CS241023B2

CS241023B2 - Method of 9-(hydroxylakyl)-hypoxanthines production

Info

Publication number: CS241023B2
Application number: CS796227A
Authority: CS
Inventors: Alfredo Giner-Sorolla
Original assignee: Newport Pharmaceuticals; Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1978-09-15
Filing date: 1979-09-14
Publication date: 1986-03-13
Also published as: IL58086A; DK145627B; PL124228B1; YU224679A; AU527881B2; JPS5559188A; MX6270E; PH15921A; HU180892B; IL58086A0; PL218318A1; US4221910A; ES484168A1; IE791752L; EP0009155B1; AU5055679A; DE2964059D1; JPH031310B2; NO792791L; YU41885B

Description

Způsob výroby sloučeniny vzorce

QH

ve kterém

R¹ je Ci—Сз-alkyl, se provádí hydrolýzou 9-chlorovaných sloučenin za alkalických podmínek. Uvedené sloučeniny jsou imunomodulátory, mají protivirový a protinádorový účinek a působí též jako inhibitory enzymů.

Vynález se týká způsobu výroby sloučenin vzorce

OH

i

H Č- CH-CHi R OH ve kterém

R¹ znamená alkyl s 1 až 8 atomy uhlíku.

Tyto sloučeniny jsou imunostimulátory, mají antivirový a protinádorový účinek a jsou rovněž inhibitory enzymů.

Jak je patrno, vzrůstá imunoregulační účinek se vzrůstající délkou řetězce u R¹, od methylu až к hexylu; R¹ je výhodně n-alkyl, například methyl, ethyl, n-propyl, n-butyl, n-amyl, n-hexyl, n-heptyl nebo n-oktyl.

Imunomodulátor je sloučenina, která reguluje imunitní odpověď. Zahrnuje tedy jak imunostimulaci (imunopotenciaci), tak imunoinhibici. Imunostimulace je samozřejmě potřebná při vytváření imunity. Imunoinhibice je rovněž užitečná v řadě odvětví. Je například potřebná při transplantaci orgánů, například ledvin nebo srdce, aby se zabránilo vyloučení orgánu.

V tabulkách udávajících imunopotenciační vlastnosti sloučenin, značí znaménko plus (4-) imunopotenciační vlastnosti, znaménko minus ( —} značí imunoinhibiční vlastnosti. Číslo 0 značí, že sloučenina nemá ani imunopotenciační ani imunoinhibiční účinek.

Mitogen je látka, která vyvolává proliferaci buněk, jak se objevuje v průběhu imunizace.

Směsi podle vynálezu jsou použitelné při léčení savců (a buněk savců) včetně lidí, prasat, psů, koček, dobytka, koní, ovcí, koz, myší, králíků, krys, morčat, křečků, opic atd.

Pokud není jinak uvedeno, všechny díly a procenta jsou hmotnostní.

Všechny teploty jsou uvedeny ve stupních Celsia, pokud není udáno jinak.

Směsi lze podávat savcům obvyklými metodami, například orálně, nazálně, rektálně, vaginálně nebo parenterálně. Mohou být používány jako injekční roztoky, například vodné, nebo jako tablety, pilulky, kapsle atd.

co oo hO o o CM CM

CD O) co ьь

O O*

CD CD

TABULKA 1 ·...····.:· . .

Přehled chemických vlastností 9-(hydroxyalkyl)purinů

‘e

cd P

XD P o

СЛ тЧ &

Φ CM O CM CM CM CM CM CM

O co in xíi to

CM CM CM

CM

CM co

OM

CD

CO to

Jiné sloučeniny vyrobené podle vynálezu jsou uvedeny níže v tabulce la, kde základní vzorec je stejný jako v tabulce 1. V tabulkách 1 a la jsou alkylové skupiny, označené symbolem R¹, vesměs n-alkyly.

TABULKA la

Sloučenina

R¹

СНз C2H5 СзН7 С|Нэ C5H11 C8H17

Způsob A

Erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)hypoxanthin (NPT 15 392)

Schéma syntézy pro přípravu erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)hypoxanthinu (nonylhypoxanthin, vzorec VIII) je znázorněno na proudovém diagramu 1. Je uvedeno zdokonalení způsobu H. J. Schaeffera a C. F. Schwendera, J. Med. Chem. 17, 6 (1974) v reakčním schématu vedoucím к erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)-6-chlorpurinu vzorce VII. Poslední stupeň, hydrolýza 6-chlorpurinového derivátu vzorce VII za vzniku nonylhypoxanthinu vzorce VIII představuje upravený způsob publikovaný A. Giner-Sorollou, C. Grytem, A. Bendichem a G. B. Brownem, J. Org. Chem. 34, 2 157 (1969) pro hydrolýzu halogenpurlnů.

