KR101441768B1 - 히알루로니다아제 및 면역글로불린의 안정한 복합제제, 및 그 사용방법 - Google Patents

히알루로니다아제 및 면역글로불린의 안정한 복합제제, 및 그 사용방법 Download PDF

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Abstract

본원에서 제공된 것은 액상으로 실온에서 적어도 6개월 동안 그리고 표준 냉장온도에서 1 내지 2년 동안 저장하기에 안정한 면역글로불린 및 히알루로니다아제의 안정한 복합제제이다. 이러한 복합제제는 피하내 투여로써 IG-치료가능한 질환 및 상태의 치료 방법으로 사용될 수 있다.

Description

히알루로니다아제 및 면역글로불린의 안정한 복합제제, 및 그 사용방법{STABLE CO-FORMULATION OF HYALURONIDASE AND IMMUNOGLOBULIN, AND METHODS OF USE THEREOF}
적어도 6개월 동안 상온 및 1-2년 동안 표준 냉장 온도에서 액상으로 저장하기에 안정된 히알루로니다아제 및 면역글로불린의 안정된 복합제제가 제공된다. 이러한 복합제제는 피하내 투여에 의하여 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료 방법에서 사용될 수 있다.
인간 혈장으로부터 제조된 면역 글로불린(IG) 제품은 면역 질환을 치료하기 위하여 1952년에 최초로 사용되었다. 처음에, 면역 글로불린의 근육내 또는 피하내 투여는 선택적인 방법이었다. 그러나 다양한 질환의 효과적인 치료를 위한 보다 많은 양의 면역 글로불린을 주입하기 위하여, 보다 작은 농도(50 mg/mL)의 면역 글로불린이 정맥내 투여가능한 제품들이 개발되었다. 면역 글로불린(IVIG)의 정맥내(IV) 투여는 면역 질환을 갖는 개인의 주요한 치료법이다. 비록 초기 IVIG 제제가 심각한 부작용을 야기하지만, 현재 이용되는 IVIG 제제는 면역 결핍 환자의 대다수에게 널리 용인되고 있다. 그럼에도 불구하고, 환자의 일부는 불쾌하고, 심지어 장애가 되는 반응들, 예컨대, 두통, 피로 및 근육통을 계속해서 가진다. 특히 환자가 병발성 감염(intercurrent infection)을 가지는 경우, 열 및 오한이 문제로 남는다. 다른 IVIG 제제의 시도, 또는 아세트아미노펜, 디펜히드라민 및 코르티코스테로이드와의 예비투약에도 불구하고 상기 반응들은 종종 지속된다. 또한, IV 투여에 대한 필요 때문에 환자 순응도의 문제가 있다.
면역 글로불린의 피하내(SQ) 투여는 정맥내 투여의 대안이 된다. IV 주입(infusion)과 비교하여, 면역 글로불린의 SQ 투여는 여러 장점을 가진다. 예를 들면, 이는 전신 반응의 발생을 감소시키고, 때때로-어려운 IV 접근을 필요로 하지 않으며, 최저치(trough level)을 개선시키며, 환자에게 더욱 독립성을 제공한다.
임의의 면역 글로불린 조제용 물질(preparation)의 치료적 사용을 위하여, 면역 글로불린을 저장하는 동안의 안정성은 또다른 중요한 고려사항이다. 단백질을 함유하는 제제의 안전한 처리 및 투여는 제약학적 약제사(formulator)에 대한 중요한 도전을 나타낸다. 단백질은 안정성의 문제를 나타내는 독특한 화학적 및 물리적 성질을 가진다: 단백질에는 화학적 및 물리적 불안정성이 모두 연관되는 다양한 분해 경로가 존재한다. 화학적 불안정성은 탈아미노화, 응집(aggregation), 펩티드 중추(peptide backbone)의 절단 및 메티오닌 잔기의 산화를 포함한다. 물리적 불안정성은 예를 들어, 응집을 포함한, 다수의 현상을 포함한다. 이러한 이유로, 면역 글로불린 조제용 물질(preparation)의 안정한 제형의 필요성이 존재한다.
관련 출원
우선권의 이익은 2009.9.17.에 출원된 “히알루로니다아제 및 면역글로불린의 안정된 복합제제 및 이들의 사용 방법"이라는 제목의 미국 가출원번호 61/277,045호에 대해 주장된다.
본 출원은 또한 본 출원과 동일한 날에 출원된 "히알루로니다아제 및 면역글로불린의 안정된 복합제제 및 이들의 사용 방법"라는 제목의 미국 출원번호 [Attorney Docket 제3800020.00139/3088]호와 관련이 있으며, 이 또한 우선권의 이익은 미국 가출원번호 61/277,045호에 대해 주장된다.
허용되는 경우, 각각의 상기 기재된 관련 출원의 대상물은 그 전체로 참조로써 포함된다.
요약
IG-치료가능 질환 및 상태를 치료하기 위한 안정한 액체 복합제제의 근육내 투여를 위한 조성물, 방법 및 키트가 제공된다. 적어도 10% w/v 농도의 면역 글로불린, 적어도 50 U/mL 농도의 히알루로니다아제를 함유하며 적어도 100 유닛/그램 (U/g) 비율의 면역 글로불린, 적어도 50 mM 농도의 NaCl에서 4 내지 5사이의 pH에서 존재하는, 근육내 투여를 위한 안정한 액체 복합제제 조성물이 제공된다. 복합제제는 28℃ 내지 32℃ 에서 적어도 6개월 동안 안정하다.
나아가, 아미노산 안정화제, 예를 들어, 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 또는 프롤린이 존재할 수 있다. 일부 예에서, 아미노산은 적어도 100 mM의 분량으로 존재한다. 한 예에서, 아미노산은 글리신이며 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM의 분량 또는 적어도 그 이상으로 존재한다. 또다른 예에서, 글리신은 250 mM의 분량으로 존재한다.
상기 제공되는 안정한 액체 복합제제는 적어도 IG를 10% 내지 22%, 예를 들어 10 % w/v, 11 % w/v, 12 % w/v, 13 % w/v, 14 % w/v, 15 % w/v, 16 % w/v, 17 % w/v, 18 % w/v, 19 % w/v, 20 % w/v, 21 % w/v, 22 % w/v 또는 그 이상으로 함유한다. 일부 예에서 상기 IG는 10 % w/v 내지 20 % w/v이다. 복합제제에 사용된 IG 는 예컨대, 알코올 분획법(fractionation)에 의하여 인간 혈장으로부터 정제될 수 있다. 일부 예에서, IG 는 화학적 변형, pH 4.0 에서 펩신 유무의 배양, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 효소 절단, 용매 계면활성제 처리, 정용여과(diafiltration) 또는 초여과(ultrafiltration) 중 임의의 하나 이상에 의하여 추가로 정제될 수 있다. 본원에서 제공되는 방법 및 용도에는 IgG, IgA 및 IgM 을 포함하는 IG 를 채택할 수 있다. 일부 예에서, IgG 는 95% 초과의 IgG 를 포함한다.
나아가, 상기 복합제제는 NaCl을 함유할 수 있다. 일부 예에서, 상기 NaCl은 50 mM 내지 220 mM의 농도, 예를 들어, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 210 mM, 220 mM 또는 그 이상의 농도를 가진다. 한 예에서, 상기 NaCl은 150 mM의 농도를 가진다.
본원에서 제공되는 복합제제에서 함유하는 가용성 히알루로니다아제는 PH20 또는 이의 절단된 형태일 수 있다. 예를 들어, 가용성 히알루로니다아제는 양 또는 소 또는 절단된 인간 PH20 일 수 있다. 절단된 인간 PH20 이 본원에서 제공되는 방법 및 용도에서 사용되는 경우의 예에서, 절단된 인간 PH20 은 서열번호:4 내지 9 중 임의의 것에 기재된 아미노산 서열을 가지는 폴리펩티드, 또는 이의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택될 수 있다. 한 예에서, 가용성 히알루로니다아제는 rHuPH20 이다.
나아가, 상기 가용성 히알루로니다아제는 50 U/mL 내지 500 U/mL의 농도, 예컨대 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/ mL 또는 그 이상일 수 있다. 예를 들어, 상기 가용성 히알루로니다아제는 100 U/mL 내지 300 U/mL의 농도일 수 있다. 본원에서 제공된 복합제제에는, 상기 가용성 히알루로니다아제는 100 U/g IG 내지 5000 U/g IG, 예컨대, 100 U/g IG, 150 U/g IG, 200 U/g IG, 250 U/g IG, 300 U/g IG, 400 U/g IG, 500 U/g IG, 600 U/g IG, 700 U/g IG, 800 U/g IG, 900 U/g IG, 1000 U/g IG, 1200 U/g IG, 1500 U/g IG, 1800 U/g IG, 2000 U/g IG, 3000 U/g IG, 4000 U/g IG, 5000 U/g IG 또는 그 이상의 비율로 존재할 수 있다. 일부 예에서 상기 가용성 히알루로니다아제는 500 U/g IG, 1000 U/g IG, 1500 U/g IG 또는 3000 U/g IG의 비율을 가진다. 상기 복합제제의 pH는 농축된 상태에서 4.4 내지 4.9일 수 있다.
본원에서 제공된 복합제제는 복수 투여량 투여용 또는 단일 투여량 투여용으로 제제화 될 수 있다. 나아가, 예컨대 복합제제가 단일 투여량 투여용이라고 할때, IG는 IG-치료가능한 질환 또는 상태를 치료하기에 충분한 양이다. IG는 IG-치료가능한 질환 또는 상태의 치료를 위하여 매일, 매주, 격주, 매 2 내지 3주마다, 매 3 내지 4주마다 또는 매월 투여될 수 있다. 상기 복합제제의 투여는 IG-치료가능한 질환 또는 상태의 치료를 위한 정맥내 투여시 투여된 IG의 양이 실질적으로 단일 투여량 투여와 동일하도록 영향을 받을 수 있다. 일부 예에서 복합제제 내 IG의 양은 약 1 그램 (g) 내지 200 g, 예를 들어, 1 그램 (g), 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g 또는 200 g일 수 있다. 나아가, 조성물 내의 히알루로니다아제의 양은 약 500 유닛 내지 100,000 유닛, 예를 들어, 500 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 10,000 유닛, 30,000 유닛, 40,000 유닛, 50,000 유닛, 60,000 유닛, 70,000 유닛, 80,000 유닛, 90,000 유닛, 100,000 유닛 또는 그 이상일 수 있다.
본원에서 제공된 상기 액체 복합제제는 28℃ 내지 32℃에서 적어도 6개월 내지 1년 동안, 예를 들어, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월 또는 그 이상 동안 안정하다. 상기 액체 복합제제는 나아가 0℃ 내지 10℃에서 적어도 6개월 내지 2년 동안, 예를 들어, 6개월, 1년, 2년 또는 그 이상 동안 안정하다.
또한 본원에서 제공된 임의의 상기 안정한 액체 복합제제 함유하는 키트 및 선택적으로 사용을 위한 설명이 본원에 제공된다.
본원에서 제공하는 안정한 액체 복합제제를 함유하는 용기가 본원에 제공된다. 상기 용기는 튜브, 병, 바이알 또는 주사기일 수 있다. 예를 들어 용기가 주사기인 경우, 용기는 나아가 주입을 위한 바늘을 포함한다. 따라서, 본원에서 제공되는 용기는 단일 투여량 투여용 또는 복수 투여량 투여용으로 상기 안정된, 액체 복합제제를 함유한다.
가용성 히알루로니다아제 및 IG를 함유하는 안정한 액체 복합제제를 환자 피하내 투여에 의하여 IG-치료가능한 질환 또는 상태를 치료하는 방법이 본원에 제공된다. 상기 복합제제는 투여된 IG의 양이 IG-치료가능한 질환 또는 상태를 치료하기 위하여 정맥내 투여시 투여량과 실질적으로 같도록 투여된다.
나아가, 본원에 제공된 방법은 일차성 면역 결핍 질환, 이차성 면역 결핍 질환, 염증성 질환, 자가면역성 질환 및 급성 감염 중에서 선택되는, IG-치료가능한 질환 또는 상태를 치료하기 위함이다.
일부 예에서, 복합제제는 본원에서 제공되는 방법을 사용하여 일차성 면역 결핍 질환의 치료에 투여될 수 있다. 상기 일차성 면역 결핍 질환은 공통 가변성 면역결핍(CVID), 선택적 IgA 결핍, IgG 서브클래스 결핍, 특정 항체 결핍, 보체 질환, 선천성 무감마글로불린혈증, 모세혈관확장성 운동실조, IgM 과다, 비스코트-올드리치 증후군 (Wiskott-Aldrich syndrome), 중증 합병증 면역결핍 장애 (SCID), 원발성 저감마글로불린혈증, 항체 결핍이 있는 원발성 면역결핍증, X-연관 무감마글로불린혈증 (XLA), 유아의 저감마글로불린혈증일 수 있다.
다른 예로, IG-치료가능 질환 또는 상태는 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증일 수 있다 혈액 암은 혈액 암은 만성 림프성 백혈병 (CLL), 다발성 골수종 (MM) 또는 비호지킨림프종 (NHL) 중에서 선택될 수 있다.
IG-치료가능 질환 또는 상태가 염증성 또는 자가면역 질환인 경우, 염증성 또는 자가면역 질환은 가와사키 병, 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증, 길랑-바레 증후군, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 다발성 근염, 피부근염, 봉입체 근염, 람베르트-이튼 근무력 증후군, 다초점 운동 신경병증, 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군(Moersch-Woltmann syndrome) 중에서 선택될 수 있다.
일부 예에서 복합제제는, 예를 들어, 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae)타입 B; 슈도모나스 아에루기노사 (Psuedomonas aeruginosa) 타입 A 및 B; 스타필로코코스 아우레우스(Staphylococcus aureus); 그룹 B 스트렙토코코스; 스트렙토코코스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 타입 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, 및 23; 아데노바이러스 타입 2 및 5; 싸이토메갈로바이러스; 엡스타인 바아 바이러스 VCA; A 형 간염 바이러스; B 형 간염 바이러스; 헤르페스 심플렉스 바이러스-1; 헤르페스 심플렉스 바이러스-2; 인플루엔자 A; 홍역; 파라인플루엔자 타입 1, 2 및 3; 폴리오; 바리셀라 주스터 바이러스;아스페르길루스 (Aspergillus) 및 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 와 같은 급성 박테리아, 바이러스 또는 진균 감염을 치료하기 위하여 투여된다.
나아가 IG-치료가능한 질병 또는 상태는, 의사에게 원인이 있는(iatrogenic) 면역결핍; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 항체가 없는 부종양성 소뇌변성; 및 골수이식 중에서 선택될 수 있다.
발명의 상세한 설명
개요
A. 정의
B. 면역 글로불린( IG ) 및 히알루로니다아제의 안정한 복합제제
1. 면역 글로불린 치료법
2. 면역 글로불린 및 히알루로니다아제 제제의 피하내 투여
3. 안정한 복합제제
C. 면역 글로불린 및 면역 글로불린의 제조( preparation )
1. 제조 및 정제
a. 콘- 온클리 법( Cohn - Oncley Method )
b. 변형된 콘- 온클리 법
c. 바이러스적 처리( Viral Processing )
d. 단백질 농축
e. IG 제조의 예
i. 10% IG
ii . 고농도 IG 제조 (e.g. 20% IG )
2. 저장 안정성
a. 단백질-안정화 첨가제
b. pH
D. 히알루로니다아제
1. PH20
2. 가용성 히알루로니다아제
a. 가용성 인간 PH20
b. 가용성 재조합 인간 PH20 ( rHuPH20 )
3. 글리코실화( Glycosylation )
4. 약동학적 성질을 개선하기 위한 히알루로니다아제의 변형
E. 가용성 히알루로니다아제를 인코딩하는 핵산 및 그의 폴리펩티드의 제조방법
1. 벡터 및 세포
2. 발현
a. 원핵 세포
b. 효모 세포
c. 곤충 세포
d. 포유류 세포
e. 식물
3. 정제 기법
F. 면역 글로불린 및 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드의 제조, 제제화 및 투여
1. 제제화 및 투여량
a. 면역 글로불린
b. 히알루로니다아제
c. 염화나트륨
d. 아미노산 안정화제
e. 기타 물질
2. 제형( Dosage Forms )
3. 투여
G. 활성, 안정성, 생체이용률 및 약동학 평가 방법
1. 분자 크기
2. 생물학적 활성
a. 면역 글로불린
b. 히알루로니다아제
1. 약동학 및 내약성
H. 치료 방법 및 치료 용도
1. 일차적 및 이차성 면역 결핍 질환
a. 일차성 면역 결핍 질환
b. 이차성 면역 결핍 질환
2. 염증성 및 자가면역 질환
a. 가와사키 병
b. 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증
c. 길랑 - 바레 증후군
d. 특발성 혈소판 감소성 자반증
e. 염증성 근육병증
i. 피부근염
ii . 다발성근염
iii . 봉입체 근염
f. 람베르트- 이튼 근무력 증후군
g. 다초점 운동 신경병증
h. 중증 근무력증
i. 뫼르쉬 -볼트만 증후군
3. 급성 감염
4. 기타 질환 및 상태
I. 제조품 및 키트
J. 실시예
A. 정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 과학기술 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자가 통상 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원의 전체 개시를 통틀어 언급된 모든 특허, 특허 출원, 공보 및 출판물, 진뱅크(Genbank) 서열, 데이터베이스, 웹사이트 및 기타 공지된 재료들은, 달리 언급되지 않는 한, 그의 전체가 참조로써 포함된다. 본원에서 용어에 대한 여러가지 정의가 있는 경우, 본 섹션에 있는 것을 우선으로 한다. URL 또는 기타 그러한 식별자 또는 주소를 언급한 경우, 상기 식별자들은 바뀔 수 있고, 인터넷상의 특별한 정보는 변천할 수 있지만, 동등한 정보는 인터넷 검색으로 찾을 수 있는 것으로 이해된다. 그곳에서 참고되는 내용은 상기 정보의 이용가능성 및 공개적 보급성을 입증한다.
본원에 사용된 바와 같이, "면역글로불린", "면역 글로불린", "감마 글로불린"은 성인 공여자의 수집한 혈장으로부터 유도된 혈장 단백질의 제제를 지칭한다. IgG 항체가 지배적이고; 기타 항체 서브클래스, 예컨대 IgA 및 IgM 가 존재한다. 치료적 면역 글로불린은 순환 항체의 수용자의 혈청 수준을 증가시킴으로써 수동성 면역을 제공할 수 있다. IgG 항체는, 예를 들어 박테리아 독소에 결합하여 중화시킬 수 있고; 병원체를 옵소닌화할 수 있고; 보체를 활성화할 수 있고; 싸이토카인 및 그의 수용체, 예컨대 CD5, 인터류킨-1a (IL-1a), 인터류킨 6 (IL-6), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), 및 T-세포 수용체와의 상호작용을 통해 병원체 싸이토카인 및 포식세포를 억제할 수 있다. 치료적 면역 글로불린은 자가항체의 활성을 억제할 수 있다. 면역 글로불린 제제에는 또한, 이에 제한되지 않으나, 정맥용 면역 글로불린 (IGIV), 면역 글로불린 IV, 치료 면역글로불린이 포함된다. 면역 글로불린 제제는 널리 공지되어 있고, BayGam®, Gamimune® N, Gammagard® S/D, Gammar®-P, Iveegam®EN, Panglobulin®, Polygam® S/D, Sandoglobulin®, Venoglobulin®-I, Venoglobulin®-S, WinRho® SDF 등과 같은 브랜드명의 것을 포함한다. 면역 글로불린 제제는 인간 혈장으로부터 유도될 수 있거나, 또는 재조합적으로 제조될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "정맥내 IgG" 또는 "IVIG" 치료는 IgG 면역글로불린의 조성물을 환자에게 정맥내 투여하여 면역 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환과 같은 다수의 상태를 치료하는 치료적 방법을 일반적으로 지칭한다. IgG 면역글로불린은 일반적으로 혈장에 모여있으며 이로부터 제조된다. 항체 전부 또는 단편이 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, IG-치료가능 질환 또는 상태는 면역 글로불린 제제가 이용되는 임의의 질환 또는 상태를 지칭한다. 상기 질환 및 상태에는, 이에 제한되지 않으나, 항체 순환 증가가 개선되는 임의의 질환, 예컨대 면역결핍; 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증; 가와사키 병; 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증 (CIDP); 길랑-바레 증후군; 특발성 혈소판 감소성 자반증; 염증성 근육병증; 람베르트-이튼 근무력 증후군; 다초점 운동 신경병증; 중증 근무력증; 뫼르쉬-볼트만 증후군; 속발성 저감마글로불린혈증 (의원성 면역결핍 포함); 특정 항체 결핍증; 급성 산재성 뇌척수염; ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염; 자가면역성 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창; 반흔성 유천포창; 에반스 증후군 (면역 저혈소판증이 있는 자가면역성 용혈성 빈혈 포함); 모자간/신생아 동종 면역성 혈소판감소증 (FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군; 고위험성 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장 이식; 다발성 경화증; 활모양강직-근육간대경련-실조; 낙엽상 천포창; 심상성 천포창; 수혈 후 자반증; 중독성 표피융해/스티븐 존슨 증후군 (TEN/SJS); 독성 쇼크 증후군; 알츠하이머 병; 전신성 홍반성 루푸스; 다발성 골수종; 패혈증; B 세포 종양; 외상; 및 박테리아성, 바이러스성 또는 진균성 감염이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 실온은 일반적으로 약 18℃ 내지 약 32℃의 범위를 지칭한다. 당업자는 실온이 위치 및 우세한 상태에 따라 달라짐을 인식할 것이다. 예를 들어, 이탈리아나 텍사스와 같은 기후일 경우 실온은 높아질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에서 제공된 복합제제와 관련하여 "안정한" 또는 "안정성"은 32℃까지의 온도에서 적어도 6개월 이상 저장되는 동안 그 물리적 및 화학적 안정성 및 경향을 유지하는 단백질(IG 및 히알루로니다아제) 중 하나를 지칭한다. 본원의 목적에 의해, "실온에서의 안정성"은 더운 지방에서는 일반적인 실온보다 더 높은 온도 범위(예를 들어, 이탈리아 또는 텍사스에서는 28 내지 32℃)에서의 안정성을 의미한다. 제제는 냉장 및 실온 범위, 예를 들어, 0 내지 32 ℃를 넘어 또는 32℃ 상한까지 적어도 6개월 동안 안정하다. 각각의 IG 및 히알루로니다아제는 복합제제 내에서 저장하는 동안 적어도 6개월은 약 또는 최고 32℃ 까지의 실온에서 안정성을 나타낸다. 각각의 안정성을 평가하는 분석시험은 당업자에게 잘 알려져 있으며 본원에 기재되어있다.
본원에서 사용된 바와 같이, IG의 안정성이라 함은 약 또는 70 kDa 이상 450 kDa 이하의 분자량을 가지는 IG가 실질적으로 적어도 그 중 90%는 단량체 또는 올리고머 또는 이량체로써 존재하도록 응집, 변성 또는 단편화(fragment)되지 않음을 의미한다. 따라서, 약 10 % 이하, 예를 들어, 약 5 % 이하, 약 4 % 이하, 약 3 % 이하, 약 2 % 이하, 약 1 % 이하의 IG 단백질이 제제 내에서 응집체(즉, 분자 크기가 450 kDa 또는 그 이상)로 존재한다. 유사하게는, 5 % 내지 7 % 이하, 예를 들어, 복합제제 내의 7 %, 6 %, 5 %, 4 %, 3 %, 2 %, 1 % 또는 0.5 % 또는 그 이하의 IG가 단편화(즉, 분자 크기가 70 kDa 또는 그 이하)되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제의 안정성이라 함은 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 그 이상으로 저장 전의 원래 히알루로니다아제 활성을 유지함을 의미한다. 각각의 안정성을 평가하는 분석시험은 당업자에게 공지되어 있으며 본원에 기재되어있다.
본원에서 사용된 바와 같이, "저장"은 제제가 제조된 이후 즉시 대상체에 투여되지는 않으나, 일정 시간동안 사용에 앞서 특정 조건(예를 들어, 특정 온도; 액체 또는 동결건조 형태)에서 보관됨을 의미한다. 예를 들어, 액상 제제는 수일, 수주, 또는 수년 단위로, 일반적으로는 적어도 6개월 동안 대상체에 대한 투여에 앞서 냉장(0℃ 내지 10℃) 또는 실온(예를 들어, 32℃까지)과 같은 다양한 온도 하에서 보관될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 투약요법(dosing regime)은 투여되는 면역 글로불린의 양 및 투여 빈도를 지칭한다. 투약요법은 치료될 질환 또는 상태의 함수이고, 따라서 가변적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "정맥용 IG (IVIG) 투약요법과 실질적으로 동일" 은 투여량 및/또는 빈도가, 특정 질환 또는 상태 치료에 유효한 양 이내, 전형적으로는 IV 투여량 또는 빈도의 약 10% 인 요법을 지칭한다. 특정 질환 또는 상태 치료에 유효한 IVIG의 양은 공지되어 있거나, 또는 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 하기에 예시된 바와 같이, 300 mg/kg (즉, 평균 성인 체중 70 kg을 가정할 때, 21 그램) 내지 600 mg/kg (즉, 42 그램) 이 원발성 면역결핍증이 있는 환자에 투여되는 IVIG의 전형적인 매월 투여량이다. 따라서, IG 는, 히알루로니다아제와 병용투여시, 원발성 면역결핍증 치료를 위해 약 또는 300 mg/kg 내지 600 mg/kg 인 투여량으로 피하투여된다.
본원에 사용된 바와 같이, 투여 빈도는 연쇄적 면역 글로불린의 투여량 사이의 시간을 지칭한다. 예를 들어, 빈도는 1, 2, 3, 4 주일 수 있고, 치료할 특정 질환 또는 상태의 함수이다. 일반적으로, 빈도는 적어도 매 2 또는 3 주이고, 전형적으로는 1회에 1 개월을 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제는 히알루론산을 분해하는 효소이다. 히알루로니다아제는 박테리아의 히알루로니다아제 (EC 4.2.99.1), 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래의 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.36), 및 포유류-타입 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.35) 를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한, 이에 제한되지 않으나, 쥐과동물, 개, 고양이, 토끼류, 조류, 소, 양, 돼지, 말, 물고기류, 개구리류, 균류, 및 거머리류, 기타 기생충류 및 갑각류 유래 임의의 것을 포함하는 임의의 비-인간 기원의 것을 포함한다. 예시되는 비-인간 히알루로니다아제는, 소 (서열번호: 10 및 11), 말벌 (서열번호: 12 및 13), 꿀벌 (서열번호: 14), 흰얼굴 호박벌 (서열번호: 15), 장수말벌 (서열번호: 16), 마우스 (서열번호: 17 내지 19, 32), 돼지 (서열번호: 20 내지 21), 랫트 (서열번호: 22 내지 24, 31), 토끼 (서열번호: 25), 양 (서열번호: 26 및 27), 오랑우탄 (서열번호: 28), 필리핀 원숭이 (서열번호: 29), 기니 피그 (서열번호: 30), 황색포도상구균 (서열번호: 33), 연쇄상구균 (서열번호: 34), 및 클로스트리디움 페르프린겐스 (Clostridium perfringens) (서열번호: 35) 유래의 히알루로니다아제를 포함한다. 히알루로니다아제에는 또한 인간 기원의 것이 포함된다. 예시 인간 히알루로니다아제는, HYAL1 (서열번호: 36), HYAL2 (서열번호: 37), HYAL3 (서열번호: 38), HYAL4 (서열번호: 39) 및 PH20 (서열번호: 1) 을 포함한다. 또한, 히알루로니다아제들 중에는 양 및 소 PH20, 가용성 인간 PH20 및 가용성 rHuPH20를 포함하는 가용성 히알루로니다아제들이 포함된다.
히알루로니다아제의 레퍼런스는 전구체 히알루로니다아제 폴리펩티드 및 성숙형 히알루로니다아제 폴리펩티드 (예컨대, 시그널 서열이 제거된 것), 활성을 갖는 그의 절단된 형태를 포함하고, 대립형질 변이체 및 종 변이체, 스플라이스 변이체에 의해 인코딩되는 변이체 및, 서열번호: 1 및 10 내지 39 에 개시된 전구체 폴리펩티드와 적어도 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상 서열 동일성을 갖는 폴리펩티드, 또는 그의 성숙형 형태를 포함하는 기타 변이체를 포함한다. 예를 들어, 히알루로니다아제라는 언급은 또한 서열번호: 50 내지 51 에 개시된 인간 PH2O 전구체 폴리펩티드 변이체를 포함한다. 히알루로니다아제는 또한 화학적 또는 번역후 변형을 포함하는 것들, 및 화학적 또는 번역후 변형을 포함하지 않는 것들을 포함한다. 상기 변형에는, 이에 제한되지 않으나, 페길화, 알부민화, 글리코실화, 파르네실화, 카르복실화, 히드록실화, 포스포릴화 및 기타 당업계에 공지된 기타 폴리펩티드 변형이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 히알루로니다아제는 생리학적 상태 하에서의 그의 용해도를 특징으로 하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일반적으로, 가용성 히알루로니다아제에는 글리코포스파티딜 앵커(GPI)의 일부 또는 전부가 존재하지 않거나, 그렇지 않으면 세포막에 충분히 고정되지 않는다. 따라서, 세포로부터의 발현으로, 가용성 히알루로니다아제는 매질(medium)로 분비된다. 가용성 히알루로니다아제는, 예를 들어 37℃ 로 승온시킨 Triton X-114 용액의 수상에 대한 그의 분배로 구분될 수 있다 (Bordier 등, (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). 지질 고정 히알루로니다아제와 같이, 막에 고정된 것은 계면활성제 풍부 상 내로 분배될 것이나, 포스포리파아제-C의 처리 후에는 계면활성제가 거의 없는 곳 또는 수성상으로 분배될 것이다. 가용성 히알루로니다아제에 포함되는 것 중에는 특히, 막에 히알루로니다아제가 고정되어 회합된 하나 이상의 영역이 제거 또는 변형된, 가용성 형태가 히알루로니다아제 활성을 보유하는 막 고정 히알루로니다아제가 있다. 가용성 히알루로니다아제에는, 재조합성 가용성 히알루로니다아제 및, 예를 들어 양 또는 소의 고환 추출물과 같은 천연 공급원에 포함되어 있거나 또는 그로부터 정제된 것이 포함된다. 상기 가용성 히알루로니다아제의 예시는 가용성 인간 PH20 이다. 기타 가용성 히알루로니다아제에는 양 (서열번호:27) 및 소 (서열번호:11) PH20가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 인간 PH20 또는 sHuPH20 에는, 발현시 폴리펩티드가 가용성이 되도록, C-말단에서의 글리코실포스파티딜이노시톨 (GPI) 결합 부위의 전부 또는 일부가 결핍된 성숙형 폴리펩티드가 포함된다. 예시 sHuPH20 폴리펩티드에는, 서열번호: 4 내지 9 및 47 내지 48 의 어느 하나에 개시된 아미노산 서열을 가진 성숙형 폴리펩티드가 포함된다. 상기 예시 sHuPH20 폴리펩티드에 대한 전구체 폴리펩티드에는 시그널 서열이 포함된다. 전구체의 예시는 서열번호 3 및 40 내지 46 에 개시된 것이며, 이들 각각은 아미노산 위치 1 내지 35 에 35 개의 아미노산 시그널 서열을 포함한다. 가용성 HuPH20 폴리펩티드는 또한 본원에 기재된 제조 및 정제 방법 동안 또는 이후 분해되는 것이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 가용성 재조합 인간 PH20 (rHuPH20) 는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 재조합적으로 발현되는 인간 PH20 의 가용성 형태를 지칭한다. 가용성 rHuPH20 는 시그널 서열을 포함하고, 서열번호: 49 에 개시된 핵산에 의해 인코딩된다. 또한 그의 대립형질 변이체 및 기타 가용성 변이체인 DNA 분자들도 포함한다. 가용성 rHuPH20 를 인코딩하는 핵산은 성숙형 폴리펩티드를 분비하는 CHO 세포에서 발현된다. 배양 배지에서 제조시, C-말단에는 비균질성이 있어서, 생성물에는 다양한 풍부성으로 서열번호: 4 내지 9 의 임의의 한가지 이상을 포함할 수 있는 종들의 혼합물이 포함된다. 서열번호: 50 내지 51 에 개시된 전구체 인간 PH20 폴리펩티드에 해당하는 것을 포함하여, 상응하는 대립형질 변이체 및 기타 변이체도 또한 포함된다. 기타 변이체는, 히알루로니다아제 활성을 보유하고 가용성인 한, 서열번호: 4 내지 9 및 47 내지 48 의 어느 것과 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 활성은 전장 (완전) 단백질과 관련된 폴리펩티드 또는 그의 일부의 기능적 활성 또는 활성들을 지칭한다. 기능적 활성에는, 이에 제한되지 않으나, 생물학적 활성, 촉매적 또는 효소적 활성, 항원성 (항-폴리펩티드 항체에 결합하는 폴리펩티드에 결합하거나 또는 그와 경쟁하는 능력), 면역원성, 다량체 형성 능력, 및 폴리펩티드에 대한 수용체 또는 리간드에 특이적으로 결합하는 능력이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 히알루로니다아제 활성은 히알루론산을 절단하는 히알루로니다아제의 능력을 지칭한다. 가용성 rHuPH20 와 같은 히알루로니다아제의 히알루로니다아제 활성 결정을 위한 시험관내 검정은 당업계에 공지되어 있고, 본원에 기재되어 있다. 예시 검정에는, 절단되지 않은 히알루론산이 혈청 알부민과 결합시 형성되는 불용성 침전물을 검출함으로써 간접적으로 히알루로니다아제에 의한 히알루론산의 절단을 측정하는, 하기에 (예를 들어, 실시예 3 참고) 기재된 미세탁도 분석이 포함된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "초여과(US)"는 정수압이 반투과막에 대하여 액체에 힘을 가하는 다양한 막여과 방법을 지시한다. 고분자량의 현탁 물질 및 용질이, 물과 저분자량의 용질이 막을 통과하는 동안 유지된다. 이러한 분획 과정은 거대분자(103 내지 106Da) 용액의 정제 및 농축, 특히 단백질 용액에 자주 사용된다. 다수의 초여과막이 그것이 함유하는 분자의 크기에 따라 존재한다. 초여과는 일반적으로 1 내지 1000 kDa 사이의 막 구멍 크기 및 0.01 내지 10 bar 사이의 동작 압력에 따라 특징지어지며, 특히 설탕 및 소금과 같은 작은 분자로부터의 콜로이드 같은 단백질 분리에 용이하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "정용여과"는 초여과와 동일한 막에서 수행되며 접선 흐름 여과에 해당한다. 정용여과를 할 때, 여과물질이 유닛 오퍼레이션으로부터 제거되는 동안 버퍼가 재활용 탱크 내로 주입된다. 생성물질이 농축물(예를 들어 IgG)인 과정에서, 정용여과는 생성물질로부터 여과물질 내로 구성요소들을 씻어내어, 버퍼를 교환하고 부산물의 농도를 감소시킨다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "혼합"은 임의의 방법으로 교반된 용액 또는 현탁액 내의 둘 또는 그 이상의 분리된 화합물 또는 물질의 동일한 분포를 초래하는 활동으로 정의된다. 본원에서 용어를 사용함에 있어 용액 또는 현탁액 내의 모든 구성물질의 완전히 동일한 분포가 "혼합"의 결과로써 반드시 요구되지는 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "용제"는 하나 또는 그 이상의 물질을 용해하거나 분산시킬 수 있는 임의의 액체 물질을 지시한다. 용제는, 물과 같이 자연에서 무기물일 수도 있고, 또는 에탄올, 아세톤, 메틸아세테이트, 에틸 아세테이트, 헥산, 페트롤에테르 등과 같이 유기액체일 수도 있다. 용어 "용제 계면활성제 처리"에서 사용된 바와 같이, 용제는 용액상태에서 지질로 덮인 바이러스를 불활성화시키는 용제 계면활성제 혼합의 일부인, 유기용제(예를 들어, 트리-N-부틸포스페이트)를 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "세제"는 본원에서 용어 "계면활성제" 또는 "표면 활성 물질"과 교환가능하게 사용된다. 계면활성제는 일반적으로 양쪽친매성인, 즉, 소수성기("꼬리") 및 친수성기("머리")를 모두 가져, 계면활성제가 유기용제 및 물 모두에 용해되도록 하는 유기화합물이다. 계면활성제는 머리에 형식적으로 하전된 그룹의 존재에 따라 분류할 수 있다. 이온성 계면활성제는 머리에 순전하를 가질 때, 비-이온성 계면활성제는 머리에 하전된 그룹이 없다. 쌍성이온 계면활성제는 두개의 반대로 하전된 그룹을 가진 머리를 함유한다. 일반적인 계면활성제의 다수 예에는: 음이온성(황산, 아황산 EH는 카르복실 음이온에 기초함): 퍼플루오로옥타노에이트(PFOA 또는 PFO), 퍼플루오로옥타노설페이트(PFOS), 소듐도데실설페이트(SDS), 암모늄라우릴설페이트, 및 다른 알킬 설페이트염, 소듐라우레스설페이트(또한 소듐라우릴에테르설페이트, 또는 SLES로 알려짐), 알킬벤젠설포네이트; 양이온성(4급 암모늄 양이온에 기초함): 헥사데실트리메틸암모늄브로마이드로도 알려진 세틸트리메틸암모늄브로마이드(CTAB) 및 다른 알킬트리메틸암모늄염, 세틸피리디늄클로라이드(CPC), 폴리에톡실레이트 수지 아민(POEA), 벤잘코늄클로라이드(BAC), 벤제토늄클로라이드(BZT); 쌍성이온성(양쪽성이온): 도데실베타인; 코카미도프로필베타인; 코코암포글리시네이트; 비이온성: 알킬폴리(에틸렌옥사이드), 알킬페놀폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌옥사이드) 및 폴리(프로필렌옥사이드)의 공중합체(상업적으로 폴록사머 또는 폴록사민으로 알려짐), 옥틸글루코사이드를 포함하는 알킬폴리글루코사이드, 데실말토사이드, 지방알코올(예를 들어, 세틸알코올 및 올레일알코올), 코카마이드 MEA, 코카마이드 DEA, 폴리소르베이트(트윈20, 트윈80 등), 트리톤 계면활성제, 및 도데실디메틸아민옥사이드가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 천연 발생 α-아미노산의 잔기는, 충전된 tRNA 분자의, 인간에서 그의 관련 mRNA 코돈에 대한 특이적인 인식에 의해 단백질로 혼입되는 자연에서 발견되는 20 개의 α-아미노산의 잔기이다.
본원에 사용된 바와 같이, 핵산은, DNA, RNA 및 펩티드 핵산 (PNA) 및 이들의 혼합물을 포함한 이들의 유사체를 포함한다. 핵산은 단일 또는 이중-가닥일 수 있다. 예컨대, 형광 또는 방사성동위원소표지와 같은 검출가능한 표지를 이용하여 임의로 표지되는 프로브 또는 프라이머 언급시, 단일-가닥 분자들이 고려된다. 상기 분자들은 전형적으로는 그들의 표적이 통계적으로 독특하거나 또는 라이브러리를 탐침 또는 프라이밍하기에 낮은 카피수 (전형적으로는 5 미만, 일반적으로는 3 미만) 의 것인 길이의 것이다. 일반적으로, 프로브 또는 프라이머는 관심대상의 유전자에 대해 상보적이거나 또는 상동인, 적어도 14, 16 또는 30 개의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 프로브 및 프라이머는 길이가 10, 20, 30, 50, 100 또는 그 이상인 핵산일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 펩티드는 길이가 2 내지 40 아미노산인 폴리펩티드를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 본원에 제공되는 각종 아미노산 서열에서 나타나는 아미노산들은 그의 공지된 3-문자 또는 1-문자 약어로 식별된다 (표 1). 각종 핵산 단편에서 나타나는 뉴클레오티드는 당업계에서 일상적으로 사용되는 표준 1-문자 표기법으로 기재한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산" 은 1 개의 아미노기 및 1 개의 카르복실산기를 포함하는 유기 화합물이다. 폴리펩티드는 2 개 이상의 아미노산을 포함한다. 본원에서의 목적에 있어서, 아미노산은 20 가지의 천연 발생 아미노산, 비-천연 아미노산 및 아미노산 유사체 (즉, α-탄소가 측쇄를 가진 아미노산) 를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "아미노산 잔기" 는 그의 펩티드 결합에서 폴리펩티드의 화학적 소화 (가수분해) 시 형성되는 아미노산을 지칭한다. 본원에 기재된 아미노산 잔기는 "L" 이성질체 형태인 것으로 추정된다. "D" 이성질체 형태의 잔기는, 그렇게 지정된 것은, 바람직한 관능 특성이 폴리펩티드에 의해 보유되는 한, 임의의 L-아미노산을 대체할 수 있다. NH2 는 폴리펩티드의 아미노 말단에 존재하는 유리된 아미노기를 지칭한다. COOH 는 폴리펩티드의 카르복실 말단에 존재하는 유리된 카르복시기를 지칭한다. J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969), 및 채택된 37 C.F.R..§§ 1.821 내지 1.822 에 기재된 표준 폴리펩티드 명명법을 고수하여, 아미노산 잔기에 대한 약어는 표 1 에 나타낸다:
표 1. 대응표
Figure 112012030178927-pct00001
화학식으로 본원에서 나타낸 모든 아미노산 잔기 서열들은 아미노-말단으로부터 카르복실-말단으로의 통상적인 방향으로 좌측에서 우측으로의 배향을 가짐을 유의해야 한다. 추가로, 어구, "아미노산 잔기" 는 대응표 (표 1) 에 열거된 아미노산 및 변형된 특이한 아미노산, 예컨대 37 C.F.R.§§ 1.821 내지1.822 에서 언급되고, 본원에 참조로써 포함된 것을 포함한다. 더욱이, 아미노산 잔기 서열의 시작부분 또는 말단에서의 대쉬 (dash) 는 하나 이상의 아미노산 잔기의 추가적 서열에, NH2 와 같은 아미노-말단기에 또는 COOH 와 같은 카르복실-말단기에 대한 펩티드 결합을 표시함을 유의해야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, "천연 발생 아미노산" 은 폴리펩티드에 나타나는 20 가지 L-아미노산을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "비-천연 아미노산" 은 천연 아미노산과 유사한 구조를 갖지만, 천연 아미노산의 구조 및 반응성을 모방하도록 구조적으로 변형된 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 비-자연 발생 아미노산에는, 예를 들어, 20 가지 천연 발생 아미노산 이외의 아미노산 또는 아미노산의 유사체가 포함되며, 이에 제한되지 않으나, 아미노산의 D-이소입체이성질체(D-isostereomer)가 포함된다. 예시 비-천연 아미노산은 본원에 기재되어 있고, 당업자에게 공지되어 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 등속 혼합물은 알려진 반응 속도에 기초하여 아미노산의 분자 비율이 조절된 것이다(참고, 예를 들어, Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34:1681).
본원에서 사용된 바와 같이, 변형은 각각 아미노산 및 뉴클레오티드의 제거, 삽입, 및 대체를 포함한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열의 변형을 참조한다. 폴리펩티드의 변형 방법은 재조합 DNA 방법론의 사용과 같이, 당업자에게 통상적인 것이다.
본원에서 사용된 바와 같이, 아미노산의 적절한 보존적 치환(conservative substitution)은 당업자에 공지되어 있으며 결과적으로 발생하는 분자의 생물학적 활성을 변경하지 않아도 일반적으로 생성할 수 있다. 당업자는 일반적으로, 폴리펩티드의 비-본질적인 영역에서 단일 아미노산 대체가 실질적으로 그 생물학적 활성을 변경시키지 않음을 인식한다(참고, 예를 들어, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin/Cummings Pub. co., p.224). 이러한 대체는 하기 표 1A에 제시된 바에 따라 이루어질 수 있다:
표 1A
Figure 112012030178927-pct00002
다른 대체 또한 허용되며 이는 경험적으로 또는 알려진 보존적 치환과 부합하게 결정될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 구축물은 자연에서 발견되지 않는 방식으로 조합 및 병치된 DNA의 분절(segment)을 포함하는, 단일 또는 이중, 선형 또는 환형 DNA 분자이다. DNA 구축물은 인간의 조작 결과로서 존재하며, 조작된 분자의 클론 및 기타 복제물들이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절은 특이화된 속성을 가진 더 큰 DNA 분자의 일부분이다. 예를 들어, 특이화된 폴리펩티드를 인코딩하는 DNA 분절은, 5' 부터 3' 방향으로 판독시 특이화된 폴리펩티드의 아미노산의 서열을 인코딩하는 더 긴 DNA 분자, 예컨대 플라스미드 또는 플라스미드의 단편의 일부분이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 폴리뉴클레오티드는 5' 부터 3' 말단으로 읽는, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 염기의 단일- 또는 이중-가닥 폴리머를 의미한다. 폴리뉴클레오티드에는 RNA 및 DNA 가 포함되고, 이는 천연 공급원으로부터 단리되거나, 시험관 내에서 합성되거나, 또는 천연 및 합성 분자들의 조합으로부터 제조될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 분자의 길이는 뉴클레오티드 ("nt" 로 약기됨) 또는 염기쌍("bp" 로 약기됨)으로 본원에 제시된다. 용어 뉴클레오티드는 문맥이 허용하는 경우, 단일- 및 이중-가닥 분자에 대해 이용된다. 상기 용어를 이중-가닥 분자에 적용하는 경우, 이는 전체 길이를 지칭하고, 용어 염기쌍과 동등한 것으로 이해될 것이다. 당업자는 이중-가닥 폴리뉴클레오티드의 두 가닥이 길이에 있어서 약간 상이할 수 있고, 그의 말단이 차이 날 수 있다는 것을 인식할 것이고; 따라서 이중-가닥 폴리뉴클레오티드 분자 내 모든 뉴클레오티드가 반드시 짝을 이루는 것은 아니다. 상기 짝지워지지 않은 말단은, 일반적으로 길이에 있어 20 뉴클레오티드를 초과하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 두 단백질 또는 핵산간의 "유사성" 은 단백질들의 아미노산 서열 또는 핵산들의 뉴클레오티드 서열간 관련성을 지칭한다. 유사성은 잔기들의 서열 및 그곳에 포함된 잔기들의 동일성 및/또는 상동성 정도에 근거할 수 있다. 단백질 또는 핵산간 유사성 정도의 평가 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 유사성 평가의 한가지 방법에서, 두 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열은 서열간 최대 수준의 동일성을 제공하도록 하는 방식으로 정렬된다. "동일성" 은 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열이 변함없는 정도를 지칭한다. 아미노산 서열의 정렬 및 어느 정도까지의 뉴클레오티드 서열의 정렬은 또한 아미노산 (또는 뉴클레오티드) 에서의 보존적 차이 (conservative difference) 및/또는 빈번한 치환을 고려할 수 있다. 보존적 차이는 관련된 잔기들의 물리화학적 특성을 보존하는 것이다. 정렬은 전체적(서열의 전장에 걸쳐 모든 잔기들을 포함하여 비교하는 서열의 정렬)이거나 또는 국지적(가장 유사한 영역 또는 영역들만을 포함하는 서열들의 일부분의 정렬)일 수 있다.
"동일성" 은 자체로 당해 분야에서 인식된 의미를 갖고, 공지된 기법을 이용하여 계산될 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.편저, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H. G. 편저, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysus Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991). 두 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 사이의 동일성 측정방법이 다수 존재하며, 용어 "동일성" 은 당업자에게 널리 공지되어 있다(Carillo, H. & Lipton, D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)).
본원에 사용된 바와 같이, 상동함 (핵산 및/또는 아미노산 서열과 관련하여) 은 대략 25% 이상의 서열 상동성, 전형적으로는 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 또는 그 이상의 서열 상동성을 의미하고; 필요한 경우, 정확한 백분율이 특정될 수 있다. 본원에서의 목적을 위해, 용어 "상동성" 및 "동일성" 은 달리 표시되지 않는 한, 호환하여 사용된다. 일반적으로, 백분율 상동성 또는 동일성을 결정하기 위해, 서열은 최고 수준의 맷치 (match) 가 수득되도록 정렬된다 (참고문헌은, 예를 들어: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M. 편저 Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W. 편저, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G. 편저, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. 및 Devereux, J. 편저, M Stockton Press, New York, 1991 ; Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48: 1073). 서열 상동성에 의해, 보존성 아미노산의 갯수를 표준 정렬 알고리즘 프로그램으로 결정하고, 각각의 공급자에 의해 확립된 디폴트 갭 페널티(default gap penalty)를 가지고 이용될 수 있다. 실질적으로 상동인 핵산 분자는 관심대상의 핵산의 길이를 따라 전체적으로, 일반적으로는 중간 정도의 엄격성으로 또는 고도의 엄격성으로 혼성화한다. 혼성화 핵산 분자 내 코돈들을 대신해 축퇴성 코돈을 포함하는 핵산 분자가 또한 고려된다.
