BR112012005890B1 - Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos de utilização da mesma - Google Patents

Co-formulação estável de hialuronidase e imunoglobulina e métodos de utilização da mesma Download PDF

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Abstract

CO-FORMULAÇÃO ESTÁVEL DE HIALURONIDASE E IMUNOGLOBULINA E MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO DA MESMA Aqui fornecidas são co-formulações estáveis de imunoglobulina e hialuronidase que são estáveis para armazenamento na forma líquida em temperatura ambiente durante pelo menos 6 meses e em temperaturas de refrigeração padrões para 1-2 anos. Tais co-formulações podem ser usadas em métodos de tratamento de doença ou condição tratável por IG por administração subcutânea.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS
O beneficio da prioridade é reivindicado para o 5 Pedido de Patente Provisório US Série No. 61/277,045, intitulado "CO-FORMULAÇÃO ESTÁVEL DE HIALURONIDASE E IMUNOGLOBULINA E MÉTODOS DE USO DESTA", depositado em 17 de setembro de 2009.
Esse pedido também está relacionado com a o 10 Pedido correspondente US No. 12/807,991, depositado no mesmo dia com o presente, intitulado "CO-FORMULAÇÃO ESTÁVEL DE HIALURONIDASE E IMUNOGLOBULINA E MÉTODOS DE USO DESTA", o qual também reivindica a prioridade ao Pedido de Patente Provisório US Série No. 61/277,045.
Onde for permitida, a matéria de cada um dos pedidos acima mencionados está incorporada por referência na sua totalidade.
CAMPO DA INVENÇÃO
Aqui fornecidas estão as co-formulações estáveis 20 de imunoglobulina e hialuronidase que são estáveis ao armazenamento na forma liquida em temperatura ambiente durante pelo menos 6 meses, e em temperaturas padrões de refrigeração durante 1-2 anos. Tais co-formulações podem ser usadas em métodos de tratamento de doenças ou condições 25 tratáveis por IG, por administração subcutânea.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Produtos de imunoglobulina (IG) de plasma humano foram utilizados pela primeira vez em 1952 para tratar a deficiência imunológica. Inicialmente, administrações 30 intramusculares ou subcutâneas de IG foram os métodos de escolha. Para injetar maiores quantidades de IG necessárias para o tratamento eficaz de várias doenças, no entanto, produtos administráveis intravenosos com IG menos concentrada (50 mg/mL) foram desenvolvidos. A administração intravenosa (IV) de imunoglobulina (IVIG) é o principal tratamento de indivíduos com deficiências imunológicas. Embora as preparações de IVIG iniciais causassem efeitos 5 colaterais graves, as preparações de IVIG disponíveis no momento presente são bem toleradas na maioria dos sujeitos com deficiência imunológica. No entanto, uma pequena proporção dos sujeitos continua a ter reações desagradáveis, mesmo reações incapacitantes, como dor de 10 cabeça, fadiga, e mialgia. Febre e calafrios continuam a ser um problema, especialmente quando os sujeitos têm infecções intercorrentes. As reações muitas vezes persistem apesar das tentativas de outras preparações IVIG ou pré- medicação com acetaminofeno, difenidramina, e 15 corticosteróides. Além disso, devido ao requisito para a administração IV, existem problemas com consentimento do sujeito.
A administração subcutânea (SQ) de imunoglobulina é uma alternativa para a administração intravenosa. Em 20 comparação com infusões IV, a administração de imunoglobulina SQ tem várias vantagens. Por exemplo, reduz a incidência de reações sistêmicas, não exige, por vezes, difícil acesso IV, melhora por níveis, e dá mais independência aos sujeitos.
Para utilização terapêutica de qualquer preparação IG, outra consideração importante em produtos IG é a sua estabilidade durante o armazenamento. Manuseio seguro e administração de formulações contendo proteínas representam desafios significativos para os formuladores 30 farmacêuticos. Proteínas possuem propriedades químicas e físicas únicas que apresentam problemas de estabilidade: uma variedade de vias de degradação existe para proteínas, implicando tanto na instabilidade química quanto na física.
Instabilidade química inclui desaminação, agregação, grampeamento da estrutura de peptideos, e oxidação de residues de metionina. Instabilidade física engloba muitos fenômenos, incluindo, por exemplo, agregação. Deste modo, 5 existe uma necessidade de formulações estáveis de preparações de imunoglobulinas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Aqui proporcionadas estão composições, métodos e kits para a administração subcutânea de co-formulações 10 líquidas estáveis para o tratamento de doenças e condições tratáveis por IG. Proporcionadas estão composições de co- formulações líquidas estáveis formuladas para administração subcutânea, contendo imunoglobulina (IG) com uma concentração que é pelo menos 10% p/v, uma hialuronidase 15 solúvel a uma concentração que é pelo menos 50 U/mL, e está presente em uma razão de pelo menos 100 Unidades/grama (U/g) IG, NaCl a uma concentração de pelo menos 50 mM e um pH de entre 4 a 5. A co-formulaçâo é estável a 28°C - 32°C durante pelo menos 6 meses.
Além disso, um estabilizador de aminoácidos pode estar presente, por exemplo, alanina, histidina, arginina, lisina, omitina, isoleucina, valina, metionina, glicina ou prolina. Em alguns exemplos, o aminoácido está presente em uma quantidade que é pelo menos 100 mM. Em um exemplo, o 25 aminoácido é a glicina e está presente em uma quantidade que é ou é pelo menos 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 300 mM, 350 mM, 400 mM, 450 mM, 500 mM ou mais. Em outro exemplo, a glicina está em uma quantidade que é de 250 mM.
As co-formulações líquidas estáveis aqui 30 proporcionadas contêm IG pelo menos 10% a 22%, por exemplo, 10% p/v, 11% p/v, 12% p/v, 13% p/v, 14% p/v, 15% p/v, 16% p/v, 17% p/v, 18% p/v, 19% p/v, 20% p/v, 21% p/v, 22% p/v ou mais. Em alguns exemplos, a IG é de 10% p/v ou 20% p/v.
A IG utilizada nas co-formulações é derivada do plasma humano, por exemplo, ela pode ser purificada a partir de plasma humano, tal como por fracionamento de álcool. Em alguns exemplos, a IG é ainda purificada por qualquer uma 5 ou mais de uma modificação química, a incubação em pH 4,0, com ou sem pepsina, precipitação de polietileno glicol (PEG), cromatografia de troca iônica, divagem enzimática, tratamento solvente/detergente de diafiltração ou ultrafiltração. As co-formulações aqui proporcionadas podem 10 empregar IG que contém IgG, IgA e IgM. Em alguns exemplos, o IG contém mais do que 95% de IgG.
Além disso, as co-formulações podem conter NaCl. Em alguns exemplos, o NaCl está em uma concentração de 50 mM a 220mM, por exemplo, 50 mM, 60 mM, 70 mM, 80 mM, 90 mM, 100 mM, 110 mM, 120 mM, 130 mM, 140 mM, 150 mM, 160 mM, 170 mM, 180 mM, 190 mM, 200 mM, 210 mm, 220 mm ou mais. Em um exemplo, o NaCl está em uma concentração de 150 mM.
As co-formulações aqui proporcionadas contêm uma hialuronidase solúvel que pode estar em PH20, ou uma forma 20 truncada da mesma. Por exemplo, a hialuronidase solúvel pode ser uma ovina, bovina ou humana truncada PH20. Em alguns exemplos em que o PH20 é uma humana truncada PH20, a humana truncada PH20 pode ser selecionada a partir de entre os polipeptideos possuindo uma sequência de aminoácidos 25 estabelecidas em qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-9, ou suas variantes alélicas ou outras variantes destas. Num exemplo, a hialuronidase solúvel é rHuPH20.
Além disso, a hialuronidase solúvel pode estar em uma concentração que é de 50 U/mL a 500 U/mL, por exemplo, 30 50 U/mL, 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL, 400 U/mL, 500 U/mL ou mais. Por exemplo, a hialuronidase solúvel pode estar em uma concentração que é 100 U/mL ou 300 U/mL. Nas co- formulações aqui fornecidas aqui, a hialuronidase solúvel pode estar presente numa razão de 100 U/g IG a 5000 U/g IG, por exemplo, 100 U/g IG, 150 U/g IG, 200 U/g IG , 250 U/g IG, 300 U/g IG, 400 U/g IG, 500 U/g IG, 600 U/g IG, 700 U/g IG, 800 U/g IG, 900 U/g IG, 1000 U/g IG, 1200 U/g IG, 1500 U/g IG, 1800 U/g IG, 2000 U/g IG, 3000 U/g IG, 4000 U/g IG, 5000 U/g IG ou mais. Em alguns exemplos, a hialuronidase solúvel está em uma razão de 500 U/g IG, 1000 U/g IG, 1500 U/g IG ou 3000 U/g IG. O pH das co-formulações podem ser 4,4-4,9 sob uma forma concentrada.
As co-formulações aqui fornecidas podem ser formuladas para administração de dosagem múltipla ou a administração de dosagem única. Além disso, em exemplos em que a co-formulação é para administração de dosagem única, a IG está em uma quantidade suficiente para tratar uma doença ou condição tratável por IG. A IG pode ser administrada diariamente, semanalmente, quinzenalmente, a cada 2-3 semanas, a cada 3-4 semanas ou mensalmente para o tratamento de uma doença ou condição tratável por IG. A administração da co-formulação é efetuada de tal forma que a quantidade de IG administrada é substancialmente a mesma que a quantidade de uma administração de dosagem única, quando administrada por via intravenosa para o tratamento de uma doença ou condição tratável por IG. Em alguns exemplos, a quantidade de IG na co-formulação pode estar 25 cerca de 1 grama (g) a 200 g, por exemplo, 1 grama (g), 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 10 g, 20 g , 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g ou 200 g. Além disso, a quantidade de hialuronidase na composição pode estar cerca de 500 Unidades a 100.000 Unidades, por exemplo, 500 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 5000 Unidades, 10.000 Unidades, 30.000 Unidades, 40.000 Unidades, 50.000 Unidades, 60.000 Unidades e 70.000 Unidades , 80.000 Unidades, 90.000 Unidades, 100.000 Unidades ou mais.
As co-formulações liquidas contidas aqui são estáveis a 28 °C - 32°C por pelo menos 6 meses a um ano, por exemplo, 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou mais. As co-formulações liquidas são mais estáveis em 0°C - 10°C durante pelo menos 6 meses a 2 anos, por exemplo, de 6 meses, 1 ano, 2 anos ou mais.
Aqui também é fornecido um kit contendo qualquer um das co-formulações liquidas estáveis aqui fornecidas, e, opcionalmente, instruções de uso.
Contidos aqui estão os recipientes que contêm as co-formulações liquidas estáveis aqui fornecidas. O recipiente pode ser um tubo, garrafa, frasco, ou uma seringa. Nos exemplos onde o recipiente é uma seringa, o recipiente compreende ainda uma agulha para injeção. Assim, os recipientes aqui fornecidos contêm as co-formulações liquidas estáveis para administração de dosagem única ou administração de dosagem múltipla.
Aqui fornecidos são métodos de tratamento de doenças ou condições tratáveis por IG, por administrar subcutaneamente uma co-formulação liquida estável contendo uma hialuronidase solúvel e IG a um sujeito. A co- formulação é administrada de tal modo que a quantidade de IG administrada é substancialmente a mesma que a quantidade quando administrada intravenosamente para o tratamento de uma doença ou condição tratável por IG.
Além disso, os métodos aqui fornecidos são para o tratamento de uma doença ou condição tratável por IG, selecionada a partir de entre as doenças primárias de deficiência imunológica, doenças secundárias de deficiência imunolôgica, doenças inflamatórias, doenças autoimunológicas e infecções agudas.
Em alguns exemplos, as co-formulações podem ser administradas utilizando os métodos aqui fornecidos para tratar uma doença de deficiência imunológica primária. A doença de deficiência imunológica primária pode ser imunodeficiência comum variável (CVID), deficiência seletiva de IgA, deficiência de subclasse de IgG, a deficiência especifica de anticorpo, distúrbios do complemento, agamaglobulinemia congênita, ataxia telangiectasia, hiper IgM, Sindrome de Wiskott-Aldrich, imunodeficiência combinada severa (SCID), hipogamaglobulinemia primária, doenças de imunodeficiência primária com deficiência de anticorpos, agamaglobulinemia ligada ao X (XLA), ou hipogamaglobulinemia da infância.
Em outros exemplos, a doença ou condição tratável por IG é uma doença de imunodeficiência adquirida secundária para malignidades hematológicas. A malignidade hematológica pode ser selecionada entre leucemia linfocitica crônica (CLL), mieloma múltiplo (MM) e linfoma não-Hodgkin (NHL).
Nos casos em que a doença ou condição tratável por IG é uma doença autoimunológica ou inflamatória, a doença autoimunológica ou inflamatória pode ser selecionada dentre a doença de Kawasaki, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, sindrome de Guillain-Barre, púrpura trombocitopênica idiopática, polimiosite, dermatomiosite, miosite por corpúsculo de inclusão, sindrome miastênica de Lambert-Eaton, neuropatia motora multifocal, miastenia gravis e sindrome de Moersch-Woltman.
Em alguns exemplos, a co-formulação é administrada para tratar uma infecção aguda bacteriana, virai ou fúngica, tais como, por exemplo, Haemophilus influenzae tipo B; Pseudomonas aeruginosa tipos A e B; Staphylococcus aureus; streptococcus grupo B, Streptococcus pneumoniae tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19, e 23; adenovirus tipos 2 e 5; citomegalovirus; virus Epstein-Barr VCA; virus da hepatite A; virus da hepatite B; virus herpes simplex tipo 1 ; virus herpes simplex tipo 2; influenza A; sarampo; parainfluenza tipos 1, 2 e 3; polio; virus varicela zoster, Aspergillus e Candida albicans.
Além disso, a doença ou condição tratável por IG pode ser selecionada dentre imunodeficiência iatrogênica; encefalomielite disseminada aguda; vasculite necrotizante sistêmica ANCA positiva, anemia hemolitica autoimunológica; penfigóide bolhoso; penfigóide cicatricial; sindrome de Evans (incluindo anemia hemolitica autoimunológica com trombocitopenia imunológica); trombocitopenia aloimunológica feto-maternal/neonatal (FMAIT/NAIT); sindrome hemofagocitica; transplante de células tronco hematopoiéticas alogênico de alto risco; neuropatia paraproteinémica de IgM; transplante renal; esclerose múltipla; ataxia mioclonia opsoclonia; pênfigo foliáceo; pênfigo vulgar; púrpura pós-transfusional; necrólise epidérmica tóxica/sindrome de Steven Johnson (TEN/SJS); sindrome do choque tóxico, Doença de Alzheimer; lúpus eritematoso sistêmico; mieloma múltiplo; sépsis; tumores de células B; degeneração cerebelar paraneoplásica sem anticorpos; e o transplante de medula óssea.
DESCRIÇÃO DETALHADA
Resumo A. Definições B. Co-formulações estáveis de Imunoglobulina (IG) e hialuronidase 1. Terapia de Imunoglobulina 2. Administração subcutânea de Formulações de Imunoglobulina e Hialuronidase 3. Co-formulações estáveis C. Imunoglobulina e Preparação de Imunoglobulina 1. Preparação e Purificação a. Método de Cohn-Oncley b. Procedimentos Cohn-Oncley Modificados c. Processamento Viral 5 d. A concentração de Proteína e. Preparações Exemplares de IG i. 10% de IG ii. Preparações de IG de elevada concentração (por exemplo, 20% de IG) 10 2. Estabilidade de Armazenamento a. Excipientes de estabilização de proteína b. pH D. Hialuronidase 15 1. PH20 2. Hialuronidase Solúvel a. PH20 humana solúvel b. PH20 solúvel humana recombinante (rHupH20) 20 3. Glicosilação 4. Modificação de hialuronidase para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas E. Métodos de Produção de Ácidos Nucléicos codificando uma Hialuronidase solúvel e Polipeptídeos desta 25 1. Vetores e Células 2. Expressão a. Células Procarióticas b. Células de Levedura c. Células de Insetos 30 d. Células de Mamíferos e. Plantas 3. Técnicas de purificação F. Preparação, Formulação e Administração de Imunoglobulinas e Polipeptideos de Hialuronidase Solúvel 1. Formulações e Dosagens a. Imunoglobulina b. Hialuronidase c. Cloreto de Sódio d. Estabilizador de Aminoácidos e. Outros Agentes 2. Formas de Dosagem 3. Administração G. Métodos de Avaliação de Atividade, Estabilidade, Biodisponibilidade e Farmacocinética 1. Tamanho Molecular 2. Atividade Biológica a. Imunoglobulina b. Hialuronidase 3. Farmacocinética e Tolerabilidade H. Métodos de Tratamento e Usos Terapêuticos I. Imunodeficiência Primária e Secundária a. Imunodeficiência Primária b. Imunodeficiência Secundária J. Doenças Inflamatórias e Autoimunológicas a. Doença de Kawasaki b. Polineuropatia Desmielinizante Inflamatória Crônica c. Sindrome de Guillain-Barre d. Púrpura trombocitopênica idiopática e. Miopatias Inflamatórias i. Dermatomiosite ii. Polimiosite iii. Miosite por corpúsculo de inclusão f, Sindrome miastênica de Lambert-Eaton g, Neuropatia motora multifocal h. Miastenia Gravis i. Sindrome de Moersch-Woltman 3. Infecções Agudas 4. Outras doenças e Condições I. Artigos de fabricação e kits J. Exemplos
A. DEFINIÇÕES
Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que é normalmente entendido por um perito versado na técnica a qual a invenção(Ões) pertence(m). Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos publicados e publicações, sequências de Genbank, bases de dados, weblocals e outros materiais publicados referidos ao longo da descrição completa neste documento, salvo indicado em contrário, são incorporados por referência na sua totalidade. No caso em que há uma pluralidade de definições para os termos aqui, aqueles nesta seção prevalecerá. Quando for feita referência para um URL ou outro, tal como identificador ou endereço, é entendido que tais identificadores podem mudar e informação particular na internet pode ir e vir, mas a informação equivalente pode ser encontrada através de pesquisa na internet. Referência aqui evidencia a disponibilidade e disseminação pública de tal informação.
Tal como aqui utilizadas, "imunoglobulina", "imuno globulina", "gama globulina" referem-se as preparações de proteínas plasmáticas derivadas a partir de mistura de plasma de doadores adultos. Os anticorpos IgG predominam; outras subclasses de anticorpos, tais como IgA e IgM estão presentes. Imunoglobulina terapêutica pode proporcionar imunização passiva por aumentar os níveis séricos de um beneficiário de anticorpos circulantes. Os anticorpos IgG podem, por exemplo, ligar e neutralizar as toxinas bacterianas; opsonizar patógenos; ativar o complemento; e suprimir as citocinas patogênicas e fagócitos através da interação com citocinas e receptores destas, tais como CD5, interleucina-la (IL-la), interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF- alfa), e receptores de células T. Imunoglobulina terapêutica pode inibir a atividade de auto-anticorpos.
Preparações de imunoglobulinas incluem também, mas não estão limitadas a imunoglobulina intravenosa (IGIV), imunoglobulina IV, imunoglobulina terapêutica. Preparações de imunoglobulina são bem conhecidas, e incluem as marcas, como BayGam®, Gamimunológica® N, Gammagard® S/D, Gammar®-P, Iveegam®EN , Panglobulin®, Polygam®S/D, Sandoglobulin®, Venoglobulin®-!, Venoglobulin®-S, WinRho® SDF e outros. Preparações de imunoglobulinas podem ser derivadas a partir de plasma humano, ou são produzidas de forma recombinante.
Tal como aqui utilizado, "intravenosa IgG" ou 20 tratamento de "IVIG" refere-se geralmente a um método terapêutico da administrar intravenosamente uma composição de imunoglubulinas IgG a um sujeito para tratar um número de condições, tais como deficiências imunológicas, doenças inflamatórias, e doenças autoimunológicas, As imunoglubulinas IgG são tipicamente preparadas e misturadas a partir de plasma. Todos os anticorpos ou fragmentos podem ser usados.
Tal como aqui utilizadas, doenças ou condições tratáveis por IG referem-se a qualquer doença ou condição 30 pela qual preparações de imunoglobulinas são usadas. Tais doenças e condições, incluem, mas não estão limitados a qualquer doença na qual um aumento de anticorpos circulantes é benéfico, tal como, por exemplo, de imunodeficiência; hipogamaglobulinemia adquirida secundária a malignidades hematológicas; doença de Kawasaki, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (CIDP); Sindrome de Guillain-Barre; púrpura trombocitopênica 5 idiopática; miopatias inflamatórias; sindrome miastênica Lambert-Eaton; neuropatia motora multifocal; Miastenia Gravis; sindrome de Moersch-Woltmann; hipogamaglobulinemia secundária (incluindo imunodeficiência iatrogênica), deficiência especifica de anticorpo; encefalomielite 10 disseminada aguda; vasculite necrotizante sistêmica ANCA- positiva; anemia hemolitica autoimunológica; penfigóide bolhoso; penfigóide cicatricial; sindrome de Evans (incluindo anemia hemolitica autoimunológica com trombocitopenia imunológica) ; trombocitopenia aloimunológica feto-maternal/neonatal (FMAIT/NAIT), sindrome Hemofagocitica; transplante de célula tronco hematopoiética alogênico de alto risco; neuropatia paraproteinémica de IgM; transplante renal; esclerose múltipla; ataxia mioclonia opsoclonia; pênfigo foliáceo; 20 pênfigo vulgar; púrpura pós-transfusional; necrólise epidérmica tóxica/sindrome de Steven Johnson (TEN/SJS); sindrome do choque tóxico, Doença de Alzheimer; lúpus eritematoso sistêmico; mieloma múltiplo; sépsis; tumores de células B; trauma; e uma infecção bacteriana, virai ou 25 fúngica.
Como aqui utilizada, temperatura ambiente refere- se a uma faixa, geralmente, a partir de cerca de 18 °C até cerca de 32°C. Aqueles peritos na técnica apreciarão que a temperatura ambiente varia consoante a localização e as 30 condições prevalecentes. Por exemplo, a temperatura ambiente pode ser mais elevada em climas mais quentes, tais como Itália ou Texas.
Como aqui utilizada, "estável" ou "estabilidade" com referência a uma co-formulação aqui proporcionada refere-se a uma na qual a (s) proteína(s) (IG e hialuronidase) nela essencialmente retém a sua estabilidade fisica e quimica e integridade sob armazenagem durante pelo menos seis meses em temperaturas de até 32°C. Para fins desta Lei, "estabilidade à temperatura ambiente" significa estabilidade na faixa superior de temperaturas ambientes tipicos para localidades mais quentes (isto é, 28-32°C para a Itália ou Texas). As formulações são estáveis ao longo da faixa de temperaturas ambientes e refrigeradas, ou seja, 0- 32 °C, ou até 32 °C durante pelo menos seis meses. Cada uma de IG e hialuronidase exibem estabilidade na co-formulação sob armazenagem durante pelo menos seis meses à temperatura ambiente, incluindo temperaturas até ou cerca de 32 °C. Os ensaios para avaliar a estabilidade de cada uma são bem conhecidos de um perito na técnica e aqui descritos.
Tal como aqui utilizada, a estabilidade de IG significa que a IG não agrega, desnatura, ou fragmenta substancialmente de tal forma que pelo menos 90% da IG está presente como monômeros ou oligo-/dimeros, com um peso molecular de IG dentre ou cerca de maior de 70 kDa e menor que <450 kDa. Assim, menor que cerca de 10%, por exemplo, menor que cerca de 5%, menor que cerca de 4%, menor que cerca de 3%, menor que cerca de 2%, menor que cerca de 1% da proteína IG está presente como um agregado (isto é, tem um tamanho molecular maior do que ou igual a 4 50 kDa em tamanho) na formulação. Da mesma forma, não mais do que 5% a 7%, por exemplo, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% ou 0,5% ou menor que a IG na co-formulação é fragmentada (isto é, tem um tamanho molecular menor que 70 kDa).
Tal como aqui utilizada, a estabilidade da hialuronidase significa que ela retém pelo menos 50%, 60%,70%, 80%, 90% ou mais da atividade de hialuronidase original antes do armazenamento. Ensaios para avaliar a atividade de hialuronidase são conhecidos por um perito na técnica e aqui descritos.
Como aqui utilizado, "armazenamento" significa que uma formulação não é imediatamente administrada a um sujeito, uma vez preparada, mas é mantida por um periodo de tempo sob condições particulares (por exemplo, temperatura particular; forma liquida ou liofilizada) antes de usar. Por exemplo, uma formulação liquida pode ser conservada durante dias, semanas, meses ou anos, geralmente, pelo menos seis meses, antes da administração a um sujeito sob temperaturas variadas, tais como refrigeradas (0° a 10°C) ou temperatura ambiente (temperatura até 32°C).
Como aqui utilizado, regime de dosagem refere-se a quantidade de imunoglobulina administrada e a frequência de administração. 0 regime de dosagem é uma função da doença ou condição a ser tratada, e assim pode variar.
Como aqui utilizado, "substancialmente o mesmo como um regime de dosagem intravenoso de IG (IVIG)" refere- se a um regime no qual a dose e/ou a frequência está dentro de uma quantidade que é eficaz para tratar uma doença ou condição particular, tipicamente está cerca de ou 10%, da dose IV ou frequência. Quantidades de IVIG que são eficazes para o tratar uma doença ou condição particular são conhecidas ou podem ser empiricamente determinadas por um perito na técnica. Por exemplo, como exemplificado abaixo, 300 mg/kg (ou seja, 21 gramas, assumindo que o adulto médio pesa 70 kg) a 600 mg/kg (ou seja, 42 gramas) é a dose tipica mensal de IVIG administrada a sujeitos com doenças de imunodeficiências primárias. Assim, IG, quando administrada em combinação com hialuronidase, é administrada por via subcutânea em doses que são, ou são cerca de 300 mg/kg a 600 mg/kg para o tratamento de doenças de imunodeficiências primárias.
Como aqui utilizada, frequência de administração refere-se ao tempo entre as doses sucessivas de 5 imunoglobulina. Por exemplo, a frequência pode ser uma, duas, três, quatro semanas, e é uma função da doença ou condição particular tratada. Geralmente, a frequência é, pelo menos a cada duas ou três semanas, e tipicamente não mais do que uma vez por mês.
Como aqui utilizada, hialuronidase refere-se a uma enzima que degrada o ácido hialurônico. Hialuronidases incluem hialuronidases bacterianas (CE 4.2.99.1) e hialuronidases de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos (CE 3.2.1.36) e hialuronidases do tipo mamíferos 15 (CE 3.2.1.35). Hialuronidases também incluem qualquer uma de origem não humana, incluindo, mas não limitado à origem murina, canina, felina, leporina, aviária, bovina, ovina, suína, equina, piscina, ranina, bacteriana, e qualquer uma a partir de sanguessugas, outros parasitas, e crustáceos. Exemplos de hialuronidases não-humanas incluem, hialuronidases de vacas (SEQ ID NOS: 10 e 11), vespas do revestimento amarelo (SEQ ID NOS: 12 e 13), abelha (SEQ ID NO: 14), vespão de face branca (SEQ ID NO: 15), vespa de papel (SEQ ID NO: 16), camundongo (SEQ ID NOS :17-19, 32), 25 suínos (SEQ ID NOS:20-21), rato (SEQ ID NOS: 22-24, 31), coelho (SEQ ID NO: 25), ovelha (SEQ ID NO: 26 e 27), orangotango (SEQ ID NO: 28), macaco cinomólogo (SEQ ID NO: 29), porquinho da índia (SEQ ID NO: 30) , Staphylococcus aureus (SEQ ID NO: 33), Streptococcus pyogenes (SEQ ID NO: 34), e Clostridium perfringens (SEQ ID NO: 35).
Hialuronidases também incluem aquelas de origem humana. Exemplos de hialuronidases humanas incluem HYAL1 (SEQ ID NO: 36), HYAL2 (SEQ ID NO: 37), HYAL3 (SEQ ID NO: 38), HYAL4 (SEQ ID NO: 39), e PH20 (SEQ ID NO: 1). Também estão incluídas entre as hialuronidases estão as hialuronidases solúveis, incluindo, PH20 ovina e bovina, PH20 humana solúvel e rHuPH20 solúvel.
Referência a hialuronidases inclui polipeptideos de hialuronidase precursores e polipeptideos de hialuronidase maduros (tais como aqueles em que uma sequência de sinal foi removida), formas truncadas destes que têm atividade, e inclui variantes alélicas e variantes 10 de espécies, variantes codificadas por variantes de splicing, e outras variantes, incluindo polipeptideos que têm pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para os polipeptideos precursores descritos em 15 SEQ ID NOS: 1 e 10-39, ou a forma madura da mesma. Por exemplo, a referência para hialuronidase também inclui as variantes de polipeptideos precursores de PH20 humanas descritas em SEQ ID NOS :50-51. Hialuronidases também incluem aquelas que contêm modificações químicas ou pós- 20 translacional e aquelas que não contêm substâncias químicas ou modificações pós-translacional. Tais modificações incluem, mas não estão limitados a, PEGilação, albuminação, glicosilação, farnisilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação, e outras modificações polipeptídicas 25 conhecidas na técnica.
Como aqui utilizada, uma hialuronidase solúvel refere-se a um polipeptídeo caracterizado pela sua solubilidade sob condições fisiológicas. Geralmente, uma hialuronidase solúvel carece de toda ou uma porção de uma 30 molécula âncora de gicofosfatidil (GPI), ou de outra forma não fixa suficientemente a membrana celular. Assim, sob expressão derivada de uma célula, uma hialuronidase solúvel é secretada para o meio. Hialuronidases solúveis podem ser distinguidas, por exemplo, por sua compartimentação na fase aquosa de uma solução de Triton X-114 aquecida a 37°C (Bordier et al., (1981) J. Biol. Chem., 256:1604-7). Membrana de molécula ancorada, tais como hialuronidases ancoradas lipídicas, dividirão em uma fase rica em detergente, mas dividirão em uma fase aquosa ou pobre em detergente seguindo tratamento com Fosfolipase-C. Incluídos entre as hialuronidases solúveis estão hialuronidases ancoradas a membrana nas quais uma ou mais regiões associadas com a ancoragem da hialuronidase para a membrana foi removida ou modificada, onde a forma solúvel retém a atividade de hialuronidase. Hialuronidases solúveis incluem hialuronidases solúveis recombinantes, e aquelas contidas ou purificadas a partir de fontes naturais, tais como, por exemplo, extratos de testículos de ovelhas ou vacas. Exemplos de tais hialuronidases solúveis são PH20 humana solúvel. Outros hialuronidases solúveis incluem PH20 ovina (SEQ ID NO: 27) e bovina (SEQ ID NO: 11).
Tal como aqui utilizada, PH20 humana solúvel ou sHuPH20 incluem polipeptideos maduros faltando todas ou uma porção do local de ligação do glicosilfospatidilinositol (GPI) com o terminal C de tal modo que sob expressão, os polipeptideos são solúveis. Exemplos de polipeptideos sHuPH20 incluem polipeptideos maduros tendo uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS :4-9 e 47-48. Os polipeptideos precursores para tais polipeptideos sHuPH20 exemplares incluem uma sequência de sinal. Exemplos dos precursores são aqueles estabelecidos nas SEQ ID NOS: 3 e 40-4 6, cada uma das quais contém uma sequência de sinal de 35 aminoácidos nas posições de aminoácidos 1-35. Polipeptideos HuPH20 solúveis também incluem aqueles degradados durante ou após os métodos de produção e purificação aqui descritos.
Tal como aqui utilizado, PH20 humana recombinante solúvel (rHuPH20) refere-se a uma forma solúvel de PH20 humana que é recombinantemente expressa em células de ovário de Hamster Chinês (CHO). rHuPH20 solúvel é codificada pelo ácido nucléico que inclui a sequência de sinal e é representada na SEQ ID NO: 49. Também estão incluídas as moléculas de DNA que são variantes alélicas das mesmas e outras variantes solúveis. O ácido nucléico codificando a rHuPH20 solúvel é expressa em células CHO, as quais secretam o polipeptídeo maduro. Como produzido no meio de cultura há heterogeneidade no terminal-C de modo que o produto inclui uma mistura de espécies que pode incluir qualquer uma ou mais das SEQ ID NOS: 4-9 em abundância diversa. Variantes alélicas correspondentes e outras variantes também estão incluídas, incluindo aquelas correspondentes aos polipeptídeos de PH20 humanas precursores representados em SEQ ID NOS: 50-51. Outras variantes podem ter 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-9 e 47-48, desde que retenham uma atividade de hialuronidase e sejam solúveis.
Como aqui utilizado, a atividade refere-se a uma atividade funcional ou atividades de um polipeptídeo ou porção deste associado com uma proteína de comprimento completo (completo) . Atividades funcionais incluem, mas não estão limitados à atividade biológica, a atividade catalítica ou enzimática, antigenicidade (capacidade de se ligar ou competir com um polipeptídeo para ligar a um anticorpo anti-polipeptideo), imunogenicidade, capacidade para formar multímeros, e a capacidade para ligar especificamente a um receptor ou ligante para o polipeptídeo.
Como aqui utilizado, atividade de hialuronidase refere-se à capacidade de hialuronidase para clivar o ácido hialurônico. Ensaios in vitro para determinar a atividade de hialuronidase de hialuronidases, tais como rHuPH20 solúvel, são conhecidos na técnica e aqui descritos. Os ensaios exemplares incluem o ensaio de microturvação descrito abaixo (ver, por exemplo, Exemplo 3) , que mede a clivagem de ácido hialurônico por hialuronidase indiretamente através da detecção do precipitado insolúvel formado quando o ácido hialurônico não clivado liga-se com albumina de soro.
Tal como aqui utilizado, o termo "ultrafiltração (UF) " engloba uma variedade de métodos de filtração por membranas em que a pressão hidrostática obriga um liquido contra uma membrana semi-permeável. Os sólidos suspensos e solutos de alto peso molecular são retidos, enquanto a água e os solutos de baixo peso molecular passa através da membrana. Este processo de separação é muitas vezes usado para purificar e concentrar soluções macromoleculares (103— 105 Da), especialmente as soluções de proteina. Um número de membranas de ultrafiltração está disponível, dependendo do tamanho das moléculas que retêm. A ultrafiltração é tipicamente caracterizada por um tamanho de poro da membrana entre 1 e 1000 kDa e pressões de operação entre IKPa e lOOOKPa, e é particularmente útil para a separação de colóides como proteínas a partir de moléculas pequenas, como açúcares e sais.
Tal como aqui utilizado, o termo "diafiltração" é realizado com as mesmas membranas como ultrafiltração e é uma filtração de fluxo tangencial. Durante a diafiltração, tampão é introduzida no tanque de reciclagem enquanto o filtrado é removido da operação da unidade. Em processos onde o produto está no concentrado (por exemplo IgG) , diafiltração lava componentes para fora da mistura de produto no filtrado, assim, trocando de tampões e reduzindo a concentração de espécies indesejáveis.
Tal como aqui utilizado, o termo "misturar" 5 descreve um ato de causar a distribuição igual de dois ou mais compostos distintos ou substâncias em uma solução ou suspensão, por qualquer forma de agitação. Distribuição igual completa de todos os ingredientes em uma solução ou suspensão não é necessária como um resultado de "misturar" 10 como o termo é utilizado neste pedido.
Tal como aqui utilizado, o termo "solvente" engloba qualquer substância liquida capaz de dissolver ou dispersar uma ou mais outras substâncias. Um solvente pode ser inorgânico na natureza, tal como água, ou pode ser um 15 liquido orgânico, tal como etanol, acetato de metil, acetona, acetato de etil, hexano, éter de petróleo, etc. Como usado no termo "tratamento com solvente detergente," solvente denota um solvente orgânico (por exemplo, fosfato de tri-N-butil) , o qual faz parte da mistura de solvente 20 detergente utilizada para inativar o vírus com envelope lipídico em solução.
Tal como aqui utilizado, o termo "detergente" é usado no presente pedido intercambiável com o termo "tensoativo" ou "agente de ação de superfície." Tensoativos 25 são tipicamente compostos orgânicos que são anfifílicos, isto é, contendo ambos os grupos hidrofóbicos ("caudas") e grupos hidrofílicos ("cabeças"), os quais tornam tensoativos solúveis em ambos os solventes orgânicos e água. Um tensoativo pode ser classificado pela presença de 30 grupos formalmente carregados na sua cabeça. Um tensoativo não-iônico tem grupos sem carga na sua cabeça, enquanto que um tensoativo iônico carrega uma carga líquida na sua cabeça. Um tensoativo zwiteriônico contém uma cabeça com dois grupos de carga oposta. Alguns exemplos de agentes tensoativos comuns incluem: aniônico (com base em sulfato, sulfonato ou ânions carboxilatos): perfluoro-octanoato (PFOA ou PFO), perfluoro-octanossulfonato (PFOS), dodecil sulfato de sódio (SDS), lauril sulfato de amónio, e outros sais de sulfato de alquil, laureth sulfato de sódio (também conhecido como lauril éter sulfato de sódio, ou SLES), alquil benzeno sulfonato; catiônico (com base em cátions de amónio quaternário): brometo de cetil trimetil amónio (CTAB) conhecido como brometo de hexadecil trimetil de amónio, e outros sais alquiltrimetilamônio, cloreto de cetilpiridinio (CPC) , amina de sebo polietoxilada (POEA), cloreto de benzalcônio (BAC), cloreto de benzetônio (BZT); zwiteriônico (anfotérico): dodecil betaina; cocamidopropil betaina; de coco anfo glicinato; não iônico: alquil poli(óxido de etileno), alquilfenol poli(óxido de etileno), copolimeros de poli(óxido de etileno) e poli(óxido de propileno) (conhecido comercialmente como poloxâmeros ou Poloxaminas), alquil poliglucosideos, incluindo octil glucosideo, decil maltosideo, álcoois glaxos (por exemplo, álcool cetilico e álcool oleilico), cocamida MEA, cocamida DEA, polissorbatos (Tween 20, Tween 80, etc.), detergentes Triton, e dodecil óxido de dimetilamina.
Tal como aqui utilizado, os residues de a- aminoácidos de ocorrência natural são os residues daqueles 20 a-aminoácidos encontrados na natureza, os quais são incorporados nas proteínas pelo reconhecimento especifico da molécula de tRNA carregada com o seu códon de mRNA cognato em humanos.
Tal como aqui utilizado, os ácidos nucléicos incluem DNA, RNA e seus análogos, incluindo ácidos nucléicos. peptidicos (PNA) e suas misturas. Os ácidos nucléicos podem ser simples ou duplos filamentos. Quando nos referimos às sondas ou aos iniciadores, os quais são opcionalmente rotulados, tal como com um marcador detectável, tal como um marcador radioativo ou fluorescente ou moléculas de filamentos simples estão contemplados. Tais moléculas são, 5 tipicamente, de um comprimento tal qüe o seu alvo é estatisticamente único ou de baixo número de cópias (tipicamente inferior a 5, geralmente inferior a 3) para sondagem ou iniciação de uma biblioteca. Geralmente uma sonda ou iniciador contém pelo menos 14, 16 ou 30 nucleotideos contiguos de sequência complementar a ou 10 idêntico ao gene de interesse. Sondas e iniciadores podem ser 10, 20, 30, 50, 100 ou de maiores comprimento ácidos nucléicos de.
Como aqui utilizado, um peptideo refere-se a um polipeptideo, isto é de 2 a 40 aminoácidos de comprimento.
Tal como aqui utilizado, os aminoácidos, os quais ocorrem 15 nas várias sequências de aminoácidos aqui fornecidas são identificados de acordo com as suas três letras ou uma letra de abreviaturas conhecidas (Tabela 1) . Os nucleotideos que ocorrem nos vários fragmentos de ácido nucléico são designados com as designações de letra única padrão utilizadas rotineiramente na 20 técnica.
Como aqui utilizado, um "aminoácido" é um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo de ácido carboxilico. Um polipeptideo contém dois ou mais aminoácidos. Para fins desta invenção, os aminoácidos incluem os vinte aminoácidos ocorrendo 25 naturalmente, os aminoácidos não-naturais e análogos de aminoácidos (isto é, os aminoácidos em que o a-carbono tem uma cadeia lateral) .
Tal como aqui utilizado, "residue de aminoácido" refere- se a um aminoácido formado sob digestão química (hidrólise) de um polipeptideo nas suas ligações peptidicas. Os residues de 30 aminoácidos aqui descritos são presumivelmente para ser na forma isomérica «L». Resíduos na forma isomérica "D", os quais são assim designados, podem ser substituídos por qualquer resíduo de L- aminoácido, desde que a propriedade funcional desejada seja mantida pelo polipeptideo. NH2 refere-se ao grupo amino livre presente no terminal amino de um polipeptideo. COOH refere-se ao grupo carbóxi livre presente no terminal carboxil de um polipeptideo. De acordo com a nomenclatura padrão de polipeptideo descrito em J. Biol. Chern., 243: 3557-3559 (1968), e adotado 37 C.F.R., §§1,821-1,822, as abreviaturas para os resíduos de aminoácidos são mostradas na Tabela 1: Tabela 1 - Tabela de Correspondência
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Deve notar-se que todas as sequências de resíduos de aminoácidos representados aqui por fórmulas têm uma orientação da esquerda para direita na direção convencional de terminal amino para terminal carboxil. Além disso, a frase "resíduo de aminoácido" é 5 amplamente definida para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência (Tabela 1) e aminoácidos modificados e não vulgares, tais como os referidos no 37 C.F.R., §§1,821-1,822, e aqui incorporados por referência. Além disso, deve notar-se que um traço no início ou no final de uma sequência de resíduo de aminoácidos 10 indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos, a um grupo amino terminal, tal como NH2 ou a um grupo carboxil terminal, tal como COOH.
Tal como aqui utilizado, "aminoácidos de ocorrência natural" referem-se aos 20 L-aminoácidos que ocorrem em 15 polipeptídeos.
Como aqui utilizado, "aminoácidos não-naturais" referem- se a um composto orgânico que tem uma estrutura similar a um aminoácido natural, mas tem sido modificado estruturalmente para imitar a estrutura e reatividade de um aminoácido natural. 20 Aminoácidos de ocorrência não-natural, assim, incluiem, por exemplo, os aminoácidos ou análogos de aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos de ocorrência natural, e incluem, mas não estão limitados aos, D-isosterômeros de aminoácidos. Exemplos de aminoácidos não-naturais são aqui descritos e são conhecidos dos 25 peritos na técnica.
Como aqui utilizado, uma mistura isocinética é uma na qual as razões molares de aminoácidos foi ajustada com base nas suas taxas indicadas de reação (ver, por exemplo, Ostresh et al., (1994) Biopolymers 34:1681).
Tal como aqui utilizado, a modificação é em referência a modificação de uma sequência de aminoácidos de um polipeptídeo ou uma sequência de nucleotídeos de uma molécula de ácido nucléico e inclui deleções, inserções, e substituições de aminoácidos e nucleotideos, respectivamente. Métodos de modificação de um polipeptideo são rotina para os peritos na técnica, por exemplo, usando metodologias de DMA recombinante.
Como aqui utilizado, substituições adequadas conservadoras de aminoácidos são conhecidas dos peritos nesta técnica, e podem ser feitas, geralmente, sem alterar a atividade biológica da molécula resultante. Os peritos nesta técnica reconhecem que, em geral, as substituições de aminoácidos únicas em regiões não essenciais de um polipeptideo não alteram substancialmente a atividade biológica (ver, por exemplo, Watson et al. Molecular Biology of a Gene, 4th Edition, 1987, The Benjamin /Cummings Pub. co., p. 224). Tais substituições podem ser feitas de acordo com aquelas estabecidas na Tabela IA, tal como se segue: Tabela IA
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Outras substituições também são permitidas e podem ser determinadas empiricamente ou de acordo com substituições conservadora conhecidas.
Como aqui utilizado, uma construção de DNA é uma 5 molécula de DNA linear ou circular de filamentos simples ou duplos, que contém segmentos de DNA combinados e justapostos de modo que não é encontrado na natureza. Construções de DNA existem como um resultado de manipulação humana, e incluem os clones e outras cópias de moléculas 10 manipuladas.
