CZ2002140A3

CZ2002140A3 - Neutrální lipopolymer a lipozomové kompozice, které jej obsahují

Info

Publication number: CZ2002140A3
Application number: CZ2002140A
Authority: CZ
Inventors: Samuel Zalipsky
Original assignee: Alza Corporation
Priority date: 1999-07-14
Filing date: 2000-07-12
Publication date: 2002-05-15
Also published as: PT1198490E; ES2255501T3; HK1048484B; DE60026030D1; HK1048484A1; WO2001005873A1; BR0012443A; EP1198490A1; IL147564A; HUP0202177A3; KR100758158B1; IL147564A0; DK1198490T3; PL352711A1; RU2250911C2; DE60026030T2; CN1360611A; CA2379060A1; NO20020175D0; KR20020012008A

Description

Neutrální lipopolymer a lipozomové kompozice, které jej obsahuj í

Oblast techniky

Tento vynález se týká neutrálních lipopolymerů substituovaných PEG a jejich užití v lipozomech s prodlouženou cirkulační dobou. Lipozomy obsahující tyto lipopolymery vykazují podobné doby cirkulace v krvi jako lipozomy, jež obsahují obvyklé fosfolipidy substituované PEG se záporným nábojem.

Dosavadní stav techniky

Lipozomy se užívají pro různé terapeutické účely a zvláště pro dodávku terapeutických činidel do cílových buněk při systémovém podávání lipozomových formulací těchto činidel. Je výhodné, že lékové formulace obsahující lipozomy dávají možnost lepších dodávkových vlastností léků včetně například řízeného uvolňování léku. Delší doba cirkulace v krvi se často od lipozomů vyžaduje v zájmu dosažení cílové oblasti, buňky nebo místa. Zvláště je potřebná, když cílová oblast, buňka nebo místo nejsou umístěny v blízkosti místa vpichu injekce. Například když se lipozomy podávají systémově, je potřebné povléci je hydrofilním činidlem, například sloučeninou s polymerním řetězcem jaký má polyethylenglykol (PEG) za účelem prodloužení životnosti lipozomů při cirkulaci v krvi. Tyto povrchově modifikované lipozomy se běžně nazývají lipozomy s dlouhou cirkulací nebo stericky stabilizované lipozomy.

Nejběžnější taková povrchová úprava lipozomů je připojení řetězců PEG s typickou relativní molekulovou hmotností od asi 1 000 daltonů (Da) do asi 5 000 Da k přibližně 5 % molárních lipidů obsažených v lipozomech (viz například Stealth Liposomes, CRC Press, Lasic D. a Martin F. (vyd.), Boča Raton, FL, (1995) a tam citované odkazy).

• · · ··

Farmakokinetika těchto lipozomů se vyznačuje na dávce nezávislým snížením absorpce lipozomů játry a slezinou prostřednictvím systému mononukleárních fagocytů (MPS) a významně prodlouženou dobou cirkulace v krvi ve srovnání s lipozomy povrchově neupravenými, kde je tendence k rychlému odstraňování lipozomů z krve a jejich ukládání v játrech a slezině.

Nej častěji užívané a komerčně dostupně fosfolipidy substituované PEG jsou na bázi fosfatidylethanolaminů (PE), obvykle DSPE (distearoylfosfatidylethanolamin), který nese na čelní skupině negativní náboj. Negativní náboj na povrchu lipozomů může být v některých ohledech nevýhodou, například při interakcích s buňkami (viz například Miller a další, Biochemistry, sv. 34, ss. 12 875-12 883 (1998)) a při dodávce kationtových léků, protože může dojít k úniku léku (viz například Webb a další, Biochim. Biophys. Acta, 1372, ss. 272-282 (1998)) .

Bylo by tedy. prospěšné získat lipidy substituované PEG bez náboje, účinně je vnést do lipidových dvojných vrstev a vytvořit tak lipozomy s dlouhou cirkulací v krvi. V ideálním případě by tyto lipidy nebyly toxické a snadno by se vyráběly.

Podstata vynálezu

V jednom ohledu obsahuje tento vynález lipozomovou kompozici s přibližně 1 až 10 molárními procenty neutrálního lipopolymeru, přičemž neutrální lipopolymer představuje vzorec:

O-fc-R¹

O •··· ·· ··

přičemž :

R¹ i R² představují alkylový nebo alkenylový řetězec s asi 8 až asi 24 uhlíkovými atomy;

n je mezi asi 10 a asi 300,

Z se vybere ze skupiny substituentů, kterou tvoří hydroxy, alkoxy, benzyloxy, ester karboxylové kyseliny, ester sulfonové kyseliny, alkyl nebo arylkarbonát, amino a alkylamino; a

L se vybere ze skupiny, kterou tvoří (i) -X-(C=0)-YCH₂-, (ii)-X-(C=O)- a (iii) -X-CH2-, kde X a Y se nezávisle vyberou z kyslíku, NH a přímé vazby. Je výhodné, když tato kompozice zahrnuje od asi 3 do asi 6 molárních procent neutrálního lipopolymeru.

V jiném aspektu je L hydrolyzovatelná vazba jako karbamátová vazba, esterová vazba nebo karbonátová vazba. V ještě dalším aspektu je Z hydroxy nebo methoxyskupina. Je výhodné, když R_x a R₂ nejsou rozvětvené. V jednom aspektu jsou jak R_x tak R₂ stearylskupiny (C₁₇H₃₅) . V dalším aspektu je hodnota n výhodně mezi asi 20 a asi 115, tak aby relativní molekulová hmotnost skupiny PEG byla mezi asi 1 000 Da a asi 5 000 Da.

Vynález též poskytuje způsob prodloužení doby cirkulace lipozomu obsahujícího lipidy tvořící váčky v krvi vnesením do lipozomu asi 1 molárního procenta až asi 10 molárních procent neutrálního lipopolymeru s výše uvedeným vzorcem. Vynález též nabízí lipopolymery představované tímto vzorcem.

I. Definice:

Zde používaný termín neutrální lipopolymer se týká lipopolymeru bez náboje, to znamená takového, který nemá iontový charakter.

