MX2007000568A - Conjugados de una fraccion gm-csf y un polimero. - Google Patents

Abstract

Se proveen conjugados de una porcion de GM-CSF y uno o mas polimeros solubles en agua. Tipicamente, el polimero soluble en agua es poli(etilenglicol) o un derivado del mismo. Tambien se proveen una composicion que comprende los conjugados, metodos para elaborar los conjugados, y metodos para administrar composiciones que comprenden los conjugados a un paciente.

Description

CONJUGADOS DE UNA FRACCIÓN GM-CSF Y UN POLÍMERO CAMPO DEL INVENTO [001] El presente invento se refiere en términos generales a conjugados que comprenden una fracción GM-CSF (es decir, una fracción que tiene actividad GM-CSF) , y un polímero. Además, el invento se refiere (entre otras cosas) a composiciones que contienen los conjugados, métodos para la sintetización de los conjugados, y métodos para la transmisión de los conjugados. TRASFONDO DEL INVENTO [002] Una función importante del sistema hematopoyético humano es el reemplazo de una variedad de células blancas de la sangre (incluyendo macrófagos, neutrófilos, y basófilos/ células mástil) , células rojas de la sangre (es decir, eritrocitos) , y células de formación de coágulos (por ejemplo, megacariocitos/plaquetas) . Cada una de estas células especializadas es formada de células hematopoyéticas precursoras ubicadas en la médula ósea. Glicoproteínas específicas a semejanza de hormonas, llamadas "factores de estimulación de colonias" controlan la diferenciación y maduración de las células hematopoyéticas precursoras, al interior de cualquiera de la cantidad de células especializadas de la sangre. [003] Un factor tal de estimulación de colonias es factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos, o "GM-CSF." Como su nombre lo indica, este factor estimulante de colonias promueve la proliferación y diferenciación de células blancas de la sangre como los granulocitos y macrófagos, aunque el GM-CSF puede promover también la formación de otros tipos de células. GM-CSF es producido por una cantidad de diferentes tipos de células (incluyendo las células T activadas, las células B, los macrófagos, las células mástil, las células endotélicas y fibroblastos) en respuesta a los estímulos citolunos, inmunológicos e inflamatorios. El GM-CSF nativo es una glicoproteína de 127 aminoácidos y puede tener una variedad de pesos moleculares, dependiendo de la magnitud de la glicosilación. [004] Farmacológicamente, GM-CSF ha sido administrado a pacientes con cáncer, a fin de acelerar el reemplazo de las células blancas que resultan muertas durante los tratamientos de quimioterapia. Con un propósito similar de acelerar el reemplazo de células blancas de la sangre, este factor estimulante de colonias ha sido administrado a pacientes con leucemia que pasan por terapia de reemplazo de médula ósea. Aplicaciones adicionales, como la curación acelerada de heridas, han sido propuestas.

Véase, por ejemplo, la patente No. 6.689.351 de los Estados Unidos . [005] Una desventaja asociada con las formas actuales de terapia GM-CSF es la frecuencia de la dosificación. Por cuanto la terapia GM-CSF generalmente requiere inyecciones diarias, los pacientes presentan aversión a la inconveniencia y la incomodidad, asociada con este régimen. Junto con el hecho de que los pacientes requieren frecuentes exámenes de sangre para determinar el conteo de células blancas de la sangre (lo cual exige viajes hacia un auxiliar de servicios médicos) , muchos pacientes preferirían una alternativa que sea menos embarazosa y/o que implique una reducción en el número de inyecciones . [006] Una solución propuesta a estos problemas ha sido proveer una forma de liberación prolongada de GM-CSF. Por ejemplo, la patente No. 5.942.253 de los Estados Unidos describe microsferas de poli (ácido láctico co-glicólico) u otros polímeros biodegradables de GM-CSF. La formación de microsferas, sin embargo, puede ser un proceso complejo, requiriendo una cantidad de pasos sintéticos. Así, este enfoque de liberación prolongada sufre de complejidades que idealmente son evitadas . [007] La PEGilación, o el enlace de un derivado de poli (etileno glicol) a una proteína, ha sido descrita como un medio para prolongar la vida media en vivo, resultando de esa manera en una actividad farmacológica prolongada. Por ejemplo, la patente No. 5.880.255 de los Estados Unidos describe un conjugado de GM-CSF y poli (etileno glicol) formado de una reacción con poli (etileno glicol) monometoxi derivado 2, 2, 2-trifluoroethanesulfonate lineal, con un peso molecular de 5.000 Daltons. [008] No obstante este conjugado descrito arriba, sin embargo, permanece una necesidad de otros conjugados que tengan GM-CSF, por ejemplo, un polímero que tenga un peso molecular mayor que 5.000 Daltons, un polímero que tenga una estructura diferente (por ejemplo, una estructura ramificada y/o bifurcada) , diferentes sitios de enlace, sitios de enlace específicos del sitio o selectivos, y así sucesivamente. [009] Así, permanece allí una necesidad en el arte, de proveer conjugados adicionales de fracción GM-CSF polímero. Entre otras cosas, uno o más anexos del presente invento está(n) entonces dirigido (s) a tales conjugados, así como composiciones que contengan los conjugados, y métodos relacionados tal como se describen aquí, de los cuales se cree que son nuevos y nunca antes sugeridos por el arte .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

[0010] De acuerdo con esto, en una o más representaciones del invento, se provee un conjugado, el cual comprende la siguiente estructura: Donde : POLY es un polímero soluble en agua; (a) es cero, o es uno; X1, cuando está presente, es una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos; R1 es un radical orgánico; GM-CSF es una fracción GM-CSF.

[0011] En una o más representaciones del invento, se provee un conjugado, el cual comprende la siguiente estructura : Donde: POLY es un polímero soluble en agua; X es una fracción espadadora compuesta por uno o más átomos ; (b) es cero, o un número entero con un valor de uno hasta 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10); (c) es cero, o un número entero con un valor de uno hasta 10 (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10) ; R2, en cada aparición, es H independientemente, o un radical orgánico; R3, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico, y GM-CSF es una fracción GM-CSF.

[0012] En una o más representaciones del invento, se provee un conjugado, el cual comprende una fracción GMCSF que contiene una amina interna enlazada de manera covalente, sea directamente o a través de una fracción espadadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, ramificado.

[0013] En una o más representaciones del invento, se provee un compuesto, el cual comprende un conjugado, como se presenta aquí .

[0014] En una o más representaciones del invento, se provee una composición farmacéutica, el cual comprende (i) un conjugado que contiene un GM-CSF humano enlazado de manera covalente, sea directamente o a través de una fracción espadadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular en promedio de peso, mayor que 5.000 Daltons, con la condición de que cuando el polímero soluble en agua es un polímero ramificado soluble en agua, el polímero ramificado soluble en agua no incluye un residuo de lisina; y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrán un total de entre uno a dos polímeros enlazados al GM-CSF humano.

[0015] En una o más representaciones del invento, se provee un método para la entrega de conjugado a un paciente, método que comprende el paso de administrar al paciente una composición farmacéutica como se presenta aquí.

[0016] En una o más representaciones del invento, se provee un método para elaborar un conjugado, método que comprende el contacto, bajo condiciones de conjugación, de una fracción GM-CSF con un reactivo polimérico, para dar como resultado un conjugado y/o composición, tal como se presenta aquí .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0017] La Fig. 1 es el cromatograma después de un análisis SEC-HPLC de una solución conjugada como se presenta en el Ejemplo 1.

[0018] La Fig. 2 es el cromatograma después de la purificación por intercambio de aniones, de una composición descrita en el Ejemplo 1.

[0019] La Fig. 3 muestra los resultados del SDS-PAGE de fracciones de conjugado, como se describen en el Ejemplo 1.

[0020] La Fig. 4 es el cromatograma después de un análisis SEC-HPLC de una solución conjugada como se presenta en el Ejemplo 2.

[0021] La Fig. 5 es el cromatograma después de la purificación por intercambio de aniones, de una composición tal como se describe en el Ejemplo 3.

[0022] La Fig. 6 es el cromatograma después de un análisis SEC-HPLC de una solución conjugada como se presenta en el Ejemplo 4.

[0023] La Fig. 7 es el cromatograma después de un análisis SEC-HPLC de una solución conjugada como se presenta en el Ejemplo 5.

[0024] La Fig. 8 es el cromatograma después de un análisis SEC-HPLC de una solución conjugada como se presenta en el Ejemplo 6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

[0025] Antes de describir en detalle una o más de las representaciones del presente invento, debe entenderse que este invento no está limitado a los polímeros, técnicas sintéticas, fracciones GM-CSF, y semejantes, pues los tales pueden variar.

[0026] Debe anotarse que, tal como son usados en esta especificación y en las declaraciones de reivindicación, las formas singulares "un" , "una" , y "el" , "la", "los", "las", incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "un polímero" incluye un polímero individual, así como dos o más del mismo polímero o diferentes; la referencia a "un excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un excipiente particular, farmacéuticamente aceptable, así como a dos o más excipientes farmacéuticamente aceptables, del mismo tipo o diferentes, y así sucesivamente

[0027] Al describir y reivindicar el presente invento o inventos, la siguiente terminología será usada en concordancia con las definiciones descritas abajo

[0028] "PEG", "polietileno glicol" y poli (etileno glicol), tal como son usados aquí, son intercambiables. Generalmente, los PEGs para su uso en concordancia con el invento comprenden la siguiente estructura: "- (OCH2CH2)n-" donde (n) es de 2 a 4000. Tal como es usado aquí, PEG incluye además "-CH2CH2-0 (CH2CH20) n-CH2CH2-" y "- (OCH2CH2) nO~ , " dependiendo de si los oxígenos terminales han sido cambiados de sitio o no. A lo largo de las especificaciones y las pretensiones o reivindicaciones aquí presentadas, debe recordarse que el término "PEG" incluye estructuras que tienen varios grupos terminales o tipo "protector de terminación" . El término "PEG" también se refiere a un polímero que contiene una mayoría, es decir, más del 50%, de unidades secundarias repetitivas de -OCH2CH2- o también -CH2CH20- unidades secundarias repetitivas. Con respecto a formas específicas, PEG puede tomar cualquier número de una variedad de pesos moleculares, así como estructuras o geometrías como "ramificada", "lineal", "bifurcada", "multifuncional", y así sucesivamente, a ser descritas abajo con más detalle.

[0029] Los términos o expresiones "de terminación cubierta" , y "con terminación cubierta" son usados de manera intercambiable aquí, para referirse a un extremo terminal o punto de terminación de un polímero que tiene una fracción protectora de terminación. Generalmente, aunque no necesariamente, la fracción protectora de terminación comprende un hidroxi o grupo alcoxi C?_20, más preferiblemente un grupo alcoxi C_?0, y aún más preferiblemente, un grupo alcoxi C?_5. Así, entre los ejemplos de fracciones protectoras de terminación están alcoxi (es decir, metoxi, etoxi y benziloxi) , así como arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo, y así sucesivamente. Debe recordarse que la fracción protectora de terminación puede incluir uno o más átomos del monómero terminal en el polímero (por ejemplo, la fracción protectora de terminación "metoxi" en CH3 (0CH2CH2)n-] .Adicionalmente, están previstas formas saturadas, no saturadas, sustituidas y no sustituidas, de cada uno de los anteriores . Más aún, el grupo protector de terminación también puede ser un silano. El grupo protector de terminación también puede ventajosamente comprender una etiqueta perceptible. Cuando el polímero tiene un grupo protector de terminación que comprende una etiqueta perceptible, el número y/o ubicación del polímero y/o la fracción (por ejemplo, el agente activo) al cual el polímero está acoplado, puede ser determinado usando un indicador o detector conveniente. Tales etiquetas incluyen, aunque sin limitación, fluorescentes, luminosos químicos, fracciones usados en el etiquetado de enzimas, fracciones colorimétricas, (es decir, tintes) , iones metales, fracciones radiactivas, y así sucesivamente. Entre los indicadores convenientes están fotómetros, películas, espectrómetros, y así sucesivamente. El grupo protector de terminación también puede ventajosamente comprender un fosfolípido. Cuando el polímero tiene un grupo protector de terminación que comprende un fosfolípido, propiedades únicas son impartidas al polímero y el conjugado resultante. Entre los fosfolípidos ejemplares están, sin limitación, aquellos seleccionados de la clase de fosfolípidos llamados fosfatidilcolinos . Entre los fosfolípidos específicos están, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo los dilauroilfosfatidilcolinos, dioleilfosfatidilcolinos, dipalmitoilfosfatidilcolinos, disteroilfosfatidilcolinos, behenoilfosfatidilcolinos, arachidoilfosfatidilcolinos y lecitina.

[0030] "De surgimiento no natural", con respecto a un polímero, tal como es descrito en este documento, se refiere a un polímero que no es hallado en su integridad en la naturaleza. Un polímero de surgimiento no natural puede, sin embargo, contener uno o más monómeros o segmentos de monómeros que sean de surgimiento natural, siempre que la estructura general del polímero no se encuentre en la naturaleza.

[0031] El término "soluble en agua", como en "polímero soluble en agua" , se refiere a cualquier polímero que sea soluble en agua a la temperatura de una habitación. Generalmente, un polímero soluble en agua transmitirá por lo menos cerca del 75%, más preferiblemente por lo menos cerca del 95%, de luz transmitida por la misma solución después del filtrado. Sobre la base del peso, un polímero soluble en agua preferiblemente será por lo menos cerca del 35% (del peso) soluble en agua, más preferiblemente por lo menos cerca del 50% (del peso) soluble en agua, y algo más preferiblemente cerca del 70% (del peso) soluble en agua, e incluso más preferiblemente cerca del 85% (del peso) soluble en agua. Es más preferido, sin embargo, que el polímero soluble en agua sea cerca del 95% (del peso) soluble en agua, o completamente soluble en agua.

[0032] El peso molecular en el contexto de un polímero soluble en agua, como PEG, puede ser expresado ya sea como un peso molecular en promedio numérico o como un peso molecular en promedio de peso. A menos que se indique de otra manera, todas las referencias a peso molecular en este documento se refieren al peso molecular en promedio de peso. Ambas determinaciones de peso molecular, tanto la de promedio numérico como la de promedio de peso, pueden ser medidas usando técnicas de cromatografía de permeación en gel, u otras técnicas de cromatografía líquida. Otros métodos para la medición de los valores de peso molecular también pueden ser usados, como el uso de análisis de grupo final, o la medición de las propiedades coligativas, (por ejemplo, depresión del punto de fusión, aumento ebulloscópico, o presión osmótica) para determinar el peso molecular en promedio numérico, o el uso de técnicas de difusión de ondas de luz, ultracentrifugado o viscometría para determinar el peso molecular en promedio de peso. Los polímeros del invento son generalmente polidispersos (es decir, el peso molecular en promedio numérico y el peso molecular en promedio de peso de los polímeros no son iguales) , poseyendo valores bajos de polidispersidad, preferiblemente de menos que cerca de 1,2, más preferiblemente de menos de cerca de 1,15; algo más preferiblemente de menos que cerca de 1,10; aún más preferiblemente de menos que cerca de 1,05; y más preferiblemente de menos que cerca de 1,03. Tal como son usadas en este documento, a veces se harán referencias a un particular polímero soluble en agua que tenga ya sea un peso molecular en promedio de peso o un peso molecular en promedio numérico; se entenderá que tales referencias significarán que el polímero individual soluble en agua fue obtenido de una composición de polímeros solubles en agua, con el peso molecular declarado.

[0033] Los términos "activo" o "activado", cuando se usan en conjunción con un grupo funcional en particular, se refieren a un grupo funcional reactivo, que reacciona rápidamente con electrófilo o nucleófilo en otra molécula. Esto es en contraste con aquellos grupos que requieren catalizadores fuertes o condiciones reactivas altamente imprácticas a fin de reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte" ) .

[0034] Tal como se usa en este documento, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo de éste, comprenden formas protegidas de éste, así como formas no protegidas .

[0035] Los términos "fracción espadadora", "unión" o "vínculo" son usados en este documento para referirse a un átomo o a un grupo átomos usados para enlazar fracciones interconectadas, como un término de un polímero y una fracción GM-CSF, o un electrófilo o nucleófilo de una fracción GM-CSF. La fracción espadadora puede ser hilidrolíticamente estable o puede incluir una unión o vínculo fisiológicamente hidrolizable, o enzimáticamente degradable .

[0036] "Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, cuya longitud generalmente oscila entre 1 y 15 átomos . Tales cadenas de hidrocarburo son preferiblemente (pero no necesariamente) saturadas, y puede ser de cadena ramificada o directa, aunque generalmente se prefiere la cadena directa. Entre los grupos ejemplares de alquilo están el metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilobutilo, 1-etilopropilo, 3-metilopentilo, y demás. Tal como es usado en este documento, "alquilo" incluye cicloalquilo, así como un alquilo que contenga cicloalquileno .