Proudový diagram 1

Schéma syntézy erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyljhypoxanthinu (vzorec VIII)

Stupeň 2

Hydrochlorid acetamidononan-2-onu (vzorec III)

Tvorba uvedeného hydrochloridu

HC1

СНз— (СНг)з-CH—СОСНз-----| 67 %

NH2 (II)

СНз— (СНг)з—CH—СОСНз

I

NHj. HC1 (III) ►

Stupeň 3

Erythro-3-amino-2-nonanol (vzorec IV)

Redukce hydrochloridu acetamidononan-2-onu

KBHi ·.

СНз— (СШ)5—CH—СОСНзi| 75 %, nh₂ . hci:

(III) снз— (ешь—сн—ch—снз>

NH2 OH·.

: '(IV) (Čísla pod šipkami udávají výtěžek v pro.centech.) ~

Stupeň .4

Erythro-5-amino-6- (2-hydroxy-3-nonyl'aminb)pyrimidin (vzorec VI)

Stupeň 1

Acetamidononan-2-on (vzorec II)

Acylace kyseliny 2-aminooktanové (СНзСО)гО

СНз— (СНз )5—CH—COOH------

I 70 »/o

NH2 (I)

СНз-(СН₂)5-СН-СОСНз nh₂ kondenzace erythro-3-amino-2-nonanolu s 5-amino-4,6-dichlorpyrimidinem

Cl

(V)

IW_SCH-NH,

I *· CHOH

I ^CH3 (IV.)

(ii) (Hydrolýzou 6chlorpurinového derivátu)

I CH ^CH3^(CH2f5 CHOH ^CH3 (Ví I

Stupeň 5

Erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) -6-chlorpurin (vzorec VII)

Uzavření kruhu erythro-5-amino-4-chlor-6-(2-hydroxy-3-n-onylamino) pyrimidinu (vzorec V)

Cl

I

CHOH ^CH3 (Ví) ct

CW₃-(C^5 CHOH

CH₃(VII)

Stupeň 6

Erýthro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) hypoxanthin (vzorec VIII)

(VII)

( Vili)

3-Acetamidononan-2-on (vzorec II) (CH3CO)2

CH3—(CH2)5—CH—COOH-----—►

I 70 %

NH2 (I)

CH3— (CH2)5—CH—COCH3

NH2 (II) ' Směs 200 g - (1,26 mol) kyseliny 2amino-1-o-ktanové (vzorec I) v 960 ml anhydridu kyseliny octové a 640 ml pyridinu byla zahřívána na vroucí vodní lázni po dobu 4 hodin. Reakční směs byla odpařena ve vakuu a zbytek byl vytřepán 6- až 8x mezi 400 ml 5% vodného roztoku hydrogenuhličítanu sodného a 400 ml etheru. Spojené etherické výtřepky byly vysušeny bezvodým síranem horečnatým a odpařeny k suchu za vzniku 154. g (70 %) sur-ového· 3-acetamidononan-2-onu.

Hydrochlorid 3-amino-2-nonanonu (vzorec III)241023

НС1

СНз-(СНг)5-СН-СОСНз-----' 67 %

NH2 (II)

СНз— (CH > )з—CH—СОСНз

I

NH?. HCl (III)

154 g surového produktu vzorce II získaného v předchozím stupni, bylo rozpuštěno v 1 540 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a zahříváno к varu pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin, potom odpařeno к suchu ve vakuu. Získaná pevná látka byla překrystalována z teplého roztoku ve 200 ml ethanolu a potom byla reakční směs ochlazena na teplotu 25 °C. К tomuto roztoku bylo přidáno 600 ml etheru. Vylučuje se bezbarvá krystalická sraženina; suspenze se udržuje při teplotě 5 °C přes noc. Sraženina se izoluje filtrací a promyje jednou 100 ml etheru za vzniku 125 g (67 °/o) bezbarvého krystalického produktu s teplotou tání 112’0.

V případě, že krystalický materiál by nebyl bezbarvý nebo měl nižší teplotu tání, měl by být překrystalován z tetrahydrofuranu za přidání aktivního uhlí. Při jednom opakování tohoto způsobu bylo použito 150 mililitrů tetrahydrofuranu na 100 g surové. ho hydrochloridu vzorce III.

