DD146049A5 - Verfahren zur herstellung von komplexverbindungen von 9-hydroxyalkyl-purinen - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Komplexverbindungen von 9-Hydroxyalkyl-purinen der allgemeinen Formel, in der X die Gruppe NH&ind2!-, HO-, HS-, RO- oder RS bedeutet, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder die Benzylgruppe ist, oder X ein Chlor- oder Jodatom darstellt, R&exp1! Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und R&exp2! Wasserstoff oder die Methylgruppe ist, Y das Salz eines Amins der allgemeinen Formel (Formel) in der R&exp3! und R&exp4! niedere Alkylgruppen mit z.B. 1 bis 4 Kohlenstoffatomen sind und n eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist, mit p-Acetamidobenzoesaeure oder anderen pharmazeutisch annehmbaren Saeuren bedeutet und z eine Zahl von 0 bis 10 ist. Diese Verbindungen sind als Immunmodulatoren und antivirale Mittel wirksam und besitzen in spezifischen Faellen Anti-Tumor-Wirkung.
Description
I 5 49 5 ~Ί~ Berlin, den 20.2.1980
56 114/12/36
Verfahren zur Herstellung von Komplexverbindungen von 9-Hydroxyalkylpurinderivaten
Die Erfindung betrifft die Herstellung von Komplexverbindungen mit 9-Hydroxyalkylpurinderivaten der allgemeinen Formel
? (Y)z
CH —- R2
OH
in der X die Gruppen HH2-, HO-, HS-, RO- oder RS- bedeutet, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen oder die Benzylgruppe ist, oder Σ ein Chlor- oder Jodatom darstellt, R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis
ρ Kohlenstoffatomen und R Wasserstoff oder die Methylgruppe ist, Y das Salz eines Amins der allgemeinen Formel
in der R-^ und R^" niedere Alkylgruppen mit z. B. 1 bis
~r-.r-.-ri ,non .O f. ', L j.i LD. t30U'vO'J -i
2 1 S 495 -2" 20.2.1980
5β 114/12/36
Kohlenstoffatomen sind und η eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist, init p-Acetamidobenzoesäure bedeutet und ζ eine Zahl von 0 bis 10 ist.
In der US-PS 3 215 696 wurde bereits ein Verfahren zur Herstellung von 3-substituierten Adeninen (3-substituierten 6-Amino-purinen) und in der US-PS 4 031 218 7-(2-Hydroxypropyl)-1,3-di-n-propy!xanthin mit bronchienerweiternder Wirkung vorgeschlagen.
Beide Verbindungen sind von der chemischen Struktur den erfindungsgemäßen Verbindungen verwandt, weisen aber andere Wirkungen auf.
Das Ziel der Erfindung liegt in der Herstellung neuartiger Verbindungen mit neuartigen Wirkungen, Es sollten neue Immunmodulatoren hergestellt werden, die z.B. nach Organtransplantationen auftretende Immunreaktionen, die zu einer Organabstoßung führen, unterdrücken. Andererseits sollen sie z. B, bei Infektionskrankheiten die Immunreaktionen stimulieren*
Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit immunmodulatorischer, anti-viraler und Anti-Tumor-Wirkung herzustellen«
Die erfindungsgemäß erhältlichen Verbindungen sind als Immunmodulatoren sowie als antivirale Mittel brauchbar
-3- 20.2.1980
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und haben in speziellen Fällen Anti-Tumor-Wirkling« Die Komplexverbindungen, in denen ζ = 1 bis 10 ist, sind neu·
Yfenn R Wasserstoff ist, verbessert die Gegenwart von Y die immunsteuernden und die antiviralen Eigenschaften.
Y/enn X die NHp-CiT11PP6 bedeutet, liegt immunhemmende, aber.
keine immunstimulierende (immunpotenzierende) Wirkung vor.
Die immunsteuernde Wirkung scheint mit zunehmender Kettenlänge von R , zumindest von der Methyl- bis Hexylgruppe zuzunehmen* Vorzugsweise ist R eine geradkettige Alkylgruppe, de h. die Methyl-, Ethyl-," n-Propyl-, η-Butyl-, n-Amyl-,
2 n-Hexyl-, n-Heptyl- oder n-Octylgruppee R ist vorzugsweise die Methylgruppe. R kann die Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, η-Butyl-, die Isopropylgruppe u. ä. sein. Wenn X die NHp-Gruppe bedeutet, kann die Verbindung als freie Base oder in Form ihres Salzes mit einer nichttoxischen Säure vorliegen, d. h. mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure, wie Chlorwasserstoff säure, Bromwasserstoffsäurey Schwefelsäure, Phosphorsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Weinsäure, Salicylsäure, Acetylsalicylsäure, Eissigsäure, Propionsäure, p-Toluolsulfonsäure, Methansulfonsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure und Adipinsäure.
Eine bevorzugte Klasse von Aminen für die Salzbildung mit der p-Acetamidobenzoesäure hat die allgemeine Formel
215 49 5 -4- 20.2.1980
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CIl R2
OH
in der R und R niedere Alkylgruppen darstellen, z. B.'die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Isopropyl- oder Butylgruppe, und η eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist· Typische Beispiele für solche Amine umfassen Mmethylaminoethanol, Dimethylaminoisopropanol, Diethylaminoethanol, Diethylaminoisobutanol, Diethylaminoisopropanol, Methylethylaininoethanol, Diisobutylamino-N-butanol, Dimethylaininopropanol, Dimethylamino-N-butanol, Diis ο but ylainino ethanol, Dimethylaminobutanol, Dibutylamino-H-butanol, Dibutylaminoethanol, Dipropylaminoethanol und Diisopropylaminoethanol· Das zur Zeit bevorzugte Amin ist Dimethylaminoisopropanol. Wenn Y vorhanden ist, d· h# ζ = 1 bis 10 ist, bedeutet ζ vorzugsweise 3· ζ kann jedoch auch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 sein.
Obwohl für die Salztdldung mit dem Amin
die p-Acetamidobenzoesäure bevorzugt wird, können auch Salze
-5- -20.2.1980
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Der Formel Y verwendet v/erden, in der das Amin die vorstehend angegebene Bedeutung hat und die Säure eine andere pharmazeutisch annehmbare Säure als p-Acetamidobenzoesäure ist, ζ« B. Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Bromwasserstoff säure, Phosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure, Malonsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Weinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Adipinsäure, Maleinsäure, Bernstein- . säure,. Methansulfonsäure, Salicylsäure oder Acetylsalicylßäure.
Wenn in den erfindungsgemäßen Verbindungen Y vorhanden ist, bedeutet die Abkürzung DIP«PAcBA Dimethylamino-2-propanol-pacetamidobenzoat« Wenn keine Zahl in Klammern, z. B, (10), dieser Abkürzung folgt, bedeutet Y 3· Wenn nach der Abkürzung DIP.PAcBA eine Zahl in Klammern angegeben ist, bezeichnet sie die Anzahl der Mole Y je ein Mol 9-Hydroxyalkylpurin«
Man nimmt an, daß die in der Tabelle 1 angegebenen Verbindungen rein sind, mit Ausnahme der Verbindung 15443» die außer der.erfindungsgemäßen Verbindung ein Salz zu enthalten scheint.
Immunmodulatoren sind die Immunreaktion steuernde bindungen, die sowohl immunstimulierend (iinmunpotenzierend) als auch immunhemmend wirken können. Die 'Immunstimulierung ist selbstverständlich für den Aufbau von Immunitat von Bedeutung· Die Inmiunhemmung ist ebenfalls für eine Reihe von Gebieten wichtig, z. B. für Organtransplantationen, z.B. von Nieren oder Herzen, um eine Organabstoßung zu ver-
15 495 -β- 20,2.1980
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hindern»
In den Tabellen ist die immunpotenzierende Wirkung einer Verbindung mit einem Pluszeichen (+) und die immunhemmende Wirkung mit einem Minuszeichen (-) angegeben· Die Zahl 0 bedeutet, daß die Verbindung weder iinmunpotenzierende noch immunhemmende Wirkung besitzt0
Ein Mitogen ist eine Substanz, die eine Zellproliferation einleitet, wie sie während der Immunisierung auftritt·
In der Tabelle 1 sind erfindungsgemäß hergestellte Verbindungen aufgeführt.
Die in der Tabelle 1 angegebenen Herstellungsverfahren A bis L sind später näher beschrieben·
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Behandlung von Menschen und Säugetieren sowie von Zellen von Menschen und Säugetieren, einschließlich Schweinen, Hunden, Katzen, Rindvieh, Pferden, Schafen, Ziegen, Mäusen, Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen, Hamstern, Affen ue ä», verwendet werdenο
Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich alle Teile und Prozentsätze vorliegend auf das Gewicht.
215 49 5 -7- 20,2.1980
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Ebenso sind alle Temperaturen, sofern nichts anderes angegeben ist, in Grad Celsius ausgedrückt·
Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen können allein oder im Gemisch unter Verwendung üblicher Träger- und Hilfsstoffe, z« B. in Form von Tabletten, Pillen, Kapseln u. ä·, oral, rektal, vaginal, enteral, nasal oder in Form injizierbarer, z. B. mit Wasser hergestellter Lösungen, parenteral verabfolgt v/erden»
2154
20.2.1980 5β 114/12/36
Chemische Eigenschaften von 9-Hydroxyalkyl-purinen
00.
~~CH "" R2 OH
| Uo. | R1 | Verbindung | R2 | X | Y | Herst ellungsverfahren |
| H | H | OH | mm | |||
| 15425 | H | H | OH- | DIP.PAcBA | D | |
| 15428 | H | H | SH | L | ||
| 15435 | H | H | SH | DIP.PAcBA | σ | |
| 15437 | H | CHo | OH | - | L | |
| 15446 | H | CH3 | OH | DIP0PAcBA | A | |
| 15447 | H | CH3 | ITH2 | - | L | |
| 15431 | H | CH3 | NH2 | DIP.PAcBA | B | |
| 15432 | CHo | H | I | - | L | |
| 15427 | CHo | H | Cl | Ml | E | |
| 15423 | CH3 | H | HH2 | - | P | |
| 15433 | CHo | H . | NH2 | DIPoPAcBA | G | |
| 15434 | L | |||||
-9- 20.2.1980
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| Ho. | R1 | Verbindung | X | DIP. | Y | Herst ellungsverfahren |
| - | CH3 | R2 | OH | mm | ||
| 15443 | CH3 | H | OH | DIP. | PAcBA | H |
| 15444 | °6H1ß | H | OH | - | L | |
| 15417 | °6H13 | H | OH | DIP. | PAcBA | I |
| 15418 | °6H1ß | H | OH | HCl | - | L |
| 15392 | G6H13 | CH3 | OH | PAcBA. | J | |
| 15410 | WO | CH3 | NH2 | Salz | L | |
| 15426 | CH3 | K | ||||
VO cn
O CM CO τ-, CTv \,
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r- CT. T- O in VQ CMCMCM
| τ— | Ln | T-CM | OO | cn co | 0 | cn cn | |
| CM τ- T- | • · | τ- O | H | ||||
| ν— τ— | • · | CMCM | |||||
| C-VO C— | OJ OJ | OO | Ln | CMCM | |||
| in | LnLn | CMCM | T-C- | ||||
| •ΰ Ln | C-VO | C-VO | |||||
| cn co in | β · | cnco | β « | ||||
