KR101484084B1 - 안전성이 개선된 암포테리신 b를 함유한 리포좀 제제의 제조방법 - Google Patents

안전성이 개선된 암포테리신 b를 함유한 리포좀 제제의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법, 및 이로부터 제조한 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 따르면, 리포좀에 봉입되지 않은 유리 암포테리신 B가 1% 미만으로 유지되고, 리포좀 내에 암포테리신 B가 안정적으로 봉입됨으로써, 정상세포에 대한 세포독성이 감소되어 안전성이 개선된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 제조할 수 있다.

Description

안전성이 개선된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법 {METHOD FOR PREPARING LIPOSOME PREPARATION CONTAINING AMPHOTERICIN B WITH IMPROVED SAFETY}
본 발명은 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법, 및 이로부터 제조된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제에 관한 것이다. 더 구체적으로는, 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제로서, 유리 암포테리신 B가 1% 미만으로 조절되어 안전성이 개선된 리포좀 제제를 제조하는 방법, 및 이로부터 제조된 리포좀 제제에 관한 것이다.
암포테리신 B는 항진균성 폴리엔(polyene)계 항생제의 일종으로서 스트렙토마이세스 노도수스 M4575(Streptomyces nodosus M4575)에서 생산되며, 양쪽성 성질을 가지는 폴리엔 거대분자(polyene macrolide)로 이루어져 있고, 친수성기인 OH부분과 소수성기인 이중결합이 접합(Conjugated)된 형태의 락톤(lactone) 구조를 갖는 거대 환으로 구성되어져 있다. 암포테리신 B의 구조는, 하기 화학식 I과 같다.
Figure 112013068638111-pat00001
상기 암포테리신 B는 전신성 진균감염, 호중구 감소 환자의 불명열(fever of unknown origin), 면역기능이 있는 성인 및 소아의 내장 리슈마니아증의 1차 치료, 면역결핍환자(HIV양성환자 등)에서 내장 리슈마니아증의 1차 치료에 대한 효능을 지니고 있으며, 세포막에 존재하는 진균의 에르고스테롤(ergosterol)에 작용하여 진균의 사멸 효과를 가진다.
즉, 에르고스테롤은 진균의 세포막에 존재하는 성분으로 세포막 효소(membrane enzyme)들과 이온교환단백질(ion transport protein)의 특이한 기능을 조절하는 역할을 수행하는데, 암포테리신 B의 폴리엔 부위가 이러한 진균 세포막의 에르고스테롤에 결합하여 세포막에 구멍을 형성하여, 세포 밖으로 Mg2 +와 K+가 흘러나오게 함으로써, 세포대사를 교란시켜, 진균이 사멸하는 직접적인 원인을 제공하게 된다.
한편, 포유동물의 세포막에 존재하는 콜레스테롤이 상기 진균 세포막의 에르고스테롤과 구조적으로 매우 비슷하지만 곁사슬이 약간 다르고, 3차원적으로 볼 때 에르고스테롤의 환 구조에서 B링의 이중결합 부분이 약간 더 평면 구조를 띠는 점에서 차이가 있는 바, 암포테리신 B의 폴리엔은, 포유동물 세포막의 콜레스테롤 보다 진균 세포막의 에르고스테롤과 친화력이 더 커서, 진균 세포에서 보다 높은 활성을 나타낸다. 그러나, 에르고스테롤과 콜레스테롤이 구조적으로 매우 유사한 스테롤이라는 점에서, 암포테리신 B는 진균의 숙주인 포유동물의 세포막에 존재하는 콜레스테롤에도 결합함으로써 정상세포와 조직에 대하여 독성을 나타내며, 오한, 발열, 조직괴사, 신독성 및 간독성 등의 부작용을 유발할 수 있다.
암포테리신 B는 물과 알콜에 난용성인 성질을 가지고 있어 정맥주사 등의 약학적 제제로 사용하기 위해서는, 염의 형태로 하거나 마이셀, 마이크로 에멀젼, 또는 리포좀으로 제제화함으로써 가용화하여 사용한다. 특히, 암포테리신 B를 리포좀 제제화할 경우 암포테리신 B의 신독성이 감소되는 장점이 있는 것으로 알려져 있다.
이와 관련하여, 미국특허 제4,981,690호에는 암포테리신 B를 봉입한 리포솜의 제조방법으로서, 인지질과 콜레스테롤을 사용하여 다중막 리포솜 형태로 제조하는 구성이 개시되어 있다. 그러나, 상기 방법은 체내 투여 시 리포좀의 구조가 불안정하기 때문에 쉽게 파괴되어 봉입되어 있던 암포테리신 B가 급격히 방출되는 문제가 있다.
