CN109400647A - 一组替诺福韦双酯化合物及其盐、制备方法及其药物用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组替诺福韦酯化合物(Ia)、其盐、其非对映异构体(Ib)及(Ib)的盐，还公开了制备方法以及含有该组化合物的药物组合物。试验证明本发明化合物具有抑制HIV‑1/HBV病毒复制的活性，同时所述化合物具有比目前治疗艾滋病药物替诺福韦酯富马酸盐(TDF、TAF)脂溶性高、生物利用度高、活性高、毒性低等优点。实验还证明本发明化合物还具有抑制HBV病毒复制的活性，可用于治疗艾滋病药物或乙型肝炎药物的开发。

Description

一组替诺福韦双酯化合物及其盐、制备方法及其药物用途
技术领域
本发明涉及一组替诺福韦双酯化合物及其盐，尤其涉及一组具有抑制HIV-1/HBV病毒复制活性的替诺福韦双酯化合物及其盐、制备方法及其药物用途。
背景技术
与环状核苷类逆转录酶抑制剂相比，非环核苷化合物替诺福韦(TNF)在防止病毒耐药性问题上具有明显优势，其对耐环状核苷类药物的病毒株有效，本身耐药发生率低，且毒性相对较小，可用于治疗感染HIV-1(艾滋病病毒)/HBV(乙肝病毒)的患者。但是，由于替诺福韦的生物膜透过性差，导致生物利用度很低，使其不能成为药物应用于临床。
药物也只有脂溶性大，才能较好地透过细胞膜进入细胞内，充分发挥治疗疾病的作用，所以提高药物的脂溶性从而提高其生物利用度是药物学家追求的一个重要价值目标。
目前全球的艾滋病/乙肝治疗药物，吉利德公司的TDF、TAF复方制剂几乎独占市场。TNF因生物利用度(穿透细胞膜能力)低而最终没有成药，科学家们把注意力集中到了提高药物的脂溶性从而提高其生物利用度上。吉利德公司的一种替诺福韦酯：9-[(R)-2-[[二(异丙氧羰基氧甲基氧基)氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤富马酸盐(TDF)由于改善了药物的生物利用度，于2001年被美国食品药物管理局(FDA)批准上市。
但TDF的毒副作用(肾功能损害、骨密度降低以及高耐药性)的出现，使科学家们急需找到TDF的第2代药物：即保持TDF的高活性、又降低毒副作用并提高生物利用度。
美国的吉利德公司找到的另一种替诺福韦酯：9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基]苯氧基氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤富马酸盐(TAF)，也由于改善了药物的生物利用度，于2016年11月11日被FDA批准上市。由于TAF进入人体后要脱落一分子的苯酚，所以TAF复方制剂上市以来表现出来了严重的毒副作用：乳酸中毒及严重肝脏肿大合并脂肪肝。
中国医学科学院医药生物技术研究所在一份关于对替诺福韦进行研究和改造的中国专利申请号2010056926.8(国际申请公布号WO2012/041015A1)文献中，明确记载：“在替诺福韦分子中磷酸基的一个羟基上引入脂溶性长链烷氧烷基长链，使分子结构中磷酸基团的一个羟基被酯化、一个仍处于游离状态，得到替诺福韦的磷酸长链烷氧乙/丙基单酯衍生物。该化合物在引入长链烷氧乙/丙基后，不仅改善了化合物的药代动力学性质，而且磷酸基中另一个游离羟基仍可以被磷酸化、参与病毒复制过程，发挥抗病毒效果，因而保留了替诺福韦的抗病毒活性。即脂溶性长链的引入既改善了化合物的药代动力学性质以保留了抗病毒活性。”
中国医学科学院医药生物技术研究所的专利ZL200610056926.8中的发明就是为了提高替诺福韦的脂溶性，而对其进行的研究和改造，并获得了重大进步。
无独有偶，名为奇默里克斯(Chimerix)的一家美国医药公司在其一篇中国专利申请CN101977610A中也披露了，其研发的抗HIV病毒药物也是对替诺福韦及其衍生物的进一步改造。该公司研发的药物编号为CMX157。
CMX157的结构式如下：
CMX157在治疗艾滋病方面有着很好的前景，无论是体外细胞活性筛选、动物实验和临床实验(I)，都显示出了其具有成为抗HIV的候选药物的属性。在CN101977610A专利申请中和公开的世界权威文献中，关于CMX157的各种检测数据表明，对HIV病毒无论野生型还是各种突变耐药型，CMX157都显示出了很高的活性、很低的毒性和不易产生耐药性，而且与上市的治疗HIV的药物联合使用时都有良好的协同作用，而不产生拮抗作用。总之CMX157以其独特的优异属性吸引了全世界制药巨头的密切关注。
据网上报道，世界制药巨头美国默克制药公司(Merck &Co.,Inc)，于2012年7月24日，以1.51亿美元的价格，得到了奇默里克斯(Chimerix)公司的许可，获得了在世界范围内独家实施CMX157的专利(WO2009/094190)。
CMX157是替诺福韦的前药，其对替诺福韦加以改造的主要目的是提高其脂溶性，改善膜透过性，提高人体的生物利用度，进而提高替诺福韦的治疗疾病的效果。
尽管上述两种前药都提高了替诺福韦的脂溶性，然而对替诺福韦及其衍生物加以改造，充分提高其脂溶性，进一步改善其人体的生物利用度而充分发挥治疗乙肝和艾滋病的药效仍然具有重要的价值。
2013年获专利授权的C0P130(申请号201210286879.1)是用CMX157上的长链(烷氧烷基)替换了TAF上的苯环，这样即保持TAF的高活性又降低了TAF的毒副作用【EC50(C0P130)＝4.169nM,EC50(TAF)＝3nM，二者活性处于一个数量级，但CC50(C0P130)>200μM,CC50(TAF)＝102.4μM这充分说明C0P130比TAF安全的多。】
简易药代检测报道又进一步证明，生物利用度C0P130有比TDF高。由于C0P130即保持了TAF的高活性，又降低了TAF的毒副作用，同时生物利用度又比CMX157、TDF高。所以我们说C0P130是TAF的升级版。
