CN103232490B - 具有抑制hiv-1/hbv病毒复制活性的核苷类化合物、制备方法及抗病毒方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组具有抑制HIV-1/HBV病毒复制活性的非环核苷类化合物、制备方法及其药物用途。还公开了该组化合物的通式I，其中R1是氢、C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基、C5-6芳基或C5-12芳烷基；R2是任一天然或可药用氨基酸侧链，并且，条件是当该侧链含有羧基时，则任选该羧基选用烷基或芳基酯化。还公开了结构通式I和结构通式Ⅱ的制备方法以及含有该组化合物的药物组合物。实验证明本发明化合物具有抑制HIV-1/HBV病毒复制的活性，且所述化合物之一具有比目前治疗艾滋病药物替诺福韦酯富马酸盐(TDF)活性高385倍多，且脂溶性又比TDF高的优点，可用于治疗艾滋病或乙型肝炎药物的开发。

Description

具有抑制HIV-1/HBV病毒复制活性的核苷类化合物、制备方法及抗病毒方面的应用
技术领域：
本发明涉及一组核苷类化合物，尤其涉及一组具有抑制HIV-1/HBV病毒复制活性的非环核苷类化合物、制备方法以及在抗病毒方面的应用。
背景技术：
人类在病毒感染性疾病的治疗中，病毒耐药性问题日益突出。与环状核苷类逆转录酶抑制剂相比，非环核苷化合物替诺福韦在防止病毒耐药性问题上具有明显优势，其对耐环状核苷类药物的病毒株有效，本身耐药发生率低，且毒性相对较小，可用于治疗同时感染HIV-1和HBV的患者。但是，由于磷酸酯基带负电荷，极性太强，生物膜透过性差，导致生物利用度很低，使其不能成为药物应用于临床。其双酯性前药替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐【TDF】(TDF的体外抗HIV-1病毒活性IC50值为：1.6μM)改善了药物的生物利用度，于2001年被美国FDA批准上市。由于治疗效果确切，适用性好，剂量合适，是多个治疗指南推荐使用的一线抗HIV药物。替诺福韦酯及其复方制剂已成为目前销售额最大的抗艾滋病药物。2008年4月和8月，欧盟和美国FDA根据大量的临床试验结果，又分别批准其用于治疗乙型肝炎(乙肝)，并被专家誉为最好的抗乙肝药物之一，其销售额进一步扩大。吉利德公司2010年年报显示，替诺福韦酯及其复方制剂2010年的销售额已经超过60亿美金。
作为前药，本身没有抗病毒活性，进入体内后必须游离出原药后才能发挥疗效，而部分药物在吸收进入血液前即被水解；另外，释放出的原药替诺福韦同样由于膜透过性差的问题，迅速被排出体外而难以在感染部分保持足够的浓度，致使其人体生物利用度只有28％左右。因此，对替诺福韦加以改造以提高其抑制病毒的活性和脂溶性，进而提高人体的生物利用度，进一步发挥治疗乙肝和艾滋病的药效仍然具有重要的价值。
发明内容：
本发明的目的是对替诺福韦及其衍生的结构进行更进一步的改造，得到具有更高的脂溶性和更高抑制病毒的活性的新的核苷类化合物，即本发明产品：一具有抑制HIV-1/HBV病复制活性的非环核苷类化合物，为今后深入研究与开发本发明化合物及其盐的抗病毒应用奠定基础。
本发明的研发人员经过艰苦不懈的努力，对替诺福韦及其衍生的结构进行改造，合成出了一组具有抑制HIV-1/HBV病毒复制的活性，该组化合物之一具有比目前治疗艾滋病药物替诺福韦脂富马酸盐(TDF)活性高385倍多，且脂溶性又比TDF高的优点，可用于治疗艾滋病及乙型肝炎药物的开发。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案是提供具有通式I非环核苷类化合物：
其中:
R1是氢、C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基、C5-6芳基或C5-12芳烷基；
R2是任一天然或可药用氨基酸的侧链，并且，条件是当该侧链含有羧基时，则任选该羧基选用烷基或芳基酯化。
本发明提供的上述的非环核苷类化合物，优选其中，R2是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或组氨酸的氨基酸侧链。
本发明提供的上述的非环核苷类化合物，再优选其中，R2是丙氨酸侧链。
本发明提供的上述的非环核苷类化合物，又优选其中，当R1为异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基、甲基、正丙基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、3-甲基己基、正己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基或正十二烷基时，具体为下列化合物：
本发明提供具有通式Ⅱ所示的非环核苷类化合物药学上可接受的盐：
其中：其中:
R1、R2定义同Ⅰ式，Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的富马酸、盐酸或硫酸。
本发明提供的上述的非环核苷类化合物药学上可接受的盐，优选其中，当R1是异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基、甲基、正丙基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、3-甲基己基、正己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基或正十二烷基，R2是丙氨酸侧链，Acid是富马酸时，具体为下列化合物：
本发明提供具有通式I所示的非环核苷类化合物的制备方法，包括以下步骤：
其中：R1、R2定义同Ⅰ式； 
该制备方法包括如下步骤：
a、用替诺福韦为原料，N-甲基吡咯烷酮为溶剂，在三乙胺存在的环境下，与氯甲基碳酸异丙酯在反应温度为50℃-80℃下缩合，反应8-15个小时，得到替诺福韦单酯化合物：(R)-9-{2-[(异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤；