| OJt-CM | C-C- | • * | C-C- | ||||
| CM CM CM | C-H | C-C- | COVO | ||||
| oom | OO | T-C- | in in | ||||
| Lnu~\Ln | CTvCTv | cn cn | |||||
| CMCMCM | U^Ln | OO | UMn | ||||
| Q) φ | Q) Q) | ||||||
| CTv | φ φ | ||||||
| CT. | C-HO τ— | C-HO r— | |||||
| τ- | CTiC-VO | C-HO τ— | C-OC- | ||||
| Ι | ο cn er» | C-VO £— | |||||
| CO | τ^°Η | HcnH | (TvCTiCTv | ||||
| CT. | OJ cn"3- | ||||||
| τ— | ^o cn | τ-τ-τ- | |||||
| m | CM CMCM | ocn Ln | |||||
| CM CM CM | •^CM O | cn cn cn | |||||
| ο OLn | CMCMCM | CMCM CM | |||||
| in · r- | LninLn | CM CM CM | τ- CTiT- | ||||
| OJCMCM | OCO^ | ^o in Ln | |||||
| in ^3- in | CM OJ OJ | ||||||
| CMCMCM | 0 | ||||||
| O | 0 | ||||||
| O | |||||||
| O | CT. | ||||||
| VO | O | I | |||||
| CM | VO | ||||||
| CM | CM | C- | |||||
| C- | O | ||||||
| τ— | CM | VO | |||||
| CM | CM | ||||||
| cn | Ln τ— | CTv | |||||
| cn | in ' τ— | ||||||
| Ln | in | ||||||
* *& -11- 20.2.1980
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Andere erfindungsgemäße Verbindungen, deren Grundstruktur der in der Tabelle 1 angegebenen entspricht, sind in der Tabelle 1a aufgeführt. In den Tabellen 1 und 1a sind alle für R angegebenen Alkylgruppen η-Alky!gruppen»
Tabelle 1a Verbindung
| E1 | E2 | X | Y |
| °6H13 | CH3 | OH | DIP.PAcBAd 0) |
| °6H13 | CH3 | OH | DIP.PAcBAd) |
| H | CH3 | OH | DIP.PAcBA(10) |
| H | CH3 | OH | DIP.PAcBAd) |
| CH, | CH3 | OH | - |
| CH3 | CH3 | OH | DIP.PAcBA |
| O2H5 | H | OH | DIP.PAcBA |
| °2H5 | H | OH | - |
| C3H7 | H | OH | - |
| C3H7 | H | OH | DIP.PAcBA |
| C2H5 | CH3 | OH | - |
| O2H5 | CH3 | OH | DIP.PAcBA |
| C3H7 | CH3 | OH | - |
| C3H7 | CH3 | OH | DIP.PAcBA |
| C4H9 | H | OH | - |
| O4H9 | H- | OH | DIP.PAcBA |
| C4H9 | CH3 | OH | - |
| O4H9 | CH3 | OH | DIPiPAcBA |
| 21 | R1 | R2 | } -12- | 20.2.1980 |
| H | 56 114/12/36 | |||
| C5H11 | H | Tabelle 1 a | (Fortsetzung) | |
| C5H11 | CH3 | Verbindung | ||
| C5H11 | CH3 | X | Y | |
| C7H15 | H | OH | - . | |
| C7H15 | H | OH | DIP.PAcBA | |
| C7H15 | CH3 | OH | DIP.PAcBA | |
| C7H15 | CH3 | OH | - | |
| C8H17 | H | OH | - | |
| C8H17 | H | OH | DIP.PAqBA | |
| C8H17 | CH3 | OH | - | |
| C8^i 7 | CH3 | OH | DIP.PAcBA | |
| C6H13 | CH3 | OH | ||
| C6H13 | CH3 | OH | DIP. PAeBA.. | |
| C6H13 | H | OH | - | |
| C6H13 | H | OH | DIP.PAcBA | |
| GH3 | H | OCH3 | - | |
| CH3 | H | A/1TT | DIP.PAcBA | |
| H | H | DIP.PAcBA | ||
| H | H | OCH3 | - | |
| H | CH3 | OCH3 | ||
| H | CH3 | OCH3 | DIP.PAcBa | |
| OCH3 | - | |||
| OCH3 | DIP.PAeBA | |||
| OCH3 | DIP.PAcBA | |||
| OCH3 |
215 49 5 -13- 20.2.1980
56 114/12/36
gabeile 1a (Fortsetzung)
| R2 | Verbindung | X | |
| R1 | CH3 | OC2H5 | |
| C6H13 | CH3 | OC2H5 | |
| C6H13 | H | OC2H5 | |
| C6H13 | H | OC2H5 | |
| C6H13 | CH3 | OC3H7 | |
| °6H13 | CH3 | OC3H7 | |
| C6H13 | H | OC3H7 | |
| CH3 | H | OC3H7 | |
| CH3 | H | OC3H7 | |
| H | CH3 | OC3H7 | |
| H | CH3 | OC4H9 | |
| C6H13 | CH3 | OC4H9 | |
| C6H13 | H | OC4H9 | |
| C6H13 | H | OC4H9 | |
| C6H13 | H | OC4H9 | |
| H | H | OC4H9 | |
| H | CH3 | OC4H9 | |
| H | CH3 | OC4H9 | |
| H | CH3 | OC4H9 | |
| CH3 | CH3 | OC4H9 | |
| GH3 | H | OC4H9 | |
| CH3 | H | OC4H9 | |
| GH3 | |||
DIP.PAcBA DIP.PAcBA
DIP·PAcBA DIP,PAcBA
DIP.PAcBA DIP.PAcBA DIP.PAoBa DIP.PAcBA DIP.PAcBA DIP.PAcBA DIPoPAcBA DIP.PAcBA
215^95 ~14~ . -. 20.2.1980
56 114/12/36
ffa/belle 1a (Fortsetzung) Verbindung
SCH3
SCH3 DIP.PAcBA
SCH3
SCH3 DIP.PAcBA
| R1 | R2 |
| C6H13 | CH3 |
| C6H13 | CH3 |
| C6H13 | H |
| °6H13 | H |
| CH3 | CH3 |
| CH3 | CH3 |
| CH3 | H |
| CH3 | H |
| H | H |
| H | H |
| H | CH3 |
| H | CH3 |
| C6H13 | CH3 |
| C6H13 | CH3 |
| C6H13 | H |
| C6H13 | H |
| CH3 | H |
| CH3 | H |
| H | H |
| H | H |
| H | CH3 |
| H | CH3 |
SCH3
DIP.PAcBA
SCH3 -
SCH3 DIP.PAcBA
SCH3
SCH3 DIP.PAcBA
SCH3 DIP.PAcBA
SCH3
SC4H9
SC4H9 DIP.PAcBA
SC71Hq DIP .PAc BA
4 y
S04H9
SC4H9 -
SC4H9 DIP.Px\cBA
SC4H9 DIP.PAcBA
SC4H9 DIP.PAcBA
OH DIP.PAcBA(IO)
20.2.1980 56 114/12/36
Tabelle 1a (Fortsetzung) Verbindung
C6H13 °6H13 °6H13 °6H13
°6H13 °6H13 °6H13
CH.
H H
CH, CH-
H H
| X | Y |
| OH | DIP.PAcBAd) |
| O-Benzyl | - |
| O-Benzyl | DIP.PAcBA |
| O-Benzyl | - |
| O-Benzyl | DIP.PAcBA |
| S-Benzyl | - |
| S-Benzyl | DIP.PAcBA |
| S-Benzyl | - |
| S-Benzyl | DIP.PAcBA |
215 49 5 "16~ 20.2.1980
56 114/12/36
Nachfolgend ist die Herstellung erfindungsgemäßer Verbindungen erläutert.
Verfahren A 9-(2-HYDROXY-I-PROPYL)-HYPOXAIiTHIN (NPT 15446)
AcOH
CH2 CH CH3 CH — CH CH3
4,0 g (20,7 mMol) 9- (2-Hydroxy-i-propyl)-adenin (I) wurden in 20 ml 50 %iger Essigsäure suspendiert und langsam mit 4 g (58 Mol) Natriumnitrit versetzt0 Die Mischung wurde drei Stunden bei 25 C gerührt« Die erhaltene Lösung wurde zur Trockene eingedampft,, und Isopropanol wurde zugegeben. Diese Operation wurde einmal wiederholte Der feste Rückstand wurde in Isopropanol zum Sieden erhitzt und filtriert. Das Piltrat wurde eingedampft und durch Zugabe von Aceton kristallisiert« Die Umkristallisation aus Isopropanol/ Methanol (98 : 2) ergab ein farbloses kristallines Produkt. Ausbeute 3,3 g (82 %); P = 244 bis 250 0C; UV (HQ0, pH 5,5) A max = 250 nm.
1 5 495
-17- 20.2-1980-
56 114/12/36
9- ( 2-HYDR0XY-1 -PROPYL) -6-CHLOR-PURIIT
Cl
^i HH2
IT-CH -CH-CH -Λ ' H (CpH 0) CH *-
OH \ ^SlH-CH0-CH-CH. L·
OH
HO
Man arbeitete nach den Verfahren von Schaeffer, H«J., Vogel, D. und Vince, R., J. Med. Chenu Band 8 (1965), Seite 502 und Schaeffer, H»J, und Vince, R., J. Med. Chem. Band 10 (1967), Seite 689.
Eine Lösung von 20 g (0,12 Mol) 5-Amino-4»6-dichlorpyrimidin (I) in 200 ml einer 11%igen ethanolischen Lösung von Isopropanolamin wurde acht Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde zu einem Sirup eingedampft, mit Ethanol versetzt und nochmals eingedampft. Diese Operation wurde einmal wiederholt« Der erhaltene Sirup wurde in 300 ml V/asser gegossen, worauf man eine kristalline Masse erhielt. Sie wurde abfiltriert und ergab nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen 19g rohes 9-(2-Hydroxy-1-propylamino)-5-amino-6-chlorpyrimidin (II).
-18- 20·2·1980
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Die rohe Verbindung II v/urde in 120 ml Triethylorthoformiat suspendiert, zu dem man fünf Tropfen Ethansulfonsäure gab· Nach 15 Minuten hatten sich die gesamten Peststoffe gelöst, und die Lösung wurde über Nacht auf 25 0C gehalten· Beim Eindampfen im Vakuum erhielt man einen dicken Sirup, der zur Entfernung überschüssigen Isopropanolamins unter hohem Vakuum eingedampft wurde. Die Kristallisation aus Xylol ergab 5 g rohes Material· .
9-(2-HYDR0XY-1-PROPYP-ADENIN (NPT 15431) Cl
Ν ^jT^ ^ NH3/Me OH
l^v LL / -ι O0O
^N' ^N
CH2- CH OH
9 g (42,4 mMol) 9-(2-Hydroxy-1-propyl)-6-chlorpurin (I) wurden in gesättigtem methalonischen Ammoniak und 50 mg Ammoniumchlorid gelöste Die Mischung wurde in einer Bombe sechs Stunden auf 130 0C erhitzt· Die gebildete Lösung wurde zur Trockene eingedampft und aus Ethanol/Aceton umkristallisiert e Ausbeute 6,68 g eines farblosen kristallinen Produkts (81 %); P = 193 bis 194 °C; UV (H2O, pH 5,5) -A. max = 260 nm;
-19- 20.2.1980
56 114/12/36
"DünnschichtChromatographie in CHCl- : CHoOH (5 : "I)R-0,44. -
Analyse für C8H11N5O berechnet: C 49,73;
H 5,74; IT 36,25.
gefunden: C 49,56;
H 5,62; N 36,22.
9-(1 -HYDROXYETHYL)-6-MERCAPTOPURIn (NPT 15435) Cl
SH
CH2OH
Man arbeitete nach dein Verfahren von Schaeffer und Bhargava, Biochemistry Band 4 (1965), Seite 71·
2 g (0,01 Mol) 9-(1-Hydrosyethyl)-6-chlorpurin (I) und 0,76 g (0,01 Mol) Thioharnstoff wurden in 15 ml Ethanol gelöst und 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und in V/asser zu einer Aufschlämmung suspendiert»
-20- 20,2.1980
56 114/12/36
Die Neutralisation mit Natriumacetat ergab farblose Kristalle· Ausbeute 1,5 g (76 %); P = 278 bis 280 0C;- UV (H2O, pH 5,5) •Λ max = 320, 230 um.
(NPT 15425)
Cl
I NaOH N
CH0 " CH0OH
^ 2 CH2 CH2OH
Man arbeitete nach dem Verfahren von Schaeffer, H,J· und Bhargava, P.S., Biochemistry Band 4 (1965), Seite 71.
4 g 6-Chlor-9-hydroxyethyl-purin (III) wurden langsam zu 30 ml warmem η UaOH gegeben und zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt· Das Reaktionsgemisch wurde dann in Eis gekühlt und mit Eisessig neutralisiert» Nach dem Filtrieren wurden Teile nichtumgesetzter Verbindung III entfernt· Das Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert und mit Aceton gewaschen· Man erhielt farblose Kristalle in einer Ausbeute von 1 g (28 %); ρ = 274 0C; UV (H0O, pH 5,5) λ max. = 250 mn.
215 49 5 ~21~ 20*2.1980
56.114/12/36
Verfahren E 9-(I-HTOROXY^-PROPYL)-6-JODPURIN (NPT 15427)
| Hl | < | ι |
| -10° | /0H\ H3C | |
| OH |
CH2OH
1»5 g (7 mMol) 9-(1~Hydroxy-2-propyl)-6~chlor-purin (I) wurden bei - 10 0C zu 15 ml Jodwasserstoffsäure gegeben, wobei man 45 Minuten rührte. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit wasserfreiem Natriumacetat bei 5 0C neutralisiert und 3mäl mit wenig kaltem Wasser gewaschen· Die Umkristallisation aus Ethanol/ELO ergab farblose Iiristalle in einer Ausbeute von 0,9 g (42 %); E= 193 bis 194 0C; UV (H2O, pH 5,5) Ά. max = 276 um.
Analyse berechnet für CqHqH.OI (Molekulargewicht 304»1)
. C 31,60;
H 2,98; K 18,43; I 41,73;
gefunden: C 31,53;
H 2,96; N 18,18; I 41,70.
20.2.1980 56 114/12/36
Verfahren
9-(1 -HYDR0XY-2-PR0PYL)-6-CHLOR-PURIh (HPT 15423)
+CH3-CH-CH2OH
CH3 CH2OH
Es wurde das Verfahren nach Schaeffer, HeJ« und Schwender, CF., J. Med. Chem· Band 17 (1974), Seite 6 angewandt. Eine Lösung von 6,56 g (40 mMol) 5-Amino~4,6-dichlorpyrimidin (I) und 3,3 g (44 mMol) 2-Amino-1-propanol (II) wurde in 283 ml n-Pentanol und 96 ml tert.-Butylamin 45 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluß erhitzt« Dann wurde die Lösung zu einem Sirup eingedampft, viermal Ethanol zugegeben und abgedampft* Der erhaltene Sirup-wurde in 150 ml Triethylorthoformiat und 10 Tropfen Ethansulfonsaure suspendiert. Die Suspension wurde heftig über Hacht gerührt, dann zur Trockene eingedampft und mit Ethanol versetzt. Diese Operation wurde dreimal wiederholt.