또한, 한국특허공고 1997-0007187에는, 개선된 암포테리신 B 리포좀 제조법에 관한 기술로서, 난용성 암포테리신 B를 가용화하기 위해 산성화시킨 메탄올과 클로로포름의 혼합용매 내에서 암포테리신 B와 음이온성 지질인 포스파티딜글리세롤을 이온결합하고 리포좀을 형성하는 구성이 개시되어 있다. 그러나, 상기 특허는, 리포좀 내로 봉입되지 않은 유리된 암포테리신 B로 인한 독성문제와, 암포테리신 B의 리포좀 내로의 봉입이 완전하지 못하여, 생체내 투여시 정상세포와 조직에 있어서 안전성(safety)의 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은, 리포좀 제조공정중에서 유리 암포테리신 B를 충분히 제거하고, 리포좀내에 암포테리신 B를 안정적으로 봉입함으로써, 안전성이 개선된 리포좀 제제를 연구한 결과, 본 발명을 완성하게 되었다.
미국특허 제4,981,690호(1991. 1. 1. 등록, LIPOSOME-INCORPORATED MEPARTRICIN) 한국공고특허 1997-0007187(1997. 5. 7. 공고, 개선된 암포테리신 B 리포좀 제조법)
본 발명의 목적은, 유리 암포테리신 B를 1% 미만으로 제거하고, 리포좀의 안정성을 개선시켜 생체내에서 암포테리신 B의 과량방출을 억제하는 것을 특징으로 한 리포좀 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 정상 숙주 세포에 대한 독성이 감소됨으로써 안전성이 개선된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 제공하는 것이다.
이러한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법은,
암포테리신 B에 유기용매를 첨가하여 생성된 현탁액을, 포스파티딜글리세롤을 유기용매 및 산에 용해하여 생성된 pH 1~3의 용액과 혼합하여, 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을 생성하는 단계(1단계);
상기 1단계에서 생성된 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을, 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 첨가하여 생성된 용액과 혼합하여 얻은, 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에 염기를 첨가하여 pH 4~5.5로 조절하는 단계(2단계);
상기 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에서 유기용매를 휘산하고, 건조물을 얻는 단계(3단계);
상기 건조물을 완충액으로 수화하여 리포좀 분산액을 얻는 단계(4단계);
상기 리포좀 분산액을 호모게나이저로 균질화 하는 단계(5단계);
상기 균질화된 리포좀 분산액에, 겔 칼럼 크로마토그래피를 적용하여 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계(6단계); 및
여과된 리포좀 분산액을 동결 및 해동시키는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계(7단계);를 포함한다.
상기 유기용매는 클로로포름과 메탄올을 0.5:2~2:0.5의 부피비로 혼합한 혼합용매인 것이 바람직하다.
상기 포스파티딜글리세롤은 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디라우로일포스파티딜글리세롤, 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 포스파티딜콜린은, 수소화대두포스파티딜콜린, 난황포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디팔미토일포스파티딜콜린로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 스테롤은 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 에르고스테롤, 및 라노스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 5단계에 있어서, 균질화는 1,000~1,500bar에서 8회~15회의 범위에서 반복적으로 수행할 수 있다.
상기 6단계에 있어서, 겔 칼럼 크로마토그래피는, 세파덱스 G-25 수지를 매트릭스로 사용할 수 있다.
상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클은, 강온하여 -50~-10℃에서 동결상태를 30분~24시간 유지한 후, 승온하여 55~65℃에서 해동상태를 30분~12시간 유지할 수 있다.
상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클을 3회~10회 반복 수행할 수 있다.
상기 6단계와 7단계 사이, 또는 상기 7단계 직후에, 리포좀 분산액을 여과하는 단계를 수행할 수 있다.
또한, 본 발명은, 다른 양태에 따르면, 상기 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법에 의해 제조된, 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더 상세하게 설명한다.
본 발명의 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법은, 우선, 암포테리신 B를 유기용매에 넣어 현탁액을 제조하고, 이와 별도로, 포스파티딜글리세롤을 용매 및 산 용액에 용해하여 pH 1~3의 용액을 생성하고 나서, 상기 현탁액과 혼합하는 단계(1단계)를 거친다.
상기 유기용매로는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 에테르, 디클로로메탄, 디메틸설폭시드, 및 클로로포름 중에서 1종 이상을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 메탄올과 클로로포름을 혼합하여 사용한다. 메탄올과 클로로포름은 0.5:2~2:0.5의 부피비로 혼합되는 것이 바람직하며, 1:1의 부피비로 혼합되는 것이 보다 바람직하다. 상기 유기용매에 암포테리신 B를 첨가한 후, 750와트 강도의 초음파기를 사용하여 현탁액을 제조한다.
