CZ2009298A3 - Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický prípravek tyto slouceniny obsahující - Google Patents

Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický prípravek tyto slouceniny obsahující Download PDF

Info

Publication number
CZ2009298A3
CZ2009298A3 CZ20090298A CZ2009298A CZ2009298A3 CZ 2009298 A3 CZ2009298 A3 CZ 2009298A3 CZ 20090298 A CZ20090298 A CZ 20090298A CZ 2009298 A CZ2009298 A CZ 2009298A CZ 2009298 A3 CZ2009298 A3 CZ 2009298A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
amino
mercapto
chloro
fluoro
methyl
Prior art date
Application number
CZ20090298A
Other languages
English (en)
Inventor
Szücová@Lucie
Kryštof@Vladimír
Zatloukal@Marek
Doležal@Karel
Strnad@Miroslav
Original Assignee
Univerzita Palackého v Olomouci
Biopatterns, S. R. O.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univerzita Palackého v Olomouci, Biopatterns, S. R. O. filed Critical Univerzita Palackého v Olomouci
Priority to CZ20090298A priority Critical patent/CZ2009298A3/cs
Priority to PCT/CZ2010/000061 priority patent/WO2010130233A1/en
Priority to EP10736593.4A priority patent/EP2430036B1/en
Priority to US13/320,396 priority patent/US20120071433A1/en
Publication of CZ2009298A3 publication Critical patent/CZ2009298A3/cs
Priority to US14/047,573 priority patent/US20140066394A1/en

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/143—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with inorganic compounds
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/145—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/141—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers
    • A61K9/146—Intimate drug-carrier mixtures characterised by the carrier, e.g. ordered mixtures, adsorbates, solid solutions, eutectica, co-dried, co-solubilised, co-kneaded, co-milled, co-ground products, co-precipitates, co-evaporates, co-extrudates, co-melts; Drug nanoparticles with adsorbed surface modifiers with organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/485—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4858—Organic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/4841—Filling excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/4866—Organic macromolecular compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
    • C07H19/04—Heterocyclic radicals containing only nitrogen atoms as ring hetero atom
    • C07H19/16—Purine radicals
    • C07H19/167—Purine radicals with ribosyl as the saccharide radical

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

Rešení se týká substituovaných 6-benzylaminopurin ribosidu obecného vzorce I, kde obecné symboly mají specifický význam, a jejich úcinku jako faktoru pro prežití neutrofilu. Tyto slouceniny mají antiapoptické, protizánetlivé a diferenciacní úcinky. Rešení se dále týká použití uvedených sloucenin a farmaceutické kompozice tyto slouceniny obsahující.