[0037] "Alquilo bajo" se refiere a un grupo alquilo que contiene de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena directa o ramificada. Algunos ejemplos no limitantes de alquilo bajo son el metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, y t-butilo.

[0038] "Cicloalquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo cíclico, saturada o no saturada, incluyendo compuestos con puente, fusionados, o espiro cíclicos, preferiblemente constituidos por una cantidad entre 3 y cerca de 12 átomos de Carbono, más preferiblemente entre 3 y cerca de 8 átomos de Carbono. "Cicloalquileno" se refiere a un grupo cicloalquilo que es insertado en una cadena de alquilo, uniendo la cadena en dos átomos cualesquiera en el sistema cíclico de anillos.

[0039] "Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo C?-6 (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, y así sucesivamente) .

[0040] El término "sustituido", como por ejemplo en "alquilo sustituido" se refiere a una fracción (por ejemplo, un grupo alquilo) sustituido con uno o más sustitutos no interferentes como los siguientes, sin estar limitados a ellos: alquilo, cicloalquilo C3_8, por ejemplo, ciclopropilo, ciclobutilo y así sucesivamente; halógenos, por ejemplo, fluoro, cloro, bromo y yodo; ciano, alcoxi, fenilo bajo, fenilo sustituido, y así sucesivamente. "Arilo sustituido" se refiere al arilo con uno o más sustitutos no interferentes. Para sustituciones en el anillo fenilo, los sustitutos pueden estar en cualquier orientación (es decir, orto, meta o para) .

[0041] "Sustitutos no interferentes" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, son generalmente no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula.

[0042] "Arilo" se refiere a uno o más anillos aromáticos, cada uno de 5 o 6 átomos con carbono. Arilo incluye anillos múltiples de arilo que pueden estar fusionados como en naftilo, o no fusionados, como en el bifenilo. Los anillos de Arilo también pueden estar fusionados o no fusionados con uno o más hidrocarburos cíclicos, heteroarilo, o anillos heterocíclicos. Tal como es usado en este documento, "arilo" incluye el heteroarilo y heterociclo.

[0043] "Heteroarilo" es un grupo arilo que contiene de uno a cuatro heteroátomos, preferiblemente azufre, oxígeno o nitrógeno, o una combinación de éstos. Los anillos de heteroarilo también pueden estar fusionados con uno o más anillos cíclicos de hidrocarburos heterocíclicos, arilo, o heteroarilo. Tal como es usado en este documento, "heteroarilo" incluye el heteroarilo sustituido.

[0044] "Heterociclo" o "heterocíclico" se refiere a uno o más anillos de 5-12 átomos, preferiblemente de 5-7 átomos, con o sin insaturación o carácter aromático y teniendo por lo menos un átomo de anillo que no sea un carbono. Entre los heteroátomos preferidos están el azufre, el oxígeno, y el nitrógeno. Tal como es usado en este documento, "heterociclo" incluye el heterociclo sustituido.

[0045] "Heteroarilo sustituido" es un heteroarilo que tiene uno o más grupos no interferentes como sustituyentes .

[0046] "Heterociclo sustituido" es un heterociclo que tiene una o más cadenas laterales formadas de sustituyentes no interferentes .

[0047] Un "radical orgánico", tal como es usado en este documento, debe incluir alquilo, alquilo sustituido, arilo y arilo sustituido.

[0048] "Electrófilo" y "grupo electrofílico" se refieren a un ion o átomo, o grupo átomos, que pueden ser iónicos, teniendo un centro electrofílico, es decir, un centro que está en busca de electrones, capaz de reaccionar con un nucleófilo.

[0049] "Nucleófilo" y "grupo nucleofílico" se refieren a un ion o átomo, o grupo átomos, que pueden ser iónicos, teniendo un centro nucleofílico, es decir, un centro que está en busca de un centro electrofílico, o capaz de reaccionar con un electrófilo.

[0050] Un enlace o unión "hidrolíticamente degradable" o "hidrolizable" es un enlace que reacciona con agua, (es decir, es hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas. Se prefieren enlaces que tengan una vida promedio de la hidrólisis en un pH 8,25 °C de menos de 30 minutos. La tendencia de un enlace a hidrolizar en agua dependerá no solo del tipo general de vínculo o enlace que conecta dos átomos centrales, sino también de los sustituyentes enlazados a los dos átomos centrales determinados. Entre los vínculos apropiados, hidrolíticamente inestables o débiles, están pero no se limitan a: éster carbolinato, éster fosfato, anhídridos, acétales, quetales, éter aciloxialquilo, iminas, ortoésteres, péptidos y oligonucleótidos.

[0051] Un "enlace enzimáticamente degradable" se refiere a un enlace que está sujeto a la degradación por parte de una o más enzimas.

[0052] Un vínculo o enlace "hidrolíticamente estable" se refiere a un vínculo químico, generalmente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en el agua, es decir, no sufre hidrólisis bajo condiciones fisiológicas en una magnitud apreciable durante un período extendido de tiempo. Entre los ejemplos de vínculos hidrolíticamente estables se encuentran, pero no están limitados a, los siguientes: enlaces de carbono-carbono (por ejemplo, en las cadenas alifáticas) , éteres, amidas, uretano, y así sucesivamente. Generalmente, un enlace hidrolíticamente estable es uno que exhibe una proporción de hidrólisis menor que aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas. Las proporciones de hidrólisis de los enlaces químicos representativos pueden encontrarse en la mayoría de los libros regulares de texto para química.

[0053] "Excipiente farmacéuticamente aceptable" se refiere a un ingrediente que puede ser incluido opcionalmente en las composiciones del invento, y que no ocasiona un efecto tóxico adverso significativo para el paciente, al serle administrado.

[0054] "Cantidad terapéuticamente efectiva" es usado en este documento para referirse a la cantidad de una fracción molecular GM-CSF polímero que se necesita para proveer el nivel deseado del conjugado (o fracción GM-CSF no conjugado correspondiente) en el torrente sanguíneo o en el tejido designado. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo la fracción particular GM-CSF, los componentes y características físicas de la composición terapéutica, la población de pacientes a la cual se apunta, el modo de transmisión o entrega, consideraciones individuales del paciente, y demás, y puede ser determinada rápidamente por una persona con habilidades en el arte .

[0055] "Multifuncional" se refiere a un polímero que tiene tres o más grupos funcionales contenidos en él, donde los grupos funcionales pueden ser iguales o diferentes . Los reactivos poliméricos multifuncionales generalmente contienen desde cerca de 3-100 grupos funcionales, o desde 3-50 grupos funcionales, o desde 3-25 grupos funcionales, o desde 3-15 grupos funcionales, o desde 3 a 10 grupos funcionales, o pueden contener 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 grupos funcionales dentro del "backbone" polímero.

[0056] El término "fracción GM-CSF", tal como se usa en este documento, se refiere a una fracción que tiene actividad GM-CSF. La fracción GM-CSF también tendrá por lo menos un grupo electrofílico o grupo nucleofílico apropiado para reacción con un reactivo polimérico. La fracción GMCSF es una proteína, esto es, compuesta de una serie de monómeros hechos de aminoácido, opcionalmente glicosilado en una o más ubicaciones. Adicionalmente, el término "fracción GM-CSF" comprende tanto la fracción GM-CSF antes de la conjugación, como el residuo de la fracción GM-CSF después de la conjugación. Como será explicado en detalle más abajo, alguien con habilidad ordinaria en la materia puede determinar si una fracción determinada tiene actividad GM-CSF. Una proteína que contiene una secuencia aminoácida correspondiente a las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, es una fracción GM-CSF, así como cualquier proteína o polipéptido sustancialmente homólogo a éste, y cualquiera de SEQ ID NOs 1 , 2 y 3 , comenzando con un residuo metionilo, cuyas propiedades biológicas resultan en la actividad de GM-CSF en ambos casos. Tal como se usa en este documento, el término "fracción GM-CSF" incluye proteínas modificadas deliberadamente, como por ejemplo, por mutagénesis orientada al sitio, o accidentalmente, a través de mutaciones El término "fracción GM-CSF" incluye además derivados que tienen de 1 a 6 sitios adicionales de glicosilación, teniendo los derivados por lo menos un aminoácido adicional en el extremo terminal carboxi de la proteína en la cual el aminoácido adicional o los aminoácidos adicionales incluye (n) por lo menos un sitio de glicosilación, y los derivados que tienen una secuencia de aminoácidos que incluye por lo menos un sitio de glicosilación.

[0057] El término "sustancialmente homólogo" significa que una secuencia particular de tema, por ejemplo, una secuencia mutante, varía de una secuencia de referencia por una o más sustituciones, eliminaciones o adiciones, el efecto red del cual no resulta en una disimilitud funcional adversa entre la referencia y las secuencias de tema. Para propósitos del presente invento, las secuencias que tienen más del 95 por ciento de homología, propiedades biológicas equivalentes (aunque potencialmente tengan diferentes grados de actividad) , y características de expresión equivalentes, son consideradas sustancialmente homologas. Para propósitos de determinación de homología, el truncamiento de la secuencia madura debe ser descartado. Las secuencias que tienen menores grados de homología, bioactividad comparable, y características de expresión equivalente, son consideradas equivalentes sustanciales. Entre las fracciones ejemplares GM-CSF para ser usadas aquí, están aquellas proteínas que tienen una secuencia que es sustancialmente homologa a una o más de las secuencias seleccionadas del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO : 2, y SEQ ID NO: 3.

[0058] El término "fragmento" se refiere a cualquier proteína o polipéptido que tiene la secuencia aminoácido de una porción de una fracción GM-CSF que mantiene algún grado de actividad GM-CSF. Entre los fragmentos están las proteínas o polipéptidos producidos por degradación proteolítica de la proteína GM-CSF, o producidos por síntesis química mediante métodos de rutina en la materia. La determinación de si un fragmento particular tiene actividad GM-CSF puede ser llevada a cabo por una persona con habilidades ordinarias en el arte . Una evaluación apropiada que puede ser utilizada para demostrar tal actividad es descrita aquí .

[0059] Una "variante de eliminación" de una fracción GM-CSF es un péptido o proteína en el cual un residuo aminoácido de la fracción GM-CSF ha sido eliminada, y los residuos aminoácido que preceden y que siguen al residuo aminoácido eliminado están conectados a través de un enlace de amida (excepto en lugares donde el residuo aminoácido eliminado estaba localizado en un punto terminal del péptido o proteína) . Entre las variantes de eliminación están lugares donde sólo un residuo aminoácido en particular ha sido eliminado, así como los lugares donde dos aminoácidos son eliminados, tres aminoácidos son eliminados, cuatro aminoácidos son eliminados, y así sucesivamente. Cada variante de eliminación debe, sin embargo, mantener cierto grado de actividad GM-CSF.

[0060] Una "variante de sustitución" de una fracción GM-CSF es un péptido o proteína en el cual un residuo aminoácido de la fracción GM-CSF ha sido eliminada, y un residuo aminoácido diferente ha tomado su lugar. Entre las variantes de sustitución están casos donde sólo un residuo aminoácido en particular ha sido sustituido, así como los lugares donde dos aminoácidos son sustituidos, tres aminoácidos son sustituidos, cuatro aminoácidos son sustituidos, y así sucesivamente. Cada variante de sustitución debe, sin embargo, tener cierto grado de actividad GM-CSF.

[0061] Una "variante de adición" de una fracción GM-CSF es un péptido o proteína en el cual un residuo aminoácido del GM-CSF ha sido añadido al interior de una secuencia de aminoácido y los residuos de aminoácido adyacentes son enlazados al residuo aminoácido que se añadió, por medio de enlaces de amida (excepto en lugares donde el residuo aminoácido añadido estaba localizado en un punto terminal del péptido o proteína, donde un solo enlace de amida se enlaza al residuo aminoácido) . Entre las variantes de adición están casos donde sólo un aminoácido en particular ha sido adicionado o añadido, así como los lugares donde dos aminoácidos son añadidos, tres aminoácidos son añadidos, cuatro aminoácidos son añadidos, y así sucesivamente. Cada variante de adición debe, sin embargo, tener cierto grado de actividad GM-CSF.

[0062] El término "paciente" se refiere a un organismo viviente que sufre de una condición que puede ser prevenida o tratada por la administración de un agente activo (por ejemplo, un conjugado) , o está propenso a esa condición, e incluye tanto seres humanos como animales.

[0063] "Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia descrita enseguida puede o no puede ocurrir, de modo que la descripción incluye instancias donde la circunstancia ocurre, e instancias donde no ocurre .

[0064] "Sustancialmente" (a menos que sea específicamente definido para un contexto particular en algún lugar diferente, o que el contexto indique claramente otra cosa) significa casi totalmente, o completamente, por ejemplo, satisfaciendo uno o más de los siguientes: más del 50%, 51% o mayor, 75% o mayor, 80% o mayor, 90% o mayor, y 95% o mayor, de la condición.

[0065] A menos que el contexto indique claramente otra cosa, cuando el término "cerca de", o "alrededor de" preceda a un valor numérico, debe entenderse que éste significa ± el 10% del valor numérico declarado.

[0066] Los residuos de aminoácido en péptidos son abreviados como sigue: Fenilalanina es Phe o F; Leucina es Leu o L; Isoleucina es lie o I; Metionina es Met o M; Valina es Val o V; Serina es Ser o S; Prolina es Pro o P; Treonina es Thr o T; Alanina es Ala o A; Tirosina es Tyr o Y; Histidina es His o H; Glutamina es Gln o Q; Asparagina es Asn o N; Lisina es Lys o K; Ácido aspártico es Asp o D; Ácido glutámico es Glu o E; Cisteína es Cys o C; Triptófano es Trp o ; Arginina es Arg o R; y Glicina es Gly o G.

[0067] Volviendo a una o más representaciones del invento, un conjugado es provisto, lo conjugado comprendiendo una fracción GM-CSF enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora conformada por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua. Los conjugados del invento tendrán una o más de las siguientes características .

[0068] La fracción GM-CSF.

[0069] Tal como se declaró anteriormente, el término "fracción GM-CSF" deberá incluir la fracción GM-CSF antes de la conjugación, así como la fracción GM-CSF después del enlace a un polímero soluble en agua (sea dicho enlace hecho directamente o a través de una fracción espaciadora) . Se entenderá, sin embargo, que cuando la fracción GM-CSF es enlazada (sea directamente o a través de una fracción espaciadora) a un polímero no péptico soluble en agua, la fracción GM-CSF es levemente alterada debido a la presencia de uno o más enlaces covalentes asociados con enlace al polímero (o fracción espaciadora que es enlazada al polímero) . A menudo, esta forma levemente alterada de la fracción GM-CSF enlazada a otra molécula recibe el nombre de "residuo" del la fracción GM-CSF.

[0070] La fracción GM-CSF puede ser derivada, ya sea de métodos no recombinantes o por métodos recombinantes , y el invento no está limitado en este sentido.

[0071] La fracción GM-CSF puede ser derivada de manera no recombinante. Por ejemplo, GM-CSF puede ser obtenido de fuentes derivadas de la sangre. En particular, el GM-CSF puede ser aislado del plasma humano o de los tej idos usando técnicas conocidas para quienes tienen habilidades ordinarias en el arte (por ejemplo, técnicas de precipitación y centrifugación, y técnicas cromatográficas) .

[0072] La fracción GM-CSF puede ser derivada de métodos recombinantes. Por ejemplo, el código cDNA para el GM-CSF humano (una fracción GM-CSF preferida) , ha sido aislado, caracterizado y clonado en vectores de expresión. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos, bajo números 5.078.996 y 5.891.429, y Wong et al . (1985) "Human GM-CSF: Molecular Cloning of the Complementary DNA and Purification of the Natural and Recombinant Proteins" , Science 218:819, y Cantrell et al . (1985) "Cloning, Sequence, and Expression of a Human Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor", Proc. Nati . Acad. Sci . U. S.A. , Vol. 82:6250. Las fracciones GM-CSF expresadas en sistemas de expresión bacteriano (Escherichia coli) , mamífero (por ejemplo, las células del ovario de marmotas chinas) , y levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae) .