21549 5 -23- 20.2.1980
56.114/12/36
Während des Eindampfens kristallisierte das Produkt in farbloser Form, Die Kristalle wurden abfiltriert, das Piltrat wurde eingedampft, mit Ethanol versetzt und diese Operation dreimal wiederholt. Man erhielt 3,6 g rohes Material·
Durch Umkristallisation aus 98%igem wäßrigen Ethanol erhielt man 2,79 g (32 %) gereinigtes Produkt. UV (H2O, pH 5,5) A max = 265 nm; P = 201 bis 203 0C.
| Analyse für | ι OCl berechnet; | Verfahren G | : C | NH3/Me0H | 45,20 | • 9 | 15433) |
| Γ | H | 130° | 4,26 | • | N ) N | ||
| N | 26,36 | • » | |||||
| Cl | 16,68 | 9 t | |||||
| gefunden: | C | 45,11 | • J | ||||
| H | 4,27 | « > | |||||
| N | 26,25 | • » | |||||
| Cl | 16,71 | • | |||||
| 9-(1 | -HYDROXY-2-PROPYL)-ADENIN | (NPT | |||||
| Cl | :"> I | NH2 OC ^N ^ | |||||
CH3
Man arbeitete nach dem Verfahren von Schaeffer, H. und Schwender, C, J. Pharm«, Sei. Band 60 (1971), Seite 1204 und nach Schaeffer und Mitarbeitern, J. Med. Chem. Band 15 (1972), Seite 456,
215495 -24- 20.2,1980
56 114/12/36
2,0 g (9,4 mBIol) 9~(1-Hydroxy-2-propyl)-6-chlor-purin (I) wurden in 30 ml Methanol/Ammoniak und 50 mg Aranioniumchlorid, das als Katalysator zugesetzt war, suspendiert· Die Mischung wurde 4 1/2 Stunden auf 130 0C erhitzt. Dann wurde die Lösung zur Trockene eingedampft« Die Umkristallisation des erhaltenen Rohprodukts aus Ethanol ergab farblose Nadeln in einer Ausbeute von 1,15 g (63 %); P = 215 bis 216 0C; UV (H2O, pH 5,5) λ max = 260 nm.
Verfahren H .
9-(1 -HYDROXY-2-PROPYL·)-HYPOXANTHIN (HPT 15443)
H3C CH2OH H3C CH2OH
I II
4 g (21 mMol) 9-(1-Hydroxy-2-propyl)-adenin (I) v/urden in 20 ml 50%iger Essigsäure gelöst, v/orauf man 4 g (58 rnliol) Natriumnitrat zugab und die Mischung 3 1/2 Stunden bei 25 0C rührte« Die Lösung wurde zweimal mit Isopropanol zur Trockene eingedampft« Der erhaltene Rückstand wurde in Isopropanol aufgenommen, filtriert, der Niederschlag verworfen und das
215495 -25- 20.2.1980
56 114/12/36
Filtrat zu einem Gel eingedampft, das sich bei der Zugabe von Aceton verfestigte. Ausbeute 3,65 g (90 %) farblose Kristalle. Die Reinigung erfolgte durch Umkristallisation aus Isopropanol/Methanol (98 : 2)„ F= 202 bis 207 0C; Bünnschichtchromatographie in CHCl : CHoOH (5:1)1
i.5? λ
Flecken Rf = 0,30; UV (H2O, pH 5,5; A max = 250 run.
Verfahren I Verbindung NPT 15417
Man arbeitete nach dem Verfahren von Schaeffer und Mitarbeitern, J. Pharm. Sei. Band 16, Seiten 1204 bis 1210, Verfahren F·
Das Produkt ist die Verbindung XL in der Tabelle III der angezogenen Literaturstelleo
Verfahren J erythro-9~(2-H7/-droxy-3-nonyl)-hypoxanthin (HPT 15392)
Die Verfahrensfolge der Herstellung von erythro-9-(2-Hydroxy-3~nonyl)-hypoxanthin (Uonylhypoxanthin, VIII) ist in den Reaktionsschemen 1 und 2 dargestellt. Die Verbesserungen gegenüber dem Verfahren von H. J. Schaeffer und C.F, .Schwender, J. Med. Chenu Band 17 (1974), Seite β in der Reaktionsfolge zur Bildung von erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-6~chlorpurin (VII) sind angegeben. Die letzte Stufe, die Hydrolyse des
-26- 20.2.1980
56 114/12/36
6-Chlorpurinderivats (VII) zu Nonylhypoxanthin (VIII) stellt eine Anpassung der von A. Giner-Sorolla, C. Gryte, A. Bendich und G.B. Brovm, J. Org. Chem· Band 34 (1969), Seite 2157 beschriebenen Methode zur Hydrolyse von Halogenpurinen dar»
Das alternative Verfahren, d» h. die Nitrosierung von erytliro-9-(2~Hydroxy-3-nonyl)-adenin (EMA, IX) zu Nonylhypoxanthin (VIII) (Reaktionsschema 2), besteht aus der vorhergehenden Umwandlung des Chlorderivats (VII) durch Ammonolyse in das Aminpurin (IX, EECHA), das nachfolgend zur Bildung von Nonylhypoxanthin (VIII) nitrosiert wird·
Reaktionsschema 1
(VIII)
Stufe 1 ACETAMIDONONAN^-ON (II)
Acylierung von 2-Amino-octansäure
O r -.
CH3-[CH2J5 -JJH2-
im2
II
Ausbeute 70
20.2.1980 56 ' 114/12/36
Stufe 2 ACETAMIDONONAN^-ON-HYDROCHLORID (III)
OH
—CH—COCH,-ι J
II
HCl
CE
,QJJ COCH3
HH2*"""" III
Ausbeute 67 %·
Stufe 3. erythro-3-ΑΙΛΙΝ0-2-NONANOL (IV) Reduktion des Acetamidononan-2-on-hydrochlorids
,— CH9L—,—COCH, —-^-4 CH,— CHJ ς —CH-CH-CH-, L 24 5 im um 3 . 3 L 2·» 5 , , 3
OH X2
NH2.HCl
NH,
III
IV
Ausbeute 75
Stufe 4 erytIiro-5-AinNO-4-CHLOR-6-(2-HYDR0XY-3-NONYLA1ÄINO)-PYRIMIDIN (VI) Kondensation von erythro-3-Amino-2~nonanol mit 5-Amino-4,6-dichlorpyrimidin
CHOH t
CHo
CH0H
Ausbeute 54
20,2.1980 56 114/12/36
Stufe 5 erythro-9-(2-HYDR0XY-3-H0HYL)-6-CHL0RPURIH (VII)
Ringschluß von erythro-5-Amino-4-chlor-6-(2-hydroxy-3-nonylamino)-pyrimidin (V) Cl Cl
HH,
(C2H O) CH
CHOH
CH,
CH
^CHOH
VI VII
Ausbeute 100 %,
Stufe 6 erythro-9- (2-HYDROXY-3-HOHYD-HYPOXAHTHIH (VIII) Durch Hydrolyse des 6-Chlorpurinderivats
01 OH
TO
,CH
[cH;j
CHOH
CH.
VII
VIII
Ausbeute 100 %«,
Reaktionsschema
20,2.1980 56 114/12/36
Alternatives Verfahren für die Herstellung von erythro-9-(2-HYDROXY-3-liONYL-HyPOXAlJTHIN (VIII)
Stufe 1 a erythro-9-(2-HYDR0XY-3-H01\iYL·)-ADENIN (IS) Ammonolyse von erythro-9- (2-Hydro:xy-3-nonyl)-6-clilorpurin (VII)
CH
VII
IX
Ausbeute 92
Stufe 2 b erytliro-9~(2-HYDR0XY-3-N0NYL)-HYPo2:antliin (VIII) Nitrosierung von erytliro-9-(2-Hydros:y-3-nony1)-adenin (IX)
20.2.1.980 56 114/12/36
CH3—[GH2J5 CHOH
IX
hoh
0H3
CH,
VIII
Ausbeute 75 %·
3-ACETAMID0H0NAN-2-0N (II)
CH
NHr
COOH
CH
HH,
II
Eine Mischung aus 200 g (1,26 Mol) 2-Araino-1-octansäure (I) in 960 ml Essigsäureanhydrid und 640 ml Pyridin wurde auf einem siedenden Wasserbad vier Stunden erhitzt« Das Reaktionsgemisch·wurde im Vakuum eingedampft und der Rückstand sechs- bis achtmal zwischen 400 ml 5%iger wäßriger
S -31- 20.2.1930
56 114/12/36
Natriimbicarbonat lösung und 400 ml Ether verteilt. Die vereinigten Etherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Man erhielt rohes 3-Acetamidononan-2-on in einer Ausbeute von 154 g (70 %).
3-AMIN0-2-NOHANOH-HYDROCHLORID (III)
CH -COCH, 22i-> CH3-[ohJ 5 -Oa-COCH3Ä 3 1
II III
154 g des im vorstehenden Verfahren erhaltenen Rohprodukts (II) wurden in 1540 ml konzentrierter wäßriger Salzsäure gelöst und zv/ei Stunden unter Rückfluß erhitzt* Dann wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft» Der erhaltene Peststoff wurde aus einer warmen Lösung in 200 ml Ethanol umkristallisiert und dann auf 25 0C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden 6OO ml Ether gegeben. Es schied sich ein weißer kristalliner Niederschlag ab. Die Suspension ließ man über Haclfc bei 5 0C stehen. Die Pällung wurde dann gesammelt und einmal mit 100 ml Ether gewaschen. Man erhielt 125 g (67 %) eines weißen kristallinen Produkts vom Schmelzpunkt 112 C (Zersetzung).
Wenn das kristalline Material nicht weiß ist oder einen geringeren Schmelzpunkt hat, sollte es unter Verwendung von Aktivkohle aus Tetrahydrofuran umkristallisiert werden. Bei einer Anwendung dieses Verfahrens wurden 150 ml Hydrofuran für 100 g des rohen Hydrochlorids (III) verwendet.
-32- 20,2.1980
56 114/12/36
erythro-3-AMIU0"2-IT0UAl!I0L· (IV)
CH- — CH0 j- —CH-COCH. — —^- CH-,- CH0 κ —CH-^H—CHQ
s ν
HH2.HOl M2 OH
III IV
43»8 g (0,226 MoI) 3-Amino-2-nonanol-hydrochlorid wurden in 150 ml absolutem Methanol gelöst und darauf in einem Eis-Salz Bad auf - 10 0C gekühlt·
1^24,4 g (0,45 Mol) Kaliumborhydrid
wurden innerhalb von zwei bis drei Stunden in kleinen Anteilen zugefügt* Me Mischung wurde dann drei Stunden bei -10 bii
3), 4) o
j, worauf man sie langsam Raumtemperatur (22 C)
erreichen ließ» Dann wurde über Uacht (20 Stunden) bei Raumtemperatur gerührt« Anschließend wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und der gebildete Sirup zwischen 150 ml Wasser und 150 ml Chloroform verteilt« Die wäßrige Schicht wurde noch dreimal mit 3ev/eils 100 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampfte Man erhielt ein leicht gelbliches öliges Produkte Diese Flüssigkeit wurde im Hochvakuum (0,15 mm Hg) bei 95 bis 100 0C destilliert« Man erhielt reines erythro-3-Amino-2-nonanol in einer Menge von 26,4 g (75 %); F = 81 bis 86 0C,
-10 bis -15 0C gehalten
215495 -33- 20.2.1980
56 114/12/36
' Beim Kühlen der Lösung von III fällt etwas Material aus, was jedoch keine Wirkung auf den Reaktionsverlauf hat*
2)
' An dieser Stelle unterscheidet sich das vorliegende Verfahren von dem nach Schaeffer und Mitarbeitern. Schaeffer gibt Essigsäure zur gleichen Zeit zu wie Kaliumborhydrid und hält dabei den pH-Wert auf 5 bis 6. Man hat gefunden, daß die Neutralisation einen Verlust an Kaliumborhydrid mit sich bringt und daß ein pH-Wert von über 5 toleriert werden kann. V/ichtiger ist, daß die gleichzeitige Zugabe von Essigsäure und Kaliumborhydrid, wie von Schaeffer vorgeschlagen, die Kontrolle der Umsetzung sehr schwierig macht·· Die Temperatur steigt beträchtlich und es treten Ausbeuteverluste und/oder Qualitätsbeeinträchtigungen des Produktes ein.
Empfehlenswert ist ein v/irksames Rühren, um die entsprechende Umsetzung zu gewährleisten, die vervollständigt wird, wenn all die kleinen Klümpchen und Anteile des Kaliumborhydrids verschwunden sind.