Description

Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický přípravek tyto sloučeniny obsahující
Oblast techniky
Vynález se týká substituovaných 6-benzylaminopurin ribosidů a jejich použití jako antiapoptotických a protizánětlivých faktorů neutrofilů a farmaceutických přípravků tyto sloučeniny obsahujících.
Dosavadní stav techniky
Neutrofílní granulocyty, zkráceně označované jako neutrofily, jsou nejpočetnějším typem bílých krvinek a tvoří nedílnou součást imunitního systému. Jejich název je odvozen od charakteristického zbarvení na hematoxylinových a eosinových (H&E) histologických preparátech. Zatímco bazofilní částice se barví tmavě modře a eosinofilní komponenty jasně červeně, neutrofílní částice zůstávají neutrálně fialové. Tyto fagocyty se běžně nachází v krevním řečišti. Avšak během akutní fáze zánětu, zejména jestliže je způsoben bakteriální infekcí, neutrofily opouštějí cévy a migrují směrem k místu zánětu při procesu zvaném chemotaxe. Jsou převládajícími buňkami v hnisu, zodpovědné za jeho bělavý/žlutavý vzhled. Neutrofily reagují během hodiny od poškození tkáně a jsou charakteristickým znakem akutního zánětu (Cohen, Stephen. Bums, Richard C. Pathways of the Pulp, 8th Edition. St. Louis: Mosby, Inc. 2002. str. 465). Průměrná poloviční životnost neaktivovaných neutrofilů při cirkulaci je kolem 4-10 hodin. Po aktivaci marginalizují (umisťují se na hranici cévního endothelia), podstupují na selektinu závislý záchyt následovaný na integrinu závislou adhezí a poté migrují do tkání, kde přežívají další 1-2 dny. Neutrofily jsou mnohem početnější než déle žijící monocyty/makrofágy. Neutrofil je tak první fagocyt, se kterým se patogen (mikroorganismus způsobující onemocnění) pravděpodobně setká. Někteří odborníci se domnívají, že krátká životnost neutrofilů je evoluční adaptací pro minimalizaci množení těch pato genů, kteří parazitují na fagocytech. Čím více času takový parazit stráví mimo hostitelskou buňku, tím je větší pravděpodobnost, že bude zničen některou ze složek obranného mechanismu těla. Avšak, protože antibakteriální produkty neutofilů mohou také poškodit tkáň hostitele, jiní odborníci se domnívají, že důvodem jejich krátké životnosti je snaha o omezení poškození hostitele během zánětu. Neutrofily jsou fagocyty schopné přijmout mikroorganismy nebo částice. Mohou pohltit a usmrtit mnoho mikrobů, každý fagocytický děj má za následek vznik fagozomů, do kterých jsou vylučovány reaktivní kyslíkové radikály a hydrolytické enzymy. Spotřeba kyslíku během tvorby reaktivních kyslíkových radikálů byla nazvána respirační vzplanutí, i když vlastně nemá nic společného s respirací nebo s produkcí energie. Toto respirační vzplanutí zahrnuje aktivaci enzymu NADPH oxidázy, která produkuje velké množství superoxidu, reaktivního kyslíkového radikálu. Superoxid se přeměňuje, spontánně nebo za katalýzy enzymem katalasou, na peroxid vodíku, který se následně přeměňuje na kyselinu chlomou (HC1O, také známou jako chlomé bělidlo) zeleným hemem enzymu myeloperoxidázy. Je pravděpodobné, že baktericidní vlastnosti HC1O jsou dostatečné k usmrcení bakterií fagocytovaných neutrofilem, ale dosud to nebylo jednoznačně prokázáno.
Nízký počet neutrofilů je označován jako neutropenie. Může být vrozená (dědičná porucha) nebo se může objevit později, jako následek aplastické anémie nebo u některých druhů leukémie. Může být také vedlejším účinkem léčby, zejména pak chemoterapie. Neutropenie činí organismus velmi náchylným k infekci. Konečně, neutropenie může být výsledkem kolonizace intracelulámími neutrofilními parazity. Poruchy funkce neutrofilů jsou často dědičné. Termín neutropenie je definován jak stav, kdy dochází k poklesu cirkulujících neutrofilů na méně než 1,5 x 109/1. Neutropenie může být klasifikována dle mechanismu jejího vzniku do několika základních tříd. Může se jednat o neutropenii způsobenou sníženou produkcí neutrofilů, poruchy či změny v uvolňování z endoteliálních buněk či tkáňových zásobáren a dále o zvýšený zánik a destrukci neutrofilů. Klinický projev neutropenie představuje zvýšená možnost infekčních komplikací. Tíže těchto infekčních komplikací je závislá na kvantitativním a v některých případech i kvalitativním defektu neutrofilů, který bývá v rámci revmatických chorob často způsoben cirkulujícími protilátkami proti neutrofilům na různé úrovni jejich vývoje. Neutropénie se může vyskytovat u pacientů se systémovým autoimunním onemocněním - lupus erytematodes, Feltyho syndromem, při autoimunní hemolytické anémií nebo imunní trombocytopénii, Sjogrenově syndromu. Onemocnění je způsobené autoprotilátkami proti specifickým antigenům neutrofilů. Jedná se o poruchy fagocytózy nebo respiračního vzplanutí (jako např. chronická granulomatóza, vzácná porucha imunity, a nedostatek myeloperoxidázy). Při nedostatku alfa 1-antitrypsinu je elastáza, důležitý enzym neutrofilů, nedostatečně inhibována alfa 1-antitrypsinem, což vede k nadměrnému poškození tkáně v případě infekce - zejména rozedmy plic. Dědičná familiární středomořská horečka (FMF) je autosomálně recesivní onemocnění postihující převážně populaci kolem Středozemního moře. Nemocní trpí periodickou horečkou doprovázenou serozitidami a artritidou, pozdní komplikací je rozvoj amyloidózy. FMF je způsobena mutací genu kódujícího bílkovinu pyrin/marenostrin (16. chromozom), který je exprimován zejména v neutrofílech a projevuje cyklické kolísáním počtu neutrofilů leukocytů v periferní krvi. Pyrin je fylogeneticky velmi starý protein s nespecifickým protizánětlivým účinkem. Vyskytuje se výlučně v periferních polymorfonukleárech a v mutované formě není schopen inhibovat běžné nežádoucí zánětlivé popudy, což je podstatou vzniku horečnatých atak FMF. Dalším onemocněním způsobeným neutrofily jsou vaskulitidy. Vaskulitidy jsou heterogenní skupina onemocnění, charakterizovaná nekrotizujícím zánětem cév, který vede k poruše prokrvení oblasti zásobované příslušnými cévami. V patogenezi se uplatňuje několik mechanismů: (a) imunokomplexy a jimi spuštěná zánětlivá reakce - v tkáních depozita imunokomplexů a C3 složky komplementu, (b)autoprotilátky proti lyzosomálním enzymům neutrofilů (tzv. ANCA - Anti Neutrophil Cytoplasmic Antibodies) - stimulují neutrofily k produkci kyslíkových radikálů a sekreci lyzosomálních enzymů - poškození okolní tkáně.
Cytokininy (CK), reprezentující jednu z hlavních skupin rostlinných hormonů, byly objeveny při hledání faktorů stimulujících buněčné dělení rostlinných buněk. V polovině padesátých let popsali Miller a Skoog první cytokinin, kinetin (K) (Miller et al. et al., J. Am. Chem. Soc. 77:1392-1392, 1955). Později byl identifikován zeatin (Z) jako první přirozeně se vyskytující cytokinin v nezralém endospermu kukuřice (Letham D.S. Life Sci. 8:569-573, 1963), a ukázalo se, že se hojně vyskytuje také v kokosovém mléce. I když cytokininy regulují mnoho dalších důležitých fyziologických procesů v rostlinách, kontrola buněčného dělení (cytokineze) je klíčová a pro tuto třídu rostlinných hormonů je považována za diagnostickou; od toho je odvozen také jejich triviální název, cytokininy. Tyto látky mají schopnost indukovat buněčné dělení prostřednictvím ovlivnění určitých fází buněčného cyklu (indukce cyklinů v G1 fázi). Regulátory, které hrají důležitou roli při diferenciaci a vývoji rostlin a bezobratlých, mohou take ovlivnit diferenciaci normálních i maligních buněk Člověka a mohou být klinicky využitelné pro léčbu některých druhů rakoviny (Mlejnek and Kuglik, 2000 J. Cell. Biochem. 77:6-17 2000).
Extracelulámí purin ribosidy byly identifikovány jako efektivní modulátory buněčného růstu a induktory diferenciace mnoha typů buněk (Rathbone et a!., Med. Hypotheses 37: 232-240: 1992). Poslední zjištění naznačují, že purin ribosidy se podílejí na přenosu signálu při mnoha patologických procesech včetně buněčné smrti. Jejich efekt je pravděpodobně zprostředkováván aktivací na membránu vázaných purin ribosidových receptorů (Franceschi et al., Drug Dev. Res. 39: 442-449, 1996). Obecně se uvažuje o dvou mechanizmech cytotoxicity, intracelulámí, kdy se purin ribosidy mohou stát cytotoxickými po jejich intracelulámí fosforylaci (Cottam et al. J. Med. Chem. 36: 3424-3430, 1993), a extraceíulámí. kdy buněčná smrt je zprostředkovávána extracelulárními adenosinovými receptory (Kohno et al., Biochetn. Biophys. Res. Commun. 221: 849-849, 1996). Ribosidy jsou jedna z forem, ve které se puriny přirozeně vyskytují. Bylo zjištěno že tyto cytokininové deriváty, které fungují jako rostlinné hormony a kontrolují mnoho procesů v rostlinách, jsou také velice efektivními inhibitory proliferace rakovinných buněk a velmi účinnými induktory s typickými morfologickými a biochemickými znaky (Ishii et al., Biochim. Biophys. ActaMol. Cell Res. 1643: 11-24, 2003). Když byl detailněji studován jejich mechanizmus účinku, bylo zjištěno že podobně jako v rostlinách, mají cytokininové nukleosidy podobnou diferenciaci-indukující aktivitu i u několika druhů leukemických buněk (Ishii et al., Cell Growth ά Differentiation 13: 19-26, 2002).
Cytokininové báze, jako například kinetin, isopentenyladenin a 6-benzylaminopurin velmi efektivně indukují morfologické změny buněk vedoucí k tvorbě zralých granulocytů. Na druhé straně, cytokininové ribosidy, jako např. kinetin ribosid, isopentenyladenosin a 6benzylaminopurin ribosid jsou velmi účinnými inhibitory růstu a indukují apoptózu. Cytokininové ribosidy také silně redukují vnitrobuněčný obsah ATP a indukují rozpad mitochondrií, zatímco volné báze chrání mitochondie před rozpadem a leukemické buňky před apoptózou (Ishii et al., Cell Growth & Differentiation 13: 19-26, 2002). Tyto výsledky naznačují, proč cytokininy i jejich ribosidy mohou indukovat diferenciaci granulocytů v leukemických HL-60 buňkách, a proč ribosidy mohou také indukovat apoptózu dříve než diferenciaci.
I když efekty cytokininů na vývoj rostlin jsou dobře známy, mechanizmus účinku cytokininů není doposud zcela objasněn. Vazebné proteiny pro cytokininy a cytokinové receptory byly z rostlin izolovány a bylo ukázáno jak jsou zapojeny do signální dráhy cytokininů. Avšak tyto signální dráhy pravděpodobně v lidských nádorových buňkách nejsou přítomny. Zjištění, že inhibitory adenosinových receptorů Al a A2 ovlivňují působení cytokininů na HL-60 buňky (Ishii et aL, Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1643: 11-24, 2003), nasvědčují, že mechanizmus cytokininem indukované diferenciace by mohl být blízce spjat s metabolickými procesy, které vyžadují intracelulámí fosforylaci benzylaminopurin ribosidu (formování nukleotidu) pomocí adenosin kinázy nebo příbuznými enzymy, a že tento proces je nezbytný pro projevení se cytotoxicity (Mlejnek and Kuglik, J. Cell. Biochem. 77:6-17 2000). Navíc bylo publikováno že do tohoto procesu mohou být význame zapojeny kaspázy (Mlejnek and Procházka, Planta 215, 158-166: 2002), V roce 2005 Mlejnek a Procházka ukázali, že deriváty adeninu a adenosinu jsou uvnitř buněk fosforylovány na úroveň monofosfátu. Zatímco N6-substituované deriváty adenosinu byly fosforylovány adenosin kinázou a byly získány ve velkém množství mononukleotidy, N6-substituované deriváty adeninu byly přeměněny na příslušné mononukleotidy fosforibosyl transferázovou drahou, kterou byly získány 50-100 krát nižší koncentrace mononukleotidů než drahou adenosin kinázovou. Adekvátně tomu, N6-substituované deriváty adeninu byly relativně málo efektivními induktory apoptózy v testovaných koncentracích. Inhibitory adenosin kinázy, které blokovaly vznik monofosfátů z N&-substituovaných derivátů adenosinu, kompletně zabránily přechodu buněk do apoptózy. Tyto výsledky logicky podporují myšlenku, že pro-apoptotický efekt N6substituováných derivátů adenosinu souvisí s jejich intracelulární konverzí na odpovídající mononukleotidy, které posléze spouští apoptózu, poté co jejich hladina dosáhne určité úrovně. Intracelulární akumulace mononukleotidů odvozených od odpovídajících N6substituovaných derivátů adenosinu vedla k rychlému snížení produkce ATP a následně k indukci apoptózy (Mlejnek et al., Planí Sci. 168: 389-395,2005).
Nicméně, mechanismus účinku, apoptotické dráhy a signální cytokinin-indukované programované buněčné smrti nebyly dosud plně popsány a zůstávají neobjasněny.
Podstata vynálezu
Objevili jsme novou generaci faktorů prodlužující přežití neutrofilů založených na substituovaných-6-benzylaminopurin ribosidech. Nej slibnějšími substituenty pro C2 polohu purinového skeletu jsou halogeny, zejména chlor a fluor, a methylmerkapto skupina, které indukují prozánětlivou a baktericidní aktivitu neutrofilů a mají specifický antiapoptotícký efekt. Proto je cílem tohoto vynálezu poskytnout nové deriváty na bázi cytokininových ribosidů regulujících přežívání, diferenciaci a apoptózu neutrofilů s vysokou selektivitou a indexem účinnosti, které jsou netoxické pro normálníbuňky a vykazují vysokou účinnost.
Předmětem vynálezu jsou substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I
I kde (R)n znamená 1 až 4 substituenty (n je 1 až 4), které mohou být stejné nebo rozdílné, přičemž tyto substituenty mohou být vybrány ze skupiny zahrnující alkyl, alkoxy, amino, halogen, merkapto a hydroxy,
R1 je vybráno ze skupiny zahrnující halogen, hydroxy, amino, alkoxy a alkyl, a
R2 je vybráno ze skupiny zahrnující halogen, amino, azido, -NHNH2, -NHCONH2, guanyto (-NH-C(NH)NH2), hydroxy, alkoxy, hydroxylamino, merkapto, alkylmerkapto, alkyl, alkenyl a alkynyl, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
Výše uvedené substituenty mají následující významy:
alkoxy znamená skupinu -O-Ra, kde Ra je alkyl nebo cykloalkyl, amino znamená skupinu -NH2, azido znamená skupinu -N3, halogen je vybrán ze skupiny zahrnující atomy fluoru, bromu, chloru a jodu, hydroxy znamená skupinu -OH, hydroxylamino znamená skupinu -NHOH, merkapto znamená skupinu -SH, alkyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkylovou skupinu obsahující 1 až 8 uhlíkových atomů, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, pentyl, isopentyl, hexyl, isohexyl;
alkenyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkenylovou skupinu obsahující 2 až 7 uhlíkových atomů, s výhodou vybranou ze skupiny zahrnující vinyl, allyl, 1-propenyl, 1 methylethenyl, but-1 až 3-enyl, pent-1 až 4-enyl, isopentenyl, hex-1 až 5-enyl, hept-1 až 6enyl, alkynyl znamená přímou nebo rozvětvenou alkynylovou skupinu obsahující 2 až 7 uhlíkových atomů, alkylmerkapto znamená skupinu -SRb, kde Rb je alkyl.
Výhodnými sloučeninami podle vynálezu jsou substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I vybrané ze skupiny zahrnující: 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-4-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cealkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-6-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,3-dihydroxy-4-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,5-dihydroxy-4methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C/r alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Cj-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-4-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Ce-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cďalkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-6-methylbenzy!amino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-4chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Caalkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-6-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Cj-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3fluorbenzylaminojpurin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Céalkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-brombenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C|-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3jodobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C^alkylmerkapto)-6-(2,3-dihydroxy-4-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,5-dihydroxy-4-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, CrC6-alkylmerkapto)-6-(2,3-dihydroxy-4 chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amÍno, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cůalkylmerkapto)-6-(2,5-dihydroxy-4-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C|-C6-alkylmerkapto)-6-(2,6-dihydroxy-4-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C]-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3aminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-4-aminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-aminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C|-Có-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5merkaptobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C]-Cóalkylmerkapto)-6-(2-amino-3-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-4-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cňalkylmerkapto)-6-(2-amino-3-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5-methylbenzylamino)purin riboside, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, alkyImerkapto)-6-(2-amino-4-chlorbenzylamino)purin
Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-3fluor, merkapto, methyl, Ci-Córibosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Cl-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-6chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cůalkyimerkapto)-6-(2-amino-3-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C|-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-3brombenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cealkylmerkapto)-6-(2,3-diaminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,5-diaminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,6-diamino-3-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,6-diamino-4chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-CV alkylmerkapto)-6-(2,3-diamino-4-chlorbenzylamino)purin ribosid, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
Následující substituční deriváty 6-benzyiaminopurin ribosidu obecného vzorce I jsou zvláště upřednostňovány:
2-(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2(chlor, fluor, Cj-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2(chlor, fluor, C]-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin ribosid, 2(chlor, fluor, Ci-Có-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-methylbenzylamino)purin ribosid,2(chlor, fluor, C|-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-chlorbenzylamino)purin ribosid,2(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin ribosid,2(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, CrC6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, C]-Cůalkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-aminobenzylamino)purin ribosid, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou zvláště výhodné pro terapeutické modulace apoptózy a zánětlivého působení neutrofilů ve smyslu jejich potlačení. Aspektem vynálezu jsou substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I pro použití jako faktory prodloužení životaschopnosti a aktivity neutrofilů, jejich mobility a schopnosti adherovat k vaskulárnímu endotheliu a migrovat skrz něj do krve. Omezení tohoto procesu sloučeninami podle tohoto vynálezu povede k potlačení zánětu.
Dalším aspektem vynálezu jsou substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I jako modulační a antiapoptotické faktory rostlinných a savčích buněk v tkáňových kulturách.
Dalším aspektem vynálezu je farmaceutická kompozice obsahující jeden nebo více substituovaných derivátů 6-benzylaminopurin ribosidu obecného vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí s alkalickými kovy, amoniakem nebo aminy, nebo jejich adičních solí s kyselinami a alespoň jednu pomocnou látku.
Dalším aspektem vynálezu jsou substituované 6-benzylaminopurin ribosidy pro použití jako léčiva.
Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I mají modulační vlastnosti při regulaci apoptózy a životaschopnosti neutrofilů, díky kterým mohou být používány k léčbě nebo profylaxi autoimunitních onemocnění, astmatu, kardiovaskulárních, neurodegenerativních onemocnění, zejména k léčbě onemocnění způsobených snížením životaschopnosti neutrofilů vybraných ze skupiny zahrnující ANCA-asociovanou vaskulitidu, progresivní glomerulonefritidou-indukované selhání ledvin (ESRF), neutropénie, rozedmu plic, familiární středomořskou horečku (FMF), artralgie, peritonitidy a amyloidózy. Sloučeniny podle tohoto vynálezu jsou dále prospěšné jako protizánětlivá činidla pro léčbu a profylaxi zánětlivých onemocnění, zejména chronických zánětlivých onemocnění, nebo pro léčbu a profylaxi psoriázy.
Dalším předmětem vynálezu je farmaceutická kompozice, obsahující jeden nebo více substituovaných 6-benzylaminopurin ribosidů obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí s alkalickými kovy, amoniakem nebo aminy, nebo jejich adičních solí s kyselinami a alespoň jednu pomocnou látku.
Sloučeniny obecného vzorce I jsou použity v nemodifikované formě nebo spolu s pomocnými látkami konvenčně užívanými v technikách přípravy těchto preparátů. Za tímto účelem jsou konvenčně formulovány podle známých postupů na emulgovatelné koncentráty, natíratelné pasty, tablety, kapsule, přímo sprejovatelné nebo ředitelné roztoky, zředěné emulze, rozpustné prášky, prachy, granuláty a také enkapsuláty, například polymemí substance. Kompozice mohou také obsahovat další pomocné látky jako stabilizátory, odpěňovače, viskozitní faktor}', pojivá nebo zahušťovadla nebo jiné formulace k získání potřebných vlastností.
FARMACEUTICKÉ PŘÍPRAVKY
Vhodné cesty pro aplikaci jsou orální, rektální, vazální místní (zahrnující okulární, bukální a sublinguální), vaginální a parenterální (zahrnující subkutánní, intramuskulámí, intravitreózní, nitrožilní, intradermální, intrathekální a epidurální). Preferovaný způsob podání závisí na stavu pacienta, toxicitě sloučeniny a místě infekce, kromě ostatních ohledů známých klinikovi.
Terapeutický přípravek obsahuje od 1 do 95 % aktivní látky, přičemž jednorázové dávky obsahují přednostně od 20 do 90 % aktivní látky a při způsobech aplikace, které nejsou jednorázové, obsahují přednostně od 5 do 20 % aktivní látky. Jednotkové dávkové formy jsou např. potahované tablety, tablety, ampule, lahvičky, čípky nebo tobolky. Jiné formy aplikace jsou např. masti, krémy, pasty, pěny, tinktury, rtěnky, kapky, spreje, disperze atd. Příkladem jsou tobolky obsahující od 0,05 g do 1,0 g aktivní látky.
Farmaceutické přípravky podle předloženého vynálezu jsou připravovány známým způsobem, např. běžným mícháním, granulací, potahováním, rozpouštěcími nebo lyofílizačními procesy.
Přednostně jsou používány roztoky aktivních látek a dále také suspenze nebo disperze, obzvláště izotonické vodné roztoky, suspenze nebo disperze, které mohou být připraveny před použitím, např. v případě lyofilizovaných preparátů obsahujících aktivní látku samotnou nebo s nosičem jako je mannitol. Farmaceutické přípravky mohou být sterilizovány a/nebo obsahují excipienty, např. konzervační přípravky, stabilizátory, zvlhčovadla a/nebo emulgátory, rozpouštěcí činidla, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry. Jsou připravovány známým způsobem, např. běžným rozpouštěním nebo lyofilizací. Zmíněné roztoky nebo suspense mohou obsahovat látky zvyšující viskozitu, jako např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, dextran, polyvinylpyrrolidon nebo želatinu.
Olejové suspense obsahují jako olejovou složku rostlinné, syntetické nebo semisyntetické oleje obvyklé pro injekční účely. Oleje, které zde mohou být zmíněny, jsou obzvláště kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselou složku mastnou kyselinu s dlouhým řetězcem majícím 8-22, s výhodou pak 12-22 uhlíkových atomů, např. kyselinu laurovou, tridekanovou, myristovou, pentadekanovou, palmitovou, margarovou, stearovou, arachidonovou a behenovou, nebo odpovídající nenasycené kyseliny, např. kyselinu olejovou, alaidikovou, eurikovou, brasidovou a linoleovou, případně s přídavkem antioxidantů, např. vitaminu E, β-karotenu nebo 3,5-di-tór/-butyl-4-hydroxytoluenu. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin nemá více než 6 uhlíkových atomů a je mono- nebo polyhydrická, např. mono-, di- nebo trihydrícké alkoholy jako metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol a jejich isomery, ale hlavně glykol a glycerol. Estery mastných kyselin jsou s výhodou např. ethyl oleát, isopropyl myrístát, isopropyl palmitát, „Labrafil Μ 2375“ (polyoxyethyien glycerol trioleát, Gattefoseé, Paříž), „Labrafil M 1944 CS“ (nenasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou oleje z meruňkových jader a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž), „Labrasol“ (nasycené polyglykolované glyceridy připravené alkoholýzou TCM a složené z glyceridů a esterů polyethylen glykolu; Gattefoseé, Paříž) a/nebo „Miglyol 812“ (triglycerid nasycených mastných kyselin s délkou řetězce Cg až C12 od Huis AG, Německo) a zvláště rostlinné oleje jako bavlníkový olej, mandlový olej, olivový olej, ricinový· olej, sesamový olej, sójový olej a zejména olej z podzemnice olejně.
Příprava injekčního přípravku se provádí za sterilních podmínek obvyklým způsobem, např. plněním do ampulí nebo lahviček a uzavíráním obalů.
Např. farmaceutické přípravky pro orální použití se mohou získat smícháním aktivní látky s jedním nebo více tuhými nosiči, případnou granulací výsledné směsi, a pokud je to požadováno, zpracováním směsi nebo granulí do tablet nebo potahovaných tablet přídavkem dalších neutrálních látek.
Vhodné nosiče jsou obzvláště plnidla jako cukry, např. laktosa, sacharosa, mannitol nebo sorbitol, celulosové preparáty a/nebo fosforečnany vápníku, s výhodou fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfosforečnan vápenatý, dále pojivá jako škroby, s výhodou kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, sodná sůl karboxymethylcelulosy a/nebo polyvinylpyrrolidin, a/nebo pokud požadováno desintegrátory jako výše zmíněné škroby a dále karboxymethylový škrob, zesítěný polyvinylpyrrolidin, alginová kyselina a její soli, s výhodou alginát sodný. Další neutrální látky jsou regulátory toku a lubrikanty, s výhodou kyselina salicylová, talek, kyselina stearová a její soli jako stearát hořečnatý a/nebo vápenatý, polyethylen glykol nebo jeho deriváty.
Jádra potahovaných tablet mohou být potažena vhodnými potahy, které mohou být odolné vůči žaludeční šťávě, přičemž používané potahy jsou mezi jinými koncentrované roztoky cukrů, které mohou obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidin, polyethylen glykol a/nebo oxid titaničitý, dále potahovací roztoky ve vhodných organických rozpouštědlech nebo směsích rozpouštědel, či pro přípravu potahů odolných vůči žaludeční šťávě roztoky vhodných celulosových preparátů jako acetylcelulosaftalát nebo hydroxypropylmethylcelulosaftalát. Barvi va nebo pigmenty jsou přimíchávány do tablet nebo potahovaných tablet např. pro identifikaci nebo charakterizaci různých dávek účinné složky.
Farmaceutické přípravky, které mohou být užívány orálně, jsou také tvrdé tobolky ze želatiny nebo měkké uzavřené tobolky ze želatiny a změkčovadla jako glycerol nebo sorbitol. Tvrdé tobolky mohou obsahovat aktivní látku ve formě granulí, smíchanou např. s plnidly jako je kukuřičný škrob, pojivý nebo lubrikanty jako talek nebo stearát hořečnatý, a se stabilizátory. V měkkých tobolkách je aktivní látka přednostně rozpuštěna nebo suspendována ve vhodných kapalných látkách neutrální povahy jako mazací tuk, parafínový olej nebo kapalný polyethylen giykol či estery mastných kyselin a ethylen nebo propylen glykolu, přičemž je také možno přidat stabilizátory a detergenty např. typu esterů polyethylen sorbitanových mastných kyselin.
Další formy orálního podávám jsou např. sirupy připravované běžným způsobem, které obsahují aktivní složku např, v suspendované formě a v koncentraci okolo 5 až 20 %, přednostně okolo 10% nebo podobné koncentrace, která umožňuje vhodnou individuální dávku, např. když je měřeno 5 nebo 10 ml. Ostatní formy jsou např. práškové nebo kapalné koncentráty pro přípravu koktejlů, např. v mléce. Takovéto koncentráty mohou být také baleny v množství odpovídajícím jednotkové dávce.
Farmaceutické přípravky, které mohou být používány rektálně, jsou např. čípky, které obsahuji kombinaci aktivní látky se základem. Vhodné základy jsou např. přírodní nebo syntetické triglyceridy, parafínové uhlovodíky, polyethylen glykoly nebo vyšší alkoholy.
Přípravky vhodné pro parenterální podání jsou vodné roztoky aktivní složky ve formě rozpustné ve vodě, např. ve vodě rozpustná sůl nebo vodná injekční suspenze, která obsahuje látky zvyšující viskozitu, např. sodnou sůl karboxymethylcelulosy, sorbitol a/nebo dextran, a stabilizátory tam kde je to vhodné. Aktivní látka může být také přítomna ve formě lyofilizátu společně s excipienty kde je to vhodné a může být rozpuštěna před parenterální aplikací přidáním vhodných rozpouštědel. Roztoky, které jsou použity pro parenterální aplikaci, mohou být použity např. i pro infůzní roztoky. Preferovaná konzervovadla jsou s výhodou antioxidanty jako kyselina askorbová, nebo mikrobicidy kyselina sorbová či benzoová.
Masti jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují ne více než 70 %, ale přednostně 20 až 50 % vody nebo vodné fáze. Tukovou fázi tvoří zejména uhlovodíky, např. vazelína, parafínový olej nebo tvrdé parafiny, které přednostně obsahují vhodné hydroxysloučeniny jako mastné alkoholy a jejich estery, např. cetyl alkohol, nebo alkoholy lanolinu, s výhodou lanolin pro zlepšení kapacity pro vázání vody. Emulgátory jsou odpovídající lipofilní sloučeniny jako sorbitanové estery mastných kyselin (Spaný), s výhodou sorbitan oleát nebo sorbitan isostearát. Aditiva k vodné fázi jsou např. smáčedla jako polyalkoholy, např. glycerol,
propylen glykol, sorbitol a/nebo polyethylen glykol, nebo konzervační prostředky či příjemně vonící látky.
Mastné masti jsou nevodné a obsahují jako bázi hlavně uhlovodíky, např. parafin, vazelínu nebo parafínový olej, a dále přírodní nebo semisyntetické tuky, např. hydrogenované kokosové triglyceridy mastných kyselin nebo, s výhodou, hydrogenované oleje, např. hydrogenovaný ricínový olej nebo olej zpodzemnice olejné, a dále částečné glycerolové estery mastných kyselin, např. glycerol mono- a/nebo distearát. Dále obsahují např. mastné alkoholy, emulgátory a/nebo aditiva zmíněná v souvislosti s mastmi, která zvyšují příjem vody.
Krémy jsou emulze oleje ve vodě, které obsahují více než 50 % vody. Používané olejové báze jsou zejména mastné alkoholy, např. lauryl, cetyl nebo staryl alkoholy, mastné kyseliny, například palmitová nebo stearová kyselina, kapalné a pevné vosky, například isopropyl myristát, lanolin nebo včelí vosk, a/nebo uhlovodíky, například vazelína (petrolátum) nebo parafínový olej. Emulgátory jsou povrchově aktivní sloučeniny s převážně hydrofilními vlastnostmi, jako jsou odpovídající neiontové emulgátory, např. estery mastných kyselin polyalkoholů nebo jejich ethylenoxy adukty, např. estery polyglycerických mastných kyselin nebo polyethylen sorbitanové estery (Tween) dále polyoxyethylenové etery mastných alkoholů nebo polyoxyethylenové estery mastných kyselin, nebo odpovídající iontové emulgátory, jako alkalické soli sulfátů mastných alkoholů, s výhodou laurylsulfát sodný, cetylsulfát sodný nebo stearylsulfát sodný, které jsou obvykle používány v přítomnosti mastných alkoholů, např. cetyl steaiyl alkoholu nebo stearyl alkoholu. Aditiva k vodné fázi jsou mimo jiné činidla, která chrání krémy před vyschnutím, např. polyalkoholy jako glycerol, sorbitol, propylen glykol a polyethylen glykol, a dále konzervační činidla a příjemně vonící látky.
Pasty jsou krémy nebo masti obsahující práškové složky absorbující sekreci jako jsou oxidy kovů, např. oxidy titanu nebo oxid zinečnatý, a dále talek či silikáty hliníku, které mají za úkol vázat přítomnou vlhkost nebo sekreci.
Pěny jsou aplikovány z tlakových nádob a jsou to kapalné emulze oleje ve vodě v aerosolové formě, přičemž jako hnací plyny jsou používány halogenované uhlovodíky, jako polyhalogenované alkany, např. dichlorfluormethan a dichlortetrafluorethan, nebo přednostně nehalogenované plynné uhlovodíky, vzduch, N2O či oxid uhličitý. Používané olejové fáze jsou stejné jako pro masti a krémy a také jsou používána aditiva tam zmíněná.
Tinktury a roztoky obvykle obsahují vodně-etanolickou bázi, ke které jsou přimíchána zvlhčovadla pro snížení odpařování jako jsou polyalkoholy, např. glycerol, glykoly a/nebo polyethylen glykol, dále promazávadla jako estery mastných kyselin a nižších polyethylen glykolů, tj. lipofilní látky rozpustné ve vodné směsi nahrazující tukové látky odstraněné z kůže etanolem, a pokud je to nutné, i ostatní excipienty a aditiva.
Tento vynález dále poskytuje veterinární přípravky obsahující nejméně jednu aktivní složku společně s veterinárním nosičem. Veterinární nosiče jsou materiály pro aplikaci přípravku a mohou to být látky pevné, kapalné nebo plynné, které jsou inertní nebo přijatelné ve veterinární medicíně a jsou kompatibilní s aktivní složkou. Tyto veterinární přípravky mohou být podávány orálně, parenterálně nebo jakoukoli jinou požadovanou cestou.
Vynález se také vztahuje na procesy nebo metody pro léčení nemocí zmíněných výše. Látky mohou být podávány profylakticky nebo terapeuticky jako takové nebo ve formě farmaceutických přípravků, přednostně v množství které je efektivní proti zmíněným nemocem, přičemž u teplokrevných živočichů, např. člověka, vyžadujícího takovéto ošetření, je látka používána zejména ve formě farmaceutického přípravku. Na tělesnou hmotnost okolo 70 kg je aplikována denní dávka látky okolo 0,1 až 5 g, s výhodou 0,5 až 2 g.
Přehled výkresů
Obr. 1 ukazuje vliv sloučeniny 10 na tlumení spontánní apoptózy neutrofilů podle příkladu 22 (modrá křivka). Neutrofily byly kultivovány 20 hod v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím lidské serum a antibiotika. Podíl apoptotických buněk byl sledován po Giemsově barvení a morfologickém pozorování pomocí optického mikroskopu. Data jsou průměrem z pěti nezávislých experimentů.
Obr. 2. ukazuje vliv sloučeniny 10 na oxidativní vzplanutí neutrofilů (tvorba superoxidu) indukované fMLP (Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanine) podle příkladu 22. Neutrofily byly kultivovány v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím lidské sérum, antibiotika a TNFa (tumor nekrotizující faktor a, 20 ng/ml, 10 minut před pokusem). Lucigeninový test byl pak použit pro kvantifikaci produkce superoxidu. Integraci získané křivky bylo zjištěno absolutní množství superoxidu vyprodukovaného během 10 minut. Graf znázorňuje zesílení fluorescenčního signálu a reprezentuje jeden z pěti provedených experimentů.
Obr. 3. znázorňuje inhibiční vliv sloučeniny 10 na produkci interleukinu IL8 podle příkladu 22. Neutrofily byly kultivovány v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím lidské sérum, antibiotika a TNFa (tumor nekrotizující faktor a, 20 ng/ml, 10 minut před pokusem). Produkce IL8 (interleukin 8) byla kvantifikována po 4 hod metodou ELISA (Enzymová imunosorbentová analýza). Data jsou průměrem dvou nezávislých opakování a reprezentují jeden z pěti provedených experimentů.
Obr. 4. ukazuje závislost koncentrace sloučeniny 10 na degranulaci neutrofilů kvantifikovanou produkcí myeloperoxidasy (červená křivka) podle příkladu 22, Neutrofily byly kultivovány v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím lidské sérum, antibiotika a TNFa (tumor nekrotizující faktor a, 20 ng/ml, 10 minut před pokusem). Uvolnění MPO bylo kvantifikováno po 30 minutách metodou ELISA. Data jsou průměrem dvou nezávislých opakování a reprezentují jeden z pěti provedených experimentů.
Obr. 5. demonstruje pozitivní vliv sloučeniny 10 na adhezi a migraci neutrofilů v průtokovém systému v kapiláře podle příkladu 22, jejíž vnitřní stěny byly pokryty endoteliálními buňkami z lidského pupečníku HUVEC (Human Umbilical Vein Endothelial Cells - endoteliální buňky z lidské pupečníkové šňůry) indukovanými TNF (tumor nekrotizující faktor a), za rychlosti proudění a tlaku mimikujícimi vaskulaturu in vivo. Neutrofily byly sledovány pomocí mikroskopické videotechniky.
Obr. 6. ukazuje pozitivní vliv sloučeniny 10 na adhezi, kutálení a migraci neutrofilů podle příkladu 22. Neutrofily byly umístěny v průtokovém systému v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640. Adheze, kutálení a transmigrace neutrofilů v kapiláře pokryté buňkami HUVEC byly sledovány pomocí mikroskopické videotechniky. Data vyjadřují počet neutrofilů adherovaných na buňky HUVEC na mm2, nebo % kutálejících se či migrujících neutrofilů. Sloučenina LGR1406 použita jako negativní kontrola. Data jsou průměrem ze tří nezávislých experimentů.
