CN109182255A - 一种非动物源性树鼩精子体外获能液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种非动物源性树鼩精子体外获能液及其应用，属于动物生殖生物学技术领域，具体步骤为：配制树鼩洗精液和获能液；分离并取出树鼩附睾尾，将附睾尾置于含洗精液的离心管中，孵育10min让精子游出；将精子悬液转移至灭菌后的离心管中，加入洗精液，轻轻混匀，离心；弃上清，再加入洗精液，离心；弃上清，加入获能液重悬精子，使精子的浓度为10×106个/mL；将上述精液分到5ml孵育管中，放入CO2培养箱中培养。本发明方法采用无动物源性成分获能液进行树鼩精子体外获能的操作，避免了体外获能或体外受精系统中引入致病性因子的风险，且易于对获能液进行质控。

Description

一种非动物源性树鼩精子体外获能液及其应用
技术领域
本发明属于动物生殖生物学技术领域，具体地说，涉及一种非动物源性树鼩精子体外获能液及其应用。
背景技术
人及哺乳动物精子在刚射出或从附睾尾部取出时虽然具有运动能力，但还不能立刻和卵细胞结合，需要在雌性生殖道中停留一段时间，发生一系列生理生化变化才具备使卵细胞受精的能力，这种现象称为“精子获能”。大量研究表明，精子获能是所有哺乳动物精子受精前必须经历的一个生理阶段。
早期的精子获能研究，采用体内获能的方法，即从交配后的雌性动物生殖道内取出精子用于受精，借以分析获能的部位、时程及其机制。但这种对体内获能的研究常常受到许多条件的限制，例如，精子在体内总是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在着影响获能的因子，人们很难控制这种复杂的体内环境，因而给研究精子获能带来极大的困难。
为此，体外获能的研究方法应运而生。早期研究精子体外获能通常使用各种动物的体液(如输卵管液、滤泡液和血清)，而这些体液的成分相对复杂，很难确定何种成分参与诱发或支持精子获能。自从Toyoda和Chang最先报道了采用一种特定的化学培养液成功实现体外受精以来，研究精子体外获能已变得相对容易。现在，体外获能技术可以精确地控制实验条件，逐个分析获能及其相关因子，由体外获能的研究结果可以揭示体内获能的本质。最使人类受益的是，体外获能的成功直接导致了目前广泛应用于不育症治疗的试管婴儿技术的诞生。然而，迄今为止，所有动物精子的体外获能，几乎无一例外都需要较高浓度的牛血清白蛋白(BSA)，一般认为，BSA的作用是移除精子膜中的胆固醇，使精子质膜的流动性改变，对Ca2+和HCO3 -的通透性增加，致使精子腺苷酸环化酶活性增强，cAMP的含量升高，精子蛋白酪氨酸磷酸化增加，最终导致精子获能及超激活运动的发生，这些都是精卵正常结合与受精的前提条件。但是，动物源性物质BSA的应用存在潜在的风险，它不仅会给获能或体外受精系统带来一些致病性因子(如病毒、细菌、真菌、朊蛋白等)，而且也不容易对其进行质量控制，故此，有必要进行非动物源性成分获能液的研发。
树鼩隶属于攀鼩目，是外形类似于松鼠的一类小型哺乳动物，尽管人类对树鼩的研究已有200年的历史，但直到20世纪80年代树鼩作为模型动物在生物学方面的研究才引起较多的关注，树鼩在生理解剖、神经发育、心理应激等方面与灵长类，甚至人类高度相似，而且它们还具有体型小、生殖周期短、繁殖快、饲养成本低等特点，被广泛应用于生物学及医学研究的诸多领域。现在，越来越多的有识之士认为树鼩是最有望于替代珍贵的灵长类动物之新型实验动物，开展其精子获能的研究有利于该动物体外受精及人工繁殖技术的发展，但关于树鼩精子获能的研究目前未见报道，而且，非动物源性成分获能液的研发因极富挑战性也未见报道。
发明内容
为克服背景技术中的问题，本发明提供一种树鼩精子体外获能的方法，为了杜绝体外获能或体外受精系统中引入致病性因子的风险，易于对获能液进行质控，本发明方法采用无动物源性成分获能液进行树鼩精子体外获能的操作，为深入研究树鼩精子获能的分子机理奠定坚实基础。
为实现以上目的，本发明是通过如下步骤实施的：
一种非动物源性树鼩精子体外获能液，所述的获能液配方为NaCl 0.6662g/100ml、KCl 0.0236g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lactic acid 185μl、CaCl2·2H2O0.00441g/100ml～0.0441g/100ml、NaHCO3 0.084g/100ml～0.252g/100ml、环糊精0.0655g/100ml～3.0831g/100ml。
应用一种非动物源性树鼩精子体外获能液进行精子体外获能的方法，具体步骤为：
1)洗精液及获能液的配制
分别配制树鼩洗精液和获能液，调节pH至7.3-7.4；
2)精子采集及计数
分离并取出树鼩附睾尾，用精细手术剪在附睾尾上剪几个开口,随后将附睾尾置于含1mL 37℃洗精液的小离心管中,继续于37℃孵育10min让精子游出；
3)精子洗涤
用精细镊子夹出附睾组织，将精子悬液转移至灭菌后的15ml离心管中，加入10ml37℃预热的洗精液，轻轻混匀，800g离心5min；弃上清，再加入10mL的洗精液，800g离心5min；弃上清，加入获能液重悬精子，使精子的浓度为10×106个/mL；
