Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia nowych zwiazków kompleksowych 6-podsta¬ wionych 9-(hydroksyalkilo)puryn o wzorze ogól¬ nym 1, w którym X oznacza grupe OH, R1 ozna¬ cza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1-—8 ato¬ mach wegla, R2 oznacza atom wodoru lub grupe metylowa, Y oznacza sól aminy o wzorze 2, w któ¬ rym R8 i R4 oznaczaja nizsze rodniki alkilowe, np. o 1—4 atomach wegla, a n oznacza liczbe calko¬ wita 2—4, z kwasem p-acetamidobenzoesowym, i w którym z oznacza liczbe od 1 do 10. Otrzy¬ mywane sposobem wedlug wynalazku zwiazki sa uzyteczne w stosowaniu jako immunomodulatory, srodki antywirusowe i jako zwiazki- wykazujace w odpowiednich warunkach wlasciwosci przeciw- nowotworowe.Gdy R2 w zwiazku o wzorze 1 oznacza atom wodoru, obecnosc soli Y wzmaga aktywnosc immunoregulacyjna i antywirusowe dzialanie zwiazku.Dzialanie immunoregulacyjne wydaje sie wzra¬ stac ze wzrostem dlugosci lancucha podstawnika R1, co najmniej od metylu do heksylu. Korzyst¬ nie, R1 oznacza rodnik n-alkilowy, to jest mety¬ lowy, etylowy, n-propylowy, n-butylowy, n-amy- lowy, n-heksylowy, n-heptylowy lub n-oktylowy.R2 oznacza korzystnie rodnik metylowy.Korzystna grupa amin dla tworzenia soli z kwasem p-acetamidobenzoesowym rna ogólny wzór 3, w którym R5 i Rc oznaczaja nizsze rodniki 10 15 15 30 alkilowe, np. rodnik metylowy, etylowy, propylo¬ wy, izopropylowy lub butylowy, a n oznacza liczbe calkowita 2—4. Takimi przykladowymi typowymi aminami sa etanolodwumetylo-amina, izopropano- Iodwumetyloamina, etanolodwuetyloamina, izobu- tanolodwumetyloamina, izopropanolodwuetyloa- mina, etanolometyloetyloamina, butanolo-N-dwu- izobutyloamina, propanolodwumetyloamina, buta- nolo-N-dwumetyloamina, etanolodwuizobutylo- nmina, butanolodwumetyloamina, butanolo-N-dwu- butyloamina, ctanolodwubutyloamina, etanolodwu- propyloamina i etanolodwuizopropyloamina. Sto¬ sowana korzystna amina jest izopropanolodwume- tyloamina. Korzystna wartoscia z jest liczba 3, aczkolwiek moze ono miec wartosc równiez 1, 2, 4, -5, 6, 7, 8, 9 lub 10.Chociaz korzystnie stosuje sie zwiazki, w któ¬ rych Y oznacza sól aminy o wzo p-acetamidobenzoesowym, mozna wykorzystywac równiez nowe zwiazki o wzorze 1, w których Y jest sola aminy jak podano wyzej, z farmaceutycz¬ nie dopuszczalnym kwasem róznym od kwasu p-acetamidobenzoesowego, np. kwasem chlorowo¬ dorowym, siarkowym, bromowodorowym, fosforo¬ wym, octowym, propionowym, malonowym, mle¬ kowym, cytrynowym, winowym, p-toluenosulforio- wym, adypinowym, maleinowym, bursztynowym, metanosulfonowym, salicylowym, acetyloalicylo- wym. 124 515124 515 W opisie dla oznaczenia zwiazków komplekso¬ wych o wzorze 1 stosuje sie skrót DIP.PAcBA oznaczajacy benzoesan dwumetyloam:no-2-propa- nolo-p-acetamidowy. O ile po skrócie nie wyste¬ puje liczba w nawiasach, np. (10), to ilosc grupy Y jest równa 3. Gdy po skrócie DIP.PAcBA naste¬ puje liczba w nawiasach, to oznacza to ilosc moli grupy Y przypadajacych na 1 mol 9-(hydroksy- alkilo)puryny.Nowe kompleksy o wzorze 1 sposobem wedlug wynalazku wytwarza sie, wprowadzajac grupe -OH w pozycji 6 do odpowiedniej 9-podstawionej 6-chloropuryny o wzorze 5, w którym X oznacza atom chloru, przez hydrolize w roztworze alkalicz¬ nym w warunkach ogrzewania, po czym sporzadza sie mieszanine otrzymanego zwiazku z sola Y w stosunku molowym 1:1—1:10, która rozpuszcza sie i wydziela sie z roztworu otrzymany kom¬ pleks.Korzystnie jako substrat stosuje sie 9-podsta- wiona puryne o wzorze 1, w którym R1 oznacza rodnik n-alkilowy, zwlaszcza n-heksylowy lub me¬ tylowy. W tablicy 1 przedstawiono wlasciwosci szeregu zwiazków o ogólnym wzorze 1, jak równiez sub- stratów.Tablica 1 Wlasnosci chemiczne 9-(hydroksyalkilo)puryn Zwiazek nr NPT 1 15425 15428 15446 15447 1*5423 15443 | 15444 | 154117 15418 15392 15410 Zwiazek o wzorze 4 E* 2 H H H H CH3 CH3 CH3 C6H13 C6H13 C6H13 C6H13| R2 3 H H CH3 CH3 H H H H H CHS CHJ 4 OH OH OH OH CL OH OH OH OH OH OH Y 1 6 — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA Temp. . topn.°C 6 274 205 244^-5 14.2 200^204 108-—.199 150 226 205 202 148 Widmo ultra¬ fioletowe maks. 1 7 250 250 254 25(8,5 250 250 254 258,2 265 265 265 2150 250 255 259 250 250 255 362,5 250 248 054 258,5 min. 8 222,5 210 221,5 2(23 223,5 220 223,5 223,2 228 228 228 223 218 225,5 225,5 224 220 223 229,5 i 224 222 220 224,5 | Stez. io-3 pH 9 | 10 11,93.M,0 12,53 62,1 11,0 1*0,6 12,1 56,5 9,1 1 9,1 9,1 7,52 6,91 7,91 48,5 1)1,09 10,37 11,96 6*7 12,1 13,3 14,1 41,9 7 1 10 V 7 1 10 7 7 1 10 7 1 10 ^7 n i 10 7 7 1, 10 7 Analiza elementarna C 1 W" obi. 45,20 zn. 45,11 obi. 59,07 zn. 59,01 obi. 60,41 zn. 60,47 | H 10 4,26 4,27 7,65 7,55 7^97 7,86 N 13 26,36 | 26,25 | 21,16 £1,24 20,13 10,08124 5 5 Jak wspomniano poprzednio, zwiazki o-wzorze 1, wytworzone sposobem wedlug wynalazku sa zwiaz¬ kami immunomodulacyjnymi.Zwiazek immunomodulacyjny jest zwiazkiem, który steruje odpornoscia organizmu. Obejmuje to * zarówno immunostymulaeje (potencjalna odpor¬ nosc) jak i inimurroinhibitacje. Immunostymulacja ma oczywiscie znaczenie dla zwiekszenia odpor¬ nosci. Immunolnhibitacja ma równiez znaczenie w szeregu dziedzin. Na przyklad odgrywa role *• przy transplantacji organów, np. przy transplan¬ tacji nerki czy serca, dla zapobiegania odrzucenia przeszczepu.W tablicach przedstawiono wlasciwosci immuno- potencjalne zwiazków. Plus ( + ) lub minus ( —) 15 oznacza odpowiednio wlasciwosci immunostymulu- jace lub immunoinhibitacyjne. Liczba 0 oznacza, ze zwiazek hie posiada zadnej z tych wlasciwosci.Mitogen jest substancja, która powoduje proli¬ feracje komórki, tak jak to ma miejsce w przy- » padku uodporniania.Kompleksy wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku sa uzyteczne w dzialaniu na ssaki (i ko¬ mórki ssaków). I tak mozna je stosowac u ludzi, swin, psów, kotów, bydla, koni, owiec, kóz, myszy, » królików, szczurów, swinek morskich, chomików, malp i podobnych.O ile nie zaznaczono tego inaczej, w dalszym opisie wszystkie czesci sa podane wagowo a wszy¬ stkie temperatury podane sa w stopniach w skali *° stustopniowej (°C). W innych przypadkach zazna¬ czono to dodatkowo.