DD146050A5

DD146050A5 - Verfahren zur herstellung von 9-hydroxyalkylpurinen

Info

Publication number: DD146050A5
Application number: DD79215493A
Authority: DD
Inventors: Alfredo Giner-Sorolla
Original assignee: Newport Pharmaceuticals; Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1978-09-15
Filing date: 1979-09-12
Publication date: 1981-01-21
Also published as: NO152446B; IL58086A0; MX6270E; NZ191482A; IL58086A; DK145627B; IE48826B1; YU41885B; CA1121818A; DK145627C; DE2964059D1; IE791752L; FI67847C; DK385579A; YU224679A; PT70179A; AU527881B2; FI792848A; PH15921A; GR72523B

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 9-Hydroxyalkyl-purinen der allgemeinen Formel, in der X die OH-, SH- oder NH&ind2!-Gruppe, J oder Cl bedeutet, R&exp1! Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen und R&exp2! Wasserstoff oder die Methylgruppe ist. Diese Verbindungen stellen Immunmodulatoren dar, haben antivirale und Antitumorwirksamkeit und sind auch als Enzyminhibitoren wirksam.

Description

19*3.1980 56 098/12

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Herstellung von 9-Hydroxyalkylpurinen der allgemeinen Formel

in der X die OH-, SH- oder NH_O-Gruppe, J oder Gl bedeutet,

R Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoff-

atomen und R Wasserstoff oder die Methylgruppe ist_e

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Es wurde bereits in der US-PS 3 215 696 ein Verfahren zur Herstellung von 3-substituierten Adeninen (3-substituierte 6 Aminspurine) vorgeschlagene Weiterhin wurde in der US-PS 4 031 218 ein 7-(2~Hydroxypropyl)-1,3-di-n-propylxanthin mit bronchienerweiternder Wirkung vorgeschlagen·

Z_-JeI der Erfindung

Ziel der Erfindung ist die Herstellung neuer Verbindungen mit neuartigen pharmakologischer Anwendung»

de s We sens der Erfindung .

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verbindungen mit immunomodulatorischer Wirkung herzustellen

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Die erfindmigsgemäß erhältlichen Verbindungen sind Immunomodulatoren mit antiviraler und Antitumorwirkung und stellen auch Enzyminhibitoren dar* Man kann sie mit Aminsalzen der p-Acetamidobenzoesäure in Komplexe überführen, was in einigen Fällen zu einer Verbesserung der vorstehend angegebenen Viiirkungsrichtungen führte Die Komplexe haben die allgemeine Pormel

CH OH

.R

in der Y das Salz eines Amins der allgemeinen Formel

N(C_nH_2n)OH

wobei R und R niedere Alkylreste mit z. B. 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, wie den Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Isopropyl- oder Isobutylrest darstellen und η eine ganze Zahl von 2 bis 4 bedeutet, mit p-Acetamidobenzoesäure und ζ eine Zahl von 1 bis 1O ist.

Die iminunoregulierende Wirksamkeit scheint mit zunehmender Kettenlänge von R₁ , d. h. mindestens von der Methyl- bis zur Hexylgruppe zuzunehmen. Vorzugsweise ist R- ein geradkettiger Alkylrest, d. h. der Methyl-, Ethyl-, n-Propyl-, η-Butyl-, n-Amyl-, n-Hexyl-, n-Heptyl- oder n-Octylrest. Typische Beispiele für Amine zur Bildung der p-Acetamidobenzoesäuresalze umfassen Dimethylaminoethanol, Dimethylaminoisopropanol, Diethylaminoethanol, Diethylaminoisobutanol, Diethylaminoisopropanol, Methylethylaminoethanol, Diisobutylamino-N-butanol, Dimethylaminopropanol, Dimethylamino-N-butanol, Diisobutylaminoethanol, Dimethylaminobutanol, Dibutylamino-N-butanol, Dibutylaminoethanol, Dipropylaminoethanol und Diisopropylaminoethanol. Das gegenwärtig bevorzugte Amin ist Dimethylaminoisopropanol. Wenn Y vorhanden ist, d. h. ζ = 1 bis 10, bedeutet ζ vorzugsweise 3. ζ kann ,jedoch auch 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 sein.

Außer Verbindungen, in denen Y das Salz des Amins

^ ^(C_nH_2n)OH

mit p-Acetamidobenzoesäure ist, können auch Salze der Formel Y hergestellt werden, in denen das Amin die oben angegebene Bedeutung hat, die Säure aber eine andere pharmazeutisch annehmbare Säure als p-Acetamidobenzoesäure ist, z. B. Chlorwasserstoff säure, Schwefelsäure, Bromwasserstoffsäure, Phosphorsäure, Essigsäure, Propionsäure, Malonsäure, Milchsäure, Zitronensäure, Weinsäure, p-Toluolsulfonsäure, Adipinsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Methansulfonsäure, Salicylsäure oder Acetylsalicylsäure.

Wenn in den nachstehend angegebenen Verbindungen Y vorhanden ist, bedeutet die Abkürzung DIP.PAcBA Dimethylamino-2-propanol-p-acetamidobenzoat. Wenn keine in Klammer gesetzte Zahl, z. B. (1O) nach dieser Abkürzung steht, bedeutet Y die Zahl 3. Wenn eine Zahl in Klammern der Abkürzung DIP.PAcBA folgt, gibt diese Zahl die Anzahl der vorhandenen Mole Y je Mol des 9-Hydroxyalkyl-purins an.

Die in der Tabelle 1 angegebenen Verbindungen scheinen rein zu sein, mit Ausnahme der Verbindung 1544 3, die außer der erfindungsgemäßen Verbindung auch ein Salz zu enthalten scheint.

3 -K-S" 19.3.1980

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Ein Immunmodulator ist eine Verbindung, die die Irnmunreaktion steuert, d. h· sowohl immunst imulier end (iramunpotenzlerend) als auch immunhemmend wirkt. Die Immunstimulierung ist selbstverständlich zum Aufbau von Immunität wertvoll. Die Immuninliibierung ist ebenfalls für eine Reihe von Gebieten von Bedeutung, z© B. bei der Transplantation von Organen, ζ« Β, Hieren oder Herzen, um eine Organabstoßung zu verhindern O

In den nachstehenden Tabellen ist die immunpotendierende Wirkung der erfindungsgemäßen hergestellten Verbindungen mit einem Pluszeichen (+) und die immunhemmende Wirkung mit einem Minuszeichen (-) angezeigte Die Zahl O bedeutet, daß die Verbindung weder immunpotenzierende noch immunhemmende V/irkung besitzt.

Ein Mitogen ist eine Substanz, die eine Zeilproliferation einleitet, wie sie während der Immunisierung vor sich geht»

In der Tabelle 1 sind erfindungsgemäß hergestellte Verbindungen mit unterschiedlichen Bedeutungen von X, R^ und Rg angegeben.