상기 포스파티딜글리세롤로는, 디스테아로일포스파티딜글리세롤, 디미리스토일포스파티딜글리세롤, 디라우로일포스파티딜글리세롤, 및 디팔미토일포스파티딜글리세롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용하는 것이 바람직하며, 디스테아로일포스파티딜글리세롤을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
상기 포스파티딜글리세롤을 유기용매에 용해하면서, 동시에 또는 순차적으로, 산 용액을 넣어 산성조건이 되도록 한 후, 암포테리신 B 함유 현탁액과 혼합하는데, 이는 산성 조건하에서 포스파티딜글리세롤과 암포테리신 B가 강한 이온결합을 형성할 수 있기 때문이다. 상기와 같은 산성조건을 만들기 위한 산으로서는, 염산, 인산, 황산 또는 아세트산 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는, 염산을 사용한다.
즉, 포스파티딜글리세롤을 용해한 용매에 염산을 첨가하여 산성조건을 만드는데, 바람직하게는 pH 1~3이 되도록 하며, 보다 바람직하게는, pH 1.2~1.5가 되도록 한다. 만일, pH 3을 초과하면, 포스파티딜글리세롤과 암포테리신 B가 이온화되지 않아 강한 이온결합을 형성하지 못하여 불투명한 노란색의 현탁 상태가 되며, pH 1 미만이면 암포테리신 B가 분해되는 문제가 있어 바람직하지 못하다. 이때 산성용액의 유지시간은 25~65℃에서 15분 이내로 유지하고 이후 단계로 진행한다. 만약 15분이 초과하게 되면 암포테리신 B가 강한 산성화로 인해 분해되게 된다.
다음으로, 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 넣어 용해한 후, 이전 단계에서 생성된 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액과 혼합하고 나서, 염기를 첨가하여 pH 4~5.5가 되도록 조절하여, 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액을 얻고 나서(2단계), 사용된 용매혼합액을 휘산하고, 건조필름 형태의 건조물을 얻는다(3단계).
포스파티딜콜린 및 스테롤과 같은 지질을 추가함으로써, 리포좀 막의 유동성을 조절하여 리포좀이 보다 안정적으로 유지될 수 있는 효과가 있다. 특별히 한정되지는 않으나, 상기 포스파티딜콜린으로서는, 수소화 대두 포스파티딜콜린, 난황 포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 및 디팔미토일포스파티딜콜린으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있고, 상기 스테롤로서는, 콜레스테롤, 콜레스테롤헥사숙시네이트, 에르고스테롤, 및 라노스테롤로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 사용할 수 있다.
본 발명에서는, 포스파티딜콜린 및 스테롤과 같은 지질류를 첨가하면서, 지질의 산화를 방지하여, 지질의 리포좀 안정화 효과를 극대화하기 위하여, 항산화제를 함께 사용한다. 이때, 사용되는 항산화제로서는 동 기술분야에서 공지된 것을 사용할 수 있다. 예컨대, 비타민 C, 비타민 E, 베타카로틴, 알파토코페릴 폴리에틸렌글리콜 1000 숙시네이트(TPGS), 알파토코페롤 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 알파토코페롤을 사용한다.
상기 2단계에서 사용되는 유기용매로는, 메탄올, 에탄올, 이소프로필알코올, 에테르, 디클로로메탄, 디메틸설폭시드 및 클로로포름 중에서 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 1단계에서 사용된 유기용매와 마찬가지로, 메탄올과 클로로포름을 0.5:2~2:0.5의 부피비로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 용해한 용액과, 1단계에서 생성된 포스파티딜글리세롤 및 암포테리신 B를 함유한 용액을 혼합하면, 투명한 오렌지색의 용액이 얻어지는데, 이 용액에, NaOH 용액과 같은 염기를 첨가하여 pH를, 바람직하게는 pH 4.0~5.5, 보다 바람직하게는 pH 4.0~5.0, 가장 바람직하게는 pH 4.0~4.5로 조절한다. 상기 투명한 오렌지 색의 용액은, 메탄올 및 클로로포름의 혼합용매에, 암포테리신 B가 인지질인 포스파티딜글리세롤과 결합되어 가용화되고, 안정화제로서 포스파티딜콜린 및 스테롤과 같은 지질류가 포함되어 있는 것으로서, 이 용액을, 본 명세서에서, ‘암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액’이라고도 칭한다.
상기 1단계 및 2단계에 있어서, 암포테리신 B:포스파티딜글리세롤:포스파티딜콜린:스테롤은 1:0.5~3:0.5~9:0.5~6의 몰비로 사용될 수 있다. 바람직하게는, 1:1~3:1~9:1~6의 몰비로 사용되고, 보다 바람직하게는, 1:1~2.5:1~6:1~3의 몰비로 사용된다.
상기 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액을, 회전식 용매 증발장치에 담아, 사용된 용매를 휘산하여, 건조 필름 형태의 건조물을 얻게 된다.
그리고 나서, 상기 건조물을 완충액으로 수화하여 리포좀 분산액을 얻는 단계(4단계), 및 상기 리포좀 분산액을 호모게나이저로 균질화 하는 단계(5단계)를 거치게 된다.