[0073] Una vez expresado, el endógeno humano GM-CSF es una glicoproteína monomérica con un peso molecular de cerca de 22.000 Daltons. La secuencia de aminoácido expresada es provista como SEQ ID No: 1. Preferido para su uso como una fracción GM-CSF aquí, está una cantidad de secuencias aminoácidos de GM-CST humano. Por lo menos tres proteínas humanas GM-CSF diferentes han sido producidas en diversos sistemas de expresión, sargramostim; molgramostim; regramostim; and ecogramostim. Sargramostim es expresado en Saccharomyces cerevisiae, tiene una sustitución aminoácida de leucina, en una posición 23 (SEQ ID NO: 2) comparado con el endógeno humano GM-CSF, y está O-glicosilado. Molgratism es expresado en Escherichia coli , y es no glicosilado. Regramostim es producida en las células de los ovarios de marmotas (CHO) , y es completamente glicosilada. Se contemplan también versiones de metionilo, de estas proteínas, donde un residuo metiono antecede a la secuencia completa de aminoácido. A menos que se indique específicamente, todas las asignaciones de ubicación numérica de un residuo aminoácido, tal como está descrito aquí, con base en SEQ ID NO: 1.

[0074] Los métodos recombinantes ejemplares usados para preparar una fracción GM-CSF (sea un GM-CFS nativo o una proteína diferente, o una proteína diferente que tenga actividad de Factor IX) pueden ser descritos brevemente. Tales métodos involucran la construcción del ácido nucleido codificando el polipéptido deseado o un fragmento, clonando el ácido nucleico en un vector de expresión, transformando una célula anfitriona (por ejemplo, planta, bacteria tal como Escherichia coli, levadura como as Saccharornyces cerevisiae, o célula de mamífero como las células del ovario de una marmota china, o una célula de riñon de marmota bebé) , y expresando el ácido nucleico para producir el polipéptido o fragmento deseado. La expresión puede ocurrir a través de una expresión exógena (cuando la célula anfitriona contiene naturalmente el código genético deseado) o a través de una expresión endógena. Los métodos para la producción y expresión de polipéptidos recombinantes in vitro y en células procarióticas y eucarióticas son conocidos por aquellos de habilidad ordinaria en el arte. Véase por ejemplo, la patente No. 4.868.122, de Estados Unidos.

[0075] Para facilitar la identificación y purificación del polipéptido recombinante, las secuencias de ácido nucleico que codifican para un "epitope tag" u otra secuencia enlazante de afinidad pueden ser insertadas o añadidas en el marco con la secuencia de codificación, produciendo así una proteína de fusión compuesta por el polipéptido deseado y un polipéptido preparado para el enlace. Las proteínas de fusión pueden ser identificadas y purificadas haciendo correr primero una mezcla con la proteína de fusión a través de una columna de afinidad que cargue fracciones enlazantes (por ejemplo, anticuerpos) dirigidos contra el "epitope tag" u otra secuencia enlazante en las proteínas de fusión, enlazando así la proteína de fusión dentro de la columna. Después de esto, la proteína de fusión puede ser recuperada lavando la columna con la solución apropiada (por ejemplo, ácido) para liberar la proteína de fusión enlazada. El polipéptido recombinante también puede ser identificado y purificado mediante la separación de las células anfitrionas, separando el polipéptido, por ejemplo, por cromatografía de exclusión de tamaño, y recogiendo el polipéptido. Estos y otros métodos para la identificación y purificación de polipéptidos recombinantes se conocen como aquellos de habilidad ordinaria en el arte . En una o más representaciones del presente invento, sin embargo, se prefiere que la fracción GM-CSF no esté en la forma de una proteína de fusión.

[0076] Dependiendo del sistema usado para expresar las proteínas que tienen actividad GM-CSF, la fracción GMCSF puede estar desglicosilada o glicosilada y ambas pueden ser usadas. Esto es, la fracción GM-CSF puede ser desglicosilada o la fracción GM-CSF puede ser glicosilada. En una o más representaciones del invento, se prefiere que la fracción GM-CSF sea glicosilada. Algunos ejemplos de glicosilación son O-glicosilación, y N-glicosilación. Se cree que los sitios de glicosilación del endógeno humano GM-CSF son serina 9 (O-glicosilación) , treonina 10 (O-glicosilación) , asparagina 27 (N-glicosilación) , y asparagina 37 (N-glicosilación) . Los arreglos de glicosilación preferidos de cualquier fracción GM-CSF ocurrirán en estos sitios (o sitios correspondientes a estas ubicaciones sobre la fracción GM-CSF determinada) . Así, la fracción GM-CSF puede tener un grado de glicosilación seleccionado del grupo que consta de: no glicosilación, glicosilación en un solo sitio, glicosilación en dos sitios, glicosilación en tres sitios, y glicosilación en cuatro sitios. Un arreglo de glicosilación particularmente preferido es O-glicosilación solamente en serina 9 y treonina 10, y sin N-glicosilación.

[0077] La fracción con actividad GM-CSF puede ventajosamente ser modificada para incluir uno o más residuos de aminoácido tales como, por ejemplo, lisina, cisteína y/o arginina, a fin de proveer un enlace fácil de un polímero a un átomo dentro de un aminoácido. Por ejemplo, la patente No. 6.608.183 de los Estados Unidos describe secuencias de "adición de cisteína" de GM-CSF, que pueden ser usadas como una fracción GM-CSF, y métodos para preparar tales secuencias de "adición de cisteína" . Adicionalmente, la fracción GM-CSF puede ser modificada para incluir un residuo aminoácido de surgimiento no natural. Las técnicas para añadir residuos de aminoácido y residuos aminoácidos de surgimiento no natural son bien conocidas por aquellos que tienen habilidades ordinarias en el arte. Véase, por ejemplo, la patente No. 5.393.870 de los Estados Unidos, y J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th. Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992) .

[0078] Adicionalmente, la fracción GM-CSF puede ventajosamente ser modificada para incluir el enlace de un grupo funcional (diferente del que se hace a través de la adición de un residuo aminoácido que contenga un grupo funcional) . Por ejemplo, la fracción GM-CSF puede ser modificada para incluir un grupo tiol. Además, la fracción GM-CSF puede ser modificada para incluir un alfa carbón N-terminal. Adicionalmente, la fracción GM-CSF puede ser modificada para incluir uno o más fracciones de carbohidratos. Las fracciones GM-CSF modificadas para contener un aminoxi, aldehido u otro grupo funcional también pueden ser usados . Además, pueden usarse variantes de GM-CSF como una fracción GM-CSF. Véase, por ejemplo, la patente No. 5.358.707 de los Estados Unidos. Los derivativos de GM-CSF también son incluidos como fracciones GM-CSF. Véase la patente No. 5.298.603 de los Estados Unidos .

[0079] Algunos ejemplos no limitantes de fracciones GM-CSF son los siguientes: Un GM-CSF humano; proteínas híbridas que contengan actividad GM-CSF, y miméticos pépticos que contengan actividad GM-CSF. Fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de las anteriores, que mantengan por lo menos algún grado de actividad GM-CSF, también pueden servir como una fracción GM-CSF.

[0080] Para cualquier fracción GM-CSF dada, es posible determinar si esa fracción tiene actividad GM-CSF. Por ejemplo, tal como se describe en la patente No. 5.393.870 de los Estados Unidos, la médula del hueso humano de la cresta iliaca, tomada de donantes saludables, puede ser recogida, ubicada en una solución y centrifugada, con células siendo reunidas y diluidas para su cultivo subsiguiente. Después del cultivo, cada colonia de células puede ser identificada y la fracción GM-CSF propuesta puede ser añadido a la colonia apropiada, y evaluada para proliferación acelerada en relación con un control . Otros métodos conocidos para quienes tienen habilidades ordinarias en el arte, también pueden ser usados para determinar si una fracción determinada tiene actividad GMCSF. Tales métodos son útiles para determinar la actividad GM-CSF tanto de la fracción en sí mismo (y entonces puede ser usada como una "fracción GM-CSF"), como el correspondientes conjugado de fracción polímero.

[0081] Algunos ejemplos no limitantes de la fracción GM-CSF son los siguientes: Un GM-CSF humano, tal como está identificado en cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3; versiones truncadas de éstos, variantes híbridas y miméticos pépticos que tengan actividad GM-CSF. Fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de las anteriores, que mantengan por lo menos algún grado de actividad GM-CSF, también pueden servir como una fracción GM-CSF.

[0082] Dependiendo del sistema usado para expresar las proteínas que tienen actividad GM-CSF, la fracción GMCSF puede estar desglicosilada o glicosilada y ambas pueden ser usadas. Esto es, la fracción GM-CSF puede ser desglicosilada o la fracción GM-CSF puede ser glicosilada.

[0083] El polímero soluble en agua

[0084] Como se analizó previamente, cada conjugado comprende un GM-CSF enlazado (ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora que contenga uno o más átomos) a un polímero soluble en agua. Con respecto al polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua es no péptico, no tóxico, de surgimiento no natural y biocompatible. Con respecto a la biocompatibilidad, una sustancia es considerada biocompatible si los efectos benéficos asociados con el uso de la sustancia en sí misma o con otra sustancia (por ejemplo, un agente activo como una fracción GM-CSF) en conexión con tejidos vivientes (por ejemplo, la administración a un paciente) pesa más que cualquier efecto deletéreo según la evaluación de un profesional médico, por ejemplo, un doctor en medicina. Con respecto a no inmunogenicidad, una sustancia es considerada no inmunogénica si el uso pretendido de la sustancia in vivo no produce una respuesta inmunológica no deseada (por ejemplo, la formación de anticuerpos) o, si se produce una respuesta inmunológica, tal respuesta no es considerada clínicamente significativa o importante, según la evaluación de un profesional médico. Es particularmente preferido que el polímero soluble en agua sea biocompatible y no inmunogénico.

[0085] Además el polímero soluble en agua generalmente se caracteriza por tener desde 2 hasta cerca de 300 termini. Entre los ejemplos de tales polímeros están, pero no están limitados a, poli (alquileno glicoles) tales como el polietileno glicol (PEG), el poli (propileno glicol) ("PPG"), copolímeros del etileno glicol y el propileno glicol y así sucesivamente, poli (poliol oxietilado) , poli (alcohol olefínico) , poli (vinilpirolidona) , poli (hidroxialquilometacrilamida) , poli (hidroxialquilometacrilato) , polisacáridos, poli (ácido a-hidroxi) , poli (alcohol vinilo), polifosfaceno, polioxazolina, poli (N-acriloilmorfolina) , y combinaciones de cualquiera de las anteriores .

[0086] El polímero no está limitado a una estructura particular y puede ser lineal (por ejemplo, PEG alcoxi o PEG bifuncional) , o no lineal, como la ramificada, tipo "forked" o bifurcados, de brazos múltiples (por ejemplo, PEGs enlazados a un centro poliol) , y tipo dendrita. Más aún, la estructura interna del polímero puede estar organizada en cualquier cantidad de patrones diferentes y puede ser seleccionada del grupo consistente en homopolímero, copolímero alternante, copolímero aleatorio, copolímero de bloque, tripolímero alternante, tripolímero aleatorio, y tripolímero de bloque.

[0087] El PEG activado y otros polímeros activados solubles en agua (colectivamente, "reactivos poliméricos") usados para formar conjugados con GM-CSF incluyen un grupo funcional activado, apropiado para acoplarse a un sitio deseado en la fracción GM-CSF. Así, un reactivo polimérico incluye un grupo funcional para reacción con la fracción GM-CSF. Los reactivos poliméricos y métodos representativos para la conjugación de estos polímeros a una fracción activa son conocidos en el arte, y además descritos en Zalipsky, S., et al., "Use of Functionalized Poly (?thylene Glycols) for Modif ication of Polipeptides" en Polyethylene Glycol Chemistry: Biotechnical y Biomedical Applications, J. M. Harris, Plenus Press, New York (1992) , y en Zalipsky (1995) Advanced Drug Reviews 16_: 157-182.

[0088] Generalmente, el peso molecular en promedio de peso del polímero soluble en agua en el conjugado es desde cerca de 100 Daltons hasta cerca de 150.000 Daltons. Los rangos ejemplares, sin embargo, incluyen pesos moleculares en promedio de peso, en un rango que es mayor que 5.000 Daltons hasta cerca de 150.000 Daltons, en un rango que es mayor que 5.000 Daltons hasta cerca de 100.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 6.000 Daltons hasta cerca de 100.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 6.000 Daltons hasta cerca de 90.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 10.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons, en un rango que es mayor que 10.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 15.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons en un rango que está desde cerca de 20.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 20.000 Daltons hasta cerca de 60.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 53.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 25.000 Daltons hasta cerca de 120.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 29.000 Daltons hasta cerca de 120.000 Daltons, en un rango que está desde cerca de 35.000 Daltons hasta cerca de 120.000 Daltons, y en un rango que está desde cerca de 40.000 Daltons hasta cerca de 120.000 Daltons. Para cualquier polímero soluble en agua en particular, los PEGs que tienen un peso molecular en uno o más de estos rangos, son preferidos .

[0089] Entre los pesos moleculares promedio de peso ejemplares para el polímero soluble en agua están cerca de 100 Daltons, cerca de 200 Daltons, cerca de 300 Daltons, cerca de 400 Daltons, cerca de 500 Daltons, cerca de 600 Daltons, cerca de 700 Daltons, cerca de 750 Daltons, cerca de 800 Daltons, cerca de 900 Daltons, cerca de 1.000 Daltons, cerca de 1.500 Daltons, cerca de 2.000 Daltons, cerca de 2.200 Daltons, cerca de 2.500 Daltons, cerca de 3.000 Daltons, cerca de 4.000 Daltons, cerca de 4.400 Daltons, cerca de 4.500 Daltons, cerca de 5.000 Daltons, cerca de 5.500 Daltons, cerca de 6.000 Daltons, cerca de 7.000 Daltons, cerca de 7.500 Daltons, cerca de 8.000 Daltons, cerca de 9.000 Daltons, cerca de 10.000 Daltons, cerca de 11.000 Daltons, cerca de 12.000 Daltons, cerca de 13.000 Daltons, cerca de 14.000 Daltons, cerca de 15.000 Daltons, cerca de 20.000 Daltons, cerca de 22.500 Daltons, cerca de 25.000 Daltons, cerca de 30.000 Daltons, cerca de 35.000 Daltons, cerca de 40.000 Daltons, cerca de 45.000 Daltons, cerca de 50.000 Daltons, cerca de 55.000 Daltons, cerca de 60.000 Daltons, cerca de 65.000 Daltons, cerca de 70.000 Daltons, y cerca de 75.000 Daltons. Versiones ramificadas del polímero soluble en agua (por ejemplo, un polímero soluble en agua de 40.000 Daltons, compuesto por dos polímeros de 20.000 Daltons) y que tengan un peso molecular total de cualquiera de las anteriores , también pueden ser usadas. En una o más representaciones, el conjugado no tendrá ningún fracción PEG enlazada, ya sea directa o indirectamente, con un PEG que tenga un peso molecular en promedio de peso menor que 6.000 Daltons.

[0090] Cuando se usan como polímeros, los PEGs generalmente comprenderán un número de monómeros (OCH2CH2) [o bien, monómeros (CH2CH20) , dependiendo de cómo sea definido el PEG] . Tal como se usa a lo largo de toda la descripción, el número de unidades que se repiten es identificado por el subíndice "n" en, por ejemplo, " (0CH2CH2)n" . Así, el valor de (n) generalmente cae dentro de uno o más de los siguientes rangos: desde 2 hasta cerca de 3400, desde cerca de 100 hasta cerca de 2300, desde cerca de 100 hasta cerca de 2270, desde cerca de 136 hasta cerca de 2050, desde cerca de 225 hasta cerca de 1930, desde cerca de 450 hasta cerca de 1930, desde cerca de 1200 hasta cerca de 1930, desde cerca de 568 hasta cerca de 2727, desde cerca de 660 hasta cerca de 2730, desde cerca de 795 hasta cerca de 2730, desde cerca de 795 hasta cerca de 2730, desde cerca de 909 hasta cerca de 2730, y desde cerca de 1.200 hasta cerca de 1.900. Para cualquier polímero dado, en el cual el peso molecular se conoce, es posible determinar el número de unidades que se repiten (es decir, "n" ) dividiendo el peso molecular en promedio de peso total del polímero entre el peso molecular del monómero repetitivo.

[0091] En relación con el peso molecular del polímero soluble en agua, en una o más representaciones del invento, un conjugado es provisto, comprendiendo éste una fracción GM-CSF convenientemente enlazada, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el peso molecular del polímero soluble en agua es mayor que 5.000 Daltons .