Lipidy tvořící váčky se týkají amfipatických lipidů s hydrofobními a polárními strukturními částmi nesoucími polární čelní skupinu. Takové lipidy tvořící váčky mohou ve • ••fc · · fcfcfcfc fcfc · · • · « · · · · · • fcfcfc fcfc · • fcfc * fcfcfc · · • fc fcfc fcfc fcfcfcfc vodě spontánně vytvářet dvouvrstvé váčky jako v případě fosfolipidů, nebo se mohou stabilně začlenit do lipidových dvojných vrstev, přičemž je hydrofobní část v dotyku s vnitřní, to znamená jednou hydrofobní oblastí dvouvrstvé membrány a část s polární čelní skupinou se orientuje na vnější, to znamená polární povrch membrány. Třída lipidů tvořících váčky tohoto typu typicky zahrnuje jeden nebo dva hydrofobní acyluhlovodíkové řetězce nebo steroidní skupinu a může obsahovat chemicky reaktivní skupinu (jako například amin, kyselinu, ester, aldehyd nebo alkohol) na polární čelní skupině. V této třídě jsou zahrnuty fosfolipidy jako fosfatidylcholin (PC), fosfatidylethanolamin (PE), fosfatidová kyselina (PA), fosfatidylinositol (Pl) a sfingomylelin(SM), ve kterých uvedené dva uhlovodíkové řetězce mají typicky asi 14 až asi 22 uhlíkových atomů a různé stupně nenasyceností. Další lipidy tvořící váčky zahrnují glykolipidy jako jsou cerebrosidy, gangliosidy a steroly jako cholesterol. Pro zde popsané kompozice jsou výhodnými složkami fosfolipidy jako PC a PE, cholesterol, a neutrální lipopolymery.

Alkyl se týká plně nasycených jednomocných radikálů obsahujících uhlík a vodík, jež mohou mít rozvětvený nebo přímý řetězec. Příklady alkylových skupin představují methyl, ethyl, n-butyl, terc-butyl, n-heptyl a isopropyl. Nižší alkyly se týkají alkylového radikálu obsahujícího od asi jednoho do asi šesti uhlíkových atomů, jaké představuje například methyl, ethyl, n-butyl, iso-butyl, terc-butyl, izoamyl, n-pentyl a izopentyl.

Alkenyl se týká jednomocného radikálu obsahujícího uhlík a vodík, který může mít rozvětvený nebo přímý řetězec a obsahuje nejméně jednu dvojnou vazbu.

Zkratky: PEG: polyethylenglykol; mPEG:

polyethylenglykol zakončený methoxylem; Chol: cholesterol;

PC: fosfatidylcholin; PHPC: částečně hydrogenovaný • · · ·

Φ· ·· φφφ fosfatidylcholin; PHEPC: částečně hydrogenovaný vaječný fosfatidylcholin; HSPC: hydrogenovaný sojový fosfatidylcholin; DSPE: distearoylfosfatidylethanolamin;

DSP: nebo PEG-c-DS: distearoylPEG s karbamátovou vazbou;

APD: 1-amino-2,3-propandiol; DTPA:

diethylentetraminpentaoctová kyselina; Bn: benzyl.

II. Neutrální lipolymery:

Neutrální lipopolymery substituované PEG podle vynálezu mají tuto strukturu:

o

O-fc-R¹

přičemž:

R¹ i R² vykazují alkylový nebo alkenylový řetězec s asi 8 až asi 24 uhlíkovými atomy;

n je mezi asi 10 a asi 300,

L se vybere ze skupiny, kterou tvoří (i) -X-(C=O)-YCH₂-, (ii)-X-(C=O)- a (iii) -X-CH₂-, kde X a Y se nezávisle vyberou z kyslíku, NH a přímé vazby.

Lipopolymery zahrnují neutrální vazbu (L) místo nabité fosfátové vazby PEG-fosfolipidů jako je PEG-DSPE, často používaných ve stericky stabilizovaných lipozomech. Tato neutrální vazba se typicky vybere ze skupiny karbamát, ester, amid, karbonát, močovina, amin a ether.

Hydrolyzovatelné nebo jinak štěpitelné vazby jako karbamáty, karbonáty a estery jsou preferovány v aplikacích, kde je žádoucí po ukončené době cirkulace in vivo odstranit řetězce • · · · · · · · · · f · · · • · ♦ · · « · φ · · · · · ···· · » · · ·

PEG. Taková možnost může být užitečná při uvolňování léku nebo pro usnadnění jeho absorpce buňkami poté, co lipozora dosáhl svého cíle (Martin a další, Patent US 5 891 468, Zalipsky a další, zvěř. PCT přihláška WO 98/18813 (1998)).

Skupina PEG připojená k vazebné skupině má výhodně relativní molekulovou hmotnost od asi 1 000 Da do asi 15 000 Da, kde n je mezi asi 20 a asi 340. Výhodnější je, když je relativní molekulová hmotnost od asi 1 000 Da do asi 12 000 Da (n = asi 20 až asi 275) a nejvýhodnější mezi asi 1 000 Da do asi 5 000 Da (n = asi 20 až asi 115) . R¹ á R² mají typicky od asi 8 do asi 24 uhlíkových atomů a výhodně mají délku asi 16 až asi 20 uhlíkových atomů. Nejvýhodnější je, když R¹ =· R²= C17H35, takže COOR je stearyl skupina.

Jak výše uvedeno, vnesení nenabitého lipidu do lipozomu může přinést značné výhody jako je snížená možnost úniku opouzdřeného kationtového léku. Další výhodou je zvýšená pružnost při modulování interakcí povrchu lipozomu s cílovými buňkami a s RES (Miller a další, Biochemistry, sv. 37, ss. 12 875-12 883 (1998)). Jako nenabitých složek stericky stabilizovaných lipozomu se užilo syntetických ceramidů substituovaných PEG (Webb a další, Biochim.

Biophys. Acta, sv. 1372, ss. 272-282 (1998)); tyto molekuly však jsou složité a preparačně nákladné a zpravidla se neumístí do fosfolipidové dvojné vrstvy tak dobře jako diacylglycerofosfolipidy.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 ukazuje schéma syntézy lipopolymeru bez náboje s vázaným karbamátem, zde označovaného jako PEG-c-DS;

Obrázky 2A-2D ukazují schéma syntézy nenabitých lipopolymerů s etherovou, esterovou a ketonovou vazbou.