Obr. 7. ukazuje pozitivní vliv sloučeniny 10 na rychlost kutálení neutrofilů v průtokovém systému v kapiláře podle příkladu 22, jejíž vnitřní stěny byly pokryty endoteliálními buňkami z lidského pupečníku HUVEC indukovanými TNF. Neutrofily byly sledovány pomocí mikroskopické videotechniky. Sloučenina LGR1406 použita jako negativní kontrola.
Obr. 8. znázorňuje negativní vliv sloučeniny 10 na adhezi (roztahování) neutrofilů na fibronektinu podle příkladu 22.
Obr. 9. ukazuje vliv sloučeniny 10 na expresi integritu CDllb v aktivovaných neutrofilech (n=2) podle příkladu 22. Sloučenina LGR1406 použita jako negativní kontrola.
Obr. 10 ukazuje vliv sloučeniny 10 na aktivaci integritu CD11b v aktivovaných neutrofilech (n=2) podle příkladu 22. Sloučenina LGR1406 použita jako negativní kontrola.
Obr. 11. ukazuje inhibiční vliv sloučeniny 10 na apoptózu neutrofilů vyvolanou ANČA podle příkladu 23. Neutrofily byly kultivovány v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím lidské sérum, antibiotika, TNFa (tumor nekrotizující faktor a, 20 ng/ml, 10 minut před pokusem) a protilátky ANCA (anti neutrophile cytoplasmatic antibodies, tj.protilátky proti cytoplazmě neutrofíl). Apoptóza neutrofilů byla kvantifikována pomocí měření poklesu mitochondriálního potenciálu fluorescenčním barvivém DiOCó průtokovou cytometrií.
Obr. 12. ukazuje inhibiční vliv sloučeniny 10 na degranulaci neutrofilů vyvolanou ANČA podle příkladu 23. Neutrofily byly kultivovány v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím lidské sérum, antibiotika, TNFa (tumor nekrotizující faktor a, 20 ng/ml, 10 minut před pokusem) a protilátky ANCA (1 = MPO ANCA, 2 = PR3 ANČA). Uvolnění MPO bylo kvantifikováno po 30 minutách metodou ELISA.
Obr. 13. ukazuje inhibiční vliv sloučeniny 10 na produkci reaktivních forem kyslíku v neutrofilech vyvolanou ANČA (protilátky proti cytoplazmě neutrofíl) podle příkladu 23. Neutrofily byly kultivovány v hustotě 2 x 106 buněk/ml v médiu RPMI1640 obsahujícím lidské sérum, antibiotika, TNFa (tumor nekrotizující faktor a, 20 ng/ml, 10 minut před pokusem) a protilátkami ANCA. Pro kvantifikaci superoxidu byl pužit lucigeninový test.
Integrací získané křivky bylo zjištěno absolutní množství superoxidu vyprodukovaného během 10 minut.
Obr. 14 ukazuje protektivní účinek sloučeniny 10 na endoteliální buňky HUVEC před neutrofily při ANCA-asociované vaskulitidě podle příkladu 23. Kontinentní buňky HUVEC byly vystaveny vlivu neutrofilů aktivovaných TNFa (tumor nekrotizující faktor a, 20 ng/ml), sloučenině 10 v koncentraci (50 μΜ), kombinaci TNFcc a ANČA (TA). Viabilní buňky růstaly adherované ke dnu kultivační nádobky a pozorovány optickým mikroskopem ve fázovém kontrastu.
Příklady provedení vynálezu
Následující příklady slouží k objasnění vynálezu, aniž by omezovaly jeho rozsah.
Výchozím materiálem pro přípravu sloučenin obecného vzorce I je 2,6-chlorpurin, dostupný z komerčních zdrojů (Sigma, Aldrich, Fluka, atd.). Body tání byly stanoveny na Kofflerově bloku a nejsou korigovány. Na měřeni bodu tání byl použit přístroj BUCHI Melting Point B540 Apparatus. Elementární analýzy (C,H,N) byly měřeny na EA1108 CHN analyzátoru (Thermo Finnigan). Odpařování bylo prováděno na rotační vakuové odparce při teplotách nižších než 80 °C. NMR spektra byla měřena na přístroji Bruker Avance AV 300 při teplotě 300 K a frekvenci 300,13 MHz ('H), respektive 75,48 MHz (l3C). Vzorky byly připraveny rozpuštěním daných látek v DMSO-dé. Tetramethylsilan (TMS) byl použit jako interní standard. El hmotnostní spektra byla měřena pomocí Polaris Q (Finnigan) hmotnostního spektrometru vybaveného sondou pro přímý vstup vzorku (DIP) (70 eV, teplotní gradient 40 - 450 °C, interval m/z 50 - 1000 amu za použití cyklických skenů o délce 3,0 sekundy (70 eV, 200 °C, direct inlet). ES+ hmotová spektra byla naměřena za použití přímého nástřiku na Waters ZMD 2000 hmotovém spektrometru. Hmotnostní interval při měření byl 10 - 1500 amu. Spektra byla měřena za použití cyklických skenů o délce 3.0 sekundy, při napětí na vstupní štěrbině 25 V a teplotě vypařovacího bloku 150 °C, desolvatační teplotě 80 °C a průtoku desolvatačního plynu 200 1/hodinu. Získaná data byla zpracována pomocí programu MassLynx data system. Merck silica gel Kieselgel 60 (230-400 mesh) byl použit pro kolonovou chromatografii. Všechny připravené látky poskytovaly uspokojivé výsledky elementární analýzy (± 0.4 %). Analytická tenkovrstvá chromatografie (TLC) byla prováděna na destičkách silica gel 60 WF254 (Merck), v mobilní fázi CHC^MEOHikonc.NHiOH (8:2:0,2, v/v/v).
Příklad 1
2-Chlor-6-(2,4-dimethylbemylamino)purin ribosid
2,4-dimethylanilin (6,05 g; 0,05 mol) byl přidán do suspenze 2,6-dichlorpurin ribosidu (5,67g; 0,03 mol) v n-propanolu (60 ml) a dále byl přidán Ν,Ν'-ethyldiisopropylamin (6,44g; 0,05 mol). Reakční směs byla míchána při 100 °C po dobu 4 hodin. Po zchlazení směsi na pokojovou teplotu byla vzniklá sraženina zfiltrována, promyta studeným n-propanolem (2x10 ml) a vodou (3x10 ml) a vysušena v sušárně při 60 °C do konstantní hmotnosti. Výtěžek: 6,56g nažloutlé práškové substance. TLC (chloroform-methanol; 85:15): jedna skvrna; bez výchozí sloučeniny, HPLC čistota: 98+ %
Příklad 2
2-Chlor-6-(2,3-dihydroxybenzylamino)purin ribosid
2,6-Dichlorpurin ribosid (3,78 g; 0,02 mol) byl přidán do směsi 2,3-dihydroxyanilinu (3,75 g; 0,03 mol) v n-butanolu (40 ml) v přítomnosti triethylaminu (7 ml; 0,05mol) a směs byla zahřívána na 110 °C po 3 h. Po ochlazení na pokojovou teplotu byla ještě reakční směs míchána po 2 hodiny při 0 °C. Vzniklá žlutá sraženina byla zfiltrována, promyta studeným butanolem (2x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušena v sušárně při 60 °C do konstantní váhy. Výtěžek: 3,99 g žlutého krystalického prášku. Surový produkt byl krystalován z isopropanolu s výtěžkem 2,85 g čisté substance. TLC (chloroform-methanol; 85:15): jedna skvrna; bez výchozí sloučeniny. HPLC čistota: 98+ %
Příklad 3
2-Chlor-6-(2,3-dimethoxybenzylamino)purin ribosid
Tato sloučenina byla připravena podobně jako v příkladu 2 a to reakcí 2,6-dichlorpurin ribosidu s 2,3-dimethoxyanilinem. Následně byla reakční směs odpařena na rotační vakuové odparce a odparek byl vytřepán do směsi ethylacetát/0,5 M HC1. Organická vrstva (ethylacetát) byla promyta vodou, vysušena nad MgSOí a odpařena za sníženého tlaku na žlutou pevnou látku (3,92 g). Surový produkt byl čištěn za použití flash chromatografie. Výtěžek: 2,70 g žlutý krystalický prášek. TLC (chloroform-methanol; 85:15): homogenní. HPLC čistota: 98+ %
Příklad 4
2-Chlor-6-(2,5-dihydroxybenzylamino)purin ribosid
Tato sloučenina byla připravena reakcí 2,6-dichlorpurin ribosidu (3,78 g; 0,02 mol), 2,5dihydroxyanilinu (3,75 g; (0,03 mol) s přídavkem Ν,Ν'-ethyldiisopropylaminu (6,44 g; 0,05 mol) v n-butanolu (40 ml) přičemž reakční směs se míchala po 4 h při 90°C. Reakční směs pak byla ponechána zchladnout na pokojovou teplotu, krystalický produkt byl zfiltrován, promyt studeným n-butanolem (3x10 ml), vodou (3x10 ml) a vysušen v sušárně do konstantní hmotnosti.
TLC (chloroform-methanol; 85:15): homogenní. HPLC Čistota: 98+%
Příklad 5
2-Chlor-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid
Do suspenze 2,6-dichlorpurin ribosidu (3,78 g; 0,02 mol) a 2-hydroxy-3methoxybenzylaminu (4,17 g; 0,03 mol) v n-pentanolu (40 ml) byl přidán triethylamin (7 ml; 0,05 mol). Reakční směs byla míchána po dobu 4 hodin při 100 °C a pak byla ponechána zchladnout na pokojovou teplotu. Bílý produkt byl zfiltrován, propláchnut studeným isopropanolem (2x10 ml) a vodou (3x10 ml). Surový produkt byl čištěn krystalizací z methanolu v přítomnosti aktivního uhlí a byly získány bílé krystaly. Výtěžek: 4,36 g. TLC (chloroform-methanol; 85:15): jedna skvrna, bez výchozí látky HPLC čistota:98+ %
Tabulka 1: Látky připravené způsobem podle příkladu 1-5
SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS ANALÝZA ZMD
N6 R2 spočteno/nalezeno [%] [M-H]’ a) [M+H]+b>
1 2,3-dimethoxybenzylamino chlor 050.5/50,4; 04,9/4,9; N=15,5/15,7 450 452
2 2,4-dimcthuxybcnzylamino chlor C=50,5/50,4; H=4,9/4,9; 015,5/15,7 450 452
3 2,6-dÍniethoxybenzylamino chlor C=50,5/50,3; H=4,9/4,9; N= 15,5/15,8 450 452
4 2,4,5-trimcthoxybenzylamino chlor 049,9/50,3; 11=5,0/4,9, N-14,5/14,9 480 482
5 2,6-dimethoxy-4-hydroxybcnzylammo chlor 048,8/48,3; 11=4,7/4,7; N=14,5/14,9 466 468
6 2,3-dihydroxybenzylamino chlor C=48,2/48,0; H=4,3/4,4; N=16,5/16,7 422 424
7 2,5-dihydroxybenzylamino chlor 0=48,8/47,9; H=4,3/4,2; N=16,5/16,9 422 424
8 2-chlor-5-methuxybenzylamino chlor 047,4/47,1; H=4,2/4,2; N=15,4/15,9 454 456
9 2-methoxy-5-chlorbenzy lamino chlor C =47,4/47,0; H=4,2/4,0; N= 15,4/14,9 454 456
10 2-hydroxy-3“methoxybenzy lamino chlor C=49,4/49,2; H=4,6/4,8, N= 16,0/15,8 436 438
11 2-hydroxy-4-ni€thoxybenzylaminO chlor 0=49,4/49,0, H=4,6/4,8; N=I6,0/15,6 436 438
12 2-hydroxy-5-mcthoxybenzylamino chlor 0=49,4/49,1, H=4,6/4,7; N=16,0/15,6 436 438
13 2-hydroxy-5-mcthylbenzylamino chlor 0=51,3/51,0; H=4,8/4,7; N=I6,6/16,5 420 422
14 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino chlor 0=48,0/47,8; H=4,0/4,l; N=16,5/16,1 424 426
15 2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino chlor 0=46,2/46,1; 11=3,9/4,1; N=l5.8/16,0 440 442
16 2-hydroxy-5*aminobenzylamino chlor 0=48,3/48,6; H=4,5/4,7; N= 19,9/20,3 421 423
17 2-methoxy-3-hydroxybenzylamino chlor 0=49,4/49,3; H=4,6/4,6; N=16,0/15,7 436 438
18 2,4-dimethylbenzy lamino chlor 0=54,4/54,1; H=5,3/5,4; N=16,7/16,5 418 420
19 2-amino-3-methoxybenzy lamino chlor C=49,5/49,3, H=4,9/5,0; N=19,2/19,0 435 437
20 l-amino-S-methylbenzylamino chlor C=51,4/5I,6; 11=5,0/4,9; N=20,0/20,2 419 421
21 2-amino-5-methyibenzy lamino chlor 0=51,4/51,7; H=5,0/4,8; N=20,0/20,3 419 421
a) roztok: MeOH p,a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 6
2-Fluor-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid
Tato sloučenina byla připravena reakcí 2-fluor-6-chlorpurin ribosidu (1,7 g; 0,01 mol), 2hydroxy-3-methoxybenzylaminu (1,39 g; 0,01 mol) a triethylaminu (3,5 ml; 0,025 mol) v nbutanolu (20 ml) při 90°C za 4 hodiny. Dále pak byla reakční směs zchlazena na pokojovou teplotu. Vzniklá bílá sraženina byla zfiltrována, promyta n-butanolem (3x10 ml) a vodou (3x10 ml) a vysušena v sušárně do konstantní váhy. Výtěžek: 5,65 g nažloutlého krystalického prášku. TLC (chloroform-methanol; 85:15): jedna skvrna. HPLC čistota: 99+ %.
Tabulka 2: Látky připravené způsobem podle příkladu 6
SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS ANALÝZA-ZMD
N6 R2 vypoéteno/na lezeno [%] [M-H]' a) [M+H]+ b)
22 2,3-dimethoxybenzylamino fluor 0=52,4/52,3; H=5,1/5,1; 61=16,1/15,9 434 436
23 2,4-dimethoxybenzylamino fluor 0=52,4/52.3; H=5,1/5,0; N=16,1/16,0 434 436
24 2,4,5-trimethoxybenzylamino fluor 0=51,6/51,4; H=5,2/5,2; N=15,l/14,7 464 466
25 2,6-dimethoxy-4hydroxy benzylamino fluor 0=50,6/50,1; H=4,9/4,9, N=15,5/15,8 450 452
26 2,3’dihydroxybenzylamino fluor 0=50,1/49,6,11=4,5/4,5; N= 17,2/16,8 406 408
27 2,5-dihydroxybenzy lamino fluor 0=50,1/49,8; H=4,5'4,5; 406 408
N=17,2/16.9
28 2-hydroxy-3-methoxybcnzylamino fluor 051,3/51,0; H=4,8/4,8, N= 16,6/16,9 420 422
29 2-hydroxy-5-methoxybenzylamino fluor 051,3/50,8; H=4,8/4,8; N=I6,6/17,0 420 422
30 2-hydroxy-5-methylbcnzylamino fluor 054,4/54,7; 05,3/5,2; N= 16.7/16.4 418 420
31 2-hydroxy-5-fluorbenzy lamino fluor 054,4/54,2,11=5,3/5,3; N=16,7/16,9 418 420
32 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino fluor C=48,0/47,7; H=4,0/5,3; N=16,5/16,8 424 426
33 2-methoxy-3-hydroxybenzylamino fluor 051,3/50,9; H=4,8/4,7; N=l6,6/17,0 420 422
34 2,4-dimethylbenzylamino fluor 056,6/56,3; H=5,5/5,7; N=17,4/17,6 402 404
3S 2-amino-3-chlorbenzylamino fluor 048.1/47,6; H=4,3/4,3; N= 19,8/20,2 423 425
36 2-amino-5-chlorbenzylamino fluor 048,1/47,8; 04,3/4,2; N=19,8/20,l 423 425
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 7
2-Amino-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid
Do suspenze 2-amino-6-chlorpurin ribosidu (1,69 g; 0,01 mol) a 2-hydroxy-3methoxybenzylaminu (1,39 g; 0,01 mol) v n-butanolu (20 ml) byl přidán triethylamin (3,5 ml; 0,025 mol). Výsledná hustá suspenze byla míchána při 110°C po dobu 3 hodin. Reakční směs byla ochlazena na pokojovou teplotu. Bílá sraženina byla zfiltrována, promyta nbutanolem (3x10 ml) a vodou (3x10 ml) a vysušena v sušárně do konstantní hmotnosti.Výtěžek: 2,29 g . Surový produkt byl čištěn převodem na hydrochlorid krystalizací z 2,5M methanolického roztoku HC1 s výtěžkem 2,17 g téměř bílých krystalů (hydrochlorid). TLC (chloroform-methanol-NH4OH; 4:1:0.05): jedna skvrna, bez výchozí látky. HPLC čistota: 99+ %.
Tabulka 3: Látky připravené způsobem podle příkladu 7
SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS ANALÝZA-ZMD
N6 R2 vypočteno/nalezeno l%] [Μ-ΗΓ a) [M+H]+b)
37 2,3-dímelhoxybenzylamino amino 052,8/52,7; H=5,6/5,7; N=19,4/I9,7 431 433
38 2,4-dimethoxybenzy lamino amino 0=52,8/52,5; H-5.6/5.6: N=19,4/19,8 431 433
39 2,4,5-trimethoxybenzylamino amino 0=51,9/51,6, H-5,7/5,6; N=18,2/18,5 461 463
40 2,6-dimelhoxy-4hydroxybenzylamino amino 0=50,9/50,5; H=5,4/5,4; N=18,7/19,2 447 449
41 2,3-dihydroxybcnzylamino amino 0=50,5/50,1.11=5,0/5,0. N=20,8/21,l 403 405
42 2,5-dihydroxybenzylamino amino 0=50,5/50,2, H=5,0/5,1, N=20,8/21,3 403 405
43 2-hydroxy-3methoxybenzy lamino amino 0=51,7/51,1; H=5,3/5,4, N=20,l/19,4 417 419
44 2-hydroxy-5methoxybenzylamino amino 0=51,7/51,5; H=5,3/5.3, N=20,1/20,3 417 419
45 2-hydroxy-3methylbenzylamino amino 0=53,7/53,4; H=5,5/5,4; N=20,9/21,4 401 403
46 2-hydroxy-5methylbenzylamino amino 0=53,7/53,4; H=5,5/5,5; N=20,9/21,2 401 403
47 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino amino 0=48,3/48,6; H=4,5/4,4; N= 19,9/20,4 421 423
48 2-methoxy-3hydroxybenzylamino amino 0=51,7/51,2; H=5,3/5,5; N=2O,1/2O,7 417 419
49 2,4-dimethylbenzylamino amino 0=57,0/56,7; H=6,0/6,l; N=21,0/21,3 399 401
50 2-amino-5-chlorbenzylamino amino 0=48,4/48,7; H=4,8/4,8; N=23,2/23,6 420 422
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + HjO + NH3
Příklad 8
2-Merkaptoxanthin
4,5-Diatnino-6-hydroxy-2-merkaptopyrimidin (Aldrich 95%, 100 g) byl relluxován s 90% kyselinou mravenčí (500 ml) po dobu 2 hodin v 3 1, 3-hrdle baňce opatřené míchadlem. Kvůli ztuhnutí směsi bylo přidáno dalších 100 ml kyseliny mravenčí. Ledem vychlazená reakční směs surového 4-amino-5-formamido-6-hydroxy-2-merkaptopyrimidinu byla zfíltrována na velkém sintru. Světle žlutý produkt byl obdržen po 30 min vakuovém sušení. Filtrační koláč byl dále suspendován ve formamidu (225 ml) ve velké kádince a směs byla zahřáta na lázni s parafinovým olejem na 175-185 °C s občasným zamícháním po dobu 2 hodin. Reakční směs byla ochlazena na laboratorní teplotu a zfíltrována. Filtrační koláč byl rozpuštěn v přibližně 2 L 1M NaOH a stopou ledové AcOH při 10 °C. Směs byla zfíltrována a vakuově vysušena za sníženého tlaku při 95 °C po dobu 2 h. Výtěžek 103 g (97 %).
Příklad 9
2-Benzylmerkapto-6-purinol
5,28 g 8-merkaptoxanthinu (MW 168,2) bylo suspendováno v 78,5 ml 1 M NaOH a zředěno přibližně 400 ml vody. Výchozí materiál se zcela nerozpustil ani při 2,5 násobném nadbytku báze. Byl přidán benzylchlorid (3,7 ml) a reakční směs byla prudce míchána přibližně 3 hodiny při pokojové teplotě, pak bylo nastaveno pH na 5 a to ledovou AcOH, přičemž byla získána červená sraženina. Reakční směs byla zfiltrována, filtrační koláč byl promyt vodou a vakuově vysušen před noc při 80 °C s výtěžkem 7,33 g lososově růžové pevné látky, která byla použita bez dalšího přečištění.
Příklad 10
2-Benzylmerkapto-6-chlorpurin
2-Benzylmerkaptoxanthin (FW 258, 27,6 g, 0,107 mmol) byl zalit POCI3 (506 ml) a byl přidán N,N-diethylanilin (40 ml). Reakční směs byla refluxována 1,5 h. Nadbytek oxychloridu byl odstraněn odpařením za sníženého tlaku a byla získána sirupovitá látka, která byla nalita na ledovou tříšť (2 kg). Za chlazení byl přidán hydroxid sodný k rozpuštění vytvořené pevné látky. Reakční směs byla okyselena na pH 1 pomocí HCI a vznikla pevná látka, která byla zfiltrována, promyta vodou a vakuově sušena při 70 °C po několik hodin. Surový produkt byl zpracován s malým objemem MeOH za vzniku žluté pevné látky, která byla vakuově vysušena při 70 °C. Rekrystalizace produktu z MeOH, BuOH nebo EtOAc byla neúspěšná. Výtěžek: 17,5 g (59 %). Surový 2-benzylmerkapto-6-chlorpurin a 2benzylmerkaptoxanthin se dobře rozpouštějí v DMSO. Kolonová chromatografie na silikagelu, MeOH/chlorform (5:95), surový 2-benzylmerkapto-6-chlorpurin vykazuje ostrý, hlavní pík při 0,39 se 4-mi kontaminanty v mediu a to 0,05, 0,14, 0,60 a 0,65. Nebyl však detekován žádný výchozí 2-benzylmerkaptoxanthin (2-benzylmerkaptoxanthin standard vykazuje 2 ekvivalentní píky při 0,10 a 0,18 = tautomery). Kolonová chromatografie na silikagelu - 100% chloroform: 2-benzylmerkapto-6-chlorpurin: 0,02; s 2.5 % MeOH/chloroform, 2-benzylmerkapto-6-chlorpurin: 0,25. Bylo posbíráno 36 x 100 ml frakcí ve stejném rozpouštědle. Produkt eluoval ve frakcích 6 až 36 (= finální frakce posbírány, velmi málo 2-benzylmerkapto-6-chlorpurinu v těchto frakcích); 4 rychle jdoucí kontaminanty ve frakcích 3 až 9. Žádná eluce pomalu jdoucích kontaminantů až do frakce 36. Z posbíraných frakcí 7 až 36 byla po odpaření získána žlutá látka. 2-Benzylmerkapto-6chlorpurin je velmi rozpustný v 100% MeOH (a v 10% MeOH/chloroform); Bezbarvé jehlice byly získány krystalizací z 50% vodného MeOH v ledničce. Byly vysušeny nad chloridem vápenatým do konstantní váhy a dále byla látka sušena nad oxidem fosforečným pří 45 °C přes noc. Byly obdrženy světle žluté jehlice (3 g); m.p. 176-178 °C. TLC (silika 5%MeOH/chloroform). Jeden ostrý pík (0,53) při 25, 50 a 100 pg násadě; 2 nevýrazné kontaminanty (0,76 a 0,83). Čistota 95+ %
Příklad 11
2-Benzylmerkapto-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purm