[0092] Un polímero particularmente preferido para el uso en el invento es un polímero de terminación cubierta, esto es, un polímero que tiene por lo menos una terminación cubierta con un grupo relativamente inerte, como el grupo alcoxi bajo (es decir, un grupo alcoxi C?-e) aunque un grupo hidroxilo también puede ser usado. Cuando el polímero es PEG, por ejemplo, se prefiere usar un PEG metoxi (comúnmente conocido como mPEG) , que es una forma lineal de PEG, donde la terminación del polímero tiene un grupo metoxi (-OCH3) , mientras la otra terminación es un hidroxilo u otro grupo funcional que puede ser opcionalmente modificado desde el punto de vista químico.

[0093] Una forma útil en el presente invento, un PEG libre o no enlazado es un polímero lineal terminado en cada extremo con grupos hidroxilo: p?-CB CUzO C?zQ 20 -cmlC??z-Ol?> Donde (n) generalmente oscila entre cero y cerca de 4.000.

[0094] El polímero de arriba, alfa-, omega-dihidroxilpoli (etileno glicol), puede ser representado en forma breve como HO-PEG-OH, donde se entiende que el símbolo -PEG- puede representar la siguiente unidad estructural : -CH2CH2O-(CH2CH2O)n-CH2CH2-, donde (n) es como se definió arriba.

[0095] Otro tipo de PEG útil en el presente invento es metoxi-PEG-OH, o mPEG en versión corta, en el cual un término es el grupo metoxi relativamente inerte, mientras el otro término es un grupo hidroxilo. La estructura de mPEG se muestra abajo.

CH3?-CH2CH2O-(CH2CH2O)„-CH2CH2-OH donde (n) es como se definió arriba.

[0096] Las moléculas PEG de brazos múltiples o ramificadas, tales como aquellas descritas en la patente de los EE.UU. No. 5.932.462, también pueden ser usadas como el polímero PEG. Por ejemplo, el PEG puede tener la estructura: polya- -p i Ff' I Donde : polya y polyb son PEGs de marcos o "backbone" (sean iguales o diferentes) , como el metoxi poli (etileno glicol); R" es una fracción no reactiva, como H, metilo, o un marco o backbone PEG; y P y Q son enlaces no reactivos. En algunos casos, la molécula PEG ramificada incluye un residuo de lisina. En una o más representaciones, el reactivo PEG ramificado que contiene residuo de lisina tendrá la siguiente estructura (aunque se muestra una estructura que contiene succinimidilo, los grupos reactivos diferentes al succinimidilo pueden ser reemplazados ahí . residuo de lisina Lisina Derivado succinimidilo mPEG ramificado En algunas instancias, se prefiere que el reactivo polimérico (así como el conjugado correspondiente preparado del reactivo polimérico) carezca de un residuo de lisina en el cual las porciones poliméricas estén conectadas a grupos de amina de la lisina, a través de un grupo "-OCH2CONHCH2CO-" . Aún en otras instancias, se prefiere que el reactivo polimérico (así como el conjugado correspondiente preparado del reactivo polimérico) carezca de un polímero ramificado soluble en agua, que incluya un residuo de lisina (donde el residuo de lisina es usado para actuar sobre la ramificación) .

[0097] Adicionalmente, el PEG puede comprender un PEG bifurcado. Un ejemplo de PEG bifurcado está representado por la siguiente estructura: / PEG-X-C-H \ Z donde X es una fracción espaciadora de uno o más átomos y cada Z es un grupo terminal activado, enlazado al átomo de carbono de C-H por un cadena de átomos de longitud definida. La Solicitud Internacional No. PCT/US99/05333 , revela varias estructuras PEG bifurcadas, útiles para ser usadas en una o más de las representaciones del presente invento. La cadena de átomos que enlazan los grupos funcionales Z al átomo de Carbono que se ramifica, sirven como un grupo que liga y puede comprender, por ejemplo, cadenas de alquilo, cadenas de éter, cadenas de éster, cadenas de amida y combinaciones de éstos .

[0098] El polímero PEG puede comprender una molécula PEG pendiente que tenga grupos reactivos, como el carboxilo, enlazado de manera covalente por toda la longitud del PEG, en vez de serlo por el final de la cadena PEG. Los grupos reactivos pendientes pueden ser enlazados al PEG directamente o a través de una fracción espaciadora, como un grupo alquileno.

[0099] Además de las formas de PEG arriba descritas, el polímero también puede ser preparado con uno o dos enlaces débiles o degradables (como un enlace hidrolíticamente degradable) en el polímero, incluyendo cualquiera de los polímeros arriba descritos. Por ejemplo, el PEG puede ser preparado con enlaces éster en el polímero que está sujeto a la hidrólisis. Como se muestra abajo, esta hidrólisis resulta en la división del polímero en fragmentos de peso molecular más bajo: -PEG-CO-PEG-+H2O ——** -PEG-COsH+HO-PEG- [00100] Entre otros enlaces hidrolíticamente degradables, útiles como enlace degradable dentro de un marco o "backbone" polímero, están: enlaces de carbonato; enlaces de imina resultantes, por ejemplo, de la reacción de una amina y un aldehido (véase, por ejemplo, Ouchi et al . (1997) Polymer Preprints 3_8 (1) : 582-3) ; enlaces éster de fosfato formados, por ejemplo, reaccionando un alcohol con un grupo fosfato; enlaces de hidrazona que generalmente se forman por la reacción de un hidrazido y un aldehido; enlaces acétales que generalmente se forman por la reacción entre un aldehido y un alcohol; enlaces de ortoéster que son formados, por ejemplo, por la reacción entre un formato y un alcohol; enlaces de amida formados por un grupo amino, por ejemplo, en una terminación de un polímero como PEG, y un grupo carboxilo de otra cadena PEG; enlaces de uretano formados por la reacción de, por ejemplo, un PEG con un grupo isocianato terminal y un alcohol PEG; enlaces péptidos formados por un grupo amina, por ejemplo, en una terminación de un polímero tal como PEG, y un grupo carboxilo de un péptido; y enlaces oligonucleótidos, formados por un grupo fosforamidita, por ejemplo, al final de un polímero, y un grupo hidroxilo 5 de un oligonucleótido . [00101] La presencia de uno o más enlaces degradables al interior de la cadena de polímero puede proveer control adicional sobre las propiedades farmacológicas finales deseadas para el conjugado, al administrarlo. Por ejemplo, puede administrarse un conjugado grande y relativamente inerte (por ejemplo, que tenga una o más cadenas PEG de peso molecular alto, enlazadas a una fracción GM-CSF, por ejemplo, una o más cadenas PEG que tengan un peso molecular mayor que cerca de 20.000, donde el conjugado esencialmente no posee bioactividad) , el cual está hidrolizado para generar un conjugado bioactivo con una porción de la cadena PEG original. De esta manera, las propiedades del conjugado pueden ser más fácilmente moldeadas para balancear la bioactividad del conjugado a través del tiempo. [00102] Quienes tienen habilidades ordinarias en el arte reconocerán que la discusión anterior concerniente a segmentos de polímero sustancialmente solubles en agua no es de ninguna manera exhaustiva, y es simplemente ilustrativa, y que todos los materiales poliméricos que tengan las cualidades descritas arriba, están contemplados. Tal como se usa en este documento, el término "reactivo polimérico" generalmente se refiere a una molécula entera, que puede comprender un segmento de polímero soluble en agua y un grupo funcional . [00103] Conjugados [00104] Tal como fue descrito arriba, un conjugado del invento comprende un polímero soluble en agua enlazado de manera covalente (ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora) a una fracción GM-CSF. Generalmente, para cualquier conjugado determinado, habrá de uno a cuatro polímeros solubles en agua enlazados de manera covalente a una fracción GM-CSF (donde por cada polímero soluble en agua, el polímero soluble en agua puede ser enlazado, sea directamente al fracción GM-CSF, o a través de una fracción espaciadora) . En algunas instancias, sin embargo, el conjugado puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF (una vez más, con respecto a cada polímero soluble en agua, enlazado directamente o a través de una fracción espaciadora) . Adicionalmente, el conjugado puede incluir no más de 8 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF, no más de 7 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF, no más de 6 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF, no más de 5 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF, no más de 4 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF, no más de 3 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF, no más de 2 polímeros solubles en agua enlazados individualmente a una fracción GM-CSF, y no más de 1 polímero soluble en agua enlazado a una fracción GMCSF. [00105] El enlace particular entre la fracción GMCSF y el polímero soluble en agua (o la fracción espaciadora que está enlazada al polímero soluble en agua) depende de una cantidad de factores . Entre tales factores están, por ejemplo, el químico específico de enlace empleado, la fracción particular GM-CSF, los grupos funcionales disponibles dentro del la fracción GM-CSF (sea para enlace a un polímero o conversión a un sitio de enlace conveniente) , la posible presencia de grupos funcionales reactivos adicionales dentro del la fracción GM-CSF, y así sucesivamente . [00106] En una o más representaciones del invento, el enlace entre la fracción GM-CSF y el polímero (o la fracción espaciadora que es enlazada al polímero) es un enlace hidrolíticamente estable, tal como una amida, uretano (también conocido como carbamato) , amina, tioéter (también conocido como sulfito) , o urea (también conocida como carbamida) . En una o más representaciones, el enlace no resulta de la reacción del reactivo polimérico que carga un grupo funcional con la fracción GM-CSF, donde el grupo funcional es seleccionado del grupo que consta de triazina, hidracina, hidracida, aldehido, semicarbazido, maleimida, vinilsulfona, fenilglioxal, isocianato, isotiocianato, amina y el grupo funcional tresilo con la fracción GM-CSF. [00107] En una o más representaciones del invento, el enlace entre la fracción GM-CSF y el polímero soluble en agua (o la fracción espaciadora que está enlazada al polímero soluble en agua) es un enlace degradable. De esta manera, el enlace que une la fracción GM-CSF es "degradable". En otras palabras, el polímero soluble en agua (y la fracción espaciadora, cuando está presente) se divide (ya sea a través de hidrólisis, procesos enzimáticos u otra alternativa) , resultando así la fracción nativa o no conjugada de GM-CSF. Preferiblemente, los enlaces degradables resultan haciendo que el polímero soluble en agua (y cualquier fracción espaciadora) se separe del fracción GM-CSF in vivo, sin dejar ningún fragmento del polímero soluble en agua (y cualquier fracción espaciadora) . Entre los enlaces degradables ejemplares están el carbonato, el carboxilato éster, fosfato éster, tioléster, anhídridos, acétales, quetales, éter aciloxialquilo, iminas, y ortoésteres . Tales enlaces pueden estar rápidamente listos para la apropiada modificación ya sea del fracción GM-CSF (por ejemplo, la terminación del grupo C carboxilo de una proteína, o un grupo hidroxilo de cadena lateral de un aminoácido como la serina o treonina, contenida en el interior de la proteína) y/o el reactivo polimérico, usando métodos de acoplamiento comúnmente empleados en el arte. Más preferidos, sin embargo, son los enlaces hidrolizables que son rápidamente formados por la reacción de un polímero convenientemente activado, con un grupo funcional no modificado, contenido dentro del fracción que tiene actividad GM-CSF. [00108] En relación con los enlaces, en una o más representaciones del invento, es provisto un conjugado que comprende una fracción GM-CSF enlazada de manera covalente a un residuo aminoácido, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua. [00109] Los conjugados (contrariamente a una fracción GM-CSF no conjugada) pueden o no pueden poseer un grado mesurable de actividad GM-CSF. Es decir, un conjugado en concordancia con el invento poseerá entre un 0% y cerca del 100% o más de la bioactividad del fracción GM-CSF raíz no modificada. Preferiblemente, los compuestos que poseen poca o ninguna actividad GM-CSF generalmente contienen un enlace degradable que conecta el polímero al fracción, de manera que sin importar la falta de actividad en el conjugado, la molécula raíz activa (o un derivado de ésta que tenga actividad GM-CSF) es liberada por degradación del enlace (por ejemplo, hidrólisis sobre una división del enlace inducida por agua en ambiente acuoso) . Tal actividad puede ser determinada usando un modelo in-vivo o in-vitro conveniente, dependiendo de la actividad conocida del fracción particular, que tiene actividad GM-CSF. [00110] Idealmente, la degradación de un enlace degradable es facilitada a través del uso de enlaces hidrolíticamente hendibles y/o enzimáticamente degradables como uretano, amida, carbonato, o enlaces que contengan éster. De esta manera, el espacio del conjugado [a través de la reducción de polímero (s) individual (es) soluble (s) en agua] puede ser modulada seleccionando el tamaño del polímero molecular y el tipo de grupo funcional que proveerá las propiedades de distancia deseadas. Alguien con habilidades ordinarias en el arte puede determinar el tamaño molecular apropiado del polímero, así como el grupo funcional reductible. Por ejemplo, alguien de habilidad ordinaria en el arte, usando experimentos de rutina, puede determinar un tamaño molecular apropiado y el grupo funcional reductible, preparando primero una variedad de conjugados de (GM-CSF) -polímero con diferentes pesos moleculares en promedio de peso, y grupos funcionales reductibles o degradables, y obteniendo entonces el perfil de distancia para cada conjugado, administrando el conjugado a un paciente y tomando muestras periódicas de sangre y/o orina. Una vez haya sido obtenida una serie de perfiles de distancia para cada conjugado examinado, se puede identificar un conjugado que tenga la distancia deseada . [00111] Para conjugados que poseen un enlace hidrolíticamente estable que acopla la fracción GM-CSF al polímero soluble en agua, el conjugado generalmente poseerá un grado mesurable de actividad GM-CSF. Por ejemplo, tales conjugados se caracterizan generalmente por tener una bioactividad que satisface uno o más de los siguientes porcentajes relacionados con la fracción de GM-CSF no conjugado: por lo menos cerca del 2%, por lo menos cerca del 5%, por lo menos cerca del 10%, por lo menos cerca del 15%, por lo menos cerca del 25%, por lo menos cerca del 30%, por lo menos cerca del 40%, por lo menos cerca del 50%, por lo menos cerca del 60%, por lo menos cerca del 80%, por lo menos cerca del 85%, por lo menos cerca del 90%, por lo menos cerca del 95%, por lo menos cerca del 97%, por lo menos cerca del 100%, y más del 105% (medido en un modelo conveniente, como los presentados aquí, y/o bien conocidos en el arte) . Preferiblemente, los conjugados que tengan un enlace hidrolíticamente estable (por ejemplo, un enlace de amida) poseerán por lo menos algún grado de la bioactividad del la fracción GM-CSF raíz no modificada. [00112] Ahora serán descritos conjugados ejemplares. Se espera que la fracción GM-CSF comparta (por lo menos en parte) una secuencia de aminoácido similar, o relacionada con un GM-CSF humano. Así, como se indicó previamente, aunque se hará referencia a ubicaciones específicas o átomos dentro de un GM-CSF humano, tal referencia es sólo por conveniencia, y una persona con habilidades ordinarias en el arte será capaz de determinar prontamente la ubicación correspondiente o el átomo en otras fracciones que tengan actividad GM-CSF. En particular, la descripción provista aquí para un GM-CSF humano es a menudo aplicable no sólo para un GM-CSF humano, sino para fragmentos, variantes de eliminación, variantes de sustitución y variantes de adición, de cualquiera de las anteriores. [00113] Los grupos de aminos en fracciones GM-CSF proveen un punto de enlace entre la fracción GM-CSF y el polímero soluble en agua. Cada una de las fracciones GM-CSF humana provistas en SEC ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, comprende 14 residuos de lisina, y cada residuo de lisina contiene un grupo e-amino que puede estar disponible para conjugación, así como un terminal amino. Véase SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3. Así, puntos ejemplares de enlace incluyen enlace en un aminoácido (a través de la cadena lateral que contiene amina, en un residuo de lisina) en una posición cualquiera o más de las posiciones 25, 26, 28, 49, 55, 59, 61, 66, 64, 73, 77, 110, 114 y 115. Adicionalmente, otra fracción GM-CSF contiene 15 residuos de lisina que contienen amina (véase SEQ ID NO: 3) . Así, entre los puntos de enlace preferidos de este GMCSF se incluye enlace en el residuo de amina asociado con una lisina en cualquiera de las posiciones 23, 25, 26, 28, 49, 55, 59, 61, 66, 64, 73, 77, 110, 114 y 115. [00114] Hay una cantidad de ejemplos de reactivos poliméricos solubles en agua convenientes, que son útiles para la formación de enlaces covalentes con aminas disponibles de una fracción GM-CSF. Ejemplos específicos, junto con los conjugados correspondientes, son provistos en la Tabla 1, abajo. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y "(GM-CSF)", representa la fracción GM-CSF después de la conjugación al polímero soluble en agua. Aunque cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH20)J presentada en la Tabla 1 termina en un grupo "CH3" otros grupos (como H y benzilo) pueden ser sustituidos entonces .