b、用替诺福韦单酯化合物为原料，吡啶为溶剂，在三乙胺存在的环境下，2,2′-二硫二吡啶、三苯基膦为络合剂，与L-丙氨酸酯盐酸盐在反应温度为45-75℃下脱水缩合，反应8-18个小时，得到目标物Ⅰ((R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(烷氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤)。
本发明提供具有通式Ⅱ所示的非环核苷类化合物药学上可接受的盐制备方法，反应式如下：
其中：R1、R2定义同Ⅰ式；Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的富马酸、盐酸或硫酸；
该制备方法步骤是：将化合物Ⅰ与等量的Acid溶于乙腈中回流搅拌，反应1-3小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙醚洗涤得到目标物Ⅱ。
本发明提供了一种药物组合物，含有治疗有效量的任一种上述的非环核苷类化合物或其药学上可接受的盐，所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊等多种剂型。本发明还提供了上述药物组合 物在制备抗病毒药物中的应用。
本发明提供了上述本发明任一种化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的用途。
本发明提供了上述本发明任一种化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的用途，尤其是病毒疾病为HIV或HBV感染或HIV与HBV同时感染。
药理活性试验结果表明(详见表1，表2)，本发明化合物C0P233，C0P234都表现出了很好的抗HIV-1活性；C0P230，C0P233，C0P235都表现出了很好的抗HBV活性，可作为活性成分，用于制备抗病毒药物，如抗艾滋病病毒感染的药物或治疗乙型肝炎的药物。
上述药物中还可以添加一种或多种药学上可接受的载体，如药学上可接受的稀释剂、赋型剂、填充剂、粘合剂、、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、香味剂和甜味剂等。以本发明化合物为活性成分制备的药物可以是片剂、粉剂、胶囊、粒剂或口服液以及注射制剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按药学领域的常规方法制备。
本发明替诺福韦双酯化合物的药物组合物组成可以由下配比构成：
发明效果： 
经过国家权威检测机构测定，本发明化合物具有成为治疗艾滋病及乙型肝炎的药物所需的优良属性，具体如下：
(1)本发明的化合物具有超出目前销售额最大的抗艾滋病药物、同时又被专家誉为最好的抗乙肝药物的替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF)抑制病毒复制活性10多倍，达到了纳摩级(10-9)的水平。
本发明化合物之一的C0P233抑制病毒复制活性的IC50值为4.15±1.35nM；C0P234抑制病毒复制活性的IC50值为5.0±0.4nmol/L，在相同条件下平行测定的阳性对照AZT半数有效浓度为24.3nM；替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF)的IC50值为1600nM。
(2)通常情况下，一种物质在具有很高的活性时往往也都具有很高的毒性。然而经权威检测机构检测，本发明化合物在具有很高活性的同时，却具有很低的细胞毒性：“在终浓度10μmol/L对细胞增殖无显著性影响”。
(3)在本发明化合物C0P233和TDF脂溶性的高效液相色谱图上，TDF的保留时间为3.627分钟，化合物C0P233的保留时间为4.169分钟。化合物C0P233的保留时间比TDF的保留时间延长了0.542分钟。
经对比检测，发现本发明化合物代表性实例C0P233的脂溶性比替诺福韦脂富马酸盐(TDF)脂溶性高出了许多，这自然表明了本发明化合物的膜透过性比TDF膜透过性要高出许多，改善了替诺福韦的人体的生物利用度，从而显著地提高了替诺福韦治疗乙型肝炎和艾滋病的效果，相应也必将产生巨大的经济效益和社会效益。
(4)本发明化合物本发明化合物C0P230(36.8μM)，C0P232(70.9μM)，C0P233(59.5μM)，C0P235(69.6μM)都比目前销售额最大的抗艾滋病药物、同时又被专家誉为最好的抗乙肝药物的替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF C0P22的IC50值为80.1μM)抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。
总之，本发明化合物集很高的活性、很低的毒性，极好的脂溶性等各种良好属性于一体，有着成为新一代治疗乙型肝炎和艾滋病药物的前景。这将为治疗乙型肝炎和艾滋病提供了一种新选择。
附图说明
图1为比较本发明化合物C0P233和TDF脂溶性的高效液相色谱图。
具体实施方式：
以下实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。所有化合物的结构均经1H NMR或MS所确定。
实施例1：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P231)的制备
在50ml圆底烧瓶中，依次加入(R)-9-[2-(磷酸甲氧基)丙基]腺嘌呤(替诺福韦，PMPA)(1.3g，4.5mmol)、三乙胺(7ml,5.08g，50.2mmol)、氯甲基碳酸异丙酯(0.265ml,0.305g，2mmol)和N-甲基-2-吡咯烷酮(14ml)，在60℃下搅拌15h后，蒸除溶剂，用乙酸乙酯：乙醇＝10:1硅胶柱层析，得中间化合物：(R)-9-{2-[(异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P02)(0.68g，1.68mmol)收率37.3％。
