KR20160065216A - 인터루킨-13 결합 단백질 - Google Patents

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조나단 피. 벨크
화 잉
마리아 에이. 아지리아디
캐롤린 에이. 커프
폴 알. 힌튼
샹카 쿠마
테리 엘. 멜림
옌 천
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Abstract

본 발명은 IL-13 결합 단백질을 포함한다. 구체적으로, 본 발명은 키메라 항체, CDR 이식 항체 및 사람화된 항체인 항체에 관한 것이다. 바람직한 항체는 hIL-13에 대한 친화성이 높고 시험관내 및 생체내에서 hIL-13 활성을 중화시킨다. 본 발명의 항체는 전장(full-length)의 항체 및 이의 항원결합부분일 수 있다. 또한, 본 발명의 항체를 제조 및 이용하는 방법도 제공된다. 본 발명의 항체 또는 항체 부분은 hIL-13 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 사람 피검체 등에서 hIL-13을 검출하고 hIL-13 활성을 억제하는데 유용하다.

Description

인터루킨-13 결합 단백질{Interleukin-13 binding proteins}
출원에 대한 상호참조
본 출원은 2006년 9월 8일에 출원한 미국 임시출원 제60/843,249호를 우선권으로 주장한다.
기술분야
본 발명은 IL-13 결합 단백질, 구체적으로 이 단백질의 천식, 알레르기, COPD, 섬유증 및 암을 비롯한 다양한 질환의 예방 및/또는 치료에서의 용도에 관한 것이다.
공동 연구 협약에 대한 참조설명
본 출원의 내용은 프로테인 디자인 랩스, 인크.(Protein Design Labs, Inc.)와 아보트 러보러터리즈(Abbott Laboratories) 사이에 2005년 12월 14일자로 체결된 공동 연구 협약 하에 있고 IL-13에 대한 재조합 조작된 항체에 관한 것이다.
사람 IL-13은 활성화된 T 세포로부터 클로닝된 17kDa 당단백질이며(Zurawski and de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26), Th2 계열의 활성화된 T 세포에 의해 생산되지만, Th0 및 Th1 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 여러 비-T 세포 집단, 예컨대 비만 세포도 IL-13을 생산한다(Zurawski and de Vries 1994 Immunol Today 15 19-26). IL-13의 기능은 사람 B 세포에서 IgE로의 면역글로불린 이소형(isotype) 전환(Punnonen, Aversa et al. 1993 Proc Natl Acad Sci USA 90 3730-4) 및 사람과 마우스 모두에서 염증성 사이토카인 생산의 억제(de Waal Malefyt, Figdor et al. 1993 J Immunol 151 6370-81; Doherty, Kastelein et al. 1993 J Immunol 151 7151-60)를 포함한다. IL-13은 이의 세포 표면 수용체인 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2에 결합한다. IL-13Rα1은 IL-13과 낮은 친화도(KD = 약 10nM)로 상호작용한 다음, IL-4Ra이 동원되어 고 친화도(KD = 약 0.4nM)의 신호 이종이량체성 수용체 복합체를 형성한다(Aman, Tayebi e tal. 1996 J Biol Chem 271 29265-79; Hilton, Zhang et al. 1996 Proc Natl Acad Sci USA 93 497-501). IL-4R/IL-13Rα1 복합체는 B 세포, 단핵구/대식세포, 수지상 세포, 호산구, 호염기구, 섬유아세포, 내피세포, 기도 상피 세포 및 기도 평활근 세포와 같은 다양한 세포 종류에서 발현된다(Graber, Gretener et al. 1998 Eur J Immunol 28 4286-98; Murata, Husain et al. 1998 Int Immunol 10 1103-10; Akaiwa, Yu et al. 2001 Cytokine 13 75-84). IL-13Rα1/IL-4R 수용체 복합체의 연결은 전사의 신호 전달인자 및 활성화인자(STAT6)를 포함하는 다양한 신호 전달 경로 및 인슐린 수용체 기질-2(IRS-2) 경로를 활성화시킨다(Wang, Michieli et al. 1995 Blood 86 4218-27; Takeda, Kamanaka et al. 1996 J Immunol 157 3220-2). IL-13Rα2 쇄 단독은 IL-13에 대한 높은 친화도(KD = 약 0.25-0.4mM)를 보유하여, IL-13 결합을 반대 조절하는 유인(decoy) 수용체이면서(Donaldson, Whitters et al. 1998 J Immunol 161 2317-24), 대식세포와 아마도 다른 세포 종류에서도 AP-1 경로를 통해 TGF-b 합성 및 섬유증을 유도하는 신호 수용체로서 작용한다(Fichtner-Feigl, Strober et al. 2006 Nat Med 12 99-106).
천식의 전임상 동물 모델에서 수행된 몇몇 연구는 IL-13이 천식에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 이러한 데이터에는 IL-13 녹아웃(knockout) 마우스에서의 천식 내성 및 다양한 마우스 모델에서의 IL-13 길항제(가용성 IL-13 수용체, 항-IL-13 mAb 등)에 의한 천식 표현형의 억제(Sela 1999 Harefuah 137 317-9; Wills-Karp and Chiaramonte 2003 Curr Opin Pulm Med 9 21-7; Wills-Karp 2004 Immunol Rev 202 175-90) 등을 포함한다. 다수의 연구들은 기니아 피그뿐만 아니라 마우스의 폐로의 재조합 IL-3의 약리학적 투여가 기도 점액 과다분비, 호산구증가증 및 AHR을 유도한다는 것을 증명했다(Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Kibe, Inoue et al. 2003 Am J Respir Crit Care Med 167 50-6; Vargaftig and Singer 2003 Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 284 L260-9; Vargaftig and Singer 2003 Am J Respir Cell Mol Biol 28 410-9). 이러한 IL-13의 효과는 돌연변이 마우스 시스템에서 IL-13의 구성적 또는 유도적 발현에 의해 재현된다(Zhu, Homer et al. 1999 J Clin Invest 103 779-88; Zhu, Lee et al. 2001 Am J Respir Crit Care Med 164 S67-70; Lanone, Zheng et al. 2002 J Clin Invest 110 463-74). 또한, IL-13의 만성 돌연변이적 과발현은 상피하 섬유증 및 폐기종을 유도한다. IL-13(및 IL-4) 신호 분자 STAT6 결핍성인 마우스는 알레르기항원 유도된 AHR 및 점액 과잉생산을 하지 못한다(Kuperman, Huang et al. 2002 Nat Med 8 885-9). 가용성 IL-13 수용체 융합 단백질(sIL-13Rα2Fc)을 이용한 연구는 실험적인 알레르기항원 오브알부민(OVA) 유도성 기도 질환에서 상기 사이토카인의 중추적인 역할을 입증했다(Grunig, Warnock et al. 1998 Science 282 2261-3; Wills-Karp, Luyimbazi et al. 1998 Science 282 2258-61; Taube, Duez et al. 2002 J Immunol 169 6482-9). 항-IL-13 치료의 효능은 쥐 천식의 만성 모델에서도 입증되었다. 이러한 만성 천식 모델은 점액 과다분비 및 AHR의 특징을 나타내는 것 외에도, 급성 모델에서는 없는 사람 질환의 여러 특징을 입증한다. 그 예에는 상피간 공간에 위치한 폐조직의 호산구증가증 및 콜라겐 침착 증가에 의해 측정되는 평활근 섬유증이 있다. 만성 천식 모델은 OVA-감작된 마우스에게 주당 1회씩 OVA를 총 4주 동안 반복 에어로졸 챌린지(challenge)하여 유도한다. OVA 챌린지의 마지막 2주 동안에 투여된 항-IL-13 항체(36일부터, 효능 판독은 연구 53일째 평가됨)는 AHR, 폐 염증, 배상세포 과형성, 점액 과다분비 및 기도 섬유증을 유의적으로 억제했다(Yang, Li et al. 2005 J Pharmacol Exp Ther). 더욱이, IL-13 길항제의 치료 효과도 천식의 영장류 모델에서 AHR을 억제하는 것으로 입증되었다[Abstract, American Thoracic Society 2005].
IL-13은 IL-13 mRNA 및 단백질의 상승된 수준이 천식 환자의 폐에서 검출되었는 바, 사람 천식의 발병기전에 관련되어 있고, 이 질환의 중증도와 상관성이 있다(Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94). 또한, 상승된 IL-13 수준으로 이어지는 사람 IL-13 유전자 다형성이 확인되었고, 천식 및 아토피와 관련이 있으며(Heinzmann, Mao et al. 2000 Hum Mol Genet 9 549-59; Hoerauf, Kruse et al. 2002 Microbes Infect 4 37-42; Vercelli 2002 Curr Opin Allergy Clin Immunol 2 389-93; Heinzmann, Jerkic et al. 2003 J Allergy Clin Immunol 112 735-9; Chen, Ericksen et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 553-60; Vladich, Brazille et al. 2005 J Clin Invest), 상승된 IL-13 수준은 천식 환자의 폐에서 검출되었다(Huang, Xiao et al. 1995 J Immunol 155 2688-94; Arima, Umeshita-Suyama et al. 2002 J Allergy Clin Immunol 109 980-7; Berry, Parker et al. 2004 J Allergy Clin Immunol 114 1106-9). 또한, 높은 혈장 IL-13 수준을 유발하는 IL-13 유전자의 다형성이 있는 개체가 아토피 및 천식의 증가된 위험율을 보유하는 바, IL-13과 천식 사이의 유전적 관련성도 증명되어 있다(Wills-Karp 2000 Respir Res 1 19-23).
사람 IL-13이 다양한 사람 장애에서 나타내는 역할로 인하여, IL-13 활성을 억제하거나 반대작용하는 치료 전략이 고안되었다. 특히, IL-13에 결합하고 중화시키는 항체는 IL-13 활성을 억제하는 수단으로서 연구되었다. 하지만, IL-13에 결합할 수 있는 개량 항체는 여전히 당업계의 과제이다. 항체는 사람 IL-13에 결합하는 것이 바람직하다. 항체는 사람 IL-13을 중화시킬 수 있는 것이 바람직하다. 본 발명은 사람 IL-13에 결합할 수 있고 높은 친화도로 결합할 수 있으며, 사람 IL-13에 결합하고 중화시킬 수 있는 신규 그룹의 결합 단백질, CDR 이식 항체, 사람화된 항체 및 이의 단편을 제공한다.
본 발명은 IL-13 결합 단백질에 관한 것이다. 본 발명의 결합 단백질은 사람 IL-13에 결합할 수 있는 항체, 항원결합부분, 및 다른 항원 결합 단백질을 포함하며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명은 IL-13 결합 단백질의 제조 및 사용 방법도 제공한다.