Como aqui utilizado, um segmento de DNA é uma porção de uma molécula de DNA maior tendo atributos especificados. Por exemplo, um segmento de DNA que codifica para um polipeptideo especificado é uma porção de uma 15 molécula de DNA maior, tal como um fragmento de plasmideo ou plasmideo, que, quando lida a partir da direção 5' para 3', codifica a sequência de aminoácidos do polipeptideo especificado.
Tal como aqui utilizado, o termo polinucleotideo 20 significa um polimero de filamento simples ou duplo de bases de desoxirribonucleotideos ou ribonucleotideos lidos a partir da extremidade 5' para a 3'. Polinucleotideos incluem RNA e DNA, e podem ser isolados a partir de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados a partir de 25 uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. O comprimento de uma molécula de polinucleotideo é dado aqui em termos de nucleotideos (abreviado "nt") ou pares de bases (abreviado ”bp"). O termo nucleotideos é usado para moléculas de filamento simples ou duplo, onde o contexto 30 permite. Quando o termo é aplicado a moléculas de filamento duplo, é utilizado para denotar comprimento total e será entendido como sendo equivalente ao termo pares de bases. Será reconhecido por aqueles peritos na técnica que os dois filamentos de um polinucleotideo de filamento duplo podem diferir ligeiramente em comprimento, e que as extremidades do mesmo podem ser escalonadas; assim todos os nucleotídeos dentro de uma molécula de polinucleotideo de filamento duplo não podem ser emparelhados. Tais extremidades desemparelhadas serão, em geral, não superiores a 20 nucleotídeos de comprimento.
Como aqui utilizado, "similaridade" entre duas proteínas ou ácidos nucléicos refere-se ao parentesco entre a sequência de aminoácidos das proteínas ou as sequências de nucleotídeos dos ácidos nucléicos. Similaridade pode ser baseada no grau de identidade e/ou de homologia de sequências de resíduos e os resíduos nelas contidos. Métodos para avaliar o grau de similaridade entre as proteínas ou ácidos nucléicos são conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, em um método de avaliação da similaridade de sequência, dois aminoácidos ou sequências de nucleotídeos estão alinhados de uma maneira que produz um nível máximo de identidade entre as sequências. "Identidade" refere-se à medida na qual o aminoácido ou sequências de nucleotídeos são invariantes. Alinhamento das sequências de aminoácidos, e para algumas sequências de nucleotídeos de extensão, também pode levar em consideração as diferenças conservadoras e/ou substituições frequentes em aminoácidos (ou nucleotídeos). Diferenças conservadoras são aquelas que preservam as propriedades físico-químicas dos resíduos envolvidos. Alinhamentos podem ser globais (alinhamento das sequências comparadas sobre todo o comprimento das sequências, e incluindo todos os resíduos) ou locais (o alinhamento de uma porção das sequências que inclui apenas a região ou regiões mais similares). "Identidade", por si só tem um significado reconhecido na técnica, e pode ser calculado utilizando técnicas publicadas. (Veja, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed. , Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993;
Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G. , Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New 10 York, 1991). Apesar de existir um número de métodos para medir a identidade entre dois polinucleotideos ou polipeptideos, o termo "identidade" é bem conhecido para artesãos versados (Carillo, H. & Lipton, D., SIAMJ Applied Math 48: 1013 (1988)).
Tal como aqui utilizado, homólogo (a) (em relação ao ácido nucléico e/ou sequências de aminoácidos) significa cerca de maior do que ou igual a 25%, homologia da sequência, tipicamente, maior do que ou igual a 25%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% ou 95% de homologia de 20 sequência; a porcentagem exata pode ser especifiçada, se necessário. Para fins aqui, os termos "homologia" e "identidade" são muitas vezes usados de forma intercambiável, salvo indicação em contrário. Em geral, para determinação da porcentagem de homologia ou identidade, as sequências são alinhadas de modo que a combinação mais elevada é obtida (veja, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New 30 York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 45:1073). Por homologia de sequência, o número de aminoácidos conservadores é determinado por meio de 5 programas algoritmos de alinhamento padrão, e pode ser usado com penalidades de lacunas de desvio (default gap) estabelecidas por cada fornecedor. Substancialmente, as moléculas de ácido nucléico homólogo hibridariam, tipicamente, a rigor moderado ou rigor elevado ao longo de 10 todo o comprimento do ácido nucléico de interesse. Também contempladas são moléculas de ácido nucléico que contêm códons degenerados em lugar de códons na molécula de ácido nucléico hibrida.
Se quaisquer duas moléculas têm sequências de 15 nucleotideos e sequências de aminoácidos que são pelo menos 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticas" ou "homólogas" pode ser determinadas utilizando algoritmos de computador conhecidos, tais como o programa "FASTA", utilizando, por exemplo, os parâmetros de desvio 20 (default) como em Pearson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:2444 (outros programas incluem o pacote de programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J Molec Biol 215:403 (1990)); Guide to Huge Computers, 25 Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a função BLAST da base de dados do National Center for Biotechnology Information pode ser usada para determinar a identidade. Outros programas comercialmente ou 30 publicamente disponíveis incluem o programa DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) e o programa University of Wisconsin Genetics Computer Group (DWG) "Gap" (Madison WI) . Porcentagem de homologia ou identidade de proteínas e/ou moléculas de ácidos nucléicos pode ser determinada, por exemplo, através da comparação da informação da sequência utilizando um programa de computador GAP (por exemplo, Needleman et al. (1970) J. Mol. Biol. 48:443, como revisado por Smith and Waterman ((1981) Adv. Appl. Math. 2:482). Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, os nucleotídeos ou aminoácidos), os quais são similares, dividido pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. Parâmetros por desvio (default) para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não-identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14:6745, como descrito por Schwartz and Dayhoff, eds., ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada lacuna e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada lacuna; e (3) nenhuma penalização para as lacunas finais.
Portanto, como aqui utilizado, o termo "identidade" ou "homologia" representa uma comparação entre um polipeptídeo ou polinucleotideo de teste e de referência. Tal como aqui utilizado, o termo pelo menos "90% idêntico ao" refere-se a identidade percentual de 90 a 99, 99 em relação à sequência de ácido nucléico ou de aminoácidos de referência do polipeptídeo. Identidade a um nível de 90% ou mais é indicativa do fato de que, assumindo para fins de exemplificação um comprimento de polipeptídeo teste e de referência de 100 aminoácidos são comparados. Não mais do que 10% (isto é, 10 fora dos 100) dos aminoácidos no polipeptídeo teste difere daquele polipeptídeo de referência. Comparações similares podem ser feitas entre o polinucleotídeos de teste e de referência.
Tais diferenças podem ser representadas como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente ao longo de todo o comprimento de um polipeptideo, ou elas podem ser agrupadas em um ou mais locais de comprimento variável até ao máximo permitido, por exemplo, diferença de aminoácidos 10/100 (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de ácido nucléico ou de aminoácido. Ao nivel das homologias ou identidades acima de cerca de 85-90%, o resultado deve ser independente do conjunto de parâmetros de lacuna e do programa; níveis tão elevados de identidade podem ser avaliados facilmente, muitas vezes por alinhamento manual, sem depender de software.
Como aqui utilizado, uma sequência alinhada refere-se à utilização de homologia (similaridade e/ou identidade) para alinhar as posições correspondentes em uma sequência de nucleotideos ou aminoácidos. Tipicamente, duas ou mais sequências, as quais estão relacionadas por 50% ou mais de identidade, estão alinhadas. Um conjunto alinhado de sequências refere-se à duas (2) ou mais sequências que estão alinhadas em posições correspondentes e podem incluir sequências de alinhamento derivadas a partir de RNAs, tais como ESTs e outras cDNAs, alinhadas com a sequência de DNA genômico.
Como aqui utilizado, "iniciador" refere-se a uma molécula de ácido nucléico que pode atuar como um ponto de início de síntese de DNA direcionada de forma padrão sob condições apropriadas (por exemplo, na presença de quatro trifosfatos de nucleosídeos diferentes e um agente de polimerização, tal como a polimerase do DNA, polimerase do RNA ou transcriptase reversa) num tampão apropriado e a uma temperatura adequada. Será apreciado que certas moléculas de ácido nucléico podem servir como uma "sonda" e como um "iniciador". Um iniciador tem, contudo, um grupo hidroxil 3' para extensão. Um iniciador pode ser usado em uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, a reação em cadeia da polimerase (PCR), transcriptase reversa (RT)-PCR, 5 RNA PCR, LCR, multiplex PCR, reunificação PCR, captura de PCR, expressão de PCR, 3' e 5' RACE, PCR in situ, PCR mediada por ligação e os outros protocolos de amplificação.
Tal como aqui utilizada, "par de iniciadores" refere-se a um conjunto de iniciadores que inclui um 10 iniciador 5' (a montante) que hibridiza com a extremidade 5' de uma sequência a ser amplificada (por exemplo, por PCR) e um iniciador 3' (a jusante) que hibridiza com o complemento da extremidade 3' da sequência a ser amplificada.
Como aqui utilizada, "especificamente hibrida" refere-se ao recozimento, por emparelhamento das bases complementares, de uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, um oligonucleotideo) para uma molécula de ácido nucléico alvo. Aqueles peritos na técnica estão 20 familiarizados com os parâmetros in vitro e in vivo que afetam a hibridização especifica, tal como o comprimento e a composição da molécula particular. Parâmetros, particularmente, relevantes para a hibridização in vitro incluem ainda recozimento e temperatura de lavagem, composição tampão e concentração de sal. Exemplos de condições de lavagem para a remoção de moléculas de ácido nucléico ligadas não especificamente com elevado rigor são 0,1 x SSPE, 0,1% de SDS, 65° C, e com rigor médio são 0,2 x SSPE, 0,1% de SDS, 50°C. Condições de rigor equivalentes 30 são conhecidas na técnica. A pessoa experiente pode facilmente ajustar estes parâmetros para atingir a hibridização especifica de uma molécula de ácido nucléico para uma molécula de ácido nucléico alvo apropriada para uma aplicação particular. Complementares, quando se refere a duas sequências de nucleotídeos, significa que as duas sequências de nucleotídeos são capazes de hibridizar, tipicamente com menos de 25%, 15% ou 5% descombinadas entre 5 os nucleotídeos opostos. Se necessário, a porcentagem de complementaridade será especificada. Tipicamente, as duas moléculas são selecionadas de tal modo que elas hibridizarão sob condições de elevado rigor.
Como aqui utilizado, substancialmente idêntica à 10 um produto significa suficientemente similar para que a propriedade de interesse seja suficientemente estável para que o produto substancialmente idêntica possa ser usado no lugar do produto.
Tal como aqui utilizado, é também entendido que 15 os termos "substancialmente idênticos" ou "análogos" variam de acordo com o contexto como entendido pelos peritos na técnica relevante.
Tal como aqui utilizado, a variante alélica ou uma variação alélica refere-se a qualquer de duas ou mais 20 formas alternativas de um gene que ocupa o mesmo locus cromossomal. Variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo fenotípico dentro das populações. Mutações do gene podem ser silenciosas (nenhuma alteração no polipeptídeo codificado) ou pode 25 codificar polipeptídeos tendo sequência alterada de aminoácido. 0 termo "variante alélica" também é aqui utilizado para denotar uma proteína codificada por uma variante alélica de um gene. Tipicamente, a forma de referência do gene codifica uma forma do tipo selvagem e/ou 30 uma forma predominante a partir de um polipeptídeo a partir de uma população ou membro de referência único de uma espécie. Tipicamente, as variantes alélicas, as quais incluem variantes entre e as espécies entre têm tipicamente pelo menos 80%, 90% ou maior identidade de aminoácidos com um tipo selvagem e/ou forma predominante da mesma espécie; o grau de identidade depende do gene e se a comparação é interespécies ou intraespécies. Geralmente, variantes 5 alélicas intraespécies possuem pelo menos cerca de 80%, 85%, 90% ou 95% de identidade ou superior com um tipo selvagem e/ou forma predominante, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade com um tipo selvagem e/ou forma predominante a partir de um polipeptideo. Referência a um 10 variante alélica aqui refere-se, geralmente, às variações n proteinas entre os membros da mesma espécie.
Como aqui utilizado, "alelo", o qual é aqui utilizado indiferentemente com "variante alélica" refere-se •às formas alternativas de um gene ou porções dos mesmos.
Alelos ocupam o mesmo locus ou posição em cromossomos homólogos. Quando um sujeito tem dois alelos idênticos de um gene, o sujeito é dito ser homozigótico para o gene ou alelo. Quando um sujeito tem dois alelos diferentes de um gene, o sujeito é dito ser heterozigótico para o gene.
Alelos de um gene especifico podem diferir um dos outros em únicos nucleotideos ou vários nucleotideos, e podem incluir substituições, deleções e inserções de nucleotideos. Um alelo de um gene também pode ser uma forma de um gene contendo uma mutação.
Tal como aqui utilizado, as variantes de espécies referem-se às variantes em polipeptideos entre espécies diferentes, incluindo diferentes espécies de mamiferos, tais como camundongo e humano.
Tal como aqui utilizado, uma variante de splicing 30 refere-se a uma variante produzida por processamento diferencial de um transcrito primário de DNA genômico que resulta em mais do que um tipo de mRNA.
Tal como aqui utilizado, o termo promotor designa uma porção de um gene contendo sequências de DNA que proporcionam para ligação da RNA polimerase e iniciação da transcrição. As sequências promotoras são comumente, mas nem sempre, encontradas na região 5' não codificante de genes.
Tal como aqui utilizado, polipeptideo isolado ou purificado ou proteína ou porção biologicamente ativa do mesmo é substancialmente livre de material celular ou outras proteínas contaminantes a partir da célula ou tecido a partir do qual a proteína é derivada, ou substancialmente livre a partir de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Preparações podem ser determinadas para ser substancialmente livre se elas aparecem livre de impurezas prontamente detectáveis, como determinado por métodos padrões de análise, tais como cromatografia em camada fina (TLC), eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), utilizados pelos peritos na técnica para avaliar tal pureza, ou pura suficientemente de modo que a purificação adicional não alterariam de forma detectável as propriedades físicas e químicas, tais como atividades enzimáticas e biológicas da substância. Métodos para a purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente puros quimicamente são conhecidos dos peritos na técnica. Um composto substancialmente puro quimicamente, no entanto, pode ser uma mistura de esteroisômeros. Em tais casos, purificação adicional pode aumentar a atividade específica do composto. 0 termo substancialmente livre de material celular inclui as preparações de proteínas, nas quais a proteína é separada a partir de componentes celulares das células, a partir dos quais é isolada ou recombinante produzida. Em uma modalidade, o termo substancialmente livre de material celular inclui as preparações de proteinas de enzima possuindo inferior a cerca de 30% (em peso seco) de proteinas não-enzimáticas (também aqui referidas como uma proteina contaminante), geralmente, 5 inferior a cerca de 20% das proteinas não-enzimáticas ou 10% das proteinas não-enzimáticas ou inferiores a cerca de 5% das proteinas não-enzimáticas, Quando a proteina de enzima é produzida de forma recombinante, ela é também substancialmente livre de meio de cultura, isto é, meio de 10 cultura representa menos que cerca de ou menos que em 20%, 10% ou 5% do volume da preparação de proteína enzimática.
Tal como aqui utilizado, o termo substancialmente livre de precursores químicos ou outros produtos químicos inclui preparações de proteínas enzimáticas, em que a 15 proteína é separada a partir de precursores químicos ou outros produtos químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. O termo inclui as preparações de proteínas de enzima possuindo menos do que cerca de 30% (em peso seco) de 20%, 10%, 5% ou menos de precursores químicos ou 20 produtos químicos não-enzimáticos ou componentes.
Tal como aqui utilizado, sintético, com referência a, por exemplo, uma molécula sintética de ácido nucléico ou de um gene sintético ou um peptídeo sintético refere-se a uma molécula de ácido nucléico ou uma molécula 25 polipeptídica que é produzida por métodos recombinantes e/ou por métodos de síntese química.
Tal como aqui utilizado, a produção por meios recombinantes por usar métodos de DNA recombinante significa que a utilização dos métodos bem conhecidos da 30 biologia molecular para expressar proteínas codificadas pelo DNA clonado.
Como aqui utilizado, vetor (ou plasmídeo) refere- se aos elementos discretos que são usados para introduzir um ácido nucléico heterólogo em células, quer para a expressão ou a replicação do mesmo. Os vetores permanecem tipicamente epissomal, mas pode ser designado para efetuar a integração de um gene ou porção deste em um cromossoma do genoma. Também contemplados são vetores que são cromossomas artificiais, tais como cromossomas da levedura artificiais e cromossomas artificiais de mamiferos. Seleção e utilização de tais veiculos são bem conhecidos dos peritos na técnica.
Como aqui utilizado, um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar o DNA que está operacionalmente ligado com sequências reguladoras, tais como as regiões promotoras, que são capazes de efetuar a expressão de tais fragmentos de DNA deste tipo. Tais segmentos adicionais podem incluir promotor e sequências de terminação e, opcionalmente, podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um intensificador, um sinal de poliadenilação, e semelhantes. Os vetores de expressão são geralmente derivados a partir de DNA de plasmideo ou virai, ou pode conter elementos de ambos. Assim, um vetor de expressão refere-se a um DNA recombinante ou construto de RNA, tal como um plasmideo, um fago, um virus recombinante ou outro vetor que, após introdução em uma célula hospedeira apropriada, resulta na expressão do DNA clonado. Vetores de expressão adequados são bem conhecidos dos peritos na técnica e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas, e aqueles que permanecem epissomal ou aqueles que integram no genoma da célula hospedeira.
Como aqui utilizado, vetor também inclui "vetores de virus" ou "vetores virais". Vetores virais são virus de engenharia que estão operativamente ligados aos genes exógenos para transferir (como veículos ou translado) os genes exógenos em células.
Tal como aqui utilizado, operativamente ou operacionalmente ligado quando referindo-se a segmentos de
DNA significa que os segmentos estão dispostos de modo que eles funcionam de acordo com as suas finalidades pretendidas, por exemplo, a transcrição inicia no promotor e prossegue através do segmento de codificação para a terminação.
Como aqui utilizado o termo avaliar se destina a incluir a determinação quantitativa e qualitativa no sentido da obtenção de um valor absoluto para a atividade de uma proteína, tal como uma enzima ou de protease, ou um domínio da mesma, presente na amostra, e também de se obter um índice, proporção, porcentagem, visual ou outro valor indicativo do nível da atividade. A avaliação pode ser direta ou indireta e as espécies químicas efetivamente detetadas não necessitam, evidentemente, ser o produto final de uma reação, tal como um produto da proteólise em si, mas pode ser, por exemplo, um derivado deste ou alguma substância adicional. Por exemplo, a avaliação pode ser a detecção de um produto de clivagem de uma proteína, tal como por SDS-PAGE e coloração das proteínas com Coomasie azul.
Como aqui utilizado, atividade biológica refere- se às atividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam sob administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. A atividade biológica, assim, engloba os efeitos terapêuticos e a 30 atividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. Atividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro designados para testar ou usar essas atividades. Assim, para fins aqui atividade biológica de uma protease é a sua atividade catalitica em que um polipeptídeo é hidrolisado.
Tal como aqui utilizado equivalente, quando referindo-se a duas sequências de ácidos nucléicos, significa que as duas sequências em questão codificam a mesma sequência de aminoácidos ou proteinas equivalentes. Quando equivalente é utilizado em referência a duas proteinas ou peptideos, isto significa que as duas proteinas ou peptideos têm substancialmente a mesma sequência de aminoácidos com apenas substituições de aminoácidos que não alteram substancialmente a atividade ou a função da proteina ou peptideo. Quando equivalente refere-se a uma propriedade, a propriedade não necessita estar presente na mesma extensão (por exemplo, dois peptideos podem exibir diferentes taxas de o mesmo tipo de atividade enzimática) , mas as atividades são geralmente substancialmente as mesmas.
Como usado aqui, "modular" e "modulação" ou "alterar" referem-se a uma mudança de uma atividade de uma molécula, tal como uma proteína. Atividades exemplares incluem, mas não estão limitados às atividades biológicas, tais como a transduçâo de sinal. Modulação pode incluir um aumento na atividade (isto é, a sobre-regulação ou atividade agonista), uma diminuição na atividade (isto é, baixa-regulação ou inibição) ou qualquer outra alteração numa atividade (tal como uma mudança na periodicidade, frequência, duração, cinética ou outro parâmetro) . Modulação pode ser dependente do contexto e, tipicamente, a modulação é comparada a um estado designado, por exemplo, a proteína do tipo selvagem, a proteína num estado constitutivo, ou a proteína expressa em um tipo de célula designada ou condição.
Tal como aqui utilizado, uma composição refere-se a qualquer mistura. Ela pode ser uma solução, suspensão, líquido, pó, pasta, aquoso, não aquoso ou qualquer combinação destes.
Como aqui utilizado, refere-se a uma combinação de qualquer associação entre ou entre dois ou mais itens. A combinação pode ter dois ou mais itens separados, tais como duas composições ou duas coleções, pode ser uma mistura dos mesmos, tal como uma mistura única dos dois ou mais itens, 10 ou qualquer variação dos mesmos. Os elementos de uma combinação são, geralmente, funcionalmente associados ou relacionados.
Tal como aqui utilizado, um kit é uma combinação empacotada que inclui opcionalmente outros elementos, tais 15 como reagentes adicionais e instruções para utilização da combinação ou dos seus elementos.
Tal como aqui utilizado, "doença ou distúrbio" refere-se a uma condição patológica em um organismo resultante da causa ou condição, incluindo, mas não 20 limitado às infecções, condições adquiridas, condições genéticas, e caracterizada-se por sintomas identificáveis. Doenças e distúrbios de interesse aqui são aqueles que são tratáveis por imunoglobulina.
Como aqui utilizado, "tratar" um sujeito com uma 25 doença ou condição significa que os sintomas do sujeito são parcialmente ou totalmente aliviados, ou são mantidos estáticos seguindo tratamento. Assim o tratamento engloba profilaxia, terapapia e/ou cura. Profilaxia refere-se a prevenção de uma doença potencial e/ou prevenção de um 30 agravamento de sintomas ou progressão de uma doença. O tratamento também engloba qualquer uso farmacêutico de uma preparação de imunoglobulina e as composições aqui proporcionadas.
Tal como aqui utilizado, um agente farmaceuticamente eficaz, inclui qualquer agente terapêutico ou de agentes bioativos, incluindo, mas não se limitam, por exemplo, aos anestésicos, vasoconstritores, 5 agentes dispersantes, fármacos terapêuticos convencionais, incluindo fármacos de moléculas pequenas e proteínas terapêuticas.
Tal como aqui utilizado, o tratamento significa qualquer maneira, na qual os sintomas de uma condição, 10 distúrbio ou doença, ou outra indicação são melhorados, ou de outra forma beneficamente alterados.
Tal como aqui utilizado efeito terapêutico significa um efeito resultante a partir do tratamento de um sujeito que altera, tipicamente aperfeiçoa ou melhora os 15 sintomas de uma doença ou condição ou que cura uma doença ou condição. Uma quantidade terapeuticamente eficaz refere- se à quantidade de uma composição, molécula ou composto que resulta em um efeito terapêutico seguindo da administração a um sujeito.
Como aqui utilizado, o termo "sujeito" refere-se a um animal, incluindo um mamífero, tal como um ser humano.
Tal como aqui utilizado, um paciente refere-se a um sujeito humano.
Como aqui utilizado, melhoria dos sintomas de uma 25 doença particular ou distúrbio através de um tratamento, tal como por administração de uma composição farmacêutica ou outro terapêutico, refere-se a qualquer redução, se permanente ou temporária, duradora ou transitória, dos sintomas que podem ser atribuídos ou associados com a 30 administração da composição ou terapêuticos.
Tal como aqui utilizado, a prevenção ou a profilaxia refere-se aos métodos, em que o risco de desenvolver doença ou condição em é reduzido.
Como aqui utilizado, uma "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "uma dose terapeuticamente eficaz" refere-se à quantidade de um agente, composto, material, ou composição contendo um composto que é pelo 5 menos suficiente para produzir um efeito terapêutico. Por isso, é a quantidade necessária para prevenir, curar, melhorar, capturar ou parcialmente capturar um sintoma de uma doença ou distúrbio.
Como aqui utilizado, forma de dose unitária 10 refere-se às unidades fisicamente discretas adequadas para sujeitos humanos e animais e embaladas individualmente como é conhecido na técnica.
Tal como aqui utilizado, uma formulação de dosagem única refere-se a uma formulação para administração 15 direta.
Como aqui utilizado, um "artigo de fabricação" é um produto que é feito e comercializado. Tal como utilizado ao longo deste pedido, o termo pretende englobar composições IG e hialuronidase contidas nos artigos de 20 embalagem.
Tal como aqui utilizado, o fluido refere-se a qualquer composição que pode fluir. Fluidos, desse modo, englobam composições que estão na forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e 25 outras tais composições.
Como aqui utilizado, um "kit" refere-se a uma combinação de composições aqui proporcionada e um outro item para uma finalidade, incluindo, mas não limitado à ativação, a administração, diagnóstico e avaliação da 30 atividade biológica ou propriedade. Kits, opcionalmente, incluem instruções para utilização.
Como aqui utilizado, um extrato celular ou lisado refere-se a uma preparação ou fração, a qual é feita a partir de uma célula lisada ou interrompida.
Tal como aqui utilizado, animal, inclui qualquer 5 animal, tal como, mas não estão limitados aos primatas, incluindo humanos, gorilas e macacos; roedores, tais como camundogos e ratos; aves, tais como galinhas; ruminantes, tais como cabras, vacas, veados, ovelhas; ovinos, tais como porcos e outros animais. Animais não-humanos excluem os 10 seres humanos como o animal contemplado. As enzimas aqui fornecidas são a partir de qualquer fonte, animal, planta, procariótica e fúngicas. A maioria das enzimas é de origem animal, incluindo a sua origem em mamiferos.
Como aqui utilizado, um controle refere-se a uma 15 amostra que é substancialmente idêntica à amostra de teste, exceto que não é tratada com um parâmetro de teste, ou, se é uma amostra de plasma, pode ser a partir de um voluntário normal não afetado com o condição de interesse. Um controle também pode ser um controle interno.
Como é aqui utilizado, as formas singulares "um", "uma", "a" e "o" incluem referências no plural, a menos que o contexto claramente dite o contrário. Assim, por exemplo, a referência a um composto, compreende "um dominio extracelular " inclui compostos com um ou uma pluralidade 25 de dominios extracelulares.
Tal como aqui utilizado, as faixas e as quantidades podem ser expressas como "cerca de" um valor particular ou faixa. Cerca de também inclui a quantidade exata. Por isso, "cerca de 5 bases" significa "cerca de 5 30 bases" e também "5 bases."
Como aqui utilizado, "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância subsequentemente descritos ocorre ou não ocorre, e que a descrição inclui casos onde referido evento ou circunstância ocorre, e casos onde não ocorre. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo é não substituído ou é substituído.
Tal como aqui utilizado, as abreviaturas para quaisquer grupos protetores, aminoácidos e outros compostos, são, salvo indicação em contrário, de acordo com a sua utilização comum, as abreviações reconhecidas, ou pela Comissão IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica (ver, 10 (1972) Biochem. 11 :1726).
B. CO-FORMULAÇÕES ESTÁVEIS DE IMUNOGLOBULINA (IG) E HIALURONIDASE
Fornecidas neste documento estão as co- formulações estáveis contendo imunoglobulina (IG) e 15 hialuronidase. As co-formulações retêm distribuição de tamanho molecular IG e atividade hialuronidase após armazenamento prolongado na forma liquida em temperatura ambiente (por exemplo 28-32 °C) durante pelo menos seis meses. Geralmente, as co-formulações também retêm 20 distribuição de tamanho molecular IG e atividade hialuronidase em temperaturas de refrigeração padrão por, pelo menos, 1-2 anos. As co-formulações podem ser Utilizadas para o tratamento de doenças e condições tratáveis por IG. Em particular, as co-formulações estáveis 25 aqui fornecidas são formuladas para administração subcutânea.
1. Terapia de Imunoglobulina
A imunoglobulina é um terapêutico que é, principalmente, administrado para tratar indivíduos com 30 deficiências imunológicas. Distúrbios de deficiência de imunoglobulina são um subconjunto das doenças de imunodeficiência caracterizadas pela ausência ou redução dos níveis de imunoglobulinas séricas, levando a uma maior susceptibilidade para infecções bacterianas, especialmente do trato sinopulmonar. Doenças de imunodeficiências são ou primárias (genéticas) ou secundárias (adquiridas). Doenças de imunodeficiências primárias são raras e incluem agamaglobulinemia ligada ao X, deleção de cadeia pesada de imunoglobulina, deficiência de subclasses de imunoglobulina (IgG) G seletiva, imunodeficiência comum variável, ou sindrome M de hiperimunoglobulina ligada ao X. Níveis diminuídos de imunoglobulina também são encontrados em indivíduos tendo imunodeficiências combinadas devido aos defeitos de células T e B, tais como, mas não limitado à imunodeficiência combinada severa ou Sindrome de Wiskott Aldrich (IUIS Scientific Commitee, 1999). Mais comuns são as imunodeficiências secundárias, induzidas por fatores incluindo, mas não limitado à desnutrição, vírus, envelhecimento e leucemia. Indivíduos com estas doenças necessitam de terapia de substituição com produtos de imunoglobulina para prevenir ou reduzir a gravidade das infecções.
Terapia de substituição de imunoglobulina foi usada pela primeira vez em 1952 e foi administrada por via intramuscular ou subcutânea. No entanto, para tratar eficazmente a doença, maiores quantidades de IG são necessárias, o que levou ao desenvolvimento de produtos por via intravenosa, administráveis com concentrações de IG mais baixas (50-100 mg/mL). Desde 1981, a maioria dos produtos de imunoglobulina disponíveis nos Estados Unidos são administrados por via intravenosa. Geralmente, as preparações IG são estéreis, produtos purificados que contêm imunoglobulina G (IgG, IgM, IgA ou uma combinação dessas). Tipicamente, os produtos IG contêm 95-99% de IgG e apenas traços de quantidades de imunoglobulinas A(IgA), M(IgM), D(IgD) e E(IgE). As preparações IG para administração IV são geralmente formuladas em 3 a 12% IG.
Mais recentemente, as preparações de imunoglobulinas foram desenvolvidas para a administração subcutânea (Gardulf et al. (2006) Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 6: 434-42; Gardulf et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26: 177-85; Ochs et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26:265- 73) , e pelo menos um produto, Vivaglobin®, está licenciado para administração subcutânea nos Estados Unidos. Uma rota de administração subcutânea de IG tem várias vantagens em comparação com a rota IV, tal como melhor tolerabilidade e possibilidade de tratamento domiciliar.
A biodisponibilidade de imunoglobulina administrada por via subcutânea é, geralmente, menor do que a infusão intravenosa. Após a administração IV, a imunoglobulina é imediatamente disponível no sangue e, lentamente, equilibra para o compartimento extra-vascular ao longo de 3 a 5 dias (Schiff et al. (1986) J. Clin. Immunol. 6:256-64). Imunoglobulina administrada por via subcutânea é lentamente absorvida a partir do espaço subcutâneo no sangue, e ao mesmo tempo equilibra com o compartimento extra-vascular; não há elevado espalhamento IV. A biodisponibilidade não tem sido extensivamente estudada, mas, em um ensaio recente da preparação ZLB- Behring (isto é, Vivaglobin®), foi determinada pela medição da área sob a curva (AUG) que apenas 67% da imunoglobulina foi absorvida, e assim, a dose recomendada foi 137% da dose IV (Ochs et al. (2006) J. Clin. Immunol. 26:265-73). Apesar das dificuldades técnicas de comparação, a AUC para duas rotas diferentes e frequência de administração, estudos de imunoglobulina administrada por via intradérmica em coelhos sugerem que há uma redução na biodisponibilidade através da rota subcutânea. Isto pode ser devido ao modo de absorção de grandes moléculas de proteína, a qual não pode prontamente difundir através das paredes capilares e deve ser absorvida através do sistema linfático (Supersaxo et al. (1990) Pharm. Res. 7:167-9).
Todas as preparações de imunoglobulinas atualmente utilizadas para a administração subcutânea são formuladas em 16% de IG, em comparação com preparações IVIG formulados em 5 a 12% de IG. Quanto maior for a concentração de IG em preparações subcutâneas relativas às preparações IV, volumes menores de infusão serão permitos; tais preparações não podem ter infunsões intravenosamente. Tais métodos subcutâneos de terapia de substituição de imunoglobulina são considerados eficazes, seguros e também muito apreciados pelos pacientes, uma vez que tem um baixo risco de reações adversas sistémicas e conduz a maiores concentrações séricas mínimas de IgG em comparação com infusões IV mensais (Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs., 21 1917-27; Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol, 92:200-4; Gardulf et al. (1991) Lancet, 338:162-6).
Além da diminuição da biodisponibilidade associada com a administração subcutânea de IG, outra distinção entre administração SC e IV é que apenas pequenos volumes pode ser infundidos por via subcutânea em cada local, necessitando da utilização de múltiplos locais de 25 uma base de semana ou duas vezes por semana (sempre outra semana). Em geral, contudo, os adultos só podem ser infundidos com 20-40 ml em um local subcutâneo único, com menores volumes por local para as crianças. Atualmente, a prática aceita para administração de IG é 300-600 mg/kg por via intravenosa uma vez a cada 3-4 semanas ou 100-200 mg/kg/semana por via subcutânea (Berger (2008) Immunol. Allergy Clin. North Am. 28 (2):413-438). Assim, até 15 g de IG é administrado por semana por via subcutânea. Isto significa que a administração de uma preparação 16-20% de IG para pelo menos 3 locais por semana é necessária. Mesmo que a administração semanal ou quinzenal tenha a vantagem adcional de manter os niveis minimos melhores do que as 5 infusões mensais IV, a exigência de inserções de agulhas múltiplas tem sido um impedimento para muitos pacientes.
No entanto, os métodos subcutâneos de terapia de substituição de imunoglobulina estão se tornando uma alternativa cada vez mais popular para terapia de IVIG.
Pacientes tendo reações severas às infusões de IVIG, muitas vezes, podem tolerar IG administrada por via subcutânea. A administração subcutânea é considerada ser eficaz, segura e também muito apreciada pelos pacientes, uma vez que tem um baixo risco de reações adversas sistémicas e podem ser 15 administrada em casa ou no hospital (Gardulf et al. (1995) J. Adv. Nurs. 21: 917-27; Gardulf et al. (1993) Clin. Exp. Immunol. 92: 200-4; Gardulf et al. (1991) Lancet 338: 162- 6) .
2. Administração subcutânea de Imunoglobulina e 20 Formulações de Hialuronidase
A biodisponibilidade de IG administrada por via subcutânea é aumentada em combinação com a administração de hialuronidase, permitindo assim que a administração subcutânea de imunoglobulina em doses e frequências 25 similares ao tratamento de IVIG (ver, por exemplo, Pedido de Patente US 2010-0074885 e Internacional PCT No. WO 2009- 117085, cada um aqui incorporado por referência). O espaço subcutâneo (SC), formado por uma rede de colagênio carregada com ácido hialurônico, uma substância semelhante 30 a gel, é largamente responsável pela resistência ao fluxo de fluido através dos tecidos. Hialuronidase é uma família de enzimas ocorrendo naturalmente que decompõem o ácido hialurônico, o qual é uma substância semelhante a "gel" carragada no espaço encontrada na matriz extracelular e em tecido em todo o corpo, tais como a pele e o olho. Hialuronidase age por rompimento da ligação glucosaminidica em ácido hialurônico entre o Ci de uma porção de N- 5 acetilglucosamina e C4 de uma porção glucurônico. Este temporariamente diminui a viscosidade do cimento celular e promove a difusão dos fluidos injectados, facilitando assim a sua absorção. Posteriormente, o ácido hialurônico é regenerado naturalmente dentro de 24 horas. Por 10 conseguinte, a biodisponibilidade, farmacocinética e/ou características farmacodinâmicas das co-formulações de hialuronidase contendo são melhoradas. Com base em experiências em animais, a dispersão de fluido aumentada permite a administração de até 1 L por hora por via 15 subcutânea, a qual é uma taxa de fluxo similar à IV.
Na presença de hialuronidase, a biodisponibilidade de IG administrada por via subcutânea é aumentada, tipicamente mais que 90% da biodisponibilidade de IG seguindo tratamento de IVIG. Além disso, a co- 20 administração com uma hialuronidase solúvel permite infusão de grandes volumes em um local por via subcutânea. Por exemplo, volumes de até 600 mL ou maires de IG podem ser administrados em um único local de uma sessão, por exemplo, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL ou mais podem ser 25 administrados em um único local em uma única administração.
Por exemplo, uma preparação IG formulada em ou entre 5-12%, por exemplo, a 10% de proteina, a qual tipicamente são utilizadas apenas para a terapia de IVIG podem ser co- administradas por via subcutânea com uma hialuronidase 30 solúvel em dosagens equivalentes a doses de IVIG uma vez por mês, por exemplo, em ou cerca de 100 mg/kg, 200 mg/kg, 300 mg/kg, 400 mg/kg, 500 mg/kg, 600 mg/kg ou mais. As preparações de IG em concentrações mais elevadas de proteína, por exemplo, 12-25% de IG, tais como 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% ou mais também podem ser administradas por via subcutânea na presença de hialuronidase. As dosagens podem ser administradas como uma dose única ou pode ser dividida em doses múltiplas dadas diariamente ou semanalmente, tais como uma vez por semana ou a cada duas, três ou quatro semanas ou combinações das mesmas. Assim, IG, quando administrada por via subcutânea na presença de hialuronidase, pode ser administrada uma vez por mês em doses dissipadas de IVIG para a indicação particular. Além disso, porque a hialuronidase age para abrir canais de fluxo na pele, pode acelerar as taxas de infusão. Assim, por via subcutânea, administrar IG administrada com hialuronidase aumenta as taxas de infusão e, assim, diminui o tempo de distribuição de terapia de IG.
Por administrar IG por via subcutânea na presença de uma hialuronidase, uma ou todas as considerações e problemas associados com a administração subcutânea de IG são endereçadas. Assim, em virtude das propriedades de dispersão de hialuronidase, por administração via subcutânea IG na presença de uma hialuronidase solúvel permite administração de doses de IVIG em frequências de IVIG uma vez por mês, mantendo ao mesmo tempo biodisponibilidade de IVIG.
3. Co-Formulações Estáveis
Já que preparações de imunoglobulinas administráveis por via subcutânea têm as vantagens de tratamento domiciliar, um produto pronto para o uso estável de IG e hialuronidase é contemplado. Proteínas usadas para a terapia são tipicamente sujeitas a uma faixa de condições durante o processamento e armazenagem, incluindo baixo pH, as flutuações de temperatura, vários componentes de tampão e forças iônicas, e, muitas vezes, a concentração de elevada de proteína na preparação final. Para ser eficaz, no entanto, a co-formulação deve reter atividade suficiente da IG e hialuronidase. Assim, uma co-formulação de IG e hialuronidase deve ser fornecida como uma solução estável 5 para armazenamento como uma solução aquosa, sem deterioração durante períodos prolongados de tempo. Assim, aqui proporcionada está uma co-formulação líquida estável de IG e hialuronidase. A co-formulação é tal que é fornecida como uma forma de dosagem que pode ser utilizada 10 para a injeção direta, isto é, não diluída antes da utilização.
Verificou-se aqui que um produto co-formulado preparado pela adição de uma hialuronidase designada rHuPH20 para uma preparação de IG antes da administração 15 não era estável à temperatura ambiente. A adição de sal melhora a estabilidade da formulação, em particular, através da manutenção da atividade da hialuronidase na formulação. Assim, em adição em conter uma quantidade eficaz de IG e hialuronidase, as co-formulações estáveis 20 aqui proporcionadas também contêm, pelo menos, 50 mH de um sal de cloreto de metal alcalino, por exemplo, NaCl ou KOI. Tipicamente, as co-formulações estáveis também contêm um aminoácido, por exemplo, glicina, como um estabilizador e são fornecidas a um pH de cerca de ou em 4 a 5. Em geral, a 25 proporção de hialuronidase ao IG em um. produto co-formulado é maior do que a razão quando os mesmos produtos (IG e hialuronidase) e a mesma quantidade de IG são administrados por via subcutânea em separado, por exemplo, levando a uma administração de borda. 30 Geralmente, a co-formulação estável é uma formulação líquida. 0 armazenamento do co-formulação diretamente em uma forma líquida aproveita a conveniência de ter estabilidade de armazenamento, sob a forma líquida, a facilidade de administração sem reconstituição, e capacidade de fornecer a formulação pré-carregada, seringas prontas para usar ou preparações multidoses. Potento, as co-formulações liquidas fornecem uma preparação pronta para usar de IG e hialuronidase para 5 administração subcutânea a um sujeito, sem ter que reconstituir a preparação de precisamente e assepticamente e esperar por um periodo de tempo até que a solução fique límpida antes de administrar a formulação para o sujeito. Ela simplifica o procedimento de administrar a formulação de um sujeito para um profissional de 10 saúde. Além disso, o processo de fabricação das formulações liquidas é simplificado e mais eficiente do que o processo de fabricação para a versão liofilizada, porque todos os estágios do processo de fabricação das formulações liquidas são realizados em uma solução aquosa, e eles não envolvem qualquer processo de secagem, tal como a 15 liofilização e secagem liofilizada. Por conseguinte, é mais rentável também. A co-formulação estável pode ser fornecida como uma solução liquida em um recipiente ou uma seringa. Tal co-formulação pode ser convenientemente distribuída aos seres humanos ou outras espécies de mamíferos como um produto farmacêutico, sem mais reconstituição pelo 20 médico ou paciente.
Além disso, devido à sua elevada estabilidade durante o armazenamento, as co-formulações podem conter concentrações de proteina elevadas na faixa de cerca de 10% a 22% de IG, tal como 10% a 20% de IG sem causar um efeito adverso sobre a(s) atividade (s) 25 biológica(s) de IG, devido à agregação de proteinas e/ou fragmentação durante um armazenamento prolongado. Tal estabilidade não só assegura a eficácia da co-formulação de IG, mas também reduz os riscos possíveis de causar efeitos adversos em um sujeito. Assim, as co-formulações estáveis aqui proporcionadas mantêm a atividade 30 enzimática de hialuronidase e atividade de IG, minimizando a auto- associação e agregação de IG. Geralmente, a atividade é mantida a uma temperatura que é de até 32°C, por exemplo, de ou cerca de 0°C a 32°C, geralmente, em ou cerca de 28°C a 32°C. A estabilidade da co- formulação é mantida ao longo de períodos de tempo prolongados, por exemplo, diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente ou mais. As co-formulações têm a vantagem de serem estáveis na forma líquida durante o armazenamento por períodos prolongados de tempo de pelo menos 6 meses. Num exemplo, as co-formulações estáveis são estáveis no estado líquido durante pelo menos 1 ano ou mais, por exemplo, de 1 ano a 2 anos, tal como 1 ano, 2 anos, ou mais em temperaturas de frigorífico padrão (aproximadamente 4 ±2°C, ou cerca de 2-8°C, ou, mais geralmente, variando de cerca de 0-10° C) . Num outro exemplo, as co-formulações são estáveis na forma líquida durante a armazenagem à temperatura ambiente (na faixa de 18-32°C, por exemplo, 28°C a 32°C) durante pelo menos seis meses. Por exemplo, as co-formulações estáveis têm, geralmente, uma vida de prateleira de pelo menos ou cerca de 6 meses a 18 meses, por exemplo de 6 meses, 12 meses, 18 meses, ou mais, quando armazenadas à temperatura ambiente.
As seções seguintes descrevem as formulações aqui proporcionadas, incluindo imunoglobulinas exemplares e hialuronidases nas formulações, os métodos de fazê-las, e métodos de utilização das co-formulações estáveis para o tratamento de doenças e condições tratáveis por IG.