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wynalaz¬ ku mozna podawac ssakom sposobami konwencjo¬ nalnymi, tj. doustnie,, do nosa, droga lewatywy, tó dopochwowo, dojelitowo czy pozajelitowo. Mozna je stosowac w postaci wstrzykiwanych roztworów np. wodnych, lub w postaci tabletek, pigulek, kap¬ sulek itp.Aktywnosc biologiczna zwiazków kompleksowych, *° wytworzonych sposobem wedlug wynalazku, rów¬ niez w porównaniu z innymi podobnymi zwiazka¬ mi badano nastepujaco.Aktywnosc przeciwko wirusowi grypy (oznacze¬ nie hemadsorbcji). Po zakazeniu jednowarstwo- w wych hodowli tkankowych wirusem grypy, po¬ wierzchnia komórkowa zostaje zmieniona w ten sposób, ze erytrocyty swinki morskiej moga byc adsorbowane na powierzchni komórek. Liczba ognisk (skupien) zaadsorbowanych komórek (jed- 50 nostki tworzace ogniska hemadsorbcji) jest iloscio¬ wa miara zakazenia.Opis metody. Jednowarstwowe hodowle komór¬ kowe hodowane w nastepujacy sposób: pozywke zlewano i jednowarstwowe hodowle komórkowe 5S przemywano dwukrotnie 50 ml porcjami roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami, pozba¬ wionej wapnia i magnezu (PBS), (GIBCO 419) o pH 7,2. Do kazdej butelki hodowlanej w tempe¬ raturze 37° dodawano 1 ml roztworu trypsyny- *° -EDTA (GIBCO 530 L) zawierajacy 0,5 trypsyny (1:250) i 2,0 g EDTA (litr Puck's Saline A) i roz¬ prowadzano nad jednowarstwowa hodowla przez delikatne potrzasanie. Buteki hodowlane umiesz¬ czono w inkubatorze w temperaturze 37°C na okolo •* 6 3—5 minut w zaleznosci od teg^, jaki oferes czasu byl potrzebny dla oderwania komórek. Do kazdej butelki dodawano dziesiec ml pozywki hodowlanej i komórki rozprowadzano przez wciaganie i wy¬ dmuchiwanie zawiesiny z pipety. Zawartosc szere¬ gu butelek hodowlanych zbierano razem i komórki w zawiesinie rozcienczano pozywka hodowlana do 7—8,5 X104 komórek/ml.Pozywka hodowlana miala r,?stepujacy sklad: podstawowa pozywka mirJmalna wedlug Eagle'a (MFM) z solami Earle'a Lbuforem HEPES (GIBCO 236) uzupelniona przez dodanie nastepujacych sub¬ stancji w odniesieniu do 37 ml pozywki MFM: 10 ml plodowej surowicy cielecej (FCS-GIBCO 614HI), 1 ml L-glutaminy (200 Molar GIBCO and 503), 1 ml chlortetracykliny (5000 g/ml) GIBCO 528), 1 ml mieszaniny zawierajacej 10 000 jednostek penicyliny, 10 000 g streptomycyny i 100 000 neo¬ mycyny (PSN-GIBCO 564). Komórki hodowano na tackach hodowlanych Linb.ro. Kazda tacka zawie¬ rala 24 plaskodenne studzieniki o objetosci 3 ml; zawiesine komórek (1 ml) dodawano do kazdej studzienki. Nastepnego dnia pozywke usuwano i dodawano nowa pozywke hodowlana. Jednowar¬ stwowe hodowle uzywano do badan po osiagnieciu gestosci pokrywajacej w sposób ciagly przez ko¬ mórki naczynia hodowlanego (3—4 dni). Kiedy kultury komórek Hela hodowlanych na tackach Linbro byly gotowe do eksperymentowania (patrz komórki) pozywka byla usuwana i do czterech hodowli tkankowych znajdujacych sie na tacce dodawano 1 ml pozywki podtrzymujacej (pozywka Eagle'a z surowica plodowa cieleca zmniejszona do 3%) zawierajacej w podanym stezeniu zwiazek poddany badaniu.Stosowano szereg róznych stezen badanego zwiazku od 2,3 do 150 g/ml. W hodowlach ko¬ mórkowych kontrolnych uzywano pozywke pod¬ trzymujaca bez zadnych dodatków. Po podaniu badanego zwiazku i kontrolnej pozywki, do grup eksperymentalnych i do kultur komórkowych kon¬ trolnych dodawano 0,1 ml rozcienczonej zawiesiny wirusa. Roztwór soli fizjologicznej dodawano do niezakazonych kontrolnych hodowli tkankowych.Tacki Linbro inkubowano w temperaturze 37°C w ciagu 18 godzin, a nastepnie odciagano pozywki we wszystkich grupach. Kazda hodowle przemy¬ wano jednorazowo PBS. Usuwano roztwór soli, do kazdej hodowlanej studzienki dodawano 0,5 ml 0,4% objetosciowoi/objetosciowych zawiesiny erytro¬ cytów swinki morskiej. Hodowle komórkowe po- pozostawiono w temperaturze pokojowej na 30 mi¬ nut, nastepnie pozywke usuwano i kultury ko¬ mórkowe przemywano dwukrotnie PBS-em w ce¬ lu usuniecia wszystkich komórek poza specyficznie zwiazanymi erytrocytami. Po trzecim przemyciu pozywke podtrzymujaca dodawano do wszystkich hodowli. Wewnatrz okularu Nikon mikroskopu o odwróconym kontrascie fazowym umieszczano okular pomiarowy Howarda (C8385). Kazda ho¬ dowle ogladano i bezposrednio liczono hemadsor- bowane czerwone komórki przy uzyciu siatki oku¬ laru jako markera pola. Czesciowe lub cale pola byly liczone na grupe eksperymentalna odnoszac uzyskane dane i gestosc zaadsorbowanych komórek124 515 w stosunku do zakazonych hodowli komórkowych kontrolnych.Dla liczenia hemadsorbowanych komórek wy¬ brano powiekszenie 60 X lub 150 X. Wspólczynniki pola wyliczano z obliczen hemadsorbcji przy po¬ wiekszeniu 60 X i 150 X. Przy 60 X powiekszeniu ob^czenie calego pola uzyskiwano przez pomnoze¬ nie przez wspólczynnik 55,5. Przy powiekszeniu 150 X stosowano wspólczynik mnozenia 273.Wspólczynniki mnozenia 55,5 i 273 przedstawiaja cala liczbe pól odpowiednio przy powiekszeniu 60 X S i 150 X. Liczba pól liczonych wynosila 3 do 5 na studzienke przy uzyciu 3—4 studzienek w badanej grupie (patrz bezposrednie dane w tablicach re¬ zultatów dla liczby pól badanych). Obliczono wy¬ niki srednie i blad standardowy i dane oceniano przy uzyciu testu t Studenta.Aktywnosc antywirusowa kompleksów otrzyma¬ nych sposobem wedlug wynalazku w porównaniu z innymi pochodnymi 9-{hydroksyalkilo)puryn w odniesieniu do wirusa grypy A ZSRR (90/HjNj) przedstawiono w tablicy 2.Badany zwiazek numer NiPT 15446 15447 15423 15443 15f444 ' 15417 15418 15392 15410 15110 Ta blica 2 Zwiazek o wzorze 4 R1 H H CH3 CH3 CH3 C6H13 C6H13 C6H13 C6H13 — R3 CH3 CH3 H H H H H CH3 CH3 . — X OH OH Cl OH OH OH OH OH OH — 1 Y — DIP.PAcBA — — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA — DIP.PAcBA DIP.PAcBA % likwidacji ognisk hemadsorbcji (|ig/ml) badanego zwiazku <10 2 10 2 jLS 16 66 S8 0 10—100 0 26 13 0 44 58 46 100 ®6 ;o 100 0 34 16 ' 10 54 00 52 100 96 20 Jak wynika z powyzszych danych, zwiazki otrzymane sposobem wedlug wynalazku wykazuja w opisanej próbce z reguly wyzsza aktywnosc przeciwwirusowa.Aktywnosc przeciwko wirusom opryszczki (Her- pes) (Próba lysinkowa). Zakazenie hodowli tkanko¬ wych wirusem Herpes powoduje lize komórek. Po pewnym czasie komórki, które ulegly lizie, sa widoczne jako drobne jasne pola (lysinki) w war¬ stwie komórek. Wprowadzenie badanej substancji do .pozywki bedzie zmniejszac liczbe lysinek, o ile badany zwiazek jest zdolny zapobiegac replikacji wirusa.Stosowano nastepujaca metode: Materialy i metody. Wirus. Wykorzystano wirus herpes hominis (wirus opryszczki ludzkiej) typu 2 nabyty ' z American Type Culture Collection (ATCC), 3ethesda, Maryland ATCC VR 540, Lot 3D. Liofilizowana zawiesine wirusa rozpuszczano w 1 ml destylowanej, sterylnej wody. Wirus prze¬ puszczano dwukrotnie przez jednowarstwowa ho¬ dowle komórek HeLa. Nadsacze znad hodowli tkankowych zbierano razem, dzielono na jedno- mililifcrowe "porcje, i przechowywano w tempera¬ turze —70°C. Miano tej wyjsciowo-roboczej zawie¬ siny wynosilo 10~4 TCID50/0,1 ml (2 dni inkubacji).Próba lysinkowa wirusa opryszczki. Komórki Vero w logarytmicznej fazie wzrostu hodowano 43 50 55 60 «5 w stezeniu 1X105 komórek /ml w 50 ml butelkach Falcon w pozywce Eagle'a (MEM), uzupelnionej 10% surowica plodowa cielecia i antybiotykami.Pozywke zmieniano nastepnego -dnia po zalozeniu hodowli. Jednowarstwowa hodowla Vero osiagala jednolite pokrycie nastepnego dnia po wysianiu i z komórkami w logarytmicznej fazie wzrostu, i takie hodowle uzywano do próby lysinkowej. Po¬ zywke hodowlana zlewano i przemywano jedno¬ warstwowe hodowle jednorazowo roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS).Przygotowywano szereg róznych rozcienczen wyjsciowo-roboczej zawiesiny wirusa i kazda bu¬ telke hodowlana zakazano przez dodanie do po¬ zywki bez surowicy plodowej 0,5 ml jednego z wirusowych rozcienczen. Pozywka zawierala ba¬ dany zwiazek w stezeniu 150 jig/ml. Próbki kon¬ trolne przygotowywano z pozywka bez badanego zwiazku. Adsiorbcje wirusa przeprowadzano w cia¬ gu 2 godzin w temperaturze 37°C, podczas ^ których hodowle delikatnie potrzasano co 15 minut. Na¬ stepnie pozywki zlewano i jednowarstwowe ho¬ dowle