본 발명의 한가지 관점은 IL-13에 결합할 수 있는 결합 단백질에 관한 것이다. 바람직한 양태에서, 결합 단백질은 사람 IL-13에 결합한다. 이 결합 단백질은 IL-13의 생물학적 기능을 조절할 수 있는 것이 바람직하다. 이 결합 단백질은 IL-13을 중화시킬 수 있는 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 한가지 관점에서, 결합 단백질은 IL-13에 결합할 수 있고 IL-13이 IL-13α1 수용체에 결합하는 것을 방해할 수 있다. 본 발명의 다른 관점에서, 결합 단백질은 IL-13에 결합할 수 있고 IL-13이 IL-13α2 수용체에 결합하는 것을 방해할 수 있는 것이다. 바람직한 양태에서, 결합 단백질은 IL-13에 결합할 수 있고, IL-13이 IL-13α1 수용체 및 IL-13α2 모두에 결합하는 것을 방해할 수 있다.
한가지 양태로서, 본 발명은 분리된 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공하며, 이 항체 또는 이의 항원결합단편은 사람 IL-13에 결합하고 세포표면 기반 수용체 결합 분석에서 IL-13α2 수용체에 대한 IL-13의 결합을 약 1.5x10-8 내지 1x10-8 M, 1x10-8 내지 1x10-9 M, 10-9 내지 10-10 M 및 10-10 내지 10-11 M로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 IC50 값으로 억제하거나, ELISA 기반 수용체 결합 분석에서 약 1.8x10-8 내지 1x10-8 M, 1x10-8 내지 1x10-9 M, 10-9 내지 10-10 M 및 10-10 내지 10-11 M로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 IC50 값으로 억제한다. 바람직하게는, 항체는 사람 IL-13에 결하하고 IL-13α2 수용체에 대한 IL-13의 결합을 세포표면 기반 수용체 결합 분석에서 2.7x10-9M의 IC50으로 억제하고 ELISA 기반 수용체 결합 분석에서 1.1x10-9M의 IC50으로 억제하는 것이다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은 사람 IL-13에 결합하고 세포표면 기반 수용체 결합 분석 또는 ELISA 기반 수용체 결합 분석에서 100nM의 농도에서 IL-13α2 수용체에 대한 IL-13의 결합을 약 70 내지 100% 억제하는 것이다. 바람직하게는 항체는 13C5.5이다. 더욱 바람직하게는 항체는 BAK502G9, mAb13.2 또는 MJ2-7은 아닌 것이다.
다른 관점에서, 본 발명은 사람 IL-13에 결합하고 사람 IL-13 유도된 천식 모델에서 AHR을 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제하는 분리된 항체 또는 이의 항원결합단편을 제공한다. 항체는 사람 IL-13 유도된 천식 모델에서 AHR을 86% 넘게 억제하는 것이 바람직하다. 다른 양태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람 IL-13에 결합하고 사람 IL-13 유도된 천식 모델에서 AHR을 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제하고, 점액 생산을 약 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 100% 억제하는 것이다. 항체는 13C5.5인 것이 바람직하다. 항체는 BAK502G9, mAb13.2 또는 MJ2-7이 아닌 것이 더욱 바람직하다.
한가지 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-13에 대한 결합속도상수(on rate constant; Kon)가 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 적어도 약 102M-1s-1; 적어도 약 103M-1s-1; 적어도 약 104M-1s-1; 적어도 약 105M-1s-1; 또는 적어도 약 106M-1s-1인 것이다. 본 발명의 결합 단백질은 IL-13에 대한 결합속도상수(kon)가 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 102M-1s-1 내지 103M-1s-1 사이; 103M-1s-1 내지 104M-1s-1 사이; 104M-1s-1 내지 105M-1s-1 사이; 또는 105M-1s-1 내지 106M-1s-1 사이인 것이 바람직하다.
다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-13에 대한 해리속도상수(off rate constant; Koff)가 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 최대 약 10-3s-1; 최대 약 10-4s-1; 최대 약 10-5s-1; 및 최대 약 10-6s-1인 것이다. 본 발명의 결합 단백질은 IL-13에 대한 해리속도상수(koff)가 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 10-3s-1 내지 10-4s-1 사이; 10-4s-1 내지 10-5s-1 사이; 또는 10-5s-1 내지 10-6s-1 사이인 것이 바람직하다.
다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-13에 대한 해리 상수(KD)가 최대 약 10-7M; 최대 약 10-8M; 최대 약 10-9M; 최대 약 10-10M; 최대 약 10-11M; 최대 약 10-12M; 또는 최대 10-13M인 것이다. 바람직하게는, 본 발명의 결합 단백질은 IL-13에 대한 해리 상수(KD)가 10-7M 내지 10-8M 사이; 10-8M 내지 10-9M 사이; 10-9M 내지 10-10M 사이; 10-10M 내지 10-11M 사이; 10-11M 내지 10-12M 사이; 또는 10-12M 내지 10-13M 사이인 것이다.
항체 또는 이의 항원결합단편은 a) 약 105 M-1s-1 내지 106 M-1s-1 사이 또는 약 106 M-1s-1 내지 107 M-1s-1 사이의 결합속도상수(kon); 또는 b) 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 약 10-4 s-1 내지 10-5 s-1 ; 또는 약 10-5 s-1 내지 10-4 s- 1 의 해리속도상수(koff); 또는 c) 약 1.5x10-10 내지 1x10-10 M 또는 약 10-10 내지 10-11M의 해리 상수(KD)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 결합 특성으로 IL-13에 결합하는 것이 바람직하다. 항체 또는 이의 항원결합단편은 IL-13에 대한 결합속도상수(kon)가 6.68x105 M-1s-1, 7.86x105 M-1s-1, 8.35x105 M-1s-1, 8.69x105 M-1s-1, 9.15x105 M-1s-1, 1.26x106 M-1s-1, 1.7x106 M-1s-1 및 2.51x106 M-1s-1로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 항체 또는 이의 항원결합단편은 IL-3에 대한 해리속도상수(koff)가 표면 플라즈몬 공명으로 측정했을 때, 1.23x10-4s-1 ; 1.76x10-4 s-1 ; 4.74x10-4 s-1 ; 1.91x10-5 s-1 ; 2.14x10-5 s-1 ; 3.82x10-5 s-1 ; 8.81x10-5 s-1 ; 및 9.65x10-5 s- 1 로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 항체 또는 이의 항원결합단편은 IL-13에 대한 해리 상수(KD)가 1.05x10-10M; 7.10x10-10M; 1x10-11M; 2.20x10-11M; 2.72x10-11M; 4.17x10-11M; 5.68x10-11M; 7.01x10-11M; 7.10x10-11M; 및 9.79x10-11M로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
본 발명의 한가지 관점은 IL-13 상의 특정 에피토프에 결합할 수 있는 결합 단백질에 관한 것이다. 특정 에피토프는 사람 IL-13의 C-말단 나선 D 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 특히, 특정 에피토프는 서열번호 1의 아미노산 104-130에 해당하는 아미노산 서열 VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 다른 관점에서, 항체 또는 이의 항원결합부분은 사람 IL-13의 C-말단 나선 D 영역과 N-말단 나선 A 영역을 포함하는 에피토프에 결합한다. 항체 또는 이의 항원결합단편은 서열번호 1의 국소 영역 Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 및 Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu128-Gly129-Arg130에 의해 정의된 에피토프에 결합된 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-13이 IL-13 수용체에 결합하는 것이 억제되도록 사람 IL-13에 결합하는 것이 바람직하다. 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은 서열번호 1의 국소 영역 Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 및 Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127에 의해 정의된 에피토프에 결합된 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-13이 IL-13 수용체에 결합하는 것이 억제되도록 사람 IL-13에 결합하는 것이 바람직하다. 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은 서열번호 1의 국소 영역 Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 및 Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu128-Gly129-Arg130에 의해 정의된 에피토프에 결합된 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-13이 IL-13α2 수용체에 결합하는 것이 억제되도록 사람 IL-13에 결합하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 항원결합단편은 서열번호 1의 국소 영역 Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 및 Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu128-Gly129-Arg130에 의해 정의된 에피토프에 결합된 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-13이 IL-13α2 수용체에 결합하는 것이 억제되도록 사람 IL-13에 결합하되, 단, 상기 항체가 BAK502G9 또는 MJ2-7은 아닌 것이다. 상기 항체는 13C5.5인 것이 가장 바람직하다.
한가지 관점에서, 분리된 항체 또는 이의 항원결합단편은 나선 A 및 D를 포함하는 IL-13 상의 에피토프에 대한 결합; 약 105 M-1s-1 내지 106 M-1s-1 사이 또는 약 106 M-1s-1 내지 107 M-1s-1 사이의 결합속도상수(kon); 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된, 약 10-4 s-1 내지 10-5 s-1 ; 또는 약 10-5 s-1 내지 10-6s-1의 해리속도상수(koff); 및 약 1.5x10-10 내지 1x10-10 M 또는 약 10-10 내지 10-11 M의 해리 상수(KD)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 결합 특성으로 IL-13에 결합하여, IL-13α2 수용체에 대한 IL-13의 결합을 방해하는 것이다. 다른 관점에서, 분리된 항체 또는 이의 항원결합단편은 나선 A 및 D를 포함하는 IL-13 상의 에피토프에 대한 결합; 약 105 M-1s-1 내지 106 M-1s-1 사이 또는 약 106 M-1s-1 내지 107 M-1s-1 사이의 결합속도상수(kon); 표면 플라즈몬 공명에 의해 측정된, 약 10-4 s-1 내지 10-5 s-1 ; 또는 약 10-5 s-1 내지 10-6s-1의 해리속도상수(koff); 및 약 1.5x10-10 내지 1x10-10 M 또는 약 10-10 내지 10-11 M의 해리 상수(KD)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 결합 특성으로 변이 IL-13에 결합하여 IL-13α2 수용체에 대한 변이 IL-13의 결합을 방해한다.