2-Benzylmerkapto-6-chlorpurin (3,9 g) byl refluxován po dobu 2 hodin spolu s 2-hydroxy-3methoxybenzylaminem (3,42 g) v n-BuOH (100 mi) obsahujícím triethylamin (7,5 ml). Reakční směs byla ochlazena na laboratorní teplotu a BuOH byl odpařen za sníženého tlaku. Odparek byl přelit ledovou vodou (400 mi). Směs byla ponechána v lednici přes noc a zfiltrována. Výsledný temně hnědý produkt se neodbarvil ani po rekrystalizaci v MeOH. Surový produkt byl čištěn kolonovou chromatografií (100 g silika v chloroformu) a eluován 500 ml 100% chloroformu a dále pak 500 ml směsi 1,25% MeOH/chloroform, dále pak 1,5 1 směsi 2,5% MeOH/chloroform. Bylo posbíráno dvacet pět 100 ml frakcí ze směsi 2,5% MeOH/chloroform. Produkt je eluován ve frakcích 11 až 16 včetně. Frakce 12 až 15 byly odpařeny a byla získána světle žlutá pevná látka. Látka byla rekrystalována ve vroucím MeOH kvůli odstranění barevné složky při teplotě -18 °C přes noc.. Výtěžek: 1.18 g bílé amorfní látky. TLC (2.5% MeOH/chloroform) vykazuje jen jednu skvrnu a žádné detekovatelné kontaminanty v násadě mezi 5 až 50 pg, čistota 98+ %. 95% EtOH/HCl 307 (303); 95% EtOH 291 (288); 95% EtOH/amoniak 298 (293). Dalších 600 mg surového produktu bylo získáno z matečného louhu (TLC vykazuje dvě ekvivalent! skvrny). 8-izomer je příliš rozpustný ve 100% methanolu na to aby bylo dosaženo sraženiny.
Příklad 12
2-Benzylmerkapto-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid
2-Benzylmerkapto-6-chlorpurin (4 g) byl ve 100 ml baňce smíchán s β-D-ribofuranosil 1,2,3,5-tetraacetátem (6,4 g, Aldrich) a reakční směs byla na olejové lázni zahřívána na 145 až 150 °C (teplota lázně). Bylo přidáno přibližně 100 mg jódu a pak byla reakční směs byla po dobu 30 minut odpařena na vakuové rotační odparce Černá dehtovitá látka byla zpracována s chloroformem a zfiltrována, aby byla odstraněna malé množství nerozpustného černého rezidua. Reakce byla zopakována ještě třikrát a pak byly chloroformové extrakty spojeny a čištěny kolonovou chromatografií na 2 x 400 g 7734 silica gel (Merck) plněném v 2 1 20% směsi rozpouštědel ethylacetát/toluen. Surová reakční směs byla nastříknuta ve 100 ml této směsi rozpouštědel a kolona byla eluována zbylým množstvím solventů (1 1) a následně pak 1 1 20% ethylacetátu, 2 l/20%xl 1 30% v nejvyšším gradientu. Prvních 2500 ml bylo vyhozeno a posbíráno 150 ml frakcí. Přítomnost látky byla monitorována TLC v ethylacetátu/toluenu (1/2, v/v), pak výchozí materiál detekován při 0,06, produkt 0,03. Celkový eluční objem přibližně 8 l a eluce probíhala po dobu 5 hodin. Hnědá sirupovitá látka byla vakuově vysušena a rozpuštěna v suchém horkém methanolu, ochlazena na 20°C a deacetylována přes noc v 1 1 bezvodého methanolu nasyceného amoniakem při 20 °C. Poté byl při teplotě laboratoře odpařen amoniak, při teplotě 35 °C methanol a (deset minut) při 45 °C odpařen acetamid. Surový produkt byl dvakrát rekrystalizován s dekolorizanty z vroucí vody. Výsledným produktem byly světle žluté jehlice jen s malou ztrátou. Byly vysušeny do konstantní váhy nad oxidem fosforečným. Výtěžek 4,95 g (18,6 %); mp 193-194 °C; HPLC: 25 cm ODS 0-30 % acetonitril, 1 ml.min1 po 30 min. Rt: 24,0 min. HPLC čistota = 91 %. TLC chloroform/methanol (9/1, v/v) vykazuje hlavní pík při 0,40.
Příklad 13
2-Merkapto-6-(2-hydroxy-3-me(hoxybenzylamino)purm ribosid
2-Benzylmerkapto-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid (1,18 g) byl rozpuštěn v kapalném amoniaku (125 ml) za vzniku homogenního žlutého roztoku. Pro zacházení s kapalným amoniakem nebylo použito žádného vnějšího chlazení. Byl přidán v malých dávkách sodík až modré zbarvení roztoku přetrvávalo po dobu 15 min. Bylo přidáno malé množství chloridu amonného k odstranění nadbytku Na. Amoniak byl odpařen do malého objemu a bylo přidán diethylether (125 ml) (k odstranění dibenzylu, který vzniká jako vedlejší produkt) Po odstranění většiny amoniaku byl etherický roztok extrahován vodou (2 x 65 ml). pH vodní fáze (pH 12 až 13) bylo nastaveno pomocí AcOH na 5, pak byla vodní fáze ochlazena na -10 °C na suchém ledu. Vytvořila se sraženina krémové barvy, která byla zfiltrována, promyta pořádně vodou a vysušena přes noc nad chloridem vápenatým za vzniku prakticky bílého, velmi lehkého prášku. Výtěžek: 760 mg. 2-Merkapto-6-(2-hydroxy-3methoxybenzylaminojpurin ribosid poskytoval ostrý, symetrický pík v HPLC (300 nm), který je pozorovatelný jako rychle se pohybující skrvna na TLC (směs methanol/chloroform). Je rozputný v EtOH. EtOH roztok se barví výrazně žlutě stáním po dobu několika dnů při pokojové teplotě.
Tabulka 4: Látky připravené způsobem podle přikladu 13
SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS ANALÝZA-ZMD
N6 R2 vypočteno/nalezeno [%] [M-Η]’ a) [M+H]+b)
51 2,3-dimethoxy benzylamine merkáptů 050,8/50,7; H=5,2/5,5; O15,6/15,4 448 450
52 2,4-dimethoxybenzy lamino merkapto C=50,8/50,l; 05,2/5,3; N= 15.6/15.9 448 450
53 2,4,5-trimetlioxybenzylamino merkapte 050,1/49,6; H=5,3/5,3; 014,6/15,0 478 480
54 2,6-dimethoxy-4hydroxybcnzylamino merkapto 049,0/49,5; H=5,0/5,2; 015,1/14,6 464 466
55 2,3-dihydroxy benzylamine merkapto 0=48,5/48,2; H=4,5/4,4; 016,6/16,3 420 422
56 2,5-dihydtoxybenzylamino merkapto C=48,5/48,0; 04,5/4,6; 016,6/16,9 420 422
57 2-hydroxy-3methoxy benzylamine merkapto C=49,6/49,4; H=4,9/4,8; 016,1/15,9 434 436
58 2-hydroxy-5methoxybenzylamino merkapto C=49,6 /49,2; 04,9/4,6; 016,1/15,7 434 436
59 2-hydroxy-3methylbenzylamino merkapto 051,5/51,1; H=5,0/5,1; N=16,7/16,2 418 420
60 2-hydroxy-5methylbenzy lamino merkapto 051,5/50,9; 05,0/4,9, 016,7/16,9 418 420
61 2-hydroxy-5’Chlorbenzylamino merkapto 046,4/45.9, 04,1/4,3; 015,9/16,4 438 440
62 2-mcthoxy-3hydroxy benzylamine merkapto C =49,6/49,1,04,9/4,5, 016,1/16,8 434 436
63 2,4-dimethylbenzy lamino merkapto 054,7,6 /54,2; 11=5,6/5,5; 016,8/17,3 418 420
64 2-amino-5-chlorbcnzylamino merkapto 046,5 /46,0; 04.4,4,3: 019,2/19.7 437 439
65 2-chler-5methoxybcnzylamino merkapto 047,6/47,2; 04,4/4,5; 015,4/15,9 452 454
66 2-methoxy-3chlorbenzylamino merkapto 047,6 /47,2; 04,4/4,5; 015,4/15,7 452 454
a) roztok: MeOH p a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 14
2-Methylmerkaptoxanthin
2-Merkaptoxanthin (103 g, 0,613 mol) byl rozpuštěn v 2M NaOH (613 ml) a vodě (245 ml) ve třílitrové trojhrdlé baňce opatřené mechanickým míchadlem a snímatelnou ledovou lázní.
Byl po kapkách přidán dimethylsulfát (77 g, 58 ml), teplota byla udržována mezi 25 - 40 °C za použití ledové lázně. Reakční směs byla míchána po dobu 1 h a ponechána stát přes noc při teplotě laboratoře. Temně Červený roztok byl přefiltrován, produkt byl vysrážen ledovou kyselinou octovou při pH mezi 5-10. Sraženina byla zfiltrována na Buchnerově nálevce a rekrystalizována z vroucí vody (1500 ml), pak byla krystalována při 10 °C. Získaný produkt byl zfiltrován a vakuově vysušen při 95 °C po 3 h, pak do konstantní váhy nad oxidem fosforečným. Zahuštěním matečných louhů na poloviční objem byl získán další podíl produktu. Výtěžek první podíl 48 g, druhý podíl 16 g. Celkem 48 % z výchozího diaminohydroxy merkaptopyrimidinu. UV čistota 80 %, což odpovídá 1,5 hydrátu. UV pHl: 266,5 (265); pHl 1:271 (270).
Příklad 15
2-Methylmerkapto-6-chlorpurin
2-Methylmerkaptoxanthin (65 g, rekrystalován z vody, světle žlutá práškovitá látka, vysušena do konstantní váhy nad oxidem fosforečným) byl umístěn v 31 trojhrdlé baňce opatřené mechanickým míchadlem a zalit POCI3 (975 ml) a N,N'-diethylanilinem (97,5 ml). Reakční směs byla refluxována 1,5 h. Prakticky veškerý přebytek POCI3 byl odpařen za sníženého tlaku (rotační vakuová odparka) při 55-60 °C a odparek byl nalit na ledovou tříšť (0 °C, 1,75 kg) v a 10 1 baňce, přičemž byla směs míchána tyčinkou po dobu 10 minut, aby došlo ke kompletní hydrolýze POCI3. Poté byla reakční směs extrahována ethylacetátem (4 x 2,5 1). Spojené ethylacetátové extrakty byly promyty vodou (3 x 1 1) a vysušeny za vzniku temné pevné látky. Surový produkt byl rekrystalován (s dekolorizanty) zethanolu a po filtraci vysušen do konstantní váhy nad oxidem fosforečným. Výtěžek 23,6 g (33 %). UV čistota 99 % HPLC (25 x 0,4 cm ODS, 0 do 30 % acetonitril, 1 ml/min, 30 min), Rt: 26,8 min, čistota 92 %. TLC (chloroform/methanol, 9/1, v/v) Rf 0,80. Zbylá část byla dále čištěna: rozpuštěna v minimálním množství 2M NaOH (míchání), roztok byl zfiltrován, ochlazen a produkt byl vysrážen ledovou AcOH při pH 5 přes noc při teplotě 10 °C, dále 3 x rekrystalován zethanolu (30 min prodloužený var) s aktivním uhlím (odbarvení roztoku). Výtěžek: přibližně 7 g citrónově žluté mikrokrystalické látky,. HPLC (25 x 0,46 cm ODS-2 Spherisorb 5 pm, 0-40 % acetonitril, 30 min, 2 ml/min), Rt 7,8 min, čistota: 99 %.
Příklad 16
2-Methylmerkapto-6-chlor-9-B-D-ribofuranosylpurin
2-Methylmerkapto-6-chlorpurin (4 g vysušeny do konstantní váhy nad oxidem fosforečným) byl míchán ve 100 ml kulaté baňce spolu s β-D-ribofuranosa 1,2,3,5-tetraacetátem (6.4 g, Aldrich) při 145 až 150 °C (teplota olejové lázně). Přibližně 100 mg jódu bylo přidáno do reakční směsi a pak byla směs vakuově odpařena (30 min).Vzniklý černý sirupovitý produkt byl zpracován s chloroformem a vzniklý roztok byl přefiltrován aby byly odstraněny stopy nerozpustného černého rezidua. Reakce byla opakována nejméně 3x a chloroformové extrakty byly spojeny a čištěny kolonovou chromatografií na 2 x 400 g 7734 silica gel (Merck) plněném v 2 1 20% směsi ethylacetát/toluen. Surový reakční mix byl ve 100 ml plnícího solventu vložen na kolonu a kolona byla eluována zbytkem připravené mobilní fáze (ethylacetát/toluen) (přibližně 1 I), pak následovala eluce 1 1 20% ethylacetátu, 2 1/20% x 1 1 30%- prvních 2500 ml bylo odloženo a posbíráno 150 ml frakcí. Kolonová chromatografie byla sledována pomocí TLC v ethylacetát/toluen (1/2, v/v) (výchozí materiál = 0,06, produkt 0,25). Celkový eluční objem byl přibližně 8 1 a proces trval přibližně 5 h (test pomocí benzen/ethylacetát: 5/1, v/v). Hlavní produkt, B-isomer, byl získán jako B-acetát v množství 26 g (71 %). Hnědý syrup byl vakuově vysušen a rozpuštěn v malém množství horkého methanolu. Dále byl roztok zchlazen na teplotu 20 °C a deacetylován přes noc pomocí 1000 ml bezvodého methanolu nasyceného amoniakem při 20 °C. Amoniak byl odstraněn při teplotě laboratoře, dále byl odstraněn methanol při 35 °C, jehož po 10 min a při teplotě 45 °C následoval acetamid. Produkt byl dvakrát rekrystalován (dekolorizanty) z vroucí vody. Produkt snadno krystaloval za vzniku světle žlutých jehlic a jen s malou ztrátou ve vodě. Jehlice byly vysušeny na vzduchu a pak nad oxidem fosforečným do konstantní váhy. Výtěžek: 4,95 g (18,6 %); mp 187-188 °C; HPLC: 25 cm ODS 0 - 30% acetonitriL 1 ml za min přibližně 30 min. Rt: B-anomer 26,0 min, A-anomer 26,5 min. Dvakrát rekrystalovaný produkt vykazuje nějaký materiál při 20,6 min (který není výchozím 2methylthio-6-chlorpurinem, Rt 26,8 min), ale žádný A-anomer. Celková HPLC čistota = 91 %. TLC: chloroform/methanol (9/1, v/v) vykazuje hlavní skvrnu 0,38 + 3 slabé, pomalu se pohybující kontaminanty při 0,31, 0,19 a 0,09. TLC ethylacetát/ethanol (10/1, v/v) vykazuje hlavní skvrnu při 0,38 + 2 slabé kontaminanty při 0,11 a 0,02. Očekávaný B-anomer 0,31, Aanomer 0,19. MW volný ribosid: 332,8 C11H13O4N4SCI, MW triacetát: 459
Příklad 17
2-Methylmerkapto-6f2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid
2-Methylmerkapto-6-chlorpurin ribosid (3,3 g, 10 mmol) byl refluxován s 2-hydroxy-3methoxybenzylaminem (7,7 g, 12,5 mmol) v butanolu (100 ml), který obsahoval triethylamin (3,2 ml) po 2 h. Butanol byl odpařen na rotační vakuové odparce při 50-60 °C. Surový produkt byl čištěn nejprve smísením s vodou, ale tento postup se ukázal jako neúspěšný. Poté byla surová reakční směs čištěna kolonovou chromatografií na 100 g silica v methanol/chloroform (5:95) a eluována směsí methanol/chlorform s gradientem (5 až 20% v 2,5% x 250 ml krocích, bylo posbíráno 50 ml frakcí, prvních 500 ml vylo vyhozeno). Produkt byl eluován ve frakcích 19 do 30. TLC (15% methanol/chloroform) vykazovalo několik rychle se eluujících sloučenin a také výchozí materiál. Finální produkt byl kontaminován hlavním pomalým kontaminantem. Produkt byl vysušen na téměř bílý prášek a čištěn kolonovou chromatografií na 100 g silikagelu v ethylacetátu/ethanolu (10/1, v/v), jímž byla sloučenina také eluována. Bylo posbíráno 25 ml frakcí. Opakovaná kolonová chromatografie poskytla rapidní eluci s dobrou dekolorizací produktu. Výtěžek 2,2 g (56 %) bílý prášek. HPLC vykazuje 1 pozůstalý kontamínant, celková čistota produktu je však 97 %. Rekrystalizace z ethylacetátu poskytla jasně bílé mikrokrystalky. Produkt je velmi rozpustný v methanolu a vodě ale je možné jej překrystalovat pouze z ethylacetátu.
Tabulka 5: Látky připravené způsobem podle příkladu 17
SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS ANALÝZA-ZMD
N6 R2 [%] [M-H]' a) [Μ+ΗΓι»
67 2,3-dimethoxybenzylamino methylmerkapto C=51,8 /51,2; H=5,4/5,5; N=15,l/15,6 462 464
68 2,4-dimethoxybenzylamino methylmerkapto C=51,8 /51.5; H=5,4/5,4; N=15,l/15,4 462 464
69 2,4,5-tnmethoxybenzylami no methylmerkapto C=51,1/51,4; H=5,5/5.6; N=14,2/14,7 492 494
70 2.6-dimethoxy-4hydroxybenzy lamino methylmerkapto C=50,1/51,0; H=5,3/5,5; N= 14,6/15,1 478 480
71 2,3-dihydroxy benzylamine methylmerkaplo C=49,6 /50,2; H=4,9/4,8; N=16,1/16,2 434 436
72 2,5-dihydroxybenzy lamino methylmerkapto C=49,6/50,0; H=4,9/5,l; N=16,1/15,4 434 436
73 2-hydroxy-3methoxybcnzy lamino methylmerkapto C=50,8 /50,3; 11-5.2/5,0; N=15,6/16,1 448 450
74 2-hydroxy-5methoxy benzylamino methylmerkapto 050,8/50,4; H=5,2/5,l; Ο15.6Ί6.2 448 450
75 2-hydroxy-3methylbenzylamino methylmerkapto 052,7 /52,2; H=5,4/5,4; N=16,2/16,7 432 434
76 2-hydroxy-5methylbenzylamino methylmerkapto C-527 /52.3, H=5,4/5,5, N= 16,2/16,6 432 434
77 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino methylmerkapto C=47,6/47,2; H=4,4/4,3; N=I5,4/15,9 452 454
78 2-methoxy-3hydroxy benzylamine methylmerkapto C=50,8/50,1, H=5,2/4.9; N=15,6/16,3 448 450
79 2,4-dimethylbenzylamino methylmerkapto C=55,7 /55,0; H=5,8/5.7; N=16,2/16,8 430 432
80 2-amino-5-chlorbenzylamino methylmerkapto C=47,7 /47,1; H=4,7/5,0; N=18,6/19,3 451 453
81 2-chlor-5methoxybenzylamino methylmerkapto C=48,8 /48,2; H=4,7/4,7; N=15,0/14,7 466 468
82 2-methoxy-3chlorbenzylamino methylmerkapto C=48,8 /48,4; H=4,7/4,6; N=15,0/15,3 466 468
a) roztok: MeOH p a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 18
2-Methyl-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)puurin ribosid
K suspenzi 2-methyl-6-chlorpurin ribosidu (1,69 g; 0,01 mol) a 2-hydroxy-3methoxybenzy laminu (1,23 g; 0.01 mol) v n-butanolu (20 ml) byl přidán triethy lamin (3,5 ml; 0,025 mol). Výsledná hustá suspenze byla míchána 3 h při 110 °C. TLC ukázalo absenci výchozí sloučeniny a přítomnost požadovaného produktu. Poté byla reakční směs zchlazena na teplotu laboratoře. Bílá sraženina byla zfiltrována, promyta n-butanolem (2x10 ml) a vodou (3x10 ml) a vysušena v sušárně do konstantní váhy.. Výtěžek: 1,92 g (75 %). Surový produkt byl přečištěn převedením na hydrochloridovou sůl krystalizací z 2,5M methanolické HC1 a výsledkem byly téměř bílé krystaly (hydrochlorid produktu). TLC (chloroformmethanol-NH+OH; 4:1:0.05): jedna skvna, bez výchozí látky. HPLC čistota: 99+ %
Tabulka 6: Sloučeniny připravené podle příkladu 18
SUBSTITUENT CHN ANALÝZA MS ANALÝZY-ZMD
N6 R2 [%] [M-H]’ a) [M+H]+b)
83 2,3-dimethoxybcnzy lamino methyl 0=55,7/55,3; H=5,8/5,7; N=16,2/16,9 430 432
84 2,4-dimethoxybenzylamino methyl 0=55,7 /55,4; H=5,8/5,8; N= 16,2/16,7 430 432
85 2,4,5- trimelhoxybenzylamino methyl 0=54,7/54,2; 11=5,9/6,0; N=15,2/15,9 460 462
86 2,6-dimethoxy-4hydroxybcnzylamino methyl C=55,7/55,4; H=5,8/5,8; N= 15,6/16,1 446 448
87 2,3-dihydroxybenzylarnino methyl C=53,6/53,2; 14=5,3/5,2; N=17,4/18,0 404 404
88 2,5-d ihydroxybenzyla mino methyl C=53,6/53,4; H=5,3/5,4; N=17,4/17,7 404 404
89 2-hydroxy-3methuxybenzylamino methyl C=54,7 /54,1; H=5,6/5,5; N= 16.8/17,3 416 418
90 2-hydroxy-5methoxybenzylamino methyl C=54,7/54,4; H=5,6/5,6; N=I6,8/17,2 416 418
91 2-hydroxy-3methylbenzy lamino methyl C=56,9 /56,5; H=5,8/5,8; N= 17,5/17,9 400 402
92 2-hydroxy-5methylbenzylamino methyl C=56,9 /56,4, H=5,8/5,7; N=17,5/17,7 400 402
93 2-hydroxy-5chlorbenzylamino methyl C=51,3 /50,9; 11-4,8/4,7, N=I6,6/17,1 420 422
94 2-methoxy-3hydroxybenzylamino methyl C=54,7 /54,9, H=5,6/5,4; N-16.8/16.3 416 418
95 2,4-dimethylbcnzy lamino methyl 060,1 /59,6; H=6,3/6,l; N=17,5/18,0 400 402
96 2-amino-5chlorbcnzylamino methyl 051,4/50,9; H=5,l/5,0; N=20,0/20,7 400 402
97 2-chlor-5- methoxy benzylamino methyl 052,4/51,5; H=5,1/5,3; N=I6,I/16,9 400 402
98 2-methůxy-3chlorbenzylarnino methyl 052,4/51,7; 05,1/5.2; N=I6,1/17.0 400 402
a) roztok: MeOH p.a. + HCOOH
b) roztok: MeOH p.a. + H2O + NH3
Příklad 19
Testování vlivu nových látek na buněčné dělení u rostlin
Stimulační vliv nově připravených derivátů byl testován v kalusovém biotestu za použití cytokinin-dependentního kalusu tabáku. Tento cytokinin-dependentní tabákový kalus Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38 byl udržován při 25 °C na modifikovaném mediu Murashige-Skoog (MS) obsahujícím na 1 litr: 4 pmol kys. nikotinové, 2,4 pmol pyridoxin hydrochloridu, 1,2 pmol thiaminu, 26,6 pmol glycinu, 1,37 pmol glutaminu, 1,8 pmol myoinositolu, 30 g sacharosy, 8 g agaru, 5,37 pmol a-naftyloctové kyseliny a 0,5 pmol 6benzylaminopurinu. Subkultivace probíhala každé 3 týdny. Čtrnáct dní před započetím biotestu byl kalus přenesen na médium bez 6-benzylaminopurinu. Stimulační růstová aktivita byla stanovena na základě nárůstu čerstvé hmoty kalusu po 4 týdnech kultivace. Pět replikátů bylo připraveno pro každou testovanou koncentraci a daný test byl opakován minimálně 233 krát. V každém experimentu byla použita jako kontrolní látka kinetin, který je znám velmi vysokou cytokininovou aktivitou. Testované cytokininy byly rozpuštěny v dimethylsulfoxidu (DMSO) a zásobní roztok doplněn vodou na ΙΟ'3 M. Tento zásobní roztok byl dále ředěn testovacím médiem na koncentrační rozsah 10’8 až ΙΟ4 M. Finální koncentrace DMSO v médiu nepřevýšila 0,2 % a v této koncentraci neovlivňovala biologickou aktivitu testu. Ze získaných dat byla opět vypočítána maximální účinná koncentrace testované látky a její relativní účinnost v této koncentraci (Tab. 8). ΙΟ'5 M koncentrace kontrolní látky 6furfurylaminopurin ribosidu (kinetin ribosid, KR) byla postulována jako 100% biologické aktivity.
Přehled látek je uveden v Tabulce 8. První látka kinetin ribosid zastupuje „klasické cytokininy“ (C = kontrola). Dále jsou uvedeny aktivity nových 2-substituovaných-6benzylamino purin ribosidů. Výsledky v Tabulce 8 ukazují, že substituce v poloze 2 purin ribosidového kruhu obvykle vede ke zvýšení cytokininové aktivity v kalusovém biotestu ve srovnání s analogem klasického cytokininu.
