Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych zwiazków kompleksowych 6- podstawionych 9-(hydroksyalkilo)puryn o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza grupe OH, Rl oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1-8 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, Y oznacza sól aminy o wzorze 2, w którym R3 i R4 sa nizszymi rodnikami alkilowymi, np. o 1-4 atomach wegla, oraz n jest liczba calkowita w zakresie 2-4, z kwasem p-acetamidobenzoesowym, i w którym z oznacza liczbe w zakresie od 1 do 10.Otrzymywane sposobem wedlug wynalazku zwiazki sa uzyteczne w stosowaniujako immuno- modulatory, srodki antywirusowe i jako zwiazki wykazujace w odpowiednich warunkach wlasci¬ wosci przeciwnowotworowe. Zwiazki kompleksowe, w którym z jest w zakresie 1-10 sa zwiazkami nowymi.Gdy R2 oznacza atom wodoru, obecnosc soli Y wzmaga aktywnosc immunoregulacyjna i antywirusowe dzialanie zwiazku.Dzialanie immunoregulacyjne wydaje sie wzrastac ze wzrostem dlugosci lancucha podstaw- nika R1, co najmniej od metylu do heksylu. Korzystnie, Rl oznacza rodnik n-alkilowy, to jest metylowy, etylowy, n-propylowy, n-butylowy, n-amylowy, n-heksylowy, n-heptylowy lub n- oktylowy. R2 oznacza korzystnie rodnik metylowy. R2moze byc rodnikiem metylowym, etylowym, n-propylowym, n-butylowym, izopropylowym i podobnym.Korzystna grupa amin dla tworzenia soli z kwasem p-acetamidobenzoesowym posiada ogólny wzór 3, w którym R5 i R6 oznaczaja nizsze rodniki alkilowe, np. rodnik metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy lub butylowy, a n jest liczba calkowita w zakresie 2-4. Do przykladów takich typowych amin naleza etanolodwumetyloamina, izopropanolodwumetyloamina,etanolod- wuetyloamina, izobutanolodwuetyloamina, izopropanolodwuetyloamina, etanolometyloetyloa- mina, butanolo-N-dwuizobutyloamina, propanolodwumetyloamina, butanolo-N-dwumetyloa- mina, etanolodwuizobutyloamina, butanolodwumetyloamina, butanolo-N-dwubutyloamina, etanolodwubutyloamina, etanolodwupropyloamina i etanolodwuizopropyloamina. Stosowany119 685 ktualnie korzystna amina jest izopropanolodwumetyloamina. Korzystna wartoscia dla z jest czba 3, aczkolwiek moze ono miec wartosc równiez 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10.Chociaz korzystnie sa nowe zwiazki, w którym Y jest sola aminy o wzorze 2 z kwasem -acetamidobenzoesowym, mozna wytwarzac równiez nowe zwiazki, w których Y jest sola aminy ik podano wyzej, z farmaceutycznie dopuszczalnym kwasem róznym od kwasu p- cetamidobenzoesowego, np. kwasem chlorowodorowym, siarkowym, bromowodorowym, fosfo¬ rowym, octowym, propionowym, malonowym, mlekowym, cytrynowym, winowym, p-toluenosul- fonowym, adypinowym, maleinowym, bursztynowym, metanosulfonowym, salicylowym, acetylosalicylowym.W opisie ponizszych zwiazków stosuje sie, w razie obecnosci soli Y, skrót DIP.PAcBA, oznaczajacy benzoesan dwumetyIoamino-2-propanolo-p-acetamidowy. O ile po skrócie nie wyste¬ puje liczba w nawiasach, np. (10), to ilosc Y jest równa 3. Gdy po strócie DIP.PAcBAnastepuje liczba w nawiasach, to oznacza to ilosc moli grup Y przypadajacych na 1 mol 9-(hydroksyalkilo)- -puryny.Zwiazek immunomodulacyjny jest zwiazkiem, który steruje odpornoscia organizmu. Obej¬ muje on równiez immunostymulacje (potencjalna odpornosc) i immunoinhibitacje. Immunosty- mulacja ma oczywiscie znaczenie dla zwiekszenia odpornosci. Immunoinhibitacja ma równiez znaczenie w wielu dziedzinach. Na przyklad odgrywa role przy transplantacji organów, np. przy transplantacji nerki czy serca, dla zapobiegania odrzucenia przeszczepu.Nowe kompleksy o wzorze 1 wedlug wynalazku otrzymuje sie wprowadzajac do odpowiedniej 9-podstawionej-6-aminopuryny o wzorze 5, w którym X oznacza grupe —NH2, a R1 i R2 maja wyzej podane znaczenie, grupe —OH w pozycji 6 przez dwuazowanie azotynem sodu w zakwaszonym roztworze, po czym wytwarza sie kompleks otrzymanego zwiazku z sola Y w stosunku molowym 1:1-1:10, który wydziela sie z roztworu.Korzystnie stosuje sie 9-podstawiona puryne o wzorze 5, w której R1 oznacza rodnik n- alkilowy, zwlaszcza n-heksylowy lub metylowy.W tablicach przedstawiono wlasnosci immunopotencjalne zwiazków. Plus (+) lub minus (—) oznacza odpowiednio wlasnosci immunostymulujace lub immunoinhibitacyjne. Liczba O oznacza, ze zwazek nie posiada zadnej z tych wlasciwosci.Mitogen jest substancja, która powoduje wzrost komórki, tak jak to ma miejsce w przypadku uodporniania.Kompleksy wytwarzane sposobem wedlug wynalazku sa uzyteczne w dzialaniu na ssaki (i komórki ssaków). I tak, moze je stosowac u ludzi, swin, psów, kotów, bydla, koni, owiec, kóz, myszy, królików, szczurów, swinek morskich, chomików, malp i podobnych.Zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku mozna podawac ssakom sposobami kon¬ wencjonalnymi, tj. doustnie, do nosa, droga lewatywy, dopochwowo, dojelitowo czy pozajelitowo.Mozna je stosowac w postaci wstrzykiwanych roztworów np. wodnych, lub w postaci tabletek, pigulek, kapsulek itp.Metody badania aktywnosci biologicznej.Aktywnosc przeciwko wirusowi grypy (oznaczenie hemadsorbcji). Po zakazeniu jednowar¬ stwowych hodowli tkankowychwirusem grupy, powierzchnia komórkowazostaje zmieniona w ten sposób, ze erytrocyty swinki morskiej moga byc adsorbowane na powierzchni komórek. Liczba ognisk (skupien) zaabsorbowanych komórek (jednostki tworzace ogniska hemadsorbcji) jest ilos¬ ciowa miara zakazenia.Opis metody. Jednowarstwowe hodowle komórkowe hodowane w nastepujacy sposób: pozywke zlewano i jednowarstwowe hodowle komórkowe przemywano dwukrotnie 50 ml por¬ cjami roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami,pozbawionej wapnia i magnezu (PBS), (GIBCO 419) o pH 7,2. Do kazdej butelki hodowlanej w temperaturze 37° dodawano 1 ml roztworu trypsyny-EDTA (GIBCO 530L) zawierajacy 0,5 trypsyny (1:250) i 2,0g EDTA (litr Puck's Saline A) i rozprowadzano nad jednowarstwowa hodowla przez delikatne potrzasanie.Butelki hodowlane umieszczono w inkubatorze w temperaturze 37° na okolo 3-5 minut w zale¬ znosci od tego, jaki okres czasu byl potrzebny dla oderwania komórek. Do kazdej butelki dodawano dziesiec ml pozywki hodowlanej i komórki rozprowadzano przez wciaganie i wydmu¬ chiwanie zawiesiny z pipety.119685 3 Zawartosc szeregu butelek hodowlanych zbierano razem i komórki w zawiesinie rozcienczono pozywka hodowlana do 7-8,5 X 104 komórek/ml. Pozywka hodowlana miala nastepujacy sklad: podstawowa pozywka minimalna wedlug Eagle'a (MEM) z solami Earle'a i buforem HEPES (GIBCO 236) uzupelniona przez dodanie nastepujacych substancji w odniesieniu do 87 ml pozywki MEM: 10 ml plodowej surowicy cielecej (FCS—GIBCO 614 HI), lml L-glutaminy (200 Molar GIBCO and 503), 1 ml chlortetracykliny (5000 g/ml) GIBCO 528), 1 ml mieszaniny zawierajacej 10000 jednostek penicyliny, 10000 g streptomycyny i 100000 neomycyny (PSN—GIBCO 564).Komórki hodowano na tackach hodowlanych Linbro. Kazda tacka zawierajaca 24 plaskodenne studzienki o objetosci 3 ml; zawiesine komórek (1 ml) dodawano do kazdej studzienki.Nastepnego dnia