Obrázky 3A-3C jsou grafy ukazující biodistribuci lipozomů HSPC/Chol obsahujících 3 molární procenta PEG-c-DS (A), 5 molárních procent PEG-DSPE (B) nebo 5 molárních ·· ·· procent PEG-c-DS (C) v krvi, játrech a slezině;

Obrázek 4 je graf ukazující retenci v krvi lipozomú HSPC (poměr 2:1) bez PEG (křížky), to znamená žádný PEG, 5 molárních procent PEG-DSPE (trojúhelníky) a 5 molárních procent PEG-c-DS (kroužky) a

Obrázek 5 ukazuje retenci v krvi lipozomú PHEPC obsahujících 5 molárních procent PEG-c-DS (kroužky) a 5 molárních procent PEG-DSPE (čtverečky) .

Lipopolymery se mohou připravovat za použití standardních syntetických způsobů. Například sloučenina vázaná na karbamát (L = -0 (C=0)-NH-CH₂-) se připravuje, jak ukazuje obrázek 1, reakcí terminálnihoshydroxylu mPEG (methoxy-PEG) s p-nitrofenylchloroformátem za vzniku pnitrofenylkarbonátu. Tento produkt potom reaguje s 1-amino2.3- propandiolem a získá se meziproduktový karbamát. Hydroxylové skupiny diolu se acylují a získá se finální produkt. Podobná syntéza za použití glycerolu místo 1-amino2.3- propandiolu se může použít při přípravě produktu . vázaného na karbonát (L = -0-(C=0)-O-CH₂-) . V příkladu 1 se též popisuje příprava distearoyl- a diekosanoyllipopolymerů.

Jak ukazuje obrázek 2A, lipopolymer vázaný na ether (L = -0-CH₂-) se připravuje reakcí koncového hydroxylu mPEGOH s glycidylchloridem, hydrolýzou výsledného epoxidu a acylací výsledného diolu. Lipopolymery vázané na estery (L = -0-(C=0)- nebo -O-(C=0)-CH₂-) se mohou připravit (jak ukazuje obrázek 2B) reakcí mPEG-OH s aktivovaným derivátem acetonidu kyseliny glycerové (2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4karboxylovou kyselinou) nebo jejím čtyřuhlíkovým homologem 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-octovou kyselinou. Z diolu se potom sejme chránící skupina a acyluje se.

Odpovídajícími reakcemi se za použití mPEG-NH₂ připraveného způsobem který popsal Zalipsky a další, zvěř.

* · · · ·· ·*

PCT přihláška WO 98/18813 (1998), místo m-PEG-OH, mohou připravit lipopolymery s vazbami na amid, močovinu nebo amin (to znamená kde L = -NH-(C=0)-NH-, NH-(C=0)-CH₂- nebo -NHCH₂-).

Sloučeniny, ve kterých L je -X-(C=0)-, a X je 0 nebo NH, se mohou připravit reakcí aktivovaného a karboxylem zakončeného PEG (připraveného oxidací hydroxylem zakončeného PEG a aktivací karboxylové skupiny například konverzí na nitrofenylester nebo reakcí s DCC) s 1,2,3-propantriolem nebo l-amino-2,3-propandiolem (obrázek 2C) . Sloučenina s ketonovou vazbou (například kde X znamená přímou vazbu) se může připravit kondenzací PEG zakončeného aldehydem (připraveného mírnou oxidací PEG zakončeného hydroxylem) s například Grignardovým činidlem l-bromo-2,3propandiolacetonidu (obrázek 2D), po níž následuje oxidace na keton v neokyseleném prostředí a hydrolýza acetonidu na diol. Ve všech případech se potom diol acyluje jako obvykle.

Konec oligomeru PEG, který není připojen na glycerolovou strukturní část (a konec; výše uvedená skupina Z) je typicky hydroxy- nebo methoxyskupina, ale může se funcionalizovat způsoby známými v oboru, pro usnadnění vazby různých molekul na neutrální lipopolymer a/nebo pro použití při zacílení lipozomů na určité buňky nebo typy tkání, nebo pro jiné usnadnění dodávky léku. Navazované molekuly mohou zahrnovat například proteiny, peptidy, glycidy, protilátky nebo vitaminy. Příklady 2 a 3 popisují stupně při přípravě α-funkcionalizovaných lipopolymerů způsoby podobnými způsobům popsaným výše, připravují se však z komerčně dostupných oligomerů PEG, přičemž se α-konec substituuje skupinou jako je terc-butylether nebo benzylether, které se snadno konvertují na hydroxyl po ukončení syntézy lipidové části molekuly. Potom se tento konec aktivuje, v tomto případě konverzí na p-nitrofenylkarbonát.

φφφφ φφφφ

III. Farmakokinetika lipozomu

Lipozomy s dlouhou dobou cirkulace vznikly vnesením asi 1 až asi 10 % molárních a výhodněji asi 3 až asi 6 % molárních neutrálního lipopolymeru do lipozomu složených z lipidů tvořících váčky. Lipozomy obsahující asi 3 až asi 5 % molárních buď mPEG_2OOo-DSPE (distearoylfosfatidylethanolamin) nebo lipopolymeru vázaného na karbamát jako je mPEG₂₀₀o-c-DS se připravily podle popisu v příkladu 4. Zbytek lipidů obsahoval HSPC a cholesterol v poměru 1,5:1. Lipozomy byly značeny ¹²⁵I-tyraminylinulinem. Vzorek každého přípravku se injektoval do ocasní žíly myši a jeho distribuce v tkáních se stanovila v různých časových úsecích, jak popisuje příklad 4. Koncentrace v krvi, játrech a slezině ukazují tabulky 1-3 a graficky v obrázky 3A-3C. Údaje ukazují, že farmakokinetika lipozomů obsahujících PEG-c-DS se podobá farmakokinetice lipozomů obsahujících PEG-DSPE.