' Ein Kühlen auf 0 0C, wie von Schaeffer und Mitarbeitern beschrieben, (Verfahren D, Zeile 4 ff·) ist unzureichend. Eine Verbesserung wird erreicht, wenn man das Reaktionsgemisch während der gesamten Zeit gut unter 0 0C, am besten unter -10 C, hält. Läßt man die Temperatur über -10 0C ansteigen, so können beträchtliche Ausbeuteverluste auftreten»
215
20*2.1980 56 114/12/36
erythro-5-Amino~4-chlor-6-(2-HYDR0XY-3 -HONYLAMINO ) -pyr imidin (VI)
Cl
OH
Cl
CH
CH0H
CH,
VI
Eine Mischung aus 24,6 g (0,15 Mol) 4,6~Dichlor-5~aminopyrimidin (V) und 26,2 g (0,164 Mol) erythro-3~Amino~2~ nonanol (IV) in 1080 ml 1-Pentanol und 350 ml Tributylamin wurde unter Rühren bei 25 C hergestellt· Die gebildete Suspension wurde unter Stickstoff 28 Stunden unter. Rückfluß erhitzt· Die Lösung trat innerhalb etwa 1/2 Stunde .ein· Zu diesem Zeitpunkt zeigte eine Probe des Reaktionsproduktes ein UV X max von 267 und 297 nm (H2O, pH 5,5)·
215 495 -35- 20.2.1980
56 114/12/36
Die erhaltene Lösung wurde in einem heißen Wasserbad bei einem Druck von 10 mm Hg zu einem Sirup eingeengt und weiter in einem Ölbad bei 0,1 mm Hg und 100 0C zu einer viskosen Flüssigkeit eingedampft, zu der man 450 ml n-Hexan gab* Diese Mischung wurde eine Stunde unter Rückfluß erhitzt. Das heiße, überstehende gelbliche Hexan wurde von der Flüssigkeit am Boden des Rundkolbens abgetrennt.
Das erhaltene hellbraune Öl, aus dem jegliches restliche Hexan im Vakuum entfernt worden war, wurde in 150 ml Chloroform gelöste Die Chloroformlösung wurde achtmal mit jeweils 250 ml einer wäßrigen gesättigten NatriumbicarbonatlÖsung extrahiert. Die Chloroformschicht wurde dann abgetrennt, über Natrium- oder Magnesiumsulfat getrocknet und unter hohem Vakuum von 0,1 mm H bei 40 C in einem Wasserbad eingedampft, worauf man ein hellbraunes Öl erhielt, das sich beim Kühlen verfestigte. Dieses Material kann direkt in der nächsten Stufe eingesetzt oder wie folgt gereinigt v/erden: Das erhaltene Öl wird in 75 "bis 100 ml Chloroform gelöst, worauf man etwa 300 ml η-Hexan zugibt, um einen weißen kristallinen Peststoff auszufällen, der von der gekühlten Lösung abfiltriert wird. Das Extraktionsverfahren wird vier- bis achtmal durchgeführt, bis sich kein Kohlendioxid mehr entwickelt. Diese Behandlung wurde zweimal wiederholt. ...
Ausbeute 23,3 g (54 %)\ UV A.max = 267, 297 nm (H2O, pH 5,5); F = 113 bis 116 0C.
20,2,1980 56 114/12/36
erythro-9-(2-HYDROXY-3-(VII)
-6-CHLORPURIh
1 <*^r \
CH,
CH.
CHv -[CH2J 5 CHOH
VI
VII
11 »48 g (40 iallol) des im vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen rohen Sirups aus erytliro-5-Aniiiio~4-chlor-6-(2-hydroxy-3-nonylamino)-pyrimidin wurden in 106 ml Triethylorthoformiat und 34 ml Chloroform gelöst, wobei man au Bewirkung der Lösung 10 Tropfen Ethansulfonsäure zugab, Nach dem Stehen über lacht bei 25 0C wurde die Lösung im Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Die Ausbeute von 11,7 g war quantitativ. Dieser Sirup aus rohem erythro-9~(2-Hydroxy-3-nonyl)-6-chlorpurin (VII) wurde für die nächste Stufe verwendet; A· max, = 264
215495 -37-
20.2.1980 56 114/12/36
erythro-9- (2-HYDROXY^-UONYL)-HYPOXAlITHIn (VIII)
durch. Hydrolyse des 6-Chlorpurinderivates Cl
CHOH
VII
VIII
Eine Suspension von 4,0 g (13,4 mMol) erythro-6-Chlor-9~ (2-hydroxy-3-nonyl)-purin (VII) in 40 ml 0,5 η HaOH wurde zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt und dann gekühlt« Die Neutralisation mit Eisessig und nachfolgende Kühlung ergab einen kristallinen Niederschlag aus erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (VIII), der anfiltriert und getrocknet wurde. Die Ausbeute von 3,8g war quantitativ« F = 196 UC; UV A max (pH 5,5) = 251 um.
-38- 20.2.1980
56 114/12/36
Das so erhaltene Rohprodukt (VIII) war homogen, wie die Papierchromatographie (3 Lösungsmittel) ergab, und im Test auf Cl"" negativ (Kupferdraht und Flamme; Hatriumschmelze, Ansäuern und Silbernitrat).
Die dreimalige Umkristallisation einer Probe des rohen Materials aus wäßrigem Ethanol (siehe nachfolgende Reinigung) ergab farbl C14H22IT4O2
ergab farblose Kristalle vom Schmelzpunkt 202 °Ce Analyse für
berechnet: C 60,41; H 7,97; N 20,13;
gefunden: C 60,47; H 7,86; Έ 20,08.
Reinigung von erythro~9~ (2-HYDR0ZY-3-HQNYL) »ΗΥΡΟΣΑΙΙΤΗΐυ (VIII)
Das rohe Nonyl-hypoxanthin (VIII) wird durch Umkristallisation gereinigt. Man löst hierzu das rohe Material unter Erhitzen in etwa der 6- bis lOfachen Menge seines Gewichts in Ethylalkohol und fügt dann das gleiche Volumen Wasser zu. Die Lösung wird in einem Erlenmeyer mit Aktivkohle behandelt und heiß durch Diatomeenerde filtriert« Anschließend
215 495 -39- 20.2.1980
56 114/12/36
dampft man die Lösung unter ständigem Rühren auf einer heißen Platte ein. Um die abgedampfte Flüssigkeit zu ersetzen, wird Wasser in kleinen Anteilen zugefügt, bis reichlich Niederschlag ausfällt. Das Lösungsmittel wird weiter abgedampft, bis der gesamte Ethylalkohol entfernt ist, wobei man wiederholt V/asser zugibt, um ein Volumen vom 8- bis 12fachen des Gewichts des Materials zu erreichen. Je Umkristallisation beträgt der Materialverlust etv/a 10 %, Durch zweimalige Umkristallisation wurde der Schmelzpunkt auf 202 C erhitzt. Man erhielt ein farbloses kristallines Produkt, während das Rohmaterial etwas gelblich oder rosa war und bei 192 0C schmolz.
erythro~9-(2-HYDROXY-3-HOHYL)-Adenin. HQl (IX)
. HCl
VII IX
f'5 495 "*4°~ 20*2.1980
56 114/12/36
6,15 g des rohen öligen erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-6-chlorpurins (VII) aus dem vorstehenden Verfahren.wurden in 300 ml gesättigtem methanolischen Ammoniak, der 1 g Ammoniumchlorid enthielt, eine Stunde in einer nichtrostenden Stahlbombe (Parr Instruments) auf 80 bis 100 C erhitzt. Nach dem Kühlen wurde die Lösung im Vakuum zur Trockene eingedampft» Dann wurde Methanol zugesetzt und eingedampft (3mal), um den überschüssigen Ammoniak zu entfernen«
Der sirupartige Rückstand wurde in absolutem Methylalkohol gelöst, und durch die Lösung wurde trockener Chlorwasserstoff in Bläschenform geleitet, wobei man die Temperatur durch Anwendung eines Eis-Wasser-Bads unter 20 0C hielt» Nach 1/2stündigem Durchleiten des Chlorwasserstoffs wurde die Mischung auf 5 C gekühlt· Der ausgefallene Niederschlag wurde in einem trichter aus gesintertem Glas gesammelt, mit kaltem Methylalkohol gewaschen und an der Luft getrocknet» Ausbeute 6,0 g (92 %); F = 173 bis 175 0C (Zersetzung); UV Xmax = 260 nm (H2O, pH 5,5)
1 5 49 5
20»2.1980 56 114/12/36
Alternatives Verfahren für die Herstellung von erythro-9-(2-HYDROSY-3-HOITYl)-HYPOXMTHIIT (VIII)
durch Desaminierung von VII
OH
NaIiO,
ΉΟΗ
AcOH; Έ HCl
5 CHOH
CH.
VII
VIII
5,6 g (71 mMol) ITatriumnitrit wurden langsam unter Rühren bei 25 0C zu einer Lösung von 4»0 g (14 mMol) erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-adenin (IX) in 20 ml 50%iger Essigsäure und 3»2 ml η HCl gegeben» Die Mischung Wurde zwei Stunden bei 25 0C gerührt· Danach wurde das UV-Spektrum aufgenommen« .Wenn die maximale Absorption 250 nm erreicht hatte, wurde die Lösung mit 2 η UaOH neutralisiert» Der ausgefallene Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen* Ausbeute 3,03 g (75 %); P = 195 °C·
20.2.1980 56 114/12/36
Eine Analysenprobe wurde dreimal aus Wasser umkristallisiert, worauf das Produkt bei 202 0C schmolz· Analyse für C-)4H221T4°2
berechnet:
gefunden:
C 60,40; H 7,96; N 20,13.
C 60,40; H 7,90; N 20,12,
Verfahren K Verbindung HPT 15426
Man v/endete das Verfahren von H.J. Schaeffer und S· F« Schwender, J- Med· Chem« Band 17 (1974), Seite 6 an»
Verfahren L Herstellung von UPT 15410
27,9 mg (0,1 ralvlol) 9-(2-Hydrozy-3-nonyl)~6-hydro2ypurin, HPT 15392, und 77,1 mg (0,3 mMol) des p-Acetamidobenzzoats von Dimethylaminoisopropanol (DIP.PAcBA) wurden sorgfältig abgewogen und in 105 ml 0,25%iger Matriumcarbonatlösung zu einer 0,1%igen Lösung von ΪΤΡΤ 15410 gelöst, das ist die Verbindung aus HPT 15392 und (DIP·PAcBA) im Molverhältnis 1:3«
215495
20,2,1980 56 114/12/36
Phasenlöslichkeitsuntersuchungen mit HPT 15392 und DIP.PAcBA zeigen, daß ITPT 15392 mit zunehmenden Konzentrationen an DIP.PAcBA unter konstanten pH-Wert-Bedingungen zunehmend löslicher wird. Dies beweist eine in Lösung vor sich gehende Reaktion unter Bildung eines Komplexes·
Anstelle des Molverhältnisses 1 : 3 (NPT 15392 und DIP.PAcBA) können bei Anwendung anderer Molverhältnisse von 1 : 1 bis -1 : 10 weitere Komplexe hergestellt werden.
Die antivirale Wirkung ist in den Tabellen 2 und 3 angegeben.
Herstellung eines erythro-9~(2-Hydroxy-3~nonyl)-6-Alkoxypurins (II)
OCH-
II
215 495 -44- 20.2.1980
56 114/12/36
10 m Mol der Verbindung I und eine Lösung von 11 mMol Uatriummethylat in 50 ml Methanol wurden sechs Stunden unter Rückfluß erhitzt» Der Reaktionskolben wurde gekühlt, der pH Wert mit Eisessig auf 5 eingestellt und die Mischung unter verringertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in der geringstmöglichen Menge kalten Wassers aufgenommen, filtriert und im Vakuum getrocknet.