Erythro-3-amino-2-nonanol (vzorec IV]

KBHj

СНз—(CH?)s—CH—СОСНз------I 75 %

NH2. HCl (III)

СНз— (CH? )з—CH—CH—СНз

I I

NH? OH (IV)

43,8 g (0,226 mol) hydrochloridu 3-amino-2-nonanolu bylo rozpuštěno ve 150 ml absolutního methanolu a reakční směs byla ochlazena ledovou lázní se solí na teplotu —10 ^CC. 1. 24,4 g (0,45 mol) borohydridu draselného, 2. bylo přidáno v malých dávkách během doby 2 až 3 hodin.· Směs se potom udržuje po dobu 3 hodin při teplotě —10 až —15 °C, 3., 4. a pomalu se nechá vystoupit na teplotu místnosti (22 °C), potom se míchá přes noc (20 hodin) při teplotě místnosti. Směs se potom odpaří к suchu (sirup) ve vakuu a rozdělí se mezi 150 ml vody a 150 ml chloroformu. Vodná vrstva se dále extrahuje třikrát po 100 ml chloroformu. Chloroformová vrstva byla vysušena bezvodým síranem hořečnatým a poskytla po odpaření ve vakuu nažloutlý olejovitý produkt. Tato kapalina byla destilována ve vysokém vakuu při 95 až 100 °C (20 Pa) za vzniku čistého erythro-3-amino-2-nonanolu.

Výtěžek: 26,4 g (75 %). Teplota tání 81 až 86 °C.

1. Po ochlazení roztoku látky vzorce III se sráží něco materiálu, který je však bez vlivu na výsledek reakce.

2. Zde v tomto stadiu se tento způsob liší od způsobu Schaeffera se sp., Schaeffer přidává kyselinu octovou současně s KBHi, přičemž udržuje hodnotu pH na 5 až 6. Bylo nalezeno, že neutralizace vede ke ztrátě KBHj, a že je možné pracovat při hodnotě pH nad 5. Důležitější je skutečnost, že, současné přidávání kyseliny octové a KBHi (jak je navrženo Schaefferem) činí průběh reakce těžko kontrolovatelný. Dochází ke značnému vzrůstu teploty a snížení výtěžku a/nebo kvality produktu.

3. Doporučuje se použít výkonného míchání к zajištění vlastní reakce, která je skončena, když všechny malé shluky a částečky borohydridu draselného zmizí.

4. Chlazení na 0 °Č, jak je popisováno Schaefferem se sp. je nedostatečné. Zdokonalení spočívá v udržování reakční směsi pod teplotou 0^cC; nejlépe je ji udržovat pod hodnotou —10 ^CC. a to po celou reakční dobu. Jestliže teplota vystoupí na —10 ^CC, dochází к podstatné ztrátě na výtěžku.

Erythro-5-amino-4-chlor-6- (2-hydroxy-3nonylamino)pyrimidin (vzorec VI)

NH_Z

CH₃ (VI)

Směs 24,6 g (0,15 mol) 4,6-dichlor-5-ami241023 nopyrimidinu vzorce V a 26,2 g (0,164 mol) erythro-3-amino-2-nonanolu vzorce IV v 1 080 ml 1-pentanolu a 350 ml tributylaminu byla připravena za míchání při teplotě 25 ^CC. Získaná suspenze byla zahřívána k . varu pod zpětným chladičem v dusíkové atmosféře po dobu 28 hodin. (Roztok vznikl asi po 0,5 hodině). V této době vzorek reakčního produktu vykazoval UV spektrum —267 a 297 nm (voda, pH 5,5).

Získaný roztok byl koncentrován na horké vodní lázni za tlaku 1,33 kPa na sirup a dále odpařen na olejové lázni při 13,33 Pa a teplotě 100 ^CC za vzniku viskózní kapaliny, ke které bylo přidáno 450 ml n-hexanu. Směs byla zahřívána k varu pod zpětným chladičem po dobu 1 hodiny a potom horký nažloutlý hexanový supernatant byl oddělen od tekutiny na dně kulaté reakční baňky.

Získaný lehce nahnědlý olej, ze kterého byl ve vakuu odstraněn všechen zbylý hexan., byl rozpuštěn ve 150 ml chloroformu. Chloroformový roztok byl extrahován 8x po 250 ml nasyceným vodným roztokem hydrogenuhličitanu sodného. Chloroformová vrstva byla oddělena, vysušena bezvodým síranem horečnatým a odpařena ve vysokém vakuu (13,33 Pa) při teplotě 40 °C (na vodní lázni) a poskytla světle hnědý olej, který ztuhl ochlazením. Materiálu lze použít přímo pro příští stupeň nebo k čištění následujícím způsobem:

Získaný olej byl rozpuštěn v 75 až 100 ml chloroformu a asi 300 ml hexanu bylo přidáno k vysrážení bezbarvé krystalické látky, která byla odfiltrována od ochlazeného roztoku. (Extrakce se provádí 4 až 8x, až se dále nevyvíjí oxid uhličitý). Tato· opereme byla opakována dvakrát.