przemywano jednorazowo 10 ml PBS. Aga- roze przygotowywano w stezeniu 6% wagowo/obje¬ tosciowych w 50 ml PBS. Przygotowywano wyjs¬ ciowa pozywke MEM uzupelniona 2% surowica plodowa. Badane zwiazki dodawano do wyjscio¬ wej pozywki w ilosci 150 fig/ml. Trzy roztwory \124 515 9 10 utrzymywano w temperaturze 47°C. Dodatkowo przygotowano w rozcienczeniu 1:10 ludzka surowica przeciwko wirusowi opryszczki. Tuz przed rozpo¬ czeciem badania do 35 ml pozywki dodawano 1-5 ml roztworu agarozy. Inne 15 ml agairozy dodawano do 85 ml pozywki zawierajacej badany zwiazek.Kazda z jednowarstwowych przemytych hodowli z tej samej grupy eksperymentalnej zadawano albo 5 ml po/ywki z agaroza albo 5 ml pozywki z aga- roza i badanym zwiazkiem.W innej grupie eksperymentalnej do kazdej jednowarstwowej hodowli dodawano 0,2 ml suro¬ wicy przeciwko wirusowi opryszczki w 5 ml wyjs¬ ciowej pozywki albo 0;2 mi surowicy przeciwko wirusowi opryszczki w 5 ml pozywki zawierajacej badany zwiazek, Zamiast agarozy do lokalizowa¬ nia lysinek przez neutralizowanie wolnego wirusa w pozywce stosowano surowice przeciwwirusowa.Butelki hodowlane pozostawiano w temperaturze pokojowej na 5 minut, po czym inkubowano je w temperaturze 37°C w ciagu dwóch dni.Dla wiekszosci badanych grup stosowano po trzy hodowle komórkowe. Nastepnie do kazdej butelki hodowlanej dodawano 10 ml PRS. Komórki ros¬ nace ponad jedna warstwe delikatnie wytrzasano i nastepnie zlewano z butelek. Jednowarstwowe hodowle barwiono roztworem 0,5% wag/obj. kry¬ stalicznego fioletu w 50% metanolu w trzykrotnie destylowanej wodzie. Lysinki liczono albo bezpo¬ srednio makroskopowo w przechodzacym swietle fluoryzujacym albo uzywajac swietlnego mikro¬ skopu dla mikrelysinek. Mikrolysinki liczono obli¬ czajac przecietna trzech pól w grupie eksperymen¬ talnej przy powiekszeniu 150X.Aktywnosc" antywirusowa kompleksów otrzyma¬ nych sposobem wedlug wynalazku w porównaniu z innymi pochodnymi 9-(hydroksyalkilo)puryn w odniesieniu do wirusa opryszczki przedstawiono w tablicy 3. Przedstawione dane wskazuja, ze jest ona w przypadku zwiazków kompleksowych rów¬ nie dobra jak w przypadku zwiazków nieskomplek- sowanych.Tablica 3 NPT i nu- I mar 15392 15410 Zwiazek o wzorze 4 Ri C6H13 C6H13 R8 CH3 H X OH OH Y DIP.PAcBa % , likwi¬ dacji 98 98 \ 30 W tablicy 4 przedstawiono przeciwdzialanie kompleksów otrzymanych sposobem wedlug wyna¬ lazku o wzorze 4 w porównaniu z innymi 9-(hydro- ksyalkilo)purynami w odniesieniu do róznych ro¬ dzajów wirusa grypy, a w tablicy 5 dodatkowo próby nowego kompleksu otrzymanego sposobem wedlug wynalazku, oznaczonego jako zwiazek NPT 15410 w odniesieniu do róznych wirusów grypy. ; Zwiazek NPT numer 1 15392 15417 15418 15410 Tablica 4 % zahamowania przy podanym stezeniu badanego zwiazku w }ig/ml 0,1—1,0 2 30—50 — — 50—70 1,0-40 3 — 50—70 — 30—50 10—100 4 70 70 70 70 100 5 70 — 70 70 Wirus 6 swinska grypa A 1976(Hlsw-N1) swinska grypa A 1976(Hlsw-N1) swinska grypa A 1976(Hlsw-N1) (swinski) Tablica 5 Zahamowanie replikacji wirusa grypy przez zwiazek NPT 15410 Wirus A (swinski) 76 (H^N^ A (texas) 77 (H3N2) A (Dunedin)- 73 (H3N2) A (Jap) 305 (H3N2) A A2Hong Kong (H2N2) Szereg stezen badanego zwiazku (\ng/ml) 0,1—1,0 + + + + + -NT ¦ NT +¦+ NT 1,0—10,0 | 10,0—100 + + + NT NT + + NT + + + + +,+ + + ± +!+ + + +:++ + •+,+ . 100 +.'+ + + +¦+. + .+ + -l- + + + + + NT — nie badano; ± — 10—20% zahamowania; + — 20—30% zahamowania; ++ — 30—50% za¬ hamowania; + +¦•+ — 50—70% zahamowania; +H- + + — 70% zahamowania.11 Próba immunoregulacyjna. Aby ocenic zdolnosc badanych substancji do regulacji aktywnosci sze¬ regu klas komórek w systemie odpornosci, stoso¬ wano trzy nastepujace sposoby badan. W syste¬ mach tych mozliwa jest identyfikacja zarówno wzmozonej odpowiedzi immunologicznej (uwidocz¬ nionej przez wzrost badanych parametrów) jak równiez aktywnosci immunosupresyjnej (uwidocz¬ niona przez zahamowanie badanych parametrów). 1. Próba indukcji mysich splenocytów mitoge- nem. Komórki sledziony mysiej zawieraja popula¬ cje zarówno limfocytów B jak i T, które moga byc pobudzane przez szereg róznych substancji (jak np. roslinne mitogeny takie jak ConA) do prolife- racji. Ten wzrost proliferacji jest wskaznikiem wzrostu odpornosci komórkowej.Opisana nizej metoda opisuje system uzywany do oceny badanych zwiazków jako wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej. Materialy. Concana- valina A (CalbLochem, La Jolla, Calafornia), Lot 210 073, liofilizowana w NaCl, przygotowywana najpierw jako 1% roztwór i rozcienczana z dwu¬ krotnie wyzszego stezenia dla kazdego rozciencze¬ nia (0,5, 1,0, 2,0, 5 fig/ml).Zwierzeta. Szescio- do osmiotygodniowe samce myszy osobnych linii Balb/e i C3H pochodzace z na¬ stepujacych zródel: Flow research Animals, Inc., Dublin, Virginia; Charles River Breeding Labora¬ tories, Wilmington, Massachusetts; Labioratory Supply Company, Indianopolis, Indiana; i Lionel Strong Foundation, San Diego, California.Komórki. Trzy do pieciu myszy zabijano przez przeciecie karku i sterylnie usuwano sledziony.Zebrane sledziony miazdzono i rozdrabniano ste¬ rylnymi kleszczami; nastepnie osadzano prizez pod¬ wójna warstwe nylonowej siatki. Zawiesine ko¬ mórkowa przemywano jednorazowo 15 ml RPMI 1640 uzupelnionej 5% plodowa surowica cieleca i antybiotykami. Komórki hodowano w stezeniu 106 komórek (0,1 ml) na studzienke w mikroplyt- kach. Hodowle inkubowano w ciagu 48 godzin w obecnosci lub braku mitogenu w wilgotnej atmosferze zawierajacej 5% C02. Badany zwiazek dodawano do hodowli komórkowych w róznych stezeniach w towarzystwie mitogenu.Proliferacja. Proliferacje okreslano jako stopieii wlaczania 1,0 Ci (3H) tymidyny po 18-godzinnym okresie inkubacji. Hodowle zbierano przy zastoso¬ waniu zestawu MASH {Otto Hiller Co., Madison, Wisconsin) i oznaczano wlaczenie tymidyny przy zastosowaniu plynnej scyntylacyjnej spektrometrii.Hodowle tkankowe przygotowywano w trzykrotnych powtórzeniach i dane przedstawiono jako srednie, plus lub minus blad standardowy eksperymental¬ nych srednich. Obliczano równiez i przedstawiano graficznie pobudzenie badanym zwiazkiem powyzej wartosci kontrolnych. 2. Limfocyty ludzkiej krwi obwodowej induko¬ wanej mitogenem. Istnieje kliniczne zapotrzebowa¬ nie na czynniki terapeutyczne wzmagajace odpo¬ wiedz immunologiczna u pacjentów z wadliwa lub zmniejszona odpornoscia immunologiczna wystepu¬ jaca w przypadku chorób wirusowych lub raka.Badajac czynniki zdolne do wzmozenia proliferacji ludzkich limfocytów krwi obwodowej, mozna iden- 4 515 12 tyfikowac czynniki wzmagajace odpowiedz immu¬ nologiczna u czlowieka. Stosowano spo-sób badania jak przedstawiono poprzednio, jak równiez opisany przez Hadden J. W., Infect. Immunity, February, * 1976, str. 382—307, glównie strony 382^383. 