Tabla 1 Reactivos poliméricos específicos de la amina, y conjugado de la fracción GM-CSF formada de lo mismo [00115] La conjugación de un reactivo polimérico a un grupo amina de una fracción GM-CSF puede ser efectuada por medio de una variedad de técnicas. En un enfoque, una fracción GM-CSF puede ser conjugada a un reactivo polimérico hecho funcional con un derivado succinimidilo (u otro grupo éster activado, donde los enfoques similares a los descritos para un derivado succinimidilo pueden ser usados para otros reactivos poliméricos con un grupo éster activado) . En este enfoque, el reactivo polimérico que carga un grupo succinimidilo puede ser enlazado la fracción GM-CSF en medio acuoso, a un pH de 7.0 a 9.0, aunque pueden resultar diferentes condiciones de reacción (por ejemplo, un pH más bajo como 6 ó 7, o diferentes temperaturas y/o menos de 15 °C) , al enlazar un polímero a una ubicación diferente en la fracción GM-CSF. [00116] Los conjugados ejemplares que pueden ser preparados usando, por ejemplo, reactivos poliméricos que contengan un éster reactivo, comprenden la siguiente estructura: Donde: POLY es un polímero soluble en agua; (a) es cero, o es uno; X1, cuando está presente, es una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos; R1 es hidrógeno, un radical orgánico, y GM-CSF es una fracción GM-CSF. [00117] Con respecto a la estructura correspondiente a la citada en el párrafo inmediatamente anterior, cualquiera de los polímeros solubles en agua y provistos aquí puede ser definido como POLY; cualquiera de las fracciones espadadoras provistas allí puede ser definida como X1 (cuando está presente) , cualquiera de los radicales orgánicos provistos aquí pude ser definido como R1 (en casos donde R^no es hidrógeno) , y cualquiera de las fracciones GM-CSF provistas aquí puede ser definida como GM-CSF. Con respecto a la estructura correspondiente a aquella citada en el párrafo inmediatamente precedente, se prefiere que: POLY sea un poli (etileno glicol) como H3CO (CH2CH20) , - , donde (n) es un entero que tiene un valor de entre 3 y 4000; (a) es uno; X1 es un alquileno C?-6, más preferiblemente seleccionado del grupo que consta de metileno (es decir, ~CH2-) , etileno (es decir, -CH2-CH2-) y propileno (es decir, -CH2-CH2-CH2-) ; R^-es H o un alquilo bajo, como el metilo o el etilo, y GM-CSF es un GM-CSF humano. [00118] Típico de otro acercamiento útil para conjugar la fracción GM-CSF a un reactivo polimérico es el uso de una reacción de aminación reductiva para conjugar una amina primaria de una fracción GM-CSF con un reactivo polímero hecho funcional con una ketona, aldehido, o una forma hidratada de éstos (por ejemplo, hidrato de ketona e hidrato aldehido) . En este acercamiento, la amina primaria del la fracción GM-CSF reacciona con el grupo carbonilo del aldehido o la ketona (o el correspondiente grupo contenedor de hidroxi, de un aldehido hidratado o ketona) , formando de esa manera una base Schiff. La base Schiff, a cambio, puede entonces ser convertida en forma reductiva a un conjugado estable, a través del uso de un agente reductor como el borohidrido de sodio. Las reacciones selectivas (por ejemplo, en el extremo N, son posibles) son posibles, particularmente con un polímero hecho funcional con una ketona o un alfametilo aldehido ramificado y/o bajo condiciones de reacción específicas (por ejemplo, pH reducido) . [00119] Conjugados ejemplares que pueden ser preparados usando, por ejemplo, reactivos poliméricos que contengan un aldehido (o hidrato aldehido) o ketona (o hidrato de ketona) , comprenden la siguiente estructura: Donde : POLY es un polímero soluble en agua; (d) es cero o uno; X2, cuando está presente, es una fracción espaciadora, compuesta por uno o más átomos; (b) es un entero que tiene un valor de uno a diez; (c) es un entero que tiene un valor de uno a diez; R2, en cada aparición, es H independientemente, o un radical orgánico; R3, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico, y GM-CSF es una fracción GM-CSF. [00120] Con respecto a la estructura correspondiente a la citada en el párrafo inmediatamente anterior, cualquiera de los polímeros solubles en agua y provistos aquí puede ser definido como POLY; cualquiera de las fracciones espaciadoras provistas aquí puede ser definido como X2 (cuando está presente) , cualquiera de los radicales orgánicos provistos aquí pude ser definido independientemente como R2 y R3 (en casos donde R2 y R3, independientemente, no son de hidrógeno) , y cualquiera de las fracciones GM-CSF provistas aquí puede ser definida como GM-CSF. Con respecto a la estructura correspondiente a aquella citada en el párrafo inmediatamente precedente, en algunas circunstancias se prefiere que: POLY sea un poli (etileno glicol), tal como H3CO (CH2CH20) , - , donde (n) es un entero con un valor de 3 a 4000; (d) es uno; X1 es amida, [por ejemplo, -C(0)NH-] ; (b) es de 2 a 6, más preferiblemente 4; (c) es de 2 a 6, más preferiblemente 4; tanto R2 como R3 son independientemente H o alquilo bajo, más preferiblemente metilo cuando se trate de alquilo bajo; y GM-CSF es un GM-CSF humano. En otras circunstancias, se prefiere que el conjugado comprenda la siguiente estructura: Donde : cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 3 a 4000; X2 es tal como se definió previamente; (b) es de 2 a 6; (c) es de 2 a 6; R2, en cada aparición, es independientemente H o alquilo bajo, y GM-CSF es una fracción GM-CSF. [00121] Los grupos carboxilo representan otro grupo funcional que puede servir como punto de enlace en la fracción GM-CSF. Estructuralmente, el conjugado comprenderá lo siguiente : H (OM-CSF)-C-X-PO Y Donde GM-CSF y el grupo carbonilo adyacente corresponden la fracción GM-CSF que tiene carboxilo, X es una fracción espaciadora, preferiblemente un heteroátomo seleccionado de O, N(H) , y S, y POLY es un polímero soluble en agua como PEG, opcionalmente terminando en una fracción con protector de terminación. [00122] El enlace C(0)-X resulta de la reacción entre un derivado polimérico que carga un grupo funcional terminal y una fracción GM-CSF con carga de carboxilo. Como se explicó arriba, el enlace específico dependerá del tipo de grupo funcional utilizado. Si el polímero es de terminación funcionalizada, o "activado" con un grupo hidroxilo, el enlace resultante será un éster de ácido carboxílico y X será O. Si el marco del polímero es funcionalizado con un grupo tiol, el enlace resultante será un tioéster, y X será S. Cuando son usados ciertos polímeros de brazos múltiples, ramificados o tipo "forked" (bifurcados), la fracción C(0)X, y en particular la fracción X, puede ser relativamente más compleja y puede incluir una estructura de enlace más larga. [00123] Los reactivos poliméricos con una fracción hidracida también son útiles para la conjugación en un carbonilo. Hasta el punto en que la fracción GM-CSF no contenga una fracción carbonilo, puede ser introducida una fracción carbonilo, reduciendo cualquier ácido carboxílico (por ejemplo, el ácido carboxílico de terminación C) y/o proveyendo una versión glicosilada o glicatada (donde el azúcar añadido tiene una fracción carbonilo) del la fracción GM-CSF. Ejemplos específicos de reactivos poliméricos con una fracción hidrazida, junto con los correspondientes conjugados, están provistos en la Tabla 2, en la parte de abajo. Adicionalmente, cualquier reactivo polimérico con un éster activado (por ejemplo, un grupo succinimidilo) puede ser convertido para contener una fracción hidrazida, reaccionando el reactivo polimérico que tiene el éster activado, con hidracina (NH2- H2) o tert-butilo carbazato [NH2NHC02C(CH3) 3] . En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y ,?=C- (GM-CSF) " representa una fracción GM-CSF después de la conjugación al reactivo polimérico.

Opcionalmente, el enlace de hidrazina puede ser reducido usando un agente reactor conveniente. Aunque cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH20) n] presentada en la Tabla 2 termina en un grupo "CH3", otros grupos (como H y benzilo) pueden ser sustituidos entonces.

Tabla 2 Reactivos poliméricos específicos de carboxilo, y conjugado de fracción GM-CSF formada de los mismos [00124] Los grupos de tiolo contenidos dentro del la fracción GM-CSF pueden servir como sitios efectivos de enlace para el polímero soluble en agua. Los grupos de tiolo contenidos en residuos de cisteína del la fracción GM-CSF pueden ser reaccionados con un PEG activado que es específico para reacción con grupos de tiolo, por ejemplo, un polímero N-maleimidilo u otro derivado, tal como se describe, por ejemplo, en la patente No. 5.739.208 de los Estados Unidos, y en la Publicación Internacional de Patente No. WO 01/62827, y en la tabla 3 de abajo. [00125] Con respecto, al mismo tiempo, a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO : 3, hay cuatro residuos de cisteína que contienen tiolo. Pese a que no queremos ser atados por la teoría, se cree que todos los residuos de cisteína en estas secuencias participan del enlace de disulfida. Como consecuencia, la conjugación a un residuo de cisteína participando en un enlace de disulfida puede romper la estructura terciaria de una fracción GM-CSF y potencialmente puede disminuir significativamente su actividad general. Así, hasta el punto en que cualquier la fracción particular GM-CSF carezca de un grupo tiolo o la ruptura de enlaces de disulfida deba evitarse, es posible añadir un residuo de cisteína al la fracción GM-CSF usando técnicas sintéticas convencionales. Véase, por ejemplo, la patente No. 6.608.183 de los Estados Unidos, y el procedimiento descrito en la Publicación Internacional de Patente WO 90/12874, donde tal procedimiento puede ser adaptado para una fracción GM-CSF. Adicionalmente, los procesos convencionales de ingeniería genética también pueden ser usados para introducir un residuo de cisteína en el interior del la fracción GM-CSF. [00126] Ejemplos específicos, junto con los conjugados correspondientes, son provistos en la Tabla 3, abajo. En la tabla, la variable (n) representa el número de unidades monoméricas repetitivas y "-S- (GM-CSF) " , representa el fracción GM-CSF después de la conjugación al polímero soluble en agua. Aunque cada porción polimérica [por ejemplo, (OCH2CH2)n o (CH2CH20)n] presentada en la Tabla 3 termina en un grupo "CH3", otros grupos (como H y benzilo) pueden ser sustituidos entonces.

Tabla 3 Reactivos poliméricos específicos de tiol, y el conjugado de fracción GM-CSF formado de los mismos [00127] Con respecto a conjugados formados de polímeros solubles en agua y que contienen uno o más grupos funcionales de maleimida (sin importar si la maleimida reacciona con una amina o grupo tiol en la fracción GM-CSF), la(s) correspondiente (s) forma (s) de ácido maleánico del polímero soluble en agua también puede (n) reaccionar con la fracción GM-CSF. Bajo ciertas condiciones, (por ejemplo, un pH de cerca de 7-9 y en la presencia del agua) , el anillo de maleimida se ??abrirá" para formar el correspondiente ácido maleánico. El ácido maleánico, en cambio, puede reaccionar con una amina o grupo tiol de una fracción GM-CSF. Reacciones maleánicas ejemplares basadas en ácidos están mostradas sistemáticamente en la parte de abajo. POLY representa el polímero soluble en agua, y GM-CSF representa la fracción GM-CSF.