한가지 관점에서, 본 발명은 다음과 같은 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함하는 항원 결합 도메인을 포함하고, IL-13에 결합할 수 있는 결합 단백질을 제공한다:
CDR-H1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (서열번호 64),
여기서, X1은 T, D, G 또는 S이고;
X2는 S이고;
X3은 D이고;
X4는 M, S, Y, L 또는 H이고;
X5는 G, W, Y, A, S 또는 N이고;
X6은 V, I 또는 M이고;
X7은 D, H, S, Y, N 또는 G이다;
CDR-H2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (서열번호 65),
여기서, X1은 M, E, H, R, S, G 또는 L이고;
X2는 I이거나 존재하지 않고;
X3은 H, Y, A, D, S 또는 W이고;
X4는 P, S, W 또는 G이고;
X5는 S, G, E 또는 D이고;
X6은 D, G, S, E 또는 N이고;
X7은 S, Y 또는 G이고;
X8은 E, N, Y, V 또는 R이고;
X9는 T, I 또는 K이고;
X10은 R, Y, I, D 또는 A이고;
X11은 L, Y, D 또는 F이고;
X12는 N, P, S 또는 D이고;
X13은 Q, E, D, P 또는 S이고;
X14는 K, M, S, T, A 또는 V이고;
X15는 F, L, V 또는 M이고;
X16은 K, R 또는 Q이고;
X17은 D, G 또는 S이다;
CDR-H3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14 (서열번호 66),
여기서, X1은 W, T, G, Y, D 또는 I이고;
X2는 R, A, S, G 또는 V이고;
X3은 T, F, Y 또는 S이고;
X4는 S, T 또는 Y이고;
X5는 Y, F 또는 G이고;
X6은 F 또는 Y이고;
X7은 S, Y, I 또는 F이고;
X8은 D, L, Y 또는 P이고;
X9는 Y이고;
X10은 G이고;
X11은 Y, A, P 또는 E이고;
X12는 F, M, S, L 또는 I이고;
X13은 D, V, N 또는 K이고;
X14는 Y 또는 F이다;
CDR-L1. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15X16-X17 (서열번호 67),
여기서, X1은 K 또는 R이고;
X2는 S 또는 A이고;
X3은 S 또는 T이고;
X4는 Q, K 또는 I이고;
X5는 N, S, T, G 또는 E이고;
X6은 L, T 또는 S이고;
X7은 L, Q 또는 V이고;
X8은 Y, N, H, D 또는 T이고;
X9는 S, I 또는 T이고;
X10은 S, D, N, H 또는 Y이고;
X11은 N 또는 G이고;
X12는 Q이고;
X13은 K, F, N, E 또는 S이고;
X14는 N, T 또는 S이고;
X15는 Y 또는 F;
X16은 L, A 또는 M이고;
X17은 A, D, E, H 또는 N이다;
CDR-L2. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7 (서열번호 68),
여기서, X1은 L, S, K, T, W 또는 Y이고;
X2는 V, T 또는 A이고;
X3은 S 또는 N이고;
X4는 N, K, T, M 또는 R이고;
X5는 R, K 또는 L이고;
X6은 F, D, E, H, P 또는 A이고;
X7은 S, R 또는 P이다;
및
CDR-L3. X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9 (서열번호 69),
여기서, X1은 F, W, Q 또는 A이고;
X2는 Q 또는 L이고;
X3은 H, G, Y, W 또는 N이고;
X4는 N, S, T, L 또는 Y이고;
X5는 Y, T, S, E 또는 H이고;
X6은 L, V, F, Y, N, G, P 또는 D이고;
X7은 P 또는 H이고;
X8은 L, F, Y, W 또는 R이고;
X9는 T 또는 V이다.
바람직하게는, 항원결합 도메인은 다음 아미노산 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 CDR을 포함한다:
서열번호 32의 잔기 31-35; 서열번호 47의 잔기 24-34;
서열번호 32의 잔기 50-66; 서열번호 47의 잔기 50-56;
서열번호 32의 잔기 99-105; 서열번호 47의 잔기 89-97;
서열번호 33의 잔기 24-39; 서열번호 48의 잔기 31-37;
서열번호 33의 잔기 55-61; 서열번호 48의 잔기 52-67;
서열번호 33의 잔기 94-102; 서열번호 48의 잔기 100-112;
서열번호 34의 잔기 31-35; 서열번호 49의 잔기 24-34;
서열번호 34의 잔기 50-66; 서열번호 49의 잔기 50-56;
서열번호 34의 잔기 99-105; 서열번호 49의 잔기 89-97;
서열번호 35의 잔기 24-39; 서열번호 50의 잔기 31-37;
서열번호 35의 잔기 55-61; 서열번호 50의 잔기 52-67;
서열번호 35의 잔기 94-102; 서열번호 50의 잔기 100-112;
서열번호 36의 잔기 31-35; 서열번호 51의 잔기 24-34;
서열번호 36의 잔기 50-66; 서열번호 51의 잔기 50-56;
서열번호 36의 잔기 99-109; 서열번호 51의 잔기 89-97;
서열번호 37의 잔기 24-39; 서열번호 52의 잔기 31-35;
서열번호 37의 잔기 55-61; 서열번호 52의 잔기 50-66;
서열번호 37의 잔기 94-102; 서열번호 52의 잔기 99-107;
서열번호 38의 잔기 31-35; 서열번호 53의 잔기 23-36;
서열번호 38의 잔기 50-66; 서열번호 53의 잔기 52-58;
서열번호 38의 잔기 99-109; 서열번호 53의 잔기 91-99;
서열번호 39의 잔기 31-35; 서열번호 54의 잔기 31-35;
서열번호 39의 잔기 50-66; 서열번호 54의 잔기 50-65;
서열번호 39의 잔기 99-112; 서열번호 54의 잔기 98-107;
서열번호 40의 잔기 24-39; 서열번호 55의 잔기 24-38;
서열번호 40의 잔기 55-61; 서열번호 55의 잔기 54-60;
서열번호 40의 잔기 94-102; 서열번호 55의 잔기 93-101;
서열번호 41의 잔기 31-35; 서열번호 56의 잔기 31-35;
서열번호 41의 잔기 50-66; 서열번호 56의 잔기 50-65;
서열번호 41의 잔기 99-112; 서열번호 56의 잔기 98-107;
서열번호 42의 잔기 31-35; 서열번호 57의 잔기 24-38;
서열번호 42의 잔기 50-66; 서열번호 57의 잔기 54-60;
서열번호 42의 잔기 99-100; 서열번호 57의 잔기 93-101;
서열번호 43의 잔기 24-39; 서열번호 58의 잔기 31-35;
서열번호 43의 잔기 55-61; 서열번호 58의 잔기 50-65;
서열번호 43의 잔기 94-102; 서열번호 58의 잔기 98-107;
서열번호 44의 잔기 31-35; 서열번호 59의 잔기 24-38;
서열번호 44의 잔기 50-65; 서열번호 59의 잔기 54-60;
서열번호 44의 잔기 98-106; 서열번호 59의 잔기 93-101;
서열번호 45의 잔기 24-40; 서열번호 60의 잔기 31-35;
서열번호 45의 잔기 56-62; 서열번호 60의 잔기 50-65;
서열번호 45의 잔기 95-103; 서열번호 60의 잔기 98-107;
서열번호 46의 잔기 31-37; 서열번호 61의 잔기 24-38;
서열번호 46의 잔기 52-67; 서열번호 61의 잔기 54-60;
서열번호 46의 잔기 100-112; 서열번호 61의 잔기 93-101;
서열번호 62의 잔기 31-35;
서열번호 62의 잔기 50-65;
서열번호 62의 잔기 98-107;
서열번호 63의 잔기 24-38;
서열번호 63의 잔기 54-60; 및
서열번호 63의 잔기 93-101.
바람직한 양태에서, 결합 단백질은 다음과 같은 CDR 세트로 이루어진 가변 도메인 CDR 세트 중에서 선택되는 3개 이상의 CDR을 포함한다:
Figure pat00001
Figure pat00002
Figure pat00003
Figure pat00004
결합 단백질은 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트를 포함하는 것이 바람직하다. 2개 이상의 가변 도메인 CDR 세트는 다음 CDR 세트로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다:
VH 25C8 CDR 세트 및 VL 25C8 CDR 세트;
VH 9C11 CDR 세트 및 VL 9C11 CDR 세트;
VH 21D9 CDR 세트 및 VL 21D9 CDR 세트;
VH 22D10 CDR 세트 및 VL 22D10 CDR 세트;
VH 5F1 CDR 세트 및 VL 5F1 CDR 세트;
VH 5G1 CDR 세트 및 VL 5G1 CDR 세트;
VH 3H7 CDR 세트 및 VL 3H7 CDR 세트;
VH 14B2 CDR 세트 및 VL 14B2 CDR 세트;
VH 13C5 CDR 세트 및 VL 13C5 CDR 세트;
VH 29G5 CDR 세트 및 VL 29G5 CDR 세트;
VH 33C3 CDR 세트 및 VL 33C3 CDR 세트;
VH 4A8 CDR 세트 및 VL 4A8 CDR 세트;
VH 1B6 CDR 세트 및 VL 1B6 CDR 세트;
VH 3E5 CDR 세트 및 VL 3E5 CDR 세트;
VH 6C8 CDR 세트 및 VL 6C8 CDR 세트;
VH 5D3 CDR 세트 및 VL 5D3 CDR 세트; 및
VH 8B6 CDR 세트 및 VL 8B6 CDR 세트.
다른 양태에서, 앞에서 개시한 결합 단백질은 사람 어셉터 프레임워크(acceptor framework)를 추가로 포함한다. 사람 어셉터 프레임워크는 다음 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것이 바람직하다:
서열번호 6, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11, 서열번호 12, 서열번호 13, 서열번호 14, 서열번호 15, 서열번호 16, 서열번호 17, 서열번호 18, 서열번호 19, 서열번호 20, 서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 서열번호 24, 서열번호 25, 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 28, 서열번호 29, 서열번호 30 및 서열번호 31.
바람직한 양태에서, 결합 단백질은 IL-13에 결합할 수 있는 CDR 이식 항체 또는 이의 항원결합부분이다. CDR 이식 항체 또는 이의 항원결합부분은 앞에 개시한 CDR을 하나 이상 포함하는 것이 바람직하다. CDR 이식 항체 또는 이의 항원결합부분은 사람 어셉터 프레임워크를 포함하는 것이 바람직하다. 사람 어셉터 프레임워크는 앞에서 개시한 사람 어셉터 프레임워크 중 어느 하나인 것이 더욱 바람직하다.
바람직한 양태에서, 결합 단백질은 IL-13에 결합할 수 있는 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분이다. 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분은 사람 어셉터 프레임워크의 사람 항체 가변 도메인에 통합된 앞에서 개시한 하나 이상의 CDR을 포함하는 것이 바람직하다. 사람 항체 가변 도메인은 컨센서스 사람 가변 도메인인 것이 바람직하다. 사람 어셉터 프레임워크는 주요 잔기에 하나 이상의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하고, 상기 주요 잔기가 CDR에 인접한 잔기; 글리코실화 부위 잔기; 희귀 잔기; 사람 IL-13과 상호작용할 수 있는 잔기; CDR과 상호작용할 수 있는 잔기; 표준(canonical) 잔기; 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기; 버니어(Vernier) 구역 내의 잔기; 및 초티아(Chothia)에 의해 정의된 가변 중쇄 CDR1과 카밧(Kabat)에 의해 정의된 제1 중쇄 프레임워크 사이에 중첩되는 영역 내의 잔기로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 더욱 바람직하다. 사람 어셉터 프레임워크는 하나 이상의 프레임워크 영역 아미노산 치환을 포함하되, 이 프레임워크의 아미노산 서열이 상기 사람 어셉터 프레임워크의 서열과 적어도 65% 동일하고 상기 사람 어셉터 프레임워크와 동일한 적어도 70개의 아미노산 잔기를 포함하는 것이 바람직하다. 주요 잔기에서의 프레임워크 영역 아미노산 치환은 2L, 15L, 22L, 41L, 42L, 44L, 49L, 50L, 51L, 62L, 71L, 73L, 10H, 44H, 46H, 48H, 67H, 68H, 70H, 72H, 74H, 76H, 83H, 84H, 86H, 87H 및 97H로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 결합 단백질은 IL-13에 결합할 수 있는 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분이다. 이러한 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분은 앞에서 개시한 CDR을 하나 이상 포함하는 것이 바람직하다. 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분은 앞에서 개시한 3개 이상의 CDR을 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분은 앞에서 개시한 6개의 CDR을 포함하는 것이 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 양태에서, 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분은 다음과 같은 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 하나 이상의 가변 도메인을 포함하는 것이다:
서열번호 70, 서열번호 71, 서열번호 72, 서열번호 73, 서열번호 74, 서열번호 75, 서열번호 76, 서열번호 77, 서열번호 78, 서열번호 79, 서열번호 80, 서열번호 81, 서열번호 82, 서열번호 83, 서열번호 84, 서열번호 85, 서열번호 92, 서열번호 93 및 서열번호 94.
