FI67847C

FI67847C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara 9-hydroxialkylpuriner

Info

Publication number: FI67847C
Application number: FI792848A
Authority: FI
Inventors: Alfredo Giner-Sorolla
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer; Newport Pharmaceuticals
Priority date: 1978-09-15
Filing date: 1979-09-13
Publication date: 1985-06-10
Also published as: IL58086A; DK145627B; PL124228B1; YU224679A; AU527881B2; JPS5559188A; MX6270E; PH15921A; HU180892B; IL58086A0; PL218318A1; US4221910A; ES484168A1; IE791752L; EP0009155B1; AU5055679A; DE2964059D1; CS241023B2; JPH031310B2; NO792791L

Description

rBl m,KUULUTUSjULKAISU , η p a η ^|fg 11 UTLÄGG Nl N GSSKRIFT 0^04/ (45) Pa to i ;t π; c d d:. 1 a t (51) Kv.lkZ/Int-CI.* C 07 D 473/30 S U O M I — FI N L A N D (21) Patenttihakemus — Patentansökning 792848 (22) Hakemispäivä — Ansökningsdag Qg yg (23) Alkupäivä — Giltighetsdag 1 ^ Qg yg

(41) Tullut julkiseksi — Blivit offentlig ^ ^ gQ

Patentti- ja rekisterihallitus Nähtäväksipanon ja kuul.julkaisun pvm.— _ β

Patent-OCh registerstyrelsen ' ' Ansökan utlagd och ucl.skriften publicerad 28,02.85 (32)(33)(31) Pyydetty etuoikeus — Begärd prioritet 15.09.78 USA(US) 942804 (71) Newport Pharmaceuticals International, Inc., 1590 Monrovia Boulevard, Newport Beach, California,

Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 1275 York Avenue,

New York, New York, USA(US) (72) Alfredo Giner-Sorol1 a , Riverside, Connecticut, USA(US) (74) Oy Koister Ab (54) Menetelmä uusien, terapeuttisesti käytettävien 9-hydroksialkyyli-puriinien valmistamiseksi - Förfarande för f ramstä11 ning av nya , terapeutiskt användbara 9-hydroxialkylpuriner Tämän keksinnön kohteena on menetelmä uusien, terapeuttisesti käytettävien 9-hydroksialkyylipuriinien valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava

OH

!

-N · N

HC-CH-CHg

R1 OH

jossa R·*· on 1-8 hiiliatomia sisältävä alkyyli.

Näitä yhdisteitä valmistetaan siten, että a) vastaava 9-substituoitu 6-amino-puriini diatsotoidaan natriumnitri.itillä happamassa liuoksessa, OH-ryhmän saamiseksi 6-asemaan, tai 67847 b) vastaavaa 9-substituoitu 6-kloori-puriini hydrolysoidaan alkaalisessa liuoksessa kuumentaen OH-ryhmän saamiseksi 6-asemaan.

Yhdisteet ovat immunomodulaattoreita, niillä on viruksia vastustava vaikutus ja kasvaimia vastustava vaikutus ja ne ovat lisäksi entsyymi-inhibiittoreita.

Yhdisteet voidaan niin ikään saattaa reagoimaan p-asetamido-bentsoehapon amiinisuolojen kanssa sellaisten kompleksien muodostamiseksi, jotka jossain tapauksissa voimistavat yllä mainittuja vaikutuksia. Komplekseilla on kaava

OM

i

1 I

" n ^ <Y>Z

\ ' HC-CH-CK..

I 0 1 f

K OH

Y on p-asetamidobentsoehapon kanssa muodostettu amiinisuola, jossa amiinilla on kaava E1

N(CnH2n)OH

R

4 jossa R ja R ovat alempia alkyylejä, esim. metyyli, etyyli, pro-pyyli, butyyli, isopropyyli tai isobutyyli, n on kokonaisluku 2-4 ja z on luku väliltä 1-10.

Immunologisia reaktioita säätelevä vaikutus näyttää lisääntyvän R^in ketjun pituuden kasvaessa, ainakin metyylistä heksyyliin. R1 on edullisesti n-alkyyli, toisin sanoen metyyli, etyyli, n-pro-pyyli, n-butyyli, n-amyyli, n-heksyyli, n-heptyyli tai n-oktyyli. Tyypillisiä esimerkkejä asetamidobentsoehapposuolojen muodostamisessa käytettävistä amiineista ovat dimetyyliaminoetanoli, dimetyy-liaminoisopropanoli, dietyyliaminoetanoli, dietyyliaminoisobutanoli, dietyyliaminoisopropanoli, metyylietyyliaminoetanoli, di-isobutyy-liamino-N-butanoli, dimetyyliaminopropanoli, dimetyyliamino-N-buta-noli, di-isobutyyliaminoetanoli, dimetyyliaminobutanoli, dibutyyli- 67847 amino-N-butanoli, dibutyyliaminoetanoli, dipropyyliaminoetanoli ja di-isopropyyliaminoetanoli. Tässä yhteydessä edullisin amiini on dimetyyliaminoisopropanoli. Kun Y on läsnä, toisin sanoen z on 1-10, niin tällöinz mieluimmin on 3. z voi kuitenkin olla myös 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 tai 10.