综上所诉，虽然目前全球的艾滋病治疗药物，吉利德公司的TDF、TAF复方制剂几乎独占市场，但是我们的基于TNF的治疗艾滋病药物研究仍然意义巨大。充分提高其脂溶性，进一步改善其人体的生物利用度而充分发挥治疗乙肝和艾滋病的药效仍然具有重要的价值。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足，对替诺福韦及其衍生的结构进行更进一步的改造，得到具有更高的生物利用度、更高抑制病毒活性和更低毒性的新的核苷酸类似物化合物。
本发明产品提高了替诺福韦治疗艾滋病和乙肝疾病的效果，并将最终造福于全人类。
本发明提供了一组具有有效抑制HIV-1的复制，其半数有效浓度EC50分别为:C0P130-2(4.169nM)、C0P133-2(7.567nM)；与在相同条件下平行测定的阳性对照EFV、TAF的半数有效浓度EC50分别为：EFV(3.134nM)、TAF(3.000nM)都处于纳摩级水平。化合物C0P130-2、C0P133-2的半数毒性浓度CC50都大于150μM，而TAF的CC50＝102.41μM，这说明C0P130-2、C0P133-2比TAF安全的多。开发系数SI:C0P130-2(SI：35984)也大于TAF(SI：34144)。
本发明化合物C0P130-2、C0P133-2还可有效抑制HBV的复制，其半抑制浓度IC50分别为：C0P130-2(27.1μM)；C0P133-2(6.47μM)；在相同条件下平行测定的阳性对照TDF半数有效浓度为80.1μM。本发明化合物之一的FC0P130-2生物利用度高于TDF、毒性低于TAF,为今后深入研究与开发本发明化合物及其盐的抗病毒应用奠定基础。
本发明采用的技术方案为具有结构(Ia)的替诺福韦双酯化合物，
其盐、其非对映异构体(Ib)及(Ib)的盐，
其中，m＝0-4，n＝12-16；R1＝C1-C6烷基。
本发明提供的化合物(Ia)及其非对映异构体(Ib)，优选其中当m＝1，n＝14(或m＝0，n＝16)，R1是异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基或环己基时，所优选的化合物结构式为下列结构式：
本发明提供的化合物(Ia)的盐及其非对映异构体(Ib)的盐，优选其中的草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、天冬氨酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，酸和(Ia)、(Ib)摩尔比的范围又优选0.5至1。
本发明提供的化合物(Ia)的盐及其非对映异构体(Ib)的盐，又优选其中，当m＝1，n＝14(或m＝0，n＝16)，R1是异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基或环己基时的富马酸盐，所优选的盐的结构式为下列结构式：
本发明还提供了制备化合物(Ia)及其非对映异构体(Ib)或其药学上可接受的盐的方法，所述方法的合成路线以下：
其中，m＝0-4，n＝12-16；R1＝C1-C6烷基。
该制备方法包括如下步骤：
a、替诺福韦溶于氯化亚砜中，温度30-90℃，时间10min-3h，减压蒸干加入乙腈，回流0.5-3h后，依次缓慢加入烷氧基烷醇、L-丙氨酸酯、三乙胺，冷却、抽滤，既得化合物(Ⅱ)。
b、拆分：化合物(Ⅱ)加入到乙腈溶液中，搅拌，加入2％的化合物(Ⅰa)晶种，10-25℃搅拌0.5-2h后加入烷氧基烷醇、DBU，低温下搅拌、抽滤得化合物(Ⅰa)。也可以使用制备色谱柱，通过间歇洗脱色谱法，按如下洗脱条件拆分化合物(Ⅱ)得到异构体(Ⅰa)。
c、化合物(Ⅰa)加入到乙腈溶液中，在60-90℃下，加入富马酸，搅拌0.5-3h,冷却、抽滤，得化合物(Ⅲ)。
本发明还提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有治疗有效量替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明所涉及的一种药物组合物，又优选所述药物组合物还包含治疗有效量的额外的治疗剂，其中所述额外的治疗剂是抑制HIV蛋白酶的化合物，逆转录酶的HIV非核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷酸抑制剂，HIV整合酶抑制剂，gp41抑制剂，CXCR4抑制剂，gp120抑制剂，CCR5抑制剂，病毒壳体聚合抑制剂，或非催化部位HIV整合酶部位抑制剂和其组合。
本发明所涉及的药物组合物，药物组合物的剂型优选其中的片剂或胶囊。
本发明还提供了替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用。
本发明所涉及的用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用，优选3其中毒疾病为HIV-1或HBV感染或HIV-1与HBV同时感染。
经过国家权威检测机构测定，本发明化合物具有成为治疗艾滋病/乙肝的药物所需的各种优良属性，具体如下：
(1)本发明化合物C0P130-2、C0P133-2可有效抑制HIV-1的复制，其半数有效浓度EC50分别为:C0P130-2(4.169nM)、C0P133-2(7.567nM)；与在相同条件下平行测定的阳性对照EFV、TAF的半数有效浓度EC50分别为：EFV(3.134nM)、TAF(3.000nM)都处于纳摩级水平。化合物C0P130-2、C0P133-2的半数毒性浓度CC50都大于150μM，而TAF的CC50＝102.41μM，这说明C0P130-2、C0P133-2比TAF安全的多。开发系数SI:C0P130-2(SI：35984)也大于TAF(SI：34144)。这充分表明：开发化合物C0P130-2比上市药物TAF更安全，意义更大，.有望成为治疗HIV-1感染的药物。
(2)对比检测本发明化合物代表性实例COP130的脂溶性比CMX157脂溶性高出了许多，约是CMX157脂溶性5.23倍，表明本发明化合物的膜透过性比CMX157膜透过性要高出许多，改善了替诺福韦的生物利用度，从而显著地提高了替诺福韦艾滋病的效果，相应也必将产生巨大的经济效益和社会效益。