Tabulka 1

Distribuce lipozomu v krvi

Časová	% injektované dávky
lhůta	A	B	C
30 min	-	94,8 ± 3,99	89,7 ± 6,94
2 hod	85,1 ± 1,99	79,8 ± 3,42	73,0 ± 17,4
6 hod	67,1 ± 6,25	54,5 ± 3,05	55,3 ± 2,51
12 hod	54,9 + 6,04	39,7 ± 2,52	44,4 ± 2,52
24 hod	14,8 ± 2,81	12,4 ± 2,34	16,6 ± 2,38

0» *· 0· 0· 0···

Tabulka 2

Distribuce lipozomu v játrech

ν' Casova	% injektované dávky
lhůta	A	B	C
3 0 min		2,27 ± 0,13	3,14 ± 0,95
2 hod	8,76 ± 2,01	9,42 + 1,24	11,7 ± 1,74
6 hod	21,7 ± 2,55	19,3 ± 1,37	20,8 ± 0,86
12 hod	26,6 ± 0,51	26,4 ± 1,99	30,4 ± 1,28
24 hod	43,9 ± 2,7	36,6 ± 2,25	42,6 ± 0,48

Tabulka 3

Distribuce lipozomu ve slezině

Časová	% injektované dávky
lhůta	A	B	C
3 0 min		0,09 ± 0,06	0,23 ±0,08
2 hod	0,96 ± 0,16	0,99 ± 0,09	1,08 ± 0,09
6 hod	1, 94 ± 0,07	1,96 ± 0,29	2,12 ± 0,13
12 hod	3,15 ± 0,31	3,13 ± 0,12	3,35 ± 0,22
24 hod	4,69 ± 0,37	3,91 ± 0,31	4,56 ± 0,29

Podobná studie srovnávala chování obou PEG lipidů proti kontrolní formulaci, která neobsahovala žádný PEG lipid. Obrázek 4 ukazuje retenci v krvi lipozomů HSPC neobsahujících PEG (poměr 2:1) (křížky), PEG₂₀oo-DSPE (5 molárních procent) (trojúhelníky) nebo PEG₂ooo-c-DS (5 molárních %) (kroužky).

Další studie se prováděly za pomoci lipozomů obsahujících mPEG_2OOo-c-DS : PHPC : Chol v molárním poměru 5 : 55 : 40. Lipozomy se značily vnesením komplexu indiumDTPA. Procentuální zbytek injektované dávky se stanovil v

krvi v různých tkáních po 24 hodinách. Výsledky ukazuji tabulky 4-6. Lipozomy opět vykazují typickou farmakokinetiku vyznačující se dlouhou dobou cirkulace, přičemž průměrná retence injektované dávky po 4 hodinách je větší než 70 % a po 24 hodinách větši než 30 %.

Tabulka 4

Procentuální množství injektované dávky india v krvi

Zvíře v c.	0,0 hod	0,5 hod	1,0 hod	2,0 hod	4,0 hod	24 hod
Krysa 1	103,7	91,2	82,5	73,8	72,0	33,1
Krysa 2	97,7	87,7	79,4	78,7	74,4	30,7
Krysa 3	95,1	83,1	77,8	68,6	64,4	29,8
Krysa 4	91,9	85,4	78,5	75,6	72,6	33,2
Průměr	97,1	86,8	79,6	74,2	70,9	31,7
Stand. Odchylka	5,0	3,4	2,1	4,2	4,4	1/7

Tabulka 5

Množství injektované dávky v tkáních po 24 hod. v %

Tkáň	Krysa 1	Krysa 2	Krysa 3	Krysa 4	Průměr	Stand. odchylka
Játra	7,5	6,9	6,7	7,2	7,1	0,3
Slezina	4,9	5,4	5,6	4,8	5,2	0,4
Srdce	0,4	0,5	0,5	0,6	0,5	0,1
Ledviny	1,2	1,2	1,0	1,2	1,1	0,1
Plíce	0,7	0,7	0,7	0,8	•0,7	0,1
Pokožka	0,1	0,3	0,2	0,2	0,2	0,1
Kost	0,3	0,2	0,2	0,2	0,2	0,2
Svalstvo	0,1	0,1	0,1	0,2	0,1	0,4
Moč	11,2	13,4	5,7	12,3	10,7	3,4

Tabulka 6

Procento injektované dávky na gram tkáně po 24 hod.

Tkáň	Krysa 1	Krysa 2	Krysa 3	Krysa 4	Průměr	Stand. Odchylka
Játra	0,7	0,7	0,7	0,7	0,7	0,3
Slezina	7,3	6,9	8,2	5,9	7,1	0,9
Srdce	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,4
Ledviny	0,6	0,6	0,5	0,6	0,6	0,6
Plíce	0,6	0,5	0,5	0,6	0,5	0,6
Pokožka	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1
Kost	0,4	0,4	0,4	0,4	0,4	0,3
Svalstvo	0,1	0,1	0,1	0,1	0,1	0,2
Moč*	0,6	0,6	0,3	0,8	0,6	0,2

* % Injektované dávky na ml

Nakonec se srovnávaly lipozomy, obsahující 5 % molárních mPEG2ooo^-c-DS nebo mPEG₂ooo-DSPE a zbytek PHEPC, z hlediska procentuálního množství zbývajícího v krvi v průběhu 24 hodin po podání. Obrázek 4 ukazuje, že jejich farmakokinetika charakterizovaná retencí asi 40 % po 24 hodinách byla prakticky identická.

Všechny publikace, patenty a patentové dokumenty jsou zde zahrnuty ve formě odkazu jako individuálně zahrnuté odkazy. Vynález byl popsán se zřetelem k různým specifickým a výhodným provedením a technikám. Je však třeba chápat, že lze realizovat různé variace a modifikace a přitom zachovat smysl a rozsah vynálezu.

Následující příklady vynález ilustrují, ale nemají za cíl jakkoli jej omezovat.