Niiden yhdisteiden ohella, joissa Y on amiinin R?.

4^N(CnH2n)0H

R

p-asetamidobentsoehapon kanssa muodostettu suola, voidaan myös valmistaa suoloja, joissa amiini on edellä määritellyn mukainen ja happo on farmaseuttisesti hyväksyttävä happo, muu kuin p-asetamidobent-soehappo, esim. kloorivetyhappo, rikkihappo, bromivetyhappo, fosfo-rihappo, etikkahappo, propionihappo, malonihappo, maitohappo, sitruunahappo, viinihappo, p-tolueenisulfonihappo, adipiinihappo, ma-leiinihappo, meripihkahappo, metaanisulfonihappo, salisyylihappo, asetyyliselisyylihappo.

Kun Y on läsnä, lyhenne DIP·PAcBA merkitsee yhdisteiden kuvauksissa jäljempänä dimetyyliamino-2-propanoli-p-asetamidobentsoaat-tia. Mikäli tätä lyhennettä ei seuraa suluissa oleva numero, esim. (10), niin Y on 3. Mikäli lyhennettä DIP·PAcBA seuraa suluissa oleva numero, niin tämä numero merkitsee yhtä 9 -(hydroksi-alkyyli)-puriinimolekyyliä kohden läsnä olevien Y-ryhmien moolien lukumäärän.

Immunomodulaattori on yhdiste, joka säätelee immuunireaktiota. Sen toimintaan kuuluvat siis sekä immuniteetin stimulaatio (im-munopotentiaatio) että immuniteetin inhibitio. Immuniteetin stimulaatio on tietenkin hyödyllinen immuniteetin luomisessa. Immuniteetin inhibitiolla on myöskin käyttöä monilla alueilla. Se on käyttökelpoinen esimerkiksi elinten siirtojen yhteydessä elimistön hylkimisreaktion estäjänä esimerkiksi munuais- ja sydänsiirroissa.

Yhdisteiden immuniteettiä synnyttäviä ominaisuuksia esittelevissä taulukoissa plus-merkki (+) tarkoittaa immuniteettiä synnyttäviä ominaisuuksia ja miinus-merkki (-) tarkoittaa immuniteettiä estäviä ominaisuuksia. Luku 0 merkitsee sitä, että yhdisteellä ei ole immuniteettiä synnyttäviä eikä estäviä ominaisuuksia.

Mitogeeni on aine, joka saa aikaan immunisaation aikana tapahtuvaa solujen proliferaatiota, 67847

Taulukosta 1 käyvät ilmi keksinnön mukaiset yhdisteet. Keksinnön mukaiset yhdisteet ovat käyttökelpoisia hoidettaessa nisäkkäitä (ja nisäkkäiden soluja) mukaan lukien ihmiset, siat, koirat, kissat, nautakarja, hevoset, lampaat, vuohet, hiiret, kaniinit, rotat, marsut, hamsterit, apinat jne.

Kaikki osuudet ja prosentit ovat paino-osia ja -prosentteja, ellei toisin ole ilmoitettu.

Kaikki lämpötilat ovat Celsius-asteita, ellei toisin ole ilmoitettu.

Yhdistelmiä, jotka sisältävät keksinnön mukaista yhdistettä, voidaan antaa nisäkkäille tavanomaisilla tavoilla, esimerkiksi suun, nenän, peräsuolen, tai vaginan kautta tai parenteraalisesti. Niitä voidaan käyttää ruiskutettavina liuoksina, esimerkiksi veteen liuotettuina, tai sitten tabletteina, pillereinä, kapseleina jne.

Taulukko 1

Keksinnön mukaisten 9-(hydroksi-alkyyli)-puriinien kemiallisten ominaisuuksien yhteenveto

OH

N 'S N

’ i 'N N (Y) C* i

HC-CH-CH3 R1 OH

N: o___Yhdiste__ Synteettinen R1 γ menetelmä 15446 _H_-__A__ 15447 __H_DIP· PAcBA_L__ _C6H13 _I__J_

15410 C,H, , DIP.PAcBA L

__O 13_ 5 6 7 8 4 7 N: o_UV-spektrit__Alkuaineanalyysi

Kons.

_Sp.°C_Λmaks. min-__10 ^_Ph_C___H_N

250 223,5 11,0 7 15446 244-5 250 220 10,6 1 ____254 233,5 12,1 10____ 250 224 12,1 7 lask. 60,41 7,97 20,13 15392 202°C 248 222 13,1 1 saatu 60,47 7,86 20,08 _254_220_14,1 10___

Muut keksinnön mukaiset yhdisteet ja niihin liittyvät p-ase-tamidobentsoehapposuolat on esitetty alla olevassa taulukossa la, jonka peruskaava on sama kuin taulukossa 1. Taulukoissa 1 ja la kaikki R :n kohdalla esitetyt alkyyliryhmät ovat n-alkyylejä.