임의의 두 분자가 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상 "동일" 또는 "상동" 인 뉴클레오티드 서열 또는 아미노산 서열을 갖는지 여부는, "FASTA" 프로그램, 예를 들어, Pearson 등의 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 55:2444 에서와 같은 디폴트 파라미터를 이용하는 공지된 컴퓨터 알고리즘을 이용하여 결정될 수 있다 (기타 프로그램에는 GCG 프로그램 패키지 (Devereux, J., 등, Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F. 등, J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop 편저, Academic Press, San Diego, 1994, 및 Carillo 등 (1988) SIAM J Applied Math 48:1073 가 포함됨). 예를 들어, National Center for Biotechnology Information 데이터베이스의 BLAST 기능이 동일성 결정에 이용될 수 있다. 기타 시판되거나 또는 공지되어 이용가능한 프로그램에는, DNAStar "MegAlign" 프로그램 (Madison, WI) 및 University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) "Gap" 프로그램 (Madison WI) 이 포함된다. 단백질 및/또는 핵산 분자의 백분율 상동성 또는 동일성은 예를 들어 GAP 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, Needleman 등 (1970) J. Mol. Biol. 48:443, 이는 Smith 및 Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482 에서 개정됨) 을 이용하는 서열 정보 비교에 의해 결정될 수 있다. 간략하게, GAP 프로그램에서는, 유사성을 두 서열 중 더 짧은 것의 기호의 총 갯수로 나눈 유사한 정렬된 기호 (즉, 뉴클레오티드 또는 아미노산) 의 갯수로 정의한다. GAP 프로그램에 대한 디폴트 파라미터는 다음을 포함할 수 있다: (1) Schwartz 및 Dayhoff, 편저, ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979) 에 기재된, 단항 비교 매트릭스 (동일함에 대해서는 1 의 값을, 비-동일함에 대해서는 0 의 값을 내포함) 및 Gribskov 등 (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745 의 칭량 비교 매트릭스; (2) 각각의 갭에 대해서는 3.0 의 페널티, 각각의 갭에서의 각 기호에 대해서는 추가적인 0.10 의 페널티; 및 (3) 말단 갭에 대해서는 페널티 없음.
따라서, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "동일성" 또는 "상동성" 은 시험 및 기준 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 사이의 비교를 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 적어도 "90% 동일" 은 폴리펩티드의 기준 핵산 또는 아미노산 서열에 대해 90 내지 99.99 의 백분율 동일성을 지칭한다. 90% 이상의 수준의 동일성은 예시 목적으로 100 개 아미노산의 시험 및 기준 폴리펩티드 길이를 비교함을 가정했음을 표시한다. 시험 폴리펩티드에서 10% (즉, 100 개 중 10 개) 이하의 아미노산이 기준 폴리펩티드의 것과 상이하다. 시험 및 기준 폴리뉴클레오티드 사이에서도 유사한 비교가 가능하다. 그러한 차이는 폴리펩티드의 전장에 걸쳐 무작위로 분포하는 점 돌연변이로서 나타날 수 있거나, 또는 최대 허용되는 범위, 예를 들어 10/100 아미노산 차이 (약 90% 동일성) 까지 길이가 다양한 한 군데 이상의 위치에서 무리를 이룰 수 있다. 차이는 핵산 또는 아미노산 치환, 삽입 또는 결실로 규정된다. 약 85 내지 90% 를 상회하는 동일성 또는 상동성 수준에서는, 그 결과가 프로그램 및 갭 파라미터 셋트와는 독립적이며; 그러한 높은 수준의 동일성은, 종종 소프트웨어에 의지하지 않고 수동적인 정렬에 의해서도 쉽게 평가될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 정렬된 서열은 뉴클레오티드 또는 아미노산 내에 상응하는 위치에 정렬되는 상동성 (유사성 및/또는 동일성) 의 이용을 지칭한다. 전형적으로는, 50% 이상의 동일성으로 연관되어 있는 2 개 이상의 서열이 정렬된다. 서열의 정렬된 셋트란, 상응하는 위치에서 정렬되는 2 개 이상의 서열을 지칭하고, 게놈 DNA 서열과 정렬되는, EST 및 기타 cDNA 와 같은 RNA 로부터 유도된 정렬 서열이 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머" 는 적당한 조건 하 (예를 들어, 4 가지 상이한 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합제, 예컨대 DNA 폴리머라아제, RNA 폴리머라아제 또는 역전사효소의 존재 하), 적당한 완충액 및 적합한 온도 하에서의 템플레이트-지시 DNA 합성의 개시점으로서 작용할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 특정 핵산 분자가 "프로브" 및 "프라이머" 로서 제공될 수 있음이 감안될 것이다. 그러나, 프라이머는 신장을 위한 3' 히드록실기를 갖는다. 프라이머는, 예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR), 역전사효소 (RT)-PCR, RNA PCR, LCR, 멀티플렉스 PCR, 팬핸들 (panhandle) PCR, 캡춰 (capture) PCR, 발현 PCR, 3' 및 5' RACE, 제자리 (in situ) PCR, 라이게이션-매재 PCR 및 기타 증폭 프로토콜을 포함하는 다양한 방법에서 이용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "프라이머 쌍" 은 (예를 들어 PCR 로) 증폭시킬 서열의 5' 말단에 혼성화하는 5' (상류) 프라이머 및 증폭할 서열의 3' 말단에 상보적인 것에 혼성화하는 3' (하류) 프라이머를 포함하는 프라이머들의 셋트를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "특이적으로 혼성화"는, 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자(예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 상보적 염기-짝지움에 의한 어닐링을 지칭한다. 당업자는 특이적 혼성화에 영향을 주는 시험관내 및 생체 내 파라미터들, 예컨대 특정 분자의 길이 및 조성에 친숙하다. 특히 시험관 내 혼성화와 관련된 파라미터에는 추가로, 어닐링 및 세척 온도, 완충액 조성 및 염 농도가 포함된다. 비특이적으로 결합된 핵산 분자에 대한 예시 세척 조건은, 고도의 엄격성에 대해서는 0.1 x SSPE, 0.1% SDS, 65℃, 중간 엄격성에 대해서는 0.2 x SSPE, 0.1% SDS, 50℃ 이다. 동등한 엄격성 조건은 당업계에 공지되어 있다. 당업자는 특별한 적용을 위한 표적 핵산 분자에 대한 핵산 분자의 특이적 혼성화를 달성하기 위한 파라미터들을 쉽게 조정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 서열 언급시, 상보적이라 함은, 뉴클레오티드의 두 서열이, 반대되는 뉴클레오티드 사이에서 전형적으로 25%, 15% 또는 5% 미만의 미스맷치로 혼성화할 수 있음을 의미한다. 필요한 경우, 상보성의 백분율을 구체적으로 특정될 것이다. 전형적으로는, 두 분자는 고도의 엄격성 조건 하에 혼성화할 수 있도록 선택된다.
본원에 사용된 바와 같이, 생성물과 실질적으로 동일함이란, 관심대상의 특성이 충분히 변하지 않아 실질적으로 동등한 생성물이 해당 생성물을 대체하여 사용될 수 있을 정도로 충분하게 미변경되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "실질적으로 동일" 또는 "유사" 는 관련 분야의 당업자에 의해 이해되는 맥락에서 가변적임이 이해될 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대립형질 변이체 또는 대립형질 변이는 동일한 염색체 위치를 차지하는 유전자의 임의의 2 가지 이상의 대안적인 형태를 지칭한다. 대립형질 변이체는 돌연변이를 통해 자연적으로 나타나며, 집단내 표현형 다형질성을 초래할 수 있다. 유전자 돌연변이는 침묵형 (인코딩되는 폴리펩티드에서는 변화가 없음) 일 수 있거나 또는 변경된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 용어 "대립형질 변이체" 는 또한 본원에서 유전자의 대립형질 변이체에 의해 인코딩되는 단백질을 지칭하기 위해 이용된다. 전형적으로는, 유전자의 기준 형태가 야생형 형태 및/또는 집단 유래 폴리펩티드의 우세형 또는 종의 단일 기준 구성원을 인코딩한다. 전형적으로는, 대립형질 변이체는 동일한 종 유래 야생형 및/또는 우세형과 적어도 80%, 90%, 또는 더 큰 아미노산 동일성을 갖는 종간 변이체를 포함하고; 동일성의 정도는 유전자에 좌우되고, 비교가 동종간 또는 이종간인지 여부에 따라 좌우된다. 일반적으로, 이종내 대립형질 변이체들은, 폴리펩티드의 야생형 및/또는 우세형과, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 더 큰 동일성을 포함하여, 적어도 약 80%, 85%, 90% 또는 95% 동일성 또는 더 큰 동일성을 갖는다. 본원에서 대립형질 변이체라는 언급은 일반적으로 동종 구성원간 단백질에서의 변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "대립 형질(allele)" 은, 본원에서 "대립형질 변이체" 와 호환되어 사용되는데, 유전자 또는 그의 일부분의 대안적인 형을 지칭한다. 대립형질은 상동 염색체에서 동일한 구역 또는 위치를 차지한다. 대상체가 유전자의 2 개의 동일 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상체는 해당 유전자 또는 대립형질에 대해 동형접합성이라고 일컫는다. 대상체가 유전자의 2 개의 상이한 대립형질을 갖는 경우, 상기 대상체는 해당 유전자에 대해 이형접합성이라고 일컫는다. 특정 유전자의 대립형질은 단일 뉴클레오티드 또는 여러 뉴클레오티드에서 서로 상이할 수 있고, 뉴클레오티드의 치환, 결실 및 삽입을 포함할 수 있다. 유전자의 대립형질은 또한 돌연변이를 포함하는 유전자의 형태일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 종 변이체는, 마우스 및 인간과 같은 상이한 포유류를 포함하는, 상이한 종간의 폴리펩티드에 있어서의 변이를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 스플라이스 변이체는 한 가지를 초과하는 유형의 mRNA를 제공하는, 게놈 DNA의 일차적인 전사물의 차별적인 프로세싱에 의해 제공되는 변이체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 프로모터는, RNA 폴리머라아제의 결합 및 전사의 개시를 제공하는, DNA 서열을 포함하는 유전자의 일부분을 지칭한다. 프로모터 서열은 통상, 언제나 그런 것은 아니지만, 유전자의 5' 비-코딩 영역에서 발견된다.
본원에 사용된 바와 같이, 단리 또는 정제된 폴리펩티드 또는 단백질 또는 생물학적으로 활성인 그의 일부분은, 해당 단백질이 유래하는 세포 또는 조직으로부터의 세포 물질 또는 기타 오염성 단백질로부터 실질적으로 유리되어 있거나, 또는 화학적으로 합성된 경우 화학적 전구체 또는 기타 화학물로부터 실질적으로 유리된 것이다. 제제들은, 그들이 박층 크로마토그래피 (TLC), 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC) 와 같은, 순도 평가를 위해 당업자가 이용하는 표준 분석 방법으로 측정되는 쉽게 검출가능한 불순물로부터 유리되어 있거나, 또는 추가 정제가 해당 물질의 효소 및 생물학적 활성과 같은 물리적 및 화학적 특성을 눈에띄게 변경하지 않을 정도로 충분히 순수하다면, 실질적으로 유리되어 있다고 결정될 수 있다. 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물을 제조하기 위한 화합물의 정제 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 그러나, 실질적으로 화학적으로 순수한 화합물은 입체이성질체의 혼합물일 수 있다. 그런 경우, 추가 정제는 화합물의 특이적 활성을 증대시킬 수 있다.
용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리되었다는 것은, 그것이 단리되거나 또는 재조합적으로 제조된 세포의 세포 구성원들로부터 분리된 단백질들의 제제를 포함한다. 한 구현예에서, 용어 세포성 물질로부터 실질적으로 유리되었다는 것은, 약 30% (건중량) 미만의 비-효소 단백질 (본원에서는 오염 단백질로도 언급함), 일반적으로 약 20% 미만의 비-효소 단백질 또는 10% 미만의 비-효소 단백질 또는 약 5% 미만의 비-효소 단백질을 가진 효소 단백질의 제제를 포함한다. 효소 단백질이 재조합적으로 제조된 경우, 이는 또한 배양 배지로부터 실질적으로 유리되어 있는데, 즉 배양 배지는 약 20%, 10% 또는 5% 미만의 부피의 효소 단백질 제제를 나타낸다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 화학물 전구체 또는 기타 화학물이 실질적으로 없음은, 단백질의 합성에 수반되는 화학물 전구체 또는 기타 화학물로부터 단백질이 분리된 효소의 제제를 포함한다. 상기 용어는 약 30% (건중량) 20%, 10%, 5% 미만 또는 그 미만의 화학물 전구체 또는 비-효소 화학물 또는 성분들을 가진 효소 단백질의 제제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어 합성 핵산 분자 또는 합성 유전자 또는 합성 펩티드에서 언급되는 합성은, 재조합 방법 및/또는 화학 합성 방법으로 제조된 핵산 분자 또는 폴리펩티드 분자를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 재조합 DNA 방법을 이용한 재조합적 수단에 의한 제조는, 클로닝된 DNA 에 의해 인코딩되는 단백질 발현을 위해 분자생물학의 널리 공지된 방법의 이용을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터 (또는 플라스미드) 는 이종성 핵산을 그의 발현 또는 복제를 위해 세포로 도입하기 위해 사용되는 별개의 요소를 지칭한다. 벡터는 전형적으로는 에피좀으로 남아 있으나, 유전자 또는 그의 일부의 게놈 염색체로의 통합을 수행하기 위해 설계될 수 있다. 효모 인공 염색체 및 포유류 인공 염색체와 같은 인공 염색체인 벡터도 또한 고려된다. 상기 비히클의 선택 및 이용은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 발현 벡터는 해당 DNA 단편의 발현을 수행할 수 있는 프로모터 영역과 같은 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 DNA 를 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 추가적인 분절은 프로모터 및 종결 서열을 포함할 수 있고, 임의로는 하나 이상의 복제 기점, 하나 이상의 선별가능한 마커, 인핸서, 폴리아데닐화 시그널 등을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA 로부터 유도되거나, 또는 이들 두가지 요소를 포함할 수도 있다. 따라서, 발현 벡터는 적당한 숙주 세포에 도입시 클로닝된 DNA 의 발현을 제공하는, 플라스미드, 파지, 재조합 바이러스 또는 기타 벡터와 같은 재조합 DNA 또는 RNA 구축물을 지칭한다. 적당한 발현 벡터는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 진핵 세포 및/또는 원핵 세포에서 복제가능한 것들 및 에피좀으로 남아있는 것들 또는 숙주 세포 게놈으로 통합하는 것들을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 벡터는 또한 "바이러스 벡터" 또는 "바이러스성 벡터"를 포함한다. 바이러스성 벡터는 외인성 유전자를 세포에 (비히클로서 또는 셔틀로서) 전달하기 위해 외인성 유전자에 작동가능하게 연결되어 있는 조작된 바이러스이다.
본원에 사용된 바와 같이, DNA 분절 언급시, 작동가능하게 또는 작동적으로 연결됨은 분절들이 그의 의도하는 목적, 예를 들어 프로모터에서의 전사 개시 및 종결자까지 코딩 분절을 통한 진행을 위하여 함께 기능하도록 배열되어 있음을 의미한다.
본원에서 사용된 바와 같이 용어 평가는, 샘플에 존재하는, 효소 또는 프로테아제 같은, 또는 이들의 도메인 같은, 단백질의 활성에 관한 정확한 값을 얻고, 또한 지수, 비율, 백분율, 시각자료 또는 활성의 정도를 나타낼 수 있는 다른 값을 얻는다는 뜻의 양적 및 질적 측정을 포함하는 경향이 있다. 평가는 직접 또는 간접적으로 이루어질 수 있으며 단백질 가수분해 산물과 같이, 실제로 검출된 화학종은 당연히 반응의 최종산물일 필요는 없으나, 예를 들어 그 도는 추가적인 물질의 유도체일 수는 있다. 예를 들어, 평가는 SDS-PAGE와 같은 단백질의 분열 산물 및 단백질을 쿠마시블루(Coomasie blue)로 염색하여 검출할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 생물학적 활성은, 생체내 화합물의 활성 또는 화합물, 조성물 또는 기타 혼합물의 생체내 투여시 결과로서 수득되는 생리학적 응답성을 지칭한다. 따라서, 생물학적 활성은 상기 화합물, 조성물 및 혼합물의 치료적 유효성 및 약제학적 활성을 포함한다. 생물학적 활성은 상기 활성을 시험 또는 이용하기 위해 고안된 시험관내 시스템에서 관찰될 수 있다. 따라서, 본원에서의 목적을 위해, 프로테아제의 생물학적 활성은 폴리펩티드가 가수분해되는 그의 촉매 활성이다.
본원에 사용된, 핵산의 2 개 서열 언급시, 동등함이란, 의문대상의 두 서열이 동일한 아미노산 서열 또는 동등한 단백질을 인코딩함을 의미한다. 동등함이 두 단백질 또는 펩티드 언급시 이용되는 경우, 이는 상기 두 단백질 또는 펩티드가 해당 단백질 또는 펩티드의 활성 또는 기능을 실질적으로 변경하지 않는 유일한 아미노산 치환만을 가지는 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 가짐을 의미한다. 동등함이 특성과 관련되는 경우, 해당 특성은 동일한 정도로 존재할 필요는 없으나 (예를 들어 상기 두 펩티드는 동일한 타입의 효소 활성의 상이한 비율을 나타낼 수 있음), 활성은 일반적으로 실질적으로 동일하다.
본원에 사용된 바와 같이, "변동하다" 및 "변동" 또는 "변경" 은 단백질과 같은 분자의 활성을 변화시키는 것을 지칭한다. 예시 활성에는, 이에 제한되지 않으나, 생물학적 활성, 예컨대 신호 전달이 포함된다. 변동은, 활성의 증가 (즉, 상향조절 또는 작용제 활성), 활성 감소 (즉, 하향조절 또는 저해) 또는 활성에 있어서의 임의의 기타 변경 (예컨대 주기, 빈도, 기간, 동역학 또는 기타 파라미터에 있어서의 변화) 을 포함할 수 있다. 변동은 문맥에 좌우될 수 있고, 전형적으로는 변동은 정해져 있는 상태, 예를 들어 야생형 단백질, 구성 상태에 있는 단백질 또는 정해진 세포 유형 또는 조건에서 발현되는 단백질과 비교된다.
본원에 사용된 바와 같이, 조성물은 임의의 혼합물을 지칭한다. 이는 용액, 현탁액, 액체, 분말, 페이스트, 수성, 비수성 또는 임의의 이들의 조합일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 조합물은 2 가지 이상의 항목들 사이에서의 임의의 연합을 지칭한다. 조합물은 2 가지 이상의 분리된 항목들, 예컨대 2 가지 조성물 또는 2 가지 수집물일 수 있고, 이들의 혼합물, 예컨대 2 가지 이상의 항목들의 단독 혼합물, 또는 그의 임의의 변형일 수 있다. 조합물의 요소들은 일반적으로 기능적으로 연합되어 있거나 또는 관련되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 키트는 선택적으로는 기타 요소들, 예컨대 추가적인 시약 및 그의 조합물 또는 요소들의 사용설명서를 포함하는 포장된 조합물이다.
본원에 사용된 바와 같이, "질환 또는 장애"는, 이에 제한되지 않으나, 감염, 후천적 상태, 유전적 상태를 포함하는 원인 또는 상태에 기인하며, 식별가능한 징후를 특징으로 하는 병리학적 상태를 지칭한다. 본원에서의 관심대상의 질환 또는 장애는 면역 글로불린에 의해 치료가능한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 질환 또는 상태에 처한 대상체를 "치료"한다는 것은, 대상체의 징후를 부분적으로 또는 전체적으로 완화시키거나, 또는 치료 후 정체되도록 한다는 것을 의미한다. 따라서, 치료는 예방, 요법 및/또는 치유를 포함한다. 예방은 잠재적인 질환의 예방 및/또는 질환의 징후 악화 또는 질환의 진행의 예방을 지칭한다. 치료는 또한 본원에 제공되는 면역 글로불린 제제 및 조성물의 임의의 약제학적 용도를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 약제학적 유효한 제(제제, agent)는, 이에 제한되지 않으나, 예를 들어 마취제, 혈관 수축제, 분산제, 저분자 약물 및 치료용 단백질을 포함하는 통상적인 치료용 약물을 포함하는 임의의 치료제 또는 생물학적 활성제를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료는 상태, 장애 또는 질환 또는 기타 적응증이 개선되거나 또는 그렇지 않으면 이득이 되도록 변경되는 임의의 방식을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료적 효과(유효성)는 질환 또는 상태의 징후를 변경, 일반적으로는 개선 또는 완화하거나 또는 질환 또는 상태를 치유하는, 대상체의 치료의 결과인 효과를 의미한다. 치료적 유효량은 대상체에 대한 투여 후 치료적 효과를 결과로서 제공하는 조성물, 분자 또는 화합물의 양을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체" 는 인간과 같은 포유류를 포함하는 동물을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 환자는 인간 대상체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 치료, 예컨대 약제학적 조성물 또는 기타 치료제의 투여에 의한 특정 질환 또는 상태의 징후의 개선은, 해당 조성물 또는 치료제의 투여에 의해 부여되거나 또는 그에 연합될 수 있는, 영구적이든 임시적이든, 또는 지속성이든 일시적인 것이든, 징후의 임의의 경감을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 방지 또는 예방은 질환 또는 상태의 발생 위험이 줄어들게 하는 방법을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "치료적 유효량" 또는 "치료적으로 유효한 투여량" 은 치료적 유효성을 제공하기에 최소한으로 충분한 화합물을 포함하는 제제, 화합물, 재료 또는 조성물의 양을 지칭한다. 따라서, 상기 양은 질환 또는 장애의 징후를 방지, 치유, 개선, 정지 또는 부분적으로 정지시키기 위해 필요한 양이다.
본원에 사용된 바와 같이, 단위 제형(unit dosage form)은, 당업계에 공지된 바와 같이 개별적으로 포장되어 있는, 인간 및 동물 대상체에 적합한 물리적으로 분리되어 있는 유닛을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 단일 투여량 제형은 직접 투여용 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, "제조품"은 제조 및 판매되는 제품이다. 본 출원을 통틀어 사용되는 바와 같이, 상기 용어는 포장품에 포함되는 IG 및 히알루로니다아제 조성물을 포함하는 것을 의도로 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 액체는 유동할 수 있는 임의의 조성물을 지칭한다. 따라서, 액체는 반고체, 페이스트, 용액, 수성 혼합물, 겔, 로션, 크림 및 기타 상기 조성물의 형태인 조성물을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "키트"는 본원에 제공되는 조성물 및, 이에 제한되지 않으나, 생물학적 활성 또는 특성의 활성화, 투여, 진단 및 평가를 포함하는 목적을 위한 또다른 항목을 포함하는 조합물을 지칭한다. 키트는 임의로는 사용설명서를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 세포 추출물 또는 세포용해물은 세포용해 또는 파괴된 세포로부터 제조된 제제를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 동물은 임의의 동물, 예컨대 이에 제한되지 않지만, 인간, 고릴라 및 원숭이를 포함하는 영장류; 마우스 및 랫트와 같은 설치류; 닭과 같은 가금류; 염소, 소, 사슴, 양과 같은 반추동물; 돼지와 같은 양류 등을 포함한다. 비-인간 동물은 인간을 고려 동물에서 배제한다. 본원에서 제공하는 효소는 임의의 공급원, 동물, 식물, 원핵생물 및 균류 유래일 수 있다. 대부분의 효소는 포유류 기원을 포함하는 동물 기원의 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 대조군은, 시험 파라미터로 처리하지 않거나, 또는 혈장 시료인 경우, 관심대상의 상태에 영향을 받지 않은 정상 자원자 유래의 것임을 제외하고는, 시험 시료와 실질적으로 동일한 시료를 지칭한다. 대조군은 또한 내부 대조군일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태의 대표 단수는 문맥상 달리 명시되지 않으면 복수의 대상체까지도 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포외 도메인"을 포함하는 화합물을 언급하는 것은 하나 이상의 복수의 세포외 도메인들을 가진 화합물들도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 "약" 특정값 또는 범위로서 표현될 수 있다. 약은 또한 정확한 양까지도 포함한다. 따라서, "약 5 개 염기"는 "약 5 개 염기" 및 또한 "5 개 염기"까지도 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "임의" 또는 "임의로"는 후속 기재되는 사건 또는 상황이 일어날 수도 있고 일어나지 않을 수도 있으며, 해당 기재는 상기 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 그것이 일어나지 않는 경우도 포함하는 것을 의미한다. 예를 들어, 임의 치환기는 해당 기가 비치환이거나 또는 치환되어 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 임의의 보호기, 아미노산 및 기타 화합물에 대한 약어는, 달리 표시되지 않는 한, 그의 범용되는 용례, 인식되는 약어 또는 IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (참고, (1972) Biochem. 11:1726) 에 따른 것이다.
B. 면역 글로불린( IG ) 및 히알루로니다아제의 안정한 복합제제
본원에서 제공된 것은 면역 글로불린(IG) 및 히알루로니다아제를 함유하는 복합제제이다. 복합제제는 실온(예를 들어, 28 내지 32 ℃)에서 적어도 6개월간 액상으로 길어진 저장 이후에도 IG 분자 사이즈 분포 및 히알루로니다아제 활성을 유지한다. 일반적으로, 복합제제는 표준 냉장온도에서 적어도 1 내지 2년간 IG 분자 사이즈 분포 및 히알루로니다아제 활성을 또한 유지한다. 복합제제는 IG-치료가능한 질환 및 상태의 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본원에 제공된 안정한 복합제제는 피하내 투여를 위해 제제화된다.
1. 면역 글로불린 치료법
면역 글로불린은 면역 질환을 갖는 개인을 치료하기 위해 우선적으로 처방되는 치료제이다. 면역글로불린 결핍 질환은 혈청 면역글로불린의 상실 또는 그 정도 감소로 인하여 특히 부비강폐 경로(sinopulmonary tract)의 세균성 감염에 대한 감수성이 증가하는 것으로 특징지어지는 면역결핍증의 부분집합이다. 면역결핍증은 일차적(유전적)이거나 이차적(후천적)이다. 일차성 면역결핍증은 보기 드물고 이는 X-연관 무감마글로불린혈증, 면역글로불린 중쇄 결실, 선별적인 면역글로불린 G (IgG) 아형 결핍, 공통 가변성 면역결핍, 또는 X-연관 고면역글로불린 M 증후군을 포함한다. 감소된 면역글로불린 수준은 또한 T 및 B 세포 결함에 의한 복합 면역결핍증, 예컨대 이에 제한되지 않으나, 중증 합병증 면역결핍 장애 또는 비스코트 올드리치 증후군 (Wiskott Aldrich Syndrome) (IUIS Scientific Committee, 1999) 을 가진 개인에서 발견된다. 더욱 보편적인 것은, 영양실조, 바이러스, 노화 및 백혈병으로부터 초래된, 그러나 이에 제한되지 않는, 이차성 면역결핍이다. 이러한 질병을 가진 개인은 감염의 심각성을 예방 또는 경감시키기 위하여 면역글로불린 제품을 이용한 대상요법(replacement therapy)을 필요로 한다.
면역글로불린 대상요법은 1952년에 최초로 사용되었으며 근육내 및 피하내 투여되었다. 그러나 질병을 효과적으로 치료하기 위하여, 보다 큰 양의 IG가 필수적인바, 이로써 보다 작은 농도(50-100 mg/mL) IG의 정맥내 투여용 제품이 개발되었다. 1981년부터, 미국에서는 정맥내 투여되는 다수의 면역글로불린 제품이 이용되었다. 일반적으로, IG 제조품은 면역글로불린 G(IgG, IgM, IgA 또는 이들의 조합)를 함유한 살균, 정제된 제품이다. 전형적으로, IG 제품은 95-99 % IgG 및 단지 소량의 면역글로불린 A(IgA), M(IgM), D(IgD) 및 E(IgE)를 함유한다. IV 투여용 IG 제조품은 일반적으로 3 내지 12% IG로 제제화한다.
보다 최근에는, 면역글로불린 제조품은 피하내 투여용으로 개발되었으며(Gardulf et al. (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 6: 434-42; Gardulf et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26: 177-85; Ochs et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26:265-73), 적어도 하나의 제품, Vivaglobin®이, 피하내 투여용으로 미국에서 허가를 받았다. 면역글로불린의 투여를 위한 피하내 경로는 IV 경로와 비교하여 개선된 내약성 및 홈케어 치료의 가능성과 같은 몇가지 장점을 가진다.
피하내 투여된 면역글로불린의 생체이용률은 일반적으로 정맥내 투여된 경우보다 적다. IV 투여 이후, 면역글로불린은 즉시 혈액 내에서 이용가능하며, 3 내지 5일에 걸쳐 서서히 혈관-외 구역과 평형을 이루게 된다(Schiff et al. (1986) J. Clin. Immunol. 6:256-64). 피하 투여되는 면역글로불린은 피하 공간으로부터 혈액으로 느리게 흡수되며, 동시에 혈관 외 구역과 평형을 이루며; 높은 IV 스파이크가 없다. 생체이용률은 집중적으로 연구된 바 없지만, ZLB-Behring 제제 (즉, Vivaglobinx®)의 최근 시도가 있었고, 오직 67%의 면역글로불린만이 흡수된다는 것은 곡선하면적(AUC)을 측정함으로써 결정되었고, 권장 투여량은 IV 투여량의 137% 였다 (Ochs 등 (2006) J Clin. Immunol., 26:265-73). 2 가지 상이한 경로 및 투여 빈도에 대한 AUC 비교의 기술적인 어려움에도 불구하고, 토끼에서 피내 투여된 면역글로불린의 연구는 피하 경로를 통해서는 생체이용률이 저감된다는 것을 시사한다. 이는, 모세관 벽을 통해 쉽게 확산할 수 없고, 림프관을 통해 흡수되어야만 하는 대형 단백질 분자의 흡수 양태에 기인한다 (Supersaxo 등 (1990) Pharm. Res., 7: 167-9).
모든 면역글로불린 제조품은 5 내지 12 % IG로 제제화되는 IVIG 제조품과 비교하여, 현재 16 % IG로 제제화되어 피하내 투여용으로 사용된다. 피하내 제조품에 있어 상대적으로 IV 제조품보다 높은 IG의 농도는 주입 용량이 보다 적어지도록 허용하며; 이러한 제조품은 정맥내로 주입될 수 없다. 면역글로불린 대상요법의 이러한 피하내 방법은 적은 전신성 부작용(systemic adverse reaction)의 위험과 매월 IV를 주입하는 것에 비하여 높은 기저(trough) 혈청 IgG 농도를 유도하기 때문에 효과적이고, 안전하며 또한, 환자들에게 높이 평가되는 것으로 여겨지고 있다(Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs., 21:917-27; Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol., 92:200-4; Gardulf et al. (1991) Lancet, 338:162-6).
IG의 피하내 투여와 연관된 생체이용률의 감소뿐만 아니라, SC 및 IV 간의 또 다른 차이는 각각의 위치에서 피하내에는 단지 소량이 주입될 수 있어, 반드시 복수 위치에서 매주 또는 2주마다(격주로) 기반으로 사용하여야 한다는 것이다. 그러나, 일반적으로, 성인은 1회의 피하내 위치에서 단지 20-40 mL을, 어린이의 경우 위치당 더 낮은 용량으로 주입할 수 있다. 현재, 허용되는 IG 투여 행위는 매 3 내지 4주마다 정맥내 300-600 mg/kg 또는 피하내 100-200 mg/kg/wk이다(Berger (2008) Immunol. Allergy Clin. North Am. 28(2):413-438). 따라서, 피하 내로 매주 IG는 투여는 15g까지 된다. 이는 적어도 매주 세 위치에서의 16-20% IG 제조품의 투여가 필요함을 의미한다. 비록 매주 또는 격주 투여가 매월 IV 주입보다 더 높은 기저 수준을 유지한다는 장점을 추가하였지만, 복수의 바늘 주입의 요구는 넣어야 하여 많은 환자들을 제지하였다.
그럼에도 불구하고, 면역글로불린 대상요법의 피하내 방법은 점점 보편적인 IVIG 치료법의 대체수단이 되고 있다. IVIG 주입에 심각한 반응을 갖는 환자는 흔히 피하내 투여된 IG를 견딘다. 피하내 투여는 전신 부작용의 낮은 위험을 갖고 병원에서 또는 집에서 투여가능하기에, 효과적이고, 안전하며 또한 환자들에게 높이 평가되는 것으로 여겨진다(Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs. 21: 917-27; Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 92: 200-4; Gardulf et al. (1991) Lancet 338: 162-6).
2. 면역 글로불린 및 히알루로니다아제 제제의 피하내 투여
히알루로니다아제 투여와 조합 시, 피하내 투여된 IG의 생체이용률은 증가하였고, 이는 IVIG 치료와 유사한 투여량 및 투여횟수로 면역글로불린의 피하내 투여를 허용하였다(참고, 예를 들어, 미국출원 번호 제 2010-0074885 호 및 PCT 번호 제 WO 2009-117085 호, 본원에서 각각 포함하여 참조). 젤과 같은 물질인 히알루론산으로 채워진 콜라겐 네트워크인, 피하내(SC) 공간은 조직을 통과하는 유체 흐름의 저항의 큰 원인이 된다. 히알루로니다아제는, 인체에 걸쳐 피부나 눈과 같은 세포외 매트릭스 및 조직에서 "젤"과 같은 물질로 공간을 채우고 있는 히알루론산을 분해하는 자연적으로 발생하는 효소의 패밀리이다. 히알루로니다아제는 히알루론산에서 N-아세틸글루코사민 부분의 C1 및 글루쿠로닉 부분의 C4 사이의 글루코사미니딕 결합을 깨뜨려 작동한다. 이는 일시적으로 세포 시멘트질(cellular cement)의 점도를 감소시키며 주입된 유체의 확산을 증가시켜, 이들의 흡수를 가능하게 한다. 이후, 히알루론산은 24시간 이내로 자연적으로 재생성된다. 이에 따라, 히알루로니다아제를 함유하는 복합제제의 생체이용률, 약동학 및/또는 약역학적 성질은 개선된다. 동물 실험에 기초하여, 증가된 유체 확산은 피하내 경로를 통하여 IV-유사한 흐름 속도인 시간당 1L까지의 투여를 허용한다.
히알루로니다아제의 존재 하에서, 피하내 투여된 IG의 생체이용률은, 전형적으로 IVIG 치료의 IG 생체이용률의 90% 이상으로 증가한다. 더욱이, 가용성 히알루로니다아제와의 병용-투여는 단일 피하 부위에서 큰 부피의 주입을 가능케 한다. 예를 들어, 600 ml 또는 그 이상까지의 부피의 IG 가 단일 시팅 (single sitting) 에서의 단일 부위에 투여될 수 있고, 예를 들어 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500, ml, 600 ml 또는 그 이상이 단일 투여로 단일 부위에 투여될 수 있다. 예를 들어, 전형적으로는 단지 IVIG 만을 위해 사용되는, 약 5 내지 12%, 예를 들어 10% 단백질로 제제화된 IG 제제는, 매월 1 회 IVIG 투여량과 동등한 투여량, 예를 들어 약 또는 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg 또는 그 이상으로 가용성 히알루로니다아제와 함께 피하로 병용-투여될 수 있다. 보다 높은 단백질의 농도를 가진 IG 제제, 예를 들어, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 % 또는 그 이상과 같이 12 내지 25 %의 IG는 또한 히알루로니다아제의 존재하에서 피하내 투여될 수 있다. 상기 투여량은 단일 투여량으로서 투여될 수 있거나, 또는 매일 또는 매주, 예컨대 1 주 1 회 또는 매 2, 3 또는 4 주마다, 또는 이들의 조합으로 제공되는 다중 투여량으로 나뉘어질 수 있다. 따라서, 히알루로니다아제의 존재하에서 피하내 투여되었을 때, IG는 특정한 징후에 대하여 효과적인 IVIG 투약량으로 매월 투여될 수 있다. 나아가, 히알루로니다아제가 피부의 흐름 채널을 개방하도록 작동하기 때문에, 이는 주입 속도를 가속화할 수 있다. 이러한 이유로, 히알루로니다아제와 함께 투여한 IG 피하내 투여는 주입 속도를 증가시켜 IG 치료법의 전달 시간을 감소시킨다.
가용성 히알루로니다아제의 존재 하에 IG 를 피하 투여함으로써, IG 의 피하 투여와 연관된 한가지 또는 모든 고려사항 및 문제점들이 다루어졌다. 따라서, 히알루로니다아제의 분산 특성으로 인해, 가용성 히알루로니다아제의 존재 하의 IG 의 피하 투여는, IVIG 생체이용률을 유지하면서도, 매월 1 회 IVIG 빈도로 IVIG 투여량의 투여를 허용한다.
3. 안정한 복합제제
피하내 투여가능한 면역 글로불린 제제가 홈-케어 치료에 장점을 가지면서부터, IG 및 히알루로니다아제의 안정한, 바로 사용 가능한 제제를 꾀하게 되었다. 치료에 사용되는 단백질은 일반적으로 낮은 pH, 온도의 변동, 다양한 버퍼 구성물질 및 이온강도, 그리고, 대체로, 마지막 준비과정에서는 높은 단백질 농도를 포함하는, 처리 및 저장과정에서의 다양한 조건에 놓이게 된다. 효과적이려면, 그러나, 복합제제는 IG 및 히알루로니다아제의 충분한 활성을 유지해야 한다. 이에 따라, IG 및 히알루로니다아제의 복합제제는 반드시 확장된 시간동안 악화 없이 수성 용액으로 저장되기에 안정한 용액으로 제공되어야 한다. 이러한 이유로, 본원에서 제공된 것이 IG 및 히알루로니다아제의 안정한 액체 복합제제이다. 복합제제는 직접적인 주입, 즉 사용전에 희석되지 않고 사용될 수 있는 투여량으로 제공되는 것이다.
본원에서 rHuPH20로 명명된 히알루로니다아제를 투여 전에 조제된 IG로 첨가한 복합제제 제품이 실온에서 안정하지 않음이 발견되었다. 염의 첨가는 특히, 제제 내의 히알루로니다아제의 활성을 유지함으로써 제제의 안정성을 개선한다. 이에 따라, 효과적인 양의 IG 및 히아룰로니다아제에 추가적으로, 본원에서 제공된 복합제제는 또한 적어도 50 mM의 염화알칼리금속염, 예를 들어, NaCl 또는 KCl을 함유한다. 전형적으로, 안정한 복합제제는 또한 안정화제로써 예를 들어 글리신과 같은 아미노산을 함유하고 그리고 약 4 내지 약 5의 pH로 제공된다. 일반적으로, 복합제제화된 제품 내에서 IG에 대한 히알루로니다아제의 비율은 동일한 제품(IG 및 히알루로니다아제)과 동일한 양의 IG가 별개로 피하투여될 때, 예를 들면, 리딩엣지(leading edge) 투여시의 비율보다 더 높다.
일반적으로, 안정한 복합제제는 액체 제제이다. 액상에서 직접적으로 복합제제를 저장하는 것은 액상에서의 저장 안정성, 재구성(reconstitution) 없는 투여, 그리고 제제를 미리 채워져 바로 사용 가능한 주사기 또는 복수투여량 제제로 공급할 수 있는 능력의 편의에 있어 유리하다. 따라서, 액체 복합제제는, 제제를 정확하게 무균으로 재구성하지 않고 또한 대상체에 제제를 투여하기 전에 용액이 투명해질 때까지 일정 시간 동안의 대기 없이, 대상체로의 피하내 투여에 있어 IG 및 히알루로니다아제의 바로 사용 가능한 제제를 제공한다. 이는 헬스케어 전문가에게 있어 대상체에 제제를 투여하는 과정을 단순하게 한다. 추가적으로, 액체 제제를 제조하는 모든 단계가 수성 용액에서 동결건조 및 냉동-건조와 같은 건조과정 없이 수행되기 때문에, 액체 제제를 제조하는 공정이 동결건조된 버전에 비하여 단순화되고 더욱 효율적으로 된다. 이에 따라, 비용 효율도 더욱 높다. 상기 안정한 복합제제는 용기 또는 주사기 내의 액체 제제로 제공될 수 있다. 이러한 복합제제는 인간 또는 다른 포유류에게 약으로써 의사나 환자의 추가적인 재구성 없이 간편하게 제조될 수 있다.
추가적으로, 저장 동안의 높은 안정성으로 인하여, 복합제제는 길어지는 저장 동안 단백질의 응집 및/또는 단편(fragment)로 인한 IG 생체이용률의 부작용 없이 예를 들어 10% 내지 20%와 같은, 약 10% 내지 22% IG의 높은 단백질 농도를 함유할 수 있다. 이러한 안정성은 IG 복합제제의 효능을 보장할 뿐만 아니라, 대상체에게 부작용을 일으킬 수 있는 위험도 감소시킨다. 이에 따라, 본원에서 제공된 안정한 복합제제는 IG 자가-연합 및 응집을 최소화하는 동안 히알루로니다아제 효소 활성 및 IG 활성을 유지한다. 일반적으로, 활성은 32℃까지의 온도, 예를 들어 약 0℃ 내지 32℃에서, 일반적으로 약 28℃ 내지 32℃에서 유지된다. 복합제제의 안정성은 길어진 시간, 예를 들어, 일단위, 주단위, 월단위, 년단위로 또는 그 이상에 걸쳐 유지된다. 상기 복합제제는 적어도 6개월 이상의 길어진 기간의 저장 동안에 액상에서 안정하다는 장점을 가진다. 하나의 예에서, 안정한 복합제제는 액상에서 적어도 1년 또는 그 이상, 예를 들어, 1년, 2년과 같은, 1년 내지 2년 동안 표준 냉장 온도(대략 4±2℃, 또는 약 2 내지 8℃, 또는, 보다 일반적으로는, 약 0 내지 10℃의 범위)에서 안정하다. 또 다른 예에서, 복합제제는 실온(18 내지 32°C의 범위, 예를 들어, 28℃ 내지 32℃)에서 적어도 6개월 저장하는 동안 액상으로 안정하다. 예를 들어, 상기 안정한 복합제제는 실온에서 저장되었을 때 일반적으로 적어도 약 6개월 내지 18개월, 예를 들어 6개월, 12개월, 18개월 또는 그 이상의 저장수명을 가진다.
이하의 문단은 본원에서 제공된 제제에 관하여, 제제 내의 면역글로불린 및 히알루로니다아제의 예시, 이들의 제조방법, 및 복합제제를 사용한 IG-치료가능한 질환 및 상태를 치료하는 방법을 기재하였다.
C. 면역 글로불린 및 면역 글로불린의 제조
본원에서 제공된 것은 히알루로니다아제와 안정한 조성물에서 제제화될 수 있는 면역글로불린(IG, 또는 이뮤노글로불린, 감마글로불린 또는 IgG로도 언급)이다. 상기 안정한 복합제제는 IG-치료가능한 질환 및 상태를 치료하는 용도로 사용될 수 있다.
면역글로불린은 고등동물의 체액성 면역계에서 생성되어 혈청에서 발견되는 감마 글로불린 단백질이다. IG는 보체의 활성을 변화시고, 자동항체 생성을 억제하며, 대식세포 및 B 림프구 Fc 수용체를 포화시키거나 막고 그리고 사이토카인, 케모카인 및 메탈로프로티나아제(metalloproteinase)와 같은 염증성 매개체의 생성을 억제하여 면역체계를 강화한다. IG는 항체의 다섯가지 클래스, 또는 아이소타입(IgG, IgA, IgM, IgD 및 IgE) 및 다양한 서브클래스로 구성되며, 각각은 다양한 특성을 가진다. IgG는 혈액에서 발견되는 IG 중에서 가장 우세하며 2차 면역 반응에서 중요하고 간염에 대하여 조직을 보호한다. 표 2는 혈청에서 발견되는 면역글로불린의 전형적인 양을 보여주며, 다만 치료를 위한 IG의 제조는 특정 면역글로불린 단수 또는 복수의 클래스의 비율을 달리하기 위하여 정제과정을 거칠 수는 있다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 또는 단백질 H 세파로스 크로마토그래피는 면역글로불린 혼합물의 IgG, 또는 IgG 아형을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다(참고, 예를 들어, Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Harlow and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; 미국 특허번호 제 5,180,810호).
표 2. 혈청 면역글로불린
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1. 제조 및 정제
본원에서 제공된 면역글로불린 제조는 임의의 적당한 출발물질로부터 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린은 인간 또는 동물의 혈액, 예를 들어, 인간 기부 혈청, 또는 다른 수단으로부터 생산된, 예를 들어, 재조합 DNA 기술 또는 세포융합기술로부터 분리될 수 있다. 이에 따라, 면역글로불린 제조는 단일클론 또는 재조합 면역글로불린을 포함할 수 있다. 예를 들어, 면역 글로불린은 조직, 림프구 융합세포 배양, 혈장 또는 혈청, 또는 임의의 적당한 과정, 예를 들어, 침전(콘 알코올 분획 또는 폴리에틸렌 글리콜 분획); 크로마토그래피법(이온교환크로마토그래피, 친화성크로마토그래피, 면역친화성크로마토그래피); 원심분리; 또는 전기영동 제조와 같은 과정을 통한 재조합 세포 배양으로 획득할 수 있다(참고, 예를 들어, Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-75; Oncley et al. (1949) J. Am. Chem. Soc., 71:541-50; Barandern et al. (1962) Vox Sang., 7:157-74; Koblet et al. (1967) Vox Sang., 13:93-102; 미국 특허번호 제 5,122,373 호 및 제 5,177,194 호). 전형적으로, 면역글로불린은 당업자에게 공지된 알코올 분획법 및/또는 이온 교환 및 친화성 크로마토그래피로 생산된 감마 글로불린-함유 산물로부터 제조된다.
제조 단계는 면역글로불린의 특정 아이소타입 또는 아형을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들어, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 H 세파로스 크로마토그래피는 면역글로불린 혼합물의 IgG, 또는 특정 IgG 아형을 증가시키기 위하여 사용될 수 있다. (일반적 참고 Harlow and Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1999); Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); 미국 특허번호 제 5,180,810 호).
a. 콘- 온클리 방법
혈장으로부터 면역 글로불린을 정제하는 종래기술 방법은, 최초에 콘이 실시하고 온클리가 변형한, 영하의 온도에서 주어진 알코올 농도에서 등전점에 근거하여 단백질 그룹을 공침시키는, 차가운 에탄올 분획에 기초한다(참고, 예를 들어, Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-75; Oncley et al. (1949) J. Am. Chem. Soc. 71:541-50). 정제 과정에서의 알코올의 용도는 잠재적으로 오염원이 되는 바이러스를 불활성화시킬 수 있으나, 온도 및 알코올 농도가 증가하면, 콘-온클리 방법의 결과 단백질이 변성 및 응집할 수 있다. 이러한 고분자 형태는 거침없이 보체를 고정하는 능력을 가진 항원-항체 복합체로 작동할 수 있다.
b. 변형된 콘- 온클리 과정
콘-온클리 방법의 불필요한 효과를 막기 위해서, 변형된 콘-온클리 방법들이 IG의 제조 및 정제를 위하여 개발되었다. 이러한 다양한 과정들은 공지되어있으며 본원의 IG 제조품을 생산하기 위하여 적용 및 변형될 수 있다. 당업계에서 알려지고 존재하는 상세한 방법의 관점에서 IG 제조용 물질을 제조하는 것은 공지기술의 범위이다.
전형적으로, IG 제조품을 획득하기 위한 출발물질로부터 불필요한 오염물을 제거하기 위하여(참고, 예를 들어, 특허번호 US 3,869,436, EP 91300790 및 WO 94/29334) IG는 일차적 차가운 에탄올 분획법 및 이차적 분획법, 예를 들어, 낮은 항보체 활성(ACA)을 획득하기 위한 이하의 단계 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 원심분리 또는 배제크로마토그래피와 같은 종래기술을 이용한 IG 응집의 분리; 알코올화, 알킬화, 설폰화 및 환원제를 이용한 IG 분자의 화학적 변형(참고, 예를 들어, 미국 특허번호 제 6,875,848 호); 펩신, 플라스민 및 고정화 트립신의 존재 또는 부재 하의 적절한 산성 pH (pH 4.0)에서의 배양;
에틸렌글리콜 중합체를 이용한 인간혈장 분리(Polson et al. (1964) Biochim. Biophys. Acta. 82: 463-475), 콘 분획으로부터 발생한 물질의 분리를 위한 정제제로서의 폴리에틸렌글리콜(PEG)의 배양(분획 II 또는 II + III, 참고, 예를 들어, 미국 특허번호 제 4,093,606 호 및 제 4,165,370호), 폴리에틸렌글리콜을 침전제로 사용하는 분획법 및 미국 특허번호 제 4,093,606, 4,126,605, 3,966,906, 및 4,124,576 호에 기재된 기타 기법, 그리고 폴리에틸렌글리콜을 이용한 정제 처리의 기타 유사 방법(EP 0246579); B-프로피오락톤 치료; 이온교환크로마토그래피. EP 0440483은 이온교환 크로마토그래피 및 약산성 pH에서의 정용여과; 효소 분열; 용제/계면활성제 처리; 및 정용여과 및 초여과에 기초한 제품의 정맥내 제조를 가능하게 하는데 유용한 기술의 조합을 상술한다. 다른 방법은 또한 당업계에 상술되어있으며 당업자에게 공지되어있다(참고, 예를 들어, 미국 특허번호 제 5,177,194 호 및 제 6,875,848 호).