4)体外获能
将上述精液分到5ml孵育管中，每管800μl，放入CO2培养箱中培养。
进一步地，步骤1)中，所述的洗精液配方为NaCl 0.6975g/100ml、KCl 0.0356g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvicacid 0.0011g/100ml、lactic acid 185μl、CaCl2·2H2O 0.0294g/100ml、NaHCO3 0.0168g/100ml、环糊精0.1000g/100ml、Hepes(Na salt)0.1302g/100ml、HepesAcid form 0.1192g/100ml。
进一步地，步骤4)中，CO2培养箱中温度控制为37℃，CO2含量为5％，培养时间为4～10h。
本发明的有益效果：本发明建立了用无动物源性成分获能液使树鼩精子体外获能的方法，本发明中所用溶液均不含动物源性成分，配方合理，杜绝了体外获能或体外受精系统中引入致病性因子的风险，而且易于对获能液或其他培养液进行质控，能使树鼩精子体外获能达到较好的效果。
具体实施方式
实施例1
一种采用非动物源性体外获能液进行树鼩精子体外获能的方法，具体步骤为：
1)洗精液及获能液的配制：分别配制树鼩洗精液和获能液，调节pH至7.3-7.4；所述的洗精液配方为NaCl 0.6975g/100ml、KCl 0.0356g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lacticacid 185μl、CaCl2·2H2O 0.0294g/100ml、NaHCO3 0.0168g/100ml、环糊精0.1000g/100ml、Hepes(Na salt)0.1302g/100ml、HepesAcid form 0.1192g/100ml；所述的获能液配方为NaCl 0.6662g/100ml、KCl 0.0236g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lactic acid 185μl、CaCl2·2H2O0.0294g/100ml、NaHCO3 0.2100g/100ml、环糊精0.1000g/100ml。
2)精子采集及计数
分离并取出树鼩附睾尾，用精细手术剪在附睾尾上剪几个开口,随后将附睾尾置于含1mL 37℃洗精液的小离心管中，继续于37℃孵育10min让精子游出，选择活力在65％以上的精子用于后续步骤；
3)精子洗涤
用精细镊子夹出附睾组织，将精子悬液转移至灭菌后的15ml离心管中，加入10ml37℃预热的洗精液，轻轻混匀，800g离心5min，弃上清；再加入10mL的洗精液，800g离心5min，弃上清，加入获能液重悬精子，使精子的浓度为10×106个/mL；
4)体外获能
将上述精液分到5ml孵育管中，每管800μl，放入CO2培养箱中培养，温度控制为37℃，CO2含量为5％，培养时间为4h。
实施例2
一种采用非动物源性体外获能液进行树鼩精子体外获能的方法，具体步骤为：
1)洗精液及获能液的配制：分别配制树鼩洗精液和获能液，调节pH至7.3-7.4；所述的洗精液配方为NaCl 0.6975g/100ml、KCl 0.0356g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lacticacid 185μl、CaCl2·2H2O 0.0294g/100ml、NaHCO3 0.0168g/100ml、环糊精0.1000g/100ml、Hepes(Na salt)0.1302g/100ml、HepesAcid form 0.1192g/100ml；所述的获能液配方为NaCl 0.6662g/100ml、KCl 0.0236g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lactic acid 185μl、CaCl2·2H2O0.00441g/100ml、NaHCO3 0.252g/100ml、环糊精0.0655g/100ml。
2)精子采集及计数
分离并取出树鼩附睾尾，用精细手术剪在附睾尾上剪几个开口,随后将附睾尾置于含1mL 37℃洗精液的小离心管中，继续于37℃孵育10min让精子游出，选择活力在65％以上的精子用于后续步骤；
3)精子洗涤
用精细镊子夹出附睾组织，将精子悬液转移至灭菌后的15ml离心管中，加入10ml37℃预热的洗精液，轻轻混匀，800g离心5min，弃上清；再加入10mL的洗精液，800g离心5min，弃上清，加入获能液重悬精子，使精子的浓度为10×106个/mL；
4)体外获能
将上述精液分到5ml孵育管中，每管800μl，放入CO2培养箱中培养，温度控制为37℃，CO2含量为5％，培养时间为10h。
实施例3
一种采用非动物源性体外获能液进行树鼩精子体外获能的方法，具体步骤为：
