranalyse:	3°5:	C	3	H
Berechnet für C._H,		63,94	3	,30
Gefunden:	8,86	63,87		,47
NMR (DMSO) S H-4:	ppm

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I.R. (in KBr) V-C = O : 1745 und 1695 cm"¹.

IV. Ein gleicher Versuch wurde unter Verwendung von S-Carboäthoxy-e-methylpsoralen (R₂ = -CH--, R- = -CHp-CH-), das nach der genannten Methode von P.Queval und E. Bisagni, Eur. J. Med. Chem., hergestellt worden war, durchgeführt.

Schmelzpunkt 188°C.

I.R.: 1^-C = 0 (Ester), 1730 cm"¹; Ό -C = 0 α-Pyron: 1750 cm"¹; V-C=C 1620 und 1590 cm"¹.

V. Um die Wirkung der Verbindungen gemäß der Erfindung mit Verbindungen von analoger Struktur

/R₂ = -H; R₃ = -C-(CH₃J_3-/

zu vergleichen, wurde Psoralen-3-t-butylcarboxylat nach der oben genannten Methode hergestellt und aus Cyclohexan umkristallisiert.

Schmelzpunkt: 162	- 164°C.	67	C	4	H
ElernentaranaIyse:		66	,12%	4	,93%
Berechnet:		,94%		,97%
Gefunden:

Diese Verbindung erwies sich als inaktiv.

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Claims (4)

-JT- Patentansprüche

1.J Monofunktionelle Psoralenderivate der Formel •J

in der R₁ für -COOR- oder -CN, R₉ für -H oder -CH₁. und R₃ für -H, -CH₃ oder-CH₂CH₃ steht.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R₁ für COOR, oder -CN, R₂ für -H oder -CH₃ und R₃ für -H oder -CH₃

steht.

3. Arzneimittelzubereitung für die Behandlung von Hautkrankheiten, enthaltend eine therapeutisch wirksame Menge wenigstens eines monofunktionellen Psoralenderivats nach Anspruch 1 und 2.

4. Arzneimittelzubereitung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß sie etwa o,5 bis 4 %, vorzugsweise etwa 1 bis 2 % des Psoralenderivats enthält.

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OR/G/NAL INSPECTED