Polímero Maleimida Ácido de Polímero Maleimida (GM-CSF)-NH2 pH -8-9 mui lento '«Y (QM-CSF) [00128] Un conjugado representativo en concordancia con el invento puede tener la siguiente estructura: POLY-Lo,rC(0)Z-Y-S-S-ÍGM-CSQ Donde POLY es un polímero soluble en agua, L es un enlace opcional, Z es un heteroátomo seleccionado del grupo que consta de O, NH, y S, y Y es seleccionado del grupo que consta de C2-?o alquilo, alquilo sustituido C_?0/ arilo y arilo sustituido, y GM-CSF es una fracción GM-CSF. Los reactivos poliméricos que pueden ser reaccionados con una fracción GM-CSF y resultan en este tipo de conjugado son descritos en la publicación de solicitud de Patente No. 2005/0014903 de los Estados Unidos. [00129] Con respecto a los reactivos poliméricos, los que fueron descritos aquí y en otros lugares pueden ser comprados de fuentes comerciales (por ejemplo, Ne tar Therapeutics, Huntsville AL) . Adicionalmente, los métodos para preparar los reactivos poliméricos son descritos en la literatura. [00130] El enlace entre la fracción GM-CSF y el polímero soluble en agua puede ser directo, en el cual no hay átomos participantes ubicados entre la fracción GM-CSF y el polímero, o indirecto, en el cual uno o más átomos están ubicados entre la fracción GM-CSF y el polímero. Con respecto al enlace indirecto, una "fracción espaciadora" sirve como enlace entre la fracción GM-CSF y el polímero soluble en agua. El átomo o los átomos que constituyen la fracción espaciadora puede incluir uno o más átomos de carbón, de nitrógeno, de azufre, de oxígeno, y combinaciones de éstos . La fracción espaciadora puede comprender una amida, una amida secundaria, un carbamato, un tioéter, y/o un grupo disulfuro. Entre los ejemplos no limitantes de fracciones espadadoras de manera específica están aquellos seleccionados del grupo que consta de: -O-, -S-, -S-S-, -C(O)-, -C(0)-NH-, -NH-C(0)-NH-, -0-C(0)-NH-, -C(S)~, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2- , -0-CH2-, -CH2-0-, -0-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-0-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2- , -CH2-CH2-CH2-0- , -0-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-CH2- , -CH2-CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-0-, -C (O) -NH-CH2- , -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0) -NH-CH2-, -CH2-CH2-C (0) -NH- , -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C (O) -NH-CH2- , -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-, -C (O) -NH-CH2-CH2-CH2-CH2- , -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-, -C(0) -0-CH2-, -CH2-C(0) -0-CH2-, -CH2-CH2- C(0)-0-CH2-, -C(0)-0-CH2-CH2-, -NH-C(O) -CH2-, -CH2-NH-C (O) -CH2- , -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -NH-C(O) -CH2-CH2-, -CH2-NH-C (O) -CH2-CH2- , -CH2-CH2-NH-C(0) -CH2-CH2-, -C (O) -NH-CH2- , -C (O) -NH-CH2-CH2- , -O-C(0) -NH-CH2-, -O-C(O) -NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2- , -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(0)-CH2-, -C (O) -CH2-CH2- , -CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(0) -CH2-, -CH2-CH2-C (O) -CH2-CH2- , -CH2~CH2-C(0) -, -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(O) -NH-CH2-CH2-NH-C(0) - , -CH2-CH2-CH2-C (O) -NH-CH2-CH2-NH- C(0)-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0) -NH-CH2-CH2-NH-C (O) -CH2-CH2-, -O-C(O) -NH- [CH2]h- (OCH2CH2) j-, grupo cicloalquilo bivalente, -O-, -S-, un aminoácido, -N(R6)-, y combinaciones de dos o más de cualquiera de los anteriores, donde Rs es H o un radial orgánico seleccionado del grupo que consta de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido, (h) es de cero a seis, y (j) es de cero a 20. Otras fracciones espadadoras específicas tienen las siguientes estructuras: -C (O) -NH- (CH2) ?-6-NH-C(0) - , -NH-C(0)-NH-(CH2)!-6-NH-C(0)-, y -O-C (O) -NH- (CH2) ?_6-NH-C (O) - , donde los valores suscritos que siguen a cada metileno indican el número de metilenos contenidos en la estructura, por ejemplo, (CH2)?.s significa que la estructura puede contener 1, 2, 3, 4, 5 ó 6 metilenos. Adicionalmente, cualquiera de las anteriores fracciones espadadoras puede además incluir una cadena oligomérica de óxido de etileno comprendiendo de 1 a 20 unidades monoméricas de óxido de etileno [es decir, - (CH2CH20) ?_20] . Es decir, la cadena oligomérica de óxido de etileno puede ocurrir antes o después de la fracción espaciadora, y opcionalmente en medio de dos átomos cualesquiera de una fracción espaciadora compuesta por dos o más átomos. Además, la cadena oligomérica no sería considerada parte de la fracción espaciadora si el oligómero está adyacente a un segmento polímero y apenas representa una extensión del segmento del polímero. La fracción espaciadora no incluye azúcares ni carbohidratos (es decir, una fracción espaciadora específicamente no incluye el azúcar de un residuo de glicosilato) . El polímero soluble en agua puede ser enlazado a través de un residuo de glicosilato (por ejemplo, un azúcar o carbohidrato) . En aquellas instancias donde tal arreglo es deseado, la presente aplicación se referirá a tal arreglo como a una "fracción GM-CSF enlazada de manera covalente a un polímero soluble en agua, a través de un residuo de glicosilato" . [00131] Como se indicó arriba, en algunas instancias el conjugado del polímero soluble en agua (GM-CSF) incluirá un polímero no lineal, soluble en agua. Tal polímero no lineal soluble en agua incluye un polímero ramificado soluble en agua (aunque también se contemplan otros polímeros no lineales, solubles en agua) . Así, en una o más representaciones del invento, el conjugado comprende una fracción GM-CSF que contiene una amina interna enlazada de manera covalente, sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, ramificado. Tal como es usado aquí, una amina interna es una amina que no forma parte del aminoácido de terminal N (y como tal incluye no sólo 1 amina de terminal N, sino cualquiera amina en la cadena lateral del aminoácido de terminal N) . Con respecto a una fracción GM-CSF que tenga una secuencia que comprenda SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, y SEQ ID NO: 3, por ejemplo, las aminas internas están ubicadas en cada cadena de cada residuo de lisina. [00132] Debe notarse que aunque tales conjugados incluyen un polímero ramificado soluble en agua, enlazado (ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora) a una fracción GM-CSF en un aminoácido interno de la fracción GM-CSF, polímeros ramificados adicionales, solubles en agua, también pueden ser enlazados a la misma fracción GM-CSF en otras ubicaciones, del mismo modo. Así, por ejemplo, un conjugado que incluye un polímero ramificado soluble en agua, enlazado (ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora) a una fracción GM-CSF en un aminoácido interno de la fracción GM-CSF, puede además incluir un polímero ramificado adicional soluble en agua, enlazado de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, al residuo aminoácido de terminal N, preferiblemente en la amina de terminal N. Como se declaró arriba, en algunas instancias, el polímero ramificado soluble en agua carece de un residuo de lisina en el cual las porciones poliméricas estén conectadas a grupos aminas de la lisina a través de un grupo w-OCH2CONHCHCO-" . Incluso en otras instancias, se prefiere que el polímero ramificado soluble en agua carezca de un residuo de lisina (donde el residuo de lisina es usado para efectuar la ramificación) . Un polímero ramificado soluble en agua, preferido, comprende la siguiente estructura: En donde cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 3 a 4000. [00133] Composiciones [00134] Los conjugados son generalmente parte de una composición. Generalmente, la composición comprende una variedad de conjugados, preferiblemente aunque no necesariamente, cada uno de ellos tendría uno, dos, tres o cuatro polímeros solubles en agua individualmente enlazados de manera covalente (sea directamente o a través de una fracción espaciadora) a una fracción GM-CSF. Las composiciones, sin embargo, también pueden comprender otros conjugados que tengan cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más polímeros enlazados a cualquier fracción GM-CSF determinada. [00135] Con respecto a los conjugados en la composición, la composición generalmente satisfará una o más de las siguientes características : por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cinco polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá entre uno y cuatro polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá de uno a tres polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá de uno a dos polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca del 85% de los conjugados de la composición tendrá un polímero enlazado a la fracción GM-CSF (es decir, será monoPEGilizado) ; por lo menos cerca del 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cinco polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cuatro polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a tres polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá de uno a dos polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca de 95% de los conjugados de la composición tendrá un polímero enlazado a la fracción GM-CSF (es decir, será monoPEGilizado) ; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cinco polímeros enlazados a la fracción GMCSF; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a cuatro polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a tres polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá de uno a dos polímeros enlazados a la fracción GM-CSF; y por lo menos cerca de 99% de los conjugados de la composición tendrá un polímero enlazado a la fracción GM-CSF (es decir, será monoPEGilizado) . [00136] En una o más representaciones, se prefiere que la composición que contiene el conjugado esté libre o sustancialmente libre de albúmina. También se prefiere que la composición estea sustancialmente libre de proteínas que no tengan actividad GM-CSF. Así, se prefiere que la composición sea 85%, más preferiblemente 95%, y aún más preferiblemente 99% libre de albúmina. Adicionalmente, se prefiere que la composición sea el 85%, más preferiblemente el 95%, y aún más preferiblemente 99% libre de cualquier proteína que no tenga actividad GM-CSF. Hasta el punto en que la albúmina esté presente en la composición, las composiciones ejemplares del invento están sustancialmente libres de conjugados que comprendan un polímero de poli (etileno glicol) enlazando un residuo de una fracción GM-CSF a la albúmina. [00137] En una o más representaciones del invento, se provee una composición farmacéutica que comprende (i) un conjugado que comprende un GM-CSF humano enlazado de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular en promedio de peso, mayor que 5.000 Daltons; y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde por lo menos cerca del 85% de los conjugados en la composición tendrá de uno a cuatro polímeros enlazados al GM-CSF humano. En algunas instancias, la composición farmacéutica incluye la condición de que cuando el polímero soluble en agua sea un polímero ramificado soluble en agua, el polímero ramificado soluble en agua carece de un residuo de lisina en el cual las porciones poliméricas estén conectadas con grupos amina de la lisina, a través de un grupo "-OCH2CONHCH2CO-" . Incluso en otras instancias, la composición farmacéutica incluye la condición de que el polímero ramificado soluble en agua carezca de un residuo de lisina (donde el residuo de lisina es usado para efectuar la ramificación) . [00138] El control de número deseado de polímeros para cualquier fracción determinada puede lograrse seleccionando el reactivo polimérico apropiado, la razón del reactivo polimérico a la fracción GM-CSF, la temperatura, condiciones de pH y otros aspectos de la reacción de conjugación. Adicionalmente, la reducción o eliminación de conjugados no deseados (por ejemplo, aquellos conjugados con cuatro o más polímeros enlazados) puede lograrse a través de medios de purificación. [00139] Por ejemplo, los conjugados de fracción (GM-CSF) - polímero soluble en agua pueden ser purificados para obtener / aislar diferentes especies conjugadas. Específicamente, la mezcla de producto puede ser purificada para obtener un promedio de cualquiera entre uno, dos, tres, cuatro, cinco o más PEGs por fracción GM-CSF, generalmente uno, dos o tres PEGs por fracción GM-CSF. La estrategia para la purificación de la mezcla de reacción del conjugado final dependerá de una cantidad de factores, incluyendo, por ejemplo, el peso molecular del reactivo polimérico empleado, la fracción GM-CSF en particular, el régimen de dosificación deseado, y la actividad residual y las propiedades in vivo del conjugado o los conjugados en particular. [00140] Si se desea, los conjugados con diferentes pesos moleculares pueden ser aislados usando cromatografía de filtración de gel y/o cromatografía de intercambio de iones. Es decir, la cromatografía de filtración de gel se usa para fraccionar razones de fracción de polímero para (GM-CSF) diferentemente numeradas [por ejemplo, 1-mer, 2-mer, 3-mer, y así sucesivamente, donde "1-mer" indica 1 polímero enlazado a una fracción GM-CSF (o monoPEGildo cuando el polímero es PEG) , "2-mer" indica dos polímeros enlazados a una fracción GM-CSF (o diPEGilado cuando el polímero es PEG) , y así sucesivamente] sobre la base de sus pesos moleculares diferentes (donde la diferencia corresponde esencialmente al peso molecular promedio de la porción del polímero soluble en agua) . Por ejemplo, en una reacción ejemplar donde una proteína de 20.000 Daltons está siendo conjugada de manera aleatoria con un reactivo polimérico que tiene un peso molecular de cerca de 20.000 Daltons, la mezcla de reacción resultante puede contener proteína no modificada teniendo un peso molecular de cerca de 20.000 Daltons, proteína monoPEGilizada (o de "1-mer"), teniendo un peso molecular de cerca de 40.000 Daltons, proteína diPEGilizada (o de 2-mer") teniendo un peso molecular de cerca de 60.000 Daltons), y así sucesivamente. [00141] Aunque este enfoque puede ser usado para separar PEGs y otros conjugados de fracción (GM-CSF) de polímero soluble en agua que tengan diferentes pesos moleculares, este enfoque generalmente es ineficaz para separar isómeros posicionales que tienen diferentes sitios de enlace de polímero dentro de la fracción GM-CSF. Por ejemplo, puede usarse cromatografía de filtración de gel para separar entre sí mezclas de 1-mers, 2- mers, 3-mers, y así sucesivamente, aunque cada uno de las composiciones PEG-mer recuperadas puede contener PEGs enlazados a diferentes grupos amino reactivos (por ejemplo, residuos de lisina) dentro de la fracción GM-CSF. [00142] Algunas columnas de filtración de gel convenientes para llevar a cabo este tipo de separación son columnas Superdex™ y Sephadex™, disponibles de Amersham Biosciences (Piscataway, NJ) . La selección de una columna particular dependerá de la gama de separación deseada. La elución generalmente es desarrollada usando un búfer conveniente, como un fosfato, acetato, o semejantes. Las fracciones recogidas pueden ser analizadas por una cantidad de métodos diferentes, por ejemplo, (i) absorción a 280 nm por contenido de proteína, (ii) análisis de proteína con base en el tinte usando albúmina de suero bovino como estándar, (iii) evaluación de yodo para contenido del PEG (Sims et al . (1980) Anal . Biochem, 107: 60-63), (iv) electroforesis de gel de sodio dodecil sulfato poliacrilamida (SDS PAGE) , seguida por manchas con yoduro de bario, y cromatografía líquida de más alto desempeño. [00143] La separación de isómeros posicionales puede ser efectuada por cromatografía de fase reversa, usando métodos de cromatografía líquida de alto desempeño de fase reversa (RPHPLC) , usando por ejemplo una columna C18 o una C3 (Amersham Biosciences o Vydac) o por medio de cromatografía de intercambio de iones usando una columna de intercambio de iones, por ejemplo, una columna de intercambio de iones Sepharose™, disponible de parte de Amersham Biosciences . Cada enfoque puede ser usado para separar polímero - agente activo que tienen el mismo peso molecular (isómeros posicionales) . [00144] Preferiblemente, las composiciones están sustancialmente libres de proteínas que no tengan actividad GM-CSF. Adicionalmente, las composiciones preferiblemente están sustancialmente libres de todos los demás polímeros solubles en agua y enlazados de manera no covalente . En algunas circunstancias, sin embargo, la composición puede contener una mezcla de polímero soluble en agua -conjugados de fracción (GM-CSF) y GM-CSF no conjugado. [00145] Opcionalmente, la composición del invento comprende además un excipiente farmacéuticamente aceptable . Si se desea, el excipiente farmacéuticamente aceptable puede ser añadido a un conjugado para formar una composición. [00146] Entre los excipientes ejemplares están, sin limitación, aquellos seleccionados del grupo que consta de carbohidratos, sales orgánicas, agentes antimicrobióticos, antioxidantes, tensoactivos, búferes, ácidos, bases, y combinaciones de éstos . [00147] Un carbohidrato como un azúcar, un azúcar derivado como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterizada y/o un polímero de azúcar pueden estar presentes como excipiente . Entre los excipientes específicos de carbohidratos están, por ejemplo: monosacáridos, como fructosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-mannosa, sorbosa, y demás; disacáridos, como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y demás; polisacáridos, como rafinosa, melecitosa, rnaltodextrinas , dextrans, a idos, y semejantes; y alditois, such as manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xihitol, sorbitol (glucitol) , piranosil sorbitol, mioinositol, y semejantes. [00148] El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o búferes como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato monobásico de sodio, fosfato dibásico de sodio, y combinaciones de éstos . [00149] La composición puede también incluir un agente antimicrobiótico para prevenir o detener el crecimiento de microbios. Algunos ejemplos no limitantes de agentes antimicrobióticos convenientes para el presente invento son cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, benzil alcohol, cloruro de cetiloopiridinio, clorobutanol, fenol, feniloetil alcohol, nitrato fenilomercúrico, timersol, y combinaciones de éstos. [00150] Un antioxidante puede asimismo estar presente en la composición. Los antioxidantes son usados para impedir la oxidación, impidiendo así el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Antioxidantes convenientes para el uso en el presente invento incluyen, por ejemplo, palmitato de ascorbil, hidroxianisola butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propil galato, bisulfito de sodio, sulfoxilato de sodio formaldehído, metabisulfito de sodio, y combinaciones de éstos. [00151] Un tensoactivo puede estar presente como excipiente. Algunos tensoactivos ejemplares son: polisorbatos, tales como "Tween 20' y "Tween 80," y plurónicos como F68 y F88 (ambos están disponibles de parte de BASF, Mount Olive, New Jersey) ; esteres de sorbitano; lípidos, como los fosfolípidos como la lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma de liposoma) , ácidos grasos y esteres grasos; asteroides, como el colesterol; y agentes quelatantes, como EDTA, zinc y otros cationes convenientes. [00152] Puede haber ácidos o bases presentes como excipientes en la composición. Algunos ejemplos no limitantes de ácidos que pueden ser usados, son aquellos ácidos seleccionados del grupo que consta de ácido hidroclórico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido fumárico y combinaciones de éstos. Algunos ejemplos de bases convenientes incluyen, sin limitación, bases seleccionadas del grupo que consta del hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumerato de potasio, y combinaciones de éstos. [00153] La cantidad del conjugado (es decir, el conjugado formado entre el agente activo y el reactivo polimérico) en la composición variará dependiendo de una cantidad de factores, pero idealmente será una cantidad terapéuticamente efectiva cuando la composición es almacenada en un contenedor de dosis por unidades (por ejemplo, un frasco) . Adicionalmente, la preparación farmacéutica puede ser almacenada en una jeringa. Una cantidad terapéuticamente efectiva puede ser determinada experimentalmente mediante la administración repetida de cantidades crecientes del conjugado a fin de determinar qué cantidad produce un punto de efectividad clínicamente deseado. [00154] La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Generalmente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual es determinada a través de la experimentación de rutina, es decir, preparando composiciones que contengan diversas cantidades del excipiente (oscilando desde cantidades bajas hasta altas) , examinando la estabilidad y otros parámetros, y determinando entonces la gama en el cual se consigue un desempeño óptimo sin efectos adversos significativos. [00155] Generalmente, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad desde cerca del 1% hasta cerca del 99% por el peso, preferiblemente desde cerca del 5% hasta cerca del 98% por el peso, más preferiblemente desde cerca de 15 hasta cerca del 95% por el peso del excipiente, con preferencia hacia las concentraciones menores al 30% del peso. [00156] Estos anteriores excipientes farmacéuticos junto con otros excipientes son descritos en "Remington: The Science & Practice of Pharmacy" , 19th ed. , Williams & Williams, (1995), "Physician' s Desk Reference", 52th ed. , Medical Economics, Montvale, NJ (1998), y Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000. [00157] También se provee un método para elaborar un conjugado, método que comprende el contacto, bajo condiciones de conjugación, entre una fracción GM-CSF y un reactivo polimérico. Como se menciona aquí, el método no necesariamente involucra llevar a cabo pasos de protección y de desprotección. La sección experimental en la parte de abajo provee acercamientos ejemplares para la elaboración de conjugados. Una vez se prepara un conjugado, puede añadírsele un excipiente farmacéuticamente aceptable, al conjugado, para proveer una composición farmacéutica. [00158] Las composiciones comprenden todos los tipos de formulas y en particular aquellas que están preparadas para inyección, por ejemplo, polvos o liofilatos que pueden ser reconstituidos, así como los líquidos. Entre los ejemplos de diluyentes convenientes para reconstituir composiciones sólidas antes de la inyección, están el agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, salina con búfer de fosfato, solución de Ringer, salina, agua estéril, agua desionizada, y combinaciones de éstos. Con respecto a las composiciones farmacéuticas líquidas, se vislumbran soluciones y suspensiones. [00159] En una o más representaciones del invento, se provee un método, el cual comprende la entrega de conjugado a un paciente, método que comprende también el paso de administrar al paciente una composición farmacéutica como se presenta aquí . Este método tiene utilidad, entre otras cosas, como un método para evaluar la toxicidad de la composición farmacéutica (sea de sí mismo contra un estándar conocido, o de otras composiciones para evaluar toxicidades de manera relativa) . Además, el método puede ser usado para tratar a un paciente que sufre de una condición que responde al tratamiento con el conjugado, administrando una cantidad terapéuticamente efectiva de la composición farmacéutica. La administración puede ser efectuada, por ejemplo, a través de inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección subcutánea, y así sucesivamente . Entre los tipos de formulación convenientes para la administración parenteral están las soluciones listas para inyectar, los polvos secos para ser combinados con un solvente antes de su uso, las suspensiones listas para inyección, composiciones secas no solubles para combinación con un vehículo antes de su uso, y emulsiones y concentrados líquidos para su dilución antes de la administración, entre otros. [00160] Como se declaró previamente, el método de administración o entrega puede ser usado para el tratamiento de un paciente que tiene una condición que puede ser remediada o prevenida por la administración del conjugado. Aquellos con habilidades ordinarias en el arte aprecian qué condiciones, puede tratar un conjugado específico de manera efectiva. Por ejemplo, el conjugado puede ser administrado al paciente antes de la administración de un agente de quimioterapia, o simultáneamente, o después. Adicionalmente, el conjugado puede ser administrado a un paciente que pasa por un transplante de médula ósea (por ejemplo, un paciente que sufre de leucemia mielogenosa aguda) , donde la administración ocurre antes del transplante de médula ósea, o después del transplante de médula ósea (ya sea autóloga o alogénica ) . Además, el conjugado puede ser usado en el tratamiento de cánceres, a través del mejoramiento de la actividad citotóxica de los monocitos periféricos, los linfocitos, mucositis, estomatitis, diarrea, curación de heridas, proteinosis pulmonar alveolar, e hipercolesterolemia. Finalmente, el conjugado también puede ser usado como un coadyuvante para vacuna. [00161] La dosis real a ser administrada variará dependiendo de la edad, el peso y la condición general del sujeto, así como la severidad de la condición que está siendo tratada, el juicio del profesional de la salud y el conjugado que está siendo administrado. Las cantidades terapéuticamente efectivas son conocidas para quienes tienen habilidades en el arte y/o son descritas en los libros de referencia y la literatura pertinente. Generalmente, sobre la base del peso, una cantidad terapéuticamente efectiva variará desde cerca de 0,001 mg hasta 100 mg, preferiblemente en dosis de 0,001 mg/día hasta 75 mg/día, y más preferiblemente en dosis desde 0,01 mg/día hasta 50 mg/día. Sobre la base de la actividad, las dosis correspondientes fundamentadas en unidades internacionales de actividad pueden ser calculadas por una persona con habilidades ordinarias en el área. [00162] Las dosis por unidad de cualquier conjugado determinado (una vez más, preferiblemente provisto como parte de • una composición farmacéutica) puede ser administrada en una variedad de horarios de dosis dependiendo del juicio del profesional médico, las necesidades del paciente, entre otras cosas. El horario específico de administración será conocido por aquellos con habilidades en el arte, o puede ser determinado experimentalmente usando métodos de rutina. Entre los ejemplos de horarios de dosificación están, sin limitación, la administración cinco veces por día, cuatro veces por día, tres veces por día, dos veces por día, una vez por día, tres veces por semana, dos veces por semana, una vez por semana, dos veces por mes, una vez por mes, y cualquier combinación de estos . Una vez haya sido logrado el punto clínico de efectividad, se detiene la dosificación de la composición. [00163] Debe entenderse, aunque el invento ha sido descrito en conjunto con las representaciones específicas preferidas, que la anterior descripción así como los ejemplos que siguen tienen la intención de ilustrar y no limitan el alcance del invento. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del alcance del invento serán evidentes a quienes tienen habilidades en el arte a la cual pertenece el invento. EXPERIMENTACIÓN [00164] La práctica del invento empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de síntesis orgánica y demás, que están dentro de las habilidades del arte . Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Los reactivos y materiales están disponibles en el comercio, a menos que se indique específicamente lo contrario. Véase, por ejemplo, J. March, Advanced Organic Chemistry: Reactions Mechanisms and Structure, 4th Ed. (New York: Wiley-Interscience, 1992) , supra . [00165] En los siguientes ejemplos, se han hecho esfuerzos para asegurar la confiabilidad con respecto a las cifras usadas (por ejemplo, cantidades, temperaturas, entre otros) pero debe tenerse en cuenta algo de error experimental error y desviación. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados centígrados y la presión está al nivel de la presión atmosférica a nivel del mar, o cerca de ese nivel. [00166] Aunque otras abreviaciones conocidas por quienes tienen habilidades ordinarias en el arte serán referenciadas, otros reactivos y materiales serán usados, y otros métodos conocidos por quienes tienen habilidades ordinarias en el arte serán usados, la siguiente lista y descripción de métodos es provista para propósitos de conveniencia . [00167] ABREVIATURAS: [00168] NaCNBH3 cianoborohidrido de sodio [00169] HCl ácido hidroclórico [00170] HEPES [4- (2-hidroxietil) - 1 piperazinaetanosulfónico ácido] [00171] K ó kDa KiloDaltons [00172] SEC Cromatografía de exclusión de tamaño [00173] HPLC Cromatografía líquida de alto desempeño [00174] SDS-PAGE electroforesis de gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida [00175] Análisis SDS-PAGE [00176] Las muestras indicadas para ello, fueron analizadas por medio de electroforesis de gel de sodio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE) usando un sistema Bio-Rad (Mini-PROTEAN III Precast Gel Electrophoresis System) . Las muestras fueron mezcladas con búfer muestra. Entonces, las muestras preparadas fueron cargadas en un gel, y activadas durante aproximadamente treinta minutos. [00177] Análisis SEC-HPLC [00178] Se ha hecho cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) en un sistema Agilent 1100 HPLC (Agilent) . Las muestras fueron analizadas usando una columna KW-804 de proteína Shodex (300 x 8 mm, Phenomenex), con un pH de 7,4. La tasa de flujo para la columna fue establecida a 0,5 ml/minuto. La proteína eluída y los conjugados de PEG-proteína fueron detectados usando UV en 280 nm. [00179] Cromatografía de intercambio de aniones [00180] Se usó una columna HiTrap Q Sepharose HP de intercambio de aniones (Amersham Biosciences) con el sistema AKTAprime system (Amersham Biosciences) para purificar los conjugados GM-CSF PEGilizados que fueron preparados en los Ejemplos del 1 al 6. Para cada solución de conjugado preparada, la solución de conjugado fue cargada en una columna equilibrada previamente en un búfer de 20 mM Tris , pH 7,5 (búfer A) y luego lavada con volúmenes de diez columnas de búfer A para eliminar cualquier reactivo PEG no reaccionado. Consecuentemente, surgió una pendiente de búfer A con un búfer B de 0-100% (20mM Tris con 0,5 M NaCl buffer, pH 7,5). El eluente fue monitoreado por un detector UV a 280 nm. Los mers más altos (por ejemplo, 3-mers, 4-mers, y así sucesivamente) eludieron primero, seguidos luego por 2-mers, y luego 1-mers, y finalmente el GM-CSF no conjugado. Los fragmentos fueron agrupados de acuerdo con el cromatograma, y la pureza del conjugado individual fue determinada por un SEC-HPLC O SDS-PAGE. [00181] Se usó recombinante humano GM-CSF (hGM-CSF) correspondiente a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. en los ejemplos del 1 al 6 , y fue obtenido de una fuente comercial . Se preparó una solución de abastecimiento hGM-CSF, asegurando que el GM-CSF humano recombinante existía en un búfer libre de amina, usando (si fuese necesario) una técnica de intercambio de búfer conocida para quienes tienen habilidad es ordinarias en el arte .