在50ml圆底烧瓶中，依次加入C0P02(8.47g,21mmol),L-丙氨酸乙酯盐酸盐(6.6g，43mmol)、2,2′-二硫二吡啶(9.03g,41mmol)、三乙胺(11.04g，15.2ml,109mmol)、三苯基膦(11.2g，43mmol)和吡啶(25ml)，在65℃下密闭搅拌16h后，蒸除溶剂，用乙酸乙酯：乙醇＝7:1硅胶柱层析，得到产品：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P231)。(4.4g，8.76mmol)，收率41.7％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):1.16-1.44(15H,m,5×CH3),3.57-4.27(8H,m,OCH，NCH2，OCH2P,COOCH2and NCH),4.31-4.47(1H,m,COOCH),4.85-5.00(1H,m,NH),5.53-5.74(2H,m,OCH2O),6.05-6.34(2H,d,NH2),7.93-8.05(1H,d,嘌呤环上的H),8.26-8.42(1H,d,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+503.2，[M+Na]+525.2
实施例2：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P232)的制备
以实施例1类似方法合成得到：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丁氧羰基)] 乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P232)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.87-0.95(6H,m,2×CH3)，1.17-1.45(12H,m,4×CH3),1.84-2.00(1H,m,CH),3.60-3.71(1H,m,OCH),3.83-4.00(4H,m,COOCH,COOCH2and NCH),4.08-4.18(2H,m,OCH2P),4.25-4.46(2H,m,NCH2),4.87-4.98(1H,m,NH),5.57-5.73(2H,m,OCH2O),6.60(2H,s,NH2),7.96-8.03(1H,d,嘌呤环上的H),8.29-8.36(1H,d,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+531.3，[M+Na]+553.2
实施例3：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P233)的制备
以实施例1类似方法合成得到：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P233)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.94(9H,s,3×CH3),1.17-1.22(3H,d,CH3)，1.26-1.32(6H,m,2×CH3),1.40-1.46(3H,d,CH3),3.60-3.87(3H,m,2×COOCH and NCH),3.88-3.95(2H,m,COOCH2),4.08-4.39(4H,m,OCH2P and NCH2),4.86-4.97(1H,m,NH),5.57-5.73(2H,m,OCH2O),6.46(2H,s,NH2),7.99(1H,s,嘌呤环上的H),8.33(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+545.4，[M+Na]+567.3
实施例4：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P234)的制备
以实施例1类似方法合成得到：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P234)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.93(3H,t,3×CH3),1.18-1.44(14H,m,4×CH3and CH2)，1.55-1.67(2H,m,CH2),3.58-3.95(3H,m,OCH,COOCH and NCH),3.96-4.07(2H,m,COOCH2),4.08-4.41(4H,m,OCH2P and NCH2),4.85-4.98(1H,m,NH),5.53-5.72(2H,m,OCH2O),6.26(2H,s,NH2),7.96-8.04(1H,d,嘌呤环上的H),8.33(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+531.2，[M+Na]+553.2
实施例5：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P235)的制备