C. IMUNOGLOBULINA E PREPARAÇÃO DE IMUNOGLOBULIIIA
Aqui proporcionadas são imunoglobulinas (IG, também referida como a imunoglobulina de gamaglobulina, ou IgG) que podem ser formuladas em composições estáveis com hialuronidase. As co- formulações estáveis podem ser utilizadas para uso no tratamento de doenças e condições tratáveis por IG.
As imunoglobulinas são proteínas gamaglobulinas produzidas pelo sistema imunológico humoral e encontradas no plasma de animais superiores. IG age para fortalecer o sistema imunológico por modular a atividade de complemento, suprimindo a produção de autoanticorpos, saturando ou bloqueando os receptores Fc em macrófagos e linfócitos B, e suprimindo a produção de mediadores inflamatórios, como citocinas, quimiocinas e metaloproteinases. IG é composta por cinco classes, ou isotipos, de anticorpos (IgG, IgA, IgM, IgD e IgE) e várias subclasses, cada uma com diferentes especificidades diferentes. A IgG é a classe mais predominante de IG 5 encontrada no sangue e é importante em respostas imunológicas secundárias e tecidos protetores contra a infecção. A Tabela 2 ilustra quantidades típicas de imunoglobulinas encontradas no soro, embora as preparações de IG para o tratamento podem empregar etapas de purificação para alterar proporções de uma classe de 10 imunoglobulina particular ou classes. Por exemplo, proteína A, proteína G ou proteína H, cromatografia sefarose pode ser utilizada para enriquecer uma mistura de imunoglobulinas para IgG, ou para subtipos específicos de IgG (ver, por exemplo, Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Harlow 15 and Lane (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press; US Patent No. 5,180,810). Tabela 2. Imunoglobulina sérica
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1. Preparação e Purificação
As preparações de imunoglobulina aqui 20 proporcionadas podem ser preparadas a partir de quaisquer materiais adequados de iniciação. Por exemplo, as globulinas imunológicas podem ser isoladas a partir de sangue humano ou animal, por exemplo, a partir de soro de doador humano, ou elas podem ser produzidas por outros meios, por exemplo, por tecnologia de DNA recombinante ou tecnologia de hibridoma. Assim, as preparações de imunoglobulina podem incluir imunoglobulinas monoclonais ou 5 recombinantes. Por exemplo, a imunoglobulina pode ser obtida a partir de tecidos, culturas de hibridoma de linfócitos, plasma de sangue ou soro, ou culturas de células recombinantes, utilizando qualquer procedimento adequado, tal como, por exemplo, precipitação 10 (fracionamento de álcool de Cohn ou fracionamento de polietilenoglicol); métodos cromatográficos (cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de imunoafinidade); ultracentrifugação; ou preparação eletroforética (ver, por exemplo, Cohn et al. (1946) J. Am. 15 Chem. Soc. 68:459-75; Oncley et al. (1949) J. Am. Chem. Soc. 71:541-50; Barandern et al. (1962) Vox Sang., 7:157- 74; Koblet et al. (1967) Vox Sang., 13:93-102; Patentes ÜS Nos. 5,122,373 e 5,177,194). Tipicamente, a imunoglobulina é preparada a partir de gamaglobulina contendo os produtos 20 produzidos por fracionamento de álcool e/ou de troca iônica e métodos de cromatografia de afinidade e bem conhecidos dos peritos na técnica.
Etapas preparativas podem ser utilizadas para enriquecer um isotipo particular ou subtipo de 25 imunoglobulina. Por exemplo, proteina A, proteina G ou a proteina H-Sefarose cromatografia pode ser utilizada para enriquecer uma mistura de imunoglobulinas para IgG, ou para subtipos específicos de IgG. (Ver em geral, Harlow and Lane, Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press 30 (1999); Harlow and Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Patente US No. 5,180,810).
a. Método de Cohn-Oncley
Os métodos industriais clássicos de purificação de imunoglobulina a partir de plasma de sangue são baseados em fracionamento de etanol a frio, o qual co-precipitada grupos de proteínas com base em seus pontos isoelétricos em concentrações de álcool dadas em temperaturas abaixo de zero, originalmente empregadas por Cohn e modificadas por Oncley (ver, por exemplo, Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-75; Oncley et al. (1949) J. Am. Chem. Soc. 71 : 541-50) . 0 uso de álcool no processo de purificação pode potencialmente inativar vírus contaminantes, no entanto, com o aumento da temperatura e da concentração de álcool, o método de Cohn-Oncley pode resultar em proteínas desnaturadas e agregadas. Estas formas de elevado peso molecular podem agir como complexos anticorpo-antígeno que têm a capacidade de fixar o complemento livremente.
b. Procedimentos Modificados Cohn-Oncley
Para evitar os efeitos indesejáveis do método de Cohn-Oncley, métodos Cohn-Oncley modificados foram desenvolvidos para a preparação e purificação de IG. Vários desses procedimentos são conhecidos e podem ser adaptados e modificados para produzir as preparações IG aqui. É dentro da perícia na técnica para preparar preparações de IG, tendo em conta os métodos detalhados conhecidos e disponíveis na técnica.
Tipicamente, IG é fabricada usando um processo de fracionamento de etanol frio primário e fracionamento secundário que pode incluir, por exemplo, qualquer uma ou mais das seguintes etapas para obter um produto tendo uma atividade anti-complementar baixa (ACA): separação de IG agrega por técnicas convencionais, tais como a cromatografia de ultra-centrifugação ou exclusão; modificação química das moléculas de IG por alcoolização, alquilação, sulfonação e tratamento com agentes redutores (ver, por exemplo, Patente US 6, 875, 848); incubação a um pH moderadamente ácido (pH 4,0) com ou sem pepsina, plasmina e tripsina imobilizada; de fracionamento de plasma humano por meio de polímeros de etilenoglicol (Poison et al. (1964) Biochim. Biophys. Acta. 82: 463-475), a incorporação de polietilenoglicol (PEG) como um agente de purificação para o material separado do fracionamento Cohn (fração II ou II + III, ver, por exemplo, Patentes US Nos. 4,093,606 e 4,165,370), métodos de fracionamento que utilizam polietilenoglicol como um agente de precipitação, e outras técnicas descritas nas Patentes US Nos. 4,093,606, 4,126,605, 3,966,906, e 4,124,576, e outros métodos semelhantes de processos de purificação com polietilenoglicol (EP 0246579); tratamento de B- propiolactona; cromatografia de troca iônica para eliminar os contaminantes indesejáveis a partir dos materiais de partida utilizados para se obter as preparações IG (ver, por exemplo, Patentes US No. 3,869,436, EP 91300790 e WO 94/29334). EP 0440483 descreve uma combinação de técnicas úteis para facilitar a preparação intravenosa do produto à base de cromatografia de troca iônica e diafiltração a um pH fracamente ácido; clivagem enzimática; tratamento com solvente/detergente; e diafiltração e ultrafiltração.
Outros métodos também são descritos na técnica e são conhecidos por um perito na técnica (ver, por exemplo, as Patentes US 5,177,194 e 6,875,848).
Frações II de Cohn purificadas são comumente usadas. A partir da pasta da fração II de Cohn é 30 tipicamente cerca de 95 por cento de IgG e também contém os quatro subtipos de IG. Os subtipos diferentes estão presentes na Fração II em aproximadamente na mesma razão à medida que são encontrados no plasma humano misturado a partir da qual eles são obtidos. A Fração II é ainda purificada antes da formulação para um produto administrável. Por exemplo, a Fração II pode ser dissolvida em solução aquosa de álcool purificado frio e impurezas removidas através de precipitação e filtração. Após a filtração final, a suspensão de imunoglobulina pode ser dialisada ou diafiltrada (por exemplo, usando membranas de ultrafiltração com um limite de peso molecular nominal menor que ou igual a 100.000 daltons) para remover o álcool. A solução pode ser concentrada ou diluída para obter a concentração de proteína desejada e pode ser ainda purificada por técnicas bem conhecidas dos peritos na técnica.
c. Processamento Virai
As preparações de IG devem ser tratadas para remover a carga viral. Existem dois métodos de processamento virai : inativação virai e particionamento virai ou remoção. Inativação virai torna vírus inativos, por exemplo, altera quimicamente o revestimento de lípidio ou de proteína, ou por desnaturação completa do vírus. Exemplos de métodos de inativação virai incluem, mas não estão limitados ao aquecimento (pasteurização), o tratamento de solvente/detergente (S/D) e exposição a um ambiente ácido (pH baixo). O processo de S/D é o método de inativação virai mais amplamente utilizado na indústria de plasma sanguíneo, utilizado para inativar os vírus contendo um revestimento lipídico. Por exemplo, o processo de S/D tem sido demonstrado ter ação virucidal contra VSV (vírus estomatite vesicular), virus Sindbis, HIV, HBV (vírus da hepatite B) e HCV (vírus da hepatite C).
Remoção virai é um método que remove completamente todos os vírus a partir da amostra. Exemplos de partição virai ou remoção incluem, mas não estão limitados ao fracionamento etanol a frio, o particionamento fase ou precipitação com PEG, cromatografia de afinidade, troca iônica ou cromatografia de exclusão em gel e nanofiltração.
d. A concentração de proteína
As imunoglobulinas podem ser preparadas em concentrações variadas. Por exemplo, IG podem ser preparadas em concentrações de proteína variando a partir de ou cerca de 3-25% de IG, tipicamente de ou cerca de 10% a 22%, tal como 10%-20% p/v. Por exemplo, preparações Ig podem estar em ou cerca de 18% a 22% p/v de IG. As preparações de IG aqui fornecidas são, geralmente, preparadas em concentrações de IG em ou cerca de 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 21%, 22% ou mais. A concentração de proteína final depende em grande parte do método de geração e purificação. É contemplado aqui que qualquer preparação de imunoglobulina pode ser aqui utilizada para co-formulações estáveis com hialuronidase. Está dentro do nível de um perito na técnica determinar empiricamente a concentração apropriada de IG por inclusão na aqui co-formulações estáveis. A escolha de preparação IG dependerá de uma variedade de fatores, tais como a rota de administração, o paciente a ser tratado e o tipo de condição a ser tratada.
Por exemplo, qualquer preparação conhecida ou existente de IG pode ser usada. Estas incluem as preparações de IG tipicamente usadas para a administração IV (IVIG). Em geral, as preparações finais IG para administração intravenosa têm uma concentração de proteína de cerca de 3 a 12% p/v, ou tipicamente 10% p/v. Por exemplo, IVIG está comercialmente disponível como Carimunológica® NE, Flebogamma® 5%, Gammagard® Líquido, Gammagard® S/D, Gamunex®, Iveegam® PT, Octagam® e Polygam® S/D. Tipicamente, tais preparações utilizam um método de fracionamento de álcool frio, mas diferem nos métodos utilizados para isolar e purificar o globulina imunológica e métodos para reduzir a contaminação por virus potencial.
Além disso, outras preparações presentemente formuladas para administração intramuscular ou subcutânea podem ser usadas nas composições e métodos aqui proporcionados. Por exemplo, as preparações IG para administração intramuscular e administração subcutânea estão comercialmente disponíveis como GamaSTAN® S/D e Vivaglobin®, respectivamente. Tipicamente, tais preparações usam fracionamentos de etanol a frio a partir de plasma humano e têm uma concentração de IgG de cerca de 15 a 18% ou 10 a 22%, respectivamente. O Pedido Provisório No. 61/181,606 descreve a geração de uma composição de imunoglobulina concentrada e altamente purificada a partir de uma mistura de plasma para administração subcutânea.
e. Preparações de IG Exemplares i. 10% de IG
Exemplos de uma preparação de IG é Imunoglobulina intravenosa (humana), 10% (IVIG, 10%, comercializado como Gammagard® líquido, Baxter Healthcare Corporation), a qual é uma preparação de IgG líquida não modificada, com uma distribuição de subclasses de IgG similar ao plasma normal. A preparação contém fragmento intacto cristalizável (Fc) e regiões de fragmentos de ligação do antígeno (Fab) . As preparações contêm 100 mg/mL de proteína, com pelo menos 98% sendo de IgG; IgA está presente em uma concentração de 37 μg/mL, e IgM está presente apenas em quantidades vestigiais. Tem uma osmolalidade semelhante à osmolalidade fisiológica, e não contém açúcares adicionados, sódio ou conservantes. É formulado com glicina para a estabilização em um pH de 4,6 a 5,1. O processo de fabricação emprega um procedimento de fracionamento de álcool a frio de Cohn- Oncley modificado e outras purificações por um processo continuo através da utilização de cromatografia de troca catiônica fraca e cromatografia de troca aniônica fraca. O processo de fabricação também inclui três etapas de inativação virai independente ou remoção: tratamento solvente/detergente (S/D), nanofiltração e incubação a um pH baixo e uma temperatura elevada. Preparação de uma preparação de 10% de IVIG é descrita no Exemplo 1.
ii. Preparações de IG com concentração elevada (por exemplo, 20% de IG)
A geração de preparações de imunoglobulina de alta concentração é descrita no Pedido Provisório US No. 61/181,606. Exemplos de preparações contendo 18-22% de IG altamente purificadas, formulações liquidas isotônicas de imunoglobulina (pelo menos 95% de IgG) formuladas em 0,25 mM de glicina a pH 4,4 a 4,9, representadas nos Exemplos abaixo.
Os produtos de IgG de concentração elevada aqui descritos são produzidos por um processo tendo muitas das mesmas etapas ou similares, como no processo de produção de preparações tradicionais IVIG (por exemplo, 10% de IG) . As etapas adicionais de ultrafiltração/diafiltração utilizando membranas canal aberto com uma pós-lavagem especificamente concebida e formulação próxima do fim do processo de produção, rendem as composições resultantes de IG em cerca de duas vezes mais concentração elevada de proteina (200 mg/mL) comparado ao estado da técnica de IVIGs (por exemplo, Gammagard Líquido), sem afetar o rendimento e a estabilidade de armazenagem. Com membranas de ultrafiltração mais comercialmente disponíveis, uma concentração de 200 mg/mL de IgG não pode ser alcançada sem perdas de proteína principais. Estas membranas ficam precocemente bloqueadas, consequentemente, pós-lavagem adequada é difícil de conseguir. Portanto, configurações de membrana de canal aberto devem ser usadas. Além disso, um procedimento especificamente concebido de pós-lavagem é 5 utilizado para obter a concentração de IG necessária sem perda significativa de proteína (menos de 2% de perda); a maior concentração de proteína de 200 mg/mL não afeta a capacidade de inativação de vírus da etapa de armazenamento de baixo pH.
O processo geral de produzir a composição IG em alta concentração inclui as seguintes etapas, as quais são descritas mais em detalhes no Exemplo 2. Primeiro, os crioprecipitados são separados a partir de plasma congelado anteriormente para obter um líquido "plasma com baixo 15 crio", o qual é processado na etapa seguinte para obter o sobrenadante (ou fracionamento I). Ajuste de pH e da concentração de etanol, tipicamente a 7 e 20 a 25% v/v, respectivamente, seguido por centrifugação subsequente, enquanto a diminuição da temperatura, separa o líquido e sólido. 0 precipitado a partir dessa etapa é, então, extraído, misturado com sílica fumada, e filtrada, todas as etapas executadas a baixas temperaturas, tipicamente 2 a 8°C. 0 filtrado é então misturado com polisorbato-80 e citrato de sódio desidratado, sob agitação de 2 a 8°C. Precipitado G é então obtido em uma maneira similar à etapa de precipitação de Cohn II, na qual o pH e a concentração de álcool são ajustados. O precipitado G é dissolvido e filtrado com um filtro de profundidade de um tamanho nominal de poro de 0,2 μm (por exemplo, filtro Cuno VR06 ou equivalente) para se obter um filtrado límpido. Tratamento com solvente/detergente subsequente, tipicamente usando 1,0% (v/v) de Triton X-100, 0,3% (v/v) de Tween-80, e 0,3% (v/v) TNBP, a 18 a 25°C durante pelo menos 60 minutos, seguido por cromatografia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica e de nanofiltração usando, por exemplo, um filtro de Asahi Planova 35N ou equivalente. Subsequente a nanofiltração, o filtrado é concentrado para uma 5 concentração de proteina de 5 ± 1% p/v por ultrafiltração.
Em alguns exemplos, a ultrafiltração é realizada em um cassete com uma tela de canal aberto e a membrana de ultrafiltração tem um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 50 kDa ou menos. Após a conclusão da etapa de 10 ultrafiltração, o concentrado é diafiltrado contra uma solução 0,25 M de glicina com um pH baixo. Tipicamente, o volume de troca minima é de 6 vezes o volume de concentrado original, e a solução é concentrada até uma concentração de proteina de mais de 20% p/v. No final do processo de 15 diafiltração e concentração, o pH da solução está tipicamente entre 4,4 a 4,9. Para a formulação, a concentração de proteina da solução é então ajustada para um pouco mais de 20% p/v, por exemplo, 20,4 + 04% p/v, com o tampão de diafiltração. A solução volumosa formulada é 20 ainda esterilizada por primeiro filtrar através de um filtro de membrana com um tamanho de poro absoluta de 0,2 micron ou menos. Em seguida, a solução é assepticamente dispensada em recipientes finais para a selagem apropriada, com amostras coletadas para testar. A etapa final é 25 armazenar os recipientes selados com 30 a 32°C durante um periodo de tempo prolongado, por exemplo, 21 a 22 dias.
Incorporando etapas de ultrafiltração e formulações no processo de fabricação é uma melhoria sob purificação IG anteriormente utilizada e métodos de 30 concentração, resultando em preparações com concentrações mais elevadas de IG sem uma perda significativa de atividade IG, mantendo um pH baixo na formulação final. Tipicamente, os produtos têm uma concentração de proteina de pelo menos 18% peso/volume (p/v) , do qual a grande maioria (tipicamente não inferior a 95%) é de IgG, e um pH na faixa de pH 3-6, o que facilita a inativação de organismos patogênicos, tais como vírus que podem estar 5 presentes no plasma. Devido à concentração IG elevada e, por conseguinte, um volume reduzido na administração, as preparações de concentração elevada são adequadas para administração subcutânea. Em algumas modalidades, os produtos IG possuem uma viscosidade não superior a 18 10 mPascal-segundo e podem, portanto, ser adequados para administração intravenosa também. Diluição simples pode também permitir a administração intravenosa.
2. Estabilidade de armazenamento
Final, formulações purificadas IG devem estar 15 preparadas para manter a atividade do IG e evitar a agregação excessiva. Durante o armazenamento das preparações de IG, agregação pode ser minimizada e estabilidade melhorada através, por exemplo, da adição de excipientes de estabilização de proteína ou ajustando o pH 20 da solução.
a. Excipientes de estabilização de proteína
Uma maneira para aumentar a estabilidade das preparações IG que é bem conhecida na técnica é adicionar excipientes de estabilização de proteína para a preparação 25 IG. Excipientes conhecidos incluem, mas não estão limitados aos açúcares, polióis, aminoácidos, aminas, sais, polímeros e tensoativos. Por exemplo, Patente US 4,499,073 descreve a estabilização como um resultado da força iônica e pH da solução de armazenamento; Patente JP 54020124 descreve a 30 adição de um aminoácido para uma preparação intramuscular para tornar a preparação estável e segura para o armazenamento; JP 57031623 e JP 57128635 revelam o uso de arginina e/ou lisina com NaCl em 5 a 15% de preparações IG para alcançar estabilidade a longo prazo em uma preparação intramuscular; JP 4346934 descreve a utilização de baixa condutividade (menos de 1 rnrnho) , pH 5,3 a 5,7 e opcionalmente um ou mais estabilizadores, incluindo PEG, albumina de soro humano e manitol; US 4,439,421 ensina a adição de uma macromolécula hidrofílica, um poliol e uma outra proteína para estabilizar contra geração de anti- complemento; US 5,945,098 divulga a estabilização de soluções isotônicas pela adição de aminoácidos (0,1 a 0,3 M de glicina) e detergentes não iônicos (Polissorbato e PEG); US 4,186,192 divulga vários aditivos, incluindo aminoácidos; WO 2005/049078 divulga a estabilização com maltose, e, adicionalmente, glicina a 0,1 M; US 4,362,661 divulga o uso de aminoácidos básicos e neutros para conferir estabilidade de uma preparação IG 5%. Formulações liquidas estáveis podem também ser preparadas usando carboidratos em um meio aquoso, com força iônica muito baixa e um pH de 4,25 (Patente US No. 4,396,608) ou um pH fracamente ácido de 5-6 (EP 0278422),
Formação de dimero de preparações IG também pode ser controlada. Por exemplo, Patente US No. 5,871,736 divulga preparações IG, particularmente preparações líquidas, contendo um ou mais estabilizadores anfifílicos contra a formação de dimero. Os estabilizadores anfifílicos incluem o ácido nicotínico e seus derivados, em particular nicotinamida, e principalmente em conjunto com aminoácidos possuindo cadeias laterais não carregadas lipofílicas, por exemplo, fenilalanina, metionina, leucina, isoleucina, prolina e valina.
b. pH
As preparações de IG podem ser preparadas por métodos conhecidos na técnica, tais como quaisquer um aqui descrito. Geralmente, contudo, o pH da preparação final é ajustado para um pH relativamente elevado, nomeadamente na faixa de cerca de pH 4,0 a 7,4. Verificou-se que o pH da preparação de imunoglobulina é um fator importante em relação ao teor de monômero de IgG do produto final. Geralmente, uma preparação de imunoglobulina de 5 por cento tem um pH de 4,2 ± 0,5. Preparações de dez por cento são mais estáveis a um pH de 5,2 ± 0,2. O pH ótimo é obtido por técnicas de formulação bem conhecidas dos peritos na técnica. Por exemplo, o pH ótimo pode ser determinado a partir de determinações de exclusão de tamanho de cromatografia bem como dados de estabilidade de calor e a titulação anticomplemento das diversas preparações em condições de pH diferentes.
D. Hialuronidase
Aqui fornecidas são as co-formulações estáveis contendo imunoglobulina e uma hialuronidase, tipicamente uma hialuronidase solúvel. Hialuronidases são membros de uma grande família de enzimas que degradam o ácido hialurônico, o qual é um componente essencial da matriz extracelular e um constituinte principal da barreira intersticial. Por catalisar a hidrólise de ácido hialurônico, é um constituinte principal da barreira intersticial, hialuronidase reduz a viscosidade do ácido hialurônico, aumentando assim a permeabilidade do tecido. Como tal, hialuronidases têm sido utilizadas, por exemplo, como um agente de espalhamento ou de dispersão em conjunto com outros agentes, fármacos e proteínas para melhorar a sua dispersão e distribuição. Exemplos indicados aqui de hialuronidase nas co-formulações são hialuronidases solúveis. Há três classes gerais de hialuronidases; hialuronidase de mamíferos, hialuronidase bacteriana e hialuronidase de sanguessugas, outros parasitas e crustáceos.
Hialuronidases do tipo mamíferos (CE 3.2.1.35) são endo-/3-N-acetil-hexosaminidases que hidrolisam a ligação glicosidica βl → 4 de ácido hialurônico em vários comprimentos de oligossacarideos, tais como tetrassacarideos e hexassacarídeos. Elas têm tanto atividades hidrolíticas quanto atividades transglicosidases, e podem degradar o ácido hialurônico e o sulfato de condroitina (CS), em geral, C4-S e C6-S. Hialuronidases deste tipo incluem, mas não estão limitadas às hialuronidases de vacas (bovino) (SEQ ID NOS; 10 e 11), camundongo (SEQ ID NOS: 17-19, 32), suinos (SEQ ID NOS: 20- 21), rato (SEQ ID NOS: 22-24, 31), coelho (SEQ ID NO: 25), ovelha (ovino) (SEQ ID NOS: 26 e 27), orangotango (SEQ ID NO: 28), macaco cinomólogo (SEQ ID NO: 29), porquinho da índia (SEQ ID NO: 30), e hialuronidases humanas.
Hialuronidases de mamíferos podem ser subdivididas dentro daquelas que são ativas neutras, predominantemente encontradas em extratos dos testículos, e ácidas ativas, predominantemente encontradas em órgãos como o fígado. Exemplos de hialuronidases ativas neutras incluem PH20, incluindo, mas não limitado às PH20 derivadas de espécies diferentes, tais como ovinos (SEQ ID NO: 27), bovino (SEQ ID NO: 11) e humano (SEQ ID NO: 1). PH20 humana (também conhecida como SPAM1 ou PH20 de proteína de superfície de esperma) está, geralmente, ligada à membrana do plasma por meio de uma âncora de inositol glicosilfosfatidil (GPI). É naturalmente envolvida em adesão ovo-esperma e auxilia a penetração por esperma da camada de células de acúmulo por digestão de ácido hialurônico.
Além de PH20 humana (também denominada SPAM1), cinco genes semelhantes à hialuronidase têm sido identificados no genoma humano, HYAL1, HYAL2, HYAL3, HYAL4 e HYALP1. HYALP1 é um pseudogene e HYAL3 (SEQ ID NO: 38) não demonstrou possuir atividade enzimática para quaisquer substratos conhecidos. HYAL4 (precursor de polipeptideo estabelecido em SEQ ID NO: 39) é um condroitinase e exibe pouca atividade para hialuronano. HYAL1 (precursor de polipeptideo descrito em SEQ ID NO: 36) é a enzima ácida ativa prototípica e PH20 (precursor de polipeptideo descrito em SEQ ID NO: 1) é a enzima neutra ativa prototípica. Hialuronidases ácidas ativas, tais como HYAL1 e HYAL2 (precursor de polipeptideo descrito em SEQ ID NO: 37), geralmente não têm atividade catalítica em pH neutro (isto é, pH 7). Por exemplo, HYAL1 tem pouca atividade catalítica in vitro sob pH 4,5 (Frost et al. (1997) Anal. Biochemistry, 251:263-269). HYAL2 é uma enzima ácida ativa com uma atividade especifica muito baixa in vitro. As enzimas do tipo hialuronidase também podem ser caracterizadas por aquelas que são, geralmente, ligadas à membrana plasmática via uma âncora de glicosilfosfatidil inositol, tais como HYAL2 humana e PH20 humana (Danilkovitch-Miagkova et al. (2003) Proc Natl Acad Sei USA. 100(8):4580-5), e aquelas que são geralmente solúveis, tais como HYAL1 humana (Frost et al., (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236 (1):10-5) .
1. PH20
PH20, similar a outras hialuronidase de mamíferos, é uma endo-/3-N-acetil-hexosaminidase que hidrolisa ligação glicosidica a βl → 4 de ácido hialurônico em vários comprimentos de oligossacarideos, tais como tetrassacarideos e hexassacarideos. Elas têm ambas as atividades hidroliticas e transglicosidase, e podem degradar o ácido hialurônico e o sulfato de condroitina (CS) , tais como C4-S e C6-S. PH20 é naturalmente envolvida em adesão de esperma-ovo e auxilia na penetração por esperma da camada de células de acúmulo por digestão de ácido hialurônico. PH20 está localizada sobre a superficie do esperma, e no acrossoma derivado de lisossoma, onde está ligada à membrana interna acrossomal. Membrana plasmática PH20 tem atividade hialuronidase apenas em pH neutro, enquanto PH20 da membrana acrossomal interna tem atividade tanto pH neutro quanto ácido. Além de ser um hialuronidase, PH20 também parece ser um receptor para sinalização de célula induzida por HA, e um receptor para a zona pelúcida em torno do oócito.
Exemplos de proteinas PH20 incluem, mas não estão limitadas aos humanos (polipeptídeo precursor descrito em SEQ ID NO: 1, polipeptídeo maduro descrito em SEQ ID NO: 2), PH20 de bovino (SEQ ID NO: 11), coelho (SEQ ID NO: 25), ovino (SEQ ID NOS: 32), polipeptídeos PH20 de camundongo (SEQ ID NO: 31) e rato (SEQ ID NO: 32). PH20 Bovina é um polipeptídeo precursor de aminoácidos na posição 553 (SEQ ID NO: 11) . Alinhamento de PH20 bovina com o PH20 humana mostra apenas uma homologia fraca, com lacunas múltiplas existentes desde o aminoácido na posição 470 até os terminais carbóxi respectivos, devido à ausência de uma âncora de GPI no polipeptídeo de bovino (ver, por exemplo, (ver, por exemplo, Frost GI (2007) Expert Opin. Drug. Deliv. 4:427-440). De fato, as âncoras claras GPI não são previstas em muitas outras espécies de PH20 além dos seres humanos. Assim, polipeptídeos de PH20 produzidos a partir de ovinos e bovinos naturalmente existem como formas solúveis. Embora PH20 bovina existe muito fracamente ligada à membrana plasmática, a qual não está ancorada por meio de uma âncora de fosfolipase sensível (Lalancette et al. (2001) Biol Reprod. 65(2):628- 36) . Esta característica única de hialuronidase de bovino tem permitido o uso da enzima solúvel testículos de hialuronidase de bovinos como um extrato para utilização clínica (Wydase®, Hyalase®).
A transcrição de mRNA PH20 humana é normalmente traduzida para gerar um polipeptideo precursor de aminoácido na posição 509 (SEQ ID NO: 1) contendo um sequência de sinal de aminoácido na posição 35 em N- terminal (posições 1-35 de resíduos de aminoácidos) e uma sequência de sinal de fixação de âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) de aminoácido na posição 19 no C-terminal (posições 491-509 de resíduos de aminoácidos) . A PH20 madura é, por conseguinte, um polipeptideo aminoácido na posição 474 definidos na SEQ ID NO: 2. Seguindo de transporte do polipeptideo precursor para o ER e remoção do peptídeo de sinal, o peptídeo de sinal fixado em GPI C-terminal é clivado para facilitar a fixação covalente de uma âncora de GPI para o aminoácido C- terminal formado recentemente na posição de aminoácido correspondente à posição 490 do polipeptideo precursor descrito em SEQ ID NO: 1. Assim, um polipeptideo maduro ancorado por GPI do aminoácido na posição 47 4 com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 é produzido.
Comparado com as outras hialuronidases, incluindo hialuronidase de veneno de abelha e mel e camundongo, macaco e PH20 de porquinho da índia, PH20 humana contém uma região comum de aminoácido na posição 340 com aminoácido na posição 57 conservado (ver, por exemplo, Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814). Os aminoácidos conservados incluem quatro resíduos de cisteína que formam pontes dissulfeto nos resíduos de aminoácidos nas posições 25, 189, 203 e 316 na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2 (correspondente aos residues 60, 224, 238 e 351 na sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 1) . Ligações de dissulfeto formam entre os residues de cisteina 060 e 0351 e entre 0224 e C238 para formar o dominio de hialuronidase no núcleo. No entanto, cisteinas adicionais são necessárias no terminal carbóxi para a atividade catalítica da enzima neutra de tal modo que os aminoácidos na posição 36-464 de SEQ ID NO: 1 contém o domínio de hialuronidase PH20 humana ativa minimamente. As outras quatro ligações de dissulfureto são formadas entre os resíduos de cisteina C376 e 0387; entre 0381 e 0435; entre 0437 e 0443; e entre 0458 e 0464 do polipeptídeo exemplificado na SEQ ID NO: 1 (correspondente aos resíduos 0341 e 0352; entre 0346 e 0400; entre 0402 e 0408; e entre 0423 e 0429 do polipeptídeo maduro representado na SEQ ID NO: 2, respectivamente).
Além disso, outros resíduos conservados estão similarmente envolvidos na ligação do substrato e catálise. Os resíduos de aminoácidos nas posições de aminoácidos 111, 113, 176, 249 e 252 correspondente aos resíduos na SEQ ID NO: 2 parecem estar envolvidos na atividade de PH20, uma vez que mutação nessa posição torna a enzima desprovidas de atividade enzimática ou deixa apenas uma atividade residual comparada ao PH20 do tipo selvagem não contendo as mutações (ver, por exemplo, Arming et al. (1997) Eur. J. Biochem., 247:810-814).
Existem sete locais de glicosilação ligados a N potenciais em N82, N166 e N235 e N254 e N368 e N393 e N490 de PH20 humana exemplificada na SEQ ID NO: 1. Ligações de dissulfeto formam entre os resíduos de cisteina C60 e C351 e entre C224 e 0238 para formar o domínio de hialuronidase do núcleo. Uma vez que os aminoácidos nas posições 36 a 464 da SEQ ID NO: 1 contêm o dominio de hialuronidase PH20 humana minimamente ativa, o local N-490 de glicosilaçâo ligado em N não é requerido para a atividade de hialuronidase adequada.
2. Hialuronidase solúvel
Geralmente, a hialuronidase nas co-formulações estáveis aqui proporcionadas são hialuronidases solúveis. Hialuronidases solúveis, quando expressas em células, são secretadas para o meio. A solubilidade pode ser demonstrada 10 através da partição da proteina na fase aquosa da solução de Triton X-114. Por conseguinte, é entendido que uma hialuronidase solúvel não inclui qualquer hialuronidase que contém uma âncora GPI, tornando o polipeptideo fixado à membrana celular. Por exemplo, a PH20 humano de comprimento 15 completo (representada na sua forma madura como SEQ ID NO: 2) contém uma âncora GPI e não é solúvel. Em contraste, polipeptideos de PH20 bovina e ovina não contêm uma âncora GPI que seja suficiente para fixação à âncora de GPI, e, portanto, são considerados como proteinas solúveis. Além 20 disso, a hialuronidase solúvel que estão incluidas nas co- formulações aqui fornecidas são, geralmente, proteinas substancialmente purificadas. Além disso, as hialuronidases solúveis mantêm a atividade de hialuronidase. Por exemplo, PH20 humana solúvel mantém atividade neutra.
Hialuronidases solúveis incluem hialuronidases que não incluem naturalmente uma âncora de GPI ou uma âncora suficiente para fixação à membrana, incluindo, mas não se limitam à Hyall, PH20 bovina e PH20 ovina, suas variantes alélicas e outras variantes. Também estão 30 incluidos entre hialuronidases solúvel estão qualquer hialuronidase que foi modificada para ser solúvel. Por exemplo, PH20 humana, a qual normalmente é uma membrana ancorada por meio de uma âncora de GPI, pode ser feita solúvel por truncamento de e remoção de todos ou uma porção da âncora de GPI no C-terminal. Hialuronidases solúveis também incluiem hialuronidases neutras ativas e ácidas ativas, no entanto, hialuronidases neutras ativas são contempladas para utilização nesta invenção para fins de administração subcutânea.
Assim, exemplo de uma hialuronidase solúvel é PH20 de quaisquer espécies, tais como qualquer uma representada em qualquer de SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31 e 32, ou formas truncadas destas faltando todas ou uma porção da âncora de GPI C-terminal, contanto que a hialuronidase seja solúvel e retenha a atividade de hialuronidase. Também incluidos entre as hialuronidases solúveis estão as variantes alélicas ou outras variantes de formas solúveis de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30, 31 e 32, tais como as formas truncadas das mesmas. Variantes alélicas e outras variantes são conhecidas por um perito na técnica, e incluem polipeptideos tendo 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% ou mais identidade de sequência para qualquer uma das SEQ ID NOS: 1, 2, 11, 25, 27, 30 e 31, ou formas truncadas destas.
Tipicamente, as co-formulações aqui contêm um PH20 humana solúvel. Embora PH20 de outros animais possam ser utilizadas, tais preparações são potencialmente imunogênicas, uma vez que são proteinas de origem animal. Por exemplo, uma proporção significativa dos pacientes demonstra prévia sensibilização secundária para alimentos ingeridos, e uma vez que estas são proteinas de origem animal, todos os pacientes têm um risco de sensibilização subsequente. Assim, preparações não-humanas pode não ser adequada para utilização crônica. Se preparações não- humanas são desejadas, é contemplado aqui que tais polipeptídeos podem ser preparados para ter imunogenicidade reduzida. Tais modificações estão dentro do nivel de um dos peritos na técnica.
a. PH20 humana solúvel
Exemplos de um hialuronidase solúvel é PH20 humana solúvel. As formas solúveis de PH20 humana recombinante foram produzidas e podem ser incluídas nas co- formulações aqui descritas. A produção de tais formas solúveis de PH20 é descrita nos Pedidos de Patente US Nos 10 2005-0260186 e 2006-0104968. As formas solúveis incluem, mas não estão limitadas a qualquer um tendo truncamentos C- terminais para gerar polipeptideos contendo aminoácido na posição 1 até o aminoácido na posição 4 64 ou da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO 1. Por exemplo, 15 formas solúveis incluem, mas não estão limitadas a qualquer um tendo truncamentos C-terminais para gerar polipeptideos contendo aminoácido na posição 1 até o aminoácido nas posições 467 a 483, por exemplo, 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 e 483. Quando expresso em células de mamíferos, a 20 sequência de sinal N-terminal de aminoácido na posição 35 é clivada durante o processamento, e a forma madura da proteína é segregada. Assim, os polipeptideos maduros solúveis contêm pelo menos os aminoácidos nas posições 36 a 464 de SEQ ID NO: 1. Por exemplo, polipeptideos solúveis 25 maduros contêm aminoácidos nas posições 36 a 467 para 36 a 483 de SEQ ID NO: 1, por exemplo 36 a 467, 477, 478, 479, 480, 481, 482 e 483 de SEQ ID NO: 1. Mutantes de deleção terminando nas posições 477 a 483 do aminoácido (correspondente ao polipeptídeo precursor representado na 30 SEQ ID NO: 1) exibem maior atividade de hialuronidase secretada do que a forma ancorada de GPI de comprimento completo. Assim, exemplos de hialuronidase solúveis são aqueles que são aminoácidos nas posições 442, 443, 444, 445, 446 ou 447 de comprimento, tal como definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 4-9, ou variantes alélicas ou espécies ou outras variantes das mesmas.
b. Recombinante PH20 solúvel humana (rHuPH20)
Formas solúveis recombinantes de PH20 humana designadas como rHuPH.20 foram geradas e podem ser produzidas e purificada utilizando os métodos aqui descritos. A geração de tais formas solúveis de rHuPH20 está descrita no Pedido de Patente US Nos. de Série 11/065,716 e 11/238,171 (publicados como pedidos de patentes publicados US Nos US20050260186 e US 20060104968), e nos Exemplos 3 a seguir. Exemplos de tais polipeptideos são aqueles gerados a partir de uma molécula de ácido nucléico codificando os aminoácidos nas posições 1-482 descritos em SEQ ID NO: 3. Processamento de tradução posterior remove a sequência de sinal de aminoácido na posição 35, resultando na secreção de uma rHuPH20 solúvel de aminoácido na posição 447 (SEQ ID NO: 4). rHuPH20 purificada resultante pode ser heterogênea devido a peptidases presentes no meio de cultura sobre a produção e purificação. Tipicamente, rHuPH20 é produzida em células que facilitam N-glicosilação correta para reter a atividade, tais como células CHO (por exemplo, células CHO DG44).
3. glicosilação
Glicosilação, incluindo a glicosilação ligada em N e O, de algumas hialuronidases pode ser muito importante para a sua atividade catalitica e estabilidade. Enquanto alterar o tipo de glicano modificando uma glicoproteina pode ter dramática influência sobre a antigenicidade de uma proteína, dobragem estrutural, solubilidade e estabilidade, a maioria das enzimas não são pensadas para exigir glicosilação para a atividade enzimática ótima. Tais hialuronidases são únicas, a este respeito, em que a remoção de glicosilação ligada em N pode resultar em inativação completa perto da atividade de hialuronidase. Para tais hialuronidases, a presença de glicanos ligados em N é critica para a geração de uma enzima ativa.
Oligossacarideos ligados em N recaem em vários tipos principais (oligomanose, complexo, hibrido, sulfado), todos os quais têm (Man) 3-GlcNAc-GlcNAc-núcleos ligados através do nitrogênio da amida de residues Asn que recaem dentro de sequências Asn-Xaa-Thr/Ser (onde Xaa não é Pro) . A glicosilação em um local Asn-Xaa-Cys tem sido relatada para a coagulação da proteína C. Em alguns casos, a hialuronidase pode conter tanto ligações N-glicosídicas quanto ligações O-glicosídicas. Por exemplo, PH.20 tem oligossacarideos ligados em 0, bem como oligossacarideos ligados em N. Existem sete locais potenciais de glicosilação ligados em N em N82, N166, N235, N254, N368, N393, N490 de PH20 humana exemplificada na SEQ ID NO: 1. Como notado acima, glicosilação ligada em N em N490 não é necessária para a atividade de hialuronidase.
4. Modificações de hialuronidase para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas
Hialuronidases fornecidas nas co-formulações podem ser modificadas para melhorar as suas propriedades farmacocinéticas, tais como aumentar a sua semi-vida in vivo e/ou atividades. A modificação de hialuronidase para uso em co-formulações aqui fornecidas podem incluir fixação diretamente ou indiretamente através de um ligante, tal como covalentemente ou por outra ligação estável, um polímero, tal como dextrano, um polietilenoglicol (pegilação (PEG)) ou porção sialil, ou outros polímeros, tais como polímeros naturais ou açúcar.
É conhecida que PEGuilação de terapêuticos aumenta a resistência à proteólise, aumenta semi-vida plasmática, e diminui a antigenicidade e imunogenicidade. fixação covalente ou outra estável (conjugação) de 5 moléculas poliméricas, tais como porção de polietilenoglicol (PEG), para a hialuronidase, portanto, pode conferir propriedades benéficas à composição de enzima-polimero resultante. Tais propriedades incluem biocompatibilidade melhorada, extensão da meia-vida da 10 proteina (e atividade enzimática) no sangue, as células e/ou em outros tecidos dentro de um sujeito, blindagem eficaz da proteina a partir de proteases e de hidrólise, biodistribuição aperfeiçoada, farmacocinética e/ou farmacodinâmica melhorada, e solubilidade em água 15 aumentada.
Polimeros exemplares que podem ser conjugados com a hialuronidase, incluem homopolimeros naturais e sintéticas, tais como polióis (isto é, poli-OH), poliaminas (isto é, poli-NH2) e ácidos policarboxilicos (isto é, poli- 20 COOH), e heteropolimeros adicionais, ou seja, polimeros contendo um ou mais grupos de acoplamento diferentes, por exemplo, um grupo hidroxil e grupos amina. Exemplos de moléculas poliméricas adequadas incluem moléculas poliméricas selecionadas de entre os óxidos de 25 polialquileno (PAO), tais como polialquileno glicóis (PAG), incluindo polipropileno glicóis (PEG), metoxipolietileno glicóis (mPEG) e polipropileno glicóis, PEG-glicidil éteres (Epox-PEG), polietileno glicóis (PEGs) ramificado de PEG- oxicarbonilimidazol (CDI-PEG), álcool polivinilico (PVA), 30 policarboxilatos, polivinilpirrolidona, poli-D,L- aminoácidos, anidrido de ácido polietileno-co-maléico, anidrido de ácido poliestireno-co-maléico, dextranos incluindo carboximetil-dextranos, heparina, albumina homóloga, celuloses, incluindo metilcelulose, carboximetilcelulose, etilcelulose, hidroxietilcelulose, carboxietilcelulose e hidroxipropilcelulose, hidrolisados de quitosana, amidos, tais como hidroxietil amidos e 5 hidroxipropil amidos, glicogênio, agaroses e seus derivados, goma de guar , pululano, inulina, goma xantana, carragenina, pectina, hidrolisados de ácido alginico e bio- polimeros.
Tipicamente, os polímeros são os óxidos de polialquileno (PAQ), tais como óxidos de polietileno, tais como PEG, tipicamente mPEG, a qual, em comparação com polissacarideos, tais como dextrano, pululano e semelhantes, têm poucos grupos reativos capazes de reticulação. Tipicamente, os polímeros são moléculas poliméricas não-tóxicas, tais como (m)polietileno glicol (mPEG), o qual pode ser covalentemente conjugado com a enzima degradante hialuronano (por exemplo, aos grupos de fixação na superfície da proteína), utilizando uma química relativamente simples.
