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Benzthiazol-2-thion-derivate enthaltende Arzneimittel.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutische Präparate,
insbesondere Virustatika, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein Benzthiazolderivat
der allgemeinen Formel I
in welcher R einen gegebenenfalls durch Halogen oder Hydroxygruppen substituierten
niederen Alkylrest bedeutet, als Wirkstoff enthalten.
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Die erfindungsgemäßen Virustatica zeichnen sich gegenüber der Wirksamkeit
bekannter antiviraler Substanzen insbesondere dadurch vorteilhaft aus, daß sie sowohl
gegen RNS- als auch gegen DNS-Viren wirken. Die als Virustatica bekannten Substanzen
5-Jod-2'-Desoxyuridin und N-Methyl-Isatin-ß-Thiosemicarbazon wirken nur gegen DNS-Viren,
das bekannte Aminoadamantan nur auf RNS-Viren. Die Breitbandwirkung der erfindungsgemäßen
Virustatica gegen RNS- und DNS-Viren verschiedener Virusgruppen ist daher überraschend
und war nicht vorauszusehen.
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Daß es sich bei den vorliegenden Präparaten um antivirale Substanzen
mit virustatischer Wirksamkeit handelt, ergibt sich aus der nachgewiesenen Wirksamkeit
in vitro und in vivo.
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Die Untersuchung und Bewertung der virustatischen Wirkung erfolgte
nach folgenden Methoen: 1. Zellkulturteste In Zellkulturen wurde die virustatische
Wirksainkeit der Substanzen in vergleichenden Infektionstiterbestimmungen im Teströhrchen,
im Plaquehemmungs- sowie im Plaquereduktionstest geprüft. Die Auswertung der Teste
erfolgte im Vergleich zu virus freien und substanzfreien Zellkontrollen und zu substanzfreien
Viruskontrollen.
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Zur Auswertung wurden für die Röhrchenteste die Tabellen nach dem
Verfahren von Kärber (Kärber, G.: Naunyn-Schmiedeberg's Arch. exp. Path. Pharmak.
162, 480, 1931, berechnet von R.J. Lorenz, Bundesforschungsanstalt für Viruskrankheiten
der Tiere, Tübingen 1960) verwendet, während die Plaquetestergebnisse nach Lorenz
berechnet wurden (Lorenz, R.J. : Zur Statistik des Plaque-Testes. Arch. ges. Virusforschg.
12, 108-137, 1963).
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Die Irrtumswahrscheinlichkeit ist kleiner als 5%.
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ar Vergleichende Infektionstiterbestimmungen im Teströhrchen Jedes
Teströhrchen erhält 1 ml Erhaltungsmedium mit 100 wg Testsubstanz. Nach einer zweistündigen
Einwirkungszeit wird 1 ml Virusverdünnung zugefügt. Jede Virsuverdünnungsstufe ist
mit 6 Teströhrchen besetzt, der Test wird nach zweitägiger Begrütung bei 360C abgelesen.
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Berechnet wird die mittlere Infektionsdosis der Substanzreihe sowie
der substanzfreien Kontrolle.
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b) Plaquehemmungstest Nach 24 Stunden ausgewachsene Zellkulturen
in Piastikschalen werden mit 0,5 ml einer geeigneten Virusverdünnung beimpft und
nach einer Inkubationszeit von 2 Stunden bei 36 0C im C02-Brutschrank mit einer
Ionagarschicht bedeckt. Nach dem
Erstarren des Agars wird ein Testblättenen
X einem Durchmesser von 0,6 cm und einem Testsubstanzgchalt von 33 mg aufgelegt.
Die Testplatten werden nach einer zweitägigen Bebrütung bei 36°C mit einer zweiten
Agarschicht, die zum Anfärben der noch intakten Zellen Neutralrot oder Tetrazoliumchlorid
enthält, überschichtet. Nach einer weiteren Bebrütung über Nacht werden die Platten
ausgewertet. Die Viruswirksamkeit einer Substanz zeigt sich als ringförmige Plaquehemmung
um das substanzhaltige Testblättchen.