정제된 콘 분획 II는 보편적으로 이용된다. 출발물질인 콘 분획 II 페이스트는 전형적으로 95 퍼센트 IgG이며 또한 네가지 IG 아형을 함유한다. 이들이 얻어진 인간 혈장으로부터 발견된 서로 다른 아형들은 분획 II에 거의 동일한 비율로 존재한다. 상기 분획 II는 투여가능한 제품으로 제제화되기 이전에 추가적으로 정제된다. 예를 들어, 상기 분획 II는 차가운 정제된 수성 알코올 용액 내로 용해되고 불순물은 침전 및 여과를 통해 제거될 수 있다. 최종 여과 이후, 면역글로불린 현탁액은 투석 또는 정용여과(예를 들어, 100,000 달톤 또는 그 이하의 일반적인 분자량 한계를 가지는 초여과막을 이용하여) 되어, 알코올을 제거할 수 있다. 용액은 원하는 단백질 농도를 얻기 위하여 농축 또는 희석될 수 있으며 나아가 당업계에 공지된 기술로 정제될 수 있다.
c. 바이러스적 처리
상기 IG 제조품은 바이러스 함유물을 제거하기 위한 처리가 되어야 한다. 바이러스적 처리에는 두가지 방법: 바이러스 불활성화 및 바이러스 분할 또는 제거가 있다. 바이러스 불활성화는 바이러스가 예를 들어, 화학적으로 지질막 또는 단백질막을 변형시키거나, 바이러스 전체를 변성시켜 바이러스를 불활성화시킨다. 바이러스 불활성화 방법의 예시는, 가열(저온살균), 용제/계면활성제(S/D) 처리 및 산성 환경(낮은 pH)에의 노출을 포함하며, 이에 제한되지 않는다. S/D 처리는 혈장 산업에서 바이러스 불활성화 방법으로 가장 널리 사용되어, 지질막을 가지는 바이러스를 불활성화시키는데 사용된다. 예를 들어, S/D 처리는 VSV(소낭성 구염 바이러스), 신드비스 바이러스, HIV, HBV(B형 간염바이러스), 및 HCV(C형 간염바이러스)에 대한 바이러스 박멸 작용을 가짐을 보여준다.
바이러스적 제거는 모든 바이러스를 샘플로부터 완전히 제거하는 방법이다. 바이러스 분할 또는 제거의 예시는 차가운 에탄올 분획, 단계적 분할(phase partitioning) 또는 PEG 침전, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 또는 겔 배제 크로마토그래피 및 나노여과를 포함하며, 이에 제한되지 않는다.
d. 단백질 농도
면역글로불린은 다양한 농도로 제조될 수 있다. 예를 들어, IG는 약 3 내지 25 % IG 범위, 전형적으로는 10 % 내지 20 % w/v와 같은 약 10% 내지 22%의 단백질 농도에서 제조될 수 있다. 예를 들어, IG 제조품은 약 18% 내지 22% IG w/v일 수 있다. 본원에서 제공된 IG 제조용 물질은 일반적으로 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 %, 21 %, 22 % 또는 그 이상의 IG 농도에서 제조된다. 최종 단백질 농도는 생산 및 정제 방법에 크게 의존한다. 본원에서는 임의의 면역 글로불린 제조품은 히알루로니다아제가 있는 안정한 복합제제를 위하여 본원에서 사용될 수 있다고 생각된다. 경험적으로 본원의 안정한 복합제제에 포함되는 적당한 IG 농도를 결정하는 것은 당업자에게 공지된 영역이다. IG 제조용 물질의 선택은 투여 경로, 치료를 받을 환자 및 치료될 상태와 같은 다양한 변수에 의존할 것이다.
예를 들어, 임의의 공지되거나 또는 존재하는 IG의 제조품이 사용될 수 있다. 이는 IV 투여용으로 전형적으로 사용되는 IG(IVIG) 제조품도 포함한다. 일반적으로, 최종 정맥내 투여용 IG 제조품은 3 내지 12 % w/v, 또는 전형적으로 10 % w/v의 단백질 농도를 가진다. 예를 들어, IVIG는 Carimune® NF, Flebogamma® 5 %, Gammagard® Liquid, Gammagard® S/D, Gamunex®, Iveegam® EN, Octagam® and Polygam® S/D로써 상업적으로 시판되고 있다. 전형적으로, 이러한 제조품은 차가운 알콜 분획법을 사용하나, 면역글로불린을 격리 또는 정제하는 방법 및 잠재적인 바이러스 오염을 감소시키는 방법을 달리한다.
나아가, 현재 근육내 또는 피하내 투여용으로 제제화된 다른 제조품도 본원에서 제공된 조성물 및 방법으로 사용될 수 있다. 예를 들어, 근육내 투여용 및 피하내 투여용 IG 제조품은 각각 GamaSTAN® S/D 및 Vivaglobin®로써 상업적으로 시판되고 있다. 전형적으로, 이러한 제조품은 인간 혈장의 차가운 알코올 분획법을 사용하며 각각 15 내지 18% 또는 10 내지 22 %의 IgG 농도를 가진다. 미국 가출원번호 제 61/181,606 호는 혼주 혈장으로부터 고도로 정제 및 농축된 피하내 투여용 면역글로불린 조성물의 제조에 대하여 상술한다.
e. IG 제조의 예시
i. 10% IG
IG 제제의 예시는, 정맥용 면역 글로불린 (인간), 10% (IVIG, 10%, Gammagard® 액체로 시판, Baxter Healthcare Corporation) 으로, 정상 플라느마의 것과 유사한 IgG 서브클래스의 분포를 가진 액체 비변형 IgG 제제인 것이 있다. 상기 제제는 온전한 fragment crystallizable (Fc) 및 fragment antigen binding (Fab) 영역을 포함한다. 상기 제제는 100 mg/ml 단백질을 포함하며, 적어도 98% 는 IgG 이고; IgA 는 37 ㎍/ml 의 농도로 존재하고, IgM 은 미량으로만 존재한다. 이는 생리학적 삼투성과 유사한 삼투성을 갖고, 첨가된 당, 나트륨 또는 보존제가 없다. 이는 4.6 내지 5.1 의 pH 에서 안정화를 위해 글리신과 제제화된다. 제조 프로세스는 변형된 콘-온클리 냉각 알코올 분획화 과정 및, 추가로 약한 양이온 교환 크로마토그래피 및 약한 음이온 교환 크로마토그래피의 이용을 통한 연속적인 프로세스에 의한 추가적인 정제를 채용한다. 제조 프로세스는 또한 3 개의 독립적인 바이러스 불활성화 또는 제거 단계: 용매/계면활성제 (S/D) 처리, 나노여과 및 낮은 pH 및 상승한 온도에서의 배양을 포함한다. 10 % IVIG 제조용 물질의 제조는 예시 1에 기재되어 있다.
ii . 고농도 IG 제조 (예를 들어 20 % IG )
고농도 면역글로불린 제조용 물질의 생산은 미국 가출원번호 제 61/181,606에 상술되어 있다. 18-22 % IG를 함유하는 제조용 물질의 예시는 고도로 정제되었고, pH 4.4-4.9의 0.25 mM 글리신에서 제제화된 면역글로불린의 등장성 액체 제제(적어도 95 % IgG)는 하기 예시에 나타나 있다.
본원에 기재된 IgG 제품의 높은 농도는 전통적인 IVIG 조제용 물질(예를 들어, 10 % IG)의 생산 과정과 동일 또는 유사한 단계를 다수 가지는 과정에 따라 생산된다. 추가적 단계인, 특별히 설계된 후-세척(post-wash)을 가지는 개방 채널 막을 이용하는 초여과/정용여과 및 제품 생산 마지막의 제제화는, 수득률과 저장 안정성에 대한 영향없이, 결과적인 IG 조성물의 단백질 농도가 당업계의 IVIG(예를 들어, Gammagard Liquid)와 비교하여 약 두배 이상(200 mg/mL)이 되도록 한다. 대부분의 상업적으로 시판되는 초여과막을 이용하면, 다수의 단백질 손실 없이는 200 mg/mL IgG의 농도를 만들 수가 없다. 이러한 막은 일찍 닫히고, 그 결과 충분한 후-세척은 이루어지기 어렵다. 따라서, 개방 채널 막(open channel membrane) 구조가 사용되어야 한다. 나아가, 특별히 설계된 후-세척 과정은 명백한 단백질 손실(2% 손실 이하) 없이 필요한 IG 농도를 얻기 위해 수행된다; 200 mg/mL의 보다 높은 단백질 농도는 낮은 pH 저장 단계의 바이러스 불활성화 능력에 영향을 주지 않는다.
고농도 IG 조성물을 생산하는 일반적인 과정은 실시예 2에서 추가적으로 기재된 바를 포함한다. 우선, 동결침전물이 미리 냉동된 혈장으로부터 다음단계에서 상청액을 얻기 위하여 처리(또는 분리 I)될 "동결침전물 감소 혈장(cryo-poor plasma)"를 얻기 위하여 분리된다. 전형적으로 7 및 20 내지 25% v/v로, pH 및 에탄올 농도를 각각 조절하면 액체 및 고체가 분리되며, 이후 온도를 감소시키면서 원심분리한다. 이 단계에서의 침전은 그후 훈증된 실리카와 혼합, 추출되고, 그리고 여과되며, 모든 단계는 저온, 전형적으로는 2 내지 8℃에서 수행된다. 상기 여과물은 이후 2 내지 8℃에서의 교반 하에 폴리소르베이트-80 및 무수시트르산나트륨과 혼합된다. 이후 pH 및 알코올 농도가 조절된, 콘 II의 침전단계와 유사한 방법으로 침전 G를 얻는다. 침전 G는 투명한 여과액을 얻기 위하여 용해 및 공칭공경(nominal pore size)이 0.2 μm인 깊이 필터(예컨대, Cuno VR06 필터 또는 등가물)로 여과된다. 용제/계면활성제 처리는, 전형적으로는 1.0 % (v/v) 트리톤 X-100, 0.3 % (v/v) 트윈-80, 및 0.3 % (v/v) TNBP를 18 내지 25℃의 온도에서 적어도 60분 동안이루어지고, 이후 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온교환 크로마토그래피 및 예를 들어, Asahi Planova 35N 필터 또는 등가물을 이용하여 나노여과 한다. 나노여과에 이어, 여과액은 5±1 % w/v의 단백질 농도로 초여과를 통해 농축된다. 일부 예에서, 초여과는 개방 채널 스크린 및 50 kDa 또는 그 이하의 공칭분획분자량(NMWCO)을 가진 초여과막을 갖는 카세트에서 수행된다. 초여과 단계가 완료하면, 농축액은 낮은 pH를 갖는 0.25M 글리신 용액에 대하여 정용여과된다. 전형적으로는, 최소 교환 용량은 최초 농도 용량의 6배가 되며, 용액은 20% w/v 이상의 단백질 농도로 농축된다. 정용여과 및 농축 과정이 종료하면, 용액의 pH는 전형적으로 4.4 내지 4.9 사이에 있게 된다. 제제화를 위해, 용액의 단백질 농도는 이후 정용여과 버퍼와 함께 20 % w/v를 약간 넘도록, 예를 들어, 20.4±04 % w/v로 조절된다. 제제화된 벌크 용액은 추가적으로 0.2 마이크론 또는 그 이하의 절대 공경(absolute pore size)을 갖는 막여과를 통해 첫번째 여과에 의하여 소독된다. 용액은 테스트를 위해 체취한 샘플과 함께, 무균으로 최종 용기로 분산되어 적절히 밀봉된다. 최종 단계는 밀봉된 용기를 30 내지 32℃에서 장기간, 예를 들어 21 내지 22일 동안 저장하는 것이다.
제조과정에서 초여과 및 제제화 단계를 포함하는 것은 종래 사용된 IG 정제 및 농축 방법보다 개선된 것들로, 제제는 최종 제제에서 낮은 pH를 유지하는 동안 유의한 IG 활성의 손실 없이 보다 높은 IG 농도를 갖게 된다. 전형적으로는, 제품은 IG가 가장 우세(전형적으로는 적어도 95% 이상)한, 적어도 18 % 중량/부피(w/v)의 단백질 농도 및 혈장에 존재할 수 있는 바이러스와 같은 병원체를 불활성화시키는 3 내지 6의 pH를 갖게 된다. 높은 IG 농도와 그러므로 감소된 투여용량에 의해, 고농도 제제는 피하내 투여에 적합하다. 일부 실시예에서, IG 제품들은 18 mPascal·초 이하의 점도를 가져 정맥내 투여에도 적합할 수 있다. 단순 희석 또한 정맥내 투여를 가능하게 한다.
2. 저장 안정성
최종, 정제된 IG 제제는 반드시 IG의 활성을 유지하고 과도한 응집을 피하도록 제조되어야 한다. IG 제제를 저장할 때, 예를 들어, 단백질 안정화제 첨가제 또는 용액의 pH 조절로 응집 최소화 및 안정성 개선이 이루어질 수 있다.
a. 단백질 안정화 첨가제
IG 제제의 안정성을 증가시키는 방법으로 당업계에 공지된 방법은 단백질 안정화 첨가제를 IG 제제에 첨가하는 것이다. 알려진 첨가제는 설탕, 폴리올, 아미노산, 아민, 염, 고분자 및 계면활성제를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 미국 특허번호 제 4,499,073 호는 안정화를 저장 용매의 이온강도 및 pH의 결과로 기술한다; 일본 특허번호 제 54020124 호는 저장하기 안정하고 안전한 제제를 얻기 위해 근육내 제제로의 아미노산의 첨가를 개시한다; 일본 특허번호 제 57031623 호 및 제 57128635 호는 근육내 제제의 장기간 안정성을 획득하기 위한 NaCl과 함께 5 내지 15% IG 제제 내의 아르기닌 및/또는 라이신의 용도를 개시한다; 일본 특허번호 제 4346934 호는 저전도도(1 mmho 이하), pH 5.3 내지 5.7 및 하나 또는 그 이상의 PEG를 포함하는 안정화제, 인간 혈청 알부민 및 만니톨의 용도를 개시한다; 미국 특허번호 제 4,439,421 호는 항-보체 생성에 대항하여 안정화하기 위한 친수성 거대분자, 폴리올 및 기타 단백질의 첨가를 개시한다; 미국 특허번호 제 5,945,098 호는 아미노산(0.1 내지 0.3 M 글리신) 및 세제(폴리소르베이트 및 PEG)의 첨가에 의한 등장성 용액의 안정화를 개시한다; 미국 특허번호 제 4,186,192 호는 아미노산을 포함하는 다양한 첨가제를 개시한다; WO 2005/049078 호는 말토오즈, 추가적으로, 0.1M까지의 글리신을 이용한 안정화를 개시한다. 미국 특허번호 제 4,362,661 호는 5 % IG 제제에 안정성을 주기 위한 중성 및 염기성 아미노산의 용도를 개시한다. 안정한 액체 제제는 또한 수성 매체 내의 당질을 이용하여 극히 낮은 이온강도 및 4.25의 pH에서(미국 특허번호 제 4,396,608 호), 또는 5 내지 6의 약산성 pH에서(EP 0278422) 제조될 수 있다.
IG 제제의 이량체 제제화 또한 조절 가능하다. 예를 들어, 미국 특허번호 제 5,871,736 호는 이량체 제제화에 대응하여 하나 또는 그 이상의 양친매성 안정화제를 함유한, 특히 액체 제제인, IG 제제를 개시한다. 양친매성 안정화제는 니코틴산 및 그 유도체, 특히 니코틴아마이드을 포함하며, 이는 대체로 하전되지 않은 친유성 사슬을 가진 아미노산, 예를 들어, 페닐알라닌, 메티오닌, 류신, 이소류신, 프롤린 및 발린과 결합되어 있다.
b. pH
IG 제제는 본원에서 기재된 임의의, 당업계에 공지된 방법으로 준비될 수 있다. 일반적으로, 그러나 최종 제제의 pH는 상대적으로 높은 pH, 즉 약 pH 4.0 내지 7.4의 범위로 조절된다. 면역 글로불린 제제의 pH는 최종 산물의 IgG 단량체 함유물과 관련하여 중요한 요소인 것으로 발견되었다. 일반적으로, 5 % 면역글로불린 제제는 4.2 ± 0.5의 pH를 가진다. 10 % 제제는 5.2 ± 0.2의 pH에서 가장 안정하다. 최적 pH는 당업자에게 공지된 제제화 기법으로 얻을 수 있다. 예를 들어, 최적 pH는 다양한 제제의 가변 pH 조건 하에서 열안정성 데이터 및 항보체역가와 마찬가지로 사이즈 배제크로마토그래피 실험을 통해 결정될 수 있다.
D. 히알루로니다아제
본원에서는 면역글로불린 및 가용성 히알루로니다아제를 함유하는 안정한 복합제제, 전형적으로는 가용성 히알루로니다아제를 제공한다. 히알루로니다아제는 히알루론산을 분해하는 효소들의 거대한 패밀리로, 세포외 기질의 핵심적인 성분이며, 간질 장벽 (interstitial barrier) 의 주된 구성원이다. 히알루론산의 가수분해를 촉매함으로써, 히알루로니다아제는 히알루론산의 점도를 낮추고, 그로써 조직 투과성을 증가시킨다. 이와 같이, 히알루로니다아제는, 예를 들어 다른 시약들, 약물들 및 단백질들과 함께 전착제 또는 분산제로서 사용되어 그의 분산성 및 전달성을 증강시킨다. 본원에서 제공되는 복합제제에서의 예시 히알루로니다아제는 가용성 히알루로니다아제이다.
히알루로니다아제의 세가지 일반적 클래스; 포유류 히알루로니다아제, 박테리아 히알루로니다아제, 및 거머리, 기타 기생충 및 갑각류 유래의 히알루로니다아제가 있다.
포유류-유형 히알루로니다아제 (EC 3.2.1.35) 는 히알루론산의 β1 → 4 글리코시드 결합을 각종 길이의 올리고당류, 예컨대 사당류 및 육당류로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 가수분해성 및 트랜스글리코시다아제 활성의 두가지를 모두 갖고 있으며, 히알루론산 및 콘드로이틴 설페이트, 예컨대 C4-S 및 C6-S 를 분해할 수 있다. 이러한 유형의 히알루로니다아제에는, 이에 제한되지 않지만, 소(bovine) 유래의 히알루로니다아제 (서열번호: 10 및 11), 마우스 (서열번호: 17 내지 19, 32), 돼지 (서열번호: 20 내지 21), 랫트 (서열번호: 22 내지 24, 31), 토끼 (서열번호: 25), 양 (서열번호: 26 및 27), 오랑우탄 (서열번호: 28), 필리핀 원숭이 (서열번호: 29), 기니 피그 (서열번호: 30) 및 인간 히알루로니다아제가 포함된다.
포유류 히알루로니다아제는 고환 추출물에서 주로 발견되는 중성 활성의 것, 및 간과 같은 기관에서 주로 발견되는 산성 활성의 것으로 더 하위분류될 수 있다. 예시 중성 활성 히알루로니다아제에는, PH20, 이에 제한되지 않으나, 양 (서열번호: 27), 소 (서열번호: 11) 및 인간 (서열번호: 1) 과 같은 상이한 종들로부터 유도된 PH20 이 포함된다. 인간 PH20 (SPAM1 또는 정자 표면 단백질 PH20으로도 공지됨) 은, 일반적으로 글리코실포스파티딜 이노시톨 (GPI) 앵커를 통해 세포막에 고정된다. 이는 본래 정자-난자 결합에 관여하고, 히알루론산 소화에 의해 난구 세포층의 정자에 의한 침투를 보조한다.
인간 PH20 (SPAM1 로도 지칭함) 이외에도, 5 가지 히알루로니다아제-유사 유전자, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 및 HYALP1 가 인간 게놈에서 동정되었다. HYALP1 은 슈도유전자 (pseudogene) 이고, HYAL3 (서열번호: 38) 은 임의의 공지된 물질에 대한 효소 활성을 보유하지 않는 것으로 나타났다. HYAL4 (서열번호: 39 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 콘드로이티나아제이고, 히알루론산에 대해서는 거의 활성을 나타내지 않는다. HYAL1 (서열번호: 36 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 원형적 (prototypical) 산성-활성 효소이고, PH20 (서열번호: 1 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 원형적 중성-활성 효소이다. 산-활성 히알루로니다아제, 예컨대 HYAL1 및 HYAL2 (서열번호: 37 에 개시된 전구체 폴리펩티드) 는 일반적으로 중성 pH (즉, pH 7) 에서 촉매 활성이 결핍되어 있다. 예를 들어, HYAL1 은 pH 4.5 를 초과하면 시험관내에서 촉매 활성을 거의 갖지 않는다 (Frost 등 (1997) Anal Biochemistry 251: 263-269). HYAL2 는 시험관내에서 매우 낮은 비활성(specific activity)을 갖는 산성-활성 효소이다. 히알루로니다아제-유사 효소는 또한 일반적으로 인간 HYAL2 및 인간 PH20 와 같은 글리코실포스파티딜 이노시톨 앵커를 통해 세포막에 고정되어 있는 것 (Danilkovitch-Miagkova, 등 (2003) Proc. Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5), 및 인간 HYAL1 과 같은 일반적으로 가용성인 것 (Frost 등 (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5) 을 특징으로 한다.
1. PH20
기타 포유류 히알루로니다아제와 같은 PH20은, 히알루론산의 β1→4 글리코시딕 결합을 4당류 및 6당류와 같은 다양한 올리고당 길이로 가수분해하는 엔도-β-N-아세틸-헥소사미니다아제이다. 이들은 모두 가수분해능 및 글리코시드 전달효소 활성이 있으며 히알루론산 및 C4-S 및 C6-S와 같은 황산 콘드로이틴을 분해할 수 있다. PH20은 난자-정자 부착에 자연발생적으로 관여하며 히알루론산을 소화하여 층적된 세포의 층을 정자로 통과하는 것을 돕는다. PH20은 첨체 내부막에 결합한 정자 표면 및 리소좀-유도된 첨체에 위치한다. 내부 첨체막 PH20이 중성 및 산성 pH 모두에서 활성을 가지는 반면, 세포막 PH20은 중성 pH에서만 히알루로니다아제 활성을 가진다. 추가적으로 히알루로니다아제가 되기위해, PH20는 또한 HA-유도 세포 신호발생의 수용체, 그리고 난모세포를 둘러싸는 투명대의 수용체로 작용하는 것으로 보인다.
예시적 PH20 단백질은 인간(서열번호 1로 나타나는 전구체 폴리펩티드, 서열번호 2로 나타나는 성숙한 폴리펩티드), 소(서열번호 11), 토끼(서열번호 25), 양의 PH20(서열번호 27), 게먹이 원숭이(서열번호 29), 기니아 피그(서열번호 30), 랫(서열번호 31) 및 마우스(서열번호 32) PH20 폴리펩티드를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
소 PH20 는 553 아미노산 전구체 폴리펩티드 (서열번호: 11) 이다. 소 PH20 과 인간 PH20 의 정렬은, 소 폴리펩티드에서의 GPI 앵커의 부재로 인해, 아미노산 470 부터 각각의 카르복시 말단까지 존재하는 멀티플 갭이 있는, 오직 약한 상동성만을 나타낸다 (참고문헌은 예를 들어, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4: 427-440). 사실, 인간을 제외하고는 그 어떤 PH20 종에서도 명백한 GPI 앵커가 예측되지 않는다. 따라서, 양 및 소에서 제조된 PH20 폴리펩티드는 가용성 형태로 존재한다. 소 PH20 가 세포막에 매우 느슨하게 결합되어 존재하기는 하지만, 이는 포스포리파아제 감응성 앵커를 통해 고정되어 있지 않다 (Lalancette 등, Biol Reprod. 2001 Aug; 65(2):628-36.). 소 히알루로니다아제의 이러한 독특한 특성은, 가용성 소 고환 히알루로니다아제 효소가 임상 용도의 추출물로서 이용되게끔 한다 (WydaseTM, HyalaseTM).
인간 PH20 mRNA 전사물은 일반적으로 번역되어, N-말단 (아미노산 잔기 위치 1 내지 35) 에 35 개의 아미노산 시그널 서열 및 C-말단 (아미노산 잔기 위치 491 내지 509) 에 19 개의 아미노산 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커 부착 신호 서열을 포함하는 509 개의 아미노산 전구체 폴리펩티드(서열번호: 1)를 생성한다. 따라서, 성숙형 PH20 폴리펩티드는 서열번호: 2 에 개시된 아미노산 서열이 있는 474 개의 아미노산 폴리펩티드이다. 전구체 폴리펩티드의 하기 ER로의 운송 및 신호 펩티드의 제거, C-말단 GPI-부착 신호 펩티드는 GPI앵커의 서열번호 1에서 개시된 전구체 폴리펩티드의 490 자리에 대응하는 새로 형성된 C-말단 아미노산 위치로의 공유결합을 활성화하기 위하여 절단된다. 따라서, 서열번호 2로 개시된 아미노산 서열 474 아미노산 GPI-앵커된 성숙한 폴리펩티드는 제공된다.
벌꿀독 히아룰로니다아제 및 마우스 원숭이 및 기니아피그 PH20을 포함한 기타 히알루로니다아제와 비교하여, 인간 PH20는 57 보존 아미노산과 함께 340 아미노산의 공통영역을 함유한다(예를 들어, Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814 참고). 보존 아미노산은(서열번호 1로 개시된 아미노산 세트의 서열의 60, 224, 238 및 351 잔기 와 대응하는) 서열번호 2로 개시된 아미노산 서열의 아미노산 잔기 25, 189, 203 및 316에서 이황화 다리를 형성하는 네 개의 시스테인 잔기를 포함한다. 이황화 결합은 시스테인 잔기 C60 및 C351 그리고 C224 및 C238 사이에서 코어 히아룰로니다아제 도메인을 만들기 위해 형성된다. 그러나, 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464가 최소 활성화 인간 PH20 히알루로니다아제 도메인을 함유하도록 중성 효소 촉매활성을 위해 추가적인 시스테인이 C-말단에서 요구된다. 추가적인 네개의 이황화 결합은 서열번호 1로 예시되는 폴리펩티드의 시스테인 잔기 C376 및 C387 사이; C381 및 C435 사이; C437 및 C443 사이; 그리고 C458 및 C464 사이(각각 서열번호 2로 개시된 성숙한 폴리펩티드 C341 및 C352; C346 및 C400 사이; C402 및 C408 사이; 그리고 C423 및 C429 사이 잔기에 대응)에 형성된다.
추가적으로, 기타 보존 잔기는 기질 결합 및 촉매작용에 관여하는 경향이 있다. 서열번호 2의 잔기와 대응하는 111, 113, 176, 249 및 252 아미노산 자리의 변이가, 무변이의 야생형 PH20과 비교하여 효소 활성이 전혀 없거나 잔효만 가지는 효소를 만드는 것으로 보아, 이들 아미노산 잔기는 PH20의 활성에 관여하는 것으로 나타난다(참고 e.g. Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814).
서열번호 1로 예시되는 인간 PH20에는 일곱개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 자리 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490가 존재한다. 이황화 결합은 시스테인 잔기 C60 및 C351 그리고 C224 및 C238 사이에 형성되어 코어 히알루로니다아제 도메인을 이루게 된다. 서열번호 1의 아미노산 36 내지 464가 최소 활성화 인간 PH20 히알루로니다아제 도메인을 가지는 바, N-연결 글리코실화 자리 N-490은 정상 히알루로니다아제 활성에 불필요하다.
2. 가용성 히알루로니다아제
일반적으로, 본원에서 제공된 안정한 복합제제의 히알루로니다아제는 가용성 히알루로니다아제이다. 가용성 히알루로니다아제가 세포에서 발현되면, 매개물(media)로 분비된다. 가용성은 단백질을 트리톤 X-114 용액의 수성상으로 격리시키는 것으로 입증할 수 있다. 이러한 이유로, 가용성 히알루로니다아제는 GPI 앵커를 함유하는 임의의 히알루로니다아제를 포함하지 않아, 폴리펩티드를 세포막에 부착시키지 않는 것으로 이해된다. 예를 들어, 온전한 길이의 인간 PH20(서열번호 2로 개시되는 이의 성숙한 형태)은 GPI 앵커를 함유하며 불용성이다. 이와 다르게, 소 및 양 PH20 폴리펩티드는 부착에 충분한 GPI 앵커를 함유하지 않아, 가용성 단백질인 것으로 이해된다. 나아가, 본원에서 제공된 복합제제 내의 가용성 히알루로니다아제는 일반적으로 잠재적으로 정제된 단백질이다. 또한, 가용성 히알루로니다아제는 히알루로니다아제 활성을 유지한다. 예를 들어, 가용성 인간 PH20은 중성 활성을 유지한다.
GPI 앵커 또는 막에 부착될 수 있는 충분한 앵커를 자연적으로 포함하지 않는 가용성 히알루로니다아제는 이에 제한되지 않으나, Hyal1, 소 PH20 및 양 PH20, 이들의 대립형질 변이체 및 기타 변이체를 포함하는, 가용성 형태로 존재하는 임의의 것이 포함된다. 또한, 가용성 히알루로니다아제 중에는 가용성이 되도록 변형된 임의의 히알루로니다아제가 포함된다. 예를 들어, 일반적으로는 GPI 앵커를 통해 막에 정상적으로 고정되어 있는 인간 PH20 은, C-말단에서의 GPI 앵커의 전부 또는 일부를 절단 및 제거함으로써 가용성으로 만들 수 있다. 가용성 히알루로니다아제는 또한 중성 활성 및 산성 활성 히알루로니다아제를 포함하나, 중성 활성 히알루로니다아제가 피하 투여의 목적을 위한 본원에서의 용도를 위해 고려된다.
따라서, 가용성 히알루로니다아제의 예시는, 히알루로니다아제가 가용성이고, 히알루로니다아제 활성을 보유하는 한, 서열번호: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31 및 32 중 어느 하나에 개시된 것과 같은, 임의의 종 유래의 PH20, 또는 C-말단 GPI 앵커의 전부 또는 일부가 결여된 그의 절단된 형태이다. 또한, 가용성 히알루로니다아제 중에는, 서열번호: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31 및 32 의 어느 하나의 대립형질 변이체 또는 기타 변이체, 또는 이들의 절단된 형태가 포함된다. 대립형질 변이체 및 기타 변이체는 당업자에게 공지되어 있으며, 서열번호: 1, 2, 11, 25, 27, 30 및 31 의 임의의 것과 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 가진 폴리펩티드, 또는 그의 절단된 형태를 포함한다.
전형적으로, 본원의 복합제제는 가용성 인간 PH20를 함유한다. 기타 동물 유래의 PH20 가 이용될 수도 있지만, 그들이 동물 단백질이기 때문에, 상기 제제는 잠재적으로는 면역원성이다. 예를 들어, 상당한 비율의 환자들이 섭취되는 음식에 이차적인 사전 민감화를 나타내고, 이들이 동물성 단백질이기 때문에, 모든 환자들은 후속 민감화의 위험을 갖는다. 따라서, 비-인간 제제는 만성 용도로는 적합하지 않을 수 있다. 비-인간 제제가 바람직하다면, 본원에서는 상기 폴리펩티드가 감소된 면역원성을 갖도록 제조될 수 있다는 것이 고려된다. 상기 변형은 당업자의 수준의 범위 내이다. 본원의 방법에서 사용되는, PH20 을 포함하는 히알루로니다아제는 재조합적으로 제조되거나, 또는 예를 들어 고환 추출물과 같은 자연 공급원으로부터 정제되거나 또는 부분적으로 정제될 수 있다.
a. 가용성 인간 PH20
가용성 히알루로니다아제의 예시는 가용성 인간 PH20 이다. 재조합 인간 PH20 의 가용성 형태가 생상되어져서 본원에서 기재된 복합제제에 포함될 수 있다 PH20 의 상기 가용성 형태의 제조는 미국 특허출원번호 제 2005-0260186 및 2006-0104968 에 기재되어 있다. 가용성 형태에는, 이에 제한되지 않으나, 서열번호: 1 에 개시된 아미노산의 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 464 를 포함하는 폴리펩티드를 형성하는 C-말단 절단을 가진 임의의 것이 포함된다. 예를 들어, 가용성 형태에는, 이에 제한되지 않으나, 서열번호: 1 에 개시된 아미노산의 서열의 아미노산 1 내지 아미노산 467 내지 483, 예를 들어, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 포함하는 폴리펩티드를 형성하는 C-말단 절단을 가진 임의의 것이 포함된다. 포유류 세포에서 발현되는 경우, 35 개 아미노산 N-말단 시그널 서열은 프로세싱 동안 절단되고, 상기 단백질의 성숙형 형태가 분비된다. 따라서, 성숙형 가용성 폴리펩티드는 서열번호: 1 의 아미노산 36 내지 464를 포함한다. 예를 들어, 성숙형 가용성 폴리펩티드는 서열번호: 1 의 아미노산 36 내지 467 또는 36 내지 483, 예를 들어 서열번호: 1 의 36 내지 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 및 483을 포함한다. 아미노산 위치 477 내지 483 (서열번호: 1 에 개시된 전구체 폴리펩티드에 해당) 에서 종결되는 결실 돌연변이는, 전장(full length) GPI-고정 형태보다 더 높은, 분비된 히알루로니다아제 활성을 나타낸다. 따라서, 가용성 히알루로니다아제의 예시는 442, 443, 444, 445, 446 또는 447 아미노산 길이를 갖는, 예컨대 서열번호: 4 내지 9 의 어느 하나에 개시된 것 또는 그의 대립형 또는 그의 종 변이체 또는 다른 변이체이다.
b. 재조합 가용성 인간 PH20 ( rHuPH20 )
rHuPH20의 형태로 표시되는 인간 PH20의 가용성 형태는 본원에 기재된 방볍을 제조되고 생산 및 정제될 수 있다. rHuPH20 의 상기 가용성 형태의 생성은 U.S. 특허 출원 번호 11/065,716 및 11/238,171 (U.S. 공개 특허 출원 번호 US20050260186 및 US 20060104968 로 공개됨), 및 하기의 실시예 3 에 기재되어 있다. 상기 폴리펩티드의 예시는 서열번호: 3 에 개시된 아미노산 1 내지 482 를 인코딩하는 핵산 분자로부터 생성된 것이다. 번역 후 프로세싱은 35 개 아미노산 시그널 서열을 제거하여, 그 결과 447 아미노산 가용성 rHuPH20 (서열번호:4) 의 분비를 초래한다. 수득된 정제 rHuPH20 은 제조 및 정제시 배양 배지에 존재하는 펩티다아제로 인해 이종성일 수 있다. 전형적으로는, rHuPH20 은 활성을 보유하도록 하는 올바른 N-글리코실화를 촉진하는 세포, 예컨대 CHO 세포 (예를 들어, DG44 CHO 세포) 에서 제조된다.
3. 글리코실화
일부 히알루로니다아제의 N- 및 C-연결 글리코실화를 포함한 글리코실화는 그의 촉매 활성 및 안정성을 위해 매우 중요할 수 있다. 글리칸의 유형을 변경시키면서, 당단백질을 변경하는 것은 단백질의 항원성, 구조적 폴딩, 가용성 및 안정성에 대한 극적인 영향력을 행사할 수 있지만, 대부분의 효소들은 최적의 효소 활성을 위한 글리코실화를 필요로 하는 것으로 생각되지 않는다. 상기 히알루로니다아제는 N-연결 글리코실화의 제거가 히알루로니다아제 활성의 거의 완전한 불활성화를 초래할 수 있다는 점에서 그와 관련하여 특이하다. 그러한 히알루로니다아제에 대해, N-연결 글리칸의 존재는 활성 효소의 생성에 중요하다.
N-연결 올리고당류에는 몇가지 주된 타입 (올리고만노오스, 복합체, 하이브리드, 설페이트화) 이 있는데, 이들은 모두 -Asn-Xaa-Thr/Ser- 서열 (여기서, Xaa 는 Pro 가 아님) 내에 있는 Asn 잔기의 아미드 질소를 통해 결합된 (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-코어를 갖는다. -Asn-Xaa-Cys-부위에서의 글리코실화는 응고 단백질 C 에 대해 보고된 바 있다. 일부의 경우, 히알루로니다아제는 N-글리코시드 및 O-글리코시드 결합의 두가지를 모두 포함할 수 있다. 예를 들어, PH20 은 O-연결 올리고당류 뿐만 아니라 N-연결 올리고당류를 갖는다. 서열번호: 1 로 예시된 인간 PH2O 의 N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 에 7 개의 잠재적인 N-연결 글리코실화 부위가 있다. 언급된 바와 같이, N-연결 글리코실화 부위 N490 는 적절한 히알루로니다아제 활성에 필요하지 않다.
4. 히알루로니다아제의 약동학적 성질을 개선시키기 위한 이들의 변형
복합제제에 제공된 히알루로니다아제는 그 약동적 성질, 예를 들어 이들의 생체내 반감기 및/또는 활성을 개선시키기 위해 변형될 수 있다. 히알루로니다아제의 본원에서 제공된 복합제제 내의 사용을 위한 변형은 공유적인 또는 다른 안정한 연결의, 덱스트란, 폴리에틸렌글리콜(페길레이션(PEGylation), PEG), 시알릴기, 또는 천연 또는 당 고분자와 같은 고분자 링커를 통한 직접 또는 간접부착을 포함할 수 있다.
치료제의 페길레이션은 단백질가수분해에 대한 저항증가, 혈장 반감기 증가, 및 항원성 및 면역원성의 감소를 초래하는 것으로 알려져 있다. 폴리에틸렌글리콜(PEG) 부분과 같은 중합체 분자의 히알루로니다아제에 대한 공유결합 또는 다른 안정한 부착(접합)은, 결과적인 효소-중합체 조성물에 이로운 성질을 전할 수 있다. 이러한 성질은 개선된 생체적합성, 대상체의 혈액, 세포 및/또는 기타 조직내 단백질(및 효소 활성) 반감기의 확장, 프로테아제 및 가수분해효소로부터 단백질의 효과적인 보호, 그리고 수용성의 증가를 포함한다.
히알루로니다아제와 접합 가능한 예시적 중합체는 폴리올(즉, 폴리_OH), 폴리아민(즉, 폴리-NH2) 및 폴리카르복실산(즉, 폴리-COOH)과 같은 천연 및 합성 단일중합체, 그리고 추가적인 예를 들어 히드록실기 및 아민기와 같은 서로 다른 결합기를 하나 또는 그 이상 함유하는 고분자 즉 이종중합체를 포함한다. 적절한 중합체 분자의 예시는 폴리프로필렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하는 폴리알킬렌 글리콜(PAG)과 같은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO), PEG-글리시딜 에테르(Epox-PEG), PEG-옥시카르보닐이미다졸(CDI-PEG) 가지친 폴리에틸렌 글리콜(PEGs), 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리카르복실레이트, 폴리비닐피롤리딘, 폴리-D,L-아미노산, 폴리에틸렌-코-말레산 무수물, 폴리스티렌-코-말레산 무수물, 카복시메틸-덱스트란을 포함하는 덱스트란, 헤파린, 균질한 알부민(homogeneous albumin), 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 카복시에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로오스, 키토산의 가수분해물, 히드록시에틸-전분 및 히드록시프로필-전분과 같은 전분, 글리코겐, 아가로스 및 이의 유도체, 구아검, 풀룰란, 이눌린, 잔탄검, 카라기난, 펙틴, 알긴산 가수분해물 및 생체고분자로부터 선택된 중합체 분자를 포함한다.
전형적으로, 덱스트란, 풀룰란 등과 같은 다당류 및 가교-결합이 가능한 반응기가 적은 물질과 바교하여, 고분자는 PEG, 전형적으로는 mPEG와 같은 폴리에틸렌 옥사이드와 같은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)이다. 전형적으로, 고분자는 상대적으로 단순한 화학반응을 사용하여 히알루로난 분해효소와 공유결합 가능한(예를 들어, 단백질 표면의 결합부위) (m)폴리에틸렌 글리콜(mPEG)와 같은 무독성 중합체 분자이다.
히알루로난 분해효소에 부착시킬 적절한 중합체 분자는 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG), 가지친 PEGs, 그리고 폴리에틸렌 옥사이드(PEO) 같은 PEG 유도체를 포함하나, 이에 국한되지 않는다(참고 e.g. Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Poly(ethy1ene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3(1):125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004). 중합체 분자는 전형적으로 약 3 kDa 내지 약 60 kDa 범위의 분자량을 가질 수 있다. 일부 실시예에서 rHuPH20와 같이 단백질에 결합한 중합체 분자는 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 또는 60 kDa 이상의 분자량을 가진다.
PEG 또는 PEG 유도체를 공유결합시켜 폴리펩티드를 변형시키는 다양한 방법은 당업계에 공지되어있다(참고 e.g., U.S. 2006/0104968; U.S. 5,672,662; U.S. 6,737,505; 및 U.S. 2004/0235734). 페길레이션 기법은 특화된 링커 및 연결 반응(참고 e.g., Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), 단일 결합자리에 복수 PEG 부분의 부착(가지친 PEGs의 사용과 같은; 참고 e.g., Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), 자리-특이적 페길레이션 및/또는 모노페길레이션(참고 e.g., Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783, 1999), 그리고 자리-유도 효소적 페길레이션(참고 e.g., Sato, Adv. Drug Deliv. Rev., 54:487-504, 2002) (또한 예를 들어 참고, Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43:127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088-95; see also, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S))을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 당업계에 기술된 방법 및 기법은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 10 이상의 PEG 또는 단일 단백질 분자에 부착된 PEG 유도체를 가진 단백질을 생산할 수 있다(참고 e.g., U.S. 2006/0104968).
다수의 페길레이션 시약이 당업계에 공지되어 있다. 이러한 시약은 N-하이드록시숙신이미딜(NHS) 활성화된 PEG, 숙신이미딜 mPEG, mPEG2-N-히드록시숙신이미드, mPEG 숙신이미딜 알파-메틸부타노에이트, mPEG 숙신이미딜 프로피오네이트, mPEG 숙신이미딜 부타노에이트, mPEG 카르복시메틸 3-히드록시부탄산 숙신이미딜 에스터, 호모바이펑셔널 PEG-숙신이미딜 프로피오네이트, 포모바이펑셔널 PEG 프로피온알데하이드, 호모바이펑셔널 PEG 부티르알데하이드, PEG 말레이미드, PEG 히드라지드, p-니트로페닐카보네이트 PEG, mPEG-벤조트리아졸 카보네이트, 프로피온알데하이드 PEG, mPEG 부티르알데하이드, 가지친 mPEG2 부티르알데하이드, mPEG 아세틸, mPEG 피페리돈, mPEG 메틸케톤, mPEG "링커리스(linkerless)" 말레이미드, mPEG 비닐 설폰, mPEG 싸이올, mPEG 오르쏘피리딜싸이오에스터, mPEG 오르쏘피리딜 다이설파이드, Fmoc-PEG-NHS, Boc-PEG-NHS, 비닐설폰 PEG-NHS, 아크릴레이트 PEG-NHS, 플루오레세인 PEG-NHS, 및 비오틴 PEG-NHS를 포함하나, 이에 국한되지 않는다(참고 e.g., Monfardini et al., Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; U.S. 5,672,662; U.S. 5,932,462; U.S. 6,495,659; U.S. 6,737,505; U.S. 4,002,531; U.S. 4,179,337; U.S. 5,122,614; U.S. 5,183,550; U.S. 5,324, 844; U.S. 5,446,090; U.S. 5,612,460; U.S. 5,643,575; U.S. 5,766,581; U.S. 5,795, 569; U.S. 5,808,096; U.S. 5,900,461; U.S. 5,919,455; U.S. 5,985,263; U.S. 5,990, 237; U.S. 6,113,906; U.S. 6,214,966; U.S. 6,258,351; U.S. 6,340,742; U.S. 6,413,507; U.S. 6,420,339; U.S. 6,437,025; U.S. 6,448,369; U.S. 6,461,802; U.S. 6,828,401; U.S. 6,858,736; U.S. 2001/0021763; U.S. 2001/0044526; U.S. 2001/0046481; U.S. 2002/0052430; U.S. 2002/0072573; U.S. 2002/0156047; U.S. 2003/0114647; U.S. 2003/0143596; U.S. 2003/0158333; U.S. 2003/0220447; U.S. 2004/0013637; US 2004/0235734; U.S. 2005/000360; U.S. 2005/0114037; U.S. 2005/0171328; U.S. 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; 및 WO 0187925).
E. 가용성 히알루로니다아제 및 그의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산의 제조 방법
본원에 제시된 가용성 히알루로니다아제의 폴리펩티드는 단백질 정제 및 재조합 단백질 발현 분야에서 널리 공지된 방법으로 수득될 수 있다. 원하는 유전자를 인코딩하는 핵산의 동정을 위한, 당업자에게 공지된 임의의 방법이 이용될 수 있다. 당업계에서 이용가능한 임의의 방법이 전장 (즉, 온전한 코딩 영역 포함) cDNA 또는, 예컨대 세포 또는 조직 공급원 유래의 히알루로니다아제를 인코딩하는 게놈 DNA 를 수득하기 위해 이용될 수 있다. 변형되거나 또는 변이체인 가용성 히알루로니다아제가, 예컨대 부위 지정 돌연변이생성법에 의해, 야생형 폴리펩티드로부터 조작될 수 있다. 전형적으로, 본원에서 제공되는 복합제제에 사용되는 rHuPH20과 같은 가용성 히알루로니다아제를 포함하는 히알루로니다아제는, 예를 들어, 고환 추출물과 같은 천연 자원으로부터 재조합으로 생산되거나 정제 또는 부분-정제될 수 있다.
폴리펩티드는 핵산 분자를 클로닝 및 단리하기 위한 당업계에 공지된 임의의 이용가능한 방법을 이용하여 클로닝 또는 단리될 수 있다. 상기 방법은, 핵산 혼성화 스크리닝, 항체 기재 스크리닝 및 활성 기반 스크리닝을 포함하는, 핵산의 PCR 증폭 및 라이브러리의 스크리닝을 포함한다.
예를 들어 폴리머라아제 연쇄 반응 (PCR) 방법을 포함하는, 핵산 증폭을 위한 방법은, 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 분자를 단리하기 위해 이용될 수 있다. 핵산 포함 물질이, 원하는 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자를 단리할 수 있는 출발 물질로서 사용될 수 있다. 예를 들어, DNA 및 mRNA 제제, 세포 추출물, 조직 추출물, 액체 샘플 (예를 들어, 혈액, 혈청, 타액), 건강한 및/또는 질병이 있는 대상체로부터의 시료가 증폭 방법에 이용될 수 있다. 핵산 라이브러리는 또한 출발 물질의 공급원으로서 사용될 수 있다. 프라이머는 원하는 폴리펩티드를 증폭하기 위해 지정될 수 있다. 예를 들어, 프라이머는 원하는 폴리펩티드가 생성되는 발현 서열을 기준으로 설계될 수 있다. 프라이머는 폴리펩티드 아미노산 서열의 역-번역을 기준으로 설계될 수 있다. 증폭으로 생성되는 핵산 분자들은 서열분석되어 원하는 폴리펩티드를 인코딩하는지 확인할 수 있다.
합성 유전자를 벡터, 예를 들어, 단백질 발현 벡터 또는 코어 단백질 코딩 DNA 서열의 증폭을 위해 설계된 벡터에 클로닝하기 위한 목적으로, 제한 엔도뉴클레아제 부위를 포함하는 링커 서열을 포함하는 추가적인 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자에 결합될 수 있다. 더욱이, 기능성 DNA 요소들을 특정하는 추가적인 뉴클레오티드 서열이 폴리펩티드-인코딩 핵산 분자에 작동가능하게 연결될 수 있다. 상기 서열의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 세포내 단백질 발현을 촉진하기 위해 설계된 프로모터, 및 단백질 분비를 촉진하기 위해 설계된 분비 서열, 예를 들어 이종성 시그널 서열이 포함된다. 상기 서열들은 당업자에게 공지되어 있다. 추가적인 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 단백질 결합 영역을 특정하는 염기들의 서열이 또한 효소-인코딩 핵산 분자에 연결될 수 있다. 상기 영역에는, 이에 제한되지 않으나, 특이적 표적 세포 내로의 효소의 흡수를 촉진하는 단백질을 촉진 또는 인코딩하거나, 또는 그렇지 않으면 합성 유전자의 생성물의 약물동력학을 변경시키는 잔기들의 서열이 포함된다. 예를 들어, 효소는 PEG 잔기에 연결될 수 있다.
추가로, 태그 또는 기타 잔기(moiety)들이, 예를 들어 폴리펩티드의 검출 또는 친화성 정제를 보조하기 위해 첨가될 수 있다. 예를 들어, 추가적인 뉴클레오티드 잔기 서열, 예컨대 에피토프 태그 또는 기타 검출가능한 마커를 특정하는 염기들의 서열이 또한 효소-인코딩 핵산 분자에 연결될 수 있다. 상기 서열의 예시에는, His 태그 (예를 들어, 6xHis, HHHHHH; 서열번호: 54) 또는 Flag 태그 (DYKDDDDK; 서열번호:55) 를 인코딩하는 핵산 서열이 포함된다.
