CN108690080A

CN108690080A - 一组核苷酸类似物化合物及其盐、制备方法及其药物用途

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Publication number: CN108690080A
Application number: CN201810780952.8A
Authority: CN
Inventors: 刘洪海
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2018-07-17
Filing date: 2018-07-17
Publication date: 2018-10-23

Abstract

本发明公开了一组核苷酸类似物化合物Ia)、其盐、其非对映异构体(Ib)及(Ib)的盐，还公开了制备方法以及含有该组化合物的药物组合物。试验证明本发明化合物具有抑制HBV病毒复制的活性，同时所述化合物具有比目前治疗艾滋病药物替诺福韦酯富马酸盐(TDF)脂溶性高、生物利用度高、活性高、毒性低等优点。实验还证明本发明化合物还具有抑制HIV‑1病毒复制的活性，可用于治疗艾滋病药物或乙型肝炎药物的开发。

Description

一组核苷酸类似物化合物及其盐、制备方法及其药物用途

技术领域

本发明涉及一组核苷酸类似物化合物及其盐，尤其涉及一组具有抑制HIV-1/HBV病毒复制活性的核苷酸类似物化合物及其盐、制备方法及其药物用途。

背景技术

在病毒感染性疾病的治疗中，病毒耐药性问题日益突出。与环状核苷类逆转录酶抑制剂相比，非环核苷化合物替诺福韦在防止病毒耐药性问题上具有明显优势，其对耐环状核苷类药物的病毒株有效，本身耐药发生率低，且毒性相对较小，可用于治疗同时感染HIV-1和HBV的患者。但是，由于磷酸酯基带负电荷，极性太强，生物膜透过性差，导致生物利用度很低，使其不能成为药物应用于临床。其双酯性前药替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐【TDF】(TDF的体外抗HIV-1病毒活性IC50值为：1.6μM)改善了药物的生物利用度，于2001年被美国FDA批准上市。由于治疗效果确切，适用性好，剂量合适，是多个治疗指南推荐使用的一线抗HIV-1药物。替诺福韦酯及其复方制剂已成为目前销售额最大的抗艾滋病药物。2008年4月和8月，欧盟和美国FDA根据大量的临床试验结果，又分别批准其用于治疗乙型肝炎(乙肝)，并被专家誉为最好的抗乙肝药物之一，其销售额进一步扩大。

作为前药，本身没有抗病毒活性，进入体内后必须游离出原药后才能发挥疗效，而部分药物在吸收进入血液前即被水解；另外，释放出的原药替诺福韦同样由于膜透过性差的问题，迅速被排出体外而难以在感染部分保持足够的浓度，致使其人体生物利用度只有28％左右。因此，对替诺福韦加以改造以提高其抑制病毒的活性和脂溶性，进而提高人体的生物利用度，进一步发挥治疗乙肝和艾滋病的药效仍然具有重要的价值。

但TDF的毒副作用(肾功能损害、骨密度降低以及高耐药性)的出现，使科学家们急需找到TDF的第2代药物：即保持TDF的高活性、又降低毒副作用并提高生物利用度。

2014年、2015年获授权的两篇专利(申请号201310134492.9、201310134491.4)是把TDF的一个链(异丙氧羰基氧甲基氧基)保留，另一个链换成了L-丙氨酸酯/烷氧基烷基氧基，这样即提高了TDF的活性、又降低了TDF的毒性、耐药性，同时又提高了生物利用度。

综上所诉，虽然目前全球的抗HIV-1/HBV药物，吉利德公司的TDF、TAF复方制剂几乎独占市场，但是我们的基于TNF的治疗艾滋病药物研究仍然意义巨大。充分提高其脂溶性，进一步改善其人体的生物利用度而充分发挥治疗乙肝和艾滋病的药效仍然具有重要的价值。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，对替诺福韦及其衍生的结构进行更进一步的改造，得到具有更高的生物利用度、更高抑制病毒活性和更低毒性的新的核苷酸类似物化合物。

