ES2902063T3

ES2902063T3 - Proteínas de unión a interleucina-13

Info

Publication number: ES2902063T3
Application number: ES19164395T
Authority: ES
Inventors: Chengbin Wu; Richard Dixon; Jonathan Belk; Hua Ying; Maria Argiriadi; Carolyn Cuff; Paul Hinton; Shankar Kumar; Terry Melim; Yan Chen
Original assignee: AbbVie Bahamas Ltd
Current assignee: AbbVie Bahamas Ltd
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2022-03-24
Anticipated expiration: 2027-09-07
Also published as: AU2007351514A1; NZ599144A; ES2661032T3; JP5981964B2; US20110165066A1; HK1256740A1; KR101676269B1; MY188368A; SG174782A1; US10086076B2; IL226291A; EP2064336A4; CR20140465A; MX349810B; RU2016132208A; MX2009002554A; JP2010502224A; BRPI0716438A8; DK3339445T3; BRPI0716438A2

Abstract

Una composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma que comprende un anticuerpo que comprende un (i) conjunto de CDR de VH de 13C5 que comprende los restos 31 - 37 de la SEQ ID NO: 46, restos 2-67 de la SEQ ID NO: 46, y restos 100-112 de la SEQ ID NO: 46; y (ii) un conjunto de CDR de VL de 13C5 que comprende los restos 24-34 de la SEQ ID NO: 47, restos 50-56 de la SEQ ID NO: 47 y restos 89-97 de la SEQ ID NO: 47.

Description

DESCRIPCIÓN

Proteínas de unión a interleucina-13

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una composición para su uso en la prevención y/o el tratamiento del asma.

Antecedentes de la invención

La IL-13 humana es una glucoproteína de 17 kDa clonada a partir de linfocitos T activados (Zurawski y de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26) y está producida por linfocitos T activados del linaje Th2, aunque los linfocitos T CD⁸+, linfocitos T ^cD4+ Th0 y Th1, y varias poblaciones de células que no son T, tal como los mastocitos, también producen IL-13 (Zurawski y de Vries 1994 Immunol Today 1519-26). La función de IL-13 incluye el cambio de isotipo de inmunoglobulina a IgE en linfocitos B humanos (Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 903730 4) y la supresión de la producción de citocinas inflamatorias tanto en seres humanos como en ratones (de Waal Malefyt, Figdor et al. 1993 J Immunol 1516370-81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 151 7151-60). IL-13 se une a sus receptores de superficie celular, IL-13Ralfa1 e IL-13Ralfa2. El IL-13Ralfa1 interactúa con IL-13 con baja afinidad (KD ~ 10 nM), seguido del reclutamiento de IL-4Ra para formar el complejo receptor heterodimérico de señalización de alta afinidad (KD ~ 0,4 nM) (Aman, Tayebi et al. 1996 J Biol Chem 27129265-70; Hilton, Zhang et al.

1996 Proc Natl Acad Sci U S A 93497-501). El complejo IL-4R/IL-13Ralfa1 se expresa en muchos tipos de células, tal como los linfocitos B, monocitos/macrófagos, células dendríticas, eosinófilos, basófilos, fibroblastos, células endoteliales, células epiteliales de las vías respiratorias y células del músculo liso de las vías respiratorias (Graber, Gretener et al. 1998 Eur J Immunol 284286-98; Murata, Husain et al. 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu et al. 2001 Cytokine 1375-84). La unión del complejo receptor IL-13Ralfa1/IL-4R da como resultado la activación de una variedad de vías de transducción de señales que incluyen el transductor de señal y activador de la transcripción (STAT⁶) y las vías del sustrato 2 del receptor de insulina (IRS-2) (Wang, Michieli et al. 1995 Blood ⁸⁶4218-27; Takeda, Kamanaka et al. 1996 J Immunol 157 3220-2). La cadena IL-13Ralfa2 sola tiene una alta afinidad (KD ~ 0,25-0,4 nM) por IL-13 y funciona tanto como un receptor señuelo que regula negativamente la unión de IL-13 (Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 1612317-24) como un receptor de señalización que induce la síntesis de TGF-b y la fibrosis a través de la vía AP-1 en macrófagos y posiblemente otros tipos celulares (Fichtner-Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 1299-106).

Varios estudios realizados en modelos animales preclínicos para el asma indican que la IL-13 desempeña un papel importante en el asma. Estos datos incluyen la resistencia al asma en los ratones nuligénicos para IL-13, así como la inhibición del fenotipo del asma con antagonistas de IL-13 (receptores solubles de IL-13, mAb anti-IL-13, etc.) en varios modelos de ratón (Sela 1999 Harefuah 137317-9; Wills-Karp y Chiaramonte 2003 Curr Opin Pulm Med 921 7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90). Múltiples estudios han demostrado que la administración farmacológica de IL-13 recombinante a los pulmones de ratones así como a cobayas induce una hipersecreción de moco en las vías respiratorias, eosinofilia y AHR (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 2822258-61; Kibe, Inoue et al. 2003 Am J Respir Crit Care Med 16750-6; Vargaftig y Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig y Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol ^{2 8}410-9). Estos efectos de IL-13 se reproducen en sistemas de ratones transgénicos con expresión constitutiva o inducible de IL-13 (Zhu, Homer et al. 1999 J Clin Invest 103779-88; Zhu, Lee et al. 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70; Lanone, Zheng et al. 2002 J Clin Invest 110463-74). La sobreexpresión transgénica crónica de IL-13 también induce fibrosis subepitelial y enfisema. Los ratones deficientes en la molécula de señalización de IL-13 (e IL-4) STAT⁶no presentan AHR inducida por alérgenos ni sobreproducción de moco (Kuperman, Huang et al. 2002 Nat Med ⁸885-9). Los estudios que utilizan la proteína de fusión del receptor soluble de IL-13 (sIL-13Ralfa2Fc) han demostrado el papel fundamental de esta citocina en la enfermedad experimental de las vías respiratorias inducida por alérgeno ovoalbúmina (OVA) (Grunig, Warnock et al. 1998 Science 2822261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 2822258-61; Taube, Duez et al. 2002 J Immunol 1696482-9). La eficacia del tratamiento anti-IL-13 también se demostró en un modelo crónico de asma murina. Además de presentar características de hipersecreción de moco y AHR, este modelo de asma crónica demuestra varios rasgos característicos de la enfermedad humana que faltan en los modelos más agudos. Estos incluyen la eosinofilia del tejido pulmonar ubicado en los espacios interepiteliales, así como la fibrosis del músculo liso medida por los aumentos en la deposición de colágeno. El modelo de asma crónica se induce con exposiciones repetidas de aerosol con OVA en ratones sensibilizados con OVA 1 vez a la semana durante un total de 4 semanas. El anticuerpo anti-IL-13 administrado durante las últimas 2 semanas de prueba de provocación con OVA (desde el día 36 con lecturas de eficacia evaluadas el día 53 del estudio) inhibió significativamente la AHR, inflamación pulmonar, hiperplasia de células caliciformes, hipersecreción de moco y fibrosis de las vías respiratorias (Yang, Li et al. 2005 J Pharmacol Exp Ther). Por otra parte, también se demostró que el efecto terapéutico del antagonista de IL-13 inhibe la AHR en un modelo de primate de asma [Abstract, American Thoracic Society 2005].

La IL-13 está implicada en la patogenia del asma humana, ya que se han detectado niveles elevados de ARNm y proteína de IL-13 en pulmones de pacientes asmáticos, que se correlacionan con la gravedad de la enfermedad (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 1552688-94). Además, se han identificado polimorfismos genéticos de IL-13 humana, que dan lugar a niveles elevados de IL-13, y se asocian con asma y atopia (Heinzmann, Mao et al. 2000 Hum Mol Genet 9549-59; Hoerauf, Kruse et al. 2002 Microbes Infect 437-42; Vercelli 2002 Curr Opin Allergy Clin Immunol 2389-93; Heinzmann, Jerkic et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112735-9; Chen, Ericksen et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114553-60; Vladich, Brasil et al. 2005 J Clin Invest), y se han detectado niveles elevados de IL-13 en el pulmón de pacientes con asma (Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 1552688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al. 2002 J Allergy Clin Immunol 109980-7; Berry, Parker et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 1141106-9). También se ha demostrado un vínculo genético entre la IL-13 y el asma, ya que los individuos con un polimorfismo en el gen de IL-13 que causa niveles más altos de IL-13 en plasma tienen un mayor riesgo de atopia y asma (Wills-Karp 2000 Respir Res 119-23).

Debido al papel de la IL-13 humana en una variedad de trastornos humanos, se han diseñado estrategias terapéuticas para inhibir o contrarrestar la actividad de IL-13. En particular, se han buscado anticuerpos que se unan y neutralicen a IL-13 como un medio para inhibir la actividad de IL-13. Sin embargo, existe una necesidad en la técnica de anticuerpos mejorados capaces de unirse a IL-13. Preferentemente, los anticuerpos se unen a IL-13 humana. Preferentemente, los anticuerpos son capaces de neutralizar la IL-13 humana. La presente divulgación proporciona una nueva familia de proteínas de unión, anticuerpos injertados con CDR, anticuerpos humanizados y fragmentos de los mismos, capaces de unirse a IL-13 humana, de unirse con alta afinidad y de unirse y neutralizar la IL-13 humana.

Sumario de la invención

El alcance de la invención y diversas realizaciones de la invención se definen mediante las reivindicaciones adjuntas. En consecuencia, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención del asma que comprende un anticuerpo que comprende un (i) conjunto de CDR de VH de 13C5 que comprende los restos 31-37 de la SEQ ID NO: 46, restos 52-67 de la SEQ ID NO: 46, y restos 100-112 de la SEQ ID NO: 46; y (ii) un conjunto de CDR de VL de 13C5 que comprende los restos 24-34 de la SEQ ID NO: 47, restos 50-56 de la S^eQ ID NO: 47 y restos 89-97 de la SEQ ID NO: 47.

La presente solicitud se refiere a diversas realizaciones de la invención y a aspectos adicionales de la divulgación. En la medida en que tales aspectos se encuentren fuera del alcance de la presente invención como se define anteriormente y en las reivindicaciones adjuntas, se presentan con fines comparativos.

Esta divulgación se refiere a proteínas de unión a IL-13. Las proteínas de unión de la divulgación incluyen, pero sin limitación, anticuerpos, porciones de unión a antígeno y otras proteínas de unión a antígeno capaces de unirse a IL-13 humana. Aún más, la divulgación proporciona métodos para preparar y usar proteínas de unión a IL-13.

Un aspecto de la divulgación se refiere a una proteína de unión capaz de unirse a IL-13. En un aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión se une a la IL-13 humana. Preferentemente, la proteína de unión es capaz de modular una función biológica de IL-13. Más preferentemente, la proteína de unión es capaz de neutralizar IL-13. En un aspecto de la divulgación, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-13 y prevenir la unión de IL-13 al receptor de IL-13a1. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-13 y prevenir la unión de IL-13 al receptor de IL-13a2. En un aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-13 y prevenir la unión de IL-13 tanto al receptor de IL-13a1 como al de IL-13a2.

Un aspecto de la divulgación proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana e inhibe la unión de ^{dicha IL-13 al recep}1^{tor de IL-13a2 en un ensay} J ^{o de unión a rece}*^{ptor b}8^asado8 ^{en la}8 ^supe9^rficie9 ^celul1^{ar con}0 ^{una CI50} _{seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente de 1,5X10' a 1x10' M, 1x10' a 1x10' M, 10' a 10' M y}10'10 a 10'11 M o en un ensayo de unión a receptor basado en ELISA con una CI⁵⁰seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1,8X10'8 a 1x10'8 M, 1x10'8 a 1x10'9 M, 10'9 a 10'10M y 10'10 a 10'11 M. Preferentemente, el anticuerpo se une a IL-13 humana e inhibe la unión de dicha IL-13 al receptor de IL-13a2 en un ensayo de unión a receptor basado en la superficie celular con una CI50 de 2,7 x10'9 M y en un ensayo de unión a receptor basado en ELISA con una CI⁵⁰de 1,1 X10'9 M. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana e inhibe la unión de dicha IL-13 al receptor de IL-13a2 en un ensayo de unión a receptor basado en la superficie celular o en un ensayo de unión a receptor basado en ELISA en aproximadamente un 70-100 % a una concentración de 100 nM. Preferentemente, el anticuerpo es 13C5.5. Más preferentemente, el anticuerpo no es BAK502G9, mAb13.2 o MJ2-7.

En otro aspecto, la divulgación proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, donde dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana e inhibe la AHR en aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % en un modelo de asma inducida por IL-13 humana. Preferentemente, el anticuerpo inhibe la AHR en más del 86 % en un modelo de asma inducida por IL-13 humana. En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a la IL-13 humana e inhibe la AHR en aproximadamente un 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % e inhibe la producción de moco en aproximadamente un 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o 100 % un modelo de asma inducida por IL13 humana. Preferentemente, el anticuerpo es 13C5.5. Más preferentemente, el anticuerpo no es BAK502G9, mAb13.2 o MJ2-7.

^{En un asp1ecto, la proteína de unión 1 de la divulgación tiene una constante de velocidad de asociación (kon) a IL-13 de}al menos ap₁roxima ¹damente 10²

₅M ₁s¹

₁; al menos ap ₁roximadamente 10³M ¹

₆s ¹

₁; ₁al menos ap ₁roximadamente 10⁴M ¹s¹;

_{al menos aproximadamente 10 M s ; o al menos aproximadamente 10 M s ' , medida por resonancia de plasmón}superficial. Preferentemente, la proteína de unión de la divulgación tiene una constante de velocidad de asociación

(kon) a IL-13 entre 10^2mV ⁱy 10^3mV ⁱ; entre 10^3mV ⁱy 104M lV '; entre 1 0 W y 1 medida por resonancia de plasmón superficial.

En otro aspecto, la proteína de unión de la divulgación tiene una constante de velocidad de disociación (koff) a IL-13 de como máximo aproximadamente 10 'V ; como máximo aproximadamente 10 'V ; como máximo aproximadamente 10'5s , o como máximo aproximadamente 10 'V , medida por resonancia de plasmón superficial.

^{Prefe n te de velocidad de disociación (koff) a IL-13} _{de 10} ^r-3^e

_s-1^temen

_{a 10}-^t4^e,

_s-1 ^{la prote}

_{; de 10}-4^{ína e u}

_s-1 ^d

_{a 10}-ⁿ5^ió

_s-1^{n de la div}

_{; o de 10}-5^ul

_s-^g1^{ación t e e una constan}

_{a 10}-6ⁱ

_s-1ⁿ

_{, medida por resonancia de plasmón superficial.}

En otro aspecto, la proteína de unión de la divulgación tiene una constante de disociación (K^d) a IL-13 de un máximo de 10-7 M; como má10ximo ap 1roximadamente 10-8 M; como m ₁á₁ximo ap 1roximadamente 10-9 M; como m 12áximo aproximadamente 10 M; como máximo aproximadamente 10 M; como máximo aproximadamente 10 M; o como máximo 10-13 M. Preferentemente, la proteína de unión de la divulgación tiene una constante de disociación

(K^d) a IL-13 de 10-7 M a 10-8 M; de 10-8 M a 10-9 M; de 10-9 M a 10-10 M; de 10-10 a 10-11 M; de 10-11 M a 10-12 M; o de

10-12 M a 10-13 M.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a la IL-13 con características de unión seleccionadas del grupo que consiste en: a) una constante de velocidad de asociación (kon) entre aproximadamente 10 M s y 10 M s o aproximadamente 10 M s a 10 M s , o b) una constante de velocidad de disociación (koff) de aproximadamente 10- s- a 10- s- ; o de aproximadamente 10- s- a 10- s- , medidas por resonancia de plasmón superficial; o c) una constante de disociación (KD) de aproximadamente 1,5X1010 a 1x10"10

M o aproximadamente 1010 a 1011 M. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tiene una constante de velocidad de asociación (kon) a IL-13 seleccionada del grupo que consiste en: 6,68 x 105M'1s' ^{1 7,86 x 105 mV 1 1 i 8,35 x ^ V 5 s 1 - 1 , 8,69 x 105M'1s'1, 9,15 x 105M-V1, 1,26 x 106M-V1, 1,7 x ^ mV ^ 2,51 x 106M-1}s --¹. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, tiene una constante de velocidad _{de disociación (koff) a IL-13 seleccionada del grupo que consiste en: 1,23 x 10-4’ s -1 1,76 x 1 ü V ; 4,74 x 10 V ; 1,91}x 10 V ; 2,14 x 10 V , 3,82 x 10 V ; 8,81 x 10 V y 9,65 x 10 V , medida por resonancia de plasmón superficial.

Preferentemente, el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene una constante de disociación (KD) a

IL-13 seleccionada del grupo que consiste en: 1,05 x 1010 M; 7,10 x 1010 M; 1 x 1011 M; 2,20 x 1011 M; 2,72 x 1010

M; 4,17 x 1011 M; 5,68 x 1011 M; 7,01 x 1011 M; 7,10 x 1011 M; y 9,79 x 1011 M.

Un aspecto de la divulgación se refiere a la unión de proteínas capaces de un epítopo específico en IL-13.

Preferentemente, el epítopo específico comprende la región carboxiterminal de la hélice D de la iL-13 humana. Más preferentemente, el epítopo específico comprende la secuencia de aminoácidos VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR, correspondiente a los aminoácidos 104-130 de la SEQ ID NO: 1. En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo o porción de unión a antígeno, se une a un epítopo que comprende la región carboxiterminal de la Hélice

D y la región aminoterminal de la Hélice A de la IL-13 humana. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana de manera que la IL-13 con dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, unido al epítopo definido por las regiones topográficas Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 y Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129 -Arg130 de la SEQ ID NO:. 1 se inhibe de la unión al receptor de IL-13. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana de manera que la IL-13 con dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, unido al epítopo definido por las regiones topográficas Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 y Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127 de la SEQ ID NO: 1 se inhibe de la unión al receptor de IL-13 receptor. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana de manera que la IL-13 con dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, unido al epítopo definido por las regiones topográficas Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 y Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129 -Arg130 de la SEQ ID NO:. 1 se inhibe de la unión al receptor de IL-13a2. Más preferentemente, según la divulgación, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana de manera que la IL-13 con dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, unido al epítopo definido por las regiones topográficas Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 y Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129 -Arg130 de la SEQ ID NO: 1 se inhibe de la unión al receptor de IL-13a2, siempre que dicho anticuerpo no sea BAK502G9 o

MJ2-7. Lo más preferentemente, el anticuerpo es 13C5.5.

En un aspecto de la divulgación, el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 y evita la unión de IL-13 al receptor de IL-13a2 con características de unión seleccionadas del grupo que consiste en unión a un epítopo en IL-13 que incluye las hélices A y D; una constante de velocidad de asociación (kon) entre aproximadamente 10 M s y 10 M s o aproximadamente 10 M s a 10 M s ; una constante de velocidad de disociación (koff) de aproximadamente 10⁴s ¹a ⁵10¹s ; o de aproximadamente 10⁵s ¹a ⁶10¹s , medidas por resonancia de plasmón superficial; y una constante de disociación (KD) de aproximadamente 1,5 x 10-10 a 1 x 10-10 M o de aproximadamente 10-10 a 10-11 M. En otro aspecto, el anticuerpo aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a la variante de IL-13 y evita la unión de la variante de IL-13 al receptor de IL-13a2 con características de unión seleccionadas del grupo que consiste en unión a un epítopo en IL-13 que incluye las hélices A y D; una constante de velocidad de asociación (kon) entre aproximadamente 105M"1s"1 y 106M"1s"1 o aproximadamente 106M"1s"1 a 107M"1s"1; una constante de velocidad de disociación (koff) de aproximadamente 10 'V1 a 10 'V ; o de ap1roximadamente 10 'V a 10 'V 10 , medida 1s0* por resonancia de 1 plasmón 10 sup 1erf ₁i₁cial; y y una constante de _{disociación (Kd) de aproximadamente 1,5 x 10 a 1 x10 M o aproximadamente 10 a 10 M.}

En un aspecto de la divulgación, la proteína de unión es capaz de unirse a IL-13, comprendiendo dicho dominio de unión a antígeno al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

CDR—H1. X¹—X²—X³—X⁴—X⁵—X⁶—X⁷(SEQ ID NO: 64), donde;

X¹es T, D, G o S;

X²es S;

X3 es D;

X⁴es M, S, Y, L o H;

X⁵es G, W, Y, A, S o N;

X6 es V, I, o M; y

X⁷es D, H, S, Y, N o G;

CDR-H2. X¹—X²—X³—X⁴—X⁵—X⁶—X⁷—X⁸—X⁹—X¹⁰—X¹¹—X¹²—X¹³—X¹⁴—X¹⁵—X¹⁶—X¹⁷(SEQ ID NO: 65), donde;

Xi es M, E, H, R, S, G o L;

X²es I o no está presente;

X³es H, Y, A, D, S o W;

X⁴es P, S, W o G;

X⁵es S, G, E o D;

X6 es D, G, S, E o N;

X⁷es S, Y o G;

X8 es E, N, Y, V o R;

X⁹es T, I o K;

X¹⁰es R, Y, I, D o A;

Xii es L, Y, D o F;

X¹²es N, P, S o D;

X¹³es Q, E, D, P o S;

X¹⁴es K, M, S, T, A o V;

X¹⁵es F, L, V o M;

X¹⁶es K, R o Q; y

X17 es D, G o S;

CDR-H3. X¹—X²—X³—X⁴—X⁵—X⁶—X⁷—X⁸—X⁹—X¹⁰—X¹¹—X¹²—X¹³—X¹⁴(SEQ ID NO: 66), donde;

Xi es W, T, G, Y, D, o I;

X²es R, A, S, G o V;

X³es T, F, Y o S;

X⁴es S, T o Y;

X⁵es Y, F o G;

X6 es F o Y;

X⁷es S, Y, I, o F;

X8 es D, L, Y, o P;

X⁹es Y;

X¹⁰es G;

Xii es Y, A, P o E;

X¹²es F, M, S, L o I;

X¹³es D, V, N o K; y

X¹⁴es Y o F;

CDR-L1. X¹—X²—X³—X⁴—X⁵—X⁶—X⁷—X⁸—X⁹—X¹⁰—X¹²—X¹²—X¹³—X¹⁴—X¹⁵X¹⁶—X¹⁷(SEQ ID NO: 67), donde;

Xi es K o R;

X₂es S o A;

X3es S o T;

X4 es Q, K, o I

X5 es N, S, T, G o E;

X6 es L, T o S;

X7 es L, Q o V

X8 es Y, N, H, D o T;

X9 es S, I, o T;

X1 es S, D, N, H, o Y

Xii es N o G;

X¹²es Q;

X¹³es K, F, N, E o S;

X¹⁴es N, T o S;

X¹⁵es Y o F;

Xi⁶es L, A o M; y

X¹⁷es A, D, E, H o N

CDR-L2. X¹—X²—X³—X⁴—X⁵—X⁶—X⁷(SEQ ID NO: ^{6 8}), donde;

X¹es L, S, K, T, W o Y;

X²es V, T o A;

X³es S o N;

X⁴es N, K, T, M o R;

X⁵es R, K o L;

X6 es F, D, E, H, P o A; y

X⁷es S, R o P;

donde;

X¹es F, W, Q o A;

X²es Q o L;

X³es H, G, Y, W o N;

X⁴es N, S, T, L o Y;

X⁵es Y, T, S, E o H;

X6 es L, V, F, Y, N, G, P o D;

X⁷es P o H;

Xa es L, F, Y, W o R; y

X⁹es T o V.

Preferentemente, el dominio de unión al antígeno comprende al menos una CDR que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en:

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 32; restos 52-67 de la SEQ ID NO: 48;

restos 50-66 de la SEQ ID NO: 32; restos 100-112 de la SEQ ID NO: 48;

restos 99-105 de la SEQ ID NO: 32; restos 24-34 de la SEQ ID NO: 49;

restos 24-39 de la SEQ ID NO: 33; restos 50-56 de la SEQ ID NO: 49;

restos 55-61 de la SEQ ID NO: 33; restos 89-97 de la SEQ ID NO: 49;

restos 94-102 de la SEQ ID NO: 33; restos 31-37 de la SEQ ID NO: 50;

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 34; restos 52-67 de la SEQ ID NO: 50;

restos 50-66 de la SEQ ID NO: 34; restos 100-112 de la SEQ ID NO: 50;

restos 99-105 de la SEQ ID NO: 34; restos 24-34 de la SEQ ID NO: 51;

restos 24-39 de la SEQ ID NO: 35; restos 60-66 de la SEQ ID NO: 51;

restos 55-61 de la SEQ ID NO: 35; restos 89-97 de la SEQ ID NO: 51;

restos 94-102 de la SEQ ID NO: 35; restos 31-35 de la SEQ ID NO: 52;

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 36; restos 50-66 de la SEQ ID NO: 52;

restos 50-66 de la SEQ ID NO: 36; restos 99-107 de la SEQ ID NO: 52;

restos 99-109 de la SEQ ID NO: 36; restos 23-36 de la SEQ ID NO: 53;

restos 24-39 de la SEQ ID NO: 37; restos 52-58 de la SEQ ID NO: 53;

restos 55-61 de la SEQ ID NO: 37; restos 91-99 de la SEQ ID NO: 53;

restos 94-102 de la SEQ ID NO: 37; restos 31-35 de la SEQ ID NO: 54;

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 38; restos 50-65 de la SEQ ID NO: 54;

restos 50-66 de la SEQ ID NO: 38; restos 98-107 de la SEQ ID NO: 54;

restos 99-109 de la SEQ ID NO: 38; restos 24-38 de la SEQ ID NO: 55;

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 39; restos 54-60 de la SEQ ID NO: 55;

restos 50-66 de la SEQ ID NO: 39; restos 93-101 de la SEQ ID NO: 55;

restos 99-112 de la SEQ ID NO: 39; restos 31-35 de la SEQ ID NO: 56;

restos 24-39 de la SEQ ID NO: 40; restos 50-65 de la SEQ ID NO: 56;

restos 55-61 de la SEQ ID NO: 40; restos 98-107 de la SEQ ID NO: 56;

restos 94-102 de la SEQ ID NO: 40; restos 24-38 de la SEQ ID NO: 57;

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 41; restos 54-60 de la SEQ ID NO: 57;

restos 50-66 de la SEQ ID NO: 41; restos 93-101 de la SEQ ID NO: 57;

restos 99-112 de la SEQ ID NO: 41; restos 31-35 de la SEQ ID NO: 58;

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 42; restos 50-65 de la SEQ ID NO: 58;

restos 50-66 de la SEQ ID NO: 42; restos 98-107 de la SEQ ID NO: 58;

restos 99-100 de la SEQ ID NO: 42; restos 24-38 de la SEQ ID NO: 59;

restos 24-39 de la SEQ ID NO: 43; restos 54-60 de la SEQ ID NO: 59;

restos 55-61 de la SEQ ID NO: 43; restos 93-101 de la SEQ ID NO: 59;

restos 94-102 de la SEQ ID NO: 43; restos 31-35 de la SEQ ID NO: 60;

restos 31-35 de la SEQ ID NO: 44; restos 50-65 de la SEQ ID NO: 60;

restos 50-65 de la SEQ ID NO: 44; restos 98-107 de la SEQ ID NO: 60;

restos 98-106 de la SEQ ID NO: 44; restos 24-38 de la SEQ ID NO: 61;

restos 24-40 de la SEQ ID NO: 45; restos 54-60 de la SEQ ID NO: 61;

restos 56-62 de la SEQ ID NO: 45; restos 93-101 de la SEQ ID NO: 61;

restos 95-103 de la SEQ ID NO: 45; restos 31-35 de la SEQ ID NO: 62;

restos 31-37 de la SEQ ID NO: 46; restos 50-65 de la SEQ ID NO: 62;

restos 52-67 de la SEQ ID NO: 46; restos 98-107 de la SEQ ID NO: 62;

restos 100-112 de la SEQ ID NO: 46; restos 24-38 de la SEQ ID NO: 63;

restos 24-34 de la SEQ ID NO: 47; restos 54-60 de la SEQ ID NO: 63; y restos 50-56 de la SEQ ID NO: 47;

restos 89-97 de la SEQ ID NO: 47; restos 93-101 de la SEQ ID NO: 63.

restos 31-37 de la SEQ ID NO: 48;

En un aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión comprende al menos 3 CDR que se seleccionan de un conjunto de CDR de dominio variable que consiste en:

(continuación)

(continuación)

(continuación)

Preferentemente, la proteína de unión comprende al menos dos conjuntos de CDR de dominio variable. Preferentemente, al menos dos conjuntos de ^cD^rde dominio variable se seleccionan de un grupo que consiste en:

conjunto de CDR de VH de 25C8 y conjunto de CDR de VL de 25C8;

conjunto de CDR de VH de 9C11 y conjunto de CDR de VL de 9C11;

conjunto de CDR de VH de 21D9 y conjunto de CDR de VL de 21D9;

conjunto de CDR de VH de 22D10 y conjunto de CDR de VL de 22D10;

conjunto de CDR de VH de 5F1 y conjunto de CDR de VL de 5F1;

conjunto de CDR de VH de 5G1 y conjunto de CDR de VL de 5G1;

conjunto de CDR de VH de 3H7 y conjunto de CDR de VL de 3H7;

conjunto de CDR de VH de 14B2 y conjunto de CDR de VL de 14B2;

conjunto de CDR de VH de 13C5 y conjunto de CDR de VL de 13C5;

conjunto de CDR de VH de 29G5 y conjunto de CDR de VL de 29G5;

conjunto de CDR de VH de 33C3 y conjunto de CDR de VL de 33C3;

conjunto de CDR de VH de 4A8 y conjunto de CDR de VL de 4A8;

conjunto de CDR de VH de 1B6 y conjunto de CDR de VL de 1B6;

conjunto de CDR de VH de 3E5 y conjunto de CDR de VL de 3E5;

conjunto de CDR de VH de 6C8 y conjunto de CDR de VL de 6C8;

conjunto de CDR de VH de 5D3 y conjunto de CDR de VL de 5D3; y

conjunto de CDR de VH de 8B6 y conjunto de CDR de VL de 8B6.