Příklady provedení vynálezu

PŘÍKLAD IA

Syntéza mPEG-c-DS (mPEG aminopropandioldistearoyl; ameth.oxy-a>-2,3• · · ·

di (s tearoyl oxy) propylkarbamá tpoly (e thyl enoxi d))

Roztok mPEG_2Ooo (20 g, 10 molů) se azeotropicky sušil v toluenu (50 ml, 120 °C). Když teplota tohoto roztoku dosáhla 25 °C, reagoval s nitrofenylchloroformátem (3,015 g, 15 molů) a pak s TEA (2,01 ml, 15 molů). Tato směs se nechala reagovat jednu a půl hodiny. Sůl TEA se zfiltrovala a rozpouštědlo se odstranilo za vzniku surového mPEG_2Ooonitrofenylchloroformátu, k němuž se přidal roztok aminopropandiolu (3 g, 30 molů) v acetonitrilu (50 ml).

Potom se směs přes noc míchala za teploty místnosti. Nerozpustný podíl se odstranil filtrací a rozpouštědlo se odpařilo. Produkt se dvakrát překrystaloval z izopropanolu. Výtěžek: 13,7 g, 65 %. ¹HNMR: (300 MHZ, DMSO-D6), δ 3,23 (s,OCH₃, 3H), 3,65 (s, PEG, 180 Η) , 4,05 (t, urethan CH₂,

2H), 4,42 (t, 1°OH, 1H), 4,57 (d, 2°OH, 1H).

Produktový mPEG₂ooo aminopropandiol (2,3 g, 1,08 mol,

2,17 meq OH) se rozpustil v toluenu (30 ml) a azeotropicky sušil, čímž se odstranilo asi 10 ml roztoku. Rotok se nechal ochladit na pokojovou teplotu. Pipetou se přidal pyridin (4 ml, 20 %),, pak následovalo přidání stearoylchloridu (1 g,

4,3 molu). Ihned se vytvořila bílá sraženina. Reakční směs se zahřívala pod zpětným chladičem přes noc při 120 °C a nechala vychladnout. Když teplota v reakční nádobě dosáhla asi 40 °C, sůl pyridinu se zfiltrovala. Filtrát se odpařil. Produkt (PEG_2Ooo-c-DS) se přečistil dvojnásobným překrystalováním z izopropanolu (2 x 30 ml) a sušil ve vakuu nad P₂O₅.

Výtěžek: 2,26 g, 80 %. TLC (chloroform : methanol, 90 : 10): mPEG aminopropandiol R_f = 0,266; PEG-c-DS Rf = 0,533. ^NMR: (300 MHz, DMSO-D₆) δ 0,89 (t, CH₃, 6H) , 1,26 (s, CH₂,

Η) , 1,50 (2t, 2CH₂, 4H) , 2,24 (t, CH₂CH₂C=O, 4H) , 3,23 (s,

OCH₃, 3H) , 3,50 (S, PEG, 180H) , 4,00 (dd, CH₂ zAPD, 1H) ,

4,02 (t, CH₂OC=O-N, 2H) , 4,20 (dd, CH₂ z APD, 1H) , 4,98 (m,

CHOC(O), 1H), 7,34 (m, NH, 1H).

9 « 9 9« 4 4

9 9 9 9 9

9 9 * *

9 9 ·· ·

Podobný postup se užil při přípravě mPEG-c-DS za použití mPEG polymerů s relativní molekulovou hmotností 750, 5 000 a 12 000. Struktura se ověřovala spektroskopií ¹H-NMR a hmotnostní spektrometrií. Relativní molekulové hmotnosti stanovené MALDI (Matrix Assisted Laser

Desorption/Ionization) jsou v následující tabulce:

Konj ugát	Relativní molekulová hmotnost stanovená MALDI
mPEG(750)-c-DS	1 426
mPEG(2000)-c-DS	2 892
mPEG(5000) -c-DS	5 816
mPEG(12000)-c-DS	12 729

PŘÍKLAD 1B

Syntéza mPEG-c-DS (mPEG aminopropandioldiekosanoyl: amethoxy-ú)-2,3di(ekosanoyloxy)propylkarbamátpoly(eth.ylenoxid))

V baňce s kulatým dnem o obsahu 100 ml se v toluenu (20 ml) rozpustila ekosanová kyselina (500 mg, 1,6 mmolu) a pipetou se přidal oxalylchlorid (147 μΐ, 1,68 mmolů). Do reakční směsi se za míchání přidal 1 % DMF. Po přidání DMF se uvolnil plyn. Je třeba se vyvarovat jakéhokoliv styku s tímto plynem. Po 10 minutách se toluen odpařil a přidalo se dalších 20 ml toluenu a odpařoval se pro odstranění jakéhokoliv nadbytku oxalylchloridu. Zbytek se znovu rozpustil v 10 ml toluenu. K roztoku se přidalo 1,19 g, 0,56 mmolu mPEG aminopropandiolu připraveného jak výše uvedeno, připojil se zpětný chladič a směs se přes noc zahřívala pod zpětným chladičem. Ukončení reakce ukázala analýza pomocí TLC (methanol a chloroform v poměru 9:1). Po ochlazení reakční směsi se nerozpuštěný materiál zfiltroval a filtrát • · ·· · « ι· · fc • · se vysušil. Produkt se přečistil trojnásobnou rekrystalizací z izopropanolu a sušil ve vakuu nad P₂O₅. Výtěžek: 1,0 mg, 70 %. ¹HNMR: (360 MHz, DMSO-D_s) δ 0,89 (t, CH₃, 6H) , 1,26 (s,

CH₂, 66H z lipidu), 1,50 (t, 2CH₂, 4H) , 2,24 (t,

CH₂CH₂C=O, 4H) , 3,23 (s, OCH₃, 3H) , 3,50 (s, PEG, 180H) , 4,00 (dd, CH₂ z APD, IH) , 4,05 (t, CH₂OC=O-N, 2H) , 4,20 (dd, CH₂ z APD, IH), 4,98 (m, CHOC(O), IH), 7,34 (m, NH, IH) ppm.

PŘÍKLAD 2

Příprava terc-Bu-O-PEG-aminopropandiolu přés terc-Bu-O-PEGO-sukcinimid

A, terc-Bu-O-PEG-O-sukcinimid terc-Bu-O-PEG-2000 od firmy Polymer- Labs (10 g, 5 mmolu) se azeotropicky sušil rozpuštěním v 120 ml toluenu a odstraněním asi 20 ml rozpouštědla izolací veškeré obsažené vody v odlučovači Dean Stark.