以实施例1类似方法合成得到：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)] 乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P235)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):1.01-1.26(12H,m,4×CH3),1.27-1.53(6H,m,环己基上的3×CH2),1.59-1.70(2H,m,环己基上的CH2),1.71-1.81(2H,m,环己基上的CH2),3.70-3.98(4H,m,NCH,OCH，环己基上与氧相连的CH and NH)，4.11-4.30(2H,m,OCH2P),4.60-4.86(2H,m,NCH2),5.38-5.56(3H,m,OCH2O and COOCH),7.20(2H,s,NH2),8.05-8.09(1H,d,嘌呤环上的H),8.13(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+557.3，[M+Na]+579.2
实施例6：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P230)的制备
以实施例1类似方法合成得到：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P230)。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):1.14-1.42(18H,m,6×CH3),3.55-3.71(1H,m,OCH),3.75-4.07(3H,m,2×COOCH and NH),4.08-4.24(2H,m,OCH2P),4.29-4.45(1H,m,NCH),4.84-5.10(2H,m,NCH2),5.54-5.74(2H,m,O CH2O),6.45(2H,s,NH2),7.95-8.04(1H,d,嘌呤环上的H),8.27-8.38(1H,d,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+517.2，[M+Na]+539.1
实施例7：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P230)的制备
将等量的(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤(C0P230)和富马酸溶于乙腈中，回流搅拌2小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙醚洗涤得白色固体:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P230)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):1.04(3H,t,CH3),1.12-1.28(15H,m,5×CH3),3.67-4.00(4H,m,OCH2P，NCH,and OCH),4.12-4.31(2H,m,NCH2),4.75-4.95(2H,m,NH,COOCH),5.37-5.59(3H,m,OCH2O and COOCH),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.22(2H,s,NH2),8.06-8.10(1H,d,嘌呤环上的H),8.14(1H,s,嘌呤环上的H).12.22-14.23(2H,br,富马酸的两个COOH).ESI-MS:[M+H]+517.3 
实施例8：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P231)的制备
以实施例7类似方法合成得到:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(乙氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P231)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):1.19-1.39(15H,m,5×CH3),3.67-3.98(6H,m,OCH2P，NCH,COOCH2and OCH),4.11-4.31(2H,m,NCH2),4.75-4.86(1H,m,NH),5.42-5.60(3H,m,OCH2O and COOCH),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.21(2H,s,NH2),8.05-8.10(1H,d,嘌呤环上的H),8.13(1H,s,嘌呤环上的H).12.52-13.63(2H,br,富马酸的两个COOH).ESI-MS:[M+H]+503.2 
实施例9：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P232)的制备
以实施例7类似方法合成得到:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(异丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P232)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.81-0.94(6H,m,2×CH3),1.04(3H,t,CH3),1.13-1.32(9H,m,3×CH3),1.80-1.95(1H,m,CH),3.68-3.97(6H,m,COOCH2,OCH2P，NCH and OCH),4.11-4.31(2H,m,NCH2),4.75-4.86(1H,m,NH),5.41-5.60(3H,m,OCH2O and COOCH),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.21(2H,s,NH2),8.05-8.10(1H,d,嘌呤环上的H),8.14(1H,s,嘌呤环上的H),12.74-13.60(2H,br,富马酸的两个COOH).ESI-MS:[M+H]+531.3，[M+Na]+553.2
实施例10：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P233)的制备