이어서, 동정되고 단리된 핵산 서열이 적당한 클로닝 벡터에 삽입될 수 있다. 당업계에 공지된 수많은 벡터-숙주 시스템이 이용될 수 있다. 가능한 벡터에는, 이에 제한되지 않으나, 플라스미드 또는 변형된 바이러스가 포함되나, 벡터 시스템은 사용되는 숙주 세포와 반드시 상용성이어야 한다. 상기 벡터에는, 이에 제한되지 않으나, 박테리오파지, 예컨대 람다 유도체, 또는 플라스미드, 예컨대 pCMV4, pBR322 또는 pUC 플라스미드 유도체 또는 블루스크립트 (Bluescript) 벡터 (Stratagene, La Jolla, CA) 가 포함된다. 기타 발현 벡터에는, 본원에 예시된 HZ24 발현 벡터가 포함된다. 클로닝 벡터로의 삽입은, 예를 들어 DNA 단편을 상보적인 화합성 (cohesive) 말단을 가진 클로닝 벡터 내로 라이게이션하여 달성될 수 있다. 삽입은 TOPO 클로닝 벡터 (INVITROGEN, Carlsbad, CA) 를 이용하여 수행될 수 있다. DNA를 단편화하기 위해 이용되는 상보적인 제한효소 부위가 클로닝 벡터 내에 존재하지 않는 경우, DNA 분자들의 말단은 효소적으로 변형될 수 있다. 대안적으로, 임의의 원하는 부위는 DNA 말단 상에 뉴클레오티드 서열 (링커) 의 라이게이션으로 생성될 수 있으며; 상기 라이게이션된 링커들은 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인코딩하는 특이적인 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 대안적인 방법에서, 절단된 벡터 및 단백질 유전자는 호모폴리머 테일링 (homopolymeric tailing) 으로 변형될 수 있다. 재조합 분자들은 예를 들어 형질전환, 트랜스펙션, 감염, 전기천공 및 소노포레이션 (sonoporation) 을 통해 숙주 세포로 도입될 수 있고, 그로써 수많은 카피의 유전자가 생성된다.
특이적 구현예에서, 단리된 단백질 유전자, cDNA, 또는 합성된 DNA 서열을 혼입하는 재조합 DNA 분자들을 이용한 숙주 세포의 형질전환은 유전자의 복수의 카피 생성을 가능케 한다. 따라서, 유전자는 형질전환체들을 배양하고, 형질전환체로부터 재조합 DNA 분자를 단리하고, 필요한 경우 단리된 재조합 DNA 로부터 삽입된 유전자를 회수함으로써 유전자를 대량으로 수득할 수 있다. 일반적으로, PH20의 가용형태를 포함하는 히알루로니다아제는, 글리코실화가 히알루로니다아제의 촉매적 활성 및 안정성에 중요한 만큼, 폴리펩티드가 활성을 유지하도록 보장하게끔 정확한 N-글리코실화를 이용하는 단백질 발현 시스템으로 생산된다. 이러한 세포는, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포를 포함한다(예컨대 DG44 CHO 세포).
1. 벡터 및 세포
예컨대 본원에 기재된 임의의 것과 같은 하나 이상의 원하는 단백질의 재조합체 발현을 위해, 단백질을 인코딩하는 뉴클레오티드 서열의 전부 또는 일부를 포함하는 핵산을 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 단백질 코딩 서열의 전사 및 번역을 위해 필요한 요소들을 포함하는 벡터로 삽입할 수 있다. 필요한 전사 및 번역 시그널은 또한 효소 유전자에 대한 본래 프로모터 및/또는 그의 측면 영역에 의해 공급될 수 있다.
효소를 인코딩하는 핵산을 포함하는 벡터도 제공한다. 벡터를 포함하는 세포도 또한 제공한다. 세포에는 진핵 및 원핵 세포가 포함되고, 벡터는 본원에서 이용하기에 적합한 임의의 것이다.
벡터를 포함하는, 내피 세포를 포함한, 원핵 및 진핵 세포가 제공된다. 상기 세포에는 박테리아 세포, 효모 세포, 진균 세포, 아르케아 (Archea), 식물 세포, 곤충 세포 및 동물 세포가 포함된다. 세포는, 인코딩되는 단백질이 세포에 의해 발현되는 조건 하에 상기 언급한 세포를 배양하고, 발현된 단백질을 회수함으로써, 그의 단백질 생산에 이용된다. 본 발명의 목적을 위해, 예를 들어 효소는 배지에 분비될 수 있다.
본래 또는 이종성 시그널 서열에 커플링되어 있는 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드의 서열 뿐만 아니라 그의 다중 카피를 포함하는 벡터가 제공된다. 벡터는 세포에서의 효소 단백질의 발현을 위해 선별될 수 있거나, 또는 효소 단백질이 분비되는 단백질로서 발현되도록 선별될 수 있다.
각종 숙주-벡터 시스템이 단백질 코딩 서열의 발현에 이용될 수 있다. 여기에는, 이에 제한되지 않으나, 바이러스 (예를 들어, 백시니아 바이러스, 아데노바이러스 및 기타 바이러스) 로 감염된 포유류 세포 시스템; 바이러스 (예를 들어, 바큘로바이러스) 로 감염된 곤충 세포 시스템; 미생물, 예컨대 효모 벡터를 포함하는 효모; 또는 박테리오파지, DNA, 플라스미드 DNA, 또는 코스미드 DNA 를 이용하여 형질전환된 박테리아가 포함된다. 벡터의 발현 요소들은 그의 세기 및 특이성에 있어서 다양하다. 사용되는 숙주-벡터 시스템에 좌우되어, 다수의 적합한 전사 및 번역 요소들 중 임의의 한가지가 이용될 수 있다.
DNA 단편을 벡터에 삽입하기 위한 당업자에게 공지된 임의의 방법이 적당한 전사/번역 조절 시그널 및 단백질 코딩 서열을 포함하는 키메라 유전자를 포함하는 발현 벡터 구축에 이용될 수 있다. 상기 방법에는 시험관내 재조합 DNA 및 합성 기법 및 생체내 재조합체 (유전자 재조합) 가 포함될 수 있다. 단백질을 인코딩하는 핵산 서열, 또는 그의 도메인, 유도체, 단편 또는 유사체의 발현은 제 2 의 핵산 서열에 의해 조절되어, 그의 유전자 또는 단편들이 재조합 DNA 분자(들)로 형질전환된 숙주에서 발현된다. 예를 들어, 단백질의 발현은 당업계에 공지된 임의의 프로모터/인핸서에 의해 제어될 수 있다. 특정 구현예에서, 프로모터는 원하는 단백질에 대한 유전자에 대해 본래의 것이 아니다. 사용될 수 있는 프로모터에는, 이에 제한되지 않으나, 하기의 것이 포함된다: SV40 조기 프로모터 (Bernoist 및 Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), 라우스 육종 바이러스의 3' 긴 말단 반복부위에 포함되는 프로모터 (Yamamoto 등 Cell 22:787-797 (1980)), 헤르페스 티미딘 키나아제 프로모터 (Wagner 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), 메탈로티오네인 유전자의 조절 서열 (Brinster 등, Nature 296:39-42 (1982)); 원핵생물 발현 벡터, 예컨대 β-락타마아제 프로모터 (Jay 등, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543) 또는 tac 프로모터 (DeBoer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); 참고문헌으로는 또한 "Useful Proteins from Recombinant Bacteria", Scientific American 242:79-94 (1980)); 노팔린 합성효소 프로모터 (Herrara-Estrella 등, Nature 303:209-213 (1984)) 또는 컬리플라워 모자이크바이러스 35S RNA 프로모터 (Garder 등, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), 및 광합성 효소 리불로스 비스포스페이트 카르복실라아제의 프로모터 (Herrera-Estrella 등, Nature 310:115-120 (1984)) 를 포함하는 식물 발현 벡터; 효모 및 기타 진균으로부터의 프로모터 요소들, 예컨대 Gal4 프로모터, 알코올 디히드로게나아제 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제 프로모터, 알칼리성 포스파타아제 프로모터, 및 조직 특이성을 나타내며, 트랜스제닉 동물에서 이용되는 하기의 동물 전사 조절 영역: 췌장 선방 세포에서 활성인 엘라스타아제 I 유전자 조절 영역 (Swift 등, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol . 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 영역 (Hanahan 등, Nature 315:115-122 (1985)), 림프구 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 영역 (Grosschedl 등, Cell 38:647-658 (1984); Adams 등, Nature 318:533-538 (1985); Alexander 등, Mol . Cell Biol . 7:1436-1444 (1987)), 고환, 유방, 림프구 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 영역 (Leder 등, Cell 45:485-495 (1986)), 간에서 활성인 알부민 유전자 조절 영역 (Pinckert 등, Genes and Devel . 1:268-276 (1987)), 간에서 활성인 알파-페토단백질 유전자 조절 영역 (Krumlauf 등, Mol . Cell . Biol . 5:1639-1648 (1985); Hammer 등, Science 235:53-58 1987)), 간에서 활성인 알파-1 안티트립신 유전자 조절 영역 (Kelsey 등, Genes and Devel . 1:161-171 (1987)), 골수 세포에서 활성인 베타 글로빈 유전자 조절 영역 (Magram 등, Nature 315:338-340 (1985); Kollias 등, Cell 46:89-94 (1986)), 뇌의 희돌기교세포에서 활성인 미엘린 염기성 단백질 유전자 조절 영역 (Readhead 등, Cell 48:703-712 (1987)), 골격근에서 활성인 미오신 경쇄-2 유전자 조절 영역 (Shani, Nature 314:283-286 (1985)), 및 시상하부의 성선자극 분비 세포에서 활성인 성선자극 방출 호르몬 유전자 조절 영역 (Mason 등, Science 234:1372-1378 (1986)).
특정 구현예에서, 원하는 단백질을 인코딩하는 핵산, 또는 그의 도메인, 단편, 유도체 또는 유사체에 작동가능하게 연결된 프로모터, 하나 이상의 복제 기점, 및 선택적으로 선별가능한 마터 (예를 들어, 항생제 내성 유전자) 를 포함하는 벡터가 이용된다. E. coli 세포의 형절전환을 위한 예시 플라스미드 벡터에는, 예를 들어 pQE 발현 벡터 (Qiagen, Valencia, CA 로부터 입수가능; 상기 시스템을 설명하는, Qiagen 에 의해 출판된 문헌 참조) 가 포함된다. pQE 벡터는 파지 T5 프로모터 (E. coli RNA 폴리머라아제에 의해 인식됨) 및 E. coli 에서의 재조합체 단백질의, 긴밀하게 조절되는, 높은 수준의 발현을 제공하기 위한 이중 lac 작동자 억제 모듈, 효율적인 번역을 위한 합성 리보솜 결합 부위 (RBS II), 6XHis 태그 코딩 서열, t0 및 T1 전사 종결자, ColE1 복제 기점, 및 앰피실린 저항성을 부여하기 위한 베타-락타마아제 유전자를 갖는다. pQE 벡터는 재조합 단백질의 N- 또는 C- 말단 중 어느 곳에 6xHis 태그를 위치시키는 것을 가능케 한다. 상기 플라스미드에는, 모든 3 개의 리딩 프레임에 대한 다중 클로닝 부위를 제공하고 N-말단 6xHis-태그 단백질의 발현을 제공하는, pQE 32, pQE 30 및 pQE 31 가 포함된다. E. coli 세포의 형질전환을 위한 기타 예시 플라스미드 벡터에는, 예를 들어 pET 발현 벡터 (참고문헌은, U.S. 특허 4,952,496; NOVAGEN, Madison, WI 에서 입수가능; 또한, 상기 시스템을 설명하는, Novagen 에서 출판한 문헌 참고) 가 포함된다. 상기 플라스미드에는, T7lac 프로모터, T7 종결자, 유도성 E. coli 작동자, 및 lac 억제자 유전자를 포함하는 pET 11a; T7 프로모터, T7 종결자 및 에셰리키아 콜라이 ompT 분비 시그널을 포함하는 pET 12a-c; 및 His 컬럼을 이용한 정제에 사용하기 위한 His-TagTM 리더 서열 및 컬럼을 통한 정제 후 절단을 허용하는 트롬빈 절단 부위, T7-lac 프로모터 영역 및 T7 종결자를 포함하는 pET 15b 및 pET19b (NOVAGEN, Madison, WI) 가 포함된다.
포유류 세포 발현을 위한 벡터의 예시는 HZ24 발현 벡터이다. HZ24 발현 벡터는 pCI 벡터 백본 (Promega) 으로부터 유도된다. 이는 베타-락타마아제 내성 유전자를 인코딩하는 DNA (AmpR), F1 복제 기점, 싸이토메갈로바이러스 극초기 인핸서/프로모터 영역 (CMV), 및 SV40 레이트 폴리아데닐화 시그널 (SV40) 을 포함한다. 발현 벡터는 또한 ECMV 바이러스 유래의 내부 리보솜 진입 부위 (IRES) (Clontech) 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 유전자를 갖는다.
2. 발현
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는 생체내 및 시험관내 방법을 포함하는, 당업자에게 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 원하는 단백질은, 예를 들어 투여 및 치료용으로 필요한 것과 같은, 필요한 양 및 형태의 단백질 제조에 적합한 임의의 유기체에서 발현될 수 있다. 발현 숙주에는 원핵성 및 진핵성 유기체, 예컨대 E.coli, 효모, 식물, 곤충 세포, 인간 세포주 및 트랜스제닉 동물을 포함하는 포유류 세포가 포함된다. 발현 숙주는 그의 단백질 제조 수준에서 뿐만 아니라 발현 단백질 상에 존재하는 그의 번역 후 변형의 유형에 있어서도 상이할 수 있다. 발현 숙주의 선택은 상기 및 기타 요인들, 예컨대 조절 및 안전 고려사항, 제조 비용 및 정제의 필요조건 및 방법을 기준으로 할 수 있다.
수많은 발현 벡터들이 이용가능하며, 당업자에게 공지되어 있고, 단백질 발현을 위해 이용될 수 있다. 발현 벡터의 선택은 숙주 발현 시스템의 선택에 의해 영향을 받는다. 일반적으로, 발현 벡터는 전사 프로모터, 선택적으로는 인핸서, 번역 시그널, 및 전사 및 번역 종결 시그널을 포함할 수 있다. 안정한 형질전환을 위해 이용되는 발현 벡터는 전형적으로 형질전환된 세포의 선별 및 유지를 가능케 하는 선별가능한 마커를 갖는다. 일부의 경우, 복제 기점을 이용하여 벡터의 카피수를 증폭시킬 수 있다.
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는 또한 단백질 융합체로서 이용 또는 발현될 수 있다. 예를 들어, 효소 융합체는 효소에 추가적인 기능을 추가하기 위해 생성될 수 있다. 효소 융합체 단백질의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 시그널 서열, 예컨대 위치지정을 위한 태그, 예를 들어 his6 태그 또는 myc 태그, 또는 정제를 위한 태그, 예를 들어 GST 융합체, 및 단백질 분비 및/또는 막 회합 지시를 위한 서열이 포함된다.
a. 원핵 세포
원핵생물, 특히 E.coli 는 대량의 단백질 제조를 위한 계를 제공한다. E. coli 의 형질전환은 당업자에게 널리 공지된 단순하고 신속한 기법이다. E. coli에 대한 발현 벡터는 유도성 프로모터를 포함할 수 있고, 상기 프로모터는 높은 수준의 단백질 발현 및 숙주 세포에 대한 약간의 독성을 나타내는 단백질의 발현에 유용하다. 유도성 프로모터의 예시에는, lac 프로모터, trp 프로모터, 하이브리드 tac 프로모터, T7 및 SP6 RNA 프로모터 및 온도 조절성 λPL 프로모터가 포함된다.
단백질, 예컨대 본원에 제공된 임의의 것들은 E. coli의 세포의 환경에서 발현될 수 있다. 세포질은 환원성 환경이며, 일부 분자에 있어서는, 불용성 봉입체의 형성을 초래할 수 있다. 환원제, 예컨대 디티오트레이톨 및 β-메르캅토에탄올 및, 변성제, 예컨대 구아니딘-HCl 및 우레아가 단백질을 다시 재용해시키기 위해 이용될 수 있다. 대안적인 접근법은, 산화성 환경 및 샤페로닌-유사 및 디설파이드 이소머라아제를 제공하고, 가용성 단백질의 생산을 유도할 수 있는 박테리아의 세포질 주변 공간에서의 단백질의 발현이다. 일반적으로, 단백질을 주변 세포질로 지시하는 리더 서열은 발현될 단백질에 융합되어 있다. 이어서, 리더는 주변 세포질 내부에서 시그널 펩티다아제에 의해 제거된다. 주변 세포질-표적화 리더 서열의 예시에는, 펙테이트 라이아제 유전자 유래의 pelB 리더 및 알칼리성 포스파타아제 유전자 유래의 리더가 포함된다. 일부의 경우, 주변 세포질 발현은 발현되는 단백질의 배양 배지로의 누출을 가능케 한다. 단백질의 분비는 배양 상청액으로부터의 신속하고 단순한 정제를 가능케 한다. 분비되지 않는 단백질은 삼투성 세포용해에 의해 주변 세포질로부터 수득될 수 있다. 세포질 발현과 유사하게, 일부의 경우 단백질들은 불용성 및 변성체가 될 수 있고, 환원제는 가용화 및 리폴딩을 촉진하기 위해 이용될 수 있다. 유도 및 성장의 온도는 또한 발현 수준 및 용해도에 영향을 줄 수 있으며, 일반적으로 25℃ 내지 37℃ 의 온도가 이용된다. 일반적으로, 박테리아는 비-글리코실화 단백질을 생산한다. 따라서, 단백질이 기능을 위해 글리코실화를 필요로 하면, 글리코실화는 숙주 세포로부터의 정제 후 시험관내에서 추가될 수 있다.
b. 효모 세포
사카로마이세스 세레비시애 (Saccharomyces cerevisae), 쉬조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 야로위니아 리폴리티카 (Yarrowia lipolytica), 클루이베로마이세스 락티스 ( Kluyveromyces lactis) 및 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris) 와 같은 효모는, 본원에 기재된 임의의 것과 같은 단백질 제조용으로 이용될 수 있는 널리 공지된 효모 발현 숙주이다. 효모는 에피좀 복제 벡터를 이용하거나 또는 상동성 재조합에 의한 안정한 염색체 통합에 의해 형질전환될 수 있다. 일반적으로, 유도성 프로모터가 유전자 발현에 이용된다. 상기 프로모터의 예시에는, GAL1, GAL7 및 GAL5 및, 메탈로티오네인 프로모터, 예컨대 CUP1, AOX1 또는 기타 피키아 (Pichia) 또는 기타 효모 프로모터가 포함된다. 발현 벡터는 종종 형질전환된 DNA 의 선별 및 유지를 위한, LEU2, TRP1, HIS3 및 URA3 과 같은 선별가능한 마커를 포함한다. 효모에서 발현되는 단백질들은 종종 가용성이다. Bip 및 단백질 디설파이드 이소머라아제와 같은 샤페로닌과의 공동발현은 발현 수준 및 용해도를 개선할 수 있다. 추가로, 효모에서 발현되는 단백질은 사카로마이세스 세레비시애 유래의 효모 접합 타입 알파-인자 분비 시그널과 같은 분비 시그널 펩티드 융합 및 효모 세포 표면 단백질, 예컨대 Aga2p 접합 결합 수용체 또는 아륵술라 아데니니보란스 (Arxula adeninivorans) 글루코밀라아제와의 융합을 이용하여 분비에 대해 지시될 수 있다. 예컨대 Kex-2 프로테아제에 대한 프로테아제 절단 부위는, 분비 경로를 탈출할 때 발현되는 폴리펩티드로부터 융합된 서열들을 제거하도록 조작될 수 있다. 효모는 또한 Asn-X-Ser/Thr 모티프에서 글리코실화가 가능하다.
c. 곤충 세포
곤충 세포, 특히 바큘로바이러스 발현을 이용하는 것은, 히알루로니다아제 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드 발현에 유용하다. 곤충 세포는 높은 수준의 단백질을 발현하며, 고등 진핵세포에 의해 이용되는 대부분의 번역후 변형이 가능하다. 바큘로바이러스는 안전성을 개선하고 진핵세포 발현의 조절 염려를 줄이는 제한적 숙주 범위를 갖는다. 전형적인 발현 벡터는 바큘로바이러스의 폴리헤드린 프로모터와 같은, 높은 수준 발현을 위한 프로모터를 이용한다. 통상적으로 이용되는 바큘로바이러스 시스템에는, 바큘로바이러스, 예컨대 오토그라파 칼리포르니카 (Autographa californica) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (AcNPV), 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori) 핵 폴리헤드로시스 바이러스 (BmNPV) 및 곤충 세포주, 예컨대 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda), 슈달레티아 유니펑타 (Pseudaletia unipuncta) (A7S) 및 다나우스 프렉시푸스 (Danaus plexippus (DpN1) 로부터 유래한 Sf9 가 포함된다. 높은 수준 발현을 위해서는, 발현될 분자의 뉴클레오티드 서열이 바이러스의 폴리헤드린 개시 코돈의 하류에 바로 융합된다. 포유류 분비 시그널은 곤충 세포에서 정확하게 가공되며, 발현된 단백질을 배양 배지로 분비하기 위해 이용될 수 있다. 추가로, 세포주 슈달레티아 유니펑타 (Pseudaletia unipuncta) (A7S) 및 다나우스 플렉시푸스 (Danaus plexippus) (DpN1) 는 포유류 세포계와 유사한 글리코실화 패턴을 가진 단백질을 제공한다.
곤충 세포에서의 대안적인 발현 시스템은 안정하게 형질전환된 세포의 이용이다. Schneider 2 (S2) 및 Kc 세포 (드로소필라 멜라노개스테르 (Drosophila melanogaster)) 및 C7 세포 (아에데스 알보핑투스 (Aedes albopictus)) 와 같은 세포주들이 발현에 이용될 수 있다. 드로소필라 메탈로티오네인 프로모터는 카드뮴 또는 구리를 이용한 중금속 유도의 존재 하에 높은 수준의 발현을 유도하기 위해 이용될 수 있다. 발현 벡터는 일반적으로 네오마이신 및 히그로마이신과 같은 선별가능한 마커의 이용으로 유지된다.
d. 포유류 세포
포유류 발현계가 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드를 포함한 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물은 아데노바이러스와 같은 바이러스 감염에 의해 또는 리포좀, 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란과 같은 직접적인 DNA 이동에 의해, 그리고 전기천공 및 미세주사와 같은 물리적인 수단에 의해 포유류 세포로 이동될 수 있다. 포유류 세포용 발현 벡터는 일반적으로 mRNA cap 부위, TATA 박스, 번역 개시 서열 (Kozak 컨센서스 서열) 및 폴리아데닐화 요소를 포함한다. IRES 요소가 또한 추가되어, 선별가능한 마커와 같은 또다른 유전자와의 비시스트로닉 (bicistronic) 발현을 가능케 만들 수 있다. 상기 벡터는 종종 높은 수준 발현을 위한 전사 프로모터-인핸서, 예를 들어 SV40 프로모터-인핸서, 인간 싸이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 라우스 육종 바이러스 (RSV) 의 긴 말단 반복부위를 포함한다. 상기 프로모터-인핸서는 수많은 세포 유형에서 활성이다. 조직 및 세포-유형 프로모터 및 인핸서 영역이 또한 발현에 이용될 수 있다. 예시적인 프로모터/인핸서 영역에는, 이에 제한되지 않지만, 엘라스타아제 I, 인슐린, 면역글로불린, 마우스 유방 육종 바이러스, 알부민, 알파 태아단백질, 알파 1 안티트립신, 베타 글로빈, 수초 염기성 단백질, 미오신 경쇄 2, 및 성선자극성 방출 호르몬 유전자 컨트롤과 같은 유전자 유래의 것이 포함된다. 선별가능한 마커는 발현 구축물이 있는 세포를 선별 및 유지하기 위해 이용될 수 있다. 선별가능한 마커 유전자의 예시에는, 이에 제한되지 않으나, 히그로마이신 B 포스포트랜스퍼라아제, 아데노신 디아미나아제, 잔틴-구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라아제, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제, 디히드로폴레이트 리덕타아제 (DHFR) 및 티미딘 키나아제가 포함된다. 예를 들어, 발현은 DHFR 유전자를 발현하는 상기 세포만을 선별하기 위해 메토트렉세이트의 존재 하에 수행될 수 있다. TCR-ξ 및 FcεI-γ와 같은 세포 표면 신호전달 분자가 있는 융합체는 세포 표면 상의 활성 상태에서 단백질의 발현을 지시할 수 있다.
마우스, 랫트, 인간, 원숭이, 닭 및 햄스터 세포를 포함한 수많은 세포주들이 포유류 발현에 이용가능하다. 예시 세포주에는, 이에 제한되지 않으나, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, 마우스 NS0 (비분비성) 및 기타 골수종 세포주, 하이브리도마 및 헤테로하이브리도마 세포주, 림프구, 섬유아세포, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, 및 HKB 세포가 포함된다. 세포주는 또한 세포 배양 배지로부터의 분비된 단백질의 정제를 촉진하는 무혈청 배지를 채택해 이용가능하다. 예시에는, CHO-S 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA, 카탈로그 번호 11619-012) 및 무혈청 EBNA-1 세포주 (Pham 등, (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.) 가 포함된다. 최대 발현을 위해 최적화된 특별한 배지에서 성장하도록 적응된 세포주가 또한 이용가능하다. 예를 들어, DG44 CHO 세포는 화학적으로 규정된, 동물 생성물이 없는 배지에서의 현탁 배양물 중에서 성장하도록 적응시킨다.
e. 식물
트랜스제닉 식물 세포 및 식물이 임의의 본원에 기재된 바와 같은 단백질 발현에 이용될 수 있다. 발현 구축물들은 일반적으로 미세입자투사법 및 원형질체 내로의 PEG-매개 이동과 같은 직접적인 DNA 이동, 및 아그로박테리아-매개성 형질전환을 이용하여 식물에 이동된다. 발현 벡터는 프로모터 및 인핸서 서열, 전사 종결 인자 및 번역 조절 인자를 포함할 수 있다. 발현 벡터 및 형질전환 기법은 일반적으로 쌍자엽식물(dicot) 숙주, 예컨대 아라비돕시스 (Arabidopsis) 및 담배, 및 단자엽식물(monocot) 숙주, 예컨대 옥수수 및 쌀로 분류된다. 발현에 이용되는 식물 프로모터의 예시에는, 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터, 노팔린 신타아제 프로모터, 리보오스 비스포스페이트 카르복실라아제 프로모터 및 유비퀴틴 및 UBQ3 프로모터가 포함된다. 히그로마이신, 포스포만노오스 이소머라아제 및 네오마이신, 포스포트랜스퍼라아제와 같은 선별가능한 마커가 종종, 형질전환된 세포의 선별 및 유지 촉진에 이용된다. 형질전환된 식물 세포들은 세포, 응집물 (캘러스 조직) 로서 배양 중에 유지될 수 있거나 또는 전체 식물로 재생성될 수 있다. 트랜스제닉 식물 세포는 또한 히알루로니다아제 폴리펩티드를 생산하도록 조작된 조류 (algae) 를 포함할 수 있다. 식물은 포유류 세포와는 상이한 글리코실화 패턴을 갖기 때문에, 이는 상기 숙주들에서 생산되는 단백질의 선택에 영향을 줄 수 있다.
3. 정제 기법
가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드 또는 기타 단백질들을 포함하는 폴리펩티드의 숙주 세포로부터의 정제 방법은 선택한 숙주 세포 및 발현계에 좌우될 것이다. 분비된 분자들에 대해서, 단백질은 일반적으로 세포 제거 후 배양 배지로부터 정제된다. 세포내 발현에 대해서, 세포는 세포용해될 수 있고 단백질은 추출물로부터 정제될 수 있다. 트랜스제닉 식물 및 동물과 같은 트랜스제닉 유기체가 발현에 이용된 경우, 조직 또는 장기가 세포용해 세포 추출물 제조를 위한 출발 재료로서 이용될 수 있다. 추가로, 트랜스제닉 동물 제조는 유즙 또는 난(卵) 중의 폴리펩티드의 제조를 포함하는데, 이는 수집될 수 있고, 필요한 경우, 당업계의 표준 방법을 이용하여 단백질을 추출하고, 추가로 정제될 수 있다.
단백질, 예컨대 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드는, 이에 제한되지 않으나, SDS-PAGE, 크기 분획 및 크기 배제 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 침전 및 이온 교환 크로마토그래피, 예컨대 음이온 교환을 포함하는 당업계에 공지된 표준 단백질 정제 기법을 이용하여 정제될 수 있다. 친화성 정제 기법도 제제의 효율 및 순도 개선을 위해 이용될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다아제 효소에 결합하는 항체, 수용체 및 기타 분자들이 친화성 정제에 이용될 수 있다. 발현 구축물이 또한 myc 에피토프, GST 융합체 또는 His6 와 같은 단백질에 대한 친화성 태그를 부가하도록 조작되거나 또는 myc 항체, 글루타티온 수지 및 Ni-수지를 이용하여 각각 친화성 정제될 수 있다. 순도는 겔 전기영동 및 염색 및 분광계 기법을 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 평가될 수 있다.
F. 면역 글로불린 및 가용성 히알루로니다아제 폴리펩티드의 제조, 제제화 및 투여
본원에서 제공된 것은 액상제제에서 적어도 6개월의 장기간 동안 32℃까지의 온도, 예를 들어, 약 0℃ 내지 32℃에서 안정한 IG 및 히알루로니다아제의 복합제제이다. IG 및 히알루로니다아제의 활성을 유지하는 동안, 증가된 안정성은 개선된 저장 기간, 감소한 절단, 감소한 응집형성, 감소한 이량체 형성 또는/및 감소한 변색으로 특징지어진다. 이러한 복합제제는 추가적인 재구성 및/또는 추가적인 희석에 대한 어떠한 요구 없이 "바로 사용 가능한" 액상 제제로 제공될 수 있다. 상기의 결과적인 안정한 복합제제는 의사나 환자에게 직접 주입 또는 투여 제제으로 용이하게 제공될 수 있다. 예를 들어, 복합제제는 집이나 임의의 장소에서 주입 또는 투여될 수 있다.
면역 글로불린과 복합제제를 이루는 가용성 히알루로니다아제는 면역 글로불린의 생체이용률을 높여 신체 내 원하는 곳으로의 면역 글로불린의 증가된 이동을 허용한다. 따라서, 복합제제는 통상적인 피하 투여법에 비해, 피하 투여 후 면역 글로불린의 상승되고/되거나 더욱 신속하게 달성되는 농도를 달성하여 예를 들어 주어진 투여량에 대해 더욱 강력하고/하거나 더욱 신속한 응답성을 제공할 수 있다. 추가적으로, 가용성 히알루로니다아제를 함유하는 IG의 복합제제는 더 적은 IG 투여량으로도 주어진 응답성이 달성되도록 하는데 이용될 수 있다. 주사 또는 주입 부위 및 그 부근에서의 벌크 액체 유동을 증강시키는 가용성 히알루로니다아제의 능력은 또한 연합된 약리학적 전달의 다른 측면들을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 벌크 액체 유동의 증가는, 주입되는 액체 부피가 주사 부위로부터 더욱 쉽게 분산되도록 보조할 수 있다 (잠재적 고통 또는 주사의 다른 부작용 결과를 감소시킴). 이는 피하 주입물이 더 많은 투여량으로 투여될 수 있도록 하여 특히 중요하다. 증가된 생체이용률에 추가하여, IG 의 가용성 히알루로니다아제와의 복합제제화는 통상적인 정맥내 투여 경로보다도 더욱 안전하고 더욱 편리한 투여를 제공한다.
본원에서 제공된 복합제제는 다양한 온도를 포함하여, 장기간 동안 안정하다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제제는 안정하고 IG 및 히알루로니다아제의 활성을 32℃까지의 온도에서 적어도 6개월 동안 유지한다. 예를 들어, 복합제제는 "냉장"온도, 예를 들어, 약 4℃와 같은, 2℃ 내지 8℃에서, 1년 내지 2년과 같은, 적어도 6개월 내지 4년간, 예를 들어, 적어도 6개월, 적어도 1년, 적어도 2년, 적어도 3년 또는 적어도 4년 또는 그 이상 안정하다. 또다른 예에서, 복합제제는 안정하고 실온, 예를 들어 18℃ 내지 32℃, 18℃ 내지 32℃와 같은, 일반적으로는 18℃ 내지 32℃에서, 적어도 6개월 내지 1년, 예를 들어 6개월, 적어도 7개월, 적어도 8개월, 적어도 9개월, 또는 적어도 1년 또는 그 이상 활성을 유지한다.
특히, 상기 안정한 복합제제는 저장 이후 지정된 기간에서 측정되지 않는 낮은 수준의 IG 응집 및/또는 단편를 나타낸다. 응집 및 단편을 평가하는 방법은 당업자에게 공지되어 있으며, 하기 섹션 G에 예시로 나타나있다. 일반적으로, HPSEC 또는 다른 방법으로 측정했을 때, 상기 언급된 바와 같이 저장 이후 지정된 기간에서, 0.5% 내지 5% 이하의 IG, 예를 들어, 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하 및 일반적으로 0.5% 이하의 복합제제 내 IG가 응집한다.
추가적으로, 본원에서 제공된 안정한 복합제제의 IG 및 히알루로니다아제는 저장에 앞선 IG 및 히알루로니다아제의 최초의 활성을 하나 또는 그 이상 유지한다. 하나의 공지기술은 IG 및 히알루로니다아제의 활성과 유사하며 이러한 활성은 평가될 수 있다. 섹션 G는 예시적 활성 및 활성을 평가하는 실험을 제공한다. 전형적으로, 본원에서 제공된 안정한 액체 복합제제는 저장 이후 적어도 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 또는 그 이상의, 일반적으로는 적어도 70% 내지 95%의 저장 이전의 단백질 최초의 활성을 유지한다. 예를 들어 안정한 액체 복합제제는 저장 이후 70% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상, 또는 99.5% 이상의 저장 이전의 각각의 단백질의 최초 활성을 유지한다.
1. 제형 및 투여량
본원에서 제공된 복합제제는 액체로 제제화되었다. 복합제제는 면역 글로불린, 히알루로니다아제를, 적어도 0.05 M의 염화 알칼리 금속염, 예를 들어, 적어도 0.05 M의 염화나트륨(NaCl 또는 소금) 또는 0.05 M의 염화칼륨(KCl)과 함께 함유한다. 복합제제의 pH 또한 응집을 제한하고 IG 및 히알루로니다아제의 활성을 유지할 수 있도록 조절된다. 일부 예에서, 복합제제는 물 또는 적절한 용제 이외의 다른 재료를 함유하지 않는다. 또다른 예에서, 복합제제는 나아가 희석제, 캐리어 또는 다른 첨가제를 함유한다.
일반적으로, 화합물들은 당업계에 널리 공지된 기법 및 과정을 이용하여 약제학적 조성물로 제제화된다 (참고문헌은, 예를 들어, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126). 약제학적으로 허용되는 조성물은 동물 및 인간에서의 사용을 위해 일반적으로 인식되는 약전에 따라 제조되는, 관리 기관 또는 기타 기관을 위한 승인을 고려하여 제조된다. 제형은 투여 모드에 맞춰져야 한다.
복합제제는 용액, 시럽 또는 현탁액과 같은 액상의 약제학적 제제로 제공될 수 있다. 액체 형태일 때, 약제학적 제제는 사용 전에 치료적으로 유효한 농도로 희석되는 농축 제제로 제공될 수 있다. 상기 액체 제제는 약제학적으로 허용되는 첨가제, 예컨대 현탁제 (예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소첨가된 섭취가능한 지방); 에멀전화제 (예를 들어, 레시틴 또는 아카시아); 비수성 비히클 (예를 들어, 아몬드 오일, 오일성 에스테르 또는 분획화된 식물성 오일); 및 보존제 (예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-히드록시벤조에이트 또는 소르브산) 를 이용하여 통상적인 수단으로 제조될 수 있다. 또다른 예에서, 약제학적 제제는 사용 전에 물 또는 기타 적합한 비히클을 이용한 재구성을 위한 동결건조된 형태로 제시될 수 있다.
본원에서 제공된 안정한 복합제제의 pH는 섹션 G에서 기술한 바와 같이 복합제제의 IG가 비응집 및/또는 IG 및 히알루로니다아제의 활성 유지시킨다. 최적 pH는 당업자에게 공지된 제제화 기법으로 얻어질 수 있다. 예를 들어, 최적 pH는 응집 및 활성을 평가함으로써 결정될 수 있다. 예를 들어, 최적 pH는 서로 다른 pH 조건 하에서 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, 섹션 G에서 기술된 방법을 사용하여 응집 및 활성을 평가하여 결정될 수 있다. 이러한 실험 또는 평가는 크기배제크로마토그래피, HSPEC 측정, 열안정성 데이터, 다양한 제제의 항보체 역가 및/또는 히알루로니다아제 활성 평가를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 본원에서 제공된 복합제제 내에서 pH는 복합제제의 농축된 용액 내에서 측정시 4.0 내지 8.0의 범위에 이를 수 있다. 그러나 일반적으로, 최대 단량체 함유를 보장하기 위해서 이런 범위에서, 낮은 pH가 선호된다. 이러한 이유로, 본원에서 제공된 복합제제는 전형적으로 적어도 약 4.0 내지 7.4, 일반적으로 적어도 약 4.0 내지 6.0, 그리고 전형적으로 4.4 내지 4.9의 pH를 가진다. 언급된 바와 같이, 지시된 pH는 복합제제의 농축된 용액에서 측정된다. pH는 산화제를 이용하여 더 낮게 또는 알킬화제를 이용하여 더 높게 조절 가능하다. 산화제의 예시는 아세트산, 시트르산, 염산, 제일인산나트륨 및 인산을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 알킬화제의 예시는 제이인산나트륨용액, 탄산나트륨 또는 수산화나트륨을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
임의의 완충제가 그것이 복합제제의 안정성에 상반되는 효과를 나타내지 않고, 필요한 pH 범위를 만드는 한 본원에서 제공된 액체 제제의 제조에 사용될 수 있다. 특정 적절한 완충제의 예시는 석시네이트, 아세테이트, 포스페이트 완충제, 시트레이트, 아코니테이트, 말레이트 및 카보네이트를 포함한다. 그러나 당업자는 본원에서 제공된 제제는 완충제가 수용가능한 pH 안정성을 제공하는 한, 또는 지시된 범위 내의 "완충 용량(buffer capacity)"인 한 특정 완충제에 국한되지 않는다는 것을 인식할 것이다. 일반적으로, 완충제는 그 pK의 약 1pH 유닛 정도의 적절한 완충 용량을 가진다(Lachman et al. 1986). 완충 안정성은 알려진 pK 도표에 기초하여 또는 당업계에 잘 알려진 방법에 의해 경험적으로 측정될 수 있다. 용액의 pH는 상기 기술된 범위 내로, 예를 들어 임의의 허용가능한 산 또는 염기를 이용하여 조절 가능하다.
a. 면역 글로불린
복합제제의 IG는 약 5% 내지 22% w/v, 예를 들어, 약 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 120 mg/mL, 150 mg/mL, 180 mg/mL, 200 mg/mL, 220 mg/mL, 250 mg/mL 또는 그 이상의 농도로 제공된다. 일반적으로, 복합제제 내의 IG는 적어도 10 % (100 mg/mL) 내지 20 % (200 mg/mL), 예를 들어, 10 %, 11 %, 12 %, 13 %, 14 %, 15 %, 16 %, 17 %, 18 %, 19 %, 20 % 또는 그 이상의 양으로 제공된다.
본원에서 제공된 면역 글로불린 제제는 단일 또는 복수 투여량 투여용의 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. 전형적으로, 본원의 다른 문단에서 언급된 바와 같이, 복합제제의 IG는 추가적인 희석이 필요없이 바로 사용 가능한 양으로 제제화된다. 복합제제가 단일 또는 복수 투여량 제제인지에 따라, 당업자는 복합제제 내의 IG의 정확한 양을 경험적으로 측정할 수 있다.
일반적으로, 면역 글로불린은 특정 투여법에 따른 치료적으로 효과적인 양으로 제공된다. 치료적 유효 농도는, 공지된 시험관내 및 생체내 시스템에서, 예컨대 본원에 기재된 검정으로 화합물들을 시험하여 경험적으로 결정될 수 있다. 조성물 내 선별된 면역 글로불린의 농도는 복합체의 흡수, 불활성화 및 배설률, 복합체의 물리화학적 특징, 투여량 계획 및 투여되는 양뿐만 아니라 당업자에게 공지된 기타 요인들에 좌우된다. 예를 들어, 정확한 투여량 및 치료 기간은 치료할 조직의 함수이고, 공지된 시험 프로토콜을 이용하여 또는 생체내 또는 시험관내 시험 데이터의 외삽으로 결정될 수 있다는 점이 이해될 것이다. 농도 및 투여량 값은 또한 치료할 개인의 연령에 따라 가변적일 수 있다는 점이 이해될 것이다. 또한, 임의의 특별한 대상체에 대해서, 개인의 요구 및 제형물의 투여 또는 투여를 관장하는 실무자의 전문적인 판단에 따라 특이적 투약요법이 조정되어야 하며, 본원에 제시된 농도 범위는 오직 예시이고 그의 범위를 제한하고자 하는 의도가 아님이 이해될 것이다. 질환 또는 상태, 예를 들어 IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료를 위해 투여될 선별된 면역 글로불린 제제의 양은, 표준 임상 기법으로 결정될 수 있다. 추가로, 시험관내 검정 및 동물 모델이 최적 투여량 범위를 밝히는 것을 보조하기 위해 채용될 수 있다. 따라서, 정확한 투여량은, 경험적으로 결정될 수 있고, 특별한 면역 글로불린 제제, 가용성 히알루로니다아제를 이용하는 투약 처방 및 투여량, 투여 경로, 치료할 질환의 유형 및 질환의 중증도에 좌우될 수 있다.
예를 들어, IG 제제는 특정 IG-치료가능한 질환 및 상태를 위한 현재 정맥내(IVIG) 제제가 제조 및 투여되는, 투약 처방을 달성하기 위해서 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. 공지 기술 중 하나는 특정 질환 또는 상태의 IVIG 투여를 위한 투약 처방과 비슷하다. 예를 들어, 하기 섹션 H는 특정 질환 또는 상태를 위한 IG의 예시적 투약처방을 제공한다. 다른 투약 처방은 당업자에게 공지되어 있다. 필요하다면, 특정 투여량 및 지속기간 및 치료 프로토콜은 경험적으로 결정 또는 외삽 가능하다.
예를 들어, 정맥내 투여된 면역글로불린의 예시적 투여량은 적절한 투여량을 결정하기 위한 시작점으로 사용 가능하다. 투여 수준은 개인의 몸무게, 일반적인 건강, 나이, 특정 화합물이 관여하는 활성, 성별, 식이, 투여 시간, 및 질환에 대한 환자의 성향 및 치료하는 의사의 판단에 기초하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 면역 글로불린의 투여량은 약 kg 몸무게당 100 mg(즉, 100 mg/kg BW) 내지 2 g/kg BW이다. 투여할 양이 치료된 지표, 그리고 견디게 될 가능한 부작용의 기능을 하리라고 이해된다. 투여량은 각각의 질환에 대해 알려진 모델을 사용하여 경험적으로 결정할 수 있다.
하나의 예에서, 치료될 특정 표지를 위한 IG는 매월 투여하는 IV 투여량과 같은 피하내 투여를 허용하는 양으로 제공된다. 이러한 예에서, 면역 글로불린 제제는 매월 1 회 투여량을 제공하기에 충분한 양의 단일 투여량 투여용으로 제제화되나, 다중 투여량 투여를 위해 더 적은 양으로 제공될 수 있다. 예를 들어, IG 제제의 매월 1 회 투여량을 매일, 매주, 2 주마다, 또는 매월 1 회 투여할 수 있다. 투약요법은 수개월 또는 수년간 계속될 수 있다. 특별한 매월 1 회 IV 투여량은 치료할 질환의 함수이고, 따라서 가변적일 수 있다.
IG 의 피하 투여를 위한 예시적인 투여량 범위는, 약 또는 1 그램 (g), 5g, 10g, 20g, 30g, 40g, 50g, 60g, 70g, 80g, 90g, 100g 또는 200g 이다. 그의 특별한 투여량 및 제형물은 적응증 및 개인에 좌우된다. 예를 들어, 투여량은 50 mg/kg 체중 (BW) 내지 600 mg/kg BW, 예컨대, 100 mg/kg BW, 200 mg/kg BW, 300 mg/kg BW, 400 mg/kg BW, 500 mg/kg BW, 600 mg/kg BW, 또는 그 이상으로 투여될 수 있다. 필요한 경우, 투여량은 경험적으로 결정될 수 있다. 상기 투여량을 달성하기 위해, 피하 투여되는 IG 제제의 부피는 약 또는 10 mL 내지 700 mL, 예컨대, 100 mL 내지 500 mL, 200 mL 내지 400 mL 일 수 있다. 예를 들어, 단일 투여량 투여를 위한 피하내 투여된 IG-함유 복합제제의 용량은 약 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml 또는 그 이상일 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 표지를 위한 10% 액체 IG 복합제제(100 mg/ml)는 20 g 내지 70 g IG의 단일 투여량을 달성하기 위하여 200 ml 내지 700 ml의 용량으로 투여가능하다. 또다른 예에서, 20% 액체 IG 복합제제(200 mg/mL)는 유사한 20 g 내지 70 g IG의 단일 투여량을 달성하기 위하여 100 mL 내지 350 mL의 용량으로 투여가능하다. 언급된 바와 같이, IG는 복합제제에서 복수 투여량 투여를 위해 더 적은 양으로 제공될 수 있다.
b. 히알루로니다아제
선택된 히알루로니다아제, 특히 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어, rHuPH20는, 약 50 U/mL 내지 300 U/mL, 예를 들어 50 U/ml, 75 U/mL, 100 U/ml, 150 U/ml, 200 U/ml, 300 U/mL, 400 U/ml 또는 500 U/ml, 전형적으로는 적어도 100 U/mL 내지 300 U/mL, 일반적으로는 75 U/mL 내지 350 U/mL의 농도로 복합제제에 포함된다. 원한다면, 히알루로니다아제는 더욱 농축된 형태, 예를 들어 1000 U/ml, 1500 Units/ml, 2000 U/ml, 4000 U/ml 또는 5000 U/ml와 같이, 약 1000 U/mL 내지 5000 U/mL로 제공될 수 있다.
복합제제 내의 히알루로니다아제는 단일 또는 복수 투여량 투여를 위한 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. IG에서 언급된 바와 같이, 복합제제 내의 히알루로니다아제는 전형적으로 추가적인 희석 없이 바로 사용 가능한 양으로 제제화된다. 제제가 단일 또는 복수 투여량 형태인지에 따라, 당업자는 복합제제에 포함된 히알루로니다아제의 양을 경험적으로 결정할 수 있다.
일반적으로, 선택된 히알루로니다아제, 특히 가용성 히알루로니다아제, 예를 들어, rHuPH20은 치료할 환자에서 바람직하지 않은 부작용없이 IG 의 치료적으로 유용한 효과를 발휘하기에 충분한 양으로 포함된다. 치료적 유효 농도는, 본원에 제공되거나 또는 당업계에 공지되어 있는 검정을 이용하여 공지된 시험관내 및 생체내 시스템에서 폴리펩티드를 시험하여 경험적으로 결정될 수 있고 (참고문헌은, 예를 들어, Taliani 등 (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo 등 (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo 등 (1996) Antiviral Res. 32: 9-18; Buffard 등 (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi 등 (1996) Anal. Biochem., 237: 239-244; Hamatake 등 (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler 등 (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza 등 (1995) J Gen. Virol., 76:1729-1736; Takeshita 등 (1997) Anal. Biochem., 247:242-246; 참고문헌으로는 또한, 예를 들어, Shimizu 등 (1994) J. Virol. 68:8406-8408; Mizutani 등 (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani 등 (1996) Biochem. Biophys. Res. Commun., 227:822-826; Lu 등 (1996) Proc. Natl. Acad. Sci (USA), 93:1412-1417; Hahm 등, (1996) Virology, 226:318-326; Ito 등 (1996) J. Gen. Virol., 77:1043-1054; Mizutani 등 (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun., 212:906-911; Cho 등 (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207, 이후 인간에 대한 투여량에 대해서는 그로부터 외삽한다.
예를 들어, 치료적 유효 투여량은 약 또는 500 유닛 내지 500,000 유닛, 예를 들어, 1000 유닛 내지 100,000 유닛의 히알루로니다아제이다. 예를 들어, 히알루로니다아제는 약 또는 500 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 10,000 유닛, 30,000 유닛, 40,000 유닛, 50,000 유닛, 60,000 유닛, 70,000 유닛, 80,000 유닛, 90,000 유닛, 100,000 유닛 또는 그 이상으로 피하 투여될 수 있다. 히알루로니다아제는 언급된 바와 같이, 복합제제의 복수 투여량 투여용으로는 더 적은 양으로도 제공될 수 있다.