3. Makrofagi naleza do subpopulacji bialych cia¬ lek krwi, i sa waznym skladnikiem ukladu immu¬ nologicznego, kontrolujacego zarówno odpornosc komórkowa jak i humoralna. Ponizej opisany spo- i° sób badania opisuje ocenianie badanych'substancji jako wzmacniaczy funkcji makrofagów. Fitohema- glutynine (PHA) sprowadzano z Burroughs Wellcome.Preparat zawierajacy Makrofagowy Czynnik 15 Mitogenny (MMF) i Czynnik Aktywujacy Makro- . fagi (MAF) otrzymywano poprzez immunologiczna stymulacje antygenem limfocytów wezlów chlon¬ nych (swinki morskiej) wedlug wczesniejszego opisu Hadden i wsp. Nature 257, 483—485 (1975). Czes- 20 ciowe oczyszczenie tego preparatu poprzez dialize prózniowa i chromatografie kolumnowa na sefa- deksie G-100, daje aktywna frakcje w zakresie 35—70 000 daltonów wykazujaca wlasciwosci za¬ równo mitogenne jak i aktywujace. W badaniach 2d zarówno proliferacji jak i aktywacji stosowano frakcje aktywna Metody badania, Limfocyty ludzkie krwi obwo¬ dowej otrzymywano metoda Ficollowa i badano proliferacje limfocytów indukowana PHA przez 30 wlaczanie trytowan^j tymidyny wedlug opisu Hadden i wspólpracow.lików, Celi Immunol. 20, 98—(103 (1975). Kazdy zwiazek badano w obecnosci suboptymalnego, optymalnego i nadoptymalnego stezenia PHA (odpowiednio 0,001, 0,0.1, 0,1 jedno- 35 stek /ml). Otrzewnowe makrofagi swinki morskiej indukowane olejem parafinowym przygotowano i hodowano w jednowarstwowej hodowli (98% czystych makrofagów). Proliferacje indukowana limfokina (MMF) badano przez wlaczanie trytowa- 40 nej tymidyny po 3 i 5-oiu dniach hodowli jak opisano przez Haddena i wspólpracowników, Na¬ ture 257, 483—485 (1975). Aktywacje makrofagów indukowana limfokina (MAF) do zabijania pale¬ czek Listerii badano po 5 dniach hodowli w obec- 15 nosci lub braku MAF w ciagu 6-ciu godzin jak opisano przez Haddena i IEnglanda, Inimunophar- macology, str. 87—100 (Plenum Press, .1977).Fagocytoze okreslano ilosciowo podczas 20-mmu- towej ekspozycji na dzialanie paleczek Listerii zli- 50 czajac liczbe makrofagów zawierajacych bakterie i liczbe bakterii na fagocytujaca komórke, na gram wybarwionych jednowarstwowych hodowli w ko¬ morach Labtek. Wewnatrzkomórkowe zabijanie bakterii oceniano przez zliczenie liczby komórek 55 zawierajacych bakterie i liczbe bakterii na ko¬ mórke po poczatkowej 20-minutowej ekspozycji.Równolegle przeprowadzone próby, w których makrofagi poddawano rozpuszczeniu i hodowano bakterie wewnatrzkomórkowe potwierdzaja waz- 60 nosc aktywnosci bakteryjnej oznaczanej w ten sposób w tym ukladzie. Zwiazki badano w kazdym z trzech systemów w seryjnym szeregu logaryt¬ micznych stezen w obecnosci lub braku mitogenu lub limfokiny., Kazdy rodzaj eksperymentu prze- w prowadzano co najmniej trzykrotnie. Poprzednie124 515 13 14 eksperymenty wykazuja równoleglosc odpowiedzi na modulowanie farmakologiczne w próbach proli¬ feracji i aktywacji.Aktywnosc przeciwbialaczkowa (zahamowanie wzrostu L-1210). Komórki bialaczkowe izolowano z myszy majacej guz L-1210 i hodowano in vitro, a ich wzrost mierzono zliczajac hczbe komórek w hodowli pj pewnym okresie czasu. Wprowadze¬ nie badanej substancji do pozywki zapobiega wzro¬ stowi komórek bialaczkowyeh, co wskazuje na ich skutecznosc j jko czynnika przeciwbialaczkowego. luc/Stezenie zwiazku hamujace wzrost L-1210 wy¬ razone w % dla badanych zwiazków podano w ta¬ blicy (5.Tablica 6 Zwiazek NPT nr 15392 .15410 15417 / 154,18! Stezenie (mikrogramy/mi) 23 54 47 70 Zastosowano sposób badania przedstawiony nizej.Pomiar zahamowania wzrostu komórek bialaczko¬ wych (Lnl210). Sprawdzano, czy w hodowlach wyjsciowych jest odpowiedni wzrost komórek.Uzywano komórki po 48—72 godzinach od przenie¬ sienia. Badane zwiazki odwazano w 50-krptnie wiekszej ilosci od pozadanego stezenia koncowego i przygotowywano seryjne rozcienczenia. Koncowa pozywke przygotowywano uzywajac 500 ml pozywki Mc Coya 5A, 15% surowicy plodowej cielecej, 5 ml roztworu antybiotyku i srodków przec iwgrzy bi¬ ezyeh i pozostawiano w temperaturze pokojowej.Do kazdej probówki dodawano w warunkach ste- rylnosci 0,1 ml rozcienczen badanego zwiazku. Do poprzednio przygotowanej pozywki dodawano od¬ powiednia ilosc komórek. Po wymieszaniu usuwano 0,5 ml próbke i przenoszono do fiolki zawierajacej 9,5 ml roztworu soli fizjologicznej i zliczano na liczniku Coulter. Wynik mnozono przez 40 dla wyrównania 40-krotneeo rozcienczenia (0,5 ml w 0,5 ml roztworu soli i zanotowana ilosc inoculum). Do kazdej probówki dodawano 5 ml zawiesiny komórek. Aby zapewnic równomierne rozmieszczenie komórek po nalaniu do kazdych 4 probówek pokrecano butelke. Zamocowywano na probówkach kapturki i umieszczano w inkubatorze C02 w temperaturze 36—38° na okres 96 godzin Po 96 godzinach próbki wyjmowano z inkubatora i liczono zawartosc kazdej na liczniku Coultert Wszystkie wyniki mnozono przez 40 i obliczano srednia z 4 zliczen dla kazdego rozcienczenia ba danego zwiazku. Jezeli wynik liczenia jest mniei szy niz inoculum, odnotowywano 100% zahamowa¬ nia. Jezeli wynik jest wiekszy niz przecietna z 8 kontrolnych zliczen, odnotowywano 0% zaha¬ mowania. Dla wszystkich innych obliczen uzywano nastepujacego wzoru: \ 20 26 30 srednia liczba komórek/ml w badanych hodowlach—inoculum w komórkach/ml vino=% srednia liczba komórek/ml w kontrolnychPrzezyaa hodowlach ¦— inoculum w komórkach/ml 100% — % przezycia = zahamowanie wzrostu na skutek traktowania bada¬ nym zwiazkiem.Przy uzyciu standardowych technik .hodowli tkankowych wykazano, zj badane zwiazki wy¬ twarzane sposobem wedlug wynalazku hamowaly replikacje reprezentatywnej grupy wirusów zarów¬ no RNA jak i DNA. W przypadku wirusów RNA hamowaniu ulegalo szereg szczepów wirusa grypy, nalezacych zarówno do podtypu A jak i B, co wy¬ kazano uzywajac techniki hemadsorpcji.W tablicy 1 przedstawiono zwiazki hamujace specyficznie replikacje wirusa grypy (Typ A/ZSRR 90). Wykazano, ze szereg badanych zwiazków ozna¬ czonych w tablicy 1 jako NPT 15392, NPT 154,10, NPT 15417 i NPT 15418 hamowalo replikacje co najmniej czterech róznych .szczepów wirusa grypy w stezeniach od 1—150 ug/ml.Ponadto wykazano, ze szereg badanych zwiaz¬ ków, oznaczonych jako NPT 15410 i NPT 15392 hamuje replikacje wirusa opryszczki, reprezentan¬ ta wirusów DNA i odpowiedzialnego za ciezkie uszkodzenia skórnosluzowe u czlowieka, jak rów¬ niez smiertelnego Herpes encephalitis.Inni przedstawiciele tej klasy wirusów sa wirusy odpowiedzialne za pryszczyce swin i bydla i infek¬ cje kataralne u kotów oraz nosówke u psów.Stwierdzono, ze nawet stezenie zwiazków oznaczo¬ nych jako NPT 15392 i 15410 mniejsze niz 1Q0 ug/ml zmniejiszaja tworzenie lysinek spowodo¬ wane przez wirusa opryszczki do ponad 90%.Innych przedstawicieli wirusów klasy RNA i DNA odpowiedzialnych za wymienione choroby wymieniono w tablicy 8. Ze wszystkich chorób swiata przynajmniej 25% jest powodowana przez wirusy, w dodatku, wyizolowano szereg wirusów odpowiedzialnych za wzrost guzów. Stad tez, prze¬ ciwwirusowe czynniki powinny miec wlasciwosci przeciwnowotworowe.Jest faktem udowodnionym, ze wiele czynników infekujacych, takich jak wirusy (grypy, HSV, bialaczki), bakterie i grzyby powoduja stan immu¬ nologicznej supresji gospodarza, oslabiajac tym sa¬ mym jego zdolnosci obronne. Wiele innych prze- ciwwirusowych substancji antymetabolicznych ta¬ kich jak AdraC powoduje supresje mechanizmów obronnych, wykazujac przez to potencjalne zmniej¬ szenie naturalnych mechanizmów obronnych orga¬ nizmu i ulatwianie wtórnej infekcji.Wzmacniaczem odpowiedzi immunologicznej lub regulatorem