(3)本发明化合物C0P130-2、C0P133-2可有效抑制HBV的复制，其半抑制浓度分别为：C0P130-2(27.1μM)；C0P133-2(6.47μM)；在相同条件下平行测定的阳性对照TDF半数有效浓度为80.1μM。
这充分表明：本发明化合物比抗乙肝药物TDF抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。
总之，本发明化合物集高活性、低毒性、高生物利用度等各种良好属性于一体，有着成为新一代治疗艾滋病或治疗乙型肝炎的药物的前景。
附图说明
图1为化合物COP13O和CMX157脂溶性对比的高效液相色谱图。
图2为化合物COP13O-1的空间结构图。
具体实施方式：
以下实施例可以使本专业技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。所有化合物的结构均经1H NMR或MS所确定。
本发明所用原料：替诺福韦由市场购买得到、L-丙氨酸酯由市场购买其盐酸盐后脱盐得到，烷氧基烷醇由合成得到(合成参照申请号为201310134160.0或申请号为201210286879.1的专利合成方法)。
实施例1
非对映异构体混合物9-[(R)-2-[[(R,S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P130)的制备
将L-丙氨酸异丙酯盐酸盐500g和碳酸氢钾730g于DCM(2kg)中室温搅动12小时。然后将混合物过滤并且进一步用DCM(1kg)冲洗。在分子筛床上干燥滤液直到溶液的水含量≤0.03％。将制得的L-丙氨酸异丙酯冷却到-20℃的罐温度备用。
称取500g替诺福韦(投料前先于烘箱中105℃干燥3小时)加入2000ml烧瓶中，再加入氯化亚砜1500g，升温至55℃，10分钟后，再继续升温至70℃后搅拌3小时，倒入20L旋蒸瓶中减压蒸馏氯化亚砜，蒸馏结束后加入7kg乙腈并在85℃下回流0.5h后，等分10次加入630克3-十六烷氧基-1-丙醇(每10分钟加一次)，加完后回流状态下继续搅拌0.5h，后缓慢降温至35℃，然后加入3kg二氯甲烷，再继续搅拌0.5h后0.5h内滴加完458g L-丙氨酸异丙酯，再搅拌0.5h后滴加350g三乙胺，继续搅拌0.5h后体系冷至室温后抽滤，滤液蒸干加入5kg乙酸乙酯。滤饼用1kg乙酸乙酯搅拌1h后抽滤，滤液和上步合并，合并后乙酸乙酯溶液分别用6kg5％碳酸氢钾水溶液洗涤两次、6kg 20％氯化钠水溶液洗涤两次，洗涤后乙酸乙酯溶液冷至-7℃，2h后开始抽滤，滤液蒸干。蒸干后滤液用2kg的二氯甲烷：乙腈＝1:20的混合溶剂在-10℃下结晶，结晶后抽滤，滤饼用2kg的乙腈重结晶，结晶后抽滤，得到的滤饼室温下真空干燥后得C0P130约628g(产率52.1％，纯度98.6％)。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86(3H,t,CH3),1.20-1.39(38H,m,13×CH2and 4×CH3),1.46-1.62(2H,m,CH2),1.80-1.97(2H,m,CH2),3.27-3.58(6H,m 3×OCH2),3.80-4.21(6H,m,OCH2P，NCH2OCH and NCH),4.35-4.45(1H,m，COOCH),4.92-5.05(1H,m,NH),5.80-6.25(2H,d,NH2),7.95-8.06(1H,d,嘌呤环上的H),8.30-8.44(1H,d,嘌呤环上的H)。
31P NMR(400MHz,CDCl3):δ23.341，24.320。
ESI-MS:[M+H]+683.4，[M+Na]+705.3。
实施例2
9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P130-2)的制备
将非对映异构体混合物9-[(R)-2-[[(R,S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P130)存于乙腈中的20wt％溶液(2.730kg乙腈，0.683kg C0P130，1mol，1eq)中装入配备有搅拌器、蒸馏设备和氮入口的容器中。60℃下进行减压蒸馏将混合物浓缩到25wt％到28wt％的最终浓度。然后将溶液冷却到室温(22℃-25℃)。向溶液中加C0P130-2晶种14g并且在室温下搅拌1小时。添加3-十六烷氧基-1-丙基(30g，0.1mol,0.1当量)和DBU(15.2g，0.1mol,0.1当量)并且将混合物再搅拌24小时，或直到溶液中残留的C0P130-1的重量百分比小于10％。然后将浆液冷却到0℃并且在0℃下再搅拌24小时。在0℃下将浆液过滤并且用乙酸异丙酯∶乙腈的1∶1溶液(2L)洗涤。在60℃真空炉中干燥固体，得到534g白色固体9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P130-2)(76％产率)。
1HNMR(400MHz,CDCl3):δ0.88(3H,t,CH3),1.18-1.39(38H,m,13×CH2and 4×CH3),1.46-1.60(2H,m,CH2),1.77-1.95(2H,m,CH2),3.30-3.63(6H,m,3×OCH2),3.71-4.17(6H,m,NCH2，OCH2P，OCH and NCH),4.29-4.41(1H,m,COOCH),4.96-5.10(1H,m,NH),6.18(2H,s,NH2),8.018(1H,s,嘌呤环上的氢),8.333(1H,s,嘌呤环上的氢)。
31P NMR(400MHz,CDCl3):δ23.441。
ESI-MS:[M+H]+683.5
实施例3
9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P130-2)的制备