En otro aspecto de la divulgación la proteína de unión divulgada anteriormente comprende además un marco aceptor humano. Preferentemente, el marco aceptor humano comprende una secuencia de aminoácidos consiste en:

SEQ ID NO 6 SEQ ID NO 16 SEQ ID NO: 26

SEQ ID NO 7 SEQ ID NO 17 SEQ ID NO: 27

SEQ ID NO 8 SEQ ID NO 18 SEQ ID NO: 28

SEQ ID NO 9 SEQ ID NO 19 SEQ ID NO: 29

SEQ ID NO 10 SEQ ID NO: 20 SEQ ID NO 30 y

SEQ ID NO 11 SEQ ID NO: 21

SEQ ID NO 12 SEQ ID NO: 22 SEQ ID NO 31

SEQ ID NO 13 SEQ ID NO: 23

SEQ ID NO 14 SEQ ID NO: 24

SEQ ID NO 15 SEQ ID NO: 25

En un aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión es un anticuerpo injertado con CDR o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a IL-13. Preferentemente, el anticuerpo injertado con CDR o porción de unión a antígeno del mismo comprende una o más CDR divulgadas anteriormente. Preferentemente, el anticuerpo injertado con CDR o porción de unión a antígeno del mismo comprende un marco aceptor humano. Más preferentemente, el marco aceptor humano es cualquiera de los marcos aceptores humanos divulgados anteriormente.

En un aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión es un anticuerpo humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a IL-13. Preferentemente, el anticuerpo humanizado o porción de unión a antígeno del mismo comprende una o más CDR divulgadas anteriormente incorporadas en un dominio variable de anticuerpo humano de un marco aceptor humano. Preferentemente, el dominio variable del anticuerpo humano es un dominio variable humano consenso. Más preferentemente, el marco aceptor humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos de la región marco en un resto clave, donde el resto clave se selecciona del grupo que consiste en un resto adyacente a una CDR; un resto de sitio de glicosilación; un resto raro; un resto capaz de interactuar con IL-13 humana; un resto capaz de interactuar con una CDR; un resto canónico; un resto de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera; un resto dentro de una zona de vernier; y un resto en una región que se solapa entre una CDR1 de cadena pesada variable definida por Chothia y un primer marco de cadena pesada definido por Kabat. Preferentemente, el marco aceptor humano marco aceptor humano comprende al menos una sustitución de aminoácidos en la región marco, donde la secuencia de aminoácidos del marco es al menos un 65 % idéntica a la secuencia de dicho marco aceptor humano y comprende al menos 70 restos de aminoácidos idénticos a dicho marco aceptor humano. Preferentemente, la sustitución de aminoácidos de la región marco en un resto clave se selecciona del grupo que consiste en 2L, 15L, 22L, 41L, 42L, 44L, 49L, 50L, 51L, 62L, 71L, 73L, 10H, 44H, 46H, 48H, 67H, 68H, 70H, 72H, 74H, 76H, 83H, 84H, 86H, 87H y 97H.

En un aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión es un anticuerpo humanizado o una porción de unión a antígeno del mismo capaz de unirse a IL-13. Preferentemente, el anticuerpo humanizado o porción de unión a antígeno del mismo comprende una o más CDR divulgadas anteriormente. Más preferentemente, el anticuerpo humanizado, o porción de unión a antígeno del mismo comprende tres o más CDR divulgadas anteriormente. Lo más preferentemente, el anticuerpo humanizado o porción de unión a antígeno del mismo comprende seis CDR divulgadas anteriormente.

En otro aspecto de la divulgación, el anticuerpo humanizado o porción de unión a antígeno del mismo comprende al menos un dominio variable que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo seleccionado del grupo que consiste en;

SEQ ID NO: 70 SEQ ID NO: 77 SEQ ID NO: 84

SEQ ID NO: 71 SEQ ID NO: 78 SEQ ID NO: 85

SEQ ID NO: 72 SEQ ID NO: 79 SEQ ID NO: 92

SEQ ID NO: 73 SEQ ID NO: 80 SEQ ID NO: 93 y

SEQ ID NO: 74 SEQ ID NO: 81

SEQ ID NO: 75 SEQ ID NO: 82 SEQ ID NO: 94.

SEQ ID NO: 76 SEQ ID NO: 83

Más preferentemente, según la presente divulgación, el anticuerpo humanizado o porción de unión a antígeno del mismo comprende dos dominios variables seleccionados del grupo divulgado anteriormente. Más preferentemente, la proteína de unión comprende dos dominios variables, donde dichos dos dominios variables tienen secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en;

SEQ ID NO: 70 y SEQ ID NO: 71,

SEQ ID NO: 72 y SEQ ID NO: 73,

SEQ ID NO: 74 y SEQ ID NO: 75,

SEQ ID NO: 76 y SEQ ID NO: 77,

SEQ ID NO: 78 y SEQ ID NO: 79,

SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81,

SEQ ID NO: 82 y SEQ ID NO: 83,

SEQ ID NO: 84 y SEQ ID NO: 85

SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 92,

SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 93 Y

SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 94.

Un aspecto de la divulgación proporciona una construcción de anticuerpo que comprende una cualquiera de las proteínas de unión divulgadas anteriormente y un polipéptido enlazador o una inmunoglobulina. En un aspecto preferido, la construcción de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en una molécula de inmunoglobulina, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo injertado con CDR, un anticuerpo humanizado, un Fab, un Fab', un F(ab')2, un Fv, un Fv enlazado por disulfuro, un scFv, un anticuerpo de un solo dominio, un diacuerpo, un anticuerpo multiespecífico, un anticuerpo de doble especificidad y un anticuerpo biespecífico. En un aspecto preferido, la construcción de anticuerpo comprende un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina seleccionado del grupo que consiste en un dominio constante de IgM humana, un dominio constante de IgG1 humana, un dominio constante de IgG2 humana, un dominio constante de IgG3 humana, un dominio constante de IgG4 humana, un dominio constante de IgE humana y un dominio constante de IgA humana. Más preferentemente, la construcción de anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 2; SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 4; y SEQ ID NO: 5. En otro aspecto, la divulgación proporciona un conjugado de anticuerpo que comprende una construcción de anticuerpo divulgada anteriormente y un agente, un agente seleccionado del grupo que consiste en; una molécula de inmunoadhesión, un agente de obtención de imágenes, un agente terapéutico y un agente citotóxico. En un aspecto preferido de la divulgación, el agente de obtención de imágenes seleccionado del grupo que consiste en un radiomarcador, una enzima, un marcador fluorescente, un marcador luminiscente, un marcador bioluminiscente, un marcador magnético y biotina. Más preferentemente, el agente de obtención de imágenes es un radiomarcador seleccionado del grupo que consiste en: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho, y 153Sm. En un aspecto preferido de la divulgación, el agente terapéutico o citotóxico se selecciona del grupo que consiste en; un antimetabolito, un agente alquilante, un antibiótico, un factor de crecimiento, una citocina, un agente antiangiogénico, un agente antimitótico, una antraciclina, toxina y un agente apoptótico.

En otro aspecto de la divulgación, la construcción de anticuerpo está glucosilada. Preferentemente, la glucosilación es un patrón de glucosilación humano.

En otro aspecto de la proteína de unión de la divulgación, la construcción de anticuerpo o el conjugado de anticuerpo divulgados anteriormente existe como un cristal. Preferentemente, el cristal es un cristal de liberación controlada farmacéuticamente libre de transportadores. En un aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión cristalizada, la construcción de anticuerpo cristalizado o el conjugado de anticuerpo cristalizado tiene una semivida in vivo mayor que su homólogo soluble. En otro aspecto preferido de la divulgación, la proteína de unión cristalizada, la construcción de anticuerpo cristalizado o el conjugado de anticuerpo cristalizado conservan la actividad biológica después de la cristalización.

Un aspecto de la divulgación se refiere a una proteína de unión a DVD que comprende proteínas de unión capaces de unirse a IL-13. Preferentemente, la proteína de unión a DVD es capaz de unirse a IL-13 y a una segunda diana. La segunda diana se selecciona del grupo que consiste en CSF1 (^mC^sF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNal, IFNp1, IFN-y, histamina y receptores de histamina, IL-1a, IL-1p, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12a, IL-12P, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, KITLG, PDGFB, IL-2Ra, IL-4R, IL-5Ra, IL-8Ra, IL-8RP, IL-12Rp1, IL-12Rp2, IL-13Ra1, IL-13Ra2, IL-18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR y quitinasa. Más preferentemente, la proteína DVD es capaz de reconocer IL-13 e IL-1 p, IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; o IL-13 y ADAM8. Lo más preferentemente, la proteína DVD es capaz de unirse a IL-13 y TNFa.

Un aspecto de la divulgación se refiere a un ácido nucleico aislado que codifica cualquiera de las proteínas de unión, construcción de anticuerpo o conjugado de anticuerpo divulgados anteriormente. Un aspecto adicional de la divulgación proporciona un vector que comprende el ácido nucleico aislado divulgado anteriormente donde dicho vector se selecciona del grupo que consiste en pcDNA; pTT (Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, N.° 2); pTT3 (pTT con sitio de clonación múltiple adicional; pEFBOS (Mizushima, S. y Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, N.° 17); pBV; pJV; y pBJ.

En otro aspecto de la divulgación, una célula hospedadora se transforma con el vector divulgado anteriormente. Preferentemente la célula hospedadora es una célula procariota. Más preferentemente, la célula hospedadora es E. Coli. En un aspecto relacionado, la célula hospedadora es una célula eucariota. Preferentemente la célula eucariota se selecciona del grupo que consiste en una célula protista, célula animal, célula vegetal y célula fúngica. Más preferentemente, la célula hospedadora es una célula de mamífero que incluye, pero sin limitación, CHO y COS; o una célula fúngica tal como Saccharomyces cerevisiae; o una célula de insecto tal como Sf9.

Otro aspecto de la divulgación proporciona un método para producir una proteína de unión que se une a IL-13, que comprende cultivar una cualquiera de las células hospedadoras divulgadas anteriormente en un medio de cultivo en condiciones suficientes para producir una proteína de unión que se una a IL-13. Otro aspecto de la divulgación proporciona una proteína de unión producida según el método divulgado anteriormente.

Un aspecto de la divulgación proporciona una composición para la liberación de una proteína de unión donde la composición comprende una formulación que a su vez comprende una proteína de unión cristalizada, una construcción de anticuerpo cristalizado o un conjugado de anticuerpo cristalizado como se divulga anteriormente y un ingrediente; y al menos un transportador polimérico. Preferentemente, el portador polimérico es un polímero seleccionado de uno o más del grupo que consiste en: ácido poli(acrílico), poli(cianoacrilatos), poli(aminoácidos), poli(anhídridos), poli(depsipéptido), poli(ésteres), ácido poli(láctico), ácido poli(láctico-co-glicólico) o PLGA, poli(bhidroxibutirato), poli(caprolactona), poli(dioxanona); poli(etilenglicol), poli((hidroxipropil) metacrilamida, poli[(organo)fosfaceno], poli(ortoésteres), alcohol poli(vinílico), poli(vinilpirrolidona), copolímeros de anhídrido maleico-alquilviniléter, polioles plurónicos, albúmina, alginato, celulosa y derivados de celulosa, colágeno, fibrina, gelatina, ácido hialurónico, oligosacáridos, glucaminoglucanos, polisacáridos sulfatados, mezclas y copolímeros de los mismos. Preferentemente, el ingrediente se selecciona del grupo que consiste en albúmina, sacarosa, trehalosa, lactitol, gelatina, hidroxipropil-p-ciclodextrina, metoxipolietilenglicol y polietilenglicol. Otro aspecto de la divulgación proporciona un método para tratar a un mamífero que comprende la etapa de administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición divulgada anteriormente.

La divulgación también proporciona una composición farmacéutica que comprende una proteína de unión, una construcción de anticuerpo o un conjugado de anticuerpo como se divulga anteriormente y un transportador farmacéuticamente aceptable. En un aspecto adicional de la divulgación, la composición farmacéutica comprende al menos un agente terapéutico adicional para tratar un trastorno en el que la actividad de IL-13 es perjudicial. Preferentemente en donde el agente adicional se selecciona del grupo que consiste en: agente terapéutico, agente de obtención de imágenes, agente citotóxico, inhibidores de la angiogénesis (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anti-VEGF o trampa de VEGF); inhibidores de cinasas (incluidos, pero sin limitación, inhibidores de KDR y TIE-2); bloqueantes de moléculas de coestimulación (incluyendo, pero sin limitación anti-B7.1, anti-B7.2, CTLA4-Ig, anti-CD20); bloqueantes de moléculas de adhesión (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anti-LFA-1, anticuerpos anti-E/L selectina, inhibidores de moléculas pequeñas); anticuerpo anticitocinas o fragmento funcional del mismo (incluyendo, pero sin limitación, anticuerpos anti-IL-18, anti-TNF, antirreceptor de IL-6/citocina); metotrexato; ciclosporina; rapamicina; FK506; marcador o indicador detectable; un antagonista de TNF; un antirreumático; un relajante muscular, un narcótico, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, una epinefrina o análogo, una citocina y un antagonista de citocina.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una proteína de unión divulgada anteriormente para su uso en un método para inhibir la actividad de la IL-13 humana que comprende poner en contacto la IL-13 humana de manera que se inhiba la actividad de la IL-13 humana. En un aspecto relacionado, la divulgación proporciona una proteína de unión divulgada anteriormente para su uso en un método para inhibir la actividad de IL-13 humana en un sujeto humano que padece un trastorno en el que la actividad de IL-13 es perjudicial, que comprende administrar al sujeto humano una proteína de unión divulgada anteriormente de manera que se inhiba la actividad de IL-13 humana en el sujeto humano y se consiga el tratamiento.

En otro aspecto, la divulgación proporciona una proteína de unión divulgada anteriormente para su uso en un método de tratamiento (por ejemplo, curar, suprimir, mejorar, retrasar o prevenir la aparición o prevenir la recurrencia o recaída de) o prevenir un trastorno asociado a IL-13, en un sujeto. El método incluye: administrar al sujeto un agente de unión a IL-13 (particularmente un antagonista), por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo como se describe en el presente documento, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir el trastorno asociado a IL-13. El antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo, puede proporcionarse para su administración al sujeto, solo o en combinación con otras modalidades terapéuticas como se describe en el presente documento.

En un aspecto de la divulgación, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que padece uno o más trastornos asociados a IL-13, que incluyen, por ejemplo, trastornos respiratorios (por ejemplo, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD, por sus siglas en inglés) y otras afecciones que implican inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco; trastornos atópicos (por ejemplo, dermatitis atópica y rinitis alérgica); afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias de, la piel, los órganos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (EII), tal como colitis ulcerosa y/o enfermedad de Crohn) del hígado (por ejemplo, cirrosis, fibrosis); esclerodermia; tumores o cánceres, por ejemplo, Linfoma de Hodgkin como se describe en el presente documento. En consecuencia, la divulgación incluye el uso de un agente de unión a IL-13 (tal como un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo descrito en el presente documento) para un tratamiento descrito en el presente documento y el uso de un agente de unión a IL-13 (tal como un anticuerpo anti-IL -13 o fragmento del mismo descrito en el presente documento) para preparar un medicamento para un tratamiento descrito en el presente documento. Los ejemplos de trastornos asociados a IL-13 incluyen, pero sin limitación, un trastorno elegido de uno o más de: trastornos respiratorios, por ejemplo, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica (por ejemplo, asma debido a una infección con, por ejemplo, virus respiratorio sincitial (RSV, por sus siglas en inglés), por ejemplo, en niños más pequeños)), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y otras afecciones que implican inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, por ejemplo, fibrosis quística y fibrosis pulmonar; trastornos atópicos, por ejemplo, como resultado de una mayor sensibilidad a la IL-13 (por ejemplo, dermatitis atópica, urticaria, eccema, rinitis alérgica y enterogastritis alérgica); afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias de la piel (por ejemplo, dermatitis atópica), los órganos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (EII), tal como colitis ulcerosa y/o enfermedad de Crohn), del hígado (por ejemplo, cirrosis, carcinoma hepatocelular) y esclerodermia; tumores o cánceres (por ejemplo, tumores de tejidos blandos o sólidos), tal como leucemia, glioblastoma y linfoma, por ejemplo, linfoma de Hodgkin; infecciones víricas (por ejemplo, de HTLV-1); fibrosis de otros órganos, por ejemplo, fibrosis del hígado, (por ejemplo, fibrosis provocada por un virus de la hepatitis B y/o C); y supresión de la expresión de respuestas inmunitarias protectoras de tipo 1, (por ejemplo, durante la vacunación), como se describe en el presente documento.

En otros aspectos, en el presente documento se divulga un antagonista de IL-13 para su uso en un método para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o prevenir uno o más síntomas asociados con un trastorno respiratorio, por ejemplo, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica); alergias; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (C^oP^d); una afección que implica inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, por ejemplo, fibrosis quística y fibrosis pulmonar. Por ejemplo, los síntomas del asma incluyen, pero sin limitación, sibilancias, dificultad para respirar, broncoconstricción, hiperreactividad de las vías respiratorias, disminución de la capacidad pulmonar, fibrosis, inflamación de las vías respiratorias y producción de moco. El método comprende administrar al sujeto un antagonista de IL-13, por ejemplo, un anticuerpo contra IL-13 o un fragmento del mismo, en una cantidad suficiente para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o prevenir uno o más síntomas. El anticuerpo contra IL-13 puede proporcionarse para su uso en administración terapéutica o profiláctica, o ambas. El antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13, o fragmento del mismo, se puede proporcionar para su uso en la administración al sujeto, solo o en combinación con otras modalidades terapéuticas como se describe en el presente documento. Preferentemente, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que padece un trastorno asociado a IL-13 como se describe en el presente documento.

En otro aspecto de la divulgación, esta aplicación proporciona un método para detectar la presencia de IL-13 en una muestra in vitro (por ejemplo, una muestra biológica, tal como suero, plasma, tejido, biopsia). El método objeto se puede utilizar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado a células inmunitarias. El método incluye: (i) poner en contacto la muestra o una muestra de control con el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo y la muestra o la muestra de control, donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra con respecto a la muestra de control es indicativo de la presencia de IL-13 en la muestra.

En otro aspecto más de la divulgación, esta aplicación proporciona un antagonista de IL-13 para su uso en un método para detectar la presencia de IL-13 in vivo (por ejemplo, obtención de imágenes in vivo en un sujeto). El método objeto se puede utilizar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado a IL-13. El método incluye: (i) administrar el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento a un sujeto o un sujeto de control en condiciones que permitan la unión del anticuerpo o fragmento a IL-13; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo o fragmento e IL-13, donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en el sujeto en relación con el sujeto de control es indicativo de la presencia de IL-13.

En otro aspecto, las proteínas de unión de la divulgación son para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en artritis, artrosis, artritis crónica juvenil, artritis séptica, artritis de Lyme, artritis psoriásica, artritis reactiva, espondiloartropatía, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Crohn, colitis ulcerosa, enfermedad intestinal inflamatoria, diabetes mellitus insulinodependiente, tiroiditis, asma, enfermedades alérgicas, psoriasis, dermatitis esclerodermia, enfermedad de injerto contra huésped, rechazo de trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria aguda o crónica asociada con el trasplante de órganos, sarcoidosis, aterosclerosis, coagulación intravascular diseminada, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de Graves, síndrome nefrítico, síndrome de fatiga crónica, granulomatosis de Wegener, púrpura de Enoch-Schoenlein, vasculitis microscópica de los riñones, hepatitis crónica activa, uveítis, choque séptico, síndrome de choque tóxico, síndrome de sepsis, caquexia, enfermedades infecciosas, enfermedades parasitarias, síndrome de inmunodeficiencia adquirida, mielitis transversa aguda, corea de Huntington, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, ictus, cirrosis biliar primaria, anemia hemolítica, neoplasias malignas, insuficiencia cardiaca, infarto de miocardio, enfermedad de Addison, deficiencia poliglandular tipo I y deficiencia poliglandular tipo II esporádicas, síndrome de Schmidt, síndrome de dificultad respiratoria (aguda) del adulto, alopecia, alopecia areata, artropatía seronegativa, artropatía, enfermedad de Reiter, artropatía psoriásica, artropatía por colitis ulcerosa, sinovitis enteropática, clamidia, artropatía asociada a yersinia y salmonella, espondiloartropatía, enfermedad ateromatosa/arteriosclerosis, alergia atópica, enfermedad ampollosa autoinmunitaria, pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, penfigoide, enfermedad de IgA lineal, anemia hemolítica autoinmunitaria, anemia hemolítica positiva de Coombs, anemia perniciosa adquirida, anemia perniciosa juvenil, encefalitis miálgica/enfermedad de Royal Free, candidiasis mucocutánea crónica, arteritis de células gigantes, hepatitis esclerosante primaria, hepatitis autoinmunitaria criptogénica, enfermedad del síndrome de inmunodeficiencia adquirida, enfermedades relacionadas con la inmunodeficiencia adquirida, hepatitis B, hepatitis C, inmunodeficiencia común variada (hipogammaglobulinemia variable común), miocardiopatía dilatada, infertilidad femenina, insuficiencia ovárica, insuficiencia ovárica prematura, enfermedad pulmonar fibrótica, alveolitis fibrosante criptogénica, enfermedad pulmonar intersticial posinflamatoria, neumonitis intersticial, enfermedad del tejido conectivo asociada a enfermedad pulmonar intersticial, enfermedad pulmonar mixta asociada a enfermedad del tejido conectivo, enfermedad pulmonar intersticial asociada a esclerosis sistémica, enfermedad pulmonar intersticial asociada a artritis reumatoide, enfermedad pulmonar asociada a lupus eritematoso sistémico, enfermedad pulmonar asociada a dermatomiositis/polimiositis, enfermedad pulmonar asociada a la enfermedad de Sjogren, enfermedad pulmonar asociada a espondilitis anquilosante, enfermedad vasculítica pulmonar difusa, enfermedad pulmonar asociada a hemosiderosis, enfermedad pulmonar intersticial inducida por fármacos, fibrosis, fibrosis por radiación, bronquiolitis obliterante, neumonía eosinofílica crónica, enfermedad pulmonar infiltrativa linfocítica, enfermedad pulmonar intersticial posinfecciosa, artritis gotosa, hepatitis autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria de tipo 1 (hepatitis autoinmunitaria o lupoide clásica), hepatitis autoinmunitaria de tipo 2 (hepatitis por anticuerpos anti-LKM), hipoglucemia autoinmunitaria mediada, resistencia a la insulina de o B con acantosis nigricans, hipoparatiroidismo, enfermedad inmunitaria aguda asociada con el trasplante de órganos, enfermedad inmunitaria crónica asociada con el trasplante de órganos, osteoartrosis, colangitis esclerosante primaria, psoriasis DE o 1, psoriasis DE o 2, leucopenia idiopática, neutropenia autoinmunitaria, NOS por enfermedad renal, glomerulonefritis, vasculitis microscópica de los riñones, enfermedad de Lyme, lupus eritematoso discoide, infertilidad masculina idiopática o NOS, autoinmunidad espermática, esclerosis múltiple (todos los subtipos), oftalmia simpatética, hipertensión pulmonar secundaria a enfermedad del tejido conectivo, síndrome de Goodpasture, manifestación pulmonar de poliarteritis nudosa, fiebre reumática aguda, espondilitis reumatoide, enfermedad de Still, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, enfermedad/arteritis de Takayasu, trombocitopenia autoinmunitaria, trombocitopenia idiopática, enfermedad tiroidea autoinmunitaria, hipertiroidismo, hipotiroidismo autoinmunitario goitroso (enfermedad de Hashimoto), hipotiroidismo autoinmunitario atrófico, mixedema primario, uveítis facogénica, vasculitis primaria, enfermedad hepática aguda por vitíligo, enfermedades crónicas del hígado, cirrosis alcohólica, lesión hepática inducida por alcohol, coleostasis, enfermedad hepática idiosincrásica, hepatitis inducida por fármacos, esteatohepatitis no alcohólica, alergia y asma, infección por estreptococos del grupo B (GBS, por sus siglas en inglés), trastornos mentales (por ejemplo, depresión y esquizofrenia), enfermedades mediadas por el tipo Th2 y el tipo Th1, dolor agudo y crónico (diferentes formas de dolor) y cánceres tal como cáncer de pulmón, mama, estómago, vejiga, colon, páncreas, ovario, próstata y recto y neoplasias hematopoyéticas (leucemia y linfoma), abetalipoproteinemia, acrocianosis, procesos parasitarios o infecciosos agudos y crónicos, leucemia aguda, leucemia linfoblástica aguda (ALL, por sus siglas en inglés), leucemia mieloide aguda (AML, por sus siglas en inglés), infección bacteriana aguda o crónica, pancreatitis aguda, fallo renal agudo, adenocarcinomas, latidos ectópicos aéreos, complejo de demencia del SlDA, hepatitis inducida por alcohol, conjuntivitis alérgica, dermatitis alérgica de contacto, rinitis alérgica, rechazo de aloinjerto, deficiencia de alfa-1-antitripsina, esclerosis lateral amiotrófica, anemia, angina de pecho, degeneración de las células del cuerno anterior, terapia anti cd3, síndrome antifosfolípido, reacciones de hipersensibilidad antirreceptor, aneurismas aórticos y periféricos, disección de la aorta, hipertensión arterial, arteriosclerosis, fístula arteriovenosa, ataxia, fibrilación auricular (sostenida o paroxística), aleteo auricular, bloqueo auriculoventricular, linfoma de linfocitos B, rechazo de injerto óseo, rechazo del trasplante de médula ósea (BMT, por sus siglas en inglés), bloqueo de rama del haz, linfoma de Burkitt, quemaduras, arritmias cardíacas, síndrome de aturdimiento cardíaco, tumores cardíacos, miocardiopatía, respuesta inflamatoria por derivación cardiopulmonar, rechazo de trasplante de cartílago, degeneraciones corticales cerebelosas, trastornos cerebelosos, taquicardia auricular caótica o multifocal, trastornos asociados a quimioterapia, leucemia mielocítica crómica (CML, por sus siglas en inglés), alcoholismo crónico, patologías inflamatorias crónicas, leucemia linfocítica crónica (CLL, por sus siglas en inglés), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), intoxicación crónica por salicilatos, carcinoma colorrectal, insuficiencia cardíaca congestiva, conjuntivitis, dermatitis de contacto, cor pulmonale, enfermedad de las arterias coronarias, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, sepsis con cultivo negativo, fibrosis quística, trastornos asociados a terapia con citocinas, demencia pugilística, enfermedades desmielinizantes, fiebre hemorrágica del dengue, dermatitis, afecciones dermatológicas, diabetes, diabetes mellitus, enfermedad aterosclerótica diabética, enfermedad difusa por cuerpos de Lewy, miocardiopatía congestiva dilatada, trastornos de los ganglios basales, Síndrome de Down en la mediana edad, trastornos del movimiento inducidos por fármacos inducidos por fármacos que bloquean los receptores de dopamina del SNC, sensibilidad a fármacos, eccema, encefalomielitis, endocarditis, endocrinopatía, epiglotitis, infección por virus de epstein-barr, eritromelalgia, trastornos extrapiramidales y cerebelosos, linfohistiocitosis hematofagocítica familiar, rechazo de implante de timo fetal, ataxia de Friedreich, trastornos funcionales de las arterias periféricas, sepsis por hongos, gangrena gaseosa, úlcera gástrica, nefritis glomerular, rechazo de injerto de cualquier órgano o tejido, sepsis gramnegativa, sepsis grampositiva, granulomas debidos a organismos intracelulares, tricoleucemia, enfermedad de Hallerrorden-Spatz, tiroiditis de Hashimoto, fiebre del heno, rechazo de trasplante de corazón, hemacromatosis, hemodiálisis, síndrome urémico hemolítico/púrpura trombocitopénica trombolítica, hemorragia, hepatitis (A), arritmias del haz de His, infección por VIH/neuropatía por VIH, enfermedad de Hodgkin, trastornos del movimiento hipercinético, reacciones de hipersensibilidad, neumonitis por hipersensibilidad, hipertensión, trastornos del movimiento hipocinético, evaluación del eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal, enfermedad de Addison idiopática, fibrosis pulmonar idiopática, citotoxicidad mediada por anticuerpos, astenia, atrofia muscular espinal infantil, inflamación de la aorta, gripe A, exposición a radiaciones ionizantes, iridociclitis/uveítis/neuritis óptica, lesión por isquemia-reperfusión, accidente cerebrovascular isquémico, artritis reumatoide juvenil, atrofia muscular espinal juvenil, sarcoma de Kaposi, rechazo de trasplante de riñón, legionela, leishmaniosis, lepra, lesiones del sistema corticoespinal, lipedema, rechazo de trasplante de hígado, linfedermia, malaria, linfoma maligno, histiocitosis maligna, melanoma maligno, meningitis, meningococcemia, metabólico/idiopático, dolor de cabeza de tipo migraña, trastorno multisistema mitocondrial, enfermedad mixta del tejido conjuntivo, gammapatía monoclonal, mieloma múltiple, degeneraciones de múltiples sistemas (Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager y Machado-Joseph), miastenia grave, Mycobacterium avium intracelular, Mycobacterium tuberculosis, síndrome mielodisplásico, infarto de miocardio, trastornos isquémicos del miocardio, carcinoma nasofaríngeo, enfermedad pulmonar crónica neonatal, nefritis, nefrosis, enfermedades neurodegenerativas, atrofias musculares neurogénicas, fiebre neutropénica, linfoma no hodgkiniano, oclusión de la aorta abdominal y sus ramas, trastornos arteriales oclusivos, terapia con okt3, orquitis/epididimitis, procedimientos de reversión de orquitis/vasectomía, organomegalia, osteoporosis, rechazo de trasplante de páncreas, carcinoma de páncreas, síndrome paraneoplásico/hipercalcemia de malignidad, rechazo de trasplante de paratiroides, enfermedad pélvica inflamatoria, rinitis perenne, enfermedad pericárdica, enfermedad aterosclerótica periférica, trastornos vasculares periféricos, peritonitis, anemia perniciosa, neumonía por pneumocystis carinii, neumonía, síndrome de POEMS (polineuropatía, organomegalia, endocrinopatía, gammapatía monoclonal y síndrome de cambios cutáneos), síndrome posperfusión, síndrome post bombeo, síndrome de cardiotomía postinfarto de miocardio, preeclampsia, parálisis progresiva del supranúcleo, hipertensión pulmonar primaria, radioterapia, fenómeno y enfermedad de Raynaud, enfermedad de Raynaud, enfermedad de Refsum, taquicardia de QRS estrecho regular, hipertensión renovascular, lesión por reperfusión, miocardiopatía restrictiva, sarcomas, esclerodermia, corea senil, demencia senil de tipo cuerpos de Lewy, artropatías seronegativas, accidente cerebrovascular, anemia de células falciformes, rechazo de aloinjerto de piel, síndrome de cambios en la piel, rechazo de trasplante de intestino delgado, tumores sólidos, arritmias específicas, ataxia espinal, degeneraciones espinocerebelares, miositis estreptocócica, lesiones estructurales del cerebelo, panencefalitis esclerosante subaguda, síncope, sífilis del sistema cardiovascular, anafalaxis sistémica, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, artritis reumatoide juvenil de inicio sistémico, ALL de linfocitos T o FAB, telangiectasia, tromboangitis obliterante, trombocitopenia, toxicidad, trasplantes, trauma/hemorragia, reacciones de hipersensibilidad de tipo III, hipersensibilidad de tipo IV, angina inestable, uremia, urosepsis, urticaria, enfermedades valvulares del corazón, venas varicosas, vasculitis, enfermedades venosas, trombosis venosa, fibrilación ventricular, infecciones víricas y fúngicas, encefalitis vital/meningitis aséptica, síndrome hemafagocítico vital, síndrome de Wernicke-Korsakoff, enfermedad de Wilson, rechazo de xenoinjerto de cualquier órgano o tejido, síndromes coronarios agudos, polineuritis idiopática aguda, polirradiculoneuropatía desmielinizante inflamatoria aguda, isquemia aguda, enfermedad de Still del adulto, alopecia areata, anafilaxia, síndrome de anticuerpos antifosfolípidos, anemia aplásica, arteriosclerosis, eczema atópico, dermatitis atópica, dermatitis autoinmunitaria, trastorno autoinmunitario asociado con infección por estreptococo, enteropatía autoinmunitaria, hipoacusia autoinmunitaria, síndrome linfoproliferativo autoinmunitario (ALPS, por sus siglas en inglés), miocarditis autoinmunitaria, insuficiencia ovárica prematura autoinmunitaria, blefaritis, bronquiectasis, penfigoide bulloso, enfermedad cardiovascular, síndrome antifosfolípido catastrófico, enfermedad celíaca, espondilosis cervical, isquemia crónica, penfigoide cicatricial, síndrome clínico aislado (CIS, por sus siglas en inglés) con riesgo de esclerosis múltiple, conjuntivitis, trastorno psiquiátrico de inicio en la niñez, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), dacriocistitis, dermatomiositis, retinopatía diabética, diabetes mellitus, hernia de disco, prolapso de disco, anemia hemolítica inmunitaria inducida por fármacos, endocarditis, endometriosis, endoftalmitis, epiescleritis, eritema multiforme, eritema multiforme mayor, penfigoide gestacional, síndrome de Guillain-Barre (g Bs , por sus siglas en inglés), fiebre del heno, síndrome de Hughes, enfermedad de Parkinson idiopática, neumonía intersticial idiopática, alergia mediada por IgE, anemia hemolítica inmunitaria, miositis por cuerpos de inclusión, enfermedad inflamatoria ocular infecciosa, enfermedad inflamatoria desmielinizante, enfermedad inflamatoria del corazón, enfermedad renal inflamatoria, IPF/UIP, iritis, queratitis, queratojuntivitis seca, enfermedad de Kussmaul o Enfermedad de Kussmaul-Meier, parálisis de Landry, histiocitosis de células de Langerhans, livedo reticularis, degeneración macular, poliangitis microscópica, Morbus Bechterev, trastornos de las neuronas motoras, penfigoide de las membranas mucosas, fallo multiorgánico, miastenia grave, síndrome mielodisplásico, miocarditis, trastornos de la raíz nerviosa, neuropatía, hepatitis no A no B, neuritis óptica, osteolisis, ARJ pauciarticular, oclusión arterial periférica (PAOD, por sus siglas en inglés), enfermedad vascular periférica (PVD, por sus siglas en inglés), arteriopatía periférica (^pA^d, por sus siglas en inglés), flebitis, poliarteritis nudosa (o periarteritis nudosa), policondritis, polimialgia reumática, poliosis, ARJ poliarticular, síndrome de deficiencia poliendocrina, polimiositis, polimialgia reumática (PMR, por sus siglas en inglés), síndrome post bombeo, parkinsonismo primario, prostatitis, aplasia pura de glóbulos rojos, insuficiencia suprarrenal primaria, neuromielitis óptica recurrente, reestenosis, cardiopatía reumática, SAPHO (sinovitis, acné, pustulosis, hiperostosis y osteítis), esclerodermia, amiloidosis secundaria, edema pulmonar fulminante, escleritis, ciática, insuficiencia suprarrenal secundaria, enfermedad del tejido conectivo asociada a la silicona, dermatosis de Sneddon-Wilkinson, espondilitis anquilosante, síndrome de Stevens-Johnson (SJS, por sus siglas en inglés), síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, arteritis temporal, retinitis toxoplasmática, necrólisis epidérmica tóxica, mielitis transversa, TRAPS (receptor del factor de necrosis tumoral, reacción alérgica de tipo 1, diabetes de tipo II, urticaria, neumonía intersticial habitual (UIP, por sus siglas en inglés), vasculitis, conjuntivitis primaveral, retinitis vírica, síndrome de Vogt-Koyanagi-Harada (síndrome de VKH), degeneración macular húmeda y cicatrización de heridas.