일부 예에서, 투여량은 투여되는 비율 IG 로 제공될 수 있다. 예를 들어, 히알루로니다아제는 10 U/그램 내지 2000 U/g 또는 그 이상의 IG, 예를 들어 약 또는 10 U/g, 20 U/g, 30U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 250U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g, 1000 U/g, 1500 U/g, 2000 U/g, 3000 U/g 또는 그 이상 투여될 수 있다. 일반적으로, 복합제제 제품에 있어 IG에 대한 히알루로니아다아제의 비율은 같은 제품(IG 및 히알루로니다아제)일때 및 예를 들어, 리딩 에지(Leading Edge) 투여와 같이 같은 양의 IG가 피하내로 개별적으로 투여되었을때의 비율보다 높다. 따라서, 일반적으로 비율은 적어도 약 100 U/g, 그리고 일반적으로 250 U/g 또는 그 이상, 예를 들어 250 U/g 내지 1000 U/g와 같이 100 U/g 내지 3000 U/g IG, 그리고 특히 500 U/g IG와 같이 250U/g to 750 U/g이다. 예를 들어, 20% IG (200 mg/mL)로 복합제제화될 때, 100 U/mL의 히알루로니다아제를 함유하는 복합제제가 약 500 U/g IG의 비율로 제공된다. 전형적으로, 피하내 투여된 용량은 약 10 mL 내지 700 mL, 예를 들어 단일 투여량 투여에서는 100 mL 내지 400 mL일 수 있다. 예를 들어, 피하내 단일 투여량 투여인 경우, 투여된 용량은 약 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600 ml, 700 ml 또는 그 이상일 수 있다.
c. 염화 알칼리 금속염
본원에서 제공된 복합제제는 적어도 0.05 M의 염화 알칼리 금속염을 함유한다. 염화 알칼리 금속염은 염화나트륨(NaCl) 또는 염화칼륨(KCl)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 염화 알칼리 금속염, 예를 들어 NaCl 또는 KCl은, 히알루로니다아제의 안정성과 활성을 유지하기 위해 제공된다. 정확한 염의 양은 당업자에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 예를 들어, 제제 내의 염의 양은 당업자에게 공지된 다양한 방법을 이용한 서로 다른 염 조건에서 응집 및 활성을 평가 예를 들어, 섹션 G의 방법으로 결정될 수 있다. 전형적으로, 본원에서 제공된 복합제제에는, 염화나트륨이 약 0.05 M 내지 0.3 M의 양, 예를 들어, 약 0.05M, 0.06 M, 0.07 M, 0.08 M, 0.09 M, 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M 또는 그 이상으로 제공된다. 전형적으로, 염의 양은 0.05 M 내지 0.25 M 사이, 예를 들어 0.15 M이다.
d. 아미노산 안정화제
본원에서 제공된 복합제제는 제제의 안정성에 기여하는 아미노산 안정화제를 함유한다. 안정화제는 비-이온성 및 염기성 아미노산일 수 있다. 비-극성 및 염기성 아미노산의 예시는 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 및 프롤린을 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 예를 들어, 아미노산 안정화제는 글리신 또는 프롤린, 전형적으로는 글리신이다. 안정화제는 단일 아미노산이거나 2 또는 그 이상 아미노산의 조합일 수 있다. 아미노산 안정화제는 천연 아미노산, 아미노산 유사체, 변형 아미노산 또는 아미노산 등가물일 수 있다. 일반적으로, 아미노산은 L-아미노산이다. 예를 들어, 프롤린이 안정화제로 사용될 경우, 이는 일반적으로 L-프롤린이다. 아미노산 등가물, 예를 들어, 프롤린 유사체를 사용하는 것도 가능하다.
일반적으로, 단량체 형태에서 면역 글로불린을 유지하는 효과적인 하나 또는 그 이상의 아미노산의 양이 용액에 첨가된다. 아미노산 안정화제의 농도, 예를 들어 0.1 M 내지 1 M 범위의 아미노산의 액체 복합제제에 포함된 글리신은, 전형적으로 0.1 M 내지 0.75 M, 일반적으로 0.2M 내지 0.5M, 예를 들어, 적어도 약 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.75 M 또는 그 이상이다. 예를 들어 글리신 같은 아미노산은 염산, 염화브로마이드, 설페이트, 아세테이트 등과 같은 제약학적으로 허용가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 예를 들어 글리신과 같은 아미노산의 순도는 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 적어도 99.5% 또는 그 이상이 되어야 한다.
e. 기타 첨가제
선택적으로, 히알루로니다아제 또는 IG 가 투여되는 복합제제는 담체, 예컨대 희석제, 아쥬반트, 부형제 또는 비히클을 포함할 수 있다. 적합한 약제학적 담체의 예시는, E. W. Martin 의 "Remington's Pharmaceutical Sciences" 에 기재되어 있다. 상기 조성물은, 적합한 양의 담체와 함께 일반적으로 정제된 형태 또는 부분적으로 정제된 형태의, 치료 유효량의 화합물을 포함하여, 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공할 것이다. 상기 약제학적 담체는 멸균 액체, 물 및 석유, 동물, 땅콩 오일, 대두 오일, 미네랄 오일 및 참기름과 같은 식물 또는 합성 기원의 것을 포함하는, 오일일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우, 물이 전형적인 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액은 또한 특히 주사용 용액은 액체 담체로서 채용될 수 있다.
예를 들어, 비경구용 제제에 사용되는 약제학적으로 허용되는 담체에는, 수성 비히클, 비수성 비히클, 항미생물제, 등장화제, 완충제, 산화방지제, 국소 마취제, 현탁 및 분산제, 에멀전화제, 금속봉쇄 또는 킬레이트화제 및 기타 약제학적으로 허용되는 물질이 포함된다. 수성 비히클의 예시에는, 염화나트륨 주사제, 링거 주사제, 등장성 덱스트로스 주사제, 멸균수 주사제, 덱스트로스 및 락테이트화 링거 주사제가 포함된다. 비수성 비경구 비히클에는 식물 기원의 고정된 오일, 면실유, 옥수수유, 참기름 및 땅콩 오일이 포함된다. 정균 또는 정진균 농축물 중의 항미생물제는, 페놀 또는 크레졸, 메르쿠리알, 벤질 알코올, 클로로부탄올, 메틸 및 프로필 p-히드록시벤조산 에스테르, 티메로살, 벤즈알코늄 클로라이드 및 벤즈에토늄 클로라이드를 포함하는, 다중-투여량 용기에 포장된 비경구 제제에 첨가될 수 있다. 등장화제에는 염화나트륨 및 덱스트로스가 포함된다. 완충제에는 포스페이트 및 시트레이트가 포함된다. 산화방지제에는 나트륨 비설페이트가 포함된다. 국소 마취제에는 프로케인 히드로클로라이드가 포함된다. 현탁 및 분산제에는 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 히드록시프로필 메틸셀룰로스 및 폴리비닐피롤리돈이 포함된다. 에멀전화제에는 폴리소르베이트 80 (TWEENs 80) 가 포함된다. 금속 이온의 금속봉쇄제 또는 킬레이트화제에는 EDTA 가 포함된다. 약제학적 담체는 또한 수혼화성 비히클용의 에틸 알코올, 폴리에틸렌 글리콜 및 프로필렌 글리콜, 및 pH 조정용의 수산화나트륨, 염산, 시트르산 또는 락트산을 포함한다.
조성물은 활성 성분과 함께 다음과 같은 것: 희석제, 예컨대 락토오스, 수크로스, 디칼슘 포스페이트 또는 카르복시메틸셀룰로스; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트 및 탈크; 및 결합제, 예컨대 전분, 천연 검, 예컨대 검 아카시아젤라틴, 글루코스, 당밀, 폴리비닐피롤리딘, 셀룰로스 및 이들의 유도체, 포비돈, 크로스포비돈 및 당업자에게 공지된 기타 상기 결합제를 포함할 수 있다.
예를 들어, 첨가제 단백질은 제약학적으로 허용가능한 단백질 또는 펩타이드의 임의의 숫자만큼 복합제제에 첨가될 수 있다. 일반적으로 첨가제 단백질은 면역 반응을 유발하지 않고 포유류에 투여되는 능력으로 선택된다. 예를 들어, 인간 혈청 알부민은 약제학적 제제에 사용하기에 적당하다. 다른 알려진 약제학적 부형제는 전분, 글루코스, 락토오스, 수크로스 젤라틴, 엿기름, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카 겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 전지분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물 및 에탄올를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 첨가제는 이를 운반하는 용기 또는 바이알에 흡수되는 것을 막기에 충분한 제제에 포함된다. 첨가제의 농도는 첨가제의 성질 및 복합제제 내의 단백질 농도에 따라 달라질 것이다.
원하는 경우, 조성물은 또한 미량의 습윤제 또는 에멀전화제, 또는 pH 완충제, 예를 들어 아세테이트, 나트륨 시트레이트, 시클로덱스트린 유도체, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 나트륨 아세테이트, 트리에탄올아미노 올레에이트, 및 기타 상기 제제들을 포함할 수 있다.
2. 투여 형태
본원에서 제공된 복합제제는 단일 또는 복수 투여량 투여용으로 제제화될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 제공된 복합제제가 장기간 안정해짐에 따라, 복합제제는 복수 투여량으로 수일, 수주, 수개월 또는 수년에 걸쳐 투여할 수 있게 되었다. 따라서, 액체 복합제제는 유닛 투여량으로 제조될 수 있다. 약제학적으로 활성을 가지는 화합물의 농도는 주입에 의해 원하는 약리학적 효과를 만들기 위한 효과적인 농도로 제공되도록 조절된다. 예를 들어, 각각의 단위 투여량은, 필요한 약제학적 담체, 비히클 또는 희석제와 함께, 원하는 치료 효과를 제공하기에 충분한 예정된 양의 치료용 활성 화합물을 포함한다. 정확한 투여량은 공지된 바와 같이 나이, 체중 및 환자 또는 동물의 상태에 의존한다.
유닛 투여 형태는 부분 또는 복수의 부분으로 투여 가능하다. 복수의 투여 형태는 분리된 유닛 투여 형태로 투여되기 위한 복수의 단일 용기에 포장된 동일한 유닛 투여량 형태이다. 이에 따라, 복수 투여 형태는 포장에서 분리되지 아니한 복수의 유닛 투여형태이다.
단위-투여량 비경구 제제는 앰플, 바이알 또는 바늘이 있는 주사기에 포장된다. 약제학적 활성 화합물을 포함하는 액체 용액 또는 재구성된 분말 제제의 부피는, 치료할 질환 및 포장용으로 선택한 특별한 제조품의 함수이다. 비경구 투여를 위한 모든 제제들은 당업자 및 실무자에게 공지된 바와 같이 멸균성이어야 한다. 복수투여량 제제로 제공된 경우, 제제는 세균 발육 저지제를 함유하고 있을수 있다.
3. 투여
전형적으로 본원에서 제공된 복합제제 조성물은 예를 들어, 피하내 경로와 같은 비경구 투여용으로 제제화된다. 히알루로니다아제와 복합제제로 이용되는 IG의 증가된 생체이용률로 인해, 면역 글로불린은, 현재 정맥내 주사(IVIG) 제제가 제조 및 투여되는 투여량 및 빈도로 피하 투여될 수 있다. IG 의 현재 피하 내 주사 제형에 장점은, 병용-제제화된 히알루로니다아제/IG 가, 더욱 선호될 수 있는 투약요법, 예를 들어 더 적은 빈도의 투여량을 제공할 수 있다는 점이다. 덜 빈번하거나 더 적은 투여량으로, 독성과 연합된 부작용이 감소될 수 있다. 일반적으로, 피하 IG 요법의 약물동력학 및/또는 약력학이 개선된다. 추가로, IG 의 피하 투여는 또한 현재의 정맥내 주입을 넘어선 장점을 갖는다. 예를 들어, 피하 주입은 숙련된 간호사에 반대하여 환자 또는 가족에 의한 주입이 허용되고; 통상적인 IVIG 요법에 대해서는 5 내지 10 시간이 걸리는 것에 비해 IG 가 1 내지 3 시간 내에 주입되어 주입이 더욱 빠른 속도로 달성될 수 있고; 기능 정맥(functional vein)에 대한 필요가 없고; 혈전증, 두통, 혈전정맥염 및 오심과 같은 주입 관련 부작용이 없고, 부작용 발생 가능성이 더 낮고; 주입이 가정에서 또는 어느 곳에서든 수행될 수 있다.
피하내 투여는 또한 히알루로니다아제가 투여될 때 피부 또는 조직의 간극에 도달하는 것을 보장하여, 면역글로불린의 차후 간극내 공간으로의 운송을 줄이는바 선호된다. 따라서, 피하내 투여 방법과 같은, 피부 저변으로의 직접 주입을 꾀할 수 있다.
투여는 치료의 위치에 따라, 국소, 국부 또는 전신적일 수 있다. 치료를 필요로 하는 영역으로의 국소적인 투여는 예를 들어, 국소 주입, 국소 처리, 예를 들어, 수술 이후의 붕대처리와 함께, 카테터에 의한 주입으로, 좌약으로, 또는 이식으로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 국소 적용은 바늘과 같은 주입 장치를 가지는 주사기 또는 다른 제조물 등에 의한 주입으로 달성된다. 또다른 예에서, 국소 적용은 펌프 또는 다른 유사한 장치를 사용하여 실시할 수 있는 주입에 의하여 달성될 수 있다.
투여의 다른 형태도 실시할 수 있다. 약제학적 조성물은 각각의 투여 경로에 적절한 투여 형태로 제제화될 수 있다. 임의의 주어진 상황에서 가장 적절한 경로는 질환의 발생, 질환의 진행, 질환의 심각성 및 사용되는 조성물에 따라 결정된다. 당업자에게 공지된, 투여의 다른 경로는 근육내, 정맥내, 피내, 병소내, 복막내 주사, 경막내, 비강내, 구강내, 질내, 직장내, 국부, 국소, 안내, 호흡, 협측내 (예를 들어, 설하), 및 경피 투여 또는 임의의 경로를 포함하며, 이에 국한되지 않는다. 상기 경로에 적합한 제형물들은 당업자에게 공지되어 있다.
조성물은 또한 연속적이거나, 간헐적이거나 또는 동일한 조성물인 다른 생물학적 활성화제와 함께 투여 가능하다. 투여는 또한 펌프와 같은, 방출제어제제 및 방출제어장치를 포함하는 방출제어시스템을 포함할 수 있다.
일반적으로 주사 또는 주입으로 특징지어지는 피하내 투여를, 본원에서 기술한다. 액상 또는 현탁액, 주입에 앞선 액체 내 용액 또는 현탁액에 적절한 고체, 또는 에멀젼과 같은, 주사가능한 물질은 종래의 형태일 수 있다. 일반적으로, 본원에서 제공된 복합제제는 액체로 제조된다. 주사가능한 물질은 국소 및 전신 투여를 위해 설계된다. 본원의 목적에 따라, 국소 투여는 효과를 받는 간극으로의 직접 투여를 위해 설계된다. 비경구 투여 제제는 주입이 준비된 소독 용액, 피하주사정을 포함하는, 사용에 앞서 용제와 결합할 준비가 된 동결 건조 파우더와 같은 소독된 건조 용액 산물, 주입 가능한 소독 현탁액, 사용에 바로 앞서 비히클과 결합할 준비가 된 소독 건조 불용성 산물 및 소독 현탁액을 포함한다. 용액은 수용성 또는 비수성일 수 있다. 정맥내 투여시, 적절한 수송체는 생리식염수 또는 인산염버퍼식염수(PBS), 및 글로코오스, 폴리에틸렌글리콜, 및 폴리프로필렌클리콜과 같은 농밀화제 및 가용화제를 포함한 용액 및 이들의 혼합물을 포함한다.
예컨대 단백질가수분해성 분해, 및 항원 및 면역원 응답성을 경유하는 면역학적 개재와 같은 분해적인 프로세스에 대한 선택된 화합물들의 노출을 감소시키기 위한 투여 방법을 채용할 수 있다. 상기 방법의 예시에는 치료 부위에서의 국소 투여가 포함된다. 치료제의 페길화는 단백질가수분해에 대한 내성을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시키고, 항원성 및 면역원성을 감소시키는 것으로 보고되었다. 페길화 방법론의 예시는 당업계에 공지되어 있다 (참고문헌은, 예를 들어 Lu 및 Felix, Int. J. Peptide Protein Res ., 43: 127-138, 1994; Lu 및 Felix, Peptide Res ., 6: 142-6, 1993; Felix 등, Int . J. Peptide Res ., 46 : 253-64, 1995; Benhar 등, J. Biol . Chem ., 269: 13398-404, 1994; Brumeanu 등, J Immunol ., 154: 3088-95, 1995; 참고문헌으로 또한, Caliceti 등 (2003) Adv . Drug Deliv . Rev . 55(10):1261-77 및 Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). 페길화는 또한 생체내 핵산 분자의 전달에 이용될 수 있다. 예를 들어, 아데노바이러스의 페길화는 안정성 및 유전자 전달을 증가시킬 수 있다 (참고문헌은, 예를 들어, Cheng 등 (2003) Pharm . Res . 20(9): 1444-51).
더 큰 부피가 투여되는 경우, 투여는 일반적으로 주입에 의한 것이다. 대상체에는 약 또는 0.5 ml/kg/BW/h, 1 ml/kg/BW/h, 2 ml/kg/BW/h, 3 ml/kg/BW/h, 4 ml/kg/BW/h, 또는 5 ml/kg/BW/h 의 주입 속도로 투여될 수 있다. 주입 속도는 경험적으로 결정될 수 있고, 일반적으로는 대상체의 용인능(tolerability)의 함수이다. 주입 동안 부작용이 나타나면, 주입 속도를 부작용이 일어나는 값의 바로 아래로 늦출 수 있다. 부작용이 속도 감소에 대한 응답을 수반하면, 주입 속도는 내과의의 재량으로 서서히 증가시킬 수 있다. 피하 IG 복합제제 주입은 중력, 펌프 주입 또는 원하는 투여량, 예를 들어, 완전한 20 내지 30 그램 주사로 용이하게 될 수 있다. 일반적으로, 주입을 위해 정맥내 주입 펌프가 채용될 수 있다. IG/히알루로니다아제 복합제제는 약 또는 5 ml/h, 10 ml/h, 30 ml/h, 60 ml/h, 120 ml/h, 240 ml/h 또는 300 ml/h 의 속도로 주입될 수 있다. 환자에 의해 주입이 용인되는 한, 주입 속도는 치료 과정 동안 증가될 수 있다. 일반적으로, 주입의 투여 시간은 약 또는 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5h, 3 h, 4 h 또는 그 이상이다. 히알루로니다아제와 함께 공동-제제화되는 IG의 피하 투여에 의해 달성되는 주입의 높은 비율로 인해, 주입 시간은 통상적인 IVIG 요법을 위한 것보다 훨씬 더 적다. 주입 시간이 원하는 한계를 초과하는 경우, 내과의 및 환자의 재량에 따라 제 2 주입 부위를 시작할 수 있다. 제 2 부위는 일반적으로 최초 부위로부터 적어도 10 cm 떨어진 곳에서 시작한다.
주입을 위한 기법은 당업계에 공지되어 있고, 치료하는 내과의의 기술에 속한다. 일반적으로, 적당한 투여량의 IG/히알루로니다아제 복합제제는 표준 IV 백 내로 담을 수 있다. 예를 들어, 그의 말단에 Y-포트를 가진 비-관통 주입 세트를 이용할 수 있다. 24-게이지 피하 주입 바늘이 대상체의 원하는 부위에 삽입될 수 있으나, 복부 및 2 차적으로는 대퇴부가 권장되는데, 이는 주입되는 용액의 부피 때문이다. 히알루로니다아제 및 IG 는 동일한 Y 포스 장치 내에 제공될 수 있다. 기타 제조품이 또한 중력 또는 펌프에 의한 주입의 목적으로 본원에서 이용될 수 있고, 이에 제한되지 않으나, 관, 병, 주사기 또는 기타 용기가 포함된다.
주입이 용인되지 않는 경우 (예컨대, 그것이 중등도 내지 중증 국소 반응을 야기하는 경우), 대상체에 전체 투여량을 주입하기 위하여 제 2 주입 부위가 시작될 수 있다.
나아가, 본원에 제공되는 안정한 복합제제는 기간적 투약빈도가 포함된 투여량의 적용이 가능한 것으로 이해된다. 예를 들어, 투여 빈도는 매일 또는 격일, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 일 또는 그 이상의 연이은 주어진 간격의 시간일 수 있다. 다른 예에서, 투약요법은 주 단위, 예를 들어 매주 1 회, 매 2 주, 매 3 주, 매 4 주, 매 5 주, 매 6 주, 또는 그 이상이다. 이에 따라, IG/히알루로니다아제 제제는 한번에 투여되거나, 더 작은 투여량으로 나뉘어 일정한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 선택된 IG/히알루로니다아제 제제는 치료 시점 과정에 걸쳐, 예컨대, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월에 걸쳐 하나 이상의 투여량으로 투여될 수 있다. 일부 경우에는, 연속적 투여가 유용하다. 정확한 투여량 및 투여 과정은 적응증 및 환자의 내약성에 좌우되는 것으로 이해된다.
또한, 정확한 투여량 및 치료 지속기간은 치료되는 질환의 함수이며, 알려진 시험 프로토콜을 이용하거나, 생체내 또는 시험관내 시험 데이터로부터 외삽하여 경험적으로 결정될 수 있다고 이해된다. 농도 및 투여량 값은 또한 완화될 상태의 중증도와 함께 변할 수 있음에 유의해야 한다. 또한, 임의의 특별한 대상체에 대하여, 특이적 투약 요법은 개체의 필요 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 자의 전문적 소견에 따라 시간 경과와 함께 조정되어야 하며, 본원에 개시된 농도 범위는 단지 예시적일 뿐이며, 이를 포함하는 조성물 및 조합물의 범위 또는 용도를 제한하는 의도가 아니라는 것이 이해되어야 한다. 상기 조성물은 매시간, 매일, 매주, 매달, 매년 또는 한번 투여될 수 있다. 일반적으로, 투약 요법은 독성을 제한하도록 선택된다. 참석 내과의라면 독성, 또는 골수, 간 또는 신장 또는 기타 조직 이상으로 인한 더 낮은 투여량에 대한 요법을 종료하거나, 중단하거나, 조정하는 방법 및 시점을 알 것임을 유의해야 한다. 역으로, 참석 내과의라면 또한 임상 반응이 적절하지 않은 경우 (독성 부작용은 배재) 더 높은 수준으로 치료를 조정하는 방법 및 시점을 알 것이다.
G. 안정성, 활성, 생체이용률 및 약동학의 평가방법
제제 내의 IG 및 히알루로니다아제의 안정성 및 활성은 당업계에 공지된 다양한 체외 및 체내 실험으로 평가될 수 있다. 당업계에 존재하는 단백질의 안정성을 측정하는 다양한 분석 기법은 Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993)에 기술되어 있다. 안정성은 선택된 온도에서 선택된 시간으로 측정될 수 있다.
IG의 분자 사이즈를 평가하는 실험(예를 들어, 응집, 변성 및/또는 단편에 의한 크기)은 복합제제의 안정성을 평가하는데 있어서 중요한 고려사항이다. 추가적으로, 액상의 안정성 또한 복합제제 내의 IG 및 히알루로니다아제의 생물학적 활성을 측정하는 임의의 실험으로써 평가될 수 있다. 이러한 실험은 당업계에 공지된 것이다. 복합제제의 안정성을 평가하는 것 외에, 이러한 실험은 예를 들어, 면역 글로불린 및 히알루로니다아제의 치료를 위한 적절한 복용량, 투약빈도를 결정하는 데에 사용될 수 있다. 나아가, 당업자에게 공지된 실험은 또한 피하-투여된 면역 글로불린의 생체이용률, 및 내약성을 포함한 약동학적 성질을 평가하기 위해 수행될 수 있다.
1. 분자 사이즈
안정성을 나타내는 주요 지표는 분자 사이즈이며, 사이즈의 변화는 변성, 응집 또는 단편화에 의한 분해의 결과일 수 있다. IG의 응집은 IG 제품의 저장에 있어 흔히 문제된다. 응집은 그것이 환자의 혈액 내 보체와 결합하여 항보체 반응을 일으키는 것 때문에 문제된다. 보체와 결합하는 IG의 능력은 변성, 특히 고분자량을 가지는 종과 응집한 결과 크게 증가한다. 이러한 응집의 보체 결합 원리는 항원-항체 복합체의 그것과 동일한 것으로 나타난다. Marcus, D. M., (1960) J. Immunol. 84:273-284. IgG의 경우, 보체 결합자리에 서로 근접한 두 분자가 필요한 것으로 알려져 있다. 그러므로 필요한 배좌의 변화보다는, 분자의 임계적 패킹이 필요할 수 있다.
IG의 안정성을 모니터링하는 방법은 본원에 기재된 방법 및 예시를 포함하여 업계에 존재한다. 단백질의 물리적 및 화학적 구조 그리고 생물학적 활성에 기초하여, 항체 또는 면역 글로불린 제제를 포함하는, 단백질 제제의 안정성을 평가하는 다양한 방법들이 존재한다. 예를 들어, 단백질의 응집, 단편(fragment) 및 변성을 연구하기 위한, 전하-이동 흡수, 열분석, 형광분석, 원편광 이색성, NMR, 환원 모세관 겔 전기영동(reduced capillary gel electrophoresis, rCGE), 및 고성능 크기배제 크로마토그래피(HPSEC)와 같은 방법이 존재한다. 예를 들어, Wang et al., 1988, J. of Parenteral Science & Technology 42(supp):S4-S26 참고. 상기 rCGE, 및 HPSEC는 단백질 응집, 단백질 변성 및 단백질 단편(fragment)의 발생으로 기인하는 분자의 크기를 평가할 수 있는 가장 보편적이고 간단한 방법이다. 나아가, 항보체 활성(ACA)이 직접적으로 측정될 수 있다.
예를 들어, HPSEC 또는 rCGE를 이용하여 액상 제제의 안정성을 측정할 수 있고, 이때 피크의 백분율 영역은 비-분해 단백질을 나타낸다. 하나의 예에서, 단백질은 TosoH Biosep TSK G3000 SW 600 x 7.5 mm 컬럼으로 주입된다. 단백질은 용출된다. 용출된 단백질은 280 nm UV 흡광도에서 검출된다. 대조 실험으로써 표준 레퍼런스(reference standard)가 실시되고, 포함된 볼륨 피크를 제외한 모든 다른 피크와 비교하여 산물 단량체 피크 영역 백분율로써 결과가 보고된다. 단량체 피크보다 빠르게 용출되는 피크는 응집 백분율로 기록된다.
ACA 역가 또한 유럽약전에 기술된 바와 같이 측정될 수 있다(유럽약전, 1997, 2판. Part II. Maisonneuve, S.A., Saint Ruffine, France). 일반적으로, ACA 역가는 정맥내(IV) 투여를 위한 사양 지표(specification indicator)이지 복합제제의 피하내 투여와는 관련이 없다. 따라서, 본원의 목적에 따라, ACA 역가는 피하내 투여용 복합제제의 일반적인 결정적 지표는 아니다.
일반적으로, ACA 실험은 표준화된 용량의 보체 및 단백질의 혼합물에 의해 결합하는 보체의 양을 측정한다.(예를 들어, Palmer, D. F. and Whaley, S. D., Complement Fixation Test, in Manual of Clinical Laboratory Immunology (Ed. N. R. Rose, et al., American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1986) pp. 57-66.; Mayer, M. M., Quantitative C' Fixation Analysis, Complement and Complement Fixation, in Experimental Immunochemistry (Ed. E. A. Kabat and M. M. Meyer, Thomas, Springfield, III., 1961), pp. 214-216, 227-228.참조) 간략히, 적혈구 항체에 선배양되어 민감해진 적혈구가 보체/단백질 혼합물에 첨가된다. (이미 단백질에 결합하지 아니한)자유로운 보체의 존재하에 이러한 민감화된 세포들이 용해되어(lyse), 용해의 정도를 측정하는 것으로 정량화될 수 있는 헤모글로빈을 방출한다. 이와 동시에, 민감화된 적혈구는 또한 100 %로 정의된 용해도(lysis)를 가지는, 버퍼 제어-보체 혼합물에 첨가된다. 100% 용해도(lysis)를 나타내기 위한 보체의 정확한 양과 단백질의 존재 하에서 비결합 상태로 남아있는 보체의 양의 차이는 단백질과 실제로 결합한 보체의 양, 또는 항보체 활성을 가지는 양과 같다. ACA 활성의 하나의 유닛(단일 CH50 유닛)은 최적으로 적정된 보체 및 적혈구/용혈 시스템에서 50%의 보체를 활성화 시킬 수 있는 단백질의 양이다. 일반적으로, 수용가능한 ACA 역가는 mg 단백질 당 소비되는 50 % CH50 유닛보다 적다.
또다른 예에서, 예를 들어 액상제제의 저장 동안 응집 생성으로 기인하는, 분자 사이즈 분포는 시간에 따라 용액내 가용성 단백질의 변화를 측정하는 것으로 미리 측정될 수 있다. 용액내 가용성 폴리펩티드의 양은 다수의 분석 실험으로 측정될 수 있다. 이러한 실험은 예를 들어, 역상(RP)-HPLC 및 UV 흡광도분광법을 포함한다. 예를 들어, 가용성 응집으로 존재하는 가용성 폴리펩티드 부분과 응집하지 않은, 생물학적 활성이 있는 분자 형태로 존재하는 부분을 분리하기 위한 분석적 원심분리를 통하여 액상제제의 저장 동안 가용성 및 불용성 응집 모두의 측정이 이루어질 수 있다.
추가적 예로, 복합제제의 안정성은 시각적 침전에 대하여 제품을 관찰하는 동안 완제품을 57℃로 가열하고 그것을 그 온도로 네 시간 동안 유지함으로써 평가될 수 있다. (예를 들어, Code of Federal Regulations 21, Food and Drugs, 640. 101a (April 1978 수정) 참조). 상기 방법의 변형(예를 들어, Fernandes and Lundblad, Vox Sang 39:101-112 (1980) 참조)에서는, 대략 2 밀리리터의 실험 제품이 57℃에서 네시간 동안 가열되고 그 이 후 실험실 분광계로 580 nm에서의 투광도를 기록하여 측정된 유백광 정도의 백분율의 변화가 평가된다(또한, 미국 특허번호 제 4,597,966 호 참조).
SDS-PAGE 또한 응집 및/또는 단편화(fragmentation)를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 방사성 동위원소로 표지된 각각의 밴드의 밀도 또는 방사능은, 얻을 수 있는 비-변성 단백질을 나타내는 밴드의 % 밀도 또는 % 방사능으로 측정될 수 있다.
일반적으로, 복합제제에 있어 예를 들어 HPSEC 또는 rCGE와 같은 상기 임의의 실험에 의할 때 응집의 정도는 낮게 측정된다. 예를 들어, 무거운 단백질에 의한 응집은 5 % 이하, 4 % 이하, 3 % 이하, 2 % 이하, 1 % 이하, 그리고 일반적으로 0.5 % 이하이며, 비손상 항체 또는 단편을 나타내는 피크의 총 피크 면적의 80 % 이상, 85 % 이상, 90 % 이상, 95 % 이상, 98 % 이상, 또는 99 % 이상, 또는 99.5 % 이상인 단편화(fragmentation)의 경우에 비하여 측정불가능한 정도로 낮다. 예를 들어, 전형적으로, 수용가능한 응집은 ≥ 90 % 단량체 및 올리고머/이량체; ≤ 5 % 응집, 및 ≤ 5 % 단편(frament)을 포함한다.
2. 생물학적 활성
a. 면역글로불린
치료제로서 작용하는 면역글로불린의 능력은 시험관내 또는 생체내에서 평가될 수 있다. 예를 들어, 바이러스 또는 박테리아 전염성을 중화하는 면역글로불린의 능력을 평가하기 위하여 시험관내 분석법이 수행될 수 있다(Hiemstra 등.,(1994) J Lab Clin Med 123:241-6). 다른 시험관내 분석법이 면역글로불린의 다른 생물학적 활성을 평가하는데 이용될 수 있다. 예를 들어, 보체 활성화 산물과 상호작용하여 조절하고, 이디오타입 항체와 결합하고, 대식세포의 Fc 수용체에 결합하고, 사이토카인, 케모카인 및 메탈로프로테이나제를 포함하는 다양한 염증 매개체들을 억제하는 면역글로불린 제제의 능력은 ELISA, 웨스턴블롯, 노던블롯 및 마커발현을 평가하기 위한 유세포분석(flow cytometry)을 포함하나, 이에 국한되지 않는, 당업계에 알려진 임의의 방법들을 이용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 말초혈액 단핵세포의 케모카인 수용체 발현에 대한 면역글로불린의 효과는 유세포분석을 이용하여 평가될 수 있다(Trebst 등(2006) Eur J Neurology). 또다른 예에서, 대식세포내 메탈로프로테이나제 발현에 대한 면역글로불린의 효과는 노던블롯 분석을 이용하여 평가될 수 있다(Shapiro 등(2002) Cancer 95:2032-2037).
면역글로불린의 치료적 활성을 평가하기 위하여 동물모델을 이용한 생체내 연구가 또한 수행될 수 있다. 면역글로불린이 하나 이상의 미생물로 감염된 동물모델에 투여될 수 있으며, 예컨대, 이환율 마커로서 미생물의 수를 측정하거나 무게를 측정함으로써 감염진행에 대한 효과가 평가될 수 있다. 면역글로불린의 치료적 효과는 또한 면역글로불린을 사용한 요법이 고려되는 질환 및 상태의 동물모델을 이용하여 평가될 수 있다. 그러한 동물모델은 당업계에 알려져 있으며, X-연관 무감마글로불린혈증(X-linked agammaglobulinemia), SCID, 비스코트-올드리치 증후군(Wiskott-Aldrich syndrome), 가와사키병, 길랑-바레 증후군(Guillain-Barre syndrome), ITP, 다발성근염(polymyositis), 람버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome), 중증 근무력증(Myasthenia gravis) 및 뫼르쉬-볼트만 증후군을 위한 작은 동물모델을 포함하나, 이에 국한되지 않는다(Czitrom 등(1985) J Immunol 134:2276-2280, Ellmeier 등(2000) J Exp Med. 192:1611-1624, Ohno(2006) Drug Discovery Today: Disease Models 3:83-89, Oyaizu 등(1988) J Exp Med 2017-2022, Hansen 등(2002) Blood 100:2087-2093, Strongwater 등(1984) Arthritis Rheum. 27:433-42, Kim 등(1998) Annals NY Acad Sci 841:670-676, Christadoss 등(2000) 94:75-87, Sommer 등(2005) Lancet 365:1406-1411, 미국특허번호 7309810).
b. 히알루로니다아제
히알루로니다아제 활성은 당업계에서 잘 알려진 방법들을 이용하여 평가될 수 있다. 하나의 예에서, 활성은 미세탁도(microturbidity) 분석을 이용하여 측정된다. 이는 히알루론산이 혈청 알부민과 결합할 때, 불용성 침전물이 형성되는 것에 기초한다. 상기 활성은 설정된 기간의 시간 동안(예컨대, 10분) 히알루로니다아제를 소디움 히알루로네이트(히알루론산)와 배양시킨 다음, 산성화된 혈청 알부민을 첨가하여 소화되지 않은 소디움 히알루로네이트를 침전시킴으로써 측정된다. 추가 진행 기간 후, 생성된 시료의 탁도가 650nm에서 측정된다. 소디움 히알루로네이트 기질에 대한 히알루로니다아제 활성에서 기인한 탁도감소는 히알루로니다아제 효소활성의 척도이다. 또다른 예에서, 히알루로니다아제 활성은 히알루로니다아제와의 배양후 잔여 비오틴화(biotinylated) 히알루로산이 측정되는 미량역가(microtiter) 분석을 이용하여 측정된다(예컨대, Frost 및 Stern(1997) Anal. Biochem. 251:263-269, 미국특허 공개번호 20050260186 참조). 히알루론산의 글루쿠론산 잔기의 유리 카르복실기가 비오틴화되고, 상기 비오틴화 히알루론산 기질이 미량역가 플레이트에 공유결합된다. 히알루로니다아제와 배양후, 잔여 비오틴화 히알루로산 기질은 아비딘-페록시다제 반응을 이용하여 검출되며, 알려진 활성의 히알루로니다아제 표준과의 반응후 확보된 것과 비교된다. 히알루로니다아제 활성을 측정하는 다른 분석법 또한 당업계에서 알려져 있으며, 본원의 방법에서 사용될 수 있다(예컨대, Delpech 등(1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi 등(2003) Anal. Biochem. 322:257-263).
전착제 또는 분산제로서 작용하는 히알루로니다아제의 능력이 또한 평가될 수 있다. 예를 들어, 트리판 블루 염료는 누드 마우스의 각각의 면에 측면 피부 내로 히알루로니다아제 없이 또는 이와 함께 피하주사될 수 있다. 이어서, 전착제로서 작용하는 히알루로니다아제의 능력을 결정하기 위하여, 예컨대 마이크로칼리퍼로 염료 면적을 측정한다(미국특허번호 20060104968).
3. 약동학 및 내약성
약동학 및 내약성 연구는 동물모델을 이용하여 수행되거나 환자와의 임상연구 동안에 수행될 수 있다. 동물모델은 마우스, 랫드, 토끼, 개, 기니피그 및 비인간 영장류 모델, 예컨대 사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이 또는 레소스(Rhesus) 원숭이를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 어떠한 예에서, 약동학 및 내약성 연구는 건강한 동물을 이용하여 수행된다. 다른 예에서, 상기 연구는 면역글로불린을 이용한 요법이 고려되는 질환의 동물모델, 예컨대 하기 기술된 임의의 질환 및 상태의 동물모델을 이용하여 수행된다.
피하 투여된 면역글로불린의 약동학은 투여후, 최고(피크) 혈장 면역글로불린 농도(Cmax), 피크시간(즉, 최고 혈장 면역글로불린 농도가 발생할 때; Tmax), 최소 혈장 면역글로불린 농도(즉, 면역글로불린의 용량 사이에 최소 혈장 농도; Cmin), 소실 반감기(T1 /2) 및 곡선하면적(즉, 시간 대 혈장 면역글로불린 농도를 플로팅(plotting)함으로써 생성되는 곡선하면적; AUC)과 같은 파라미터들을 측정함으로써 평가될 수 있다. 피하 투여된 면역글로불린의 절대 생체이용률은 피하전달후 면역글로불린의 곡선하면적(AUCsc)을 정맥내 전달후 면역글로불린의 AUC(AUCiv)와 비교함으로써 결정된다. 절대 생체이용률(F)은 식:F = ([AUC]sc × dosesc) / ([AUC]iv × doseiv)을 이용하여 계산될 수 있다. 피하 투여후 혈장내 면역글로불린 농도는 혈액 시료 내 면역글로불린 농도를 평가하기에 적합한 당업계에 알려진 임의의 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 방법의 예는 ELISA 및 비탁법(nephelometry)을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
약동학 연구에서 투약시 일련의 용량 및 다른 투약빈도를 투여하여, 상기 용량에서 면역글로불린 및/또는 히알루로니다아제의 농도의 증가 또는 감소 효과를 평가할 수 있다. 피하 투여된 면역글로불린의 약동학적 성질, 예컨대 생체이용률은 또한 히알루로니다아제 병용-투여 없이 또는 이와 함께 평가될 수 있다. 예를 들어, 개, 예컨대 비글에 히알루로니다아제와 병용으로 또는 단독으로 면역글로불린을 피하 투여할 수 있다. 또한, 또다른 그룹의 비글에 정맥내 용량의 면역글로불린이 주어진다. 그다음 다양한 시점에 혈액시료를 취하여, 혈장내 면역글로불린의 양을 예컨대, 비탁법으로 결정한다. 그다음 AUC를 측정하고, 히알루로니다아제 없이 또는 이와 함께 피하 투여된 면역글로불린의 생체이용률을 결정할 수 있다. 그러한 연구는 피하 투여된 면역글로불린의 약동학적 성질, 예컨대 생체이용률에 대한 히알루로니다아제와의 병용-투여의 효과를 평가하기 위하여 수행될 수 있다.
안전성 및 내약성을 평가하는 연구는 또한 당업계에 알려져 있으며, 본원에서 이용될 수 있다. 히알루로니다아제 병용-투여 없이 또는 이와 함께, 면역글로불린의 피하 투여후, 임의의 유해 반응 진행이 모니터링될 수 있다. 유해 반응은 주사부위 반응, 예컨대 부종 또는 부기(swelling), 두통, 열, 피로, 오한, 홍조, 현기증, 두드러기, 천명 또는 가슴 답답함(chest tightness), 오심, 구토, 경직(rigors), 등통증, 흉통, 근육경련, 발작 또는 경련, 혈압변화 및 아나필락시스 또는 심각한 과민 반응을 포함할 수 있으나, 이에 국한되지 않는다. 전형적으로, 안전성 및 내약성 연구에서 일련의 범위의 용량 및 다른 투약빈도가 투여되고, 상기 용량에서 면역글로불린 및/또는 히알루로니다아제의 농도의 증가 또는 감소 효과가 평가될 수 있다.
H. 치료법 및 치료용도
본원에서 기술된 IG/히알루로니다아제 복합제제들은 면역글로불린이 활용되는 임의의 상태의 치료에 이용될 수 있다. 면역글로불린을 이용한 치료에 적합한 임의의 상태를 치료하기 위하여, 면역글로불린(IG)을 히알루로니다아제와 복합제제로하여 피하 투여할 수 있다. 본 섹션은 IG/히알루로니다아제 복합제제의 치료용도의 예를 제공한다. 본원에서 제공된 IG/히알루로니다아제 복합제제는 하기에 기재된 임의의 질환 또는 상태 및 당업자에게 IG로 치료가능한 것으로 공지된 또다른 질환 및 상태를 치료하기 위한 방법, 과정 또는 용도로 사용될 수 있는 것으로 이해된다. 특히, 복합제제의 피하내 투여를 할 수 있다. 투여된 IG의 투여량은 당업자에게 공지된 정맥내 투여량과 동일 또는 유사하다. 투여량 및 투약빈도는 본원의 다른 문단과 같이 다양할 수 있다. 하기 기술된 치료용도는 예이며, 본원에서 기술된 방법들의 적용을 제한하지 않는다.
예를 들어, 본원에서 제공된 복합제제는, X-연관 무감마글로불린혈증(XLA), 저감마글로불린혈증, 및 낮은 항체수준; 염증성 및 자가면역성 질환; 및 급성 감염과 같은 후천성 면역저하 상태(이차성 면역결핍증)와 같은 면역결핍증을 치료하는데 사용될 수 있다. 치료용도는 다양한 면역학적, 혈액학적, 신경학적, 염증성, 피부과 및/또는 감염성 질환 및 상태를 위한 면역글로불린 대체요법 및 면역조절요법을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 어떠한 예에서, 면역글로불린은 예컨대, 감염성 질환에 가능한 노출(예컨대, 우연한 주사바늘 자상)후 건강한 환자에서 면역반응을 증가시키기 위하여 투여된다. 본원에서 제공되는 IG 복합제제는 또한 다발성 경화증(특히 재발-이장성 다발성 경화증 또는 RRMS), 알츠하이머 병, 파킨슨 병을 치료하는데 사용될 수 있다. 이러한 질환 또는 상태를 정의하는 것은 치료하는 의사에게 있어 당업계에 공지된 바이다.
면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제는 상기 질환 및 상태의 치료에 사용되는 다른 제제와 병용으로, 피하로 히알루로니다아제와 병용-투여될 수 있다. 예를 들어, 투여될 수 있는 다른 제제는 항생제, 화학요법제, 스테로이드 항염증제, 비스테로이드 항염증제 및 다른 면역조절제제, 예컨대 사이토카인, 케모카인 및 성장인자를 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
필요하다면, 특정 용량 및 지속기간 및 투여프로토콜은 경험적으로 결정되거나 외삽될 수 있다. 예를 들어, 적당한 용량을 결정하기 위하여 정맥내 투여된 면역글로불린 용량의 예가 출발점으로서 이용될 수 있다. 용량수준은 다양한 인자들, 예컨대 개체의 체중, 일반건강, 연령, 채택된 특정 화합물의 활성, 성별, 식단, 투여시간, 배설속도, 약물조합, 질환의 중증도 및 경과, 및 환자의 질환에 대한 소인, 및 치료하는 외과의의 판단에 기초하여 결정될 수 있다. 일반적으로, 면역글로불린 용량은 약 또는 kg 체중당 100 mg(즉, 100mg/kg BW) 내지 2 g/kg BW이며, 히알루로니다아제 용량은 본원의 다른 문단에 제공되어 있다. 투여되는 양은 치료되는 적응증, 및 용인될 가능한 부작용의 함수인 것으로 이해된다. 용량은 각각의 장애에 대해 인정되는 모델을 이용하여 경험적으로 결정될 수 있다.
환자상태가 개선될 때, 유지용량의 면역글로불린이 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여될 수 있으며, 필요하다면, 용량, 제형 또는 투여빈도, 또는 이들의 조합이 변경될 수 있다. 어떠한 경우에, 질환증상이 임의로 재발시 대상체는 장기적으로 간헐적인 치료를 요구할 수 있다.
1. 일차성 및 이차성 면역결핍증
a. 일차성 면역결핍증
세계보건기구에서는 80가지 이상의 일차성 면역결핍증 질환이 인정하고 있으며 10,000명 중 1명 꼴로 발병한다. 이러한 질병은 일부 예에서, 체내에서 감염에 대응하여 충분한 항체를 생산하지 못하는, 면역계의 내재성 결함이라는 특징을 가진다. 또다른 예에서, 감염에 대항하는 세포적 방어가 적절히 작동하지 못한다. 면역글로불린은 항체결핍을 가지는 원발성 면역결핍을 치료하는데 이용될 수 있다. 따라서, 면역글로불린은 그러한 질환을 보이는 환자에게 면역글로불린 대체요법으로서 투여될 수 있다.
전형적으로, 원발성 면역결핍은 유전장애이다. 원발성 면역결핍의 예는 공통 가변성 면역결핍증(common variable immunodeficiency, CVID), 선택적 IgA 결핍증, IgG 아형 결핍증, X-연관 무감마글로불린혈증(XLA), 중증 합병증 면역결핍증(severe combined immunodeficiency, SCID), 보체 질환, 운동실조성 모세혈관확장증(ataxia telangiectasia), IgM 과다증 및 비스코트-올드리치 증후군을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제는 면역글로불린의 정맥내 투여에 사용되는 용량과 유사한 용량으로 항체결핍을 가지는 원발성 면역결핍증 환자에게 피하 투여될 수 있다. 용량의 예는 4주 간격으로, 예를 들어, 100 mg/kg BW와 800 mg/kg BW 면역글로불린 사이를 포함한다. 상기 용량은 임상반응에 따라 증가되거나 감소될 수 있으며, 용량빈도도 마찬가지이다.
b. 이차성 면역결핍증
이차성, 또는 후천성, 면역결핍증은 유전적 장애를 물려받은 결과가 아니나, 면역계 외부의 요소에 의하여 면역계가 제대로 작동하지 못하는 개인에게 발생한다. 예시는 외상, 바이러스, 화학요법, 독소, 및 오염을 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 후천성 면역결핍증후군(AIDS)은 바이러스, T 림프구의 감소가 감염에 대한 대항을 불가능하게 하는, 인간 면역결핍증 바이러스(HIV)에 기인한 이차성 면역결핍증 질환의 예시이다.
또다른 예에서, 저감마글로불린혈증은 B-림프구의 부족과 그로 인한 혈액내 저수준 항체에 의해 유발되며, 만성 림프구성 백혈병(CLL), 다발성 골수종(MM), 비-호지킨 림프종(NHL) 환자에서, 및 백혈병-관련 면역기능이상 및 치료-관련 면역억제 둘다의 결과로서 발생할 수 있다. 혈액 암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증 환자, 그리고 조혈모세포이식-후(post-hematopoietic stem cell transplantation) 후천성 저감마글로불린혈증 환자는 박테리아 감염에 민감하다. 체액성면역 결핍은 특히 캡슐화된 미생물에 의해서, 이러한 환자들에서 감염-관련 이환률 및 사망률 리스크가 증가되는 원인이다. 예를 들어, 스 트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae) 및 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphyloccus aureus)뿐만 아니라, 레지오넬라 및 노카르디아 속은 CLL 환자에서 폐렴을 유발하는 빈번한 박테리아 병원체이다. 기회감염, 예컨대 뉴모시스티스 카리니(Pneumocystis carinii), 진균, 바이러스 및 마이코박테리아가 또한 관찰되었다. 이러한 환자에서 감염의 횟수 및 중증도는 면역글로불린 투여에 의해 현저하게 감소될 수 있다(Griffiths 등(1989) Blood 73:366-368, Chapel 등(1994) Lancet 343:1059-1063).
따라서, 재발성 감염을 방지하기 위하여 면역글로불린/히알루로니다아제와 복합제제가 상기 환자에게 피하 투여될 수 있다. 예시적인 용량은 혈액암에 이차적인 후천성 저감마글로불린혈증 환자에게 면역글로불린의 정맥내 투여에 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, 약 400 mg/kg BW 면역글로불린이, 히알루로니다아제와 병용으로, 매 3 내지 4주 마다 피하 투여될 수 있다. 추가예에서, 환자의 혈청 IgG가 4 g/L 미만인 경우 치료 첫달에서 추가용량의 400 mg/kg BW가 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양 및 투여빈도는 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
2. 염증성 및 자가면역성 질환
a. 가와사키병
가와사키병은 종종 관상동맥이 관련되는 어린이, 및 어린 유아의 급성, 열성, 다중-시스템 질환이다. 이는 또한 림프절 증후군, 점막피부절 질환, 유아 다발동맥염 및 가와사키 증후군으로서 알려져 있다. 가와사키병은 피부와 점막, 림프절, 혈관벽, 및 심장을 포함하는 많은 기관에서 발병하는 잘 이해되지 않은 자기-제한적(self-limited) 혈관염이다. 관상동맥류는 회복기 단계 동안 병의 2주째부터 발생할 수 있다. 상태의 원인은 알려져 있지 않으나, 알려지지 않은 항원에 대한 T-세포 및 대식세포 활성화, 사이토카인 분비, 폴리클론 B-세포 활동항진(hyperactivity), 및 내피세포 및 평활근 세포에 자가항체 형성이 특징인 면역반응으로부터 특유의 혈관염이 유발된다는 증거가 있다. 유전적으로 민감한 개체에서, 아마도 초(super)-항원 활성을 가지는, 하나 이상의 비특성 공통 감염원이 상기 질환을 유발할 수 있다.