odpowiedzi immunologicznej jest kaz¬ dy czynnik, który przywraca zahamowane funkcje immunologiczne, ulatwia normalne funkcje immu¬ nologiczne lub jedno i drugie. Funkcje immunolo- 60 giczna definiuje sie jako rozwój i ekspresje od¬ pornosci humoralnej (przeciwcial), komórkowej (tymocyty) lub odpornosci uwarunkowanej granu- locytami i makrofagami. Powyzsze logicznie obej¬ muje czynniki dzialajace bezposrednio na komórki M biorace udzial w odpowiedzi immunologicznej, lub 35 40 50 551245 15 na mechanizmy czasteczkowe lub komórkowe, co z kolei dziala na funkcje komórek bioracych udzial w odpowiedzi immunologicznej.Wzmocnienie funkcji immunologcznej moze byc rezultatem aktywnosci czynnika, który usuwa me- 5 chanizmy supresji wyprowadzone z wplywów ujemnego sprzezenia zwrotnego, endogennego • lub egzogennego na uklad immunologczny. Stad wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej maja rozbiezne mechanizmy dzialania. Jednakze, pomi- io jajac odrebnosc w miejscu dzialania i w bioche¬ micznych mechanizmach dzialania, ich zastosowa¬ nia sa w zasadzie takie same, tzn. zwiekszaja odpornosc gospodarza.Zastosowania wzmacniaczy odpowiedzi imrau- 13 nologicznej. 1. Glówna funkcja ochronna ukladu immunolo¬ gicznego odnosi sie do odpornosci na inwazje pa¬ togenów takich jak wirusy, riketsje, mykoplasmy, bakterie, grzyby i pasozyty wszystkich typów. Stad, '20 ulepszenie odpowiedzi immunologicznej, szczególnie tej zahamowanej, poprawiloby zdecydowanie od¬ pornosc na zakazenie lub wnikniecie wszystkich wymienionych wyzej patogenów. Sam wzmacniacz odpowiedzi immunologicznej, lub w polaczeniu 23 z terapia przeciwzakazna, moze byc zastosowany we wszystkich bez wyjatku chorobach zakaznych. 2. Druga funkcja ochronna ukladu immunologicz¬ nego jest odpornosc na wszczepianie obcej tkanki zarówno naturalne jak w stosunku matczyno- plo- ^ dowym, lub sztuczne dokonane przez lekarza tran- splantologa. Wzmacniacze odpowiedzi immunolo¬ gicznej moga byc takze uzyte do ulatwienia od¬ rzucenia tkanek plodowych lub lozyskowych a tak¬ ze do zmiany lub indukcji tolerancji na przeszczep. C5 3. Trzecia funkcja obronna jest odpornosc- na zlosliwy wzrost komórek jak w raku. Uzycie wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej rnozr byc uzyte w leczeniu raka w celu ulatwienia od- rzecenia guza lub zahamowania nawrotów po in- 40 nych formach terapii. 4. Czwarta funkcja obronna to zdolnosc roz¬ poznania obcego i utrzymywania braku odpowiedz*' na swoje przez mechanizmy. dodatniej supresji.W schorzeniach autoimmunologicznych i podob- 45 nych reaktywnosc immunologiczna skierowana jest przeciwko wlasnym antygenom lub wystepuja przesadzone, nasilone odpowiedzi, które sa samo- niszczace. Wzmacniacze odpowiedzi immunologicz¬ nej moga byc uzywane do przywrócenia zwyklych 50 mechanizmów supresyjnych, wywolania tolerancji lub przywrócenia prawidlowej odpowiedzi immu¬ nologicznej.Kazda z funkcji ukladu immunologicznego moze byc modyfikowana przez niespecyficzne leczenie 53 wzmacniaczami odpowiedzi immunologicznej lub tez w polaczeniu z innymi czynnikami uzywanymi do poprawienia odpornosci lub do zabicia ataku¬ jacego patogenu. W dodatku, specyficzna odpor¬ nosc moze byc wzmocniona przy uzyciu wzmac- 60 niaczy odpowiedzi immunologicznej w polaczeniu z pewnymi formami antygenu jak w szczepion¬ kach np. wirusa, komórki guza. Ten sposób za¬ stosowania daje indukcje zarówno specyficznej od¬ pornosci jak i tolerancji., To ostatnie mozna po- 65 16 przec przykladem zastosowania antygenu w alergii lub chorobach autoimmunologicznych.Zastosowanie wzmacniaczy odpowiedzi immunolo¬ gicznej moze byc zarówno terapeutyczne jak i pro¬ filaktyczne; to ostatnie, czesciowo podczas starze nia, kiedy to zakazenia, autoimmunologiczne scho¬ rzenia i rak sa czesciej spotykane. Czas i sposób podawania sa róznorodne i moga byc krytyczne w oznaczaniu wyników zarówno pozytywnej jak i negatywnej odpowiedzi. Kazdy czynnik wywo¬ lujacy wzrost odpowiedzi immunologicznej moze hamowac ja w zaleznosci od czasu i dawki. Tak wiec, w pewnych okolicznosciach wzmacniacze od¬ powiedzi immunologicznej moga byc stosowane jako inimunosupresory w alergii, schorzeniach aukoimmunizacyjny ch i przeszczepianiu.W tablicy 7 przedstawiono wynrki oceny szeregu badanych zwiazków jako wzmacniaczy odpowiedzi immunologicznej. Stosowano trzy rodzaje testów.Pierwszy polega na mierzeniu zdolnosci badanego zwiazku do wzrostu zdolnosci do proliferacji my¬ sich limfocytów w odpowiedzi na roslinny mitogen (Gon A). Drugi z nich przedstawia pomiary zdol¬ nosci badanych zwiazków do wzmozenia prolifera¬ cji limfocytów ludzkich w odpowiedzi na inny roslinny mitogen (PHA). Trzeci rodzaj testu okresla zdolnosc badanych zwiazków do wzmo¬ zenia proliferacji makrofagów w odpowiedzi na naturalna limfokine (MMF — Makrofagowy czyn¬ nik mitogenny). Ta ostatnia odpowiedz dotyczy proliferacji i aktywacji makrofagów, jak wyka¬ zano przez zabijanie bakterii, wirusów i komórek guza przez biale cialka krwi tego rodzaju.Wyniki aktywnosci immunologicznej wyrazonej jako zdolnosc pochodnych 9-(hydro!ksyalkilo)puryny i ich kompleksów otrzymanych sposobem wedlug wynalazku do regulacji odpornosci komórkowej, podano w tablicy 7, z której wynika, ze kampleksy wykazuja na ogól lepsze wlasciwosci od zwiazków nieskompleksowanych.Znaczne wzmozenie odpowiedzi immunologicznej zaobserwowano w przypadku zwiazków oznaczo¬ nych jako NPT 15392 oraz kompleksów NPT 15410 i NPT 15418.Szereg pochodnych 9-(hydroksyalkilo)puryny jak równiez utworzonych z nich kompleksów wedlug wynalazku badanego jako mitogeny indukujace proliferacje mysich limfocytów, w sposób opisany poprzednio. Wyniki tych badan, przedstawione w tablicy 8 wskazuja, ze kompleksy wedlug wy¬ nalazku wykazuja co najmniej równe lub wyzsze wlasciwosci pobudzajace proliferacje niz zwiazki nieskompleksowane.Wreszcie oznaczono aktywnosc szeregu badanych zwiazków 15392 i 15410 jako inhibitorów wzrostu nienormalnych limfocytów. Nalezy zauwazyc, ze obie te substancje sa" zdolne do zahamowania w hodowli tkankowej proliferacji limfocytów bia¬ laczki mysiej (linia komórkowa L-1210). Osiagano 50% zahamowania komórek L-1210 przy pomocy zwiazku oznaczonego jako 15392 w stezeniu 28 |Ag/ml i przy uzyciu zwiazku oznaczonego jako 15410 w stezeniu 54 \ig/ml. Zdolnosc do hamowania limfocytów bialaczkowyeh w stezeniach, które po* budzaja zwykle limfocyty jest wlasciwoscia jedyna124 515 17 CS Ó fi O ca E N cd 3 i—i Maksyma *tf Ci SJ hn » •* crt* £ N -OT «H tt fi 3 W 'N "O . «tf o 1 H O 1 o «J C N* " i ¦r?