pozywke usuwano i dodawano nowa pozywke hodowlana. Jednowarstwowe hodowle uzywano do badan po osiagnieciu gestosci pokrywajacej w sposób ciagly przez komórki naczynia hodowlanego (3-4 dni). Kiedy kultury komórek Hela hodowanych na tackach Linbro byly gotowe do eksperymentowania (patrz komórki) pozywka byla usuwana i do czterech hodowli tkanowych znajdujacych sie na tacce dodawano 1 ml pozywki podtrzymujacej (pozywka Eagle'a z surowica plodowa cieleca zmniejszona do 3%) zawierajacej w podanym stezeniu zwiazek poddany badaniu. Stosowano szereg róznych stezen badanego zwiazku od 2,3 do 150 g/ml. W hodowlach komórkowych kontrolnych uzywano pozywke podtrzymujaca bez zadnych dodatków.Po podaniu badanego zwiazku i kontrolnej pozywki, do grup eksperymentalnych i do kultur komórkowych kontrolnych dodawano 0,1 ml rozcienczonej zawiesiny wirusa. Roztwór soli fizjolo¬ gicznej dodawano do niezakazonych kontrolnych hodowli tkankowych. Tacki Linbro inkubo- wano w temperaturze 37°C w ciagu 18 godzin, a nastepnie odciagano pozywki we wszystkich grupach. Kazda hodowle przemywano jednorazowo PBS. Usuwano roztwór soli, do kazdej hodowlanej studzienki dodawano 0, 5 ml 0,4% objetosciowo/objetosciowych zawiesiny erytrocy¬ tów swinki morskiej. Hodowle komórkowe pozostawiono w temperaturze pokojowej na 30minut, nastepnie pozywke usuwano i kultury komórkowe przemywano dwukrotnie PBS w celu usuniecia wszystkich komórek poza specyficznie zwiazanymi erytrocytami. Po trzecim przemyciu pozywke podtrzymujaca dodawano do wszystkich hodowli.Wewnatrz okularu Nikon mikroskopu o odwróconym kontrascie fazowym umieszczano okular pomiarowy Howarda (C8385). Kazda hodowle ogladano i bezposrednio liczono hemadsor- bowane czerwone komórki przy uzyciu siatki okularu jako markera pola. Czesciowe lub cale pola byly Uczone na grupe eksperymentalna odnoszac uzyskane dane i gestosc zaadsorbowanych komórek w stosunku do zakazonych hodowli komórkowych kontrolnych.Dla liczenia hemadsorbowanych komórek wybrano powiekszenie 60x lub 150x. Wspólczyn¬ niki pola wyliczono z obliczen hemadsorbcji przy powiekszeniu 60x i 150x. Przy 60x powiekszeniu obliczenie calego pola uzyskiwano przez pomnozenie przez wspólczynnik 55,5. Przy powiekszeniu 150x stosowano wspólczynnik mnozenia 273. Wspólczynniki mnozenia 55,5 i 273 przedstawiaja cala liczbe pól odpowiednio przy powiekszeniu 60x i 150x. Liczba pól liczonych wynosila 3 do 5 na studzienke przy uzyciu 3-4 studzienek w badanej grupie (patrz bezposrednio dane w tablicach rezultatów dla liczby pól badanych). Obliczono wyniki srednie i blad standardowy i dane oceniano przy uzyciu testu t Studenta.Aktywnosc antywirusowa kompleksów otrzymanych sposobem wedlug wynalazku w porów¬ naniu z innymi pochodnymi 9-(hydroksyalkilo)puryn w odniesieniu do wirusa grupy A ZSRR (90/HiNi) przedstawiono w tablicy 1.Jak wynika z powyzszych danych, zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku wykazuja w opisanej próbie z reguly wyzsza aktywnosc przeciwwirusowa.Aktywnosc przeciwko wirusom opryszczki (Herpes). (Próba lysinkowa). Zakazenie hodowli tkankowych wirusem Herpes powoduje lize komórek. Po pewnym czasie komórki, które ulegly lizie, sa widoczne jako drobne jasne pola (lysinki) w warstwie komórek. Wprowadzenie badanej substancji do pozywki bedzie zmniejszac liczbe lysinek, o ile badany zwiazekjest zdolny zapobiegac replikacji wirusa.Stosowano nastepujaca metode: Materialy i metody. Wirus. Wykorzystano wirus herpes hominis (wirus opryszczki ludzkiej) typu 2 nabyty z American Type Culture Collection (ATCC), Bethesda, Maryland ATCCVR 540, Lot 3D. Liofilizowana zawiesine wirusa rozpuszczano w 1 ml destylowanej, sterylnej wody. Wirus przepuszczano dwukrotnie przez jednowarstwowa hodowle4 119 685 komórek HeLa. Nadsacze znad hodowli tkankowych zbierano razem, dzielono na jednomililitrowe porcje i przechowywano w temperaturze —70°C. Miano tej wyjsciowo-roboczej zawiesiny wynosilo 10~4 TCID50/OJ ml (2 dni inkubacji).Próba lysinkowa wirusa opryszczki. Komórki Verow logarytmicznej fazie wzrostu hodowano w stezeniu 1X 105 komórek/ml w 50 ml butelkach Falcon w pozywce Eagle'a (MEM), uzupelnionej 10% surowica plodowa cieleca i antybiotykami. Pozywke zmieniano nastepnego dnia po zalozeniu hodowli. Jednowarstwowa hodowla Vero osiagala jednolite pokrycie nastepnego dnia po wysianiu i z komórkami w logarytmicznej fazie wzrostu, i takie hodowle uzywano do próby lysinkowej.Pozywke hodowlana zlewano i przemywano jednowarstwowe hodowle jednorazowo roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przygotowywano szereg róznych rozcienczen wyjsciowo-roboczej zawiesiny wirusa i kazda butelke hodowlana zakazano przez dodanie do pozywki bez surowicy plodowej 0,5 ml jednego z wirusowych rozcienczen. Pozywka zawierala badany zwiazek w stezeniu 150 /xg/ml. Próbki kontrolne przygotowywano z pozywka bez badanego zwiazku. Adsorbcje wirusa przeprowadzano w ciagu 2 godzin w temperaturze 37°C, podczas których hodowle delikatnie potrzasano co 15 minut.Nastepnie pozywki zlewano i jednowarstwowe hodowle przemywanojednorazowo 10 ml PBS.Agaroze przygotowywano w stezeniu 6% wagowo/objetosciowych w 50 ml PBS. Przygotowywano wyjsciowa pozywke MEM uzupelniona 2% surowica plodowa. Badane zwiazki dodawano do wyjsciowej pozywki w ilosci 150 ii%/m\. Trzy roztwory utrzymywano w temperaturze 47°C.Dodatkowo przygotowano w rozcienczeniu 1:10 ludzka surowice przeciwko wirusowi opryszczki.Tuzprzed rozpoczeciem badania do 85 ml pozywki dodawano 15 ml roztworu agarozy. Inne 15 ml agarozy dodawano do 85 ml pozywki zawierajacej badany zwiazek. Kazda z jednowarstwowych przemytych hodowli z tej samej grupy eksperymentalnej zadawano albo 5 ml pozywki z agaroza albo 5 ml pozywki z agaroza i badanym zwiazkiem.W innej grupie eksperymentalnej do kazdej jednowarstwowej hodowli dodawano 0,2 ml surowicy przeciwko wirusowi opryszczki w 5 ml wyjsciowej pozywki albo 0,2 ml surowicy przeciw¬ ko wirusowi opryszczki w 5 ml pozywki zawierajacej badany zwiazek. Zamiast agarozy do lokalizowania lysinek przez neutralizowanie wolnego wirusa w pozywce stosowano surowice przeciwwirusowa. Butelki hodowlane pozostawiono w temperaturze pokojowej na 5 minut, po czym inkubowano je w temperaturze 37°C w ciagu dwóch dni. Dla wiekszosci badanych grup stosowano po trzy hodowle komórkowe.Nastepnie do kazdej butelki hodowlanej dodawano 10 ml PBS. Komórki rosnace ponad jedna warstwe delikatnie wytrzasano i nastepnie zlewano z butelek. Jednowarstwowe hodowle barwiono roztworem 0,5% wag/obj. krystalicznego fioletu w 50% metanolu w trzykrotnie destylowanej wodzie. Lysinki liczono albo bezposrednio makroskopowo w przechodzacym swietle fluoryzujacym albo uzywajac swietlnego mirkoskopu dla mikrolysinek. Mikrolysinki liczono obliczajac przecietna trzech pól w grupie eksperymentalnej przy powiekszeniu 150x.Aktywnosc antywirusowa kompleksów otrzymanych sposobem wedlug wynalazku w porównaniu z innymi pochodnymi 9-(hydroksyalkilo)puryn w odniesieniu do wirusa opryszczki przedstawiono w tablicy 2. Przedstawione