Taulukko la Yhdiste

R1 Y

C6H13 DIP·PAcBA(10) C6H13 DIP·PAcBA(1) ch3

CH3 DIP-PAcBA

C2H5

C2H5 DIP-PAcBA

C3H7

C3H7 DIP-PAcBA

C4H9

C4Hg DIP-PAcBA

C5Hi;l DIP-PAcBA

C5H11

C7H15 DIP-PAcBA

C8H17

CgH17 DIP·PAcBA

6 67847

Keksinnön mukaisten yhdisteiden valmistus- ja käyttömene-telmien kuvaus.

Menetelmä A

9-(2-hydroksi-l-propyyli)-hypoksantiini (NPT 15446)

NH2 OH

A - x

N'T' NO2 Ν '" N ''N

j-, .. ÄcOH ^ 1 \

'N N NN

CH2_?H_CH3 CH -CH-CH..

i 2 ! 3

OH OH

9-(2-hydroksi-l-propyyli) -adeniinia (I, 4,0 g, 20,7 itunoolia) suspendoitiin 50 %:seen etikkahappoon {20 ml) ja lisättiin hitaasti natriumnitriittiä (4 g, 58 mmoolia). Seosta sekoitettiin 25°:ssa 3 tuntia. Saatu liuos haihdutettiin kuiviin ja lisättiin isopropanolia; tämä toimenpide toistettiin vielä kerran. Kiinteää jäännöstä keitettiin isopropanolissa ja suodatettiin. Suodos haihdutettiin ja kiteyttäminen suoritettiin lisäämällä siihen asetonia. Uudelleen kiteytys tapahtui isopropanolin ja metanolin seoksesta (98:2); saatiin väritön kiteinen tuote. Saanto 3,3 g (82 %) , sp. 244-250°, UV (H2O; pH 5,5) Λ maks. 250 nm.

Menetelmä J

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (NPT 15392)

Juoksukaavioista 1 ja 2 käy ilmi erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiinin (Nonyylihypoksantiini, VIII) synteesivai-heiden luonnos. H. J. Scahefferin ja C. F. Scwenderin menetelmään, J. Med. Chem., 17, 6 (1974), erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripuriiniin johtavaan reaktiosarjaan tehdyt parannukset on mainittu. Viimeinen vaihe, 6-klooripuriinijohdannaisen (VII) hyd-rolyysi, jolla päästään nonyylihypoksantiiniin (VIII), on A. Giner-Sorollan, C. Gryten, A. Bendichin ja G. B. Brovmin julkaisussa J. Org. Chem. 34, 2157 (1969) esittämän halogeenipuriinien hydro-lysointimenetelmän sovellutus.

Vaihtoehtoinen tie, toisin sanoen erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniinin (EHNA) (IX), nitrosointi, jolla päästään nonyy- 7 67847 lihypoksantiiniin (VIII) (esitetty juoksukaaviossa 2), käsittää kloorijohdannaisen (VII) muuttamisen ennalta ammonolyysillä ami-nopuriiniksi (IX, EHNA), mitä seuraa nitrosointi nonyylihypoksan-tiinin (VIII) saamiseksi.

Juoksukaavio 1

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) synteesin luonnos

Vaihe 1 Asetamidononaani-2-oni (II) 2-amino-oktaanohapon asylointi (ch3co)2o ch--zch 7 -ch-cooh-----------> ch -/ch„7 -ch-coch0 3 ^ 5 ; 70% 3 ^ 5 i 2 3 NH2 /u * NH2

I II

Vaihe 2 Asetamidononaani-2-onin hydrokloridi (III)

Asetamidononaani-2-onin hydrokloridin muodostaminen HC1 CH_-/CH / -CH-COCH-----^ CH--/CH0/.--CH-COCH- j 2 5 3 ^ 7 % ^ 25 -3 NH2 NH2*HC1

II III

Vaihe 3 Erytro-3-amino-2-nonanoli (IV)

Asetamidononaani-2-onin hydrokloridin pelkistäminen

KBH

CH--/CH„7-CH-COCH,------—·» CH,-/CH- 7,-CH CH-CH- 3-^-5, 3 75 s 3 l ä , ; 3

nh2-hci nh2 OH

III IV

(Nuolen alla olevat luvut tarkoittavat saantoa prosentteina)

Vaihe 4 Erytro-5-amino-4-kloori-6-(2-hydroksi-3-nonyyli-amino)-pyrimidiini (VI)

Erytro-3-amino-2-nonanolin kondensointi 5-amino-4,6-dikloo-ripyrimidiinillä 67847 8

Cl CH3 Cl I NH, /CH^/c I NH, * ·" 2 'i ‘ , s-'··-' > k 2 54 % ^ x

' Cl CHOH "N x NH

CH3 CH

CH,-/CH,7c 'CHOH

3 ' 2 o | V IV VI CH3

Vaihe 5 Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripuriini (VII) Erytro-5-amino-4-kloori-6-(2-hydroksi-3-nonyyliaraino)-pyri-midiinin (V) renkaan sulkeminen

Cl Cl i i NH, i.