将等量的9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P130-2)和富马酸溶于热的乙腈中，回流搅拌2小时,室温下冷却析晶，滤出析出的固体并用乙腈洗涤得白色固体:9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(异丙氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P130-2)。
1H NMR(400MHz,DMSO):δ0.80-0.89(3H,t,CH3),0.98-1.07(3H,d,CH3),1.10-1.32(35H,m,13×CH2and 3×CH3),1.39-1.52(2H,m,CH2),1.62-1.82(2H,m,CH2),3.23-3.43(4H,m,2×OCH2),3.57-3.98(6H,m,OCH2，OCH,OCH2P and NCH),4.07-4.38(2H,m,NCH2),4.80-4.95(1H,m,COOCH),5.00-5.15(1H,m,NH),6.63(2H,s,富马酸双键上的氢),7.18(2H,s,NH2),8.08(1H,s,嘌呤环上的氢),8.13(1H,s,嘌呤环上的氢),12.70-13.62(2H,s,富马酸羧基上的氢)。ESI-MS:[M+H]+683.5
实施例4
非对映异构体混合物9-[(R)-2-[[(R,S)-[[(S)-1-(新戊氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P133)的制备
以实施例1类似方法合成得到:9-[(R)-2-[[(R,S)-[[(S)-1-(新戊氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P133)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.78-1.00(12H,m,4×CH3),1.14-1.46(32H,m,13×CH2and 2×CH3),1.47-1.60(2H,m,CH2),1.80-1.95(2H,m,CH2),3.25-3.52(6H,m,3×OCH2)，3.54-4.20(8H,m,NCH2，OCH，OCH2P，NCH and COOCH2),4.30-4.44(1H,m,NH),6.12(2H,s,NH2),7.93-8.11(1H,d,嘌呤环上的H),8.34(1H,s,嘌呤环上的H)。
ESI-MS:[M+H]+711.4，[M+Na]+733.4
实施例5
9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(新戊氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P133-2)的制备
以实施例2类似方法拆分得到:9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(新戊氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤(C0P133-2)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.78-1.02(12H,m,4×CH3),1.14-1.46(32H,m,13×CH2and 2×CH3),1.47-1.60(2H,m,CH2),1.80-1.95(2H,m,CH2),3.28-3.62(6H,m,3×OCH2)，3.66-3.93(4H,m,OCH,OCH2P and NCH)，3.99-4.20(4H,m,COOCH2，NCH2),4.30-4.44(1H,m,NH),6.25(2H,s,NH2),8.00(1H,s,嘌呤环上的H),8.33(1H,s,嘌呤环上的H)。
ESI-MS:[M+H]+711.4
实施例6
9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(新戊氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P133-2)的制备
以实施例3类似的成盐方法得到:9-[(R)-2-[[(S)-[[(S)-1-(新戊氧基羰基)乙基]氨基][(3-十六烷氧基-1-丙基)氧基]氧膦基]甲氧基]丙基]腺嘌呤富马酸盐(FC0P133-2)
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ,(ppm):0.78-0.98(12H,m,4×CH3),1.0-1.1(3H,m,CH3),1.14-1.46(29H,m,13×CH2and CH3),1.47-1.65(2H,m,CH2),1.80-1.93(2H,m,CH2),3.25-3.50(4H,m,2×OCH2)，3.54-3.70(3H,m,OCH2and NCH),3.72-3.93(5H,m,OCH,NCH2andOCH2P)，4.08-4.20(2H,m,COOCH2),5.05-5.29(1H,m,NH),6.63(2H,s,富马酸双键上的H),7.19(2H,s,NH2),8.07(1H,s,嘌呤环上的H),8.13(1H,s,嘌呤环上的H)，13.14(2H,s,富马酸羧基上的H)。
ESI-MS:[M+H]+711.4
实施例7
本发明化合物抗HIV-1病毒活性的测定
化合物的配制：
化合物配制当天，将4个样品化合物C0P130-1、C0P130-2、C0P133-1、C0P133-2溶解于DMSO溶剂，配制浓度为30mM。