dane wskazuja, ze jest ona w przypadku zwiazków kompleksowych równie dobra jak w przypadku zwiazków niekompleksowanych.W tablicy 3 przedstawiono przeciwdzialanie komplesków otrzymanych sposobem wedlug wynalazku o wzorze 4 w porównaniu z innymi 9-(hydroksyalkilo)purynami w odniesieniu do róznych rodzajów wirusa grypy, a w tablicy 4 dodatkowo próby nowego kompleksu otrzymanego sposobem wedlug wynalazku, oznaczonego jako zwiazek NPT 15410 w odniesieniu do róznych wirusów grypy.Próba immunoregulacyjna. Aby ocenic zdolnosc badanych substancji do regulacji aktywnosci szeregu klas komórek w systemie odpornosci, stosowano trzy sposoby badan. W systemach tych mozliwa jest identyfikacja zarówno wzmozonej odpowiedni immunologicznej (uwidocznionej przez wzrost badanych parametrów), jak równiez aktywnosci immunosupresyjnej (uwidoczniona przez zahamowanie badanych parametrów). a) Próba indukcji mysich splenocytów mitogenem. Komórki sledziony mysiej zawieraja populacje zarówno limfocytów B jak i T, które moga byc pobudzane przez szereg róznych substancji (jak np. roslinne mitogeny takie jak ConA) do proliferacji. Ten wzrost proliferacji jest119 685 5 wskaznikiem wzrostu odpornosci komórkowej. Opisana nizej metoda opisuje system uzywany do oceny badanych zwiazków jako wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej. Materialy.Concanavalina A (Calbiochem, La Jolla, California), Lot 210073, liofilizowana w NaCl, przygotowywana najpierw jako 1% roztwór i rozcienczana z dwukrotnie wyzszego stezenia dla kazdego rozcienczenia (0,5, 1,0, 2,0, 5 /xg/ml.Zwierzeta. Szescio- do osmiotygodniowe samce myszy osobnych linii Balb/c i C3H pochodzace z nastepujacych zródel: Flow research Animals, Inc., Dublin, Virginia; Charles River Breeding Laboratories, Wilmington, Massachusetts; Laboratory Supply Company, Indianapolis, Indiana; i Lionel Strong Foundation, San Diego, California.Komórki. Trzydo pieciu myszy zabijano przez przeciecie karku i sterylnie usuwano sledziony.Zebrane sledziony miazdzono i rozdrabniano sterylnymi kleszczami; nastepnie osadzono przez podwójna warstwe nylonowej siatki. Zawiesine komórkowa przemywano jednorazowo 15 ml RPMI 1640 uzupelnionej 5% plodowa surowica cieleca i antybiotykami. Komórki hodowano w stezeniu 106 komórek (0,1 ml) na studzienke w mikroplytkach. Hodowle inkubowano w ciagu 48 godzin w obecnosci lub braku mitogenu w wilgotnej atmosferze zawierajacej 5% CO2. Badany zwazek dodawano do hodowli komórkowych w róznych stezeniach w towarzystwie mitogenu.Proliferacja. Prolifereacje okreslana jako stopien wlaczania 1,0 Ci (3H) tymidyny po 18- godzinnym okresie inkubacji. Hodowle zbierano przy zastosowaniu zestawu MASH (Otto Hiller Co., Madison, Wisconsin) i oznaczano wlaczenie tymidyny przy zastosowaniu plynnej scyntylacyjnej spektrometrii. Hodowle tkankowe przygotowywano w trzykrotnych powtórzeniach i dane przedstawiono jako srednie, plus lub minus blad standardowy eksperymentalnych srednich.Obliczano równiez i przedstawiono graficznie pobudzenie badanym zwiazkiem powyzej wartosci kontrolnych. b) Limfocyty ludzkiej krwi obwodowej indukowanej mitogenem. Istnieje kliniczne zapotrzebowanie na czynniki terapeutyczne wzmagajace odpowiedz immunologiczna u pacjentów z wadliwa lub zmniejszona odpornoscia immunologiczna wystepujaca w przypadku chorób wirusowych lub raka. Badajac czynniki zdolne do wzmozenia proliferacji ludzkich limfocytów krwi obwodowej, mozna identyfikowac czynniki wzmagajace odpowiedz immunologiczna u czlowieka.Stosowano sposób badania jak przedstawiono poprzednio, jak równiez opisany przez Hadden J.W., Infect. Immunity, February, 1976, str. 382-387, glównie strony 382-383. c) Makrofagi naleza do subpopulacji bialek cialek krwi, i sa waznym skladnikiem ukladu immunologicznego, kontrolujacego zarówno odpornosc komórkowa jak i humoralna. Ponizej opisany sposób badania opisuje ocenianie badanych substancji jako wzmacniacza funkcji makrofagów. Fitohemaglutynine (PHA) sprowadzano z Burroughs Wellcome. Preparat zawierajacy Makrofagowy Czynnik Mitogenny (MMF) i Czynnik Aktywujacy Makrofagi (MAF) otrzymywano poprzez immunologiczna stymulacje antygenem limfocytów wezlów chlonnych (swinki morskiej) wedlug wczesniejszego opisu Hadden i wsp. Nature 257, 483-485 (1975).Czesciowe oczyszczenie tego preparatu poprzez dialize prózniowa i chromatografie kolumnowa na sefadeksie G-100, daje aktywna frakcje w zakresie 35-70000 daltonów wykazujaca wlasciwosci zarówno mitogenne jak i aktywujace. W badaniach zarówno proliferacjijak i aktywacji stosowano frakcje aktywna.Metody badania. Limfocyty ludzkie krwi obwodowej otrzymywano metoda Ficollowa i badano proliferacje limfocytów indukowana PHA przez wlaczanie trytowanej tymidyny wedlug opisu Hadden i wspólpracowników, Celi Immunol. 20, 98-103 (1975). Kazdy zwiazek badano w obecnosci suboptymalnego, optymalnego i nadoptymalnego stezenia PHA odpowiednio (0,001, 0,01, 0,1 jednostek/ml). Otrzewnowe makrofagi swinki morskiej indukowane olejem parafinowym przygotowywano i hodowano w jednowarstwowej hodowli (98% czystych makrofagów).Proliferacje indukowana limfokina (MMF) badano przez wlaczanie trytowanej tymidyny po 3 i 5 dniach hodowli jak opisano przez Hadden i wspólpracowników, Nature 257, 483-485 (1975).Aktywacje makrofagów indukowana limfokina (MAF) do zabijania paleczek Listerii badano po £ dniach hodowli w obecnosci lub braku MAF w ciagu 6 godzin jak opisano przez Haddena i IEnglanda, Immunopharmacology, str. 87-100 (Plenum Press, 1977).Fagocytoze okreslano ilosciowo podczas 20-minutowej ekspozycji na dzialanie paleczek Listerri zliczaja liczbe makrofagów zawierajacych bakterie i liczbe bakterii na fagocytujaca6 119 685 komórke, na gram wybarwionych jednowarstwowych hodowli w komorach Labtek. Wewnatrz komórkowe zabijanie bakterii oceniano przez zliczenie liczby komórek zawierajacych bakterie i liczbe bakterii na komórke po poczatkowej 20-minutowej ekspozycji. Równolegle przeprowadzone próby, w których makrofagi poddawano rozpuszczeniu i hodowano bakterie wewnatrzkomórko- wo potwierdzaja waznosc aktywnosci bakteryjnej oznaczanej w ten sposób w tym ukladzie.Zwiazki badano w kazdym z trzech systemów w seryjnym szeregu logarytmicznych stezen w obecnosci lub braku mitogenu lub limfokiny. Kazdy rodzaj eksperymentu przeprowadzono co najmniej trzykrotnie. Poprzednie eksperymenty wykazuja równoleglosc odpowiedzi na modulowanie farmakologiczne w próbach proliferacji i aktywacji.Aktywnosc przeciwbialaczkowa (zahamowanie wzrostu L-1210). Komórki bialaczkowe izoilowano z myszy majacej guz L-1210 i hodowano in vitro, a ich wzrost mierzono zliczajac liczbe komórek w hodowli po pewnym okresie czasu. Wprowadzenie badanej substancji do pozywki zapobiega wzrostowi komórek bialaczkowych, co wskazuje na ich skutecznosc jako czynnika przeciwbialaczkowego. I50 (Stezenie zwiazku hamujace wzrost L-1210) wyrazone w % dla badanych zwiazków podano w tablicy 5.Zastosowano nastepujacy sposób badania. Pomiar zahamowania wzrostu komórek bialaczkowych (L-1210). Sprawdzano, czy