En otro aspecto, las proteínas de unión de la divulgación son para su uso en el tratamiento de un trastorno seleccionado del grupo que consiste en leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cáncer de ano, cáncer de apéndice, astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral, carcinoma basocelular, cáncer del conducto biliar extrahepático, cáncer de vejiga, cáncer de huesos, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno, glioma de tronco encefálico, tumor cerebral, glioma del tronco encefálico, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de la vía visual e hipotalámico, cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, tumor carcinoide, tumor carcinoide, carcinoma gastrointestinal de origen primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso primario, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, trastornos mieloproliferativos crónicos, cáncer de colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de linfocitos T, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, familia de tumores de Ewing, tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, cáncer extrahepático del conducto biliar, cáncer ocular, melanoma intraocular retinoblastoma, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor estromal gastrointestinal (GIST, por sus siglas en inglés), tumor de células germinales extracraneal, tumor de células germinales extragonadal, tumor de células germinales ováricas, tumor trofoblástico gestacional, glioma, glioma del tronco encefálico, glioma de astrocitoma cerebral, glioma de la vía visual e hipotalámico infantil, tricoleucemia, cáncer de cabeza y cuello, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, melanoma intraocular, carcinoma de células de islote (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (células renales), cáncer de laringe, leucemia linfoblástica aguda, leucemia mieloide aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, tricoleucemia, cáncer de labio y de la cavidad oral, cáncer de hígado, cáncer de pulmón no microcítico, cáncer de pulmón microcítico, linfoma relacionado con SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de linfocitos T, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, linfoma del sistema nervioso central primario, macroglobulinemia de Waldenstrom, histiocitoma fibroso maligno del hueso/osteosarcoma, meduloblastoma, melanoma, melanoma intraocular (ocular), carcinoma de células de Merkel, mesotelioma maligno, cáncer escamoso metastásico de cuello con tumor primario oculto, cáncer de boca, síndrome neoplásico endocrino múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, micosis fungoide, síndromes mielodisplásicos, enfermedades mielodisplásicas/mieloproliferativas, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica, mieloma múltiple, trastornos mieloproliferativos, cáncer de las fosas nasales y senos paranasales, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de la cavidad oral, cáncer de labio y orofaríngeo, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno del hueso, cáncer de ovario, cáncer de ovarios epitelial, tumor de células germinales ováricas, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de células de islote pancreáticas, cáncer de senos paranasales y fosas nasales, cáncer paratiroideo, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, tumor pituitario, neoplasia de células plasmáticas/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer de recto, cáncer de células renales (riñón), cáncer de las células de transición de pelvis renal y uréter, retinoblastoma, cáncer de las glándulas salivales, sarcoma, familia de tumores de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino, síndrome de Sezary, cáncer de piel (no melanoma), cáncer de piel (melanoma), carcinoma de piel de células de Merkel, cáncer del intestino delgado, carcinoma de células escamosas, cáncer escamoso metastásico de cuello con tumor primario oculto, cáncer de estómago (gástrico), tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, linfoma cutáneo de linfocitos T, cáncer de testículos, cáncer de garganta, timoma, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de la pelvis renal y uréter, tumor trofoblástico gestacional, cáncer de células de transición de uréter y pelvis renal, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma uterino endometrial, cáncer de vagina, glioma de la vía visual e hipotalámico, cáncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, tumor de Wilms.

En otro aspecto, lo que se divulga en el presente documento es una proteína de unión como se divulga anteriormente para su uso en un método de tratamiento de un paciente que padece un trastorno en el que la IL-13 humana es perjudicial, que comprende la etapa de administrar una cualquiera de las proteínas de unión divulgadas anteriormente, de manera simultánea o después de la administración de un segundo agente, como se analiza anteriormente. En un aspecto de la divulgación, el agente terapéutico adicional que se proporciona para su uso en la administración conjunta y/o formulación conjunta con uno o más antagonistas de IL-13, (por ejemplo, anticuerpos anti-IL-13 o fragmentos de los mismos) incluye, pero sin limitación, uno o más de: esteroides inhalados; esteroides orales; agonistas beta, por ejemplo, agonistas beta de acción corta o de acción prolongada; antagonistas de leucotrienos o receptores de leucotrienos; fármacos de combinación tal como ADVAIR; inhibidores de IgE, por ejemplo, anticuerpos anti-IgE (por ejemplo, XOLAIR); inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, inhibidores de PDE4); xantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizantes de mastocitos tales como cromolín; inhibidores de IL-4; inhibidores de IL-5; inhibidores de eotaxina/CCR3; antagonistas de la histamina o sus receptores, incluyendo H1, H2, H3 y H4, y antagonistas de la prostaglandina D o sus receptores (DPI y CRTH2). Estas combinaciones se pueden utilizar para tratar asma y otros trastornos respiratorios. Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se proporcionan para su uso en la administración conjunta y/o formulación conjunta con uno o más anticuerpos anti-IL-13 o fragmentos de los mismos incluyen uno o más de: antagonistas de TNF (por ejemplo, un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF humano p55 o p75 o derivados del mismo, por ejemplo, TNFR-IgG de 75 kD (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD, ENBREL)); antagonistas de la enzima TNF, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de TNF (TACE); antagonistas de los receptores muscarínicos; antagonistas de TGF-beta; interferón gamma; perfenidona; agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, leflunomida, o un sirolimus (rapamicina) o un análogo de los mismos, por ejemplo, CCI-779; inhibidores de COX2 y cPLA2; AINE; inmunomoduladores; inhibidores de p38, TPL-2, inhibidores de MK-2 y NFkB, entre otros. El segundo agente adicional se selecciona del grupo que consiste en budenosida, factor de crecimiento epidérmico, corticoesteroides, ciclosporina, sulfasalazina, aminosalicilatos, 6-mercaptopurina, azatioprina, metronidazol, inhibidores de la lipoxigenasa, mesalamina, olsalazina, balsalazida, antioxidantes, inhibidores de tromboxano, antagonistas del receptor de IL-1, anticuerpos monoclonales anti-IL-1 p, anticuerpos monoclonales anti-IL-6, factores de crecimiento, inhibidores de elastasa, compuestos de piridinil-imidazol, anticuerpos o agonistas de TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF y PDGF, anticuerpos de CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 o sus ligandos, metotrexato, ciclosporina, FK506, rapamicina, micofenolato mofetilo, leflunomida, AINE, ibuprofeno, corticoesteroides, prednisolona, inhibidores de la fosfodiesterasa, agonistas de adenosina, agentes antitrombóticos, inhibidores del complemento, agentes adrenérgicos, IRAK, NIK, IKK, p38, Inhibidores de la MAP cinasa, inhibidores de la enzima convertidora de IL-1 p, inhibidores de la enzima convertidora de TNFah, Inhibidores de la señalización de linfocitos T, inhibidores de metaloproteinasas, sulfasalazina, azatioprina, 6-mercaptopurinas, inhibidores de la enzima convertidora de la

angiotensina, receptores de citocinas solubles, receptor de TNF p55 soluble, receptor de TNF p75 soluble, sIL-1RI,

sIL-1RII, sIL-6R, citocinas antiinflamatorias, IL-4, IL-10, IL-11 y TGFp.

En un aspecto preferido de la divulgación, las composiciones farmacéuticas divulgadas anteriormente son para su

uso en la administración al sujeto mediante al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo,

intramuscular, intravenoso, intrarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario,

intracelular, intracerebeloso, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático,

intramiocárdico, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdiaco, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar,

intrarrectal, intrarrenal, intrarretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, en bolo, vaginal,

rectal, bucal, sublingual, intranasal y transdérmico.

Un aspecto de la divulgación proporciona al menos un anticuerpo antiidiotípico de IL-13 para al menos una proteína

de unión a IL-13 de la presente divulgación. El anticuerpo antiidiotípico incluye cualquier molécula que contenga

proteína o péptido que comprenda al menos una porción de una molécula de inmunoglobulina tal como, pero sin

limitación, al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) de una cadena pesada o ligera o una

porción de unión a ligando de la misma, una región variable de cadena pesada o cadena ligera, una región constante

de cadena pesada o cadena ligera, una región marco, o; cualquier porción de las mismas, que se puede incorporar

en una proteína de unión de la presente divulgación.

En una segunda realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o

prevención del asma según la primera realización, donde el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO:

81.

En una tercera realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o

prevención del asma según la primera o la segunda realización, donde el anticuerpo comprende además un marco

aceptor humano.

En una cuarta realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o

prevención del asma según la tercera realización, donde el marco aceptor humano comprende una secuencia de

aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9,

SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31.

En una quinta realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la

prevención del asma según una cualquiera de las realizaciones 1-4, donde el anticuerpo comprende una región

constante de cadena pesada de IgG1 humana que comprende una región bisagra que comprende un cambio de

leucina a alanina en la posición 234 y un cambio de leucina a alanina en la posición 235.

En una sexta realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la

prevención del asma según una cualquiera de las realizaciones 1-5, donde el anticuerpo comprende cuatro dominios

variables, donde cada uno de los dos dominios variables comprende un conjunto de CDR de VH de 13C5 y cada uno

de los otros dos de los otros dos dominios variables comprende un conjunto de CDR de VL de 13C5.

En una séptima realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o

prevención del asma según la realización 6, donde cada uno de los dos dominios variables comprende la secuencia

de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 y cada uno de los otros dos dominios variables comprende la secuencia de

aminoácidos de la SEQ ID NO: 81.

En una octava realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la

prevención del asma según una cualquiera de las realizaciones 1-7, donde la composición comprende además al

menos un agente adicional, donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en: un agente terapéutico, un

agente de obtención de imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis, un inhibidor de cinasas, un

bloqueante de moléculas de coestimulación, un bloqueante de moléculas de adhesión, un anticuerpo anticitocinas o

un fragmento funcional del mismo; metotrexato, una ciclosporina, una rapamicina, un FK506, un marcador o

indicador detectable, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, fármacos

antiinflamatorios no esteroideos (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un

bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una

eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un

fármaco de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un

medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o análogo, una

citocina y un antagonista de citocina.

En una novena realización, la presente invención proporciona una composición para su uso en el tratamiento o la prevención del asma según una cualquiera de las realizaciones 1-8, donde el asma es asma alergénica o no alergénica.

Descripción detallada de la invención

El alcance de la invención se define mediante las reivindicaciones adjuntas. En la medida en que otros aspectos de la divulgación se encuentren fuera del alcance de la presente invención como se define en las reivindicaciones adjuntas, se presentan con fines comparativos.

Esta divulgación se refiere a proteínas de unión a IL-13 humana, particularmente anticuerpos anti-IL-13 o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen a IL-13. Varios aspectos de la divulgación se refieren a anticuerpos y fragmentos de anticuerpos y composiciones farmacéuticas de los mismos, así como ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospedadoras para preparar tales anticuerpos y fragmentos. La divulgación también abarca métodos de uso de anticuerpos de la divulgación para detectar IL-13 humana, para inhibir la actividad de la IL-13 humana, ya sea in vitro o in vivo; y para regular la expresión génica.

A menos que se defina de otra forma en el presente documento, los términos científicos y técnicos utilizados en relación con la presente divulgación han de tener los significados que se entienden comúnmente por los expertos habituales en la materia. El significado y alcance de los términos deben ser claros, sin embargo, en el caso de cualquier ambigüedad latente, las definiciones proporcionadas en el presente documento tienen precedencia sobre cualquier diccionario o definición extrínsecos. Aún más, a menos que el contexto requiera otra cosa, los términos en singular incluirán los términos en plural y los términos en plural incluirán el singular. En la presente solicitud, el uso de "o" significa "y/o" a no ser que se indique otra cosa. Asimismo, el uso del término "incluyendo", así como otras formas, tales como "incluye" e "incluido", no es limitante. También, términos tales como "elemento" o "componente" abarcan tanto elementos como componentes que comprenden una unidad y elementos y componentes que comprenden más de una subunidad, a menos que se indique específicamente lo contrario.

Generalmente, las nomenclaturas usadas vinculadas con, y las técnicas de, cultivo celular y cultivo de tejidos, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química e hibridación de proteínas y de ácidos nucleicos descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Los métodos y técnicas de la presente divulgación se llevan a cabo generalmente según los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y según se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan en la totalidad de la presente memoria descriptiva salvo que se indique otra cosa. Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante, como comúnmente se realizan en la técnica o como se describen en el presente documento. La terminología usada vinculada con, y los procedimientos de laboratorio y las técnicas de, química analítica, química orgánica sintética, y química médica y farmacéutica descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Se utilizan técnicas convencionales para síntesis químicas, análisis químico, la preparación, formulación y suministro de productos farmacéuticos y tratamiento de pacientes.

Para que la presente divulgación pueda entenderse más fácilmente, los términos seleccionados se definen a continuación.

El término "polipéptido", tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier cadena polimérica de aminoácidos. Los términos "péptido" y "proteína" se usan indistintamente con el término polipéptido y también se refieren a una cadena polimérica de aminoácidos. El término "polipéptido" abarca proteínas naturales o artificiales, fragmentos de proteínas y análogos de polipéptidos de una secuencia de proteínas. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.

El término "proteína aislada" o "polipéptido aislado" es una proteína o polipéptido que en virtud de su origen o fuente de derivación no está asociado con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado natural; está sustancialmente libre de otras proteínas de la misma especie; se expresa por una célula de una especie diferente; o no se da en la naturaleza. Por tanto, un polipéptido que se sintetiza químicamente o se sintetiza en un sistema celular diferente de la célula de la que se origina naturalmente estará "aislado" de sus componentes asociados de manera natural. Una proteína también puede quedar sustancialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante aislamiento, utilizando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica.

El término "recuperar", tal como se usa en el presente documento, se refiere al proceso de convertir una especie química, tal como un polipéptido, sustancialmente libre de componentes asociados de manera natural mediante aislamiento, por ejemplo, utilizando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la técnica.

Las expresiones "IL-13 humana" e "IL-13 humana de tipo silvestre" (abreviados en el presente documento como h IL-13, h IL-13wt), como se usa en el presente documento, incluyen una citocina humana que es secretada principalmente por los linfocitos T auxiliares 2. Las expresiones incluyen una proteína monomérica de polipéptido de 13 kDa. La estructura de IL-13 humana se describe con más detalle en, por ejemplo, (Moy, Diblasio et al. 2001 J Mol Biol 310 219-30). La expresión IL-13 humana pretende incluir IL-13 humana recombinante (rhIL-13), que puede prepararse mediante métodos de expresión recombinantes convencionales. La tabla 1 muestra la secuencia de aminoácidos de IL-13 humana, SEQ ID NO: 1, que es conocida en la técnica.

Tabla 1: Secuencia de IL-13 humana

La expresión "variante de IL-13 humana" (abreviada en el presente documento como h IL-13v), como se usa en el presente documento, incluye una variante de IL-13 humana donde el resto de aminoácido 130 de la SEQ ID NO: 1 se cambia de arginina a glutamina (R130Q).

"Actividad biológica" tal como se usa en el presente documento, se refiere a todas las propiedades biológicas inherentes de la citocina. Las propiedades biológicas de IL-13 incluyen, pero sin limitación, la unión al receptor de IL-13; (otros ejemplos incluyen el cambio de isotipo de inmunoglobulina a IgE en linfocitos B humanos y la supresión de la producción de citocinas inflamatorias).

Las expresiones "unión específica" o "que se une específicamente", como se usa en el presente documento, en referencia a la interacción de un anticuerpo, una proteína o un péptido con una segunda especie química, significa que la interacción depende de la presencia de una estructura particular (por ejemplo, un determinante antigénico o epítopo) en la especie química; por ejemplo, un anticuerpo reconoce y se une a una estructura de proteína específica en lugar de a proteínas en general. En caso de que un anticuerpo sea específico para el epítopo "A", la presencia de una molécula que contiene el epítopo A (o A libre, no marcado), en una reacción que contiene "A" marcado y el anticuerpo, reducirá la cantidad de A marcado unido al anticuerpo.

El término "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere en términos generales a cualquier molécula de inmunoglobulina (Ig) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L), o cualquier fragmento funcional, mutante, variante, o derivación de la misma, que conserva las características esenciales de unión al epítopo de una molécula de Ig. Dichos formatos de anticuerpos mutantes, variantes o derivados son conocidos en la técnica. Aspectos no limitantes de los cuales se comentan a continuación. En un anticuerpo de longitud completa, cada cadena pesada está compuesta por una región variable de cadena pesada (abreviada en el presente documento como HCVR o VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada está compuesta de tres dominios, CHI, CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta por una región variable de cadena ligera (abreviada en el presente documento como LCVR o VL) y una región constante de cadena ligera. La región constante de la cadena ligera está compuesta de un dominio, CL. Las regiones VH y VL se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco (FR). Cada VH y VL se compone de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino hasta el extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las moléculas de inmunoglobulina pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG 1, IgG2, IgG 3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase.

La expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa en el presente documento, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad de unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, hIL-13). Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo se puede realizar mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Dichos aspectos de anticuerpos también pueden ser formatos biespecíficos, duales específicos o multiespecíficos; que se unen específicamente a dos o más antígenos diferentes. Los ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo, (v) un fragmento de dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546, Winter et al., publicación del PCT WO 90/05144 A1), que comprende un único dominio variable; y (vi) una región determinante de la complementariedad (CDR) aislada. Asimismo, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, están codificados por genes separados, se pueden unir, utilizando métodos recombinantes, mediante un enlazador sintético que permite producirlos como una sola cadena de proteína en la que se emparejan las regiones VL y VH para formar moléculas monovalentes (lo que se conoce como Fv monocatenario (scFv); véase, por ejemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). También se pretende que dichos anticuerpos monocatenarios estén abarcados dentro de la expresión "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. También están abarcadas otras formas de anticuerpos monocatenarios, tales como diacuerpos. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos, en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptídica, pero usando un enlazador que es demasiado corto como para permitir el emparejamiento entre los dos dominios de la misma cadena, forzando así a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Tales porciones de unión a anticuerpos son conocidas en la técnica (Kontermann y Dubel eds., Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. Nueva York. 790 págs. (ISBN 3 540-41354-5).

La expresión "construcción de anticuerpo" tal como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido que comprende una o más porciones de unión a antígeno de la divulgación unidas a un polipéptido enlazador o un dominio constante de inmunoglobulina. Los polipéptidos enlazadores comprenden dos o más restos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y se utilizan para enlazar una o más porciones de unión a antígeno. Dichos polipéptidos enlazadores son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R.J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123). Un dominio constante de inmunoglobulina se refiere a un dominio constante de cadena ligera o pesada. Las secuencias de aminoácidos de dominio constante de cadena pesada y cadena ligera de IgG humana se conocen en la técnica y se representan en la tabla 2.

Tabla 2: Secuencia de dominio constante de cadena pesada y dominio constante de cadena ligera de IgG humana

Aún más, un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo puede ser parte de una molécula de inmunoadhesión más grande, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o porción de anticuerpo con una o más proteínas o péptidos diferentes. Ejemplos de tales moléculas de inmunoadhesión incluyen el uso de la región central de estreptavidina para producir una molécula scFv tetramérica (Kipriyanov, S.M., et al. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) y el uso de una resto de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta de polihistidina carboxiterminal para producir moléculas scFv bivalentes y biotiniladas (Kipriyanov, S.M., et al. (1994) Mol. Immunol. 31:1047-1058). Las porciones de anticuerpos, tales como fragmentos Fab y F(ab ')2, se pueden preparar a partir de anticuerpos completos utilizando técnicas convencionales, tales como digestión con papaína o pepsina, respectivamente, de anticuerpos completos. Por otra parte, pueden obtenerse anticuerpos, porciones de anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión usando técnicas de ADN recombinante convencionales, como se describe en el presente documento.

Un "anticuerpo aislado", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a hIL-13 está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de hIL-13). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a hIL-13 puede tener, sin embargo, reactividad cruzada con otros antígenos, tal como moléculas de IL-13 de otras especies. Por otra parte, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos.

La expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la divulgación pueden incluir restos de aminoácidos no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR y en particular CDR3. Sin embargo, la expresión "anticuerpo humano", como se usa en el presente documento, no pretende incluir anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias marco humanas.

La expresión "anticuerpo humano recombinante", como se usa en el presente documento, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedadora (descrito más adelante en la Sección II C, a continuación), anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante, combinatoria (Hoogenboom H.R., (1997) TIB Tech. 15:62-70; Azzazy H. y Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35:425-445; Gavilondo J.V.y Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145; Hoogenboom H. y Chames P. (2000) Immunology Today 21:371-378), anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucl. Acids Res.

20:6287-6295; Kellermann S-A. y Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597; Little M. et al (2000) Immunology Today 21:364-370) o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados por cualquier otro medio que implique el corte y empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes procedentes de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. En determinados aspectos, sin embargo, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o, cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo) y, por lo tanto, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque proceden de y están relacionadas con secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, no pueden existir de forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Un aspecto proporciona anticuerpos completamente humanos capaces de unirse a IL-13 humana que se pueden generar usando técnicas bien conocidas en la técnica, tales como, pero sin limitación, utilizando bibliotecas de fagos de Ig humana tal como las divulgadas en Jermutus et al., publicación del PCT N.° WO 2005/007699 A2.

La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie y secuencias de región constante de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena ligera y pesada murinas unidas a regiones constantes humanas.

La expresión "anticuerpo injertado con CDR" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de regiones variables de cadena pesada y ligera de una especie, pero en las que las secuencias de una o más de las regiones CDR de VH y/o VL se reemplazan con secuencias de CDR de otra especie, tales como anticuerpos que tienen regiones variables de cadena ligera y pesada murina en las que una o más de las CDR murinas (por ejemplo, CDR3) se han reemplazado con secuencias de CDR humanas.

La expresión "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos que comprenden secuencias de región variable de cadena pesada y ligera de una especie no humana (por ejemplo, un ratón) pero en las que se ha alterado al menos una porción de la secuencia de V^hy/o VL para que sea más "similar a la humana", es decir, más similar a las secuencias variables de línea germinal humana. Un tipo de anticuerpo humanizado es un anticuerpo injertado con CDR, en el que las secuencias de CDR humanas se introducen en secuencias de VH y VL no humanas para reemplazar las correspondientes secuencias de CDR no humanas. En un aspecto, se proporcionan anticuerpos humanizados anti-IL-13 humana y porciones de unión a antígeno. Dichos anticuerpos se generaron mediante la obtención de anticuerpos monoclonales murinos anti-hIL-13 usando tecnología de hibridoma tradicional seguida de humanización usando ingeniería genética in vitro, tales como los divulgados en Kasaian et al, publicación del PCT N.° WO 2005/123126 A2.

Las expresiones "numeración de Kabat", "definiciones de Kabat" y el "marcado de Kabat" se usan indistintamente en el presente documento. Estas expresiones, que son reconocidas en la técnica, se refieren a un sistema de numeración de restos de aminoácidos que son más variables (es decir, hipervariables) que otros restos de aminoácidos en las regiones variables de cadena pesada y ligera de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo (Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad, Sci. 190:382-391 y, Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación NIH N.° 91-3242). Para la región variable de cadena pesada, la región hipervariable varía desde las posiciones de aminoácidos 31 a 35 para CDR1, posiciones de aminoácidos 50 a 65 para CDR2 y posiciones de aminoácidos 95 a 102 para CDR3. Para la región variable de cadena ligera, la región hipervariable varía desde las posiciones de aminoácidos 24 a 34 para CDR1, posiciones de aminoácidos 50 a 56 para CDR2 y posiciones de aminoácidos 89 a 97 para CDR3.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "aceptor" y "anticuerpo aceptor" se refieren al anticuerpo o secuencia de un ácido nucleico que proporciona o codifica al menos un 80 %, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o el 100 % de las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones marco. En algunos aspectos, el término "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de un anticuerpo que proporciona o codifica la una o más regiones constantes. En otro aspecto más, el término "aceptor" se refiere a la secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de un anticuerpo que proporciona o codifica una o más de las regiones marco y la una o más regiones constantes. En un aspecto específico, el término "aceptor" se refiere a una secuencia de aminoácidos o ácidos nucleicos de un anticuerpo humano que proporciona o codifica al menos un 80 %, preferentemente, al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o el 100 % de las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones marco. De acuerdo con este aspecto, un aceptor puede contener al menos 1, al menos 2, al menos 3, al menos 4, al menos 5, o al menos 10 restos de aminoácidos que se producen o no, en una o más posiciones específicas de un anticuerpo humano. Una región marco aceptora y/o una región o regiones constantes aceptoras pueden proceder u obtenerse, por ejemplo, de un gen de anticuerpo de línea germinal, un gen de anticuerpo maduro, un anticuerpo funcional (por ejemplo, anticuerpos bien conocidos en la técnica, anticuerpos en desarrollo o anticuerpos disponibles comercialmente).