4个样品化合物在抗病毒实验中的起始浓度是1μM，0.5％DMSO，在细胞毒性实验中是150μM，0.5％DMSO。抗病毒阳性药物依法韦伦(efavirenz,EFV)起始浓度在抗病毒实验和细胞毒性实验中都是1μM。细胞毒性阳性化合物在两个实验中的起始浓度都是10μM。所有化合物从起始浓度都做3倍倍比稀释，共计11个稀释度。100nM的EFV作为抗病毒HPE(100％抗病毒)对照。10nM的细胞毒性阳性化合物作为细胞毒性实验HPE(100％毒性)对照。0.5％DMSO作为两个实验的ZPE(0％抗病毒或毒性)对照。
抗病毒实验：MT2Rep assay
将HIV-1病毒株NL4-3与MT2细胞混合，然后将细胞病毒混合液转到含有待测化合物的384孔板中。37℃培养箱培养3天，让病毒有若干轮的复制与感染。孵育3天后，将上清液转移到新的384孔板，加入HIV-1的指示性细胞系。该细胞系表达CXCR4、CCR5、CD4受体及HIV-1-LTR-β-Gal。在未感染HIV-1时，该细胞系不表达β-Gal，当病毒感染后，HIV-1的tat蛋白能够激活LTR启动子，从而启动β-Gal酶的表达。β-Gal的表达水平与病毒感染量成正相关。如果化合物抑制病毒的复制，将降低报告基因的信号。所有与HIV-1相关的操作都是在生物安全3级实验室完成的。
第1天：MT2细胞感染
第4天：转移病毒上清到报告细胞系
第5天：检测β-Gal信号
第4天：细胞毒性检测
检测结果
表1 Compounds EC50,CC50 and SI
实验结论
化合物C0P130-2、C0P133-2可有效抑制HIV-1的复制，其半数有效浓度EC50分别为：C0P130-2(4.169nM)、C0P133-2(7.567nM)；与在相同条件下平行测定的阳性对照EFV、TAF的半数有效浓度EC50分别为：EFV(3.134nM)、TAF(3.000nM)都处于纳摩级水平。化合物C0P130-2、C0P133-2的半数毒性浓度CC50都大于150μM，而TAF的CC50＝102.41μM，这说明C0P130-2、C0P133-2比TAF安全的多。开发系数SI:C0P130-2(SI：35984)也大于TAF(SI：34144)。
这充分表明：开发化合物C0P130-2比上市药物TAF更安全，意义更大，有望成为治疗HIV-1感染的药物。
实施例8
本发明化合物抗HBV病毒活性的体外测定
1.体外细胞模型:HepG2 2.215细胞
2.试验过程
2.1药液配制
药物先用DMSO溶解为40mg/mL的母液，临用前用细胞培养液将母液稀释为200、100、50、25和12.5μg/mL五个工作浓度。
2.2药物的细胞毒性检测
HepG2 2.2.15细胞在48孔细胞培养板中培养48小时后，加入上述所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，观察药物对HepG2 2.2.15细胞的毒性。
2.3药物对HBV病毒抗原和DNA抑制作用检测
HepG2 2.2.15细胞在24孔细胞培养板中培养48小时后，加入所配不同浓度含药培养液，继续培养9天(每3天换液一次)，收集上清液，用ELISA方法检测样品对HBV s抗原和e抗原的抑制，用荧光探针法进行实时定量PCR检测HBV引物：HBV上游引物：
5’-TgT CCT ggT TAT CgC Tgg-3’
HBV下游引物：
5’-CAA ACg ggC AAC ATA CCT T-3’
HBV荧光探针序列：
5’(FAM)-TgT gTC TgC ggC gTT TTA TCA T-(TAMRA)3’
PCR：
95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃退火和延伸共30s，40个循环
3.结果：见下表-体外抗乙肝病毒活性筛选表
表2
4.实验结论：
化合物C0P130、C0P133、C0P135可有效抑制HBV的复制，其半抑制浓度IC50分别为：C0P130(27.1μM)；C0P133(6.47μM)；C0P135(14.5μM)，在相同条件下平行测定的阳性对照TDF半数有效浓度IC50为80.1μM。
这充分表明：本发明化合物比目前抗乙肝药物TDF抑制病毒复制的活性高出很多，有望成为治疗HBV感染的药物。
实施例9
FC0P130-2化合物急性毒性的测定
实验目的
给SPF级KM小鼠一次或一日内最大体积、最大浓度经口灌胃受试物，观察动物在14天内所产生的毒性反应及死亡分布情况、可能出现异常的靶器官。为临床安全用药提供科学依据。
实验材料
1、受试物：FC0P130-2由洛阳聚慧医药科技有限公司提供，批号20150715；性状：白色粉末状，EP管装、密封，4℃冰箱储存。
2、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)购自上海浦东化学品有限公司，批号20120605，配制成0.5％的溶液，高压灭菌备用。
3、实验动物：SPF级KM小鼠，购自河南省实验动物中心。
4、喂养饲料：SPF级标准饲料，购自河南省实验动物中心。
5、饲养垫料：购自河南省实验动物中心，经120℃高压灭菌。
6、喂养饮水：经动物全自动消毒饮水器消毒后标准瓶装自由饮水。
7、实验条件：动物在实验室环境温度24±2℃、湿度40-60％，IVC独立送风系统条件下饲养，三天换一次垫料，每天更换一次饮用水，实验室在超净工作台内进行。
实验设计
实验设计：参考《化学药物急性毒性实验技术指导原则》资料，通过不同剂量的预实验，观察动物的毒性反应及死亡分布情况，计算半数致死剂量(LD50)。如动物未出现可能出现死亡情况，应进行一日内最大耐受量实验。
实验方法
1、用0.5％CMC-Na溶液配制成不同浓度的受试物混悬液，经口灌胃，进行预实验，最高用药量4.0g/kg(体重)，观察动物在14天内是否出现明显的毒性反应及死亡。根据预实验结果动物在14天内未出现死亡，因此进行一日内最大体积、最大配制浓度，连续两次给药(间隔时间6小时)的耐受量实验。
2、受试物剂量配制：试验前称取受试物1.7992g，用CMC-Na稀释至12.0ml,浓度为15％，上、下午各配一次，用组织匀浆机配制成均匀的混悬液。