가와사키병에서 초기에 투여된 면역글로불린은 관상동맥 병리를 예방할 수 있다. 가와사키병과 관련된 진행중인 염증을 가진 환자에게 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제의 피하 투여는 증상을 개선할 수 있다. 용량의 예는 가와사키병 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, 가와사키병 환자에게 kg 환자체중당 약 1-2 g의 면역글로불린이 투여될 수 있다. 이는 예를 들어, 400 mg/kg BW 4회 용량으로 4일 연속 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 1 g/kg BW 면역글로불린이 단일용량으로서 10시간 기간에 걸쳐 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가하거나 감소될 수 있다.
b. 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증
만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증(chronic inflammatory demyelinating polyneuropathy, CIDP)은 다리와 팔에 진행성 약화 및 손상된 감각기능을 특징으로 하는 신경계장애이다. 때때로 만성 재발성 신경병증이라 불리는, 상기 장애는 말초신경의 수초손상이 원인이다. 이는 임의의 연령에서와 양성(both genders)에서 발생할 수 있으나, CIDP는 청소년에서 더 일반적이고, 여성보다도 남성에서 더 일반적이다. 이는 종종 저림 또는 무감각(발가락과 손가락에서 시작), 팔과 다리의 약화, 심부건반사(deep tendon reflexes)의 소실(무반사), 피로 및 감각이상을 포함하는 증상을 야기한다. CIDP는 길랑-바레 증후군과 밀접한 관련이 있으며, 그러한 급성질환의 만성 카운터파트로서 여겨진다. 특정 진단시험은 없으나, 상기 장애를 다른 면역매개 신경병증 증후군과 구별하도록 돕는 특징적인 임상 및 실험실 소견이 있다.
연구들은 면역글로불린을 이용한 치료가 증상을 감소시킨다는 것을 나타낸다(van Schaik 등(2002) Lancet Neurol. 1:497-498). 따라서, 본원에 기술된 방법을 이용하여 CIDP를 나타내는 환자에게 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제를 피하로 투여할 수 있다. 용량의 예는 CIDP 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 하나의 예에서, CIDP 환자에 약 2 g/kg BW의 면역글로불린을 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여한다. 이는 예를 들어, 400mg/kg BW 5회 용량으로 5일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
c. 길랑 - 바레 증후군
길랑-바레 증후군은 말초신경의 염증성 탈수초화를 수반하는 신경학적 자가면역장애이다. 초기증상은 다리에 다양한 정도의 약화 또는 저린감(tingling sensations)을 포함하며, 이는 팔과 상체로 확산될 수 있다. 이러한 증상은 근육이 전혀 사용될 수 없고 환자가 거의 완전히 마비될 때까지 강도가 증가되어, 생명을 위협하는 상태를 유발할 수 있다. 대부분 환자에서 일반적으로 회복이 좋거나 완전하지만, 지속적인 장애가 전체 환자 중 약 20% 환자에서, 4 내지 15% 환자에서 사망하는 것으로 보고되고 있다. 길랑-바레 증후군은 호흡 또는 위장관 바이러스 감염의 증상후 몇일 또는 몇주후에 발생할 수 있다. 어떠한 예에서, 수술 또는 예방접종이 상기 증후군을 유발할 수 있다. 상기 장애는 수시간 또는 수일에 걸쳐 발전될 수도 있고, 3 내지 4주가 걸릴 수도 있다. 신경전도속도(NCV) 검사는 의사에게 진단을 돕는 단서를 줄 수 있다. 어떠한 예에서, 길랑-바레 증후군 환자의 뇌척수액은 전형적으로 정상인보다 더 많은 단백질을 함유하므로, 척추천자(spinal tap)가 진단에 사용될 수 있다.
길랑-바레 증후군에 대한 알려진 치유법은 없으나, 면역글로불린 치료가 상기 병의 중증도를 줄이고, 회복을 가속화할수 있다. 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제는 적당한 용량, 예컨대 길랑-바레 증후군 환자에게 정맥내로 면역글로불린을 투여하는데 사용한 IG 용량과 유사용량으로, 환자에게 피하 투여될 수 있다. 예를 들어, 길랑-바레 증후군 환자는 2 g/kg BW의 면역글로불린을 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여할 수 있다. 이는 예를 들어, 400 mg/kg BW 5회 용량으로 5일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은, 예를 들어, 당업계에서 쉽게 평가될 수 있는, 질환의 중증도 및 치료에 대한 임상반응에 따라, 증가되거나 감소될 수 있다.
d. 특발성 혈소판 감소성 자반증
특발성 혈소판감소성 자반증(idiopathic thrombocytopenic purpura, ITP)은 원발성 면역 혈소판감소성 자반증 및 자가면역 혈소판감소성 자반증으로서 또한 알려져 있으며, 항-혈소판 항체 때문에 혈소판 생존이 단축된 데서 기인한 혈소판수의 감소(혈소판 감소증)이다. 혈소판수가 매우 적을 때(예컨대, 30 × 109/L 미만), 피부(자반) 및 점막내로 출혈이 발생할 수 있다. ITP 환자에서 골수 혈소판 생산(거핵구형성(megakaryopoiesis))은 형태학적으로 정상이다. 어떠한 예에서, 혈소판 표면의 당단백질에 항체결합과 관련된 추가 혈소판 기능손상이 있다. ITP는 만성 및 급성 형태로서 나타날 수 있다. 약 80%의 ITP 환자가 만성형태의 질환을 가진다. 어떠한 보고는 연령에 따라 발생률이 증가한다고 제시하고 있으나, 만성 ITP의 가장 높은 발생률은 15 내지 50세 여성에서이다. ITP는 HIV 환자에서 비교적 흔하다. ITP는 임의의 감염단계에서 발견되는 반면, HIV 질환은 진행할수록 유병률이 증가한다.
연구들은 ITP 환자를 치료하는데 면역글로불린이 사용될 수 있음을 입증하고 있다(Godeau 등(1993) Blood 82(5):1415-21, Godeau 등(1999) Br J Haematol 1999;107(4):716-9). ITP 환자를 치료하기 위하여, 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제를 정맥내 투여하는데 사용된 IG 용량과 유사용량으로 환자에게 면역글로불린을 피하 투여할 수 있다. 예를 들어, ITP 환자는 약 1 내지 2 g/kg의 면역글로불린을 히알루로니다아제와 병용으로 피하 투여할 수 있다. 이는 며칠에 걸쳐 투여되거나, 한 용량으로 투여될 수 있다. 어떠한 예에서, 400 mg/kg BW 면역글로불린의 5회 용량으로 수일간 연속 투여할 수 있다. 또다른 예에서, 혈소판수 및 임상반응에 따라, 1 g/kg BW가 1 내지 2일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양 및 용량빈도는, 예를 들어, 당업자에게 쉽게 평가될 수 있는, 혈소판수 및 치료에 대한 임상반응에 따라, 증가되거나 감소될 수 있다.
e. 염증성 근육병증
염증성 근육병증(inflammatory myopathies)은 골격근 조직의 염증 및 퇴행을 수반하는 근육질환의 한 그룹이다. 이러한 후천성 장애는 모두 현저한 근육약화 및 근육내 염증반응의 존재를 나타낸다.
i. 피부근염
피부근염(dermatomyositis, DM)은 눈꺼풀, 볼 및 콧대에서, 및 등 또는 상부 가슴, 팔꿈치, 무릎 및 수지관절(knuckles)에서 반점형(patchy), 탁한(dusky), 적색 또는 라일락색 발진으로서 발생하는, 독특한 발진 때문에 가장 쉽게 인식되는 염증성 근육병증이다. 어떠한 환자에서, 석회결절 또는 경화된 범프(hardened bumps)가 피부밑에서 발달한다. 상기 발진은 종종 근육약화에 선행하며, 전형적으로 수주간의 기간을 걸쳐 발달하거나, 몇달 또는 심지어 며칠에 걸쳐 발달할 수도 있다. 피부근염은 아동기부터 성인기까지 어느 연령에서나 발생할 수 있으며, 남성보다 여성에서 더 흔하다. DM 환자의 약 삼분의 일이 연하곤란을 보고한다. 근육 통증 및 압통이 일반적으로 DM을 가진 성인의 25% 미만에서 발생하는 동안, DM을 가진 어린이의 50% 이상이 근육 통증 및 압통을 호소한다.
ii . 다발성근염
다발성근염(polymyositis, PM)은 피부근염의 특징적인 발진이 없으며, 근육약화의 발현이 보통 DM보다 느리게 진행된다. 많은 PM 환자가 연하곤란을 겪는다. 어떠한 예에서, 환자는 또한 근육부전 때문에 호흡곤란을 겪는다. 무려 PM 환자의 삼분의 일이 근육통을 겪는다. 아동기 및 유아의 다발성근염 사례가 보고되긴 했으나, 상기 질환은 남성보다 여성에서 더 발생하며, 20살 미만 사람에서는 드물게 발생한다.
iii . 봉입체근염
봉입체근염(IBM)은 다발성근염과 매우 유사하다. IBM에서 근육약화의 발현은 대개 매우 점진적으로, 수개월 또는 수년에 걸쳐 일어난다. 일반적으로 PM에서 근위근육만이 발병되는 반면, IBM은 근위 및 원위 근육 둘다에서 발병된다는 점에서 PM과 다르다. 전형적인 소견은 손목 굴곡근 및 손가락 굴곡근 약화를 포함한다. 팔뚝 및 사두근육 위축이 상기 질환의 특징이며, 다른 근육의 다양한 정도의 함께 약화되는 것이 일반적이다. IBM으로 고통받는 환자들의 약 절반이 연하곤란을 겪는다. 어떠한 연령그룹도 배제될 수는 없으나, IBM 증상은 보통 50세이후에 시작된다. IBM은 여성보다 남성에서 더 빈번하게 발생한다. IBM의 열개 사례 중 약 한개가 유전적일 수 있다.
연구들은 이러한 염증성 근육병증 환자에게 면역글로불린 투여가 유리할 수 있음을 나타낸다. 면역글로불린은 근육강도를 개선시키고, 염증을 감소시키며, 질환 진행 및 증증도를 감소시킬 수 있다(Dalakas 등(1993) N Engl J Med 329(27):1993-2000; Dalakas 등(2001) Neurology 56(3):323-7, Dalakas(2004) Pharmacol Ther 102(3):177-93, Walter 등(2000) J Neurol 247(1):22-8). 면역글로불린/히알루로니다아제와 복합제제는 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량과 유사용량으로 DM, PM 또는 IBM 환자에게 피하 투여될 수 있다. 예를 들어, 2 g/kg BW의 면역글로불린이, 전형적으로 수일에 걸쳐, 예컨대 400 mg/kg BW의 5회 용량으로 수일간 연속 투여될 수 있다.
f. 람버트 - 이튼 근무력증후군
람버트-이튼 근무력증후군(Lambert-Eaton myasthenic syndrome, LEMS)은 폐암과 관련하여 임상적으로 최초 인식되고, 그후 신생물이 검출되지 않았던 사례에서 신경근전달의 드문 자가면역장애이다. LEMS 환자는 시냅스이전 신경근 접합부(presynaptic neuromuscular junction) 결함을 가진다. 상기 질환은 운동후 강도증가, 경증의 동안사인(oculomotor signs), 하락된 심부건반사 및 자율신경 기능이상(구갈, 변비, 발기부전)와 함께 근위근 약화가 임상특징이다.
LEMS 환자에게 하는 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제의 피하 투여가 증상을 개선할 수 있다. 용량의 예는 LEMS 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, LEMS 환자에 kg 환자체중당 2 g의 면역글로불린이 수개의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 400 mg/kg BW 면역글로불린의 5회 용량이 5일 연속 투여될 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
g. 다초점성 운동 신경병증
전도차단이 있는 다초점성 운동 신경병증(multifocal motor neuropathy, MMN)은 서서히 진행되는 약화, 근섬유다발수축(fasciculations) 및 경련이 있고, 현저한 감각관여(sensory involvemen)가 없는 후천성 면역-매개 탈수초성 신경병증이다. 진단전 질환의 기간은 수개월부터 15년 초과까지 다양하다. MMN의 정확한 원인은 알려져 있지 않다. 병리조직학적 및 전기진단적 연구는 탈수초화와 축색손상 둘다의 존재를 입증한다. 감각신경에서도 경증의 탈수초화가 입증되어 있으나, 운동신경에서 주로 발병된다. 면역조절 및 면역억제 치료의 효능이 MMN의 면역성질을 더욱 지원한다. 항-GM1 항체의 역가는 MMN 환자의 절반이상에서 상승된다. 상기 질환에서 항-GM1 항체의 역할은 알려져 있지 않으나, 이들의 존재가 MMN 진단마커로서 사용될 수 있다.
MMN 환자에게 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제의 피하 투여는 증상을 개선시킬 수 있다. 용량의 예는 MMN 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 복합제제 내의 IG 용량을 포함한다. 예를 들어, MMN 환자는 kg 환자체중당 2 g의 면역글로불린이 몇개의 투여량으로 투여될 수 있다. 예를 들어, 400 mg/kg BW 면역글로불린의 5회 용량이 5일 연속 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 1g/kg BW가 2일 연속 투여될 수 있다. 어떠한 환자는 유지요법이 제공될 수 있으며, 이는 예를 들어, 매 2-6주마다 제공되는, 400mg/kg BW 내지 2g/kg BW의 용량을 포함한다. 투여되는 면역글로불린의 양은, 환자반응을 고려하여, 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
h. 중증 근무력증
중증 근무력증(Myasthenia gravis, MG)은 신체 골격근의 다양한 정도의 약화를 특징으로 하는 자가면역 신경근 질환이다. 어떠한 환자는 항체음성이지만, 이는 신경근 접합부에 아세틸콜린 수용체(AChR) 또는 근육-특이적 타이로신 키나제(MuSK)에 대한 항체의 존재와 관련이 있다. MG의 임상특징은 수의근, 특히 상안검거근(levator palpebrae), 외안(extraocular), 연수(bulbar), 사지 및 호흡 근육들의 변동이 있는 약화 및 피로를 포함한다. 환자는 보통 눈꺼풀의 편측 또는 양측 처짐(안검하수증), 겹보임(복시), 삼킴곤란(연하곤란) 및 근위근 약화를 겪는다. 호흡근의 약화는 중증사례 또는 급성중증악화(중증근무력증 위기)에서 호흡부전을 유발할 수 있다. 중증 근무력증은 모든 인종집단 및 양성에서 발생한다. 40세 미만의 젊은 성인여성 및 60세 초과의 나이든 남성에서 가장 흔하게 발병되나, 어떠한 연령에서도 발생할 수 있다. 어떠한 예에서, 증상을 줄이기 위하여 흉선절제술이 실시된다.
면역글로불린은 전형적으로 다른 치료가 효과가 없거나 심각한 부작용을 유발할 때, 예를 들어, 중등도 내지 중증 MG 환자의 유지요법으로서 사용될 수 있으며, 또한 흉선절제술 전 또는 상기 질환(중증 근무력증 위기)의 급성악화 동안 투여될 수 있다. 본원에 기술된 방법을 이용하여 MG 환자에게 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제를 피하 투여할 수 있다. 용량의 예는 MG 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, MG 환자는 유지요법을 위하여 매4 내지 6주 마다 400 mg/kg BW 내지 2 g/kg BW의 용량으로 투여될 수 있다. 흉선절제술 전 또는 중증 근무력증 위기 동안, 1 내지 2 g/kg BW가 수개의 투여량을 거쳐, 예컨대, 400 mg/kg BW의 5회 용량을 5일 연속 투여될 수 있다. 또다른 예에서, 1g/kg BW가 2일 연속 투여될 수 있다.
i. 뫼르쉬 -볼트만 증후군
강직인간(stiff person) 증후군(SPS) 또는 스티프만 증후군으로 또한 알려진, 뫼르쉬-볼트만(Moersch-Woltmann) 증후군은 자가면역질환 특징을 가지는 드문 신경계장애이다. 환자들은 근육 경축 및 중첩된 우발적 연축(superimposed episodic spasms)과 관련된 증상을 겪는다. 근육경축이 확산되어 중축근육(axial muscles), 주로 복부 및 흉요부 뿐만 아니라, 근위사지 근육이 관여된다. 전형적으로, 몸통의(truncal) 작용 및 길항적 근육의 협력-수축은 과전만증(hyperlordosis)을 지닌 보드-형(board-like) 모양을 초래한다. 덜 빈번하게, 호흡근육 관여는 호흡곤란을, 그리고 안면근 관여는 마스크-형 얼굴을 초래한다.
면역글로불린 치료가 뫼르쉬-볼트만 증후군 환자에서 감소된 강직 및 고조된 민감도 점수를 가져올 수 있다(Dalakas 등(2001) N Engl J Med 345(26):1870-6). 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제는 본원에 기술된 방법을 이용하여 뫼르쉬-볼트만 증후군 환자에게 피하 투여될 수 있다. 용량의 예는 뫼르쉬-볼트만 증후군 환자에게 면역글로불린을 정맥내 투여하는데 사용되는 용량을 포함한다. 예를 들어, 복합제제 내의 면역글로불린은 400 mg/kg BW 용량에서 5일 연속 투여될 수 있다. 어떠한 환자들은 유지요법이 제공될 수 있으며, 이는, 예를 들어, 매4 내지 6주마다 1 내지 2 g/kg BW 면역글로불린을 포함할 수 있다. 투여되는 면역글로불린의 양은 적당히 증가되거나 감소될 수 있다.
3. 급성 감염
면역글로불린은 또한 헤모필루스 인플루엔자 B형, 슈도모나스 아애루지노사(Psuedomonas aeruginosa) A 및 B형, 스타필로코쿠스 아우레우스, 그룹 B 스트렙토코커스, 스트렙토코커스 뉴모니아 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 및 23형, 아데노바이러스 2 및 5형, 싸이토메갈로바이러스, 엡스타인 바아 바이러스(Epstein Barr virus), A형 간염 바이러스, B형 간염 바이러스, 단순포진 바이러스-1(Herpes simplex virus-1), 단순포진 바이러스-2, 인플루엔자 A, 홍역, 파라인플루엔자 1, 2 및 3형, 폴리오, 바리셀라 조스터 바이러스, 아스페길루스(Aspergillus) 및 칸디다 알비칸스(Candida albicans)를 포함하나, 이에 국한되지 않는, 다수의 박테리아, 바이러스 및 진균 감염에 대한 항미생물 활성을 가지는 것으로 알려져 있다. 따라서, 환자의 면역시스템을 증가시키고 상기 질환을 치료하기 위하여 박테리아, 바이러스 및 진균 감염 환자에게 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제가 피하 투여될 수 있다. 어떠한 예에서, 항생제 또는 다른 항미생물제 또한 투여될 수 있다.
4. 다른 질환 및 상태
IG 치료법으로 치료가능하면서 상기에 포함되어 진술되지 않은 다른 질환 및 상태의 예는, 의인성(iatrogenic) 면역결핍; 특정 항체결핍; 급성 파종성 뇌척수염(Acute disseminated encephalomyelitis); ANCA-양성 전신성 괴사성 혈관염(systemic necrotizing vasculitis); 자가면역 용혈성 빈혈; 수포성 유천포창(Bullous pemphigoid); 반흔성 유천포창(Cicatricial pemphigoid); 에반스 증후군(면역 혈소판감소증을 가지는 자가면역 용혈성 빈혈을 포함); 태아-모체/신생아 동종면역 혈소판감소증(Foeto-maternal/neonatal alloimmune thrombocytopenia, FMAIT/NAIT); 혈구탐식 증후군(Haemophagocytic syndrome); 고위험 동종 조혈모세포 이식; IgM 파라단백혈증성 신경병증; 신장이식; 다발성 경화증; 눈간대경련-근육간대경련 실조(Opsoclonus myoclonus ataxia); 낙엽상 천포창(Pemphigus foliaceus); 심상성 천포창(Pemphigus vulgaris); 수혈후 자반증(Post-transfusion purpura); 독성표피괴사용해(Toxic epidermal necrolysis)/스티브 존슨 증후군(TEN/SJS); 독성쇼크 증후군; 전신 홍반성 루프스(Systemic lupus erythematosus) ; 다발성 골수종; 패혈증; 골수이식, B 세포 종양; 및 알츠하이머 병을 포함하나, 이에 국한되지 않는다.
알츠하이머 병(Alzheimer’s disease)은, 예를 들어, 정맥내 면역글로불린 치료를 포함한다(예컨대, Dodel 등(2004) J Neurol Neurosurg. Psychiatry, 75:1472-4; Solomon 등(2007) Curr. Opin. Mol. Ther., 9:79-85; Relkin 등(2008) Neurobiol Aging 참조). IG은 알츠하이머 환자 뇌에서 플라크의 중심 구성요소인 베타 아밀로이드(AB)에 결합하는 항체를 함유한다. 따라서, IG은 뇌로부터 AB 제거 촉진 및 뇌세포에 대한 AB의 독성효과 차단을 도울 수 있다. 그러므로, 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제는 본원에 기술된 방법을 이용하여 알츠하이머 질환 환자에게 피하 투여될 수 있다. 투여되는 대상은 경증, 중등도 또는 중증 알츠하이머 질환을 가진 환자를 포함한다. 치료를 위하여 환자를 확인하는 것은 치료하는 외과의의 기술수준 범위 내에 있다. 면역글로불린/히알루로니다아제 복합제제는 매주, 2주마다 또는 한달에 한번 투여될 수 있다. 치료는 수개월 또는 수년동안 계속될 수 있다. IG는 약 또는 200 mg/kg BW 내지 2 g/kg BW 사이 용량에서 매주 또는 2주마다 투여될 수 있으며, 일반적으로 적어도 200 mg/kg 내지 2 g/kg BW에서 적어도 한달에 한번이다. 면역글로불린 치료는 치료전 수준과 비교하여 환자의 항-아밀로이드 베타 항체의 수준증가를 가져올 수 있다.
I. 제조품 및 키트
면역글로불린 및 가용성 히알루로니다아제 복합제제의 약학적 조성물은 포장재료, IG-치료가능 질환 또는 상태의 치료에 유효한 약학적 조성물, 및 IG-치료가능 질환 및 상태의 치료에 사용되는 조성물과 조합물을 지시하는 라벨을 포함하는 제조품으로서 포장될 수 있다. 제조품의 예는 단일챔버 및 이중챔버 용기를 포함하는 용기이다. 상기 용기는 튜브, 병 및 주사기를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 상기 용기는 피하 투여를 위한 바늘을 추가로 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 제조품은 포장재료를 함유한다. 약학적 제품을 포장하는데 사용하기 위한 포장재료는 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 각각이 전체로 본원에 통합되어 있는, 미국특허번호 5,323,907, 5,033,252 및 5,052,558 참조. 약학적 포장재료의 예는 블리스터 팩, 병, 튜브, 흡입기, 펌프, 백(bags), 바이알, 용기, 주사기, 병, 및 선택된 제형과 의도된 투여 및 치료의 방식에 적합한 임의의 포장재료를 포함하나, 이에 국한되지 않는다. 본원에서 제공되는 화합물 및 조성물의 제형의 다양한 집합체가 임의의 IG-치료가능 질환 또는 상태를 위한 다양한 치료인 것으로서 고려된다.
면역글로불린 및 가용성 히알루로니다아제 복합제제의 약학적 조성물은 또한 키트로서 제공될 수 있다. 키트는 본원에 기술된 약학적 조성물 및 투여를 위한 아이템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 투여를 위한 장치, 예컨대 주사기, 흡입기, 용량컵, 점적기 또는 도포기가 공급될 수 있다. 상기 키트는, 임의적으로, 용량, 투약요법 및 투여방식을 위한 설명서를 포함하는 적용을 위한 설명서를 포함할 수 있다. 키트는 또한 본원에 기술된 약학적 조성물 및 진단용 아이템을 포함할 수 있다. 예를 들어, 그러한 키트는 IG의 농도, 양 또는 활성을 측정하기 위한 아이템을 포함할 수 있다.
본원에서 제공된 것은 액상제제에서 적어도 6개월의 장기간 동안 32℃까지의 온도, 예를 들어, 약 0℃ 내지 32℃에서 안정한 IG 및 히알루로니다아제의 복합제제이다. IG 및 히알루로니다아제의 활성을 유지하는 동안, 증가된 안정성은 개선된 저장 기간, 감소한 절단, 감소한 응집형성, 감소한 이량체 형성 또는/및 감소한 변색으로 특징지어진다. 이러한 복합제제는 추가적인 재구성 및/또는 추가적인 희석에 대한 어떠한 요구 없이 "바로 사용 가능한" 액상 제제로 제공될 수 있다. 상기의 결과적인 안정한 복합제제는 의사나 환자에게 직접 주입 또는 투여 제제으로 용이하게 제공될 수 있다. 예를 들어, 복합제제는 집이나 임의의 장소에서 주입 또는 투여될 수 있다.
면역 글로불린과 복합제제를 이루는 가용성 히알루로니다아제는 면역 글로불린의 생체이용률을 높여 신체 내 원하는 곳으로의 면역 글로불린의 증가된 이동을 허용한다. 따라서, 복합제제는 통상적인 피하 투여법에 비해, 피하 투여 후 면역 글로불린의 상승되고/되거나 더욱 신속하게 달성되는 농도를 달성하여 예를 들어 주어진 투여량에 대해 더욱 강력하고/하거나 더욱 신속한 응답성을 제공할 수 있다. 추가적으로, 가용성 히알루로니다아제를 함유하는 IG의 복합제제는 더 적은 IG 투여량으로도 주어진 응답성이 달성되도록 하는데 이용될 수 있다. 주사 또는 주입 부위 및 그 부근에서의 벌크 액체 유동을 증강시키는 가용성 히알루로니다아제의 능력은 또한 연합된 약리학적 전달의 다른 측면들을 개선시킬 수 있다. 예를 들어, 벌크 액체 유동의 증가는, 주입되는 액체 부피가 주사 부위로부터 더욱 쉽게 분산되도록 보조할 수 있다 (잠재적 고통 또는 주사의 다른 부작용 결과를 감소시킴). 이는 피하 주입물이 더 많은 투여량으로 투여될 수 있도록 하여 특히 중요하다. 증가된 생체이용률에 추가하여, IG 의 가용성 히알루로니다아제와의 복합제제화는 통상적인 정맥내 투여 경로보다도 더욱 안전하고 더욱 편리한 투여를 제공한다.
J. 실시예
다음의 실시예들은 예증적 목적만을 위하여 포함된 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1
감마가드 액체( Gammagard liquid )(10% 면역글로불린( IG ) 제제)의 제조
감마가드 액체(10% IG)는 인간 혈장의 큰 풀들(pools)로부터 제조하였고, 감염제들(infectious agents)에 대해 전부 스크린하였다. 면역글로불린들은 양이온 및 음이온 교환 크로마토그래피(Teschner 등 (2007) Vox Sang. 92:42-55) 뿐만 아니라, 변형된 콘-온클리(Cohn-Oncley) 냉각 알코올 분획화 공정(Cohn 등 (1946) J. Am. Chem . Soc . 68:459-467)을 이용하여 혈장 풀들로부터 정제되었다. 상기 정제된 단백질은 3개의 독립적인 바이러스 불활성화/제거 단계를 더 거치게 되었다: 용매/계면활성제(S/D) 처리(Horowitz 등 (1994) Blood Coagul . Fibrin . 5(3):S21-S28; Kreil 등 (2003) Transfusion 43:1023-1038), 35㎚ 나노여과(nanofiltartion)(Hamamoto 등 (1989) Vox Sang. 56:230-236; Yuasa 등 (1991) J. Gen . Virol. 72:2021-2024), 및 낮은 pH 및 상승된 온도에서의 배양(Kempf 등 (1991) Transfusion 31:423-427; Louie 등 (1994) Biologicals 22:13-19). 용매/계면활성제(S/D) 방법(procedure)은 트리-n-부틸 포스페이트(tri-n-butyl phosphate), 옥톡시놀-9(octoxynol-9) 및 폴리소르베이트-80(polysorbate-80)로 18 내지 25℃에서 최소 60분 동안 처리하는 것을 포함한다(Posler 등 (2008) Vox Sang. 94:184-192).
본 연구에서 사용된 최종 제제(final preparations)는 pH 4.6 내지 5.1에서 0.25 mM 글리신에서 제제화된 고도로 정제되고 농축된 면역글로불린 G(IG) 항체들의 10% 액체 제제이었다(농축된 용액에서 측정된 것과 같은). 글리신은 안정화제 및 완충제로서 역할을 하며, 첨가된 당, 나트륨 또는 보존제가 없다. 10% IG의 모든 롯은(예를 들어, 롯들(lots) LE12H020, LE12H062, LE12H173, LE12F047)가 실질적으로 유사하였다. 삼투압 농도(osmolality)는 240 내지 300 mOsmol/㎏이고, 이는 생리학적 삼투압와 유사하다. 상기 설명된 공정에 따라 제조된 생성물(product)의 IG 서브클래스들의 분포(distribution)는 정상 혈장의 것과 유사하였다: 적어도 98%의 단백질제제는 IgG이고, 평균 IgA 농도는 37 ㎍/ml이었고(이들 롯들(lots) 중 어느 것도 IgA 농도 > 140㎍/ml 아님), IgM은 미량으로만 존재하였다. Fc 및 Fab 기능들은 유지되었다. 전-칼리크레인 활성화제 활성(Pre-kalikrein activator activity)은 검출될 수 없었다.
실시예 2
SUBQ NG 20%(20% IG )의 제제
A. 농축된, 정제된 IG 조성물의 제조
a. 요약
Teschner 등(2007) Vox Sang . 92:42-55에 의해 설명된 바와 같은 변형된 Cohn 분획화 방법을 이용하는 다음의 냉각 알코올 분획 전에 다양한 미정제(Crude) 응고 인자들 및 억제제들을 분리(isolation)를 위하여 헌혈자들(blood donors)로부터의 미리 동결되어 모아진(pooled) 혈장은 동결침전물 감소혈장(cryo-poor plasma) 시료로 분리되었다. 알코올 분획 방법은, 침전물 G(Precipitate G)로 불리는, 주요한 중간 IG 분획(principal intermediate IG fraction)을 제공하였고, 이것은 크로마토그래피 정제를 이용하여 최종 생성물로 추가적으로 처리되었다. 하류 제조(downstream manufactuing)는 양이온 교환(CM-Sepharose Fast flow) 및 음이온 교환(ANX-Sepharos fast flow)를 포함하였다. 가능한 바이러스 전파(virus transmission)에 대한 높은 안전 한계(safety margin)를 제공하기 위하여, 그들의 작용의 모드를 서로 보완하는, 3개의 전용(dedicated) 바이러스 불활성화/제거 단계들이 제조 공정에 통합되었다. 즉: 용매/계면활성제 처리(1% 트리톤(Triton) X-100, 0.3% 트리-n-부틸 포스페이트 및 0.3% 폴리소르베이트-80), 나노여과(Asahi Planova 35㎚), 및 3주 동안 상승된 온도에서 낮은 PH(4.7) 저장.
b. 동결침전물( Cryoprecipitates )의 분리
안전성 및 품질의 고려사항들을 이미 점검한, 헌혈자들로부터의 미리 동결되어 모아진 혈장을, 6℃ 이하의 온도에서 녹였다. 차가운 상태로 원심분리가 수행되어 고체 및 액체로 분리되었고, 이는 혈장 해동(plasma thawing)을 구성했다. 액체 부분(portion)(또한, "동결침전물 감소혈장"으로도 일컬어지며, 신선한 해동된 혈장으로부터 원심분리에 의해 냉-불용성 단백질들(cold-insoluble proteins)이 제거된 후)은 그리고 나서 0±1℃에서 냉각되었고, 이들의 pH는 7로 조정되었다. 동결침전물 감소 혈장을 다음의 냉각 알코올 분획 전에 다양한 미정제 응고 인자들 및 억제제들을 분리하는데 이용하였다. SUBQ NG 20% 정제 전에 탈-냉동성 혈장으로부터 다양한 미정제 응고 인자들 및 억제제들의 배치 흡착(batch adsorption)을 위해 7개의 경로들(pathways)이 선택되었고, 경로들 1 내지 7은 표 3에 언급된 바와 같다.
표 3. 동결침전물 감소 혈장으로부터 응고 인자들 및 억제제들의 배치 흡착을 위한 경로들
Figure 112012030178927-pct00004
전-임상 SUBQ NG 20% 생산을 위하여, 경로 1(흡착단계 없이 US 소스 혈장(source plasma)), 3(FEIBA, AT-III 흡착 후 US 소스 혈장) 및 6(F-IX, F-VII, AT-III 흡착 후 US 소스 혈장)으로부터 유도된 Cohn 출발 물질들이 알코올 분획 전에 폭넓은 다양한 다른 흡착 단계를 커버하도록 선택되었다. 다양한 흡착 공정들은 Teschner 등 (2007) Vox Sang . 92:42-55; Polsler 등 (2008) Vox Sang . 94:184-192; 미국특허 번호 제6,395,880호 및 제5,409,990호; 및 Prothrombin complex : Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation (J.M. Curling Editor, Academic Press, 1980)에 설명된다.
C. 분획( fractionation )
i. 분획 I의 상청액을 수득
혈장을 교반하는 동안에, 전-냉각된(pre-cooled) 에탄올이 표적 농도(target concentration) 8% v/v(부피/부피) 에탄올에 첨가되었고, 온도를 침전이 허용되도록 추가적으로 -2 내 0℃로 낮추었다. 상청액(또는 분획 I)은 원심분리 후에 수집되었다.
ii . 분획들 II 및 III 의 침전물
온도를 추가적으로 낮춘 동안에, 분획 I은 pH 7 및 20 내지 25% v/v 에탄올 농도로 조정되었다. 다음에, 원심분리를 수행하여 액체(분획 II + 분획 III 상청액) 및 고체를 분리하였다.
iii . 분획들 II 및 III 침전물로부터의 추출
차가운 추출 완충액(5mM 모노베이직 소듐 포스페이트, 5mM 아세테이트, pH 4.5±0.2, 0.7 내지 0.9 mS/㎝ 전도도(conductivity))를 1:15 침전물:추출 완충액의 비율로 분획들 II + III를 재-현탁 하는데 이용하였다.
iv . 흄드 실리카( Fumed Silica ) 처리 및 여과
흄드 실리카(예를 들어, 에어로실 380(Aerosil 380) 또는 동등한 것)가 현탁액의 약 40g/㎏의 농도(또는 1.8g/L의 탈-냉동성 혈장과 동등한 것)로 현탁액에 첨가되었고, 2 내지 8℃에서 50 내지 70분동안 혼합되었다. 액체 및 고체가 2 내지 8℃에서 여과 보조기구(filter aid)(Hyflo Super-Cel, World Minerals Inc., 0.5 kg/kg의 현탁액)를 이용하여 분리되었고, 이어서 추출 완충액으로 압착식 여과기(filter press)의 후-세척(post-washing)을 하였다.
v. 침전물 G의 분획
2 내지 8℃에서 적어도 30분 동안 교반하면서, 여과물(filtrate)을 폴리소르베이트-80와 혼합하여 약 0.2% w/v(중량/부피)의 농도로 혼합하였다. 소듐 시트레이트 디하이드레이트(sodium citrate dehydrate)를 그리고나서 상기 용액에 8g/L로 혼합하였고 2 내지 8℃에서 30분간 더 교반하였다. pH는 그리고 나서 1M 소듐 하이드록사이드 또는 1M 아세트산로 7.0±0.1로 조정되었다. 차가운 알코올은 그리고나서 약 25% v/v의 농도로 용액에 첨가되었고, Cohn II와 유사한 침전 단계가 수행되었다(Cohn 등 (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-467).
vi . 침전물 G의 현탁 및 용매/계면활성제 처리
침전물이 용해되었고, 0.2㎛의 공칭공경(nominal pore size)의 심층필터(Depth filter)(예를 들어 Cuno VR06 필터 또는 동등한 것)으로 여과되어 용매/계면활성제(S/D) 처리에 이용되는 맑은 여과물을 얻었다.
바이러스 불활성화의 첫 번째 단계는 재-현탁된 침전물 G의 S/D 처리이다. S/D 처리 혼합물은 1.0% (v/v) 트리톤(Triton) X-100, 0.3% (v/v) 트리-n-부틸 포스페이트 및 0.3% (v/v) 폴리소르베이트-80를 포함하였고, 상기 혼합물을 18 내지 25℃에서 적어도 60분 동안 유지시켰다.
d. 양이온 교환 크로마토그래피
상기 S/D-포함 단백질 용액은 그리고 나서 양이온 교환 칼럼(카복시메틸(CM)-Sepharose fast flow)를 통과시켜 용매 및 계면활성제를 제거하였다. S/D 시약들을 세척한 후, 흡수된 단백질은 그리고 나서 높은 pH의 용리 완충액(pH 8.5±0.1)으로 용리 되었다.
e. 음이온 교환 크로마토그래피
용출액은 그 후 용액이 평형을 이룬 음이온 교환 컬럼(ANX-Sepharose fast flow)을 통과하기 전에 pH 6으로 조절되어 적절한 전도도까지 희석되었다. 로딩 및 세척이 이루어지는 동안 컬럼 흐름-통과 물질은 추가적인 처리를 위하여 수집되었다.
f. 나노여과
두 번째의 3개의 바이러스 불활성화 단계에서, 마지막 단계로부터의 칼럼의 유출액(column effluent)은 나노 여과(Asahi Planova 35㎚ 필터)되어 나노여과물(nanofiltrate)을 생성하였다.
g. 초여과 ( Ultraflitration ) 및 정용여과( Diafiltration )
상기 나노여과물의 글리신 농도는 0.25M로 조정되었고, 상기 나노여과물은 초여과에 의해 추가로 5±1% w/v 단백질 농도로 농축되었고, pH는 5.2±0.2로 조정되었다. 피하의 적용을 위해 더 높은 단백질 농도에 도달하도록, 상기 초여과는 오픈 채널 스크린(open channel screen) 및 특히 높은 점도(viscosity) 생성물들을 위해 고안된 50kDa 또는 그 이하의 공칭분획분자량(nominal molecular weight cut off; NMWCO)을 갖는 초여과 막(Millipore Pellicon Biomax)을 갖는 카세트에서 수행되었다.
상기 농축물은 pH 4.2±0.2를 갖는 0.25M 글리신 용액에 대해 정용여과 되었다. 최소 교환 부피는 원래 농축물(original concentrate) 부피의 10x이었다. 초여과/정용여과 공정 동안, 상기 용액은 4 내지 20℃를 유지하였다. 정용여과 후, 상기 용액은 최소한 22% w/v의 단백질 농도로 농축되었고, 2 내지 8℃로 조정되었다.
시스템에서 완전한 잔여 단백질(complete residual protein)이 회복되도록, 그에 의해 상기 단백질 농도가 높아지도록, 첫 번째 더 큰 초여과 시스템의 후-세척(post-washing)이 모든 단백질이 세척되는 것이 보증되도록 재-순환 모드에서 적어도 2x 불용부피(dead volume)로 행해졌다. 그리고나서 첫 번째 초여과 시스템의 후-세척물은, 첫 번째 것의 10분의 1 또는 그 이하의 크기인 동일 타입의 막을 갖춘 두 번째 초-/정용여과 시스템를 이용하여, 적어도 22% w/v의 단백질 농도로 농축되었다. 상기 후-세척 농축물은 벌크 용액에 첨가되었다. 상기 두 번째 초여과 시스템은 그리고 나서 후-세척되었고, 상기 용액은 2 내지 8℃로 조정되었다.
h. 제제화( Formulation )
제제화를 위하여, 상기 용액의 단백질 농도는 제2 더 작은 초여과 시스템의 후세척액 및/또는 정용여과 완충액을 갖는 20±0.4% w/v로 조정되었다. 만일 필요하다면, pH는 4.4 내지 4.9로 조정되었다.
i. 추가적인 멸균화
상기 제제화된 벌크 용액은 0.2 마이크론 또는 그 이하의 절대 공경(absolute pore size)를 갖는 막 필터를 통해 첫 번째 여과함으로써 추가로 멸균되었고, 그리고 나서 시험(test)을 위해 취한 시료들과 함께, 적절한 밀봉을 위해 최종 용기들에 무균적으로 제공되었다. 최종 바이러스 불활성화/제거 단계가 밀봉된 용기들을 30 내지 32℃에서 21 내지 22일 동안 저장함으로써 수행되었다.
따라서, 수득된 20% IG 제제들은 고도로 정제되었고, pH 4.4 내지 4.9에서 0.25mM 글리신 내에서 제제화된 면역글로불린(적어도 95% 감마 글로불린)의 등장성 액체 제제였다. 본 연구들에 이용된 최종 제제들은 롯들(lots) SC00107NG, SC00207NG, 및 SC00307NG이었다.
B. 전-임상 배치들( Pre - Clinical Batches )의 특징
전-임상 롯들(lots) SC00107NG, SC00207NG, 및 SC00307NG는 200L 스케일로 제조되었고, 표 4에 따라 특징화 되었다. 최종 벌크 수준에서, 제제의 순도는 주요 불순물들의 낮은 수준에 의해 표시되었고, 상기 주요 불순물들은 총 IgG의 0.1% 보다 훨씬 낮았다. 공정의 최종 단계(stage)에서 20% IG 생성물 내의 분자 사이즈 분포(molecular size distribution; MSD)는 10% IG(감마가드 액체) 최종 용기의 MSD와 유사하였다. 이것은 20% 단백질로 농도가 증가하는 것이 IgG 분자의 완전성(integrity)에 부정적인 영향을 주지 않음을 나타내었다.
표 4. SUBQ NG 20% 롯 들의 특징
Figure 112012030178927-pct00005
예비의 최종 용기 방출 기준(release criteria)은 피하의 인간 면역글로불린들을 위한 미국(U.S) 및 유럽 당국(FDA 및 EMEA)으로부터의 필요요건들(requirements), 피하 투여(SUBCUVIA, 유럽에서 피하의 투여에 대한 허가 받은)를 위한 최신의 생성물(current product)의 최종 용기 설명들(specifications) 및 감마가드 액체 설명들을 기초로 정의되었다. 세 개의 최종 용기들의 관련 항체 스펙트럼의 특징이 완성되었고, 전-임상 10% IG Triple Virally Reducesd(TVR) 롯들로부터의 결과들과 비교하였다. 표 5는 세 개의 전-임상 SUBQ NG 20% 최종 용기들 및 전-임상 감마가드 액체 롯들의 항체 역가들(antibody titers) 및 농축 인자들(enrichment factors)의 결과들을 비교한다. 상기 결과들은 양 롯들에 대한 규모의 동일 차수(same order of magnitude)에 있다.
표 5. SUBQ NG 20% 및 10% IG TVR 방출 데이터의 비교
Figure 112012030178927-pct00006
추가적인 품질 대조군 시험들(quality control tests)을 수행하여 생성물 및/또는 공정-관련 불순물들의 수준을 평가하였다. 표 6은 세 개의 SUBQ NG 20% 최종 용기들의 품질 대조군 데이터를 보여준다. 생성물 및 공정-관련 불순물들의 제거가 만족스러우며, 모든 생성물-관련 예비의 설명들은 모든 세 개의 롯들에 대해 충족되었다.
표 6. SUBQ NG 20% 최종 용기의 품질 대조군 시험들
Figure 112012030178927-pct00007
Figure 112012030178927-pct00008
전-임상의 생산 동안에 공정 파라미터들(In-process parameters)을 모니터링하였고, 중간체들(intermediates) 및 최종 생성물의 특징은 세 가지 롯들 사이의 검출 가능한 명백한 차이가 없음을 보여주었다. 출발 물질(침전물 G VNELG171, VNELG173, 또는 LB0790401)의 종류로 어떤 것이 선택되었는지와 관계없이 모든 최종 용기들은 예비적인 설명들과 관련된 생성물을 만족시켰다.
C. 20% IG 제제의 저장 연구
20% IG 최종 용기들의 저장 안정성(storage stability)을 평가하기 위해, 상기 설명된 3 전-임상 롯들(SC00107NG, SC00207NG, SC00307NG) 및 하나의 실현가능성 롯(feasibility lot)(IgGSC 62/1)들이 2 내지 8℃ 및 28 내지 30℃(실현가능성 롯만)에서 18개월까지동안 저장되었다. 고성능 사이즈 배제 크로마토그래피(high performance size exclusion chromatography)가 시료의 분자 사이즈 분배(MSD) 및 안정성을 결정하는데 이용되었다. 주요 안정성 표시 파라미터(main stability indicating parameter)는 분자 사이즈이며, 및 사이즈에 대한 변화는 변성(denaturation), 응집(aggregation) 또는 단편화(fragmentation)에 의한 분해(degradation)의 결과일 수 있다.
2 내지 8℃에서 12개월까지 저장 후에 상기 전-임상 최종 용기들의 MSD를 표 7에 나타낸다. 표 8은 2 내지 8℃ 및 28 내지 30℃에서 18개월까지 후에 실현가능성 롯, IgGSC 62/1의 MSD를 제공한다. 데이터는 상기 생성물들이 2 내지 8℃ 및 28 내지 30℃에서 18개월까지동안 조사된 파라미터들에 대한 전-임상 설명들을 준수함을 확인했다.
표 7. 2 내지 8℃에서 전-임상의 20% IG 배치의 MSD
Figure 112012030178927-pct00009
표 8. 2 내지 8℃ 및 28 내지 30℃에서 실현가능성 롯 IgGSC 62/1의 MSD
Figure 112012030178927-pct00010
D. 다양한 IG 농도 및 제제의 안정성 연구
낮은 pH(0.25M 글리신 pH 4.4-4.9)를 갖는 높은 단백질 농도 제제(14-20%)의 저장 안정성은, 최근에 근육내로 및 피하로 주입가능한 면역글로불린으로 사용되는, 중성의 pH(22.5g/L 글리신, 3g/L NaCl, pH 7.0)을 갖는 높은 농도 제제과 비교하였다.
모든 작동들(runs)은 5% 나노여과물의 농도에서 시작하였다. 0.15M 글리신(가장 낮은 글리신 농도가 조사되었다.)에 대한 10x 완충액 교환이 수행되었고, 이어서 30K의 분자분획(molecular cut-off)(표준 스크린)을 갖는 0.5㎡ 폴리에테르술폰 Millipore 막을 이용하여 표적에 대한 최종농도 20% 초과 단백질을 평가했다. 최종 용기들은 2 내지 8℃ 또는 28 내지 30℃에서 3개월동안 저장 전에 낮은 pH(4.7)에서 제제화되고 저장되거나, 낮은 pH 저장을 대량으로 행하였고 이후 그들은 중성의 pH(7.0)에서 제제화되었다. 3개월 후, 응집물 및 단편 함량을 결정하기 위하여 분자 사이즈 분포는 고성능 사이즈 배제 크로마토그래피에 의해 결정되었다.
허용 기준(acceptance criteria)은 다음과 같이 정의 되었다: 단량체 및 올리고-/이량체, ≥ 90%; 응집물, ≤ 5%, 단편, ≤ 5%. ACA 역가는 유럽 약전(European Pharmacopoeia)에 설명된 것과 같이 시험되었다. 용인되는 ACA 역가는 mg 단백질 당 소비되는 50% 미만 CH50 유닛으로서 정의되었다.
표 9 및 10은 서로 다른 단백질 농도에서 표준 제형들(pH 4.7, 0.25M 글리신; 또는 pH 7.0, 22.5g/L 글리신, 3g/L NaCl)에 대한, 각각 28 내지 30℃ 및 2 내지 8℃에서 3개월 저장 후, ACA 역가 뿐만 아니라 응집물 및 단편 함량을 나타낸다. 데이터는 28 내지 30℃에서 3개월 저장 후, 낮은 pH 제형이 더 낮은 응집물 및 더 낮은 ACA 역가를 가진다는 것을 명백하게 나타낸다. pH 7.0 제형의 모든 ACA 역가는 이 시험 대해 정의된 허용 기준을 초과했다.
2 내지 8℃에서의 결과는 28 내지 30℃에서 보여진 추세를 확인한다. pH 7.0 제형이 더 높은 값을 보였지만, ACA 역가는 모두 허용 기준으로 정의된 허용치(limit) 아래였다. 단백질 값은 시험된 파라미터의 결과에 영향을 미치지 않는다.