本发明产品提高了替诺福韦治疗艾滋病和乙肝疾病的效果，并将最终造福于全人类。

本发明提供了一组具有有效抑制HIV-1的复制，其半数有效浓度化合物COP233、COP234可有效抑制野生型HIV-1的复制，其半抑制浓度IC50分别为：COP234(4.7nmol/L)；COP233(2.8nmol/L)；在相同条件下平行测定的阳性对照齐多夫定AZT半抑制效浓度为24.3nM。所有化合物在终浓度10μmol/L时均无细胞毒性。这说明COP233-2、COP234-2比齐多夫定AZT有效的多。本发明化合物COP232-2、COP233-2还可有效抑制HBV的复制，化合物拆分之后，两个异构体活性数据差距还是较大的，EC50：COP232-2是COP232-1的1.52倍，COP233-2是COP233-1的1.46倍，COP232-2、COP233-2可有效抑制HBV的复制，其SI(CC50/EC50)分别为4410、11070，而在相同条件下平行测定的阳性对照3TC的SI是3883，尤其是COP233-2，其SI是3TC的2.85倍。

这充分表明：本发明化合物比目前抗乙肝药物3TC抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。为今后深入研究与开发本发明化合物及其盐的抗病毒应用奠定基础。

为解决上述问题，本发明提供的技术方案是提供了一组具有结构(Ia)的核苷酸类似物化合物，

其盐、其非对映异构体(Ib)及(Ib)的盐，

其中，

R₁＝-OCH₂(CH₂)_mCH₂OCH₂(CH₂)_nCH₃或

m＝0-4，n＝12-16，R2＝C1-C6烷基。

本发明还提供了化合物(Ia)及其非对映异构体(Ib)，当m＝1，n＝14，R₂＝异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基时，所优选的具体化合物结构式：

本发明还提供了化合物(Ia)的盐及其非对映异构体(Ib)的盐，所述的盐为草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、天冬氨酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，酸和(Ia)、(Ib)摩尔比的范围为0.5至1。

本发明还公开了化合物(Ia)的盐及其非对映异构体(Ib)的盐当m＝1，n＝14，R₂＝异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基时，所优选的富马酸盐的结构式：

本发明公开了化合物(Ia)及其非对映异构体(Ib)以及它们的盐的合成路线图：

其中，

R₁＝-OCH₂(CH₂)_mCH₂OCH₂(CH₂)_nCH₃或

m＝0-4，n＝12-16，R₂＝C₁-C₆烷基。

该制备方法包括如下步骤：

a、拆分：化合物(II)参照中国专利(申请号201310134491.4或201310134492.9)合成方法得到。化合物(II)加入到乙腈溶液中，搅拌，加入2％的化合物(Ia)晶种，10-25℃搅拌0.5-2h后加入苯酚、DBU，低温下搅拌、抽滤得化合物(Ia)。或者使用制备色谱柱，通过间歇洗脱色谱法拆分化合物(I)得非对应映异构体(Ia)。

b、化合物(Ia)加入到乙腈溶液中，在60-90℃下，加入富马酸，搅拌0.5-3h，冷却、抽滤，得化合物(II)。

本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量的核苷酸类似物化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明还公开了所述药物组合物还包含治疗有效量的额外的治疗剂，其中所述额外的治疗剂是抑制HIV蛋白酶的化合物，逆转录酶的HIV非核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷酸抑制剂，HIV整合酶抑制剂，gp41抑制剂，CXCR4抑制剂，gp120抑制剂，CCR5抑制剂，病毒壳体聚合抑制剂，或非催化部位HIV整合酶部位抑制剂和其组合。

本发明还公开了所提供的药物组合物的剂型为片剂或胶囊。

本发明还公开了所提供的药物组合物在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用。

本发明还公开了所提供的药物组合物在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用中病毒疾病为HIV-1或HBV感染或HIV-1与HBV同时感染。

总之，本发明化合物集高活性、低毒性、高生物利用度等各种良好属性于一体，有着成为新一代治疗艾滋病或治疗乙型肝炎的药物的前景。

附图说明

图1为化合物COP233和TDF脂溶性对比的高效液相色谱图。

具体实施方式：

以下实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。所有化合物的结构均经1H NMR或MS所确定。

本发明所用原料：替诺福韦酯由市场购买得到、L-丙氨酸酯由市场购买其盐酸盐后脱盐得到，烷氧基烷醇由合成得到(合成参照申请号为201310134160.0或申请号为201210286879.1的专利合成方法)。

实施例1

9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(正丁氧基羰基)乙基]氨基][(异丙氧羰基氧甲基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(COP234-1)的制备