더욱 바람직하게는, 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분은 앞에서 개시한 그룹 중에서 선택되는 2개의 가변 도메인을 포함하는 것이다. 결합 단백질은 2개의 가변 도메인을 포함하고, 이 2개의 가변 도메인은 다음과 같은 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 갖는 것이 더욱 바람직하다:
서열번호 70 및 서열번호 71,
서열번호 72 및 서열번호 73,
서열번호 74 및 서열번호 75,
서열번호 76 및 서열번호 77,
서열번호 78 및 서열번호 79,
서열번호 80 및 서열번호 81,
서열번호 82 및 서열번호 83,
서열번호 84 및 서열번호 85,
서열번호 80 및 서열번호 92,
서열번호 80 및 서열번호 93, 및
서열번호 80 및 서열번호 94.
한가지 양태에서, 본 발명은 앞에서 개시한 결합 단백질 중 어느 하나와 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린을 포함하는 항체 작제물을 제공한다. 바람직한 양태에서, 항체 작제물은 면역글로불린 분자, 모노클로날 항체, 키메라 항체, CDR 이식 항체, 사람화된 항체, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, 이황화 결합된 Fv, scFv, 단일 도메인 항체, 디아바디(diabody), 다특이성(multispecific) 항체, 이중 특이성(dual specific) 항체 및 이특이성(bispecific) 항체로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 바람직한 양태에서, 항체 작제물은 사람 IgM 불변 도메인, 사람 IgG1 불변 도메인, 사람 IgG2 불변 도메인, 사람 IgG3 불변 도메인, 사람 IgG4 불변 도메인, 사람 IgE 불변 도메인 및 사람 IgA 불변 도메인으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 중쇄 면역글로불린 불변 도메인을 포함한다. 더욱 바람직하게는, 항체 작제물은 서열번호 2, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5를 포함한다. 다른 양태에서, 본 발명은 앞에서 개시한 항체 작제물과 면역부착 분자, 조영제(imaging agent), 치료제 및 세포독성제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 제제를 포함하는 항체 접합체를 제공한다. 바람직한 양태에서, 조영제는 방사능표지, 효소, 형광 표지, 발광 표지, 생물발광 표지, 자성 표지 및 비오틴으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, 조영제는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방사능표지이다. 바람직한 양태에서, 치료제 또는 세포독성제는 항대사산물, 알킬화제, 항생제, 성장인자, 사이토카인, 항혈관형성제, 항유사분열제, 안트라사이클린, 독소 및 아폽토시스제로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
다른 양태에서, 항체 작제물은 글리코실화되어 있다. 글리코실화는 사람 글리코실화 패턴인 것이 바람직하다.
다른 양태에서, 앞에서 개시한 결합 단백질, 항체 작제물 또는 항체 접합체는 결정으로서 존재한다. 결정은 무담체 약제학적 제어 방출 결정인 것이 바람직하다. 바람직한 양태에서, 결정화된 결합 단백질, 결정화된 항체 작제물 또는 결정화된 항체 접합체는 이의 가용성 대응물보다 생체내 반감기가 더 긴 것이다. 다른 바람직한 양태에서, 결정화된 결합 단백질, 결정화된 항체 작제물 또는 결정화된 항체 접합체는 결정화 후에도 생물학적 활성을 보유한다.
한가지 관점으로서, 본 발명은 IL-13에 결합하는 결합 단백질을 포함하는 DVD 결합 단백질에 관한 것이다. 이 DVD 결합 단백질은 IL-13 및 제2 표적에 결합할 수 있는 것이 바람직하다. 제2 표적은 CSF1(MCSF), CSF2(GM-CSF), CSF3(GCSF), FGF2, IFNα1, IFNβ1, IFNγ, 히스타민 및 히스타민 수용체, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12α, IL-12β, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, KITLG, PDGFB, IL-2Rα, IL-4R, IL-5Rα, IL-8Rα, IL-8Rβ, IL-12Rβ1, IL-12Rβ2, IL-13Rα1, IL-13Rα2, IL-18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR 및 키티나제로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 더욱 바람직하게는, DVD 단백질은 IL-13 및 IL-1β, IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MIF; IL-13 및 TGF-b; IL-13 및 LHR 효능제; IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; 또는 IL-13 및 ADAM8을 인식할 수 있다. 가장 바람직하게는, DVD 단백질은 IL-13 및 TNFα에 결합할 수 있다.
한가지 관점으로서, 본 발명은 앞에서 개시한 결합 단백질, 항체 작제물 또는 항체 접합체 중 어느 하나를 암호화하는 분리된 핵산에 관한 것이다. 다른 양태로서, 앞에서 개시한 분리된 핵산을 포함하는, pcDNA; pTT(Durocher et al., Nucleic Acids Research 2002, Vol 30, No.2); pTT3 (pTT + 추가의 다중 클로닝 부위); pEFBOS (Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17); pBV; pJV; 및 pBJ로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 벡터를 제공한다.
다른 관점에서, 숙주 세포는 앞에서 개시한 벡터에 의해 형질전환된다. 숙주 세포는 원핵생물 세포인 것이 바람직하다. 숙주 세포는 이.콜라이(E. coli)인 것이 더욱 바람직하다. 관련 양태에서, 숙주 세포는 진핵생물 세포이다. 진핵생물 세포는 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 숙주 세포는 CHO 및 COS를 포함한, 이에 국한되지 않는 포유동물 세포; 또는 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 진균 세포; 또는 Sf9와 같은 곤충 세포인 것이 더욱 바람직하다.
본 발명의 다른 관점은 IL-13에 결합하는 결합 단백질을 생산하기에 충분한 조건 하에 배양 배지에서 앞에서 개시한 숙주 세포 중 어느 하나를 배양하는 것을 포함하는, IL-13에 결합하는 결합 단백질의 생산 방법을 제공한다. 다른 양태는 앞서 개시한 방법에 따라 생산된 결합 단백질을 제공한다.
한가지 양태는, 결합 단백질의 방출용 조성물로서, 앞에서 개시한 결정화된 결합 단백질, 결정화된 항체 작제물 또는 결정화된 항체 접합체 및 성분을 포함하는 제형; 및 하나 이상의 중합체성 담체를 포함하는, 상기 조성물을 제공한다. 상기 중합체성 담체는 폴리(아크릴산), 폴리(시아노아크릴레이트), 폴리(아미노산), 폴리(안하이드라이드), 폴리(뎁시펩타이드), 폴리(에스테르), 폴리(락트산), 폴리(락트-코-글리콜산) 또는 PLGA, 폴리(b-하이드록시부티레이트), 폴리(카프로락톤), 폴리(디옥사논), 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리(하이드록시프로필) 메타크릴아미드, 폴리[(오르가노)포스파젠], 폴리(오르토 에스테르), 폴리(비닐 알콜), 폴리(비닐피롤리돈), 말레산 안하이드라이드-알킬 비닐 에테르 공중합체, 플루론산 폴리올, 알부민, 알기네이트, 셀룰로스 및 셀룰로스 유도체, 콜라겐, 피브린, 젤라틴, 히알루론산, 올리고사카라이드, 글리카미노글리칸, 황산화 폴리사카라이드, 이의 배합물 및 공중합체로 이루어진 그룹 중 하나 이상으로부터 선택된 중합체인 것이 바람직하다. 상기 성분은 알부민, 슈크로스, 트레할로스, 락티톨, 젤라틴, 하이드록시프로필-β-사이클로덱스트린, 메톡시폴리에틸렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다. 다른 양태는 앞에서 개시한 조성물의 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하는 포유동물의 치료 방법이다.
또한, 본 발명은 앞에서 개시한 결합 단백질, 항체 작제물 또는 항체 접합체와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 다른 양태에서, 약제학적 조성물은 IL-13 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 다른 치료제를 하나 이상 포함한다. 다른 제제는 치료제, 조영제, 세포독성제, 혈관형성 억제제(예컨대, 항VEGF 항체 또는 VEGF-트랩 등, 이에 국한되지 않는다); 키나제 억제제(예컨대, KDR 및 TIE-2 억제제 등, 이에 국한되지 않는다); 공동자극 분자 차단제(예컨대, 항-B7.1, 항-B7.2, CTLA4-Ig, 항-CD20 등, 이에 국한되지 않는다); 부착 분자 차단제(예컨대, 항-LFA-1 Ab, 항-E/L 셀렉틴 Ab, 소분자 억제제); 항-사이토카인 항체 또는 이의 기능성 단편(예컨대, 항-IL-18, 항-TNF, 항-IL-6/사이토카인 수용체 항체 등, 이에 국한되지 않는다); 메토트렉세이트; 사이클로스포린; 라파마이신; FK506; 검출가능한 표지 또는 리포터; TNF 길항제; 항류마티스제; 근육 이완제, 최면제, 비스테로이드성 소염제(NSAID), 진통제, 마취제, 진정제, 국소 마취제, 신경근육 차단제, 항미생물제, 건선치료제, 코르티코스테로이드, 동화성 스테로이드, 에리트로포이에틴, 면역제, 면역글로불린, 면역억제제, 성장호르몬, 호르몬 대용 약물, 방사성의약, 항우울제, 항정신병제, 자극제, 천식 약물, 베타 효능제, 흡입형 스테로이드, 경구 스테로이드, 에피네프린 또는 유사체, 사이토카인 및 사이토카인 길항제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
다른 관점에서, 본 발명은 사람 IL-13 활성이 감소되도록, 앞에서 개시한 결합 단백질과 사람 IL-13을 접촉시키는 것을 포함하여, 사람 IL-13의 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 관련된 관점에서, 본 발명은 IL-13 활성이 유해한 장애를 앓고 있는 사람 피검체에게 앞에서 개시한 결합 단백질을 투여하여 사람 피검체 중의 사람 IL-13 활성을 억제하여 치료가 달성되도록 하는 것을 포함하는, 상기 사람 피검체의 사람 IL-13 활성을 억제하는 방법을 제공한다.
다른 관점에서, 본 발명은 피검체의 IL-13 관련 장애를 치료(예컨대, 치유, 억제, 경감, 장애 개시의 지연 또는 방해, 또는 장애의 재발 방지) 또는 예방하는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 피검체에게 IL-13 결합 제제(구체적으로, 길항제), 예컨대 본 명세서에 기술한 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 IL-13 관련 장애의 치료 또는 예방에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. IL-13 길항제, 예컨대 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 피검체에게 단독으로 또는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 치료법과 함께 투여될 수 있다.