N ^ (C-H,. 0) ,CH ψ- i jj -?_5-3-> t! ,\

‘X X 100% X

• NH |

CH

CH \

- \ CH,-/CH,7c CHOH

CH3-/CH275 CHOH 3-25 CH0 CH3 3

Vaihe 6 Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (VIII) (Hydrolysoimalla 6-klooripuriinijohdannainen)

Cl OH

X"" oh" κΧχΧ3 ' N ' "Ιί 100 % '^

I N

CH . CHX

X /„CH 7 ' CHOH

CH0-/CH,/r- ' CHOH ^ S

3 2 3 ; ch CH3 CH3

VII VIII

9 67847

Juoksukaavio 2

Erytro-9-{2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) vaihtoehtoinen valmistustie

Vaihe la Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniini (IX)

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripuriin in (VII) ammonolyysi

Cl Cl ! ί v · .. -N N .

h r NH-, !' ^ ; ί —3—> i-

K 92 % N N

“ ! i CH , CH.

CH^-/CH^7r ^ CHOH cH3-/_CH275 CHOH

5 £ 5 ί ch3 ch3

VII IX

Vaihe 2b Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (VIII)

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniinin (IX) nit- rosointi

nh2 OH

i ; H'-' - N s Ι II > 1 il ' .

"N XN 75 % ’>n '-N

CH CH

\ _ / \

CH -/.CH275 'CHOH CH3-ZCH2/5" X CHOH

CH3 ch3

IX VIII

67847 10 3-asetamidononaani-2-oni (II) (£Η CO) CH0- /_CH / -CH-COOH -----------------> CH--/CH_.7c“CH-COCH, 325, ms 3 25| 3 K 70 *

I II

Seosta, joka sisälsi 2-amino-l-oktaanihappoa (I, 200 g) 1,26 moolia) asetanhydridissä (960 ml) sekä pyridiiniä (640 ml), kuumennettiin kiehuvalla vesihauteella 4 tuntia. Reaktioseos haihdutettiin tyhjössä ja jäännös erotettiin 6-8 kertaa 5 %:sella NaHCO^in vesiliuoksella (400 ml) ja eetterillä (400 ml). Yhdistetyt eetteriuutteet kuivattiin vedettömällä MgS04:llä ja haihdutettiin kuiviin, jolloin saatiin 3-asetamidononaani-2-onin raaka-tuote , 154 g (70 %) .

3-amino-2-nonanonin hydrokloridi (III) HC1 CH -/CH-Ze-CH-COCH---------------------> CH_-/CH-/c-CH-C0CHo • 3 · ' 2 5 | 3 3 5 | 3 NH2 67 % NH2*HC1

II III

Edullisessa toimenpiteessä saatu raakatuote (154 g) liuotettiin kloorivetyhapon konsentroituun vesiliuokseen (1,540 ml) ja keitettiin palautusjäähdyttäen 2 tuntia ja haihdutettiin sitten kuiviin tyhjössä. Saatu kiinteä aine kiteytettiin uudelleen lämpimästä etanoliliuoksesta (200 ml) ja jäähdytettiin sitten 25°:seen. Tähän liuokseen lisättiin eetteriä (600 ml). Tällöin ilmestyi valkea kiteinen saostuma; suspensiota seisotettiin 5°:ssa yön ajan. Saostuma koottiin ja pestiin eetterillä (kerran 100 ml :11a) jolloin saatiin 125 g (67 %) valkeata kiteistä tuotetta, sp. 112°, hajoaa.

Mikäli kiteinen aine ei ollut valkoista tai sen sulamispiste oli alhainen, se oli kiteytettävä uudelleen hiilen avulla tetrahyd-rofuraanista. Tätä toimenpidettä suoritettaessa käytettiin 150 mi hydrofuraania 100 g hydrokloridin (III) raakatuotetta kohden.

67847

Erytro-3-amino-2-nonanoli (IV) KBH .

CH-,-/CH„ / -CH-COCH_---------> CH0- /CH_ 7C-CH-CH-CH.

5 - δ b 3 7ς ο ό Z 5 / \ 3

NH?'HCl NH2 X0H

III IV

3-amino-2~nonanolin hydrokloridia (43,8 g, 0,226 moolia) liuotettiin absoluuttiseen metanoliin (150 ml) ja jäähdytettiin -10°:seen jää-suolahauteessa. 1/ Lisättiin kaliumboorihydridiä (24,4 g, 0,45 moolia) pieninä annoksina 2/ 2-3 tunnin aikana. Seosta pidetään sitten -10°:een ja -15°:een välisessä lämpötilassa 3 tuntia 3,4/ ja annettiin hitaasti lämmetä huoneen lämpötilaan (22°) ja sekoitettiin sitten yön ajan (20 h) huoneen lämpötilassa. Seos haihdutettiin sen jälkeen kuiviin (siirappimaiseksi) tyhjössä ja erotetaan vedellä (150 ml) ja kloroformilla (150 ml). Vesikerros uutettiin vielä (3 x) kloroformilla (100 ml kukin). Kloroformiker-ros kuivattiin MgS04:llä ja haihdutettiin tyhjössä, jolloin saatiin hieman kellertävä öljymäinen tuote. Tämä neste tislattiin tyhjössä (0,15 mm Hg) 95-100°:ssa, jolloin saatiin puhdas erytro-3--amino-2-nonanoli, 26,4 g, 75 % saanto, sp. 81-86°.