Výtěžek: 23,3 g (54 %).

UV: λ_Ι44η —267, 297 nm (voda, pH 5,5). Teplota tání: 113 až 116 °C.

Erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl) -6-chlorpurin (vzorec VII) .

XX ' ^N NH

I

CHjfcHJs CHOH

CHo ( V! > ³

OH

I ch₃-|ch₂]5

CHj (VID

11,48 g (40 mmol) surového sirupu z předchozí operace, sestávajícího z erythro-5-amino-4-chlor-6- (2-hydroxy-3-nonylamino)pyrimidinu, bylo rozpuštěno ve směsi 106 ml orthomravenčanu _ ethylnatého a 34 mililitrů chloroformu a 10 kapek kyseliny ethansulfonové bylo přidáno, aby vznikl roztok. Po stání přes noc při teplotě 25 °C byl roztok odpařen ve. vakuu na sirup. Bylo získáno 11,7 g produktu (kvantitativní výtěžek). Tohoto sirupu, který sestává ze surového erythro-9- (2-hydr oxy-3-nonyl)-6-chlorpurinu (vzorec VII) bylo použito do dalšího stupně.

UV: A_mo —264 nm.

Erythro-9-(2-hydroAy3-nonyl)hypoxanthin (vzorec VlIIj (Pomocí hydrolýzy 6-chlorpurinového derivátu)

^CH3 (VID

OH

I ^CH^ ^^НОНCH₃ ( Vlil)

Suspenze 4,0 g (13,4 mmol) erythro-6-chlor-9-(2-hydroxy-3-nonyl)purinu (vzorce VII) ve 40 ml 0,5 N hydroxidu sodného byla zahřívána к varu pod zpětným chladičem po dobu 2 hodin a potom ochlazena. Neutralizace koncentrovanou kyselinou octovou a ochlazení poskytlo krystalickou sra ženinu erythro-9- (2-hydroxy-3-nonyl ]hypoxanthinu (vzorec VIII), který byl odfiltrován a vysušen.

Výtěžek: 3,8 g (kvantitativní).

Teplota tání: 196 °C.

UV: A_I)1;)X — (voda, pH 5,5) 251 nm.

Takto získaný surový produkt vzorce VIII byl podle výsledků papírové chromatografie homogenní (ve třech soustavách) a poskytoval negativní test na přítomnost chloridových. iontů (měděný drát a plamen, tavení se sodíkem, okyselení a reakce s dusičnanem stříbrným).

Překrystalování vzorku surového produktu třikrát z vodného ethanolu (viz čištění) poskytlo bezbarvé krystaly.

Teplota tání: 202 °C.

Analýza pro- C14H22N4O2 (VIII):

vypočteno:

60,41 % C, 7,97 % H, 20,13 % N, nalezeno:

60,47 % C, 7,86 % H, 20,08 % N.

Čištění erythro-9-(2-hydroxy-3-nonyl)hypoxanthinu (vzorec VIII)

Surový nonylhypoxanthin vzorce VIII se čistí překrystalováním. Surový materiál se rozpustí zahřátím asi v 6- až lOnásobkusvé hmotnosti v ethanolu a potom se přidá stejný objem vody. Roztok se vyčeří aktivním uhlím v Erlenmeyerově baňce a filtruje za horka celitem. Roztok·se odpaří za stálého míchání na vyhřívané desce. Po malých dávkách se přidává voda, aby nahradila odpařený objem, až se začne objevovat sraženina. V odpařování se má pokračovat, až se odstraní všechen ethanol opakovaným přidáváním vody až se dosáhne 8 až 12násobku hmotnosti materiálu. Překrystalováním se ztrácí asi 10 % materiálu. Po dvojím překrystalování vystoupí teplota tání na hodnotu 202 ^:C a získá se bezbarvý krystalický produkt, kdežto surový materiál byl nažloutlý nebo růžový a měl teplotu tání 192 ^CC. NPT 15 392 má protichřipkový, protilcukemický a imuhopotenciální účinek.

Ošetření myší in vivo pomocí NPT 15 392: Účinek na stimulaci proliferace slezinných buněk konkanavalinem A.

Účelem této studie bylo stanovit účinky ošetření myší in vivo sloučeninou NPT 15 392 na následnou aktivitu slezinných buněk isolovaných z těchto· zvířat a hodnocených in vitro na jejich proliferační odezvu na mitogen konkanavalin A (Con A).

