CN103242366B - 一组替诺福韦酯化合物、制备方法及其在抗病毒方面的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一组具有抑制HIV/HBV病毒复制活性的替诺福韦酯化合物、制备方法及其药物用途。该组化合物具有通式I，其中：X=H，Y=H；R1=-CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3，m=0-4,n=10-20；R2=-OCH2OC(O)OCH(CH3)2。还公开了含有该组化合物的药物组合物。实验证明本发明化合物之一具有的抑制HIV-1病毒复制的活性是齐多夫定（AZT）的4.5倍、约是目前治疗艾滋病最好药物韦瑞德（TDF）的250倍、是处于临床阶段的药物CMX157的1.37倍，且脂溶性又约是CMX157的2倍的优点；还具有的抑制HBV病毒复制的活性；可用于治疗艾滋病/乙型肝炎药物的开发。
Description
技术领域：
本发明涉及一组类核苷化合物，尤其涉及一组具有抑制HIV-1病毒复制活性的替诺福韦酯化合物、制备方法及其在抗病毒方面的应用。
背景技术：
人类在病毒感染性疾病的治疗中，病毒耐药性问题日益突出。与环状核苷类逆转录酶抑制剂相比，非环核苷化合物阿德福韦和替诺福韦在防止病毒耐药性问题上具有明显优势，其对耐环状核苷类药物的病毒株有效，本身耐药发生率低，且毒性相对较小，可用于治疗感染HIV-1的患者。但是，由于磷酸酯基带负电荷，极性太强，生物膜透过性差，导致生物利用度很低，使其不能成为药物应用于临床，其双酯性前药替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF)〖商品名：韦瑞德(Viread)，其IC50为1.6μM〗改善了药物的生物利用度，于2001年被FDA批准上市，是迄今为止抗病毒活性较强、肾毒性又较低的HIV逆转录酶抑制剂类AIDS治疗药物。
作为前药，本身没有抗病毒活性，进入体内后必须游离出原药后才能发挥疗效，而部分药物在吸收进入血液前即被水解；另外，释放出的原药阿德福韦和替诺福韦同样由于膜透过性差的问题，迅速被排出体外而难以在感染部分保持足够的浓度，致使其人体生有28％左右。因此，对阿德福韦和替诺福韦进行进一步的研究和改造具有重要价值。
一份专利申请WO2012/041015A1中，其发明人论述道：“专利(CN1810816)在替诺福韦分子中磷酸基的一个羟基上引入脂溶性长链烷氧乙基长链，使分子结构中磷酸基团的一个羟基被酯化、一个仍处于游离状态，得到阿德福韦和替诺福韦的磷酸长链烷氧乙/丙基单酯衍生物。该化合物在引入长链烷氧乙/丙基后，不仅改善了化合物的药代动力学性质，而且磷酸基中另一个游离羟基仍可以被磷酸化、参与病毒复制过程，发挥抗病毒效果，因而保留了替诺福韦的抗病毒活性。即脂溶性长链的引入既改善了化合物的药代动力学性质又保留了抗病毒活性。”
专利CN1810816中的发明化合物的通式结构式为：
其中，x＝0-8,y＝1-20.