3、用动物20只，♂、♀各半，合格证号：SCXK(豫)2010-0002，随机分成两组，在动物空腹14-16小时后经口灌胃，浓度15％，3.0g/kg(体重)，体积0.2ml/10g,上、下午各灌胃一次，一日内总剂量达6.0g/kg(混悬液)。观察动物在14天内是否出现活动异常、毛发出现竖毛、动物体重明显减轻等明显的毒性反应及死亡。
实验结果
1、SPF级KM小鼠一日内连续两次(间隔时间6小时)经口灌胃FC0P130-2，浓度15％，3.0g/kg(体重)，体积0.2ml/10g,上、下午各灌胃一次，一日内总剂量达6.0g/kg(混悬液),观察动物在14天内未出现活动迟缓、毛发竖毛、动物体重明显减轻等明显的毒性反应及死亡。解剖，肉眼观察，心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等脏器无明显异常现象。
2、动物体重增长情况见下表
KM小鼠经口灌胃受试物FC0P130-2急性毒性试验体重变化
表3
试验结论
给KM小鼠一日内连续两次经口灌胃FC0P130-2，总剂量达6.0g/kg的混悬液,动物未出现明显的毒性反应及死亡情况。解剖，肉眼观察，心、肝、脾、肺、肾、胃、肠等脏器无明显异常现象。按临床拟用剂量，300mg/人/天，按体重60kg计算，相当于临床用量的1200倍。
实施例10简易药代的测定
背景
目前全球的艾滋病治疗药物，吉利德公司的TDF、TAF复方制剂几乎独占市场，TDF生物利用度较低和它的毒副作用(肾功能损害、骨密度降低以及高耐药性)以及TAF复方制剂上市以来所表现出来的严重的毒副作用(乳酸中毒及严重肝脏肿大合并脂肪肝)的相继出现，使得继续开发出口服吸收效率更高、耐药发生率更低和毒性更小的高活性抗HIV-1前药具有重大意义。
FC0P130-2为酯化酰胺化前药，在理论意义上具有更强的生物效应。本研究主要对FC0P130-2及TDF在大鼠体内的药代动力学进行研究，通过口服及静脉注射两种方式给药，不同时间点采血，建立大鼠血浆中母药及替诺福韦浓度的HPLC测定法，采用DAS3.0软件进行数据处理，得到有关FC0P130-2和TDF及其活性代谢物替诺福韦在大鼠体内的药动学参数，为该药物进一步开发研究提供依据。
1.摘要
1.1建立一种快速、灵敏的测定大鼠血浆样品中FC0P130-2、TDF及其活性代谢物替诺福韦的高效液相色谱法，对FC0P130-2和TDF在大鼠体内的药代动力学进行研究。
1.2药代动力学SD大鼠分别灌胃50mg/kg FC0P130-2和TDF后，其活性代谢物替诺福韦的主要动力学参数：半衰期(t1/2)分别为：6.905±1.635h，5.915±1.733h；表观分布容积(V)分别为：111.557±13.7L/kg，110.09±31.2L/kg；清除率(CL)分别为：11.769±29L/h/kg，13.347±33.8L/h/kg；最大血药浓度Cmax分别为：1171±34.8ug/L，1104.667±42.6ug/L；曲线下面积AUC分别为：4500±1080ug/L*h，4081±1268ug/L*h；平均驻留时间MRT分别为：7.312±1.2h，6.527±0.906h；生物利用度F分别为25％、21％。
2.目的
本实验的主要目的是研究并比较FC0P130-2和TDF灌胃后在大鼠体内的药代动力学特征，为其进一步的临床试验方案提供参考。
3.材料
3.1仪器
高效液相色谱仪(美国DIONEX U3000)，包括在线真空脱气机(LPG-3400SD型)，自动进样器(WPS-3000SL型),四元输液泵(ANAL YTICAL型),柱温箱(TCC-3000RS型),可变波长紫外检测器(VDW-3100型)。XS105型梅特勒-托利多十万分之一电子分析天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；真空浓缩仪5305(上海艾本德生物技术国际贸易有限公司)；PHS-25型PH计(上海大普仪器厂)；XK96-A型快速混匀器(姜堰市新康医疗器械有限公司)；
KQ3200DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；
Milli-Q Advantage A10 Systems超纯水器(Millipore公司)。
3.2试剂
甲醇(色谱纯)：天津四友有限公司；乙腈(色谱纯)：天津四友有限公司；甲酸、无水乙醇等均为分析纯。
3.3动物
SD(Sprague Dawley)大鼠，雌雄兼用，由河南省郑州市惠济区华兴实验动物养殖场提供。大鼠质量检测单位：山西医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK(晋)2015-0001。
3.4试药
FC0P130-2原料药(纯度>99％)，TDF原料药(纯度>99％)，替诺福韦原料药(纯度>99％)，均由洛阳聚慧医药科技有限公司提供。
4.生物样品中FC0P130-2测定法的建立与考证
4.1色谱条件
色谱柱为Prodigy 5u 100A C18柱(250×4.60mm，美国菲罗门公司)，同时配备一个C18预柱(KJO-4282，美国菲罗门公司)；流动相(用于测定体内活性代谢物研究)：乙腈/水(甲酸调PH至3.0)＝4/96(V/V)；流速：1ml.min-1；柱温：38℃；进样量：20μl，紫外检测波长为260nm。FC0P130-2、TDF的分析方法测定采用梯度洗脱，流动相A是乙腈，流动相B是水(甲酸调PH至3.0),洗脱程序见表4、表5。
表4 FC0P130-2的洗脱程序
表5 TDF的洗脱程序
时间/min 流动相A％ 流动相B％
0 4 96
8 4 96
20 60 40
22 4 96
25 4 96
4.2标准溶液的配制
取FC0P130-2约1mg，精密称定，置10ml量瓶中，以乙腈-水(95:5)溶液为溶剂溶解，并稀释至刻度，摇匀作为储备液(100μg.ml-1)。再分别定量稀释配制成质量浓度为0.5,1,2,5,10,20,50μg.ml-1的系列标准溶液。
4.3血浆样品处理