Roztok se ochladil na pokojovou teplotu a přidal se fosgen (15 ml). Směs se nechala reagovat přes noc při teplotě místnosti. Po ukončení reakce se rozpouštědlo odstranilo v rotační odparce. Přidalo se asi 50 ml čerstvého toluenu, který se odstranil rotační odparkou. Zbytek se rozpustil v suchém toluenu (30 ml) a methylenchloridu (10 ml). K tomuto roztoku se přidaly N-hydroxysukcinimid (1,7 g, 14,8 mmolu) a triethylamin (2,1 ml, 14,9 mmolu) a směs se nechala reagovat přes noc při teplotě místnosti, pak se ukončení reakce potvrdilo TLC.

Sloučenina	R_f (CHCl₃:CH₃OH, 90:10)
terc-Bu-O-PEG-OH	0,44
terc-Bu-O-PEG-OSc	0,51

Sůl se zfiltrovala z reakční směsi, rozpouštědlo se odstranilo odpařením a pevná složka se dvakrát

Φ· * · · φ · • φ φ φ • φ · · φ φφ φ φ φ φ φ φ φφφφ překrystalovala z izopropylalkoholu a sušila nad P₂0_s. Výtěžek: 9,2, 85 %. ¹HNMR: (CDCl₃, 360 MHz) δ 1,25 (s, tercBu, 9H) , 2,82 (s, CH₂CH₂, 4H) , 3,60 (s, PEG, 180H) , 4,45 (t,

CHzOCONH, 2H) ppm.

B. terc-Bu-O-PEG-aminopropandiol

K roztoku aminopropandiolu (300 mg, 3,2 mmolu) v DMF (10 ml) se přidal terc-Bu-PEG-OSc (5 g, 2,29 mmolu) a nechal se reagovat přes noc. Po spotřebě všech esterů NHS vznikla směs vykazující při TLC jedinou skvrnu.

Sloučenina	R_f (CHC1₃:CH₃OH, 90:10)
terc-Bu-O-PEG-OSc	0,51
terč-Bu-0-PEG-APD	0,35

K reakční směsi se přidala předem promytá acidická iontoměničová pryskyřice (asi 1 g) a po 30 minutách se odstranila filtrací. Rozpouštědlo se odstranilo a zbytek se překrystaloval z 200 ml izopropylalkoholu. Pevná fáze se shromáždila a vysušila nad P₂O₅. Výtěžek: 4,2 g, 85 %. ¹HNMR: (D6-DMSO, 360 MHz) δ 1,25 (s, terc-Bu, 9H) , 3,68 (s, PEG, 180H), 4,03 (t, CH₂OCONH, 2H), 4,43 (t, 1°OH, ÍH), 4,55 (d, 2°OH, ÍH) , 6,98 (t, NH, ÍH) ppm.

PŘÍKLAD 3

Příprava p-ni trof enylkarbonát-PEG-c-DS A. Bn-O-PEG-nitrofenylkarbonát (NPC)

Bn-0-PEG-2000 od firmy Shearwater Polymers (Huntsville, LA; 5 g, 2,41 mmolu) se azeotropicky vysušil rozpuštěním v 120 ml toluenu, odstraněním 20 ml rozpouštědla a izolací veškeré vody v odlučovači Dean Stark. Roztok se ochladil na pokojovou teplotu a zbylé rozpouštědlo se odpařilo za sníženého tlaku.

»· 0 · · 0* 0

00 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 · 000 0000 0 0 0 0 0 0 0 0

00 00 0000

Zbytek se rozpustil v 30 ml směsi methylenchlorid/ethylacetát (60:40) a přidal se pnitrofenylchloroformát (729 mg, 3,6 mmolů) a triethylaminu (1 ml, 7,2 mmolů). Reakce probíhala 8-16 hodin při 4 °C. Tento způsob reakci zpomalí, ale eliminuje vznik bis-PEGkarbonátu. Ukončení reakce se zjistí pomocí skvrny na desce z oxidu křemičitého GF viditelné v ultrafialovém světle.

Reakční směs reagovala s předem přečištěnou acidickou a bazickou iontoměničovou pryskyřicí po dobu 30 minut, potom se zfiltrovala a zcela vysušila. Produkt se překrystaloval z izopropylalkoholu a sušil nad P₂O₅. Výtěžek: 4,4 g, 80 %.

B. Bn-O-PSG-aminopropandiol

K roztoku aminopropandiolu (260 mg, 1,9 mmolů) v DMF (10 ml) se přidal Bn-O-PEG-NPC (připravený jak uvedeno výše) v množství 4,3 g (2,9 mmolů) a nechal se reagovat 5 hodin. Spotřebu veškerého Bn-O-PEG-NPC signalizuje vznik jediné skvrny při TLC (chloroform:methanol:voda v poměru 90:18:2).

Reakční směs se na 30 minut přivedla do styku s 5 g předčištěné acidické iontoměničové pryskyřice, zfiltrovala a zcela vysušila. Produkt se překrystaloval z izopropylalkoholu a sušil nad P₂O₅. Výtěžek:3,8 g, 91 %.

C. Bn-O-PEG-c-distearoyl

Roztok Bn-O-PEG-aminopropandiolu (3 g, 1,36 mmolů), stearové kyseliny (1,94 g, 6,79 mmolů) a DPTS (4(dimethylamino)pyridinium-4-toluensulfonátu) jako katalyzátoru (408 mg, 1,36 mmolů) se 20 minut míchal při teplotě místnosti. Diizopropylkarbodiimid (1,28 ml, 8,16 mmolů) se napipetoval a směs se nechala přes noc reagovat. TLC (chloroform:methanol v poměru 90:10) prokázala že diol beze zbytku zreagoval.

K reakční směsi se přidala bazická iontoměničová pryskyřice (asi 5 g). Po 30 minutách třepání se pryskyřice

ΦΦ ΦΦ

Φ Φ Φ ·

Φ Φ «

ΦΦΦ ·· φφφφ

Φ ····

ΦΦ *

Φ Φ

Φ·Φ ΦΦ

ΦΦ ΦΦ φ φ ΦΦΦΦ zfiltrovala a filtrát se vysušil. Zbytek se překrystaloval z izopropanolu (100 ml) a sušil nad P₂O₅. Výtěžek: 4 g, 80 %.