已各完成了临床前的各项检测，不仅证明了该化合物有很高的活性和抗耐药性，而且还发现其毒性也是很低的，不会抑制肝脏内代谢这些药物的酶系。
另一家外国公司研发的药物CMX157(专利CN101977610A)也是对替诺福韦及其衍生物进行的改造。CMX157的结构式如下：
尤其是CMX157，无论是体外细胞活性筛选还是动物实验，都表现出了良好的前景。对HIV病毒无论野生型还是各种突变耐药型，CMX157都显示出了很高的活性、很低的毒性，而且与上市的治疗HIV的药物联合使用时都有良好的协同作用。CMX157有着成为新的治疗艾滋病药物的前景。
上述两种化合物都是替诺福韦的前药，其对替诺福韦加以改造的主要目的是提高其脂溶性，改善膜透过性，进而提高人体的生物利用度。然而上述两种前药的脂溶性仍有待进一步的提高，从而提高人体的生物利用度。
发明内容：
本发明的目的是对替诺福韦及其衍生的结构进行更进一步的改造，得到具有更高的脂溶性和更高抑制病毒的活性的新的核苷类化合物，即本发明产品：一组具有抑制HIV-1病毒复制活性的替诺福韦酯化合物，为今后深入研究与开发本发明化合物及其盐的抗病毒应用奠定基础。
本发明的研发人员经过艰苦不懈的努力，对替诺福韦及其衍生的结构进行改造，合成出了一组具有抑制HIV-1病毒复制的活性的替诺福韦酯化合物及其盐，经国家权威部门检测，本发明化合物之一的C0P12-114的抑制HIV-1病毒复制活性是CMX157的1.37倍，是AZT的4.5倍；且脂溶性又是CMX157脂溶性约2倍的优点，可用于治疗艾滋病药物的开发。
为解决上述问题，本发明采用的技术方案为：
本发明提供具有通式(I)的替诺福韦酯化合物及其药学上可接受的盐：
其中：X＝H，Y＝H
R1＝-CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3，m＝0-4,n＝10-20,
R2＝-OCH2OCOOCH(CH3)2
上述替诺福韦酯化合物及其分别与富马酸形成的药学上可接受的盐，具体为下列结构式所示(化合物结构式下的编号为其上的具体化合物在本发明中的编号)：
本发明提供替诺福韦酯化合物及其药学上可接受的盐，优选为下列结构式所示的化合物及其药学上可接受的盐：
其中m＝0-4,n＝12-16。
本发明提供替诺福韦酯化合物与硫酸、盐酸或富马酸所形成的药学上可接受的盐。
本发明提供的替诺福韦酯化合物及其药学上可接受的盐，又优选为通式I中m＝1,n＝14时，下列结构式所示的化合物：
及其与硫酸盐、盐酸盐或富马酸形成的药学上可接受的盐。
本发明提供的所述替诺福韦酯化合物与富马酸形成的药学上可接受的盐，又优选为通式I中m＝1,n＝14时，具体为下列结构式所示：
本发明提供一种制备权通式I所述的替诺福韦酯化合物其及药学上可接受的盐的方法，所述方法的合成路线如下：
其中：X＝H，Y＝H；
R1＝-CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3，m＝0-4,n＝10-20；
R2＝-OCH2OCOOCH(CH3)2，Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的药学上可接受的无机酸或有机酸；
该制备方法包括以下步骤：
a、用N-甲基-2-吡咯烷酮为溶剂，在三乙胺存在的环境下，用市售的替诺福韦与氯甲基碳酸异丙酯进行脱酸缩合反应，反应过程中反应温度为45℃-75℃，反应时间为12-18个小时，得到化合物Ⅱ即(R)-9-{2-[(异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤；
b、用N-甲基吡咯烷酮为溶剂，在三乙胺存在的环境下，N,N'-二环己基碳二亚胺为络合剂，用上述反应中得到的化合物Ⅱ与自制的烷氧基醇进行脱水缩合反应，反应过程中反应温度为90℃-110℃，反应时间为7-15个小时，得到目标化合物Ⅰ，即其药学上可接受的盐；
c、将式Ⅰ化合物与等量的Acid溶于乙腈中，回流搅拌1-3小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙醚洗涤得式Ⅰa，即式Ⅰ化合物药学上可接受的盐；
上述的制备方法，优选在步骤a中反应温度为55℃-65℃，反应时间为14-16个小时；在步骤中b中反应温度为95℃-105℃，反应时间为9-13个小时。
上述制备方法中，起始原料替诺福韦、氯甲基碳酸异丙酯由市售购得。
上述的制备方法，优选其中：m＝0-4,n＝12-16；Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的硫酸、盐酸或富马酸。
上述的制备方法，再优选其中：m＝1,n＝14；Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的富马酸。
本发明还提供一种含有上述的替诺福韦酯化合物及其药学上可接受的盐的药物组合物，所述的药物组合物含有治疗有效量的任何一种上述的替诺福韦酯化合物及其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂；所述药物组合物的剂型为片剂、胶囊。
本发明提供了上述本发明任一种替诺福韦酯化合物及其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用。