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c) Plaqueredu,tionstest Nach 24 Stunden ausgewachsene Zellkulturen
in Plastikschalen werden mit 0,5 ml einer geeigneten Virusverdünnung beimpft und
nach einer zweistündigen Inkubationszeit bei 36 0C im C02-Brutschrank mit 5 ml Ionagar
bedeckt, der pro ml zwischen 100 und 300 ug Testsubstanz enthält. Nach weiteren
zwei Bebrütungstagen wird mit 4 ml Ionagar überschichtet, der zum Anfärben der noch
intakten Zellen Neutralrot oder Tetrazoliumchlorid enthält. Nach einer weiteren
Bebrütung über Nacht werden die durch Virus gebildeten Plaques gezählt. Die Viruswirksamkeit
einer Substanz zeigt sich in ihrer Fähigkeit, die Plaquezahl gegenüber der substanzfreien
Viruskontrolle zu senken.
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2. Tierversuche Die Parainfluenza 3-Teste wurden in syrischen Hamstern
mit einem Gewicht zwischen 40 und 50 g durchgeführt.
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Parainfluenza 3-Versuche im Hamster Jeder Hamster erhält an 4 hintereinanderliegenden
Tagen in einmaliger Gabe 15 mg Testsubstanz (~300 mg/kg/Tag) per os. Eine Stunde
nach der ersten Substanzgabe wird der Hamster in leichter Äthernarkose mit 0,1 ml
einer geeigneten Virusverdünnung intranasal infiziert.
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Am 5. Versuchstage werden die.Hamster nach Äthernarkose entblutet,
die Lungen werden entnommen und der Virusgehalt der Lungen wird im Plaquetest geprüft.
Wirksamkeit der Testsubstanz bedeutet signifikant herabgesetzter Virusyehalt in
der Hamsterlunge.
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Die Ergebnisse der Untersuchungen sind in nachfolgenden Tabellen zusammengestellt.
In der Tabelle II bedeuten: + = Wirksam-in der geprüften Dosis (+)= Schwach wirksam
in der geprüften Dosis.
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T a b e l l e I Übersicht über unscre Testviren und aeren Xultur
| T e s t i n |
| Virus Typ Zellkultur T i e r |
| HeLa (HEZ*) Hamster |
| Influenza A2- RNS + |
| Mannkeim/57 |
| Influenza A2 - RNS |
| Japan/305/57 |
| Influenza A2 RNS |
| Hongkong/50/62 |
| Parainfluenza 3 RNS + + |
| Vesicular-Stomatits- RNS + |
| Indiana |
| Herpes simplex - DNS + |
| CAM 13 |
| Vaccinia - DNS + |
| Ankara |
*) primäre Hühnerembryonalzelle
Tabelle II
| Z e l l k u l t u r t e s t e T i e r v e r s u c h e |
| Infl. A2 Parainfl. Vesic. Herpes Vaccinia Parafinfluenza |
| Stomat. simpl. DNS RNS |
| 57 3 Virus DNS |
| RNS RNS RNS |
| a + + |
| b (+) + + + |
| c + |
a = 3-Chlormethyl-benzthiazolthion-(2) b = 3-Äthyl-benzthiazolthion-(2)
c = 3-liydroxymethyl-benzthiazolthion-(2).
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Die Verbindungen der allgemeinen Formel I sind bekannt. Die Herstellung
erfolgt in an sich bekannter Weise durch Umsetzung von 2 -Mercaptobenzthiazol mit
entsprechend reaktiven Derivaten, welche den Rest R enthalten oder eine in diesen
überführbare Gruppe besitzen. Als reaktive Derivate kommen beispielsweise Alkylhalogenide
oder niedere Aldehyde infrage. Das Herstellungsverfahren wird in den nachfolgenden
Beispielen jeweils erläutert.
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Die Substanzen I können in flüssiger oder fester Form oral und parenteral
appliziert werden. Als Injektionsmedium kommt vorzugsweise Wasser zur Anwendung,
welches die bei Injektionslösungen üblichen Zusätze wie Stabilisierungsmittel, Lösungsvermittler
und/ oder Puffer enthält. Derartige Zusätze sind z.B. Tartrat- oder Borat-Puffer,
Äthanol, Dimethylsulfoxyd, Komplexbildner (wie Ä.thylendiamintetraessigsäure), hochmolekulare
Polymere (wie flüssiges Polyäthylenoxid) zur Viskositätsregulierung. Feste Trägerstoffe
sind z.B. Stärke, Lactose, Mannit, Methylcellulose, Talkum, hochdisperse Kieselsäure,
höher-molekulare Fettsäuren (wie Stearinsäure), Gelatine, Agar-Agar, Calciumphosphat,
Magnesiumstearat, tierische und pflanzliche Fette, feste hochmolekulare Polymere
(wie Polyäthylenglykole). Für die orale Applikation geeignete Zubereitungen können
gewünschtenfalls Geschmacks- und Süßstoffe enthalten. Für die äußerliche Behandlung
werden die Substanzen I in Form von Salben mit üblichen Salbengrundlagen oder als
Tinkturen angewandt.