w hodowlach wyjsciowych jest odpowiedni wzrost komórek. Uzywano komórki po 48-72 godzinach od przeniesienia. Badane zwiazki odwazano w 50-krotnie wiekszej ilosci od pozadanego stezenia koncowego i przygotowywano seryjne rozcienczenia. Koncowa pozywke przygotowywano uzywajac 500 ml pozywki McCoya 5A, 15% surowicy plodowej cielecej, 5 ml roztworu antybiotyku i srodków przeciwgrzybicznych i pozostawiono w temperaturze pokojowej. Do kazdej probówki dodawano w warunkach sterylnosci 0,1 ml rozcienczen badanego zwiazku. Do poprzednio przygotowanej pozywki dodawano odpowiednia ilosc komórek. Po wymieszaniu usuwano 0,5 ml próbke i przenoszono do siatki zawierajacej 9,5 ml roztworu soli fizjologicznej i zliczano na liczniku Coulter. Wynik mnozono przez 40 dla wyrównania 40-krotnego rozcienczania (0,5 ml w 0,5 ml roztworu soli i zanotowana ilosc inoculum). Do kazdej probówki dodawano 5 ml zawiesiny komórek.Aby zapewnic równomierne rozmieszczenie komórek po nalaniu do kazdych 4 probówek pokrecano butelke. Zamocowywano na probówkach kapturki i umieszczano w inkubatorze CO2 w temperaturze 36-38° na okres 96 godzin. Po 96 godzinach probówki wyjmowano z inkubatora i liczac zawartosc kazdej na liczniku Coultera. Wszystkie wyniki mnozono przez 40 i obliczano srednia z 4 zliczen dla kazdego rozcienczenia badanego zwiazku. Jezeli wynik liczeniajest mniejszy niz inoculum, odnotowywano 100% zahamowania. Jezeli wynik jest wiekszy niz przecietna z 8 kontrolnych zliczen, odnotowywano 0% zahamowania. srednia liczba komórek/ml w badanych hodowlach — inoculum w komórkach/ml lnn „ x 100 = % przezycia srednia liczba komórek/ml w kontrolnych hodowlach — inoculum w komórkach/ml Dla/wszystkich innych obliczen uzywano nastepujacego wzoru: 100% - % przezycia = zahamowanie wzrostu na skutek traktowania badanym zwiazkiem.Przy uzyciu standarodowych technik hodowli tkankowych wykazano, ze badane zwiazki wytwarzane sposobem wedlug wynalazku hamowaly replikacje reprezentatywnej grupy wirusów zarówno RNA jak i DNA. W przypadku wirusów RNA hamowaniu ulegalo szereg szczepów wirusa grypy, nalezacych zarówno do podtypu A jak i B, co wykazano uzywajac techniki hemadsorpcji.W tablicy 1 przedstawiono zwiazki hamujace specyficznie replikacje wirusa grypy (Typ A/ZSRR 90). Wykazano, ze szereg badanych zwiazków oznaczonych w tablicy 1 jako NPT 15392, NPT 15410, NPT 15417 i NPT 15418 hamowalo replikacje co najmniej czterech róznych szczepów wirusa grypy w stezeniach od 1-150 /ig/ml.Ponadto wykazano, ze szereg badanych zwiazków, oznaczonychjako NPT 15410 i NPT 15392 hamuje replikacje wirusa opryszczki, reprezentanta wirusów DNA i odpowiedzialnego za ciezkie uszkodzenia skórnosluzowe u czlowieka, jak równiez smiertelnego Herpes encephalitis. Inni przedstawiciele tej klasy wirusów sa wirusy odpowiedzialne za pryszczyce swin i bydlai infekcje119 685 7 kataralne u kotów oraz nosówke u psów. Stwierdzono, ze nawet stezenia zwiazków oznaczonych jakoNPT 15392 i 15410 mniejsze niz 100 /zg/ml zmniejszaja tworzenie lysinek spowodowane przez wirusa opryszczki do ponad 90%.Innych przedstawicieli wirusów klasy RNA i DNA odpowiedzialnych za wymienione choroby wymieniono w tablicy 8. Ze wszystkich chorób swiata przynajmniej 25% jest powodowane przez wirusy, w dodatku, wyizolowano szereg wirusów odpowiedzialnych za wzrost guzów. Stad tez, przeciwwirusowe czynniki powinny miec wlasciwosci przeciwnowotworowe.Jest faktem udowodnionym, ze wiele czyników infekujacych, takich jak wirusy (grypy, HSV, bialaczki), bakterie i grzyby powoduja stan immunologicznej supresji gospodarza, oslabiajac tym samym jego zdolnosci obronne. Wiele innych przeciwwirusowych substancji antymetabolicznych takich jak AraC powoduje supresje mechanizmów obronnych, wykazujac przez to potencjalne zmniejszanie naturalnych mechanizmów obronnych organizmu i ulatwianie wtórnej infekcji.Wzmacniaczem odpowiedzi immunologicznej lub regulatorem odpowiedzi immunologicznej jest kazdy czynnik, który przywraca zahamowane funkcje immunologiczne, ulatwia normalne funkcje immuologiczne lub jedno i drugie. Funkcje immunologiczna definiuje sie jako rozwój i ekspresje odpornosci humoralnej (przeciwcial), komórkowej (tymocyty) lub odpornosci uwarunkowanej granulocytami i makrofagami. Powyzsze logicznie obejmuje czynniki dzialajace bezposrednio na komórki biorace udzial w odpowiedzi immunologicznej, lub na mechanizmy czasteczkowe lub komórkowe,co z kolei dziala na funkcje komórekbioracych udzial w odpowiedzi immunologicznej.Wzmocnienie funkcji immunologicznej moze byc rezultatem aktywacji czynnika, który usuwa mechanizmy supresji wyprowadzone z wplywów ujemnego sprzezenia zwrotnego, endogennego lub egzogennego na uklad immunologiczny. Stad wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej maja rozbiezne mechanizmy dzialania. Jednakze, pomijajac odrebnosc w miejscu dzialania i w biochemicznych mechanizmach dzialania, ich zastosowania sa w zasadzie takie same, tzn. zwiekszaja odpornosc gospodarza.Pierwsza glówna funkcja ochronna ukladu immunologicznego odnosi sie do odpornosci na inwazje patogenów takich jak wirusy, riketsje, mykoplasmy, bakterie, grzyby i pasozyty wszystkich typów. Stad, ulepszenie odpowiedni immunologicznej, szczególnie tej zahamowanej, poprawiloby zdecydowanie odpornosc na zakazenie lub wnikniecie wszystkich wymienionych wyzej patogenów.Sam wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej, lub w polaczeniu z terapia przeciwzakazna, moze byc zastosowany we wszystkich bez wyjatku chorobach zakaznych.Druga funcja ochronna ukladu immunologicznego jest odpornosc na wszczepianie obcej tkanki zarówno naturalne jak w stosunku matczyno-plodowym, lub sztuczne dokonane przez lekarza transplantologa. Wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej moga byc takze uzyte do ulatwienia odrzucania tkanek plodowych lub lozyskowych a takze do zmiany lub indukcji tolerancji na przeszczep.Trzecia funkcja obronna jest odpornosc na zlosliwy wzrost komórek jak w raku. Uzycie wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej moze byc uzyte w leczeniu raka w celu ulatwienia odrzucania gazu lub zahamowania nawrotów po innych formach terapii.Czwarta funkcja obronna to zdolnosc rozpoznania obcego i utrzymywania braku odpowiedzi na swoje przez mechanizmy dodatniej supresji. W schorzeniach autoimmunologicznych i podobnych reaktywnosc immunologiczna skierowana jest przeciwko wlasnym antygenom lub wystepuja przesadzone, nasilone odpowiedzi, które sa samoniszczace. Wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej moga byc uzywane do przywrócenia zwyklych mechanizmów supresyjnych, wywolania tolerancji lub przywrócenia prawidlowej odpowiedzi immunologicznej.Kazda z funkcji obronnych ukladu immunologicznego moze byc modyfikowana przez niespecyficzne leczenie wzmacniaczami odpowiedzi immunologicznej lub tez w polaczeniu z innymi czynnikami uzywanymi do poprawienia odpornosci lub do zabicia atakujacego patogenu.W dodatku, specyficzna odpornosc moze byc wzmocniona przy uzyciu wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej w polaczeniu z pewnymi formami antygenu jak w szczepionkach np. wirusa, komórki guza. Ten sposób zastosowania daje indukcje zarówno specyficznej odpornosci jak i tolerancji. Toostatnie mozna poprzec przykladem zastosowania antygenu w alergii lub chorobach autoimmunologicznych.8 119685 Zastosowanie wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej moze byc zarówno terapeutyczne jak i profilaktyczne; to ostatnie, czesciowo podczas starzenia, kiedy to zakazenia, autoimmunologiczne schorzenia i rak sa czesciej spotykane. Czas i sposób podawania sa róznorodne i moga byc krytyczne w oznaczaniu wyników zarówno pozytywnej jak i negatywnej odpowiedzi. Kazdy czynnik wywolujacy wzrost odpowiedzi immunologicznej moze hamowacja w zaleznosci od czasu i dawki. Tak wiec, w pewnych okolicznosciach wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej moga byc stosowane jako immunosupresory w alergii, schorzeniach autoimmunizacyjnych i przeszczepianiu.W tablicy 6 przedstawiono wyniki oceny szeregu badanych zwiazków jako wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej. Stosowano trzy rodzaje testów. Pierwszy polega na mierzeniu zdolnosci badanego zwiazku do wzrostu zdolnosci do proliferacji mysich limfocytów w odpowiedzi na roslinny mitogen (Con A). Drugi z nich przedstawia pomiary zdolnosci badanych zwiazków do wzmozenia proliferacji limfocytów ludzkich w odpowiedzi na inny roslinny mitogen (PHA). Trzeci rodzaj testu okresla zdolnosc badanych zwiazków do wzmozenia proliferacji makrofagów w odpowiedzi na naturalna limfokine (MMF — Makrofagowy czynnik mitogenny). Ta ostatnia odpowiedz dotyczy proliferacji i aktywacji makrofagów jak wykazano przez zabijanie bakterii, wirusów i komórek guza przez biale cialka krwi tego rodzaju.Wyniki aktywnosci immunoregulacyjnej wyrazonejh jako zdolnosc pochodnych 9- (hydroksyalkilo)puryny i ich kompleksów otrzymanych sposobem wedlug wynalazku do regulacji odpornosci komórkowej, podano w tablicy 6, z której wynika, ze kompleksy wykazuja na ogól lepsze wlasciwosci od zwiazków nieskompleksowanych.Znaczne wzmozenie odpowiedzi immunologicznej zaobserwowano w przypadku zwiazków oznaczonych jako NPT 15392 oraz kompleksów NPT 15410 i NPT 15418.Szereg pochodnych 9-(hydroksyalkilo)puryny, jak równiez utworzonych z nich kompleksów wedlug wynalazku badano jako mitogenny indukujace proliferacje mysich limfocytów, w sposób opisany poprzednio. Wyniki tych badan, przedstawione w tablicy 7 wskazuja, ze kompleksy wedlug wynalazku wykazuja co najmniej równe lub wyzsze wlasciwosci pobudzajace proliferacje niz zwiazki nieskompleksowane.Wreszcie oznaczono aktywnosc szeregu badanych zwiazków 15382 i 15410 jako inhibitorów wzrostu nienornalnych limfocytów. Nalezy zauwazyc, ze obie te substancje sa zdolne do zahamowania w hodowli tkankowej proliferacji limfocytów bialaczki mysiej (linia komórkowe L-1210). Osiagano 50% zahamowania komórek L-1210 przy uzyciu zwiazku oznaczonego jako 15392 w stezeniu 28/xg/ml i przy uzyciu zwiazku oznaczonego jako 15410 w stezeniu 54 /zg/ml.Zdolnosc do hamowania limfoctów bialaczkowych w stezeniach, które pobudzaja zwykle limfocytyjest wlasciwoscia jedyna w swoim rodzaju, niespotykana dotychczas w zadnej innej klasie substancji tego rodzaju.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku naleza do klasy zwiazków, które specyficznie hamuja replikacje wirusów RNA i DNA, reguluja (wzmacniaja wzrost limfocytów bialaczkowych). W oparciu o badania in vitro, w których wykazano aktywnosc w zakresie stezen od 0,01-150 fig/ml9 skuteczna dawke u ssaków okreslano jako 0,05-500 mg/kg. Zaobserwowano brak toksycznosci przy poziomie 1,5 mg/kg u myszy dla pewnej liczby zwiazków tej serii.Wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej otrzymane sposobem wedlug wynalazku moga byc zastosowane np. do zapewnienia odpornosci przeciwko inwazji wirusów podanych w tablicy 8.Wzmocnienie przez Dip. PaCBA biologicznych aktywnosci. Sposród zwiazków przedstawio¬ nych w tablicach zwiazki oznaczone jako NPT 15392 i NPT 15446 sa zwiazkami nowymi. Równiez nowymi sa: DIP. PAcBA sole, przedstawione wpowyzszych tablicach, oznaczone jakoNPT 15428, NPT 15447, NPT 15432, NPT 15444, NPT 15417 i NPT 15410. Zwiazki NPT 15392, NPT 15417 i NPT 15426 posiadaja same w sobie znaczaca aktywnosc przeciwgrypowa. Wjednym przypadku (z NPT 15392) dodanie DIP. PAcBA soli do NPT 15392 z utworzeniem zwiazku NPT 15410 nie wzmaga aktywnosci przeciwgrypowej.W przypadku zwiazku NPT 15417, dodanie DIP.PAcBAsoli z utworzeniem zwiazku NPT 154188 wzmaga aktywnosc przeciwgrypowa. Sumaryczne zestawienie wzglednych zdolnosci DIP.PAcBAsoli do wzmagania róznych aktywnosci biologicznych przedstawiono w tablicy 9.Traktowaniemyszy zwiazkami oznaczonymi jako NPT 15392 i 15410: wplyw na stymulacje in vitro proliferacji komórek sledziony pod wplywem Conkanowaliny A. Celem tych badan bylo119 685 9 okreslenie efektów leczenia in vivo myszy zwiazkami oznaczonymi jako NPT 15392 i NPT 15410 na nastepna aktywnosc spelnocytów wyizolowanych z tych zwierzat i ocena in vitro ich proliferacji w odpowiedzi na mitogen Conkanawaline A (Con A).Sposób postepowania. Leczenie in vivo. Dziewiec 8-9-tygodniowych samców myszy szczepu Balb/C o ciezarze 18-20 g podzielono na trzy podgrupy. Jednej z nich podawano 2 razy dziennie (w ciagu jednego dnia) rano i po poludniu doustnie zwiazek NPT 15392 w dawce 10 mg/kg. Druga podgrupe traktowano podobnie zwiazkiem NPT 15410 w dawce 20 mg/kg. Trzecia podgrupa otrzymywala sól fizjologiczna i sluzyla jako próba kontrolna (porównawcza).Badanie splenocytów in vitrto: przygotowywanie komórek. Nastepnego dnia, kazda podgrupe zabijano, usuwano sledziony i zbierano w obrebie podgrup. Sledziony rozdrabniano, a komórki uzyskane przemywano pozywka RPMI-1640 (GIBCO) uzupelniono 2 mm glutaminy i antybiotykami. Oznaczano stezenie komórek w kazdym preparacie w liczniku Coulter i doprowadzono do 5X 106 komórek/ml pozywka RPMI.Próba mikromiareczkowa na plytce. Próby mikromiareczkowe przeprowadzano w objetosciach 0,2 ml, zawierajacych 5X105 komórek i Con A lub Con A i badane zwiazki w podanych stezeniach. Wszystkie próby przygotowano w szesciokrotnych powtórzeniach i porównywano ze slepa próba zawierajaca tylko komórki. Plytki inkubowano w temperaturze 37° w atmosferze 5% CO2 w ciagu 4 dni. W ciagu ostatnich 18-20 godzin inkubacji do studzienek dodawano 0,5 ml 3HTdR (10 /xCi/ml, 6 Ci(mmol). Z hodowli pobierano próbki automatycznym zestawem do pobierania próbek (MASH) i oznaczano wbudowana radioaktywna tymidyne H*TdR przy uzyciu licznika scyntylacyjnego Beckmana typu LS 8000 jako miare proliferacji komórek.Wyniki podawano tabelarycznie jako stosunek aktywnosci proliferacyjnej uzyskanej dla hodowli zawierajacych Con A lub Con A plus badane zwiazki w odniesieniu do slepej próby.Podawanie in vivo zarówno zwiazku NPT 15392 jak i NPT 15410 wzmaga nastepujaca odpowiedz splenocytów w warunkach hodowli in vitro na Con A przy suboptymalnym stezeniu mitogenu (5 ^ig/ml). I tak zwiazek NPT 15410 powoduje wzrost pubudzenia proliferacji w stosunku 100:1 w porównaniu 55:1 dla próbki kontrolnej. Nie zaobserwowano istotnych róznic w pobudzaniu proliferacji zwiazkami NPT 15392 i NPT 15410 gdy stezenie mitogenu Con A bylo optymalne (10 /xg/ml).Badano takze efekt nastepstwa traktowania in vitro zwiazkami NPT 15392 i NPT 15410 w stezeniu 1/ug/ml na pobudzeniu komórek przez Con A. Oba zwiazki wykazaly wzmozenie pobudzenia proliferacji przez Con A zwlaszcza w suboptymalnym stezeniu mitogenu (5 ^ig/m\) i w mniejszym stopniu w stezeniu 10/ig/ml.Przy stezeniu Con A wynoszacym 5 /ig/ml, stymulacja zwiazkiem NPT 15392 byla 2,8 razy wyzsza niz przez sama Con A, a zwiazkiem NPT 15410byla3,3 razy wyzsza.Te wyniki wskazuja na immunoregualcyjne dzialanie tych zwiazków w procesie proliferacji splenocytów. Uprzednie traktowanie zwierzat zwiazkami uczulajacymi komórki w celu nastepnego stymulowania ich mitogenem podczas eksponowania komórek in vitro na dzialanie wymienionych zwiazków nastepna stymulacja mitogenem wzmaga odpowiedz proliferacyjna szczególnie w warunkach gdy odpowiedz na sam mitogen jest niska.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalazku mozna podawac doustnie ssakom wdawce 1-1000 mg/kg wagi ciala. Wykazuja one aktywnosc na poziomie tak niskim, jak 0,05 mg/kg wagi ciala. LD50 oznaczone u myszy przy podaniu dootrzewnowym zwiazku 15410 wynosi 4,300 mg/kg, natomiast przy podaniu podskórnym wynosilo 4,900 mg/kg. Zwiazek 15392 podawany myszom w dawce 1000 mg/kg nie powodowal smiertelnosci.Zwiazki te moga byc podawane w postaci tabletek lub kapsulek ludziom, ajezeli pozwala na to rozpuszczalnosc — w formie syropów lub roztworów injekcyjnych lub nierozpuszczalnych zawiesin.Typowe tabletki lub kapsulki zawieraja 50-500 mg zwiazku wytworzonego sposobem wedlug wynalazku oraz znane adjuwanty, stosowane w farmacji.Wodne zawiesiny mozna przygotowywac z szergu srodków suspendujacych i substancji czynnej leczniczo. Srodkami suspendujacymi moga byc substancje takie jak karboksymetolocelu- loza sodowa, alginian sodu, guma tragankowa, Avicel RC-591 (mikroceluloza), metyloceluloza,10 119 685 guma ksantanowa, guma Vee (Vecgum). Oprócz tego mozna dodawac substancje smakowe, zapachowe, barwiace, zabezpieczajace, konserwujace i srodki ulatwiajace utrzymanie zawiesiny.Sposów wedlug wynalazku jest blizej wyjasniony w przykladach wykonania, przy czym w przykladach I-III podano sposoby wytwarzania zwiazków o wzorze 1, w którym z oznacza O a w przykladzie IV sposób przeprowadzania zwiazków o wzorze 1, w którym z oznacza O w kompleksy o wzorze 1, w którym z oznacza wartosc liczbowa 1-10.O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie czesci i procenty oznaczaja czesci i procenty wagowe, a temperature podano w stopniach Celsjusza.Przyklad I. Wytwarzanie 9-(2-hydroksy-l-propylo)-hipoksantyny (NPT 15446).Przebieg reakcji przedstawiono na schemacie 1. 9-(2-hydroksy-l-propylo)adenine (4,0 g, 20,7 mmoli) rozpuszcza sie w 50% kwasie octowym (20 ml) i powoli dodaje azotyn sodowy (4g, 58 mmoli). Calosc miesza sie w temperaturze 25°C w ciagu 3 godzin. Otrzymany roztwór odparowuje sie do sucha i do pozostalosci dodaje izopropanol. Operacje te powtarza sie. Stala pozostalosc zagotowuje sie w izopropanolu i saczy. Przesacz odparowuje sie i pozostalosc krystalizuje z acetonu a nastepnie przekrystalizowuje z mieszaniny izopropanol/metanol (98:2). Uzyskuje sie bezbarwny, krystaliczny produkt w ilosci 3,3 g (wydajnosc 82%) o temperaturze topnienia 244-250°C. Widmo w ultrafiolecie (H20, pH 5,5) \max250nm.Przyklad Ilf Wytwarzanie 9-(l-hydroksy-2-propylo)-hipoksantyny (NPT 15443).Przebieg reakcji przedstawiono na schemacie2. 9-(l-hydroksy-2-propylo)adenine (4g 21 mmoli) rozpuszcza sie w 20 ml 50% kwasu octowego, dodaje azotyn sodu (4g 58 mmoli) i calosc poddaje sie w ciagu 3,5 godziny mieszaniu w temperaturze 25°C, po czym odparowuje dwukrotnie do sucha z izopropanolu. Pozostalosc roztwarza sie w izopropanolu i saczy, osad odrzuca sie a przesacz odparowuje do utworzenia zelu, który zestala sie po dodaniu acetonu. Otrzymuje sie 3,65 g bezbarwnych krysztalów (wydajnosc 90%). Po przekrystalizowaniu z mieszaniny izopropanol/metanol (98:2) produkt topnieje w temperaturze 202-207°C. Poddany chromatogra¬ fii cienkowarstwowej przy uzyciu CHCb: MNOH (5:1) wykazuje 1 plamke przy Rf= 0,30. Widmo w ultrafiolecie (H2O, pH 5,5) \max250nm.Przyklad III. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)hipoksantyny (NPT 15392).Synteze erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)hipoksantyny (nonylohypoksantyna) pokazano na schemacie 4 a wytwarzanie wyjsciowej erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)adeniny na schemacie 3.Stanowi on ulepszenie w stosunku do metody Schaeffera H.J. i Schwendera C.F., J.Med.Chem. 17,6 (1974) prowadzacej do powstania erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)-6-chloropuryny.Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)hypoksantyny (przez odaminowanie substratu) jak przedstawiono na schemacie 4.Do roztworu erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)adeniny (4,0 g 14 mmoli) w 50% kwasie octowym (20 ml) i IN HC1 (3,2ml), o temperaturze 25°, dodaje sie mieszajac azotyn sodu (5,6 g, 71 mmoli).Calosc miesza sie w temperaturze 25°C w ciagu dwóch godzin. Po tym czasie analizuje sie widmo w ultrafiolecie. Gdy wartosc maksymalna osiaga 250nm, roztwór neutralizuje sie 2 N NaOH.Uzyskany w efekcie osad odfiltrowuje sie i przemywa H2O. Wydajnosc 3,03 g (75%), temperatura topnienia 195°. Badana próbke rekrystalizuje sie (3x) z wody, otrzymujac produkt o temperaturze topnienia 202°.Wynik analizy dla C14H22N4O2: obliczono: C 60,40, H 7,96, N 20,13 oznaczono: C 60,40, H 7,90, N 20,12.Wyjsciowa erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo) adenine wytwarza sie jak wspomniano poprzednio w wieloetapowej syntezie przedstawionej na schemacie 3, wychodzac z kwasu 1-aminokaprylowego. Liczby pod strzalkami na schemacie 3 oznaczaja wydajnosc reakcji.Etap 1. Wytwarzanie 3-acetamidononanonu-2.Mieszanine kwasu 1-aminokaprylowego (200 g, 1,26 mola) i bezwodnika octowego (960 ml) oraz pirydyny (640 ml) ogrzewa sie na lazni z wrzacej wody w ciagu 4 godzin. Mieszanine reakcyjna odparowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a pozostalosc ekstrahuje 6-8 razy 5% wodnym roztworem NaHC03 (400 ml) i eterem (400 ml). Polaczone ekstrakty eterowe suszy sie za pomoca bezwodnego MgS04 i odparowuje do sucha, otrzymujac 154g (70%) surowego 3- acetamidononanonu-2.119685 11 Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku 3-aminononanonu-2.Surowy 3-acetamidononanon otrzymany jak opisano w etapie 1, (154 g) rozpuszcza sie w stezonym wodnym roztworze HCl (1540 ml) i ogrzewa w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 2 godzin, a nastepnie odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem.Powstala stala substancje przekrystalizowuje sie z cieplego roztworu w EtOH (200 ml), a nastepnie ochladza sie