본 발명에 있어서, 완충액으로서는, 당류가 포함된 완충액이 사용되며, 특히, 당류가 포함된 숙신산 완충액이 바람직하게 사용된다.
상기 완충액에 포함되는 당류로는, 특별히 제한되지는 않으나, 백당, 락토오스, 말토오스 등이 사용될 수 있고, 바람직하게는, 백당이 사용된다.
상기의 수화 공정은 55~65℃에서 수행되는 것이 바람직하며, 60~65℃에서 수행되는 것이 보다 바람직하다.
상기 수화된 용액을 호모게나이저(homogenizer)로 균질화하는 단계를 통해, 리포좀 입자가 형성되는데, 이때 균질화를 1000~1500bar에서 반복적으로 수행하며, 바람직하게는 8회 이상, 보다 바람직하게는 8회~15회, 가장 바람직하게는 8회~12회를 수행한다.
이처럼, 균질화를 8회 이상 수행하는 것은, 수화(hydration) 공정이 완료된 직후에 생성된 다량의 유연물질을 현저하게 감소시키는 효과가 있다. 상기 다량의 유연물질은 다이머(dimer) 또는 테트라머(tetramer) 형태로 존재하는 암포테리신 B가 대부분이라고 볼 수 있는데, 이러한 유연물질이 적을수록, 리포좀 분산액으로부터 제거되는 유리 암포테리신 B의 양이 적어지고, 이에 따라, 원료 암포테리신 B의 공급량 대비, 최종 생성된 리포좀 제제 내에 봉입된 암포테리신 B의 함량이 증가하게 되므로, 생산효율이 향상되는 효과가 있다.
HPLC(High Performance Liquid Chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피) 분석결과, 수화 공정 후 리포좀 분산액을 균질화기로 반복처리했을 때, 특히, 1,000~1,500bar에서 8회 이상 균질화 처리하는 경우에는, 유연물질의 양이 2% 이하로 감소되는 효과가 있어 바람직하다. 한편, 균질화를 15회 초과하는 경우, 본 발명의 리포좀이 깨질 우려가 있어 적절하지 않다. 또한, 균질화시의 원심분리기의 압력을 2000bar로 5회 이상 균질화하면 강한 압력 때문에 리포좀이 깨지게 되는 문제가 있어 바람직하지 않다.
상기와 같이 리포좀 입자가 형성되어 분산된 리포좀 분산액을, 겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계(6단계)를 거친 후, 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계(7단계)를 수행한다.
한편, 리포좀 분산액을 제균필터로 여과하는 공정을, 상기 6단계와 7단계 사이에, 또는 상기 7단계 직후에 수행할 수 있다.
본 발명자들은, 겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 리포좀 분산액에서 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계와, 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계를 동시에 수행함으로써, 최종적으로 생성된 리포좀 제제의 정상세포에 대한 독성이 현저히 감소되는 효과가 있음을 확인하였다.
상기 겔 칼럼 크로마토그래피 적용시, 겔여과용 담체로서, 시판되는 공지의 겔여과용 담체를 사용할 수 있으며, 본 발명에서는, 특히, 세파덱스(Sephadex) G-25 미세(fine) 수지를 사용함으로써, 유리 암포테리신 B를 99% 이상 제거하는 효과를 얻을 수 있다. 상기 세파덱스 G-25 수지, 또는 이와 동등한 정도의 입자 크기를 갖는 겔여과용 담체를 빈 칼럼에 충진한 후, 당류가 포함된 완충액, 바람직하게는, 수화 공정에서 사용된 것과 동일한 종류의 완충액을 사용하여 칼럼을 세척하고 나서, 균질화 처리된 암포테리신 B를 로딩한 후, 로딩이 완료되면 상기 완충액으로 세척하면서, 칼럼 밖으로 분획된 리포좀 분산액을 수득하게 된다.
그리고 나서, 여과된 리포좀 분산액을 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행함으로써, 리포좀 내로 암포테리신 B가 안정성 있게 봉입되게 되어, 진균류 등의 숙주인 인체 또는 포유동물의 정상 세포에 대한 독성을 효과적으로 감소시킨 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 수득할 수 있다.
특히, 본 발명에서는, 겔 칼럼 크로마토그래피를 적용하는 단계 이후에, 리포좀 분산액을 동결 및 해동하는 사이클을 3회 이상 반복 수행함으로써, 균질화처리에 의해 리포좀 내로 봉입되었던 암포테리신 B가, 다시 불안정한 봉입 상태로 되는 문제도 해결하는 효과가 있다.