Herstellung von erythro-9-(2-Hydro:xy-3-nonyl)-6-methylmarcapto-purin (III)
CH - CH3 OH
II
CH3
OH III
215495
-45- 20,2.1980
56 114/12/36
Stufe 1
10 mMol der Verbindung I in 25 ml Ethanol und 10 mMol Thioharnstoff sowie 11 mMol wasserfreies Natriumacetat wurden eine Stunde unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Kühlen wurde das gebildete Produkt abfiltriert, in der geringstmoglichen Menge kalten Wassers suspendiert und der pH Wert mit 20%iger Essigsäure auf 5 eingestellt· Das Produkt wurde mit der geringstmoglichen Menge kaltem Wasser gewaschen, filtriert und der Niederschlag im Vakuum getrocknet·
Stufe 2
Eine Lösung von 10 mMol der Verbindung II in 25 ml 2n NaOH wurde auf 5 0C gekühlt. Dann wurden 20 mMol Methyljodid zugefügt, und die Mischung wurde in einer dicht verschlossenen Flasche bei 5 0C 15 Minuten heftig geschüttelt. Dann wurde drei Stunden bei 25 °C mechanisch gerührt und der pH Wert mit Eisessig auf 5 eingestellt. Der ausgefallene Niederschlag wurde abfiltriert, zweimal mit 15 ml kaltem Wasser gewaschen und getrocknet·
Hemmung der Vermehrung von Influenzavirus durch 9-Hydroxyalkylpurine
« (Y)., Virus-Stamm / ' USSR/iXKlLII.. ) Influenza A
HC -OH-R I1 ι R1 OH
215
20,2.1980 56 114/12/36
| Test ver bind. Nr, | H | Verbindung R2 X Y ^ 10 | OH | DIP,PAcBA | Prozentuale Hemmung der Hämadsorption Oug/ml) Testverbindung 10-100 >100 | - | *** |
| 15425 | H | H | OH | - | 50 | 10 | |
| 15428 | H | H | SH | DIP.PAcBA | - | 65 | 65 |
| 15435 | H | H | SH | - | O | O | |
| 15437 | H | H | OH | DIP.PAcBA | 26 | 34 | |
| 15446 | H | CH3 | OH | - | .2 | 22 | O |
| 1 5447 | H | CH3 | NH2 | DIP.PAcBa | 10 | 48 | 62 |
| 15431 | H | CH3 | NH2 | ||||
| 15432 | CH3 | CHo | 1 | 13 | 6 | ||
| 15427 | CH3 | H | Cl | -. | 32 | O | |
| 15423 | CH3 | H | NH2 | DIPePAcBA | 2 | 41 | 62 |
| 15433 | CH3 | H | NH2 | - | O | O | |
| 15434 . | CH3 | H | OH | DIP.PAcBA | 44 | 54 | |
| 15443 | CH3 | H | OH | - | 58 | 60 | |
| 15444 | °6H13 | H | OH | DIP.PAcBA | 46 | 52 | |
| 15417 | C6H13 | H | OH | DIP.PAcBA | 18 | 100 96 | 100 96 |
| 15418 | C6H13 C6H13 | H | OH OH | 16 | 96 | 100 | |
| 15392 15410 | °6H13 | CH3 CH3 | NH2 | DIP.PAcBA | 86 58 | O | 20 |
| 15426 | CH3 | -· | Tabelle 3 | 50 | |||
| 15110 | O | ||||||
Hemmung der Vermehrung von Herpes-Virus durch 9~Hydroxyalkylpurine
20,2.1980 56 114/12/36
- CH - R
OH
| NPT Hr, | > ti- | CH3 | X | DIP· | Y |
| 15392 | °6H13 | CH3 | OH | DIP· | - |
| 15417 | C6H13 | H | OH | ||
| 15418 | C6H13 | H | OH | PAcBA | |
| 15410 | C6H13 | Biologische Wirkung | OH | PAcBA | |
| Methoden | |||||
| Flecken | (PPU) | Pro |
| test | Kon | zen |
| (15-150 | trol | tuale |
| g/ml) | le | Hemmung |
98 %
98 %
Anti-Influenza-Wirkung (Hämadsorptionsversuch)
Bei einer Infizierung einer Honoschicht von Gev/ebezellkulturen durch Influenzavirus v/ird die Zelloberfläche verändert, so daß von der Zelloberfläche Erythrozyten vom Meerschweinchen adsorbiert v/erden können· Die Anzahl der Stellen adsorbierter Zellen (Hämadsorptionsstellen bildende Einheiten MPPU) stellt ein quantitatives Maß für die Infizierung dar. Die Methode ist wie folgt:
-48- 20.2.1980
56 114/12/36
Die Monoschichten wurden in der folgenden Weise subkultiviert: Das Medium wurde abgegossen und die Monoschicht zweimal mit je etwa 50 ml Kochsalzlösung vom pH 7,2 gewaschen, die mit Phosphat gepuffert und von Calcium und Magnesium frei war (PBS)V (GIBCO Nr. 419). Bei 37 0C wurde zu jedem Kolben 1 ml einer Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure-Lösung gegeben, die 0,5 g Trypsin (1 : .250) und 2,0 g Ethylendiamintetraessigsäure je Liter modifizierter Puck's Kochsalzlösung A enthielt (GIBCO Hr. 53OL), und unter mäßigem Schütteln über der Monoschicht dispergiert« Die Kolben wurden dann je nach der für die Herauslösung der Zellen erforderlichen Zeit etwa 3 bis 5 Minuten bei 37 0C bebrütet. Hierfür war ein gelegentliches Schütteln erforderlich« Anschließend wurden zu jedem Kolben 10 ml Nährmedium gegeben, und die Zellen wurden durch Aufsaugen und Wiederausstoßen der Suspension aus einer Pipette dispergiert* Der Inhalt einer Reihe von Kolben wurde gesammelt, und die Zellen der Suspension wurden mit Nährmedium auf 7 bis 8,5 2C 10 Zellen/ml verdünnt. Das liährmedium hatte die folgende Zusammensetzung: Eagles minimales essentielles Medium (FiEM) mit EarIe's Salzen und HEPES Puffer (GIBCO Nr. "236) plus folgende Zusätze zu 87 ml ¥i
10 ml fötales Kalbsserum (ECS-GIBCO ITr. 614HI), 1 ml L-Glutamin (200 Molar-GIBCO Nr* 503), 1 ml Chlortetracyclin (5000 /ug/ml, GIBCO Nr. 528), 1 ml mit 10.000 Einheiten Penicillin, 1O0OOO /ug Streptomycin und 10»000 /Ug Neomycinmischung (PSH-GIBCO ffr.- 564).
215495
-49- 20.2.1980
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Die Zellen wurden in Linbro-Gewebekulturschalen subkultiviert, Die Schalen enthielten 24 flache Vertiefungen, jede mit einem Fassungsvermögen von 3 ml· In jede Vertiefung wurde 1 ml Zellkultursuspension gegeben·
Am folgenden Tag vmrde das Medium entfernt und durch frisches Nährmedium ersetzt. Die Monoschienten wurden für den Versuch verwendet, wenn sie eine nahezu flüssige Beschaffenheit erreicht hatten. Das war nach etwa 3 bis 4 Tagen der Fall·
Wenn die Linbroschalen-HeLa-Zellkulturen, die für den Versuch richtige Beschaffenheit hatten (siehe Zellen), wurde das Medium abdekandiert und 1 ml Medium zum Aufrechterhalten (MEM mit PCS auf 3 % gebracht) zu vier parallel laufenden Kulturproben innerhalb einer Schale gegeben, das die zu untersuchende Verbindung bei einer gegebenen Konzentration enthielt.
Es wurde eine Reihe verschiedener Konzentrationen der Testverbindung von 2,3 bis 150 ug/ml verwendet. Zu den Kontrollkulturen wurde nur das oben angegebene Medium allein gegeben. Nach der Zugabe von Testverbindung und Kontrollmedium v/urden die experimentellen Proben und die infizierten Kontrollproben mit 0,1 ml verdünnter Virussuspension versetzt. Zu den nichtinfizierten Kontrollproben wurde nur Kochsalzlösung gegebene Die Linbrοschalen wurden dann 18 Stunden bei 37 0C inbubiert, worauf bei allen Proben das Medium abgesaugt wurde. Jede Kultur wurde einmal mit PBS gev/aschen« Die Kochsalzlösung wurde abgesaugt, und zu jeder Kulturprobe wurden 0,5 ml einer 0,4%igen Volumen/Volumen-Suspension roter Blutkörperchen von Meerschweinchen in PBS gegeben« Die Kulturen hielt man 30 Minuten bei Raumtemperatur, wora\if das Medium abde-
2 i 5495 -50- 20.2,1980
56 114/12/36
kandiert und die Kultur zweimal mit PBS gewaschen wurde, um mit Ausnahme der spezifisch gebundenen roten Blutkörperchen alle Zellen zu entfernen. Hach dem dritten Waschvorgang wurde MEM, mit FCS auf 3 % gebracht, zu allen Kulturproben gegeben·
In das Ocular eines Nikon Phasenumkehr-Kontrastmikrokops wurde ein Howard-Mikrometer-Ocular eingesetzt· Jede Kultur wurde mit einem 4mal schwachen Objektiv abgetastet, und die hämadsorbierten roten Blutkörperchen wurden unter Verwendung des Gitters der Linse als Feldmarkierung direkt ausgezählt· In Abhängigkeit von der Anzahl und Dichte der hämadsorbierten Zellen in den infizierten Kontrollkulturen wurden ganze oder Teilfelder ausgezählte Vergrößerungen um das 60- oder 15Ofache wurden angewandt, um die besten Bedingungen für die Auszählung der hämadsorbierten Zellen zu erreichen· Für die Auszählung bei 6Ofacher und 15Ofacher Vergrößerung wurden Feldfaktoren errechnet· Der Faktor betrug bei 6Ofacher Vergrößerung 55,5» bei 15Ofacher Vergrößerung 273o Diese Faktoren ergeben die Gesamtzahl der Felder bei 6Ofacher bzw· 15Ofacher Vergrößerung· Die Anzahl der ausgezählten Felder betrug 3 bis 5 de Probe in der Schale, wobei jeweils 3 bis 4 Proben je Behandlungsgruppe angewandt wurden, vgl· unbearbeitete Datentabellen im Ergebnisabschnitt für die Anzahl der untersuchten Felder· Es wurden mittlere und Standardabweichungen errechnet und die Ergebnisse unter Anwendung der Student's t-Analyse ausgewertet«
Biologische V/irkung
Anti-Herpes-Wirkung (Fleckenuntersuchung)
Die Infizierung von Gewebekulturen durch Herpes-Virus verursacht eine Zellauflösung· Nach einer gewissen Zeit werden
215495 -51- 20,2.1980
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diese aufgelösten Zellen als kleine klare Bereiche (Flecken) auf einer Schicht der Zellen sichtbar· Die Einarbeitung einer Testsubstanz in die Medien verringert die Anzahl der Flecken, sofern diese Substanz eine Virusvermehrung zu verhindern vermag. Die Methode ist wie folgt:
Virus .
Es wurde Herpes hominis Typ 2 von der American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, Maryland, ATCC Mr, VR 540, Partie 3D verwendet. Die lyophilisierte Virus-Suspension wurde mit 1 ml sterilem destillierten Wasser rekonstituiert» ' Das Virus wurde zweimal einer Passage durch HeLa-Monozell— schichten unterworfen. Der Überstand über der Gewebekultur wurde gesammelt, in 1 ml Anteile unterteilt und bei -70 0C aufbewahrt» Der Titer dieser Arbeitssuspension betrug 10 TCID50A),1 ml (2tägige Inkubation),
Herpes-Virus Fleckenuntersuchung
Vero-Zellen in 10 g-Wachstumsphase wurden in einer Konzentration von Ί χ 10-* Zellen/ml in 50 ml Falcon Flaschen in Eagle's minimalem essentiellen Medium (MEM), ergänzt mit 10 % fötalem Kalbsserum (FCS) und Antibiotika, subkultiviert. Die Medien wurden am Tag nach Beginn der Kultivierung ausgetauscht. Die Vero Monoschichten erreichten am zweiten Tag nach Beginn der Kultivierung fließfähige Beschaffenheit, und mit den Zellen in dieser Phase wurden die Kulturen, für die Fleckenunter- . suchung verwendet.
21549
-52- 20,2,1980
56 114/12/36
Die Kulturmedien wurden abgegossen und die Monoschiehten einmal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gev/aschen (PBS)· Mehrere verschiedene Verdünnungen der Arbeitssuspension des Virus wurden hergestellt und jede Kulturflasche wurde mit 0,5 ml einer der Virusverdünnungen, die J1SC-freiem Medium zugefügt war, infiziert. Dieses Medium enthielt die Testsubstanz in einer Konzentration von 1 50 /ug/ml» Kontrollproben wurden mit Medium ohne Testsubstanz hergestellt.
Man ließ die Virusadsorption 2 Stunden bei 37 C vor sich geheiio Während dieser Zeit wurden die Kulturen alle 15 Minuten leicht geschüttelt ο Dann wurden die Medien abgegossen und die Monoschichten einmal mit 10 ml PBS gev/aschen.
Agarose wurde in einer Konzentration von 6 % Gewicht/Volumen in 50 ml PBS hergestellt« Ferner wurde ein Grundmedium aus MEM, ergänzt mit 2 % PCS, hergestellt» Testsubstanz wurde in einer Menge von 150 /ug/ml zu einem Teil des Grundmediums gegeben. Die drei Lösungen wurden auf 47 0C gehalten. Außerdem wurde eine 1 : 10-Verdünnung gesammelter menschlicher Anti-Herpes-Seren bereitgestellt. Unmittelbar vor Beginn der Behandlung wurden 15 ml der Agarose-Lösung zu 85 ml Medium gegeben. Weitere 15 ml Agarose wurden· zu 85 ml von Testsubstanz enthaltendem Medium gegeben»
Jede der gewaschenen Monoschichten in einer Versuchsgruppe wurde entweder mit 5 ml Agarose-Medium oder mit 5 ml Testsubstanz enthaltendem Agarose-Medium behandelt. In einer
-53- 20.2.1980
56 114/12/36
v/eiteren Versuchsgruppe wurde jede Monoschicht entweder mit 0,2 ml Anti-Herpes-Seren in 5 ml des Grundmediums oder mit 0,2 ml Anti-Herpes-Seren in 5 ml Testsubstanz enthaltendem Medium "behandelt. Die Anti-Herpes-Seren wurden anstelle der Agarose verwendet, um Flecken durch Neutralisieren jeglicher freier Viren im Medium zu lokalisieren. Man ließ die Flaschen 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen, worauf sie 2 Tage bei 37 C inkubiert wurden« Für die meisten Behandlungsgruppen wurden Dreifachkulturen angewandt.
Zu jeder der Flaschen wurden 10 ml PBS gegeben· Der Überstand wurde leicht geschüttelt und dann aus den Flaschen gegossen» Die Monoschichten wurden mit einer 0,5%igen Gewicht-Volumen— Lösung von Kristallviolett in 50%igem Methanol in dreifach destilliertem V/asser gefärbt.
Die Flecken wurden entweder direkt unter Anwendung von transmittiertem Fluoreszenzlicht und Feststellung mit dem Auge oder mittels eines Lichtinikroskops für die Mikroflecken gezählt« Bei den Mikroflecken wurden jeweils drei Felder je Versuchsgruppe unter 15Ofacher Vergrößerung ausgezählt und gemittelt. In anderen Tests auf antivirale Wirkung wurden die folgenden Ergebnisse erhalten.