以实施例7类似方法合成得到:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(新戊氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P233)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.85-0.93(9H,d,3×CH3),1.03(3H,t,CH3),1.21-1.30(9H,m,3×CH3),①3.66-3.98(6H,m,OCH2P，COOCH2,OCH and NCH),4.11-4.30(2H,m,NCH2),②4.75-4.86(1H,m,NH),③5.43-5.60(3H，m，OCH2O，COOCH),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.20(2H,s,NH2),8.05-8.10(1H,d,嘌呤环上的H),8.13(1H,s,嘌呤环上的H),④ 12.88-13.40(2H,br,富马酸的两个COOH).ESI-MS:[M+H]+545.4，[M+Na]+567.3
实施例11：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P234)的制备
以实施例7类似方法合成得到:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(正丁氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P234)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.85(3H,t,CH3),1.26-1.39(14H,m,CH2and 4×CH3),1.58-1.62(2H,m,CH2),3.66-3.98(6H,m,COOCH2,OCH2P,NCH and 0CH),4.11-4.31(2H,m,NCH2),4.74-4.86(1H,m,NH),5.39-5.59(3H,m,OCH2O,COOCH),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.22(2H,s,NH2),8.05-8.10(1H,d,嘌呤环上的H),8.14(1H,s,嘌呤环上的H).12.48-13.52(2H,br,富马酸的两个COOH).ESI-MS:[M+H]+531.2 
实施例12：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P235)的制备
以实施例7类似方法合成得到:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P235)。1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):1H NMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):1.04(3H,t,CH3),1.14-1.52(15H,m,3×CH3and环己基上的3×CH2),1.54-1.85(4H,m,环己基上的2×CH2),3.65-4.00(4H,m,OCH2P,NCH and OCH),4.11-4.32(2H,m,NCH2),4.60-4.71(1H,m,环己基上与氧相连的CH),4.74-4.86(1H,m,NH),5.38-5.58(3H,m,OCH2O,COOCH),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.22(2H,s,NH2),8.05-8.11(1H,d,嘌呤环上的H),8.14(1H,s,嘌呤环上的H)，12.64-13.69(2H,br,富马酸的两个COOH).ESI-MS:[M+H]+557.4，[M+Na]+579.2
实施例13：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤盐酸盐(YC0P235)的制备
以实施例7类似方法合成得到:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)]乙基] 氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤盐酸盐(YC0P235)。
实施例14：(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸盐(SC0P235)的制备
以实施例7类似方法合成得到:(R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(环己氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤硫酸盐(SC0P235)。
实施例15：本发明化合物抗HIV-1病毒活性的测定
1.实验材料
1.1供试品：化合物C0P230、C0P231、C0P233、C0P234。
1.2对照品：阳性对照品齐多夫定由检测单位提供。
1.3细胞株
1.4病毒株
1.5培养基
1.6实验用介质 
二甲基亚砜(DMSO)美国Sigma。
1.7主要仪器及试剂
BS124S电子天平：德国Sartorius公司
离心机：美国Beckman公司；
CO2细胞培养箱：美国ShellAB公司；
Sirius化学发光检测仪：德国Berthold公司；
胰蛋白酶：美国Invitrogen公司；
青链霉素：美国Invitrogen公司；
胎牛血清：美国Gibco公司；
细胞裂解液及荧光素酶检测试剂盒：美国Promega公司
2.实验方法
2.1供试品、对照品配制
受试样品：称重化合物并溶解于DMSO中，贮液浓度为10mmol/L；
对照品：称重齐多夫定溶解于DMSO，贮液浓度为10mmol/L.