-^ ».i ! i ^ •- a N ; h &•- -¦ &X* - KS S g£ Q. S w TJ Ph ' 3 W' M S o 1 1 o o o o o o 1—I 1 S lir 11 * ¦8*1 OT £ Cff o •£ -o m on f 5 Q o i o o r 1 o 1—1 o *H ^ ^ Z CO oi-g si-s 3*" 'ó 3 ^ C T3 N ^.5 a 1—l o i-H 1 o" lx X «...K « '¦aa- IB N£ a o o o i-H [ 1 O i-H i-H 1 W O w w lO 9 i?5 O lO 1 9 lO < O < Ph Oh HH A W O W W 00 <# Ift O o o o o O o CM iH I ffi O W O M CD *tf ^ ift O O M + O co O t- C* t- CM fc- iH | W O w «0 o co ^ "tf m o 1 r-l 1 o o o o o [ w O W w W co u r~ i-i tf lO ,¦ o 1 8 CSI i-l «P CO. t l—l ^ < to o < Ph Oh h-H Q W O w M w u co 1—1 Tf m co co co o 10 1 o SM 1—1 1 1—1 T-H I 1 csi cp i-H t r~i y \ W 0 CS w u « w u (M C55 CO m co M tH S O P 9- ° "* iH < o ^ Ph Dh" w Q W 0 M W u M W CC <= ] 1—1 1 ^ Ift li Tablica 8 ie 21 25 30 35 49 SD 60 «5 Zwiazek Nr NPT 15392 15410 15-117 i 15418 % pobudzenia przy stezeniu badanego zwiazku w jjg/ml i 0,01—1,0 1 1,0—19 50% 50% 0 20-30% 30—50% 30—50% 0 50% 10—100 100 ' 30—50% 30—50%- 0 20—30% nie badano nie badano 0 nie badano w swoim rodzaju, niespotykana dotychczas w zad¬ nej innej klasie substancji tego rodzaju.Zwiazki wytworzone sposobem * wedlug wyna¬ lazku naleza do klasy zwiazków, które specyficz¬ nie hamuja replikacja wirusów RNA i DNA, re¬ guluja (wzmacniaja wzrost limfocytów bialaczko- wych).W oparciu o badania in vitro, w których wy¬ kazano aktywnosc w zakresie stezen od 0,01— 150 ng/ml, skuteczna dawke u ssaków okreslono jjko 0,05—500 mg/kg. Zaobserwowano brak to¬ ksycznosci przy poziomie 1,5 mg/kg u myszy dla pewnej liczby zwiazków tej serii.Wzmacniacze odpowiedzi immunologicznej otrzy¬ mane sposobem wedlug wynalazku moga byc za¬ stosowane np. do zapewnienia odpornosci prze¬ ciwko inwazji wirusów podanych w tablicy 9.Tablica 9 Wirus 1 1 Arenawirus 1 Influenza Rhinowirus Poliwirus Menslos Wirus choroby Newcastles Rotawirus Hepatitis Typ A Wirus wscieklizny Arbowirus Vaccinia wirus Herpes Simplex wirus Herpes Zoster Varicella Zoster Adenowirus Hepatitis Typ B Wirud pryszczycy Klasa 2 RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA RNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA DNA Choroba 3 Goraczka. Rift Valley Grypa Przeziebienie POLIO Rózyczka Choroba Newcastles Zapalenie zoladka i jelit Zapalenie watroby Wscieklizna Zapalenie mózgu Ospa Zapalenie mózgu, choroby weneryczne Pólpasiec Ospa kurza Zapalenie dróg oddechowych Zapalenie watroby chroniczne i ciezkie Pryszczyca |124 515 i* Wzmocnienie przez Dip.PaCBA biologicznych aktywnosci; Zwiazki NPT 15392 i NPT 15417 po¬ siadaja same w sobie znaczaca aktywnosc przeciw- grypowa. W jednym przypadku (z NPT 15392) do¬ danie DIP.PAcBA soli do NPT 15392 z utworze¬ niem zwiazku NPT 1,5410 nie wzmaga aktywnosci przeciwgrycowej. W przypadku zwiazku NPT 15417, dodanie Dip.PAcBa soli z utworzeniem zwiazku NPT 154118 wzmaga aktywnosc przeciw- grypowa. Sumaryczne zestawienie wzglednych zdolnosci DIP.PAcBA soli do wzmagania róznych aktywnosci biologicznych przedstawiono ponizej w tablicy 10.Zwiazek NPT numejr 15392 li5417 15446 15443 Sól DIP.PAcBA NPT numer 15410 15418 15447 15444 Tablica- Przeciwgrypowa Obie sa równo aktywne tak -tak tak 10 Wzmocnienie przeciwbialaczkowe tak . Wzmocnienie odpo¬ wiedzi immunolo¬ gicznej tak tak Traktowanie myszy zwiazkami oznaczonymi jako NPT 15392 i 15410: wplyw na stymulacje in vitro proliferacji komórek sledziony pod wplywem Con- kanowaliny A. Celem tych badan bylo okreslenie efektów leczenia in vivo myszy zwiazkami ozna¬ czonymi jako NPT 15392 i NPT 15410 na nastepna aktywnosc splenocytów wyizolowanych z tych zwierzat i ocena in vitro ich proliferacji w odpo¬ wiedzi na mitogen Conkanawaline A {Gon A).Sposób postepowania. Leczenie in vivo. Dziewiec 8—9-tygodniowych samców myszy szczepu Balb/C o ciezarze 18—20 g podzielono na trzy podgrupy.Jednej z nich podawano 2 razy dziennie {w ciagu jednego dnia) rano i po poludniu doustnie zwiazek NPT 15392 w dawce 10 mg/kg. Druga podgrupe traktowano podobnie zwiazkiem NPT 15410 w daw¬ ce 20 mg/kg. Trzecia podgrupa otrzymywala sól fizjologiczna i sluzyla jako próba kontrolna (po¬ równawcza).Badanie splenocytów in vitro: przygotowanie komórek. Nastepnego dnia, kazda podgrupe zabi¬ jano, usuwano sledziony i zbierano w obrebie pod¬ grup. Sledziony rozdrabniano, a komórki uzyskane przemywano pozywka RPMI-1640 (GIBCO) uzupel¬ niona 2 mm glutaminy i antybiotykami. Oznaczono stezenie komórek w kazdym preparacie w liczniku Coulter i doprowadzono do 5X166 komórek/ml po¬ zywka RPMI.Próba mikromiareczkowa na plytce. Próby mikromiareczkowe przeprowadzano w objetosciaeh 0,2 ml, zawierajacych 5X105 komórek i Con A lub Con A i badane zwiazki w podanych stezeniach.Wszystkie próby przygotowano w szesciokrotnych powtórzeniach i porównywano ze slepa próba za¬ wierajaca tylko komórki. Plytki inkubowano w temperaturze 37° w atmosferze 5% C02 w ciagu 4 dni. W ciagu ostatnich 18—20 godzin inkubacji do studzienek dodawano 0,5 ml 3HTdR (10 \iOifiml, 6 Ci(mmol). Z hodowli pobierano próbki automa¬ tycznym zestawem do pobierania próbek (MASH) i oznaczano wbudowana radioaktywna tymidyne H3TdR przy uzyciu licznika scyntylacyjnego Beck- mana typu LS 8000 jako miare proliferacji ko¬ mórek. Wyniki podawano tabelarycznie jako sto- 15 35 40 45 50 15 sunek aktywnosci proliferacyjhej uzyskanej dla hodowli zawierajacych Con A lub Con A plus badane zwiazki w odniesieniu do slepej próby.Podawanie in vivo zarówno zwiazku NPT 15392 jak i NPT 15410 wzmaga nastepujaca odpowiedz splenocytów w warunkach hodowli in vitro na Con A przy suboptymalnym stezeniu mitogenu (5 fig/ml). I tak zwiazek NPT 15410 powoduje wzrost pobudzenia proliferacji w stosunku 100:1 w porównaniu 55:1 dla próbki kontrolnej. Nie zaobserwowano istotnych róznic w pobudzaniu proliferacji zwiazkami NPT H5392 i NPT 15410 gdy stezenie mitogenu Con A bylo optymalne (10 |ig/ml).Badano takze efekt nastepstwa, traktowania in vitro zwiazkami NPT 15392 i NpT 15410 w steze¬ niu 1 n-g/ml na pobudzenie komórek przez Con A.Oba zwiazki wykazaly wzmozenie pobudzenia pro¬ liferacji przez Con A zwlaszcza w isuboptymalnym stezeniu mitogenu (5 jig/ml) i w mniejszym stopniu w stezeniu 10 fig/mL Przy stezeniu Con A wyno¬ szacym 5 lxg/ml, stymulacja zwiazkiem NPT 15392 byla 2,8 razy wyzsza niz przez sama Con A, a zwiazkiem NPT 15410 byla 3,3 razy wyzsza.Te wyniki wskazuja na immunoregulacyjne dzia¬ lanie tych zwiazków w procesie proliferacji spleno¬ cytów. Uprzednie traktowanie zwierzat zwiazkami uczulajacymi komórki w celu nastepnego stymulo¬ wania ich mitogenem podczas eksponowania ko¬ mórek in vitro na dzialanie wymienionych zwiaz¬ ków nastepna stymulacja .mitogenem wzmaga odpo¬ wiedz proliferacyjna szczególnie w warunkach gdy odpowiedz na sam mitogen jest niska.Zwiazki wytworzone sposobem wedlug wyna¬ lazku mozna podawac doustnie ssakom w dawce 1—1000 mg/kg wagi ciala. Wykazuja one aktyw¬ nosc na poziomie tak niskim, jak 0,05 mg/kg wagi ciala. LD50 oznaczone u myszy przy podaniu do¬ otrzewnowym zwiazku 15410 wynosi 4,300 mg/kg, natomiast przy podaniu podskórnym wynosilo 4,900 mg/kg. Zwiazek 1539i2 podawany myszom w dawce 1000 mg/ kg nie powodowal smiertel¬ nosci. Zwiazki te moga byc podawane w postaci tabletek lub kapsulek ludziom, a jezeli pozwala na to rozpuszczalnosc — w formie syropów lub124 5 21 roztworów injekcyjnych lub nierozpuszczalnych zawiesin. ^ Typowe tabletki lub kapsulki zawieraja 50— 500 mg zwiazku wytworzonego sposobem wedlug wynalazku oraz znane adjuwanty, stosowano • w farmacji.Wodne zawiesiny mozna przygotowywac z sze¬ regu srodków suspendujacych i substancji czynnej leczniczo. Srodkami suspendujacymi moga byc substancje takie jak karboksymetoloceluloza s- *• dowa, alginiali sodu, guma tragankowa, Avicel RC-591 (mikroceluloza), metyloceluloza, guma ksantanowa, guma Vee (Veegum). Oprócz tego moza dodawac substancje smakowe, zapachowe, barwiace, zabezpieczajace, konserwujace i srodki i* ulatwiajace utrzymanie zawiesiny.Sposób wedlug wynalazku jest blizej wyjasniony w ponizszych przykladach wykonania, przy czym w przykladach I i II podano sposoby wytwarza¬ nia zwiazków o wzorze l, w którym z oznacza 0 w a w przykladzie III sposób przeprowadzania zwiaz¬ ków o wzór z ^ 1, w którym z oznacza 0 w kom¬ pleksy o wzorze 1, w którym z oznacza wartosc liczbowa 1—10. O ile nie zaznaczono inaczej, wszystkie czesci podano jako czesci wagowe a tern- tf perature w °C.P rz y k l a d I. Wytwarzanie 9-(hydroksyetylo)- -hipoksantyny (NPT 15425). Przebieg rekaeji przed¬ stawiono na schemacie 1.Wykorzystuje sie metoda hydrolizy Schaeffera w H.J. i Bhargava P.S., Biochemistry 4, 71 (1965). 