将非对映异构体混合物9-[(R)-2-[[(R，S)-[[(S)-1-(正丁氧基羰基)乙基]氨基][(异丙氧羰基氧甲基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(COP234)存于乙腈中的20wt％溶液(2.730kg乙腈，0.530kg COP234，1mol，1eq)中装入配备有搅拌器、蒸馏设备和氮入口的容器中。60℃下进行减压蒸馏将混合物浓缩到25wt％到28wt％的最终浓度。然后将溶液冷却到室温(22℃-25℃)。向溶液中加COP234-1晶种12g并且在室温下搅拌1小时。添加氯甲基碳酸异丙酯(15.2g，0.1mol，0.1当量)和DBU(15.2g，0.1mol，0.1当量)并且将混合物再搅拌24小时，或直到溶液中残留的COP130-1的重量百分比小于10％。然后将浆液冷却到0℃并且在0℃下再搅拌24小时。在0℃下将浆液过滤并且用乙酸异丙酯：乙腈的1∶1溶液(2L)洗涤。在60℃真空炉中干燥固体，得到400g白色固体9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(正丁氧基羰基)乙基]氨基][(异丙氧羰基氧甲基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(COP234-1)(75％产率)。

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ，(ppm)：0.93(3H，t，3×CH₃)，1.18-1.44(14H，m，4×CH₃and CH₂)，1.55-1.67(2H，m，CH₂)，3.58-3.95(3H，m，OCH，COOCH and NCH)，3.96-4.07(2H，m，COOCH₂)，4.08-4.41(4H，m，OCH₂P and NCH₂)，4.85-4.98(1H，m，NH)，5.53-5.72(2H，m，OCH2O)，6.26(2H，s，NH₂)，7.96-8.04(1H，d，嘌呤环上的H)，8.33(1H，s，嘌呤环上的H).

ESI-MS：[M+H]+531.2，[M+Na]+553.2

实施例2

9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(正丁氧基羰基)乙基]氨基][(异丙氧羰基氧甲基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FCOP234-1)的制备

将等量的9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(正丁氧基羰基)乙基]氨基][(异丙氧羰基氧甲基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(COP234-1)和富马酸溶于热的乙腈中，回流搅拌2小时，室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙腈洗涤得白色固体：9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(正丁氧基羰基)乙基]氨基][(异丙氧羰基氧甲基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(COP234-1)富马酸盐(FCOP234-1)。

¹H NMR(400MHz，DMSO)δ，(ppm)：0.85(3H，t，CH₃)，1.26-1.39(14H，m，CH₂and 4×CH₃)，1.58-1.62(2H，m，CH₂)，3.66-3.98(6H，m，COOCH₂，OCH₂P，NCH and 0CH)，4.11-4.31(2H，m，NCH₂)，4.74-4.86(1H，m，NH)，5.39-5.59(3H，m，OCH₂O，COOCH)，6.63(2H，s，富马酸双键上的氢)，7.22(2H，s，NH₂)，8.05-8.10(1H，d，嘌呤环上的H)，8.14(1H，s，嘌呤环上的H).12.48-13.52(2H，br，富马酸的两个COOH).ESl-MS：[M+H]+531.2

实施例3

本发明化合物抗HIV-1病毒活性的测定

1.实验材料

1.1供试品：化合物COP230、COP231、COP233、COP234。

1.2对照品：阳性对照品齐多夫定由检测单位提供。

1.3细胞株

1.4病毒株

1.5培养基

1.6实验用介质

二甲基亚砜(DMSO)美国Sigma。

1.7主要仪器及试剂

BS124S电子天平：德国Sartorius公司

离心机：美国Beckman公司；

CO₂细胞培养箱：美国ShelIAB公司；

Sirius化学发光检测仪：德国Berthold公司；

胰蛋白酶：美国Invitrogen公司；

青链霉素：美国Invitrogen公司；

胎牛血清：美国Gibco公司；

细胞裂解液及荧光素酶检测试剂盒：美国Promega公司

2.实验方法

2.1供试品、对照品配制

受试样品：称重化合物并溶解于DMSO中，贮液浓度为10mmol/L；

对照品：称重齐多夫定溶解于DMSO，贮液浓度为10mmol/L.