Como se usa en el presente documento, el término "CDR" se refiere a la región determinante de la complementariedad dentro de secuencias variables de anticuerpos. Hay tres CDR en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que se denominan CDR1, CDR2 y CDR3, por cada una de las regiones variables. La expresión "conjunto de CDR", como se usa en el presente documento, se refiere a un grupo de tres CDR que se produce en una sola región variable capaz de unirse al antígeno. Los límites exactos de estas CDR se han definido de manera diferente según diferentes sistemas. El sistema descrito por Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) no solo proporciona un sistema de numeración de restos unívoco aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, sino que también proporciona límites precisos de restos que definen las tres CDR. Estas CDR pueden denominarse CDR de Kabat. Chothia y colaboradores (Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)) descubrieron que determinadas subporciones dentro de las CDR de Kabat adoptan conformaciones de la cadena principal peptídica prácticamente idénticas, a pesar de tener una gran diversidad a nivel de secuencia de aminoácidos. Estas subporciones se denominaron L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 donde la "L" y la "H" indican las regiones de cadena ligera y cadena pesada, respectivamente. Estas regiones se pueden denominar CDR de Chothia, que tienen límites que se solapan con las CDR de Kabat. Padlan (FASEB J. 9:133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262 (5): 732-45 (1996)) han descrito otros límites que definen las CDR que se solapan con las CDR de Kabat. Otras definiciones más de límites de CDR pueden no seguir estrictamente uno de los sistemas anteriores, pero sin embargo se solaparán con las CDR de Kabat, aunque pueden estar acortadas o alargadas en vista de la predicción o de hallazgos experimentales de que restos o grupos de restos particulares o incluso CDR enteras no tienen un impacto significativo en la unión al antígeno. Los métodos usados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas según cualquiera de estos sistemas, aunque los aspectos preferidos utilizan las CDR definidas por Kabat o Chothia.

Como se usa en el presente documento, el término resto "canónico" se refiere a un resto en una CDR o marco que define una estructura de CDR canónica particular como la define Chothia et al. (J. Mol. Biol. 196:901-907 (1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992)). Según Chothia et al., las porciones críticas de las CDR de muchos anticuerpos tienen conformaciones de la cadena principal peptídica casi idénticas a pesar de la gran diversidad a nivel de secuencia de aminoácidos. Cada estructura canónica especifica principalmente un conjunto de ángulos de torsión de la cadena principal peptídica para un segmento contiguo de restos de aminoácidos que forman un bucle.

Como se usa en el presente documento, las expresiones "donante" y "anticuerpo donante" se refieren a un anticuerpo que proporciona una o más CDR. En un aspecto preferido, el anticuerpo donante es un anticuerpo de una especie diferente del anticuerpo del que se obtienen o proceden las regiones marco. En el contexto de un anticuerpo humanizado, la expresión "anticuerpo donante" se refiere a un anticuerpo no humano que proporciona una o más CDR.

Como se usa en el presente documento, la expresión "marco" o "secuencia marco" se refiere a las secuencias restantes de una región variable menos las CDR. Debido a que la definición exacta de una secuencia de CDR puede determinarse por diferentes sistemas, el significado de una secuencia marco está sujeto a interpretaciones correspondientemente diferentes. Las seis CDR (CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 de cadena ligera y CDR-H1, CDR-H2 y CDR-H3 de la cadena pesada) también dividen las regiones marco en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en las que la CDR1 está posicionada entre la FR1 y la FR2, la CDR2 entre la FR2 y la FR3 y la CDR3 entre la FR3 y la FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región marco, como se cita por otros, representa las FR combinadas dentro de la región variable de una sola cadena de inmunoglobulina de origen natural. Como se usa en el presente documento, una FR representa una de las cuatro subregiones y las FR representan dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región marco.

Las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humanas se conocen en la técnica. En un aspecto de la divulgación, las secuencias aceptoras de cadena pesada y cadena ligera humanas se seleccionan de las secuencias descritas en la tabla 3 y la tabla 4.

TABLA 3: SECUENCIAS ACEPTADORAS DE CADENA PESADA

TABLA 4 SECUENCIAS ACEPTADORAS DE CADENA DE LIGERA

continuación

Como se usa en el presente documento, la expresión "gen de anticuerpo de la línea germinal" o "fragmento génico" se refiere a una secuencia de inmunoglobulina codificada por células no linfoides que no han experimentado el proceso de maduración que da lugar al reordenamiento genético y la mutación para la expresión de una inmunoglobulina particular. (Véanse, por ejemplo, Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)). Una de las ventajas proporcionadas por varios aspectos de la presente divulgación se deriva del reconocimiento de que los genes de anticuerpos de la línea germinal tienen más probabilidades que los genes de anticuerpos maduros de conservar las estructuras de secuencias de aminoácidos esenciales características de los individuos de la especie, por lo tanto, es menos probable que se reconozca como de una fuente extraña cuando se usa terapéuticamente en esa especie.

Como se usa en el presente documento, el término restos "clave" se refiere a ciertos restos dentro de la región variable que tienen más impacto en la especificidad y/o afinidad de unión de un anticuerpo, en particular, un anticuerpo humanizado. Un resto clave incluye, pero sin limitación, uno o más de los siguientes: un resto adyacente a una CDR, un posible sitio de glucosilación (puede ser un sitio de N-glucosilación u O-glucosilación), un resto raro, un resto capaz de interactuar con el antígeno, un resto capaz de interactuar con una CDR, un resto canónico, un resto de contacto entre la región variable de cadena pesada y la región variable de cadena ligera, un resto dentro de la zona de Vernier y un resto en la región que se solapa entre la definición de Chothia de una CDR1 de cadena pesada variable y la definición de Kabat del primer marco de cadena pesada.

Como se usa en el presente documento, la expresión "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo o una variante, derivado, análogo o fragmento del mismo que se une inmunoespecíficamente a un antígeno de interés y que comprende una región marco (FR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo humano y una región determinante de la complementariedad (CDR) que tiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo no humano. Como se usa en el presente documento, el término "sustancialmente" en el contexto de una CDR se refiere a una CDR que tiene una secuencia de aminoácidos al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, al menos un 90 %, al menos un 95 %, al menos un 98 % o al menos un 99 % idéntica a la secuencia de aminoácidos de una CDR de anticuerpo no humano. Un anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno y normalmente dos, dominios variables (Fab, Fab', F(ab') 2, FabC, Fv) en los que todas o sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a aquellas de una inmunoglobulina no humana (es decir, anticuerpo donante) y todas o sustancialmente todas las regiones marco son aquellas de una secuencia consenso de inmunoglobulina humana. Preferentemente, un anticuerpo humanizado también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), normalmente, la de una inmunoglobulina humana. En algunos aspectos, un anticuerpo humanizado contiene tanto la cadena ligera, así como al menos el dominio variable de una cadena pesada. El anticuerpo también puede incluir las regiones CHI, bisagra, CH2, CH3 y CH4 de la cadena pesada. En algunos aspectos, un anticuerpo humanizado contiene únicamente una cadena ligera humanizada. En algunos aspectos, un anticuerpo humanizado contiene únicamente una cadena pesada humanizada. En aspectos específicos, un anticuerpo humanizado contiene únicamente un dominio variable humanizado de una cadena ligera y/o una cadena pesada humanizada.

El anticuerpo humanizado puede seleccionarse de cualquier clase de inmunoglobulinas, incluyendo IgM, IgG, IgD, IgA e IgE y cualquier isotipo, incluyendo, sin limitación, IgG 1, IgG2, IgG3 y IgG4. El anticuerpo humanizado puede comprender secuencias de más de una clase o isotipo y pueden seleccionarse dominios constantes particulares para optimizar las funciones efectoras deseadas usando técnicas bien conocidas en la técnica.

Las regiones marco y CDR de un anticuerpo humanizado no necesitan corresponder exactamente a las secuencias precursoras, por ejemplo, la CDR o el marco consenso del anticuerpo donante pueden mutagenizarse mediante sustitución, inserción y/o eliminación de al menos un resto de aminoácido, de tal forma que el resto de la CDR o el marco en el sitio no corresponde con el anticuerpo donante o el marco consenso. En un aspecto preferido, dichas mutaciones, sin embargo, no serán extensas. Habitualmente, al menos un 80 %, preferentemente al menos un 85 %, más preferentemente al menos un 90 % y lo más preferentemente al menos un 95 % de los restos de anticuerpo humanizado corresponderán a los de las secuencias de FR y CDR precursoras. Como se usa en el presente documento, la expresión "marco consenso" se refiere a la región marco en la secuencia de inmunoglobulina consenso. Como se usa en el presente documento, la expresión "secuencia de inmunoglobulina consenso" se refiere a la secuencia formada a partir de los aminoácidos (o nucleótidos) de aparición más frecuente en una familia de secuencias de inmunoglobulina relacionadas (véase, por ejemplo, Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemania, 1987). En una familia de inmunoglobulinas, cada posición en la secuencia consenso está ocupada por el aminoácido que se da con más frecuencia en esa posición en la familia. En caso de que dos aminoácidos se den con la misma frecuencia por igual, se puede incluir cualquiera de ellos en la secuencia consenso.

Como se usa en el presente documento, la zona de "Vemier" se refiere a un subconjunto de restos marco que pueden ajustar la estructura de CDR y afinar el ajuste al antígeno como describen Foote y Winter (1992, J. Mol. Biol.

224:487-499). Los restos de la zona de Vernier forman una capa subyacente a las CDR y pueden afectar a la estructura de las CDR y la afinidad del anticuerpo.

La expresión "proteína de unión multivalente" se usa en la presente solicitud para indicar una proteína de unión que comprende dos o más sitios de unión a antígeno. La proteína de unión multivalente se modifica por ingeniería preferentemente para que tenga los tres o más sitios de unión a antígeno y normalmente no es un anticuerpo de origen natural. La expresión "proteína de unión multiespecífica" se refiere a una proteína de unión que puede unirse a dos o más dianas relacionadas o no relacionadas. Proteínas de unión de dominio variable doble (DVD, por sus siglas en inglés) tal como se usa en el presente documento, son proteínas de unión que comprenden dos o más sitios de unión a antígeno y son proteínas de unión tetravalentes o multivalentes. Estos DVD pueden ser monoespecíficos, es decir, capaces de unirse a un antígeno o multiespecíficos, es decir, capaces de unirse a dos o más antígenos. Las proteínas de unión de DVD que comprenden dos polipéptidos de DVD de cadena pesada y dos polipéptidos de DVD de cadena ligera se denominan DVD Ig. Cada mitad de una DVD Ig comprende un polipéptido de DVD de cadena pesada y un polipéptido de DVD de cadena ligera y dos sitios de unión a antígeno. Cada sitio de unión comprende un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera con un total de 6 CDR implicadas en la unión al antígeno por sitio de unión a antígeno.

Como se usa en el presente documento, el término "neutralizante" se refiere a la neutralización de la actividad biológica de una citocina cuando una proteína de unión se une específicamente a la citocina. Preferentemente, una proteína de unión neutralizante es un anticuerpo neutralizante cuya unión a hIL-13 y/o hIL-13 da como resultado la inhibición de una actividad biológica de hIL-13 y/o hIL-13. Preferentemente, la proteína de unión neutralizante se une a hIL-13 y/o hIL-13 y reduce la actividad biológica de IL-13 y/o hIL-13 en al menos aproximadamente un 20 %, 40 %, 60 %, 80 %, 85 % o más. La inhibición de una actividad biológica de hIL-13 y/o hIL-13 por una proteína de unión neutralizante puede evaluarse midiendo uno o más indicadores de la actividad biológica de hIL-13 y/o hIL-13 bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, la inhibición de la producción de TARC (CCL-17) inducida por IL-13 humana por las células A-549 (véase el ejemplo 1.1.C).

El término "actividad" incluye actividades tales como la especificidad/afinidad de unión de un anticuerpo por un antígeno, por ejemplo, un anticuerpo anti-hIL-13 que se une a un antígeno IL-13 y/o la potencia neutralizante de un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo anti-hIL-13 cuya unión a hIL-13 inhibe la actividad biológica de hIL-13, por ejemplo. Por ejemplo, la inhibición de la producción de TARC (CCL-17) inducida por IL-13 humana por las células A-549 (véase el ejemplo 1.1.C).

El término "epítopo" incluye cualquier determinante polipeptídico capaz de unirse específicamente a una inmunoglobulina o receptor de linfocitos T. En determinados aspectos, los determinantes de epítopos incluyen agrupaciones superficiales químicamente activas de moléculas tales como aminoácidos, cadenas laterales de azúcar, fosforilo o sulfonilo y, en determinados aspectos, pueden tener características estructurales tridimensionales específicas y/o características de carga específicas. Un epítopo es una región de un antígeno que está unida por un anticuerpo. En determinados aspectos, se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando reconoce preferentemente su antígeno diana en una mezcla compleja de proteínas y/o macromoléculas.

La expresión "resonancia de plasmón superficial", como se usa en el presente documento, se refiere a un fenómeno óptico que permite el análisis de interacciones bioespecíficas en tiempo real mediante la detección de alteraciones en las concentraciones de proteínas dentro de una matriz de biosensor, por ejemplo, utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia y Piscataway, Nueva Jersey). Para más descripciones, véase Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11:620-627; Johnsson, B., et al. (1995) J. Mol. Recognit. 8:125-131; y Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198:268-277.

El término "kon", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de velocidad de activación para la asociación de un anticuerpo al antígeno para formar el complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica.

El término "koff", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo anticuerpo/antígeno como se conoce en la técnica. El término "KD", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a la constante de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular como se conoce en la técnica.

La expresión "proteína de unión marcada" tal como se usa en el presente documento, se refiere a una proteína con una etiqueta incorporada que proporciona la identificación de la proteína de unión. Preferentemente, la etiqueta es un marcador detectable, por ejemplo, incorporación de un aminoácido radiomarcado o unión a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero sin limitación, los siguientes: radioisótopos o radionucleidos (por ejemplo, 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho o 153Sm); etiquetas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, fósforos de lantánidos), etiquetas enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, luciferasa, fosfatasa alcalina); marcadores quimioluminiscentes; grupos biotinilo; epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de pares de cremallera de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, epítopo de identificación); y agentes magnéticos, tales como los quelatos de gadolinio.

La expresión "conjugado de anticuerpo" se refiere a una proteína de unión, tal como un anticuerpo, unido químicamente a un segundo resto químico, tal como un agente terapéutico o citotóxico. El término "agente" se usa en el presente documento para indicar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto elaborado a partir de materiales biológicos. Preferentemente, los agentes terapéuticos o citotóxicos incluyen, pero sin limitación, toxina pertussis, taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y análogos u homólogos de los mismos.

Los términos "cristal" y "cristalizado" tal como se usan en el presente documento, se refieren a un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que existe en forma de un cristal. Los cristales son una forma del estado sólido de la materia, que es distinto de otras formas tales como el estado sólido amorfo o el estado cristalino líquido. Los cristales se componen de matrices regulares, de repetición, tridimensionales de átomos, iones, moléculas (por ejemplo, proteínas tales como anticuerpos) o ensamblajes moleculares (por ejemplo, complejos antígeno/anticuerpo). Estas matrices tridimensionales se organizan según relaciones matemáticas específicas que se comprenden bien en el campo. La unidad fundamental, o componente básico, que se repite en un cristal se llama unidad asimétrica. La repetición de la unidad asimétrica en una disposición que se ajusta a una determinada simetría cristalográfica bien definida proporciona la "celda unitaria" del cristal. La repetición de la celda unitaria mediante traslaciones regulares en las tres dimensiones proporciona el cristal. Véase Giege, R. y Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2a edición, págs 201-16, Oxford University Press, Nueva York, Nueva York, (1999)".

El término "polinucleótido" tal como se denomina en el presente documento significa una forma polimérica de dos o más nucleótidos, tanto ribonucleótidos como desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN monocatenarias y bicatenarias, pero preferentemente es ADN bicatenario.

La expresión "polinucleótido aislado" tal como se usa en el presente documento significará un polinucleótido (por ejemplo, de origen genómico, ADNc o sintético, o alguna combinación de los mismos) que, debido a su origen, el "polinucleótido aislado": no está asociado con todo o una parte de un polinucleótido con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza; está unido operativamente a un polinucleótido con el que no está unido en la naturaleza; o no se produce en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

El término "vector", como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una molécula de un ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN bicatenario circular en el que pueden unirse segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector vírico, donde pueden unirse segmentos de ADN adicionales en el genoma vírico. Determinados vectores son capaces de replicarse de manera autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómicos de mamífero). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) pueden integrarse en el genoma de una célula hospedadora tras su introducción en la célula hospedadora y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Por otra parte, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que están unidos operativamente. Dichos vectores se denominan en el presente documento "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente "vectores de expresión"). En general, los vectores de expresión útiles en las técnicas de ADN recombinante se encuentran normalmente en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente, ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la divulgación pretende incluir dichas formas de vectores de expresión diferentes, tales como los vectores víricos (por ejemplo, retrovirus defectuosos en la replicación, adenovirus y virus adenoasociados), que tienen funciones equivalentes.

La expresión "unido operativamente" se refiere a una yuxtaposición donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia de control "unida operativamente" a una secuencia codificante está unida de tal manera que se consigue la expresión de la secuencia codificante en condiciones compatibles con las secuencias de control. Las secuencias "unidas operativamente" incluyen tanto secuencias de control de expresión que son contiguas con el gen de interés como secuencias de control de expresión que actúan en trans o a una distancia para controlar el gen de interés. La expresión "secuencia de control de la expresión" tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias codificantes a las que están unidas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio de la transcripción, terminación, promotoras y potenciadoras adecuadas; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y poliadenilación; secuencias que estabilizan el ARNm citoplasmático; secuencias que potencian la eficacia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando se desee, secuencias que potencian la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere dependiendo del organismo hospedador; en procariotas, dichas secuencias de control incluyen generalmente un promotor, sitio de unión a ribosomas y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y secuencias de terminación de la transcripción. La expresión "secuencias de control" pretende incluir componentes cuya presencia es esencial para la expresión y el procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias líder y secuencias de compañeros de fusión. Las construcciones de proteínas de la presente divulgación pueden expresarse y purificarse usando vectores de expresión y células hospedadoras conocidas en la técnica, incluyendo casetes de expresión, vectores, células hospedadoras recombinantes y métodos para la expresión recombinante y el procesamiento proteolítico de poliproteínas y preproteínas recombinantes a partir de un único marco de lectura abierto (por ejemplo, documento WO 2007/014162).

"Transformación", tal como se define en el presente documento, se refiere a cualquier proceso por el cual el ADN exógeno ingresa a una célula hospedadora. La transformación puede tener lugar en condiciones naturales o artificiales usando varios métodos bien conocidos en la técnica. La transformación puede depender de cualquier método conocido para la inserción de secuencias de ácidos nucleicos extrañas en una célula hospedadora procariota o eucariota. El método se selecciona en función de la célula hospedadora que se está transformando y puede incluir, pero sin limitación, infección vírica, electroporación, lipofección y bombardeo de partículas. Dichas células "transformadas" incluyen células transformadas de manera estable en las que el ADN insertado es capaz de replicarse como un plásmido de replicación autónoma o como parte del cromosoma hospedador. También incluyen células que expresan transitoriamente el ADN o ARN insertado durante períodos de tiempo limitados.

La expresión "célula hospedadora recombinante" (o simplemente "célula hospedadora"), como se usa en el presente documento, pretende hacer referencia a una célula en la que se ha introducido ADN exógeno. Debe entenderse que dichos términos pretenden hacer referencia no solamente a la célula objeto en particular, sino, a la descendencia de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones posteriores debido a una mutación o a influencias ambientales, dicha descendencia puede, de hecho, no ser idéntica a la célula precursora, pero aun así se incluyen dentro del alcance de la expresión "célula hospedadora", tal como se usa en el presente documento. Preferentemente, las células hospedadoras incluyen células procariotas y eucariotas seleccionadas de cualquiera de los Reinos de la vida. Las células eucariotas preferidas incluyen células de protistas, de hongos, vegetales y animales. Lo más preferentemente, las células hospedadoras incluyen, incluyen, pero sin limitación, la línea celular procariota E. Coli; las líneas celulares de mamíferos CHO, HEK 293 y COS; la línea celular de insecto Sf9; y la célula fúngica Saccharomyces cerevisiae.

Se pueden utilizar técnicas convencionales para las síntesis de ADN recombinante, síntesis de oligonucleótidos, y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación pueden llevarse a cabo según las especificaciones del fabricante o como se lleva a cabo comúnmente en la técnica o como se describe en el presente documento. Las técnicas y procedimientos anteriores se pueden llevar a cabo generalmente según los métodos convencionales bien conocidos en la técnica y según se describen en diversas referencias generales y más específicas que se citan y analizan a lo largo de la presente memoria descriptiva. Véase, por ejemplo, Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)).

"Organismo transgénico", como se conoce en la técnica y como se usa en el presente documento, se refiere a un organismo que tiene células que contienen un transgén, donde el transgén introducido en el organismo (o un antepasado del organismo) expresa un polipéptido que no se expresa de forma natural en el organismo. Un "transgén" es una construcción de ADN, que está integrada de forma estable y operativa en el genoma de una célula a partir de la cual se desarrolla un organismo transgénico, dirigiendo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del organismo transgénico.

Los términos "regular" y "modular" se usan indistintamente y, como se usa en el presente documento, se refieren a un cambio o una alteración en la actividad de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de hIL-13). La modulación puede ser un aumento o una disminución de la magnitud de una determinada actividad o función de la molécula de interés. Las actividades y funciones ilustrativas de una molécula incluyen, pero sin limitación, características de unión, actividad enzimática, activación del receptor celular y transducción de señales.

Análogamente, el término "modulador", como se usa en el presente documento, es un compuesto capaz de cambiar o alterar una actividad o función de una molécula de interés (por ejemplo, la actividad biológica de hIL-13). Por ejemplo, un modulador puede provocar un aumento o disminución de la magnitud de una determinada actividad o función de una molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del modulador. En determinados aspectos, un modulador es un inhibidor, que disminuye la magnitud de al menos una actividad o función de una molécula. Los inhibidores ilustrativos incluyen, pero sin limitación, proteínas, péptidos, anticuerpos, pepticuerpos, carbohidratos o moléculas orgánicas pequeñas. Se describen los pepticuerpos, por ejemplo, en el documento WO01/83525.

El término "agonista", como se usa en el presente documento, se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés, provoca un aumento en la magnitud de una determinada actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del agonista. Los agonistas particulares de interés pueden incluir, pero sin limitación, polipéptidos o polipéptidos de IL-13, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra molécula que se una a hIL-13.

El término "antagonista" o "inhibidor", como se usa en el presente documento, se refiere a un modulador que, cuando se pone en contacto con una molécula de interés provoca una disminución en la magnitud de una determinada actividad o función de la molécula en comparación con la magnitud de la actividad o función observada en ausencia del antagonista. Los antagonistas particulares de interés incluyen aquellos que bloquean o modulan la actividad biológica o inmunitaria de hIL-13 y/o hIL-13. Los antagonistas e inhibidores de hIL-13 y/o hIL-13 pueden incluir, pero sin limitación, proteínas, ácidos nucleicos, carbohidratos o cualquier otra molécula, que se una a hIL-13 y/o hIL-13.

La expresión "inhibir la unión al receptor" se refiere a la capacidad de la proteína de unión para evitar la unión de IL-13 a uno o más de sus receptores. Dicha inhibición de la unión al receptor daría como resultado la disminución o eliminación de la actividad biológica mediada por la unión de IL-13 a su receptor o receptores.

Como se usa en el presente documento, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia que es suficiente para reducir o mejorar la gravedad y/o duración de un trastorno o uno o más síntomas del mismo, prevenir el avance de un trastorno, causar la regresión de un trastorno, prevenir la recurrencia, desarrollo, inicio o progresión de uno o más síntomas asociados con un trastorno, detectar un trastorno, o potenciar o mejorar el uno o más efectos profilácticos o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, agente profiláctico o terapéutico).

El término "muestra", como se usa en el presente documento, se utiliza en su sentido más amplio. Una "muestra biológica", como se usa en el presente documento, incluye, pero sin limitación, cualquier cantidad de una sustancia de un ser vivo o un ser viviente anteriormente. Tales seres vivos incluyen, pero sin limitación, seres humanos, ratones, ratas, monos, perros, conejos y otros animales. Tales sustancias incluyen, pero sin limitación, sangre, suero, orina, líquido sinovial, células, órganos, tejidos, médula ósea, ganglios linfáticos y bazo.

I. Anticuerpos que se unen a IL-13 humana.

Un aspecto de la presente divulgación proporciona anticuerpos monoclonales murinos aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen a IL-13 con alta afinidad, una velocidad de disociación lenta y una alta capacidad neutralizante. Un segundo aspecto de la divulgación proporciona anticuerpos quiméricos que se unen a IL-13. Un tercer aspecto de la divulgación proporciona anticuerpos humanizados o porciones de unión a antígeno de los mismos, que se unen a IL-13. Preferentemente, los anticuerpos o porciones de los mismos, son anticuerpos aislados. Preferentemente, los anticuerpos de la divulgación son anticuerpos anti-IL-13 humanos neutralizantes y/o anti-IL-13 humanos.

A. Método de producción de anticuerpos anti IL-13

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden producirse mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la materia.

1. Anticuerpos monoclonales anti-IL-13 que utilizan tecnología de hibridoma

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales usando una gran variedad de técnicas conocidas en la materia, incluyendo el uso de tecnologías de hibridoma, recombinantes y de presentación en fagos o una combinación de las mismas. Por ejemplo, pueden producirse anticuerpos monoclonales usando técnicas de hibridoma, incluyendo las conocidas en la técnica y enseñadas, por ejemplo, en Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cel1Hybridomas 563 681 (Elsevier, N.Y., 1981). La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en el presente documento no se limita a anticuerpos producidos mediante tecnología de hibridomas. La expresión "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo que procede de un solo clon, incluyendo cualquier clon eucariota, procariota o de fago y no el método mediante el que se produce.

Los métodos para producir y explorar anticuerpos específicos usando tecnología de hibridoma son habituales y bien conocidos en la técnica. En un aspecto, la presente divulgación proporciona métodos para generar anticuerpos monoclonales así como anticuerpos producidos por el método que comprende cultivar una célula de hibridoma que secreta un anticuerpo de la divulgación donde, preferentemente, el hibridoma se genera fusionando esplenocitos aislados de un ratón inmunizado con un antígeno de la divulgación con células de mieloma y explorando después los hibridomas resultantes de la fusión para determinar clones de hibridoma que secreten un anticuerpo capaz de unirse a un polipéptido de la divulgación (véase el ejemplo 1.2). En resumen, se pueden inmunizar ratones con un antígeno IL-13. En un aspecto preferido, el antígeno iL-13 se proporciona para su uso en la administración con un adyuvante para estimular la respuesta inmunitaria. Dichos adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimulantes). Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido frente a una rápida dispersión secuestrándolo en un depósito local o pueden contener sustancias que estimulan al hospedador para secretar factores que son quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmunitario. Preferentemente, si se proporciona un polipéptido para su uso en la administración, la pauta de inmunización implicará dos o más administraciones del polipéptido, dispersadas a lo largo de varias semanas.

Después de la inmunización de un animal con un antígeno IL-13, los anticuerpos y/o las células productoras de anticuerpo pueden obtenerse del animal. Se obtiene un suero que contiene el anticuerpo anti-IL-13 del animal extrayendo sangre o sacrificando al animal. El suero puede usarse tal cual se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero o pueden purificarse los anticuerpos anti-IL-13 del suero. El suero o las inmunoglobulinas obtenidos de este modo son policlonales, teniendo de este modo una serie heterogénea de propiedades.

Una vez que se detecta una respuesta inmunitaria, por ejemplo, se detectan anticuerpos específicos para el antígeno IL-13 en el suero del ratón, se recoge el bazo del ratón y se aíslan los esplenocitos. Después, se fusionan los esplenocitos mediante técnicas bien conocidas a cualquier célula de mieloma adecuada, por ejemplo, células de la línea celular SP20 disponibles en la ATCC. Los hibridomas se seleccionan y clonan mediante dilución limitante. Después, se someten a ensayo los clones de hibridoma mediante métodos conocidos en la técnica para células que secretan anticuerpos capaces de unirse a IL-13. El fluido de ascitis, que generalmente contiene altos niveles de anticuerpos, puede generarse inmunizando ratones con clones de hibridoma positivos.

En otro aspecto, pueden prepararse hibridomas inmortalizados productores de anticuerpos a partir del animal inmunizado. Después de la inmunización, se sacrifica al animal y se fusionan los linfocitos B esplénicos a células de mieloma inmortalizadas, como se conoce bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lane, supra. En un aspecto preferido de la divulgación, las células de mieloma no secretan polipéptidos de inmunoglobulina (una línea celular no secretora). Después de la fusión y la selección con antibiótico, se exploran los hibridomas usando IL-13 o una porción de la misma o una célula que expresa IL-13. En un aspecto preferido de la divulgación, la exploración inicial se lleva a cabo usando un inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o un radioinmunoensayo (RIA), preferentemente un ELISA. En el documento WO 00/37504 se proporciona un ejemplo de exploración por ELISA.