本发明提供了上述本发明任一种替诺福韦酯化合物及其药学上可接受的盐在制备用于预防或
治疗病毒疾病药物中的应用，其中病毒疾病为HIV或HBV感染或HIV和HBV同时感染。
上述药物中还可以添加一种或多种药学上可接受的载体，如药学上可接受的稀释剂、赋型剂、填充剂、粘合剂、、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、润滑剂、香味剂和甜味剂等。以本发明化合物为活性成分制备的药物可以是片剂、粉剂、胶囊、粒剂或口服液以及注射制剂等多种形式，上述各种剂型的药物均可以按药学领域的常规方法制备。
药理活性试验结果表明，本发明化合物C0P12-114表现出了很好的抗HIV-1活性，其可作为活性成分，用于制备抗病毒药物，如抗艾滋病病毒感染的药物。
本发明的药物组合物组成可以由下配比构成：
发明效果：
经过国家权威检测机构测定，本发明化合物具有成为治疗艾滋病的药物所需的各种优良属性，具体如下：
(1)本发明化合物的抑制HIV野生型病毒复制活性的能力比目前治疗艾滋病的首选药物齐多夫定(AZT)以及正处于临床实验阶段的潜在药物CMX157都高的多。从检测结果IC50值看，C0P12-114的抑制HIV-1病毒复制活性的能力，达到了纳摩级(10-9)的水平，是CMX157的1.37倍，是AZT的4.5倍，约是目前治疗艾滋病最好药物TDF的250倍。
(2)通常情况下，一种物质在具有很高的活性时往往也都具有很高的毒性。然而经权威检测机构检测，本发明化合物C0P12-114在具有很高活性的同时，却具有很低的细胞毒性：“在终浓度10μmol/L对细胞增殖无显著性影响”。
(3)经对比检测本发明化合物C0P12-114的脂溶性比CMX157脂溶性高出了许多，本发明化合物COP12-114的脂溶性大约是化合物CMX157的脂溶性的2倍，这充分表明本发明化合物C0P12-114的膜透过性比CMX157膜透过性要高出许多，显然本发明化合物C0P12-114极大地改善了替诺福韦的人体的生物利用度，从而显著地提高了替诺福韦治疗艾滋病的效果，相应也必将产生巨大的经济效益和社会效益。
(4)经对比检测本发明化合物C0P12-114还具有抗HBV的活性其IC50值为48.4μM))比目前销售额最大的抗艾滋病药物、同时又被专家誉为最好的抗乙肝药物TDF(C0P22的抗HBV的IC50值为80.1μM)抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。
总之，本发明化合物集很高的活性、很低的毒性，极好的脂溶性等各种良好属性于一体，有着成为新一代治疗艾滋病或治疗乙型肝炎的药物的前景。
附图说明
图1为比较本发明化合物C0P12-114和CMX157脂溶性的高效液相色谱图。
具体实施方式：
以下实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。所有化合物的结构均经1HNMR或MS所确定。
实施例1：3-十六烷氧基-1-丙醇(L114)的制备
在250ml三口圆底烧瓶中，依次加入1,3-丙二醇(9.13g，0.12mol)、叔丁醇钾(6.8g,0.06mol)和叔戊醇(50ml)，回流状态下，慢慢滴加溴代十六烷(12.17g，12.2ml,0.04mol)和四氢呋喃(50ml)的混合液，3小时滴完。再回流搅拌50小时后，冷至室温，将反应液倾入50ml水中，搅拌，用10％的盐酸酸化至PH＝7，加入正己烷(100ml),分出有机相，水相用正己烷萃取，合并有机相，有机相干燥浓缩后用正戊烷重结晶得到3-十六烷氧基-1-丙醇(L114)(7.8g,0.026mol)，收率：65％。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.14-1.37(26H,m,13×CH2),1.48-1.65(2H,m,CH2),1.71-1.94(2H,m,CH2),2.38-2.53(1H,br,OH),3.43(2H,t,OCH2),3.62(2H,t,OCH2),3.78(2H,t,OCH2)。ESI-MS:[M+H]+301.3，[M+Na]+323.2
实施例2：2-十八烷氧基乙醇(L016)的制备
以实施例1类似方法合成得到2-十八烷氧基乙醇(L016)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.06-1.49(30H,m,15×CH2),1.53-1.654(2H,m,CH2),1.90-2.10(1H,br,OH),3.47(2H,t,OCH2),3.53(2H,t,OCH2),3.73(2H,t,OCH2)。ESI-MS:[M+H]+315.3，[M+Na]+337.3。
实施例3：6-十二烷氧基-1-己醇(L410)的制备
以实施例1类似方法合成得到6-十二烷氧基-1-己醇(L410)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.14-1.34(18H,m,9×CH2),1.35-1.42(4H,m,2×CH2),1.48-1.64(6H,m,3×CH2),1.93-2.01(1H,br,OH),3.28-3.48(4H,m,2×OCH2),3.62(2H,t,OCH2)。ESI-MS:[M+H]+287.3，[M+Na]+309.3.