한가지 양태에서, 피검체는 포유동물, 예컨대 하나 이상의 IL-13 관련 장애, 예컨대 호흡기 장애(예: 천식(예: 알레르기성 및 비알레르기성 천식)), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 및 기도 염증, 호산구 증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 다른 병태; 아토피 장애(예: 아토피 피부염 및 알레르기성 비염); 피부, 위장 기관(예: 염증성 장 질환(IBD), 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병) 및 간(예: 경변증, 섬유증)의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 경피증; 종양 또는 암, 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 호지킨 림프종을 앓고 있는 사람이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 치료에 사용되는 IL-13 결합 제제(예컨대, 본 명세서에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)의 용도 및 본 명세서에 기술된 치료용 약제의 제조에 사용되는 IL-13 결합 제제(예컨대, 본 명세서에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)의 용도를 포함한다. IL-13 관련 장애의 예에는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 다음과 같은 장애 중 하나 이상에서 선택되는 장애가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다: 호흡기 장애, 예컨대 천식(예: 알레르기성 및 비알레르기성 천식(예: 유아 등의 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염으로 인한 천식)), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 및 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 다른 병태, 예컨대 낭성 섬유증 및 폐 섬유증; 아토피 장애, 예컨대 IL-13에 대한 증가된 민감성으로 인한 장애(예: 아토피 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 비염, 및 알레르기성 위창자염); 피부의 염증성 및/또는 자가면역 병태(예: 아토피성 피부염), 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태(예: 염증성 장 질환(IBD), 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병), 간의 염증성 및/또는 자가면역 병태(예: 경화증, 간세포 암종), 및 경피증; 종양 또는 암(예: 연조직 또는 고형 종양), 예컨대 백혈병, 아교모세포종 및 림프종, 예 호지킨 림프종; 바이러스 감염(예: HTLV-1 감염); 다른 장기의 섬유증, 예컨대 간 섬유증(예: B형 및/또는 C형 간염 바이러스에 의한 섬유증); 및 보호성 1형 면역 반응의 발현 억제(예컨대, 백신접종 동안).
다른 양태에서, 본 발명은 호흡기 장애, 예컨대 천식(예: 알레르기성 및 비알레르기성 천식); 알레르기; 만성 폐색성 폐질환(COPD); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 병태, 예컨대 낭성 섬유증 및 폐 섬유증과 관련 있는 하나 이상의 증상을 치료(예컨대, 감소, 경감)하거나 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 천식의 증상으로는, 쌕쌕거림, 숨참, 기관지수축, 기도 과다반응, 폐용량 감소, 섬유증, 기도 염증 및 점액 생산을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 방법은 IL-13 길항제, 예컨대 IL-13 항체 또는 이의 단편을 하나 이상의 증상을 치료(예: 감소, 경감)하거나 예방하기에 충분한 양으로 피검체에게 투여하는 것을 포함한다. IL-13 항체는 치료 또는 예방적으로, 또는 양자의 용도로 투여될 수 있다. IL-13 길항제, 예컨대 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 피검체에게 단독으로 또는 본 명세서에 기술된 다른 치료법과 함께 투여될 수 있다. 피검체는 포유동물, 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 IL-13 관련 장애를 앓고 있는 사람인 것이 바람직하다.
다른 관점에서, 본 발명은 시험관내에서 시료(예컨대, 생물학적 시료, 예컨대 혈청, 혈장, 조직, 생검) 중의 IL-13의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 장애, 예컨대 면역 세포 관련 장애를 진단하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 시료 또는 대조 시료를 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 상기 시료 또는 대조 시료 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 시료 대비, 당해 시료 중의 복합체 형성의 통계적으로 유의적인 변화가 시료 중의 IL-13의 존재를 나타낸다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 생체내에서 IL-13의 존재를 검출하는 방법(예컨대, 피검체의 생체내 영상화)을 제공한다. 당해 방법은 IL-13 관련 장애 등의 장애를 진단하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 이 항체 또는 단편의 IL-13에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 피검체 또는 대조 피검체에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 항체 또는 단편과 IL-13 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이 때 대조 피검체 대비, 피검체 중의 복합체 형성의 통계적으로 유의적인 변화가 IL-13의 존재를 나타낸다.
다른 관점에서, 본 발명의 결합 단백질은 관절염, 골관절염, 청소년 만성 관절염, 패혈성 관절염, 라임 관절염, 건선성 관절염, 반응성 관절염, 척추관절염, 전신성 홍반성 낭창, 크론병, 궤양성 대장염, 염증성 장 질환, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 갑상선염, 천식, 알레르기성 질환, 건선, 피부염, 경피증, 이식편 대 숙주 질환, 장기 이식편 거부, 장기 이식과 관련된 급성 또는 만성 면역 질환, 유육종증, 아테롬성 동맥경화증, 파종성 혈관내 응고, 가와사키병, 그레이브병, 신증후군, 만성 피로 증후군, 베게너 육아종증, 헤노흐-쉔라인 자반증, 신장의 현미경적 혈관염, 만성 활동성 간염, 포도막염, 패혈성 쇼크, 독성 쇼크 증후군, 패혈증 증후군, 악액질, 감염성 질환, 기생충성 질환, 후천성 면역결핍 증후군, 급성 횡단성 척수염, 헌팅턴 무도병, 파킨슨병, 알츠하이머병, 발작, 원발성 담즙성 간경변, 용혈성 빈혈, 악성 종양, 심부전, 심근경색, 애디슨병, 산발성 다분비선 결핍증 I형 및 다분비선 결핍증 II형, 슈미트 증후군, 성인성 (급성) 호흡 곤란 증후군, 탈모증, 원형 탈모증, 혈청 반응 음성 관절증, 관절증, 라이터 질환, 건선성 관절증, 궤양성 대장염성 관절증, 장병증성 활막염, 클라미디아, 예르시니아 및 살모넬라 관련된 관절증, 척추관절증, 아테롬성 질환/아테롬성 동맥경화증, 아토피성 알레르기, 자가면역성 수포성 질환, 심상성 천포창, 낙엽성 천포창, 유천포창, 선상 IgG 질환, 자가면역성 용혈성 빈혈, 쿰스 양성 용혈성 빈혈, 후천성 악성 빈혈, 청소년 악성 빈혈, 근통성 뇌염/로열 프리 질환(Royal Free Disease), 만성 점막피부 칸디다증, 거세포 동맥염, 원발성 경화성 간염, 잠재성 자가면역성 간염, 후천성 면역결핍 증후군, 후천성 면역결핍 관련된 질환, B형 간염, C형 간염, 공통 가변성 면역결핍증(공통 가변성 저감마글로불린혈증), 확장형 심근증, 여성 불임증, 난소 기능 부전, 조기 난소 기능 부전, 섬유성 폐 질환, 잠재성 섬유성 폐포염, 염증 후 간질성 폐 질환, 간질성 폐렴, 결합 조직 질환 관련된 간질성 폐질환, 혼합 결합 조직 질환 관련된 폐 질환, 전신성 경화증 관련된 간질성 폐 질환, 류마티스성 관절염 관련된 간질성 폐 질환, 전신성 홍반성 낭창 관련된 폐 질환, 피부근염/다발성 근염 관련된 폐 질환, 쇼그렌 질환 관련된 폐 질환, 강직성 척추염 관련된 폐 질환, 혈관염성 미만성 폐 질환, 혈청증 관련된 폐 질환, 약물-유도된 간질성 폐 질환, 섬유증, 방사선 섬유증, 폐색성 기관지염, 만성 호산구성 폐렴, 림프구 침윤성 폐 질환, 감염후 간질성 폐 질환, 통풍성 관절염, 자가면역성 간염, 1형 자가면역성 간염(전형적 자가면역성 또는 루푸스양 간염), 2형 자가면역성 간염(항-LKM 항체 간염), 자가면역 매개된 저혈당증, 흑색 표피종을 수반하는 B형 인슐린 저항성, 부갑상선기능저하증, 장기 이식과 관련된 급성 면역 질환, 장기 이식과 관련된 만성 면역 질환, 골관절증, 원발성 경화성 담관염, 건선 1형, 건선 2형, 특발성 백혈구감소증, 자가면역성 호중구감소증, NOS 신장 질환, 사구체신염, 신장의 현미경적 혈관염, 라임 질환, 원판상 홍반성 낭창, 특발성 또는 NOS 남성 불임증, 정자 자가면역, 다발성 경화증(모든 아형), 교감신경성 안염, 결합 조직 질환에 속발성인 폐 고혈압, 굿패스쳐 증후군, 결절성 다발성동맥염의 폐 징후, 급성 류마티스성 열, 류마티스성 척추염, 스틸병, 전신성 경화증, 쇼그렌 증후군, 다카야스 질환/관절염, 자가면역성 혈소판감소증, 특발성 혈소판감소증, 자가면역성 갑상선 질환, 갑상선기능항진증, 갑상선종성 자가면역성 갑상선기능저하증(하시모토 질환), 위축성 자가면역성 갑상선기능저하증, 원발성 점액수종, 수정체성 포도막염, 원발성 혈관염, 백반증, 급성 간 질환, 만성 간 질환, 알콜성 경화증, 알콜 유도성 간 손상, 담즙분비장애, 특발성 간 질환, 약물 유도성 간염, 비알콜성 지방간, 알레르기 및 천식, B형 연쇄구균(GBS) 감염, 정신 장애(예: 우울증 및 정신분열증), Th2형 및 Th1형 매개 질환, 급성 및 만성 통증(여러 형태의 통증), 및 암, 예컨대 폐, 유방, 위, 방광, 결장, 췌장, 난소, 전립선 및 직장 암 및 혈액암(백혈병 및 림프종), 무베타지방단백혈증, 말단청색증, 급성 및 만성 기생충성 또는 감염성 과정, 급성 백혈병, 급성 림프모세포성 백혈병(ALL), 급성 골수성 백혈병(AML), 급성 또는 만성 세균 감염, 급성 췌장염, 급성 신부전, 아데노암종, 심방 이소성 박동, AIDS 치매 복합증, 알콜 유도성 간염, 알레르기성 결막염, 알레르기성 접촉성 피부염, 알레르기성 비염, 동종이식편 거부, α-1 항트립신 결핍증, 근위축성 측삭 경화증, 빈혈, 협심증, 전각세포 변성, 항 CD3 요법, 항인지질 증후군, 항-수용체 과민 반응, 대동맥 및 말초 동맥류, 대동맥 박리, 동맥 고혈압, 동맥경화증, 동정맥루, 운동실조, 심방세동(지속성 또는 발작성), 심방조동, 방실차단, B 세포 림프종, 골이식거부, 골수 이식(BMT) 거부, 다발갈래차단, 버킷 림프종, 화상, 심장부정맥, 심장 기절 증후군, 심장 종양, 심근병증, 심장폐 측로 염증 반응, 연골 이식 