표 9. 서로 다른 단백질 농도에서 pH 4.7 및 pH 7.0에서 28 내지 30℃에서 3개월 저장 후 단편, 응집물 , 및 ACA 값
Figure 112012030178927-pct00011
표 10. 서로 다른 단백질 농도에서 pH 4.7 및 pH 7.0에서 2 내지 8℃에서 3개월 저장 후 단편, 응집물 , 및 ACA 값
Figure 112012030178927-pct00012
MSD 및 ACA 역가에 대한 서로 다른 농축 방법(procedure)의 영향을 조사하였다. 첫 번째 방법은, 상기 설명된 바와 같은, 30K의 분자분획(molecular cut-off)(표준 스크린)을 갖는 0.5㎡ 폴리에테르술폰 Millipore 막을 이용하였고, 및 두 번째 방법은, 더 높은 점도를 갖는 용액에 적합한, 오픈 스크린을 갖는 0.5㎡ 폴리에테르술폰 Millipore 막을 이용하였다. 후-세척 분획들은, 수율 손실(yield losses)을 줄이도록 더 낮은 막 표면적(0.1㎡, 오픈 스크린)을 갖는 두 번째 초-/정용여과 장치에 의해 농축되었다.
표 11 및 12는 다양한 단백질 농도에서 낮은 pH(4.7) 제형에 대한, 각각 28 내지 30℃ 또는 2 내지 8℃에서 3개월 저장 후, MSD 및 ACA 역가를 나타낸다. 2 내지 8℃에서 수득한 값은 28 내지 30℃에서 수득한 결과를 확인했다. 적절한 후-세척이 단지 오픈 스크린 막을 이용하여 수득될 수 있음에도 불구하고, 농축 방법(concentration method)은 생성물의 안정성에 영향을 미치지 않는다.
표 11. 서로 다른 단백질 농축방법으로 pH 4.7에서 28 내지 30℃에서 3개월 저장 후 단편, 응집물 , 및 ACA 값
Figure 112012030178927-pct00013
표 12. 서로 다른 단백질 농축방법으로 pH 4.7에서 2 내지 8℃에서 3개월 저장 후 단편, 응집물 , 및 ACA 값
Figure 112012030178927-pct00014
실시예 3
가용성 재조합 인간 PH 20( rHuPH20 )의 제조
A. 가용성 rHuPH20 -발현 세포주의 생성
HZ24 플라스미드(서열번호:52로 표시)가 차이니즈 햄스터 난소(CHO 세포)를 트랜스펙션하는데 이용되었다(예를 들어, 출원번호 10,795,095, 11/065,716 및 11/238,171 참조). 가용성 rHuPH20 발현을 위한 HZ24 플라스미드 벡터는 pCI 벡터 백본(Promega), 인간 PH20 히알루로니다아제(서열번호:49)의 아미노산 1 내지 482를 코딩하는 DNA, ECMV 바이러스로부터의 내부 리보솜 부착부위(internal ribosomal entry site; IRES)(Clontech), 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제(dihydrofolate reductase; DHFR) 유전자를 포함한다. pCI 벡터 백본은 또한 베타-락타마제 내성 유전자(AmpR)를 코딩하는 DNA, f1 복제기점, 시토메갈로바이러스 즉시-초기 인핸서/프로모터 부위(CMV), 키메릭 인트론 및 SV40 후기 폴리아데닐화 시그널(SV40)을 포함한다. 가용성 rHuPH20 구축물(construct)을 코딩하는 DNA는 인간 PH20의 고유한 35개의 아미노산 시그널 서열의 아미노산 위치 1의 메티오닌을 코딩하는 DNA 앞에 NheI 부위 및 코작 컨센서스서열, 및 인간 PH20 히알루로니다아제(서열번호:1로 표시)의 아미노산 위치 482에 해당하는 타이로신을 코딩하는 DNA 뒤의 정지코돈, 이어서 BamHI 제한부위를 포함한다. 구축물 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)은, 따라서, 구축물 pCI-PH20-IRES-DHFR-SV40pa(HZ24)은, 따라서, 내부 리보솜 부착부위(IRES)에 의해 분리되는, 인간 PH20의 아미노산 1 내지 482(서열번호:3로 표시) 및 마우스 디히드로폴레이트 리덕타제의 아미노산 1 내지 186(서열번호:53로 표시)을 코딩하는 CMV 프로모터에 의해 유도되는 단일 mRNA종을 생성한다.
4mM 글루타민 및 18ml/L 플루리오닉(Pluronic) F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 GIBCO 변형 CD-CHO 배지에서 성장하는 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포를, 트랜스펙션용으로 준비한 플라스크 내에 0.5 x 106 세포/ml로 접종하였다. 세포를 120rpm으로 진탕시키면서, 습식배양기에서 5% CO2에서 37℃로 성장시켰다. 기하급수적으로 성장하는 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 생존력(viability)을 트랜스펙션 전에 시험하였다.
비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포 배양물의 6천만 생존세포를 펠렛화하고, 2x 트랜스펙션 완충액(2x HeBS: 40 mM 헤페스(Hepes), pH 7.0, 274 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.4 mM Na2HPO4, 12 mM 덱스트로스) 0.7 mL 내에 2×107 세포밀도로 재현탁시켰다. 재현탁된 세포의 각각의 분액(aliquot)에, 선형 HZ24 플라스미드(Cla I(New England Biolabs))로 하룻밤동안 소화시켜 선형화됨) 0.09 mL(250μg)을 첨가하고, 상기 세포/DNA 용액을 실온에서 0.4 cm gap BTX(Gentronics) 전기천공 큐벳(electroporation cuvettes) 내로 이동시켰다. 음성대조군 전기천공을 상기 세포와 플라스미드 DNA를 혼합하지 않고 수행하였다. 상기 세포/플라스미드 혼합물을 330V 및 960μF 또는 350V 및 960μF의 캐패시터 방전(discharge)으로 전기천공하였다.
전기천공 후 상기 세포를 큐벳으로부터 제거하여, 4mM 글루타민 및 18ml/L 플루리오닉 F68/L(Gibco)이 보충된, DHFR(-) 세포용 변형 CD-CHO 배지 5 mL내로 옮기고, 습식배양기에서 5% CO2에서 37℃로 2일 동안 선별없이 6-웰 조직배양 플레이트의 웰 내에서 성장하도록 하였다.
전기천공 2일 후, 조직배양 배지 0.5 mL을 각각의 웰로부터 제거하고, 실시예 4에 설명된 미세탁도 분석(microturbidity assay)을 이용하여, 히알루로니다아제 활성의 존재를 시험하였다.
표 13. 트렌스펙션 40시간 후 HZ24 트렌스펙션된 DG44 CHO 세포의 초기 히알루로니 다아제 활성
Figure 112012030178927-pct00015
트랜스펙션 2(350V)의 세포를 조직배양 웰로부터 수집하고, 계수하여 mL당 1×104 내지 2×104 생존세포로 희석하였다. 세포현탁액 0.1 mL 분액(aliquot)을 5개의, 96웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트의 각각의 웰로 옮겼다. 4 mM GlutaMAX™-1 보충물(GIBCO™, Invitrogen Corporation)을 포함하고 하이포크산틴(hypoxanthine) 및 티미딘(thymidine) 보충물 부재인 CD-CHO 배지(GIBCO) 100 마이크로리터를 세포를 포함하는 웰에 첨가하였다(최종부피 0.2mL).
10개의 클론을 메토트렉세이트 부재하 성장시킨 5개의 플레이트로부터 확인하였다(identified).
표 14. 확인된 클론의 히알루로니다아제 활성
Figure 112012030178927-pct00016
6개의 HZ24 클론을 배양물 내 확장시키고, 단일세포 현탁액으로서 진탕플라스크 내로 옮겼다. 클론 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11 및 4D10을 맨위 왼쪽 웰에서 5000개 세포로 시작하여, 플레이트의 아래로 1:2로, 그리고 플레이트를 가로질러 1:3으로 세포를 희석하는 이차원 무한희석전략을 이용하여 96-웰 라운드 보텀 조직배양 플레이트 내로 플레이팅하였다. 희석된 클론을 웰당 500개의 비-트랜스펙션된 DG44 CHO 세포의 백그라운드에서 성장시켜, 배양물내에 초기 몇일 동안 필수성장인자들을 제공하였다. 서브클론당, 50nM 메토트렉세이트를 포함한 5개 플레이트 및 메토트렉세이트 부재의 5개 플레이트를 가지는, 10개의 플레이트를 만들었다.
클론 3D3은 24개의 가시적인 서브클론을 생산하였다(메토트렉세이트 미처리로부터 13개 및 50 nM 메토트렉세이트 처리로부터 11개). 유의적인 히알루로니다아제 활성이 24개 서브클론 중 8개의 상청액에서 측정되었으며(>50 유닛/mL), 상기 8개의 서브클론을 T-25 조직배양 플라스크 내로 확장시켰다. 메토트렉세이트 처리 프로토콜로부터 분리된 클론을 50nM 메토트렉세이트 존재하에 확장시켰다. 클론 3D35M을 500nM 메토트렉세이트에서 추가로 확장시켜 진탕플라스크 내 1,000 유닛/ml 초과로 생산하는 클론을 생성하였다(클론 3D35M; 또는 Gen1 3D35M). 그 다음 3D35M 세포의 마스터 세포은행(master cell bank, MCB)을 준비하였다.
B. Gen1 인간 PH20 의 생산 및 정제
a. 5L 생물반응기 공정
3D35M 바이얼을 해동하고, 100nM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad Calif.)에서 1L 스피너 플라스크를 통하여 진탕플라스크로부터 확장시켰다. 세포를 ml당 4×105개 생존세포의 접종밀도로 스피너 플라스크로부터 5L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도 설정점: 37℃; pH 7.2(시작 설정점); 용존산소 설정점: 25%; 및 공기 오버레이: 0 내지 100 cc/분이었다. 168시간에, 피드#1 배지(50 g/L 글루코스를 함유한 CD CHO) 250 ml을 첨가하였다. 216시간에, 피드#2 배지(50 g/L 글루코스 및 10mM 부티르산 나트륨를 함유한 CD CHO) 250 ml을 첨가하고, 264시간에 피드#2 배지 250 ml을 첨가하였다. 상기 공정은 6×106 세포/ml의 최대 세포밀도를 가지는 ml당 1600 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 부티르산 나트륨의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20 생산을 크게 향상시키기 위한 것이었다.
3D35M 클론의 조건배지를 10mM pH 7.0 Hepes 내로 심층여과 및 접선유동(tangential flow) 정용여과에 의해 정화하였다. 그다음 가용성 rHuPH20을 Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환, 페닐 세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피, 페닐 보로네이트(Prometics) 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피(Biorad, Richmond, CA)상에 순차적인 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
Q 세파로즈에 결합된 가용성 rHuPH20을 동일한 완충액 내 400 mM NaCl에서 용출시켰다. 상기 용출물을 최종농도 500mM의 암모늄 설페이트가 되도록 2 M 암모늄 설페이트로 희석하고, 페닐 세파로즈(low sub) 컬럼을 통과시킨 후, 페닐 보로네이트 레진에 동일한 조건하에 결합시켰다. 가용성 rHuPH20을 암모늄 설페이트 부재의 50 mM 비신(bicine)으로 pH 9.0에서 세척한 후, pH 6.9 Hepes로 페닐 세파로즈 레진으로부터 용출시켰다. 상기 용출물을 5mM 포타슘 포스페이트 및 1mM CaCl2 내 pH 6.9에서 세라믹 히드록시아파타이트 레진 상에 로딩하고, 0.1mM CaCl2 함유 pH 7.4, 80 mM 포타슘 포스페이트로 용출시켰다.
생성된 정제된 가용성 rHuPH20은 USP 참조표준을 이용한 미세탁도 분석(실시예 4)의 방법에 의해 65,000 USP 유닛/mg 단백질 초과의 비활성(specific activity)을 보유하였다. 정제된 가용성 PH20는 0.1% TFA/H2O 내지 0.1% TFA/90% 아세토니트릴/10% H20 사이의 구배를 가지는 Pharmacia 5RPC 스티렌 디비닐벤젠 컬럼으로부터 24분 내지 26분까지 단일피크로서 용출되었고, SDS 전기영동에 의해 하나의 넓은 61kDa 밴드로서 나타났으며, 이는 PNGASE-F 처리시 선명한 51kDa 밴드로 감소되었다. N-말단 아미노산 서열분석은 리더 펩티드가 효율적으로 제거되었음을 보여주었다.
b. 100L 생물반응기 세포배양 내로의 상류 세포배양 확장 공정
스케일-업 공정을 이용하여 3D35M 세포의 4개의 다른 바이알로부터 가용성 rHuPH20를 별도로 정제하여 가용성 HuPH20의 4개의 분리된 배치를 생산하였다; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C 및 HUA0420C. 각각의 바이알을 별도로 확장시키고, 125L 생물반응기를 통하여 배양한 다음, 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제하였다. 전과정 동안 시료를 취하여 효소 수율과 같은 파라미터를 평가하였다. 하기 제공되는 공정의 설명은 생물반응기 시작 및 피드배지 부피, 이동 세포밀도, 및 세척 및 용출부피와 같은 것들에 대한 대표적인 설명을 나타낸다. 정확한 수치는 각 배치마다 약간씩 다르며, 표 15 내지 22에 상세히 나와 있다.
3D35M 세포의 4개의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 100 nM 메토트렉세이트 및 40 mL/L GlutaMAX™-1이 포함된 CD CHO를 첨가하고, 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20 mL을 함유한 125 mL 진탕플라스크 내 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125 mL 진탕플라스크 내 40 mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 100 mL 배양부피로 125 mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 200 mL 배양부피로 250 mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 800 mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 5L 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 배양물을 20L 배양부피로 36L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
125L 반응기를 121℃, 20 psi에서 증기로 멸균하고, CD CHO 배지 65L를 첨가하였다. 사용 전, 반응기의 오염을 점검하였다. 36L 스피너 플라스크 내 세포밀도가 1.8 내지 2.5x106 세포/mL에 도달했을 때, 20L 세포배양물을 36L 스피너 플라스크로부터 125L 생물반응기(Braun)로 옮겨, 최종부피는 85L, 파종밀도(seeding density)는 약 4×105 세포/mL를 얻었다. 파라미터는 온도설정점: 37℃; pH: 7.2; 용존산소: 25%±10%; 임펠러(Impeller)속도 50 rpm; 용기압력 3 psi; 공기 분사(Sparge) 1 L/분; 공기 오버레이: 1 L/분이었다. 세포계수, pH 검사(verification), 배지분석, 단백질 생산 및 체류(retention)를 위해 매일 반응기를 샘플링하였다. 작동(run) 동안에 영양분 피드(feeds)를 첨가하였다. 6일에, 피드#1 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 40 mL/L GlutaMAX™-1) 3.4L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 9일에, 피드#2 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 40 mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1 g/L 부티르산 나트륨) 3.5L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 11일에, 피드#3 배지(CD CHO + 50 g/L 글루코스 + 40 mL/L GlutaMAX™-1 + 1.1 g/L 부티르산 나트륨) 3.7L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 14일 또는 세포의 생존률이 50% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정 결과, 8백만 세포/mL의 최대세포밀도를 가지고 1600 유닛/ml의 효소활성을 가지는 가용성 rHuPH20이 생산되었다. 수확 시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도(bioburden), 내독소, 바이러스, 바이러스 입자용 투과전자현미경(transmission electron microscopy, TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
100리터 생물반응기 세포배양 수확물을 폴리에테르설폰 배지(Sartorius)를 가지는 일련의 일회용 캡슐필터를 통하여 최초 8.0μm 심층캡슐, 0.65μm 심층캡슐, 0.22μm 캡슐을 통과, 그리고 최종적으로 0.22μm Sartopore 2000cm2 필터를 통과한 후 100L 멸균 저장백 내로 여과하였다. 배양물을 스피랄 폴리에테르설폰 30kDa MWCO 필터(Millipore)가 있는 2개의 TFF를 이용하여 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로 20L 멸균 저장백 내로 HEPES, 25mM Na2SO4, pH 7.0으로 6× 완충액-교환하였다. 표 15는 세포배양, 수확, 농축 및 완충액-교환 단계에 대한 모니터링 데이터를 제공한다.
표 15. 세포배양, 수확, 농축 및 완충액 -교환 단계에 대한 모니터링 데이터
Figure 112012030178927-pct00017
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(3L 레진, 높이=20cm, 직경=14cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 검정의 결정을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 평형화하였다. 농축되고 정용여과된(diafiltered) 수확물을 100 cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0으로 단백질을 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통하여 여과하였다.
다음에 페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 실시하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(9.1L 레진, 높이=29cm, 직경=20cm)을 준비하였다. 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 상기로부터의 단백질 용출물을 2 M 암모늄 설페이트, 1 M 포타슘 포스페이트 및 1 M CaCl2 원액용액으로, 최종농도가 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM이 되도록 보충하였다. 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트 및 0.1 mM CaCl2, pH 7.0를 100 cm/시간으로 첨가하였다. 통과유체(flow through)를 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다.
컬럼부피 5배의 5mM 포타슘 포스페이트, 0.5M 암모늄 설페이트로 평형화된 아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMedics)(6.3L 레진, 높이=20cm, 직경=20cm)상에 PS-정제된 단백질을 로딩하였다. 상기 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 컬럼을 통과시키고, 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 그 후 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0으로 컬럼을 세척하고, 단백질을 멸균필터를 통하여 20L 멸균백 내로 50 mM Hepes, 100 mM NaCl pH 6.9로 용출시켰다. 용출물의 미생물부하도, 단백질농도, 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(Bio-Rad)(1.6L 레진, 높이=10cm, 직경=14cm)을 5 mM 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 pH 7.0으로 평형화하였다. 세척시료를 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 평가)를 측정하였다. 상기 아미노페닐 보로네이트-정제된 단백질을 포타슘 포스페이트 및 CaCl2를 보충하여 최종농도 5 mM 포타슘 포스페이트 및 0.1 mM CaCl2를 수득하고, 100 cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 세척한 다음, 10 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2 pH로 세척하였다. 단백질을 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0로 용출시키고, 5L 멸균백 내로 0.22μm 필터를 통하여 여과하였다. 용출물의 미생물부하도, 단백질 농도, 효소활성을 시험하였다.
그 다음 HAP-정제된 단백질을 압력탱크를 거쳐 20 nM 바이러스 제거필터를 통하여 펌핑(pump)하였다. 단백질을 DV20 압력탱크 및 필터(Pall Corporation)에 첨가하고, 멸균 20L 저장백 내로 20 nm 포어(pore)가 있는 Ultipor DV20 필터(Pall Corporation)를 통과시켰다. 여과물 내 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산(sialic acid) 프로파일링, 및 공정-관련 불순물을 측정하였다. 그 다음 여과물 내 단백질을 10kDa 분획분자량(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 1mg/mL로 농축하였다. Hepes/식염수 용액(10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0)으로 세척하여 먼저 필터를 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과액을 샘플링하였다. 농축 후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10mM Hepes, 130mM NaCl, pH 7.0으로 6× 완충액-교환을 수행하였다. 농축된 단백질을 20L 멸균저장백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프히드릴기, 올리고당 프로파일링 및 삼투압 농도를 측정하였다.
표 16 내지 22는 각각의 3D35M 세포 롯(lot)에 대한, 상기에서 기술된 각각의 정제단계와 관련된 모니터링 데이터를 제공한다.
표 16. Q 세파로즈 컬럼 데이터
Figure 112012030178927-pct00018
표 17. 페닐 세파로즈 컬럼 데이터
Figure 112012030178927-pct00019
표 18. 아미노 페닐 보로네이트 컬럼 데이터
Figure 112012030178927-pct00020
표 19. 히드록시아파타이트 컬럼 데이터
Figure 112012030178927-pct00021
표 20. DV20 여과 데이터
Figure 112012030178927-pct00022
표 21. 최종농도 데이터
Figure 112012030178927-pct00023
표 22. 최종제형 데이터로 완충액 -교환
Figure 112012030178927-pct00024
정제되고 농축된 가용성 rHuPH20 단백질을 5 mL 및 1 mL 충전부피(fill volume)의 멸균 바이알에 무균적으로 충전하였다. 단백질을 중량판독(gravimetric readout)을 이용하여 바이알을 충전하는데 사용되는 오퍼레이터-조절 펌프로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 바이알의 마개를 닫고, 가열한 캡으로 고정하였다. 닫힌 바이알의 외래 입자를 가시적으로 검사하고, 라벨을 붙였다. 라벨링 후, 바이알을 1분 이하 동안 액체질소에서 담구어 급속동결시켜 -15℃ 이하(-20±5℃)에 저장하였다.
C. 가용성 인간 PH20 ( rHuPH20 )을 포함하는 Gen2 세포의 생산
상기 설명된 Gen1 3D35M 세포주를 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켜 세대 2(Gen2) 클론을 생산하였다. 확립된 메토트렉세이트-포함 배양물로부터 4 mM GlutaMAX™-1 및 1.0 μM 메토트렉세이트를 포함한 CD CHO 배지 내로 3D35M 세포를 접종하였다. 세포를 37℃, 7% CO2 습식배양기에서 46일의 기간에 걸쳐 성장시키고, 이들을 9번 계대함으로써 더 고수준의 메토트렉세이트로 적응시켰다. 상기 증폭된 세포집단을 2.0 μM 메토트렉세이트를 포함한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 약 4주 후, 클론을 확인하고, 확장을 위해 클론 3E10B를 선택하였다. 3E10B 세포를 20 계대 동안 4mM GlutaMAX™-1 및 2.0μM 메토트렉세이트를 포함한 CD CHO 배지에서 성장시켰다. 3E10B 세포주의 마스터 세포은행(MCB)을 만들고, 후속연구를 위해 동결하여 사용하였다.
4 mM GlutaMAX™-1 및 4.0 μM 메토트렉세이트를 포함한 CD CHO 배지에서 3E10B 세포를 배양함으로써 세포주를 계속 증폭하였다. 12번째 계대 후, 세포를 연구세포은행(research cell bank, RCB)으로서 바이알에 동결시켰다. RCB의 한 바이알을 해동하고, 8.0 μM 메토트렉세이트를 포함한 배지에서 배양하였다. 5일 후, 배지 내 메토트렉세이트 농도를 16.0 μM로, 18일 후에는 20.0 μM로 증가시켰다. 20.0 μM 메토트렉세이트를 포함한 배지 내 8번째 계대로부터 세포를 4mM GlutaMAX™-1 및 20.0 μM 메토트렉세이트를 포함한 CD CHO 배지를 함유한 96-웰 조직배양 플레이트에서 한계희석으로 클로닝하였다. 5 내지 6주 후 클론을 확인하고, 20.0 μM 메토트렉세이트를 포함한 배지에서 확장을 위해 클론 2B2를 선택하였다. 11번째 계대 후, 2B2 세포를 연구세포은행(RCB)로서 바이알에 동결시켰다.
생성된 2B2 세포는 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)을 발현하는 디하이드로폴레이트 리덕타제 결핍(dhfr-) DG44 CHO 세포이다. 가용성 rHuPH20은 약 206카피/세포의 카피수로 2B2 세포에 존재한다. rHuPH20-특이적인 프로브를 이용한 Spe I-, Xba I- 및 BamH I/Hind III-소화된 게놈 2B2 세포 DNA의 서던블롯 분석은 다음의 제한효소분해 프로파일을 나타내었다: Spe I으로 소화된 DNA에서 ~7.7kb의 한 개의 주된 혼성화밴드 및 네 개의 작은 혼성화밴드(~13.9, ~6.6, ~5.7 및 ~4.6kb); Xba I으로 소화된 DNA에서 ~5.0kb의 한 개의 주된 혼성화밴드 및 두 개의 작은 혼성화밴드(~13.9 및 ~6.5kb); BamH I/Hind III으로 소화된 2B2 DNA를 이용하여 관찰된 ~1.4kb의 한개의 단일 혼성화밴드. mRNA 전사물의 서열분석은 유래된 cDNA(서열번호:56)가 위치 1131에서, 예상 시토신(C) 대신에 티미딘(T)인 것으로 관찰되는, 하나의 염기쌍 차이를 제외하고 참조서열(서열번호:49)과 동일함을 나타내었다. 이는 아미노산 서열에는 영향이 없는, 침묵성 돌연변이(silent mutation)이다.
D. 300L 생물반응기 세포배양물에서 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산
HZ24-2B2 바이알을 해동하고, 20μM 메토트렉세이트 및 GlutaMAX™-1(Invitrogen)이 보충된 CD-CHO 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 진탕플라스크로부터 36L 스피너 플라스크를 통하여 확장시켰다. 요약하면, 세포의 바이알을 37℃ 항온조에서 해동하고, 배지를 첨가하여 세포를 원심분리하였다. 세포를 신선배지 20 mL이 있는 125 mL 진탕플라스크에 재-현탁시키고, 37℃, 7% CO2 배양기에 두었다. 세포를 125 mL 진탕플라스크에서 40 mL까지 확장시켰다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 100 mL 배양부피로 125 mL 스피너 플라스크 내로 확장시켰다. 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 200 mL 배양부피로 250 mL 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 플라스크를 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 800 mL 배양부피로 1L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 초과에 도달했을 때, 배양물을 5000 mL 배양부피로 6L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다. 세포밀도가 1.5x106 세포/mL 이상에 도달했을 때, 배양물을 32 L 배양부피로 36 L 스피너 플라스크 내로 확장시키고, 37℃, 7% CO2에서 배양하였다.
400L 반응기를 멸균하고, CD-CHO 배지 230mL을 첨가하였다. 사용 전, 반응기의 오염을 점검하였다. 약 30L의 세포를 36L 스피너 플라스크로부터 접종밀도 mL당 4.0x105개 생존세포 및 총부피 260 L로, 400 L 생물반응기(Braun)로 옮겼다. 파라미터는 온도설정점: 37℃; 임펠러속도: 40 내지 55 rpm; 용기압력: 3 psi; 공기 분사(sparge): 0.5 내지 1.5 L/분; 공기 오버레이: 3 L/분이었다. 세포계수, pH 검사, 배지분석, 단백질 생산 및 체류를 위해 반응기를 매일 샘플링하였다. 또한, 작동 동안에 영양분 피드를 첨가하였다. 120시간(5일)에, 피드#1 배지(4×CD CHO + 33g/L 글루코스 + 160mL/L Glutamax™-1 + 83mL/L 이스톨레이트(Yeastolate) + 33mg/L rHuInsulin) 10.4L를 첨가하였다. 168시간(7일)에, 피드#2 배지(2×CD CHO + 33g/L 글루코스 + 80mL/L Glutamax™-1 + 167mL/L 이스톨레이트 + 0.92mg/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36.5℃로 변경하였다. 216시간(9일)에, 피드#3 배지(1×CD-CHO + 50g/L 글루코스 + 50mL/L Glutamax™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 1.80mg/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 36℃로 변경하였다. 264시간(11일)에, 피드#4 배지(1×CD CHO + 33g/L 글루코스 + 33mL/L Glutamax™-1 + 250mL/L 이스톨레이트 + 0.92g/L 부티르산 나트륨) 10.8L를 첨가하고, 배양온도를 35.5℃로 변경하였다. 피드배지의 첨가는 생산의 최종단계에서 가용성 rHuPH20의 생산을 크게 향상시키는 것으로 관찰되었다. 14일 또는 15일에, 또는 세포의 생존률이 40% 미만으로 감소했을 때, 반응기를 수확하였다. 상기 공정은, 12백만 세포/mL의 최대세포밀도를 갖고 ml당 17000 유닛의 최종 생산성의 결과를 가져왔다. 수확 시, 시험관내 및 생체내의 마이코플라스마, 미생물부하도, 내독소 및 바이러스, 투과전자현미경(TEM) 및 효소활성을 위해 배양물을 샘플링하였다.
4 내지 8μm 등급의 규조토(diatomaceous earth) 층 및 1.4 내지 1.1μm 등급의 규조토 층을 각각 포함하는, 평행한 4개의 밀리스택 여과시스템 모듈(Millistak filtration system module, Millipore)을 통하여 연동펌프에 의해 배양물을 펌핑한 다음, 이어서 셀룰로스 막을, 그 다음 0.4 내지 0.11μm 등급의 규조토 층 및 0.1μm 미만 등급의 규조토 층을 함유하는 2번째 단일 밀리스택 여과시스템(Millipore)을 통과 후, 그 다음 셀룰로스 막을, 그 다음 350L 용량의 멸균 일회용 연성 백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 수확된 세포배양 유체를 10mM EDTA 및 10mM 트리스로 pH 7.5까지 보충하였다. 4개의 Sartoslice TFF 30kDa 분획분자량(MWCO) 폴리에테르 설폰(PES) 필터(Sartorious)를 이용하여 접선유동여과(TFF) 장치로 배양물을 10× 농축시킨 다음, 0.22μm 최종필터 내로, 50L 멸균 저장백 내로 10mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 10× 완충액-교환시켰다.
농축되고 정용여과된 수확물을 바이러스에 대하여 불활성화시켰다. 바이러스 불활성화 전에, 10% 트리톤 X-100, 3% 트리-n-부틸 포스페이트(TNBP) 용액을 준비하였다. 농축되고 정용여과된 수확물을 Q 컬럼에서 정제하기 직전 36L 유리 반응용기에서 1시간 동안 1% 트리톤 X-100, 0.3% TNBP에 노출시켰다.
E. Gen2 가용성 rHuPH20 의 정제
Q 세파로즈(Pharmacia) 이온교환 컬럼(9L 레진, H=29cm, D=20cm)을 준비하였다. pH, 전도도 및 내독소(LAL) 분석을 위하여 세척시료를 수집하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5로 컬럼을 평형화하였다. 바이러스 불활성화후, 농축되고 정용여과된 수확물을 100 cm/시간의 유속으로 Q 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼부피 5배의 10 mM 트리스, 20 mM Na2SO4, pH 7.5 및 10 mM Hepes, 50 mM NaCl, pH 7.0으로 컬럼을 세척하였다. 10 mM Hepes, 400 mM NaCl, pH 7.0을 가지고 0.22μm 최종필터 내로, 멸균백 내로 단백질을 용출시켰다. 용출물 시료의 미생물부하도, 단백질 농도, 히알루로니다아제 활성을 측정하였다. 상기 교환의 시작과 끝에 A280 흡광도를 측정하였다.
페닐-세파로즈(Pharmacia) 소수결합 크로마토그래피를 다음으로 실시하였다. 페닐-세파로즈(PS) 컬럼(19-21L 레진, H=29cm, D=30cm)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 평형화시켰다. Q 세파로즈 컬럼으로부터 단백질 용출물을 2M 암모늄 설페이트, 1 M 포타슘 포스페이트 및 1 M CaCl2 원액용액으로 보충하여, 최종농도가 각각 5 mM, 0.5 M 및 0.1 mM이 되었다. 단백질을 100 cm/시간의 유속으로 PS 컬럼 상에 로딩하고, 컬럼 통과유체(flow-through)을 수집하였다. 컬럼을 100 cm/시간으로 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트 및 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 세척하고, 세척물을 수집된 통과유체에 첨가하였다. 컬럼 세척물과 합쳐진, 통과유체를 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 위하여 통과유체를 샘플링하였다.
아미노페닐 보로네이트 컬럼(ProMetic)을 준비하였다. 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)을 위하여 샘플링하였다. 컬럼을 컬럼부피 5배의 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트로 평형화시켰다. 정제된 단백질을 포함한 PS 통과유체를 100 cm/시간의 유속으로 아미노페닐 보로네이트 컬럼 상에 로딩하였다. 컬럼을 5 mM 포타슘 포스페이트, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 7.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 0.5 M 암모늄 설페이트, pH 9.0으로 세척하였다. 컬럼을 20 mM 비신, 100 mM NaCl, pH 9.0으로 세척하였다. 단백질을 50 mM Hepes, 100 mM NaCl, pH 6.9로 용출하고, 멸균백 내로 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
히드록시아파타이트(HAP) 컬럼(Bio-Rad)을 준비하였다. 상기 세척물을 수집하고, pH, 전도도 및 내독소(LAL 분석)를 측정하였다. 5 mM 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2, pH 7.0으로 컬럼을 평형화하였다. 아미노페닐 보로네이트 정제 단백질을 최종농도 5 mM의 포타슘 포스페이트 및 0.1 mM CaCl2로 보충하고, 100 cm/시간의 유속으로 HAP 컬럼 상에 로딩하였다. 5 mM pH 7 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 다음에 10 mM pH 7 포타슘 포스페이트, 100 mM NaCl, 0.1 mM CaCl2로 컬럼을 세척하였다. 단백질을 70 mM pH 7.0 포타슘 포스페이트로 용출시키고, 멸균백 내로 0.22μm 멸균필터를 통과시켰다. 용출된 시료의 미생물부하도, 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다.
그 다음 HAP-정제된 단백질을 바이러스 제거필터를 통과시켰다. 멸균 Viosart 필터(Sartorius)를 먼저 2L의 70 mM 포타슘 포스페이트, pH 7.0 로 세척하여 준비하였다. 사용 전, pH 및 전도도를 위하여 여과된 완충액을 샘플링하였다. HAP 정제된 단백질을 20 nM 바이러스 제거필터를 통하여 연동펌프를 거쳐 펌핑하였다. 70 mM pH 7.0 포타슘 포스페이트 내 여과된 단백질을 멸균백 내로 0.22μm 최종필터를 통과시켰다. 바이러스 여과된 시료의 단백질 농도, 효소활성, 올리고당, 단당류 및 시알산 프로파일링을 측정하였다. 또한 시료의 공정 관련 불순물(process related impurities)을 측정하였다.
다음으로 여과물 내 단백질을 10kDa 분획분자량(MWCO) Sartocon Slice 접선유동여과(TFF) 시스템(Sartorius)을 이용하여 10mg/mL로 농축시켰다. 필터를 먼저 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0으로 세척하여 준비하고, pH 및 전도도를 위해 투과물을 샘플링하였다. 농축 후, 농축된 단백질을 샘플링하여 단백질 농도 및 효소활성을 측정하였다. 농축된 단백질에 대하여 최종완충액: 10 mM 히스티딘, 130 mM NaCl, pH 6.0 내로 6× 완충액-교환을 실시하였다. 완충액-교환 후, 농축된 단백질을 20L 멸균저장백 내로 0.22μm 필터를 통과시켰다. 단백질을 샘플링하여 단백질 농도, 효소활성, 유리 설프하이드릴기, 올리고당 프로파일링 및 삼투압 농도를 측정하였다.
그 다음 멸균여과된 벌크 단백질을 30 mL 멸균 테프론 바이알(Nalgene) 내로 20 mL씩 무균적으로 분주하였다. 그 다음 바이알을 급속동결시키고, -20±5℃에서 저장하였다.
F. Gen1 가용성 rHuPH20 및 Gen2 가용성 rHuPH20 의 생산과 정제의 비교
300L 생물반응기 세포배양물 내 Gen2 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제는 100L 생물반응기 세포배양물 내 Gen1 가용성 rHuPH20의 생산 및 정제와 비교하여 프로토콜상의 약간의 변화를 포함한다. 표 23은 상기 방법들 간에 단순한 스케일업 변화뿐만 아니라 실시예의 차이를 기재하고 있다.
표 23. Gen 1과 Gen 2 방법의 비교
Figure 112012030178927-pct00025
Figure 112012030178927-pct00026
실시예 4
미세탁도 분석법을 사용한 가용성 rHuPH20 히알루로니다아제 활성의 결정
세포 배지, 정제 분획 및 정제된 용액과 같은 샘플에서 가용성 재조합 인간 PH20(rHuPH20)의 히알루로니다아제 활성은, 히알루론산과 혈청 알부민의 결합 시 불용성 침전물의 형성에 기초한 탁도 분석법을 사용하여 수행되었다. 활성은 설정된 시간 간격(10분) 동안 소듐 히알루로네이트(히알루론산)와 함께 가용성 rHuPH20을 배양하고, 그 후, 소화되지 않은 소듐 히알루로네이트을 산성화된 혈청 알부민과 함께 침전시킴으로써 측정되었다. 수득된 샘플의 탁도는 30분의 진행 기간 후 640nm에서 측정하였다. 소듐 히알루로네이트 기질에 대한 효소 활성에 기인한 탁도의 감소는 가용성 rHuPH20 히알루로니다아제 활성의 척도이다. 상기 방법은 가용성 rHuPH20 평가 작용 참조 표준(working reference standard)의 희석물로 만들어진 보정 곡선(calibration curve)을 사용하여 수행되며, 시료 활성 측정은 보정 곡선과 비교하여 측정하였다.
시료의 희석물을 효소희석용액(Enzyme Diluent Solutions)에서 제조하였다. 상기 효소희석용액 (EDS)은 50 mM PIPES 반응 완충액 (140 mM NaCl, 50 mM PIPES, pH 5.5) 25.0mL와 Sterile Water for Irrigation (SWFI) 25.0 mL에 가수분해된 젤라틴(hydrolyzed gelatin) 33.0 ± 0.05 mg을 용해시키고 25% 인간 혈청 알부민 용액 0.2 mL를 상기 혼합물로 희석하고 30초 동안 볼텍싱(vortexing)하여 제조하였다. 이를 사용하기 2시간 이내에 실시하고, 필요할 때까지 얼음 위에 보관하였다. 상기 시료를 약 1-2 U/mL까지 효소희석용액으로 희석하였다. 일반적으로 각 단계당 최대 희석은 1: 100을 초과하지 않았으며 제1 희석을 위한 초기 시료 크기는 적어도 20μL 이상이었다. 분석을 실시하기 위해 필요한 최소 시료 부피는 공정 시료(In-process Sample)에서, FPLC 분획: 80μL; 조직 배양 상청액: 1 mL; 농축된 재료: 80 μL; 정제 또는 최종 ttep 재료: 80μL 였다. 저단백질 결합(Low Protein Binding) 96-웰 플레이트에 3개씩(in triplicate) 희석물을 만들고, 각각의 희석물 30μL를 Optilux 블랙/클리어 보텀 플레이트(BD BioSciences)로 옮겼다.
2.5 U/mL 농도로 공지의 가용성 rHuPH20의 희석물을 효소희석용액 내에 제조하여 표준 곡선을 작성하고 Optilux 플레이트에 트리플리케이트로 첨가하였다. 상기 희석물은 0 U/mL, 0.25 U/mL, 0.5 U/mL, 1.0 U/mL, 1.5 U/mL, 2.0 U/mL 및 2.5 U/mL을 포함하였다. 효소희석용액 60 μL를 함유하는 “공시약(Reagent blank)”웰을 플레이트에 음성 대조군으로 포함시켰다. 그 다음 상기 플레이트를 덮고 37℃에서 5분 동안 열블록(heat block)으로 가온하였다. 덮개를 제거하고 플레이트를 10초간 진탕하였다. 진탕 후, 플레이트를 열블록에 되돌려 놓고 MULTIDROP 384 액체 핸들링 장치를 SWFI 20.0mL에서 가온한 0.25 mg/mL의 소듐 히알루로네이트 용액(소듐 히알루로네이트(LifeCore Biomedical) 100 mg을 용해시켜 제조)으로 프라임(prime)하였다. 이는 2 내지 4시간 동안, 또는 완전히 용해될 때까지, 2 내지 8℃에서 부드럽게 회전 및/또는 흔들어 부드럽게 혼합하였다. 기질 용액(substrate solution)을 SWFI 9mL, PIPES 10mL 및 5 mg/mL 히알루로네이트 1mL를 혼합하여 제조하였다). 반응 플레이트를 MULTIDROP 384로 이동시키고, 시작키를 눌러서 각 웰 내로 소듐 히알루로네이트 기질 용액 30μL를 분주하여 반응을 개시하였다. 그다음 플레이트를 MULTIDROP 384로부터 제거하고, 플레이트 덮개를 교체하고, 열블록으로 옮기기 전에 10초간 진탕하였다. 37℃에서 10분간 플레이트를 배양하였다. 혈청작용용액(Serum Working Solution)(pH 4.3의 500 mM 아세테이트 완충액 75 mL에서 혈청 저장액 25 mL [1부피의 말 혈청(Sigma)을 9배 부피의 pH 4.3의 500 mM 아세테이트 완충용액으로 희석하고, 염산으로 pH를 3.1로 조정])으로 기계를 프라이밍하고 240μL로 부피설정을 변경함으로써 반응이 정지되도록 MULTIDROP 384를 준비하였다. 플레이트를 열블록으로부터 제거하여 MULTIDROP 384 위에 놓고, 혈청 작용용액 240μL를 웰 내로 분주하였다. 플레이트를 제거하고 10초간 플레이트 리더에서 진탕하였다. 추가 15분 후, 시료의 탁도를 640 nm에서 측정하고, 각 시료의 히알루로니다아제 활성(U/mL로)을 표준곡선에 맞춤(fitting)으로써 결정하였다.
히알루로니다아제 활성(U/ml)을 단백질 농도(mg/mL)로 나누어 비활성도(Units/mg)를 계산하였다.
실시예 5
rHuPH20 의 안정성에 대한 염화나트륨의 영향
rHuPH20은 히스티틴/HCl 및 130 mM 염화나트륨 (NaCl)에서 10 mg/mL를 함유하는 pH 6.5에서 용액 내에 존재하였다. 표 24에서 볼 수 있는 바와 같이, 하기 구성요소를 포함하는 총 6개의 상이한 제제를 제조하였다: pH 7.3, 25 mM Tris, 100 μg/mL rHuPH20, 0.01 % 트윈 80 및 NaCl (0, 50, 100, 150, 200 또는 250 mM). 상기 용액들은 고무 스톱퍼(stopper)를 가지며 알루미늄 캡으로 봉인된 2mL type I 글래스 바이알로 나누어 담았다. 상기 바이알 중 한 세트는 4일 동안 40℃에서 저장되었고 나머지 세트는 2 내지 8℃의 냉장고에서 유지하였다.
표 24. NaCl 을 가진 rHuPH20 제제
Figure 112012030178927-pct00027
저장 4일 후, 표 24에 기재된 제제 각각을 실시예 4에 설명된 미세탁도 분석법을 사용하여 히알루로니다아제 효소 활성을 위해 시험하였다. 사이즈 배제 크로마토그래피 (SEC)를 다음의 조건을 사용하여 응집체의 양을 결정하기 위해 수행하였다; 1X PBS, Toso BioScience G2000 SWXL 컬럼, 유량 = 1 mL/min.
표 25는 각 제제에 대하여 히알루로니다아제 활성(U/ml), % 주요 피크 면적(주요 피크 면적에 포함된 rHuPH20의 백분율)과 % 응집체 피크 면적(응집체에 기인한 피크에 함유된 rHuPH20의 백분율)을 포함하는 연구의 결과를 보여준다. 상기 결과는 40℃에서 배양될 때, rHuPH20의 안정성은 NaCl의 농도에 의존적이라는 것을 나타낸다: NaCl 농도의 증가는 rHuPH20의 증가된 효소 활성을 초래한다. 2 내지 8℃ 저장된 시료는 제제와 상관없이 연구 과정을 통해 비슷한 rHuPH20 효소 활성을 유지한다. 상승된 온도에서 NaCl의 부재하면, rHuPH20의 전 효소 활성이 상실되었다.
표 25의 결과는 또한 rHuPH20의 응집체 양(level)에 대한 NaCl의 농도의 영향을 보여준다. 40℃에서 저장된 시료에서 NaCl 농도 감소와 함께 응집체 양(level)은 증가하였다. 2 내지 8℃에 저장된 시료에서는 본질적인 변화는 없었다.
따라서, 상기 결과는 시험된 NaCl 농도(0-250 nM) 내에서 NaCl 농도와 증가된 rHuPH20 안정성 간에 직접적인 관계가 있으며, 이는 NaCl 농도는 상승된 온도에서 rHuPH20의 안정성을 증가시키기 위하여 용해도 및 긴장도 범위 내에서 가능한 높게 유지된다는 것을 나타낸다.
표 25. 40℃ 및 28℃에서 4일 저장된 시료의 효소 활성 및 SEC 결과
Figure 112012030178927-pct00028
실시예 6
복합 제제화된 rHuPH20 and IG 의 안정성
A. rHuPH20 과 복합 제제화된 10% IG 또는 20% IG 의 안정성
rHuPH20을 다음과 같이 제제화하였다. 1mL는, pH 6.0에서 10 mM 히스티틴 및 130 mM 염화나트륨 (NaCl) 내에 롯(lot) HUB0702CA(실시예 3에 설명된 Gen 2 생산을 사용하여 제조)로부터의 재조합 인간 히알루로니다아제 1048071 유닛을 함유한다. rHuPH20을 면역글로불린과 혼합 전에 pH 6.0, 10 mM의 히스티틴 + 130 mM NaCl을 사용하여 100000 U/mL로 희석하였다. 이를 위해, rHuPH20 저장액 200μL를 pH 6.0, 히스티딘/ NaCl 완충액 1896 μL로 희석하였다.
미리 희석된 rHuPH20를 pH 4.4 내지 4.9의 0.25M 글리신에서 제제화된 상이한 IG 제형에 첨가하여 용액에서 100 U/mL 또는 300 U/mL의 최종 농도로 만들었다. 대규모 제조로부터의 세 개의 상이한 10% IG 롯 (LE12H020, LE12H062, and LE12H173) 중 하나 또는 세 개의 상이한 전-임상(pre-clinical) 20% IG 롯 (SC00107NG, SC00207NG, 및 SC00307NG) 중 하나를 표 26에 따라 사용하였다. 용액들은 0.2 μm 필터로 여과하고 멸균된 5mL글래스 바이알로 1mL의 양(portion)으로 옮겼다. 상기 바이알은 2 내지 8℃ 또는 28 내지 32℃에서 저장되었다. 그러므로 수득된 rHuPH20 및 IG 복합 제제를 pH 4.4 내지 4.9의 0.25M 글리신에서 제제화하였다.
표 26 rHuPH20 및, 10% IG 또는 20% IG 복합제제
Figure 112012030178927-pct00029
0 (시작), 1, 3, 6, 12, 24 및 36 주 (오직 2 내지 8℃) 저장 후, 표 26에 기재된 6개의 제형 각각 및 저장 챔버(2 내지 8℃ 및 28 내지 32℃) 각각으로부터의 하나의 시료를 배양을 중단하고 실시예 4에 설명된 미세탁도 분석법을 사용하여 히알루로니다아제 활성에 대하여 분석하였다. IG에 대한 영향을 평가하기 위하여, 20% IG를 포함하는 제제에서 IG의 분자 사이즈 분포를 TSK G 3000 SW 600 x 7.5 mm 컬럼 (Tosoh Bioscience) 및 DMSO-함유 완충 시스템 (Kolarich et al . (2006) Transfusion, 46:1959-1977)을 사용하는 고성능 액체 크로마토그래피로 0(시작) 및 6개월에 결정하였다.
표 27은 2 내지 8℃에 저장된 각각의 복합제제에 대하여 7 시점(0, 1, 3, 6, 12, 24 및 36 주)에서 히알루로니다아제 활성(U/mL)을 보여준다. 표 28은 28 내지 32℃에 저장된 복합제제에 대하여 6시점(0, 1, 3, 6, 12 및 2주)에서 히알루로니다아제 활성(U/mL)을 보여준다. 24주 후에 28 내지 32℃에 저장된 10% 및 20% IG 복합제제 존재 하에서 명백하고 지속적인 히알루로니다아제 활성의 상실이 나타났으며, 이는 rHuPH20의 불안정성을 나타낸다. 20% IG 복합제제에서 rHuPH20 활성이 다소 감소하는 반면, 10% IG 복합제제는 2 내지 8℃에서 9개월 저장 후 안정하였다. 20% IG 함유 제제에서 IG의 분자 사이즈 분포는 6개월 저장 후에 두 온도 모두에서 변화가 없었다(표 29 및 30).
표 27. 2-8℃ 저장 후 복합제제의 히알루로니다아제 활성(U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00030
표 28. 28-32℃ 저장 후 복합제의 히알루로니다아제 활성(U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00031
표 29. 2-8℃ 저장 후 rHuPH20 와 복합 제제화된 20% IG 에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00032
표 30. 28-32℃ 저장 후 rHuPH20 와 복합 제제화된 20% IG 에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00033
B. rHuPH20 및 염화나트륨 (0-150 mM)과 복합 제제화된 10% IG 의 안정성
복합제제에서 rHuPH20 안정성을 향상시키기 위하여, 염화나트륨(NaCl) 첨가의 영향을 조사하였다. 4개의 상이한 농도(0, 50, 100 및 150 mM)로 NaCl이 첨가된 10% IG (롯 LE12F047)에서 300 U/mL rHuPH20 (롯 HUB0702CA; 실시예 3에 설명된 Gen 2 생산을 사용하여 제조)의 복합제제를 위의 실시예 7A에서 설명된 것과 같이 제조하였다. 상기 복합제제를 2 내지 8℃ 또는 28 내지 32℃에서 저장하였다. 따라서, 수득된 rHuPH20와 IG의 복합제를 다양한 함량의 NaCl의 존재 하에서 pH 4.6 내지 5.1, 0.25M 글리신(희석된 용액에서 측정되었을 때)에서 제제화하였다.
0 (시작), 1, 3, 6, 12, 18 및 24 주 저장 후, 복합제제(NaCl 농도가 0, 50, 100 및 150 mM) 각각 및 저장 챔버(2 내지 8℃ 및 28 내지 32℃) 각각으로부터의 하나의 시료를 배양을 중단하고 실시예 4에서 설명된 미세탁도 분석법을 사용하여 히알루로니다아제 활성에 대하여 분석하였다. IG 응집은 TSK G 3000 SW 600 x 7.5mm 컬럼 및 DMSO-함유 완충 시스템 (Kolarich et al . (2006) Transfusion, 46:1959-1977)을 사용하는 고성능 분자 사이즈 배제 크로마토그래피(HP-SEC)로 분자 사이즈 분포에 의해 결정하였다.