实施例4：4-二十二烷氧基-1-丁醇(L220)的制备
以实施例1类似方法合成得到：4-二十二烷氧基-1-丁醇(L220)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),0.99-1.46(38H,m,19×CH2),1.52-1.61(2H,m,CH2),1.62-1.78(4H,m,2×CH2),1.95-2.67(1H,br,OH),3.30-3.51(4H,m,2×OCH2),3.64(2H,t,OCH2).ESI-MS:[M+H]+399.4。
实施例5：(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-114)的制备
在50ml圆底烧瓶中，依次加入(R)-9-[2-(磷酸甲氧基)丙基]腺嘌呤(替诺福韦，PMPA)(1.3g，4.5mmol)、三乙胺(7ml,5.08g，50.2mmol)、氯甲基碳酸异丙酯(0.265ml,0.305g，2mmol)和N-甲基-2-吡咯烷酮(14ml)，在60℃下搅拌15h后，蒸除溶剂，用乙酸乙酯：乙醇＝20:1硅胶柱层析，得中间化合物：(R)-9-{2-[(异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P02)(0.68g，1.68mmol)收率37.3％。
在50ml圆底烧瓶中，将C0P02(1.23g，3.04mmol)、L114(1.83g，6.09mmol)混合溶于10mlN-甲基吡咯烷酮中，加热到85℃搅拌10分钟后，滴加三乙胺2.5ml，然后升温至100℃，再滴加N,N'-二环己基碳二亚胺1.24g(溶于2mlN-甲基-2-吡咯烷酮中)，100℃下搅拌反应8h后，冷却至45℃，混合液旋干，加入二氯甲烷和甲醇为2：1的混合溶剂100ml充分溶解后过滤，滤液旋干，残余物硅胶柱层析分离后得到白色固体:(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-114)1.32g(1.93mmol,63.5％)。
1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.08-1.38(35H,m,13×CH2and3×CH3),1.45-1.60(2H,m,CH2),1.81-1.94(2H,m,CH2),3.30-3.49(4H,m,2×OCH2),3.62-3.73(1H,m,OCH),3.85-3.99(2H,m,OCH2),4.05-4.43(4H,m,OCH2PandNCH2),4.86-4.98(1H,m,COOCH),5.54-5.71(2H,m,OCH2O),6.37(2H,s,NH2),7.95-8.06(1H,d,嘌呤环上的H),8.33(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+686.3，[M+Na]+708.3
实施例6：(R)-9-{2-[(十八烷氧乙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-016)的制备
在50ml圆底烧瓶中，将C0P02(1.23g，3.04mmol)、L016(1.91g，6.08mmol)混合溶于10mlN-甲基吡咯烷酮中，加热到75℃搅拌15分钟后，滴加三乙胺2.5ml，然后升温至90℃，再滴加N,N'-二环己基碳二亚胺1.24g(溶于2mlN-甲基-2-吡咯烷酮中)，90℃下搅拌反应7h后，冷却至室温，混合液旋干，加入二氯甲烷和甲醇为2：1的混合溶剂100ml充分溶解后过滤，滤液旋干，残余物硅胶柱层析分离后得到目标物:(R)-9-{2-[(十八烷氧乙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-016)。1.4g(1.99mmol,65.6％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.07-1.40(39H,m,15×CH2and3×CH3),1.46-1.61(2H,m,CH2),3.32-3.47(4H,m,2×OCH2),3.63-3.71(1H,m,OCH),3.86-3.97(2H,m,OCH2),4.06-4.41(4H,m,OCH2PandNCH2),4.87-4.96(1H,m,COOCH),5.56-5.69(2H,m,OCH2O),6.38(2H,s,NH2),7.96-8.04(1H,d,嘌呤环上的H),8.33(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+700.4，[M+Na]+722.4
实施例7：(R)-9-{2-[(十二烷氧己基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-410)的制备