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In den folgenden Beispielen wird die Erfindung näher erläutert.
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Beispiel 1 Pharmazeutisches Präparat in Saftform 1000 g 3-Hydroxymethyl-benzthiazolthion-(2)
werden mikronisiert (Korngröße 1-5 ,>) und in 10 Litern einer 300C warmen Lösung
von 500 g Polyoxyäthylenstearat (Myrj 52) und 500g Stärkesirup mittels eines Intensivrührers
feinst suspendiert. Die Wirkstoffsuspension wird in 60 Litern einer gemäß a.) hergestellten
Lösung von Nipabutyl, Farbstoff (Tartrazin), Zucker und Aroma (Vanillin) homogen
eingerührt und durch Zusatz von Wasser und Stärkesirup auf eine Viskosität von etwa
500 cp gebracht, um einer Entmischung vorzubeugen.
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Die erfindungsgemäß verwendete Verbindung ist bekannt [Zhur. Obshchei.
Khim. 30, S.689-694 (1960); CA 23, 2691; CA 54, 24665b] und wird wie folgt hergestellt:
50 g (0,3 Mol) 2-Mercaptobenzthiazol werden mit 50 g (0,5 Mol) wässriger Formalinlösung
2-3 Stunden am Rückfluß gekocht und nach dem Erkalten in Eiswasser gegossen.
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Der ausfallende kristalline Niederschlag wird abgesaugt und aus Chloroform
umkristallisiert. Man erhält 31 g 3-Hydroxymethylbenzthiazol-2-thion vom Fp. = 120-125°C.
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B e i s p i e 1 2 Pharmazeutische Zubereitung in Tablettenform 50
g 3-Chlormethyl-benzthiazolthion-(2) werden mit 40 g Milchzucker und 40 g Maisstärke
gemischt und unter Zusatz von lOtigem Maisstärkekleister granuliert. Das fertige
Granulat wird durch ein Sieb mit der Maschenweite 0,8 mm gesiebt. Anschließend werden
dem so erhaltenen Granulat lOg Methylcellulose, 10 g Talkum und 2 g Magnesiumstearat
zugemischt. Die
Mischung wird dann homogenisiert und zu Tabletten
mit einem Durchmesser von 9 mm mit einem Gesamtgewicht von 202 mg verpreßt Die erfindungsgemäß
verwendete Verbindung ist bekannt rßhur. Obshchei khim. 30, S.689-694 (1960), CA
43, 1767; CA 54, 24665b] und wird wie folgt hergestellt: 19,7 g (0,1 Mol) 3-Hydoxymethylbenzthiazol-2-thion,
8,5 g (0,05 Mol) Phosphoroxidchlorid und 50 ml Äthylenchlorid werden 30 Minuten
unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen wird mit Natronlauge und Wasser gewaschen
und aus Chloroform umkristallisiert. Man erhält ca.
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5 g 3-Chlormethyl-benzthiazolthion-(2) vom Fp. 123-125°C.
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Beispiel 3 Pharmazeutische Zubereitunq in Drageeform 30 g 3-Athyl-benzthiazolthion-(2)
werden gemäß Beispiel 2 mit 25 g Milchzucker, 25 g Maisstärke, 5 g Methylcellulose,
5 g Talkum und 1 g Magnesiumstearat zu einer Grundmasse verarbeitet, welche zu gewölbten
Dragéekernen mit einem Gesamtgewicht von 110 mg verpreßt werden. Die so erhaltenen
Kerne werden anschließend in bekannter Weise mit einer Z.uckerdragierschicht überzogen
und anschließend gewachst.
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Die erfindungsgemäß verwendete Erfindung ist bekannt [Zhur. Obshchei
Khim. 19 (1949), S. 1523-1528, CA 44, 3487 g] und wird wie folgt hergestellt: 20
g 2-Äthylmercaptobenzthiazol werden mit 0,5 g Jod für 3 Stunden im Glasautoklaven
auf 210°C erhitzt. Zur
Aufreinigung wird zunächst mit Salzsäure
nicht isomerisiertes Ausgangsprodukt abgetrennt und der verbleibende Rückstand aus
Äthanol umkristallisiert. Man erhält 5 g 3-Äthylbenzthíazolthion-(2) vom Fp. = 77-780C.