표 31 및 32는 각 복합제제에 대하여 7시점(0, 1, 3, 6, 12, 18 및 24 주)에서 히알루로니다아제 활성(U/mL)을 보여준다. 상기 결과는 rHuPH20 안정성이 28 내지 32℃ 저장된 시료의 경우 향상된 반면, 50, 100 또는 150 mM NaCl 존재 하에 10% IG와 복합 제제화된 rHuPH20의 안정성은 2 내지 8℃에서 저장 24주까지 변화 없이 유지되었다. 그러나, 28 내지 32℃에서 저장할때 NaCl의 농도가 0 mM인 복합 제제에서는 히알루로니다아제 활성이 빠르게 감소하였다.
표 33 및 34는 NaCl은 두 저장 온도 모두에서 IG 이합체화(~350 kDa)와 28 내지 32℃에서 IG 응집(>450 kDa)을 약간 강화하였으며, 6개월 후에 모든 값이 MSD 규격 한계(≥90 % 모노머/다이머, ≤5 % 응집체, ≤5 % 단편) 이내로 유지시킨다는 것을 보여준다.
비록 NaCl의 첨가가 28 내지 32℃에 저장된 IG 제제의 항보체 활성(ACA) 역가에 부정적인 영향을 미침에도 불구하고, ACA 역가는 정맥 내(IV) 투여에 대한 사양 지표(specification indicator)이며, 복합제제의 피하 내 투여와는 관계가 없다.
표 31. 2-8℃ 저장후 NaCl 을 함유하는 10% IG / rHuPH20 복합제제의 히알루로니다아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00034
표 32. 28-32℃ 저장후 NaCl 을 함유하는 10% IG / rHuPH20 복합제제의 히알루로니다 아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00035
표 33. 2-8℃ 저장후 NaCl 을 함유하는 10% IG / rHuPH20 복합제제에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00036
표 34. 28-32℃ 저장 후 NaCl 을 함유하는 10% IG / rHuPH20 복합제제에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00037
C. rHuPH20 및 염화나트륨(0-50 mM )과 함께 복합제제화된 10% IG 또는 20% IG 복합제제의 안정성
28-32℃에서 저장되고 rHuPH20 함유하는 10% IG 또는 20% IG의 복합제제에 염화나트륨의 첨가의 영향을 조사하였다. 0, 5, 10, 20, 30, 40 및 50 mM NaCl 농도를 사용하여, 10% IG(롯 LE12F047)에서 300 U/mL rHuPH20 (롯 HUB0702CA: 실시예 1에서 설명된 Gen2 생산을 사용하여 제조됨) 및 20 % IG (롯 SC00108NG)에서 300 U/mL rHuPH20 (롯 HUB0702CA; 실시예 1에서 설명된 Gen2 생산을 사용하여 제조됨)의 복합제제를 위의 실시예 6B에 설명된 바와 같이 제조하였다. 따라서, 수득되는 rHuPH20 및 IG의 복합제제를 다양한 함량의 NaCl 존재 하에서 pH 4.6 내지 5.1, 0.25M 글리신(희석된 용액에서 측정될 때)에서 제제화하였다.
0 (start), 1, 3, 6, 12 및 24주 저장 후, 복합제제(0, 5, 10, 20, 30, 40 및 50 mM NaCl 농도를 가짐) 각각으로부터의 하나의 시료를 배양을 중단하고 실시예 4에 설명된 미세탁도 분석법을 사용하여 히알루로니다아제 활성에 대해 분석하였다. IG 응집은 SK G 3000 SW 600 x 7.5 mm 컬럼 및 DMSO 함유하는 완충 시스템을 사용하는 고성능 사이즈 배제 크로마토그래피로 분자 사이즈 분포에 의해 결정하였다.
표 35 및 36은 다양한 시점(0, 1, 3, 6 및 12 및 24 주)에서 각각의 복합 제제에 대하여 히알루로니다아제 활성 (U/mL)을 보여준다. 상기 결과는 더 높은 NaCl 농도(20, 30, 40 및 50 mM) 하에서 10% IG와 복합 제제화된 rHuPH20의 안정성은 28 내지 32℃에서 24주 저장 동안 상대적으로 변화 없이 유지되었다는 것을 보여준다. 28 내지 32℃에서 저장될 때, 20 mM 이하의 NaCl 농도를 가지는 복합 제제에서 히알루로니다아제 활성이 급격하게 감소하였다. 20% IG와 함께 복합 제제화된 rHuPH20의 안정성은 모든 NaCl 농도에서 28 내지 32℃ 24주 저장 동안 상대적으로 변화 없이 유지되었다.
염화나트륨는 28 내지 32℃에서 10% 및 20% IG 복합제제 내의 IG 이합체화(~350 kDa)와 응집을 다소 강화하였다. 이 결과는 IG 응집(표 37 및 38)에 있어 20% IG(즉, 더 높은 IG 농도)에서 덜 현저하다.
표 35. 28-32℃ 저장후 NaCl 을 함유하는 10 % IG / rHuPH20 복합제제의 히알루로니다아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00038
표 36. 28-32℃ 저장후 NaCl 을 함유하는 20 % IG / rHuPH20 복합제제의 히알루로니다아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00039
표 37. 28-32℃ 저장후 NaCl 을 함유하는 10 % IG / rHuPH20 의 복합제제에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00040
표 38. 28-32℃ 저장후 NaCl 을 함유하는 20% IG / rHuPH20 의 복합제제에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00041
D. 염화나트륨 (100-250 mM ) 또는 아미노산 (500 mM ) 존재 하에 10% IG 또는 20% IG 함유하는 복합제제에서 rHuPH20 의 안정성
rHuPH20와 함께 10% IG 또는 20% IG 및, 염화나트륨 또는 아미노산 안정제를 함유하는 복합제제의 rHuPH20의 안정성에 대한 영향을 조사하였다. 10% IG(pH 4.4에서 0.25 M의 글리신 함유) (롯 LE12F047) 또는 20% IG(롯 SC00108NG)에서 100 U/mL 또는 300 U/mL rHuPH20 (롯 HUB0702CA; 실시예 3에서 설명된 Gen2 생산을 사용하여 제조됨)를 상기 실시예 6A에 설명된 바와 같이 제조하였다. 시료는 NaCl (100, 150 또는 250 mM의 농도), 글리신 (500 mM) 또는 프롤린(500 mM) 중 하나를 포함하였다. 복합제제를 2 내지 8℃ 또는 28 내지 32℃에서 저장하였다. 따라서, 수득된 rHuPH20 및 IG의 복합제제를 다양한 양의 NaCl, 글리신 또는 프롤린의 존재 하에서 pH 4.5 내지 5.1의 0.25 M 글리신에서 제제화하였다.
0 (시작), 1, 2, 3, 6 및 12 (오직 300 U/mL) 주 저장 후에, 각 복합제제 (100, 150 또는 250 mM농도의 NaCl, 500 mM 농도의 글리신 또는 500 mM 농도의 프롤린 중 하나를 포함) 로부터의 하나의 샘플을 배양을 중지하고 실시예 4에 설명된 미세탁도 분석법을 사용하여 히알루로니다아제 활성에 대하여 분석하였다. IG의 응집은 TSK G 3000 SW 600 x 7.5 mm 컬럼 및 DMSO-함유 완충 시스템(Kolarich et al. (2006) Transfusion, 46:1959-1977)을 사용하는 고성능 사이즈 배제 크로마토그래피 (HP-SEC)로 0(시작) 및 12주에 분자 사이즈 분포에 의해 결정되었다.
표 39 및 표 41은 100 U/mL rHuPH20 및, 10% 또는 20%의 IG를 각각 포함하는 복합제제에 대하여 5개의 시점( 0, 1, 2, 3 및 6 주)에 히알루로니다아제 활성 (U/mL)을 보여준다. 표 40 및 42는 300 U/mL 및, 10% 또는 20%의 IG를 각각 포함하는 복합제제에 대하여 6개의 시점(0, 1, 2, 3, 6 및 12 주) 에 히알루로니다아제 활성 (U/mL)을 보여준다. 상기 결과는 높은 아미노산 농도 (500 mM 글리신 또는 500 mM 프롤린)은 rHuPH20를 포함하는 10% IG 또는 20% IG 복합제의 rHuPH20을 안정화시키는데 있어서 NaCl보다 덜 효과적이었다는 것을 보여준다.
모든 복합제제에서 28 내지 32℃ 저장 후에 연구된 모든 농도에서 염화나트륨은 IG 응집 (>450kDa)을 강화하였다. 500 mM 프롤린을 함유하는 모든 복합제제는 28 내지 32℃에서 6주 저장 후 감소된 IG 다이머 함량 (~350 kDa)과 증가된 모노머 함량 (~160 kDa)을 가진다. 프롤린 함유 복합제제만큼 현저하지는 않지만 IG 다이머 함량은 글리신을 함유하는 복합제제에서도 역시 감소하였다 (표 43 및 44). 높은 농도의 프롤린은 단백질 간의 비-특이적인 소수성 상호작용(non-specific hydrophobic interaction)을 효과적으로 막아 리폴딩(refolding) 동안 단백질 응집 억제에 효과적이라는 것을 입증하였다 (Kumar et al. (1998) Biochem . Mol . Biol . Int. 4:59-517).
표 39. 28-32℃ 저장 후 안정화제를 함유하는 10% IG 및 100 U/ mL rHuPH20 복합제제의 히알루로니다아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00042
표 40. 28-32℃ 저장 후 안정화제를 함유하는 10% IG 및 300 U/ mL rHuPH20 복합제제의 히알루로니다아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00043
표 41. 28-32℃ 저장 후 안정화제를 함유하는 20 % IG 및 100 U/ mL rHuPH20 복합제제 의 히알루로니다아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00044
표 42. 28-32℃ 저장 후 안정화제를 함유하는 20 % IG 및 300 U/ mL rHuPH20 복합제의 히알루로니다아제 활성 (U/ mL )
Figure 112012030178927-pct00045
표 43. 28-32℃ 저장 후 NaCl , 글리신 또는 프롤린을 함유하는 10% IG / rHuPH20 복합제에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00046
표 44. 28-32℃ 저장 후 NaCl , 글리신 또는 프롤린을 함유하는 20% IG / rHuPH20 복합제제에서 IG 의 분자 사이즈 분포
Figure 112012030178927-pct00047
실시예 7
유카탄 미니 돼지에서 복합 제제화된 rHuPH20 및, 10% 또는 20% IG 의 효과
A. 실험 설계
유카타 미니 돼지에서 10% 또는 20% 면역 글로불린(IG) 용액 (130 mM NaCl, 10 mM 히스티딘, pH 6.6)과 복합제제화된 rHuPH20 피하 투여 실현 가능성을 결정하고 리딩 에지(Leading Edg) 투여(rHuPH20과 뒤이은 IG 용액의 연속적인 투여)와 비교하였다. rHuPH20의 다양한 농도를 이용한 투여 반응을 각각의 IG 용액에 대하여 또한 평가하였다.
18.4 - 23.2 kg (SNS 농장)의 18 마리 수컷 유카타 미니 돼지를 각 그룹이 3 마리의 돼지를 이용하도록 표 45에서 볼 수 있는 바와 같이 11 개의 치료 그룹 중 하나 또는 두 개에 할당하였다. 모든 제제는 10-게이지(gauge) 90 도 소프트 벤드 후버 바늘(soft bend Huber needle)로 마취된 수컷 돼지의 등에 피하 주사하였다. 리딩 에지 투여의 경우, rHuPH20 및 이어서 IgG를 동일한 바늘을 사용하여 정확한 위치에 단순히 주사기만 교체하여 연속 주입하였다. rHuPH20 및 IgG 투여 사이에 지연을 전혀 필요로 하지 않거나 또는 사용되지 않았다. 상이한 치료 그룹의 각각을 투여 부위 당 110 mL의 최대 용량으로 각 돼지에 두 개의 상이한 제형까지 시험하였다. 복합 제제들에 대해서는 약 20분 동안 주입을 지속하였고, 리딩 에지 제제의 경우 이 22 - 28 분 동안 주입을 지속하였다 .
표 45. 실험 설계 요약
Figure 112012030178927-pct00048
투여 후 투여 부위 관찰을 결정하였다. 각 제제를 투여하는데 부과된 연속적인 압력(mmHg)을 측정하는데 트랜스듀서(trasducer)를 이용하였으며, 일반 혈액 검사 (CBC) 및 감마 면역 글로불린(IgG) 분석을 위해 혈액을 채취하였다. 투여 후 3일이 되는(3 days post-dosing) 연구 종결 시에 모든 동물들을 안락사시켰고 두 개의 샘플 단편(A 및 B)을 투여 부위 1, 투여 부위 2 및 대조군 (두 투여 부위 각각으로부터 먼 부위로부터 수득)으로부터 수득하고 10% 중성 완충 포르말린에 보존하고(preserve), 광학 현미경(Nova Pathology, PC, San diego, CA)으로 평가하였다. 사이트 A는 투여 부위의 중심을 관통하는 2-3mm 두께 단편이며, 사이트 B는 획득된 투여 부위의 말단으로부터 얻어진 2-3mm 두께 단편이다.
B. 투여 부위 관찰
10% IG 단독 투여(~25 mL 투입(infusion); 그룹 1) 후 5분 이내, 뚜렷한 '물집'이 모든 세 마리의 돼지에서 나타났다. 20% IG 단독 투여(~25 mL 투입(infusion); 그룹 5) 후 약 10 분에 뚜렷한 물집이 나타났다. 관찰된 물집 형성 면적은 IG 단독 투여와 비교하여 rHuPH20 (리딩 에지 포함)을 함유하는 모든 제제에서 중가하였으며, 이는 rHuPH20을 이용하는 경우 유액(fluid)의 분산이 더 크다는 것을 나타낸다 (표 46).
10% 및 20% IG를 함유하는 rHuPH20 복합제제는 모든 rHuPH20 농도에서 명백하게 감소된 피부 경화 (부위가 부드러운 채로 유지) 및 모든 rHuPH20 농도에서 피부의 감소된 분홍/붉은 기를 나타냈다. 리딩 에지 비교 투여는 복합제제와 유사한 분홍/붉은 기를 나타냈다. 투여 후 관찰되는 투입 부위의 분홍/붉은 기 발생은 모든 그룹에서 24시간 이내에 완전히 회복을 나타냈다 (표 46)
표 46. 투여 부위 외관 및 분석
Figure 112012030178927-pct00049
C. 압력 측정 관찰
표 47은 평균 압력 측정을 요약한다. 20% IG 단독 투여 (그룹 5) 후 2.5 분 또는 더 빠른 시점에서, 압력은 모든 세 마리 돼지에 대하여 측정가능한 범위 (> 460 mmHg)를 벗어났다. 그룹 6에서 세 마리의 돼지 중 두 마리가 측정가능한 압력 범위를 벗어났고, 그리고 그룹 7 및 8의 각각의 경우 돼지 한 마리가 범위를 벗어났다. 그룹 1 및 2 각각은 한 마리의 돼지가 범위를 벗어났다. 이 결과는 투여를 성취하기 위해 필요한 압력이 rHuPH20를 함유하는 모든 복합제제에서 감소하였다는 것을 나타낸다.
표 47. 평균 압력 측정 분석
Figure 112012030178927-pct00050
N/A = 이용 불가능, >460 mmHg
N/A* = 해석하기 불명확한 압력 기록 상승 곡선
D. 일반 혈액 검사 및 IgG 혈장 분석
일반 혈액 검사(CBC) 분석을 위해 K3EDTA 튜브에 투여 전(~2.0 mL) 및 투여 후 30분(~2.0 mL)에 혈액을 채취하였다. 샘플은 분석 때까지 4℃에서 저장되었다 (Bioquant, Inc., San Diego, CA). CBC 결과는 특별한 안정성 문제(specific safety concerns)와 관계된 결과물을 제공하지는 않는다. 돼지의 대부분은 정상 CBC 수준 (SNS 농장으로부터 참조된(referenced) 정상 CBC 범위)을 유지하였다. 열 여덟 마리의 돼지 중 다섯 마리가 샘플에서 눈에 보이지 않는 덩어리(clot)가 있었으며 평가될 수 없었다.
감마 면역 글로불린 (IgG) 분석을 위한 혈액을 소듐 시트레이트 튜브에 투여 전 (~2.0 mL) 및 연구 종결시(~4.0 mL)에 채취하여 인간 IgG의 피하 주사 후 생체 이용율 (systemic availability)을 확인하였다. 샘플은 4℃에서 10분 동안 3000 rpm으로 원심분리하였으며, 혈장은 나누어 담고(aliquotted), 상기 샘플을 분석 때까지 -20℃에서 저장하였다. 표 48에서 볼 수 있는 바와 같이, IgG에서 일반적 증가가 투여 후 3일에 모든 동물에서 관찰되었다. 각 돼지에서 IgG 플라즈마 양(level)은 각각의 돼지에게 투여된 두 개의 상이한 치료의 평균을 나타낸다 (오직 하나의 치료만 받은 돼지 7-9를 제외).
표 48. IgG 분석
Figure 112012030178927-pct00051
E. 조직 병리학적 결과
조직 병리학적 결과가 외피, 진피 및 피하 조직에 존재하였고, 혼합 백혈구 염증(mixed leukocyte inflammation), 부종 및 출혈을 포함하였다. 각각의 조직 병리학적 결과는 중증도 등급(severity grade)을 다음의 체계(scheme)에 근거하여 부여하였다.
없음(not present): 0; 있음(present), 등급 없음(Not Graded): 0; 최소(Minimal): 1; 가벼운(Mild): 중간(Moderate): 3; 현저한(Marked): 4
표 49 내지 51에 조직 병리학적 결과를 발생률과 평균 그룹 중증도 점수에 따라 요약하였다.
표 49. 조직 병리학적 결과의 요약: 10% IG + rHuPH20
Figure 112012030178927-pct00052
* 영향을 받은 단편의 수 / 평가된 단편의 수
** 그룹에서 평가된 단편의 수로 나눈 그룹의 중증도 점수의 합
표 50. 조직 병리학적 결과의 요약: 20% IG + rHuPH20
Figure 112012030178927-pct00053
* 영향을 받은 단편의 수 / 평가된 단편의 수
** 그룹에서 평가된 단편의 수로 나눈 그룹의 중증도 점수의 합
표 51. 조직 병리학적 결과의 요약: 리딩 에지 투여
Figure 112012030178927-pct00054
*영향을 받은 단편의 수 / 평가된 단편의 수
** 그룹에서 평가된 단편의 수로 나눈 그룹의 중증도 점수의 합
이 연구에서 IG와 rHuPH20의 투여에 대한 반응은 각 투여 그룹에서 양적으로 유사하였다. 이 반응들은 투여 부위의 피하 조직에서 혼합 백혈구 염증, 부종 및 출혈의 특징을 나타냈다. 표 52는 투여 그룹의 모두에서 평균 중증도 점수를 비교한다.
표 52. 평균 그룹 중증도 점수의 요약
Figure 112012030178927-pct00055
평균 그룹 중증도 점수의 합에 근거하여, 가장 중증의 투여 부위 반응은 10% IG 100 mL 단독 투여 (그룹 1) 및 300 U/mL rHuPH20과 복합 제제화된 20% IG 20 mL(그룹 8)의 투여와 관련이 있다. 10% IG의 50, 100 및 300 U/mL에서 rHuPH20과 함께 복합 제제화된 10% IG 100 mL의 투여에 대한 반응(그룹 2-4)은 20% IG 50mL 단독 투여(그룹 5), 20% IG의 50 및 100 U/mL에서 rHuPH20 복합 제제화된(그룹 6 및 7)과 rHuPH20 10mL (150 U/mL) 및 연이은 10% IG 100 mL의 리딩 에지 투여 (그룹 9)에 대한 반응과 유사하였다. 그러나 rHuPH20 10 또는 20 mL 및 연이은 20% IG 50mL의 리딩 에지 투여(그룹 10 및 11)는 유사한 복합제제(그룹 6 및 7)의 경우보다 더 중증의 반응을 초래하였다. 대조군 피부의 단편은 거의 조직 병리학적 결과를 포함하지 않았으며, 이는 시험 제품 투여 부위로부터 투여된 제제의 확산 때문이며, 제제와 관련없는 부수적인 결과도 거의 포함하지 않았다.
F. 요약
상기 결과는 10% 및 20% IG와 복합 제제화된 rHuPH20를 유카타 미니 돼지에게 피하 투여하는 것의 실현 가능성을 확인해주었다. 중간 또는 심각한 정도의 피부 경화 및 분홍/붉은 기를 초래함에도 불구하고 단독으로 IG (10% 및 20%)를 투여가는 것도 가능하다. rHuPH20를 포함하는 복합제제는 주사하기 위해 필요한 압력을 감소시켰으며, 피부의 분홍/ 붉은 기를 감소시켰다. 관찰된 물질 형성 면적은 IG 단독 투여과 비교하여 rHuPH20를 포함하는 제제 모두에서 유사하거나 또는 증가하였으며, rHuPH20가 이용될 때 유액(fluid)이 더 많이 분산된다는 것을 알 수 있었다. 리딩 에지 투여도 가능하였으며, 비슷한 압력, 분홍/붉은 기 및 물집 면적이 복합제제의 경우처럼 관찰된다. 투여로 인한 하부 피하 조직(deep subcutaneous tissue)에 존재하는 조직 병리학적 결과는, 10% IG 단독 투여 및 rHuPH20와 복합 제제화된 20% IG (300 U/mL)의 투여와 관련된 가장 중증의 반응으로, 혼합 백혈구 염증, 부종 및 출혈을 포함하였다.
변경이 당 분야의 당업자에게 명확할 것이므로, 본 발명은 첨부된 청구항의 범위만으로 제한되는 것을 의도하지 않는다.
SEQUENCE LISTING <110> Baxter International, Inc. Baxter Healthcare, S.A. Teschner, Wolfgang Svatos, Sonja Bruckschwaiger, Leopold Weber, Alfred Schwarz, Hans-Peter Lei, Laura <120> STABLE CO-FORMULATION OF HYALURONIDASE AND IMMUNOGLOBULIN, AND METHODS OF USE THEREOF <130> 3800020-00137/3088PC <140> Not yet assigned <141> Herewith <150> US 61/277,045 <151> 2009-09-17 <160> 56 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor human PH20 <400> 1 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp 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ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag ccaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctac 1446 <210> 50 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> PH20 variant P48A <400> 50 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Ala 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Leu Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 51 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> precursor PH20 variant L499W <400> 51 Met Gly Val Leu Lys Phe Lys His Ile Phe Phe Arg Ser Phe Val Lys 1 5 10 15 Ser Ser Gly Val Ser Gln Ile Val Phe Thr Phe Leu Leu Ile Pro Cys 20 25 30 Cys Leu Thr Leu Asn Phe Arg Ala Pro Pro Val Ile Pro Asn Val Pro 35 40 45 Phe Leu Trp Ala Trp Asn Ala Pro Ser Glu Phe Cys Leu Gly Lys Phe 50 55 60 Asp Glu Pro Leu Asp Met Ser Leu Phe Ser Phe Ile Gly Ser Pro Arg 65 70 75 80 Ile Asn Ala Thr Gly Gln Gly Val Thr Ile Phe Tyr Val Asp Arg Leu 85 90 95 Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ile Asp Ser Ile Thr Gly Val Thr Val Asn Gly 100 105 110 Gly Ile Pro Gln Lys Ile Ser Leu Gln Asp His Leu Asp Lys Ala Lys 115 120 125 Lys Asp Ile Thr Phe Tyr Met Pro Val Asp Asn Leu Gly Met Ala Val 130 135 140 Ile Asp Trp Glu Glu Trp Arg Pro Thr Trp Ala Arg Asn Trp Lys Pro 145 150 155 160 Lys Asp Val Tyr Lys Asn Arg Ser Ile Glu Leu Val Gln Gln Gln Asn 165 170 175 Val Gln Leu Ser Leu Thr Glu Ala Thr Glu Lys Ala Lys Gln Glu Phe 180 185 190 Glu Lys Ala Gly Lys Asp Phe Leu Val Glu Thr Ile Lys Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Leu Arg Pro Asn His Leu Trp Gly Tyr Tyr Leu Phe Pro Asp Cys 210 215 220 Tyr Asn His His Tyr Lys Lys Pro Gly Tyr Asn Gly Ser Cys Phe Asn 225 230 235 240 Val Glu Ile Lys Arg Asn Asp Asp Leu Ser Trp Leu Trp Asn Glu Ser 245 250 255 Thr Ala Leu Tyr Pro Ser Ile Tyr Leu Asn Thr Gln Gln Ser Pro Val 260 265 270 Ala Ala Thr Leu Tyr Val Arg Asn Arg Val Arg Glu Ala Ile Arg Val 275 280 285 Ser Lys Ile Pro Asp Ala Lys Ser Pro Leu Pro Val Phe Ala Tyr Thr 290 295 300 Arg Ile Val Phe Thr Asp Gln Val Leu Lys Phe Leu Ser Gln Asp Glu 305 310 315 320 Leu Val Tyr Thr Phe Gly Glu Thr Val Ala Leu Gly Ala Ser Gly Ile 325 330 335 Val Ile Trp Gly Thr Leu Ser Ile Met Arg Ser Met Lys Ser Cys Leu 340 345 350 Leu Leu Asp Asn Tyr Met Glu Thr Ile Leu Asn Pro Tyr Ile Ile Asn 355 360 365 Val Thr Leu Ala Ala Lys Met Cys Ser Gln Val Leu Cys Gln Glu Gln 370 375 380 Gly Val Cys Ile Arg Lys Asn Trp Asn Ser Ser Asp Tyr Leu His Leu 385 390 395 400 Asn Pro Asp Asn Phe Ala Ile Gln Leu Glu Lys Gly Gly Lys Phe Thr 405 410 415 Val Arg Gly Lys Pro Thr Leu Glu Asp Leu Glu Gln Phe Ser Glu Lys 420 425 430 Phe Tyr Cys Ser Cys Tyr Ser Thr Leu Ser Cys Lys Glu Lys Ala Asp 435 440 445 Val Lys Asp Thr Asp Ala Val Asp Val Cys Ile Ala Asp Gly Val Cys 450 455 460 Ile Asp Ala Phe Leu Lys Pro Pro Met Glu Thr Glu Glu Pro Gln Ile 465 470 475 480 Phe Tyr Asn Ala Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Thr Met Phe Ile Val 485 490 495 Ser Ile Trp Phe Leu Ile Ile Ser Ser Val Ala Ser Leu 500 505 <210> 52 <211> 6630 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HZ24 vector <400> 52 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaataaccc 660 cgccccgttg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagagc 720 tcgtttagtg aaccgtcaga tcactagaag ctttattgcg gtagtttatc acagttaaat 780 tgctaacgca gtcagtgctt ctgacacaac agtctcgaac ttaagctgca gaagttggtc 840 gtgaggcact gggcaggtaa gtatcaaggt tacaagacag gtttaaggag accaatagaa 900 actgggcttg tcgagacaga gaagactctt gcgtttctga taggcaccta ttggtcttac 960 tgacatccac tttgcctttc tctccacagg tgtccactcc cagttcaatt acagctctta 1020 aggctagagt acttaatacg actcactata ggctagcatg ggagtgctaa aattcaagca 1080 catctttttc agaagctttg ttaaatcaag tggagtatcc cagatagttt tcaccttcct 1140 tctgattcca tgttgcttga ctctgaattt cagagcacct cctgttattc caaatgtgcc 1200 tttcctctgg gcctggaatg ccccaagtga attttgtctt ggaaaatttg atgagccact 1260 agatatgagc ctcttctctt tcataggaag cccccgaata aacgccaccg ggcaaggtgt 1320 tacaatattt tatgttgata gacttggcta ctatccttac atagattcaa tcacaggagt 1380 aactgtgaat ggaggaatcc cccagaagat ttccttacaa gaccatctgg acaaagctaa 1440 gaaagacatt acattttata tgccagtaga caatttggga atggctgtta ttgactggga 1500 agaatggaga cccacttggg caagaaactg gaaacctaaa gatgtttaca agaataggtc 1560 tattgaattg gttcagcaac aaaatgtaca acttagtctc acagaggcca ctgagaaagc 1620 aaaacaagaa tttgaaaagg cagggaagga tttcctggta gagactataa aattgggaaa 1680 attacttcgg ccaaatcact tgtggggtta ttatcttttt ccggattgtt acaaccatca 1740 ctataagaaa cccggttaca atggaagttg cttcaatgta gaaataaaaa gaaatgatga 1800 tctcagctgg ttgtggaatg aaagcactgc tctttaccca tccatttatt tgaacactca 1860 gcagtctcct gtagctgcta cactctatgt gcgcaatcga gttcgggaag ccatcagagt 1920 ttccaaaata cctgatgcaa aaagtccact tccggttttt gcatataccc gcatagtttt 1980 tactgatcaa gttttgaaat tcctttctca agatgaactt gtgtatacat ttggcgaaac 2040 tgttgctctg ggtgcttctg gaattgtaat atggggaacc ctcagtataa tgcgaagtat 2100 gaaatcttgc ttgctcctag acaattacat ggagactata ctgaatcctt acataatcaa 2160 cgtcacacta gcagccaaaa tgtgtagcca agtgctttgc caggagcaag gagtgtgtat 2220 aaggaaaaac tggaattcaa gtgactatct tcacctcaac ccagataatt ttgctattca 2280 acttgagaaa ggtggaaagt tcacagtacg tggaaaaccg acacttgaag acctggagca 2340 attttctgaa aaattttatt gcagctgtta tagcaccttg agttgtaagg agaaagctga 2400 tgtaaaagac actgatgctg ttgatgtgtg tattgctgat ggtgtctgta tagatgcttt 2460 tctaaaacct cccatggaga cagaagaacc tcaaattttc tactgaggat ccatagctaa 2520 cgcccctctc cctccccccc ccctaacgtt actggccgaa gccgcttgga ataaggccgg 2580 tgtgcgtttg tctatatgtt attttccacc atattgccgt cttttggcaa tgtgagggcc 2640 cggaaacctg gccctgtctt cttgacgagc attcctaggg gtctttcccc tctcgccaaa 2700 ggaatgcaag gtctgttgaa tgtcgtgaag gaagcagttc ctctggaagc ttcttgaaga 2760 caaacaacgt ctgtagcgac cctttgcagg cagcggaacc ccccacctgg cgacaggtgc 2820 ctctgcggcc aaaagccacg tgtataagat acacctgcaa aggcggcaca accccagtgc 2880 cacgttgtga gttggatagt tgtggaaaga gtcaaatggc tctcctcaag cgtattcaac 2940 aaggggctga aggatgccca gaaggtaccc cattgtatgg gatctgatct ggggcctcgg 3000 tgcacatgct ttacatgtgt ttagtcgagg ttaaaaaaac gtctaggccc cccgaaccac 3060 ggggacgtgg ttttcctttg aaaaacacga tgataagctt gccacaaccc acagcggccg 3120 ctgccatcat ggttcgacca ttgaactgca tcgtcgccgt gtcccaaaat atggggattg 3180 gcaagaacgg agacctaccc tggcctccgc tcaggaacga gttcaagtac ttccaaagaa 3240 tgaccacaac ctcttcagtg gaaggtaaac agaatctggt gattatgggt aggaaaacct 3300 ggttctccat tcctgagaag aatcgacctt taaaggacag aattaatata gttctcagta 3360 gagaactcaa agaaccacca cgaggagctc attttcttgc caaaagtttg gatgatgcct 3420 taagacttat tgaacaaccg gaattggcaa gtaaagtaga catggtttgg atagtcggag 3480 gcagttctgt ttaccaggaa gccatgaatc aaccaggcca cctcagactc tttgtgacaa 3540 ggatcatgca ggaatttgaa agtgacacgt ttttcccaga aattgatttg gggaaatata 3600 aacttctccc agaataccca ggcgtcctct ctgaggtcca ggaggaaaaa ggcatcaagt 3660 ataagtttga agtctacgag aagaaagact aaacgcgtgg tacctctaga gtcgacccgg 3720 gcggccgctt cgagcagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag 3780 aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac 3840 cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt 3900 tcagggggag atgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtaaaat 3960 cgataaggat ccgggctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc cttcccaaca 4020 gttgcgcagc ctgaatggcg aatggacgcg ccctgtagcg gcgcattaag cgcggcgggt 4080 gtggtggtta cgcgcagcgt gaccgctaca cttgccagcg ccctagcgcc cgctcctttc 4140 gctttcttcc cttcctttct cgccacgttc gccggctttc cccgtcaagc tctaaatcgg 4200 gggctccctt tagggttccg atttagtgct ttacggcacc tcgaccccaa aaaacttgat 4260 tagggtgatg gttcacgtag tgggccatcg ccctgataga cggtttttcg ccctttgacg 4320 ttggagtcca cgttctttaa tagtggactc ttgttccaaa ctggaacaac actcaaccct 4380 atctcggtct attcttttga tttataaggg attttgccga tttcggccta ttggttaaaa 4440 aatgagctga tttaacaaaa atttaacgcg aattttaaca aaatattaac gcttacaatt 4500 tcctgatgcg gtattttctc cttacgcatc tgtgcggtat ttcacaccgc atatggtgca 4560 ctctcagtac aatctgctct gatgccgcat agttaagcca gccccgacac ccgccaacac 4620 ccgctgacgc gccctgacgg gcttgtctgc tcccggcatc cgcttacaga caagctgtga 4680 ccgtctccgg gagctgcatg tgtcagaggt tttcaccgtc atcaccgaaa cgcgcgagac 4740 gaaagggcct cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt 4800 agacgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 4860 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 4920 attgaaaaag gaagagtatg agtattcaac atttccgtgt cgcccttatt cccttttttg 4980 cggcattttg ccttcctgtt tttgctcacc cagaaacgct ggtgaaagta aaagatgctg 5040 aagatcagtt gggtgcacga gtgggttaca tcgaactgga tctcaacagc ggtaagatcc 5100 ttgagagttt tcgccccgaa gaacgttttc caatgatgag cacttttaaa gttctgctat 5160 gtggcgcggt attatcccgt attgacgccg ggcaagagca actcggtcgc cgcatacact 5220 attctcagaa tgacttggtt gagtactcac cagtcacaga aaagcatctt acggatggca 5280 tgacagtaag agaattatgc agtgctgcca taaccatgag tgataacact gcggccaact 5340 tacttctgac aacgatcgga ggaccgaagg agctaaccgc ttttttgcac aacatggggg 5400 atcatgtaac tcgccttgat cgttgggaac cggagctgaa tgaagccata ccaaacgacg 5460 agcgtgacac cacgatgcct gtagcaatgg caacaacgtt gcgcaaacta ttaactggcg 5520 aactacttac tctagcttcc cggcaacaat taatagactg gatggaggcg gataaagttg 5580 caggaccact tctgcgctcg gcccttccgg ctggctggtt tattgctgat aaatctggag 5640 ccggtgagcg tgggtctcgc ggtatcattg cagcactggg gccagatggt aagccctccc 5700 gtatcgtagt tatctacacg acggggagtc aggcaactat ggatgaacga aatagacaga 5760 tcgctgagat aggtgcctca ctgattaagc attggtaact gtcagaccaa gtttactcat 5820 atatacttta gattgattta aaacttcatt tttaatttaa aaggatctag gtgaagatcc 5880 tttttgataa tctcatgacc aaaatccctt aacgtgagtt ttcgttccac tgagcgtcag 5940 accccgtaga aaagatcaaa ggatcttctt gagatccttt ttttctgcgc gtaatctgct 6000 gcttgcaaac aaaaaaacca ccgctaccag cggtggtttg tttgccggat caagagctac 6060 caactctttt tccgaaggta actggcttca gcagagcgca gataccaaat actgttcttc 6120 tagtgtagcc gtagttaggc caccacttca agaactctgt agcaccgcct acatacctcg 6180 ctctgctaat cctgttacca gtggctgctg ccagtggcga taagtcgtgt cttaccgggt 6240 tggactcaag acgatagtta ccggataagg cgcagcggtc gggctgaacg gggggttcgt 6300 gcacacagcc cagcttggag cgaacgacct acaccgaact gagataccta cagcgtgagc 6360 tatgagaaag cgccacgctt cccgaaggga gaaaggcgga caggtatccg gtaagcggca 6420 gggtcggaac aggagagcgc acgagggagc ttccaggggg aaacgcctgg tatctttata 6480 gtcctgtcgg gtttcgccac ctctgacttg agcgtcgatt tttgtgatgc tcgtcagggg 6540 ggcggagcct atggaaaaac gccagcaacg cggccttttt acggttcctg gccttttgct 6600 ggccttttgc tcacatggct cgacagatct 6630 <210> 53 <211> 186 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> dihydrofolate reductase <400> 53 Val Arg Pro Leu Asn Cys Ile Val Ala Val Ser Gln Asn Met Gly Ile 1 5 10 15 Gly Lys Asn Gly Asp Leu Pro Trp Pro Pro Leu Arg Asn Glu Phe Lys 20 25 30 Tyr Phe Gln Arg Met Thr Thr Thr Ser Ser Val Glu Gly Lys Gln Asn 35 40 45 Leu Val Ile Met Gly Arg Lys Thr Trp Phe Ser Ile Pro Glu Lys Asn 50 55 60 Arg Pro Leu Lys Asp Arg Ile Asn Ile Val Leu Ser Arg Glu Leu Lys 65 70 75 80 Glu Pro Pro Arg Gly Ala His Phe Leu Ala Lys Ser Leu Asp Asp Ala 85 90 95 Leu Arg Leu Ile Glu Gln Pro Glu Leu Ala Ser Lys Val Asp Met Val 100 105 110 Trp Ile Val Gly Gly Ser Ser Val Tyr Gln Glu Ala Met Asn Gln Pro 115 120 125 Gly His Leu Arg Leu Phe Val Thr Arg Ile Met Gln Glu Phe Glu Ser 130 135 140 Asp Thr Phe Phe Pro Glu Ile Asp Leu Gly Lys Tyr Lys Leu Leu Pro 145 150 155 160 Glu Tyr Pro Gly Val Leu Ser Glu Val Gln Glu Glu Lys Gly Ile Lys 165 170 175 Tyr Lys Phe Glu Val Tyr Glu Lys Lys Asp 180 185 <210> 54 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> His tag <400> 54 His His His His His His 1 5 <210> 55 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Flag tag <400> 55 Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys 1 5 <210> 56 <211> 1449 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <223> Gen2 mRNA sequence <400> 56 atgggagtgc taaaattcaa gcacatcttt ttcagaagct ttgttaaatc aagtggagta 60 tcccagatag ttttcacctt ccttctgatt ccatgttgct tgactctgaa tttcagagca 120 cctcctgtta ttccaaatgt gcctttcctc tgggcctgga atgccccaag tgaattttgt 180 cttggaaaat ttgatgagcc actagatatg agcctcttct ctttcatagg aagcccccga 240 ataaacgcca ccgggcaagg tgttacaata ttttatgttg atagacttgg ctactatcct 300 tacatagatt caatcacagg agtaactgtg aatggaggaa tcccccagaa gatttcctta 360 caagaccatc tggacaaagc taagaaagac attacatttt atatgccagt agacaatttg 420 ggaatggctg ttattgactg ggaagaatgg agacccactt gggcaagaaa ctggaaacct 480 aaagatgttt acaagaatag gtctattgaa ttggttcagc aacaaaatgt acaacttagt 540 ctcacagagg ccactgagaa agcaaaacaa gaatttgaaa aggcagggaa ggatttcctg 600 gtagagacta taaaattggg aaaattactt cggccaaatc acttgtgggg ttattatctt 660 tttccggatt gttacaacca tcactataag aaacccggtt acaatggaag ttgcttcaat 720 gtagaaataa aaagaaatga tgatctcagc tggttgtgga atgaaagcac tgctctttac 780 ccatccattt atttgaacac tcagcagtct cctgtagctg ctacactcta tgtgcgcaat 840 cgagttcggg aagccatcag agtttccaaa atacctgatg caaaaagtcc acttccggtt 900 tttgcatata cccgcatagt ttttactgat caagttttga aattcctttc tcaagatgaa 960 cttgtgtata catttggcga aactgttgct ctgggtgctt ctggaattgt aatatgggga 1020 accctcagta taatgcgaag tatgaaatct tgcttgctcc tagacaatta catggagact 1080 atactgaatc cttacataat caacgtcaca ctagcagcca aaatgtgtag tcaagtgctt 1140 tgccaggagc aaggagtgtg tataaggaaa aactggaatt caagtgacta tcttcacctc 1200 aacccagata attttgctat tcaacttgag aaaggtggaa agttcacagt acgtggaaaa 1260 ccgacacttg aagacctgga gcaattttct gaaaaatttt attgcagctg ttatagcacc 1320 ttgagttgta aggagaaagc tgatgtaaaa gacactgatg ctgttgatgt gtgtattgct 1380 gatggtgtct gtatagatgc ttttctaaaa cctcccatgg agacagaaga acctcaaatt 1440 ttctactga 1449 1

Claims (55)

  1. 적어도 10 % w/v 농도의 면역 글로불린(IG);
    적어도 50 U/mL 농도이며 정맥주사용 면역 글로불린에 대한 정맥 내 주사 주입 속도와 같거나 그 초과의 주입속도로 단일 주입 부위에 피하투여 하기에 충분한 양으로 존재하는 가용성 히알루로니다아제; 및
    적어도 0.05 M 농도의 염화 알칼리 금속염을 포함하고,
    4 또는 약 4 내지 5 또는 약 5 사이의 pH를 가지고,
    32℃까지의 온도에서 적어도 6개월 동안 안정한, 액체 복합제제인 피하 투여용으로 제제화된 안정한 조성물.
  2. 적어도 10 % w/v 농도의 면역 글로불린(IG);
    적어도 50 U/mL 농도이며 적어도 100 유닛/그램 (U/g) IG 비율로 존재하는 가용성 히알루로니다아제; 및
    적어도 0.05 M 농도의 염화 알칼리 금속염을 포함하고,
    4 또는 약 4 내지 5 또는 약 5 사이의 pH를 가지고,
    32℃까지의 온도에서 적어도 6개월 동안 안정한, 액체 복합제제인, 피하 투여용으로 제제화된 안정한 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 적어도 0.1 M 양의 아미노산 안정화제를 더 포함하는 안정한 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 아미노산 안정화제는 알라닌, 히스티딘, 아르기닌, 라이신, 오르니틴, 이소류신, 발린, 메티오닌, 글리신 및 프롤린으로부터 선택된 것인 안정한 조성물.
  5. 제 3 항에 있어서, 상기 아미노산 안정화제는 글리신 또는 프롤린인 것인 안정한 조성물.
  6. 제 3 항에 있어서, 상기 아미노산 안정화제는 적어도 0.1 M, 0.15 M, 0.2 M, 0.25 M, 0.3 M, 0.35 M, 0.4 M, 0.45 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M 또는 0.75 M인 것인 안정한 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 아미노산 안정화제는 0.25 M의 양인 것인 안정한 조성물.
  8. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 적어도 10 % w/v, 11 % w/v, 12 % w/v, 13 % w/v, 14 % w/v, 15 % w/v, 16 % w/v, 17 % w/v, 18 % w/v, 19 % w/v, 20 % w/v, 21 % w/v, 22 % w/v 또는 그 이상인 것인 안정한 조성물.
  9. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 약 또는 10 % w/v 내지 약 또는 20 % w/v인, 안정한 조성물.
  10. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 인간 혈장으로부터 유래한 것인 안정한 조성물.
  11. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 알코올 분획법을 포함하는 정제 방법에 의하여 인간 혈장으로부터 정제된 것인 안정한 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 IG는 폴리에틸렌글리콜(PEG) 침전, 이온-교환 크로마토그래피, 효소 절단, 정용여과(diafiltration) 또는 초여과(ultrafiltration) 중 하나 또는 그 이상으로 더 정제된 것인 안정한 조성물.
  13. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 펩신 유무하에 pH 4.0에서의 배양, 용제 계면활성제 처리 및 나노여과 중에서 선택되는 바이러스 감소 단계를 적용하는 것인 안정한 액체 복합제제.
  14. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 IgG, IgA 및 IgM를 함유하는 것인 안정한 조성물.
  15. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 95% 초과의 IgG를 함유하는 것인 안정한 조성물.
  16. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 염화 알칼리 금속염은 KCl 및 NaCl 중에서 선택된 것인 안정한 조성물.
  17. 제 16 항에 있어서, 염화 알칼리 금속염은 NaCl이며 NaCl은 0.05 M 내지 0.3M 의 농도인 것인 안정한 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, NaCl은 0.15 M의 농도인 것인 안정한 조성물.
  19. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다아제는 PH20, 또는 이의 절단된 형태인 것인 안정한 조성물.
  20. 제 19 항에 있어서, 상기 PH20는 양, 소 또는 절단된 인간 PH20인 것인 안정한 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 PH20은 절단된 인간 PH20이며 상기 절단된 인간 PH20은 서열번호: 4 내지 9 중 어느 것에 개시된 아미노산 서열을 가진 폴리펩티드들, 또는 그의 대립형질 변이체 또는 다른 변이체 중에서 선택된 것인 안정한 조성물.
  22. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다아제는 rHuPH20로 명명된 것인 안정한 조성물.
  23. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다아제는 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/ mL 또는 그 이상의 농도인 것인 안정한 조성물.
  24. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다아제는 약 또는 75 U/mL 내지 또는 약 또는 350 U/mL의 농도인 안정한 조성물.
  25. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 가용성 히알루로니다아제는 그램 당 100 유닛 IG (U/g IG) 내지 3000 U/g IG 비율인 것인 안정한 조성물.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 가용성 히알루로니다아제는 250 U/g, 500 U/g IG, 1000 U/g IG, 1500 U/g IG 또는 3000 U/g IG 비율인 것인 안정한 조성물.
  27. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 농축된 형태로 4.4 내지 4.9의 pH를 가지는 안정한 조성물.
  28. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 복합제제는 복수 투여량 투여용인 것인 안정한 조성물.
  29. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 복합제제는 단일 투여량 투여용인 것인 안정한 조성물.
  30. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG는 단일 투여량 투여로 IG-치료가능한 질환 및 상태를 치료하기에 충분한 양인 것인 안정한 조성물.
  31. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 IG 는 IG-치료가능한 질환 또는 상태 치료에 있어 매일, 매주, 격주, 2 내지 3주마다, 3 내지 4주마다 또는 매월 단일 투여량 투여로 충분한 양인 것인 안정한 조성물.
  32. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 복합제제는 단일 투여량 투여용이고, 복합제제에서 상기 IG의 양은 IG-치료가능한 질환 또는 상태 치료에 있어 정맥내 투여시 단일 투여량 투여와 실질적으로 같은 양인 것인 안정한 조성물.
  33. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 복합제제는 단일 투여량 투여용이며 IG의 양은 약 또는 적어도 1그램(g), 2g, 3g, 4g, 5g, 10g, 20g, 30g, 40g, 50g, 60g, 70g, 80g, 90g, 100g 또는 200g이거나 약 또는 1-200, 1-100, 10-100, 5-50, 6-50, 5-100g인 것인 안정한 조성물.
  34. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 복합제제는 단일 투여량 투여용이며 조성물에서 히알루로니다아제의 양은 약 또는 적어도 500 유닛, 1000 유닛, 2000 유닛, 5000 유닛, 10,000 유닛, 30,000 유닛, 40,000 유닛, 50,000 유닛, 60,000 유닛, 70,000 유닛, 80,000 유닛, 90,000 유닛, 100,000 유닛 또는 그 이상인 것인 안정한 조성물.
  35. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 28℃-32℃에서 적어도 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월 또는 그 이상 동안 안정한 것인, 안정한 조성물.
  36. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 0℃-10℃에서 6개월 내지 2년 동안 안정한 것인, 안정한 조성물.
  37. 제 1 항 또는 제 2 항의 안정한 조성물, 및 선택적으로 사용설명서를 포함하는 키트.
  38. 제 1 항 또는 제 2 항의 안정한 조성물을 포함하는 용기.
  39. 제 38 항에 있어서, 튜브, 병 또는 바이알인 것인 용기.
  40. 제 38 항에 있어서, 주사기인 것인 용기.
  41. 제 38 항에 있어서, 상기 용기는 주사용 바늘을 더 포함하는 것인 용기.
  42. 제 38 항에 있어서, 상기 안정한 조성물은 단일 투여량 투여용 또는 복수 투여량 투여용으로 제공되는 것인 용기.
  43. 제 38 항의 용기 및 조성물 주입 수단을 포함하는 키트.
  44. 제1항 또는 제2항의 안정한 조성물을 사용하여 IG-치료가능한 질환 또는 상태의 치료용 의약 제형을 제조하기 위한 방법.
  45. 제 44 항에 있어서, 상기 IG-치료가능한 질환 또는 상태는 일차성 면역 결핍 질환, 이차성 면역 결핍 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 급성 감염 중에서 선택되는, 방법.
  46. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, IG-치료가능한 질환 또는 상태의 치료에 사용을 위한 안정한 조성물.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 IG-치료가능한 질환 또는 상태는 일차성 면역 결핍 질환, 이차성 면역 결핍 질환, 염증성 질환, 자가면역 질환 및 급성 감염 중에서 선택되는 것인 안정한 조성물.
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