1)洗精液及获能液的配制：分别配制树鼩洗精液和获能液，调节pH至7.3-7.4；所述的洗精液配方为NaCl 0.6975g/100ml、KCl 0.0356g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lacticacid 185μl、CaCl2·2H2O 0.0294g/100ml、NaHCO3 0.0168g/100ml、环糊精0.1000g/100ml、Hepes(Na salt)0.1302g/100ml、HepesAcid form 0.1192g/100ml；所述的获能液配方为NaCl 0.6662g/100ml、KCl 0.0236g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lactic acid 185μl、CaCl2·2H2O0.0441g/100ml、NaHCO3 0.084g/100ml、环糊精3.0831g/100ml。
2)精子采集及计数
分离并取出树鼩附睾尾，用精细手术剪在附睾尾上剪几个开口,随后将附睾尾置于含1mL 37℃洗精液的小离心管中，继续于37℃孵育10min让精子游出，选择活力在65％以上的精子用于后续步骤；
3)精子洗涤
用精细镊子夹出附睾组织，将精子悬液转移至灭菌后的15ml离心管中，加入10ml37℃预热的洗精液，轻轻混匀，800g离心5min，弃上清；再加入10mL的洗精液，800g离心5min，弃上清，加入获能液重悬精子，使精子的浓度为10×106个/mL；
4)体外获能
将上述精液分到5ml孵育管中，每管800μl，放入CO2培养箱中培养，温度控制为37℃，CO2含量为5％，培养时间为8h。
实验分析
按照实施例1-3中的获能液配方构成3个环糊精组，对应的在配方中去除环糊精构成3个对照1，将实施例1-3中的获能液配方中的环糊精替换成BSA构成3个对照2，在相同的操作条件下对树鼩精子进行获能实验，统计精子获能比例，具体数据见表1：
表1各组获能精子比例统计表
注：A,B:同一行数据上标字母不同表示存在极显著差异(P<0.001)。实验重复三次。
a,b,c:同一列数据上标字母不同表示存在显著差异(P<0.05)。实验重复三次。
由上表可以看出，在无环糊精的获能液中，树鼩精子几乎不能完成获能(仅有不到2％的精子可以获能)，而含有BSA或环糊精的获能液能够成功支持树鼩精子获能，获能精子数可达65％左右，与无环糊精的获能液相比差异极显著，且环糊精组与BSA组相比，获能效果无显著差异，说明环糊精完全可以代替动物源性的BSA支持树鼩精子获能，有效杜绝了树鼩体外获能或体外受精系统中引入致病性因子的风险，且易于对获能液进行质控，为深入研究树鼩精子获能的分子机理奠定了坚实基础。
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (4)

1.一种非动物源性树鼩精子体外获能液，其特征在于：所述的获能液配方为NaCl0.6662g/100ml、KCl 0.0236g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lactic acid 185μl、CaCl2·2H2O0.00441g/100ml～0.0441 g/100ml、NaHCO3 0.084g/100ml～0.252 g/100ml、环糊精0.0655g/100ml～3.0831 g/100ml。
2.根据权利要求1所述的一种非动物源性树鼩精子体外获能液的应用，其特征在于：采用所述获能液进行树鼩精子体外获能的方法的具体步骤为：
1）洗精液及获能液的配制
分别配制树鼩洗精液和获能液，调节pH至7.3-7.4；
2）精子采集及计数
分离并取出树鼩附睾尾，用精细手术剪在附睾尾上剪几个开口, 随后将附睾尾置于含1 mL 37 ℃洗精液的小离心管中，继续于37 ℃孵育10min 让精子游出；
3）精子洗涤
用精细镊子夹出附睾组织，将精子悬液转移至灭菌后的15ml离心管中，加入10ml37℃预热的洗精液，轻轻混匀，800g离心5min；弃上清，再加入10mL的洗精液，800g离心5min；弃上清，加入获能液重悬精子，使精子的浓度为10×106个/mL；
4）体外获能
将上述精液分到5ml孵育管中，每管800μl，放入CO2培养箱中培养。
3.根据权利要求2所述的一种非动物源性树鼩精子体外获能液的应用，其特征在于：步骤1）中，所述的洗精液配方为NaCl 0.6975g/100ml、KCl 0.0356g/100ml、MgSO4 0.0143g/100ml、KH2PO4 0.0161g/100ml、Glucose 0.0901g/100ml、pyruvic acid 0.0011g/100ml、lactic acid 185μl、CaCl2·2H2O 0.0294g/100ml、NaHCO3 0.0168g/100ml、环糊精0.1000g/100ml、Hepes(Na salt) 0.1302g/100ml、HepesAcid form 0.1192g/100ml。
4.根据权利要求3所述的一种非动物源性树鼩精子体外获能液的应用，其特征在于：步骤4）中，CO2培养箱中温度控制为37℃，CO2含量为5%，培养时间为4～10h。
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