在50ml圆底烧瓶中，将C0P02(1.23g，3.04mmol)、L410(1.74g，6.08mmol)混合溶于10mlN-甲基吡咯烷酮中，加热到90℃搅拌30分钟后，滴加三乙胺3ml，然后升温至105℃，再滴加N,N'-二环己基碳二亚胺1.24g(溶于2mlN-甲基-2-吡咯烷酮中)，105℃下搅拌反应14小时后，冷却至室温，混合液旋干，加入二氯甲烷和甲醇为2：1的混合溶剂100ml充分溶解后过滤，滤液旋干，残余物硅胶柱层析分离后得到目标物:(R)-9-{2-[(十二烷氧己基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-410)。0.84g(1.25mmol,41％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.07-1.39(31H,m,9×CH2,2×CH2and3×CH3),1.44-1.61(4H,m,2×CH2),1.80-1.95(2H,m,CH2),3.29-3.50(4H,m,2×OCH2),3.61-3.74(1H,m,OCH),3.84-4.00(2H,m,OCH2),4.04-4.44(4H,m,OCH2PandNCH2),4.85-4.99(1H,m,COOCH),5.53-5.72(2H,m,OCH2O),6.36(2H,s,NH2),7.94-8.07(1H,d,嘌呤环上的H),8.32(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+672.4，[M+Na]+694.4
实施例8：(R)-9-{2-[(二十二烷氧丁基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-220)的制备
在50ml圆底烧瓶中，将C0P02(1.23g，3.04mmol)、L220(2.42g，6.08mmol)混合溶于10mlN-甲基吡咯烷酮中，加热到90℃搅拌20分钟后，滴加三乙胺3ml，然后升温至105℃，再滴加N,N'-二环己基碳二亚胺1.24g(溶于2mlN-甲基-2-吡咯烷酮中)，105℃下搅拌反应10h后，冷却至室温，混合液旋干，加入二氯甲烷和甲醇为2：1的混合溶剂100ml充分溶解后过滤，滤液旋干，残余物硅胶柱层析分离后得到目标物:(R)-9-{2-[(二十二烷氧丁基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-220)。1.13g(1.45mmol,47.6％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.88(3H,t,CH3),1.06-1.37(47H,m,19×CH2and3×CH3),1.43-1.59(4H,m,2×CH2),1.79-1.93(2H,m,CH2),3.28-3.48(4H,m,2×OCH2),3.60-3.72(1H,m,OCH),3.83-3.98(2H,m,OCH2),4.03-4.42(4H,m,OCH2PandNCH2),4.84-4.97(1H,m,COOCH),5.52-5.70(2H,m,OCH2O),6.35(2H,s,NH2),7.93-8.05(1H,d,嘌呤环上的H),8.31(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+784.5，[M+Na]+806.5
实施例9：(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤富马酸盐(FC0P12-114)的制备
将等量的(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-114)和富马酸溶于乙腈中，回流搅拌2小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙醚洗涤得白色固体:(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤富马酸盐(FC0P12-114)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.85(3H,t,CH3),1.04-1.12(3H,d,CH3),1.12-1.33(32H,m,13×CH2and2×CH3),1.34-1.51(2H,m,CH2),1.62-1.81(2H,m,CH2),3.21-3.39(4H,m,2×OCH2),3.80-4.06(5H,m,OCH,OCH2P,OCH2),4.10-4.33(2H,m,NCH2),4.75-4.89(1H,m,COOCH),5.45-5.60(2H,m,OCH2O),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.21(2H,s,NH2),8.04(1H,s,嘌呤环上的H),8.13(1H,s,嘌呤环上的H),12.09-14.12(2H,s,富马酸的两个COOH).ESI-MS:[M+H]+686.3
实施例10：(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤硫酸盐(SC0P12-114)的制备