Die synthetischen Verfahren A bis L in der Tabelle 1 sind später näher beschrieben«

Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen eignen sich zur Behandlung von Menschen und Säugetieren sowie von Zellen von Menschen und Säugetieren, einschließlich Schweinen, Hunden, Katzen, Rindvieh, Pferden, Schafen, Ziegen, Mäusen, Kaninchen, Ratten_s Meerschweinchen, Hamstern, Affen u_e ä_o

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Sofern nichts anderes angegeben ist, beziehen sich alle Teile imd Prozentsätze auf das Gewicht.

Ebenso bedeuten alle Temperaturen, sofern nichts anderes angegeben ist, Grad Celsius«,

Die erfindungsgemaß hergestellten Verbindungen können zu therapeutischen Zubereitungen verarbeitet werden, die eine oder mehrere dieser Verbindungen als Wirkstoffe zusammen mit üblichen Trägern und Hilfsstoffen enthalten« Diese können in herkömmlicher Weise, z» B« oral, nasal, rektal, vaginal oder parenteral verabfolgt werden* Hierfür werden sie in die Form von Tabletten, Pillen, Kapseln u. ä_e bzw_e unter Verwendung von Z₀ B₉ Wasser in die Form ,injizierbarer Lösungen gebrachte

Tabelle 1

Chemische Eigenschaften von 9-Hydroxyalkyl-purinen

(Y)

15417 15418 15392 15410 15426

HC-CH-R

R¹A

No.	R¹	R²	Verbindung	Y	Verfahren
	H	H	X	_
15425	H	H	OH	DIP-PAcBA	D
15428	H	H	OH		L
15435	' H	H	SH	DIP-PAcBA	C
15437	H	CH₀	SH		L
15446	H	CH₀	OH	DIP'PAcBA	A
15447	H	CH	OH	_	L
15431	H	CH	NH_n	DIP'PAcBA	B
15432	CH	H	NH_n .		L
15427	CH₀.	H	I	.a	E
15423	CH₀	H	Cl	_	F
15433	CH₀	H	NH₀	DIP-PAcBA	G
15434	CH-,	H	⁵NH₀		L
15443	j , ... CH₀	H	OH	DIP'PAcBA	H
15444		OH	L

OH

?"l3

H	OH	DIP	.· PAcBA	L
CH,	OH			J
CH,	OH	DIP	•PAcBA	L
GH«,	NH₂	HCl	Salz	K

-K-

No.	UV-Spektren	F, ° C-	λ Max	XMJLn	251 252 251	Konz. ΙΟ"³	pH	Elementaranalyse	H	N
	274°	250 250 254	222.5 219 221.5		11.93 11.0 12.53	7 1 10	C
15425			*	223.5 220 223.5
15428	278-80	323 323 323		23.0 19.9 19.9	7 1 10
15435			228 231 225
15437	244-5	250 250 254		11.0 10.6 12.1	7 1 10
15446			237 237 237
15447	188°	261 259 261	228 228 228	15.8 15.4 15.7	7 1 10		5.74 5.62	36.25 36.22
15431			»5 228 231 224.5			ber. 49.73 gef. 49.56
15432	178°	276 276 276		10.9 10.9 10.9	7 1 10		2.98 2.96	18.43 18.18
15427	200-204	265 265 265	223 218 225.5	9.1 9.1 9.1	7 1 10	ber. 31.60 gef. 31.53	4.26 4.27	26.36 26.25
15423	215-16	261. 259 261	-	13.56 13.26 13.80	7 1 10	ber. 45.20 gef .45.11
15433			224 - 220 223
15434	198-199	250 250 255		7.52 6.91 7.91	7 1 10
15443			224 222 220
15444	226°C	250 250 255		11.09 10.37 11.96	7 1 10		7.65 7.55	21.16 21.24
15417			230 233 235			ber. 59.07 gef.59.01
15418	202⁰C	250 248 254		12.1 13.3 14.1	7 1 10		7.97 7.86	20.13 20.08
15392					ber. 60.41 gef.60.47
15410	176-9^eC	~Ι6Γ 259 251	9.77 9.60 9.77	1 1 10		7.71 7,67	22.32 22.34
15426		ber. 53.58 gef. 53.56

-fs-3-

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Andere erfindungsgemäß hergestellte Verbindungen und deren p-Acetamido-benzoesäuresalze sind in der folgenden Tabelle a aufgeführt, deren Strukturformel der in Tabelle 1 angegebenen entspricht. In den Tabellen 1 und 1 a stellen die Alleylgruppen R-, sämtlich n-Alkylgruppen dar.

Tabelle 1 a Verbindung

DIP.PAcBA(10) DIP.PAcBAd )

DIP.PAcBA DIP.PAcBA DIP.PAcBA

DIP.PAcBA DIP.PAcBA

R'	R-	X
^C6^H13	CH₃	OH
C₆H₁₃	CH₃	OH
CH	CH₃	OH
CH₃	CH₃	OH
C₂H₅	CH₃	OH
C₂H₅	CH₃	OH
C₃H₇	CH₃	OH
C₃H₇	CH₃	OH
^C4^H9	CH₃	OH
C₄H₉	CH₃	OH
C₅H₁₁	CH₃	OH
C₅H₁₁	CH₃	OH
C₇H₁₅	H	OH
C₇H₁₅	CH₃	OH
C₈H₁₇	CH₃	OH
C₈H₁₇	CH₃	OH

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Es wurde gefunden, daß man die neuen 9-Hydroxyalkylpurinen der allgemeinen Formel

HC CH R

I I

R¹ OH

12

in der X, R und R die vorstehend genannte Bedeutung haben,

durch a) Diazotierung eines in 9-Stellung entsprechend substituierten 6-Amino-purins in saurer Lösung

mit Natriumnitrat, um in 6-Stellung eine OH-Gruppe einzuführen,

b) Behandlung eines in 9-Stellung entsprechend substituierten 6-Chlor-purins in alkoholischer Lösung mit Ammoniak, um in 6-Stellung eine NHg-Gruppe einzuführen,

c) Behandlung eines in 9-Stellung entsprechend substituierten 6~Chlor~purins mit Thioharnstoff, um in 6-Stellung eine SH-Gruppe einzuführen«

d) Hydrolysierung eines in 9-Stellung entsprechend substituierten 6-Chlor-purins in alkalischer Lösung unter Erhitzung, um in 6~Stellung eine OH-Gruppe einzuführen _f

e) Behandlung eines in 9-Stellung entsprechend substituierten 6-Chlor-purins mit Jodwasserstoff, um in 6-Stellung ein Jodatom einzuführen oder