거부, 소뇌피질 변성, 소뇌 장애, 혼돈성 또는 다소성 심방빈맥, 화학요법 관련 장애, 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 알콜중독증, 만성 염증성 병태, 만성 림프성 백혈병(CLL), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 만성 살리실레이트 중독, 결장직장 암종, 울혈성 심부전, 결막염, 접촉성 피부염, 폐심장증, 관상 동맥 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 배양 음성 패혈증, 낭성 섬유증, 사이토카인 요법 관련 장애, 권투선수 치매, 탈수초성 질환, 뎅기출혈열, 피부염, 피부 병태, 당뇨병, 진성당뇨병, 당뇨성 동맥경화 질환, 미만 루이소체 질환, 확장울혈성심근병증, 기저신경절 장애, 중년기 다운 증후군, CNS 도파민 수용체를 차단하는 약물에 의해 유도된 약물 유도성 운동 장애, 약물 민감성, 습진, 뇌척수염, 심내막염, 내분비병증, 후두개염, 엡스타인-바르 바이러스 감염, 홍색사지통증, 추체외로 및 소뇌 장애, 가족성 식혈세포성 림프조직구증, 태아 흉선 이식 거부, 프리드리히 운동실조, 기능성 말초 동맥 장애, 진균 패혈증, 가스 괴저, 위궤양, 사구체신염, 임의의 장기 또는 조직의 이식거부, 그람 음성 폐혈증, 그람 양성 패혈증, 세포내 유기체로 인한 육아종, 모발상세포 백혈병, 할레로덴-스파쯔 질환, 하시모토 갑상선염, 건초열, 심장이식거부, 혈색소침착증, 혈액투석, 용혈 요독 증후군/혈전용해성 혈소판감소 자색반, 출혈, A형 간염, 히스다발 부정맥, HIV 감염/HIV 신경병, 호지킨 질환, 운동과다 운동 장애, 과민 반응, 과민 폐렴, 고혈압, 운동저하성 운동 장애, 시상하부-뇌하수체-부신계 평가, 특발성 애디슨병, 특발성 폐섬유증, 항체 매개 세포독성, 무력증, 영아 척수 근위축증, 대동맥 염증, A형 인플루엔자, 이온화 방사선 노출, 홍채섬모체염/포도막염/시각신경염, 허혈-재관류 손상, 허혈성 발작, 청소년 류마티스성 관절염, 청소년 척수근위축증, 카포시육종, 신장이식거부, 레지오넬라, 리슈만편모충증, 나병, 피질척수계 병변, 지방부종, 간 이식 거부, 림프부종, 말라리아, 악성 림프종, 악성 조직구증, 악성 흑색종, 수막염, 수막구균혈증, 대사성/특발성 편두통, 미토콘드리아 다발적 전신이상, 혼합성 결합조직 질환, 모노클로날 감마글로불린병증, 다발성 골수종, 다발적 전신 변성(Menzel, Dejerine-Thomas, Shy-Drager, and Machado-Joseph), 중증근육무력증, 세포내 조류형 결핵균, 결핵균, 골수형성이상증후군, 심근경색, 심근허혈성 장애, 비인강 악성종양, 신생아 만성 폐질환, 신염, 신장증, 신경변성 질환, 신경성 I형 근육 위축증, 호중구감소성 발열, 비호지킨스 림프종, 복부대동맥 및 그 분지의 폐색, 폐색성 동맥 장애, OKT3 요법, 고환염/부고환염, 고환염/정관절제 역전 시술, 장기비대, 골다공증, 췌장 이식 거부, 췌장 암종, 부신생물 증후군/악성종양의 고칼슘혈증, 부갑상선 이식 거부, 골반염질환, 무계절 알레르기성 비염, 심장막병, 말초 죽상경화 질환, 말초 혈관 장애, 복막염, 악성빈혈, 폐포자충 폐렴, 폐렴, POEMS 증후군(다발신경병증, 장기비대, 내분비병증, 모노클로날 감마글로불린병증 및 피부 변화 증후군), 관류후 증후군, 펌프후 증후군, MI 심장절개후 증후군, 전자간증, 진행성 핵상 마비, 원발성 폐 고혈압, 방사선요법, 레이노 현상, 레이노 질환, 레프섬 질환, 규칙적인 좁은 QRS 빈맥, 신장혈관 고혈압, 재관류 손상, 제한 심장근육병증, 육종, 공피증, 노인성 무도병, 루이소체형 노인성 치매, 혈청음성 관절병증, 쇼크, 겸상적혈구빈혈, 피부 동종이식 거부, 피부 변화 증후군, 소장 이식 거부, 고형 종양, 특이적 부정맥, 척수성 운동실조, 척수소뇌 변성, 연쇄구균성 근염, 소뇌의 구조성 병변, 아급성 경화성 범뇌염, 실신, 심장혈관계의 매독, 전신 아나필락시스, 전신 염증성 반응 증후군, 전신 발병 청소년성 류마티스성 관절염, T-세포 또는 FAB ALL, 모세혈관확장, 폐쇄성 혈전혈관염, 저혈소판증, 독성, 이식조직, 외상/출혈, III형 과민 반응, IV형 과민, 불안정한 협심증, 요독증, 요로성폐혈증, 두드러기, 판막성 심장병, 정맥류성 정맥, 혈관염, 정맥 질환, 정맥 혈전증, 심실 세동, 바이러스 및 진균 감염, 바이러스성 뇌염/무균 수막염, 바이러스 관련 식혈세포성 증후군, 베르니케-코르사코프 증후군, 윌슨병, 임의의 장기 또는 조직의 이종이식 거부, 급성 관상동맥 증후군, 급성 특발성 다발신경염, 급성 염증성 탈수초성 다발신경근병증, 급성 허혈, 성인 스틸병, 원형탈모증, 아나필락시스, 항인지질 항체 증후군, 무형성빈혈, 동맥경화증, 아토피성 습진, 아토피성 피부염, 자가면역 피부염, 연쇄구균 감염 관련 자가면역 장애, 자가면역 장병증, 자가면역 청력상실, 자가면역 림프증식성 증후군(ALPS), 자가면역 심근염, 자가면역 조기 난소 기능 부전, 눈꺼풀염, 기관지확장증, 수포성 유천포창, 심혈관 질환, 파국적 항인지질 증후군, 복강병, 경부 척추증, 만성 허혈, 흉터성 유천포창, 다발성 경화증의 위험을 있는 임상적 독립 증후군(CIS), 결막염, 아동기발병 정신병, 만성 폐색성 폐질환(COPD), 누낭염, 피부근육염, 당뇨병성 망막병증, 진성당뇨병, 원반탈출증, 추간판탈출증, 약물 유도 면역 용혈성 빈혈, 심장내막염, 자궁내막증, 안구내염, 상공막염, 다형홍반, 주요 다형홍반, 임신성 유사천포창, 길랑-바레 증후군(GBS), 건초열, 휴스 증후군, 특발성 파킨슨병, 특발성 간질성 폐렴, IgE 매개 알레르기, 면역 용혈성 빈혈, 봉입체 근염, 감염성 안구 염증성 질환, 염증성 탈수초성 질환, 염증성 심장병, 염증성 신장병, IPF/UIP, 홍채염, 각막염, 건조 각막결막염, 쿠스마울병 또는 쿠스마울-마이어 질환, 란드리 마비, 랑게르한스세포 조직구증, 그물울혈반, 황반변성, 현미경적 다발성 혈관염, 베크테레프병, 운동신경세포장애, 점막 유사천포창, 다발성 장기부전, 중증근무력증, 골수형성이상 증후군, 심근염, 신경근 장애, 신경병, 비-A형 비-B형 간염, 시신경염, 골용해, 소수관절형 JRA, 말초 동맥 폐색성 질환(PAOD), 말초혈관 질환(PVD), 말초동맥 질환(PAD), 정맥염, 결정성 다발동맥염(또는 결절성 동맥주위염), 다연골염, 류마티스성 다발성 근육통, 백모증, 다관절 JRA, 다선결핍 증후군, 다발성근염, 다발성근육통(PMR), 펌프후 증후군, 원발성 파킨슨병, 전립선염, 순수적혈구 무형성, 원발성 부신피질호르몬 기능장애, 재발성 시속신경수염, 재협착증, 류마티스성 심장병, SAPHO(윤활막염, 여드름, 농포증, 뼈과다증 및 골염), 공피증, 속발성 아밀로이드증, 쇼크 폐, 공막염, 좌골신경통, 속발성 부신피질호르몬 기능장애, 실리콘 관련 결합조직 질환, 스네돈-윌킨슨 피부병, 강직성 척추염, 스티븐스-존슨 증후군(SJS), 전신 염증성 반응 증후군, 일시적 동맥염, 톡소포자충성 비염, 독성 표피 괴사증, 횡단 척수염, TRAPS(1형 종양 괴사 인자 수용체(TNFR) 관련 주기성 증후군), 1형 알레르기 반응, II형 당뇨병, 두드러기, 통상성 간질성 폐렴(UIP), 혈관염, 춘계결막염, 바이러스성 비염, 보그트-고야나기-하라다 증후군(VKH 증후군), 노년 황반 변성 및 상처치유로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 장애를 치료하는데 유용하다.
다른 관점에서, 본 발명의 결합 단백질은 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 부신피질 암종, 항문암, 충수암, 소뇌 별아교세포종, 기저세포 암종, 담관암, 간외, 방광암, 골암, 골육종/악성 섬유성 조직구종 뇌줄기 신경아교종, 뇌종양, 뇌줄기 신경교종, 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, 뇌실막세포종, 속질모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 시각경로 및 시상하부 신경아교종, 유방암, 기고나지 선종/유암종, 카시노이드 종양, 미상 원시 위장 암종, 중추신경계 림프종, 원시 소뇌 별아교세포종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 유잉계 종양, 두개외 배세포 종양, 생식선외 배세포 종양, 간외 담관암, 안구암, 안내 흑색종 망막아세포종, 쓸개암, 위(스토마크)암, 위장 유암종 종양, 위장 간질종양(GIST), 두개외, 배세포 종양, 생식선외 배세포 종양, 난소 배세포 종양, 임신융모종양, 신경아교종, 뇌줄기 신경아교종, 뇌별아교세포종 신경아교종, 아동기 시각경로 및 시상하부 신경아교종, 털세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간)암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안내 흑색종, 섬세포 암종(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장(신장세포)암, 후두암, 급성 림프아세포 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병, 털세포 백혈병, 입술 및 구강암, 간암, 비소세포폐암, 소세포 폐암, AIDS 관련 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 원시중추신경계 림프종, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증, 뼈의 악성 섬유성 조직구종/골육종, 속질모세포종, 흑색종, 안내(눈) 흑색종, 메켈세포 암종, 악성 중피종, 잠복 원발성 구강암을 동반한 전이 편평 경부암, 복합 내분비선 신생물 증후군, 다발성 골수종/형질세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수종, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동암, 비인두암, 신경아세포종, 구암, 구강암, 입술 및 구인두암, 골육종/뼈의 악성 섬유성 조직구종, 난소암, 난소 상피세포암, 난소 배세포암, 난소 저 악성 잠재 종양, 췌장암, 섬세포 췌장암, 부비동 및 비강암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 솔방울모세포종, 천막위 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 종양, 형질세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 직장암, 신장세포(신장)암, 신우 및 요관 전이 세포암, 망막아세포종, 침샘암, 육종, 유잉계 종양, 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁 육종, 세자리 증후군, 피부암(비흑색종), 피부암(흑색종), 메켈세포 피부 암종, 소장암, 편평세포암종, 잠복 원발성 스토마크(위)암을 동반한 전이성 편평 경부암, 천막위 원시신경외배엽 종양, 피부 T-세포 림프종, 고환암, 인후암, 흉선암 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 전이세포암, 임신 융모종양, 요관 및 신우, 전이 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁내막성 자궁 육종, 질암, 시각경로 및 시상하부 신경교종, 외음부암, 왈덴스트룀 마크로글로불린혈증 및 윌름즈종양으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 장애를 치료하는데 유용하다.