Los hibridomas productores de anticuerpo anti-IL-13 se seleccionan, se clonan y se exploran adicionalmente para determinar características deseables, incluyendo un crecimiento de hibridoma fuerte, alta producción de anticuerpo y características de anticuerpo deseables, como se analiza adicionalmente más adelante. Los hibridomas pueden cultivarse y expandirse in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmunitario, por ejemplo, ratones atímicos o en cultivo celular in vitro. Los métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas son bien conocidos por los expertos habituales en la materia.

En un aspecto preferido de la divulgación, los hibridomas son hibridomas de ratón, como se describe anteriormente. En otro aspecto preferido de la divulgación, los hibridomas se producen en una especie no humana distinta de ratón, tales como ratas, ovejas, cerdos, cabras, ganado bovino o caballos. En otro aspecto de la divulgación, los hibridomas son hibridomas humanos, en los que se fusiona un mieloma humano no secretor con una célula humana que expresa un anticuerpo anti-IL-13.

Pueden generarse fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopos específicos mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, pueden producirse los fragmentos Fab y F(ab')2 de la divulgación mediante escisión proteolítica de moléculas de inmunoglobulina, usando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir un fragmento F(ab')2). Los fragmentos F(ab')2 contienen la región variable, la región constante de la cadena ligera y el dominio CHI de la cadena pesada.

2. Anticuerpos monoclonales anti-IL-13 usando SLAM

En otro aspecto de la divulgación, se generan anticuerpos recombinantes a partir de linfocitos aislados individuales usando un procedimiento denominado en la técnica como el método de anticuerpo de linfocito seleccionado (SLAM, por sus siglas en inglés), como se describe en la patente de los Estados Unidos n.° 5.627.052, publicación del PCT WO 92/02551 y Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848. En este método, las células individuales que secretan anticuerpos de interés, por ejemplo, linfocitos procedentes de uno cualquiera de los animales inmunizados descritos en la sección 1, se exploran mediante un ensayo de placa hemolítica específica de antígeno, donde el antígeno IL-13, una subunidad de IL-13 o un fragmento de la misma, se acopla a glóbulos rojos de oveja usando un enlazador, tal como biotina y se usa para identificar células sueltas que secretan anticuerpos con especificidad por IL-13. Después de la identificación de células secretoras de anticuerpos de interés, se rescatan los ADNc de la región variable de cadena pesada y ligera de las células mediante PCR de retrotranscriptasa (RTPCR) y después pueden expresarse estas regiones variables, en el contexto de regiones constantes de inmunoglobulina adecuadas (por ejemplo, regiones constantes humanas), en células hospedadoras de mamífero, tales como células COS o c Ho . Las células hospedadoras transfectadas con las secuencias de inmunoglobulina amplificadas, procedentes de linfocitos seleccionados in vivo, pueden someterse posteriormente a análisis y selección in vitro, por ejemplo, seleccionando las células transfectadas para aislar las células que expresan anticuerpos para IL-13. Las secuencias de inmunoglobulina amplificadas además pueden manipularse in vitro, tal como mediante métodos de maduración de la afinidad in vitro tales como los descritos en la publicación del PCT WO 97/29131 y la publicación del PCT WO 00/56772.

3. Anticuerpos monoclonales anti-IL-13 utilizando animales transgénicos

En otro aspecto de la divulgación, se producen anticuerpos inmunizando un animal no humano que comprende algunos o todos, los locus de inmunoglobulina humana con un antígeno IL-13. En un aspecto preferido de la divulgación, el animal no humano es un ratón transgénico XENOMOUSE, una estirpe de ratón modificada por ingeniería que comprende grandes fragmentos de los locus de inmunoglobulina humanos y es defectuoso en la producción de anticuerpos de ratón. Véase, por ejemplo, Verde et al. Nature Genetics 7:13-21 (1994) y las patentes de los Estados Unidos 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075.181.6.091.001.6.114.598 y 6.130.364. Véase también el documento WO 91/10741, publicado el 25 de julio de 1991, el documento WO 94/02602, publicado el 3 de febrero de 1994, los documentos WO 96/34096 y WO 96/33735, ambos publicados el 31 de octubre de 1996, el documento WO 98/16654, publicado el 23 de abril de 1998, el documento WO 98/24893, publicado el 11 de junio de 1998, el documento WO 98/50433, publicado el 12 de noviembre de 1998, el documento Wo 99/45031, publicado el 10 de septiembre de 1999, el documento WO 99/53049, publicado el 21 de octubre de 1999, el documento WO 00 09560, publicado el 24 de febrero de 2000 y el documento WO 00/037504, publicado el 29 de junio de 2000. El ratón transgénico XENOMOUSE produce un repertorio humano similar al adulto de anticuerpos completamente humanos y genera mAb humanos específicos de antígeno. El ratón transgénico XENOMOUSE contiene aproximadamente un 80 % del repertorio de anticuerpos humanos mediante la introducción de fragmentos de YAC con configuración de línea germinal con un tamaño de megabase de los locus de cadena pesada y locus de cadena ligera humanos. Véase Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green y Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998).

4. Anticuerpos monoclonales anti-IL-13 utilizando bibliotecas de anticuerpos recombinantes

También pueden usarse métodos in vitro para producir los anticuerpos de la divulgación, donde se explora una biblioteca de anticuerpos para identificar un anticuerpo que tenga la especificidad de unión deseada. Los métodos para dicha exploración de bibliotecas de anticuerpos recombinantes se conocen bien en la técnica e incluyen métodos descritos en, por ejemplo, Ladner et al., patente de los Estados Unidos N.° 5,223,409; Kang et al., publicación del PCT N.° WO 92/18619; Dower et al., publicación del PCT N.° WO 91/17271; Winter et al., publicación del PCT N.° WO 92/20791; Markland et al., publicación del PCT N.° WO 92/15679; Breitling et al., publicación del PCT N.° WO 93/01288; McCafferty et al., publicación del PCT N.° WO 92/01047; Garrard et al., publicación del PCT N.° WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; y Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982, publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos 20030186374 y publicación del PCT n° WO 97/29131.

La biblioteca de anticuerpos recombinantes puede proceder de un sujeto inmunizado con IL-13 o IL-13 o una porción de IL-13 o IL-13. Como alternativa, la biblioteca de anticuerpos recombinantes puede proceder de un sujeto no expuesto previamente, es decir, uno que no ha sido inmunizado con IL-13, tal como una biblioteca de anticuerpos humanos procedente de un sujeto humano que no ha sido inmunizado con IL-13. Los anticuerpos de la divulgación se seleccionan explorando la biblioteca de anticuerpos recombinantes con el péptido que comprende IL-13 humana para seleccionar de este modo aquellos anticuerpos que reconocen a IL-13. Los métodos para llevar a cabo dicha exploración y selección se conocen bien en la técnica, tales como los descritos en las referencias en el párrafo anterior. Para seleccionar anticuerpos de la divulgación que tengan afinidades de unión particulares para hIL-13, tales como aquellos que se disocian de IL-13 humana con una constante de velocidad koff particular, puede usarse el método conocido en la técnica de resonancia de plasmón superficial para seleccionar anticuerpos que tienen la constante de velocidad koff deseada. Para seleccionar anticuerpos de la divulgación que tengan una actividad neutralizante particular para hIL-13, tales como aquellos con una CI⁵⁰particular, pueden usarse métodos convencionales conocidos en la técnica para evaluar la inhibición de la actividad de hIL-13.

En un aspecto, la divulgación se refiere a un anticuerpo aislado o a una porción de unión a antígeno del mismo, que se une a IL-13 humana. Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo neutralizante. En diversos aspectos de la divulgación, el anticuerpo es un anticuerpo recombinante o un anticuerpo monoclonal.

Por ejemplo, los anticuerpos de la presente divulgación también pueden generarse usando diversos métodos de presentación en fagos conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en fagos, se presentan dominios de anticuerpo funcionales sobre la superficie de partículas de fago que portan las secuencias de polinucleótido que los codifican. En un particular, dicho fago puede utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humana o murina). Los fagos que expresan un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés pueden seleccionarse o identificarse con antígeno, por ejemplo, usando antígeno marcado o antígeno unido o capturado sobre una superficie sólida o una perla. Los fagos usados en estos métodos son normalmente fagos filamentosos, incluyendo dominios de unión a fd y M13 expresados a partir de fago con dominios de anticuerpo Fab, Fv o Fv estabilizado por disulfuro fusionados de manera recombinante con la proteína del gen III o el gen VIII de fago. Los ejemplos de métodos de presentación en fagos que pueden usarse para producir los anticuerpos de la presente divulgación incluyen aquellos divulgados en Brinkmann et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); solicitud P^cT N.° PCT/GB91/01134; las publicaciones del PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; y las patentes de los Estados Unidos n.° 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780, 225; 5.658.727; 5.733.743 y 5.969.108.

Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección en fagos, pueden aislarse las regiones codificantes de anticuerpo del fago y usarse para generar anticuerpos completos, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado y expresarse en cualquier hospedador deseado, incluyendo células de mamífero, células de insecto, células vegetales, levaduras y bacterias, por ejemplo, como se describe en detalle más adelante. Por ejemplo, las técnicas para producir de manera recombinante fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también pueden emplearse usando métodos conocidos en la técnica, tales como aquellos divulgados en la Publicación del PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240:1041-1043 (1988). Los ejemplos de técnicas que pueden usarse para producir Fv monocatenarios y anticuerpos incluyen aquellas descritas en las patentes de los Estados Unidos n.° 4.946.778 y 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

Como alternativa a la exploración de bibliotecas de anticuerpos recombinantes mediante presentación en fagos, pueden aplicarse otras metodologías conocidas en la técnica para explorar grandes bibliotecas combinatorias para la identificación de anticuerpos de especificidad dual de la divulgación. Un tipo de sistema de expresión alternativo es uno en el que se expresa la biblioteca de anticuerpos recombinantes en forma de fusiones de ARN-proteína, como se describe en la publicación del PCT n.° WO 98/31700 por Szostak y Roberts y en Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302. En este sistema, se crea una fusión covalente entre un ARNm y el péptido o proteína que codifica mediante traducción in vitro de ARNm sintéticos que portan puromicina, un antibiótico aceptor de peptidilo, en su extremo 3'. Por tanto, puede enriquecerse un ARNm específico a partir de una mezcla compleja de ARNm (por ejemplo, una biblioteca combinatoria) basándose en las propiedades del péptido o la proteína codificados, por ejemplo, anticuerpo o porción del mismo, tal como unión del anticuerpo o porción del mismo, al antígeno de especificidad dual. Las secuencias del ácido nucleico que codifican anticuerpos o porciones de los mismos, recuperadas de la exploración de dichas bibliotecas pueden expresarse por medios recombinantes, como se ha descrito anteriormente (por ejemplo, en células hospedadoras de mamífero) y, por otra parte, pueden someterse a maduración de la afinidad adicional mediante o bien rondas adicionales de exploración de fusiones de ARNm-péptido en las que se han introducido mutaciones en las secuencias originalmente seleccionadas o mediante otros métodos para maduración de la afinidad in vitro de anticuerpos recombinantes, como se describe anteriormente.

En otro enfoque, los anticuerpos de la presente divulgación también se pueden generar usando métodos de presentación en levaduras conocidos en la técnica. En los métodos de presentación en levaduras, se usan métodos genéticos para anclar dominios de anticuerpo a la pared celular de las levaduras y presentarlos sobre la superficie de la levadura. En particular, dichas levaduras pueden utilizarse para presentar dominios de unión a antígeno expresados a partir de un repertorio o biblioteca de anticuerpos combinatoria (por ejemplo, humanos o murinos). Los ejemplos de métodos de presentación en levaduras que pueden usarse para producir los anticuerpos de la presente divulgación incluyen aquellos divulgados en Wittrup, et al., patente de los Estados Unidos n.° 6,699,658.

B. Producción de anticuerpos contra IL-13 recombinantes

Los anticuerpos de la presente divulgación pueden producirse mediante cualquiera de una serie de técnicas conocidas en la técnica. Por ejemplo, expresión a partir de células hospedadoras, donde los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera se transfectan en una célula hospedadora mediante técnicas convencionales. Se pretende que las diversas formas del término "transfección" abarquen una gran variedad de técnicas comúnmente usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedadora procariota o eucariota, por ejemplo, electroporación, precipitación con fosfato de calcio, transfección con DEAE-dextrano y similares. Aunque es posible expresar los anticuerpos de la divulgación en células hospedadoras procariotas o eucariotas, es preferible la expresión de anticuerpos en células eucariotas y lo más preferible, en células hospedadoras de mamífero, debido a que dichas células eucariotas (y en particular las células de mamífero) tienen mayores probabilidades que las células procariotas de ensamblarse y secretar un anticuerpo adecuadamente plegado e inmunitariamente activo.

Las células hospedadoras de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la divulgación incluyen de ovario de hámster chino (células CHO) (incluidas las células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas con un marcador de selección de DHFR, por ejemplo, tal como se describe en R.J. Kaufman y P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células NS0 de mieloma, células COS y células SP2. Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpo en células hospedadoras de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células hospedadoras durante un periodo de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospedadoras o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hospedadoras. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos de purificación de proteínas convencionales.

Las células hospedadoras también pueden usarse para producir fragmentos de anticuerpo funcionales, tales como fragmentos Fab o moléculas de scFv. Ha de entenderse que se encuentran dentro del alcance de la presente divulgación variaciones de los procedimientos anteriores. Por ejemplo, puede ser deseable transfectar una célula hospedadora con ADN que codifica fragmentos funcionales de la cadena ligera y/o la cadena pesada de un anticuerpo de la presente divulgación. También puede usarse tecnología de ADN recombinante para eliminar la totalidad o parte, del ADN que codifica una o las dos cadenas pesada y ligera que no son necesarias para la unión a los antígenos de interés. Las moléculas expresadas a partir de dichas moléculas de ADN truncadas también están abarcadas por los anticuerpos de la presente divulgación. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los que una cadena pesada y una cadena ligera son un anticuerpo de la divulgación y la otra cadena pesada y ligera son específicas para un antígeno diferente a los antígenos de interés reticulando un anticuerpo de la divulgación con un segundo anticuerpo mediante métodos de reticulación química convencionales.

En un sistema preferido para la expresión recombinante de un anticuerpo o una porción de unión a antígeno del mismo, de la divulgación, se introduce un vector de expresión recombinante que codifica tanto la cadena pesada del anticuerpo como la cadena ligera del anticuerpo en células dhfr-CHO mediante transfección mediada por fosfato de calcio. En el vector de expresión recombinante, los genes de cadena pesada y ligera del anticuerpo se unen cada uno operativamente a elementos reguladores del potenciador de CMV/promotor de AdMLP para impulsar altos niveles de transcripción de los genes. El vector de expresión recombinante también porta un gen de DHFR, que permite la selección de células CHO que se han transfectado con el vector usando selección/amplificación con metotrexato. Las células hospedadoras transformantes seleccionadas se cultivan para permitir la expresión de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo y se recupera el anticuerpo intacto del medio de cultivo. Se usan técnicas de biología molecular convencionales para preparar el vector de expresión recombinante, transfectar las células hospedadoras, seleccionar los transformantes, cultivar las células hospedadoras y recuperar el anticuerpo del medio de cultivo. Aún más, la divulgación proporciona un método para sintetizar un anticuerpo recombinante de la divulgación cultivando una célula hospedadora de la divulgación en un medio de cultivo adecuado hasta que se sintetiza un anticuerpo recombinante de la divulgación. El método puede comprender además aislar el anticuerpo recombinante del medio de cultivo.

1. Anticuerpos anti-IL-13

La tabla 5 es un listado de secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos anti-hIL-13 preferidos de la divulgación.

Tabla 5 Listado de secuencias de aminoácidos de las re iones VH VL

(continuación)

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continuación

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Las secuencias de CDR de anticuerpos anti-IL-13 aisladas anteriores establecen una nueva familia de proteínas de unión a IL-13, aisladas de acuerdo con esta divulgación, y que comprenden polipéptidos que incluyen las secuencias de CDR enumeradas en la tabla ⁶a continuación. Para generar y seleccionar CDR de la divulgación que tengan actividad de unión y/o neutralización de IL-13 preferida con respecto a hIL-13 y/o hIL-13, se pueden usar métodos convencionales conocidos en la técnica para generar proteínas de unión de la presente divulgación y evaluar la IL-13 y/o las características de unión y/o neutralización de IL-13 de esas proteínas de unión, incluidos, pero sin limitación, los descritos específicamente en el presente documento.

2. Anticuerpos anti IL-13 quiméricos

Un anticuerpo quimérico es una molécula en la que diferentes porciones del anticuerpo proceden de diferentes especies animales, tales como anticuerpos que tienen una región variable procedente de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos se conocen en la técnica y se analizan en detalle en el ejemplo 2.1. Véanse, por ejemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985) ; Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; y las patentes de los Estados Unidos N.° 5.807.715; 4.816.567; y 4.816.397. Además, también pueden usarse técnicas creadas para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454) mediante el corte y empalme de genes de una molécula de anticuerpo de ratón de especificidad antigénica apropiada junto con genes de una molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada.

En un aspecto, los anticuerpos quiméricos de la divulgación se producen reemplazando la región constante de cadena pesada de los anticuerpos anti IL-13 humana monoclonales murinos descritos en la sección 1 con una región constante de IgG1 humana. En un aspecto específico, el anticuerpo quimérico de la divulgación comprende una región variable de cadena pesada (Vh) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 34; SEQ ID NO: 36; SEQ ID NO: 41; s Eq ID NO: 42; SEQ iD NO: 46 y una región variable de cadena ligera (Vl) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35; SEQ ID NO: 37; SEQ ID NO: 40; SEQ ID NO: 43 o SEQ ID NO: 47.

3. Anticuerpos anti IL-13 humanizados

Los anticuerpos humanizados son moléculas de anticuerpo de una especie no humana que se une al antígeno deseado que tiene una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDR) procedentes de la especie no humana y regiones marco procedentes de una molécula de inmunoglobulina humana. Se divulgan secuencias de Ig humana conocidas en, por ejemplo, www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez- /query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/online- comp.html; w w w .p u b lic .ia s ta te .e d u /.a b o u t.p e d ro /re se a rch _ to o ls .h tm l;www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH- 05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; w w w .an tibodyresource .com /;m cb .harva rd .edu /B ioL inks/Im m uno logy.h tm l.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; w w w .p e b io .co m /p a /340913 /340913.h tm l-;www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu.acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp;www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; w w w .b io te ch .u fl.e d u /.a b o u t.fc c l/p ro to co l.h tm l;www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.unimarburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.unihd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/public/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/. about. martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about. honegger/AHOseminar/Slide01.htfnl; w w w .cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/;www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.m rc7/h-umanisation/TAHHP.htm l;www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.about.fmolina/Webpages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983). Estas secuencias importadas se pueden utilizar para reducir la inmunogenicidad o reducir, potenciar o modificar la unión, afinidad, velocidad de asociación, velocidad de disociación, avidez, especificidad, semivida o cualquier otra característica adecuada, como se conoce en la técnica.

Los restos del marco en las regiones de marco humanas se sustituirán por el resto correspondiente del anticuerpo donante de CDR para alterar, preferentemente mejorar, la unión al antígeno. Estas sustituciones del marco se identifican mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante modelado de las interacciones de los restos de CDR y del marco para identificar los restos del marco importantes para la unión al antígeno y comparación de secuencias para identificar restos del marco inusuales en posiciones determinadas. (Véanse, por ejemplo, Queen et al., la patente de los Estados Unidos n.° 5.585.089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).) Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales están habitualmente disponibles y son conocidos para los expertos en la materia. Se encuentran disponibles programas informáticos que ilustran y presentan estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de estas presentaciones permite un análisis del papel probable de los restos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antígeno. De esta manera, los restos de FR pueden seleccionarse y combinarse a partir del consenso e importar secuencias, de tal forma que se logran las características de anticuerpo deseadas, tales como afinidad aumentada por el antígeno diana. En general, los restos de CDR están implicados directa y más sustancialmente en la influencia sobre la unión al antígeno. Se pueden humanizar anticuerpos usando diversas técnicas conocidas en la técnica, tal como, pero sin limitación, las descritas en Jones et al., Nature 321:522 (1986) ; Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia y Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol.

151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994); las publicaciones del PCT WO 91/09967, PCT/:US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592.106; EP 519596, EP 239400, patentes de los Estados Unidos N.° 5.565.332, 5.723.323, 5.976.862, 5.824.514, 5.817.483, 5814476, 5763192, 5723323, 5.766886, 5.714.352, 6.204.023, 6.180.370, 5.693.762, 5.530.101, 5.585.089, 5.225.539; 4.816.567.

C. Producción de anticuerpos y líneas celulares productoras de anticuerpos

Preferentemente, los anticuerpos anti-IL-13 de la presente divulgación, presentan una alta capacidad para reducir o neutralizar la actividad de IL-13, por ejemplo, como se evalúa por cualquiera de varios ensayos in vitro e in vivo conocidos en la técnica (por ejemplo, véase el ejemplo 1.1.C). Por ejemplo, estos anticuerpos neutralizan la producción de TARC inducida por IL-13 por las células A-549 con valores de CI⁵⁰en el intervalo de al menos aproximadamente 10-8 M, aproximadamente 10-9 M, o aproximadamente 10-10 M.

En aspectos preferidos de la presente divulgación, el anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana, donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, se disocia de la IL-13 humana con una constante de velocidad koff de aproximadamente ^{0 ,1}s-1 o menos, determinada por resonancia de plasmón superficial, o que inhibe la actividad de IL-13 humana y/o IL-13 humana con una Cl50 de aproximadamente 1 x 10-6M 0 menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede disociarse de la IL-13 humana con una constante de velocidad koff de aproximadamente ¹x ¹⁰'V 1 o menos, determinada por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la IL-13 humana y/o la actividad de IL-13 humana con una CI⁵⁰de aproximadamente 1 x 10-7M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede disociarse de la IL-13 humana con una constante de velocidad koff de aproximadamente ¹x ¹⁰'V 1 o menos, determinada por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la IL-13 humana y/o IL-13 humana con una CI⁵⁰de aproximadamente 1 x 10-8M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede disociarse de la IL-13 humana con una constante de velocidad koff de aproximadamente 1 x 10-4s-1 o menos, determinada por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de IL-13 y/o IL-13 humana con una CI⁵⁰de aproximadamente 1 x 10-9M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede disociarse de la IL-13 humana con una constante de velocidad koff de aproximadamente 1 x 10'5s'1 o menos, determinada por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de IL-13 y/o IL-13 humana con una CI⁵⁰de aproximadamente 1 x 10-10M o menos. Como alternativa, el anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, puede disociarse de la IL-13 humana con una constante de velocidad de aproximadamente ¹x ^{1 0}'5s'1 o menos, determinada por resonancia de plasmón superficial, o puede inhibir la actividad de IL-13 y/o IL-13 humana con una Cl50 de aproximadamente 1 x 10-11M o menos.

IL-13 ejerce sus acciones al unirse al receptor de IL-13 (IL-13R) en la superficie celular, el heterodímero compuesto por la cadena IL-13Ra1 (IL-13Ra1) y la cadena IL-4R (IL-4R). ⁱL-13 se une a IL-13Ral primero con baja afinidad (K^d= 2-10 nM) y después recluta IL-4R al complejo, generando un receptor de alta afinidad (K^d= 0,03-0,4 nM) (Aman, M. J., et al. 1996 J. Biol. Chem. 271,29265-29270; Miloux, et al. 1997 FEBS Lett. 401, 163-166; Andrews, et al 2002 J. Biol. Chem. 277, 46073-46078). La heterodimerización de IL-13R provoca la activación de las cinasas Jano, TYK2 y JAK1, asociadas de manera constitutiva con IL-13Ra1 e IL-4R, respectivamente, seguida de la activación del transductor de señal y activador de la transcripción ⁶(STAT⁶) (Izuhara, K. y Arima, K. 2004 Drug News Perspect. 17, 91-98). Hay otra unidad de unión a IL-13, la cadena lL-13Ra2 (IL-13Ra2), que se une a IL-13 con alta afinidad (0,25 1,2 nM) (Caput, et al 1996 J. Biol. Chem. 271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J. Immunol. 161,2317-2324). No se conoce ninguna otra molécula receptora que esté implicada en el complejo IL-13IL-13R2. Se piensa inicialmente que IL-13R2 actúa como un receptor "señuelo" no señalizador. Sin embargo, más tarde se descubrió que puede unirse a IL-13 y señala a través de la vía AP-1, dando lugar a la producción de TNF-beta en determinados tipos de células, incluidos los macrófagos, que, a su vez, da lugar a la fibrosis pulmonar (Fichtner-Feigl, 2006 Nat Med 12:99-106). Por lo tanto, las vías de IL-13Ra1/IL-4Ra e IL-13Ra2 contribuyen a la patofisiopatología general del asma y otras afecciones pulmonares inflamatorias. Por lo tanto, un anticuerpo terapéutico anti-l L-13 que bloquea la unión de IL-13 a ambos receptores será más eficaz que aquellos que bloquean únicamente un receptor.

Se han aislado anticuerpos monoclonales que bloquean la unión de IL-13 tanto a IL-13Ral como a IL-13Ra2. Tanto el ensayo de unión a receptor basado en ELlSA como el ensayo de unión a IL-13 marcado con 125-I en la superficie celular demostraron que 13C5, tanto la versión murina como la versión humanizada (es decir, 13C5.5) pudieron bloquear eficazmente la unión de IL-13 a ambos receptores. Los anticuerpos del mismo linaje que 13C5, incluyendo 25C8 y 33C3, también pudieron bloquear la unión de IL-13 a ambos receptores. El mapeo de epítopos de 13C5 indicó que su uno o más sitios de unión incluían la región carboxiterminal de la hélice D de IL-13 humana (restos VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR, correspondientes a los aminoácidos 104-130 de la SEQ ID NO: 1). Se ha propuesto que la región carboxiterminal de la hélice D está implicada en interacciones con el receptor de IL-13 (Zuegg et al 2001 Immunol Cell Biol. 79:332-9). La estructura cristalina de IL-13 humana en forma de complejo con la porción Fab del anticuerpo 13C5.5 indicó que 13C5.5 se une a la región carboxiterminal de la hélice D, así como a la región aminoterminal de la hélice A de la IL-13 humana. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana de manera que la IL-13 con dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, unido al epítopo definido por las regiones topográficas Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 y Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu-128-Gly129 -Arg130 de la SEQ ID NO:. 1 se inhibe de la unión al receptor de IL-13. Preferentemente, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une a IL-13 humana de manera que la IL-13 con dicho anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, unido al epítopo definido por las regiones topográficas Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 and Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127 de la SEQ ID NO: 1 se inhibe de la unión al receptor de IL-13a2 receptor.

En determinados aspectos de la presente divulgación, el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada, tal como una región constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD. Preferentemente, la región constante de cadena pesada es una región constante de cadena pesada de IgG1 o una región constante de cadena pesada de IgG4. Asimismo, el anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera, una región constante de cadena ligera kappa o una región constante de cadena ligera lambda. Preferentemente, el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa. Como alternativa, la porción de anticuerpo puede ser, por ejemplo, un fragmento Fab o un fragmento Fv monocatenario.

Los reemplazos de restos de aminoácidos en la porción Fc para alterar la función efectora del anticuerpo son conocidos en la técnica (Winter, et al., patentes de los Estados Unidos N.° 5.648.260; 5624821). La porción Fc de un anticuerpo media varias funciones efectoras importantes, por ejemplo, inducción de citocinas, ADCC, fagocitosis, citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y semivida/tasa de eliminación de anticuerpos y complejos antígeno-anticuerpo. En algunos casos, estas funciones efectoras son deseables para anticuerpos terapéuticos, pero en otros casos pueden ser innecesarias o incluso perjudiciales, dependiendo de los objetivos terapéuticos. Ciertos isotipos de IgG humana, particularmente IgG1 e IgG3, median la ADCC y la CDC mediante la unión a F^cyR y C1q del complemento, respectivamente. Los receptores de Fc neonatales (FcRn) son los componentes críticos que determinan la semivida en circulación de los anticuerpos. En otro aspecto más, al menos un resto de aminoácido se reemplaza en la región constante del anticuerpo, por ejemplo, la región Fc del anticuerpo, de manera que se alteran las funciones efectoras del anticuerpo.

Un aspecto de la divulgación proporciona una proteína de unión marcada donde un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la divulgación se modifica o se une a otra molécula funcional (por ejemplo, otro péptido o proteína). Por ejemplo, una proteína de unión marcada de la divulgación puede obtenerse uniendo funcionalmente un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la divulgación (mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otro tipo) a una o más entidades moleculares diferentes, tales como otro anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo biespecífico o un diacuerpo), un agente detectable, un agente citotóxico, un agente farmacéutico y/o una proteína o péptido que puede mediar en la asociación del anticuerpo o porción de anticuerpo con otra molécula (tal como una región central de estreptavidina o una etiqueta de polihistidina).

Los agentes detectables útiles con los que puede modificarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación incluyen compuestos fluorescentes. Los agentes detectables fluorescentes ilustrativos incluyen fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina y similares. Un anticuerpo también se puede modificar con enzimas detectables, tales como fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo se modifica con una enzima detectable, se detecta añadiendo reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción detectable. Por ejemplo, cuando el agente detectable peroxidasa de rábano picante está presente, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina da lugar a un producto de reacción coloreado, que es detectable. Un anticuerpo también puede modificarse con biotina y detectarse mediante medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina.

Otro aspecto de la divulgación proporciona una proteína de unión cristalizada. Preferentemente la divulgación se refiere a cristales de anticuerpos anti-IL-13 completos y fragmentos de los mismos como se divulga en el presente documento, y formulaciones y composiciones que comprenden dichos cristales. En un aspecto de la divulgación, la proteína de unión cristalizada tiene una semivida in vivo mayor que la homóloga soluble de la proteína de unión. En otro aspecto de la divulgación, la proteína de unión conserva la actividad biológica después de la cristalización.