do temperatury 25° i dodaje eter (600 ml). Wytraca sie krystaliczna stala substancja bialej barwy, która pozostawia sie w ciagu nocy w temperaturze 5°C. Wytracona substancje odsacza sie i przemywa raz eterem (100 ml), otrzymujac 125 g (67%) krystalicznego produktu bialej barwy, topniejacego z rozkladem w temperaturze 112°C.Gdy krystaliczny produkt nie ma bialej barwy lub topi sie w nizszej temperaturze, nalezy poddac go rekrystalizacji z tetrahydrofuranu z uzyciem wegla aktywnego. Wjednym takim zabiegu uzyto 150 ml hydrofuranu na 100 g surowego chlorowodorku.Etap 3. Wytwarzanie erytro-3-aminononanolu-2.Chlorowodorek 3-aminononanolu-2 (43,8 g 0,226 mola) rozpuszcza sie w absolutnym metanolu (150 ml) i ochladza w kapieli z lodu i sola do temperatury -10°(1). W ciagu 2-3 godzin dodaje sie w malych porcjach borowodorek potasu (2). Mieszanine pozostawia sie w temperaturze od -10° do -15° w ciagu 3 godzin (3,4), po czym pozwalajej powoli osiagnac temperature pokojowa (22°), a nastepnie poddaje sie ja mieszaniu w ciagu nocy (20 godzin) w temperaturze pokojowej.Nastepnie mieszanine odparowuje sie do sucha (syrop) pod zmniejszonym cisnieniem i ekstrahuje H2O (150 ml) i chloroformem (150 ml). Warstwe wodna poddaje sie dalszej ekstrakcji (3x) chloroformem (100 ml za kazdym razem). Warstwe chloroformowa suszy sie za pomoca MgSOW odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem, otrzymujac oleisty produkt lekko zóltawej barwy.Ciecz te poddaje sie destylacji pod bardzo niskim cisnieniem w temperaturze 95°-100° (20 Pa) otrzymujac czysty erytro-3-aminononanol-2, w ilosci 26,4 g z wydajnoscia 75%, o temperaturze topnienia 81-86°. a) W czasie chlodzenia roztworu chlorowodorku 3-aminononanonu-2 wytraca sie nieco substancji co nie ma wplywu na przebieg reakcji. b) W tym punkcie tok postepowania rózni sie od przyjetego przez Schaeffera i wspólpracowników. Schaeffer dodaje kwas octowy razem z KBH4, utrzymujac pH 5-6.Stwierdzono, ze zobojetnienie pociaga za soba straty KBH4 oraz ze pH powyzej 5 niejest szkodliwe.Wazniejszyjest fakt, ze równoczesne dodawanie kwasu octowego i KBH4 (co proponuje Schaeffer) bardzo utrudnia kontrole reakcji. Temperatura znacznie wzrasta, a wydajnosc i/lub jakosc produktu ulegaja pogorszeniu. c) Zaleca sie stosowanie intensywnego mieszania dla zapewnienia prawidlowego przebiegu reakcji, która dobiega konca gdy znikna wszystkie male kawalki i czastki borowodorku potasu. d) Chlodzenie w temperaturze 0°, jak to opisali Schaeffer i wspólpracownicy (Biochemistry 4, 71 (1965) jest niewystarczajace. Ulepszenie polega na utrzymywaniu temperatury reakcji znacznie ponizej 0°, najlepiej przez caly czas ponizej -10°. Gdy dopusci sie do wzrostu temperatury powyzej -10°, wydajnosc moze sie powaznie zmniejszyc.Etap 4/ Wytwarzanie erytro-5-amino-4-chloro-6-(2-hydroksy-3-nonyloamino)pirymidyny.Sporzadza sie mieszanine 4,6-dwuchloro-5-aminopirymidyny (24,6 g 0,15 mola) i erytro-3-aminononanolu-2 (26,2 g 0,164 mola) w pentanolu-1 (1080 ml) i trójbutyloaminie (350 ml) mieszajac skladniki w temperaturze 25°. Powstala zawiesine ogrzewa sie w atmosferze azotu w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 28 godzin (roztwór powstaje po uplywie okolo 0,5 godziny). W tym czasie wartosc Ama* w widmie UV próbki produktu reakcji wynosi 267 i 297 nm (H20, pH 5,5).Powstaly roztwór zateza sie na lazni z goraca woda pod cisnieniem 1333,22 Pa do konsystencji syropu, po czym odparowuje dalej na lazni olejowej w temperaturze 100° i pod cisnieniem 13,33 Pa, otrzymujac lepka ciecz, do której dodaje sie n-heksan (450 ml). Mieszanine ogrzewa sie w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 1 godziny, po czym od cieczy na dnie okraglodennej kolby oddziela sie górna goraca warstwe cieczy zawierajacej heksan, zabarwiona zólto.Otrzymany jasnobrazowy olej, z którego odparowano pod zmniejszonym cisnieniem wszelkie pozostalosci heksanu, rozpuszcza sie w chloroformie (150 ml). Roztwór chloroformowy poddaje sie osmiokrotnie ekstrakcji nasyconym wodnym roztworem NaHCC3 (250 ml za kazdym razem).12 119 685 Warstwe chloroformowa oddziela sie, suszy (za pomoca siarczanu sodowego lub magnezowego) i odparowuje pod bardzo niskim cisnieniem (13,32 Pa) w temperaturze 40° (laznia wodna), otrzymujac olej jasnobrazowy barwy, który zestala sie po ochlodzeniu. Substancje te mozna stosowac bezposrednio w nastepnym etapie lub oczyszczac w nastepujacy sposób. Powstaly olej rozpuszcza sie w 75-100 ml chloroformu i dodaje n-heksanu (okolo 300 ml) w celu wytracenia krytalicznej substancji stalej o bialej barwie, która odsacza sie z ochlodzonego roztworu.(Ekstrakcje prowadzi sie 4-8 razy, az przestaje sie wydzielac dwutlenek wegla). Ten tok postepowania powtarza sie dwukrotnie. Wydajnosc: 23,3 g (54%), widmo UV: A,™ 267, 297 (H2, pH 5,5), temperatura topnienia 113-116°.Etap 5. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)-6-chloropuryny.Surowy syrop otrzymany jak opisano w etapie 4, zawierajacy erytro-5-amino-4-chloro-6-(2- hydroksy-3-nonyloamino)pirymidyne (11,48 g, 40 milimoli) rozpuszcza sie w ortomrówczanie etylu (106 ml) i dodaje chloroform (34 ml) oraz kwas etanosulfonowy (10 kropli). Roztwór pozostawia sie w ciagu nocy w temperaturze 25°, a nastepnie odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji syropu. Wydajnosc 11,7 g (ilosciowa). Syrop ten, który stanowi surowa erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)-6-chloropuryna uzywa sie w nastepnym etapie Xmn264nm.Etap 6. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)-adeniny.Surowa oleista erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo)-6-chloropuryne (6,15 g) otrzymana jak opi¬ sano w etapie 5 rozpuszcza sie w nasyconym metanolowym rotzworze amoniaku (300 ml) i chlorku amonowego (1 g), prowadzac rozpuszczenie w temperaturze 80-100° w ciagu 1 godziny w kolbie ze stali nierdzewnej (Parr Instruments). Po ochlodzeniu roztwór odparowuje sie do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Do pozostalosci dodaje sie metanol i odparowuje ponownie (3 razy) w celu odpedzenia nadmiaru amoniaku. W celu identyfikacjia, pozostalosc o konsystencji syropu przeprowadza sie w postac chlorowodorku rozpuszczajac ja w alkoholu metylowym i przeprowa¬ dzajac przez roztwór pecherzyki bezwodnego HC1, utrzymujac temperature ponizej 20° (laznia wodno-lodowa). HC1 przepuszcza sie w ciagu 1/2 godziny, po czym mieszanine chlodzi sie do temperatury 5°. Osad odsacza sie przez lejek z wkladka ze spiekanego szkla, przemywa zimnym alkoholem metylowym i suszy na powietrzu. Wydajnosc 6,0 g (92%) temperatura topnienia 173-175° (z rozkladem), widmo UV: km 260 nm. (w H20, pH 5,5).Przyklad IV. Wytwarzanie kompleksu 9-(2-hydroksy-3-nonylo)-6-hydroksypuryny (ozna¬ czonego symbolem NPT 15410). 