2.2实验步骤
2.2.1野生型HIV-1重组假病毒的制备：
转染前一天，按2.2×106个细胞的密度接种293T细胞到100mm培养皿中，用改良的磷酸钙沉淀法共转染3μg VSV-G质粒和8μg野生型HIV-1核心基因，转染后16小时，用PBS冲洗细胞并换新鲜的培养基继续培养32小时，收集上清并经0.45m的滤膜过滤，生成野生型HIV-1重组病毒颗粒VSVG/HIV-WT。
2.2.2 HIV-1重组假病毒的p24抗原测定：
倍比稀释病毒原液野生型后各取450μl，用50μl的裂解液进行裂解，按照p24抗原ELISA试剂盒说明书(ZeptoMetrix，Cat：0801111)，测定并计算重组病毒原液的p24抗原浓度。
2.2.3药物对HIV-1抑制性检测： 
感染前一天，将293T细胞按每孔6×104的密度接种到24孔板上，用DMSO溶解待测化合物，于感染前15分钟加入细胞培养液中，DMSO溶剂作空白对照，再加入0.5ml病毒液(根据p24浓度将病毒原液稀释至0.1–0.5ng p24/ml)。感染后48小时，去除上清，每孔中加入50 l细胞裂解液(Promega)裂解细胞，再将20 l细胞裂解产物加入至30 l荧光素酶底物中(Promega)，用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，以DMSO作对照，计算化合物对野生型HIV-1复制的半数抑制浓度，检测数据见药理筛选结果表1。
表1：药理筛选结果表
2.2.4应用MTS法检测化合物对细胞存活的影响
将对数生长期的293T细胞按8000～10000个/孔的细胞密度接种至96孔板中，每孔100ul，37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，加入待测化合物，并以DMSO为空白对照(终浓度为0.1％)，37℃，5％CO2培养箱中继续培养44小时。向每孔中加入20μl MTS/PMS现配的混合液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后显色。在酶联检测仪上，波长490nm和650nm(本底)处检测各孔的光吸收值(OD)，并计算细胞的存活率。
4、实验结论 
化合物C0P230、C0P231、C0P233、C0P234可有效抑制野生型HIV-1的复制，其半数有效浓度分别为：C0P231(33.4±8.1nmol/L)；C0P234(5.0±0.4nmol/L)；C0P230(40±0.2nmol/L)；C0P233(4.15±1.35nmol/L)；在相同条件下平行测定的阳性对照AZT半数有效浓度为24.3nM。所有化合物在终浓度10μmol/L时均无细胞毒性。
上述对本发明化合物抗HIV活性与细胞毒性的测定表明：
本发明化合物C0P234、C0P233的体外活性比齐多夫定(AZT)高出了5-8倍，达到了纳摩级(10-9)水平。其中化合物C0P233抑制病毒复制活性的IC50值为4.15±1.35nM，目前销售额最大的抗艾滋病药物、同时又被专家誉为最好的抗乙肝药物的替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF)的IC50值为1.6μM，这说明本发明化合物C0P233抑制病毒复制的活性高出TDF385倍多。
这种活性级别在药物研发筛选中是非常罕见的，而且本发明化合物C0P234、C0P233的细胞毒性也是很低的。这些检测数据充分证明本发明化合物C0P234、C0P233不仅具有很高的抑制HIV-1/HBV病毒复制活性的优点，而且具有很低的毒性，有望成为治疗HIV-1/HBV的药物的前景。
实施例16：化合物COP233与TDF脂溶性大小的测定
比较两种物质脂溶性大小的原理：
物质的脂溶性与物质的极性大小相关，物质的极性越大，则该物质的脂溶性越小，物质的极性越小，则该物质的脂溶性越大。
各种物质的脂溶性大小的比较，通常通过测定不同物质在一定的的条件下，在反向液相色谱图上，保留时间的长短来表征。物质的脂溶性越高，则表现为该物质在反向液相色谱图上，保留时间越长。
本发明化合物COP233与TDF脂溶性大小的比较就是根据上述的原理来进行的。
在色谱条件：色谱柱,Agilent ZorBax SB-C18(250×4.6mm.id.5μm)；流动相,甲醇：水＝(80:20，v/v)；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃下，TDF的保留时间为3.627分钟，化合物C0P233的保留时间为4.169分钟。化合物C0P233的保留时间比TDF的保留时间延长了0.542分钟。
根据上述检测，本发明化合物C0P233的脂溶性比TDF的脂溶性脂溶性高出了许多。这也就是说本发明化合物C0P233的膜透过性比TDF膜透过性的高出了许多，从而提高了药物的治疗疾病的效果。
实施例17：本发明化合物抗HBV病毒活性的测定
1.体外细胞模型:HepG2 2.215细胞