精密吸取血浆样品0.30ml，置2ml EP管中，加入甲醇1.2ml，涡旋混匀1min，离心10min，精密吸取上清液1ml，减压挥干溶剂，残留物精密加入乙腈-水(80:20)溶液200μl，涡旋溶解，离心10min，精密吸取上清液100μl转移至自动进样瓶中，进样20μl，进行HPLC分析。
4.4方法学验证
4.4.1方法的特异性考证
取大鼠的空白血浆，按上述“血浆样品处理”的方法进行处理，并与给药后生物样品以及标准品对照。在本试验条件下，FC0P130-2的保留时间约为22.0±0.5min，TDF的保留时间为20.2±0.5min，替诺福韦的保留时间为5.7±0.6min。
4.4.2回收率测定
取大鼠空白血浆300μl，按“血浆样品处理”项下方法制备成低、中、高3个浓度(FC0P130-2的血浆浓度分别为100,500,3750ng.ml-1)的质控(QC)样品，每个浓度分析5个样本，同时用溶剂制备相同浓度的标准品溶液，HPLC进样20μl，测得的质控样品峰面积与标准品的峰面积比较得到回收率。结果见表6。
表6 FC0P130-2回收率测定
4.4.3准确度的测定
取大鼠空白血浆300μl，按“血浆样品处理”项下方法制备成低、中、高3个浓度(FC0P130-2的血浆浓度分别为100,500,3750ng.ml-1)的质控(QC)样品，HPLC进样20μl，将测定结果代入血浆标准曲线算出测定浓度，将测定浓度与加入浓度相比，算得血浆中FC0P130-2的相对回收率，试验结果见下表7：
表7 FC0P130-2的准确度测定
4.4.4精密度的测定
取大鼠空白血浆300μl，按“血浆样品处理”项下方法制备成低、中、高3个浓度(FC0P130-2的血浆浓度分别为100,500,3750ng.ml-1)的质控(QC)样品，HPLC进样20μl，测定日内精密度(n＝15)和日间精密度(连续考察三天)(n＝45)。结果见下表8、表9，要求测定浓度在理论浓度的±15％以内(低浓度点可达±20％)。试验数据表明QC样品的精密度小于15％；准确度在85％-115％之间。
表8 FC0P130-2日内精密度(n＝15)
表9 FC0P130-2日间精密度(n＝45)
4.4.5稳定性的测定
进行大鼠室温稳定性试验(分别放置0、1h、2h)，处理后稳定性试验(4度放置0、1h、2h)。将测定结果的峰面积比代入血浆标准曲线计算实测值，评估稳定性。实验结果表明该药物在2h之内稳定性良好，在4℃时的稳定性较常温稳定性好。结果见表10、表11。
表10 FC0P130-2室温稳定性试验
表11 FC0P130-2 4℃稳定性试验
4.4.6残留
对该药物进行残留考察，注射高浓度样品后，再注射空白样品，在空白样品中的残留不超过定量下限的20％。
4.4.7稀释可靠性
生物样品测定时，对高浓度样品稀释后进行测定，测定结果表明样品稀释不影响精密度及准确度。
4.5标准曲线和定量下限
精密量取空白血浆300μl多份，分别加入替诺福韦标准溶液，制备替诺福韦质量浓度分别为50,100,200,500,1000,2000和5000ng.ml-1的标准血浆样品，照“血浆样品处理”项下方法处理并进行色谱分析，记录替诺福韦色谱峰面积(As)。典型标准曲线的回归方程为Y＝0.686X-0.016，回归系数(r)为0.999，最低定量限为50ng.ml-1。结果表明替诺福韦在50-5000ng.ml-1范围内线性良好。
5 FC0P130-2在大鼠体内药代动力学
5.1剂量选择的依据
参照参比药物TDF人体有效药物剂量5mg/kg，通过种属间的剂量换算确定两种药物的大鼠给药剂量为50mg/kg。
5.2动物分组及实验过程
取大鼠14只，雌雄各半，体重180-220g。随机分成2组，每组7只。禁食(可自由饮水)12小时后，其中6只大鼠分别灌胃FC0P130-2和TDF 10mg，剩余1只分别静脉注射FC0P130-2和TDF 10mg。于给药后30、45、60、90、120、240、360、480、600、720min，用肝素化毛细管于眼眶静脉丛取血，按血浆样品处理项下处理测定。
5.3数据分析
两组动物根据血药浓度-时间数据用Das3.0软件求算药代动力学常数。
5.4结果
5.4.1血药浓度及药时数据大鼠分别灌胃50mg/kg FC0P130-2(FC0P130-2浓度：2mg/ml)和50mg/kg TDF(TDF浓度：2mg/ml)后测得活性代谢物替诺福韦的血药浓度-时间数据分别列于表12、表13。
表12大鼠灌胃FC0P130-2 50mg/kg后血浆中血药浓度(ng/ml)
时间(h) no.1 no.2 no.3 no.4 no.5 no.6
0.5 578 308 806 598 514 503
0.75 851 537 1338 957 801 781
1 1171 692 1916 1204 1049 994
1.5 845 512 1302 932 776 715
2 684 393 928 659 591 512
4 318 247 385 286 310 283
6 179 145 185 147 156 176
8 140 98 152 130 137 138
10 118 78 122 112 114 116
12 99 52 103 95 93 90
表13大鼠灌胃TDF 50mg/kg后血浆中血药浓度(ng/ml)
5.4.2药动学参数
表14 FC0P130-2给药
表15 TDF给药
5.4.3生物利用度通过灌胃与静脉注射两种给药途径给药后AUC的比较，最后得出FC0P130-2的生物利用度约为25％，TDF的生物利用度约为21％。
6总结