La proteína de unión cristalizada de la divulgación se puede producir según métodos conocidos en la técnica y como se divulga en el documento WO 02072636.

Otro aspecto de la divulgación proporciona una proteína de unión glucosilada donde el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo comprende uno o más restos de carbohidrato. La producción de proteínas nacientes in vivo puede someterse a un procesamiento adicional, conocido como modificación postraduccional. En particular, se pueden añadir restos de azúcar (glucosilo) enzimáticamente, un proceso conocido como glucosilación. Las proteínas resultantes que llevan cadenas laterales de oligosacáridos unidas covalentemente se conocen como proteínas glucosiladas o glucoproteínas. Los anticuerpos son glucoproteínas con uno o más restos de carbohidratos en el dominio Fc, así como el dominio variable. Los restos de carbohidratos en el dominio Fc tienen un efecto importante sobre la función efectora del dominio Fc, con un efecto mínimo sobre la unión del antígeno o la semivida del anticuerpo (R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), págs. 11-16). Por el contrario, la glucosilación del dominio variable puede tener un efecto sobre la actividad de unión al antígeno del anticuerpo. La glucosilación en el dominio variable puede tener un efecto negativo sobre la afinidad de unión del anticuerpo, probablemente debido a un impedimento estérico (Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367), o dar como resultado una mayor afinidad por el antígeno (Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:27172723).

Un aspecto de la presente divulgación se refiere a generar mutantes en el sitio de glucosilación en los que se ha mutado el sitio de glucosilación ligado a O o N de la proteína de unión. Un experto en la materia puede generar tales mutantes usando tecnologías convencionales bien conocidas. Los mutantes del sitio de glicosilación que conservan la actividad biológica, pero tienen una actividad de unión aumentada o disminuida, son otro objeto de la presente divulgación.

En otro aspecto adicional, se modifica la glucosilación del anticuerpo o porción de unión a antígeno de la divulgación. Por ejemplo, se puede preparar un anticuerpo aglucosilado (es decir, el anticuerpo carece de glucosilación). La glucosilación se puede alterar para, por ejemplo, aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden llevarse a cabo, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación en la secuencia del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden realizar una o más sustituciones de aminoácidos que den como resultado la eliminación de uno o más sitios de glucosilación de la región variable para eliminar así la glucosilación en este sitio. Dicha aglucosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo por el antígeno. Este enfoque se describe con más detalle en la publicación del PCT WO2003016466A2 y en las patentes de los Estados Unidos N.° 5.714.350 y 6.350.861.

Adicionalmente, o como alternativa, se puede producir un anticuerpo modificado de la divulgación que tenga un tipo alterado de glucosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tenga cantidades reducidas de restos fucosilo o un anticuerpo que tenga estructuras GlcNAc bisectantes aumentadas. Se ha demostrado que dichos patrones de glucosilación alterados aumentan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden llevarse a cabo, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula hospedadora con una maquinaria de glucosilación alterada. Se han descrito en la técnica células con una maquinaria de glucosilación alterada y se pueden usar como células hospedadoras donde expresan anticuerpos recombinantes de la divulgación para producir por tanto un anticuerpo con glucosilación alterada. Véanse, por ejemplo, Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem.

277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, así como, la Patente europea N.° Ep 1.176.195; las publicaciones del PCT WO 03/035835; WO 99/5434280.

La glucosilación de proteínas depende de la secuencia de aminoácidos de la proteína de interés, así como de la célula hospedadora en la que se expresa la proteína. Diferentes organismos pueden producir diferentes enzimas de glucosilación (por ejemplo, glucosiltransferasas y glucosidasas) y tener diferentes sustratos (azúcares nucleotídicos) disponibles. Debido a tales factores, el patrón de glucosilación de proteínas y la composición de restos de glucosilo, puede diferir dependiendo del sistema hospedador en el que se expresa la proteína particular. Los restos de glucosilo útiles en la divulgación pueden incluir, pero sin limitación, glucosa, galactosa, manosa, fucosa, nacetilglucosamina y ácido siálico. Preferentemente, la proteína de unión glucosilada comprende restos de glucosilo de manera que el patrón de glucosilación es humano.

Los expertos en la materia saben que una glucosilación de proteínas diferente puede dar como resultado características de proteínas diferentes. Por ejemplo, la eficacia de una proteína terapéutica producida en un microorganismo hospedador, tal como levadura, y glucosilada utilizando la vía endógena de la levadura puede reducirse en comparación con la de la misma proteína expresada en una célula de mamífero, tal como una línea celular CHO. Dichas glucoproteínas también pueden ser inmunogénicas en seres humanos y mostrar una semivida in vivo reducida después de la administración. Los receptores específicos en seres humanos y otros animales pueden reconocer restos de glucosilo específicos y promover la rápida eliminación de la proteína del torrente sanguíneo. Otros efectos adversos pueden incluir cambios en el plegamiento de proteínas, la solubilidad, la susceptibilidad a las proteasas, el tráfico, el transporte, la compartimentación, la secreción, el reconocimiento por otras proteínas o factores, la antigenicidad o la alergenicidad. En consecuencia, un médico puede preferir una proteína terapéutica con una composición y un patrón de glucosilación específicos, por ejemplo, composición de glucosilación y patrón idénticos, o al menos similares, a los producidos en células humanas o en las células específicas de la especie del animal sujeto pretendido.

La expresión de proteínas glucosiladas diferentes de las de una célula hospedadora puede lograrse modificando genéticamente la célula hospedadora para expresar enzimas de glucosilación heterólogas. Usando técnicas conocidas en la técnica, un médico puede generar anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos que muestren glucosilación de proteínas humanas. Por ejemplo, las cepas de levadura se han modificado genéticamente para expresar enzimas de glucosilación no naturales, de modo que las proteínas glucosiladas (glucoproteínas) producidas en estas cepas de levadura presentan una glucosilación de proteínas idéntica a la de las células animales, especialmente células humanas (solicitudes de patente de los Estados Unidos 20040018590 y 20020137134 y publicación del PCT WO2005100584 A2).

Además de las proteínas de unión, la presente divulgación también se refiere a un anticuerpo antiidiotípico (anti-Id) específico para tales proteínas de unión de la divulgación. Un anticuerpo anti-Id es un anticuerpo, que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con la región de unión a antígeno de otro anticuerpo. El anti-Id se puede preparar inmunizando un animal con la proteína de unión o una región que contenga CDR de la misma. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante y producirá un anticuerpo anti-Id. El anticuerpo anti-Id puede utilizarse también como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal adicional, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-Id.

Aún más, un experto en la materia apreciará que una proteína de interés se puede expresar utilizando una biblioteca de células hospedadoras modificadas genéticamente para expresar diversas enzimas de glucosilación, de manera que las células hospedadoras miembro de la biblioteca produzcan la proteína de interés con patrones de glucosilación variantes. A continuación, un médico puede seleccionar y aislar la proteína de interés con patrones de glucosilación novedosos y particulares. Preferentemente, la proteína que tiene un patrón de glucosilación novedoso particularmente seleccionado presenta propiedades biológicas mejoradas o alteradas.

D. Usos de anticuerpos anti-IL-13

Dada su capacidad para unirse a la IL-13 humana, los anticuerpos anti-IL-13 humana, o porciones de los mismos, de la divulgación se puede utilizar para detectar IL-13 humana (por ejemplo, en una muestra biológica, tal como suero o plasma), utilizando un inmunoensayo convencional, tal como un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA) o inmunohistoquímica tisular. La divulgación proporciona un método para detectar IL-13 humana en una muestra biológica que comprende poner en contacto una muestra biológica con un anticuerpo, o porción de anticuerpo, de la divulgación y detectar el anticuerpo (o porción del anticuerpo) unido a la IL-13 humana o el anticuerpo (o porción del anticuerpo) no unido, para detectar, de este modo, IL-13 humana en la muestra biológica. El anticuerpo se marca directa o indirectamente con una sustancia detectable para facilitar la detección del anticuerpo unido o no unido. Las sustancias detectables adecuadas incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, p-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de material luminiscente incluye luminol; y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen ³H, ¹⁴C, ³⁵S, ⁹⁰Y, ⁹⁹Tc, ¹¹¹In, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁷⁷Lu, 166Ho o ¹⁵³Sm.

Como alternativa al marcado del anticuerpo, la IL-13 humana se puede analizar en fluidos biológicos mediante un inmunoensayo de competición utilizando patrones de rhIL-13 marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-13 humana sin marcar. En este ensayo, la muestra biológica, los patrones de rhIL-13 marcados y el anticuerpo anti-IL-13 humana se combinan y se determina la cantidad de patrón de rhIL-13 marcado unido al anticuerpo sin marcar. La cantidad de IL-13 humana en la muestra biológica es inversamente proporcional a la cantidad de patrón de rhIL-13 marcado unido al anticuerpo anti-IL-13. De manera similar, la IL-13 humana también se puede analizar en fluidos biológicos mediante un inmunoensayo de competición utilizando patrones de rhIL-13 marcados con una sustancia detectable y un anticuerpo anti-IL-13 humana sin marcar.

Los anticuerpos y las porciones de anticuerpo de la divulgación preferentemente son capaces de neutralizar la actividad de IL-13 humana tanto in vitro e in vivo. En consecuencia, tales anticuerpos y porciones de anticuerpo de la divulgación se pueden usar para inhibir la actividad de hIL-13, por ejemplo, en un cultivo celular que contiene hIL-13, en sujetos humanos o en otros sujetos mamíferos que tienen IL-13 con la que un anticuerpo de la divulgación reacciona de forma cruzada. En un aspecto, la divulgación proporciona un método para inhibir la actividad de hIL-13 que comprende poner en contacto la hIL-13 con un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación de manera que se inhiba la actividad de hIL-13. Por ejemplo, en un cultivo celular que contiene o se sospeche que contiene hIL-13, se puede añadir un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la divulgación al medio de cultivo para inhibir la actividad de hIL-13 en el cultivo.

También se divulga en el presente documento un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación para su uso en un método para reducir la actividad de hIL-13 en un sujeto, ventajosamente de un sujeto que padece una enfermedad o trastorno en el que la actividad de IL-13 es perjudicial. En el presente documento se divulgan anticuerpos o porciones de anticuerpo de la divulgación para su uso en métodos para reducir la actividad de IL-13 en un sujeto que padece tal enfermedad o trastorno, cuyo método comprende administrar al sujeto un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la divulgación de manera que se reduzca la actividad de IL-13 en el sujeto. Preferentemente, la IL-13 es IL-13 humana y el sujeto es un sujeto humano. Como alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que expresa una IL-13 a la que es capaz de unirse un anticuerpo de la divulgación. Además, el sujeto puede ser un mamífero en el que se ha introducido IL-13 (por ejemplo, mediante la administración de IL-13 o mediante la expresión de un transgén de IL-13). Se proporciona un anticuerpo de la divulgación para su uso en la administración a un sujeto humano con fines terapéuticos. Por otra parte, se proporciona un anticuerpo de la divulgación para su uso en la administración a un mamífero no humano que expresa una IL-13 con la que el anticuerpo es capaz de unirse con fines veterinarios o como un modelo animal de enfermedad humana. Respecto a este último, tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de la divulgación (por ejemplo, prueba de dosis y tiempos de administración).

Como se usa en el presente documento, la expresión "un trastorno en el que la actividad de IL-13 es perjudicial" pretende incluir enfermedades y otros trastornos en los que se ha demostrado o se sospecha que la presencia de IL-13 en un sujeto que padece el trastorno es responsable de la fisiopatología del trastorno o un factor que contribuye a un empeoramiento del trastorno. En consecuencia, un trastorno en el que la actividad de IL-13 es perjudicial es un trastorno en el que se espera que la reducción de la actividad de IL-13 alivie los síntomas y/o la progresión del trastorno. Tales trastornos pueden evidenciarse, por ejemplo, por un aumento en la concentración de IL-13 en un fluido biológico de un sujeto que padece el trastorno (por ejemplo, un aumento en la concentración de IL-13 en suero, plasma, líquido sinovial, etc. del sujeto), que se puede detectar, por ejemplo, usando un anticuerpo anti-IL-13 como se describe anteriormente. Los ejemplos no limitantes de trastornos que se pueden tratar con los anticuerpos de la divulgación incluyen aquellos trastornos analizados en la sección a continuación que pertenece a las composiciones farmacéuticas de los anticuerpos de la divulgación.

La IL-13 está implicada en que tiene un papel fundamental en la generación de respuestas patológicas asociadas con el asma. Sin embargo, otros mediadores de vías inmunitarias diferenciales que también están implicados en la patogénesis del asma y bloquean estos mediadores, además de IL-13, pueden ofrecer un beneficio terapéutico adicional. Por tanto, las proteínas de unión de la divulgación pueden incorporarse en proteínas de DVD-Ig donde en el DVD es capaz de unirse a pares diana que incluyen, pero sin limitación, IL-13 y una citocina proinflamatoria, tal como el factor de necrosis tumoral a (TNF-a). El TNF-a puede amplificar la respuesta inflamatoria en el asma y puede estar relacionado con la gravedad de la enfermedad (McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.). Esto sugiere que bloquear tanto IL-13 como TNF-a puede tener efectos beneficiosos, particularmente en la enfermedad grave de las vías respiratorias. En un aspecto preferido de la divulgación, la DVD-Ig de la divulgación se une a las dianas IL-13 y TNFa y se usa para tratar el asma.

En otro aspecto, las proteínas de unión de la divulgación pueden usarse para generar moléculas de DVD-Ig que se unen a IL-13 e IL-1beta, IL-13 e IL-9; IL-13 e IL-4; IL-13 e IL-5; IL-13 e IL-25; IL-13 y TARC; IL-13 y MDC; IL-13 y MIF; IL-13 y TGF-p; IL-13 y agonista de LHR; IL-13 e CL25; IL-13 e SPRR2a; IL-13 e SPRR2b; e IL-13 y ADAM⁸. La presente divulgación también proporciona DVD-Ig capaces de unirse a IL-13 y una o más dianas implicadas en el asma seleccionadas del grupo que consiste en CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), Fg F2, IFNA1, IFNB1, IFNG, histamina y receptores de histamina, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL⁶, IL7, IL⁸, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL⁸RA, IL⁸RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL⁸, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR⁶, CCR7, CCR⁸, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT⁶, TBX21, TGFB1, TNFSF⁶, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR y quitinasa.

D. Composiciones farmacéuticas

La divulgación también proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, de la divulgación y un transportador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden anticuerpos de la divulgación son para su uso en, pero sin limitación, diagnosticar, detectar o monitorizar un trastorno, en prevenir, tratar, gestionar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo y/o en investigación. En un aspecto específico de la divulgación, una composición comprende uno o más anticuerpos de la divulgación. En otro aspecto de la divulgación, la composición farmacéutica comprende uno o más anticuerpos de la divulgación y uno o más agentes profilácticos o terapéuticos distintos de anticuerpos de la divulgación para tratar un trastorno en el que la actividad de IL-13 es perjudicial. Preferentemente, se sabe que los agentes profilácticos o terapéuticos son útiles para o que se han usado o se usan en la actualidad en la prevención, tratamiento, gestión o mejora de un trastorno o uno o más síntomas del mismo. De acuerdo con estos aspectos de la divulgación, la composición puede comprender además un transportador, diluyente o excipiente.

Los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a un sujeto. Normalmente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación y un transportador farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, "transportador farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de transportadores farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, suero salino tamponado con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Los transportadores farmacéuticamente aceptables pueden comprender además cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian la vida útil o la eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.

Se conocen diversos sistemas de suministro y pueden usarse para administrar uno o más anticuerpos de la divulgación o la combinación de uno o más anticuerpos de la divulgación y un agente profiláctico o agente terapéutico útil para prevenir, gestionar, tratar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo, por ejemplo, encapsulación en liposomas, micropartículas, microcápsulas, células recombinantes capaces de expresar el anticuerpo o fragmento de anticuerpo, endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construcción de un ácido nucleico como parte de un vector retrovírico o de otro tipo, etc. Los métodos para administrar un agente profiláctico o terapéutico de la divulgación incluyen, pero sin limitación, administración parenteral (por ejemplo, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa y subcutánea), administración epidural, administración intratumoral y administración mucosa (por ejemplo, vías intranasal y oral). Además, se puede emplear la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador y formulación con un agente de formación de aerosol. Véanse, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos N.° 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y las publicaciones del PCT n.° WO 92/19244; WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903. En un aspecto, un anticuerpo de la divulgación, la terapia de combinación, o una composición de la divulgación se proporciona para su uso en la administración utilizando la tecnología de suministro de fármacos pulmonares Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.). En un aspecto específico, se pueden proporcionar agentes profilácticos o terapéuticos de la divulgación para su uso en la administración por vía intramuscular, intravenosa, intratumoral, oral, intranasal, pulmonar o subcutánea. Los agentes profilácticos o terapéuticos pueden proporcionarse para su uso en la administración por cualquier vía conveniente, por ejemplo, mediante infusión o inyección en embolada, mediante absorción a través de los revestimientos epiteliales o mucocutáneos (por ejemplo, mucosa oral, mucosa rectal e intestinal, etc.) y se puede proporcionar para su uso en administración junto con otros agentes biológicamente activos. La administración puede ser sistémica o local.

En un aspecto específico de la divulgación, puede ser deseable administrar los agentes profilácticos o terapéuticos de la divulgación localmente en el área que necesita tratamiento; esto puede lograrse mediante, por ejemplo y sin limitación, infusión local, mediante inyección o mediante un implante, siendo dicho implante de un material poroso o no poroso, incluyendo membranas y matrices, tales como membranas sialásticas, polímeros, matrices fibrosas (por ejemplo, Tissuel®) o matrices de colágeno. En un aspecto, una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la divulgación se proporciona para su uso en la administración local al área afectada a un sujeto para prevenir, tratar, gestionar y/o mejorar un trastorno o un síntoma del mismo. En otro aspecto, se proporciona una cantidad eficaz de uno o más anticuerpos de la divulgación para su uso en la administración local al área afectada en combinación con una cantidad eficaz de una o más terapias (por ejemplo, uno o más agentes profilácticos o terapéuticos) distintos de un anticuerpo de la invención de un sujeto para prevenir, tratar, gestionar y/o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo.

En otro aspecto, el agente profiláctico o terapéutico de la divulgación se proporciona para su suministro en un sistema de liberación controlada o de liberación sostenida. En un aspecto de la divulgación, puede usarse una bomba para lograr la liberación controlada o sostenida (véase Langer, anteriormente mencionado; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med.

321:574). En otro aspecto, los materiales poliméricos pueden usarse para lograr la liberación controlada o sostenida de las terapias de la divulgación (véase, por ejemplo, Medical Applications of Controlled Release, Langer y Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen y Ball (eds.), Wiley, Nueva York (1984); Ranger y Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem.

23:61; véase también Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105); la patente de los Estados Unidos n.° 5.679.377; la patente de los Estados Unidos n.° 5.916.597; la patente de los Estados Unidos n.° 5.912.015; la patente de los Estados Unidos n.° 5.989.463; la patente de los Estados Unidos n.° 5.128.326; la publicación del PCT n.° WO 99/15154; y publicación del PCT n.° WO 99/20253. Los ejemplos de polímeros usados en formulaciones de liberación sostenida incluyen, pero sin limitación, poli(²-hidroxi etil metacrilato), poli(metil metacrilato), ácido poli(acrílico), poli(acetato de etileno-co-vinilo), poli(ácido metacrílico), poliglicólidos (^pL^g), polianhídridos, poli(N-vinil pirrolidona), poli(alcohol de vinilo), poliacrilamida, poli(etilenglicol), polilactidas (PLA), poli(lactida-co-glicolidas) (PLGA) y poliortoésteres. En un aspecto preferido, el polímero usado en una formulación de liberación sostenida es inerte, libre de impurezas lixiviables, estable durante el almacenamiento, estéril y biodegradable. En otro aspecto más de la divulgación, puede colocarse un sistema de liberación controlada o sostenida en proximidad de la diana profiláctica o terapéutica, requiriendo de este modo solamente una fracción de la dosis sistémica (véase, por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, anteriormente citado, vol. 2, págs. 115-138 (1984)).

Los sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión por Langer (1990, Science 249:1527-1533). Se puede usar cualquier técnica conocida por un experto en la materia para producir formulaciones de liberación sostenida que comprendan uno o más agentes terapéuticos de la divulgación. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos n.° 4.526.938, la publicación del pCt WO 91/05548, la publicación del PCT WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel", Radiotherapy &Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions", PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application" Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater.

24:853-854 y Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery", Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760.

En un aspecto específico, en donde la composición de la divulgación es un ácido nucleico que codifica un agente profiláctico o terapéutico, el ácido nucleico se puede proporcionar para su uso en la administración in vivo para promover la expresión de su agente profiláctico o terapéutico codificado, construyéndolo como parte de un vector de expresión de ácido nucleico adecuado y para su administración de tal forma que se vuelve intracelular, por ejemplo, mediante el uso de un vector retrovírico (véase la patente de los Estados Unidos N.° 4.980.286), o mediante inyección directa, o mediante el uso de bombardeo de micropartículas (por ejemplo, una pistola de genes; Biolistic, Dupont) o recubrimiento con lípidos o receptores de la superficie celular o agentes de transfección o su administración en unión con un péptido similar a caja homeostática que se sabe que entra en el núcleo (véase, por ejemplo, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). Como alternativa, un ácido nucleico puede proporcionarse para introducción intracelular e incorporarse en el ADN de la célula hospedadora para su expresión mediante recombinación homóloga.

Una composición farmacéutica de la divulgación se formula para que sea compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración incluyen, pero sin limitación, administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral, intranasal (por ejemplo, inhalación), transdérmica (por ejemplo, tópica), transmucosa y rectal. En un aspecto específico, la composición se formula de acuerdo con procedimientos habituales en forma de una composición farmacéutica adaptada para administración intravenosa, subcutánea, intramuscular, oral, intranasal o tópica a seres humanos. Normalmente, las composiciones para administración intravenosa son soluciones en tampón acuoso isotónico estéril. En caso necesario, la composición también puede incluir un agente solubilizante y un anestésico local, tal como lignocaína para aliviar el dolor en el sitio de la inyección.

Si las composiciones de la divulgación se proporcionan para su uso en administración tópica, las composiciones pueden formularse en forma de una pomada, crema, parche transdérmico, loción, gel, champú, pulverización, aerosol, solución, emulsión u otra forma bien conocida por un experto en la materia. Véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19a ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995). Para las formas farmacéuticas tópicas no pulverizables, se emplean normalmente formas semisólidas o sólidas que comprenden un transportador o uno o más excipientes compatibles con la aplicación tópica y que tienen una viscosidad dinámica preferentemente mayor que el agua. Las formulaciones adecuadas incluyen, sin limitación, soluciones, suspensiones, emulsiones, cremas, pomadas, polvos, linimentos, salvas y similares, que, si se desea, se esterilizan o mezclan con agentes auxiliares (por ejemplo, conservantes, estabilizantes, agentes humectantes, tampones o sales) para influenciar diversas propiedades, tales como, por ejemplo, presión osmótica. Otras formas farmacéuticas tópicas adecuadas incluyen preparaciones en aerosol pulverizables, donde el principio activo, preferentemente, en combinación con un transportador sólido o líquido inerte, se envasa en una mezcla con un componente volátil a presión (por ejemplo, un propulsor gaseoso, tal como freón) o en un envase exprimible. Los agentes hidratantes o humectantes también pueden añadirse, si se desea, a las composiciones farmacéuticas y las formas farmacéuticas. Los ejemplos de dichos ingredientes adicionales son bien conocidos en la técnica.

Si el método divulgado en el presente documento comprende la administración intranasal de una composición, la composición puede formularse en forma de aerosol, pulverización, nebulización o en forma de gotas. En particular, los agentes profilácticos o terapéuticos para su uso según la presente divulgación pueden suministrarse convenientemente en forma de una presentación de pulverización en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado (por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado). En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación puede determinarse proporcionando una válvula la cual suministra una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos (compuestos de, por ejemplo, gelatina) para su uso en un inhalador o insuflador pueden formularse para que contengan una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada, tal como lactosa o almidón.

Si el método divulgado en el presente documento comprende la administración oral, las composiciones pueden formularse para vía oral en forma de comprimidos, cápsulas, sellos, cápsulas de gel, soluciones, suspensiones y similares. Los comprimidos o cápsulas pueden prepararse por medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil metilcelulosa); cargas (por ejemplo, lactosa, celulosa microcristalina o hidrogenofosfato de calcio); lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco o sílice); disgregantes (por ejemplo, almidón de patata o glicolato sódico de almidón); o agentes humectantes (por ejemplo, lauril sulfato de sodio). Los comprimidos pueden recubrirse mediante métodos bien conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden tomar la forma de, pero sin limitación, soluciones, jarabes o suspensiones o pueden presentarse como un producto seco para su constitución con agua u otro vehículo adecuado antes de su uso. Dichas preparaciones líquidas se pueden preparar por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (por ejemplo, jarabe de sorbitol, derivados de celulosa o grasas hidrogenadas comestibles); agentes emulsionantes (por ejemplo, lecitina o goma arábiga); vehículos no acuosos (por ejemplo, aceite de almendras, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados); y conservantes (por ejemplo, p-hidroxibenzoatos de metilo o propilo o ácido sórbico). Las preparaciones también pueden contener sales tampón, agentes aromatizantes, colorantes y edulcorantes, según sea adecuado. Las preparaciones para administración oral pueden formularse de manera adecuada para liberación lenta, liberación controlada o liberación sostenida de agentes profilácticos o terapéuticos.

El método de la divulgación puede comprender la administración pulmonar, por ejemplo, mediante el uso de un inhalador o nebulizador, de una composición formulada con un agente de formación de aerosol. Véase, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos N.° 6.019.968, 5.985.320, 5.985.309, 5.934.272, 5.874.064, 5.855.913, 5.290.540 y 4.880.078; y las publicaciones del PCT n.° WO 92/19244; WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 y WO 99/66903. En un aspecto específico, un anticuerpo de la divulgación, terapia de combinación y/o una composición de la divulgación es para su uso en la administración que utiliza la tecnología de administración de fármacos pulmonares Alkermes AIR® (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.).

El método divulgado en el presente documento puede comprender la administración de una composición formulada para administración parenteral mediante inyección (por ejemplo, mediante inyección en embolada o infusión continua). Las formulaciones para inyección pueden presentarse en forma farmacéutica unitaria (por ejemplo, en ampollas o en envases multidosis) con un conservante añadido. Las composiciones pueden adoptar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden comprender agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, agentes estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, el principio activo puede encontrarse en forma de polvo para su constitución con un vehículo adecuado (por ejemplo, agua despirogenada estéril) antes de su uso.

Los métodos divulgados en el presente documento pueden comprender adicionalmente la administración de composiciones formuladas como preparaciones de absorción lenta. Estas formulaciones de acción prolongada pueden proporcionarse para su uso en la administración mediante implantación (por ejemplo, subcutánea o intramuscular) o mediante inyección intramuscular. Por tanto, por ejemplo, las composiciones pueden formularse con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo, en forma de una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o en forma de derivados poco solubles (por ejemplo, en forma de una sal poco soluble).

Los métodos divulgados en el presente documento abarcan la administración de composiciones formuladas como formas neutras o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen aquellas formadas con aniones, tales como aquellos derivados de los ácidos clorhídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., y los formados con cationes tales como los derivados de sodio, potasio, amonio, calcio, hidróxidos férricos, isopropilamina, trietilamina, ²-etilamino etanol, histidina, procaína, etc.

Generalmente, los ingredientes de las composiciones se suministran bien por separado o se mezclan conjuntamente en forma de dosis unitaria, por ejemplo, como un polvo liofilizado seco o concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecillo que indica la cantidad de principio activo. Cuando el modo de administración es infusión, la composición puede dispensarse con una botella de infusión que contiene agua o suero salino de grado farmacéutico. Cuando el modo de administración es mediante inyección, puede proporcionarse una ampolla de agua estéril para inyección o solución salina de modo que los ingredientes pueden mezclarse antes de la administración.

En particular, la divulgación también prevé que uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la divulgación, se envasen en un recipiente herméticamente cerrado tal como una ampolla o sobrecillo que indique la cantidad del agente. En un aspecto, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la divulgación se suministran como un polvo liofilizado esterilizado seco o un concentrado exento de agua en un recipiente herméticamente cerrado y se pueden reconstituir (por ejemplo, con agua o solución salina) a la concentración apropiada para administración a un sujeto. Preferentemente, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la divulgación se suministra como un polvo liofilizado estéril seco en un recipiente herméticamente cerrado a una dosis unitaria de al menos 5 mg, más preferentemente al menos 10 mg, al menos 15 mg, al menos 25 mg, al menos 35 mg, al menos 45 mg, al menos 50 mg, al menos 75 mg o al menos 100 mg. Los agentes profilácticos o terapéuticos liofilizados o las composiciones farmacéuticas de la divulgación deben almacenarse entre 2 °C y ⁸°C en su envase original y los agentes profilácticos o terapéuticos, o las composiciones farmacéuticas de la divulgación deben administrarse antes de 1 semana, preferentemente antes de 5 días, antes de 72 horas, antes de 48 horas, antes de 24 horas, antes de 12 horas, antes de ⁶horas, antes de 5 horas, antes de 3 horas o antes de 1 hora después de reconstituirse. En un aspecto alternativo, uno o más de los agentes profilácticos o terapéuticos o composiciones farmacéuticas de la divulgación se suministran en forma líquida en un recipiente herméticamente cerrado que indica la cantidad y concentración del agente. Preferentemente, la forma líquida de la composición administrada se suministra en un recipiente sellado herméticamente al menos a 0,25 mg/ml, más preferentemente al menos 0,5 mg/ml, al menos 1 mg/ml, al menos 2,5 mg/ml, al menos 5 mg/ml, al menos ⁸mg/ml, al menos 10 mg/ml, al menos 15 mg/kg, al menos 25 mg/ml, al menos 50 mg/ml, al menos 75 mg/ml o al menos 100 mg/ml. La forma líquida ha de almacenarse a entre 2 °C y ⁸°C en su recipiente original.