6-chloro-9-hydroksyetylopuryne (4 g) dodaje sie powoli do goracego IN NaOH (30 ml) i ogrzewa w ciagu 2 godzin w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrotna. Mieszanine reakcyjna chlodzi M sie w lodzie i neutralizuje lodowatym kwasem octowym. Po przesaczeniu oddziela sie nieprzerea- gowana czesc substratu. Produkt przekrystalizowujc sie z metanolu i przemywa acetonem. Otrzymuje sie bezbarwne krysztaly w ilosci 1 g (wydajnosc 49 28%), o temperaturze topnienia 274°. Widmo w ultrafiolecie (H20, pH 5,5) A,max 250 nm.Przyklad II. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydro- ksynonylo-3)hipoksantyny; (NPT 15392).Synteze erytro-9-(2-hydroksynonylo-3)hipoksanty- -4B ny (Nonylohypoksantyna) pokazano na schemacie 2.Stanowi on ulepszenie w stosunku do metody Schaeffera H. J. i Schwendera C. F., J. Med. Chem. 17() (1974) prowadzacej do powstania erytro-9-(2- -hydroksynonylo-3)-6-chloropuryny. ¦• Wyjsciowa erytro-9-(2-hydroksy-3-nonylo) ade¬ nine wytwarza sie w wieloetapowej syntezie przedstawionej na schemacie 2 (etapy 1—5) wy¬ chodzac z kwasu 1-aminokaprylowego. Liczby pod strzalkami na schemacie 2 oznaczaja wydajnosc H reakcji.Etap 1. Wytwarzanie 3-acetamidononanonu-2.Mieszanine kwasu 1-aminokaprylowego (200 g, 1,26 mola) i bezwodnika octowego (960 ml) oraz pirydyny (640 ml) ogrzewa sie na lazni z wrzacej *3 wody w ciagu 4 godzin. Mieszanine reakcyjna od¬ parowuje sie pod zmniejszonym cisnieniem, a po¬ zostalosc ekstrahuje 6—8 razy 5% wodnym roz¬ tworem NaHC03 (400 rnl) i eterem 400 ml). Po¬ laczone ekstrakty eterowe suszy sie bezwodnym • MgS04 i odparowuje do sucha, otrzymujac 154 g (70%) surowego 3-acetamidononanonu-2.Etap 2. Wytwarzanie chlorowodorku 3-amino- nonanonu-2.Surowy 3-acetamidononanon-2 otrzymany jak opisano w etapie 1, (154 g) rozpuszcza sie w stezo¬ nym wodnym rcztworze HC1 {1540 ml) i ogrzewa w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 2 godzin, a n:;stepnio odparowuje do sucha pod zmniejszonym cisnieniem. Powstala stala substancje przekrystalizowuje sie z cieplego roztworu w etanolu (200 ml), a nastepnie ochladza sie do temperatury 25° i dodaje eter (600 ml).Wytraca sie krystaliczna stala substancja bialej barwy, która pozostawia sie. w ciagu nocy w tem¬ peraturze 5°C. Wytracona substancje odsacza sie i przemywa raz eterem (100 ml), otrzymujac 125 g (67%) krystalicznego produktu bialej barwy, topnie¬ jacego z rozkladem w temperaturze 112°C.Gdy krystaliczny produkt nie ma bialej barwy lub topi sie w nizszej temperaturze, nalezy poddac go rekrystalizacji z tetrahydrofuranu z uzyciem wegla aktywnego. W jednym takim zabiegu uzyto 150 ml hydrofuranu na 100 g surowego chlorowo¬ dorku.Etap 3. Wytwarzanie erytro-3-aminononanolu-2.Chlorowodorek 3-aminononanolu-2 (43,8 g 0,226 mola rozpuszcza sie w absolutnym metanolu (150 ml) i ochladza w kapieli z lodu z sola do tem¬ peratury — 10° (1). W ciagu 2—3 godzin dodaje sie w malych porcjach borowodorek potasu (2). Miesza¬ nine pozostawia sie w temperaturze od —10° do — 15° w ciagu 3 godzin (3,4), po czym pozwala jej powoli osiagnac temperature pokojowa (22°), a na¬ stepnie poddaje sie ja mieszaniu w ciagu nocy (20 godzin) w temperaturze pokojowej. Nastepnie mieszanine odparowuje sie do sucha (syrop) pod zmniejszonym cisnieniem i ekstrahuje H20 (150 ml) i chloroformem d!50 ml). Warstwe wodna poddaje sie, dalszej ekstrakcji (3X) chloroformem (100 ml za kazdym razem). Warstwe chloroformowa suszy sie MgS04 i odparowuje pod zmniejszonym cisnie¬ niem, otrzymujac oleisty produkt lekko zóltawej barwy. Ciecz te poddaje sie destylacji podbardzo niskim cisnieniem w temperaturze 95°—100° (20 Pa) otrzymujac czysty arytro-3-amiriononariol-2, w ilosci 26,4 g, z wydajnoscia 75%, o temperaturze topnienia 81—86°. 1. W czasie chlodzenia roztworu chlorowodorku 3-aminononanonu-2 wytraca sie nieco substancji, co nie ma wplywu na przebieg reakcji. 2. W tym punkcie tok postepowania rózni sie od przyjetego przez Schaeffera i wspólpracowników.Schaeffer dodaje kwas octowy razem z KBH4, utrzymujac pH 5—6. Stwierdzono, ze zobojetnienie pociaga za soba straty KBH4 oraz, ze pH po¬ wyzej 5 nie jest szkodliwe. Wazniejszy jest fakt, ze równoczesne dodawanie kwasu octowego i KBH4 (co proponuje Schaeffer) bardzo utrudnia kontrole reakcji. Temperatura znacznie wzrasta, a wydaj¬ nosc i/lub jakosc produtotu ulegaja pogorszeniu. 3. Zaleca sie stosowanie intensywnego mieszania dla zapewnienia prawidlowego przebiegu reakcji, która dobiega konca gdy znikna wszystkie male kawalki i czastki borowodorku potasu.124 515 Z3 U 4. Chlodzenie w temperaturze 0°, jak to opisali Schaeffer i wspólpracownicy (Biochemistry 4, 71 {1965) jest niewystarczajace. Ulepszenie polega na utrzymywaniu temperatury reakcji znacznie po¬ nizej 0°, najlepiej przez caly czas ponizej —10°.Gdy dopusci sie do wzrostu temperatury powyzej — 10°, wydajnosc moze sie powaznie zmniejszyc.Etap 4. Wytwarzanie erytro-5-arnino-4-ehloro-6- -(2-hydroksynonyloamino-3)pirymidyny.Sporzadza sie mieszanine 4,6-dwuchloix)-5-amino- -pirymidyny (24,6 g, 0,15 mola) i erytro-3-airiino- nonanolu-2 (26,2 g, 0,164' mola) w pentanolu-1 (1080 rnl) i trójbutyloaniinie (350 ml) mieszajac skladniki w temperaturze 25°. Powstala zawiesine ogrzewa sie w atmosferze azotu w temperaturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 28 godzin (roztwór powstaje po uplywie okolo 0,5 godziny).W tym czasie wartosc ^max w widmie UV próbk: produktu rekacji wynosi 267 i 297 nm (H2C, pH 5,5).Powstaly roztwór zateza sie na lazni z goraca woda pod cisnieniem 1333,22 Pa do konsystencji syropu, po czym odparowuje dalej na lazni olejo wej w temperaturze 100° i pod cisnieniem 13,33 Pa, otrzymujac lepka ciecz, do której dodaje sie n-heksan (450 ml). Mieszanine ogrzewa sie w tem¬ peraturze wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 1 godziny, po czym od cieczy na dnie okragloden- nej kolby oddziela sie górna warstwe cieczy zawie¬ rajacej heksan, zabarwiona zólto., Otrzymany jasnobrazowy olej, z którego odparo¬ wano pod zmniejszonym cisnieniem wszelkie po¬ zostalosci heksanu, rozpuszcza sie w chloroformie (150 ml). Roztwór chloroformowy poddaje sie osmiokrotnie ekstrakcji nasyconym wodnym roztwo¬ rem NaHCO (250 ml za kazdym razem). Warstwe chloroformowa oddziela sie, suszy (za pomoca siar¬ czanu sodowego lub magnezowego) i odparowuje pod bardzo niskim cisnieniem (13,32 Pa) w tempe¬ raturze 40° (laznia wx)dna), otrzymujac olej jasno- brazowej barwy; który zestala sie po ochlodzeniu.Substancje te mozna stosowac bezposrednio w na¬ stepnym etapie lub oczyszczac w nastepujacy spo¬ sób. Powstaly olej rozpuszcza sie w 75—ilOO ml chloroformu i dodaje n-heksanu (okolo 300 ml) w celu wytracenia krystalicznej substancji stalej o bialej barwie, która odsacza sie z ochlodzonego roztworu. (Ekstrakcje prowadzi sie 4—8 razy, az przestaje sie wydzielac dwutlenek wegla). Ten tok postepowania powtarza sie dwukrotnie. Wydajnosc: 23,3 g (54%), widmo UV: Xmax 267, 297 (H20, pH 5,5), temperatura topnienia 113—116°.Etap 5. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksynoiiylo- -3)6-chlóropuryny.Surowy syrop otrzymany jak opisano w etapie 4, zawierajacy arytro-5-amino-41chloro-6-(2-hydiroksy- nonyloamino-3)pirymidyne (11,48 g, 40 milimoli) rozpuszcza sie w ortornrówczanie etylu (106 ml) i dodaje chloroform (34 ml) oraz kwas etanosul- fonowy (10 kropli). Roztwór pozostawia sie w ciagu nocy w temperaturze 25°, a nastepnie odparowuje pod zmniejszonym cisnieniem do konsystencji sy¬ ropu. Wydajnosc 11,7 g (ilosciowa). Syrop ten, który stanowa surowa erytro-9-(2-hydroksynonylo- -3)-6-chloropuryna uzywa sie w nastepnym etapie. *max 264 nm- Etap 6. Wytwarzanie erytro-9-(2-hydroksynonylo- -3)-hypoksantyny.B Zawiesine erytroj9^(2-hydroksynonylo-3)-6-chlorO'- -puryny (4,0 g, 13,4 milimoli) w 0,5 N NaOH (40 ml) ogrzewa sie w warunkach wrzenia pod chlodnica zwrotna w ciagu 2 godzin, a nastepnie ochladza. W wyniku neutralizacji lodowatym kwa- 10 sem octowym i ochlodzenia otrzymuje sie krysta¬ liczny osad erytro-9-(2-hydroksynoiiylo-3)-hypo- ksantyny, który odfiltrowuje sie i suszy. Wydaj¬ nosc: 3,8 g (ilosciowa), temperatura topnienia 196°, widmo w ultrafiolecie ^max 25.1 urn (pH 5„5). 13 Tak otrzymany surowy produkt bada sie na homogenicznosc metoda chromatografii bibulowej (3 roztwory) uzyskujac negatywny wynik na tesl na Cl- (drut miedziany i plomien; stapianie z sodem, zakwaszanie i azotyn srebrowy). 20 Trzykrotne przekrystalizowanie próbki surowego produktu z roztworu etanolu daje bezbarwne kry¬ sztaly o temperaturze topnienia 202°C.Wynik analizy dla C^Hg^C^: 25 obliczono: C 60,41, H 7,97, N 20,13, oznaczono: C 60,47, H 7,86, N 20,08.Oczyszczanie erytro-9-(2-hydroksynonylo-3)-hypo- ksantyny. Surowa nonylohipoksantyne oczyszcza 59 sie droga rekrystalizacji. Surowa substancje roz¬ puszcza sie przez ogrzanie z 6—10-krotnym wago¬ wym nadmiarem alkoholu etylowego, po czym do¬ daje sie wode w ilosci równej pod wzgledem obje¬ tosci. Roztwór poddaje sie w kolbie Erlenmeyera 35 dzialaniu wegla aktywnego i przesacza na goraco przez celit, po czym odparowuje przy ciaglym mieszaniu na goracej plytce., Dla zastapienia od¬ parowujacej cieczy dodaje sie malymi porcjami wode do chwili pojawienia sie duzej ilosci wy- 40 tracajacej sie substancji. Odparowanie rozpuszczal¬ nika w celu odpedzenia alkoholu etylowego pro¬ wadzi sie nadal, dodajac H20 do osiagniecia obje¬ tosci odpowiadajacej 8—12-krotnej wadze substan¬ cji. W kazdym zabiegu rekrystalizacji strata sub- ii stancji wynosi okolo 10%. Dwa zabiegi rekrystali¬ zacji powoduja wzrost temperatury topnienia do 202°, przy czyrn otrzymuje sie bezbarwny produkt krystaliczny, podczas gdy produkt surowy ma za¬ barwienie nieco zólte lub rózowe i topnieje w tem- M peraturze 192°.Przyklad III. Wytwarzanie kompleksu 9-(2- -hydroksynonylo-3)-6-hydroksypuryny (oznaczonego symbolem NPT ,15410). 0,1 mmoli 9-(2-hydroksynonylo-3)-6-hyajroksypu- u ryny (NPT 15392) (27,6 mg) i 0,3 mmoli 4-(acetylo- amino)benzoesanu dwumetylo-2-hydroksypropylo- amoniowegO' (DIP.PAcBA) (77,1 mg) odwaza sie dokladnie i rozpuszcza w 105 ml 25% weglanu sodu (Na2C03), otrzymujac 0,1% roztwór NPT 15410 •• (zwiazek powstaly z NPT 15392 i DIP.PAcBA w stosunku molowym 1:3). Zwiazek ten po wykry¬ stalizowaniu ma temperature topnienia 198°C.Postepujac jak opisano wyzej i stosujac równo¬ wazne ilosci zwiazku wyjsciowego, otrzymuje sie *5 nastepujace kompleksy:25 124 515 26 9-(2-hydroksy-l-propylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony jako NPT 15447) o temperaturze top¬ nienia 142°C,' 9-(l-hydiroksy-2"propylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony juko NPT 15414) o temperaturze topnie¬ nia 150°C, 9-(l-hydroksy-2-oktylo)hipoksantyna. DIP.PAcBA (oznaczony j-ako NPT 154-18) o temperaturze top- nia 20onC, • 9-(l-bydroksy-2'etylo)hip'jkii:intyna. DIP.PAcBA (oznaczany jako NPT 15428) o temperaturze topnie¬ nia 205°C.Dowód na powstanie kompleksu. Badania roz¬ puszczalnosci fazowej, prowadzone z NPT 15392 i DIP.PAcBA wykazaly, ze NPT 15392 posiada zwiekszona rozpuszczalnosc przy zwiekszajacych sie stezeniach DIP.PAcBA. w warunkach zachowa¬ nia stalej wartosci PH. Jest to dowodem^wskazu- jacym na powstawanie kompleksu w roztworze.Przy uzyciu innych stosunków molowych niz 1:3 (NPT 15392 i DIP.PAcBA), takich jak 1:1 i 1:10, powstaja inr? kompleksy.Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wytwarzania nowych zwiazków kom¬ pleksowych 6-p'odstawionycli 9-(hydroksyalkilo)- X hc-ch-r2 i i R1 OH Wzór i 25 -puryn o wzorze ogólnym 1, w którym X oznacza grupe -OLI, R1 oznacza atom wodoru lub rodnik alkilowy o 1—8 atomach wegla, R2 oznacza atorn wodoru lub grupe metylowa, Y oznacza sól aminy o wzorze 2, w którym IV i R4 oznaczaja nizsze rodniki alkilowe, n oznacza liczbe calkowita 2—4, z kwasem p-acetamidobenzoesowym lub tez innym, stosowanym w takich przypadkach, farmaceutycz¬ nie dopuszczalnym kwasem, a z oznacza liczbe 1—10, znamienny tym, zo grupe -OH wprowadza sie w pozycji 6 do odpowiedniej 9-podstawionej 6-chloropuryny o wzorze 5, w którym X oznacza atom chloru, przez hydrolize w roztworze alkalicz¬ nym, w warunkach ogrzewania, po czym sporzadza sie mieszanine zwiazku i soli Y w stosunku molo¬ wym 1:1 do 1:10, która rozpuszcza sie i powstaly kompleks wydziela z roztworu. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 9-podsta wiona puryne o wzorze 6, w którym Rj korzystnie oznacza grupe n-heksylowa, a pozostale podstawniki maja znacze¬ nie jak w zastrz. 1. 3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako substrat stosuje sie 9-podstawiona puryne o wzorze 6, w którym Ra korzystnie oznacza grupe metylowa, a pozostale podstawniki maja znaczenie jak w zastrz. 1.R: R4' R5 R6' X j(CnH2n)a U W2ór Z N(CnH2n)0H Wiór 3 HC-CH-R2 i i R1 OH Wzór 4 fjC-CH-R- R1 OH Wzór 5, 124 515 Ci OH N'YH\ ^ Nq0H , WN^ Ch2-ch2oh Ch2-ch2oh Schemat i 2_ap_l (CH3C0)20 CH3-[CH2]5-CH-C00H —^rCH3-[CH2]5- CH2-C0CH3 J„1 ' /U/o 1 NH2 NH2 —P— '-, Hfl CH3-[CH2]5-CH-C0CH3-^~r-CH3- [CH2]5-CH -COCH3 Etap3 NHz NH2-HCI CH3-[CH2]5-CH-C0CH3-^Fo7:"CH3-rCH2]5-CH-CH-CH3 rt , NH2-HCI ° r. NH2ÓH M^yNH, [CH2]5 _ t^NH* Vxi CH-NH2 54% N W CHOH ~.. ,--..^chL CH3-[CH2]6 CHOH Etgp_5 CH3 pij Schemat 2 UM3 Cl Cl V^H 100% TTN^ CH CH CH3-[CH2]5 CHOH CH3_[CH2]5 CH0H topi CH3 ¦ CH: 3 Cl • OH OH" \fY\ -^- rW Vn\K 100% SAlT CH ,CHx CH3-[CH2]5 NCH0H [CH2]5 ^CHOH CH3 - Chb CH3 Schemat 2 ccf.LZGraf. Z-d Nr 2 — 1403/86 85 egz. A4 CtBftlMil / PL PL PL PL PL PL PL PL PL