大鼠分别灌胃50mg/kg FC0P130-2和TDF后，母药的生物利用度F分别为25％、21％，FC0P130-2比TDF的生物利用度提高了约4％。两者的活性代谢物替诺福韦的主要动力学参数如下：半衰期(t1/2)分别为：6.905±1.635h，5.915±1.733h；表观分布容积(V)分别为：111.557±13.7L/kg，110.09±31.2L/kg；清除率(CL)分别为：11.769±29L/h/kg，13.347±33.8L/h/kg；Cmax分别为：1171±34.8ug/L，1104.667±42.6ug/L；AUC分别为：4500±1080ug/L*h，4081±1268ug/L*h；MRT分别为：7.312±1.2h，6.527±0.906h。与TDF给药相比，FC0P130-2给药后活性代谢物替诺福韦t1/2延长约1.0个小时，AUC(0-∞)提高约419ug/L*h，Cmax提高约66ug/L。通过比较上述参数可知，FC0P130-2比TDF作用持续时间长，抗病毒活性更强。本实验采用相同药物用量给药，FC0P130-2比TDF分子量大，如果换算成相同摩尔分子给药，FC0P130-2疗效更强。
结论：FC0P130-2与TDF相比，FC0P130-2具有生物利用度高，且在体内代谢的活性代谢物具有更好的药代动力学特征和更强的药效学作用。
实施例11：化合物COP130与CMX157脂溶性大小的测定
比较两种物质脂溶性大小的原理：物质的脂溶性与物质的极性大小相关，物质的极性越大，则该物质的脂溶性越小，物质的极性越小，则该物质的脂溶性越大。各种物质的脂溶性大小的比较，通常通过测定不同物质在一定的条件下，在反向液相色谱图上，保留时间的长短来表征。物质的脂溶性越高，则表现为该物质在反向液相色谱图上，保留时间越长。本发明化合物COP13O和CMX157脂溶性大小的比较就是根据上述的原理来进行的。在色谱条件：色谱柱,Agilent ZorBax SB-C18(250×4.6mm.id.5μm)；流动相,甲醇/水＝95:5(v:v)；检测波长：254nm；流速：1.0ml/min；柱温：30℃下，CMX157的保留时间为1.784分钟，化合物COP13O的保留时间为9.326分钟。根据上述检测，本发明化合物COP13O的脂溶性比CMX157脂溶性高出了5.228倍。这也就是说本发明化合物COP13O的膜透过性是CMX157膜透过性的5.228倍，这自然得出这样的结论：如果原来每天服用CMX157治疗艾滋病或乙型肝炎需5片，若改服化合物COP13O则仅需服1片，就达到同样的效果。患者由于服药量减少到了1/5，则药物对身体的不良反应也减小到了原来的1/5，相应也将产生巨大经济效益和社会效益。
实施例12：制剂配方与工艺
本发明的药物组合物可按通用的口服药物制剂制备方法制成片剂或胶囊，
200mg剂量的本发明化合物片剂或胶囊单位含量如下(mg/片，mg/粒)。
表16
名称 配比/mg
本发明化合物 100mg
乳糖 65mg
淀粉 24mg
微晶纤维素 5mg
羧甲淀粉钠 5mg
硬脂酸鎂 1mg

Claims (10)

1.具有结构(Ia)的替诺福韦双酯化合物，
其盐、其非对映异构体(Ib)及(Ib)的盐，
其中，
m＝0-4，n＝12-16；
R1＝C1-C6烷基。
2.如权利要求1所述的化合物(Ia)及其非对映异构体(Ib)，其特征在于，当m＝1，n＝14(或者m＝0，n＝16)，R1是异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基或环己基时，所优选的化合物结构式为下列结构式：
3.如权利要求1所述的化合物(Ia)的盐及其非对映异构体(Ib)的盐，其特征在于，所述的盐为草酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、天冬氨酸盐、柠檬酸盐、水杨酸盐、盐酸盐、硫酸盐、磷酸盐，酸和(Ia)、(Ib)摩尔比的范围为0.5至1。
4.如权利要求3所述的化合物(Ia)的盐及其非对映异构体(Ib)的盐，其特征在于，当m＝1，n＝14(或者m＝0，n＝16)时，R1是异丙基、乙基、异丁基、新戊基、正丁基或环己基时，所优选的富马酸盐的结构式为下列结构式：
5.一种制备权利要求1-4所述的化合物或其药学上可接受的盐的方法，其特征在于，所述方法的合成路线以下：
其中：m＝0-4，n＝12-16；R1＝C1-C6烷基。
该制备方法包括如下步骤：
a、替诺福韦溶于氯化亚砜中，温度30-90℃，时间10min-3h，减压蒸干加入乙腈，回流0.5-3h后，依次缓慢加入烷氧基烷醇、L-丙氨酸酯、三乙胺，冷却、抽滤，既得化合物(Ⅱ)。
b、拆分：化合物(Ⅱ)加入到乙腈溶液中，搅拌，加入2％的化合物(Ⅰa)晶种，10-25℃搅拌0.5-2h后加入烷氧基烷醇、DBU，低温下搅拌、抽滤得化合物(Ⅰa)。或者使用制备色谱柱，通过间歇洗脱色谱法拆分化合物(Ⅱ)得到异构体(Ⅰa)。
c、化合物(Ⅰa)加入到乙腈溶液中，在60-90℃下，加入富马酸，搅拌0.5-3h,冷却、抽滤，得化合物(Ⅲ)。
6.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有治疗有效量的权利要求1-4中任一项所述的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐和一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物还包含治疗有效量的额外的治疗剂，其中所述额外的治疗剂是抑制HIV蛋白酶的化合物，逆转录酶的HIV非核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷抑制剂，逆转录酶的HIV核苷酸抑制剂，HIV整合酶抑制剂，gp41抑制剂，CXCR4抑制剂，gp120抑制剂，CCR5抑制剂，病毒壳体聚合抑制剂，或非催化部位HIV整合酶部位抑制剂和其组合。
8.如权利要求6-7所述的药物组合物，其特征在于：所述药物组合物的剂型为片剂或胶囊。
9.权利要求1-4中任一项所述的替诺福韦酯化合物或其药学上可接受的盐在制备用于预防或治疗病毒疾病药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，其中病毒疾病为HIV-1或HBV感染或HIV-1与HBV同时感染。
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