Moléculas poliméricas adequadas para fixação à enzima degradante de hialuronano incluem, mas não estão limitados ao polietileno glicol (PEG) e os derivados de PEG, tais como metóxi-polietileno glicóis (mPEG), PEG- glicidil éteres (Epox-PEG), PEG-oxicarbonilimidazol (CDI- PEG), PEGs ramificados, e óxido de polietileno (PEO) (ver, por exemplo, Roberts et al., Advanced Drug Delivery Review 2002, 54: 459-476; Harris and Zalipsky, S (eds.) "Polyethylene glycol), Chemistry and Biological Applications" ACS Symposium Series 680, 1997; Mehvar et 30 al., J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3 (1) :125-136, 2000; Harris, Nature Reviews 2:215 et seq. (2003); and Tsubery, J Biol. Chem 279(37):38118-24, 2004). A molécula polimérica pode ser de um peso molecular tipicamente variando de cerca de 3 kDa a cerca de 60 kDa. Em algumas modalidades, a molécula polimérica que é conjugada com uma proteína, tal como rHuPH20, tem um peso molecular de 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 ou mais do que 60 kDa .
Vários métodos de modificação de polipeptideos por ligação covalente (conjugando) um PEG ou derivado de PEG (isto é, "PEGuilação") são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, US 2006/0104968; US 5,672,662; US 6,737,505; e US de 2004/0235734). Técnicas para PEGuilação incluem, mas não estão limitados aos ligantes especializados e químicas de acoplamento (ver, por exemplo, Harris, Adv. Drug Deliv. Rev. 54:459-476, 2002), fixação de porções de PEG múltiplas a um local único de conjugação (tal como via de utilização de PEGs ramificados; veja, por exemplo, Veronese et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 12:177-180, 2002), PEGuilação de local específico e/ou mono PEGuilação (ver, por exemplo, Chapman et al., Nature Biotech. 17:780-783,1999), e PEGuilação enzimática direcionada ao local (ver, por exemplo, Sato, Adv. Drug Deliv. Rev. , 54:487-504, 2002) (ver, também, por exemplo, Lu and Felix (1994) Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138; Lu and Felix (1993) Peptide Res. 6:142-6, 1993; Felix et al. (1995) Int. J. Peptide Res. 46:253-64; Benhar et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:13398-404; Brumeanu et al. (1995) J Immunol. 154:3088- 95; veja também, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55 (10) :1261-77 e Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). Os métodos e técnicas descritos na técnica podem produzir proteínas com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais que 10 PEG ou derivados de PEG ligados a uma única molécula de proteína (ver por exemplo, US 2006/0104968).
Os reagentes numerosos para PEGuilação têm sido descritos na técnica. Tais reagentes incluem, mas não estão limitados ao N-hidroxisuccinimidil PEG ativado (NHS), succinimidil mPEG, mPEG2-N-hidroxisuccinimida, alfa- metilbutanoato de succinimidil mPEG, propionato de succinimidil mPEG, butanoato de succinimidil mPEG, succinimidil éster de carboximetil mPEG de ácido 3- hidroxibutanóico, propionato de PEG-succinimidil homobifuncional, propionaldeido PEG homobifuncional, butiraldeido PEG homobifuncional, maleimida de PEG, hidrazida de PEG, p-nitrofenil-carbonato de PEG, carbonato de mPEG-benzotriazol, propionaldeido de PEG, butiraldeido de mPEG, butiraldeido mPEG2 ramificado, acetil mPEG, piperidona de mPEG, mPEG metilcetona, maleimida "sem ligação" mPEG, sulfona vinil mPEG, tiol mPEG, tioéster de ortopiridil mPEG, dissulfeto de ortopiridil mPEG, Fmoc-PEG- NHS, Boc-PEG-NHS, PEG-NHS vinilsulfona, acrilato de PEG- NHS, fluoresceina PEG-NHS, e biotina-NHS PEG (veja, por exemplo, Monfardini et al,, Bioconjugate Chem. 6:62-69, 1995; Veronese et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12:197-207, 1997; OS 5,672,662; US 5,932,462; US 6,495,659; US 6,737,505; US 4,002,531 ; US 4,179,337; US 5,122,614; US 5,183,550; US 5,324,844; US 5,446,090; US 5,612,460; US 5,643,575; US 5,766,581; US 5,795,569; US 5,808,096; US 5,900,461; US 5,919,455; US 5,985,263; US 5,990, 237; US 6,113,906; US 6,214,966; US 6,258,351; US 6,340,742; US 6,413,507; US 6,420,339; US 6,437,025; US 6,448,369; US 6,461,802; US 6,828,401; US 6,858,736; US 2001/0021763; US 2001/0044526; US 2001/0046481; US 2002/0052430; US 2002/0072573; US 2002/0156047; US 2003/0114647; US 2003/0143596; US 2003/0158333; US 2003/0220447; US 2004/0013637; US 2004/0235734; US 2005/000360; US 2005/0114037; US 2005/0171328; US 2005/0209416; EP 01064951; EP 0822199; WO 00176640; WO 0002017; WO 0249673; WO 9428024; e WO 0187925).
E. Métodos de produção de ácidos nucléicos codificando uma Hialuronidase solúvel e polipeptideos destes
Polipeptideos de uma hialuronidase solúvel aqui estabelecida, podem ser obtidos por métodos bem conhecidos na técnica para a purificação de proteinas e expressão de proteina recombinante. Qualquer método conhecido dos peritos na técnica para a identificação de ácidos nucléicos que codificam genes desejados podem ser usados. Qualquer método disponivel na técnica pode ser usado para obter um comprimento total (isto é, abrangendo a região codificadora completa) cDNA ou clone de DNA genómico codificando uma hialuronidase, tais como a partir de uma fonte de célula ou tecido. Hialuronidases solúveis variantes ou modificadas, podem ser concebidas a partir de um tipo selvagem de polipeptideo, tal como por mutagénese direta no local. Tipicamente, hialuronidases, incluindo hialuronidases solúveis tais como rHuPH20, utilizadas nas co-formulações aqui proporcionadas podem ser produzidas de forma recombinante ou podem ser purificadas ou parcialmente purificadas a partir de fontes naturais, tais como, por exemplo, a partir de extratos de testículos.
Polipeptideos podem ser clonados ou isolados utilizando quaisquer métodos disponíveis conhecidos na técnica para a clonagem e isolamento de moléculas de ácido nucléico. Tais métodos incluem a amplificação por POR de ácidos nucléicos e de triagem de bibliotecas, incluindo a triagem de hibridação de ácido nucléico, triagem baseada em anticorpos e triagem baseada nas atividades.
Métodos para a amplificação de ácidos nucléicos podem ser utilizados para isolar moléculas de ácido nucléico codificando um polipeptideo desejado, incluindo por exemplo, métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR). Um ácido nucléico contendo material pode ser usado como material de partida a partir do qual uma molécula de ácido nucléico codificando polipeptideo desejado pode ser isolada. Por exemplo, preparações de DNA e mRNA, extratos 5 de células, extratos de tecidos, amostras de fluido (por exemplo, sangue, saliva, soro), as amostras de sujeitos saudáveis e/ou doentes podem ser utilizadas em métodos de amplificação. Bibliotecas de ácido nucléico também podem ser usadas como uma fonte de material de partida.
Iniciadores podem ser concebidos para amplificar um polipeptideo desejado. Por exemplo, os iniciadores podem ser concebidos com base em sequências expressas a partir das quais um polipeptideo desejado é gerado. Iniciadores podem ser concebidos com base na retro-tradução de uma sequência de aminoácido de polipeptideo. Moléculas de ácido nucléico geradas por amplificação podem ser sequenciadas e confirmadas para codificar um polipeptideo desejado.
Sequências adicionais de nucleotideos podem ser unidas a uma molécula de ácido nucléico codificando 20 polipeptideo, incluindo sequências ligantes contendo locais de endonucleases de restrição para o propósito da clonagem do gene sintético num vetor, por exemplo, um vetor de expressão de proteina ou um vetor concebido para a amplificação da proteina do núcleo codificando sequências 25 de DNA. Além disso, sequências de nucleotideos adicionais especificando elementos de DNA funcionais podem ser operacionalmente ligadas a uma molécula de ácido nucléico codificando de polipeptideo. Exemplos de tais sequências incluem, mas não estão limitados às sequências promotoras 30 concebidas para facilitar a expressão da proteina intracelular, e sequências de secreção, por exemplo, sequências de sinal heterólogo, concebidas para facilitar a secreção da proteina. Tais sequências são conhecidas dos peritos na técnica. Sequências de resíduos adicionais de nucleotídeos, tais como sequências de bases especificando as regiões de ligação de proteínas também podem estar ligadas às moléculas de ácido nucléico codificando enzima. Tais regiões incluem, mas não estão limitaas às sequências de resíduos que facilitam ou codificam proteínas que facilitam a absorção de uma enzima em células alvo específicas, ou de outro modo alteraram a farmacocinética de um produto de um gene sintético. Por exemplo, as enzimas podem estar ligadas às porções de PEG.
Além disso, as etiquetas ou outras porções podem ser adicionadas, por exemplo, para auxiliar na detecção ou purificação de afinidade do polipeptídeo. Por exemplo, sequências de resíduos de nucleotídeos adicionais, tais como sequências de bases especificando uma etiqueta de epítopo ou outro marcador detectável também pode estar ligadas às moléculas de ácido nucléico codificando enzima. Exemplos de tais sequências incluem sequências de ácidos nucléicos codificando uma etiqueta de His (por exemplo, βxHis, HHHHHH; SEQ ID NO: 54) ou sinalização por etiqueta (DYKDDDDK; SEQ ID NO: 55).
Os ácidos nucléicos identificados e isolados podem então ser inseridos num vetor de clonagem apropriado. Um grande número de sistemas hospedeiro e vetor conhecidos na técnica pode ser utilizado. Vetores possíveis incluem, mas não estão limitados aos plasmídeos ou vírus modificados, mas o sistema de vetor deve ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Tais vetores incluem, mas não estão limitados aos bacteriófagos, tais como derivados de lambda, ou plasmídeos, tais como derivados plasmídicos pCMV4, pBR322 ou pUC ou vetor Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) . Outros vetores de expressão incluem o vetor de expressão HZ24 aqui exemplificado. A inserção em um vetor de clonagem pode, por exemplo, ser realizada por ligar o fragmento de DNA num vetor de clonagem, o quealtem terminais coesivos complementares. A inserção pode ser efetuada usando vetores de clonagem TOPO (Invitrogen, 5 Carlsbad, CA) . Se os locais de restrição complementares utilizados para fragmentar o DNA não estão presentes no vetor de clonagem, as extremidades das moléculas de DNA podem ser enzimaticamente modificadas. Alternativamente, qualquer local desejado pode ser produzido por ligar 10 sequências de nucleotideos (ligantes) para os terminais de DNA; esses ligantes ligados podem conter oligonucleotideos sintetizados quimicamente específicos codificando as sequências de reconhecimento da endonuclease de restrição. Em um método alternativo, o vetor clivado e o gene de 15 proteína podem ser modificados por cauda homopolimérica.
Moléculas recombinantes podem ser introduzidas em células hospedeiras através, por exemplo, da transformação, transfecção, infecção, eletroporação e sonoporação, de modo que muitas cópias da sequência do gene são geradas.
Em modalidades específicas, a transformação de células hospedeiras com moléculas de DNA recombinante que incorporam o gene da proteína isolada, cDNA, ou sequência de DNA sintetizada permite a geração de cópias múltiplas do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades 25 por transformantes de crescimento, isolandoe as moléculas de DNA recombinantes a partir dos transformantes e, quando necessário, recuperando o gene inserido a partir do DNA recombinante isolado. Geralmente, hialuronidases, incluindo formas solúveis de PH20, são produzidas usando sistemas de 30 expressão de proteínas que facilitam a N-glicosilação correta para assegurar que o polipeptideo retém a atividade, uma vez que a glicosilação é importante para a atividade catalítica e a estabilidade de hialuronidases.
Tais células incluem, por exemplo as células do Ovário de Hamster Chinês (CHO), (por exemplo, DG44 células CHO).
1. Vetores e células
Para a expressão recombinante de uma ou mais das proteinas desejadas, tais como qualquer aqui descritas, o ácido nucléico contendo a totalidade ou uma porção da sequência de nucleotideos codificando a proteina pode ser inserido num vetor de expressão apropriado, isto é, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência codificando proteina inserida. Os sinais necessários de transcrição e tradução também podem ser fornecidos pelo promotor nativo para genes de enzimas, e/ou das suas regiões flanqueadoras.
São também proporcionados vetores que contêm um ácido nucléico codificando a enzima. As células contendo os vetores também são fornecidas. As células incluem células eucarióticas e procarióticas, e os vetores são adequados para qualquer utilização nestas.
As células procarióticas e eucarióticas, incluindo células endoteliais, contendo os vetores são fornecidas. Tais células incluem células bacterianas, células de levedura, células de fungos, Archea, células de planta, células de insetos e células animais. As células são utilizadas para produzir uma proteina destas por crescimento das células acima descritas sob condições, nas quais a proteina codificada é expressa pela célula, e recuperando a proteina expressa. Para fins aqui descritos, por exemplo, a enzima pode ser segregada no meio.
Fornecidos são vetores que contêm uma sequência de nucleotideos que codifica o polipeptideo de hialuronidase solúvel acoplado para a sequência de sinal nativa ou heteróloga, bem como várias cópias da mesma. Os vetores podem ser selecionados para expressão da proteina da enzima na célula ou de tal forma que a proteína de enzima é expressa como uma proteína secretada. □ma variedade de sistemas vetor e hospedeiro pode ser usada para expressar a sequência codificando a proteína. Estas incluem, mas não estão limitados aos sistemas de células de mamíferos infectados com o vírus (por exemplo, vírus vaccinia, adenovirus e outros vírus); sistemas de células de insetos infectados com vírus (por exemplo, baculovírus) ; micro-organismos, tais como leveduras contendo vetores de leveduras; ou bactérias transformadas com bacteriófago, DNA , DNA de plasmideo, ou DNA cosmídeo. Os elementos de expressão de vetores variam em suas resistência e especificidades. Dependendo do sistema vetor e hospedeiro utilizado, qualquer um de um número de transcrição adequada e elementos de tradução podem ser usados.
Quaisquer métodos conhecidos dos peritos na técnica para a inserção de fragmentos de DNA em um vetor podem ser utilizados para construir vetores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais de controle de transcrição/translação apropriados e sequências codificando as proteínas. Estes métodos podem incluir DNA recombinante in vitro e técnicas sintéticas e recombinantes in vivo (recombinação genética). Expressão de sequências de ácidos nucléicos codificando a proteína, ou domínios, derivados, fragmentos ou homólogos deste, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucléico de modo que os genes ou seus fragmentos são expressos em um hospedeiro transformado com a molécula(s) de DNA recombinante(s). Por exemplo, a expressão das proteínas pode ser controlada por qualquer promotor/intensificador conhecido na técnica. Em uma modalidade específica, o promotor não é nativo para os genes para uma proteína desejada. Os promotores, os quais podem ser utilizados incluem, mas não estão limitados ao promotor precoce de SV40 (Bernoist and Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), o promotor contido na repetição terminal de comprimento 3' do vírus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), o promotor de quinase timidina da herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78: 1441 -1445 (1981)), as sequências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster et al., Nature 299:39-42 (1982)); vetores de expressão procariótico, tais como o promotor β-lactamase (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79:5543) ou o promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:21-25 (1983)), ver também "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": in Scientific American 242:19- 94 (1980)); vetores de expressão de plante contendo o promotor sintetase da nopalina (Herrara-Estrella et al, Nature 303:209-213 (1984)) ou o promotor RNA 35S do virus mosaio da couve-flor (Garden et al., Nucleic Acids Res. 9:2871(1981)) e o promotor da enzima fotossintética da ribulose bisfosfato carboxilase (Herrera- Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos promotores de leveduras e outros fungos tais como o promotor Gal4, o promotor de álcool desidrogenase, o promotor quinase fosfoglicerol, o promotor da fosfatase alcalina, e as seguintes regiões de controle transcricional de animais que exibem especificidade de tecido e têm sido utilizados em animais transgênicos: elastase região de controle do gene I, a qual é ativa nas células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); região de controle do gene de insulina, a qual que é ativa nas células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), região de controle do gene de imunoglobulina, a qual é ativa em células linfóides (Grosschedl et al., Cell 38:647-658 (1984); Adams et al., Nature 326:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7: 1436-1444 (1987)), região de controle do virus do tumor mamário de camundongo, o qual é ativo nas células testiculares, do peito, linfóides mastócida (Leder et al,, Cell 45:485-495. (1986)), região de controle do gene de albumina, o qual é ativo no figado (Pinckert et al. , Genes e Devei. 1:268-276 (1987)), região de controle do gene de alfa-fetoproteina, o qual é ativo no figado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987), região de controle do gene de alfa-1 antitripsina, o qual é ativo no figado (Kelsey et al., Genes e Devei 2:161-171 (1987)), região de controle do gene da beta globina, o qual é ativo nas células mielóides (Magram et al., Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), região de controle do gene da proteina básica de mielina, o qual é ativo em células oligodendrócas do cérebro (Readhead et al., Cell 43:703-712 (1987)), região de controle do gene de cadeia-2 leve da miosina, o qual é ativo no músculo esquelético (Shani, Nature 314: 283-286 (1985)), e região de controle do gene hormônio de liberação gonadotrófico, o qual é ativo em Gonadotrofos do hipotálamo (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)).
Em uma modalidade especifica, um vetor é usado que contém um promotor operativamente ligado aos ácidos nucléicos codificando uma proteina desejada, ou um dominio, fragmento, derivado ou homólogo, deste, um ou mais origens de replicação, e opcionalmente, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de resistência ao antibiótico) . Exemplos de vetores plasmidicos para a transformação de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vetores de expressão pQE (disponíveis a partir de Qiagen, Valencia, CA, ver também literatura publicada por Qiagen descrevendo o sistema). vetores pQE têm um promotor T5 fago (reconhecido por polimerase AR E. coli) e um módulo 5 de repressão operador lac duplo para fornecer expressão de alto nível estritamente regulada de proteínas recombinantes em E. coli, um local de ligação ribossomal sintético (RBS II) para tradução eficiente, uma sequência codificando tag 6xHis, to para e terminadores da transcrição Tl, origem 10 ColEl de replicação, e um gene da beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina. Os vetores pQE permitem colocação de uma etiqueta de 6xHis ou em N- ou C-terminal da proteína recombinante. Tais plasmídeos incluem pQE 32, pQE 30, e pQE 31, os quais proporcionam locais de clonagem 15 múltiplos para todos as três estruturas de leitura, e proporcionam para a expressão de proteínas alvo 6xHis N- terminalmente. Outros exemplos de vetores plasmídicos para a transformação de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vetores de expressão pET (ver, patente dos US 20 4,952,496; disponível a partir de NOVAGEN, Madison, WI; ver, também literatura publicada por Novagen descrevendo o sistema). Tais plasmídeos incluem PETlla, os quais contêm o promotor T71ac, terminador T7, o induzível operador lac E. coli, e o gene repressor lac; pET 12a-c que contém o 25 promotor T7, terminador T7, e o sinal de secreção E. coli ompT; e pET 15b e pET19b (NOVAGEN, Madison, WI) que contêm uma sequência líder His-Tag™ para utilização na purificação com uma coluna de His e um local de clivagem da trombina que permite a purificação de clivagem na sequência 30 ao longo da coluna, a região promotora T7-lac e terminador expressão HZ24 foi derivado do esqueleto do vetor pCI (Promega). Ele contém DNA codificando o gene de resistência a Beta-lactamase (AmpR), uma origem Fl de replicação, uma região promotora/intensicadora precoce imediata ao citomegalovírus (CMV), e um sinal tardio de poliadenilação de SV40 (SV40). 0 vetor de expressão também tem um local de entrada de ribossoma interno (IRES) do virus ECMV (Clontech) e o gene redutase dihidrofolato do camundongo (DHFR).
2. Expressão
Polipeptideos de hialuronidase solúveis podem ser produzidos por qualquer método conhecido dos peritos na técnica, incluindo in vivo e in vitro. Proteinas desejadas pode ser expressas em qualquer organismo adequado para produzir as quantidades necessárias e formas das proteinas, tais como por exemplo, necessárias para a administração e tratamento. Hospedeiros de expressão incluem organismos procarióticos e eucarióticos, tais como E. coli, levedura, plantas, células de insetos, células de mamiferos, incluindo linhas de células humanas e animais transgênicos, Hospedeiros de expressão podem diferir em seus niveis de produção de proteína, bem como os tipos de modificações pós-translacionais que estão presentes nas proteínas expressas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser feita com base nestes e outros fatores, tais como considerações regulatórias e de segurança, custos de produção e a necessidade e métodos para purificação.
Muitos vetores de expressão estão disponíveis e são conhecidos dos peritos na técnica, e podem ser usados para a expressão de proteínas. A escolha dos vetores de expressão irá ser influenciada pela escolha do sistema do hospedeiro de expressão. Em geral, vetores de expressão podem incluir promotores transcricionais e, opcionalmente intensificadores, sinais de translação (translational), e sinais de terminação da transcrição e da translação. Os vetores de expressão que são usados para a transformação estável têm tipicamente um marcador selecionável que permite a seleção e manutenção das células transformadas. Em alguns casos, uma origem de replicação pode ser usado para amplificar o número de cópias do vetor.
Polipeptideos de hialuronidase solúveis também pode ser utilizados ou expressos como fusões de proteina. Por exemplo, uma fusão da enzima pode ser gerada para adicionar a funcionalidade adicional para uma enzima. Exemplos de proteinas de fusão de enzimas incluem, mas não estão limitados às fusões de uma sequência de sinal, uma etiqueta, tal como para a localização, por exemplo, uma etiqueta His6 ou uma etiqueta myc, ou uma etiqueta para a purificação, por exemplo, uma fusão GST, e uma sequência para direcionar a secreção de proteínas e/ou associação de membrana.
a. As células procarióticas
Procariotas, especialmente E.coli, proporcionam um sistema para a produção de grandes quantidades de proteínas. Transformação de E. coli é uma técnica simples e rápida bem conhecida dos peritos na técnica. Os vetores de expressão para E. coli podem conter promotores induzíveis, tais promotores são úteis para induzir níveis elevados de expressão de proteína e para expressar proteínas que exibem alguma toxicidade para as células hospedeiras. Exemplos de promotores induzíveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor tac híbrido, os promotores T7 e RNA SP6 e o promotor ÀPL regulado por temperatura.
Proteínas, tais como qualquer uma aqui proporcionada, pode ser expressa no ambiente citoplasmático de E. coli. 0 citoplasma é um ambiente de redução e para algumas moléculas, isto pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis. Agentes redutores, tais como ditiotreitol e β-mercaptoetanol e desnaturantes, tais como guanidina-HCl e uréia podem ser usados para ressolubilizar as proteínas. Uma abordagem alternativa é a expressão de proteinas no espaço periplásmico da bactéria, o qual fornece um ambiente oxidante e isomerases de dissulfeto similares a chaperonina, e pode levar à produção de proteína solúvel. Tipicamente, uma sequência líder é fundida com a proteína a ser expressa, a qual direciona a proteína para o periplasma. A líder é então removida por peptidases de sinal no interior do periplasma. Exemplos de sequências líder de com alvo periplasmático incluem a líder pelB a partir do gene liase de pectato e a líder derivada do gene da fosfatase alcalino. Em alguns casos, a expressão periplasmática permite o vazamento da proteína expressa no meio de cultura. A secreção de proteínas permite a purificação rápida e simples a partir do sobrenadante da cultura. As proteinas que não são secretadas podem ser obtidas a partir do periplasma por lise osmótica. Similar a expressão citoplasmática, em alguns casos, as proteínas podem tornar-se insolúveis e desnaturantes e agentes de redução podem ser usados para facilitar a solubilização e redobramento. Temperatura de indução e de crescimento também podem influenciar os níveis de expressão e solubilidade, tipicamente temperaturas entre 25°C e 37°C são utilizadas. Tipicamente, as bactérias produzem proteínas aglicosilada. Assim, se as proteínas requerem glicosilação para funcionar, glicosilação pode ser adicionada in vitro após purificação a partir de células hospedeiras.
b. As células de levedura
As leveduras, tais como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis e Pichia pastoris são hospedeiros de 5 de expressão de leveduras bem conhecidas que podem ser utilizadas para a produção de proteinas, tais como qualquer uma aqui descrita. -A levedura pode ser transformada com vetores de replicação epissomal ou por integração cromossomal estável por recombinação homóloga. Tipicamente, 10 promotores induziveis são utilizados para regular a expressão do gene. Exemplos de tais promotores incluem GALI, GAL7 e GAL5, e promotores da metalotioneína, tais como CUP1, AOX1 ou outro Pichia ou outro promotor de levedura. Vetores de expressão incluem frequentemente um 15 marcador selecionável, tal como LEU2, TRP1, HIS3 e URA3 para seleção e manutenção do DNA transformado. Proteinas expressas em levedura são frequentemente solúveis. Co- expressão com chaperoninas, tais como BIP e isomerase de dissulfito de proteína pode aperfeiçoar os níveis de 20 expressão e de solubilidade. Além disso, proteínas expressas em levedura podem ser direcionadas para a secreção utilizando sinal de secreção de fusões peptídeo, tal como combinação de levedura do tipo sinal de secreção do fator tipo alfa de Saccharomyces cerevisiae e fusões com 25 proteínas de levedura de superfície celular, tal como o receptor de adesão de combinação Aga2p ou o Arxula adeninivorans glucoamilase. Um local de clivagem de protease, tal como para a protease KEX-2, pode ser concebido para remover as sequências fundidas a partir dos 30 polipeptideos expressos uma vez que eles saem da via de secreção. Levedura também é capaz de glicosilação em motivos Asn-X-Ser/Thr.
c. Células de Insetos
Células de insetos, particularmente, usando expressão de baculovirus, são úteis para expressar polipeptideos, tais como polipeptideos de hialuronidase. Células de insetos expressam niveis elevados de proteína e são capazes da maioria das modificações pós-translacionais utilizadas por eucariotas superiores. Baculovirus têm uma faixa de hospedeiro restritivo, o que aperfeiçoa a segurança e reduz as preocupações regulamentares de expressão eucariótica. Vetores de expressão típicos usam um promotor para expressão de nível elevado, tal como o promotor de poliedrina de baculovirus. Sistemas de baculovirus comumente utilizados incluem os baculovirus, tal como vírus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV), e o vírus da poliedrose nuclear Bombyx mori (BmNPV) e uma linha de células de inseto, tal como derivados de Sf9 de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl). Para expressão de alto nível, a sequência de nucleótidos da molécula a ser expressa é fundida imediatamente a jusante do códon de iniciação da poliedrina do vírus. Sinais de secreção de mamíferos são processados com precisão em células de inseto, e podem ser utilizados para secretar a proteína expressa no meio de cultura. Além disso, as linhas de células Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl) produzem proteínas com padrões de glicosilação similares aos sistemas de células de mamíferos.
Um sistema alternativo de expressão em células de inseto é o uso de células estavelmente transformadas. As linhas celulares, tais como o Schneider 2 (S2) e células Kc (Drosophila melanogaster} e células C7 (Aedes albopictus) podem ser usadas para a expressão. O promotor de metalotioneína de Drosophila pode ser usado para induzir níveis elevados de expressão na presença de indução por metais pesados com cádmio ou cobre. Os vetores de expressão são, geralmente, mantidos pelo uso de marcadores selecionáveis, tais como neomicina e higromicina.
d. Células de mamíferos
Os sistemas de expressão de mamífero podem ser usados para expressar as proteínas incluindo polipeptideos de hialuronidase solúveis. Construções de expressão podem ser transferidos para células de mamíferos por infecção 10 viral, tal como adenovirus ou por transferência direta de DNA, tais como lipossomas, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e por meios físicos, tais como eletroporação e microinjeção. Os vetores de expressão para células de mamífero incluem, tipicamente, um local de tampão de mRNA, 15 uma caixa TATA, uma sequência de iniciação da translação (sequência de consenso Kozak) e elementos de poliadenilação. Elementos IRES também podem ser adicionados para permitir a expressão bicistrónica com outro gene, tal como um marcador selecionável. Tais vetores incluem, 20 frequentemente, intensificadores de promotor de transcrição para alto nível de expressão, por exemplo, o intensificador de promotor SV40, o promotor citomegalovírus humano (CMV) e a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (RSV). Esses intensificadores de promotor são ativos em 25 muitos tipos de células. Promotores do tipo tecidos e células e regiões intensificadoras também podem ser usados para a expressão. Exemplos de regiões promotor/intensificador incluem, mas não estão limitados àquelas a partir de genes, tais como a elastase I, 30 insulina, imunoglobulina, vírus do tumor mamário do camundongo, albumina, alfa fetoproteína, alfa 1 antitripsina, beta globina, proteína básica de mielina, miosina de cadeia 2 leve, controle do gene do hormônio de liberação gonadotrópica. Marcadores selecionáveis podem ser utilizados para selecionar e manter as células com a construção de expressão. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados à higromicina B, fosfotransferase, adenosina desaminase, xantina-guanina fosforribosil transferase, aminoglicosideo fosfotransferase, diidrofolato redutase (DHFR) e timidina- quinase. Por exemplo, a expressão pode ser realizada na presença de metotrexato para selecionar apenas àquelas células expressando o gene DHFR. A fusão com moléculas de sinalização de superficie celular, tais como TCR-Ç e FcεRI- y pode direcionar a expressão das proteinas em estado ativo na superficie da célula.
Muitas linhas celulares estão disponíveis para expressão de mamífero, incluindo células de camundongo, rato, humano, macaco, frango e hamster. Exemplos de linhas celulares incluem, mas não estão limitados às CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NSO camundongo (não secretores) e outras linhas de células de mieloma, e linhas de células de hibridoma heterohibridoma, linfócitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 2B8, e as células HKB. As linhas celulares também estão adaptadas disponíveis para meio isento de soro, o qual facilita a purificação de proteínas secretadas a partir dos meios de cultura de células. Exemplos incluem células CHO-S (Invitrogen, Carlsbad, CA, cat # 11619-012) e a linha de células EBNA-1 isenta de soro (Pham et al., (2003) Biotechnol. Bioeng. 84:332-42.). As linhas celulares também estão disponíveis, as quais são adaptadas para crescer em meios especiais optimizados para a expressão máxima. Por exemplo, células DG44 CHO são adaptadas para crescer em cultura de suspensão em um meio livre do produto animal quimicamente definido.
e. Plantas
Células de plantas transgênicas e plantas podem ser usadas para expressar as proteínas, tais como qualquer uma aqui descrita. Construções de expressão são tipicamente transferidas para plantas usando transferência direta de DNA, tais como bombardeamento de microprojéteis e transferência mediada por PEG em protoplastos, e com transformação mediada por agrobacterium. Os vetores de expressão podem incluir sequências promotoras e intensificadoras, os elementos de terminação da transcrição e os elementos de controle da translação. Vetores de expressão e técnicas de transformação são geralmente divididos entre os hospedeiros de dicotiledôneas, como Arabidopsis e tabaco, e os hospedeiros de monocotiledôneas, como milho e arroz. Exemplos de promotores de plantas utilizados para a expressão incluem o promotor do vírus do mosaico da couve-flor, o promotor sintase de nopalina, o promotor ribose bifosfato carboxilase e os promotores de ubiquitina e UBQ3. Marcadores selecionáveis, tais como higromicina, isomerase fosfomanose e neomicina fosfotransferase são frequentemente utilizados para facilitar a seleção e manutenção de células transformadas. Células de plantas transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregados (tecido de calos) ou regeneradas em plantas inteiras. Células de plantas transgênicas também podem incluir algas modificadas para produzir polipeptideos de hialuronidase. Porque as plantas têm diferentes padrões de glicosilação das células de mamíferos, isto pode influenciar a escolha de proteína produzida nestes hospedeiros.
3. Técnicas de purificação
Método para a purificação de polipeptideos, incluindo polipeptideos de hialuronidases solúveis ou outras proteinas, a partir de células hospedeiras dependerá das células hospedeiras escoletadas e sistemas de expressão. Para moléculas secretadas, as proteinas são, geralmente, purificadas a partir do meio de cultura após a remoção das células. Para a expressão intracelular, as células podem ser lisadas e as proteinas purificadas a partir do extrato. Quando os organismos transgênicos, tais como plantas transgênicas e animais são utilizados para a expressão, tecidos ou órgãos podem ser usados como material de partida para fazer um extrato de células lisadas. Além disso, a produção animal transgênico pode incluir a produção de polipeptideos em leite ou ovos, os quais podem ser extraidos e, se necessário, as proteinas podem ser extraídas e, adicionalmente, purificadas utilizando métodos padrão na técnica.
Proteinas, tais como polipeptideos de hialuronidases solúveis, podem ser purificadas utilizando técnicas padrões de purificação de proteinas conhecidas na técnica incluindo mas não limitado às SDS-PAGE, fração de tamanho e cromatografia de exclusão por tamanho, precipitação de sulfato de amónio e cromatografia de troca iônica, tal como troca aniônica. Técnicas de purificação por afinidade pode também ser utilizadas para aperfeiçoar a eficiência e a pureza das preparações. Por exemplo, anticorpos, receptores e outras moléculas que se ligam às enzimas de hialuronidase podem ser utilizadas na purificação de afinidade. Construções de expressão também podem ser concebidas para adicionar um etiqueta de afinidade para uma proteina tal como um epitopo myc, fusão GST ou Hisõ, e purificado por afinidade com anticorpo myc, resina de glutationa e resina de Ni, respectivamente. Pureza pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica, incluindo eletroforese em gel e coloração e as técnicas espectrofotométricas.
F. Preparação, Formulação e Administração de Imunoglobulinas e Polipeptideos de Hialuronidase Solúvel
Aqui fornecidas são co-formulações de IG e hialuronidase que são estáveis como uma formulação liquida, por periodos prolongados de tempo de pelo menos 6 meses, em temperaturas de até 32°C, por exemplo, variando a partir de ou cerca de 0°C a 32 °C. A estabilidade aumentada é caracterizada pelo tempo de armazenamento aperfeiçoado, fragmentação diminuida, formação diminuída de agregados, formação diminuída de dímeros e/ou descoloração diminuída, mantendo a atividade da IG e hialuronidase. Tais co- formulações podem ser fornecidas como formulação líquida "pronto para usar" sem reconstituição adicional e/ou sem qualquer requisito para diluição adicional. As co- formulações estáveis resultantes podem ser convenientemente dispensadas aos médicos ou pacientes nas formas de dosagem para a injeção direta ou administração. Por exemplo, as co- formulações podem ser infunsas ou injetadas em casa ou em qualquer lugar. Hialuronidases solúveis que são co-formuladas com imunoglobulina permitem distribuição aumentada de imunoglobulina aos locais desejados no interior do corpo por aumentar a biodisponibilidade da imunoglobulina. Assim, as co-formulações alcançam níveis elevados e/ou concentrações mais rapidamente alcançadas da imunoglobulina após a administração subcutânea em comparação com os métodos convencionais de administração subcutânea, para fornecer, por exemplo, uma resposta mais potente e/ou mais rápida para uma dada dose. Além disso, as co-formulações de IG contendo hialuronidases solúveis também permitem doses inferiores de IG para serem administradas alcançando uma dada resposta com uma dose inferior de IG administrada. Finalmente, a capacidade de um hialuronidase solúvel aumentar o fluxo de fluído volumoso em e perto de um local de injeção ou infusão pode também aperfeiçoar outros aspectos da distribuição farmacológica associada. Por exemplo, o aumento do fluxo de fluído volumoso pode ajudar permitindo que o volume de fluido injetado a ser mais facilmente disperso a partir do local de injeção (reduzindo dor potencialmente ou outras consequências adversas de injeção). Isto é particularmente importante para infusões subcutâneas para permitir doses mais elevadas a serem administradas. Além disso, a biodisponibilidade aumentada, co-formulação de IG com hialuronidase fornece uma rota mais segura ou mais conveniente de administração em relação com a rota intravenosa convencional de administração.
As co-formulações aqui proporcionadas são estáveis durante períodos prolongados de tempo, incluindo as temperaturas variadas. Por exemplo, as co-formulações aqui proporcionadas são estáveis e retêm a atividade da IG e temperaturas de hialuronidase até 32 °C durante pelo menos 6 meses. Por exemplo, as co-formulações são estáveis em temperaturas "refrigerador", por exemplo a 2°C a 8°C, tal como em ou cerca de 4 °C, durante pelo menos 6 meses para 4 anos, tal como 1 ano a 2 anos, por exemplo, 6 meses, pelo menos 1 ano, pelo menos 2 anos, pelo menos 3 anos ou, pelo menos 4 anos ou mais. Em um outro exemplo, as co- formulações são estáveis e retêm a atividade à temperatura ambiente, por exemplo, a 18°C a 32°C, geralmente, 20°C a 32°C, tal como 28 °C a 32°C, durante pelo menos 6 meses a 1 ano, por exemplo, 6 meses, pelo menos 7 meses, pelo menos 8 meses, pelo menos 9 meses, ou pelo menos 1 ano ou mais.
Em particular, as co-formulações estáveis exibem baixa para níveis não detectáveis de agregação e/ou fragmentação de IG após armazenagem durante períodos de tempo definidos. Métodos para avaliar a agregação e a fragmentação são conhecidos por um perito na técnica, e são exemplificados na seção G abaixo. Geralmente, não mais do que 0,5% a 5% de IG, por exemplo, não mais do que 5%, não mais do que 4%, não mais do que 3%, não mais do que 2%, não mais do que 1% e, geralmente, não mais do que 0,5% de IG na co-formulação forma um agregado, tal como medido por HPSEC ou outros métodos, após armazenagem durante os períodos de tempo definidos como estabelecido acima.
Além disso, a IG e hialuronidase nas co- formulações estáveis proporcionadas aqui retêm uma ou mais atividades da atividade inicial da IG e hialuronidase antes do armazenamento. Um perito na técnica está familiarizado com atividades de IG e hialuronidase, e pode avaliar essas atividades. Seção G oferece atividades exemplares e ensaios para avaliar a atividade. Tipicamente, as co-formulações líquidas estáveis aqui proporcionadas retêm após armazenamento pelo menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, ou mais da atividade inicial da proteína antes do armazenamento, geralmente, pelo menos 70% a 95% da atividade inicial. Por exemplo, as co-formulações líquidas estáveis retêm após armazenagem mais que 70%, mais que 80%, mais que 85%, mais que 90%, mais que 95%, mais que 98%, mais que 99%, ou mais que 99,5 % da atividade inicial da proteína respectiva antes do armazenamento.
1. Formulações e Dosagens
As co-formulações aqui proporcionadas são formuladas como líquidos. As co-formulações contêm imunoglobulina, hialuronidase, pelo menos, 0,05 M de um sal de de cloreto de metal alcalino, por exemplo, pelo menos, 0,05 M de cloreto de sódio (NaCl ou sal) ou 0,05 M de cloreto de potássio (KC1). As co-formulações também são ajustadas em pH para limitar a agregação e reter atividade da IG e hialuronidase. Em alguns exemplos, as co- formulações não contêm outros ingredientes, com exceção de água ou solventes adequados. Em outros exemplos, as co- formulações ainda contêm diluentes, veículos ou outros excipientes.
Tipicamente, os compostos são formulados em composições farmacêuticas utilizando técnicas e procedimentos bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, Fourth Edition, 1985, 126) . As composições farmaceuticamente aceitáveis são preparadas em vista das aprovações para uma agência reguladora ou outra agência preparada de acordo com farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais e em humanos. A formulação deve ser adequada ao modo de administração.
As co-formulações podem ser fornecidas como uma preparação farmacêutica na forma líquida como soluções, xaropes ou suspensões. Na forma líquida, as preparações farmacêuticas podem ser fornecidas como uma preparação concentrada de ser diluída a uma concentração terapeuticamente eficaz antes da utilização. Geralmente, as preparações são fornecidas numa forma de dosagem que não requer diluição para uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsionantes (por exemplo, lecitina, ou acácia); veículos não-aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos, ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metil ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). Em um outro exemplo, as preparações farmacêuticas podem ser apresentadas na forma liofilizada para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes da utilização.
O pH das co-formulações estáveis aqui proporcionadas é tal que a IG na co-formulação não agregada e/ou a IG e hialuronidase retêm a atividade como descrita na Seção G. 0 pH ótimo pode ser obtido por técnicas de formulação conhecidas dos peritos na técnica. Por exemplo, o pH ótimo pode ser determinado através da avaliação de agregação e atividade em condições de pH diferentes, utilizando vários métodos conhecidos de um perito na técnica, por exemplo, como descrito na Seção ensaios G. Tais ensaios ou avaliação incluem, mas não estão limitados à cromatografia de exclusão de tamanho, determinações HSPEC, os dados de estabilidade de calor, as titulações de anti-complemento das diversas preparações e/ou ensaios de atividade de hialuronidase. Tipicamente, nas co-formulações aqui proporcionadas, o pH pode variar de 4,0 a 8,0, medido na solução concentrada da co-formulação. Geralmente, dentro desta faixa, um pH mais baixo é desejado, no entanto, para assegurar o teor de monômero máximo. Por conseguinte, as co-formulações aqui proporcionadas tipicamente têm um pH que é, pelo menos, ou cerca de 4,0 a 7,4, geralmente, pelo menos, ou cerca de 4,0 a 6,0, e tipicamente 4,4 a 4,9. Como se observa, o pH indicado é medido na solução concentrada da formulação. O pH pode ser ajustado usando de agentes acidificantes para baixar o pH ou agentes alcalinizantes para aumentar o pH. Exemplos de agentes acidificantes incluem, mas não estão limitados ao ácido acético, ácido cítrico, ácido sulfúrico, ácido clorídrico, solução de fosfato de sódio monobásico e ácido fosfórico. Exemplos de agentes alcalinizantes incluem, mas não estão limitados à solução de fosfato de sódio dibásico, carbonato de sódio, ou hidróxido de sódio.
Qualquer tampão pode ser utilizado na preparação da formulação liquida aqui proporcionada, contanto que não 5 afete adversamente a estabilidade da co-formulação, e suporte a faixa de pH requisito necessária. Exemplos de tampões, particularmente, adequados incluem succinato, acetato, tampões fosfatos, citrato, aconitato, malato e carbonato. Aqueles peritos na técnica, no entanto, irão 10 reconhecer que as formulações fornecidas aqui não são limitadas a um tampão particular, desde que o tampão forneça um grau aceitável de estabilidade do pH, ou "capacidade tampão" na faixa indicada. Geralmente, um tampão tem uma capacidade tampão adequada dentro de cerca 15 de 1 unidade de pH do seu pK (Lachman et al,, 198 6) .
Adequação tampão pode ser estimada com base em tabulações de pK publicadas, ou pode ser determinada empiricamente por métodos bem conhecidos na técnica. O pH da solução pode ser ajustado para o ponto final desejado dentro da faixa, tal 20 como descrito acima, por exemplo, utilizando qualquer ácido ou base aceitável.
a. Imunoglobulina
A IG nas co-formulações é fornecida em uma concentração que é ou é cerca de 5% a 22% p/v, por exemplo, 25 que é ou é cerca de 50 mg/mL, 60 mg/mL, 70 mg/mL, 80 mg/mL, 90 mg/mL, 100 mg/mL, 120 mg/mL, 150 mg/mL, 180 mg/mL, 200 mg/mL, 220 mg/mL, 250 mg/ml ou mais. Geralmente, a IG na co-formulação é fornecida numa quantidade que é pelo menos 10% (100 mg/mL) a 20% (200 mg/mL) , por exemplo, 10%, 11%, 30 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20% ou mais.
As preparações de imunoglobulinas aqui proporcionadas podem ser formuladas como composições farmacêuticas para utilização de dosagem única ou múltipla.
Tipicamente, como observado em outro lugar aqui, a IG na co-formulação é formulada em uma quantidade tal que está pronta para usar, e nenhuma diluição adicional é necessária. Dependendo se a co-formulação é fornecida como 5 uma formulação de dosagem única ou múltipla, um perito na técnica pode determinar empiricamente a quantidade exata de IG na co-formulação.