1. Jäähdytettäessä yhdisteen III liuosta saostuu hiukan ainetta; tällä ei ole vaikutusta reaktion lopputulokseen.

2. Tässä kohdassa kyseinen menetelmä eroaa Schaefferin et ai. menetelmästä. Schaeffer lisää etikkahapon samanaikaisesti KBH^rn kanssa pitäen pH:n välillä 5-6. On havaittu, että neutralointi saa aikaan KBH^in häviötä ja että yli 5:n olevat pH-arvot ovat vielä mahdollisia. Vieläkin tärkeämpi on se seikka, että etikkahpon ja KBH4:n samanaikainen lisääminen (kuten Schaeffer ehdottaa) tekee reaktiosta hyvin vaikeasti hallittavan. Lämpötila kohoaa huomattavasti ja aiheutuu saantohäviöitä ja/tai tuotteen laatu kärsii.

3. On suositeltavaa käyttää tehokasta sekoitusta reaktion asianmukaisen kulun varmistamiseksi, sillä reaktio on päättynyt vasta kun kaliumboorihydridikokkareet ovat kokonaan kadonneet.

4. Jäädhyttäminen 0°:seen, kuten Schaeffer et ai kuvaavat (menetelmä D, rivi 4 ja siitä edelleen) on riittämätöntä. On parempi pitää reaktion lämpötila selvästi 0°:seen alapuolella; pa- 12 67847 rasta on pitää se alle -10°:ssa koko ajan. Mikäli lämpötila pääsee kohoamaan yli -10°:seen saattaa aiheutua huomattavia saanto-häviöitä .

Erytro-5-amino-4-kloori-6-(2-hydroksi-3-nonyyliamino)-py- rimidiini (VI)

Cl cl ί i NH- NH2 j !j + CH3-/_CH275-CH-CH-CH3-jrj|>[ ^ |l ^N· ‘""Cl ! * N "NH2 nh °H i 2

* CH

CH-j- / CH^7,- ^^CHOH 3 δ 5 CH3

V IV VI

25°:ssa sekoittamalla valmistettiin seos, joka sisälsi 4,6-dikloori-5-aminopyrimidiiniä (V, 24,6 g, 0,15 moolia) ja erytro- 3-amino-2-nonanolia (IV, 26,2 g, 0,164 moolia) 1-pentanolissa (1,080 ml) ja tributyyliamiinissa (350 ml). Saatua suspensiota keitettiin palautusjäähdyttäen typpikaasukehässä 28 h (liukeneminen tapahtui noin puolessa tunnissa). Tässä vaiheessa reaktio-tuotteesta otettu näyte antoi UV:llä maks 267 ja 297 nm (^0, pH 5,5).

Saatu liuos konsentroitiin kuumalla vesihauteella 10 mm:n paineessa siirappimaiseksi ja haihdutettiin edelleen öljyhauteella 0,1 mm:ssä ja 100°:ssa saaden tahmea neste, johon lisättiin n-hek-saania (450 ml). Seosta keitettiin palautusjäähdyttäen 1 tunti ja kuuma kellertävä pinnalle noussut heksaani erotettiin pyöreäpoh-jaisen kolvin pohjalle jääneestä nesteestä.

Saadusta vaaleanruskeasta öljystä haihdutettiin tyhjössä viimeisetkin jätteet heksaanista ja liuotettiin se sitten kloroformiin (150 ml). Tämä kloroformiliuos uutettiin 8 kertaa NaHC03:n kyllästetyllä vesiliuoksella (250 ml kullakin kerralla). Kloro-formikerros erotettiin sitten, kuivattiin (natrium- tai magnesium-sulfaatilla) ja haihdutettiin vakuumissa (0,1 mm) 40°:ssa (vesi-haude) , jolloin saatiin ruskea, jäähtyessään kiteytyvä öljy. Tätä 13 67847 ainetta voidaan käyttää sellaisenaan seuraavassa vaiheessa tai se voidaan puhdistaa seuraavasti: Saatu öljy liuotettiin 75- .

100 ml:aan kloroformia ja tähän lisättiin n-heksaania (noin 300 ml), jolloin saostunut valkea kiteinen aine suodatettiin jäähtyneestä liuoksesta. (Uuttaminen suoritetaan 4-8 kertaa, kunnes hiilidioksidia ei enää vapaudu). Tämä käsittely toistettiin vielä kaksi kertaa. Saanto: 23,3 g (54 %) , UV '1 maks. 267, 297 (H^O, pH 5,5), sp. 113-116°C.