I «j^ -j? & «#. -1^0.. yf-f„ 19.3.1980

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f) Umsetzung eines 5-Amino--4> 6-Dichlorpyrimidin der Formel

Cl

N Cl mit einem AmIn der allgemeinen Formel

CH-CH-R²

IV OH

1 2

in der R und R die oben angegebene Bedeutung haben, zu dem 4-Chlor-5-amino-6-(hydroxyalkyl" amino)-pyrimidin der allgemeinen Formel

H -0 - CH - R² ,

R OH

das mit Triethylorthoformiat einem Ringschluß unterworfen 'wird· Speziell werden in 9-Stellung substituierte Purine verwendet ₉

in denen R - eine geradkettige Alkylgruppe, bevorzugt mit 1 bis 7 und speziell mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder die n-Hexyl oder Methylgruppe ist·

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Ausführungsbeispiel

Verfahren _i A 9-(2-Hydroxy-1 -Propyl)-Hypoxjmthin (NPT 15446)

OH

)H

N02

AcOH

GH.

4,0 g (20,7 mMol) 9-»(2-Hydroxy-1-propyl)-aden±n (I) v/urden in 20 ml 50%iger Essigsäure suspendiert und langsam mit 4 g (58 mMol) Natriumnitrit versetzt« Die Mischung wurde drei Stunden bei 25 ⁰C gerührte Die erhaltene Lösung wurde zur Trockne eingedampft, und Isopropanol wurde zugegeben« Diese Operation wurde einmal wiederholt« Der feste Rückstand wurde in Isopropanol zum Sieden erhitzt und filtriert· Das PiItrat wurde eingedampft und durch Zugabe von Aceton kristallisierte Die Umkri.stallisation aus Isopropanol/Methanol (98:2) ergab ein farbloses kristallines Produkte Ausbeute 3,3 g (82 %); F = 244 - 250 ⁰C; UV (H₂O, pH 5,5)A max = 250 mn.

Cl

Verfahren B

9-(2-HYDROXY-1-PROPYL)-G-CHLOR-PURIn

"+H₂N-CH₂-CH-CH₃--*

OH

-CH₂-CH-CH OH

Cl

HO CH.

Man arbeitete nach den Verfahren von Schaeffer, H. J., Vogel, D. und Vince, R., J. Med. Chem. Band 8 (1965), Seite 502 und Schaeffer, H.J. und Vince, R., J. Med. Chem. Band 10 (1967), Seite 689.

Eine Lösung von 20 g (0,12 Mol) 5-Amino-4,6-dichlorpyrimidin (I) in 200 ml einer 11 %igen ethanolischen Lösung von Isöpropanolamin wurde acht Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde zu einem Sirup eingedampft, mit Ethanol versetzt und nochmals eingedampft. Diese Operation wurde einmal wiederholt. Der erhaltene Sirup wurde in 300 ml Wasser gegossen, worauf man eine-kristalline Masse erhielt. Sie wurde abfiltriert und ergab nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen

Ι 9 g rohes 9- (2-Hydroxy-1-propylamino)-5--ainino-6-chlorpyrimidin (II).

Die rohe Verbindung II wurde in 120 ml Triethylorthoformiat suspendiert, zu dem man fünf Tropfen Ethansulfonsäure gab. Nach 15 Minuten hatten sich die gesamten Feststoffe gelöst, und die Lösung wurde über Nacht auf 25° C gehalten. Beim Eindampfen im Vakuum erhielt man einen dicken Sirup, der zur Entfernung überschüssigen Isopropanolamins unter hohem Vakuum eingedampft wurde. Die Kristallisation aus Xylol ergab 5 g rohes Material.

9-(2-HYDROXY-1-PROPYL)-ADENIN (NPT 15431)

CH₂-CH-CH

OH

NH₃/Me0H

-CH-CH

9 g (42,4 mMol) 9~(2-Hydroxy-i-propyl)-6-chlorpurin (I) wurden in gesättigtem methalonischen Ammoniak und 50 mg Ammoniumchlorid gelöst. Die Mischung wurde in einer Bombe sechs Stunden auf 130° C erhitzt. Die gebildete Lösung wurde zur Trockene eingedampft und aus Ethanol/Aceton umkristallisiert. Ausbeute 6,68 g eines farblosen kristallinen Produkts

- 45-

(81 %); F β 193-194° C; UV (H₃O, pH 5,5) λ max. = 260 nm; Dünnsehichtchromatographie in CHCl₃ICH₃OH (5:1) R_f «= O,44,

Analyse für CpH₁₁N₁-O berechnet: C 49,73; ^ö . ^D H 5,74;

N 36,25

gefunden:

C 49,56; H 5,62; N 36,22.

Verfahren C

9-(1-HYDROXYETHyL)-O-MERCAPTOPURIN (NPT 15435)

.NH.

NH,

CH₂OH

Man arbeitete nach dem Verfahren von Schaeffer und Bhargava, Biochemistry Band 4 (1965), Seite 71.

2 g (O,O1 Mol) 9-(1-Hydroxyethyl)-6-chlorpurin (I) und 0,76 g (0,01 Mol) Thioharnstoff wurden in 15 ml Ethanol gelöst und 30 Minuten unter Rückfluß erhitzt. Die gebildete Fällung wurde abfiltriert und in Wasser zu einer Aufschlämmung suspendiert.'

Die Neutralisation mit Natriumacetat ergab farblose Kristalle. Ausbeute 1,5 g (76 % Λ max.= 320, 230 run.

Ausbeute 1,5 g (76 %); F «= 278 - 280° C; UV (H₂O, pH 5,5)

Verfahren D 9-HyDROXyETHYL-HYPOXANTHIN' (NPT 15425)

CHr—CH.OH

²² CH^ CH₂OH

Man arbeitete nach dem Verfahren von Schaeffer, H.J. und Bhargava, P.S., Biochemistry Band 4:(1965), Seite 71.

4 g 6-Chlor-9-hydroxyethyl~purin (III) wurden langsam zu 30 ml warmem η NaOH gegeben und zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in Eis gekühlt und mit Eisessig neutralisiert. Nach dem Filtrieren wurden Teile nicht-umgesetzter Verbindung III entfernt. Das Produkt wurde aus Methanol umkristallisiert und mit Aceton gewaschen. Man erhielt farblose Kristalle in einer Ausbeute von 1 g (28 %); F = 274° C; UV (H₀O,- pH 5,5) λ max. = 250 πια.