Tabulka 8: Vliv nových látek na růst cytokinin-dependentního kalusu tabáku Nicotiana tabacum L. cv. Wisconsins 38
No. Testovaná látka Koncentrace s nejvyšší aktivitou (molT1) aktivita (%) [lO'W.F1 KR = 100%]
R6 R2
c furfurylamino (kinetin ribosid) 10’5 100
1 2,3-dímethoxybenzy lamino chlor 10'6 109.7 (±12)
14 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino chlor 10’6 108.6 (±3)
31 2-hydroxy-5-fluorbenzy lamino fluor 1T6 105.1 (±2)
32 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino fluor I06 112 (±8)
67 2,3-dimethoxybenzylamino methylmerkapto 10‘6 107 (±4)
Příklad 20
Cytotoxická aktivita nových derivátů in vitro
Pro rutinní screening sloučenin jsme používali buněčné linie odvozené z lidské Tlymfoblastické leukemie (CEM), lidské promyelocytární leukemie (HL-60), lidské monocytární leukemie (U937), lidské chronické myeloidní leukemie (K562), lidského prsního karcinomu (MCF-7), lidské cervikálního karcinomu (HeLa), lidské maligního melanomu (G361), a dále normální myší fibroblasty (NIH3T3). Buňky byly udržovány v Nunc/Corning 80 cm2 plastikových lahvích a pěstovány v mediu pro buněčné kultury (DMEM obsahující 5 g/1 glukózy, 2 mM glutamin, 100 U/ml penicilinu, 100 pg/ml streptomycinu, 10% fetálního telecího séra a hydrogenuhličitan sodný).
Buněčné kultury byly připraveny a naředěny podle typu buněk a podle očekávané konečné hustoty buněk (104 buněk na jamku na základě charakteristik buněčné proliferace); pipetovalo se 80 μί buněčné suspenze do každé jamky 96-jamkové mikrotitrační destičky. Inokuláty byly stabilizovány 24 hodinovou preinkubací při 37 °C v atmosféře CO2. Jednotlivé koncentrace testovaných látek byly přidány v čase nula jako 20 μί alikvotní podíl do jamek mikrotitračních destiček. Obvykle se sloučeniny ředily do šesti koncentrací v čtyřnásobné ředící řadě. Při rutinním testování byla nejvyšší koncentrace v jamce 166,7 μΜ, změny této koncentrace závisí na dané látce. Všechny koncentrace byly testovány ve dvou opakováních. Inkubace buněk s testovanými deriváty trvala 72 hodin při 37 °C, 100% vlhkosti a v atmosféře CO2. Na konci inkubační periody byly živé buňky označeny přidáním roztoku fluorescenčního barviva Calceinu AM (Molecular Probes) a inkubace probíhala další 1 hodinu. Fluorescence živých buněk (FD) byla měřena pomocí readeru Fluoroskan Ascent (Labsystems). Přežití buněk (GI, growth inhibition) bylo spočítáno podle následujícího vztahu. GI—(FDjanika s derivátem /FDkontroiní jamka ) 100 /0. Hodnota GI50, která odpovídá koncentraci látky, kdy je v kultuře přítomno 50 % buněk, byla vypočtena ze získaných křivek závislosti frakce živých buněk na koncentraci testované látky.
Minimální cytotoxicita nových sloučenin je jejich základní podmínkou pro terapeutické aplikace. Cytotoxicita nových sloučenin byla testována na panelu živočišných buněčných linií různého histologického původu. Data uvedená v tabulce 9 ukazují, že cytotoxická aktivita 2-substituovaných derivátů 6-benzylaminopurin ribosidu je minimální nejen na všechny nádorové buněčné linie. Sloučeniny uvedené v tabulce 9 lze rozdělit do dvou skupin; první skupina obsahuje „klasické cytokininy“, čili 6-substituované ribosidy purinu, zatímco druhou skupinu tvoří nové 2-substituované deriváty 6-benzylaminopurin ribosidu. Z uvedených výsledků jasně vyplývá, že právě substituce v poloze 2 ribosidů purinu vedek k výraznému poklesu cytotoxické aktivity klasických cytokininů; hodnoty GI50 na všech testovaných liniích jsou vyšší než 100 μΜ, což znamená, že cytotoxické působení by bylo pozorovatelné až při výrazně vyšších koncentracích. Nové 2-substituované deriváty 6 benzylaminopurin ribosidu jsou tedy pro terapeutické aplikace mnohem vhodnější nežli klasické cytokininy, které polohu 2 substituovanou nemají..
Tabulka 9: Cytotoxicita nových sloučenin na různých nádorových buněčných liniích
Testovaná sloučenina buněčná linie / GI50 (pmol/L)
No. R2 R6 K-562 MCF7 G-361 HOS CEM HL60
2-hydroxy-5fluorbenzy lamino >100 >100 >100 >100 52 24
14 chlor 2-hydroxy-5fluorbcnzy lamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
31 fluor 2-hydroxy-5fluorbenzylaminO >100 >100 >100 >100 >100 >100
61 merkapto 2-hydroxy-5fluorbenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
2-hydroxy-5chlorbenzylamino 36 32 >100 >100 2.4 1.6
15 chlor 2-hydroxy-5chlorbenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
47 fluor 2-hydroxy-5chlorbenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
77 methyl mé rkapto 2-hydroxy-5chlorbenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
61 merkapto 2-hydroxy-5chlorbenzylamino 145 >100 >100 >100 68 45
amino 2-hydroxy-5chlorbenzylamino 132 125 >100 >100 57 41
93 methyl 2-hydroxy-5chlorbenzylamino 158 >100 >100 >100 84 66
2-hydroxy-3methoxybenzylamino >100 >100 >100 >100 40 9.5
10 chlor 2-hydruxy-3methoxybenzylainino >100 >100 >100 >100 >100 >100
28 fluor 2-hydroxy-3methoxybenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
73 melhylme rkapto 2-hydroxy-3methoxy benzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
57 merkapto 2-hydroxy-3methoxybenzy lamino >100 >100 >100 >100 151 89
43 amino 2-hydroxy-3methoxybcnzylamino >100 >100 >100 >100 135 73
89 methyl 2-hydroxy-3methoxybenzylamino >100 >100 >100 >100 156 92
2-liydroxy-T methoxybenzylamino 28 20 >100 >100 0.3 0.15
12 chlor 2-hydroxy-5- >100 >100 >100 >100 >100 >100
methoxybenzy lamino
29 fluor 2-hydroxy-5methoxybenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
74 methyl me rkapto 2-hydrcxy-5methoxy benzylamino >100 >100 >100 >100 >100 »00
2-hydroxy-5methylbenzylamino 18 6.9 >100 >100 0.9 10
13 chlor 2-hydroxy-5mcthylbcnzy lamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
30 fluor 2-hydroxy-5methylbenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
76 methyl tne rkapto 2-hydroxy-5methylbenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
92 methyl 2-hydroxy-5methylbenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
2-methoxy-3hydroxy benzyl amino 16.5 >100 >100 >100 1.9 10
17 chlor 2-amino-5chlorobenzylaniino >100 >100 >100 >100 >100 >100
36 fluor 2-amino-5chlorobenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
80 methyl mc rkapto 2-amino-5chlorobenzy lamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
64 merkapto 2-amino-5chlorobenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
50 amino 2-amino-5ehlorobenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
96 methyl 2-amino-5chlorobenzylamino >100 >100 >100 >100 >100 >100
Příklad 21
Protizáněllivá aktivita nových 2-substituovaných 6-benzylaminopurin ribosidů
Byla kvantifikována protizánětlivá aktivita několika 2-substituovaných derivátů 6benzylaminopurin ribosidů; jako kontrola byl použit kinetin ribosid. Potkaní gliomová linie C6 (katalogové číslo ATCC: CCL107) byla kultivována jako monovrstva v bezsérovém chemicky definovaném médiu složeném z media Ham’s F10 a media MEM (minimal essencial medium) v poměru 1:1 (v/v), s přídavkem 2 mM L-glutaminu, 1 % (v/v) MEM vitamínů, 1 % (v/v) MEM neesenciálních aminokyselin (lOOx), 100 U/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu, a 30 nM seleničitanu sodného. Inkubace byla prováděna při 37 °C v biologickém inkubátoru se 100% vlhkostí. K měření protizánětlivá activity byla používána kultura buněk v logaritmické fázi růstu s hustotou 2,5^105 buněk/cm. Syntéza intracelulárního cAMP byla indukována přídavkem 5 mM (-)-isoproterenolu a zároveň byla ve stejném okamžiku ke kultuře přidávána různá množství testovaných sloučenin. Po třicetiminutové inkubaci při 37 °C byly buňky separovány od media a množství intracelulárního cAMP bylo kvantifikováno pomocí imunochemického kitu (cAMP-enzyme immunoassay) firmy Amersham. Hodnota ho byla určena interpolací z křivek závislosti redukce cAMP na koncentraci testované sloučeniny. Tímto způsobem byl kvantifikován vliv devíti purinových sloučenin na produkci cAMP.
Tabulka 10: Modulace aktivity β-adrenergních receptorů 2-substituovanými deriváty 6benzylaminopurin ribosidu.
No. R2 R6 Efekt Ιί0(μΜ)
kontrola - furfurylamino žádný 0
10 chlor 2-hydroxy-3-methoxybenzylamino inhibice 7,5+1
13 chlor 2-hydroxy-5-methylbenzy lamino inhibice 18,7±4
14 chlor 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino inhibice 15,7±4
15 chlor 2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino inhibice 12,4±2
16 chlor 2-hydroxy-5-aminobenzylamino inhibice 22,7±3
30 fluor 2-hydroxy-5-methylbenzy lamino inhibice 20,8+4
28 fluor 2-hydroxy-3-methoxybenzylamino inhibice 4,2 ±2
32 fluor 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino inhibice 1O,8±3
31 fluor 2-hydroxy-5-fluorbenzylamino inhibice 13,6+3
43 amino 2-hydroxy-3-methoxy benzylamino inhibice 10,4±3
47 amino 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino inhibice 14,9±3
50 amino 2-amino-5-chlorbenzylamino inhibice 19,5+4
73 methylmerkapto 2-hydroxy-3-methoxybenzylamino inhibice 7,2+3
77 methylmerkapto 2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino inhibice 11,3±2
80 niethylmcrkapto 2-amino-5-chlorbenzylamino inhibice 16,1±3
61 merkapto 2-hydroxy-5-chlorbenzylamino inhibice 2I,4±6
89 methyl 2-hydroxy-3-methoxybenzylamino inhibice 18,9+5
96 methyl 2-hydroxy-5-chlorbenzy lamino inhibice 26,4+6
Aktivita adenylátcyklasy je regulována řadou membránovch receptorů, včetně negativní regulace purinogenními receptory P2Y]-like a pozitivní regulace purinogenními receptory A2. Exprese těchto receptorů v potkaních buňkách C6 přitom umožňuje sledovat, jak se při jejich deaktivaci isoprotenerolem mění produkce cAMP.
Skupina 2-substituovaných derivátů 6-benzylaminopurin ribosidu byla schopna omezit produkci cAMP, čímž demonstrovala své protizánětlivé účinky. Jako kontrolní neúčinná látka byl použit kinetin ribosid.
Příklad 22
Modulace zánětlivé aktivity neutrofilů
Byly prokázány účinky sloučenin na indukci apoptózy neutrofilů, což může mít výrazný terapeutický efekt zejména u onemocnění provázených pozměněným přežíváním neutrofilů, jako např. u systémové vaskulitidy nebo chronických zánětlivých onemocnění. Neutrofily izolované z periferní krve byly kultivovány 20 hod v médiu RPMI1640 doplněném 2 % lidského séra, 2 mM glutaminem a antibiotiky (100 U/ml penicilinu, 100 mg/1 streptomycinu) a po této době byl sledován podíl apoptotických buněk (Giemsovo barvení a morfologická pozorování pomocí optického mikroskopu, detaily viz Pongracz J et al. 1999, J. Biol. Chem. 274: 37329-37334). Sloučenina 10 inhibovala apoptózu neutrofilů s hodnotou IC50 =1 μΜ (Obr. 1).
Protizánětlivý účinek sloučenin byl sledován také prostřednictvím jejich vlivu na aktivitu neutrofilů (tvorba superoxidu, sekrece chemoatraktantu IL8, degranulace vedoucí k uvolňování myeloperoxidasy). Neutrofily byly získány z lidské krve v čistotě minimálně 95 % a byly dale kultivovány v médiu RPMI1640 doplněném 2 % lidského séra (krevní skupina AB), 2 mM L-glutaminem a antibiotiky (100 U/ml penicilinu, 100 mg/1 streptomycinu). Ke kultuře neutrofilů byl 30 min před experimentem přidán cytokin GM-CSF (finální koncentrace 50 ng/ml). Teprve poté byly neutrofily aktivovány bakteriálním peptidem fMLP (100 ng/ml) a míra jejich aktivity byla sledována pomocí produkce superoxidu, interleukinu IL8 a myeloperoxidasy. Tvorba superoxidu byla sledována lucigeninovým testem (Pongracz J and Lord JM 1998, Biochem.Biophys.Res.Commun. 247, 624-629), uvolňování IL8 a myeloperoxidasy bylo kvantifikováno pomocí imunoanalytických metod (ELISA). Testované sloučeniny byly ke kultuře přidávány v různých koncentracích (v rozsahu 0,1 - 100 μΜ) 10 minut před přidáním peptidu fMLP. Sloučenina 10 vykazovala inhibiční účinek na všechny sledované aspekty zánětlivé aktivity neutrofilů - produkci superoxidu blokovala s hodnotou IC50 = 5 μΜ (Obr. 2), sekreci 1L8 s hodnotou IC50 = 50 nM (Obr. 3) a konečně degranulaci a uvolňování myeloperoxidasy s hodnotou IC50= 4 μΜ (Obr. 4).
Schopnost neutrofilů adherovat kvaskulámímu endoteliu a migrovat skrze něj z krve do přilehlých tkání je prvním krokem zánětlivého procesu. Omezení tohoto procesu tak může vést k potlačení zánětu. Pro sledování vlivu nových sloučenin byly neutrofily studovány v průtokovém systému v kapiláře, jejíž vnitřní stěny byly pokryty endoteliálními buňkami z lidského pupečníku HUVEC indukovanými TNF, za rychlosti proudění a tlaku mimikujícími vaskulaturu in vivo. Neutrofily byly sledovány mikroskopickou videotechnikou za účelem kvantifikace jejich kutálení, adheze a transmigrace během dvacetiminutového časového intervalu (Obr. 5). Nově připravené sloučeniny byly použity kpreinkubaci neutrofilů i endoteliálních buněk HUVEC před jejich aplikací do průtokového systému, a byly přítomny také v médiu během pokusu. Pokus byl opakován s několika koncentracemi každé látky (obvykle 10, 50 a 100 μΜ). Modelová sloučenina 10 signifikantně redukovala počet neutrofilů adherovaných na buňky HUVEC, redukovala transmigraci skrze tyto buňky a zároveň zvyšovala podíl neutrofilů, které se po buňkách HUVEC pouze kutálely (Obr. 5 a 6). Bylo také prokázáno, že rychlost pohybu neutrofilů po buňkách HUVEC se výrazně zvýšila (Obr. 7).
Příklad 23
ANCA-asociovaná vaskulitida
ANCA(anti neutrophile cytoplasmatic antibodies)-asociovaná vaskulitida patří mezi nej běžnější primární systémové vaskulitidy malých cév. Je způsobená produkcí autoprotilátek (převážně IgG) proti cytoplasmatickým antigenům neutrofilů (PR3 a MPO), které napadají vlastní organismus. Patologickým projevem této nemoci je tvorba nekrotizujících ložisek v krevních cévách, což může poškozovat nejen tyto cévy, ale také vyživované orgány. Je například nejčastější příčinou progresivního terminálního ledvinového selhání (ESRF) vyvolaného glomerulonefritidou.
Řada experimentálních důkazů svědčí o deregulaci apoptózy neutrofilů (jejího zrychlení) u pacientů s ANCA-asociovanou vaskulitidou, což vede k omezení jejich fagocytozy makrofágy a tím pravděpodobně k prohloubení jejich zánětlivého působení v systémových cévách. Terapeutická modulace apoptózy a zánětlivého působeni neutrofilů ve smyslu jejich potlačení může být tedy velmi výhodná. Neutrofily byly proto kultivovány 10 hodin v médiu RPMI1640 doplněném 2 % lidského sera (krevní skupina AB), 2 mM L-glutaminem a antibiotiky (100 U/ml penicilinu, 100 mg/1 streptomycinu) a po této době byl sledován podíl apoptotických buněk (Giemsovo barvení a morfologická pozorování) pomocí optického mikroskopu). Neutrofily byly preinkubovány 10 minut v médiu s TNFa (20 ng/ ml), který indukuje expresi epitopů ANČA na jejich povrchu, a přímo s ANČA (směs anti-PR3 a antiMPO) pro vyvolání apoptózy. Sloučenina 10 byla schopna potlačit takto vyvolanou apoptózu neutrofilů s hodnotou IC5o = 4 μΜ. Pokles podílu apoptotických neutrofilů byl prokázán také pomocí měření mitochondriálniho potenciálu průtokovým cytometrem (Obr. 12).
Dále byla sledována schopnost sloučeniny 10 inhibovat zánětlivou aktivitu neutrofilů indukovanou ANČA. Neutrofily byly kultivovány v médiu RPMI1640 doplněném 2% lidského sera (krevní skupina AB), 2 mM L-glutaminem a antibiotiky (100 U/ml penicilinu, 100 mg/1 streptomycinu) a protilátek ANČA. Neutrofily byly opět preinkubovány s TNFa pro vyvolání odezvy na ANCA a jejich degranulace byla sledována skrze sekreci myeloperoxidasy do média. Po 30 minutách byla myeloperoxidasa kvantifikována metodou ELISA. Sloučenina 10 inhibovala degranulaci neutrofilů s hodnotou IC5o = 3 μΜ (Obrázek 13). V dalším podobném pokusu byly neutrofily aktivované TNFa inkubovány s protilátkami ANCA a degranulace byla sledována skrze produkci superoxidu lucigeninovým testem (Pongracz J and Lord JM 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. 247, 624-629). Sloučenina 10 již v koncentraci 10 μΜ kvantitativně inhibovala produkci superoxidů neutrofily (Obrázek 14).
Klíčovým patologickým projevem systémové vaskulitidy je poškození endoteliálních buněk neutrofily. Sledovali jsme také, zda sloučenina 10 může toto poškození omezit. Neutrofily aktivované ANCA a preinkubované s TNFa byly proto inkubovány přes noc s endoteliálními buňkami HUVEC, jejichž viabilita byla poté kvantifikována (barvení trypanovou modří a počítání poškozených buněk pomocí optického mikroskopu). Indukovaná buněčná smrt byla pozorována u 50% buněk HUVEC vystavených 24 hod vlivu neutrofilů aktivovaných TNFa. Podíl poškozených buněk HUVEC vzrostl až na 90%, pokud byly do média přidány I protilátky ANČA. Sloučenina 10 však již v koncentraci 10 μΜ zcela eliminovala negativní vliv TNFa-aktivováných neutrofilů na buněčnou smrt HUVEC, případně ji snížila na 50%, pokud byly v médiu přítomny i protilátky ANČA (Obrázek 16).
Příklad 24
Suché tobolky
5000 tobolek, každá obsahující jako aktivní složku 0,25 g jedné ze sloučenin vzorce 1, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 1250 g
Talek180 g
Pšeničný škrob120 g
Magnesium stearát 80 g
Laktosa20 g
Postup přípravy: Rozetřené látky jsou protlačeny přes síto s velikostí ok 0,6 mm. Dávka 0,33 g směsi je přenesena do želatinové tobolky pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 25
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné z látek o vzorci I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
Lauroglykol 2 litry
Postup přípravy: Prášková aktivní látka je suspendována v Lauroglykolu® (propylenglykol laurát, Gattefoseé S. A., Saint Priest, Francie) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na velikost částic asi 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,419 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
Příklad 26
Měkké tobolky
5000 měkkých želatinových tobolek, každá z nich obsahující jako aktivní složku 0,05 g jedné ze sloučenin obecného vzorce I, zmíněných v předcházejících příkladech, se připraví následujícím postupem:
Složení
Aktivní složka 250 g
PEG 400 1 litr
Tween 80 1 litr
Postup přípravy: Prášková aktivní složka je suspendována v PEG 400 (polyethylenglykol o Mr mezi 380 a 420, Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a Tween® 80 (polyoxyethylen sorbitan monolaurát, Atlas Chem. Ind., Inc., USA, dodává Sigma, Fluka, Aldrich, USA) a rozetřena ve vlhkém pulverizátoru na částice o velikosti 1 až 3 mm. Dávka o velikosti 0,43 g směsi je potom přenesena do měkkých želatinových tobolek pomocí přístroje na plnění tobolek.
PATENTOVÉ NÁROKY
1. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I