将等量的(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤(C0P12-114)和硫酸溶于乙腈中，回流搅拌2小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙醚洗涤得白色固体:(R)-9-{2-[(十六烷氧丙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤硫酸盐(SC0P12-114)。1HNMR(400MHz,DMSO)δ,(ppm):0.85(3H,t,CH3),1.03-1.13(3H,d,CH3),1.10-1.31(32H,m,13×CH2and2×CH3),1.33-1.50(2H,m,CH2),1.61-1.81(2H,m,CH2),3.22-3.37(4H,m,2×OCH2),3.80-4.05(5H,m,OCH,OCH2P,OCH2),4.10-4.31(2H,m,NCH2),4.76-4.88(1H,m,COOCH),5.46-5.61(2H,m,OCH2O),7.21(2H,s,NH2),8.04(1H,s,嘌呤环上的H),8.13(1H,s,嘌呤环上的H).ESI-MS:[M+H]+686.3
实施例11：(R)-9-{2-[(十八烷氧乙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤盐酸盐(YC0P12-016)的制备
以实施例9类似方法合成得到：(R)-9-{2-[(十八烷氧乙基异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤盐酸盐(YC0P12-016)。
实施例12：本发明化合物抗HIV-1病毒活性的测定
1.实验材料
1.1 供试品：化合物C83P01。
1.2 对照品：阳性对照品齐多夫定由检测单位提供。
1.3 细胞株
名称：293T 来源：ATCC
保存条件：液氮
1.4 病毒株
名称：VSVG/HIV-1(NL4-3)； 来源：实验室
自存
保存条件：-80℃
1.5 培养基
名称：DMEM培养基 来源：美国Gibco公司
RPMI-1640
FBS
配制方法：RPMI-1640/DMEM+10％FBS
1.6 实验用介质
二甲基亚砜(DMSO)美国Sigma。
1.7 主要仪器及试剂
BS124S电子天平：德国Sartorius公司
离心机：美国Beckman公司；
CO2细胞培养箱：美国ShellAB公司；
Sirius化学发光检测仪：德国Berthold公司；
胰蛋白酶：美国Invitrogen公司；
青链霉素：美国Invitrogen公司；
胎牛血清：美国Gibco公司；
细胞裂解液及荧光素酶检测试剂盒：美国Promega公司
2.实验方法
2.1 供试品、对照品配制
受试样品：称重化合物并溶解于DMSO中，贮液浓度为10mmol/L；
对照品：称重齐多夫定溶解于DMSO，贮液浓度为10mmol/L.
2.2 实验步骤
2.2.1 野生型HIV-1重组假病毒的制备：
转染前一天，按2.2×106个细胞的密度接种293T细胞到100mm培养皿中，用改良的磷酸钙沉淀法共转染3μgVSV-G质粒和8μg野生型HIV-1核心基因，转染后16小时，用PBS冲洗细胞并换新鲜的培养基继续培养32小时，收集上清并经0.45m的滤膜过滤，生成野生型HIV-1重组病毒颗粒VSVG/HIV-WT。
2.2.2 HIV-1重组假病毒的p24抗原测定：
倍比稀释病毒原液野生型后各取450μl，用50μl的裂解液进行裂解，按照p24抗原ELISA试剂盒说明书(ZeptoMetrix，Cat：0801111)，测定并计算重组病毒原液的p24抗原浓度。
2.2.3 药物对HIV-1抑制性检测：
感染前一天，将293T细胞按每孔6×104的密度接种到24孔板上，用DMSO溶解待测化合物，于感染前15分钟加入细胞培养液中，DMSO溶剂作空白对照，再加入0.5ml病毒液(根据p24浓度将病毒原液稀释至0.1–0.5ng p24/ml)。感染后48小时，去除上清，每孔中加入50 l细胞裂解液(Promega)裂解细胞，再将20 l细胞裂解产物加入至30 l荧光素酶底物中(Promega)，用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，以DMSO作对照，计算化合物对野生型HIV-1复制的半数抑制浓度，检测数据见药理筛选结果表1。
表1：药理筛选结果表
注：表1中化合物编号与本发明化合物编号的对应关系
| 表1化合物编号 | 对应本发明的化合物编号 | 备注 |
| COP12 | COP12-114 | |
| COP136 | COP136对应CMX157 |
替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF)〖商品名：韦瑞德(Viread)，其IC50为1.6μM〗
2.2.4应用MTS法检测化合物对细胞存活的影响