Verfahren E

9- (1-HYDR0XY-2-PR0PYL)-6-JODPURIN (NPT 15427)

Hl

-10

CH₂OH

1,5 g (7 mMol) 9-(1-Hydroxy-2~propyl)-6-chlor-purin (I) wurden bei - 10 C zu 15 ml Jodwasserstoffsäure gegeben, wobei man 45 Minuten rührte. Der gebildete Niederschlag wurde abfiltriert, mit wasserfreiem Natriumacetat bei 5° C neutralisiert und 3mal mit wenig kaltem Wasser gewaschen'. Die Umkristallisation aus Ethanol/H„0 ergab farblose Kristalle in einer Ausbeute von 0,9 c (42 %); F= 193 bis 194° C; UV (H₃O, pH 5,5) λ max.= 276 nm. Analyse berechnet für C_rHqN.OI (Molekulargewicht 304,1)

C 31,60; H 2,98; N 18,43; I 41,73;

gefunden:

C 31,53; H 2,96; N 18,18; 1.41,70.

Verfahren F

9-(1-HYDR0XY-2-PR0PYL)-ö-CHLOR-PURIN (NPT 15423)

Cl

NH,

CH -CH-CK-OH

uC

NH C

CH₃OH

Es wurde das Verfahren nach Schaeffer, H.J. und Schwender, CF. ,J. Med. Chem. Band 17 (1974), Seite 6 angewandt. Eine Lösung von 6,56 g (4O mMol) 5-Amino- 4,6- dichlorpyrimidin (I) und 3,3 g (44 mMol) 2-Amino-1-propanol (II). wurde in 288 ml n-Pentanol und 96 ml tert.-JButylamin 45 Stunden unter Stickstoff unter Rückfluß erhitzt. Dann wurde die Lösung zu einem Sirup eingedampft, und viermal Ethanol zugegeben und abgedampft. Der erhaltene Sirup wurde in 150 ml Triethylorthoformiat und 10 Tropfen Ethansulfonsäure suspendiert. Die Suspension wurde heftig über Nacht gerührt, dann zur Trockene eingedampft, und mit Ethanol versetzt. Diese Operation wurde dreimal wiederholt.

Während des Eindampfens kristallisierte das Produkt in farbloser Form. Die Kristalle wurden abfiltriert, das Filtrat wurde eingedampft, mit Ethanol versetzt und diese Operation dreimal wiederholt. Man erhielt 3,6 g rohes Material.

Durch ümkristallisation aus 98 %igem wäßrigen Ethanol erhielt man 2,79 g (32 %) gereinigtes Produkt. UV (H₂O, pH 5,5) X max.= 265 nm; F = 201 - 203° C.

Analyse für C_fiH_QN.OCl, berechnet: C 45,20; ^{ö y 4} H 4,26;

N 26,36; Cl 16,68;

gefunden:

C 45,11;

H 4,27;

N 26,25;

Cl 16,71.

Verfahren G

9-(1-HYDR0XY-2-PR0PYL)-ADENIN (NPT 15433)

NH,

NH₃/Me0H

130'

CI.)

Man arbeitete nach dem Verfahren von Schaeffer, H. und Schwender C, J. Pharm. Sei. Band 60 (1971), Seite 1204 und nach Schaeffer und Mitarbeitern, J. Med. Chem. Band'* 15 (1972), Seite 456.

2,0 g (9,4 mMol) 9-(1-Hydroxy-2-propyl)-6-chlor-purin (I) wurden in 30 ml Methanol/Ammoniak und 50 mg Ammoniumchlorid, das als Katalysator zugesetzt war, suspendiert. Die Mischung wurde 4 1/2 Stunden auf 130° C erhitzt. Dann wurde die Lösung zur Trockene eingedampft. Die Umkristallisation des erhaltenen Rohprodukts aus Ethanol ergab farblose Nadeln in einer Ausbeute von 1,15 g (63 %); F= 215 - 216° C; UV (H₂O, pH 5,5)\ max = 260 nm.

Verfahren H 9-(1-HYDR0XY-2-PR0PYL)-HYPOXANTHIN (NPT 15443)

OH

^> NO,

AcOH

CH₀OH . -

2 H-C CH₂OH

Ϊ II ·

4 g (21 mMol) 9-(1-Hydroxy-2-propyl)-adenin (I) wurden in 20 ml 50 %iger Essigsäure gelöst, worauf man 4g (58 mMol) Natriumnitrit zugab und die Mischung 3 1/2 Stunden bei 25° C rührte. Die Lösung wurde zweimal mit Isopropanol zur Trockene eingedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in Isopropanol aufgenom-

men, filtriert, der Niederschlag verworfen und das Filtrat zu einem Gel eingedampft, das sich bei der Zugabe von Aceton verfestigte. Ausbeute 3,65 g (90 %) farblose Kristalle. Die Reinigung erfolgte durch Umkristallisation aus Isopropanol/ Methanol (98:2). F = 202 bis 207° C; Dünnschichtchromatographie in CHCl₃: CH₃OH (5:1) 1 Flecken R_f = 0,30; UV (H₃O, pH 5,5) max = 250 nm.

Verfahren I Verbindung NPT 15417

Man arbeitete nach dem Verfahren von Schaeffer und Mitarbeitern, J. Pharm. Sei. Band 16, Seiten 1204 bis 1210, Verfahren F. Das Produkt ist die Verbindung XL in der Tabelle III der angezogenen Literaturstelle.

Verfahren J erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (NPT 15392)

Die Verfahrensfolge der Herstellung von erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (Nonylhypoxanthin, VIII) ist in den ReaktionsSchemen 1 und 2 dargestellt. Die Verbesserungen gegenüber dem Verfahren von H. J. Schaeffer und CF. Schwender, J. Med. Chem. Band 17 (1974) , Seite 6 in der Reaktionsfolge zur Bildung von erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-6-chlorpurin (VII) sind angegeben. Die letzte Stufe, die Hydrolyse des

6-Chlorpurinderivats (VII) zu Nonylhypoxanthin (VIII) stellt eine Anpassung der von A. Giner-Sorolla, C. Gryte, A. Bendich und G.B. Brown, Ji Org. Chem. Band 34 (1969) , Seite 2157 beschriebenen Methode zur Hydrolyse von Halogenpurinen dar.

Das alternative Verfahren, d. h. die Nitrosierung von erythro~9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-adenin (EHNA, IX) zu Nonylhypoxanthin (VIII),(Reaktionsschema 2) besteht aus der vorhergehenden Umwandlung des Chlorderivats (VII) durch Ammonolyse in das Aminpurin (IX, EHNA), das nachfolgend zur Bildung von Nonylhypoxanthin (VIII) nitrosiert wird.

Reaktionsschema 1

Herstellung von erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin

(VIII)

Stufe 1 ACETAMIDONONAN-2-ON (II) Acylierung von 2-Amino-octansäure

(GH₃CO)₂O 3 g-CH— COOH _: £ CH₃-ICH₂J₃- CH₂-—COCH₃

NH₂

II

Ausbeute 70 %.