Geralmente, a imunoglobulina é fornecida numa quantidade terapeuticamente eficaz para o regime de dosagem 10 particular. Concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando os compostos em conhecidos in vitro e em sistemas in vivo, tais como os ensaios aqui proporcionados. A concentração de uma imunoglobulina selecionada na composição depende das taxas 15 de absorção, inativação, e excreção do complexo, as características fisicoquimicas do complexo, o esquema de dosagem e quantidade administrada, bem como outros fatores conhecidos dos peritos na técnica. Por exemplo, é entendido que a dosagem precisa e a duração do tratamento é uma 20 função do tecido a ser tratado e pode ser determinada empiricamente utilizando protocolos de teste conhecidos, ou por extrapolação a partir de dados de teste in vivo ou in vitro. É para ser notado que as concentrações e valores de dosagem podem também variar de acordo com a idade do 25 indivíduo tratado. É para ser ainda entendido que para qualquer indivíduo particular, os regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual, e o julgamento profissional da pessoa administrando ou supervisionando a administração 30 das formulações, e que as faixas de concentração aqui estabelecidas são exemplos apenas, e não se destinam a limitar o escopo deste. A quantidade de uma preparação de imunoglobulina selecionada a ser administrada para o tratamento de uma doença ou condição, por exemplo uma doença ou condição tratável por IG, pode ser determinada por técnicas clinicas padrões. Além disso, os ensaios in vitro e em modelos animais podem ser empreguados para ajudar identificar as faixas de dosagem ótimas. Assim, a dosagem precisa, a qual pode ser determinada empiricamente, pode depender da preparação da imunoglobulina em particular, o regime e programação de dosagem com a hialuronidase solúvel, a rota de administração, o tipo de doença a ser tratada e a gravidade da doença.
Por exemplo, as preparações de IG podem ser formuladas em composições farmacêuticas para alcançar os regimes de dosagem (doses e frequências), pelos quais preparações atuais intravenosa (IVIG) são preparadas e administradas por doenças ou condições particulares tratáveis por IG. Um perito na técnica está familiarizado com os regimes de dosagem para administração IVIG de doenças ou condições particulares. Por exemplo, a seção H abaixo fornece regimes de dosagem exemplares (doses e frequências) de IG para doenças e condições particulares. Outros regimes de dosagem são bem conhecidos dos peritos na técnica. Se necessário, uma dosagem particular e a duração, e o protocolo de tratamento podem ser determinados empiricamente ou extrapolados.
Por exemplo, as doses exemplares de imunoglobulina administrada por via intravenosa podem ser utilizadas como um ponto de partida para determinar as dosagens adequadas. Os níveis de dosagem pode ser determinados com base numa variedade de fatores, tais como peso do corpo do indivíduo, saúde geral, idade, atividade do composto específico empregado, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, gravidade e curso da doença, e disposição do paciente para a doença, e do julgamento do médico do tratamento. Geralmente, dosagens de imunoglobulina é de ou cerca de 100 mg por kg de peso corporal (isto é, 100 mg/kg de peso corporal) para 2 g/kg de peso corporal. Entende-se que a quantidade a administrar será uma função da indicação tratada, e os efeitos secundários que, possivelmente, serão tolerados. As dosagens podem ser empiricamente determinadas utilizando modelos reconhecidos para cada distúrbio.
Num exemplo, IG é fornecida numa quantidade que permite que a administração subcutânea de uma dose equivalente a uma dose IV uma vez por mês para a indicação particular a ser tratada. Em tal exemplo, preparações de imunoglobulinas podem ser formuladas para administração de dose única em uma quantidade suficiente para proporcionar uma dose mensal, mas podem ser fornecidas em quantidades menores para as administrações de dosagem múltiplas. Por exemplo, as doses mensais de preparações de IG podem ser administradas diariamente, semanalmente, quinzenalmente ou uma vez por mês. Regimes de dosagem podem ser contínuos por meses ou anos. A dose IV mensal particular é uma função da doença a ser tratada, e assim pode variar.
Exemplos de faixas de dosagens individuais, em particular, para a administração subcutânea de IG, são a partir de ou cerca de 1 grama (g) a 200 g, por exemplo, de 1 grama (g) , 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g , 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g ou 200 g. A dosagem particular e a formulação desta depende da indicação e individual. Por exemplo, as dosagens podem ser administradas em 50 mg/kg peso corporal (PC) e 600 mg/kg, PC, por exemplo, 50 mg/kg peso corporal (PC), 100 mg/kg PC, 200 mg/kg PC, 300 mg/kg PC, 400 mg/kg PC, 500 mg/kg PC, 600 mg/kg PC, ou mais. Se a dosagem necessária pode ser determinada empiricamente. Para alcançar essas dosagens, volumes de co-formulações contendo IG administradas por via subcutânea podem ser de ou cerca de 10 mL a 700 mL, por exemplo, 100 mL a 500 mL, tal como 200 mL a 400 ml. Por exemplo, volumes de co-formulações contendo IG administradas por via subcutânea podem ser de 5 ou cerca de 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL ou mais para a administração de dosagem única. Por exemplo, uma co- formulação liquida de 10% de IG (100 mg/ mL) , para as indicações aqui descritas, pode ser administrada num volume 10 de 200 mL a 700 mL para alcançar uma dose única de 20 g para 70 g de IG. Em um outro exemplo, uma co-formulação liquida de 20% de IG (200 mg/raL) , para as indicações aqui descritas, pode ser administrada num volume de 100 mL a 350 mL para alcançar uma dosagem similar única de 20 g para 70 15 g de IG. Como notado, IG pode ser fornecida em quantidades menores na co-formulação para administrações de dosagem múltiplas.
b. Hialuronidase
A hialuronidase selecionada, em particular, uma 20 hialuronidase solúvel, por exemplo, rHuPH20, está incluida na co-formulação com uma concentração que é de ou cerca de 50 U/mL a 300 U/mL, por exemplo de 50 U/ mL, 75 U/mL, 100 U/ mL, 150 U/ mL, 200 U/ mL, 300 U/mL, 400 U/ mL ou 500 U/ mL, tipicamente, pelo menos, 100 U/mL a 300 U/mL, 25 geralmente, a uma concentração que é de 75 U/mL a 350 U/mL.
Se desejado, a hialuronidase pode ser fornecida sob uma forma mais concentrada, por exemplo, de ou cerca de 1000 U/mL a 5000 U/mL, tais como 1000 U/ mL, de 1500 unidades/ mL, 2000 U/ mL, 4000 U/ mL ou 5000 U/ mL.
A hialuronidase na co-formulação pode ser formulada como composições farmacêuticas para administração de dosagem única ou múltipla. Como notado acima para IG, a hialuronidase na co-formulação é formulada tipicamente numa quantidade que está pronta para utilizar, tal que nenhuma diluição adicional é necessária. Dependendo se a formulação é fornecida como uma forma de dosagem única ou múltipla, um perito na técnica pode determinar empiricamente a 5 quantidade exata de hialuronidase para incluir na co- formulação . Geralmente, a hialuronidase selecionada, em particular, uma hialuronidase solúvel, por exemplo, rHuPH20, está incluída na co-formulação numa quantidade 10 suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil da IG na ausência de efeitos colaterais indesejáveis sobre o paciente tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente testando os polipeptideos conhecidos in vitro e em sistemas in vivo, 15 tais como usando os ensaios aqui proporcionados ou conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Taliani et al. (1996) Anal. Biochem., 240: 60-67; Filocamo et al. (1997) J Virology, 71: 1417-1427; Sudo et al. (1996) Antiviral Res. 32:9-18; Buffard et al. (1995) Virology, 209:52-59; Bianchi et al. (1996) Anal, Biochem., 237:239-244; Hamatake et al. (1996) Intervirology 39:249-258; Steinkuhler et al. (1998) Biochem., 37:8899-8905; D'Souza et al. (1995) J Gen. Virol., 16: 1729-1736; Takeshita et al. (1997) Anal. Biochem. 247:242-246; ver também, por exemplo, Shimizu et 25 al. (1994) J. Virol. 68:8406- 8408; Mizutani et al. (1996) J. Virol. 70:7219-7223; Mizutani et al. (1996) Biochem. Biophys. Res. Common. , 227:822-826; Lu et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sei (USA), 93:1412-1417; Hahm et al., (1996) Virology, 226:318-326; Ito et al. (1996) J. Gen. Virol.r 30 77:1043-1054; Mizutani et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Common., 212:906-91 1; Cho et al. , (1997) J. Virol. Meth. 65:201-207 e, então extrapolados deste para dosagens para humanos.
Por exemplo, uma dose terapeuticamente eficaz de hialuronidase para administração de dosagem única é de ou cerca de 500 Unidades para 500.000 unidades, por exemplo, 1000 Unidades a 100.000 Unidades de hialuronidase. Por exemplo, a hialuronidase pode ser administrada, em particular, para administração subcutânea, em ou cerca de 500 Unidades, 1000 Unidades, 2000 Unidades, 5000 Unidades, 10.000 Unidades, 30.000 Unidades, 40.000 Unidades, 50.000 Unidades, 60.000 Unidades, 70.000 Unidades, 80.000 Unidades, 90.000 Unidades, de 100.000 Unidades ou mais. Como notado, hialuronidase pode ser fornecida em quantidades menores da co-formulação de dosagem para as administrações múltiplas.
Em alguns exemplos, as dosagens podem ser fornecidas como uma razão de IG administrada. Por exemplo, a hialuronidase pode ser administrada, em 10 U/grama (g) a 2000 U/g ou mais de IG, por exemplo, de ou cerca de 10 U/g, 20 U/g, 30U/g, 40 U/g, 50 U/g, 60 U/g, 70 U/g, 80 U/g, 90 U/g, 100 U/g, 150 U/g, 200 U/g, 250 U/g, 300 U/g, 400 U/g, 500 U/g, 1000 U/g, 1500 U/g, 2000 U/g, 3000 U/g de IG ou mais. Em geral, a razão de hialuronidase para IG em um produto co-formulado é maior do que a razão quando os mesmos produtos (IG e hialuronidase) e a mesma quantidade de IG são administrados por via subcutânea em separado, por exemplo, em uma administração de borda de ataque. Assim, em geral, a razão é de, pelo menos, 100 U/g, e, geralmente, 250 U/g ou mais, por exemplo 100 U/g para 3000 U/g de IG, tais como 250 U/g para 1000 U/g, e em particular 250 U/g para 750 U/g, tal como 500 U/g de IG. Por exemplo, uma co- formulação contendo 100 U/mL de hialuronidase, quando co- formulada com um 20% de IG (200 mg/mL) , é fornecida a uma razão que é ou é cerca de 500 U/g de IG. Tipicamente, os volumes administrados por via subcutânea podem ser de ou cerca de 10 mL a 700 mL, tal como 50 mL para 500 mL, por exemplo, 100 mL para 400 mL de uma administração de dosagem única. Por exemplo, os volumes administrados por via subcutânea podem ser de ou cerca de 10 mL, 20 mL, 30 mL, 40 mL, 50 mL, 100 mL, 200 mL, 300 mL, 400 mL, 500 mL, 600 mL, 700 mL ou mais para uma única administração de dosagem.
c. Sal de cloreto de metal alcalino
A co-formulação aqui proporcionada contém um sal de cloreto de metal alcalino que é pelo menos 0,05 M. O sal de cloreto de metal alcalino inclui, mas não está limitado ao cloreto de sódio (NaCl) ou cloreto de potássio (KC1). Tipicamente, o sal de cloreto de metal alcalino, por exemplo, NaCl ou KC1, é fornecido para reter a estabilidade e atividade da hialuronidase. A quantidade exata de sal pode ser determinada empiricamente por um perito na técnica. Por exemplo, a quantidade de sal nas formulações pode ser determinada através da avaliação de agregação e atividade sob condições diferentes de sal usando vários métodos conhecidos de um perito na técnica, por exemplo, como descrito na seção G. Tipicamente, nas co-formulações aqui fornecidas, cloreto de sódio é fornecido numa quantidade que é ou é cerca de 0,05 M a 0,3 M, por exemplo, de ou cerca de 0,05 M, 0,06 M, 0,07 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M , 0,25 M ou mais. Tipicamente, a quantidade de sal está entre 0,05 M a 0,25 M, por exemplo 0,15 M.
d. Estabilizador de aminoácido
A co-formulação aqui fornecida contém um estabilizador de aminoácido, o que contribui para a estabilidade da preparação. 0 estabilizador pode ser aminoácidos não-polares e básicos. Exemplos de aminoácidos não-polares e básicos incluem, mas não estão limitados à alanina, histidina, arginina, lisina, omitina, isoleucina, valina, metionina, glicina e prolina. Por exemplo, o estabilizador de aminoácido é a glicina ou prolina, tipicamente glicina. O estabilizador pode ser um único aminoácido ou pode ser uma combinação de 2 ou mais desses aminoácidos. Os estabilizadores de aminoácidos podem ser aminoácidos naturais, aminoácidos análogos, aminoácidos modificados ou equivalentes de aminoácidos. Geralmente, o aminoácido é um L-aminoácido. Por exemplo, quando a prolina é usada como o estabilizador, ela é geralmente, L-prolina. É também possível usar equivalentes de aminoácidos, por exemplo, análogos de prolina.
Geralmente, uma quantidade de um ou mais aminoácidos eficazes para manter a imunoglobulina em forma monomêrica é adicionada à solução. A concentração de estabilizador de aminoácido, por exemplo, glicina, incluido na co-formulação de liquidos varia de 0,1 M a 1 M de aminoácido, tipicamente 0,1 M a 0,75 M, geralmente, 0,2 M a 0,5 M, por exemplo, pelo menos de ou cerca de 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M, 0,75 M ou mais. O aminoácido, por exemplo, glicina, pode ser usado em uma forma de um sal farmaceuticamente aceitável, tal como cloridrato, bromidrato, sulfato, acetato, etc. A pureza do aminoácido, por exemplo, glicina, deve ser de pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou pelo menos, 99,5% ou mais.
e. Outros agentes
Opcionalmente, as co-formulações podem incluir veiculos, tais como um diluente, adjuvante, excipiente, ou veiculo com o qual uma hialuronidase ou IG é administrada. Exemplos de veiculos farmacêuticos adequados estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tais composições irão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, geralmente, na forma purificada ou na forma parcialmente purificada, em conjunto com uma quantidade adequada de veiculo de modo a proporcionar a forma de administração adequada para o paciente. Tais veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo aqueles de petróleo, animal, vegetal ou de origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, e óleo de sésamo. A água é um veículo típico quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. As soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem também ser empregadas como veículos líquidos, particularmente, para soluções injetáveis.
Por exemplo, os veículos farmaceuticamente aceitáveis utilizados em preparações parentéricas incluem veículos aquosos, veículos não aquosos, agentes antimicrobianos, agentes isotônicos, tampões, antioxidantes, anestésicos locais, agentes de suspensão e dispersantes, agentes emulsionantes, ou agentes sequestrantes ou quelantes e outras substâncias farmaceuticamente aceitáveis. Exemplos de veículos aquosos incluem Injeção de Cloreto de Sódio, Injeção de Ringer, Injeção de Dextrose Isotônico, Injeção de Água Estéril, Injeção de Ringer com Lactato e Dextrose. Veículos parentéricos não aquosos incluem óleos fixos de origem vegetal, óleo de semente de algodão, óleo de milho, óleo de sésamo e óleo de amendoim. Agentes antimicrobianos, em concentrações bacteriostáticas ou fungistáticas, podem ser adicionados às preparações parenterais embalados em recipientes de doses múltiplas, os quais incluem fenóis ou cresóis, mercuriais, álcool benzílico, clorobutanol, metil e propil ésteres de ácido p-hidroxibenzóico, timerosal, cloreto de benzalcônio e cloreto de benzetônio. Agentes isotônicos incluem cloreto de sódio e dextrose. Tampões incluem fosfato e citrato. Antioxidantes incluem bissulfato de sódio. Os anestésicos locais incluem cloridrato de procaína. Agentes de suspensão e dispersão incluem carboximetilcelulose de sódio, hidroxipropil metilcelulose e polivinilpirrolidona. Agentes emulsionantes incluem Polissorbato 80 (TWEENs 80) . Um sequestrante ou agente quelante de ions metálicos incluem o EDTA. Veículos farmacêuticos também incluem o álcool etílico, polietileno glicol e propileno glicol para veículos miscíveis em água e hidróxido de sódio, ácido clorídrico, ácido cítrico ou ácido lático para ajuste do pH.
As composições podem conter, juntamente com um ingrediente ativo: um diluente tal como lactose, sacarose, fosfato dicálcico, ou carboximetilcelulose; um lubrificante, tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio e talco; e um ligante, tal como amido, gomas naturais, tais como goma de acaciagelatina, glicose, melaço, polivinilpirrolidona, celulose e seus derivados, povidona, crospovidonas e outros ligantes conhecidos dos peritos na técnica.
Por exemplo, uma proteína excipiente pode ser adicionada à co-formulação que pode ser qualquer de um número de proteínas ou peptideos farmaceuticamente aceitáveis. Geralmente, a proteína excipiente é selecionada pela sua capacidade de ser administrada a um sujeito mamífero sem provocar uma resposta imunológica. Por exemplo, albumina de soro humano é bem adequada para utilização em formulações farmacêuticas. Outros excipientes com proteinas farmacêuticos conhecidas incluem, mas não estão limitados ao amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol , propileno, glicol, água, e etanol. O excipiente é incluído na formulação em uma concentração suficiente para prevenir a adsorção da proteína para o recipiente ou frasco de retenção. A concentração do excipiente variará de acordo com a natureza do excipiente e da concentração da proteína na co- formulação .
Uma composição, se desejada, também pode conter quantidades menores de agentes umificantes ou emulsionantes, ou agentes tamponantes de pH, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina, e outros tais agentes.
2. Formas de Dosagem
As co-formulações aqui proporcionadas podem ser formulados como formas de dosagem únicas ou múltiplas. Por exemplo, uma vez que a co-formulação aqui proporcionada é estável durante períodos prolongados de tempo, a co- formulação pode ser fornecida na forma de dosagem múltipla para administração durante um intervalo de dias, semanas, meses ou anos. Assim, aco-formulação líquida pode ser preparada como formas de dosagem unitárias. A concentração do composto farmaceuticamente ativo é ajustada de modo que uma injeção fornece uma quantidade eficaz para produzir o efeito farmacológico desejado. Por exemplo, cada dose unitária contém uma quantidade pré-determinada de composto terapeuticamente ativo suficiente para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veículo farmacêutico requerido, veículo, ou diluente. A dose exata depende da idade, peso e condição do paciente ou animal, tal como é conhecido na técnica. Formas de dose unitária podem ser administradas em frações ou múltiplos destas. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitárias idênticas embaladas em um único recipiente para ser administrado na forma segregada de dose unitária. Assim, a forma de dose múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não são 5 segregadas em embalagens.
As preparações de dose unitária parenterais são embaladas em uma ampola, um frasco ou uma seringa com uma agulha. 0 volume de solução liquida contendo o composto farmaceuticamente ativo é uma função da doença a ser 10 tratada e o artigo em particular de fabricação escolhido para o pacote, Todas as preparações para administração parenteral devem ser estéreis, como é conhecido e praticado na técnica. Quando fornecido como uma preparação de multidose, a formulação pode conter um agente 15 bacteriostático.
3. Administração
Composições co-formuladas aqui proporcionadas são tipicamente formuladas para administração parenteral, por exemplo, por via subcutânea. Devido ao aumento da 20 biodisponibilidade de IG em co-formulações com hialuronidase, imunoglobulinas podem ser administradas por via subcutânea em doses e frequências, para as quais as preparações intravenosas atuais (IVIG) são preparadas e administradas. As vantagens sobre as formulações 25 subcutâneas atuais de IG é que hialuronidase/IG co- formulada pode resultar em regimes de dosagem mais favoráveis, por exemplo, a dosagem, menos frequente. Por dosagem menos frequente ou inferior, os efeitos colaterais associados com a toxicidade podem ser reduzidos. 30 Geralmente, a farmacocinética e/ou farmacodinâmica da terapia IG subcutânea é aperfeiçoada. Além disso, administrações subcutâneas de IG também têm vantagens sobre as infusões intravenosas atuais. Por exemplo, a infusão subcutânea permite a infusão pelo paciente ou familia ao contrário de uma enfermeira qualificada; infusão pode ser alcançada a taxas mais elevadas, tais que IG é infundida em 1-3 horas em comparação com 5-10 horas para terapias 5 convencionais de IVIG; não há exigência para as veias funcionais; não há efeitos colaterais relacionados à infusão como a trombose, dor de cabeça, tromboflebite, náuseas, e menor probabilidade de eventos adversos; e infusão pode ser feita em casa ou em qualquer lugar.
A administração subcutânea também é desejada para garantir que as hialuronidases são administradas de modo que elas atingem o interstício de pele ou tecidos, assim, o espaço intersticial degradante para distribuição subsequente de imunoglobulina. Assim, a administração 15 direta sob a pele, tais como por métodos de administração subcutâneo, é contemplada.
A administração pode ser local, tópica ou sistémica dependendo do locus de tratamento. A administração local para uma área em necessidade de 20 tratamento pode ser conseguida por, por exemplo, mas não se limitam à infusão local, aplicação tópica, por exemplo, em conjunção com um curativo após a cirurgia, por injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante. Geralmente, a administração local é 25 conseguida através da injeção, tal como a partir de uma seringa ou outro artigo de fabricação contendo um dispositivo de injeção, tal como uma agulha. Em um outro exemplo, a administração local pode ser conseguida por infusão, a qual pode ser facilitada pela utilização de uma 30 bomba ou outro dispositivo similar. Outros modos de administração também são contemplados. Composição farmacêutica pode ser formulada em formas de dosagem apropriadas para cada rota de administração. A rota mais adequada em qualquer caso dado depende de uma variedade de fatores, tais como a natureza da doença, o progresso da doença, a gravidade da doença, a composição particular que é usada. Outras rotas de 5 administração, tal como qualquer rota conhecida dos peritos na técnica, incluem, mas não estão limitados à intramuscular, intravenosa, intradérmica, injeção, intralesional intraperitoneal, epidural, nasal, oral, vaginal, retal, tópica, local, ótica, inalação, 10 administração bucal (por exemplo, sublingual), administração transdérmica ou qualquer rota. Formulações adequadas para tais rotas são conhecidas por um perito na técnica.
As composições também podem ser administradas com 15 outros agentes biologicamente ativos, quer sequencialmente, de forma intermitente ou na mesma composição. Administração também pode incluir sistemas de distribuição controlada, incluindo formulações de distribuição controlada e libertação controlada por dispositivo, tal como por meio de 2 0 uma bomba.
A administração subcutânea, geralmente, caracterizada por injeção ou infusão, é contemplada aqui Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, ou como soluções ou suspensões liquidas, formas sólidas 25 adequadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção, ou como emulsões. Geralmente, as co-formulações aqui proporcionadas são preparadas como líquidos. Injetáveis são projetados para a administração local e sistêmica. Para fins aqui descritos, a administração local 30 é desejada para administração direta ao interstício afetado. As preparações para administração parentérica incluem soluções estéreis prontas para injeção, produtos solúveis estéreis secos, tais como pós liofilizados, prontos para ser combinados com um solvente imediatamente antes da utilização, incluindo comprimidos hipodérmicos, suspensões estéreis prontas para injeção, produtos insolúveis estéreis secos, prontos para combinada com um 5 veiculo imediatamente antes da utilização e emulsões estéreis. As soluções podem ser aquosas ou não aquosas. Se administrados intravenosamente, os veiculos adequados incluem soro fisiológico ou tampão fosfato salino (PBS), e soluções contendo espessamento e agentes solubilizantes, 10 tais como a glicose, polietileno glicol, e polipropileno glicol e suas misturas.
Métodos de administração podem ser empregados para diminuir a exposição de compostos selecionados para processos degradativos, tais como a degradação proteolitica 15 e intervenção imunológica através de respostas antigênicas e imunogênicas. Exemplos de tais métodos incluem a administração local no local de tratamento. A PEGuilação de terapêuticos tem sido relatada para aumentar a resistência à proteólise, aumentar semi-vida plasmática, e diminuir a 20 antigenicidade e imunogenicidade. Exemplos de metodologias de PEGilação são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Lu and Felix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994; Lu and Felix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993; Felix et al., Int. J. Peptide Res., 46 : 253-64, 1995; Benhar et 25 al., J. Biol. Chem., 269: 13398- 404, 1994; Brumeanu et al., J Immunol., 154: 3088-95, 1995; ver também, Caliceti et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(70): 1261 -77 and Molineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8S). PEGuilação também pode ser usada na distribuição de 30 moléculas de ácido nucléico in vivo. Por exemplo, PEGuilação de adenovirus pode aumentar a estabilidade e transferência de genes (ver, por exemplo, Cheng et al. (2003) Pharm Res 20 (9) :1444-51) . Onde grandes volumes são administrados, a administração é tipicamente por infusão. Sujeitos podem ser administrado em doses de taxas de infusão de ou cerca de 0,5 mL/kg/PC/h para 5 mL/kg/PC/h, por exemplo, de ou cerca de 0,5 mL/kg/PC/h, 1 mL/kg/PC/h, 2 mL/kg/PC/h, 3 mL/kg/PC/h, 4 mL/kg/PC/h, ou 5 mL/kg/PC/h. A taxa de infusão pode ser determinada empiricamente e, normalmente, é uma função da tolerabi1 idade do sujeito. Se uma reação adversa ocorre durante a infusão, a taxa de infusão pode ser retardada à taxa imediatamente abaixo daquela em que o acontecimento adverso ocorreu. Se o evento adverso resolve em resposta à diminuição da taxa, a taxa de infusão pode ser aumentada lentamente à critério do médico. Infusão subcutânea de co-formulações IG pode ser facilitada pela gravidade, bomba de infusão, ou injeção de uma dose desejada, por exemplo, uma dose total de 20-30 grama. Geralmente, para infusões de intravenosas, bombas de infusão podem ser empregadas. Co-formulações IG/hialuronidase podem ser infundidas a taxas de ou cerca de 5 mL/h, 10 mL/h, a 30 mL/h, 60 mL/h, 120 mL/h, 240 mL/h ou de 300 mL/h. As taxas de infusão podem ser aumentadas durante o curso do tratamento, desde que a infusão seja tolerada pelo paciente. Geralmente, o tempo de administração da infusão é de ou cerca de 0,5 h, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h ou mais. Devido à elevada taxa de infusão alcançada por administração subcutânea de IG co- formulada com hialuronidase, o tempo de infusão é significativamente menor do que para as terapias convencionais de IVIG. Onde o tempo de infusão exceder o limite desejado, um segundo local de infusão pode ser iniciado à critério do médico e do sujeito. O segundo local tipicamente é iniciado pelo menos 10 cm a partir do local inicial.
Técnicas para infusão são conhecidas por um perito na técnica, e estão dentro da habilidade de um médico de tratamento. Geralmente, a dose apropriada de co- formulação de IG/hialuronidase pode ser agrupada num compartimento IV padrão. Por exemplo, um conjunto de infusão não-ventilado pode ser utilizado que tem uma porta- Y perto do seu término. Uma agulha de infusão subcutânea de calibre 24 pode ser inserida em um local de preferência do sujeito, mas o abdómen e secundariamente as coxas são recomendados, devido ao volume de solução a ser infundido. A hialuronidase e IG podem ser fornecidas no mesmo aparelho porta Y. Outros artigos de fabricação também podem ser aqui utilizados para fins de infusão por gravidade ou uma bomba, e incluem, mas não estão limitados aos tubos, garrafas, seringas ou outros recipientes.
No caso em que uma infusão não é tolerada (por exemplo, causa moderadas a graves reações locais) , um segundo local de infusão pode ser iniciado de modo que o sujeito receba a dosagem total.
Além disso, entende-se que as co-formulações estáveis aqui fornecidas são passíveis de regimes de dosagem envolvendo uma frequência periódica de administração. Por exemplo, a frequência de dosagem pode ser diariamente durante um intervalo de tempo dado ao longo de dias consecutivos ou alternativos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais dias. Em outros exemplos, o regime de dosagem é semanal, por exemplo, uma vez por semana, cada duas semanas, cada três semanas, cada quatro semanas, cada cinco semanas, cada seis semanas ou mais. Assim, uma preparação de IG/hialuronidase pode ser administrada de uma só vez, ou pode ser dividida em um número de doses menores a serem administradas em intervalos de tempo. As preparações selecionadas de IG/hialuronidase podem ser administradas em uma ou mais doses ao longo de um tempo de tratamento, por exemplo, durante várias horas, dias, semanas ou meses. Em alguns casos, a administração continua é útil. Entende-se que a dosagem precisa e curso 5 de administração depende da indicação e tolerabilidade do paciente.
Além disso, é entendido que a dosagem precisa e a duração do tratamento é uma função da doença a ser tratada, e pode ser determinada empiricamente utilizando protocolos 10 de teste conhecidos ou por extrapolação a partir dos dados de teste in vivo ou in vitro. É para ser notado que as concentrações e os valores de dosagem também podem variar com a gravidade da condição a ser aliviada. É para ser ainda entendido que para qualquer individuo particular, os 15 regimes de dosagem específicos devem ser ajustados ao longo do tempo de acordo com a necessidade individual e o julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de concentração aqui estabelecidas são exemplares 20 apenas, e não se destinam a limitar o escopo ou a utilização de composições e combinações que os contenham. As composições podem ser administradas de hora em hora, diariamente, semanalmente, mensalmente, anualmente ou uma vez. Geralmente, os regimes de dosagens são escolhidos para 25 limitar a toxicidade. Deve notar-se que o médico atendente saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapia para dosagem inferior devido à toxicidade, ou médula ossea, fígado ou rins ou outras disfunção do tecido. Inversamente, o médico atendente também saberia como e 30 quando ajustar o tratamento para níveis mais elevados, se a resposta clinica não for adequada (excluindo os efeitos colaterais tóxicos).
G. Métodos de Avaliação da Estabilidade, Atividade, Biodisponibilidade e Farmacocinética
A estabilidade e a atividade de IG e hialuronidase nas formulações podem ser avaliadas usando vários ensaios in vitro e in vivo, os quais são conhecidos por um perito na técnica. Várias técnicas analíticas para medir a estabilidade da proteina de estão disponíveis na técnica e são revistas em Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991) and Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). A estabilidade pode ser medida em uma temperatura selecionada por um período de tempo selecionado.
Ensaios para avaliar o tamanho molecular (por exemplo, causado por agregação, desnaturação e/ou fragmentação) da IG é uma consideração importante para avaliar a estabilidade da co-formulação. Além disso, a estabilidade das formulações líquidas também pode ser avaliada por quaisquer ensaios que medem a atividade biológica de IG e hialuronidase na formulação. Taís ensaios são bem conhecidos na técnica. Além de avaliar a estabilidade da co-formulação, tais ensaios podem ser utilizados, por exemplo, para determinar as dosagens apropriadas de imunoglobulina e hialuronidase, e a frequência de dosagem, para o tratamento. Além disso, os ensaios conhecidos de um perito na técnica podem também ser realizados para avaliar as propriedades farmacocinéticas da imunoglobulina administrada subcutaneamente, incluindo biodisponibilidade e tolerabilidade.
1. Tamanho Molecular
A estabilidade principal indicando parâmetro é o tamanho molecular, e uma alteração no tamanho pode ser o resultado da degradação por desnaturação, agregação, ou fragmentação. Agregação de IG é um problema comum durante o armazenamento de produtos da IG. Os agregados são problemáticos, porque eles podem combinar-se com complemento no sangue do paciente e produzir uma reação do 5 anti-complemento. A capacidade de IG para ligar o complemento é grandemente aumentada como resultado da desnaturação, em particular através da agregação de espécies de elevado peso molecular. 0 mecanismo de complemento de ligação destes agregados parece ser idêntico 10 ao de complexos antigeno-anticorpo. Marcus, D. M., (1960) J. Immunol. 84:273-284. No caso de IgG, sabe-se que o local de ligação do complemento requer duas moléculas muito juntas. Por conseguinte, é possível que a embalagem critico das moléculas seja requerida, em vez de qualquer alteração 15 conformacional necessária.
Métodos para a estabilidade de monitoramento de IG estão disponíveis na técnica, incluindo os métodos descritos aqui, e nos exemplos aqui revelados. Há vários métodos disponíveis para a avaliação da estabilidade de 20 formulações de proteínas, incluindo formulações de anticorpo ou imunoglobulina, com base nas estruturas físicas e químicas das proteínas, bem como sobre as suas atividades biológicas. Por exemplo, para estudar a fragmentação, agregação e desnaturação de proteínas, tais 25 como métodos de absorção de transferência de carga, análise térmica, espectroscopia de fluorescência, dicroísmo circular, RMN, eletroforese em gel capilar reduzida (rCGE), e cromatografia de alto desempenho de exclusão de tamanho (HPSEC), estão disponíveis. Ver, por exemplo, Wang et al., 30 1988, J. of Parenteral Science & Technology 42(supp):S4- S26. O rCGE e HPSEC são os métodos mais comuns e mais simples para avaliar o tamanho molecular devido à formação de agregados de proteínas, degradação de proteínas e fragmentação de proteinas. Além disso, a atividade anti- complemento (ACA) pode ser determinada diretamente. Por exemplo, a estabilidade das formulações liquidas pode ser avaliada por HPSEC ou rCGE, onde a área percentual dos picos representa a proteina não degradada. Num exemplo, a proteina é injetada em uma coluna Tosoh Biosep TSK G3000 SW 600 x 7,5 mm. A proteina é eluida. Proteina eluida é detetada usando absorvância de UV a 280 nm. Um padrão de referência é executado no ensaio como um controle, e os resultados são relatados como a porcentagem de área do pico do monômero do produto em comparação com todos os outros picos excluindo o pico de volume incluído. Picos eluidos mais cedo do que o pico de monômero são registados como agregado por cento. Titulação ACA também pode ser determinada como descrito na Farmacopeia Europeia (European Pharmacopeia, 1997, 2nd ed. Part II. Maisonneuve, S.A., Saint Ruffine, France). Geralmente, titulação ACA é um indicador de especificação para administração intravenosa (IV) e não é relevante para a administração subcutânea das co- formulações. Assim, para fins aqui descritos, titulação ACA não é geralmente um indicador determinante para co- formulações que são formuladas para administração subcutânea. Geralmente, o ensaio de ACA mede a quantidade de complemento que está ligado pela mistura de quantidades padronizadas de complemento e de proteinas (ver, por exemplo, Palmer, D. F. and Whaley, S. D., Complement Fixation Test, in Manual of Clinical Laboratory Immunology (Ed. N. R. Rose, et al., American Society for Microbiology, Washington, D.C., 1986) pp. 57-66.; Mayer, M. M., Quantitative C Fixation Analysis, Complement and Complement Fixation, in Experimental Immunochemistry (Ed. E. A. Kabat and M. M. Meyer, Thomas, Springfield, III., 1961), pp. 214- 216, 227-228.). Resumidamente, as células vermelhas do sangue que foram sensibilizadas por pré-incubação com anticorpos de células vermelhas do sangue são adicionadas à mistura de complemento/proteína. Na presença de complemento livre (ainda não ligadas pela proteina), estas células sensibilizadas irão lisar, liberando a hemoglobina, a qual pode ser quantificada como uma medida do grau de lise. Em paralelo, células vermelhas sensibilizadas do sangue são também adicionadas a uma mistura de complemento e controle de tampão, cujo grau de lise é definido como 100%. A diferença entre a quantidade real de complemento necessário para dar 100% de lise e a quantidade de complemento não ligado remanescente na presença da proteina é igual à quantidade de complemento efetivamente ligado pela proteina, ou atividade anti-complemento. Uma unidade de atividade de ACA (uma unidade de CH50) é a quantidade de proteina capaz de ativar a 50% do complemento em um complemento otimamente titulado e sistema de células vermelhas do sangue/hemolisina. Geralmente, uma titulação de ACA aceitável é inferior a 50%, unidades CH50 consumidas por mg de proteina.
Em outro exemplo, distribuição de tamanho molecular, por exemplo, devido à formação de agregados, durante o armazenamento de uma co-formulação líquida pode ser facilmente determinada por medição da alteração na proteína solúvel em solução ao longo do tempo. Quantidade de polipeptideo solúvel em solução pode ser quantificada por um número de ensaios analíticos. Tais ensaios incluem, por exemplo, fase reversa (RP)-HPLC e espectroscopia de absorção de UV. Determinação de tanto dos agregados solúveis quanto insolúveis, durante o armazenamento em formulações líquidas pode ser alcançada, por exemplo, utilizando ultracentrifugação analítica para distinguir entre a porção do polipeptídeo solúvel que está presente como agregados solúveis, e a porção que está presente nos não agregados, forma molecular biologicamente ativa.
Num exemplo adicional, a estabilidade das co- formulações pode ser avaliada por meio de aquecimento do produto acabado a uma temperatura de 57 °C e mantendo-a nesta temperatura durante quatro horas, enquanto examinando o produto para visual precipitados. (Ver, por exemplo, Code 10 of Federal Regulations 21, Food and Drugs, 640. 101a (revised April 1978)). Numa modificação do método (ver, por exemplo, Fernandes and Lundblad, Vox Sang 39:101-112 (1980), aproximadamente 2 ml do produto teste é aquecido a 57 °C durante quatro horas e, em seguida, a alteração da 15 porcentagem em grau de opalescência como medida por registrar a transmitâncía a 580 nm com um espectrofotômetro de laboratório é avaliada (ver também Patente US No. 4,597,966) . SDS-PAGE também pode ser usado para avaliar a 20 agregação e/ou fragmentação. A densidade ou a radioatividade de cada banda corada ou marcada com radioisótopo pode ser medida e a % de densidade ou % de radioatividade da banda representando proteína não degradada pode ser obtida.
Geralmente, as co-formulações exibem níveis baixos para não detectáveis de agregação como medido por qualquer um dos ensaios acima referidos, por exemplo HPSEC ou rCGE. Por exemplo, a agregação é, não mais do que 5%, não mais do que 4%, não mais do que 3%, não mais do que 2%, 30 não mais do que 1%, e geralmente, não mais do que 0,5% do agregado por peso de proteína, e níveis baixos para não detectáveis de fragmentação, isto é, 80% ou superior, 85% ou superior, 90% ou superior, 95% ou superior, 98% ou superior, ou 99% ou superior, ou 99,5% ou superior da área total do pico no(s) pico(s) representando anticorpos intactos ou seus fragmentos. Por exemplo, tipicamente, uma agregação aceitável inclui > 90% de monômeros e oligo- /dimeros; < 5% de agregados, e < 5% de fragmentos.
2. Atividade biológica a. Imunoglobulina
A capacidade de imunoglobulina para atuar como um agente terapêutico pode ser avaliada in vitro ou in vivo. Por exemplo, ensaios in vitro podem ser realizados para avaliar a capacidade de imunoglobulina para neutralizar a infecciosidade virai ou bacteriana (Hiemstra et al., (1994) J Lab Clin Med 123:. 241-6). Outros ensaios in vitro podem ser utilizados para avaliar outras atividades biológicas da imunoglobulina. Por exemplo, a capacidade de preparações de imunoglobulinas para interagir e modular com os produtos de ativação do complemento, ligar-se aos anticorpos idiotipico, ligar-se aos receptores Fc em macrófagos, e suprimir vários mediadores inflamatórios, incluindo citocinas, quimiocinas, e as metaloproteinases, pode ser avaliada utilizando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas não se limitam a, ELISA, Western blot, Northern blot, e citometria de fluxo para avaliar a expressão do marcador. Por exemplo, o efeito de imunoglobulina sobre a expressão de receptores de quimiocina em células periféricas mononucleares do sangue pode ser avaliado utilizando fluxo de citomteria (Trebst et al., (2006) Eur J Neurology 13 (12) :1359-63). Em outro exemplo, o efeito de imunoglobulina sobre a expressão de metaloproteinase em macrófagos pode ser avaliado utilizando a análise de Northern blot (Shapiro et al., (2002) Cancer 95:2032-2037).
Os estudos in vivo utilizando modelos animais também podem ser realizados para avaliar a atividade terapêutica de imunoglobulina. A imunoglobulina pode ser administrada para modelos animais infectados com um ou mais microorganismos, e o efeito sobre a progressão da infecção pode ser avaliado, tais como através da medição do número de micro-organismos ou de medição de peso como um marcador de morbidade. O efeito terapêutico de imunoglobulina também pode ser avaliado utilizando modelos animais de doenças e condições, pelos quais a terapia utilizando imunoglobulina é considerada. Tais modelos animais são conhecidos na técnica, e incluem, mas não estão limitados aos pequenos modelos animais para agamaglobulinemia ligada ao X (XLA), SCID, sindrome de Wiskott-Aldrich, doença de Kawasaki, sindrome de Guillain-Barré, ITP, polimiosite, sindrome miastênica de Lambert-Eaton, miastenia gravis e sindrome de Moersch-Woltmann (Czitrom et al. (1985) J Immunol 134:2276- 2280, Ellmeier et al, (2000) J Exp Med. 192: 161 1-1624, Ohno (2006) Drug Discovery Today: Disease Models 3:83-89, Oyaizu et al. (1988) J Exp Med 2017-2022, Hansen et al., (2002) Blood 100:2087- 2093, Strongwater et al., (1984) Arthritis Rheum. 27:433-42, Kim et al. (1998) Annals NY Acad Sci 841 :670-676, Christadoss et al. (2000) Clin. Immunol 94:75- 87, Sommer et al., (2005) Lancet 365: 1406- 141 1 e Patent US No.7,309,810) .
b. Hialuronidase
Atividade hialuronidase pode ser avaliada utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Em um exemplo, a atividade é medida usando um ensaio de microturvação. Isto é baseado na formação de um precipitado insolúvel, quando o ácido hialurônico liga-se com albumina de soro. A atividade é medida através da incubação de hialuronidase com hialuronato de sódio (ácido hialurônico) durante um período de tempo (por exemplo, 10 minutos) e, então, precipitando o hialuronato de sódio não digerido com a adição de albumina de soro acidificado. A turvação da amostra resultante é medida a 640 nm após um período de desenvolvimento adicional. A diminuição na turbidez resultante da atividade de hialuronidase sobre o substrato de hialuronato de sódio é uma medida da atividade enzimática de hialuronidase. Em um outro exemplo, a atividade da hialuronidase é medida utilizando um ensaio de microtitulação, em que o ácido hialurônico residual biotinilado é medido após a incubação com hialuronidase (ver, por exemplo, Frost e Stern (1997) Anal. Biochem. 251:263-269, Publicação de Patente US No. 20050260186). Os grupos livres de carboxil sobre os resíduos de ácido glucurônico de ácido hialurônico são biotinilados, e o substrato de ácido hialurônico biotinilado é covalentemente acoplado nas placas de microtitulação. Seguindo a incubação com hialuronidase, o substrato de ácido hialurônico biotinilado residual é detectado usando uma reação de avidina-peroxidase, e comparado com a obtida seguindo reação com os padrões de hialuronidase de atividade conhecida. Outros ensaios para medir a atividade de hialuronidase também são conhecidos na técnica e podem ser utilizados nos métodos neste (ver, por exemplo, Delpech et al., (1995) Anal. Biochem. 229:35-41; Takahashi et al., (2003) Anal Biochem. . 322:257-263).
A capacidade de hialuronidase para agir como um agente de espalhamento ou difusão também pode ser avaliada. Por exemplo, corante azul de tripano pode ser injetado por via subcutânea com ou sem adição de hialuronidase na pele lateral de cada lado dos camundongos nús. A área de corante é então medida, tal como com um microcaliper, para determinar a capacidade de hialuronidase para atuar como um agente de espalhamento (Patente US No. 20060104968).
3. Farmacocinética e tolerabilidade
Os estudos de farmacocinética e tolerabilidade 5 podem ser realizados utilizando modelos animais ou podem ser realizados durante os estudos clínicos com pacientes. Os modelos animais incluem, mas não estão limitados aos camundongos, ratos, coelhos, cães, porquinho da índia e modelos primatas não-humanos, tais como macacos cinomólogo 10 ou macacos rhesus. Em alguns casos, os estudos de farmacocinética e tolerabilidade são realizados usando os animais saudáveis. Em outros exemplos, os estudos são realizados utilizando modelos animais de uma doença, para a qual a terapia com imunoglobulina é considerada, tais como 15 modelos animais de qualquer uma das doenças e condições descritas abaixo.