D. HO-PEG-c-distearoyl

K sejmutí ochranné benzylové skupiny Bn-O-PEG-c-DS se použilo dvou rozdílných přístupů.

Způsob 1. Hydrogenolýza: sejmutí ochranné skupiny palladiem na uhlíku.

K roztoku Bn-O-PEG-c-DS (218 mg, 0,08 mmolu) v 5 ml methanolu se přidalo 10 % Pd/C (110 mg) a mravenčan amonný (107 mg, 0,8 mmolu) a směs se nechala reagovat přes noc při teplotě místnosti. Pd/C se odstranilo filtrací přes Celíte® a filtrát se vysušil. Zbytek se rozpustil v chloroformu a třikrát promyl nasyceným roztokem NaCl. Chloroformová fáze se shromáždila, vysušila MgSO₄, zfiltrovala a zahustila. Pevný zbytek se lyofilizoval z terc-BuOH a výsledný prášek se vysušil nad P₂O₅. Výtěžek: 80 %, 175 mg.

Způsob 2. Sejmutí ochranné skupiny chloridem titaničitým.

Roztok Bn-O-PEG-c-DS (1,18 g, 0,43 mmolu) v methylenchloridu (10 ml) se během 5 minut ochladil v ledové lázni. Do uzavřené reakční kádinky se injekční stříkačkou vysušenou v pícce vnesl chlorid titaničitý (3 ml, 21,5 mol, nadbytek). Po 5 minutách se ledová lázeň odstranila a reakce sejmutí ochranné skupiny proběhla přes noc při teplotě místnosti. Její úplné ukončení ukáže níže posunutá skvrna (oproti výchozímu materiálu) na desce TLC z GF oxidu křemičitého.

Do reakční směsi se přidalo asi 40 ml chloroformu a směs se přenesla do dělíčky obsahující 40 ml nasyceného NaHCO₃. Směs se jemně třepala (aby nevznikla emulze) a chloroformová vrstva se shromáždila. Tato reakce se třikrát opakovala a chloroformová fáze se spojila a ještě jednou extrahovala novou dávkou nasyceného roztoku NaHCO₃, aby se zajistilo plné odstranění TiCl₄. Spojená chloroformová fáze

Φφφφ •Φ ΦΦΦΦ «φ Φ· φφ φ · φ « · * · · « φ φφφ φφ · • φφφφ φφφφ * φφφ φφφφ φφφ φφ« φφ φφ φφ. φφ ΦΦ·Φ se sušila MgSO₄, zfiltrovala a zahustila.

Získaný zbytek se rozpustil v 1 ml chloroformu a vnesl do připravené kolony naplněné silikagelem (200-400 mesh, 60 Angstrómů). Polarita mobilní fáze (chloroform) se zvyšovala opakovaným přidáváním 2 % methanolu až byl produkt eluován mobilní fází ve složení 10 % methanolu/90 % chloroformu. Produkt se spojil a rozpouštědlo se odstranilo rotační odparkou. Pevná fáze se lyofilizovala z terc-BuOH a sušila nad P₂O₅. Výtěžek 70 %, 800 mg.

E. p-Nitrofenylkarbonát-PEG-c-DS

Reakční baňka, tyčinka na míchání, injekční stříkačka a výchozí materiál (HO-PEG-c-DS připravený výše) se před započetím reakce pečlivě vysušily.

K roztoku HO-PEG-c-DS (1,2 g, 0,45 mmolu) v 10 ml směsi methylenchlorid/ethylacetát (60:40) se přidaly pnitrofenylkarbonát (136 mg, 0,65 mmolu) a triethylamin (188 μΐ, 1,35 mmolu). Reakce probíhala 8-16 hodin při teplotě 4 °C (aby nevznikl bis-PEG-karbonát) a pak se ukončení reakce prokázalo pomocí TLC s GF silikagelem.

Sloučenina	Rf(CHC1₃:CH₃OH, 90:10)
HO-PEG-c-DS	0,40
NPC-PEG-c-DS	0,54

Reakční směs byla 30 minut v kontaktu s předčištěnou acidickou a bazickou iontoměničovou pryskyřicí a pak se zfiltrovala. Filtrát se zcela vysušil a zbytek se překrystalizoval z izopropylalkoholu. Pevná fáze se sušila nad P₂O₅. Výtěžek: 70 %. ¹HNMR: (D6-DMSO, 360 MHz) δ 0,86 (t, CH₃, 6H) , 1,22 (S, DS, 56H) , 1,48 (m, CH₂CH₂ (CO) ) , 4H) , 2,26 (2 xt, CH₂0C0NH, 2H) , 4,03 & 4,22 (2 xd, CH₂CE z lipidu,

2H), 4,97 (M, CHCH₂ z lipidu), 6,98 (t, NH, ÍH), 7,55 % 8,32 (2xd, aromatický, 4H) ppm.

^{1 1} • «Φ·· ·· ΦΦ·· ·· · * · · • * · · · • · · * · * o o ·······

Z U ··· ·· ♦ · **

PŘÍKLAD 4

Studie přípravy a biodstribuce lipozomů obsahujících PEG-DSPE- a PEG-c-DS.

Lipidové filmy se vytvářely rozpuštěním v rozpouštědle a odstraněním rozpouštědla ze směsí HSPC:Chol:PEG lipid v následujících poměrech:

A: 58:39:3; PEG lipid = PEG-C-DS B: 57:38:5; PEG lipid = PEG-DSPE C: 57:38:5; PEG lipid = PEG-C-DS