Claims (9)

1. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I
I kde (R)n znamená 1 až 4 substituenty, které mohou být stejné nebo rozdílné, přičemž tyto substituenty mohou být vybrány ze skupiny zahrnující alkyl, alkoxy, amino, halogen, merkapto a hydroxy,
R1 je vybráno ze skupiny zahrnující halogen, hydroxy, amino, alkoxy a alkyl, a
R2 je vybráno ze skupiny zahrnující halogen, amino, azido, -NHNH2, -NHCONH2, guanylo (-NH-C(NH)NH2), hydroxy, alkoxy, hydroxylamino, merkapto, alkylmerkapto, alkyl, alkenyl a alkynyl, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, nebo jejich adični soli s kyselinami.
2. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I podle nároku 1, vybrané ze skupiny zahrnující: 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, CrC&alkyhnerkapto)-6-(2-hydroxy-3-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Có-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-4-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-{amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C[-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cgalkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-6-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cfi-alkylmerkapto)-6-(2,3-dihydroxy-4-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Có-alkylmerkapto)-6-(2,5-dihydroxy-4methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Cj-Cé- alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Cl-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-4-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-CĚ-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-CV alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-6-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-chlorbenz}'lamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C|-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-4chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cůalkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-6-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C^alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C&-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-brombenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3iodobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cůalkylmerkapto)-6-(2,3-dihydroxy-4-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,5-dihydroxy-4-methylbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,3-dihydroxy-4chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cůalkylmerkapto)-6'(2,5-dÍhydroxy-4-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Cj -C6-alkylmerkapto)-6-(2,6-dihydroxy-4-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, CrC6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3-aminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci“C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy“4-aminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5aminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cóalkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-merkaptobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-3-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C|-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-4methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Céalkylmerkapto)-6-(2-amino-5-methoxybenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-3-methylbenzylamino)purin ribosid, 245 (amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkyhnerkapto)-6-(2-amino-5methylbenzylamino)purin riboside, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-Cgalkylmerkapto)-6-(2-amino-3-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci“C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-4-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C]-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C^alkylmerkapto)-6-(2-amino-6-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, C]-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-3-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, CrCe-alkylmerkaptoj-ó-P-amino-Sfluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6alkylmerkapto)-6-(2-amino-3-brombenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,3-diaminobenzylamino)purm ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,5diaminobenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C<>alkylmerkapto)-6-(2,6-amino-3-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2,6-amino-4-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2(amino, chlor, fluor, merkapto, methyl, CrCů-alkylmerkapto)-6-(2,3-diamino-4chlorbenzy!amino)purin ribosid, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem či aminy, ve formě racemátů nebo opticky aktivních isomerů, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
3. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I podle nároku 1, vybrané ze skupiny zahrnující 2-(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3methoxybenzylaminojpurin ribosid, 2-(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5methoxybenzylaminojpurin ribosid, 2-(chlor, fluor, Ci-CValkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-3methylbenzylaminojpurin ribosid,
2-(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-methylbenzylamino)purin ribosid, 2(chlor, fluor, Ci-C6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, Ci-C6-alkyhnerkapto)-6-(2-hydroxy-3-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, C|-C6-alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-chlorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, CiC6-alkylmerkapto)-6-(2-amino-5-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, Ci-C6 alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-fluorbenzylamino)purin ribosid, 2-(chlor, fluor, C]-C6alkylmerkapto)-6-(2-hydroxy-5-aminobenzylamino)purin ribosid, a jejich farmaceuticky přijatelné soli s alkalickými kovy, amoniakem čí aminy, nebo jejich adiční soli s kyselinami.
4. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pro terapeutické potlačení apoptózy a zánětlivého působení neutrofilů.
5. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako léčiva.
6. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pro výrobu léčiva pro léčbu nebo profylaxi autoimunitních onemocnění, astmatu, kardiovaskulárních, neurodegenerativních a zánětlivých onemocnění způsobených deregulací životaschopnosti, počtu, aktivity, adherence a migrace neutrofilů.
7. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití pro výrobu léčiva pro léčbu onemocnění vybraného ze skupiny zahrnující ANCA-asociovanou vaskulítidu, progresivní glomerulonefritidou-indukované selhání ledvin (ESRF), neutropénie, rozedmu plic, familiární středomořskou horečku (FMF), artralgie, peritonitidy a amyloidózy, chronická zánětlivá onemocnění a psoriázu.
8. Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy obecného vzorce 1 podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro použití jako modulační a antiapoptotické faktory rostlinných a živočišných buněk v tkáňových kulturách.
9. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje jeden nebo více substituovaných 6benzylaminopurin ribosidů obecného vzorce I podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí s alkalickými kovy, amoniakem nebo aminy, nebo jejich adičních solí s kyselinami a alespoň jednu pomocnou látku.
CZ20090298A 2009-05-14 2009-05-14 Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický prípravek tyto slouceniny obsahující CZ2009298A3 (cs)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090298A CZ2009298A3 (cs) 2009-05-14 2009-05-14 Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický prípravek tyto slouceniny obsahující
PCT/CZ2010/000061 WO2010130233A1 (en) 2009-05-14 2010-05-12 Substituted 6-(benzylamino) purine riboside derivatives, use thereof and compositions containing these derivatives
EP10736593.4A EP2430036B1 (en) 2009-05-14 2010-05-12 Substituted 6-(benzylamino) purine riboside derivatives, use thereof and compositions containing these derivatives
US13/320,396 US20120071433A1 (en) 2009-05-14 2010-05-12 Substituted 6-(Benzylamino) Purine Riboside Derivatives, Use Thereof and Compositions Containing These Derivatives
US14/047,573 US20140066394A1 (en) 2009-05-14 2013-10-07 Substituted 6-(Benzylamino) Purine Riboside Derivatives, Use Thereof and Compositions Containing These Derivatives