Stufe 2 ' ACETAMIDONONAN-2-ON-HYDROCHLORID (III)

NH.

CHj— [CH₂]^-CH COCH₃

Ausbeute 67 %.

NH₂-HCl III

Stufe 3

erythro-3-AMINO-2-NONANOL (IV) Reduktion des Acetamidononan-2-on-hydrochlorids

KBH₁

CHCOCH

NH₂-HCl,

I I

OH

III

Ausbeute 75 %.

IV

Stufe 4 erythro-5-AMINO-4-CHLOR-6-(2-HYDROXY-3-NONYLAMINO)-PYRIMIDIN (VI) Kondensation von erythro-3-Amino-2-nonanol mit 5-Amino-4,6-dichlorpyrimidin

Cl

CH.

¹Wi

CHOH

CH,

IV

Cl

CH₃ [CH₂]

VI

Ausbeute 54 %.

Stufe 5

erythro-9- (2-HYDROXY-3-NONYD-6-CHLORPURIN (VII)

Ringschluß von erythro-5-Amino-4-chlor-6-(2-hydroxy-3-nony!amino)-pyrimidin (V)

Cl

2 (C₂H₅ O)₃CH ^N

Ausbeute 100 %.

Stufe 6 erythro-9-(2-HYDROXY-3-NONYD-HYPOXANTHIN (VIII) Durch Hydrolyse des 6-Chlorpurinderivats

CH₃-[CH₂J₅ CHOH

VII

VIII

Ausbeute 100 %.

- JS-

Reaktionsschema 2

Alternatives Verfahren für die Herstellung von erythro-9-(2-HYDROXy-B-NONyL-HYPOXANTHIN (VIII)

Stufe 1 a

erythro-9·-(2-HYDROXY-3-NONYL)-ADENIN (IX) Ammonolyse von erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl) 6-chlorpurin (VII)

Cl

CHOH

Ausbeute 92 %.

VII

IX

Stufe 2 b

erythro-9-(2-HYDROXY-3-NONYL)-HYPOXANTHIN (VIII) Nitrosierung von erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-adenin (IX)

Ausbeute 75 %.

IX

VIII

3-ACETAMIDONONAN-2-ON (II)

(CH₃CO)₂ 0 [CH_o]-£—CH COOH Ϊ CH^- [CH-] ^--CH COCH-

NH₂

II

Eine Mischung aus 200 g (1,26 Mol) 2-Amino-1-octansäure (I) in 960 ml Essigsäureanhydrid und 640 ml Pyridin wurde auf einem siedenden Wasserbad vier Stunden erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum-eingedampft und der Rückstand sechsbis achtmal zwischen 4OO ml 5 %iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung und 4OO ml Ether verteilt. Die vereinigten Etherextrakte wurden über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingedampft. Man erhielt rohes 3-Acetamidononan-2-on in einer Ausbeute von 154 g (70 %).

3-AMINO-2-NONANON-HYDROCHLORID (III)

HCl .

CHr-'"[CH_O]-P—CH COCK- £ CH= ICH-j _c CH COCH-

. Λ -. d. h j J . J 2 5 · 3

Mt? ¹HPl

2 XSiU₀ riUJL

154 g des im vorstehenden Verfahren erhaltenen Rohprodukts (II) wurden in 1540 ml konzentrierter wäßriger Salzsäure gelöst und zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt. Dann wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft,, Der erhaltene Feststoff wurde

aus einer warmen Lösung in 2OO ml Ethanol umkristallisiert und dann auf 25° C gekühlt. Zu dieser Lösung wurden 600 ml Ether gegeben. Es schied sich ein weißer kristalliner Niederschlag ab. Die Suspension ließ man über Nacht bei 5° C stehen. Die Fällung wurde dann gesammelt.und einmal mit 100 ml Ether gewaschen. Man erhielt 125 g (67 %) eines weißen kristallinen Produkts vom Schmelzpunkt 112° C (Zersetzung).

Wenn das kristalline Material nicht weiß ist oder einen geringeren Schmelzpunkt hat, sollte es unter Verwendung von Aktivkohle aus Tetrahydrofuran umkristallisiert werden. Bei einer Anwendung dieses Verfahrens wurden 150 ml Hydrofuran für 100 g des rohen Hydrochlorids (III) verwendet.

erythro-3-AMINO-2-NONANOL (IV)

KBH.

ICH₇] £ CH COCH-. = ^ CHr JCH₀] — CH — CH - CH,

^d j |J o 2 5 / . ν 3

• NH₂-HCl ' NH₂ OH

III

43,8 g (0,226 Mol) 3-Amino-2-nonanol-hydrochlorid wurden in 150 ml absolutem Methanol gelöst und darauf in einem Eis-Salz Bad auf -10° C gekühlt.¹* 24,4 g (0,45 Mol) Kaliumborhydrid ²'

wurden innerhalb von zwei bis drei Stunden in kleinen Anteilen zugefügt. Die Mischung wurde dann drei Stunden bei -10 bis -15 C gehalten ' , worauf man sie langsam Raumtemperatur (22 C) erreichen ließ. Dann wurde über Nacht (20 Stunden) bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde im Vakuum zur Trockene eingedampft und der gebildete Sirup zwischen 150 ml Wasser und 150 ml Chloroform verteilt. Die wäßrige Schicht wurde noch dreimal mit jeweils 100 ml Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde über Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Man erhielt ein leicht gelbliches öliges Produkt. Diese Flüssigkeit wurde im Hochvakuum (0,15 mm Hg) bei 95 bis 100 C destilliert. Man erhielt reines erythro-3-Amino-2-nonanol in einer Menge von 26,4 g (75 %); F= 81 bis 86° C.

Beim Kühlen der Lösung von III fällt etwas Material aus, was jedoch keine Wirkung auf den Reaktionsverlauf hat.

An dieser Stelle unterscheidet sich das vorliegende Verfahren von dem nach Schaeffer und Mitarbeitern. Schaeffer gibt Essigsäure zur gleichen Zeit zu wie Kaliumborhydrid und hält dabei den pH-Wert auf 5 bis 6. Man hat gefunden, daß die Neutralisation einen Verlust an Kaliumborhydrid mit sich bringt und daß ein pH-Wert von über 5 toleriert werden kann. Wichtiger ist, daß die gleichzeitige Zugabe von Essigsäure und Kaliumborhydrid, wie von Schaeffer vorgeschlagen, die Kontrolle der Umsetzung sehr schwierig macht. Die Temperatur steigt beträchtlich und es treten Ausbeuteverluste und/oder Qualitätsbeeinträchtigungen des Produktes ein,

3)

Empfehlenswert ist ein wirksames Rühren, um die entsprechende Umsetzung zu gewährleisten, die vervollständigt wird,'wenn all die kleinen Klümpchen und Anteile des Kaliumborhydrids verschwunden sind.