Postup

Ošetření in vivo

Devět samečků myší odrůdy Balb/c, stáří 8 až 9 týdnů, o hmotnosti 18 až 20 g, bylo rozděleno do dvou skupin. Jedna skupina byla ošetřována dvakrát denně (po jeden den), ráno a odpoledne orální dávkou sloučeniny NPT 15 392 10 mg/kg. Druhá skupina byla ošetřována podobně dávkami chloridu sodného, který sloužil jako placebo pro slepý pokus.

Zkouška slezinných buněk in vitro: preparace buněk

Následujícího dne byly obě skupiny usmrceny, vyňaty sleziny a shromážděny. Sleziny byly rozmělněny a buňky promyty v médiu RPMI-1 640 s přídavkem 2 mmol glutaminu a antibiotik. Koncentrace buněk v každém preparátu byla stanovena Coulterovým počítačem a upravena na 5 x 10⁶ buněk/ml pomocí uvedeného média.

Mikrotitrační zkouška na misce

Mikrotitrační zkoušky byly prováděny v

0,2 ml inkubacích obsahujících 5 x 10⁵ buněk a Con A, nebo Con A a sloučeninu, v uvedených koncentracích. Všechny zkoušky byly prováděny s 6 opakováními a srovnány se slepým pokusem obsahujícím pouze buňky. Zkušební misky byly inkubovány při teplotě 37 °C v 5% oxidu uhličitém po dobu 4 dní. Během posledních 18 až 20 hodin inkubace bylo přidáno 0,5 ml ⁵HTdR (3,7. . 10⁴ s¹ na ml, 22,2 .Ю¹⁰ s^_1/mmol) ke každé kultuře. Kultury byly izolovány multiplikačním automatickým vzorkovacím zařízením a inkorporovaný ³HTAR byl stanoven kapalinovým scintilačním počítačem jako měřítko proliferace buněk. Výsledky se tabelují jako poměr účinnosti kultur s Con A, nebo s Con A a uvedenou sloučeninou, proti slepým pokusům.

Působení sloučeniny 15 392 in vivo zvyšuje následnou odezvu slezinných buněk na stimulaci pomocí Con A in vitro při suboptimální mitogenní koncentraci (5 ug/ml). Stimulační poměr 120:1 byl pozorován u slezinných buněk izolovaných z myší ošetřených sloučeninou 15 392, ve srovnání s poměrem 40:1 u slezinných buněk izolovaných z myší ošetřených placebem.

Byl hodnocen rovněž účinek následného působení in vitro sloučeniny NPT 15 392 v dávce 1 .ugTnl na buňky stimulované pomocí Con A. Sloučenina vykazuje zřetelnou schopnost zvyšovat stimulaci pomocí Con A, zejména při suboptimální koncentraci mitogenů (5 ₍ug/ml), a v menším rozsahu při 10 ,«g/ml. Při koncentraci 5 _tug/l Con A je stimulace pomocí NPT 15 392 2,8x vyšší než pomocí Con A samotného.

Tyto výsledky svědčí o imunonodulačním efektu této sloučeniny na proliferaci buněk sleziny. Premedikace zvířat sloučeninou senzibiluje buňky pro následující mitogenní stimulaci, zatímco působení sloučeniny na buňky in vitro, následující po mitogenní stimulaci, zvyšuje proliferační odezvu.

Claims

PŘEDMĚT

1. Způsob výroby 9-(hydroxyalkyl)hypoxanthinů obecného vzorce

OH

I

HC-CH-CHo • Ιγ I

R OH ve kterém R¹ znamená Ci- až Cs-alkyl, vyznačující se tím, že sloučenina obecného vzorce vynalezu ve kterém R¹ má výše uvedený význam, se hydrolyzuje za alkalických podmínek.
2. Způsob podle bodu 1 vyznačující se tím, že se vychází ze sloučeniny výše udaného obecného vzorce, v němž R¹ znamená n-alkyl o Ci až Сз.
3. Způsob podle bodu 2 vyznačující se tím, že se vychází ze sloučeniny výše udaného obecného vzorce, v němž R¹ znamená n-alkyl o Ci až C7.
4. Způsob podle bodu 3 vyznačující se tím, že se vychází ze sloučeniny výše udaného obecného vzorce, v němž R¹ znamená n-alkyl o Ci až Сб.
5. Způsob podle bodu 4 vyznačující se tím, že se vychází ze sloučeniny výše udaného obecného vzorce, v němž R¹ znamená n-hexyl.
6. Způsob podle bodu 4 vyznačující se tím, že se vychází ze sloučeniny výše udaného obecného vzorce, v němž R¹ znamená methyl.