将对数生长期的293T细胞按8000～10000个/孔的细胞密度接种至96孔板中，每孔100ul，37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，加入待测化合物，并以DMSO为空白对照(终浓度为0.1％)，37℃，5％CO2培养箱中继续培养44小时。向每孔中加入20μlMTS/PMS现配的混合液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后显色。在酶联检测仪上，波长490nm和650nm(本底)处检测各孔的光吸收值(OD)，并计算细胞的存活率。
4、实验结论
化合物CMX157、COP12-114可有效抑制野生型HIV-1的复制，其半数有效浓度分别为：CMX157(8.7±1.8nmol/L)；COP12-114(5.9±0.6nmol/L)，在相同条件下平行测定的阳性对照AZT半数有效浓度为24.3nM。所有化合物在终浓度10μmol/L时均无细胞毒性。
上述对本发明化合物抗HIV活性与细胞毒性的测定表明：
本发明化合物C0P12-114的抑制HIV野生型病毒复制活性的能力比目前治疗艾滋病的首选药物齐多夫定(AZT)以及正处于临床实验阶段的潜在药物CMX157都高的多。从检测结果IC50看，C0P12-114的抑制HIV-1病毒复制活性达到了纳摩级(10-9)的水平，是CMX157的1.37倍，是AZT的4.5倍,约是目前治疗艾滋病最好药物TDF活性的250倍，而且本发明化合物C0P12-114的细胞毒性也是很低的：在终浓度10μmol/L对细胞增殖无显著性影响。这些检测数据充分证明本发明化合物C0P12-114不仅具有很高的抑制HIV-1病毒复制活性的能力、而且具有很低的毒性，成为治疗艾滋病HIV-1药物的优异属性。
经对比检测实验，本发明化合物C0P12-114的脂溶性比CMX157脂溶性高出了许多，这充分表明本发明化合物C0P12-114的膜透过性比CMX157膜透过性要高出许多，这必然极大地提高了替诺福韦的治疗效果。显然本发明化合物C0P12-114极大地改善了替诺福韦的人体的生物利用度，从而显著地提高了替诺福韦治疗艾滋病的效果，相应也必将产生巨大的经济效益和社会效益。
实施例13：本发明化合物COP12-114与CMX157脂溶性大小的测定
比较两种物质脂溶性大小的原理：
物质的脂溶性与物质的极性大小相关，物质的极性越大，则该物质的脂溶性越小，物质的极性越小，则该物质的脂溶性越大。
各种物质的脂溶性大小的比较，通常通过测定不同物质在一定的的条件下，在反向液相色谱图上，保留时间的长短来表征。物质的脂溶性越高，则表现为该物质在反向液相色谱图上，保留时间越长。
本发明化合物COP12-114和CMX157脂溶性大小的比较就是根据上述的原理来进行的。
在色谱条件：色谱柱,AgilentZorBaxSB-C18(250×4.6mm.id.5μm)；流动相,甲醇/水＝98:2(v:v)；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃下，CMX157的保留时间为2.983分钟，化合物COP12-114的保留时间为5.673分钟。化合物COP12-114的保留时间比化合物CMX157的保留时间延长了2.69分钟，这表明本发明化合物COP12-114的脂溶性大约是化合物CMX157的脂溶性的2倍。
根据上述检测，本发明化合物COP12-114的脂溶性比CMX157的脂溶性高出了许多。这也就是说本发明化合物COP12-114的膜透过性比CMX157膜透过性的高出了许多，从而提高了药物的治疗疾病的效果。
实施例14：本发明化合物抗HBV病毒活性的测定
1.体外细胞模型:HepG22.215细胞
2.药物对HBV病毒DNA抑制作用检测
HepG22.2.15细胞在24孔细胞培养板中培养48小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用荧光探针法进行实时定量PCR检测
HBV引物：HBV上游引物：5’-TgTCCTggTTATCgCTgg-3’
HBV下游引物：5’-CAAACgggCAACATACCTT-3’
HBV荧光探针序列：5’(FAM)-TgTgTCTgCggCgTTTTATCAT-(TAMRA)3’
PCR：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火和延伸共30s，40个循环。
3.结果：见体外抗乙肝病毒活性筛选表
4.实验结论：
化合物C0P12-114可有效抑制HBV病毒DNA的复制，其半数有效浓度为：48.4μM；在相同条件下平行测定的阳性对照C0P22(阳性对照TDF)半数有效浓度为：80.1μM。
这充分表明：本发明化合物C0P12-114比目前销售额最大的抗艾滋病药物、同时又被专家誉为最好的抗乙肝药物TDF(C0P22的IC50值为80.1μM)抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。
体外抗乙肝病毒活性筛选表
实施例15：本发明的药物组合物可按通用的口服药物制剂制备方法制成片剂或胶囊，200mg剂量的化合物C0P12-114片剂或胶囊单位含量如下(mg/片，mg/粒)
Claims (8)
1.具有通式I的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐：
其中：X＝H，Y＝H；