다른 관점에서, 본 발명은 사람 IL-13이 유해한 장애를 앓고 있는 환자를 치료하는 방법으로서, 앞에서 논한 바와 같은 제2 제제의 투여 전, 투여와 동시에 또는 투여 후에 앞에서 개시한 결합 단백질 중 어느 하나를 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태에서, 하나 이상의 IL-13 길항제(예: 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)과 공동투여 및/또는 공동조제될 수 있는 다른 치료제에는 흡입형 스테로이드; 경구 스테로이드; 베타 효능제; 속효성 또는 지속성 베타 효능제; 류코트리엔 또는 류코트리엔 수용체의 길항제; ADVAIR와 같은 복합 약물; IgE 억제제; 항IgE 항체(예: XOLAIR); 포스포디에스테라제 억제제(예: PDE4 억제제); 잔틴; 항콜린작동성 약물; 비만세포 안정화제, 예컨대, 크로몰린; IL-4 억제제; IL-5 억제제; 에오탁신/CCR3 억제제; 히스타민 또는 이의 수용체, 예컨대 H1, H2, H3 및 H4의 길항제; 및 프로스타글란딘 D 또는 이의 수용체(DP1 및 CRTH2)의 길항제 중 하나 이상이 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 배합물은 천식 및 다른 호흡기 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 공동투여 및/또는 공동조제될 수 있는 다른 치료제의 예에는 TNF 길항제(예: TNF 수용체의 가용성 단편, 예: p55 또는 p75 사람 TNF 수용체 또는 이의 유도체, 예: 75kD TNFR-IgG(75kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBREL)); TNF 효소 길항제, 예컨대, TNF 전환 효소(TACE) 억제제; 무스카린성 수용체 길항제; TGF-β 길항제; 인터페론 감마; 퍼페니돈; 화학요법제, 메토트렉세이트; 레플루노마이드; 시롤리무스(라파마이신) 또는 이의 유사체; CCI-779; COX2 및 cPLA2 억제제; NSAID; 면역조절제; p38 억제제; TPL-2, MK-2 및 NFkB 억제제 등 중 하나 이상이 포함된다. 또 다른 제2 제제는 부데노사이드; 상피 성장 인자; 코르티코스테로이드; 사이클로스포린; 설파살라진; 아미노살리실레이트; 6-머캅토퓨린; 아자티오프린; 메트로니다졸; 리폭시게나제 억제제; 메살라민; 올살라진; 발살라자이드; 항산화제; 트롬복산 억제제; IL-1 수용체 길항제; 항-IL-1β 모노클로날 항체; 항-IL-6 모노클로날 항체; 성장인자; 엘라스타제 억제제; 피리디닐-이미다졸 화합물; TNF, LT, IL-1, IL-2, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, EMAP-II, GM-CSF, FGF 또는 PDGF의 항체 또는 효능제; CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD90 또는 이들의 리간드의 항체; 메토트렉세이트; 사이클로스포린; FK506; 라파마이신; 마이코페놀레이트 모페틸; 레플루노마이드; NSAID; 이부프로펜; 코르티코스테로이드; 프레드니솔론; 포스포디에스테라제 억제제; 아데노신 효능제; 항혈전제; 보체 억제제; 아드레날린성 제제; IRAK, NIK, IKK, p38, 또는 MAP 키나제 억제제; IL-1β 전환효소 억제제; TNFα 전환효소 억제제; T-세포 신호 억제제; 메탈로프로테이나제 억제제; 설파살라진; 아자티오프린; 6-머캅토퓨린; 안지오텐신 전환효소 억제제; 가용성 사이토카인 수용체; 가용성 p55 TNF 수용체; 가용성 p75 TNF 수용체; sIL-1RI; sIL-1RII; sIL-6R; 항염증성 사이토카인; IL-4; IL-10; IL-11; 및 TGFβ로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
바람직한 양태에서, 앞에서 개시한 약제학적 조성물은 비경구, 피하, 근육내, 정맥내, 관절내, 기관지내, 복부내, 낭내, 연골내, 강내, 복내(intracelial), 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경관내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심막내, 복강내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수강내, 윤활막내, 흉곽내, 자궁내, 방광내 투여, 일시투여, 질, 직장, 구강, 설하, 비강내 및 경피 투여 중에서 선택되는 하나 이상의 방식으로 피검체에게 투여된다.
한가지 관점에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 IL-13 결합 단백질에 대한 하나 이상의 IL-13 항-이디오타입(idiotype) 항체를 제공한다. 항-이디오타입 항체에는 면역글로불린 분자의 적어도 일부, 예컨대 중쇄 또는 경쇄의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR), 또는 이의 리간드 결합부, 중쇄 또는 경쇄 가변 영역, 중쇄 또는 경쇄 불변 영역, 프레임워크 영역, 또는 이의 임의의 부분으로서 본 발명의 결합 단백질에 혼입될 수 있는 부분(이에 국한되는 것은 아니다)을 포함하는 임의의 단백질 또는 펩타이드 함유 분자를 포함한다.
본 발명은 사람 IL-13 결합 단백질, 구체적으로 IL-13에 결합하는 항-IL-13 항체 또는 이의 항원결합부분에 관한 것이다. 본 발명의 다양한 관점들은 항체 및 항체 단편과 이의 약제학적 조성물에 관한 것이며, 뿐만 아니라 이러한 항체 및 단편을 제조하기 위한 핵산, 재조합 발현 벡터 및 숙주 세포에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 항체를 사람 IL-13의 검출, 사람 IL-13 활성의 억제(시험관내 또는 생체내), 및 유전자 발현의 조절에 사용하는 방법들도 본 발명에 포함된다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용된 과학 용어 및 기술 용어는 당업자에게 일반적으로 이해되고 있는 의미를 가진 것이다. 하지만, 용어들의 의미와 범위는 어떠한 잠재적 모호함이 있는 경우에는 본 명세서에 제시된 정의가 임의의 사전적 정의 또는 외인적 정의보다 우선시되어야 한다는 것은 분명하다. 또한, 정황상 달리 요구되지 않는다면 단수적 용어는 복수를 포함하고 복수적 용어는 단수를 포함한다. 본 명세서에서, "또는"의 사용은 다른 언급이 없는 한, "및/또는"을 의미한다. 더욱이, "포함하는"이란 용어, 뿐만 아니라 "포함한다" 및 "포함했다"와 같은 다른 형태의 사용은 제한적인 것이 아니다. 또한, "요소" 또는 "구성성분"과 같은 용어는 다른 언급이 없는 한, 하나의 유닛을 포함하는 요소 및 구성성분과 하나보다 많은 서브유닛을 포함하는 요소 및 구성성분을 모두 포함한다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 세포 및 조직 배양, 분자 생물학, 면역학, 미생물학, 유전학 및 단백질과 핵산 화학 및 하이브리드화와 관련하여 사용된 명명 및 기술은 당업계에 공지되고 일반적으로 사용되는 것이다. 본 발명의 방법과 기술은 일반적으로 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 수행하고, 다른 언급이 없는 한, 본 명세서에서 인용되고 논의되는 많은 일반 문헌 및 더 특별한 문헌에 기술된 바와 같이 수행한다. 효소 반응과 정제 기술은 당업계에서 일반적으로 수행되거나 본 명세서에 기술된 바와 같이 제조자의 권장사항에 따라 수행한다. 본 명세서에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학 및 의약 및 약학 화학과 관련하여 사용된 전문어 및 실험 절차와 기술은 당업계에 공지되고 통용되는 것이다. 화학적 합성, 화학적 분석, 약학적 제조, 조제 및 전달, 및 환자 치료에는 표준 기술을 사용한다.
본 발명이 더 쉽게 이해될 수 있도록 하기 위해, 선택한 용어들의 정의는 다음과 같다.
본 명세서에 사용된 "폴리펩타이드"란 용어는 아미노산의 임의의 중합체 쇄를 의미한다. "펩타이드" 및 "단백질"이란 용어는 폴리펩타이드란 용어와 호환적으로 사용되며, 아미노산의 중합체성 쇄를 의미한다. "폴리펩타이드"란 용어는 천연 또는 합성 단백질, 단백질 단편 및 단백질 서열의 폴리펩타이드 유사체를 포함한다. 폴리펩타이드는 단량체성 또는 중합체성일 수 있다.
"분리된 단백질" 또는 "분리된 폴리펩타이드"란 용어는 그 기원이나 유래 근원의 덕분으로 자연 상태에서 동반되는 본래 결합된 구성성분이 결합되어 있지 않거나; 같은 종 유래의 다른 단백질이 실질적으로 없거나; 다른 종 유래의 세포에 의해 발현되거나; 또는 자연에서 발생된 것이 아닌 단백질 또는 폴리펩타이드이다. 즉, 본래 기원인 세포와 다른 세포계에서 합성되거나 화학적으로 합성된 폴리펩타이드는 본래 결합된 구성성분으로부터 "분리된" 것일 것이다. 또한, 단백질은 당업계에 공지된 단백질 정제 기술을 이용하는 분리에 의해 본래 결합된 구성성분이 실질적으로 제거된 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "회수하는"이란 용어는 예컨대 당업계에 공지된 단백질 정제 기술 등을 이용하는 분리에 의해 본래 결합된 구성성분이 실질적으로 제거된 폴리펩타이드와 같은 화학 종을 제공하는 과정을 의미한다.
본 명세서에 사용된, "사람 IL-13" 및 "사람 IL-13 야생형"(본 명세서에서 h IL-13, h IL-13wt로 약칭함)이란 용어는 T 헬퍼 2 세포에 의해 주로 분비되는 사람 사이토카인을 포함한다. 이 용어는 13kDa 폴리펩타이드의 단량체성 단백질을 포함한다. 사람 IL-13의 구조는 예컨대 문헌[Moy, Diblasio et al. 2001 J Mol Biol 310 219-30]에 더 상세하게 기술되어 있다. 사람 IL-13이란 용어는 표준 재조합 발현법에 의해 제조될 수 있는 재조합 사람 IL-13(rh IL-13)을 포함하는 것이다. 표 1은 당업계에 공지된 사람 IL-13의 아미노산 서열, 서열번호 1을 나타낸다.
[표 1]
Figure pat00005
본 명세서에 사용된 "사람 IL-13 변이체"(본 명세서에서는 h IL-13v로 약칭함)란 용어는 서열번호 1의 아미노산 잔기 130번이 아르기닌에서 글루타민으로 변화된(R130Q) 사람 IL-13의 변이체를 포함한다.
본 명세서에 사용된 "생물학적 활성"이란 용어는 사이토카인의 모든 고유의 생물학적 성질을 의미한다. IL-13의 생물학적 성질은 IL-13 수용체 결합을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니며, 다른 예에는 사람 B 세포에서 IgE로의 면역글로불린 이소형 전환 및 염증성 사이토카인 생산의 억제가 포함된다.