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-klooripuriini (VII)

Cl Cl

l - NH2 J

(OC9H ) CH N r^"N

| i -5-> i i! l--xN 100 % ' f1 en CH / \

/ \ CH0-^CH^/c - CHOH

CH0-/CHn7c ^ CHOH ‘ 3 - 2' 5 | CH^ CH,

VI J VII

Edellä saatu erytro-5-amino-4-kloori-6-(2-hydroksi-3-nonyy-liamino)-pyrimidiiniä sisältävä siirappimainen raakatuote (11,48 g, 40 mmoolia) liuotettiin trietyyliortoformiaattiin (106 ml) ja kloroformiin (34 ml), etaanisulfonihappoa (10 tippaa) lisättiin liukenemisen helpottamiseksi. Liuosta seisotettiin 25°:ssa yön ajan, ja haihdutettiin sitten se siirappimaiseksi vakuumissa. Saanto 11,7 g (kvantitatiivinen). Tämä erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)- 6-klooripuriinin (VII) raakatuotteesta koostuva siirappi käytettiin seuraavassa vaiheessa, A maks. 264 nm.

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiini (VIII) (6-klooripuriinijohdannaisen hydrolyysillä) 67847

ci OH

I ^ ;

N' NN

L ‘} '' _QH~--> l· i; > ^N ' "--N XN N x

| I

CH CH

CH3-/CH27'5 XCHOH /-δΗ2^5 CHÖH

CH, / " CH, 3 CH, 3

VII VIII

Suspensiota, joka sisälsi erytro-6-kloori-9-(2-hydroksi- 3-nonyyli)-puriinia (VII, 4,0 g, 13,4 mmoolia) 0,5 N NaOHtssa (40 ml), keitettiin palautusjäähdyttäen 2 tuntia ja jäähdytettiin sitten. Neutralointi jääetikalla ja jäähdyttäminen antoi erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) kiteisenä saostumana, joka suodatettiin ja kuivattiin. Saanto: 3,8 g (kvantitatiivinen) , sp. 196°, UV Λ maks. (pH 5,5) 251 nm.

Näin saatu raakatuote (VIII) osoittautui homogeeniseksi paperikromatografiällä (3 liuotinta) ja antoi negatiivisen tuloksen Cl -testillä (kuparilanka ja liekki; sulatus natriumin kanssa, happamaksi tekeminen ja hopeanitraatti).

Kiteytettäessä raakatuotenäyte kolme kertaa uudelleen etanolin vesiliuoksesta (katso puhdistaminen) saatiin värittömiä kiteitä. Sp. 202°. Laskettu kaavalle ci4H22N4°2 (VIII); C, 60,41; H, 7,97, N, 20,13. Saatu: C, 60,47; H, 7,86; N, 20,08.

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksantiinin (VIII) puhdi staminen

Nonyylihypoksantiinin (VIII) raakatuote puhdistetaan uudelleen kiteyttämällä. Epäpuhdas aine liuotetaan kuumentamalla painoonsa nähden 6-10 kertaiseen määrään etyylialkoholia ja lisätään tilavuudeltaan yhtä suuri määrä HO. Liuosta käsitellään hiilellä erlenmeyerkolvissa ja se suodatetaan seliitillä kuumana. Liuosta haihdutetaan jatkuvasti sekoittaen sähkölevyllä. Vettä lisätään pieninä annoksina haihtuneen tilavuusmäärän tilalle, kunnes muodostuu runsas saostuma. Liuosta haihdutetaan jatkuvasti kaiken etyyli- 67847 alkoholin poistamiseksi lisäten samalla vettä, jotta seoksen tilavuus pysyy noin 8-12 kertaisena saostuman painoon nähden. Ainehäviö on noin 10 % kullakin kiteytyskerralla. Kahdella kiteyttämisella sulamispiste saatiin kohoamaan 202°:seen ja kiteinen tuote oli väritön, kun raakatuote taas oli hieman keltainen tai vaaleanpunainen ja suli 192°:ssa.

Erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniini. HC1 (IX)

Cl , NH0 i Δ .1 l N NH · Ί \ ^ ' ' ’ N HC1 ' " N N . , I w HC1

CH CH

ch3-/ch275 'choh ch3-/_ch275 choh ί ! CH3 CH3

VII IX

Edellisistä vaiheista saatu erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)- 6-klooripuriinin (VII) öljymäinen raakatuote liuotettiin ammoniakin kyllästettyyn metanoliliuokseen (300 ml) ja ammoniumkloridiin (1 g) 30-100°:ssa 1 tunnin ajan ruostumattomasta teräksestä valmistetussa pommiputkessa (Parr Instruments). Jäähdytyksen jälkeen liuos haihdutettiin kuiviin tyhjössä. Lisättiin metanolia ja haihdutettiin uudestaan (3 kertaa) ylimääräisen ammoniakin poistamiseksi .