-54- 20.2,1980
56 114/12/36
Verbindung . %.Hemmung bei ug/ml Virus 0,1-1,0 1,0-10 10-100 ^100
15392 30-50 — > 70 >70 Influenza A
Schwein 1976
15417 — 50-70 >70 — Influenza A
Schwein 1976
15418 — .— Λ 70 > 70 Influenza A
Schwein 1976
15426 20-30 30-50 50-70 50-70 (Russisch) 15410 50-70 30-50 > 70 > 70 (Schwein)
Weitere Tests auf antivirale Wirkung der Verbindung NPT 15410 sind in der Tab, 3a angegeben«,
-55- 20.2.1980
56 114/12/36
Tabelle 3a Hemmung des Influenza-Virus durch NPT 1^410 .
Konzentrationsbereich /ug/ml
Virus 0,01-1,0 1,0-10,0 10,0-100 > 100
| A/Texas/77 | ++ | % | Hemmung |
| A/Dunedin/73 | % | Hemmung | |
| (H3N2) | NT | % | Hemmung |
| A/Jap/305 | NT | % | Hemmung |
| (HgN2) | |||
| A/PRq (HnN1) ο Ul | ++ | ||
| Ag Hong Kong | |||
| (H2Hg) | NT | ||
| NT = nicht | untersucht | ||
| + = 10 - | 20 | ||
| + = 20 - | 30 | ||
| ++ = 30 - | 50 | ||
| +++ = 50 - | 70 | ||
NT NT
NT
++++ - > 70 % Hemmung
Die Immunmodulierung ist in Tabelle 4 angegeben·
215495 ~5β"
20.2*1980 56 114/12/36
Modulierung der Zellimmurd/tät durch 9-(Hydroxyalkyl)-purine
HC — CH R'
OH
Verbindung
HPT IJr6
R1
| 15425 | H | H | OH | *** |
| 15428 | H | H | OH | DIP.PAcBA |
| 15435 | H | H | SH | |
| 15437 | H | H | SH | DIPoPAcBA |
| 15446 | H | CH3 | OH | - |
| 15447 | H | CH3 | OH | DIP.PAcBA |
| 15431 | H | CH3 | HH2 | - |
| 15432 | H | CH.. | HH2 | DIP.PAcBA |
| 15427 | CH3 | H | I | - |
| 15423 | CH3 | H | CI | - |
| 15433 | CH3 | H | HH2 | . - |
| 15434 | CH3 | H | HH2 | DIP.PAcBA |
| 15443 | CH3 | H | OH | - |
| 15444 | OH, | H | OH | DIP.PAcBA |
| 15417 | H | OH | - | |
| 15418 | C6H13 | H | OH | DIP.PAcBA |
| 15392 | C6H13 | CH3 | OH | . - |
| 15410 | C6H13 | CH3 | OH | DIP.PAcBA |
| 1 5426 | C6H13 | CH3 | HH2 | - |
495 „57- 20.2.1980
114/12/36
UPT Nr. Mitogen induzierte Mitogen induzierte (PHA) (Con A) Maus menschl. Lymph. Prolif-
Lymph. Prolif.
O1Oi-I 1O ι,ο-ιο ίο-loo 0,01-1,0 1.0-10 io-ioo
- 50 0 0
| 15425 | 11 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 45 | 0 |
| 15428 | ||||||||
| 15435 | - 47 | 55 | 0 | |||||
| 15437 | ||||||||
| 15446 | 6 | 12 | 0 | 53 | ||||
| 15447 | ||||||||
| 15431 - | • 15 | - 27 | - 65 | 0 | - | |||
| 15432 | ||||||||
| 15427 | + 27 | 0 | + 13 | |||||
| 15423 | ||||||||
| 15433 + | 15 | - 23 | 0 | 11-15 | 0 | |||
| 15434 | 26 | 30-50 | ||||||
| 15443 + | 17 | + 27 | - 72 | 6 | 20 | |||
| 15444 | 40 | 60 | ||||||
| 15417 | 0 | 0 | - 91 | - 41 | ||||
| 15418 | 41 | 73 | ||||||
| 15392 | 172 | 162 | ||||||
| 15410 | 140 | 40 | ||||||
| 15426 - | 50 | - 85 | ||||||
- 50 0
- 50
- 50
21S
20.2.1980 56 114/12/36
HPT Ur, Lymphokine induzierte Meerschweinchen Mac« Prolif
0,01-1,0 1,0-10 10-100
15425 15428 15435 15437 15446 15447 15431 15432 15427 15423 15433 15434 15443 15444 15417 15418 15392 15410 1 5426
+ 20
| 13 | - 50 | |
| 12 | 80 | - 50 |
| 33 | 23 | |
| 12 | 23 |
15 495 . -59-
20·2·1980 56 114/12/36
Mehrere Verbindungen wurden mit folgenden Ergebnissen auf Mitogen induzierte Murine Lymphozytenproliferation untersucht :
| Verbindung | • | 15410 | 0,01-1,0 | % Stimulierung | 10-100 | bei ^ug/ml |
| > 50 % | 1,0-10 | 30-50 % | > 100 | |||
| 15392 | 15417 | 30-50 % | nicht unter | |||
| 15418 | 0 | 0 | sucht | |||
| 15426 | 0 | nicht unter | ||||
| > 50 | 30-50 | sucht | ||||
| 30-50 | nicht unter | |||||
| 0 | 0 | sucht | ||||
| 20-30 | 0 | 20-30 | 0 | |||
| > 50 | nicht unter | |||||
| sucht |
Untersuchung der Immunmodulierung
Die folgenden drei Testverfahren wurden angewandt, um die Fähigkeit der Testsubstanzen zur Modulierung der Wirkung verschiedener Klassen von Zellen im Iminunsystem zu untersuchen. Mit diesen Systemen ist es möglich, sowohl die immunpotenzierende Wirkung (Verbesserung des untersuchten Parameters) als auch die immununterdrückende Wirkung (Hemmung des untersuchten Parameters) festzustellen»
-60- 20.2.1980
56 114/12/36
Mitogen induzierte Untersuchung an Milzzellen der Maus
Milzzellen von Mäusen enthalten sowohl B- als auch T-Lymphozyten, die durch eine Reihe von Fremdsubstanzen, ζ» Β* Pflanzenmytogene, wie Con A zur Proliferation ' stimuliert v/erden können» Diese verstärkte Proliferation ist ein Anzeichen vor verstärkte zeilvermittelte Immunität« Das nachstehende Verfahren beschreibt das für die Untersuchung der Testsubstanzen als Immunpotentiatoren angewandte System« -
Materialien
Concanavalin A (Calbiochem, La Jolla, Californien), Partie Nr8 210073» lyophilisiert in NaCl, wurde zuerst als1%lge Lösung hergestellt und für jede Verdünnung als 2 χ Konzentration verdünnt (0,5» 1»0, 2,5 /ug/ml)e
6-8 Wochen alte männliche Balb/c und CJK Inzuchtmäuse wurden von den folgenden Stellen bezogen: Plow Research Animals, Inc., Dublin, Virginia; Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, Massachusetts; Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana und Lionel Strong Foundation, San Diego, Californien·
Zellen
3-5 Mäuse wurden getötet, indem man ihnen den Hals abschnitt, worauf man die Milz aseptisch entferntee Die gesammelte Milz wurde zerkleinert und mit sterilen
-61- 20.2.1980
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Pinzetten auseinandergeaupft· Dann wurde durch eine doppelte Schicht aus Nylonmaschen geseiht. Die Zellsuspension wurde einmal mit 15 ml RHII I64O, ergänzt mit 5 % fötalem Kalbserum und Antibiotika, gewaschen· Die Zellen wurden in einer Konzentration von 10 Zellen/0,1 ml/Vertiefung in Mikrotiterplatten kultiviert. Die Kulturen wurden 48 Stunden in Gegenwart oder Abwesenheit von Mitogen in einer feuchten Atmosphäre, die 5 % CO enthielt, bebrütet» Die Testverbindung wurde in verschiedenen Konzentrationen gleichzeitig mit dem Mitogen zu den Kulturen gegeben·
Die Proliferation wurde anhand der Aufnahme von 1,0 Ci I HJ Thymidin während einer 18stündigen Inkubationsperiode untersucht· Die Kulturen wurden mit einer MASH-Vorrichtung abgeerntet (Otto Hiller Co., Madison, Wisconsin), und die Thymidineinverleibung wurde durch Plüssigkeits-Scintillationsspektrometrie untersucht. Die Kultivierung wurde dreimal durchgeführt, und die angegebenen Werte stellen Hittelwerte aus den erhaltenen Ergebnissen + der Standardabweichung des Versuchs dar. Die Stimulierungsindices der Testsubstanzen gegenüber den Kontrollwerten wurden errechnet und graphisch aufgezeichnet·
2· Mitogen induzierte menschliche periphere Blutlymphozyten
Es besteht klinischer Bedarf an therapeutischen Mitteln, die die Immunreaktion von Patienten verstärken, die keinen oder einen unterdrückten Abwehrmechanismus besitzen, wie dies bei Viruserkrankungen oder Krebs der
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Pall ist» Durch Untersuchung der Fähigkeit von Mitteln, die Proliferation menschlicher peripherer Blutlymphozyten als Reaktion auf Premdsubstanzen zu vermehren, kann man Mittel feststellen, die beim Menschen immunpotenzierend wirken. Das Verfahren ist das von Hadden, J. W9, Infect» & Immunity, Pebruar 1976, Seiten.382.- 387, insbesondere Seiten 382 - 383 beschriebene·'.
3ο Makrophage stellen eine Subpopulation weißer Blutkörper» chen dar, die eine wichtige Komponente des Immunsystems bei der Steuerung sowohl zellularer als auch humoraler Immunität darstellt« Mit dem nachstehend beschriebenen Testsystem lassen sich untersuchte Verbindungen als Potentiatoren der Makrophagenfunktion ermitteln«
Phytohämagglutinin (PHA) (HA-17) wurde von Burroughs Wellcome bezogen· Aus antigenstimulierten Lymphknotenlymphozyten (Meerschweinchen) wurde, wie von Hadden und Mitarbeitern, Nature Band 257 '(1975), Seite 483 bis 485 beschrieben, ein Präparat hergestellt, das Makrophagen Mitogenfaktor (MMP) und Makrophagen Aktivierungsfaktor (MAP) enthielt« Dieses Präparat wurde partiell durch Vakuumdialyse und Säulenchromatographie durch Sephades 6-100 gereinigt und ergab eine aktive Fraktion im Bereich von 35 bis 70«000 Dalton mit sowohl mitogener als auch Aktivierungseigenschaft. Die aktive Fraktion wurde für den Proliferations- und den Aktivierungstest verwendet»
2 t 5495 ~63~ 20.2.1980
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Methode
Ficoll-hypaque gereinigte menschliche periphere Blutlymphozyten wurden hergestellt, und die PHiI-induzierte Lymphozytenproliferation wurde durch Einverleibung von J_ Hj Thymidin, wie von Hadden und Mitarbeitern, Cell· Immunol. Band 20 (1975), Seiten 98-103 beschrieben, untersucht. Jede Verbindung wurde in Gegenwart suboptimaler, optimaler und supraoptimaler Konzentrationen an PHA (0,001, 0,01 bzw. 0,1 Einheiten/ml) analysiert· Mit Paräffinöl induzierte peritoneale Marophagen von Meerschweinchen wurden hergestellt und als Monoschichtkulturen bebrütet (mehr als 98 % reine Makrophagen)· Die Lymphokine (MMP)-Induzierte Proliferation wurde
3 durch Einverleibung von H Thymidin nach 3- und 5tägiger Kultivierung, wie von Hadden und Mitarbeitern, Nature Band 257 (1975), Seiten 483 - 485 beschrieben, untersucht. Die Lymphokine (MAP)-induzierte Makrophagenaktivierung zur Abtötung von Listeria Monocytogenen nach 5tägiger Kultivierung in Gegenwart oder Abwesenheit von MAP wurde sechs Stunden lang durchgeführt, wie von Hadden und England, Immunopharmakology, Seiten 87-100, Plenum Press, 1977» angegeben. Die Phagocytose wurde nach 20 Minuten langem Aussetzen an Listeria Monocytogene durch Auszählung der Anzahl von Makrophagen, die Bakterien enthielten, und der Anzahl der Bakterien je Phagocytenzelle auf Gram-gefärbten Monoschichten in Labtek-Kammern quantitativ festgestellt· Die intracelluläre Abtötung von Bakterien wurde durch Auszählen der Anzahl von Zellen, die Bakterien enthielten, und der Anzahl von Bakterien/ZeHe sechs Stunden nach der anfänglichen
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20 Minuten langen Aussetzung ermittelt. Parallelversuche, "bei denen Makrophage aufgelöst und intracellulare Bakterien kultiviert wurden, bestätigen die Richtigkeit der auf diese Weise in diesem System ermittelten Bakterienwirkung, Die Testsubstanzen wurden in jedem der drei Systeme über Reihen log-Konzentrationsbereiche dreifach in Gegenwart und Abwesenheit von Mitogen oder Lymphokine angewandt· Jede Versuchsart wurde mindestens dreimal durchgeführt» Die vorstehenden Versuche zeigen eine Parallelität der Reaktion auf die pharmakologische Modulierung bei den Proliferations- und Aktivierungsversuchen an.
Anti-Leukämiewirkung (Hemmung des Wachstums von L-1210)
Aus Mäusen mit L-1210-Tumor isolierte Leukämiezellen wurden in vitro kultiviert, und ihr Wachstum wurde durch Auszählen der Anzahl von Zellen in der Kultur über einen bestimmten Zeitraum gemessen. Die Einbringung einer Testsubstanz in das Medium verhindert das Wachstum der Leukämiezellen und zeigt damit ein wirksames Mittel gegen Leukämie an.