2.药物对HBV病毒DNA抑制作用检测 
HepG2 2.2.15细胞在24孔细胞培养板中培养48小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用荧光探针法进行实时定量PCR检测
HBV引物：HBV上游引物：5’-TgT CCT ggT TAT CgC Tgg-3’
HBV下游引物：5’-CAA ACg ggC AAC ATA CCT T-3’
HBV荧光探针序列：5’(FAM)-TgT gTC TgC ggC gTT TTA TCA T-(TAMRA)3’
PCR：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火和延伸共30s，40个循环。
3.结果：见体外抗乙肝病毒活性筛选表
4.实验结论： 
化合物C0P230、C0P231、C0P232、C0P233、C0P235可有效抑制HBV病毒DNA的复制，其半数有效浓度分别为：C0P230(36.8μM)；C0P231(112.1μM))；C0P232(70.9μM)；C0P233(59.5μM)；C0P235(69.6μM)；在相同条件下平行测定的阳性对照C0P22(阳性对照TDF)半数有效浓度为：80.1μM。
这充分表明：本发明化合物C0P230(36.8μM)，C0P232(70.9μM)，C0P233(59.5μM)，C0P235(69.6μM)都比目前销售额最大的抗艾滋病药物、同时又被专家誉为最好的抗乙肝药物的替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF C0P22的IC50值为80.1μM)抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。
表2：体外抗乙肝病毒活性筛选表
实施例18：本发的药物组合物可按通用的口服药物制剂制备方法制成片剂或胶囊，200mg剂量的本发明化合物片剂或胶囊单位含量如下(mg/片，mg/粒)

Claims (8)

1.具有通式Ⅰ的非环核苷类化合物：
其中，
R1为异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基、甲基、正丙基、仲丁基、叔丁基、正戊基、异戊基、3-甲基己基、正己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基或正十二烷基,R2为丙氨基侧链，具体为下列化合物：
2.具有通式Ⅱ所示的非环核苷类化合物药学上可接受的盐：
其中，R1、R2定义同权利要求1，Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的富马酸、盐酸或硫酸。
3.如权利要求2所述的非环核苷类化合物药学上可接受的盐，其特征在于，Acid是富马酸，具体为下列化合物：
4.一种权利要求1所述非环核苷类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
其中,R1、R2定义同权利要求1；
该制备方法包括如下步骤：
a、用替诺福韦为原料，N-甲基吡咯烷酮为溶剂，在三乙胺存在的环境下，与氯甲基碳酸异丙酯在反应温度为50℃-80℃下缩合，反应8-15个小时，得到替诺福韦单酯化合物：(R)-9-{2-[(异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤；
b、用替诺福韦单酯化合物为原料，吡啶为溶剂，在三乙胺存在的环境下，2,2′-二硫二吡啶、三苯基膦为络合剂，与L-丙氨酸酯盐酸盐在反应温度为45-75℃下脱水缩合，反应8-18个小时，得到目标物Ⅰ((R)-9-[2-[[异丙氧羰基氧甲基[(S)-1-(烷氧羰基)]乙基]氨基磷酸甲氧]丙基]腺嘌呤)。
5.一种制备权利要求2所述的非环核苷类化合物药学上可接受的盐的方法，其特征在于，反应式如下：
其中,R1、R2定义同权利要求1,Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的富马酸、盐酸或硫酸；
该制备方法步骤是：将化合物Ⅰ与等量的Acid溶于乙腈中回流搅拌，反应1-3小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙醚洗涤得到目标物Ⅱ。
6.一种药物组合物，含有治疗有效量的权利要求1-3中任一项的化合物。
7.权利要求1-3中任一项所述的化合物在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的用途。
8.权利要求7所述的用途，其特征在于，其中病毒疾病为HIV或HBV感染或HIV与HBV同时感染。
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Granted publication date: 20150610