' Ein Kühlen auf 0 C, wie von Schaeffer und Mitarbeitern beschrieben, (Verfahren D, Zeile 4 ff.) ist unzureichend. Eine Verbesserung wird erreicht, wenn man das Reaktionsgemisch während der gesamten Zeit gut unter 0 C, am besten unter -10° C hält. Läßt man die Temperatur über -10° C ansteigen, so können beträchtliche Ausbeuteverluste auftreten.

erythro-S-Amino^-chlor-e-(2-HYDROXY-3-NONYLAMINO)-pyrimidin (VI)

Cl

NH₂

NH„ ² CH

³5 ^CH0H

CH₃

IV VI

Eine Mischung aus 24,6 g (0,15 Mol) 4 ,6-Dichlor-S-aininopyrimidin (V) und 26,2 g (0,164 Mol) erythro-3-Amino-2-nonanol (IV) in 1080 ml 1-Pentanol und 350 ml Tributylamin wurde unter Rühren bei 25° C hergestellt. Die gebildete Suspension wurde unter Stickstoff 28 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Lösung trat innerhalb etwa 1/2 Stunde ein. Zu diesem Zeitpunkt zeigte eine Probe des Reaktionsproduktes ein UV \ max. von 267 und 297 nm (H₃O, pH 5,5).

Die erhaltene Lösung wurde ;in einem heißen Wasserbad bei einem Druck von 10 mm Hg zu einem Sirup eingeengt und weiter in .' einem Ölbad bei 0,1 mm Hg und 100 C zu einer viskosen Flüssigkeit eingedampft, zu der man 450 ml η-Hexan gab. Diese Mischung wurde eine Stunde unter Rückfluß erhitzt. Das heiße überstehende gelbliche Hexan wurde von der Flüssigkeit am Boden des Rundkolbens abgetrennt.

Das erhaltene hellbraune Öl, aus dem jegliches restliche Hexan im Vakuum entfernt worden war, wurde in 150 ml Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung .wurde achtmal mit jeweils 250 ml einer wäßrigen gesättigten Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Die Chloroformschicht wurde dann abgetrennt, über Natrium- oder Magnesiumsulfat getrocknet und unter hohem Vakuum von 0,1 mm Hg bei 40°- C in einem Wasserbad eingedampft, worauf man ein hellbraunes Öl erhielt, das sich beim Kühlen verfestigte. Dieses Material kann direkt in der nächsten Stufe eingesetzt oder wie

1 5-493

folgt gereinigt werden: Das erhaltene öl wird in 75 bis 1OO ml Chloroform gelöst, worauf man etwa 300 ml η-Hexan zugibt, um einen weißen kristallinen Feststoff auszufällen, der von der gekühlten Lösung abfiltriert wird. Das Extraktionsverfahren wird vier- bis achtmal durchgeführt, bis sich kein Kohlendioxid mehr entwickelt. Diese Behandlung wurde zweimal wiederholt. Ausbeute 23,3 g (54 %); UV λ max.= 267, 297 nm (H₂O, pH 5,5); F = 113 - 116° C.

erythro-9- (2-HYDROXY-3-NONYL) 6-CHLORPURIN (VII)Cl Cl

_ A

3 ^[CH2^]5 ^CH0H

VII

11,48 g (40 mMol) des im vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen rohen Sirups aus erythro-S-Amino-^-chlor-e-(2-hydroxy-3-nonylamino)-pyrimidin wurden in 106 ml Triethylorthoformiat und 34 ml Chloroform gelöst, wobei man zur Be-

wirkung der Lösung 10 Tropfen Ethansulfonsäure zugab.·.Nach dem Stehen über Nacht bei 25° C wurde die Lösung im Vakuum zu einem Sirup eingedampft. Die Ausbeute von 11,7g war quantitativ. Dieser Sirup aus rohem erythro~9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-6-chlorpurin (VJI) wurde für die nächste Stufe verwendet; A max. = 264 nm.

erythro-9-(2- HYDROXY-3-NONYL)-HYPOXANTHIN (VIII)

Durch Hydrolyse des 6-Chlorpurinderivates Cl OH

VII VIII

Eine Suspension von 4,0 g (1-3,4 mMol) erythro-6-Chlor-9-(2-hydroxy~3-nonyl)-purin (VII) in 40 ml 0,5 η NaOH wurde zwei Stunden unter Rückfluß erhitzt und dann gekühlt. Die Neutralisation mit Eisessig und nachfolgende Kühlung ergab einen kristallinen Niederschlag aus erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-hypoxanthin (VIII), der abfiltriert und getrocknet wurde. Die Ausbeute von 3,8 g war quantitativ. F = 196 C;

Λ max.(pH 5,5) = 251 nm.

W · * τ* ^/J

Das so erhaltene Rohprodukt (VIII) war homogen, wie die Papierchromatographie (3 Lösungsmittel) ergab, und im Test auf Cl negativ (Kupferdraht und Flamme; Natriumschmelze, Ansäuern und Silbernitrat).

Die dreimalige Umkristallisation einer Probe des rohen Materials aus wäßrigem Ethanol (siehe nachfolgende Reinigung) ergab farblose Kristalle vom Schmelpunkt 202° C. Analyse für ^C14^H22^N4°2 ^{VIII)

berechnet: C 60,41; H 7,97; N 20,13;

gefunden: C 60,47; H 7,86; N 20,08

Reinigung von erythro-9-(2-HYDROXY-3-NONYL)-HYPOXANTHIN (VIII)

Das rohe Nonyl-hypoxanthin (VIII) wird durch Umkristallisation gereinigt. Man löst hierzu das rohe Material unter Erhitzen in etwa der 6 - 10fachen Menge seines Gewichts in Ethylalkohol und fügt dann das gleiche Volumen Wasser zu. Die Lösung wird in einem Erlenmeyer mit Aktivkohle behandelt und heiß durch Diatomeenerde filtriert. Anschließend dampft man die Lösung unter ständigem Rühren auf einer heißen Platte ein. Um die abgedampfte Flüssigkeit zu ersetzen, wird Wasser in kleinen Anteilen zugefügt bis reichlich Niederschlag ausfällt. Das Lösungsmittel wird weiter abgedampft bis der gesamte Ethylalkohol

- 5s - M-

entfernt ist, wobei man wiederholt Wasser zugibt, um ein Volumen vom 8 bis 12fachen des Gewichts des Materials zu erreichen. Je ümkristallisation beträgt der Materialverlust etwa 10 %. Durch zweimalige Ümkristallisation wurde der Schmelzpunkt auf 202 . C erhitzt. Man erhielt ein farbloses kristallines Produkt, während das Rohmaterial etwas gelblich oder rosa war und bei 19 2° C schmolz.

erythro-9-(2-HYDROXY-3-NONYL)-ADENIN. HCl (IX)

•HCl

CHOH

VII

IX

6,15 g des rohen öligen erythro-9-(2~Hydroxy-3-nonyl)-6-chlorpurins (VII) aus dem vorstehenden Verfahren wurden in 300 ml gesättigtem methanolischen Ammoniak, der 1 g Ammoniumchlorid enthielt; eine Stunde in einer nicht-rostenden Stahl-

2154

bombe (Parr Instruments) auf 80 bis 100 C erhitzt. Nach dem Kühlen wurde die Lösung im .Vakuum zur Trockene eingedampft. Dann wurde Methanol zugesetzt und eingedampft (3mal), um den überschüssigen Ammoniak zu entfernen.