I1-Q (Konzentration der untersuchten Verbindung, die das Wachstum von L-1210 hemmt) in % für die Testsubstanzen:
Verbindung Konzentration
15392 7 28
15410 54
15417 47
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Das Testsystem ist nachfolgend beschrieben·
Prüfe, daß entsprechendes Zellwachstum in den Stammkulturen vorliegt. Verwende die Zellen 48 bis 72 Stunden nach ihrer Übertragung.
V/iege die Testsubstanzen in der 50fachen Menge der gewünschten Endkonzentration aus und stelle Reihenverdünnungen her. Stelle das endgültige Medium unter Verwendung von 500 ml McCoy's 5A Medium, 15 % fötalem Kalbserum, 5 ml Penicillin-Streptomycin-Lösung und 5 ml Antibiotika-Antimykotika-Lösung her. Lasse es bei Raumtemperatur stehen.
Füge unter sterilen Bedingungen 0,1 ml der Testsubstanz-Verdünnung zu jedem Röhrchen.
Versetze das hergestellte Medium mit einer entsprechenden Menge Zellen. Entferne nach dem Vermischen eine 0,5 ml-Probe, gebe sie in eine Phiole, die 9,5 ml Kochsalzlösung enthält, und zähle sie mit dem Coulter-Zähler aus. Multipliziere die Auszählung mit 40, um die 40fache Verdünnung zu kompensieren (0,5 ml in o,5 ml Kochsalzlösung und registriere den Impfstoff).
Füge 5ml der Zellsuspension zu jedem Röhrchen. Bewege die Röhrchen, um eine einheitlichere Verteilung der Zellen zu gewährleisten«
Verschließe mit Kappen und stelle 96 Stunden bei 36 bis
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38 0C in den C02-Inkubator.
Entferne nach 9β Stunden die Röhrchen aus dem Inkubator und zähle den Inhalt jedes Röhrchens mit dem Coulter-Zähler. Multipliziere alle Zählungen mit 40 und errechne den Durchschnitt der vier Zählungen für jede Verdünnung der Testsubstanz e Wenn die Auszählung unter derjenigen des Impfstoffs liegt, beträgt die Hemmung 100 %♦ Wenn die Auszählung über dem Durchschnitt aus den Zählungen der acht Kontrollproben liegt, beträgt die Hemmung 0 %% Pur alle anderen Zählungen gilt die folgende Gleichung:
Durchschnittliche Zellen/ml in behandelten Kulturen - Zellen im Impfstoff/ml
— χ 100 = % .
durchschnittliehe Zellen/ml in Kontroll- Überlebenkulturen - Zellen im Impfstoff/ml de
100 % » % Überlebende = Wachstumshemmung aufgrund der Behandlung·
Die erfindungsgeniäßen Verbindungen hemmten bei Anwendung von Standard Gewebekulturtechniken das Wachstum einer repräsentativen Probe von sowohl RNA- als auch DNA-Viren. Die Anwendung der Hämadsorptionstechnik (Abschnitt II, B) zeigte im Falle der RNA-Viren, daß mehrere Stämme von Influenza-Virus die sowohl zu den A- als auch zu den B-Subtypen gehören, in ihrer Vermehrung gehemmt wurden. Die speziellen Verbindungen, die sich als v/irksam gegen das Influenza- . Virus Typ A/USSR '90 erwiesen haben, sind in der Tabelle 1 aufgeführt· Mehrere Verbindungen der Reihe NPT 15392, NPT 15410, NPT 15417 und NPT 15418 waren gegen mindestens vier verschiedene Stämme von Influenza-Virus in einer
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Konzentration von 1 bis 150 ug/ml wirksam»
Außerdem hemmten mehrere Verbindungen der Reihe HPT 15410 und 15392 das Herpes-Simplex-Virus, das zu den DNA-Viren zählt, und ein Virus, das für schwerwiegende krankhafte Veränderungen der Schleimhaut beim Menschen verantwortlich ist, sowie das lebensgefährliche Virus Herpes encephalitis. Andere Viren dieser Klasse sind für Maul- und Klauenseuche bei Schweinen und Rindvieh und Nasen-Rachen-Infektionen bei Katzen sowie Husten bei Hunden verantwortlich. Sogar bei Konzentrationen von weniger als 100 /ug/ml an NPT.15392 und I54IO wurde eine Verringerung der durch das Herpes-Simplex-Virus verursachten Fleckenbildung von mehr als 90 % beobachtet. Andere RNA- und DNA-Viren, die für bestimmte Krankheiten verantwortlich sind, sind in der Tabelle 5 aufgeführt« Es ist bekannt, daß von allen Erkrankungen auf der Welt mindestens 25 % durch Viren verursacht v/erden. Außerdem wurde eine Reihe von Viren isoliert, die zur Bildung von Tumoren führen. Man kann daher annehmen, das antivirale Mittel auch gewisse Anti-Tumor-Eigenschaften haben.
Es ist eine anerkannte Tatsache, daß viele infektiöse Mittel, wie Viren (Influenza-Virus, HSV, Friend-Leukämie-Virus), Bakterien und Fungi beim Wirt einen Zustand unterdrückter Immunreaktionen hervorrufen, der dessen Abwehrkräfte gegen infektiöse Mittel schwächt. Die meisten anderen antiviralen Anti-Metaboliten, wie AraC, führen zu einer Unterdrückung der Immunreaktionen, wodurch die natürlichen Abwehrkräfte potenziell verringert und Sekundärinfektionen begünstigt werden·
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Ein Immunpotentiator oder Immuimiodulator ist ein Mittel, das entweder unterdrückte Immunfunktionen wiederherstellt, oder normale Immunfunktionen verbessert oder beides. Die Immun-· funktion wird als die Entwicklung und der Ausdruck humoraler (Antikörper-vermittelter) Immunität, zellularer (Thymozytenvermittelter) Immunität oder Makrophagen - und Granulozytenvermittelter Widerstandsfähigkeit definiert« Logischerweise umfaßt sie Mittel, die direkt auf die Zellen wirken, die an der Immunreaktion beteiligt sind, oder auf zellulare oder molekulare Mechanismen, die ihrerseits die Funktion von Zellen modifizieren, die an der Immunreaktion beteiligt sind. Eine Verstärkung der Immunfunktion kann aus der Wirkung eines Mittels resultieren, Unterdrückungsmechanismen aufzuheben, die sich von für das Immunsystem endogenen oder exogenen negativen Rückkopplungseinflüssen ableiten* Dementsprechend können Immunpotentiatoren verschiedene Wirkungsmechanismen besitzen. Trotz der unterschiedlichen Wirkung der Immunpotentiatoren, d. h. der Einwirkung auf die Zelle oder biochemischer Wirkungsmechanismen, ist die Anwendung der Immunpotentiatoren im wesentlichen die gleiche, nämlich die Verstärkung der Widerstandsfähigkeit des Wirtes«
Anwendung der Immunpotentiatoren
1) Die hauptsächliche Schutzfunktion des Immunsystems bezieht sich auf den Widerstand gegen ein Eindringen von Pathogenen, einschließlich Viren, Rickettsia, Mycοplasma, Bakterien, Fungi und Parasiten jeglicher Art, Die Verbesserung der Immunreaktion, insbesondere wenn sie geschwächt ist, verstärkt dementsprechend die Widerstandsfähigkeit gegen Infektionen durch irgendwelche der oben genannten Pathogene. Ein Immunpotentiator kann bei allen infektiösen Erkrankungen allein oder in Kombination mit einer Therapie gegen die Infektion ange-
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angewandt v/erden«
2) Eine zweite Schutzfunktion des Immunsystems besteht im Widerstand gegen die Aufnahme fremden Gewebes, entweder natürlichen Gewebes, wie bei der Beziehung Fötus-Mutterleib, oder von unnatürlichem Gewebe, wie bei vom Arzt durchgeführten Transplantationen· Immunpotentiatoren können auch zur Erleichterung der Abstoßung von fötalem plazentarem Gewebe oder zur Modifizierung oder Herbeiführung von Toleranz gegenüber Transplantaten verwendet werden·
3) Eine dritte Schutzfunktion des Immunsystems beruht vermutlich auf der Widerstandsfähigkeit gegenüber der Bildung bösartiger Zellen, wie bei Krebs· Immunpotentiatoren können in der Krebsbehandlung angewandt werden, um eine Tumorabweisung zu erhöhen und das V/iderauftreten von Tumoren nach anderen Therapieformen zu hemmen,
4) Eine vierte Schutzfunktion umfaßt die Fähigkeit, Fremdartigkeit zu erkennen und Mcht-Reaktionsf ähigkeit gegenüber sich selbst durch positive Unterdrückungsmechanismen aufrechtzuerhalten· Bei Auto-Immun und verwandten Erkrankungen richtet sich die Immunreaktion gegen eigene Antigene, oder es treten übertriebene überhöhte Reaktionen auf, die selbstzerstörend wirken· Immunpotentiatoren können angewandt werden, um den normalen Unterdrückungsmechanismus wiederherzustellen, Verträglichkeit einzuleiten oder in anderer Weise die normale Immunreaktion zu fördern.
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Jede der Schutzfunktionen des Immunsystems kann durch nichtspezifische Therapie mit Immunpotentiatoren allein modifiziert oder in Kombination mit anderen Mitteln angewandt werden, um die Widerstandsfähigkeit zu verbessern oder die eindringenden Pathogene abzutöten. Außerdem kann eine spezifische Widerstandsfähigkeit durch die Verwendung von Immunpotentiatoren in Verbindung mit einer Antigen-Form, wie in einem Impfstoff mit z. B, Viren, Tumorzellen, etc. verstärkt werden· Diese Anwendungsform kann entweder spezifische Immunität oder Toleranz herbeiführen* Ein Beispiel für letztere wäre die Anwendung mit Antigenen bei allergischen oder Auto-Immunerkrankungen. Die Immunpotentiatoren können entweder therapeutisch oder prophylaktisch angewandt werden, letzteres insbesondere im Alter, v/o Infektionen, Auto-Immunität und Krebs häufiger sind. Zeit und Weg der Verabreichung sind variabel und können bei der Bestimmung, ob eine positive oder negative Reaktion erfolgt, kritisch sein» Jegliches Mittel,.das eine Immunreaktion zu verstärken vermag, kann sie in Abhängigkeit von der Zeit und Dosis hemmen. Somit kann unter bestimmten Umständen ein Immunpotentiator als immununterdrückendes Mittel bei Allergien, Auto-Immunität und Transplantationen angewandt werden»
Die obige Tabelle 4 gibt die Ergebnisse der Bewertung einer Reihe erfindungsgemäßer Verbindungen als Potentiatoren für die Immunreaktion wieder. Es wurden drei verschiedene Testsysteme angewandt. Das erste mißt die Fähigkeit der Testverbindung, die Proliferation von Mäuse-Lymphozyten als Reaktion auf ein Pflanzenmitagen (Con A) zu erhöhen. Das zweite mißt die Fähigkeit der Testverbindungen, die Proliferation menschlicher Lymphozyten als Reaktion auf ein zweites Pflanzenmitogen (PHA) zu verstärken,. Das dritte System mißt die Fähigkeit der Testsubstanzen, die Profileration von Makrophagen aid
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Reaktion auf ein natürliches Lymphokin (MMF, Makrophagen Mitogenfaktor) zu verstärken. Es wurde nachgewiesen, daß die zuletzt genannte Reaktion, die Proliferation und Aktivierung von Makrophagen, an der Abtötung von Bakterien, Viren und Tumorzellen durch diese Klasse weißer Blutkörperchen "beteiligt ist.
Eine v/esentliehe Potenzierung der Immunreaktion wurde bei 15392, 15410 und 15418 beobachtet.
Schließlich wurde die Aktivität einiger erfindungsgemäße Verbindungen, WPT 15392 und 15410 als Inhibitoren des Wachstums anormaler Lymphozyten bestimmt. Bemerkenswert ist, daß beide Substanzen die Proliferation von leukämischen Mäuselymphozyten (Ir-1210-Zellen) in Gewebekulturen zu hemmen vermögen. Eine 50%ige Hemmung der L-1210-Zellen wurde mit HPT 15392 in einer Konzentration von 28 /ug/ml und mit ITPT 15410.in einer Konzentration von 54 /ug/ml erreicht. Die !Fähigkeit der Hemmung leukämischer Lymphozyten in Konzentrationen, die normale Lymphozyten stimulieren, stellt eine einzigartige Eigenschaft dar, die bisher für keine andere Substanzklasse bekannt ist·
Die erfindungsgemäßen Verbindungen stellen Glieder einer Substanzklasse dar, die spezifisch RIiA- und DxJA-Viren hemmt, die Immunreaktion moduliert (potenziert) und das Wachstum leukämischer Lymphozyten hemmt. Aufgrund von in-vitro-Versuchen, die Wirksamkeit über einen Konzentrationsbereich von 0,01 bis 150 ug/ml demonstrieren, sind bei Säugetieren Dosen von 0,05 bis 500 ml/kg wirksam« In Mengen von 1500 mg/kg wurde für eine Reihe erfindungsgemäßer Verbindungen bei Mäusen keine Toxizität festgestellt.