Los anticuerpos y las porciones de anticuerpo de la divulgación se pueden incorporar en una composición farmacéutica adecuada para administración parenteral. Preferentemente, el anticuerpo o porciones de anticuerpo se prepararán como una solución inyectable que contiene 0,1-250 mg/ml de anticuerpo. La solución inyectable puede estar compuesta por una forma farmacéutica líquida o liofilizada en un vial de pedernal o ámbar, ampolla o jeringa precargada. El tampón puede ser L-histidina (1-50 mM), óptimamente 5-10 mM, a pH 5,0 a 7,0 (óptimamente pH 6,0). Otros tampones adecuados incluyen, pero sin limitación, succinato de sodio, citrato de sodio, fosfato de sodio o fosfato de potasio. Puede usarse cloruro de sodio para modificar la toxicidad de la solución a una concentración de 0-300 mM (óptimamente, 150 mM para una forma farmacéutica líquida). Pueden incluirse crioprotectores para una forma farmacéutica liofilizada, principalmente, sacarosa al 0-10 % (óptimamente, al 0,5-1,0 %). Otros crioprotectores adecuados incluyen trehalosa y lactosa. Pueden incluirse espesantes para una forma farmacéutica liofilizada, principalmente, manitol al 1-10 % (óptimamente al 2-4 %). Pueden usarse estabilizantes en formas farmacéuticas líquidas y liofilizadas, principalmente L-metionina 1-50 mM (opcionalmente, 5-10 mM). Otros agentes espesantes incluyen glicina, arginina, que pueden incluirse como polisorbato-80 al 0-0,05 % (óptimamente, al 0,005-0,01 %). Los tensioactivos adicionales incluyen, pero sin limitación, polisorbato 20 y tensioactivos BRIJ. La composición farmacéutica que comprende los anticuerpos y porciones de anticuerpo de la divulgación preparada como una solución inyectable para administración parenteral, puede comprender además un agente útil como adyuvante, tal como los que se utilizan para aumentar la absorción o la dispersión de una proteína terapéutica (por ejemplo, un anticuerpo). Un adyuvante particularmente útil es la hialuronidasa, tal como Hylenex® (hialuronidasa humana recombinante). La adición de hialuronidasa en la solución inyectable mejora la biodisponibilidad en seres humanos después de la administración parenteral, en particular, la administración subcutánea. También permite mayores volúmenes en el sitio de inyección (es decir, mayores de ¹ml) con menos dolor y malestar y una incidencia mínima de reacciones en el sitio de inyección, (véase los documentos WO2004078140, US2006104968).

Las composiciones de la presente divulgación pueden encontrarse en diversas formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas farmacéuticas líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusionables), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferente depende del modo previsto de administración y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infusionables, tales como composiciones similares a las utilizadas para inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intraperitoneal, intramuscular). En un aspecto preferido de la divulgación, el anticuerpo se proporciona para su uso en administración mediante infusión o inyección intravenosa. En otro aspecto preferido de la divulgación, el anticuerpo se proporciona para su uso en la administración mediante inyección intramuscular o subcutánea.

Las composiciones terapéuticas han de ser normalmente estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para una concentración alta de fármaco. Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando el compuesto activo (es decir, un anticuerpo o porción de anticuerpo) en la cantidad requerida en un disolvente adecuado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según sea necesario, seguido de esterilización por filtrado. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos liofilizados estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por pulverización, que proporciona un polvo del principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado procedente de una solución anteriormente esterilizada por filtrado del mismo. Puede mantenerse la fluidez adecuada de una solución, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula necesario en el caso de una dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Puede propiciarse la absorción prolongada de composiciones inyectables aproximadamente incluyendo, en la composición, un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Los anticuerpos y porcines de anticuerpo de la presente divulgación pueden proporcionarse para su uso en la administración mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo de administración preferido es la inyección subcutánea, inyección intravenosa o infusión. Como apreciarán los expertos en la materia, la vía y/o el modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En determinados aspectos de la divulgación, el compuesto activo puede prepararse con un transportador que protegerá al compuesto frente a su rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Pueden usarse polímeros biodegradables y biocompatibles, tales como acetato de etilen vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen generalmente por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.

En determinados aspectos de la divulgación, se puede proporcionar un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación para su uso en la administración oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un transportador comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, en caso de que se desee) también pueden atraparse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, prensarse en comprimidos o incorporarse directamente en la dieta del sujeto. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. Para administrar un compuesto de la divulgación mediante una administración distinta a la parenteral, puede ser necesario recubrir el compuesto con, o administrar el compuesto junto con, un material para prevenir su inactivación.

Los compuestos activos complementarios también se pueden incorporar en las composiciones. En determinados aspectos, un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación se formula junto con y/o se administra junto con uno o más agentes terapéuticos adicionales que son útiles para tratar trastornos en los que la actividad de IL-13 es perjudicial. Por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-13 o una porción de anticuerpo de la divulgación puede formularse junto con y/o administrarse junto con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citocinas o que se unen a moléculas de la superficie celular). Asimismo, se pueden proporcionar uno o más anticuerpos de la divulgación para su uso en combinación con dos o más de los agentes terapéuticos anteriores. Tales terapias de combinación pueden utilizar ventajosamente dosis más bajas de los agentes terapéuticos administrados, evitando así posibles toxicidades o complicaciones asociadas a las distintas monoterapias.

En determinados aspectos de la divulgación, un anticuerpo contra IL-13 o un fragmento del mismo está unido a un vehículo que prolonga la semivida conocido en la técnica. Dichos vehículos incluyen, pero sin limitación, el dominio Fc, polietilenglicol y dextrano. Dichos vehículos se describen, por ejemplo, en la solicitud de los Estados Unidos con n.° de serie 09/428.082 y la solicitud del PCT publicada n.° WO 99/25044.

En un aspecto específico, las secuencias del ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un anticuerpo de la divulgación u otro agente profiláctico o terapéutico de la divulgación se proporcionan para su uso en la administración para tratar, prevenir, gestionar o mejorar un trastorno o uno o más síntomas del mismo mediante terapia génica. La terapia génica se refiere a la terapia realizada mediante la administración a un sujeto de un ácido nucleico expresado o que puede expresarse. En este aspecto de la divulgación, los ácidos nucleicos producen su anticuerpo o agente profiláctico o terapéutico codificado de la divulgación que media un efecto profiláctico o terapéutico.

El anticuerpo o porción de anticuerpo de la presente divulgación se proporciona para su uso en cualquiera de los métodos de terapia génica disponibles en la técnica. Para revisiones generales de los métodos de terapia génica, véanse Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu y Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926-932 (1993); y Morgan y Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; mayo de 1993, TIBTECH 11(5):155-215. Los métodos comúnmente conocidos en la técnica de tecnología de ADN recombinante que pueden usarse se describen en Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); y Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990). Se divulga una descripción detallada de diversos métodos de terapia génica en.

En otro aspecto, esta solicitud presenta un anticuerpo o porción de anticuerpo de la presente divulgación para su uso en un método para tratar (por ejemplo, curar, suprimir, mejorar, retrasar o prevenir la aparición o prevenir la recurrencia o recaída de) o prevenir un trastorno asociado a IL-13, en un sujeto. El método incluye: administrar al sujeto un agente de unión a IL-13 (particularmente un antagonista), por ejemplo, un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo como se describe en el presente documento, en una cantidad suficiente para tratar o prevenir el trastorno asociado a IL-13. El antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo, se puede proporcionar para su uso en la administración al sujeto, solo o en combinación con otras modalidades terapéuticas como se describe en el presente documento.

En un aspecto de la divulgación, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que padece uno o más trastornos asociados a IL-13, que incluyen, por ejemplo, trastornos respiratorios (por ejemplo, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y otras afecciones que implican inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco; trastornos atópicos (por ejemplo, dermatitis atópica y rinitis alérgica); afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias de, la piel, los órganos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (EII), tal como colitis ulcerosa y/o enfermedad de Crohn) del hígado (por ejemplo, cirrosis, fibrosis); esclerodermia; tumores o cánceres, por ejemplo, Linfoma de Hodgkin como se describe en el presente documento. En consecuencia, la divulgación incluye un agente de unión a IL-13 (tal como un anticuerpo anti-IL-13 o un fragmento del mismo descrito en el presente documento) para su uso en un tratamiento descrito en el presente documento y el uso de un agente de unión a IL-13 (tal como un anticuerpo anti-IL -13 o fragmento del mismo descrito en el presente documento) para preparar un medicamento para un tratamiento descrito en el presente documento.

Los ejemplos de trastornos asociados a IL-13 incluyen, pero sin limitación, un trastorno elegido de uno o más de: trastornos respiratorios, por ejemplo, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica (por ejemplo, asma debido a una infección con, por ejemplo, virus respiratorio sincitial (RSV, por sus siglas en inglés), por ejemplo, en niños más pequeños)), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) y otras afecciones que implican inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, por ejemplo, fibrosis quística y fibrosis pulmonar; trastornos atópicos, por ejemplo, como resultado de una mayor sensibilidad a la IL-13 (por ejemplo, dermatitis atópica, urticaria, eccema, rinitis alérgica y enterogastritis alérgica); afecciones inflamatorias y/o autoinmunitarias de la piel (por ejemplo, dermatitis atópica), los órganos gastrointestinales (por ejemplo, enfermedades inflamatorias del intestino (EII), tal como colitis ulcerosa y/o enfermedad de Crohn), del hígado (por ejemplo, cirrosis, carcinoma hepatocelular) y esclerodermia; tumores o cánceres (por ejemplo, tumores de tejidos blandos o sólidos), tal como leucemia, glioblastoma y linfoma, por ejemplo, linfoma de Hodgkin; infecciones víricas (por ejemplo, de HTLV-1); fibrosis de otros órganos, por ejemplo, fibrosis del hígado, (por ejemplo, fibrosis provocada por un virus de la hepatitis B y/o C); y supresión de la expresión de respuestas inmunitarias protectoras de tipo ¹, (por ejemplo, durante la vacunación), como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, esta solicitud proporciona un anticuerpo o porción de anticuerpo de la presente divulgación para su uso en un método para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o prevenir uno o más síntomas asociados con un trastorno respiratorio, por ejemplo, asma (por ejemplo, asma alérgica y no alérgica); alergias; enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD); una afección que implica inflamación de las vías respiratorias, eosinofilia, fibrosis y producción excesiva de moco, por ejemplo, fibrosis quística y fibrosis pulmonar. Por ejemplo, los síntomas del asma incluyen, pero sin limitación, sibilancias, dificultad para respirar, broncoconstricción, hiperreactividad de las vías respiratorias, disminución de la capacidad pulmonar, fibrosis, inflamación de las vías respiratorias y producción de moco. El método comprende administrar al sujeto un antagonista de IL-13, por ejemplo, un anticuerpo contra IL-13 o un fragmento del mismo, en una cantidad suficiente para tratar (por ejemplo, reducir, mejorar) o prevenir uno o más síntomas. El anticuerpo contra IL-13 puede proporcionarse para su uso en una administración terapéutica o profiláctica, o ambas. El antagonista de IL-13, por ejemplo, el anticuerpo anti-IL-13, o fragmento del mismo, se puede proporcionar para su uso en la administración al sujeto, solo o en combinación con otras modalidades terapéuticas como se describe en el presente documento. Preferentemente, el sujeto es un mamífero, por ejemplo, un ser humano que padece un trastorno asociado a IL-13 como se describe en el presente documento.

En otro aspecto, esta solicitud proporciona un anticuerpo o una porción de anticuerpo de la presente divulgación para su uso en un método para detectar la presencia de IL-13 en una muestra in vitro (por ejemplo, una muestra biológica, tal como suero, plasma, tejido, biopsia). El método objeto se puede utilizar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado a células inmunitarias. El método incluye: (i) poner en contacto la muestra o una muestra de control con el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo y la muestra o la muestra de control, donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en la muestra con respecto a la muestra de control es indicativo de la presencia de IL-13 en la muestra.

En otro aspecto más, esta aplicación proporciona un método para detectar la presencia de IL-13 in vivo (por ejemplo, imágenes in vivo en un sujeto). El método objeto se puede utilizar para diagnosticar un trastorno, por ejemplo, un trastorno asociado a IL-13. El método incluye: (i) administrar el anticuerpo anti-IL-13 o fragmento del mismo como se describe en el presente documento a un sujeto o un sujeto de control en condiciones que permitan la unión del anticuerpo o fragmento a IL-13; y (ii) detectar la formación de un complejo entre el anticuerpo o fragmento e IL-13, donde un cambio estadísticamente significativo en la formación del complejo en el sujeto en relación con el sujeto de control es indicativo de la presencia de IL-13.

Los anticuerpos de la divulgación, o porciones de unión a antígeno de los mismos se proporcionan para su uso solos o en combinación para tratar tales enfermedades. Debe entenderse que los anticuerpos de la divulgación o porción de unión a antígeno de los mismos se proporcionan para su uso solos o en combinación con un agente adicional, por ejemplo, un agente terapéutico, siendo dicho agente adicional seleccionado por el experto en la materia para su propósito previsto. Por ejemplo, el agente adicional puede ser un agente terapéutico reconocido en la técnica como útil para tratar la enfermedad o afección que se va a tratar mediante el anticuerpo de la presente divulgación. El agente adicional también puede ser un agente que imparta un atributo beneficioso a la composición terapéutica, por ejemplo, un agente que afecta la viscosidad de la composición.

Debe entenderse además que las combinaciones que se incluirán en esta divulgación son aquellas combinaciones útiles para el propósito pretendido. Los agentes que se establecen a continuación son ilustrativos para los fines y no pretenden estar limitados. Las combinaciones, que forman parte de esta divulgación, pueden ser los anticuerpos de la presente divulgación y al menos un agente adicional seleccionado de las listas siguientes. La combinación también puede incluir más de un agente adicional, por ejemplo, dos o tres agentes adicionales si la combinación es tal que la composición formada puede realizar su función prevista.

Se puede proporcionar uno o más antagonistas de IL-13, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-13 o fragmentos de los mismos para su uso en terapia de combinación, formulados junto con y/o proporcionados para su uso en administración junto con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de citocinas y factores de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios (por ejemplo, agentes antiinflamatorios sistémicos), agentes antifibróticos, inhibidores metabólicos, inhibidores de enzimas y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como se describe con más detalle en el presente documento.

Ejemplos de agentes terapéuticos adicionales preferidos que se pueden proporcionar para su uso en la administración conjunta y/o formulación conjunta con uno o más antagonistas de IL-13, por ejemplo, anticuerpos anti-IL-13 o fragmentos de los mismos, incluye, pero sin limitación, uno o más de: esteroides inhalados; agonistas beta, por ejemplo, agonistas beta de acción corta o de acción prolongada; antagonistas de leucotrienos o receptores de leucotrienos; fármacos de combinación tal como ADVAIR; inhibidores de IgE, por ejemplo, anticuerpos anti-IgE (por ejemplo, XOLAIR); inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, inhibidores de PDE4); xantinas; fármacos anticolinérgicos; agentes estabilizantes de mastocitos tales como cromolín; inhibidores de IL-4; inhibidores de IL-5; inhibidores de eotaxina/CCR3; antagonistas de la histamina o sus receptores, incluyendo H1, H2, H3 y H4, y antagonistas de la prostaglandina D o sus receptores (DPI y CRTH2). Estas combinaciones se pueden utilizar para tratar asma y otros trastornos respiratorios. Ejemplos adicionales de agentes terapéuticos que se pueden proporcionar para su uso en la administración conjunta y/o formulación conjunta con uno o más anticuerpos anti-IL-13 o fragmentos de los mismos incluyen uno o más de: antagonistas de TNF (por ejemplo, un fragmento soluble de un receptor de TNF, por ejemplo, receptor de TNF humano p55 o p75 o derivados del mismo, por ejemplo, TNFR-IgG de 75 kD (proteína de fusión de receptor de TNF-IgG de 75 kD, ENBREL)); antagonistas de la enzima TNF, por ejemplo, inhibidores de la enzima convertidora de TNF (TACE); antagonistas de los receptores muscarínicos; antagonistas de TGF-beta; interferón gamma; perfenidona; agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, metotrexato, leflunomida, o un sirolimus (rapamicina) o un análogo de los mismos, por ejemplo, CCI-779; inhibidores de COX2 y cPLA2; AINE; inmunomoduladores; inhibidores de p38, TPL-2, inhibidores de MK-2 y NFkB, entre otros.

Otras combinaciones preferidas son fármacos antiinflamatorios supresores de citocinas (CSAID, por sus siglas en inglés); anticuerpos o antagonistas de otras citocinas humanas o factores de crecimiento, por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-⁶, IL-7, IL-⁸, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, interferones, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF y edotelina-1, así como los receptores de estas citocinas y factores de crecimiento. Se pueden proporcionar anticuerpos de la divulgación, o porciones de unión a antígeno de los mismos, para su uso en combinación con anticuerpos contra moléculas de la superficie celular tales como CD2, CD3, CD4, CD⁸, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80 (B7.1), CD⁸⁶(B7.2), CD90, CTLA o sus ligandos, incluido CD154 (gp39 o CD40L).

Las combinaciones preferidas de agentes terapéuticos pueden interferir en diferentes puntos de la cascada inflamatoria; los ejemplos preferidos incluyen antagonistas de TNF como anticuerpos contra TNF quiméricos, humanizados o humanos, D2E7, (publicación del PCT n.° WO 97/29131), CA2 (RemicadeTM), CDP 571 y receptores de TNF p55 o p75 solubles, derivados, de los mismos, (p75TNFR1gG (EnbrelTM) o p55TNFR1gG (Lenercept), y también inhibidores de la enzima convertidora de TNF (TACE, por sus siglas en inglés); de manera similar pueden ser eficaces los inhibidores de IL-1 (inhibidores de la enzima convertidora de interleucina-1, IL-1RA, etc.) por la misma razón. Otras combinaciones preferidas incluyen interleucina 4. Otra combinación preferida más son otros actores clave de la respuesta asmática que pueden actuar en paralelo a, de manera dependiente de o junto con la función de IL-13; son especialmente preferidos los antagonistas de IL-9 que incluyen anticuerpos contra IL-9. Se ha demostrado que IL-13 e IL-9 tienen funciones superpuestas pero distintas y una combinación de antagonistas de ambas puede ser más eficaz. Otra combinación preferida más son los anticuerpos anti-IL-5. Otras combinaciones preferidas más incluyen antagonistas de quimiocinas que incluyen MCP-1, MCP-4, eotaxinas, RANTES, MDC, CCL-12 y CCL-17 (TARC) y receptores de quimiocinas, incluyendo CCR2, CCR3, CCR4 y CXCR4. Las más combinaciones pueden incluir antagonistas de los mediadores del asma, incluyendo la quitinasa ácida de mamíferos, CRHT2, quimasa, S1P1, S1P2, Tyk2, ROCKII, Stat⁶, p38, NFkB, fosfodiesterasa 4 (pDE-4), tritasa de mastocitos, NO, adenosina, IKK2, GATA3, ICAM-1, VCAM-1 e ICOS.

Las composiciones farmacéuticas de la divulgación pueden incluir una "cantidad terapéuticamente eficaz" o una "cantidad profilácticamente eficaz" de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad que es eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del anticuerpo o porción de anticuerpo puede determinarse por un experto en la materia y puede variar según factores tales como la patología, edad, sexo y peso del individuo y la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz es también aquella en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo, o porción de anticuerpo, se superan por los efectos terapéuticamente beneficiosos. Una "cantidad profilácticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz, a las dosificaciones y durante los periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Normalmente, dado que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa más temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.

Pueden ajustarse las pautas posológicas para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un único bolo, se pueden administrar varias dosis divididas a lo largo del tiempo o se puede reducir o aumentar proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para facilitar la administración y la uniformidad de la dosis. La forma farmacéutica unitaria usada en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se vayan a tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el transportador farmacéutico necesario. La especificación para las formas de dosis unitaria de la divulgación está dictada por y depende directamente de (a) las características exclusivas del compuesto activo y del efecto terapéutico o profiláctico concreto que se vaya a lograr y de (b) las limitaciones inherentes en la técnica de formar compuestos de dicho compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos.

Un intervalo ilustrativo, no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un anticuerpo o porción de anticuerpo de la divulgación es de 0,1-20 mg/kg, más preferentemente 1-10 mg/kg. Cabe destacar que los valores de dosificación pueden variar dependiendo del tipo y la gravedad de la afección que se vaya a aliviar. Además, ha de entenderse que, para cualquier sujeto particular, deben ajustarse las pautas posológicas específicas a lo largo del tiempo según las necesidades del individuo y el criterio profesional de la persona que administra o supervisa la administración de las composiciones y que los intervalos de dosificación expuestos en el presente documento son únicamente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance o la práctica de la composición reivindicada.

Ejemplos

Ejemplo 1: Generación y aislamiento de anticuerpos monoclonales anti-IL-13 humana

Ejemplo 1.1: Ensayos para identificar anticuerpos anti-IL-13 humana

A lo largo del ejemplo 1, se usaron los siguientes ensayos para identificar y caracterizar anticuerpos anti IL-13 humana a menos que se indique lo contrario.

Ejemplo 1.1.A: ELISA

Los ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas para explorar anticuerpos que se unen a IL-13 humana se realizaron de la siguiente manera.

Se recubrieron placas ELISA (Corning Costar, Acton, MA) con 50 pl/pocillo de 5 pg/ml de anticuerpo de cabra anti-Fc de IgG de ratón específico (Pierce n.° 31170, Rockford, IL.) en solución salina tamponada con fosfato (PBS) durante la noche a 4 grados centígrados. Las placas se lavaron una vez con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Las placas se bloquearon mediante la adición de 200 pl/pocillo de solución de bloqueo diluida al 2 % en PBS (BioRad n.° 170-6404, Hercules, CA.) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron una vez después de bloquearlas con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %.

Se añadieron cincuenta microlitros por pocillo de sueros de ratón o sobrenadantes de hibridomas diluidos en PBS que contenía albúmina de suero bovino (BSA) al 0,1 % (Sigma, St. Louis, MO.) a la placa ELISA preparada como se describe anteriormente y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Se añadieron a cada pocillo cincuenta microlitros de variante de IL-13 humana purificada recombinante biotinilada (R110Q) diluida a 100 ng/ml en PBS que contenía BSA al 0,1 % y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Se diluyó estreptavidina HRP (Pierce n.° 21126, Rockland, IL.) a 1:20000 en PBS que contenía BSA al 0,1 %; se añadieron 50 pl/pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Se añadieron cincuenta microlitros de solución TMB (Sigma n.° T0440, St. Louis, MO.) A cada pocillo y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico I N. Las placas se leyeron mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 450 nm.

Ejemplo 1.1.B: Determinaciones de afinidad utilizando tecnología BIACORE

El ensayo BIACORE (Biacore, Inc, Piscataway, NJ) determina la afinidad de los anticuerpos con las mediciones cinéticas de las constantes de velocidad de asociación y disociación. La unión de anticuerpos a IL-13 humana purificada recombinante o a la variante de IL-13 humana purificada recombinante (R110Q) se determinó mediante mediciones basadas en resonancia de plasmón superficial con un instrumento Biacore® 3000 (Biacore® AB, Uppsala, Suecia) utilizando HBS-EP (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3 mM y tensioactivo P20 al 0,005 %) de ejecución a 25 °C. Todos los productos químicos se obtuvieron de Biacore® AB (Uppsala, Suecia) o de otra fuente diferente como se describe en el texto. Aproximadamente 5000 UR de fragmento de anticuerpo policlonal específico (Fcy) de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL) diluido en acetato de sodio 10 mM (pH 4,5) se inmovilizó directamente a través de un chip biosensor de grado de investigación CM5 usando un kit de acoplamiento de amina convencional según las instrucciones y procedimientos del fabricante a 25 pg/ml. Los restos que no reaccionaron en la superficie del biosensor se bloquearon con etanolamina. La superficie de carboximetil dextrano modificado en las celdas de flujo ²y 4 se usó como superficie de reacción. Se usó carboximetildextrano sin modificar sin anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón en las celdas de flujo 1 y 3 como superficie de referencia. Para el análisis cinético, las ecuaciones de velocidad derivadas del modelo de unión de Langmuir 1:1 se ajustaron simultáneamente a las fases de asociación y disociación de las ocho inyecciones (utilizando análisis de ajuste global) con el uso del programa informático Biaevaluation 4.0.1. Los anticuerpos purificados se diluyeron en solución salina tamponada con HEPES para la captura a través de superficies de reacción específicas de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón. Se inyectaron anticuerpos de ratón a capturar como ligando (25 pg/ml) sobre matrices de reacción a un caudal de 5 pl/min. Las constantes de velocidad de asociación y disociación, kon (unidad M-1s-1) y koff (unidad s-1) se determinaron con un caudal continuo de 25 pl/min. Las constantes de velocidad se obtuvieron realizando mediciones de unión cinética a diez concentraciones de antígeno diferentes que oscilan entre 10 y 200 nM. A continuación, se calculó la constante de disociación en equilibrio (unidad M) de la reacción entre anticuerpos de ratón e IL-13 humana purificada recombinante o IL-13 humana purificada recombinante a partir de las constantes de velocidad cinéticas mediante la siguiente fórmula: K^d= kf/kon. La unión se registra en función del tiempo y se calculan las constantes de velocidad cinética. En este ensayo, se pueden medir velocidad de asociación tan rápidas como 106 M-1s-1 y velocidad de disociación tan lentas como 10-6 s-1. Ejemplo 1.1.C: Actividad funcional de los anticuerpos anti-IL-13 humana

Para examinar la actividad funcional de los anticuerpos anti-IL-13 humana de la divulgación, los anticuerpos se usaron en los siguientes ensayos que miden la capacidad de un anticuerpo para inhibir la actividad de IL-13.

Ejemplo 1.1.C 1 bioensayo con A-549

La capacidad de los anticuerpos anti-IL-13 humana para inhibir la producción de TARC (CCL-17) inducida por IL-13 humana por células A-549 se analizó de la siguiente manera. Las células A-549 se sembraron el día uno en una placa de 96 pocillos (2E5 células/pocillo) en medio de crecimiento RPMI (con FBS al 10 %). El segundo día, el medio se reemplazó con medio de crecimiento RPMI nuevo que contenía 400 ng/ml de rhTNF (100 pl/pocillo). Entretanto, se incubaron previamente varias concentraciones de suero de ratón inmunizado, sobrenadante de hibridoma murino o anticuerpos anti-IL-13 humana purificados durante una hora a 37 °C con 10 ng/ml de IL-13 humana purificada recombinante o variante de IL-13 en 100 pl de medio completo RPMI en una placa de microtitulación (fondo en U, 96 pocillos, Costar). A continuación, se añadió el anticuerpo más la mezcla de IL-13 humana purificada recombinante (100 pl/pocillo) a las células A-549 tratadas con TNF, con el volumen final de 200 pl/pocillo (las concentraciones finales de IL-13 y TNF fueron 5 ng/ml y 200 ng/ml, respectivamente), y se incubaron durante 18 horas a 37 °C. Después de la incubación, se extrajeron 150 pl de sobrenadante sin células de cada pocillo y se midió el nivel de TARC humano producido usando un ELISA de TARC humana (R&D Systems número de catálogo DDN00).

Las células A-549 también responden a IL-13 de otras especies, incluyendo mono cynomolgus, ratón, rata y oveja, con valores de DE⁵⁰similares a los de IL-13 humana. Por lo tanto, se empleó para el análisis de reacción cruzada de mAb anti-hIL-13 con IL-13 de otras especies utilizando el mismo protocolo experimental.

Ejemplo 1.2: Generación de anticuerpos monoclonales anti-IL-13 humana

Los anticuerpos monoclonales de ratón anti-IL-13 humana se obtuvieron de la siguiente manera:

Ejemplo 1.2.A: Inmunización de ratones con antígeno IL-13 humano

Se inyectaron veinte microgramos de variante de IL-13 humana purificada recombinante (Peprotech) mezclados con adyuvante completo de Freund o adyuvante Immunoeasy (Qiagen, Valencia, CA) por vía subcutánea en cinco ratones Balb/C de ^{6 - 8}semanas de edad, cinco ratones C57B/6 y cinco ratones AJ el día 1. Los días 24, 38 y 49, se inyectaron veinte microgramos de variante de IL-13 humana purificada recombinante mezclada con adyuvante incompleto de Freund o adyuvante Immunoeasy por vía subcutánea en los mismos ratones. El día 84 o el día 112 o el día 144, se inyectó a los ratones por vía intravenosa 1 ug de variante de IL-13 humana purificada recombinante.

Ejemplo 1.2.B: Generación de hibridoma

Los esplenocitos obtenidos de los ratones inmunizados descritos en el ejemplo 1.2.A se fusionaron con células SP2/O-Ag-14 en una relación 5:1 según el método establecido descrito en Kohler, G. y Milstein 1975, Nature, 256:495 para generar hibridomas. Los productos de fusión se sembraron en placas en medio de selección que contenía azaserina e hipoxantina en placas de 96 pocillos a una densidad de 2,5x106 células de bazo por pocillo. Siete a diez días después de la fusión, se observaron colonias macroscópicas de hibridomas. El sobrenadante de cada pocillo que contenía colonias de hibridomas se analizó mediante ELISA para determinar la presencia de anticuerpo contra la variante de IL-13 (como se describe en el ejemplo 1.1.A). A continuación, se probó la capacidad de los sobrenadantes que mostraban actividad específica de la variante de IL-13 para neutralizar la variante de IL-13 y la IL-13 de tipo silvestre en el bioensayo con A-549 para TARC (como se describe en el ejemplo 1.1.C).