A farmacocinética da imunoglobulina administrada por via subcutânea pode ser avaliada por medição de tais parâmetros como a concentração máxima (pico) de 20 imunoglobulina do plasma (Cwax) , o tempo de pico (ou seja, quando a concentração plasmática máxima de imunoglobulina ocorre; Tmax) , a concentração mínima de imunoglobulina plasmática (isto é, a concentração plasmática mínima entre as doses de imunoglobulina; Cmin) , a meia vida de eliminação 25 (T1/2) e área sob a curva (isto é, a área sob a curva gerada por traçar tempo versus concentração plasmática de imunoglobulina; AUC), seguindo a administração. A biodisponibilidade absoluta da imunoglobulina, administrada por via subcutânea, é determinada por comparação da área 30 sob a curva de imunoglobulina seguindo liberação subcutânea (AUCsc) com a AUC da imunoglobulina seguindo administração intravenosa (AUQIV) • A biodisponibilidade absoluta (F), pode ser calculada utilizando a fórmula: F = ([AUC]sc x dosesc) / ( [AUC] iv x doseIV) . A concentração de imunoglobulina no plasma após administração subcutânea pode ser medida utilizando qualquer método conhecido na técnica adequado para avaliar as concentrações de imunoglobulina em amostras de sangue. Exemplos de métodos incluem, mas não estão limitados ao ELISA e nefelometria.
Uma faixa de doses e frequência de dosagem diferente de dosagem pode ser administrada em estudos farmacocinéticos para avaliar o efeito de aumentar ou diminuir as concentrações de imunoglobulina e/ou hialuronidase na dose. Propriedades farmacocinéticas da imunoglobulina administrada por via subcutânea, tais como biodisponibilidade, também podem ser avaliadas com ou sem co-administração de hialuronidase. Por exemplo, cães, tais como beagles, podem ser administrados imunoglobulina por via subcutânea em combinação com hialuronidase, ou sozinha. Doses intravenosas de imunoglobulina também são dadas ao outro grupo de beagles. As amostras de sangue podem então ser tomadas em vários pontos de tempo e a quantidade de imunoglobulina no plasma determinar, tais como por nefelometria. A AUC pode então ser medida e a biodisponibilidade de imunoglobulina administrada por via subcutânea administrada com ou sem adição de hialuronidase pode ser determinada. Esses estudos podem ser realizados para avaliar o efeito da co-administração com hialuronidase sobre propriedades farmacocinéticas, tais como biodisponibilidade, imunoglobulina administrada por via subcutânea. Estudos para avaliar a segurança e tolerabilidade também são conhecidos na técnica e podem ser aqui utilizados. Após a administração subcutânea de imunoglobulina, com ou sem co-administração de hialuronidase, o desenvolvimento de quaisquer reações adversas pode ser monitorada. As reações adversas podem incluir, mas não estão limitadas às reações no local da injeção, tais como edema ou inchaço, dor de cabeça, febre, fadiga, calafrios, rubor, tontura, urticária, sibilos ou aperto no peito, náuseas, vômitos, calafrios, dor nas 5 costas, dor no peito, cãibras musculares, apreensão ou convulsões, alterações da pressão arterial e reações anafiláticas ou resposta de hipersensibilidade grave. Tipicamente, uma faixa de doses e frequências de dosagem diferentes são administradas sob estudos de segurança e 10 tolerabilidade para avaliar o efeito de aumentar ou diminuir as concentrações de imunoglobulina e/ouhialuronidase na dose.
H. MÉTODOS DE TRATAMENTO E USOS TERAPÊUTICOS
As co-formulações IG/hialuronidase aqui descritas 15 podem ser utilizadas no tratamento de qualquer condição para a qual a imunoglobulina é empregada. Imunoglobulina (IG) pode ser administrada por via subcutânea em co- formulações com hialuronidase, para tratar qualquer condição que pode ser alterada ao tratamento com 20 imunoglobulina. Esta seção fornece usos terapêuticos exemplares das co-formulações de IG/hialuronidase. Entende- se que as co-formulações de IG/hialuronidase aqui proporcionadas podem ser usadas em métodos, processos ou usos no tratamento de qualquer uma das doenças e condições 25 descritas abaixo, e outras doenças e condições conhecidas de um perito na técnica que são tratáveis por IG. Em particular, a administração subcutânea das co-formulações é contemplada. As dosagens de IG administrada é a mesma ou similar à dosagem administrada por via intravenosa e 30 conhecida para um perito na técnica. O regime de dosagem e a frequência podem variar de regimes intravenosos, como descrito neste documento. Os usos terapêuticos descritos abaixo são exemplares e não limitam as aplicações dos métodos aqui descritos.
Por exemplo, as co-formulações aqui proporcionadas podem ser usadass para tratar as deficiências imunológicas, tais como deficiências imunológicas primárias, tais como agamaglobulinemia ligada ao X, hipogamaglobulinemia, e condições imunidade comprometida adquirida (deficiências imunológicas secundárias), tais como aquelas que caracterizam os níveis de anticorpos baixos; doenças inflamatórias e autoimunológicas, e infecções agudas. Usos terapêuticos incluem, mas não estão limitados à terapia de substituição de imunoglobulina e terapia de imunomodulação para vários imunológicos, hematológicos, neurológicos, inflamatórias, dermatológicos e/ou doenças e condições infecciosas. Em alguns exemplos, a imunoglobulina é administrada para aumentar a resposta imunológica em pacientes saudáveis, tais como, seguindo a exposição possivel para doença infecciosa (por exemplo, ferimentos acidentais causado por agulha). Co-formulações de IG aqui proporcionadas também podem ser utilizadas para tratar a esclerose múltipla (especialmente esclerose múltipla recorrente-remitente ou RRMS), doença de Alzheimer e doença de Parkinson. Está dentro da perícia de um médico do tratamento para identificar tais doenças ou condições.
As co-formulações imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas em combinação com outros agentes usados no tratamento destas doenças e condições. Por exemplo, outros agentes que podem ser administrados incluem, mas não estão limitados aos antibióticos, quimioterapêuticos, anti-inflamatórios, anti-inflamatórios não-esteroidal, e outros agentes imunomoduladores, tais como as citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento.
Se necessário, uma dosagem particular e duração e protocolo de tratamento pode ser determinado empiricamente ou extrapolado. Por exemplo, as doses exemplares de imunoglobulina administrada por via intravenosa pode ser 5 utilizada como um ponto de partida para determinar as dosagens adequadas. Os niveis de dosagem podem ser determinados com base numa variedade de fatores, tais como peso do corpo do indivíduo, saúde geral, idade, a atividade do composto especifico empregue, sexo, dieta, tempo de 10 administração, taxa de excreção, combinação de fármacos, a gravidade e curso da doença, e disposição do paciente para a doença e o julgamento do médico de tratamento. Exemplos de dosagens de imunoglobulina e hialuronidase são fornecidas neste documento. Entende-se que a quantidade 15 para administrar será uma função da indicação tratada, e os possíveis efeitos secundários que serão tolerados. As dosagens podem ser empiricamente determinadas utilizando modelos reconhecidos para cada distúrbio.
Após a melhoria da condição de um paciente, uma 20 dose de manutenção de imunoglobulina pode ser administrada por via subcutânea em combinação com hialuronidase, se necessária, e a dosagem, a forma de dosagem, ou frequência de administração, ou uma combinação pode ser modificada. Em alguns casos, um sujeito pode necessitar de tratamento 25 intermitente numa base a longo prazo sobre qualquer recorrência dos sintomas da doença.
1. Imunodeficiência Primária e Secundária a. Imunodeficiência Primária
Mais de 80 doenças de deficiência imunológica 30 primáris são reconhecidas pela Organização Mundial da Saúde e ocorre em cerca de 1 em 10.000 indivíduos. Estas doenças são caracterizadas por um defeito intrínseco no sistema imunológico em que, em alguns casos, o organismo é incapaz de produzir quaisquer ou suficientes anticorpos contra a infecção. Em outros casos, as defesas celulares para combater a infecção não funciona corretamente. A imunoglobulina pode ser usada para tratar a deficiência imunológica primária com a deficiência de anticorpo. Assim, a imunoglobulina pode ser administrada como terapia de substituição de imunoglobulina para pacientes com estas doenças.
Tipicamente, deficiências imunológicas primárias são distúrbios herdados. Exemplos de deficiências imunológicas primárias incluem, mas não estão limitados à deficiência imunológica variável comum (CVID), deficiência seletiva de IgA, deficiência de subclasses de IgG, agamaglobulinemia ligada ao X (XLA), deficiência imunológica combinada grave (SCID), distúrbios do complemento, ataxia telangiectasia , hiper IgM, e sindrome de Wiskott-Aldridge. As co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea para pacientes com doenças de deficiências imunológicas primárias com deficiência de anticorpos em doses similares às doses utilizadas para administração intravenosa de imunoglobulina. Doses exemplares incluem, por exemplo, entre 100 mg/kg de PC e 800 mg/kg de globulina imunológica PC, em intervalo de quatro semanas. A dose pode ser aumentada ou diminuída, uma vez que pode a frequência das doses depender da resposta clinica.
b. Imunodeficiência Secundária
Imunodeficiência secundária, ou adquirida, não é o resultado de anormalidades genéticas hereditárias, mas sim ocorre em indivíduos, nos quais o sistema imunológico é comprometido por fatores externos do sistema imunológico. Os exemplos incluem, mas não estão limitados à trauma, vírus, quimioterapia, toxinas, e poluição. Sindrome da imunodeficiência adquirida (SIDA) é um exemplo de um distúrbio de deficiência imunológica secundária causada por um virus, o virus da imunodeficiência humana (HIV), em que uma depleção de linfócitos T torna o corpo incapaz de 5 combater a infecção.
Outro exemplo, hipogamaglobulinemia, é causada por uma falta de linfócitos B, é caracterizada por níveis baixos de anticorpos no sangue, e pode ocorrer em pacientes com leucemia linfocítica crónica (CLL), mieloma múltiplo 10 (MM), linfoma não-Hodgkin (NHL) e outras doenças malignas relevantes, como resultado tanto de disfunção imunológica relacionada à leucemia e imunossupressão relacionada com terapia. Os pacientes com hipogamaglobulinemia adquirida secundária para tais doenças malignas hematológicas, e 15 aqueles pacientes que recebem transplante de célula tronco pós-hematopoiética são suscetíveis às infecções bacterianas. A deficiência na imunidade humoral é largamente responsável pelo aumento do risco de morbidade relacionada com infecção e mortalidade nestes pacientes, 20 especialmente por micro-organismos encapsulados. Por exemplo, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, e Staphylococcus aureus, bem Como Legionella e Nocardia spp. são frequentes patogenos de bactérias que causam pneumonia em pacientes com LLC. Infecções oportunistas, 25 tais como Pneumocystis carinii, fungos, vírus, e micobactérias também têm sido observadas. O número e gravidade das infecções nestes pacientes pode ser significativamente reduzidos pela administração de imunoglobulina (Griffiths et al. (1989) Blood 73:366-368; Capela et al. (1994) Lancet 343:1059-1063).
Portanto, as co-formulações imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea em tais pacientes para prevenir infecções recorrentes. Dosagens exemplares incluem aquelas usadas para a administração intravenosa de imunoglobulina para pacientes com hipogamaglobulinemia adquirida secundária a malignidades hematológicas. Por exemplo, as co-formulações contendo cerca de 400 mg/kg PC de imunoglobulina podem ser administradas por via subcutânea a cada 3 a 4 semanas. Num exemplo adicional, uma dose adicional de 400 mg/kg de peso corporal pode ser administrada no primeiro mês de terapia nos casos em que o IgG soro do paciente é inferior a 4 g/L. A quantidade de imunoglobulina administrada, bem como a frequência das doses, podem ser aumentadas ou diminuídas, conforme apropriado.
2. Doenças inflamatórias e autoimunológicas a. Doença de Kawasaki
A doença de Kawasaki é uma doença aguda, febril, doença do multi-sistema das crianças e lactentes jovens, muitas vezes envolvendo as artérias coronárias. Ela também é conhecida como sindrome do linfonodo, doença do nó mucocutâneo, poliarterite infantil e sindrome de Kawasaki. A doença de Kawasaki é um pouco compreendida, vasculite auto-limitada que afeta muitos órgãos, incluindo a pele, membranas de mucosas, os nódulos linfáticos, as paredes dos vasos sanguíneos, e do coração. Aneurisma da artéria coronário pode ocorrer a partir da segunda semana da doença durante a fase de convalescença. Embora a causa da condição seja desconhecida, há evidências de que os resultados vasculite característicos de uma reação imunológica caracterizada por células T e ativação de macrófagos para um antigeno desconhecido, a secreção de citocinas, hiperatividade de células B policlonais, e a formação de auto-anticorpos para células endoteliais e células musculares lisas. Em indivíduos geneticamente susceptíveis, um ou mais agentes infecciosos descaracterizados comuns, possivelmente com atividade de super-antigeno, podem desencadear a doença.
A imunoglobulina administrada no início da doença de Kawasaki pode impedir patologia da artéria coronária. A administração subcutânea da co-formulações imunoglobulina/hialuronidase para pacientes com inflamação contínua associada com a doença de Kawasaki pode melhorar os sintomas. Dosagens exemplares incluem aquelas usadas para a administração intravenosa de imunoglobulina para pacientes com doença de Kawasaki. Por exemplo, a um paciente com doença de Kawasaki pode ser administrada cerca de 1-2 g/kg peso corporal do paciente de imunoglobulina. Esta pode ser administrada, por exemplo, em quatro doses de 400 mg/kg PC durante quatro dias consecutivos. Em um outro exemplo, 1 g/kg de imunoglobulina PC é administrado como uma dose única durante um período de 10 horas. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou diminuída, conforme apropriado.
b. Polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica
Polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (PDIC) é um distúrbio neurológica caracterizado por fraqueza progressiva e função sensorial prejudicada nas pernas e braços. O distúrbio, o qual é por vezes chamado de polineuropatia reicidente crônica, é causado por uma lesão da bainha de mielina dos nervos periféricos. Embora possa ocorrer em qualquer idade e em ambos os sexos, PDIC é mais comum em adultos jovens e em homens mais do que mulheres. Muitas vezes apresenta-se com sintomas que incluem formigamento ou dormência (início nos dedos dos pés e dedos), fraqueza nos braços e pernas, perda de reflexos profundos (arreflexia), fadiga e sensações anormais. CIDP está intimamente relacionado com sindrome de Guillain-Barré e é considerado o homólogo crônico da doença aguda. Não há nenhum teste de diagnóstico especifico, mas descobertas clinicas e laboratoriais características ajudam a distinguir esta doença de outras sindromes neuropáticas mediadas por imunológicas. Estudos indicam que o tratamento com imunoglobulina reduz os sintomas (van Schaik et al. (2002) Lancet Neurol. 1:497-498). Assim, as co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea a pacientes presentes com CIDP utilizando os métodos aqui descritos. Dosagens exemplares incluem aquelas utilizadas para a administração intravenosa de imunoglobulina para pacientes com CIDP. Em um exemplo, um paciente com CIDP é administrado cerca de 2 g/kg de peso corporal de imunoglobulina por via subcutânea, em combinação com hialuronidase. Esta pode ser administrada, por exemplo, em cinco doses de 400 mg/kg de peso corporal, durante cinco dias consecutivos. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou diminuida, conforme apropriado.
c. Sindrome de Guillain-Barré
Sindrome de Guillain-Barré é um distúrbio neurológico auto-imunológica que envolve desmielinização inflamatória dos nervos periféricos. Os primeiros sintomas incluem vários graus de fraqueza ou sensações de formigamento nas pernas, que podem se espalhar para os braços e parte superior do corpo. Estes sintomas podem aumentar em intensidade até que os músculos não possam mais ser usados e o paciente é quase totalmente paralisado, resultando numa condição com risco de vida. Embora a recuperação é geralmente boa ou completa na maioria dos pacientes, incapacidade persistente tem sido relatada em cerca de 20% de todos os pacientes, e morte em 4 a 15% dos pacientes. Sindrome de Guillain-Barré pode ocorrer alguns dias ou semanas após os sintomas de uma infecção respiratória ou gastrointestinal viral. Em alguns casos, cirurgia ou vacinas podem desencadear a sindrome. O distúrbio pode desenvolver-se ao longo de horas ou dias, ou pode levar até 3 a 4 semanas. O teste de velocidade de condução nervosa (NCV) pode dar algumas pistas médicas para auxiliar o diagnóstico. Em alguns casos, um grampo espinal pode ser usado para o diagnóstico, uma vez que o fluido cerebrospinal em pacientes de Guillain-Barré, tipicamente, contém mais proteinas do que os individuos normais.
Embora não haja nenhuma cura conhecida para a sindrome de Guillain-Barré, o tratamento com imunoglobulina pode diminuir a gravidade da doença e acelerar a recuperação. As co-formulações imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea aos pacientes em uma dose apropriada de IG, tal como, por exemplo, uma dose semelhante à dose utilizada para administrar a imunoglobulina intravenosa aos pacientes com sindrome de Guillain-Barré. Por exemplo, um paciente com sindrome de Guillain-Barré pode ser administrado com cerca de 2 g/kg de peso corporal de imunoglobulina, em combinação com hialuronidase, por via subcutânea. Esta pode ser administrada, por exemplo, em cinco doses de 400 mg/kg de peso corporal, durante cinco dias consecutivos. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou diminuida dependendo, por exemplo, da gravidade da doença e da resposta clinica para a terapia, as qual podem ser prontamente avaliadas por um perito na técnica.
d. A púrpura trombocitopénica idiopática
Púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), também conhecida como púrpura trombocitopénica imunológica primária e púrpura trombocitopénica autoimunológica, é uma redução na contagem de plaquetas (trombocitopenia) resultante da sobrevivência de plaquetas encurtadas devido aos anticorpos anti-plaquetas. Quando a contagem de plaquetas está muito baixa (por exemplo, <30 x 109/L) , hemorragias na pele (púrpura) e das membranas mucosas podem ocorrer. produção de plaquetas na medula osséa (megacariopoiese) em pacientes com ITP é morfologicamente normal. Em alguns casos, há comprometimento adicional da função plaquetária relacionada com a ligação do anticorpo às glicoproteinas na superfície das plaquetas. ITP pode se apresentar como formas crônicas e agudas. Aproximadamente 80% dos adultos com ITP têm a forma crônica da doença. A maior incidência de ITP crônico é em mulheres com idade entre 15-50 anos, embora alguns relatos sugerem que a incidência aumenta com a idade. ITP é relativamente comum em pacientes com HIV. Enquanto ITP pode ser encontrado em qualquer fase da infecção, a sua prevalência aumenta com o avanço da doença pelo HIV.
Estudos têm demonstrado que a imunoglobulina pode ser usada para tratar pacientes com ITP (Godeau et al. (1993) Blood 82 (5) 1415-1421; Godeau et al. (1999) Br. J. Haematol. 107 (4 ): 716-9) . As co-formulações imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea aos pacientes de uma dose de IG semelhante à dose utilizada para administrar a imunoglobulina intravenosa para tratar pacientes com ITP. Por exemplo, a um paciente com ITP pode ser administrado cerca de 1 a 2 g/kg de peso corporal de imunoglobulina, em combinação com hialuronidase, por via subcutânea. Isto pode ser administrada ao longo de vários dias, ou pode ser administrada em uma dose. Em alguns exemplos, cinco doses de 400 mg/kg PC de imunoglobulina em dias consecutivos são administradas. Em um outro exemplo, 1 g/kg de peso corporal de imunoglobulina é administrada durante 1-2 dias consecutivos, dependendo da contagem de plaquetas e da resposta clínica. A quantidade de imunoglobulina administrada, bem como a frequência das doses, pode ser aumentada ou diminuída dependendo, por exemplo, da contagem de plaquetas e da resposta clinica para a terapia, a qual pode ser prontamente avaliada por um perito na técnica.
e. Miopatias inflamatórias
Miopatias inflamatórias são um grupo de doenças musculares envolvendo a inflamação e degeneração de tecidos musculares esqueléticos. Estas doenças adquiridas, todas presentes com fraqueza muscular significativa e na presença de uma resposta inflamatória dentro do músculo.
i. Dermatomiosite
Dermatomiosite (DM) é a mais facilmente reconhecida das miopatias inflamatórias, devido à sua erupção cutânea característica, que ocorre como uma erupção cutânea, desigual escuro, avermelhado ou lilás nas pálpebras, bochechas e ponte do nariz, e no tórax, costas ou superior , cotovelos, joelhos e dedos. Em alguns pacientes, nódulos calcificados ou inchaços endurecidos desenvolvem sob a pele. A erupção, geralmente, precede a fraqueza muscular, a qual geralmente se desenvolve ao longo de um período de semanas, mas pode desenvolver ao longo de meses ou mesmo em dias. Dermatomiosite pode ocorrer em qualquer idade a partir da infância à idade adulta, e é mais comum em mulheres que homens. Aproximadamente um terço dos pacientes com DM relatam dificuldade para engolir. Mais de 50% das crianças com DM se queixam de dores musculares e de sensibilidade, enquanto isto ocorre geralmente em menos de 25% dos adultos com DM.
ii. Polimiosite
Polimiosite (PM) não tem a característica da erupção cutânea de dermatomiosite, e o aparecimento de fraqueza muscular, geralmente, progride mais lento do que a DM. Muitos pacientes portadores de MP se apresentam com dificuldade em engolir. Em alguns casos, os pacientes também têm dificuldade em respirar devido a uma falha do músculo. Tanto quanto um terço dos pacientes de PM tem dor muscular. A doença afeta mais mulheres do que homens, e raramente afeta as pessoas com idade inferior a 20, embora os casos da infância e da polimiosite infantil têm sido relatados.
iii. Miosite do corpo de inclusão
Miosite corporal de inclusão (IBM) é muito semelhante à polimiosite. O início da fraqueza muscular na IBM é, geralmente, muito gradual, ocorrendo ao longo de meses ou anos. Ela difere da PM, em que o músculo proximal e o músculo distai são afetados, embora geralmente apenas os músculos proximais são afetados na PM. As descobertas típicas incluem fraqueza dos flexores do punho e flexores dos dedos. Atrofia dos músculo de antebraços e do quadrícepes é característica da doença, com graus variados de fraqueza nos outros músculos. Aproximadamente metade dos pacientes que sofrem com a IBM tem dificuldade em engolir. Os sintomas da IBM, geralmente, começam depois dos 50 anos, embora nenhum grupo etário está excluído. IBM ocorre mais frequentemente em homens do que mulheres. Cerca de um em cada dez casos da IBM pode ser hereditária.
Estudos indicam que a administração de imunoglobulina pode beneficiar pacientes com essas miopatias inflamatórias. A imunoglobulina pode melhorar a força muscular, reduzir a inflamação e reduzir a progressão da doença e gravidade (Dalakas et al. (1993) N. Engl. J. Med. 329 (27)1993-2000; Dalakas et al. (2001) Neurology 56 (3):323-7; Dalakas (2004) Pharmacol Ther 102 (3): 177-93; Walter et al. (2000) J. Neurol. 247 (1) :22-8) . As co- formulações imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea aos pacientes com DM, PM ou IBM em uma dose de IG semelhante à dose utilizada para administrar a imunoglobulina intravenosa. Por exemplo, 2 g/kg de peso corporal de imunoglobulina pode ser administrada, tipicamente ao longo de vários dias, tais como, por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg de peso corporal em dias consecutivos.
f. Lambert-Eaton Sindrome Miastênica
Sindrome miastênica Lambert-Eaton (LEMS) é uma doença auto-imunológica rara da transmissão neuromuscular, clinicamente reconhecida pela primeira vez em associação com o câncer de pulmão e, posteriormente, nos casos em que não foi detectada neoplasia. Os pacientes com LEMS têm um defeito de junção neuromuscular pré-sináptica. A doença é caracterizada clinicamente por fraqueza muscular proximal, com aumento da força após o exercicio, sinais oculomotores leves, reflexos do tendão profundos deprimidos e disfunção autonômica (boca seca, constipação, insuficiência erétil).
A administração subcutânea das co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase para pacientes com LEMS pode melhorar os sintomas. Exemplos de dosagens de IG nas co- formulações incluem aquelas utilizadas para a administração intravenosa de imunoglobulina para pacientes com LEMS. Por exemplo, um paciente com LEMS pode ser administrada com 2 g/kg de peso corporal de imunoglobulina sob várias doses. Por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg PC de imunoglobulina podem ser administradas em cinco dias consecutivos. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou diminuida, conforme apropriado.
g. Neuropatia Motora Multifocal
Neuropatia motora multifocal (MMN), com bloqueio de condução é uma neuropatia desmielinizante imunomediada adquirida com fraqueza lentamente progressiva, fasciculações e cãibras, sem o envolvimento sensorial significativo. A duração da doença antes do diagnóstico varia de vários meses a mais de 15 anos. A causa precisa de MMN é desconhecida. Estudos histopatológicos e eletrodiagnóstico demonstram a presença de lesão tanto desmielinizante quanto axonal. Os nervos motores são principalmente afetados, embora desmielinização leve tem sido demonstrada em nervos sensoriais também. A eficácia do tratamento imunomodulador e imunossupressor apoia ainda mais a natureza imunológica do MMN. TituaçÕes de anticorpos anti-GML são elevados em mais da metade dos pacientes com MMN. Embora o papel dos anticorpos anti-GML na doença seja desconhecido, a sua presença pode ser usada como um marcador de diagnóstico para MMN.
A administração subcutânea das co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase para pacientes com MMN pode melhorar os sintomas. Exemplos de dosagens de IG na co- formulações incluem aquelas utilizadas para a administração intravenosa de imunoglobulina para pacientes com MMN. Por exemplo, a um paciente com MMN pode ser administrada 2 g/kg de peso corporal de imunoglobulina sobre várias doses. Por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg PC de imunoglobulina podem ser administradas em cinco dias consecutivos. Em um outro exemplo, 1 g/kg de peso corporal pode ser administrado em 2 dias consecutivos. Alguns pacientes podem ser dados a terapia de manutenção, o que pode incluir, por exemplo, doses de 400 mg/kg de peso corporal a 2 g/kg de peso corporal, dada a cada 2-6 semanas. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou diminuída, conforme apropriado, tendo em conta a resposta do paciente.
h. Miastenia Gravis
Miastenia gravis (MG) é uma doença neuromuscular auto-imunológica crônica caracterizada por diversos graus de fraqueza dos músculos esqueléticos do corpo. Ela está associada com a presença de anticorpos para os receptores de acetilcolina (AChR) ou da quinase tirosina especifica do músculo (MuSK) na junção neuromuscular, embora alguns pacientes são anticorpos negativos. As características clínicas da MG incluem fraqueza flutuante e fadiga dos músculos voluntários, principalmente músculo elevador da pálpebra, extraocular, bulbar, músculos respiratórios e de membro. Os pacientes, geralmente, apresentam queda da pálpebra unilateral ou bilateral (ptose), visão dupla (diplopia), dificuldade em engolir (disfagia) e fraqueza muscular proximal. Fraqueza dos músculos respiratórios pode resultar em insuficiência respiratória nos casos mais graves, ou em exacerbações agudas graves (crise miastênica). Miastenia gravis ocorre em todos os grupos étnicos e ambos os sexos. Afeta mais comumente as mulheres adultas jovens com menos de 40 anos e homens com mais de 60 anos, mas pode ocorrer em qualquer idade. Em alguns casos, timectomia é realizada para reduzir os sintomas.
A imunoglobulina pode ser usada, por exemplo, como terapia de manutenção para pacientes com MG moderada a grave, tipicamente, quando outros tratamentos têm sido ineficazes ou causaram efeitos colaterais graves, e também pode ser administrada antes de uma timectomia ou durante exacerbação aguda da doença (miastênica crise). As co- formulações imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea aos pacientes com MG, utilizando os métodos aqui descritos. Exemplos de dosagens
de IG nas co-formulações incluem aquelas utilizadas para a administração intravenosa de imunoglobulina para pacientes com MG. Por exemplo, a um paciente com MG podem ser administradas doses de 400 mg/kg PC a 2 g/kg PC a cada 4-6 5 semanas da terapia de manutenção. Antes da timectomia ou durante a crise de miastênica, uma dose de 1-2 g/kg PC pode ser administrada ao longo de várias doses, tais como, por exemplo, cinco doses de 400 mg/kg de peso corporal durante cinco dias consecutivos. Em um outro exemplo, uma dose de 1 10 g/kg de peso corporal pode ser administrada em 2 dias consecutivos.
i. Sindrome de Moersch-Woltmann
A sindrome de Moersch-Woltmann, também conhecida como sindrome pessoa rígida (SPS) ou sindrome de homem 15 duro, é uma doença neurológica rara com características de uma doença auto-imunológica. Os pacientes apresentam sintomas relacionados com a rigidez muscular e espasmos episódicos superpostos. Rigidez muscular se espalha para envolver músculos axiais, principalmente, abdominais e 20 tóraco-lombar, bem como os músculos dos membros proximais. Normalmente, co-contração agonista do tronco e músculos antagonistas levam a uma aparência de bordo como a hiperlordose. Menos frequentemente, o envolvimento dos músculos respiratórios leva à dificuldade respiratória e 25 envolvimento do músculo facial a uma máscara similar facial.
O tratamento com imunoglobulina pode afetar a rigidez diminuída e os domínio de sensibilidade elevados em pacientes com sindrome Moersch-Woltmann (Dalakas et al. (2001) N. Engl. Med. J. 345(26)1870-6). As co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea a pacientes com sindrome de Moersch-Woltmann utilizando os métodos aqui descritos. Exemplos de dosagens de IG nas co-formulações incluem aqueles utilizados para a administração intravenosa de imunoglobulina para pacientes com sindrome de Moersch-Woltmann. Por exemplo, a imunoglobulina pode ser administrada em doses de 400 mg/kg PC em cinco dias consecutivos. Alguns pacientes podem ser dada a terapia de manutenção, o que pode incluir, por exemplo, l-2g/kg PC de imunoglobulina a cada 4-6 semanas. A quantidade de imunoglobulina administrada pode ser aumentada ou diminuída, conforme apropriado.
3. Infecções agudas
Imunoglobulina também tem sido demonstrada ter atividade antimicrobiana contra um número de infecções bacterianas, virais e fúngicas, incluindo, mas não se limitando a Haemophilus influenzae tipo B; de Pseudomonas aeruginosa tipos A e B; Staphylococcus aureus; streptococcus do grupo B; Streptococcus pneumoniae dos tipos 1, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 12, 14, 18, 19 e 23; tipos de adenovirus 2 e 5; citomegalovirus; virus Epstein-Barr VGA; virus da hepatite A; virus da hepatite B; virus-1 da herpes simplex; virus-2 da herpes simplex; influenza A; sarampo; parainfluenza tipos 1, 2 e 3; poliomielite; vírus varicela zoster; Aspergillus; e Candida albicans. Assim, co- formulações imunológicas de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea aos pacientes com infecções bacterianas, virais e fúngicas para intensificar o sistema imunológico do paciente e tratar a doença. Em alguns exemplos, antibióticos ou outros antimicrobianos também são administrados.
4. Outras Doenças e Condições
Exemplos de outras doenças e condições tratáveis por terapia IG e não descrito acima incluem, mas não estão limitados à imunodeficiência iatrogênica adquirida; deficiência de anticorpo específico; encefalomielite aguda disseminada; vasculite necrotizante sistémica ANCA- positiva, anemia hemolitica auto-imunológica; penfigóide bolhoso; penfigóide cicatricial; sindrome de Evans (incluindo anemia hemolitica auto-imunológica com 5 trombocitopenia imunológica), trombocitopenia aloimunológica feto-maternal/neonatal (FMAIT/NAIT), sindrome de hemofagocitica; transplante de células tronco hematopoiéticas alogênico de alto risco; neuropatia paraproteinémica de IgM; transplante renal; esclerose 10 múltipla; ataxia mioclonia opsoclonia; pênfigo foliáceo; pênfigo vulgar; púrpura pós-transfusional; necrólise epidérmica tóxica/sindrome de Steven Johnson (TEN/SJS); sindrome do choque tóxico, lúpus eritematoso sistêmico; mieloma múltiplo; sépsis; transplante de medula óssea; tumores de células B; e Doença de Alzheimer.
A doença de Alzheimer, por exemplo, inclui o tratamento com a imunoglobulina intravenosa (ver, por exemplo, Dodel et al. (2004) J. Neurol Neurosurg Psychiatry 75:1472-4; Solomon et al. (2007) Curr. Opin. Mol. Ther. 9:79-85; Relkin et al. (2008) Neurobiol Aging). IG contém anticorpos que se ligam a beta amilóide (AB) , o qual é um componente central da placa nos cérebros dos pacientes de Alzheimer. Assim, IG pode ajudar a promover a remoção de AB do cérebro e bloquiar os efeitos tóxicos AB nas células cerebrais. Assim, as co-formulações imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas por via subcutânea aos pacientes com doença de Alzheimer utilizando os métodos aqui descritos. Os sujeitos a serem tratados incluem pacientes com nivel leve, moderada ou 30 avançada da doença de Alzheimer. Está dentro do nivel de habilidade de um médico do tratamento identificar pacientes para o tratamento. As co-formulações de imunoglobulina/hialuronidase podem ser administradas a cada semana, cada duas semanas, ou uma vez por mês. O tratamento pode continuar ao longo de meses ou anos. As co-formulações podem ser administradas em doses de IG de ou entre 200 mg/kg do peso corporal a 2 g/kg do peso corporal por semana, ou a cada duas semanas, e geralmente pelo menos 200 mg/kg a 2 g/kg de peso corporal, pelo menos uma vez por mês. 0 tratamento com imunoglobulina pode efetuar um aumento nos níveis de anticorpos beta anti-amilóide em um paciente em relação aos níveis antes do tratamento.
I. Os artigos de fabricação e os kits
As composições farmacêuticas da co-formulações de imunoglobulina e a hialuronidase podem ser empacotadas como artigos de fabricação contendo material de embalagem, uma composição farmacêutica, a qual é eficaz para tratar uma doença ou condição tratável por IG, e um rótulo que indica que a composição é para ser usada para tratamento de doenças e condições tratáveis por IG. Exemplos de artigos de fabricação são recipientes, incluindo recipientes com uma única câmara e com câmara dupla. Os recipientes incluem, mas não estão limitados aos tubos, frascos e seringas. Os recipientes podem ainda incluir uma agulha para administração subcutânea.
Os artigos de fabricação aqui proporcionados contêm materiais de embalagem. Os materiais de embalagem para utilização em produtos de embalagem farmacêuticas são bem conhecidos dos peritos na técnica. Ver, por exemplo, Patente US Nos 5,323,907, 5,033,252 e 5,052,558, cada uma das quais é aqui incorporada na sua totalidade. Exemplos de materiais de embalagem farmacêutica incluem, mas não estão limitados às embalagens blister, frascos, tubos, inaladores, bombas, compartimentos, frascos, recipientes, seringas, garrafas, bem como qualquer material de embalagem adequado para uma formulação selecionada e modo pretendido de administração e tratamento. Uma grande variedade de formulações dos compostos e composições aqui proporcionadas é contemplada como uma grande variedade de tratamentos para qualquer doença ou condição tratáveis por IG.
As composições das co-formulações de imunoglobulina e hialuronidase solúvel também podem ser fornecidas como kits. Os kits podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para administração. Por exemplo, as composições podem ser fornecidas com um dispositivo para a administração, tal como uma seringa, um inalador, um copo de dosagem, um conta-gotas, ou um aplicador. O kit pode, opcionalmente, incluir instruções de aplicação, incluindo as dosagens, regimes de dosagem e instruções para modos de administração. Kits também podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para o diagnóstico. Por exemplo, tais kits podem incluir um item para medir a concentração a concentração, ou atividade de IG.
J. EXEMPLOS
Os seguintes exemplos são incluidos para fins ilustrativos apenas, e não se destinam a limitar o escopo da invenção.
Exemplo 1 Preparação de líquido Gammagard (Formulações 10% de imunoglobulina (IG))
Líquido Gammagard (10% IG) foi fabricado a partir de grandes quantidades de mistura do plasma humano, selecionado ao longo dos agentes infecciosos. Imunoglobulinas foram purificadas a partir de misturas de plasma usando um processo de fracionamento a frio etanol Cohn-Oncley modificado (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-467), bem como cromatografia de troca catiônica e aniônica (Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55). A proteína purificada foi ainda submetida a três etapas independentes de inativação/remoção virais: tratamento solvente/detergente (S/D) (Horowitz et al. (1994) Blood Coagul. Fibrin. 5(3)S21-S28; Kreil et al. (2003) Transfusion 43: 1023-1038), nanofiltração 35 nm (Hamamoto et al. (1989). Vox Sang. 56:230-236; Yuasa et al. (1991) J. Gen. Virol. 72:2021 -2024) , e uma incubação de pH baixo a temperaturas elevadas (Kempf et al. (1991) Transfusion 31:423-427Louie et al. (1994) Biologicals 22:13-19). O procedimento de S/D incluído tratamento com um mistura orgânica de tri-n-butil-fosfato, octoxinol-9 e polissorbato-80 a 18 a 25°C durante um mínimo de 60 minutos (Põlsler et al., (2008) Vox Sang. 94:184-192).
As preparações finais utilizadas nos estudos foram preparações 10% líquidas de anticorpos de imunoglobulina G (IG) altamente purificadas e concentradas formuladas em 0,25 mM de glicina em pH 4,6-5,1 (quando medido na solução concentrada). Glicina serve como um estabilizante e agente tamponante, e não houve adição de açúcares, sódio, ou conservantes. Todos os lotes de IG 10% (por exemplo, lotes LE12H020, LE12H062, LE12H173, LE12F047) foram substancialmente similares. A osmolalidade foi de 240-300 mOsmol/kg, a qual é semelhante à osmolalidade fisiológica. A distribuição das subclasses IG do produto fabricado de acordo com o processo descrito acima foi semelhante à do plasma normal: pelo menos 98% da preparação de proteína sendo IgG, a concentração de IgA média foi de 37 μg/mL (nenhum desses lotes tinha uma concentração de IgA de > 140 μg/mL) e IgM estava presente apenas em quantidades vestígiais. As funções de Fc e Fab foram mantidas. Atividade ativador pré-calicreína não foi detectável.
Exemplo 2 Preparação de SubQ NG 20% (20% IG) A. Produzir uma Composição IG Purificada e Concentrada a. resumo
Mistura de plasma previamente congelada de dadores de sangue foi separada em uma amostra de plasma de crio-pobre para o isolamento de vários fatores de coagulação em bruto e inibidores antes do fracionamento subsequente de álcool frio usando um procedimento de fracionamento modificado Cohn como descrito por Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55. O procedimento de fracionamento do álcool deu fração IG intermediária principal, referido como Precipitado G, o qual foi subsequentemente processado no produto final utilizando purificação cromatográfica. A fabricação jusante envolvido de troca catiônica (CM-Sefarose de fluxo rápido) e cromatografia de troca aniônica (ANX-Sefarose de fluxo rápido). Para fornecer uma elevada margem de segurança com relação à transmissão do virus em potencial, três etapas dedicadas de inativação/remoção de vírus, as quais complementam um ao outro no seu modo de ação, foram integrados no processo de fabricação, a saber: tratamento com solvente/detergente (mistura de Triton 1% X-100, 0,3% de fosfato de tri-n-butil e 0,3% de polissorbato-80), nanofiltração (Asahi Planova 35 nm), e armazenamento com baixo pH (4,7) durante 3 semanas a uma temperatura elevada.
b. Separação de Crioprecipitados
Misturas anteriormente congeladas de plasma de doadores de sangue, já verificadas para a segurança e a qualidade, foram descongeladas a uma temperatura não superior a 6°C. Centrifugação a frio foi realizada para separar sólidos e líquidos, aos quais foram formados a partir do plasma descongelamento. A porção liquida (também referida como "crio-plasma pobre", depois de proteinas insolúveis a frio foram removidas por centrifugação a partir de plasma descongelado fresco) foi então resfriada a 5 0 ± 1°C, e o seu pH foi ajustado para 7. 0 plasma crio- pobre foi utilizado para o isolamento de vários fatores de coagulação e inibidores bruto antes do fracionamento subsequente de álcool frio. Sete vias foram escoletadas para lote de adsorção de fatores de coagulação em bruto e 10 os inibidores do plasma crio-pobre antes da purificação SUBQ NG 20% são referidos como vias de 1 a 7 na Tabela 3. Tabela 3. Vias para a adsorção batelada de fatores de coagulação e inibidores a partir de plasma crio-pobre
Figure img0004
Para produção pré-clinica SÜBQ NG 20%, materiais de partida de Cohn derivados de vias 1 (plasma de origem EUA sem etapas de adsorção) , 3 (plasma de origem EUA após adsorção de FEIBA, AT-III) e 6 (plasma de origem EUA após adsorção de F-IX, F-VII, AT-III) foram escolhidos para cobrir uma ampla variedade de diferentes etapas de adsorção 20 antes do fracionamento de álcool. Vários processos de adsorção são descritos em Teschner et al. (2007) Vox Sang. 92:42-55; Polsler et al. (2008) Vox Sang. 94:184-192; Patente US Nos. 6,395,880 e 5,409,990, and Prothrombin complex: Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation (J.M. Curling Editor, Academic Press, 1980).
c. Fracionamento i. Obter sobrenadante de Fracionamento I
Enquanto o plasma foi sendo agitado, pré- resfriamento de etanol foi adicionado, a uma concentração alvo de 8% de etanol v/v, e a temperatura foi ainda reduzida para -2 a 0°C para permitir a precipitação. Sobrenadante (ou fracionamento I) foi coletado após centrifugação.
ii. Precipitado de Fracionamentos II e III
Fracionamento I foi ajustado a pH 7 e concentração de etanol 20 a 25% v/v, enquanto a temperatura foi ainda mais reduzida. Subsequentemente, a centrifugação foi realizada para o liquido separado (Fracionamento sobrenadante II + III) e sólido.
iii. Extração de Precipitado de Fracionamentos da II e III
Um tampão de extração a frio (5 mM de fosfato de sódio monobásico, 5 mM de acetato, pH 4,5 ± 0,2, condutividade de 0,7 a 0,9 mS/cm) foi utilizado para re- suspender fracionamentos II + III em uma razão de 1:15 de precipitado:tampão de extração. 0 processo de extração foi realizado em 2 a 8°C.
iv. Tratamento de Silica Fumada e Filtração
Silica fumada (por exemplo, Aerosil 380 ou equivalente) foi adicionada à suspensão a uma concentração de cerca de 40 g/kg de suspensão (ou equivalente a 1,8 g/L de plasma de crio-pobre) e foi misturada em 2 a 8 °C durante 50 a 70 minutos. Liquidos e sólidos foram separados por filtração em 2 a 8 °C usando um auxiliar de filtração (Hyflo Super-Cel, World Minerais Inc., 0,5 kg/kg de suspensão), seguido por pés-lavagem da prensa do filtro com extração de tampão.
v. Fracionamento do Precipitado G
O filtrado foi misturado com polissorbato-80 a uma concentração de cerca de 0,2% p/v, com agitação, durante pelo menos 30 minutos em 2 a 8 °C. Citrato de sódio di-hidratado foi, em seguida, misturado na solução a 8 g/L por mais 30 minutos de agitação de 2 a 8 °C. O pH foi então ajustado para 7,0 ± 0,1 com 1M de hidróxido de sódio ou 1 M de ácido acético. Álcool frio foi então adicionado à solução a uma concentração de cerca de 25% v/v, e uma etapa de precipitação semelhante ao Cohn II foi realizada (Cohn et al. (1946) J. Am. Chem. Soc. 68:459-467).
vi. Suspensão de Precipitado G e Tratamento com Solvente/Detergente
O precipitado foi dissolvido e filtrado com um filtro de profundidade de um tamanho nominal de poro de 0,2μm (por exemplo, filtro Cuno VR06 ou equivalente) para se obter um filtrado limpido que foi utilizado para o tratamento de solvente/detergente (S/D).