R1＝-CH2(CH2)mCH2OCH2(CH2)nCH3，m＝0-4,n＝12-16；
R2＝-OCH2OC(O)OCH(CH3)2。
2.如权利要求1所述的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其中m＝1,n＝14，具体如下结构式：
其药学上可接受的盐是硫酸盐、盐酸盐或富马酸盐。
3.如权利要求2所述的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，其药学上可接受的盐是富马酸盐，具体如下结构式：
4.一种制备权利要求1至3任一项所述的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述方法的合成路线如下：
该制备方法包括以下步骤：
a、用N-甲基-2-吡咯烷酮为溶剂，在三乙胺存在的环境下，用市售的替诺福韦与氯甲基碳酸异丙酯进行脱酸缩合反应，反应过程中反应温度为45℃-75℃，反应时间为12-18个小时，得到化合物Ⅱ即(R)-9-{2-[(异丙氧羰基氧甲基)磷酸甲氧基]丙基}腺嘌呤；
b、用N-甲基吡咯烷酮为溶剂，在三乙胺存在的环境下，N,N'-二环己基碳二亚胺为络合剂，用上述反应中得到的化合物Ⅱ与自制的烷氧基醇进行脱水缩合反应，反应过程中反应温度为90℃-110℃，反应时间为7-15个小时，得到目标化合物Ⅰ，即本发明替诺福韦酯化合物；
c、将式Ⅰ化合物与等量的Acid溶于乙腈中，回流搅拌1-3小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙醚洗涤得式Ⅰa即式Ⅰ化合物药学上可接受的盐；
其中，所述Acid为可与腺嘌呤氨基部分成盐的药学上可接受的无机酸或有机酸；各符号的定义如权利要求1至3任一项所述。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，在步骤a中反应温度为55℃-65℃，反应时间为14-16个小时；在步骤中b中反应温度为95℃-105℃，反应时间为9-13个小时。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求1-3中任一项所述的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
7.权利要求1-3中任一项所述的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，其中病毒疾病为HIV或HBV感染或HIV和HBV同时感染。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
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Address after: 471000 Henan province Luoyang Xigong nine road No. 58 Patentee after: Luoyang Juhui Investment Inc. Address before: 471000 Henan province Luoyang Xigong nine road No. 58 Patentee before: Luoyang Juhui Investment Inc. |
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Owner name: LUOYANG JUHUI MEDICAL SCIENCE + TECHNOLOGY CO., LT Free format text: FORMER OWNER: LUOYANG JUHUI GROUP CO., LTD. Effective date: 20150729 |
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Effective date of registration: 20150729 Address after: Xigong District 471000 Henan city of Luoyang Province on the road No. 58 champs Sunshine Community Building 7 layer 24 Patentee after: LUOYANG JUHUI MEDICAL SCIENCE & TECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 471000 Henan province Luoyang Xigong nine road No. 58 Patentee before: Luoyang Juhui Investment Inc. |
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Granted publication date: 20140820 |
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