2.2实验步骤

2.2.1野生型HIV-1重组假病毒的制备：

转染前一天，按2.2×106个细胞的密度接种293T细胞到100mm培养皿中，用改良的磷酸钙沉淀法共转染3μg VSV-G质粒和8μg野生型HIV-1核心基因，转染后16小时，用PBS冲洗细胞并换新鲜的培养基继续培养32小时，收集上清并经0.45m的滤膜过滤，生成野生型HlV-1重组病毒颗粒VSVG/HIV-WT。

2.2.2HIV-1重组假病毒的p24抗原测定：

倍比稀释病毒原液野生型后各取450μl，用50μl的裂解液进行裂解，按照p24抗原ELISA试剂盒说明书(ZeptoMetrix，Cat：0801111)，测定并计算重组病毒原液的p24抗原浓度。

2.2.3药物对HIV-1抑制性检测：

感染前一天，将293T细胞按每孔6×104的密度接种到24孔板上，用DMSO溶解待测化合物，于感染前15分钟加入细胞培养液中，DMSO溶剂作空白对照，再加入0.5ml病毒液(根据p24浓度将病毒原液稀释至0.1-0.5ng p24/ml)。感染后48小时，去除上清，每孔中加入50I细胞裂解液(Promega)裂解细胞，再将20I细胞裂解产物加入至30I荧光素酶底物中(Promega)，用FB15荧光检测器(Sirius)仪器测定细胞荧光素酶的相对活性，以DMSO作对照，计算化合物对野生型HIV-1复制的半数抑制浓度，检测数据见药理筛选结果表1。

表1：药理筛选结果表

化合物	药理模型	细胞	IC50(nM)
				COP233	VSVG/HIV-1uc	293T细胞	2.8
COP234	VSVG/HIV-1uc	293T细胞	4.7
				齐多夫定AZT	VSVG/HIV-1uc	293T细胞	24

2.2.4应用MTS法检测化合物对细胞存活的影响

将对数生长期的293T细胞按8000～10000个/孔的细胞密度接种至96孔板中，每孔100ul，37℃，5％CO2培养箱中培养24h后，加入待测化合物，并以DMSO为空白对照(终浓度为0.1％)，37℃，5％CO2培养箱中继续培养44小时。向每孔中加入20μl MTS/PMS现配的混合液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养4h后显色。在酶联检测仪上，波长490nm和650nm(本底)处检测各孔的光吸收值(OD)，并计算细胞的存活率。

4、实验结论

化合物COP233、COP234可有效抑制野生型HIV-1的复制，其半抑制浓度IC50分别为：COP234(4.7nmol/L)；COP233(2.8nmol/L)；在相同条件下平行测定的阳性对照AZT半抑制效浓度为24.3nM。

所有化合物在终浓度10μmol/L时均无细胞毒性。

上述对本发明化合物抗HIV活性与细胞毒性的测定表明：

本发明化合物COP234、COP233的体外活性比齐多夫定(AZT)高出了5-8倍，达到了纳摩级(10-9)水平。其中化合物COP233抑制病毒复制活性的IC50值为4.15±1.35nM，目前销售额最大的抗艾滋病药物、同时又被专家誉为最好的抗乙肝药物的替诺福韦双异丙酰氧基甲酯富马酸盐(TDF)的IC50值为1.6μM，这说明本发明化合物COP233抑制病毒复制的活性高出TDF 385倍多。

这种活性级别在药物研发筛选中是非常罕见的，而且本发明化合物COP234、COP233的细胞毒性也是很低的。这些检测数据充分证明本发明化合物COP234、COP233不仅具有很高的抑制HIV-1/HBV病毒复制活性的优点，而且具有很低的毒性，有望成为治疗HIV-1/HBV的药物的前景。

实施例4

本发明化合物抗HBV病毒活性的体外测定

1.体外细胞模型：HepG2 2.215细胞

2.试验过程

2.1药液配制

药物先用DMSO溶解为40mg/mL的母液，临用前用细胞培养液将母液稀释为200、100、50、25和12.5μg/mL五个工作浓度。

2.2药物的细胞毒性检测

HepG2 2.2.15细胞在48孔细胞培养板中培养48小时后，加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，观察药物对HepG2 2.2.15细胞的毒性。

2.3药物对HBV病毒抗原和DNA抑制作用检测

HepG2 2.2.15细胞在24孔细胞培养板中培养48小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用ELISA方法检测样品对HBV s抗原和e抗原的抑制，用荧光探针法进行实时定量PCR检测HBV引物：HBV上游引物：