Filmy se hydratovaly v čerstvě připraveném ¹²⁵ltyraminylinulinu obsaženém v 25 ml HEPES s přídavkem 140 mM NaCl při pH 7,4, načež se lipozomy vytlačovaly do konečného tvaru o průměru 100-105 nm. Lipozomy se sterilizovaly filtrací přes filtry v ústí injekčních stříkaček s nízkou afinitou k bílkovinám z materiálu Milipore (firma Milipore Corporation, Bedford, MA) s velikostí pórů 0,22 μπι. Ve vzorcích se zjistil počet impulzů ¹²⁵I v injekci. Koncentrace lipidů se stanovily zjišťováním obsahu fosfátu v lipozomových preparátech a lipozomové preparáty se zředily ve sterilním _;pufru na finální koncentraci 2,5 μπιοί/πύ. Myši dostaly intravenózní injekci dávky 0,2 ml zředěných lipozomů do ocasní žíly, takže každá myš dostala 0,5 μιηοΐ fosfolipidu. V různých časových intervalech byly jednotlivé myši anesteticky usmrceny halothanem, následovala cervikální dislokace, odebrání vzorků krve ze srdce a testování krve a různých orgánů pomocí impulzů ¹²⁵I.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY (Změněné)

1. Lipozomová kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje od asi 1 molárního procenta do asi 10 molárních procent neutrálního lipopolymeru vzorce:

O-fc-R¹ kde

R¹ i R² představují alkylový nebo alkenylový řetězec s asi 8 až asi 24 uhlíkovými atomy;

n je mezi asi 10 a asi 300,

Z se vybere ze skupiny substituentů, kterou tvoří hydroxy, alkoxy, benzyloxy, ester karboxylové kyseliny, ester sulfonové kyseliny, alkyl nebo arylkarbonát, amino a alkylamino; a

L se vybere ze skupiny, kterou tvoří (i) -X-(C=O)-YCH₂~, (ii)-X-(C=O)- a (iii) -X-CH₂-, kde X a Y se nezávisle vyberou z kyslíku, NH a přímé vazby, za předpokladu, že L je -X-(C=O)- a X není NH;

a zbytek jsou lipidy tvořící váčky.
2. Kompozice podle nároku 1, vyznačuj ící se tím, že X je kyslík a Y je dusík.
3. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že L je karbamátová, esterová nebo karbonátová vazba.
4. Kompozice podle nároku 3, vyznačující se tím, že L je -O-(C=O)-NH-CH₂- (karbamátová vazba).

• · · · • · • · · · • · · · • · · • · · • · · • · ··· ·
5. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že Z je hydroxy nebo methoxyskupina.
6. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje asi 3 molární procenta až asi 6 molárních procent neutrálního liopopolymeru.
7. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že R¹ i R² představují nerozvětvený alkylový nebo alkenylový řetězec s asi 8 až asi 24 uhlíkovými atomy.
8. Kompozice podle nároku 6, vyznačující se tím, že R¹ i R² představují Ci₇H₃₅.
9. Kompozice podle nároku 1, vyznačující se tím, že n je mezi asi 20 až asi 115.
10. Způsob prodloužení oběhové doby lipozomu obsahujícího lipidy tvořící váčky, vyznačuj ící se tím, že tento způsob zahrnuje:

vnesení do uvedeného lipozomu obsahujícího lipidy tvořící váčky asi 1 molární procento až asi 10 molárních procent neutrálního lipopolymeru se vzorcem:

O

O-fc-R¹

O

O-fc-R² přičemž:

R¹ i R² představují alkylový nebo alkenylový řetězec s asi 8 až asi 24 uhlíkovými atomy;

n je mezi asi 10 a asi 300,

Z se vybere ze skupiny substituentů, kterou tvoří ·«·· · · · · · · φ · ♦ · · • · · · · · • · · · · · · ··« «· ·· ·· hydroxy, alkoxy, benzyloxy, ester karboxylové kyseliny, ester sulfonové kyseliny, alkyl nebo arylkarbonát, amino a alkylamino; a

L se vybere ze skupiny, kterou tvoří (i) -X-(C=0)-YCH₂-, (ii)-X-(C=0)- a (iii) -X-CH₂-, kde X a Y se nezávisle vyberou z kyslíku, NH a přímé vazby, za předpokladu, že L je -X-(C=0)- a X není NH.
11. Způsob podle nároku 10,vyznačuj ící se tím, žeXje kyslík a Y je dusík.
12. Způsob podle nároku 10,vyznačuj ící se tím, že L je karbamátová, esterová nebo karbonátová vazba.
13. Způsob podle nároku 12,vyznačuj ící se tím, že L je -0- (C=0) -NH-CH₂- (karbamátová vazba) .
14. Způsob podle nároku 10, vyznačujíc í se tím, žeZje hydroxy nebo methoxyskupina.
15. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící se t í m, že se vnese asi 3 molární procenta až asi 6 molárních procent neutrálního lipopolymerů.
16. Způsob podle nároku 10, vyznačuj ící tím, že n je mezi asi 20 a asi 115 .
17. Neutrální lipopolymer se vzorcem:

O

O-fc-R¹

O „O-fc—R² kde

Jn

R¹ i R² představují alkylový nebo alkenylový řetězec s asi 8 • · · · ♦ * · « r · · · ♦··· ··· »0 ·· ·· ··

0000 až asi 24 uhlíkovými atomy;

n je mezi asi 10 a asi 300,

Z se vybere ze skupiny substituentů, kterou tvoří hydroxy, alkoxy, benzyloxy, ester karboxylové kyseliny, ester sulfonové kyseliny, alkyl nebo arylkarbonát, amino a alkylamino; a

L se vybere ze skupiny, kterou tvoří (i) -X-(C=O)-YCH₂-, (ii)-X-(C=O) - a (iii) -X-CH₂-, kde X a Y se nezávisle vyberou z kyslíku, NH a přímé vazby, za předpokladu, že L je -X- (C=O) - a X není NH.
18. Lipopolymer podle nároku 17, ve kterém X je kyslík a Y je dusík.
19. Lipopolymer podle nároku 17, ve kterém L je karbamátová, esterová nebo karbonátová vazba.
20. Lipopolymer podle nároku 19, ve kterém L je -O(C=O)-NH-CH₂- (karbamátová vazba).
21. Lipopolymer podle nároku 17, ve kterém R¹ i R²představují nerozvětvený alkylový nebo alkenylový řetězec s asi 8 až asi 24 uhlíkovými atomy.
22. Lipopolymer podle nároku 21, ve kterém R¹ i R²představuj í C17H35.
23. Lipopolymer podle nároku 17, ve kterém Z je hydroxy nebo methoxyskupina.
24. Lipopolymer podle nároku 17, ve kterém n je mezi asi 20 a asi 115.