상기 동결 및 해동하는 사이클은, 겔 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 유리 암포테리신 B를 제거하거나 또는 리포좀 분산액을 제균필터로 여과한 상태의 온도인 20~40℃에서, 0.1~5℃/min 속도로 강온하여 -50~-10℃에서 동결상태를 30분~24시간 유지한 후, 승온하여 55~65℃에서 해동상태를 30분~12시간 유지하는 사이클을 3회 이상 반복하는 것이 바람직하다. 특히, 본 발명에 있어서, 포스파티딜글리세롤로서 디스테아로일포스파티딜글리세롤을 사용하는 경우에, 60~65℃로 승온하고, 60~65℃의 해동상태를 30분~12시간, 보다 바람직하게는 30분~6시간 동안 유지하는 것이 바람직하다. 해동시의 온도가 55℃ 미만이면, 리포좀 내로 암포테리신 B가 안정적으로 봉입된 리포좀 형성이 불충분하며, 65℃를 초과하면, 리포좀 막이 파괴되어 숙주세포에 대한 세포독성이 증가하는 문제가 있어 바람직하지 않다.
동결 및 해동하는 사이클은 3회 이상, 바람직하게는, 3회~7회, 보다 바람직하게는 3회~5회 반복한다. 이때, 상기 사이클이 3회 미만인 경우에는, 리포좀 내로 암포테리신 B가 안정적으로 봉입됨으로써 발생하는 세포독성의 감소 효과를 충분히 얻을 수 없으며, 상기 사이클이 7회를 초과하는 경우에는, 공정소요시간의 장기화로 오염에 의한 이물질의 혼입 가능성이 커져 바람직하지 않다.
상기와 같은 제조방법에 따라 제조된 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제는, 진균류의 숙주에 해당하는 포유동물의 정상세포에 대한 독성이 현저하게 감소하였을 뿐만 아니라, 진균 감염을 치료하는 데에 있어서, 종래 공지된 리포좀 제제, 예컨대, 암비솜(AmBisome) 주사와 비교했을 때, 동등 이상의 치료 효과를 발휘함을 확인하였다.
본 발명의 제조방법에 따라 제조된 리포좀 제제는 정맥주사제, 경피, 경비, 및 폐로의 약물송달에 사용될 수 있다. 이러한 제제화에 필요한 기술 및 약제학적으로 적절한 담체, 첨가제 등에 관해서는, 당해 제제학 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 널리 알려져 있는 것을 사용할 수 있다.
본 발명의 리포좀 제제의 투여량은, 통상 약학적으로 허용되는 양으로 투여될 수 있으나, 치료되는 상태 또는 대상 질환, 예컨대, 전신성 진균 감염, 호중구 감소 환자의 불명열, 내장리슈마니아증 등을 고려하여 조정된 용량이 투여될 수 있으며, 바람직하게는 체중 1kg당 0.01~10mg(역가)/day, 보다 바람직하게는 0.05~5mg(역가)/day, 가장 바람직하게는 1~5mg(역가)/day의 범위에서 투여될 수 있다.
본 발명에 따르면, 리포좀 제제내에서 유리 암포테리신 B가 1% 미만으로 존재하면서, 암포테리신 B가 리포좀 내에 안정적으로 봉입될 수 있어, 생체내 안전성이 증가한 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 얻을 수 있다.
본 발명에 따르면, 숙주의 정상세포에 대한 세포독성이 현저하게 감소한 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제를 얻을 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 제조방법에 따른 실시예 1, 비교예 1, 및 대조군으로서 암비솜(AmBisome, Gilead Sciences)약물을 마우스 모델에 단일투여하여 독성시험한 결과를 나타내는 치사량(%) 그래프이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 따른 실시예 1, 비교예 1, 및 대조군으로서 암비솜(AmBisome, Gilead Sciences)약물을 각각 처리한 SAEC(Small Airway Epithelial Cell)의 MTT 어세이 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 제조방법에 따른 실시예 1, 비교예 1, 및 대조군으로서 암비솜 약물을 토끼의 탈 섬유세포(RBC)에 처리한 용혈시험 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 제조방법에 따른 공정 중 수화 공정 직후의 유연물질의 정도(a)와, 균질화 처리 공정의 반복 횟수에 따른, 즉, 비교예 7(b), 실시예 1(c), 실시예 4(d)에 따른 유연물질의 감소 정도를 HPLC 분석을 통해 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을, 바람직한 실시예를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 암포테리신 B를 함유한 리포좀의 제조
암포테리신 B(노스차이나 파마슈티컬사) 10g을 클로로포름과 메탄올이 동일한 부피로 혼합된 용매혼합액 240ml에 넣고 750와트 강도의 초음파기(VCX-750, 바이오소닉사, 미국)로 미세현탁액을 만든다. 새로운 용기에 16.8g의 디스테아로일포스파티딜글리세롤(리포이드사)을 칭량하고, 클로로포름과 메탄올이 동일한 부피로 혼합된 용매혼합액 210ml와 2.5M HCl 용액 8ml에 가한 후 65℃에서 녹인다. 상기 암포테리신 B 미세현탁액을 디스테아로일포스파티딜글리세롤 용액에 혼합하여 맑은 오렌지색의 용액을 얻었다. 이때의 반응시간은 15분 이내로 조절하여, 산성조건에서 불안정한 암포테리신 B의 분해를 최소화하였다.