5′-TgT CCT ggT TAT CgC Tgg-3′

HBV下游引物：

5′-CAA ACg ggC AAC ATA CCT T-3′

HBV荧光探针序列：

5′(FAM)-TgT gTC TgC ggC gTT TTA TCA T-(TAMRA)3′

PCR：

95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火和延伸共30s，40个循环

3.结果：见下表-体外抗乙肝病毒活性筛选表

表2

4.实验结论：

化合物拆分之后，两个异构体活性数据差距还是较大的，EC50：COP232-2是COP232-1的1.52倍，COP233-2是COP233-1的1.46倍，COP232-2、COP233-2可有效抑制HBV的复制，其SI(CC50/EC50)分别为4410、11070，而在相同条件下平行测定的阳性对照3TC的SI是3883，尤其是COP233-2，其SI是3TC的2.85倍。

这充分表明：本发明化合物比目前抗乙肝药物3TC抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。

实施例5

化合物COP233与TDF脂溶性大小的测定

比较两种物质脂溶性大小的原理：

物质的脂溶性与物质的极性大小相关，物质的极性越大，则该物质的脂溶性越小，物质的极性越小，则该物质的脂溶性越大。

各种物质的脂溶性大小的比较，通常通过测定不同物质在一定的条件下，在反向液相色谱图上，保留时间的长短来表征。物质的脂溶性越高，则表现为该物质在反向液相色谱图上，保留时间越长。

本发明化合物COP233与TDF脂溶性大小的比较就是根据上述的原理来进行的。

在色谱条件：色谱柱，Agilent ZorBax SB-C18(250×4.6mm.id.5μm)；流动相，甲醇∶水＝(80∶20，v/v)；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃下，TDF的保留时间为3.627分钟，化合物COP233的保留时间为4.169分钟。化合物COP233的保留时间比TDF的保留时间延长了0.542分钟。

根据上述检测，本发明化合物COP233的脂溶性比TDF的脂溶性脂溶性高出了许多。这也就是说本发明化合物COP233的膜透过性比TDF膜透过性的高出了许多，从而提高了药物的治疗疾病的效果。

实施例6

制剂配方与工艺

本发明的药物组合物可按通用的口服药物制剂制备方法制成片剂或胶囊，300mg剂量的本发明化合物片剂或胶囊单位含量如下(mg/片，mg/粒)。

表3

名称	配比/mg
		本发明化合物	150mg
乳糖	98mg
		淀粉	40mg
微晶纤维素	5mg
		羧甲淀粉钠	5mg
硬脂酸鎂	2mg

Claims

1.具有结构(Ia)的核苷酸类似物化合物，

其盐、其非对映异构体(Ib)及(Ib)的盐，

其中，

R₁＝-OCH₂(cH₂)_mCH₂OCH₂(CH₂)_nCH₃或

m＝0-4，n＝12-16，R₂＝C₁-C₆烷基。

2.如权利要求1所述的化合物(Ia)及其非对映异构体(Ib)，其特征在于，当m＝1，n＝14，R₂＝异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基时，所优选的化合物结构式为下列结构式：

3.如权利要求1所述的化合物(Ia)的盐及其非对映异构体(Ib)的盐，其特征在于，所述的盐为草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、天冬氨酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，酸和(Ia)、(Ib)摩尔比的范围为0.5至1。

4.如权利要求3所述的核苷酸类似物化合物的盐，其特征在于，当m＝1，n＝14，R₂＝异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基、环己基时，所优选的富马酸盐的结构式为下列结构式：

5.一种制备权利要求1-4所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述方法的合成路线如下：

其中，

R₁＝-OCH₂(CH₂)_mCH₂OCH₂(CH₂)_nCH₃或

m＝0-4，n＝12-16，R₂＝C₁-C₆烷基。

该制备方法包括如下步骤：

6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求1-4中任一项所述的核苷酸类似物化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包含治疗有效量的额外的治疗剂，其中所述额外的治疗剂是抑制HIV蛋白酶的化合物，逆转录酶的HIV非核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷酸抑制剂，HIV整合酶抑制剂，gp41抑制剂，CXCR4抑制剂，gp120抑制剂，CCR5抑制剂，病毒壳体聚合抑制剂，或非催化部位HIV整合酶部位抑制剂和其组合。

8.如权利要求6-7所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为片剂或胶囊。

9.权利要求1-4中任一项所述的核苷酸类似物化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用。

10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，其中病毒疾病为HIV-1或HBV感染或HIV-1与HBV同时感染。