A primeira das etapas de inativação virai é tratamento S/D do precipitado re-suspenso G. A mistura de tratamento S/D continha 1,0% (v/v) de Triton X-100, 0,3% (v/v) de Tween-80, e 0,3% (v/v) de tri-n-butil-fosfato, e a mistura foi mantida a 18-25°C durante pelo menos 60 minutos.
d. Cromatografia de Troca Catiônica
A solução de proteína S/D contendo foi então passada através de uma coluna de troca catiônica (fluxo rápido de carboximetil de (CM)-Sefarose) para remover o solvente e o detergente. Após a lavagem de reagentes S/D, as proteínas absorvidas foram então eluídas com tampão de pH elevado de eluição (pH 8,5 ± 0,1).
e. Cromatografia de troca aniônica
O eluído foi em seguida ajustado para pH 6 e diluido para a condutividade apropriada antes da solução ser passada através da coluna equilibrada de troca aniônica 5 (fluxo rápido de ANX-Sefarose) . 0 fluxo através da coluna durante a carga e lavagem foi recolhido para posterior processamento.
f. Nanofiltração
No segundo das três etapas de inativação de 10 virus, o efluente da coluna a partir da última etapa foi nanofiltrada (filtro Asahi Planova 35nm) para gerar um nanofiltrado.
g. Ultrafiltração e Diafiltração
A concentração de glicina do nanofiltrado foi 15 ajustada para 0,25 M e o nanofiltrado foi ainda concentrado para uma concentração de proteina de 5 ± 1% p/v por ultrafiltração e pH foi ajustado para 5,2 ± 0,2. A fim de alcançar uma maior concentração de proteina para aplicação subcutânea, a ultrafiltração foi realizada em um cassete 20 com uma tela de canal aberto e membrana de ultrafiltração (Millipore Pellicon Biomax) com um corte de peso molecular nominal (NMWCO) de 50 kDa ou menos que foi especialmente concebido para os produtos de alta viscosidade.
O concentrado foi diafiltrado contra uma solução 25 de 0,25 M de glicina com um pH de 4,2±0,2. O volume de troca minimo era 10x o volume de concentrado original. Ao longo da operação de ultrafiltração/diafiltração, a solução foi mantida a 4-20°C. Depois de diafiltração, a solução foi concentrada até uma concentração de proteina de minimo de 30 22% p/v, e ajustada a 2 a 8°C.
A fim de recuperar a proteina completa residual no sistema, aumentando assim a concentração de proteina, a pós-lavagem do primeiro sistema de maior ultrafiltração foi
feita com pelo menos 2 vezes o volume morto no modo de recirculação a assegurar que toda a proteína foi lavada para fora. Em. seguida, a pós-lavagem do primeiro sistema de ultrafiltração foi concentrada para uma concentração de proteína de pelo menos 22% p/v com um segundo sistema de ultra/diafiltração equipado com o mesmo tipo de membrana que foi dimensionado 1/10 ou menos do primeiro. O concentrado de pós-lavagem foi adicionado à solução a granel. O segundo sistema de ultrafiltração foi então pós-lavado e a temperatura da solução foi ajustada para 2 a 8°C.
h. formulação
Para a formulação, a concentração de proteína da solução foi ajustada para 20,4 ± 0,4% p/v com. pós-lavagem do segundo sistema menor de ultrafiltração e/ou com tampão de diafiltração. O pH foi ajustado para 4,4-4,9, se necessário,
i. Esterilização Adicional
A solução volumosa formulada foi adicionalmente esterilizada por filtração através de um primeiro filtro de membrana com um tamanho de poro absoluto de 0,2 micron ou menos, em seguida, foi assepticamente dispensado para recipientes finais para a selagem, com amostras recoletadas para o ensaio. A última etapa de inativação de vírus/remoção foi realizada através do armazenamento dos recipientes fechados a 30 até 32°C durante 21 a 22 dias.
Assim, as formulações 20% IG resultantes foram altamente purificadas, formulações isotônicas líquidas de imunoglobulina (pelo menos 95% de gama globulina) formuladas em 0,25 mM de glicina a pH 4,4-4,9. Os preparativos finais utilizados nos estudos foram lotes SC00107NG, SC00207NG e SC00307NG.
B. Caracterização dos Lotes Pré-clinicos
Lotes pré-clínicos SC00107NG, SC00207NG, e SC00307NG foram fabricados na escala L 200 e caracterizados de acordo com a Tabela 4. No nível de grandes quantidades finais, a pureza da preparação foi ilustrada pelos baixos níveis de impurezas principais, as quais foram bem abaixo de 0,1% da IgG total. A distribuição do tamanho molecular (MSD) no produto de 20% IG na fase final do processo foi similar ao MSD de um recipiente final 10% de IG (Liquido Gammagard) . Isto indicou que o aumento da concentração de proteína de 20% não têm um impacto negativo sobre a integridade 5 da molécula de IgG. Tabela 4. Caracterização dos lotes SUBQ NG 20%
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Os critérios preliminares de liberação de recipients finais foram definidos em função das exigências das autoridades norte-americanas e europeias (FDA e EMEA) para imunoglobulinas 10 humanas por via subcutânea, as especificações do recipiente final do produto atual para a administração subcutânea (SUBCUVIA, licenciada para administração subcutânea na Europa ) e as especificações de líquidos Gammagard. Caracterização do espectro de anticorpo relevante dos três recipientes finais foi completada e comparada com 15 os resultados dos lotes pré-clínico 10% IG Triplo Virally reduzidos (TVR). A Tabela 5 compara os resultados da titulação de anticorpos e os fatores de enriquecimento dos três recipientes finais pré- clínicos SUBQ NG 20% e lotes pré-clínicos do líquido Gammagard. Os resultados estão na mesma ordem de grandeza para os dois lotes. Tabela 5. Comparação de SUBQ NG 20% e 10% IG TVR libertação de dados
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Testes de controle de qualidade adicionais foram realizados para avaliar o nível de produto e/ou impurezas relacionadas com processo. A Tabela 6 mostra os dados de controle de qualidade dos três recipientes finais SúbQ NG 20%. A remoção do produto e das impurezas associadas com processo é satisfatória, e todas as especificações relacionadas com o produto preliminar são preenchidas para todos os três lotes. Tabela 6. Testes de controle de qualidade de recipiente final SUBQ NG de 20%
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Parâmetros de processo monitorados durante a produção pré-clínica e a caracterização de intermediários e o produto final mostraram que não existiam diferenças óbvias detectáveis entre os três lotes. Todos os recipientes finais preencheram os produtos relacionados com as especificações preliminares, independentemente de qual tipo de que material de partida (Precipitate G VNELG171, VNELG173, ou LB0790301) foi escolhido.
C. Estudo de Armazenamento de Formulações de 20% IG
A fim de avaliar a estabilidade de armazenamento dos recipientes finais 20% IG, os 3 lotes pré-clínicos acima descritos (SC00107NG, SC00207NG, SC00307NG) e um lote de viabilidade (IgGSC 5 62/1) foram armazenados a 2-8°C e 28 a 30°C (lote de viabilidade apenas) durante até 18 meses. Cromatografia de exclusão por tamanho de alto desempenho foi utilizada para determinar a distribuição o tamanho molecular (MSD) e a estabilidade das amostras. O parâmetro indicando estabilidade principal é o tamanho molecular, e uma 10 alteração no tamanho pode ser o resultado da degradação por agregação de desnaturação, ou fragmentação. O MSD dos recipientes pré-clinicos finais após a armazenagem de 2 a 8 °C até 12 meses são mostrados na Tabela 7. Tabela 8 apresenta o MSD do lote de viabilidade, IgGSC 62/1, em 2 a 8 °C e 28 a 30°C, após armazenagem 15 até 18 meses. Os dados confirmaram que o produto está em conformidade com as especificações pré-definidas para os parâmetros investigados por até 18 meses de armazenamento a 2 a 8°C e 28 a 3°C. Tabela 7. MSD de lotes pré-clínicos 20% IG em 2 a 8°C
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Tabela 8. MSD de viabilidade do lote IgGSC 62/1 em 2 a 8°C e 28 a 30°C
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D. Estudos de Estabilidade de várias concentrações IG e Formulações
A estabilidade de armazenamento das formulações de alta concentração de proteinas (14-20%) com pH baixo (0,25 M de glicina pH 4,4 - 4,9) foi comparada com formulações de alta concentração de proteinas, com um pH neutro (22,5 g L glicina, 3 g/L de NaCl, pH 7,0), as quais são atualmente utilizadas para, imunoglobulinas injetáveis por via intramuscular ou subcutânea.
Todas as execuções começaram com a concentração do nanofiltrado à 5% de proteína. Uma troca de tampão 10x contra 0,15 M de glicina (concentração mais baixa de glicina investigada) foi realizada, seguida pela concentração final para um valor alvo acima de 20% de proteína usando uma membrana Millipore polietersulfona de 0,5m2 com um ponto de corte molecular de 30K (tela padrão). Os recipientes finais foram tanto formulados aunto armazenados em pH baixo (4,7) ou o armazenamento de pH baixo foi feito em grandes quantidades e depois foram formuladas a um pH neutro (7,0) antes do armazenamento ou em 2-8°C ou 28 para 30°C por 3 meses. Após 3 meses, a distribuição de tamanho molecular foi determinada por cromatografia de exclusão por tamanho de alto desempenho, a fim de determinar o teor de agregados e de fragmentos. Os critérios de aceitação foi definido como: monômeros e oligo-/dímeros, > 90%; agregados, <5%, fragmentos, <5%. Titulação ACA foi testada como descrito na Farmacopeia Europeia. Titulação ACA aceitável foi definida como menor que 50% de unidades CH50 consumidas por mg de proteína.
As Tabelas 9 e 10 mostram teor de agregados e fragmento bem como titulação ACA após 3 meses de armazenamento a 28 a 30°C e 2 a 8 °C, respectivamente, para as formulações padrões (pH 4,7, 0,25 M de glicina; ou pH 7,0, 22,5 g/L de glicina, 3 g/L de NaCl) com diferentes concentrações de proteína. Os dados mostram claramente que a formulação de pH baixo tinha agregados mais baixos e titulação ACA inferior após 3 meses de armazenamento a 28 a 30°C. Todas as titulações ACA das formulações em pH 7,0 foram acima do critério de aceitação definido para este teste.
Os resultados de 2 a 8°C confirmam a tendência observada em 28 a 30°C. As titulações ACA foram todas inferiores ao limite definido como critério de aceitação, embora as formulações em pH 7,0 parecem ter valores mais 5 elevados. O valor de proteína não influencia os resultados dos parâmetros testados. Tabela 9. Valores de Fragmento, Agregado, e ACA após 3 meses de armazenamento a 28 a 30°C, em pH 4,7 e pH 7,0 em diferentes concentrações de proteína
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Tabela 10. Valores de Fragmento, Agregado, e ACA após 3 meses de armazenamento a 2 a 8oC, em pH 4,7 e pH 7,0 em diferentes concentrações de proteína
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A influência dos procedimentos de conc;entraçãó diferentes sobre MSD e titulação ACA foi investigada. 0 15 procedimento utilizou pela primeira vez uma membrana
Millipore polietersulfona de 0,5 m2 com um corte molecular de 30K (tela padrão), como descrito acima, e o segundo procedimento utilizou uma membrana Millipore polietersulfona de 0,5 m com uma tela aberta, adequada para 20 soluções com viscosidade mais elevada. As frações pós- lavagem foram concentradas por um segundo dispositivo de ultra- /diafiltration com uma superficie inferior da membrana (0,1 m2 tela, aberto), a fim de reduzir as perdas de rendimento.
As Tabelas 11 e 12 mostram MSD e titulação ACA após 3 5 meses de armazenamento a 28 a 30°C ou 2 a 8°C, respectivamente, para um pH baixo (4,7) em formulações com concentrações diferentes de proteina. Os dados mostraram resultados semelhantes após 3 meses de armazenamento, para ambos os modos de concentração. Os valores obtidos em 2 a 8°C confirmaram os resultados obtidos em 28 a 30°C. O 10 método de concentração não influencia a estabilidade do produto, embora pós-lavagem adequada só pode ser obtida com membranas de tela aberta. Tabela 11. Valores de Fragmento, Agregado, e ACA após 3 meses de armazenamento a 28 a 30°C, em pH 4,7 com 15 diferentes métodos de concentração proteinas
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Tabela 12. Valores de Fragmento, Agregado, e ACA após 3 meses de armazenamento a 2 a 8°C, em pH 4,7 com diferentes métodos de concentração proteinas
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Exemplo 3 Preparação de PH20 Humana recombinante solúvel (rHuPH20) A. Geração de uma Linha Celular Expressando rHuPH20 Solúvel
O plasmideo HZ24 (representado em SEQ ID NO: 52) foi usado para transfectar o Ovário de Hamster Chinês (células CHO) (ver por exemplo, pedido Nos. 10,795,095, 11/065,716 e 11/238, 171). O vetor de plasmideo HZ24 para a expressão de rHuPH20 solúvel contém um esqueleto do vetor pCI (Promega), o DNA codificando os aminoácidos 1-482 de hialuronidase PH20 humana (SEQ ID NO: 49, um local de entrada interna ribossomal (IRES) a partir do virus ECMV (Clontech), e o gene reductase dihidrofolato (DHFR) do camundongo. 0 esqueleto do vetor pCI também inclui DNA codificando o gene de resistência a Beta-lactamase (AmpR), uma origem fl de replicação, uma região intensificadora/promotora precoce imediata ao citomegalovirus (CMV), um intron quimérico, e um sinal tardio de poliadenilação de SV40 (SV40) . O DNA codificando a construção de rHuPH20 solúvel contém um local Nhel, e uma sequência de consenso de Kozak antes do DNA codificando a metionina na posição do aminoácido 1 da sequência de sinal aminoácidos nativo na posição 35 de PH20 humana, e um códon de interrupção na sequência do DNA codificando a tirosina correspondente à posição do aminoácido 482 da hialuronidase PH20 humana (representada em SEQ ID NO: 1), seguida por um local de restrição BamHI. A construção pCI-PH20-IRES- DHFR- SV40pa (HZ24), portanto, resulta em uma espécies individuais de mRNA conduzidos pelo promotor de CMV que codifica os aminoácidos nas posições 1-482 de PH20 humana (representada em SEQ ID NO: 3) e os aminoácidos nas posições 1-186 de redutase dihidrofolato de camundongo (representada em SEQ ID NO: 53) , separadas pelo local de entrada interna ribossomal (IRES).
Células não transfectadas DG44 CHO crescendo em meio CD-CHO Modificado GIBCO para células DHFR(-), suplementado com 4 mM de glutamina e 18 mL/L Pluronic F68/L(Gibco), foram semeadas a 0,5 x 10e células/mL num frasco de agitação, em preparação para a transfecção. As células foram cultivadas a 37 °C em 5% de CO2 numa incubadora humidificada, com agitação a 120 rpm. Células CHO DG44 não transfectadas em crescimento exponencial foram testadas quanto à viabilidade antes da transfecção.
Sessenta milhões de células viáveis da cultura de células CHO DG44 não transfectadas foram sedimentadas e ressuspensas a uma densidade de 2xl07 células em 0,7 mL de 2x tampão de transfecção (2x HeBS: 40 mM Hepes, pH 7,0, 274 mM de NaCl, 10 mM KC1, 1,4 mM Na2HPO4, 12 mM de dextrose). Para cada aliquota de células ressuspensas, 0,09 mL (250 μg), do plasmideo HZ24 linear (linearizado por digestão durante a noite com Cia I (New England Biolabs) ) foi adicionado, e as soluções de célula/DNA foram transferidas para cubas de eletroporação 0,4 cm gap BTX (Gentronics) à temperatura ambiente. Um controle negativo de eletroporação foi realizado sem DNA de plasmideo misturado com as células. As misturas de célula/plasmideo foram eletroporadas com uma descarga de capacitor de 330 V e 960 μF ou a 350 V e 960 μF.
As células foram removidas das cubas após a eletroporação e transferidas para 5 mL de meios CD-CHO Modificados para células DHFR(-), suplementadas com 4 mM de glutamina e 18 mL/L Pluronic F68/L (Gibco), e deixadas crescer em uma cavidade de uma placa de cultura de tecido de 6 placas sem seleção durante 2 dias a 37 °C em 5% de CO2 em uma incubadora humidificada.
Dois dias após a eletroporação, 0,5 mL do meio de cultura de tecido foi removido de cada cavidade e testado para a presença de atividade de hialuronidase, utilizando o ensaio de microturvação descrito no Exemplo 4. Tabela 13. Atividade de hialuronidase inicial células CHO DG44 transfectadas de HZ24 em 40 horas após a transfecção
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As células de transfecção 2 (350V) foram coletadas a partir da cavidade de cultura de tecidos, contadas e diluidas em 1 x 104 para 2xl04 células viáveis por mL. Uma alíquota de 0,1 mL 10 da suspensão de células foi transferida para cada cavidade de cinco, placas de cultura de tecidos de fundo redondo de 96 cavidades. Cem microlitros de meios CD-CHO (GIBCO) contendo suplemento 4mM Glutamax™-1 (GIBCO™, Invitrogen Corporation) e sem suplementos de hipoxantina e timidina foram adicionados aos 15 poços contendo células (volume final de 0,2 mL). Dez clones foram identificados a partir das 5 placas cultivadas sem metotrexato. Tabela 14. Atividade hialuronidase de clones identificados
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Seis HZ24 clones foram expandidos em cultura e transferidos para frascos de agitação como suspensões de células únicas. Clones 3D3, 3E5, 2G8, 2D9, 1E11, e 4D10 foram plaqueadas em placas de fundo redondo de 96 cavidades de cultura de tecidos utilizando uma estratégia de diluição infinita bidimensional, em que as células foram diluidas 1:2 para baixo da placa, e 1:3 em toda a placa, partindo de 5000 células na cavidade lado superior esquerdo. Clones diluidos foram cultivados num fundo de 500 células CHO DG44 não-transfectadas por cavidade, para fornecer fatores de crescimento necessários para os dias iniciais em cultura. Dez placas foram feitas por subclone, com 5 placas contendo 50 nM de metotrexato e 5 placas sem metotrexato.
Clone 3D3 produziu 24 subclones visuais (13 a partir do tratamento sem metotrexato, e 11 a partir do tratamento com metotrexato 50 nM) . Atividade significativa de hialuronidase foi medida nos sobrenadantes a partir de 8 dos 24 subclones (> 50 Unidades/mL) , e esses 8 subclones foram expandidos em frascos cultura de tecidos de T-25. Clones isolados a partir do protocolo de tratamento metotrexato foram expandidos na presença de 50 nM de metotrexato. Clone 3D35M foi expandido em 500 nM de metotrexato dando origem aos clones que produzem em excesso de 1000 unidades/mL em frascos de agitação (clone 3D35M; ou Genl 3D35M). Um banco de células principal (MCB) das células 3D35M foi então preparado.
B. Produção e Purificação de PH20 Humana Genl a. Processo Biorreator de 5L
Um frasco de 3D35M foi descongelado e expandido a partir de frascos giratórios por meio de frascos giratórios contendo 1L em meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad Calif.) suplementado com 100 nM de metotrexato e GlutaMAX™-l (Invitrogen). As células foram transferidas a partir de frascos giratórios para um biorreator L5 (Braun) com uma densidade de inoculação de 4 x 105 células viáveis/mL. Parâmetros: ponto de ajuste de temperatura: 37°C; pH: 7,2 (ponto de ajuste de partida); ponto de ajuste de oxigênio dissolvido: 25%; e ar de sobreposição: 0-100 cc/min. Em 168 horas, 250 mL de Alimentação #1 no Meio (CD CHO com 50 g de 5 glicose/L) foi adicionada. Em 216 horas, 250 mL de Alimentação # 2 no Meio (CD CHO com 50 g/L de glicose e 10 mM de butirato de sódio) foi adicionada, e em 264 horas, 250 mL de Alimentação # 2 foi adicionada. Esse processo resultou em uma produtividade final de 1600 Unidades/mL com 10 uma densidade celular máxima de 6 x 106 células/mL. A adição de butirato de sódio aumentou dramaticamente a produção de rHuPH20 solúvel nas fases finais da produção.
O meio condicionado a partir do clone 3D35M foi clarificado por filtração profunda e diafiltração de fluxo 15 tangencial em 10 mM Hepes pH 7,0. RHuPH20 solúvel foi então purificada por cromatografia sequencial de troca iônica em Q Sefarose (Pharmacia), cromatografia de interação hidrofóbica em Fenil Sefarose (Pharmacia), fenil boronato (Prometics) e cromatografia de hidroxiapatite (Bio-Rad, 20 Richmond, CA). RHuPH20 solúvel ligada a Q-Sefarose e eluida em 400 mM de NaCl no mesmo tampão. O eluido foi diluído com sulfato de amónio 2M para uma concentração final de 500 mM de sulfato de amónio, e passado através de uma coluna de 25 Fenil Sefarose (sub baixo), seguido por ligar-se sob as mesmas condições a uma resina de boronato de fenil. A rHuPH20 solúvel foi eluida a partir da resina Fenil Sefarose em. Hepes pH 6,9, após lavagem, em pH 9,0 em 50 mM de bicina sem sulfato de amónio. O eluido foi carregado 30 numa resina de cerâmica de hidroxiapatite, em pH 6,9 em 5 mM de fosfato de potássio e 1 mM de CaCl2 e eluido com 80 mM de fosfato de potássio, pH 7,4 com 0,1 mM de CaCl2. rHuPH20 purificada resultante solúvel possuia uma atividade especifica em excesso de 65.000 USP Unidades/mg de proteina por meio do ensaio de microturvação (Exemplo 4) utilizando a referência USP padrão. rHuPH20 solúvel Purificada eluida como um pico único a partir de 24 a 26 minutos a partir de uma coluna Pharmacia 5RPC de divinilbenzeno estireno com um gradiente entre 0,1% TFA/H2O e 0,1% TFA%/90% acetonitrila/10 H2O e resolvido como um única banda larga de 61 kDa por SDS eletroforese, que reduziu uma banda kDa afiada 51 sob tratamento com PNGASE- F. Sequenciação N-terminal de aminoácidos revelou que o peptideo lider tinha sido eficientemente removido.
b. Processo de Expansão da Cultura Célula a montante em Cultura de Células biorreator 100L
Um processo em escala foi utilizado para purificar separadamente rHuPH20 solúvel a partir de quatro frascos diferentes de células 3D35M para produzir 4 lotes separados de rHuPH20 solúvel; HUA0406C, HUA0410C, HUA0415C e HUA0420C. Cada frasco foi separadamente expandido e cultivado por meio de um bioreator de 125L, em seguida, purificado usando cromatografia em coluna. As amostras foram tomadas ao longo do processo para avaliar os parâmetros, tais como o rendimento da enzima. A descrição do processo fornecido abaixo estabelece especificações adiante representativas para coisas como partida do biorreator e volumes de alimentação do meio, densidades celulares de transferência e lavagem e volumes de eluição. Os números exatos variam ligeiramente com cada lote, e são detalhados nas Tabelas 15 a 22.
Quatro frascos de células 3D35M foram descongelados em um banho de água a 37 °C, CD CHO contendo 100 nM de metotrexato e 40 mL/L Glutamax™-! foi adicionada e as células foram centrifugadas. As células foram ressuspensas em um frasco giratório de 125 mL com 20 mL de meio fresco e colocado em um 37 °C, incubadora CO2 a 7%. As células foram expandidas até 40 mL no frasco giratório de 125 mL. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 10 células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 125 mL em um volume de cultura de 100 mL. 0 frasco foi incubado a 37 °C, CO2 a 7%. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 106 células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 250 mL em 200 mL de volume de cultura, e o frasco foi incubado a 37 °C, CO2 a 7%. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 10s células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 1 L em 800 mL de volume de cultura e incubado a 37 °C, C02 a 7%. Quando a densidade celular atingiu 1,5- 2,5 x 106 células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 6 L em 5L de volume de cultura e incubada a 37 °C, CO2 a 7%. Quando a densidade celular atingiu 1,5-2,5 x 106 células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 36 L num volume de 20 L de cultura e incubada a 37C, C02 a 7%.
Um reator de 125 L foi esterilizado com vapor a 121®C, 137,90 KPa e 65 L de meios CD CHO foram adicionados. Antes da utilização, o reator foi verificado para a contaminação. Quando a densidade de células nos frascos giratórios de 36L atingiram 1,8 -2,5 x 106 células/mL, 20 L de cultura de células foi transferido do frascos giratórios de 36L para o bioreator de 125 L (Braun), resultando em um volume final de 85 L e uma densidade de de semente de cerca de 4 x 105 células/mL. Parâmetros foram: ponto de ajuste de 30 temperatura: 37°C; pH: 7,2; oxigênio dissolvido: 25% ± 10%; velocidade do impulsor: 50 rpm; vaso de pressão: 20,68 JKPa; aspersão de ar: 1 L/min; sobreposição de ar: 1 L/min. 0 reator foi testado diariamente para contagem de células, verificação de pH, análise do meio, produção de proteina e retenção. Alimentações de nutrientes foram adicionadas durante a operação. No Dia 6, 3,4 L de Alimentação # 1 no Meio (CD CHO + 50 g/L de glicose + 40 mL/L Glutamaxm-1) foi adicionada, e a temperatura da cultura foi alterada para 36,5°C. No dia 9, 3,5 L de Alimentação # 2 no Meio (CD CHO + 50 g/L de glicose + 40 mL/L Glutamax™-1 + 1,1 butirato de sódio g/L) foi adicionado, e a temperatura da cultura foi alterada para 36°C. No dia 11, 3,7 L de Alimentação # 3 no Meio (CD CHO + 50 g/L de glicose + 40 mL/L Glutamax™-! + 1,1 butirato de sódio g/L) foi adicionada, e a temperatura da cultura foi alterada para 35,5°C. O reator foi colhido aos 14 dias, ou quando a viabilidade das células caiu abaixo de 50%. 0 processo resultou na produção de rHuPH20 solúvel com uma atividade enzimática de 1600 Unidades/mL com uma densidade celular máxima de 8 milhões de células/mL. No colheita, a cultura foi testada para micoplasma, endotoxina, bioburden, e virus in vitro e in vivo, microscopia eletrônica de transmissão (TEM) para as partículas virais, e da atividade da enzima.
A colheita de cultura de células do bioreator de 100 L foi filtrada através de uma série de filtros de cápsula descartável possuindo um meio de poliéter sulfona (Sartorius): em primeiro lugar através de uma cápsula profunda de 8,0 μm, cápsula profunda de 0,65 μm, uma cápsula de 0,22 μm e, finalmente através de um filtro Sartopore 2000 cm2 e em um compartimento de armazenagem estéril de 100L. A cultura foi concentrada 10x utilizando dois TFF com filtros MWCO 30 kDa polietersulfona espirais (Millipore), seguida por uma troca de tampão 6x com 10 mM HEPES, 25 mM de NaaSOí, pH 7,0, em um filtro final 0,22μm dentro de compartimento de armazenamento estéril de 20 L. Tabela 15 fornece dados de monitoramento relacionados com cultura de células, colheita, concentração e etapas de troca de tampão. Tabela 15: Dados de monitoramento para cultura celular, colheita, concentração e etapas de troca de tampão
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Uma coluna de troca iônica AQ Sefarose (Pharmacia) (3 L de resina, Altura = 20 cm, diâmetro = 14 cm) foi preparada. As amostras de lavagem foram coletadas para a determinação do pH, condutividade e ensaio de endotoxina (LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de 10 mM Tris, 2 0 mM de Na2SO4, pH 7,5. A colheita diafiltrada e concentrada foi carregada na coluna de Q em taxa de fluxo de 100 cm/h. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de 10 mM de Tris, 20 mM de Na2SO4, pH 7,5 e 10 mM de Hepes, 50 mM de NaCl, pH 7,0. A proteina foi eluida com 10 mM de Hepes, 400 mM de NaCl, pH 7,0, e filtrada através de um filtro final 0,22μm para um compartimento estéril.
Cromatografia de interação hidrofóbica de Fenil Sefarose (Pharmacia) foi em seguida realizada. A Fenil Sefarose (PS) (9,1 L de resina, Altura = 29 cm, Diâmetro = 20cm) foi preparada. A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amónio, 0,1 mM de CaCl2, pH 7,0. 0 eluido da proteina a partir de cima foi suplementado com soluções de armazenamento de 2M de sulfato de amónio, 1M de fosfato de potássio e 1M de CaCl2 para concentrações finais de 5 mM, 0,5 M e 0,1 mM, respectivamente. A proteina foi carregada na coluna PS em uma taxa de fluxo de 100 cm/h. 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amónio e 0,1 mM de CaCl2, pH 7,0, foi adicionado a 100 cm/h. O fluxo de escoamento foi passado através de um filtro final 0,22μm para um compartimento estéril.
A proteína PS-purificada foi então carregada em uma coluna de boronato aminofenil (ProMedics) (6,3 L de resina, Altura = 20 cm, diâmetro = 20 cm) que tinha sido equilibrada com 5 volumes de coluna de 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amónio. A 5 proteina foi passada através da coluna a uma taxa de fluxo de 100 cm/h, e a coluna foi lavada com 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amónio, pH 7,0. A coluna foi, então, lavada com 20 mM de bicina, 100 mM de NaCl, pH 9,0, e a proteina eluida com 50 mM de Hepes, NaCl 100 mM, pH 6,9, através de um filtro estéril e dentro de 10 um compartimento estéril de 20 L. 0 eluido foi testado para a concentração de proteina biocarga, e a atividade enzimática.
Uma coluna de hidroxiapatite (HAP) (Bio-Rad) (1,6 L de resina, Altura = 10 cm, diâmetro = 14 cm) foi equilibrada com 5 mM de fosfato de potássio, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, pH 7,0. As 15 amostras de lavagem foram coletadas e testadas para pH, condutividade e endotoxina (ensaio de LAL). A proteína purificada de boronato de aminofenil foi suplementada com fosfato de potássio e CaCl2 para obter concentrações finais de 5 mM de fosfato de potássio e 0,1 mM de CaC12, em seguida, então, carregada na coluna de HAP em 20 uma taxa de fluxo de 100 cm/h. A coluna foi lavada com 5 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, então, 10 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2 pH. A proteína foi eluida com 70 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, e filtrada através de um filtro de 0,22μm em um compartimento 2 5 de armazenamento estéril de 5 L. O eluido foi testado para a biocarga, concentração de proteína, e a atividade enzimática.
A proteína HAP-purificada foi então bombeada através de um filtro de remoção 20 nM virai através de um reservatório sob pressão. A proteína foi adicionada ao tanque de pressão DV20 eo 30 filtro (Pali Corporation), passando através de uma filtro Ultipor DV20 com poros de 20 nm (Pali Corporation) em um compartimento de armazenagem estéril de 20 mL. O filtrado foi testado para a concentração de proteína, a atividade enzimática, perfil de oligossacarídeo, monossacarídeo e ácido siálico, e impurezas relacionadas com processo. A proteina no filtrado foi então concentrada até 1 mg/mL usando um Sistema (Sartorius) de filtração de fluxo tangencial (TFT) Slice Sartocon (MWCO) de corte de peso molecular de 10 kDa. 0 filtro foi primeiro preparado por lavagem com Hepes/solução salina (10 mM de Hepes, 130 mM de NaCl, pH 7,0) e do permeado foi experimetado para pH e condutividade, Seguindo a concentração, a proteina concentrada foi testada e testada para a concentração de proteina e a atividade enzimática. Uma. troca de 1.0 tampão 6x foi realizada na proteina concentrada para o tampão final: mM de Hepes, 130 mM de NaCl, pH 7,0. A proteina concentrada foi passada apesar de um filtro de 0,22μm em um compartimento de armazenamento estéril de 20 L. A proteina foi testada e testada para a concentração de proteina, a atividade enzimática, grupos sulfidril 15 livres, perfil de oligossacarídeo e osmolalidade.
As Tabelas 16 até 22 fornecem dados de monitoramento relacionados com cada uma das etapas de purificação descritas acima, para cada lote de células 3D35M. Tabela 16: Dados da coluna de Q sefarose
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Tabela 17: Dados da coluna de fenil sefarose
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Tabela 18: Dados da coluna de aminofenil boronato
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Tabela 19: Dados da coluna de hidroxiapatita
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Tabela 20: Dados da filtração DV20
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Tabela 21: Dados da concentração final
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Tabela 22: Dados da troca de tampão na formulação Final
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A proteína rHuPH20 solúvel purificada e concentrada foi assepticamente carregada em frascos estéreis com volumes de carga de 5 mL e 1 mL. A proteína foi passada através de um filtro de 0,22μm para uma bomba operadora controlada, a qual foi usada para encher os frascos utilizando uma leitura gravimétrica. Os frascos foram fechados com rolhas e fixados com tampas frisadas. Os frascos fechados foram inspecionados visualmente para partículas estranhas e, então, rotulados. Seguindo rotulagem, os frascos eram congelados instantaneamente por submersão em nitrogênio líquido para não mais de 1 minuto e armazenados a <- 15°C (-2Q ± 5°C).
C. Produção Células Gen2 contendo PH20 Humana Solúvel (rHuPH20)
A linha celular 3D35M Genl acima descrita foi adaptada para níveis mais elevados de metotrexato para produzir clones de geração de 2(Gen2). células 3D35M foram semeadas a partir do metotrexato estabelecido contendo culturas em meio CHO CD contendo 4mM Glutamax™-1 e 1,0 μM de metotrexato. As células foram adaptadas a um nível mais elevado de metotrexato por crescimento e passando estas 9 vezes ao longo de um período de 46 dias em uma temperatura de 37 °C, incubadora humidificada CO2 a 7%. A população amplificada de células foi clonada por diluição limitante em placas de cultura de tecidos de 96 cavidades contendo meio com 2, OμM de metotrexato. Após cerca de 4 semanas, os clones foram identificados e clone 3E10B foi selecionado para a expansão. As células 3E10B foram cultivadas em meio CD CHO contendo 4 mM Glutamax™-1 e 2,0 μM de metotrexato durante 20 passagens. Um banco de células principal (MCB) da linha de células 3E10B foi criado e congelado e usado para estudos posteriores.
Amplificação da linha de células continuou por realizar cultura de células 3E10B em meio CHO CD contendo 4 mM Glutamax™-1 e 4,0 μM de metotrexato. Após a décima segunda passagem, as células foram congeladas em frascos como um banco de células de pesquisa (RGB) . Um frasco da RCB foi descongelado e cultivado em um meio contendo 8,0 μM de metotrexato. Após 5 dias, a concentração de metotrexato no meio foi aumentada para 16,0 μM, em seguida, 20,0 μM em 18 dias mais tarde. As células a partir da oitava passagem em meio contendo 20,0 μM de metotrexato foram clonadas por diluição limitante em placas cultura de tecidos de 96 cavidades contendo meio CD CHO contendo 4 mM Glutamax™-! e 20,0 μM de metotrexato. Os clones foram identificados 5-6 semanas mais tarde e clone 2B2 foi selecionado para expansão em meio contendo 20,0 μM de metotrexato. Após a décima primeira passagem, as células 2B2 foram congeladas em frascos como um banco de células de pesquisa (RCB).
As células 2B2 resultantes são dihidrofolato redutase deficiente (dhfr-), células DG44 CHO que expressam PH20 humana solúvel recombinante (rHu.PH20) . A rHuPH20 solúvel está presente em células 2B2 em um número de cópias de cerca de 206 cópias/célula. Análise Southern blot de Spe I-, Xba I- e BamH I/Hind III-DNA de célula 2B2 genômica digerida utilizando uma rHuPH20 - sonda específica revelou o seguinte perfil de restrição de digestão: uma banda principal de hibridação de -7,7 kb e quatro pequenas bandas de hibridação (-13,9, -6, 6, -5,7 e -4,6 kb) com o DNA digerido com Spe I; uma banda principal de hibridação de -5,0 kb e duas pequenas bandas de hibridação (-13,9 e -6.5 5 kb) com DNA digerido com Xba I; e uma banda única de hibridação -1,4 kb observada utilizando DNA 2B2 digerido com BamH I/Hind III. A análise da sequência do transcrito de mRNA indicou que o derivado de cDNA (SEQ ID NO: 56) era idêntico à sequência de referência (SEQ ID NO: 49), exceto 10 por uma diferença de pares de bases na posição 1131, a qual foi observada ser uma timidina (T) em vez da citosina esperada (C) . Esta é uma mutação silenciosa, com nenhum efeito sobre a sequência de aminoácidos.
D. Produção de rHuPH20 Solúvel Gen2 em Cultura de 15 Células biorreator de 300 L
Um frasco de HZ24-2B2 foi descongelado e expandido a partir da rotação dos frascos através de frascos giratórios de 36L em meio CD-CHO (Invitrogen, Carlsbad, CA) , suplementados com 20μM de metotrexato e 20 Glutamax™-1 (Invitrogen). Resumidamente, o frasco de células foi descongelado em um banho de água a 37°C, meio foi adicionado e as células foram centrifugadas. As células foram ressuspensas em um frasco giratório de 125 mL com 20 mL de meio fresco e colocadas em uma incubadora a 37 °C, CO2 25 a 7%. As células foram expandidas até 40 mL no frasco giratório de 125 mL. Quando a densidade celular alcançou valor maior do que 1,5 x 106 células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 125 mL em um volume de cultura de 100 mL. 0 frasco foi incubado a 37°C, CO2 a 30 7%. Quando a densidade celular alcanço valor maior do que 1,5 x 106 células/mL, a cultura foi expandida para um fraco rotativo de 250 mL em 200 mL de volume de cultura, e o frasco foi incubado a 37 °C, C02 a 7%, Quando a densidade celular atingiu valor maior do que 1,5 x 106 células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 1L em 800 mL de volume de cultura, e foi incubada a 37 °C, CO2 a 7%. Quando a densidade celular atingiu valor maior do que 1,5 x 5 105 células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 6 L em 5000 mL de volume de cultura, e incubada a 37 °C, CO2 a 7%. Quando a densidade celular atingiu valor maior do que 1,5 x 10e células/mL, a cultura foi expandida para um frasco giratório de 36 L em volume de 10 32 L de cultura e incubada a 37 °C, CO2 a 7%.
Um reator de 400 L foi esterilizado e 230 mL de meio CD CHO foi adicionado. Antes do uso, o reator foi verificado para a contaminação. Cerca de 30 L de células foram transferidas a partir dos frascos giratórios 36L para 15 o bioreator de 400 L (Braun) com uma densidade de inoculação de 4,0 x 105 células viáveis por mL e um volume total de 260L. Parâmetros: ponto de ajuste de temperatura: 37°C; velocidade do impulsor 40-55 rpm; vaso de pressão: 20,68KPa; aspersão de ar:. 0,5-1,5 L/min; sobreposição de 20 ar: 3L/min. O reator foi testado diariamente para contagem de células, verificação de pH, análise de meio, produção de proteína e de retenção. Além disso, durante a operação alimentações de nutrientes foram adicionadas. Em 120 horas (dia 5), 10,4 L de Alimentação # 1 no Meio (4 x CD CHO + 33 25 g/L de glicose + 160 mL/L GlutamaxTM-1 + 83 mL/L com levedura + 33 mg/L rHuInsulin) foi adicionada. Em 168 horas (dia 7), 10,8 L de Alimentação # 2 no Meio(2x CD CHO + 33 g/L de glicose + 80 mL/L Glutamax™-! + 167 mL/L com levedura + 0,92 g/L de butirato de sódio) foi adicionada, e 30 a temperatura de cultura foi alterada para 36,5°C. Em 216 horas (dia 9), 10,8 L de Alimentação # 3 no Meio (1 x CD CHO + 50 g /L de glicose + 50 mL/L Glutamax™-1 + 250 mL/L com levedura + 1,80 g/L butirato de sódio) foi adicionada, e a temperatura de cultura foi alterada para 36°C. Em 264 horas (dia 11), 10,8 L de alimentação # 4 no Meio (lx CD CHO + 33 g /L de glicose + 33 mL/L Glutamax™-1 i 250 mL/L com levedura + 0,92 g/L de butirato de sódio) foi 5 adicionada, e a temperatura da cultura foi alterada para 35,5°C. A adição da alimentação nos meios foi observada aumentar dramaticamente a produção de rHuPH20 solúvel nas fases finais da produção. O reator foi colhido aos 14 ou 15 dias, ou quando a viabilidade das células caiu abaixo de 10 40%. O processo resultou em uma produtividade final de 17.000 Unidades/mL com uma densidade celular máxima de 12 milhões de células/mL. No momento da colheita, a cultura foi testada para micoplasma, endotoxina, biocarga e virai in vitro e in vivo, microscopia eletrônica de transmissão 15 (TEM) e a atividade da enzima.
A cultura foi bombeada por uma bomba peristáltica através de quatro módulos de sistema de filtração Millistak (Millipore), em paralelo, cada um contendo uma camada de terra diatomácea graduada para 4-8 μm e uma camada de terra 20 diatomácea graduada para 1,4-1,1 μm, seguido por uma membrana de celulose, então, através de um segundo sistema de filtração Millistak único (Millipore) contendo uma camada de terra diatomácea graduada para 0,4-0,11 μm e uma camada de terra de diatomáceas graduada para <0,1 μm, 25 seguida por uma membrana de celulose e, então através de um filtro final de 0,22 μm para um compartimento estéril flexivel de uso único com 350 litros de capacidade. O fluido de cultura de célula coletada foi suplementado com 10 mM de EDTA e 10 mM de Tris a um pH de 7,5. A cultura foi 30 concentrada 10x com um aparelho de filtração de fluxo tangencial (TFF) usando quatro filtros (Sartorious) de poliéter sulfona (PES) de corte de peso molecular (MWCO) de Sartoslice TFF 30 kDa, seguido por uma troca de tampão 10x com 10 mM de Tris, 20 mM Na2SO4, pH 7,5, em um filtro final de 0,22 μm em um compartimento estéril de armazenagem de 50 L.
A colheita diafiltrada e concentrada foi inativada para virus. Antes da inativação viral, uma solução de Triton X-100 a 10%, tri-n-butil fosfato (TNBP) a 3% foi preparada. A colheita diafiltrada e concentrada foi exposta a 1% de Triton X-100, 0,3% TNBP durante 1 hora em um vaso de reação de vidro de 36 L imediatamente antes da purificação na coluna Q.
E. Purificação da rHuPH∑O Solúvel Gen2
Uma coluna de troca iônica Q Sefarose (Pharmacia) (9L de resina, H = 29 cm, d = 20 cm) foi preparada. As amostras de lavagem foram coletadas para a determinação do pH, ensaio de condutividade e endotoxina (LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de 10 mM de Tris, 20 mM de Na2SO4, pH 7,5. Após inativação viral, a colheita diafiltrada e concentrada foi carregada na coluna de Q em uma taxa de fluxo de 100 cm/h. A coluna foi lavada com 5 volumes de coluna de 10 mM de Tris, 2 0 mM de Na2SO4, pH 7,5, e 10 mM de Hepes, 50 mM de NaCl, pH 7,0. A proteina foi eluida com 10 mM de Hepes, 400 mM de NaCl, pH 7,0, em um filtro final de 0,22μm em um compartimento estéril. A amostra eluida foi testada para a concentração de proteina, biocarga, e a atividade de hialuronidase. Leituras de absorvância A280 foram tomadas no início e no final da troca.
Cromatografia de interação hidrofóbica de Fenil Sefarose (Pharmacia) foi em seguida realizada. Fenil Sefarose (PS) (19-21 L de resina, H = 29 cm, D = 30 cm) foi preparada. A lavagem foi coletada e testada para pH, condutividade e endotoxina (ensaio de LAL) . A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amónio, 0,1 mM de CaCl2, pH 7,0. 0 eluido da proteina a partir da coluna de Q Sefarose foi suplementado com soluções de 2M de sulfato de amónio, 1M de fosfato de potássio e 1M de CaCl2 de reserva para se 5 obter concentrações finais de 5 mM, 0,5 M e 0,1 mM, respectivamente. A proteína foi carregada na coluna PS, com uma taxa de fluxo de 100 cm/h e a coluna de fluxo de escoamento coletada. A coluna foi lavada com 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amónio e 0,1 mM de 10 CaCl, pH 7,0, em 100 cm/h e a lavagem foi adicionada à ao fluxo de escoamento coletado. Combinado com a lavagem da coluna, o fluxo de escoamento foi passado através de um filtro final de 0,22μm para um compartimento estéril. O fluxo de escoamento foi testado para concentração de 15 proteína, biocarga, e a atividade enzimática.