별도로, 수소화대두포스파티딜콜린(리포이드사) 42.6g, 콜레스테롤(일본정유사) 10.4g과 알파-토코페롤 0.128g을 칭량하여 210ml의 용매혼합액을 넣어 65℃에서 녹인 다음, 위에서 제조된 오렌지색의 용액과 혼합하여 투명한 오렌지 색의 용액을 얻는다. 이 용액에 추가적으로 4.64ml의 2.5M NaOH 용액을 첨가하여 pH를 약 4.5로 하고, pH를 4.5로 조절한 용액을 회전식용매증발장치(Buchi)에 담아 용매를 휘산하였다.
용매가 휘산된 건조물에 9%(w/v%)의 백당이 포함된 10mM 숙신산 수용액 2000mL(백당 180g에 수용액 2000mL이면 9%가 되고 숙신산 5.4g/2000mL이면 10mM임)를 넣어 65℃에서 3시간(180분) 동안 수화시켰다. 생성된 수화물을, 호모게나이저(SPX-2000)를 사용하여 8회 동안 반복적으로 균질화처리하여, 리포좀 입자가 형성된 분산액을 수득하였다.
그리고나서, 수득된 리포좀 분산액을 sephadex G-25 fine(GE Healthcare) 수지 100g이 패킹되어 있는 칼럼에 로딩하여 노란색으로 형성된 띠부분을 분획한 후, 분획된 리포좀 분산액을 50℃로 가열하고, 0.2um의 제균필터로 여과한다.
이후, 여과된 리포좀 분산액을 20℃에서 0.5℃/분 속도로 -40℃로 냉각하여 -40℃에서 동결상태를 30분간 유지한 후, 0.5℃/분 속도로 65℃까지 승온하여 65℃에서 해동상태를 30분간 유지한 후, 다시 -40℃로 동결 및 65℃로 해동하는 과정을 총 3회 반복한다.
실시예 2~실시예 3, 및 비교예 1~비교예 6: 암포테리신 B를 함유한 리포좀의 제조
상기 실시예 1과 동일하게 제조하되, 동결 및 해동처리 단계의 조건을 하기 표 1와 같이 달리하여, 실시예 2 및 실시예 3의 리포좀 제제를 제조하였다.
또한, 비교예 1로서, 실시예 1과 동일하게 제조하되, sephadex G-25수지를 이용한 겔 칼럼 크로마토그래피 단계를 실시하지 않고, 동결 및 해동을 반복하는 단계를 실시하지 않은 것만을 달리하여, 리포좀 제제를 제조하였다.
또한, 비교예 2~6으로서, 실시예 1과 동일하게 제조하되, sephadex G-25수지를 이용한 겔 칼럼 크로마토그래피 단계 및/또는 동결 및 해동을 반복하는 단계를, 하기 표 1과 같이, 실시예 1과 달리하여, 리포좀 제제를 제조하였다.
구분 G-25
칼럼
크로마토
그래피
단계		 동결-해동 단계 동결시
온도 및 유지시간		 해동시
온도 및 유지시간		 강온 및 승온
속도
(℃/min)		 동결 및
해동
처리의
반복 횟수
(회)
온도(℃) 시간(min) 온도(℃) 시간(min)
실시예 1 ○ ○ -40 30 65 30 0.5 3
실시예 2 ○ ○ -40 30 65 30 0.5 5
실시예 3 ○ ○ -20 60 60 60 0.5 3
비교예 1 X X - - - - - -
비교예 2 ○ X - - - - - -
비교예 3 X ○ -40 30 65 30 0.5 3
비교예 4 ○ ○ -40 30 65 30 0.5 2
비교예 5 ○ ○ -40 120 65 120 0.5 1
비교예 6 ○ ○ -40 30 70 30 0.5 3
실시예 4 및 비교예 7: 암포테리신 B를 함유한 리포좀의 제조
실시예 4는, 실시예 1과 동일하게 제조하되, 균질화처리 단계에서 균질화 반복 정도를 총 12회 수행하여, 암포테리신 B를 함유한 리포좀을 제조하였다.
한편, 비교예 7은, 실시예 1과 동일하게 제조하되, 균질화처리 단계에서 균질화 반복 정도를 총 5회 수행하여, 암포테리신 B를 함유한 리포좀을 제조하였다.
< 시험예 1> 동물모델에서의 단일투여 독성시험( LD 50 )
8주령의 ICR 웅성 마우스를 5마리씩 30그룹으로 나누었다. 상기 마우스의 꼬리정맥으로 실시예 1~3, 및 비교예 1~6에서 제조된 리포좀 제제와 양성대조군으로서 암비솜(AmBisome, Gilead Sciences)을 각각 50, 75, 100mg/kg의 용량으로 투여하였고, 비교예 1~7에서 제조된 리포좀 제제를 10, 20, 30mg/kg의 용량으로 투여하였다(Probit법). 투여 볼륨은 12mL/kg으로 하였다.