Siirappimainen jäännös liuotettiin absoluuttiseen metyyli-alkoholiin ja kuivan HCl-kaasun annettiin kuplia siihen pitäen lämpötila alle 20°:ssa (jäävesihauteella). Kun HCl:ää oli kupli-tettu puoli tuntia, seos jäähdytettiin 5°:seen. Saostuma koottiin lasisintterillä, pestiin kylmällä metyylialkoholilla ja kuivattiin ilmassa. Saanto 6,0 g (92 %), sp. 173-175°, hajoaa, UV Λ maks.

260 nm (H20, pH 5,5) .

Vaihtoehtoinen tie erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-hypoksan- tiinin (VIII) valmistamiseksi (Deaminoimalla VII) 16 67847

»2 . OH

I i

NaNO„ N ’^N\ : I / --->, H /

'-N·'' "'-N AcOH; N HC1 " N

CH CH·..^ ch3-Z.ch275 '^choh ch3-/ch275 choh L3 CH3

VII VIII

Liuokseen, joka sisälsi erytro-9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-adeniiniä (IX, 4,0 g, 14 irunoolia) 50 %:sessa etikkahapossa (20 ml) ja 1 N HC1 (3,2 ml), lisättiin natriumnitriittiä (5,6 g, 71 mmoo-lia) 25°:ssa koko ajan sekoittaen. Sekoitusta jatkettiin 2 tuntia 25°:ssa. Tämän jälkeen ajettiin UV-spektri. Kun UV A maks. saavutti arvon 250 nm, liuos neutraloitiin 2 N NaOHslla. Saatu saostuma suodatettiin ja pestiin i^Oilla. Saanto = 3,03 g (75 %), sp. = 195°.

Analyyttinen näyte kiteytettiin uudelleen (3 kertaa) vedestä, jolloin saatiin 202°:ssa sulava tuote. Analyysi: Laskettu kaavalle c14H22N4°2: C' 60'40; H' 7'96'· N' 20,13. Saatu: C, 60,40; H, 7,90; N, 20,12.

Menetelmä L

Yhdisteen NPT 15410 valmistaminen 0,1 mmoolia 9-(2-hydroksi-3-nonyyli)-6-hydroksi-puriinia, NPT 15392 (27,9 mg) ja 0,3 mmoolia 2-hydroksipropyyli-dimetyyli-ammonium-4-(asetyyliamino)-bentsoaattia (DIP.PAcBA) (77,1 mg) punnittiin tarkasti ja liuotettiin 105 ml:aan 0,25 %:sta natrium-karbonaattia (Na2CC>3), jolloin saatiin NPT 15410:n 0,1 %:nen liuos (yhdiste muodostui NPT 15392:sta ja DIP:PAcBA:sta moolisuhteella 1:3) .

Todisteita kompleksimuodostuksesta NPT 15392:11a ja DIP.PAcBA:11a suoritetut faasien liukoisuus-tutkimukset osoittivat, että NPT 15392:n liukoisuus kasvaa DIP.PAcBA:n konsentraation kasvaessa olosuhteissa, joissa pH on vakio. Tämä osoit- 17 67847 taa, että liuoksessa tapahtuu kompleksia muodostavaa vuorovaikutusta .

Moolisuhteen 1:3 sijasta (NPT 15392 ja DIP.PAcBA) voidaan muodostaa muita komplekseja käyttäen moolisuhteita 1:1 ja 1:10.

Alla olevassa taulukossa on esitetty DIP.PAcBA-suolojen suhteellinen kyky voimistaa eri biologisia vaikutuksia.

DIP.PAcBA- Anti- Anti-leukemia- Iirmino-

Yhdiste_Suola_influessa_potentiaatio__potentiaatio 15392 15410 Molenmat yhtä kyllä kyllä aktiivisia 15446 15447 kyllä

Hiirten in vivo-käsittely NPT 15392:11a ja NPT 15410:11a: vaikutus CONCAVALIN A:11a in vitro aiheutettuun pernasolujen kasvun stimulaatioon Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli määrittää, mitä vaikutusta hiirten in vivo käsittelyllä yhdisteillä NPT 15392 ja 15410 on näistä eläimistä eristettyjen pernasolujen myöhempään aktiivisuuteen ja arvioida in vitro näiden solujen kasvuvastinetta mito-geenillä, Concavalin A:11a (Con A).

Menettely In vivo-käsittely

Yhdeksän urospuolista 8-9 viikkoa vanhaa 18-20 g painavaa Balb/c hiiret jaettiin kolmeen ryhmään. Yksi ryhmä käsiteltiin kahdesti päivässä (yhden päivän ajan), aamulla ja iltapäivällä antamalla suun kautta 10 mg:n annos kg:aa kohden NPT 15392 :ta. Toinen ryhmä käsiteltiin samalla tavalla NPT 15410:llä annoksen ollessa 20 mg/kg. Kolmas ryhmä sai annoksen suolaliuosta ja toimi siten kontrolliryhmänä.