Ejemplo 1.2.C: Identificación y caracterización de anticuerpos monoclonales anti-IL-13 humana

Los hibridomas que producían anticuerpos que se unían a la variante de IL-13, generados según los ejemplos 1.2.B y 1.2.C, y capaces de unirse a la variante de IL-13 específicamente y particularmente aquellos con valores de CI50 en el bioensayo con A-549 de 5 nM o menos de 5 nM se aumentaron a escala y se clonaron mediante dilución limitante.

Las células de hibridoma se expandieron en un medio que contenía suero bovino fetal con IgG baja al 10 % (Hyclone n.° SH30151, Logan, UT.). En promedio, se recogieron 250 ml de cada sobrenadante de hibridoma (procedente de una población clonal), se concentraron y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con proteína A, como se describe en Harlow, E. y Lane, D. 1988 "Antibodies: A Laboratory Manual". La capacidad de los mAb purificados para inhibir la actividad de IL-13 se determinó usando el bioensayo con A-549 como se describe en los ejemplos 1.1.C. La tabla 7 muestra valores de CI⁵⁰de los bioensayos con A-549 para 17 anticuerpos monoclonales.

Tabla 7: Neutralización de IL-13 mediante mAb anti IL-13 en bioensa o con A-549

Las afinidades de unión de los anticuerpos monoclonales a la variante de IL-13 humana purificada recombinante y de tipo silvestre se determinaron usando medición de resonancia de plasmón superficial (Biacore®) como se describe en el ejemplo 1.1.B. La Tabla ⁸muestra la afinidad de los 18 anticuerpos monoclonales descritos anteriormente por la IL-13 humana.

Tabl : Afini mA ni IL-1 r IL-1 h m n i ilv r v riante

Ejemplo 1.2.C.1: Especificidad de especie de anticuerpos anti-IL-13 humana monoclonales murinos

Para determinar si los 17 anticuerpos monoclonales descritos anteriormente reconocen la IL-13 murina, se preparó un ELISA indirecto recubriendo placas de ELISA con 5 ug/ml de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón específico del fragmento Fc (Pierce n.° 31170, Rockland, IL). Se prepararon mAb murinos anti-IL-13 humana a diversas concentraciones que variaban de 0,1 a 100 ng/ml en PBS que contenía BSA al 0,1 %; se añadieron 50 ul de cada dilución de anticuerpo a la placa ELISA recubierta y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Se diluyó IL-13 de ratón biotinilada recombinante (R&D Systems) a 0,1 pg/ml en PBS que contenía BSA al 0,1 %; se añadieron 50 ul/pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Se diluyó estreptavidina HRP (Pierce n.° 21126, Rockland, IL.) a 1:20000 en P^bS que contenía BSA al 0,1 %; Se añadieron 50 ml/pocillo y las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron 3 veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,05 %. Se añadieron cincuenta microlitros de solución TMB (Sigma n.° T0440, St. Louis, MO.) A cada pocillo y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido sulfúrico I N. Las placas se leyeron mediante espectrofotometría a una longitud de onda de 450 nm. Los resultados del ELISA indirecto indicaron que mAb 3H7 era capaz de unirse a m IL-13. En un bioensayo posterior se demostró que el 3H7 podría inhibir la producción de TARC estimulada por mIL-13 de una manera dependiente de la dosis, con una CI⁵⁰de 2,4 nM. El análisis de Biacore también demostró la unión positiva de 3H7 a mIL-13, con una K^dde 12 nM. Todos los demás mAb de la tabla ⁸no mostraron ninguna unión positiva a IL-13 de ratón.

La potencia de neutralización de los mAb anti-hIL-13 contra IL-13 de primates no humanos (cynomolgus) e IL-13 de oveja también se midió en el bioensayo con A-548. Para generar IL-13 de cyno y oveja, el ADNc de cada proteína se obtuvo mediante PCR en una plantilla de ADN genómico utilizando cebadores degenerados basados en la secuencia de IL-13 humana. Las proteínas IL-13 de oveja y cyno recombinantes se expresaron posteriormente en células COS transfectadas de forma transitoria. También se generó IL-13 humana de tipo silvestre en paralelo como control en todos los estudios funcionales. Las células A-549 respondieron tanto a la IL-13 de cyno como de oveja con una DE50 similar a la de la IL-13 humana. La mayoría de los mAb neutralizaron la actividad de IL-13 de cyno, demostrando reactividad cruzada con IL-13 de cyno (tabla 7). Sin embargo, ninguno de los anticuerpos mostró una neutralización significativa de IL-13 de oveja.

Ejemplo 1.2.C.2: Los anticuerpos monoclonales murinos anti-IL-13 humana bloquean la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 (IL-13Ra1 e IL-13R02)

La actividad de IL-13 está mediada por un complejo receptor que consiste en las cadenas IL-13Ra1 e IL-4Ra. La citocina primero experimenta una interacción de afinidad relativamente baja con IL-13Ra1 en la superficie de las células. El complejo IL-13/IL-13Ra1 después recluta IL-4Ra para formar el receptor de IL-13 completo, que se une a su ligando (IL-13) con alta afinidad (Zurawski et al. (1993) E^mBO J. 12:2663; Zurawski et al. (1995) J. Biol. Chem.

270:23869). La unión de IL-13 con el receptor de alta afinidad después envía señales posteriores a través de la cadena IL-4Ra que implica la vía del transductor de señales de la cinasas Jano y el activador de la transcripción (JAK-STAT), por ejemplo, a través de la fosforilación de STAT⁶, que puede ser monitorizada como una de las primeras respuestas celulares a IL-13 (Murata et al., citado anteriormente).

Hay otro receptor de unión a IL-13, la cadena IL-13Ra2 (IL-13Ra2), que se une a IL-13 con alta afinidad (0,25-1,2 nM) (Caput, et al 1996 J. Biol. Chem. 271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J. Immunol. 161,2317-2324). No se conoce ninguna otra molécula receptora que esté implicada en el complejo IL-13/IL-13Ra2. Inicialmente se pensó que IL-13Ra2 actuaba como un receptor "señuelo" no señalizador. Sin embargo, más tarde se descubrió que puede unirse a IL-13 y señalar a través de la vía AP-1, dando lugar a la producción de TGF-beta en determinados tipos de células, incluidos los macrófagos, que a su vez da lugar a la fibrosis pulmonar (Fichtner-Feigl. 2006 Nat Med 12:99-106). Por lo tanto, las vías tanto del complejo IL-13Ra1/IL-4R como las de IL-13Ra2 contribuyen a la fisiopatología general del asma y otras enfermedades mediadas por IL-13. Se utilizaron varios enfoques, tal como el mapeo de epítopos, ensayos de unión al receptor, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y análisis BIACORE adicionales, para dilucidar la interacción entre los anticuerpos anti-IL-13 de la divulgación y la IL-13 humana.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales descritos anteriormente son capaces de bloquear la unión de IL-13 a los receptores de IL-13 (IL-13Ral e IL-13Ra2), se preparó un ELISA de unión al receptor de la siguiente manera. Se recubrieron placas ELISA de 96 pocillos de alta unión con 4 ug/ml de IL-13Ra1/Fc o IL-13Ra2/Fc recombinante (R&D Systems) en 100 ul/pocillo de tampón de recubrimiento (tampón de carbonato-bicarbonato, Pierce) a 4 °C. Después de 16 horas, la solución de recubrimiento se eliminó sacudiendo el contenido de la placa en el fregadero, y las placas se lavaron y bloquearon 4 veces con tampón de bloqueo Superblock (240 ul/pocillo) (Pierce). Se añadieron mAb anti-IL13 (diluidos en serie a 1:4 a partir de 40ug/ml, 50 ul/pocillo) y biotina-IL-13 (50 ul/pocillo, concentraciones finales de 5 nM para hIL-13Ra1/Fc y 0,5 nM para hIL-13Ra2/Fc) y se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente (TA). Las placas se lavaron 5 veces con 300 pl de PBST al 0,1 %, y después se añadieron 100 pl de MAb anti-biotina de ratón diluido a 1:5000 (Jackson Immunosciences) y se incubaron a T^adurante 45 min. Las placas se lavaron de nuevo 5 veces con 300 ul de PBST al 0,1 %, seguido de la adición de reactivo de sustrato TMB (100 ul/pocillo, Pharmingen); se desarrolló durante 5 min y se detuvo añadiendo 50 ul de H2SO42 M (VWR). Las DO a 450 nm se determinaron mediante espectrofotometría.

Adicionalmente, las propiedades de bloqueo del receptor de los mAb también se evaluaron mediante un ensayo de unión a receptor usando células COS transfectadas con IL-13Ra2. La IL-13 humana recombinante se marcó con 125I (Amersham, Arlington Heights, IL), utilizando reactivo IODO-GEN (Pierce, Rockford, IL) como se describe previamente (Obiri NI et al., (1995) J Biol Chem. 270:8797-8804). Se estimó que la actividad específica de la IL-13 radiomarcada era de 158 pCi/pg de proteína. La IL-13 marcada mostró una bioactividad similar a la IL-13 sin marcar, según lo evaluado por el bioensayo con A-549. Para experimentos de unión, las células COS se transfectaron transitoriamente con IL-13Ra2 humano mediante Lipofectamine 2000 (Invitrogen) y se incubaron durante 48 h. Las células COS transfectadas (5 x 105 células en 100 pl de tampón de unión: RPMI 1640 que contenía albúmina de suero humano al 0,2 % y 10 mmol de HEPES) se incubaron con 125I-IL-13 1,0 nM con o sin IL-13 sin marcar 1 pM a 4 °C durante 2 horas. La 125I-IL-13 unida a células se separó de la 125I-IL-13 sin unir mediante centrifugación a través de un gradiente de aceite de ftalato, y se determinó la radiactividad con un contador gamma (Wallac, Gaithersburg, MD). Para el ensayo de desplazamiento de anticuerpos, las células COS transfectadas se incubaron con 125I-IL-13 (1,0 nM) con o sin concentraciones crecientes (hasta 50 ug/ml) de anticuerpos anti-IL-13, como se describe anteriormente. Ambas formas de ensayo de unión a receptor demostraron lo siguiente: En primer lugar, 13C5 y 9C11 bloquearon la unión de IL-13 a IL-13Ra1; en segundo lugar, 13C5 bloqueó de manera fuerte la unión de IL-13 a IL-13Ra2 (CI⁵⁰~ 1-3 nM tanto en RBA en la superficie celular RBA como en ELISA RB), mientras que 9C11 bloqueó la unión de IL-13 a IL-13Ra2 con una potencia más baja (CI⁵⁰> 10 nM); y en tercer lugar, 5G1 y 3E5 no pudieron bloquear la unión de IL-13 a IL-13Ra1 o IL-13Ra2. Otros tres anticuerpos anti-IL-13, BAK502G9 (CAT P^cT WO 2005/007699), mAb13.2 (Wyeth PCT WO 2005/123126A2) y MJ2-7 (Wyeth PCT WO 2006/0073148A1) también se analizaron para determinar su capacidad para bloquear la unión de IL-13 humana a IL-13Ra2 humano tanto en ELISA de unión a receptor como en RBA de superficie celular. El anticuerpo mAb13.2 no bloqueó la unión de IL-13 a IL-13Ra1 o IL-13Ra2. BAK502G9 y MJ2-7 pudieron bloquear la unión de IL-13 a IL-13Ra1; sin embargo, mostraron una baja potencia para bloquear la unión de IL-13 a IL-13Ra2 con concentraciones de anticuerpos de hasta 50 pg/ml (330 nM).

La interacción entre IL-13 e IL-13Ra1/a2 en presencia de mAb anti-IL-13 también se analizó por BIACORE. Este análisis se realizó en varios formatos. En primer lugar, IL-13Ra1/Fc se unió al chip Biacore y se hizo fluir IL-13 sobre el chip, en presencia y ausencia de mAb anti-IL-13. Los mAb 13C5 y 9C11, entre otros, fueron capaces de bloquear la unión de IL-13 a IL-13Ra1, mientras que 5G1 y 3E5 no pudieron inhibir la unión de IL-13 a IL-13Ra1, coherente con los ensayos de unión a receptor. En segundo lugar, IL-4R se unió al chip BIACORE y se hizo fluir un complejo de IL-13 unido previamente a IL-13Ra1 sobre el chip. En ausencia de mAb anti-IL-13, se demostró la formación de un complejo trimolecular. Sin embargo, la adición del anticuerpo anti-IL-13 5G1 a la mezcla de IL-13 unida previamente a IL-13Ra1 evitó la unión a IL-4R en el chip. Esto indicó que, aunque 5G1 no pudo bloquear la unión de IL-13 a IL-13Ra1, podría bloquear la unión de IL-13 a IL-4R, proporcionando una base mecanicista para su actividad neutralizadora de IL-13. Estas observaciones se confirmaron adicionalmente mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), donde se observaron complejos heterotriméricos (mAb-IL-13-IL-13Ra1/Fc) para 5G1, pero no para 13C5. Los estudios de mapeo de epítopos posteriores utilizando el procesamiento de proteinasa del complejo mAb-IL-13 seguido de análisis de espectrometría de masas indicaron lo siguiente: En primer lugar, 5G1 se une a restos de IL-13, incluido el péptido aminoterminal 11-aa (GPVPPSTALRE), que cubre parte de la región de la hélice-A que se ha demostrado que interactúa con IL-4R (Moy et al 2001J Mol Biol. 310:219 y Horita et al., (2001) J Mol Biol. 310:231); en segundo lugar, el anticuerpo 9C11 interactúa con una región entre la hélice C y la hélice D (VSAGQFSSLHVR); y en tercer lugar, el anticuerpo 13C5 interacciona con restos de IL-13 que incluyen una región que cubre la hélice D (VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR correspondiente a los aminoácidos 104-130 de la SEQ ID NO: 1). Se ha demostrado que la hélice D interactúa con los receptores de IL-13 (Moy et al 2001J Mol Biol.

310:219; Horita et al 2001 J Mol Biol. 310:231; y Madhankumar et al 2002 JBC 277:43194). Debido a que 13C5 se une a la variante de IL-13 humana (Kd= 50 pM) de manera mucho más fuerte que a IL-13 de cynomolgus (Kd= 1800 pM), y la única diferencia de secuencia entre la variante de IL-13 humana y la IL-13 de cynomolgus dentro de esta posible región epitópica de 13C5 es L en IL-13 humana, pero V en IL-13 de cyno en la posición 120, se generó una IL-13 de cyno con mutación V120L y se probó si esta mutación tendrá una mayor afinidad de unión a 13C5 sobre IL-13 de cyno de tipo silvestre. Según los resultados de Biacore y bioensayos, la afinidad de unión y la potencia de neutralización de 13C5 por la IL-13 de cyno con mutación V120L eran equivalentes a las del IL-13 de cyno de tipo silvestre, lo que indica que esta diferencia de V/L en la posición 120 dentro de la región carboxiterminal no contribuye a la diferencia de afinidad de 13C5 por la variante de IL-13 humana frente a la IL-13 de cyno, y que debe haber otros restos fuera de la región carboxiterminal que contribuyen a la afinidad de unión diferencial de 13C5 a IL-13 humana y de cyno. Esto es coherente con la observación de que 13C5 no reconoce la IL-13 humana desnaturalizada por análisis de transferencia Western, lo que indica que el epítopo de unión de 13C5 en IL-13 humana es fuertemente conformacional.

Los estudios de unión y mapeo de epítopos indicaron que 5G1 no inhibió la interacción de IL-13 con IL-13Ra1, pero alteró la interacción de IL-13/IL-13Ra1 con IL-4Ra. Se cree que esta alteración interfiere con la formación de un complejo de señalización funcional de IL-13. Estas observaciones proporcionan un modelo teórico para la actividad neutralizante de este anticuerpo en un sistema mediado por IL-13Ra1/IL-4R, tal como las células A-549. Por el contrario, 13C5 bloqueó la unión de IL-13 tanto a IL-13Ra1 como a IL-13Ra2. De manera interesante, aunque 9C11 pudo bloquear la unión de IL-13 a IL-13Ra1, solo mostró una inhibición parcial (o de baja potencia) de la unión de IL-13 a IL-13Ra2. Aunque IL-13Ra1 y Ra2 adoptan un plegamiento tridimensional y una orientación de unión a IL-13 similares, tienen una baja identidad de secuencia y, por lo tanto, pueden variar los restos específicos responsables de la unión a IL-13 (Arima 2005 JBC 280:24915; y Madhankumar et al 2002 JBC 277:43194). Por consiguiente, los restos específicos en IL-13 para unirse a IL-13Ra1 e IL-13Ra2 pueden diferir, lo que podría explicar las propiedades de bloqueo diferencial del receptor de 9C11.

Los ensayos de unión al receptor, el mapeo de epítopos, Biacore y el bioensayo descritos anteriormente indican de forma conjunta que un anticuerpo anti-IL-13 neutralizante puede inhibir la actividad asociada a IL-13 a través de los siguientes mecanismos:

1) Inhibe la unión de IL-13 tanto a IL-13Ra1 como a IL-13Ra2 interactuando con IL-13 en la región implicada en la unión al receptor tanto IL-13Ra1 como IL-13Ra2. Un ejemplo de tal anticuerpo es 13C5. Dichos anticuerpos inhibirán la señalización de IL-13 a través tanto del complejo IL-13Ra1/IL-4R como de IL-13Ra2.

2) No inhibe la unión de IL-13 a IL-13Ra1 ni a IL-13Ra2. Sin embargo, el anticuerpo inhibe la interacción con el receptor de IL-4, por lo tanto, inhibe la señalización de IL-13 a través del complejo IL-13Ra1/IL-4R. Tal anticuerpo puede no inhibir la señalización de IL-13Ra2. Ejemplos de tales anticuerpos son 5G1 y mAb13.2 (Wyeth ^pC^tWO 2005/123126).

3) Inhibe la unión de IL-13 a IL-13Ra1, pero no inhibe de manera eficaz la unión de IL-13 a IL-13Ra2. Esto puede producirse por las siguientes razones: a) epítopo: una región que está implicada en la unión de IL-13Ra1, pero no en la unión de IL-13Ra2 o no implicada de manera tan fuerte en la unión de IL-13Ra2. Un ejemplo es el 9C11; b) afinidad: debido a que IL-13Ra2 tiene una afinidad mucho mayor que IL-13Ra1 por IL-13, un anticuerpo de baja afinidad puede ser capaz de bloquear la unión de IL-13 a IL-13Ra1, pero no a IL-13Ra2 a concentraciones fisiológicas de un anticuerpo terapéutico. Un ejemplo es BAK502G9, que mostró una afinidad 2,11 nM por la IL-13 humana recombinante de tipo silvestre según lo evaluado por Biacore (CAT PCT WO 2005/007699). Otro ejemplo es MJ2-7, que mostró una afinidad de 1,4 nM por la IL-13 humana recombinante de tipo silvestre y una mayor afinidad (43 pM) por la IL-13 de mono según lo evaluado por Biacore (Wyeth PCT WO 2006/0073148A1). Debido a la diferencia de afinidad, este mAb puede inhibir eficazmente la unión de IL-13 de mono a IL-13Ra2; sin embargo, inhibe la unión de IL-13 humana al mismo receptor con mucha menos potencia.

Los mAb BAK502G9 y MJ2-7 tienen epítopos similares (CAT PCT WO 2005/007699 y Wyeth PCT WO 2006/0073148A1) y compiten por la unión a IL-13 según lo evaluado por ELISA de competición. En resumen, se inmovilizó BAK502G9 en una placa de ELISA seguida de lavado y bloqueo. Después se añadió IL-13 humana biotinilada (10 ng/ml) a la placa en presencia de varias concentraciones de MJ2-7 (0,2 ng/ml a 20 ug/ml), seguido de lavado y detección usando anticuerpo antibiotina conjugado con HRP. Este estudio demostró que MJ2-7 competía de forma dependiente de la dosis con BAK502G9 por la unión a IL-13 humana. Una IgG de control negativo no mostró competencia con BAK502G9.

Ejemplo 1.2.D Determinación de la secuencia de aminoácidos de la región variable para cada mAb murino anti-IL-13 humana

Para cada determinación de la secuencia de aminoácidos, se aislaron aproximadamente 10x106células de hibridoma mediante centrifugación y se procesaron para aislar el ARN total con Trizol (Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ARN total se sometió a la síntesis de la primera cadena de ADN utilizando el sistema de síntesis de primera cadena SuperScript (Invitrogen, Carlsbad, CA) según las instrucciones del fabricante. Se utilizó oligo(dT) para cebar la síntesis de la primera cadena para seleccionar el ARN poli(A)+. El producto de ADNc de la primera cadena se amplificó después mediante PCR con cebadores diseñados para la amplificación de regiones variables de inmunoglobulina murina (Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, WI). Los productos de PCR se resolvieron en un gel de agarosa, se cortaron, purificaron y después subclonaron con el kit de clonación TOPO en el vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) y se transformaron en E. coli químicamente competente para TOP10 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se realizó PCR de colonias en los transformantes para identificar los clones que contenían el inserto. El ADN plasmídico se aisló de los clones que contenían el inserto utilizando un kit QIAprep Miniprep (Qiagen, Valencia, CA). Los insertos en los plásmidos se secuenciaron en ambas cadenas para determinar las secuencias de ADN de cadena pesada o ligera variable usando cebadores directos M13 e inversos M13 (Fermentas Life Sciences, Hanover MD). Las secuencias de cadena pesada variable y ligera variable de los 17 anticuerpos monoclonales descritos en el ejemplo 1.2.C se describen en la tabla 5.

Ejemplo 2: Anticuerpos anti-IL-13 humana recombinante

Ejemplo 2.1: Construcción y expresión de anticuerpos anti-IL-13 humana recombinante quiméricos

El ADN que codifica la región constante de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales 5G1, 13C5, 9C11, 21D9 y 3H7 murinos anti-IL-13 humana se reemplazó por un fragmento de ADNc que codifica la región constante de IgG1 humana que contiene ²mutaciones de aminoácidos de la región bisagra mediante recombinación homóloga en bacterias. Estas mutaciones son un cambio de leucina a alanina en la posición 234 (numeración EU) y un cambio de leucina a alanina en la posición 235 (Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). La región constante de cadena ligera de cada uno de estos anticuerpos se reemplazó por una región constante kappa humana. Los anticuerpos quiméricos de longitud completa se expresaron transitoriamente en células COS mediante transfección conjunta de ADNc de cadena ligera y pesada quiméricos unidos al plásmido de expresión pBOS (Mizushima y Nagata, Nucleic Acids Research 1990, Vol 18, pág. 5322). Los sobrenadantes celulares que contenían anticuerpo quimérico recombinante se purificaron mediante cromatografía con proteína A Sepharose y el anticuerpo unido se eluyó mediante la adición de tampón ácido. Los anticuerpos se neutralizaron y dializaron en PBS.

A continuación, se probó la capacidad de los anticuerpos monoclonales anti-IL-13 humana quiméricos purificados para inhibir la producción de TARC inducida por IL-13 mediante células A-549 como se describe en los ejemplos 1.1.C 2 y 1.1.C3. La tabla 12 muestra valores de CI⁵⁰de los bioensayos con A-549 para tres anticuerpos quiméricos.

Tabla N r liz i n rhIL-1 w r n i r im ri ni IL-1 n i n n A-549

Ejemplo 2.2: Construcción y expresión de anticuerpos anti-IL-13 humana humanizados

Ejemplo 2.2.1: Selección de marcos de anticuerpos humanos

Cada secuencia de genes de cadena ligera variable y pesada variable murina (como se describe en la tabla 3) se alineó por separado contra 44 secuencias de cadena pesada variable de línea germinal de inmunoglobulinas humanas o 46 secuencias de cadena ligera variable de línea germinal (procedentes del sitio web del NCBI Ig Blast http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.) utilizando el programa informático Vector NTI.

La humanización se basó en la homología de la secuencia de aminoácidos, análisis de agrupaciones de CDR, frecuencia de uso entre los anticuerpos humanos expresados e información disponible sobre las estructuras cristalinas de los anticuerpos humanos. Teniendo en cuenta los posibles efectos sobre la unión de anticuerpos, el emparejamiento VH-VL y otros factores, los restos murinos se mutaron a restos humanos donde los restos del marco murino y humano eran diferentes, con algunas excepciones. Se diseñaron estrategias de humanización adicionales basadas en un análisis de secuencias de anticuerpos de la línea germinal humana, o un subgrupo de las mismas, que poseía un alto grado de homología, es decir, similitud de secuencia, con respecto a la secuencia de aminoácidos real de las regiones variables de anticuerpos murinos.

Se utilizó un modelado por homología para identificar restos exclusivos de las secuencias de anticuerpos murinos que se prevé que sean críticas para la estructura del sitio de combinación de los anticuerpos (las CDR). El modelado por homología es un método computacional mediante el cual se generan coordenadas tridimensionales aproximadas para una proteína. La fuente de las coordenadas iniciales y la guía para su mayor refinamiento es una segunda proteína, la proteína de referencia, cuyas coordenadas tridimensionales son conocidas y cuya secuencia está relacionada con la secuencia de la primera proteína. La relación entre las secuencias de las dos proteínas se utiliza para generar una correspondencia entre la proteína de referencia y la proteína cuyas coordenadas se desean, la proteína diana. Las secuencias primarias de las proteínas de referencia y diana se alinean con coordenadas de porciones idénticas de las dos proteínas transferidas directamente desde la proteína de referencia a la proteína diana. Se construyen coordenadas para porciones no coincidentes de las dos proteínas, por ejemplo, por mutaciones, inserciones o eliminaciones de restos, a partir de plantillas estructurales genéricas y se refinan energéticamente para asegurar la coherencia con las coordenadas del modelo ya transferidas. Esta estructura de proteína computacional puede refinarse más o emplearse directamente en estudios de modelado. Debe quedar claro a partir de esta descripción que la calidad de la estructura del modelo está determinada por la precisión de la afirmación de que las proteínas de referencia y diana están relacionadas y la precisión con la que se construye la alineación de secuencia.

Para las secuencias murinas 5G1, 13C5 y 9C11, se utilizó una combinación de búsqueda BLAST e inspección visual para identificar estructuras de referencia adecuadas. La identidad de secuencia del 25 % entre las secuencias de aminoácidos de referencia y diana se considera el mínimo necesario para intentar un ejercicio de modelado por homología. Las alineaciones de secuencia se construyeron manualmente y las coordenadas del modelo se generaron con el programa Jackal (véase Petrey, D., Xiang, Z., Tang, C.L., Xie, L., Gimpelev, M., Mitros, T., Soto, C.S., Goldsmith-Fischman, S., Kernytsky, A., Schlessinger, A., et al. 2003. Using multiple structure alignments, fast model building, and energetic analysis in fold recognition and homology modeling. Proteins 53 (Supl. ⁶): 430-435). Las secuencias primarias de las regiones marco murinas y humanas de los anticuerpos seleccionados comparten una identidad significativa. Las posiciones de los restos que difieren son candidatas para la inclusión del resto murino en la secuencia humanizada con el fin de conservar la potencia de unión observada del anticuerpo murino. Se construyó manualmente una lista de restos de marco que difieren entre las secuencias humana y murina.

La probabilidad de que un resto de marco dado afecte a las propiedades de unión del anticuerpo depende de su proximidad a los restos de CDR. Por lo tanto, utilizando las estructuras del modelo, los restos que difieren entre las

Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma que comprende un anticuerpo que comprende un (i) conjunto de CDR de VH de 13C5 que comprende los restos 31 - 37 de la SEQ ID NO: 46, restos 52-67 de la SEQ ID NO: 46, y restos 100-112 de la SEQ ID NO: 46; y (ii) un conjunto de CDR de VL de 13C5 que comprende los restos 24-34 de la SEQ ID NO: 47, restos 50-56 de la SEQ ID ⁿO: 47 y restos 89-97 de la SEQ ID NO: 47.

2. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de la reivindicación 1, donde el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81.

3. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de la reivindicación 1 o 2, donde el anticuerpo comprende además un marco aceptor humano.

4. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de la reivindicación 3, donde el marco aceptor humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: ⁶, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: ⁸, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30 y SEQ ID NO: 31.

5. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 4, donde el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada de IgG1 humana que comprende una región bisagra que comprende un cambio de leucina a alanina en la posición 234 y un cambio de leucina a alanina en la posición 235.

⁶. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 5, donde el anticuerpo comprende cuatro dominios variables, donde cada uno de los dos dominios variables comprende un conjunto de CDR de VH de 13C5 y cada uno de los otros dos de los otros dos dominios variables comprende un conjunto de CDR de VL de 13C5.

7. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de la reivindicación ⁶, donde cada uno de los dos dominios variables comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 80 y cada uno de los otros dos dominios variables comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 81.

⁸. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 7, donde la composición comprende además al menos un agente adicional, donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste en: un agente terapéutico, un agente de obtención de imágenes, un agente citotóxico, un inhibidor de angiogénesis, un inhibidor de cinasas, un bloqueante de moléculas de coestimulación, un bloqueante de moléculas de adhesión, un anticuerpo anticitocinas o un fragmento funcional del mismo; metotrexato, una ciclosporina, una rapamicina, un FK506, un marcador o indicador detectable, un antagonista de TNF, un antirreumático, un relajante muscular, un narcótico, fármacos antiinflamatorios no esteroideos (AINE), un analgésico, un anestésico, un sedante, un anestésico local, un bloqueante neuromuscular, un antimicrobiano, un antipsoriásico, un corticosteroide, un esteroide anabólico, una eritropoyetina, una inmunización, una inmunoglobulina, un inmunosupresor, una hormona de crecimiento, un fármaco de reemplazo hormonal, un radiofármaco, un antidepresivo, un antipsicótico, un estimulante, un medicamento para el asma, un beta agonista, un esteroide inhalado, un esteroide oral, una epinefrina o análogo, una citocina y un antagonista de citocina.

9. La composición para su uso en el tratamiento o prevención del asma de una cualquiera de las reivindicaciones 1 ⁸, donde el asma es asma alergénica o no alergénica.