구분 생존율(%)
0 1일 2일 3일 4일 7일 14일
실시예 1 50 100 100 100 100 100 100 100
75 100 80 80 80 80 80 80
100 100 80 40 40 40 0 0
실시예 2 50 100 100 100 100 100 100 100
75 100 100 80 80 80 80 80
100 100 80 60 40 40 0 0
실시예 3 50 100 100 100 100 100 100 100
75 100 80 80 80 80 80 80
100 100 80 40 40 40 0 0
비교예 1 10 100 100 80 80 80 80 80
20 100 60 60 20 0 0 0
30 100 0 0 0 0 0 0
비교예 2 10 100 100 100 80 80 80 80
20 100 60 60 20 20 0 0
30 100 20 0 0 0 0 0
비교예 3 10 100 100 100 100 80 80 80
20 100 60 60 60 20 20 20
30 100 40 20 20 0 0 0
비교예 4 10 100 100 100 100 80 80 80
20 100 60 40 40 20 20 20
30 100 20 20 0 0 0 0
비교예 5 10 100 100 100 80 80 80 80
20 100 80 40 40 20 0 0
30 100 20 20 0 0 0 0
비교예 6 10 100 80 80 60 60 60 60
20 100 40 20 0 0 0 0
30 100 0 0 0 0 0 0
AmBisome 50 100 100 100 100 100 100 100
75 100 100 60 60 60 60 60
100 100 60 0 0 0 0 0
상기 표 2의 시험결과 중, 실시예 1, 비교예 1 및 대조군인 암비솜에 대해서는, 치사량(%) 시험 그래프를 도 1에 도시하였다.
상기 표 2 및 도 1을 통해, 본 발명의 제조방법과 같이, sephadex G-25수지를 이용한 겔 칼럼 크로마토그래피 단계와 동결 및 해동을 반복하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 실시예 1 내지 실시예 3의 리포좀 제제가, 겔 칼럼 크로마토그래피 단계 및/또는 동결 및 해동 공정을 3회 이상 반복하는 단계를 거치지 않은 비교예 1 내지 비교예 5의 리포좀 제제나, 대조군으로 사용된 암비솜 주사에 비하여, 독성이 감소한 효과가 있음을 확인하였다.
또한, 비교예 6과 같이, 본 발명의 해동시의 온도 상한값인 65℃를 초과하여, 70℃에서 30분 동안 유지하는 경우에는, 리포좀이 파괴되어 암포테리신 B가 안정적으로 리포좀 내에 봉입되지 못하는 현상으로 인해, 독성이 높은 점을 확인하였다.
< 시험예 2> 세포독성 시험
96 well plate에 SAEC(Small Airway Epithelial Cell)를 씨딩(seeding)하고 2시간 안정화시킨 후, 2, 4, 8, 16, 32μg/ml의 농도로 실시예 1, 및 비교예 1의 리포좀 제제와 암비솜(AmBisome, Gilead Sciences) 약물을 처리하였다. 약물을 처리하고 나서 24시간이 경과한 후에 MTT 어세이를 진행한 후, 그 결과를 도 2에 세포생존율(survival(%))로 나타내었다. 상기 도 2에서 확인되는 바와 같이, 실시예 1의 리포좀 제제는, 약물의 농도가 높을수록, 비교예 1 및 대조군인 암비솜에 비하여, 세포독성이 감소하였다.
< 시험예 3> 용혈( hemolysis )시험
PBS를 사용하여 각각의 농도별로 희석된 샘플 10ml에 토끼의 탈 섬유세포(RBC) 0.2mL를 첨가하여 37℃에서 4시간 반을 유지시킨 후, 3,000rpm에서 15분간 원심분리하고 상층액을 576nm에서 흡광도를 측정하여 용혈율을 확인하고, 이를, 도 3에 도시하였다. 도 3에서의 용혈율(%)은 다음의 기준에 따라 판정하였다.
용혈율(%) 판정
용혈율≤2 비용혈
2<용혈율≤10 경도의 용혈성 있음
10<용혈율≤20 중등도의 용혈성 있음
20<용혈율≤40 강한 용혈성 있음
40<용혈율 대단히 강한 용혈성 있음
도 3을 살펴보면, 30~40ug/mL의 농도에서, 실시예 1의 리포좀 제제는 비용혈을 나타내는 반면, 비교예 1의 리포좀 제제는 경도의 용혈성을 나타내었고, 40ug/mL 이상의 농도에서도, 비교예 1의 리포좀 제제의 용혈율이 실시예 1의 리포좀 제제 대비 약 170~250% 이고, 암비솜의 용혈율이 실시예 1의 리포좀 제제 대비 최대 약 180% 정도로, 실시예 1의 세포독성이 비교예 또는 암비솜에 비해 감소되었음이 확인되었다.