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Die erfindungsgemäßen Iiamunpotentiatoren können ζ· Β. zur Vermittlung von Widerstandsfähigkeit gegen eine Infektion mit den in der Tabelle 5 aufgeführten Viren verwendet werden·
(Tabelle
5
Virus
Arenavirus Influenza .Rhinovirus Poliovirus Masern
Newcastle Virus
Rotavirus Hepatitis Typ A
Tollwut-Virus Arbovirus Vaccinia-Virus
Herpes-Simplex-Virus
Herpes Zoster Varicella Zoster Adenovirus
Hepatitis Typ B
Klasse
RNA RNA RNA RNA RNA
RNA RNA RNA
RNA RNA DNA
DNA
DNA DNA
DNA
DNA
Krankheit
Rift Valley Fieber Influenza Erkältung Polio
Deutsche Masern
NewcastIe-Krankheit
Gastroenteritis bei Kindern
Infektiöse Hepatitis
Tollwut Encephalitis Pocken
Bläschenaus schlag, Encephalitis, Geschlechtskrankheit
Gürtelrose Windpocken
Erkrankung der Atemwege
Chronische Hepatitis, Schwere Hepatitis
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Maul- und Klauenseuche-Virus DNA Maul*- und Klauenseuche
Machupo-Virus Hamorrhagisches
Fieber
Von den in der Tabelle 1 beschriebenen Verbindungen sind die Verbindungen WPT 15392 und NPT 15446 neu. Neu sind auch die DIP.PAcBA-Salze in dieser Tabelle, nämlich 15428, 15437, 15447, 15432, 15434, 15444, 15418 und 15410. NPT 15392, NPT 15417 sowie NPT 15426 zeigen sämtlich wesentliche Wirkung gegen Influenza. In einem Fall, nämlich bei der Zugabe von DIPoPAcBA-SaIz zu NPT 15392 unter Bildung von 15410, wird die Wirkung gegen Influenza nicht potenziert. Im Falle von NPT
15417 führt die Zugabe von DIP.PAcBA-SaIz unter Bildung von
15418 zu einer Potenzierung der Wirkung gegen Influenza. Eine Zusammenstellung der Fähigkeit der DIP.PAcBA-Salze zur Potenzierung der verschiedenen biologischen Wirkungen ist nachfolgend aufgeführt.
| DIPoPAcBA | Tabelle 6 | Potenzierung | Immunpoten- | |
| Salz | der Wirkung | zierung | ||
| Verbindung | Wirkung gegen | gegen Leukämie | ||
| 154IO | Influenza | ja | ja | |
| 15392 | 15418 | beide sind | - | ja |
| 15437 | gleich wirks. | - | ||
| 15417 | 15447 | ja | — | — |
| 15435 | 15432 | ja | - . | |
| 15446 | 15434 | ja | — | - |
| 15431 | 15444 | ja | OTM | |
| 15433 | ja | |||
| 15443 | ja | |||
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Formulierungen
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können an Menschen und Säugetiere in einer Dosis von 1 Ms 1000 mg/kg Körpergewicht verabfolgt werden· Man nimmt an, daß sie in einer Dosis von nur 0,05 mg/kg wirksam sind. Die IiD1-Q von NPT 15410 betrug bei parenteraler Verabreichung an Mäuse 4*300 mg/kg, bei subkutaner Verabreichung 4*900 mg/kg· NPT 15392 wurde in einer Dosis von 1000 mg/kg an Mäuse verabreicht, wobei keine durch diese Verbindung verursachte Mortalität beobachtet wurde.
Die erfindungßgemäßen Verbindungen können in Tabletten- oder Kapselform an Menschen verabfolgt werden und, wenn Löslichkeit gegeben ist, in Form von Sirup oder injizierbaren Lösungen oder bei Unlöslichkeit in Form von Suspensionen* Typische pharmazeutische Zubereitungen sind nachfolgend beschrieben·
Kapsel:
NPT 15392 50-500 mg
Avicel pH 101
(mikrokristalline
Zellulose) zum Auffüllen
auf 800 mg
Suspension:
Wäßrige Suspension können mit einer Reihe von Suspendiermitteln hergestellt werden, die mit den Wirkstoffen vermischt werden* Beispiele hierfür sind Natriumcarboxymethylzellulose,
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Natriumalginat, Gummi Tragacanth, Avicel RC-591 (Mikrozellulose), Methylzellulose, Veegum und Xanthan Gummi» Außer den Suspendiermitteln können Süßungsmittel, Geschmacksstoffe , Farbstoffe, Konservierungsmittel, Schutzkolloide und Dispergiermittel zugefügt werden·
NPT 15392 Avicel pH 101 modifizierte Stärke Magnesiumstearat U.S.P. Polyvinylpyrrolidon Stearinsäure U.S.P·
50-500 mg
mg
20 mg
5,5 mg
22 mg
30 mg
15392
25-125 mg (oder bis zur
maximalen Menge der Löslichkeit)
| Maiszucker | 3,25 | g | S |
| destilliertes Wasser | 0,05 | g | g |
| PD und C Rot 40 | 0,00175 | g | g |
| Natriumsaccharin | 0,00250 | g | g |
| Alkohol U.S0P. | 0,08 | g | g |
| Methylparaben U.S.P. | 0,005 | ||
| Propylparaben U.S.P. | 0,001 | ||
| Glycerin | 0,31225 | ||
| Kirscharoma | 0,00825 | ||
| Fruchtaroma | 0,00825 |
destilliertes Wasser zum Auffüllen auf
ml
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In-vivo-Behandlung von Mäusen mit IiPT 15392 und NPT 15410: Wirkung auf die in-vitro-Stimulierung der Proliferation von Milzzellen durch Concanavalin A ·.
Zweck dieser Untersuchung war die Peststellung der Wirkung der in-vivo-Behandlung von Mäusen mit den Verbindungen NPT 15392 und 15410 auf die nachfolgende Fähigkeit von Milzzellen, die aus diesen Tieren isoliert und in vitro untersucht wurden, auf ihre Proliferationsreaktion gegenüber dem Mitogen Concanavalin A (Con A).
Neun männliche acht bis neun Wochen alte Balb/C Mäuse mit einem Gewicht von jeweils 18 bis 20 g wurden in drei Gruppen unterteilt. Eine dieser Gruppen erhielt an einem Tag zweimal, am Morgen und am Nachmittag, eine orale Dosis an NPT 15392 von 10 mg/10 kg Körpergewicht. Die zweite Gruppe wurde in ähnlicher Weise mit NPT 15410 in einer Dosis von 20 .mg/kg behandelt» Eine dritte Gruppe, die als Kontrolle diente, erhielt Kochsalzlösung als Placebo.
An folgenden Tagen wurden die Tiere getötet, und die Milz aus den Tieren der einzelnen Gruppen wurde entfernt, gesammelt und zerkleinert. Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (Grand Island Biologicals), das mit 2 ml Glutamin und Antibiotika ergänzt war, gewaschen· Die Zellkonzentration jedes Präparats wurde mit einem Coulter-Zähler bestimmt und mit RPMI-Medium 5 s 10 Zellen/ml eingestellt.
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Mikrotiterplatten-Untersuchung
Diese Untersuchungen wurden mit 0,2 ml Inkubationsproben durchgeführt, die 5 χ 10^ Zellen und Con A oder Con A und weitere Verbindungen in den angegebenen Konzentrationen enthielten· Alle Versuche wurden mit 6 parallel laufenden Proben durchgeführt und mit einer Blindprobe verglichen, die nur Zellen enthielt. Die Mikrotiterplatten wurden bei 37 0C in 5 % COp vier Tage lang inkubiert*-.Während der letzten 18 bis 20 Stunden wurden 0,5 ml 3HTdR (10 /uCi/ml, 6 Ci/m Mol) zu jeder Kultur gegeben· Die Kulturen wurden mit einer automatischen Mehrfachproben-Aberntevorrichtung (IiIiISH)
3 abgeerntet, und das eingearbeitete HTdR wurde mit einem Beckmann LS 8000 Flüssigkeit-Scintillationszähler als Maß der Zeilproliferation bestimmt* Die erhaltenen Werte sind als Verhältnis der Aktivität der mit Con A oder Con A plus Verbindung behandelten Kulturen zu den Leerkulturen angegeben.
Die in-vivo-Behandlung mit jeder der Verbindungen 15392 und 15410 verbessert die spätere Reaktion der Milzzellen in vitro gegenüber der Con-A-Stimulierung bei einer suboptimalen Mitogenkonzentration von 5 ^ug/ml. Bei Milzzellen, die aus mit 15410 behandelten Mäusen isoliert worden waren, wurde ein Stimulierungsverhältnis von 100 : 1 im Vergleich zu einem Verhältnis von 55 s 1 bei Milzzellen beobachtet, die aus mit Placebo behandelten Mäusen isoliert worden waren. Wenn die Zellen mit einer höheren Konzentration an Con A von 10yug/ml stimuliert wurden, stellte man keine wesentlichen Unterschiede fest, weder bei der Verbindung 15392, noch bei der Verbindung 15410·
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Es wurde auch die Wirkung einer nachfolgenden in-vitro-Behandlung von mit Con A stimulierten Zellen mit NPT 15392 und 15410 in einer Dosis von 1 /ug/ml untersucht· Beide Verbindungen besitzen eine ausgeprägte Fähigkeit, die Con-A-Stimulierung zu erhöhen, insbesondere bei der suboptimalen Mitogenkonzentration von 5 /ug/ml und in geringerem Ausmaß bei 10 /ug/ml. Bei 5 /ug/ml an Con A beträgt die Stimulierung durch UPT 15392 das 2,8fache gegenüber Con A allein, während sie für UPT 15410 das 3,3fache ausmacht.
Diese Ergebnisse zeigen eine immunomodulierende Wirkung dieser Verbindungen auf die Proliferation von Milzzellen an. Die Vorbehandlung von Tieren mit beiden Verbindungen sensitiviert die Zellen für eine nachfolgende Mitogenstimulierung, während eine in-vitro-Behandlung der Zellen mit den Verbindungen im Anschluß an eine Mitogenstimulierung die Prolifertationsreaktion verbessert, insbesondere, wenn die Reaktion auf Mitogen allein gering ist.
Claims (2)
1 2
in der R und R die angegebene Bedeutung haben, durch Behandlung mit Triethylorthoformiat einem RingSchluß unterwirft
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aus den in den Stufen a) bis h) jeweils erhaltenen Verbindungen und dem Salz Y im Molverhältnis 1 : 1 bis 1 : 10 eine Mischung herstellt, die Mischung löst und aus der Lösung den gebildeten Komplex gewinnt o
Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man unter Anwendung der Verfahrensstufen a), b), c), d) bzw» h) eine Komplexverbindung herstellt, in der X die OH-, NH0- oder SH-Gruppe, R die n-Hexylgruppe,
1 2
umsetzt, in der R und R die oben angegebene Bedeutung haben, und das erhaltene 4-Chlor-5-amino-6-(hydroxyalkylamino)-pyrimidin der allgemeinen Formel
umsetzt, in der R und R die oben angegebene Bedeutung haben, und das erhaltene 4-Chlor-5-amino-6-(hydroxyalkylamino)-pyrimidin der allgemeinen Formel
NH H-C-CH -R2
R1 OH
1·.Verfahren zur Herstellung von Komplexverbindungen von in 6~Stellung substituierten 9-Hydroxyalkylpurinen der allgemeinen Formel
R2
R1 OH
in der X die Gruppen NH2, HO-, HS-, RO- oder RS-bedeutet, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis Kohlenstoffatomen oder die Benzylgruppe ist, oder
-ι X ein Chlor- oder Jodatom darstellt, R Wasserstoff
oder eine Alkylgruppe mit T bis 8 Kohlenstoffatomen
und R Wasserstoff oder die Methylgruppe ist, Y das Salz eines Amins der allgemeinen Formel
R?.
-80- 20,2·1930
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in der R und R niedere Alkylgruppen sind und η eine ganze Zahl von 2 bis 4 ist, mit p-Acetamido~ benzoesäure oder einer anderen pharmazeutisch annehmbaren Säure bedeutet und ζ eine Zahl von 0 bis 10 ist, gekennzeichnet dadurch, daß man
a) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Amino-purin in saurer Lösung mit ITatriumnitrit diazotiert, um in 6-Stellung eine OH-Gruppe einzuführen,
b) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Ohlor-purin in alkoholischer Lösung mit Ammoniak behandelt, um in 6-Stellung eine NHp-Gruppe einzuführen,
c) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Chlor-purin mit Thioharnstoff behandelt, um in 6-Stellung eine SH-Gruppe einzuführen,
d) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Chlor-purin in alkalischer Lösung unter Erhitzen hydrolisiert, um in 6-Stellung eine OH-Gruppe einzuführen,
e) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Chlor-purin mit Jodwasserstoff behandelt, um in 6-Stellung ein Jodatom einzuführen,
f) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Hydroxy-purin mit einem Alkalialkylat behandelt, um in 6-Stellung eine Alkoxygruppe einzuführen,
g) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Merkaptopurin mit einem Alkyljodid behandelt, um in 6-Stellung eine Thioalky!gruppe einzuführen oder
2^5495 -81- 20.2.1980
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h.) 5-Amino-4,6-dichlorpyrimidin der Formel
mit einem Amin der allgemeinen Formel
CH-CH-R2
I1 I
R1 OH
2 ^
R die Methylgruppe und Y das Salz von Dimethylamino-
isopropanol mit p-Acetamidobenzoesäure ist.
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