Ejemplo 1 PEGilación de hGM-CSF con mPEG-N-Hidroxisuccinimida Derivada Ramificada, 40 kDa mPEG-N-Hidroxisuccinimida Derivada Ramificada, 40kDa7 ("mPEG-NHS") [00182] rnPEG2-NHS, 40kDa, almacenado a -20 OC bajo argón, fue llevado a temperatura ambiente. Se disolvió un exceso quíntuple o de 5 veces (en relación con la cantidad de hGM-CSF en una alícuota medida de la solución hGM-CSF de inventario) del mPEG2-NHS aclimatado, en 2mM HCl para formar una solución reactiva de 10%. La solución reactiva de 10% fue rápidamente añadida a la alícuota de solución hGM-CSF de inventario (1 mg/ml en búfer de fosfato de sodio, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de la adición del reactivo PEG, el pH de la mezcla de reacción fue determinado y ajustado a 7,0 usando técnicas convencionales. Para permitir el acople de mPEG2-NHS al hGM-CSF a través de un enlace amida, la solución de reacción fue ubicada en un rotor de laboratorio a baja velocidad durante la noche, para facilitar la conjugación a temperatura de habitación. La reacción fue templada con Tris Buffer. La solución de conjugado fue caracterizada como se muestra abajo. [00183] La Figura 1 muestra el cromatograma después del análisis SEC-HPLC de la solución de conjugado. La reacción de PEGilación rindió un 57% de especies 1-mer (monoconjugado, o un PEG enlazado al hGM-CSF) y 23% 2-mer (diconjugado, o dos PEG enlazados a hGM-CSF) . [00184] Se usó cromatografía de intercambio de aniones para purificar los conjugados. La Figura 2 muestra el cromatograma después de una purificación por intercambio de aniones. Las fracciones del conjugado fueron recolectadas y analizadas por un SDS-PAGE (Figura 3) . Los conjugados purificados fueron hasta unos 100% puros. [00185] Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG2-NHS con otros pesos moleculares en promedio de peso. Ejemplo 2 PEGilación de hGM-CSF con mPEG-Succinimidil a- Metilbutanoato Derivado Lineal, 30kDa mPEG-Sucinimidil a-Metilbutanoato Derivado Linear, 30kDA ("mPEG-SMB") [00186] rnPEG-SMB, 30kDa, almacenado a -20°C bajo argón, fue llevado a temperatura ambiente. Se disolvió un exceso de diez veces (en relación con la cantidad de hGM-CSF en una alícuota medida de la solución hGM-CSF de inventario) del mPEG-SMB aclimatado, en 2mM HCl para formar una solución reactiva de 10%. La solución reactiva de 10% fue rápidamente añadida a la alícuota de solución hGM-CSF de inventario (1 mg/ml en búfer de fosfato de sodio, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de la adición del reactivo mPEG-SMB, el pH de la mezcla de reacción fue determinado y ajustado a 7,0 usando técnicas convencionales. Para permitir el acople de mPEG-SMB al hGM-CSF a través de un enlace amida, la solución de reacción fue ubicada en un rotor de laboratorio a baja velocidad durante la noche, para facilitar la conjugación a temperatura de habitación. La reacción fue templada con Tris Buffer. La solución de conjugado fue caracterizada como se muestra abajo. [00187] La Figura 4 muestra el cromatograma SEC-HPLC de la solución de conjugado. El análisis SEC-HPCL revela que la reacción de PEGilación rindió un 58% de especies 1- er (monoconjugado, o un PEG enlazado al hGM-CSF) y 14% 2- er (diconjugado, o dos PEG enlazados a hGM-CSF) . También se usó un método de cromatografía de intercambio de aniones, usando Q Sepharose High Performance y Tris buffer para purificar los conjugados. El perfil de separación de la especie de conjugado fue similar al que se muestra en la Figura 2. [00188] Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-SMB con otros pesos moleculares en promedio de peso.

Ejemplo 3 PEGilación de hGM-CSF con mPEG-Piperidona, 20 kDa [00189] La mPEG-Piperidona (mPEG-PIP) con un peso molecular de 20.000 Daltons es obtenida de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) . La estructura básica del reactivo polimérico es provista abajo: (forma hidratada) mPEG-Piperidona Derivada Lineal, 20 kDa ("mPEG-PIP") [00190] mPEG-PIP, 20kDa, almacenado a -20 °C bajo argón, fue llevado a temperatura ambiente. Se disolvió un exceso de cincuenta a cien veces (en relación con la cantidad de hGM-CSF en una alícuota medida de la solución hGM-CSF de inventario) del rnPEG-PIP aclimatado, en lOmM de fosfato de sodio (pH 7,0) para formar una solución reactiva de 10%. La solución reactiva de 10% fue rápidamente añadida a la alícuota de solución hGM-CSF de inventario (1 mg/ml en búfer de fosfato de sodio, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de la adición del reactivo mPEG-PIP, el pH de la mezcla de reacción fue determinado y ajustado a 7,0 usando técnicas convencionales, seguido de un mezclado durante treinta minutos. Un agente reductor, el cianoborohidrido de sodio, fue entonces añadido para hacer 13 M NaCNBH3. La solución de reacción fue ubicada en un rotor de laboratorio de baja velocidad, para facilitar la conjugación a temperatura de habitación. La reacción fue templada con Tris Buffer. La solución de conjugado fue caracterizada como se muestra abajo. [00191] La reacción de PEGilación rindió más del 30% de 1-mer (monoconjugado, o un PEG enlazado a hGM-CSF) . Debido a la alta selectividad de la estructura de anillo PEG, resultó poco 2-mer. [00192] También se usó un método de cromatografía de intercambio de aniones para purificar los conjugados. La Figura 5 ilustra el perfil de purificación por intercambio de aniones .

Ejemplo 4 PEGilación de hGM-CSF con mPEG-Butiraldehído Derivado Lineal , 20 kDa mPEG-Butiraldehído Derivado Lineal , 20 kDa ( " "mPEG- ButyrALD" ) [00193] El mPEG-ButyrALD, 20kDa, almacenado a -20 °C bajo argón, fue llevado a temperatura ambiente. Se disolvió un exceso de treinta veces (en relación con la cantidad de hGM-CSF en una alícuota medida de la solución hGM-CSF de inventario) del mPEG-ButyrALD aclimatado, Milli-Q H20 para formar una solución reactiva de 10%. La solución reactiva de 10% fue rápidamente añadida a la alícuota de solución hGM-CSF de inventario (1 mg/ml en búfer de fosfato de sodio, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de la adición del reactivo mPEG-ButyrALD, el pH de la mezcla de reacción fue determinado y ajustado a 6,0 usando técnicas convencionales, seguido de un mezclado durante treinta minutos. Un agente reductor, el cianoborohidrido de sodio, fue entonces añadido para hacer 9 mM NaCNBH3. La solución de reacción fue ubicada en un rotor de laboratorio de baja velocidad, para facilitar la conjugación a temperatura de habitación. La reacción fue templada con Tris Buffer. La solución de conjugado fue caracterizada como se muestra abajo . [00194] El grupo aldehido de mPEG-ButyrALD puede reaccionar con los aminos primarios asociados con hGM-CSF y enlazarse con ellos de manera covalente, a través del amino secundario, por un agente reductor como el cianoborohidrido de sodio. Por cuanto la reacción de PEGilación fue llevada a cabo a un pH de 6,0 el enlace del PEG derivativo al hGM-CSF fue más selectivo al terminal N. La Figura 6 muestra el cromatograma SEC-HPLC de la solución de conjugado. La reacción de PEGilación rindió un 75% de especies 1-mer (un PEG enlazado al hGM-CSF o monoPEGilado y 4% 2-mer (diconjugado, o dos PEG enlazados a hGM-CSF) . También se usó un método de cromatografía de intercambio de aniones, usando Q Sepharose High Performance y Tris buffer para purificar los conjugados. El perfil de separación de la especie de conjugado fue similar al que se muestra en la Figura 5. [00195] Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando rnPEG-ButyrALD con otros pesos moleculares en promedio de peso.

Ejemplo 5 PEGilación de GM-CSF con mPEG-Butiraldehído Derivado Lineal, 30 kDa mPEG-Butiraldehído Derivado Lineal, 30 kDa ("mPEG- ButyrALD") [00196] El mPEG-ButyrALD, 30 kDa, almacenado a -20 °C bajo argón, fue llevado a temperatura ambiente. Se disolvió un exceso de treinta veces (en relación con la cantidad de hGM-CSF en una alícuota medida de la solución hGM-CSF de inventario) del mPEG-ButyrALD aclimatado, en Milli-Q H20 para formar una solución reactiva de 10%. La solución reactiva de 10% fue rápidamente añadida a la alícuota de solución hGM-CSF de inventario (1 mg/ml en búfer de fosfato de sodio, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de la adición del reactivo mPEG-ButyrALD, el pH de la mezcla de reacción fue determinado y ajustado a 6,0 usando técnicas convencionales, seguido de un mezclado durante treinta minutos. Un agente reductor, el cianoborohidrido de sodio, fue entonces añadido para hacer 9 mM NaCNBH3. La solución de reacción fue ubicada en un rotor de laboratorio de baja velocidad, para facilitar la conjugación a temperatura de habitación. La reacción fue templada con Tris Buffer. La solución conjugada fue caracterizada como se muestra abajo. [00197] El grupo aldehido de mPEG-Butyr LD puede reaccionar con los aminos primarios asociados con hGM-CSF y enlazarse con ellos de manera covalente, a través del amino secundario hasta reducirse, por un agente reductor como el cianoborohidrido de sodio. Por cuanto la reacción de PEGilación fue llevada a cabo a un pH de 6,0 el enlace del PEG derivativo al hGM- CSF fue más selectivo al terminal N. La Figura 7 muestra el cromatograma SEC-HPLC de la solución de conjugado. La reacción de PEGilación rindió un 63% de especies 1-mer (un PEG enlazado al hGM-CSF o monoPEGilado y 20% 2-mer (diconjugado, o dos PEG enlazados a hGM-CSF) . También se usó un método de cromatografía de intercambio de aniones, usando Q Sepharose High Performance y Tris buffer para purificar los conjugados. El perfil de separación de la especie de conjugado fue similar al que se muestra en la Figura 2. [00198] Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando mPEG-ButyrALD con otros pesos moleculares en promedio de peso .