Der sirupartige Rückstand wurde in absolutem Methylalkohol gelöst, und durch die Lösung wurde trockener Chlorwasserstoff in Bläschenform geleitet, wobei man die Temperatur durch Anwendung eines Eis-Wasser Badsunter 20° C hielt. Nach 1/2stündigem Durchleiten des Chlorwasserstoffs wurde die Mischung auf 5 C gekühlt. Der ausgefallene Niederschlag wurde in einem Trichter aus gesintertem Glas gesammelt, mit kaltem Methylalkohol gewaschen und an der Luft getrocknet. Ausbeute 6,0 g (92 %) ; F= 173 bis 175° C (Zersetzung); UV J\ max.= 260 nm (H₂O, pH 5,5).

Alternatives Verfahren für die Herstellung von erythro-9- (2-HYDROXY-3-NONYL) -HYPOXANTHIN (VIII)

NH.

NaNO₀ N ²

durch pesaminierung von VII

OH N'

N _T

CH

CHr--ICH₂]₅ CHOH CH₃

VII

VIII

5,6 g (71 itiMol) Natriumnitrit wurden langsam unter Rühren bei 25° C zu einer Lösung von 4,0 g (14 mMol) erythro-9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-adenin (IX) in 20 ml 50 %iger Essigsäure und 3,2 ml η HCl gegeben. Die Mischung wurde zwei Stunden bei 25 C gerührt. Danach wurde das UV-Spektrum aufgenommen. Wenn die maximale Absorption 250 nm erreicht hatte, wurde die Lösung mit 2 η NaOH neutralisiert. Der ausgefallene Niederschlag wurde abfiltriert und mit Wasser gewaschen. Ausbeute 3,03 g (75 %); F = 195° C.

Eine Analysenprobe wurde dreimal aus Wasser umkristallisiert, worauf das Produkt bei 202 C schmolz. Analyse für C₁₄H„„N.O„

berechnet: C 60,40; H 7,96; N 20,13.

gefunden: C 60,40; H 7,90; N 20,12.

Verfahren K Verbindung NPT 15426

Man wendete das Verfahren von H.J. Schaeffer und S. F. Schwender, J. Med. Chem. Band 17 (1974), Seite 6 an.

Verfahren L Herstellung von NPT 15410

27,9 mg (0,1 mMol) 9-(2-Hydroxy-3-nonyl)-6-hydroxypurin, NPT 15392, und 77,1 mg (0,3 mMol) des p-Acetamidobenzoats

von Dimethylaminoisopropanol (DIP.PAcBA) wurden sorgfältig abgewogen und in 105 ml O,25 %iger Natriumcarbonatlösung zu einer 0,1 %igen Lösung von NPT 15410 gelöst, das ist die Verbindung aus NPT 15392 und (DIP.PAcBA) im Molverhältnis 1 : 3.

Nachweis der Komplexbildung.

Phasenlöslichkeitsuntersuchungen mit NPT 15392 und DIP.PAcBA zeigen, daß NPT 15392 mit zunehmenden Konzentrationen an DIP.PAcBA unter konstanten pH-Wert-Bedingungen zunehmend löslicher wird. Dies beweist eine in Lösung vor sich gehende Reaktion unter Bildung eines Komplexes.

Anstelle des Molverhältnisses 1 : 3 (NPT 15392 und DIP.PAcBA) können bei Anwendung anderer Molverhältnisse von 1 : 1 bis 1 : 10 weitere Komplexe hergestellt werden.

Potenzierung biologischer Wirksamkeiten durch DIP.PAcBA Von den in der Tabelle 1 angegebenen Verbindungen sind NPT 15 und NPT 15 446 neu. Neu sind ebenfalls die DIP.PAcBA Salze in dieser Tabelle, d. h. die Verbindungen 15428, 15437, 15447, 15432, 15434, 15444, 15418 und 15410. NPT 15392, NPT 15417 und NPT 15426 besitzen als solche sämtlich wesentliche Wirksamkeit gegen Influenza. In einem Fall, d. h. bei NPT 15392 führt die Zugabe des DIP.PAcBA Salzes zu NPT 15392 unter Bildung von 15410 nicht zu einer Potenzierung der Wirkung gegen Influenza.

Im Falle des NPT 15417 verursacht die Zugabe des DIP.PAcBA Salzes unter Bildung von 15418 eine Potenzierung der Wirkung gegen- Influenza. Eine Zusammenstellung der Fähigkeit der DIP.PAcBA Salze zur Potenzierung verschiedener biologischer Wirksamkeiten ist nachfolgend angegeben.

Verbindung	DIP.PAcBA	Wirkung gegen	Potenzierung
	Salz	Influenza	der Wirkung
			gegen
			Leukämie
15392	15410	beide gleich	ja
		wirksam
15417	15418	ja	-
15435	15437	ja	-
15446	15447	ja	-
15431	15432	ja	-
15433	15434	ja	-
15443	15444	ja	-

Immunpotenzierung

ja ja

In vivo Behandlung von Mäusen mit NPT 15392 und NPT 15410: Wirkung auf die in vitro Stimulierung der Proliferation von Milzzellen durch Concanavalin A

Zweck dieser Untersuchung war die Feststellung der Wirkung der in vivo Behandlung von Mäusen mit den Verbindungen NPT 1539 2 und 15410 auf die nachfolgende Fähigkeit von Milzzellen, die aus diesen Tieren isoliert und in vitro untersucht wurden,auf ihre Proliferationsreaktion gegenüber dem Mitogen Concanavalin A (Con A) . .........