<시험예 4> 균질화 처리 횟수에 따른 유연물질의 감소 확인 시험
실시예 1, 및 4와, 비교예 7에서 수화공정을 통하여 생성된 수화물을, HPLC(High Performace Liquid Chromatography, 고성능 액체 크로마토그래피)로 분석하였다.
검출기 : 자외부흡광광도계 (측정파장 405 nm),
칼럼 : 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 250 mm인 스테인레스강관에 5 μm의 액체크로마토그래프용 옥타데실실릴실리카겔을 충전한다.
이동상 : 메탄올ㆍ2.5 mol/L 에틸렌디아민테트라아세트산이수소디나트륨용액ㆍ아세토니트릴 혼합액(50 : 30 : 25)
유량 : 1.5 mL/분
도 4.(a) 내지 (d)의 HPLC 분석 프로파일에서 확인되는 바와 같이, 수화공정 직후에, 미지의 유연물질이 HPLC의 전체 피크 면적(peak area)의 15~20%로 생성되었으나, 실시예 1, 및 4에서처럼, 수화물을 균질화기로 1,000bar에서 8회, 및 12회 균질화 처리했을 때, 미지의 유연물질이 각각 HPLC의 전체 피크 면적(peak area)의 1~2%, 및 0.1~1% 정도로 감소되는 효과가 있는 반면, 비교예 7과 같이, 5회 균질화처리시 미지의 유연물질은 4~5%정도 였다. 따라서, 본 발명의 제조방법에 있어서, 균질화처리를 8회 이상 수행하는 것이 유연물질을 감소시키는데 유리한 효과가 있는 점이 확인되었다.

Claims (8)

  1. 암포테리신 B를 유기용매에 첨가하여 생성된 현탁액을, 포스파티딜글리세롤을 유기용매 및 산에 용해하여 생성된 pH 1~3의 용액과 혼합하여, 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을 생성하는 단계(1단계);
    상기 암포테리신 B와 포스파티딜글리세롤을 함유한 용액을, 포스파티딜콜린, 스테롤, 및 항산화제를 유기용매에 첨가하여 생성된 용액과 혼합하여 얻은, 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에, 염기를 첨가하여 pH 4~5.5로 조절하는 단계;
    상기 암포테리신 B와 지질 복합체를 함유한 용액에서 유기용매를 휘산하고, 건조물을 얻는 단계(3단계);
    상기 건조물을 완충액으로 수화하여 리포좀 분산액을 얻는 단계(4단계);
    상기 리포좀 분산액을 호모게나이저로 균질화하는 단계(5단계);
    상기 균질화된 리포좀 분산액에, 겔 칼럼 크로마토그래피를 적용하여 유리 암포테리신 B를 제거하는 단계(6단계); 및
    여과된 리포좀 분산액을 동결 및 해동시키는 사이클을 3회 이상 반복 수행하는 단계(7단계);를 포함하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 5단계에 있어서, 균질화는 1,000~1,500bar에서 8회~15회의 범위에서 반복적으로 수행되는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 6단계에 있어서, 겔 칼럼 크로마토그래피는, 세파덱스 G-25 수지를 매트릭스로 사용한 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클은, 강온하여 -50~-10℃에서 동결상태를 30분~24시간 유지한 후, 승온하여 55~65℃에서 해동상태를 30분~12시간 유지하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 7단계에 있어서, 동결 및 해동하는 사이클을 3회~7회 반복 수행하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 6단계와 7단계 사이, 또는, 상기 7단계 직후에, 리포좀 분산액을 여과하는 단계를 수행하는 것을 특징으로 하는 암포테리신 B를 함유한 리포좀 제제의 제조방법.
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  8. 삭제
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109589278A (zh) * 2018-10-10 2019-04-09 昆明贝泰妮生物科技有限公司 高稳定青刺果油脂质体的制备工艺及其在化妆品中的应用
KR102655185B1 (ko) * 2023-10-06 2024-04-05 (주)큐러블 암포테리신 b를 함유하는 지질코어의 제조방법 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766046A (en) * 1985-09-27 1988-08-23 Liposome Technology, Inc. Stabilized liposome/amphotericin composition and method

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4766046A (en) * 1985-09-27 1988-08-23 Liposome Technology, Inc. Stabilized liposome/amphotericin composition and method

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109589278A (zh) * 2018-10-10 2019-04-09 昆明贝泰妮生物科技有限公司 高稳定青刺果油脂质体的制备工艺及其在化妆品中的应用
KR102655185B1 (ko) * 2023-10-06 2024-04-05 (주)큐러블 암포테리신 b를 함유하는 지질코어의 제조방법 및 이의 용도

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