Ejemplo 6 PEGilación de hGM-CSF con mPEG-Butiraldehído Derivado Ramificado, 40 kDa mPEG-Butiraldehído Derivado Ramificado, 40 kDa ("mPEG2- ButyrALD") [00199] El mPEG2-ButyrALD, 40 kDa, almacenado a -20 °C bajo argón, fue llevado a temperatura ambiente. Se disolvió un exceso de treinta veces (en relación con la cantidad de hGM-CSF en una alícuota medida de la solución hGM-CSF de inventario) del mPEG2-ButyrALD aclimatado, en Milli-Q H20 para formar una solución reactiva de 10%. La solución reactiva de 10% fue rápidamente añadida a la alícuota de solución hGM-CSF de inventario (1 mg/ml en búfer de fosfato de sodio, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de la adición del reactivo mPEG2-ButyrALD, el pH de la mezcla de reacción fue determinado y ajustado a 6,0 usando técnicas convencionales, seguido de un mezclado durante treinta minutos. Un agente reductor, el cianoborohidrido de sodio, fue entonces añadido para hacer 9 mM NaCNBH3. La solución de reacción fue ubicada en un rotor de laboratorio de baja velocidad, para facilitar la conjugación a temperatura de habitación. La reacción fue templada con Tris Buffer. La solución de conjugado fue caracterizada como se muestra abajo. [00200] El grupo aldehido de mPEG2-ButyrALD puede reaccionar con los aminos primarios asociados con hGM-CSF y enlazarse con ellos de manera covalente, a través del amino secundario, por un agente reductor como el cianoborohidrido de sodio. Por cuanto la reacción de PEGilación fue llevada a cabo a un pH de 6,0 el enlace del PEG derivativo al hGM-CSF fue más selectivo al terminal N. La Figura 8 muestra el cromatograma SEC-HPLC de la solución de conjugado. La reacción de PEGilación rindió un 65% de especies 1-mer (un PEG enlazado al hGM-CSF o monoPEGilado) y 10% 2-mer (diconjugado, o dos PEG enlazados a hGM-CSF) . También se usó un método de cromatografía de intercambio de aniones, usando Q Sepharose High Performance y Tris buffer para purificar los conjugados. El perfil de separación de la especie de conjugado fue similar al que se muestra en la Figura 2. [00201] Usando este mismo enfoque, otros conjugados pueden ser preparados usando rnPEG2-ButyrALD con otros pesos moleculares en promedio de peso .

Ejemplo 7 PEGilación de GM-CSF con mPEG-SBA [00202] El mPEG-succinimidil butanoato con un peso molecular de 20.000 Daltons es obtenido de Nektar Therapeutics (Huntsville, AL) . La estructura básica del reactivo polimérico es provista abajo: [00203] GM-CSF es disuelto en agua desionizada, a la cual se añade trietilamina, para levantar el pH a 7,2 - 9.

A esta solución se añade luego un exceso molar de 1,5 a 10 de mPEG-SBA. La mezcla resultante es revuelta a temperatura ambiente durante varias horas . [00204] La mezcla de reacción es analizada por SDS-PAGE para determinar el grado de PEGilación de la proteína. Ejemplo 8 Conjugación de GM-CSF con cisteína insertada con mPEG-MAL, 20K mPEG MAL , 20K [00205] GM-CSF es insertada con uno o más residuos de cisteína de acuerdo con el proceso descrito en WO 90112874. [00206] mPEG-MAL, 20kDa, almacenado a -20 °C bajo argón, es llevado a temperatura ambiente. Un exceso de cinco a veinte, del mPEG-MAL aclimatado, 20K, es disuelto en agua desionizada para hacer una solución mPEG-MAL al 10%. La solución PEG-MAL es rápidamente añadida a una alícuota de solución GM-CSF de inventario (1 mg/ml en 50 mM HEPES, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de una hora de reacción a temperatura de habitación, el envase de la reacción transferido al cuarto frío y se permite que la reacción proceda durante la noche a 4 °C en Rotomix (baja velocidad, Termolina) . [00207] La mezcla de conjugado es purificada usando cromatografía por filtración de gel. Es efectuada una cromatografía de exclusión de tamaño, para analizar las mezclas de reacción, y los productos finales. También se usa el análisis SDS-PAGE para la caracterización de las muestras .

Ej emplo 9 Conjugación de GM-CSF con mPEG-MAL, 30K mPEG MAL, 30K [00208] GM-CSF es insertada con uno o más residuos de cisteína de acuerdo con el proceso descrito en WO 90112874. [00209] mPEG-MAL, 30kDa, almacenado a -20 °C bajo argón, es llevado a temperatura ambiente. Un exceso de cinco a veinte, del mPEG-MAL aclimatado, 30K, es disuelto en agua desionizada para hacer una solución mPEG-MAL al 10%. La solución PEG-MAL es rápidamente añadida a una alícuota de solución GM-CSF de inventario (1 mg/ml en 50 mM HEPES, pH de 7,0), y bien mezclada. Después de una hora de reacción a temperatura de habitación, el envase de la reacción transferido al cuarto frío y se permite que la reacción proceda durante la noche a 4 °C en Rotomix (baja velocidad, Termolina) . [00210] La mezcla de conjugado es purificada usando cromatografía por filtración de gel . Es efectuada una cromatografía de exclusión de tamaño, para analizar las mezclas de reacción, y los productos finales. También se usa el análisis SDS-PAGE para la caracterización de las muestras . Ejemplo 10 Actividad "in vitro" de los conjugados ejemplares (GM-CSF) - PEG [00211] Las actividades in vitro de los conjugados descritos en los Ejemplos 1-6 son determinadas. Todos los conjugados evaluados son bioactivos. Ejemplos 11-19 [00212] Cada uno de los Ejemplos 1-9 es replicado, excepto que la fracción GM-CSF de SEQ ID NO: 3 es reemplazado con SEQ ID NO: 1GM-CSF. Ejemplo 20 Actividades in vitro de los conjugados [00213] Las actividades in vitro de los conjugados descritos en los Ejemplos 11-19 son determinadas. Todos los conjugados evaluados son bioactivos.

Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiéndose descrito la presente se considera como novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES 1. Un conjugado que comprende la siguiente estructura: donde : POLY es un polímero soluble en agua; (a) es cero o uno; X1, cuando está presente, es una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos; R1 es un radical orgánico; GM-CSF es una fracción GM-CSF. 2. El conjugado de la reivindicación 1, comprendiendo la siguiente estructura: donde: (n) es un entero que tiene un valor de 3 a 4000; X1 es tal como se definió previamente; R1 es seleccionado del grupo que contiene metilo, etilo, propilo, e isopropilo, y GM-CSF es un GM-CSF humano. 3. El conjugado de la reivindicación 1, comprendiendo la siguiente estructura: donde (n) es un entero que tiene un valor de 3 a 4000 y GMCSF es un GM-CSF humano. . Un conjugado que comprende la siguiente estructura: donde : POLY es un polímero soluble en agua; (d) es cero o uno; X2, cuando está presente, es una fracción espaciadora, compuesta por uno o más átomos; (b) es un entero que tiene un valor de uno a diez; (c) es un entero que tiene un valor de uno a diez; R2, en cada aparición, es H independientemente, o un radical orgánico; R3, en cada aparición, es independientemente H o un radical orgánico, y GM-CSF es una fracción GM-CSF. 5. El conjugado de la reivindicación 4, comprendiendo la siguiente estructura: R2 1 H3COHCH2GH20)n-xHCHaGH20)b-|-<>- -NH—(GM-CSF) H donde: (n) es un entero que tiene un valor de 3 a 4000; X2 es tal como se definió previamente; (b) es de 2 a 6; (c) es de 2 a 6; R2, en cada aparición, es independientemente H o alquilo bajo, y GM-CSF es un GM-CSF humano. 6. El conjugado de la reivindicación 5, comprendiendo la siguiente estructura: O H3G0-(CH2CH20)n-C-NH-{CH2CH20)4—CHaCHgGHgCHs-NH-ÍGM-CSF) donde (n) es un entero que tiene un valor de 3 a 4000 y GM- CSF es un GM-CSF humano. 7. El conjugado de la reivindicación 4, comprendiendo la siguiente estructura: donde : cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 3 a 4000; X es tal como se definió previamente; (b) es de 2 a 6; (c) es de 2 a 6; R2, en cada aparición, es independientemente H o alquilo ba o, y GM-CSF es una fracción GM-CSF. 8. El conjugado de la reivindicación 5, comprendiendo la siguiente estructura: donde : cada (n) es un entero que tiene un valor de 3 a 4000 y GM-CSF es un GM-CSF humano. 9. Un conjugado con una fracción GM-CSF que comprende una amina interna enlazada de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, a un polímero ramificado soluble en agua. 10. El conjugado de la reivindicación 9, donde el conjugado comprende además un polímero adicional ramificado, soluble en agua, enlazado de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora compuesta por uno o más átomos, al residuo aminoácido de terminal N. 11. El conjugado de la reivindicación 9, donde el polímero ramificado soluble en agua carece de un residuo de lisina en el cual los polímeros sean conectados a grupos amina del residuo de lisina a través de un enlace OCH2CONHCH2CO- . 12 . El conjugado de la reivindicación 9 , donde el polímero ramificado soluble en agua comprende la siguiente estructura : donde cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 3 a 4000. 13. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9, donde el polímero soluble en agua, en cada conjugado, es seleccionado del grupo que consiste en un poli (óxido de alquileno), poli (vinil pirrolidona), poli (vinil alcohol), polioxazolina, y poli (acriloilmorfolina) . 14. El conjugado de la reivindicación 13, donde cada polímero soluble en agua es un poli (óxido de alquileno) . 15. El conjugado de la reivindicación 14, donde cada poli (óxido de alquileno) es un poli (etileno glicol) . 16. El conjugado de la reivindicación 15, donde el poli (etileno glicol) es de terminal cubierta, con una fracción de terminación cubierta seleccionada del grupo que contiene hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alkinoxi sustituido, ariloxi, y ariloxi sustituido. 17. El conjugado de la reivindicación 15 donde el poli (etileno glicol) es de terminación cubierta, con metoxi . 18. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9, donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de más de 5.000 Daltons hasta cerca de 15.000 Daltons. 19. El conjugado de la reivindicación 18, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 6.000 Daltons hasta cerca de 15.000 Daltons. 20. El conjugado de la reivindicación 19, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 15.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons. 21. El conjugado de la reivindicación 20, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 20.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons. 22. El conjugado de la reivindicación 21, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 20.000 Daltons hasta cerca de 60.000 Daltons. 23. El conjugado de la reivindicación 1 ó 4, donde el polímero soluble en agua es ramificado. 24. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9, donde la fracción GM-CSF es seleccionada del grupo que consta de GM-CSF humano, y fragmentos biológicamente activos, variantes de eliminación, variantes de sustitución o variantes de adición de cualquiera de las anteriores . 25. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9, donde la fracción GM-CSF es derivada por recombinación. 26. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9, donde no más de tres polímeros solubles en agua están enlazados a fracción GM-CSF. 27. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9 en su forma diPEGilada. 28. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9 en su forma monoPEGilada. 29. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9, donde la fracción GM-CSF es monoglicosilada. 30. El conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9, donde la fracción GM-CSF es glicosilada. 31. Una composición farmacéutica que consta de: (i) un conjugado que comprende un GM-CSF humano enlazado de manera covalente, ya sea directamente o a través de una fracción espaciadora composición por uno o más átomos, a un polímero soluble en agua, donde el polímero soluble en agua tiene un peso molecular en promedio de peso, mayor que 5.000 Daltons; y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable, donde por lo menos cerca del 85% de los conjugados en la composición tiene de uno a cuatro polímeros enlazados al GM-CSF humano. 32. La composición de la reivindicación 31, donde cada polímero soluble en agua, en cada conjugado, es seleccionado del grupo que consiste en un poli (óxido de alquileno), poli (vinil pirrolidona), poli (vinil alcohol), polioxazolina, y poli (acriloilmorfolina) . 33. La composición de la reivindicación 32, donde cada polímero soluble en agua es un poli (óxido de alquileno) . 34. La composición de la reivindicación 33, donde cada poli (óxido de alquileno) es un poli (etileno glicol) . 35. La composición de la reivindicación 34, donde el poli (etileno glicol) es de terminal cubierta, con una fracción de terminación cubierta, seleccionada del grupo que contiene hidroxi, alcoxi, alcoxi sustituido, alquenoxi, alquenoxi sustituido, alquinoxi, alquinoxi sustituido, ariloxi, y ariloxi sustituido. 36. La composición de la reivindicación 34, donde el poli (etileno glicol) es de terminación cubierta, con metoxi . 37. La composición de la reivindicación 34, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de más de 5.000 Daltons hasta cerca de 150.000 Daltons. 38. La composición de la reivindicación 37, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 6.000 Daltons hasta cerca de 100.000 Daltons. 39. La composición de la reivindicación 38, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 15.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons. 40. La composición de la reivindicación 39, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 20.000 Daltons hasta cerca de 85.000 Daltons. 41. La composición de la reivindicación 40, donde el poli (etileno glicol) tiene un peso molecular total en promedio de peso que está en la gama de cerca de 20.000 Daltons hasta cerca de 60.000 Daltons. 42. La composición de la reivindicación 41, donde cada polímero soluble en agua en cada conjugado es un polímero lineal soluble en agua. 43. La composición de la reivindicación 31, donde cada polímero soluble en agua en cada conjugado es un polímero ramificado soluble en agua. 44. La composición de la reivindicación 43, donde el polímero ramificado soluble en agua carece de un residuo de lisina en el cual los polímeros sean conectados a grupos amina del residuo de lisina a través de un grupo -OCH2CONHCH2CO- . 45. La composición de la reivindicación 31, con la condición de que cuando el polímero soluble en agua sea un polímero ramificado soluble en agua, el polímero ramificado soluble en agua carece de un residuo de lisina usado para efectuar la ramificación. 46. La composición de la reivindicación 43, donde el polímero ramificado soluble en agua comprende la siguiente estructura: donde cada (n) es independientemente un entero que tiene un valor de 3 a 4000. 47. La composición de la reivindicación 31, donde el GM-CSF humano comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 1. 48. La composición de la reivindicación 31, donde el GM-CSF humano comprende una secuencia de aminoácido de SEQ ID NO: 2. 49. La composición de la reivindicación 31, donde el GM-CSF humano es derivado por recombinación. 50. La composición de la reivindicación 48, donde el GM-CSF humano es no glicosilado. 51. La composición de la reivindicación 48, donde el GM-CSF humano es glicosilado. 52. Una composición farmacéutica que consta de: (i) el conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9; y (ii) un excipiente farmacéuticamente aceptable . 53. La composición de la reivindicación 31 ó 52, donde la composición está sustancialmente libre de albúmina. 54. La composición de la reivindicación 31 ó 52, donde la composición está sustancialmente libre de proteínas que no tengan actividad GM-CSF. 55. La composición de la reivindicación 31 ó 52, donde la composición está sustancialmente libre de polímeros solubles en agua enlazados de manera no covalente . 56. La composición de la reivindicación 31 ó 52, en su forma liofilizada. 57. La composición de la reivindicación 31 ó 52, en su forma líquida. 58. La composición de la reivindicación 31 ó 52, donde por lo menos cerca del 90% de los conjugados en la composición tiene de uno a cuatro polímeros enlazados al GM-CSF humano. 59. La composición de la reivindicación 58, donde por lo menos cerca del 95% de los conjugados en la composición tiene de uno a cuatro polímeros enlazados al GM-CSF humano. 60. Un método para la entrega de un conjugado a un paciente, comprendiendo dicho método el paso de administrar a lo paciente una composición farmacéutica de la reivindicación 31 ó 52. 61. El método de la reivindicación 60, llevado a cabo por inyección subcutánea. 62. Un método para elaborar un conjugado que comprenda el contacto, bajo condiciones de conjugación, de una fracción de GM-CSF con un reactivo polimérico, para resultar en un conjugado de la reivindicación 1, 4 ó 9. 63. El método de la reivindicación 62, donde no se efectúan los pasos de protección y desalojo de protección.