Pernasolujen in vitro-tutkimus: Solujen valmistaminen Seuraavana päivänä kunkin ryhmän eläimet tapettiin ja pernat poistettiin ja yhdistettiin. Pernat hienonnettiin ja solut pestiin RPMI-1640-väliaineella (Grand Island Biologicals) johon oli lisätty 2 mm glutamiinia ja antibiootteja. Kunkin valmisteen solupitoi-suus määritettiin Coulter-laskimella ja säädettiin arvoon 5x10 solua/ml RPMI-väliaineella.

18 6 7 84 7

Mikrotiitterilevykoe

Mikrotiitterikokeita suoritettiin 0,2 ml:n inkubaatioilla, 5 jotka sisälsivät 5x10 solua ja Con A tai Con A ja yhdisteitä mainittuina pitoisuuksina. Kaikista kokeista suoritettiin kuusi rin-nakkaiskoetta, ja jokaista verrattiin ainoastaan soluja sisältävään nollakokeeseen. Koelevyjä inkuboitiin 37°:ssa 5 %:sessa CC^tssa 4 vuorokautta. Inkuboinnissa viimeisten 18-20 tunnin aikana kuhunkin viljelmään lisättiin 0,5 ml HTdR (10 pCi/ml, 6 Ci/mmooli). Viljelmät korjattiin multippelilla automaattisella näytteenkerääjäyk- 3 siköllä (MASH) ja niiden sisältämä HTdR (kuvasi solujen lisääntymistä) määritettiin Beckman LS 8000 nestetuikelaskurilla. Tulokset taulukoitiin Con Ailia tai Con Ailia ja yhdisteillä käsiteltyjen viljelmien aktiivisuuksien suhteina nollakoeviljelmiin.

In vivo-käsittely joko yhdisteellä 15932 tai yhdisteellä 15410 lisää pernasolujen myöhempää vastinetta in vitro Con Ailia optimaalisen alapuolella olevalla mitogeenipitoisuudella (5 pg/ml) aiheutettuun stimulaatioon. Stimulaatiosuhde 120il havaittiin 15392illa käsitellyistä hiiristä eristetyillä pernasoluilla verrattuna suolaliuoksella käsitellyistä hiiristä eristetyillä pernasoluilla saatuun suhteeseen 40:1. Mitään merkittäviä eroja yhdisteiden 15392 ja 15410 välillä ei havaittu, kun soluja stimuloitiin optimaalisemmalla Con A-pitoisuudella (10 pg/ml) .

Myös Con Ailia stimuloitujen solujen myöhemmän NPT 15392111a ja 15410:11a tapahtuvan in vitro-käsittelyn vaikutus testattiin pitoisuudella 1 pg/ml. Kumpikin yhdiste osoitti selvää kykyä lisätä Con A-stimulaatiota, etenkin optimaalisen alapuolella olevalla mitogeenipitoisuudella (5 pg/ml) ja vähäisemmässä määrin pitoisuu- / della 10 pg/ml. Pitoisuudella 5 pg/ml Con Aita NPT 15392 in aiheuttama stimulaatio on 2,8-kertainen verrattuna Con Ailia yksinään aiheutettuun stimulaatioon kun taas NPT 15410:11a lisäys on 3,3-kertainen.

Nämä tulokset osoittavat näiden yhdisteiden immunomoduloivaa vaikutusta pernasolujen kasvuun. Eläinten käsittely ennalta jommal-la kummalla yhdisteellä herkistää solut myöhempää mitogeenistä stimulaatiota varten, kun taas solujen käsittely in vitro yhdisteillä lisää lisääntymisvastinetta.

Claims

19 67847 1. iMenetelmä uusien, terapeuttisesti käytettävien 9-hydr-oksialkyylipuriininen valmistamiseksi, joilla on yleinen kaava OH X k \ HC-CH-CH- u 3 R OH jossa R on 1-8 hiiliatomia sisältävä alkyyli, tunnettu siitä, että a) vastaava 9-substituoitu 6-amino-puriini diatsotoidaan natriumnitriitillä happamassa liuoksessa, OH-ryhmän saamiseksi 6-asemaan, tai b) vastaava 9-substituoitu 6-kloori-puriini hydrolysoidaan alkaalisessa liuoksessa kuumentaen OH-ryhmän saamiseksi 6-asemaan.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään 9-substituoitua puriinia, jossa R on n-alkyyliryhmä.

3. Patenttivaatimusten 1 ja 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että siinä käytetään 9-substituoitua puriinia, jossa R on 1-7 hiiliatomia sisältävä n-alkyyli.

4. Patenttivaatimusten 1-3 mukainen menetelmä, tunnet- t u siitä, että siinä käytetään 9-substituoitua puriinia, jossa 1 R on 1-6 hiiliatomia sisältävä n-alkyyli.

5. Patenttivaatimusten 1-4 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että siinä käytetään 9-substituoitua puriinia, jossa on n-heksyyli. k