Uma coluna de aminofenil boronato (ProMetic) foi preparada. A lavagem foi recolcoletada e testada para pH, condutividade e endotoxina (ensaio de LAL). A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de 5 mM de fosfato de 20 potássio, 0,5 M de sulfato de amónio. 0 fluxo de escoamento PS contendo proteína purificada foi carregado na coluna de aminofenil boronato a um taxa de fluxo de 100 cm/h. A coluna foi lavada com 5 mM de fosfato de potássio, 0,5 M de sulfato de amónio, pH 7,0. A coluna foi lavada com 20 mM de 25 bicina, 0,5 M de sulfato de amónio, pH 9,0. A coluna foi lavada com 20 mM de bicina, 100 mM de NaCl, pH 9,0. A proteína foi eluida com 50 mM de Hepes, 100 mM de NaCl, pH 6,9, e passada através de um filtro estéril para um compartimento estéril. A amostra eluida foi testada para a 30 concentração de proteína, biocarga, e a atividade enzimática.
A hidroxiapatite de coluna (HAP) (Bio-Rad) foi preparada. A lavagem foi coletada e testada para a condutividade, pH e endotoxina (ensaio de LAL) . A coluna foi equilibrada com 5 mM de fosfato de potássio, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2, pH 7,0. A proteina purificada em aminofenil boronato foi suplementada com concentrações 5 finais de 5 mM de fosfato de potássio e 0,1 mM de CaCl2, e carregada na coluna de HAP com uma taxa de fluxo de 100 cm/h. A coluna foi lavada com 5 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, 100 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2. A coluna foi lavada depois com 10 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, 100 10 mM de NaCl, 0,1 mM de CaCl2. A proteina foi eluida com 70 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, e passada através de um filtro estéril 0,22μm para um compartimento estéril. A amostra eluida foi testada para a concentração de proteina, biocarga, e a atividade enzimática.
A proteina purificada HAP foi então passada através de um filtro de remoção virai. O filtro Viosart esterilizado (Sartorius) foi primeiro preparado por lavagem com 2L de 70 mM de fosfato de potássio, pH 7,0. Antes da utilização, o tampão de filtrado foi testado para pH e 20 condutividade. A proteina purificada HAP foi bombeada através de uma bomba peristáltica através do filtro de remoção viral20 nM. A proteina filtrada em 70 mM de fosfato de potássio, pH 7,0, foi passada através de um filtro final de 0,22 μm para um compartimento estéril. A amostra virai 25 filtrada foi testada para a concentração de proteina, a atividade enzimática, perfis de oligossacarideo, monossacarideo e de ácido siálico. A amostra foi também testada para õ impurezas relacionadas com processo.
A proteina no filtrado foi então concentrada até 30 10 mg/mL utilizando sistema (Sartorius) de filtração de fluxo tangencial (TFF) Slice Sartocon(MWCO) de corte peso molecular de 10 KD. O filtro foi primeiro preparado por lavagem com 10 mM de histidiná, 130 mM de NaCl, pH 6,0, e o permeado foi testado para pH e condutividade. Após concentração, o concentrado de proteína foi testado para a concentração de proteína e a atividade enzimática. Uma troca de tampão 6x foi realizada na proteina concentrada 5 para o tampão final: 10 mM de histidina, 130 mM de NaCl, pH 6,0. Após troca de tampão, a proteína concentrada foi passada através de um filtro 0,22 μm em um compartimento de estéril armazenamento de 20 L. A proteína foi testada para a concentração de proteína, a atividade enzimática, grupos 10 sulfidril livres, perfil de oligossacarideos e osmolalidade.
A proteína estéril em grande quantidade filtrada foi então assepticamente dispensada em 20 mL em frascos Teflon estéril de 30 mL (Nalgene) . Os frascos foram então 15 congelado imediatamente e armazenado a -20 ± 5°C.
F. Comparação de Produção e Purificação de rHuPH20 Solúvel Genl e rHuPH20 Solúvel Gen2
A produção e purificação de rHuPH20 solúvel Gen2 em uma cultura de célula de bioreator de 300L continha 20 algumas alterações nos protocolos em comparação com a produção e purificação de rHuPH.20 solúvel Genl em uma cultura de célula de 100L de bioreator. Tabela 23 define diferenças diante exemlos, além de simples escalação de mudanças entre os métodos. Tabela 23: Comparação dos Métodos Gen 1 e Gen 2
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Exemplo 4 Determinação da Atividade de Hialuronidase rHuPH20 Solúvel, utilizando um Ensaio de Microturvação
Atividade de Hialuronidase de PH20 humana solúvel recombinante (rHuPH20) em amostras, tais como culturas de células, frações de purificação e soluções purificadas, foi determinada usando um ensaio turbidométrico, o qual se baseia na formação de um precipitado insolúvel quando o ácido hialurônico liga-se com albumina de soro. A atividade é medida através da incubação de rHuPH20 solúvel com hialuronato de sódio (ácido hialurônico) durante um periodo de tempo (10 minutos) e, então, precipitando o hialuronato de sódio não digerido com a adição de soro de albumina 5 acidificado. A turvação da amostra resultante é medida a 640 nm após um periodo de desenvolvimento de 30 minutos. A diminuição na turbidez resultante da atividade da enzima sobre o substrato de hialuronato de sódio é uma medida da atividade de hialuronidase rHuPH20solúvel. O método é 10 realizado utilizando uma curva de calibração gerada com diluições de um padrão referência de trabalho de ensaio rHuPH20 solúvel, e as medições de atividade de amostra são feitas em relação a esta curva de calibração.
Diluições da amostra foram preparadas em Soluções 15 Diluentes de Enzima. A Solução Diluente Enzima (EDS) foi preparada por dissolução de 33,0 ± 0,05 mg de gelatina hidrolisada em 25,0 mL de tampão de reação de 50 mM de PIPES (140 mM de NaCl, 50 mM PIPES, pH 5,5) e 25,0 mL de água estéril para irrigação (SWFI) , e diluindo 0,2 mL de 20 solução de albumina de soro humano a 25% na mistura e vortex durante 30 segundos. Isto foi realizado dentro de 2 horas de uso e armazenado em gelo até ser necessário. As amostras foram diluidas com EDS em um valor estimado 1-2 U/mL. Geralmente, a diluição máxima por etapa não excede 25 1:100 e o tamanho da amostra inicial para a primeira diluição não era inferior a 20μL. Os volumes minimos de amostra necessários para realizar o ensaio foram: Amostras em processo, Frações FPLC: 80μL; sobrenadantes de cultura de tecidos: 1 mL; material concentrado: 80μL; materiais 30 ttep purificado ou final 80μL. As diluições foram feitas triplicadas em uma placa de 96 cavidades de Ligação Baixa de Proteina, e 30 μL de cada diluição foi transferida para placas de fundo Optilux preto/claro (BD Biosciences).
As diluições de rHuPH20 solúvel conhecida com uma concentração de 2,5 U/mL foram preparadas em Solução Diluente de Enzima para gerar uma curva padrão e adicionado à placa Optilux triplicada. As diluições incluído 0 U/mL, 5 0,25 U/mL, 0,5 U/mL, 1,0 U/mL, 1,5 U/mL, 2,0 U/mL, e 2,5 U/mL. Cavidades de "Reagente em branco" que continham 60pL de Solução Diluente de Enzima foram incluídas na placa como um controle negativo. A placa foi então coberta e aquecida sobre um bloco de aquecimento durante 5 minutos a 37 °C. A 10 cobertura foi removida e a placa foi agitada durante 10 segundos. Após agitação, a placa foi retornada para o bloco de aquecimento e o Dispositivo de Manuseamento de Líquidos MULTIDROP 384 foi preparado com a solução de 0,25 mg/mL de hialuronato de sódio aquecida (preparada por dissolução de 100 mg de hialuronato de sódio (Lifecore Biomedical) em 20,0 mL de SWFI. Esta foi misturada por rotação suave e/ou balanço entre 2-8°C durante 2-4 horas, ou até estar completamente dissolvida. A solução de substrato foi preparada por mistura 9 mL SWFI, 10 mL PIPES e 1 mL de 5 20 mg/mL de hialuronato). A placa de reação foi transferida para o MULTIDROP 384 e a reação foi iniciada por pressionar a tecla de iniciar para distribuir 30μL de solução de substrato hialuronato de sódio em cada cavidade. A placa foi então removida da MULTIDROP 384 e agitada durante 10 25 segundos antes de ser transferida para um bloco de aquecimento com a cobertura da placa substituída. A placa foi incubada a 37°C durante 10 minutos.
O MULTIDROP 384 foi preparado para parar a reação por iniciação da máquina com sSolução de trabalho de soro 30 (25 mL da solução de armazenagem de soro [1 volume de soro de cavalo (Sigma) foi diluído com 9 volumes de solução tampão de 500 mM de acetato, pH 4,3, e o pH foi ajustado para 3,1 com ácido clorídrico] em 75 mL de solução tampão de 500 mM de acetato, pH 4,3) e mudando o ajuste de volume para 240μL. A placa foi removida a partir do bloco de aquecimento e colocada sobre o MULTIDROP 384, e 240 μL de solução de trabalho de soro foi dispensada para dentro das cavidades. A placa foi removida e agitada num leitor de placas durante 10 segundos. Após mais 15 minutos, a turbidez das amostras foi medida a 640 nm e a atividade de hialuronidase (em U/mL) de cada amostra foi determinada por meio de ajuste da curva padrão.
Atividade especifica (Unidades/mg) foi calculada dividindo a atividade de hialuronidase (U/mL) para concentração de proteina (mg/mL).
Exemplo 5 Efeito de cloreto de sódio na estabilidade de rHuPH20
A rHuPH20 estava em uma solução com pH 6,5 contendo 10 mg/mL em histidina/HCl e 130 μM de cloreto de sódio (NaCl) . Como mostrado na Tabela 24, um total de 6 diferentes formulações contendo os componentes seguintes foram preparados: 25 mM de Tris, pH 7,3, 100μg/mL de rHuPH20, 0,01% de Tween 80 e NaCl (0, 50, 100, 150, 200 ou 250 mM) . As soluções foram aliquotadas em frascos de vidro do tipo I de 2 mL com rolhas de borracha e selados com tampa de alumínio. Um conjunto de frascos foi armazenado a 40°C durante quatro dias, e o outro conjunto foi mantido no frigorifico a 2-8°C. Tabela 24. Formulação de rHuPH20 com NaCl
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Após 4 dias de armazenamento, cada uma das formulações mencionadas na Tabela 24 foi testada para a atividade enzimática de hialuronidase, utilizando o ensaio de microturvação descrito no Exemplo 4. Cromatografia de exclusão de Tamanho (SEC) foi realizada para avaliar o nivel de agregados usando as seguintes condições: IX PBS, coluna Toso Bioscience G2000 SWXL, taxa de fluxo = 1 mL/min. Tabela 25 mostra os resultados do estudo, incluindo a atividade hialuronidase (U/mL),% de área de pico principal (porcentagem da rHuPH20 que estava contida na área de pico principal) e a % de área de pico de agregado (porcentagem de rHuPH20 que estava contida no área do pico atribuído aos agregados) para cada formulação. Os resultados indicam que a estabilidade da rHuPH20, quando incubada a 40°C, foi dependente da concentração de NaCl: um aumento da concentração de NaCl levou a um aumento da atividade enzimática da rHuPH20. As amostras armazenadas entre 2 e 8 °C manteve níveis semelhantes de atividade enzimática da rHuPH20 durante todo o curso do estudo, independentemente da formulação. Na ausência de NaCl, as temperaturas elevadas (40°C), a atividade enzimática inteira da rHuPH20 foi perdida.
Os resultados na Tabela 25 mostram também o efeito da concentração de NaCl sobre os níveis de agregados de rHuPH20. Níveis de agregação aumentaram com a diminuição da concentração de NaCl em amostras armazenadas a 40°C. Não existe nenhuma mudança eesencial nas amostras armazenadas a 2-8 °C. Assim, os resultados mostram que dentro da faixa de concentração de NaCl testada (0-250 nM), houve uma relação direta entre a concentração de NaCl e estabilidade de rHuPH20 aumentada, o que sugere que a concentração de NaCl é mantida tão elevada quanto possível, dentro dos limites de solubilidade e de tonicidade a fim de aumentar a estabilidade de rHuPH20 em temperatura elevada. Tabela 25. Atividades enzimáticas e os resultados da SEC das amostras armazenadas 4 dias em 40 °C e 28 °C.
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Exemplo 6 Estabilidade de rHuPH20 e IG co-formulada A. Estabilidade de 10% IG ou 20% IG co-formulada com rHuPH20
A rHuPH20 foi formulada como se segue: 1 mL contida em 1048071 unidades de hialuronidase recombinante humana a partir do lote HUB0702CA (gerado usando produção Gen2 descrito no Exemplo 3) em 10 mM de histidina e 130 mM de cloreto de sódio (NaCl) a pH 6,0. A rHuPH20 foi diluida para 100.000 U/mL utilizando 10 mM de histidina + 130 mM de NaCl, pH 6,0, antes da mistura com imunoglobulina. Para este propósito, 200 pL de solução de armazenagem de rHuPH20 foi diluida com 1896 pL de tampão de histidina/NaCl, pH 6,0.
A rHuPH20 pré-diluida foi adicionada a diferentes formulações IG formuladas em 0,25 M de glicina a pH 4,4-4,9 para dar concentrações finais de 100 U/mL ou 300 U/mL na solução. Um dos três lotes diferentes de 10% de IG a partir da fabricação em grande escala (LE12H020, LE12H062, e LE12H173) ou um dos três diferentes lotes pré-clinicos de 20% IG (SC00107NG, SC00207NG, e SC00307NG) foi utilizado de acordo com a Tabela 26. As soluções foram filtradas através de um filtro 0,2μm e transferidas em porções de 1 mL em frascos de vidro estéreis de 5 mL. Os frascos foram armazenados a 2-8°C ou 28 a 32°C. Assim, as co-formulações resultantes de rHuPH20 e IG foram formuladas em 0,25 M de glicina a pH 4,4-4,9. Tabela 26. Co-formulações de rHuPH20 e 10% IG ou 20% IG
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semanas (2 a 8 °C apenas) de armazenamento, uma amostra de cada uma das 6 formulações mencionadas na Tabela 26 e de 10 cada uma das câmaras de armazenamento (2 a 8 °C e 28 a 32 °C) foi retirado da incubação e analisada para a atividade de hialuronidase utilizando o ensaio de microturvação descrito no Exemplo 4. Para avaliar os efeitos sobre IG, distribuição de tamanho molecular da IG em formulações 15 contendo 20% de IG foi determinada em 0 (início) e 6 meses por cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (HP-SEC) , utilizando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm (Tosoh Bioscience) e um sistema tampão contendo DMSO (Kolarich et al., (2006), Transfusion 46:. 1959-1977). Tabela 27 mostra a atividade de hialuronidase (U/mL) em 7 pontos de tempo (0, 1, 3, 6, 12, 24 e 36 semanas) para cada uma das co-formulação armazenadas de 2 a 8 °C. Tabela 28 mostra a atividade de hialuronidase (U/mL) em 6 pontos de tempo (0, 1, 3, 6, 12 e 2 semanas) para as co-formulações armazenadas a 28-32 °C. Uma perda significativa de atividade constante de hialuronidase foi observada na presença de co-formulações del0% e 20% IG armazenadas a 28-32°C, após 24 semanas, indicando instabilidade de rHuPH20. As co-formulações de % de IG 10 eram estáveis após 9 meses de armazenamento a 2-8 °C, 10 enquanto que a atividade rHuPH20 diminuiu ligeiramente na co-formulação de 20% de IG. A distribuição do tamanho molecular da IG em formulações contendo 20% de IG permaneceu inalterada em ambas as temperaturas após 6 meses de armazenamento (Tabelas 29 e 30). Tabela 27. Atividade de hialuronidase (U/mL) de co- formulações após armazenamento em 2-8 °C
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Tabela 28. Atividade de hialuronidase (U/mL) de co- formulações após armazenamento em 28-32°C
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Tabela 29. Distri buição de tamanho molecular d e Ig em IG 20% de co-formulado com rHuPH20 após armazenamento a 2-8 °C
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Tabela 30. Distribuição de tamanho molecular de IG em 20% de IG co-formulada com rHuPH20 após armazenamento a 28-32°C
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B. Estabilidade de 10% IG Co-formulada Com rHuPH20 e Cloreto de Sódio (0-150 mM)
Para melhorar a estabilidade das co-formulações rHuPH20, o efeito da adição do cloreto de sódio (NaCl) foi investigado. Co-formulações de 300 U/mL de rHuPH20 (lote HUB0702CA; gerado usando produção de Gen2 descrita no Exemplo 3) em IG de 10% (lote LE12F047) foram preparadas como descrito no Exemplo 7 A acima, com a adição de NaCl em 4 concentrações diferentes (0,50, 100 e 150 mM) . As co- formulações foram armazenadas a 2 a 8 °C ou 28 a 32 °C. Assim, as co-formulações resultantes de rHuPH20 e IG foram formuladas em 0,25 M de glicina a pH 4,6-5,1 (como medido na solução diluida) na presença de quantidades variáveis de NaCl.
Depois de 0 (inicio) , 1, 3, 6, 12, 18 e 24 semanas de armazenamento, uma amostra de cada uma das co- formulações (com concentrações de NaCl de 0,50, 100, e 150 mM) e de cada um das câmaras armazenamento (2 a 8 °C e 28 a 32 °C) foi retirada da incubação e analisada para a atividade de hialuronidase utilizando o ensaio de microturvação descrito no Exemplo 4. Agregação de IG foi determinada pela distribuição de tamanho molecular (MSD) por cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (HP-SEC), utilizando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm e um sistema tampão contendo DMSO (Kolarich et al. (2006) Transfusion , 46: 1 59-1977).
As Tabelas 31 e 32 mostram a atividade de hialuronidase (U/mL) a 7 pontos de tempo (0, 1, 3, 6, 12, 18 e 24 semanas) para cada uma das co-formulações. Os resultados mostram que a estabilidade da rHuPH20 co- formulada com IG de 10% na presença de 50, 100 ou 150 mM de NaCl manteve-se inalterada durante até 24 semanas de armazenamento em 2-8 °C, enquanto que a estabilidade de rHuPH20 melhorou para aquelas amostras armazenadas em 28- 32°C. No entanto, a atividade de hialuronidase rapidamente diminuiu nas co-formulações tendo uma concentração de NaCl de 0 mM, quando armazenado em 28-32 °C.
Tabelas 33 e 34 mostram que NaCl dimerização de IG ligeiramente melhorada (~ 350 kDa), nas duas temperaturas de armazenamento e de agregação de IG (> 450 kDa) em 28-32°C, e todos os valores permanecem dentro dos limites de especificação MSD (> 90% de monômero/dimeros, <5% de agregados, <5% de fragmentos 5após 6 meses.
Embora a adição de NaCl tenha impactado negativamente (aumentou), a atividade anticomplementar (ACA) titulação de formulações de IG armazenadas em 28-32 °C, titulação de ACA é um indicador de especificação para administração intravenosa (IV) e não é relevantes para 10 administração subcutânea das co-formulações. Tabela 31. Atividade de hialuronidase (U/mL) de 10% de co- formulações de IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento em 2- 8°C
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Tabela 32. Atividade de hialuronidase (U/mL) de 10% co- formulações de IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento em 28-32°C
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Tabela 33. Distribuição de tamanho molecular de IG em 10% de co-formulações de IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento em 2-8°C
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Tabela 34. Distribuição de tamanho molecular de IG em 10% de co-formulações de IG/rH.uPH20 com NaCl após armazenamento em 28-32 °C
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C. Estabilidade de 10% de IG ou 20% de IG Com rHuPH20 co-formulada e Cloreto de Sódio (0-50 mM)
O efeito da adição de cloreto de sódio nas co- formulações de IG de 10% ou 20% IG com rHuPH20 armazenadas em 28-32 °C foi investigada. As co-formulações de 300 U/mL de rHuPH20 (lote HUB0702CA; gerado usando produção de Gen2 descrita no Exemplo 1) em IG de 10% (lote LE12F047) e 300 U/mL de rHuPH20 (lote HUB0702CA; gerado usando produção de Gen2 descrita no Exemplo 1) em 20% de IG (lote SC00108NG) foram preparadas como descrito no Exemplo 6B acima, usando concentrações de NaCl de 0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mM. Assim, as co-formulações resultantes de rHuPH20 e IG foram formuladas em 0,25 M de glicina em pH 4,6-5,1 (como medido na solução diluida) na presença de quantidades variáveis de NaCl.
Depois de 0 (inicio), 1, 3, 6, 12 e 24 semanas de armazenamento, uma amostra de cada uma das co-formulações (com concentrações de NaCl de 0, 5, 10, 20, 30, 40 e 50 mM) foi retirada a partir da incubação e analisada para a atividade de hialuronidase utilizando o ensaio de microturvação descrito no Exemplo 4. Agregação de IG foi determinada pela distribuição de tamanho molecular por cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho (HP-SEC) , utilizando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm e um sistema tampão contendo DMSO.
As Tabelas 35 e 36 mostram atividade de hialuronidase (U/mL) em vários pontos de tempo (0, 1, 3, 6 e 12 e 24 semanas) para cada um das co-formulação. Os resultados mostram que a estabilidade da rHuPH20 co- formulada com 10% de IG na presença de altas concentrações de NaCl (20, 30, 4 0 e 50 mM) permaneceu relativamente inalterada ao longo de 24 semanas de armazenamento em 28- 32 °C. Atividade de hialuronidase rapidamente diminuiu nas que 20 mM, quando armazenada em 28-32°C. A estabilidade de rHuPH20 co-formulade com IG de 20% permaneceu relativamente inalterada ao longo de 24 semanas de armazenamento em 28-32 °C em todas as concentrações de NaCl. Cloreto de sódio aumentou ligeiramente a dimerização IG (-350 kDa) e agregação tanto em 10% de IG quanto em 20% de IG de co-formulações em 2832°C. 0 efeito é menos pronunciado em 20% de IG (isto é, maior concentração de IG) em agregação delG (Tabelas 37 e 3 8). Tabela 35. Atividade de hialuronidase (U/mL) de 10% de co- formulações IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento em 28-32 °C
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Tabela 36. Atividade de hialuronidase (U/mL) de 20% de co- formulações IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento em 28-32 °C
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Tabela 37. Distribuição de tamanho molecular de IG em co- formulações de 10% IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento em 28-32 °C
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Tabela 38. Distribuição de tamanho molecular de IG em co- 5 formulações de 20% IG/rHuPH20 com NaCl após armazenamento em 28-32 °C
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D. Estabilidade de rHuPH20 em Co-formulações com 10% de IG ou 20% de IG na presença de cloreto de sódio (100-250 mM) ou aminoácidos (500 mM)
O efeito sobre a estabilidade de rHuPH20 de co- 5 formulações contendo ou 10% de IG ou 20% de IG com rHuPH20 e cloreto de sódio ou estabilizadores de aminoácidos foi estudado. Co-formulações de 100 U/mL ou 300 U/mL de rHuPH20 (lote HUB0702CA; gerado usando produção de Gen2 descrita no Exemplo 3) em 10% de IG (com 0,25 M de glicina em pH 4,4) (lote LE12F047) ou 20% de IG (lote SC00108NG) foram preparadas como descrito no Exemplo 6A acima. As amostras continham ou NaCl (concentrações de 100, 150 ou 250 mM) , glicina (500 mM) ou prolina (500 mM) . As co-formulações foram armazenadas em. 28 °C ou 28 a 32 °C. Assim, as co- formulações resultantes de rHuPH20 e IG foram formuladas em 0,25 M de glicina em pH 4,6-5,1, na presença de quantidades variáveis de NaCl, glicina ou prolina.
Depois de 0 (inicio), 1, 2, 3, 6 e 12 (300 U/mL apenas) semanas de armazenamento, uma amostra de cada uma 20 das co-formulações (com as concentrações de NaCl de 100, 150 ou 250 mM, concentração de glicina de 500 mM ou concentração de prolina de 500 mM) foi retirada da incubação e analisada para a atividade de hialuronidase utilizando o ensaio de microturvação descrito no Exemplo 4.
Agregação de IG foi determinada pela distribuição de tamanho molecular em 0 (início) e 12 semanas de cromatografia de exclusão de tamanho de alto desempenho por (HP-SEC) utilizando uma coluna TSK G 3000 SW 600 x 7,5 mm de um sistema tampão contendo DMSO (Kolarich et al. (2006), Transfusion 46:. 1959-1977).
As Tabelas 39 e 41 mostram atividade de hialuronidase (U/mL) a 5 pontos de tempo (0, 1, 2, 3 e 6 semanas) para co-formulações contendo 100 U/mL de rHuPH20 e 10% ou 20% de IG, respectivamente. As Tabelas 40 e 42 mostram atividade hialuronidase (U/mL) em 6 pontos de tempo (0, 1, 2, 3, 6 e 12 semanas) para co-formulações contendo 300 U/mL de rHuPH20 e 10% ou 20% IG, respectivamente. Os resultados mostram que altas concentrações de aminoácidos (500 mM de glicina ou 500 mM de prolina) foram, menos eficazes, em seguida, NaCl na estabilização de rHuPH20 em 10% de IG ou 20% de IG de co-formulações com rHuPH20. Cloreto de sódio, em todas as concentrações estudadas, agregação IG melhorada (> 450 kDa) após armazenamento a 28-32 °C em todas as co-formulações. Todas as co-formulações contendo 500 mM de prolina tem uma teor dimero de IG reduzido (-350 kDa) e um teor de monômero aumentado (-160 kDa) após 6 semanas de armazenamento em 28- 32 °C. Teor de dimero de IG foi também reduzido em co- formulações de glicina, embora não tão pronunciado como nas co-formulações de prolina (Tabelas 43 e 44) . Altas concentrações de prolina provaram ser eficazes em inibir a agregação de proteinas durante a redobragem por eficazmente bloquear interações hidrofóbicas não-especificas entre proteinas (Kumar et al. (1998) Biochem. Mol. Biol. Int. 4:59 - 517). Tabela 39. Atividade de hialuronidase (U/mL) de 10% de IG e 100 U/mL de co-formulaçÕes rHuPH20 com estabilizadores após armazenamento em 28-32°C
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Tabela 40. Atividade hialuronidase (U/mL) de 10% de IG e 300 U/mL de co-formulações rHuPH20 com estabilizadores após armazenamento em 28-32°C
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Tabela 41. Atividade hialuronídase (U/mlj de 20% de IG e 100 U/mL de co-formulações rHuPH20 com estabílízadores após armazenamento em 28-32°C
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Tabela 42. Atividade hialuronidase (U/mL) de 20% de IG e 300 U/mL de co-formulações rHuPH20 com estabilizadores após armazenamento em 28-32°C
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Tabela 43. Distríbuição de tamanho molecular de IG em 10% de eo-formulações IG/rHuPH20 coxn NaCl, gíícína ou prolína após armazenagem eIn 28-32°C
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Tabela 44. Distribuição de tamanho molecular de IG em 20% de co-formulações IG/rHuPH20 com NaCl, glicina ou prolina após armazenagem em 28-32°C
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Exemplo 7 Efeitos de rHuPH20 co-formulada e 10% de IG ou 20% de IG em Porcos Mini Yucatan A. Projeto Experimental
A viabilidade de dosagem rHuPH20 co-formulada com solução de 10% ou 20% de imunoglobulina (IG) (130mM de NaCl, lOmM histidina, pH 6,6) por via subcutânea em Porcos Mini Yucatan foi determinada e comparada com a dosagem Leading Edge (Dosagem sucessiva de rHuPH20 seguida por solução de IG) . Uma resposta à dose utilizando várias concentrações de rHuPH20 foi também avaliada para cada solução de IG.
Dezoito porcos machos Mini Yucatan pesando 18,4 - 23,2 kg (Farms SNS) foram atribuídos a um ou dois grupos de 15 tratamento de onze como mostrado na Tabela 45 de modo que cada grupo utilizadou três porcos. Todas as formulações foram administradas por via subcutânea com agulhas Huber de dobra mole de 90 graus de 10 calibre sobre as costas dos porcos machos anestesiados. Para dosagem Leading Edge, rHuPH20 seguida por IgG foi injetada consecutivamente com a mesma agulha na localização exata, empregando um 5 interruptor seringa simples. Nenhum atraso entre a dosagem rHuPH20 e IgG foi necessário ou empregado. Até duas formulações diferentes, cada uma a partir de diferentes grupos de tratamento, foram testadas em cada porco com um volume máximo de 110 mL por local de injeção. Infusões 10 duraram aproximadamente 20 minutos para co-formulações e 22-28 minutos para formulações de Leading Edge. Tabela 45. Resumo de projeto experimental
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Observações no local da injeção foram avaliadas após a administração. Os transdutores foram utilizados para medir a pressão contínua (mmHg) exercida para administrar cada formulação, e foi coletado sangue para hemograma completo (CBC) e análise de gama imunoglobulina (IgG). Ao final do estudo, 3 dias após a administração, todos os animais foram sacrificados e duas seções de amostra (A e B) foram coletadas a partir de cada um local Ide injeção, local 2 de injeção, e Controle (coletado a partir de um local distante dos dois locais de injeção) e conservados em 10% de formalina tamponada neutra, e avaliado por microscopia de luz (Nova Patologia, PC, San Diego, CA) . Local A foi uma seção de espessura de 2-3 mm através do centro do local de injeção e o Local B era uma secção de espessura de 2-3 mm tomada a partir da extremidade do local de injeção colhido.
B. Observações do Local de Injeção
Dentro de 5 minutos da dosagem de 10% de IG sozinho (~ 25 ml em infusão; Grupo 1), uma 'bolha' distinta era visível em todos os três porquinhos. Aproximadamente 10 minutos após a dosagem de 2 0% de IG sozinho (~ 25 mL em infusão; Grupo 5), uma bolha distinta era visível. Area de formação da bolha observada aumentou com todas as formulações que contêm rHuPH20 (incluindo Leading Edge) em comparação com dosagem com IG sozinha, significando maior dispersão de fluídos quando se utiliza rHuPH20 (Tabela 46). Co-formulações de rHuPH20 com 10% e 20% de IG resultou em endurecimento significativamente reduzido de pele em todas as concentrações rHuPH20 (local permaneceu mole), e reduziu o rosa/vermelhidâo da pele em todas as concentrações de rHuPH20. Dosagem de comparação de Leading Edge resultarou em semelhantes observações de rosa/vermelhidão como co-formulações. Ocorrências de 5 rosa/vermelhidão no local da injeção observada após a administração mostraram recuperação total no prazo de 24 horas para todos os grupos (Tabela 46). Tabela 46. Aparência e Análise no Local de Injeção
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C. Observações de Medição de Pressão
Tabela 47 resume as medidas de pressão média. Em 2,5 minutos, ou pós dosagem mais cedo 20% de IG sozinha (Grupo 5), as pressões estavam fora da faixa mensurável 5 (>460 mmHg (61,33 KPa)) para todas os três porcos. Dois dos três porcos estavam fora da faixa de pressão mensurável no Grupo 6, e um porco estava fora da faixa para cada um dos grupos 7 e 8. Grupos 1 e 2, cada um, tinha um porco fora da faixa. Os resultados mostram que a pressão necessária para 10 realizar as injeções diminuiu com todos as co-formulações contendo rHuPH20. Tabela 47. Análise de medição de pressão media
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N/A = Não Disponível,> 460 mmHg N/A * = curva ascendente de registro da pressão não clara para interpretar
D. Hemograma Completo e IgG Análise de Plasma
O sangue foi coletado em tubos K3EDTA na pré-dose ( - 2,0 mL) e aos 30 minutos pós-dose (~ 2,0 mL) para completar a Análise de Contagem de sangue (CBC). As amostras foram armazenadas a 4 °C até à análise (Bioquant, Inc., San Diego, CA). Resultados de CBC não forneceram qualquer produto relacionado com questões de segurança específicas. A maioria dos suínos permaneceram dentro dos níveis normais de CBC (faixa normal de referência de CBC a partir de SNS farras). Cinco dos dezoito porcos não tinham coágulos visíveis nas amostras e não podiam ser avaliados.
Sangue para análise gama de imunoglobulina (IgG) foi coletado em tubos de Citrato de Sódio em pré-dose (-2,0 mL) e no fim do estudo (~ 4,0 mL) para confirmar a disponibilidade sistémica após administração subcutânea de IgG humana. As amostras foram centrifugadas em 4 °C durante 10 minutos a 3000 rpm, o plasma foi aliquotado, e as amostras foram armazenadas a -20 °C até à análise. Um aumento geral na IgG foi observado em todos os animais de 3 dias após a administração, como mostrado na Tabela 48. Níveis de IgG de plasma para cada porco refletiiu a média dos dois tratamentos diferentes, cada porco foi administrado (com a exceção dos suínos 7-9 que receberam um tratamento único). Tabela 48. Análise de IgG
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E. Resultados Histopatologia
As descobertas histológicas estavam presentes na epiderme, derme e tecido subcutâneo, e continham um misto de inflamação de leucócitos, edema e hemorragia. Cada 5 descoberta histológica foi atribuída em um grau de gravidade, com base no seguinte esquema: Ausente: 0; Presente, Sem Classificação: 0; Mínimo: 1; Leve: 2; Moderado: 3; Marcada: 4 As descobertas histológicas são resumidas pela 10 incidência e a pontuação média do grupo de gravidade nas Tabelas 49-51. Tabela 49. Resumo das Descobertas Histológicas: 10% IG + rHuPH20
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* Número de seções afetadas / Número de seções que avaliadas ** Soma dos resultados de severidade do grupo dividido pelo número de seções avaliadas no grupo Tabela 50. Resumo das descobertas histológicas: 20% IG + rHuPH20
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* Número de seções afetadas / Número de seções que avaliadas ** Soma dos resultados de severidade do grupo dividido pelo número de seções avaliadas no grupo Tabela 51. Resumo dos achados histológicos: dosagem Leading Edge
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* Número de seções afetadas / Numero de seções que avaliadas ** Soma dos resultados de severidade do grupo dividido pelo 5 número de seções avaliadas no grupo A resposta à administração de IG e rHuPH20 foi qua1itativamente semelhante em cada grupo de dose no presente estudo. Essas respostas foram caracterizadas por inflamação mista de leucócitos, 10 edema e hemorragia no tecido subcutâneo nos locais de injeção. Tabela 52 compara resultado médio de severidade do grupo em todos os grupos dose. Tabela 52. Resumo dos Resultados Médios de Severidade do Grupo
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Com base em resultados de severidade média do grupo, as respostas do local de injeção mais graves foram associados com a administração de 100 mL de 10% IG sozinha (Grupo 1) e com a administração de 50 mL de 20% de IG co- formulada com 300 U/mL de rHuPH20 (Grupo 8). A resposta à administração de 100 mL de 10% de IG co-formulada com rHuPH20 a 50, 100 e 300 U/mL de 10% de IG (Grupos 2-4) foi semelhante à resposta à administração de 50 mL de 20% de IG sozinha (Grupo 5) , co-formulada com rHuPH20 em 50 e 100 U/mL de 20%de IG (Grupos 6 e 7), e dosagem Leading Edge com 10 mL de rHuPH20 (150 U/mL) , seguida por 100 mL de 10% de IG (Grupo 9). No entanto, dosagem de Leading Edge com 10 ou 20 mL de rHuPH20 (150 U/mL), seguido por 50 mL de 20% de IG (Grupos 10 e 11) resultou numa resposta mais grave do que as co-formulações similares (Grupos 6 e 7). Seções de pele de controle continham poucas alterações histológicas, as quais podem ser atribuídas a difusão das formulações injetadas a partir dos locais do artigo de teste de injeção, e as descobertas incidentais não relacionadas com as formulações.
F. Resumo
Os resultados confirmaram a viabilidade de dosagem rHuPH20 co-formulada com 10% e 20% de IG por via subcutânea em Porcos Mini Yucatan. IG (10% ou 20%) administrada por si só é possível, embora um grau moderado a severo de endurecimento e rosa/vermelhidão da pele resultou. Co-formulações com rHuPH20 resultaram em uma diminuição da pressão necessária para realizar as injeções, reduziu significativamente o endurecimento da pele, e reduziu a reação rosa/vermelhidão da pele. Área de formação da bolha observada foi semelhante ou aumentada, com todas as formulações que continham rHuPH20 em comparação com dosagem de IG sozinha, confirmando maior dispersão de fluídos quando rHuPH20 foi utilizada. Dosagem de Leading Edge foi viável, e a pressão similar, áreas rosa/vermelhidão na bolha são observadas como com as co- formulações. As descobertas histopatológicas presentes no tecido subcutâneo profundo atribuída a dosagem incluído inflamação mista de leucócitos, edema e hemorragia, com as respostas mais graves associadas com a administração de 10% de IG sozinha e 20% de IG co-formulada com rHuPH20 (300 U/mL).
Uma vez que as modificações serão evidentes para aqueles que são peritos nesta técnica, pretende-se que esta invenção seja limitada apenas pelo escopo das reivindicações anexas.

Claims (33)

1. Composição estável formulada para administração por via subcutânea, caracterizada pelo fato de que a composição estável é uma co-formulação líquida; a composição tem um pH de 4 a 5, inclusive; e a composição compreende: imunoglobulina (IG) a uma concentração que é pelo menos 10% p/v; uma hialuronidase solúvel a uma concentração que é pelo menos 50 U/mL e está presente em uma quantidade suficiente para permitir a administração subcutânea da composição em um único local de injeção a uma taxa de infusão igual ou maior do que a taxa de infusão intravenosa para a imunoglobulina intravenosa; e um sal de cloreto de metal alcalino a uma concentração de pelo menos 0,05 M, de forma que a co-formulação é estável a temperaturas de até 32°C por pelo menos 6 meses.
2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase solúvel está presente a uma proporção de pelo menos 100 unidades/grama (U/g) de IG.
3. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 e 2, caracterizada por compreender adicionalmente um estabilizador de aminoácidos selecionado dentre alanina, histidina, arginina, lisina, ornitina, isoleucina, valina, metionina, glicina e prolina.
4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o estabilizador de aminoácidos está em uma quantidade de pelo menos 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M, 0,25 M, 0,3 M, 0,35 M, 0,4 M, 0,45 M, 0,5 M, 0,6 M, 0,7 M ou 0,75 M.
5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a concentração de IG é de pelo menos 10% p/v, 11% p/v, 12% p/v, 13% p/v, 14% p/v, 15% p/v, 16% p/v, 17% p/v, 18% p/v, 19% p/v, 20% p/v, 21% p/v, 22% p/v ou mais.
6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a IG é de plasma humano purificada por um método de purificação compreendendo fracionamento de álcool.
7. Composição, de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a IG é adicionalmente purificada por qualquer um ou mais dentre precipitação de polietileno glicol (PEG), cromatografia de troca iônica, clivagem enzimática, diafiltração ou ultrafiltração.
8. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que a IG é submetida a uma etapa de redução viral selecionada dentre incubação a pH 4,0, com ou sem pepsina, tratamento com detergente e solvente e nanofiltração.
9. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a IG contém IgG, IgA e IgM.
10. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o sal de cloreto de metal alcalino é NaCl ou de KCl.
11. Composição, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o sal de cloreto de metal alcalino é NaCl e o NaCl está a uma concentração de 0,025 M, 0,03 M, 0,04 M, 0,05 M, 0,08 M, 0,09 M, 0,1 M, 0,15 M, 0,2 M ou 0,25 M.
12. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase solúvel é uma PH20 ou uma forma truncada da mesma.
13. Composição, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que a PH20 é selecionada a partir de PH20 ovina, bovina ou humana truncada.
14. Composição, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a PH20 é PH20 humana truncada e a PH20 humana truncada é selecionada dentre polipeptídeos tendo uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS:4-9, ou suas variantes alelicas ou outras variantes.
15. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase solúvel é designada rHuPH20.
16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase solúvel está a uma concentração de 50 U/mL 100 U/mL, 200 U/mL, 300 U/mL,400 U/mL, 500 U/mL, ou mais.
17. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizada pelo fato de que a hialuronidase solúvel está em uma proporção de 100 U/g IG, 150 U/g IG, 200 U/g IG, 250 U/g IG, 300 U/g IG, 400 U/g IG, 500 U/g IG, 600 U/g IG, 700 U/g IG, 800 U/g IG, 900 U/g IG, 1000 U/g IG, 1200 U/g IG, 1500 U/g IG, 1800 U/g IG, 2000 U/g IG, 3000 U/g IG, 4000 U/g IG ou 5000 U/g IG.
18. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo fato de possuir um pH de 4,4 a 4,9 na forma concentrada.
19. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizada pelo fato de que a composição é para administração de dosagem única ou para administração de dosagem múltipla.
20. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a IG está em uma quantidade suficiente para dosagem única para administração para tratar uma doença ou condição tratável por IG, em que a quantidade de IG está em uma quantidade suficiente para administração de dosagem única diária, semanal, quinzenal, a cada 2-3 semanas, a cada 3-4 semanas ou mensalmente durante tratamento de uma doença ou condição tratável por IG.
21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizada pelo fato de que a quantidade de IG na co-formulação é substancialmente a mesma que a quantidade em uma administração de dosagem única quando administrado por via intravenosa para o tratamento de uma doença ou condição tratável por IG.
22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizada pelo fato de que a composição é para administração de dosagem única e a quantidade de IG é pelo menos 1 grama (g), 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 10 g, 20 g, 30 g, 40 g, 50 g, 60 g, 70 g, 80 g, 90 g, 100 g ou 200g ou é de 1 a 200 g, 1 a 100 g, 10 a 100 g, 5 a 50 g, 6 a 50 g, 5 a 100 g.
23. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizada pelo fato de que a composição é para administração de dosagem única e a quantidade de hialuronidase na composição é pelo menos 500 unidades, 1.000 unidades, 2.000 unidades, 5.000 unidades, 10.000 unidades, 30.000 unidades, 40.000 unidades, 50.000 unidades, 60.000 unidades, 70.000 unidades, 80.000 unidades, 90.000 unidades, 100.000 unidades ou mais.
24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizada pelo fato de que é estável a 28 °C - 32 °C por 6 meses, 7 meses, 8 meses, 9 meses, 10 meses, 11 meses, 12 meses ou mais.
25. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 24, caracterizada pelo fato de que adicionalmente é estável a 0 °C - 10 °C por 6 meses, 1 ano, 2 anos ou mais.
26. Kit caracterizado por compreender a composição conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 25 e, opcionalmente, instruções de uso.
27. Recipiente caracterizado por compreender a composição conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 25.
28. Recipiente, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado por ser um tubo, frasco, ampola ou seringa.
29. Recipiente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 e 28, caracterizado por compreender adicionalmente uma agulha para injeção.
30. Recipiente, de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que a composição é fornecida para administração de dosagem única ou para administração de dosagem múltipla.
31. Kit caracterizado por compreender o recipiente conforme definido em qualquer uma das reivindicações 27 a 30, e um meio para a infusão da composição.
32. Uso de uma composição, conforme definida em qualquer das reivindicações 1 a 25, caracterizado por ser para formulação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou condição tratável com IG, em que a doença ou condição tratável com IG é selecionada dentre doenças de deficiência imunológica primária, doenças de deficiência imunológica secundária, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e infecções agudas.
33. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 25, caracterizada por ser para uso no tratamento de uma doença ou condição tratável com IG, em que a doença ou condição tratável com IG é selecionada 5 dentre doenças de deficiência imunológica primária, doenças de deficiência imunológica secundária, doenças inflamatórias, doenças autoimunes e infecções agudas.
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