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ20090298A CZ2009298A3 (cs) 2009-05-14 2009-05-14 Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický prípravek tyto slouceniny obsahující

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ2009298A3 true CZ2009298A3 (cs) 2010-11-24

Family

ID=42549431

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20090298A CZ2009298A3 (cs) 2009-05-14 2009-05-14 Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický prípravek tyto slouceniny obsahující

Country Status (4)

Country Link
US (2) US20120071433A1 (cs)
EP (1) EP2430036B1 (cs)
CZ (1) CZ2009298A3 (cs)
WO (1) WO2010130233A1 (cs)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9493502B2 (en) 2011-01-26 2016-11-15 Beijing Kbd Pharmaceuticals Co., Ltd. Ribofuranosyl purine compounds, methods for preparing the same and use thereof
CN102617680B (zh) * 2011-02-01 2014-04-02 复旦大学 一种双功能抗血小板聚集药物及其用途
CZ308881B6 (cs) * 2014-12-09 2021-08-04 Univerzita Palackého v Olomouci 6-aryl-9-glykosylpuriny a jejich použití
WO2016095881A1 (en) * 2014-12-15 2016-06-23 Univerzita Palackeho V Olomouci Substituted 6-anilino-9-heterocyclylpurine derivatives for inhibition of plant stress
CN106632338B (zh) * 2016-12-16 2018-11-27 温州医科大学 一种9-取代-n-（2-氯苄基）嘌呤-6-胺类衍生物及其制备方法和应用
WO2022012702A1 (en) * 2020-07-13 2022-01-20 Univerzita Palackeho V Olomouci Nitrogen heterocyclic cytokinin derivatives, compositions containing these derivatives and use thereof

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE2524284A1 (de) * 1966-12-21 1976-10-28 Boehringer Mannheim Gmbh Adenosin-derivate und verfahren zu ihrer herstellung
DE1670175A1 (de) * 1966-12-21 1970-11-05 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Herstellung von Adenosin-Derivaten
DE1670265A1 (de) * 1967-08-25 1971-01-28 Boehringer Mannheim Gmbh 2-Amino-Adenosinderivate und Verfahren zu deren Herstellung
DE2055160A1 (de) * 1970-11-10 1972-05-18 Boehringer Mannheim GmbH, 6800 Mannheim-Waldhof N(6M2,5-Dimethylbenzyl)-2-chloradenosin
DK62692D0 (cs) * 1992-05-14 1992-05-14 Novo Nordisk As
CZ294538B6 (cs) * 2002-12-30 2005-01-12 Ústav Experimentální Botaniky Akademie Vědčeské Re Substituční deriváty N6-benzyladenosinu, způsob jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující
US7385051B2 (en) * 2005-01-24 2008-06-10 Bar-Llan University Fluorescent N2,N3-etheno-purine (2′-deoxy) riboside derivatives and uses thereof
EP1883646A1 (en) * 2005-05-19 2008-02-06 Cv Therapeutics, Inc. A1 adenosine receptor agonists

Also Published As

Publication number Publication date
US20140066394A1 (en) 2014-03-06
EP2430036A1 (en) 2012-03-21
US20120071433A1 (en) 2012-03-22
EP2430036B1 (en) 2014-07-30
WO2010130233A1 (en) 2010-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5444063A (en) Enantiomerically pure β-D-dioxolane nucleosides with selective anti-Hepatitis B virus activity
KR100416335B1 (ko) 내독소혈증의치료및예방에유용한치환지당류
JPH10508288A (ja) 置換された０▲上６▼−ベンジルグアニンおよび６（４）−ベンジルオキシピリミジン
CZ2009298A3 (cs) Substituované 6-benzylaminopurin ribosidy, jejich použití a farmaceutický prípravek tyto slouceniny obsahující
CZ294535B6 (cs) Heterocyklické sloučeniny na bázi N6-substituovaného adeninu, způsoby jejich přípravy, jejich použití pro přípravu léčiv, kosmetických přípravků a růstových regulátorů, farmaceutické přípravky, kosmetické přípravky a růstové regulátory tyto sloučeniny obsahující
CZ20024273A3 (en) Substitution derivatives of n sp 6 sp -benzyladenosine, methods of their preparation, their use for preparation of drugs, cosmetic preparations and growth regulators, pharmaceutical preparations, cosmetic preparations and growth regulators containing these compounds
CZ20022353A3 (cs) Deriváty purinu, způsob jejich přípravy a jejich použití
PL164967B1 (pl) Sposób wytwarzania nowych rybonukleozydów1. Sposób wytwarzania nowych rybonukleozy- PL PL
HU211537A9 (en) Therapeutic nucleosides
JP2002543129A (ja) 抗微生物剤としての新規なプロリン類
JPS63310831A (ja) 抗ウイルス化合物
CZ2014908A3 (cs) 6,8-Disubstituované-9-(heterocyklyl)puriny, přípravky obsahující tyto deriváty a jejich použití v kosmetických a medicínských aplikacích
KR100249111B1 (ko) 면역억제제로서 유용한 카르보시클릭 아데노신 동족체
EA001404B1 (ru) Производные ациклических нуклеозидов
HU200461B (en) Process for producing new 9-(n-hyudroxyalkoxy)-purine derivatives and pharmaceutical compositions comprising such compounds
EP3615535B1 (en) 9-(2-oxacycloalkyl)-9h-purine-2,6-diamine derivatives and their use for the treatment of skin disorders
US20130072506A1 (en) 6,8-disubstituted purine compositions
TWI537245B (zh) 用於治療自體免疫發炎疾病之化合物
US9073961B2 (en) Substitution derivatives of N6 -benzyladenosine-5′-monophosphate, methods of preparation thereof, use thereof as medicaments, and therapeutic preparations containing these compounds
Dutta et al. Synthesis and biological activities of some N6-and N9-carbamoyladenines and related ribonucleosides
KR0175313B1 (ko) 면역억제제로서 유용한 카르보시클릭 뉴클레오시드 동족체
EP0186454B1 (en) 6-purinyl n-(2-chloroethyl) carbamate and thiocarbamate, a process for their preparation and use thereof
JP2019524654A (ja) 新しいタイプのタキサン化合物、その製造方法および適用
HK40035878A (en) Cyclic di-nucleotide compounds and methods of use
KR100333749B1 (ko) O6-치환구아닌유도체,그것의제조방법및종양세포치료에서그것의사용