Verfahren

In Vivo Behandlung

Neun männliche acht bis neun Wochen alte Balb/G Mäuse mit einem Gewicht ,von jeweils 18 bis 20 g wurden in drei Gruppen unterteilt. Eine dieser Gruppen erhielt an einem Tag zweimal, am Morgen und am Nachmittag, eine orale Dosis an NPT 15 392 von 10 mg/kg Körpergewicht. Die zweite Gruppe wurde in ähnlicher Weise mit NPT 15410 in einer Dosis von 20 mg/kg behandelt. Eine dritte Gruppe, die als Kontrolle diente, erhielt Kochsalzlösung als Placebo.

In Vitro Untersuchung der Milzzellen: Zellpräparat An folgenden Tagen wurden die Tiere getötet und die Milz aus den Tieren der einzelnen Gruppen wurde entfernt, gesammelt und zerkleinert. Die Zellen wurden in RPMI-1640 Medium (Grand Island Biologicals), das mit 2 ml Glutamin und Antibiotika ergänzt war, gewaschen. Die Zellkonzentration jedes Präparats wurde mit einem Coulter-Zähler bestimmt und mit RPMI Medium auf 5 χ 10 Zellen/ml eingestellt.

Mikrotiterplatten-Untersuchung

Diese Untersuchungen wurden mit 0,2 ml Inkubationsproben durchgeführt, die 5 χ 10 Zellen und Con A oder Con A und weitere Verbindungen in den angegebenen Konzentrationen ent-

hielten. Alle Versuche wurden mit 6 parallel laufenden Proben durchgeführt und mit einer Blindprobe verglichen, die nur Zellen enthielt. Die Mikrotiterplatten wurden bei 37° C in 5 % CO₀ vier Tage lang inkubiert. Während der letzten 18 bis 20 Stunden wurden 0,5 ml³HTdR (10 ,uCi/ml, 6 Ci/m Mol) zu jeder Kultur gegeben. Die Kulturen wurden mit einer automatischen Mehrfachproben-Aberntevorrichtung (MASH) abgeerntet, und das eingearbeitete HTdR wurde mit einem Beckman LS 8000 Flüssigkeit-Scintillationszähler als Maß der Zellproliferation bestimmt. Die erhaltenen Werte sind als Verhältnis der Aktivität der mit Con A oder Con A plus Verbindung behandelten Kulturen zu den Leerkulturen angegeben.

Die in vivo Behandlung mit jeder der Verbindungen 15392 und 15410 verbessert die spätere Reaktion der Milzzellen in vitro gegenüber der Con A Stimulierung bei einer suboptimalen Mitogenkonzentration von 5 ,ug/ml. Bei Milzzellen, die aus mit 15392 behandelten Mäusen isoliert worden waren, wurde ein Stimulierungsverhältnis von 120 : 1 im Vergleich zu einem Verhältnis von 40 : 1 bei Milzzellen beobachtet, die aus mit Placebo behandelten Mäusen isoliert worden waren. Wenn die Zellen mit einer höheren Konzentration an Con A von 10 ,ug/ml stimuliert wurden, stellte man keine wesentlichen Unterschiede fest, weder bei der Verbindung 15392, noch bei der Verbindung 15410.

21549 3

Es wurde auch die Wirkung einer nachfolgenden in vitro Behandlung von mit Con A stimulierten Zellen mit NPT 15392 und 15410 in einer Dosis von 1 ,ug/ml untersucht. Beide Verbindungen besitzen eine ausgeprägte Fähigkeit, die Con A Stimulierung zu erhöhen,.insbesondere bei der suboptimalen Mitogenkonzentration von 5 ,ug/ml und in geringerem Ausmaß bei 10 ,ug/ml. Bei 5 ,ug/ml an Con A beträgt die Stimulierung durch NPT 15392 das 2,8fache gegenüber Con A allein, während sie für NPT 15410 das 3,3fache ausmacht.

Diese Ergebnisse zeigen eine immunomodulierende Wirkung dieser Verbindungen auf die Proliferation von Milzzellen an. Die Vorbehandlung von Tieren mit beiden Verbindungen sensitiviert die Zellen für eine nachfolgende Mitogenstimulierung, während eine in vitro Behandlung der Zellen mit den Verbindungen im Anschluß an eine Mitogenstimulierung die Proliferationsreaktion verbessert.

Scha/be

Claims

Berlin, den 19.3.1980 56 098/12

Erfindungsanspruch

β Verfahren zur Herstellung von 9-Hydroxyalkylpurinen der allgemeinen Formel

X .

in der X die OH-, SH- oder UH_O-Gruppe. J oder Cl bedeu-

1
tetj R Wasserstoff oder ein Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlen-

Stoffatomen und R Wasserstoff oder die Methylgruppe ist, gekennzeichnet dadurch, daß man

a) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Amino-purin in saurer Lösung mit Natriumnitrit diazotiert, um in 6-Stellung eine OH-Gruppe einzuführen,

b) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Chlor~purin in alkoholischer Lösung mit Ammoniak behandelt, um in 6-Stellung eine Mig e inz ufuhr e η ₉

19.3.1930 56 098/12

c) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Chlor-purin mit Thioharnstoff behandelt, um in 6-Stellung eine SH-Gruppe einzuführen,

d) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Chlor-purin in alkalischer Lösung unter Erhitzen hydrolysiert, um in 6-Stellung eine OH-Gruppe einzuführen,

e) ein in 9-Stellung entsprechend substituiertes 6-Chlor~purin mit Jodwasserstoff behandelt, um in 6-Stellung ein Jodatom einzuführen oder

f) 5-Amino-4,6-Dichlorpyrimidin der Formel

Cl

NHo

mit einem Amin der allgemeinen Pormel

I₂

CH-CH-R

R¹ OH

-V W-
19.3.1930 56 098/12

12

umsetzt, in der R und R die oben angegebene Bedeutung haben und das erhaltene 4-Chlor-5-amino~6-(hydroxyalkylamino)~pyriinidin der allgemeinen Formel

Cl

H-C- CH -R^£

I₁ I

R¹ OH

mit Triethylorthoformiat einem Ringschluß unterwirft,

2_β Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man ein in 9-Stellung substituiertes Purin verwendet, in dem R eine geradkettige Alkylgruppe ist»

3* Verfahren nach Punkt 1 und 2_t gekennzeichnet dadurch^ daß man ein in 9-Stellung substituiertes Purin verwendet, in dem R eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen ist·

Verfahren nach Punkt 1 bis 3? gekennzeichnet, daß man ein in 9-Stellung substituiertes Purin verwendet _$ in dem R eine geradkettige Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist ο
19.3.1980 56 098/12

5* Verfahren nach Punkt 4$ gekennzeichnet dadurch^ daß man ein in 9-^tellung substituiertes Purin Yei"//endetj

in dem R die n-Hexy!gruppe ist.

Verfahren nach Punkt 1 Ms 4_S gekennzeichnet dadurch^ daß men ein in 9-Stellung substituiertes Purin verwendet j in dem R die Methy!gruppe ist»