0,1 mmoli 9-(2-hydroksy-3-nonylo)-6-hydroksypuryny (NPT 15392) (27,9 mg) i 0,3 mmoli 4- (acetyloamino) benzoesanu dwumetylo -2- hydroksypropylo - amoniowego (DIP.PAcBA) (77,1 mg) odwaza sie doklanie i rozpuszcza w 105 ml 25% weglanu sodu (Na2C03), otrzymujac 0,1% roztwór NPT 15410 (zwiazek powstaly z NPT 15392 i DIP.PAcBAw stosunku molowym 1:3.Postepujac jak opisano wyzej i stosujac równowazne ilosci zwiazku wyjsciowego, otrzymuje sie nastepujace kompleksy 9-(2-hydroksy-l-propylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony jako NPT 15447) 9-(l-hydroksy-2-propylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony jako NPT 15444) 9-(l-hydroksy-2-oktylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA(oznaczony jako NPT 15418) 9-(l-hydroksy-2-etylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony jako NPT 15428) Dowód na powstanie kompleksu. Badania rozpuszczalnosci fazowej, prowadzone z NPT 15392 i DIP.PAcBAwykazaly, ze NPT 15392 posiada zwiekszona rozpuszczalnosc przy zwieksza¬ jacych sie stezeniach DIP.PAcBA,w warunkach zachowania stalej wartosci pH. Jest to dowodem wskazujacym na powstawanie kompleksu w roztworze.Przy uzyciu innych stosunków molowych niz 1:3 (NPT 15392 i DIP.PAcBA),takich jak 1:1 i 1:10, powstaja inne kompleksy.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych zwiazków kompleksowych 6-podstawionych 9-(hydroksyal- kilo)puryn o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza grupe OH, R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1-8 atomach wegla, R2 oznacza atom wodoru, lub grupe metylowa, Y oznacza119 685 13 sól aminy o wzorze 2, w którym R3 i R4 sa nizszymi rodnikami alkilowymi, oraz n jest liczba calkowita w zakresie 2-4 z kwasem p-acetamidobenzoesowym lub tez innym, stosowanym w takich przypadkach, farmaceutycznie dopuszczalnym kwasem, i z oznacza liczbe w zakresie 1-10, zna¬ mienny tym, ze grupe —OH wprowadza sie w pozycji 6 do odpowiedniej 9-podstawionej-6- aminopuryny o wzorze 5, w którym X oznacza grupe —NH2 a R1 i R2 maja powyzsze znaczenie przez dwuazowanie azotynem sodu w zakwaszonym roztworze, po czym wytwarza sie kompleks z sola Y, w stosunku molowym 1:1 do 1:10, który wydziela sie z roztworu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 9-podstawiona puryne o wzorze 5, w którym Ri korzystnie oznacza grupe n-heksylowa, a pozostale podstawniki maja znaczzenie jak w zastrz. 1. znaczenie jak w zastrz. 1. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 9-podstawiona puryne o wzorze 5, w którym Ri korzystnie oznacza grupe metylowa, a pozostale podstawniki maja znaczenie jak w zastrz. 1.Tablica 1 Badany zwiazek numer NPT 15446 15447 15431 15432 15433 15434 15443 15444 15417 15418 15392 15410 15426 15110 R1 H H H H CH3 CH3 CH3 CH3 CóHn C6Hl3 CiHn CtHii C6Hn — Zwiazek inumer NPT Zwiazek R2 CH3 CH3 CH3 CH3 H H H H H H CH3 CH3 CH3 — R1 o wzorze 4 X OH OH NH2 NH2 NH2 NH2 OH OH OH OH OH OH NH2 — Ta Y DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA b 1 i ca 2 Zwiazek o wzorze 4 R2 X Procent likwidacji ognisk hemadsorpcji (przy stezeniu badanego <10 2 10 18 16 86 58 50 0 Y zwiazku rr 10-100 0 26 22 48 32 41 0 44 58 46 100 96 96 0 Procent _ likwida¬ cji ig/ml) 100 0 34 0 62 0 62 0 54 60 52 100 96 100 20 n 15392 C6H13 CH3 OH — 98 15410 C6Hi3 H OH DIP.PAcBA 9814 119685 Tablica 3 Zwiazek NPT numer 15392 15417 15418 15426 15410 Procent zahamowania 0,1-1,0 30-50 20-30 50-70 badanego zw 1,0-10 — 50-70 — 30-50 30-50 przy podanym stezeniu iazku w jug/ml 10-100 70 70 70 50-70 70 100 70 ¦^— 70 50-70 70 Wirus swinska grypa A 1976 (H,sw-N,) swinska grypa A 1976 (H,sw-Ni) swinska grypa A 1976 (H,sw-N,) (rosyjski) (swinski) Tablica 4 Zahamowanie replikacji wirusa grypy przez zwiazek NPT 15410 < Wirus Szereg stezen badanego zwiazk 0,1-1,0 A (swinski/76/HiswNi) +++ A (Texas/77/H3N2) ++ A (Dunedin/73/H3N2) NT A (Jap/305/H3N2) NT A (PRg/HoN,) ++ A2Hong Kong (HJM2) NT NT ± + ++ +++ ++++ — nie badano — 10-20% zahamowania — 20-30% zahamowania — 30-50% zahamowania — 50-70% zahamowania — 70% zahamowania Ta Zwiazek NPT nr 15392 15410 15417 15418 bl (Mg/ml) 01,0-10,0 ++ + NT NT ++ NT i c a 5 Stezenie 10,0-100 ++++ ++++ ± ++++ ++++ ++ (mikrogramy/ml) 28 54 47 70 :u 100 ++++ ++++ ++ ++++ +++ +++119685 Tablica 6 15 Zwiazek o wzorze 4 Maksymalna zmiana procentowa Zwia¬ zek NPT R1 Proliferacja linfocytów Proliferacja limfocytów Proliferacja makrofagów mysich indukowana mitoge- ludzkich indukowana mitoge- swinki morskiej indukowana nem(Con A) przy stezeniu nem (PHA) przy stezeniu bada- Hmfokina (NMF) przy steze- badanego zwiazku w /ig/1 nego zwiazku w /ig/1 niu badanego zwiazku w /ig/1 nr 15425 H H 15428 H H 15446 H CH3 15431 H CH3 15433 CH3 H 15443 CH3 H 15417CóHi3 H 15418CóHi3 H 15392CóHi3 CH3 15410C6Hn CH3 15426CóHi3 CH3 OH OH OH NH2 NH2 OH OH OH OH OH NH2 DIP.PAcBA — — — — — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA HC1 sól 0,1-1,0 11 6 —15 15 17 0 41 172 140 —50 1,0-10 0 12 —27 —23 27 0 73 162 40 —85 10-100 — 0 —47 -65 27 0 26 —72 40 —91 0,1-1,0 100 55 0 0 53 0 0 11-15 30-50 6 1,0-10 0 45 0 0 0 13 0 20 60 —41 10-100 0 —50 0 0 —50 0 —50 —50 0,01-1 0 +20 12 33 12 1,0-10 0 0 13 80 23 23 10-100 0 —50 —50 Tablica 7 Zwiazek Nr NPT 15392 15426 15410 15417 15418 Procent pobudzenia przy stezeniu badanego zwiazku w Mg/ml 0,01-1,0 1,0-10 10-100 100 50% 0 50% 0 20-30% 30-50% 0 30-50% 0 50% 30-50% 0 30-50% 0 20-30% nie badano nie badano nie badano 0 nie badano Tablica 8 Wirus Klasa Choroba 1 Arenawirus Influenza Rhinowirus Poliwirus Menslos Wirus choroby Newcastlec Rotawirus Hepatitis Typ A Wirus wscieklizny Arbowirus Vaccinia wirus Herpes Simplex Wirus Herpes Zoster Varicella Zoster Adenowirus Hepatitis Typ B Wirus pryszczycy RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA Goraczka Rift Valley Grypa Przeziebienie POLIO Rózyczka Choroba Newcastles Zapalenie zoladka i jelit Zapalenie watroby Wscieklizna Zapalenie mózgu Ospa Zapalenie mózgu, choroby weneryczne Pólpasiec Ospa kurza Zapalenie dróg oddechowych Zapalenie watroby chroniczne i ciezkie Pryszczyca16 119685 Tablica 9 Zwiazek NPT numer 15392 15417 15435 15446 15431 15433 15443 Sól DIP.PAcBA NPT numer 15410 15418 15437 15447 15432 15434 15444 Przeciw- grypowa Obie sa rów¬ no aktywne tak tak tak tak tak tak Wzmocnienie przeciw- bialaczkowe tak — — — — — — Wzmocnienie odpowiedzi immunologicznej tak tak — — — — — ¦&¦ (Y); HC-CH-R' i i R1 OH Wzór 1 R- \ R* UCnH2n)0H WzorZ R R6 X .l(CnH2n)0H Wzór 3 U :o -M3 HC-CH-R2 i i R1 OH WzorG HC-CH-R2 l i R1 OH HfzórS119685 NH2 OH r\ -N°2" . nVS Nr AcOH T^NT CHi-CH-CHs CH2-CH-CH3 Schemat 4 OH OH NH2 I I ZhN XH\ H3C CH20H H3C H CH20H Schemat 2 £toni (CH£0)20 CH3-[CH2]rCH-COOH ^—CH3- [CH2]5- CH2-C0CH3 rljH2 70/o nh2 ^P- HCI CHj-LCHzls-CH-COCHa-^^CHa- [CH2]5-CH -COCHs IL0P_3 NH2 ° WhCI CH3- [CH2]5-CH -COCH3 -=± CH3- [CH^-CH - CH-CH3 NH2-HCI D r. NH2 OH LtgpJt Cl CH3 Cl Vxi + CH-NH2^% ^H ^0H CH3-[CH2^CXH0H LH3 CHs Schemat3 una119685 ^Cl Cl JyNH2 (C2H50)3 CH M^yN SrljlH 100% S^ljT CH CH CH3-[CHJ5 "CHOH CH3 - [CH2]s ""CHOH Etgp_6_ CHa ^ Cl mu H"* nVS ^- rVS ^f HCl 92% Ssi-^rjl^ • HCl £H ^CHv CH3-[CH2]5 XCHOH [CH2]5 CHOH CH3 chV CH3 Schemat 3 NH2 OH NaN02 M^vN, vV Ac0!iiHCl V^ /CH.CH 75% CH3-(CH2)f \H0H CH3-(CH2)5 CHOH CH3 CH3 Schemat 4 Pracownia Poligraficzna UP PRL. Naklad 120 egz.Cena 100 zl PL PL