제2 화학 종과 항체, 단백질 또는 펩타이드의 상호작용과 관련하여 본 명세서에 사용된 "특이적 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"이란 용어는, 그 상호작용이 화학 종 위의 특정 구조의 존재(예: 항원 결정기 또는 에피토프)에 의존적인 것을 의미하며; 예컨대 항체는 일반적으로 단백질보다는 특정 단백질 구조를 인식하여 그 구조에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 특이적이라면, 표지된 "A" 및항체를 함유하는 반응물 중의 에피토프 A를 함유하는 분자(또는 유리의 미표지된 A)의 존재는 항체에 결합된, 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
본 명세서에 사용된 "항체"란 용어는 대체로 4개의 폴리펩타이드 쇄, 즉 2개의 중쇄(H)와 2개의 경쇄(L)로 이루어진 임의의 면역글로불린(Ig) 분자 또는 Ig 분자의 필수 에피토프 결합 특징을 보유하는 임의의 기능성 단편, 돌연변이체, 변이체 또는 유도체를 의미한다. 이러한 돌연변이체, 변이체 또는 유도체성 항체 형태는 당업계에 공지되어 있다. 그 구체예에는 이하에 논의되며, 이에 국한되는 것은 아니다.
전장(full-length) 항체에서, 각 중쇄는 중쇄 가변 영역(본 명세서에서 HCVR 또는 VH로 약칭함) 및 중쇄 불변 영역으로 이루어진다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인 CH1, CH2 및 CH3으로 이루어진다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역(본 명세서에서 LCVR 또는 VL로 약칭함) 및 경쇄 불변 영역으로 이루어진다. 경쇄 불변 영역은 하나의 도메인 CL로 이루어진다. VH 및 VL 영역은 다시 상보성 결정 영역(CDR)이라고 불리는 초가변성 영역으로 세분될 수 있고, 이 영역에는 프레임워크 영역(FR)이라는 더욱 보존적인 영역이 산재되어 있다. 각 VH 및 VL은 3개의 CDR과 4개의 FR로 구성되어 있고, 아미노 말단부터 카르복시 말단까지 다음과 같은 순서로 배열되어 있다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. 면역글로불린 분자는 임의의 타입(예: IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 및 IgY), 클래스(예: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2) 또는 서브클래스일 수 있다.
본 명세서에 사용된 항체의 "항원결합부분"(또는 간단히 "항체 부분")이란 용어는 항원(예: hIL-13)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 하나 이상의 단편을 의미한다. 항체의 항원결합 기능은 전장의 항체의 단편들에 의해서 수행될 수 있다는 것은 밝혀져 있다. 이러한 항체의 구체예는 2개 이상의 상이한 항원에 특이적으로 결합하는, 이특이성(bispecific), 이중 특이성(dual specific) 또는 다특이성(multi-specific) 형태일 수 있다. 항체의 "항원결합부분"이란 용어에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지(hinge) 영역에서 이황화 가교에 의해 결합된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암(arm)의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (v) 하나의 가변 도메인을 포함하는 dAb 단편[Ward et al.(1989) Nature 341: 544-546, Winter et al., PCT 공보 WO 90/05144 A1, 본원에 참고인용됨]; 및 (vi) 분리된 상보성 결정 영역(CDR)이 포함된다. 더욱이, Fv 단편의 2개의 도메인, VL 및 VH는 분리된 유전자에 의해 암호화되지만, 재조합 방법을 이용하여 VL과 VH 영역이 쌍을 이루어 1가 분자를 형성한 단일 단백질로서 제조될 수 있게 하는 합성 링커에 의해 연결될 수 있다(단일쇄 Fv(scFv)로 알려져 있음; 예: Bird et al(1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al.(1988) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85: 5879-5883). 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원결합부분"이라는 용어에 포함되는 것으로 간주되어야 한다. 디아바디와 같은 단일쇄 항체의 다른 형태도 포함된다. 디아바디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩타이드 쇄에서 발현되지만, 같은 쇄 상의 두 도메인 사이에 쌍이 이루어기에는 너무 짧은 링커를 사용하여 상기 도메인들이 다른 쇄의 상보성 도메인들과 쌍을 이루어 2개의 항원결합부분을 산출하는 2가의 이특이성 항체이다(예: Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R.J. et al.(1994) Structure 2: 1121-1123). 이러한 항체결합부는 당업계에 공지되어 있다(Kontermann and Dubel eds., Antibody Engineering(2001) Spring-Verlag. New York. 790 pp. (ISBN 3-540-41354-5)).
본 명세서에 사용된 "항체 작제물"이란 용어는 링커 폴리펩타이드 또는 면역글로불린 불변 도메인에 결합된 본 발명의 하나 이상의 항원결합부분을 포함하는 폴리펩타이드를 의미한다. 링커 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 연결된 2개 이상의 아미노산 잔기를 포함하고 하나 이상의 항원결합부분을 연결시키는데 사용된다. 이러한 링커 폴리펩타이드는 당업계에 공지되어 있다(예: Holliger, P., et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448l Poljak, R.J., et al.(1994) Structure 2: 1121-1123). 면역글로불린 불변 도메인은 중쇄 또는 경쇄 불변 도메인을 의미한다. 사람 IgG 중쇄 및 경쇄 도메인 아미노산 서열은 당업계에 공지되어 있고, 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pat00006
또한, 항체 또는 이의 항원결합부분은 하나 이상의 다른 단백질 또는 펩타이드와 상기 항체 또는 항체 부분의 공유 또는 비공유 결합에 의해 형성된, 더 큰 면역부착 분자의 일부분일 수 있다. 이러한 면역부착 분자의 예는 사량체성 scFv 분자를 제조하기 위한 스트렙타비딘 코어 영역의 사용(Kipriyanov, S.M., et al.(1995) Human Antibodies and Hybridomas 6: 93-101), 및 2가이며 비오틴화된 scFv 분자를 제조하기 위한 시스테인 잔기, 마커 펩타이드 및 C-말단 폴리히스티딘 태그의 사용(Kipriyanov, S.M. et al.(1994) Mol.Immunol. 31: 1047-1058)을 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편과 같은 항체 부분은 전체 항체를 각각 파파인 또는 펩신 분해와 같은 통상적인 기술을 이용해서 전체 항체로부터 제조할 수 있다. 또한, 항체, 항체 부분 및 면역부착 분자는 본 명세서에 기술된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 이용해서 수득할 수 있다.
본 명세서에 사용된 "분리된 항체"는 다른 항원 특이성을 보유하는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체를 의미하는 것으로 간주되어야 한다(예: hIL-13에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 hIL-13 외에 다른 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 실질적으로 없다). 하지만, hIL-13에 특이적으로 결합하는 분리된 항체는 다른 종 유래의 IL-13 분자와 같은 다른 항원과 교차반응성이 있을 수 있다. 또한, 분리된 항체는 다른 세포 물질 및/또는 화학성분이 실질적으로 없는 것일 수 있다.
본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는 사람 배선(germline) 면역글로불린 서열 유래의 가변 영역과 불변 영역을 보유하는 항체를 포함하는 것으로 간주되어야 한다. 본 발명의 사람 항체는 예컨대 CDR 및 특히 CDR3에 사람 배선 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않은 아미노산 잔기(예: 시험관내 무작위 또는 부위 특이적 돌연변이유발 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 하지만, 본 명세서에 사용된 "사람 항체"란 용어는, 마우스와 같은 다른 포유동물 종의 배선 유래의 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열에 이식된 항체를 포함하지 않는다.
본 명세서에 사용된 "재조합 사람 항체"란 용어는 재조합 수단에 의해 제조, 발현, 산출 또는 분리된 모든 사람 항체, 예컨대 숙주 세포에 형질감염된 재조합 발현 벡터에 의해 발현된 항체(이하, 섹션 II C에 상세히 기술됨), 재조합성 조합 사람 항체 라이브러리에서 분리된 항체(Hoogenboom H.R.,(1997) TIB Tech. 15: 62-70; Azzazy H., and Highsmith W.E., (2002) Clin. Biochem. 35: 425-445; Gavilondo J.V., and Larrick J.W.(2002) BioTechniques 29: 128-145; Hoogenboom H., and Chames P.(2000) Immunology Today 21: 371-378), 사람 면역글로불린 유전에 대해 돌연변이성인 동물(예: 마우스)로부터 분리된 항체(예: Taylor, L.D., et al.(1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295; Kellermann S-A., and Green L.L.(2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 593-597; Little M. et al(2000) Immunology Today 21: 364-370) 또는 다른 DNA 서열에 사람 면역글로불린 유전자 서열의 연결을 수반하는 임의의 다른 방법에 의해 제조, 발현, 산출 또는 분리된 항체를 포함하는 것을 의미한다. 이러한 재조합 사람 항체는 사람 배선 면역글로불린 서열 유래의 가변 영역과 불변 영역을 보유한다. 하지만, 특정 양태에서, 이러한 재조합 사람 항체는 시험관내 돌연변이유발(또는 사람 Ig 서열에 대해 돌연변이성인 동물이 사용될 때에는 생체내 체세포성 돌연변이유발)로 처리되어, 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 사람 배선 VH 및 VL 서열에서 유래되어 관련된 것이지만, 생체내 사람 항체 배선 레퍼토리에는 본래 존재하지 않을 수 있는 서열이다. 한가지 양태는 당업계에 공지된 기술, 예컨대, PCT 공개번호 WO 2005/007699 A2 (Jermutus et al.)에 개시된 것과 같은 사람 Ig 파지 라이브러리를 이용하여 생성시킬 수 있는 사람 IL-13에 결합할 수 있는 완전 사람 항체를 제공한다.
"키메라 항체"란 용어는 한 종 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열과 다른 종 유래의 불변 영역 서열을 포함하는 항체, 예컨대 사람 불변 영역에 결합된 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보유하는 항체를 의미한다.
"CDR 이식 항체"란 용어는 한 종에서 유래되는 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만, VH 및/또는 VL의 하나 이상의 CDR 영역의 서열들이 다른 종의 CDR 서열로 교체된 항체를 의미하는 것으로서, 예컨대 쥐 CDR의 하나 이상(예컨대, CDR3)이 사람 CDR 서열로 교체된 쥐 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 보유한 항체가 있다.
"사람화된 항체"란 용어는 사람을 제외한 종(예컨대, 마우스) 유래의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 서열을 포함하지만 VH 및/또는 VL 서열의 적어도 일부가 더 "사람과 유사하게", 즉 사람 배선 가변 서열과 더 유사한 서열로 변경된 항체를 의미한다. 사람화된 항체의 한가지 형태는 사람 CDR 서열이 대응하는 비-사람 CDR 서열을 대신하기 위하여 비-사람 VH 및 VL 서열로 도입된 CDR 이식 항체이다. 한가지 양태에서, 사람화된 항 사람 IL-13 항체 및 항원결합부분이 제공된다. 이러한 항체는 통상의 하이브리도마 기술을 이용하여 쥐 항-hIL-13 모노클로날 항체를 수득한 뒤, PCT 공개번호 WO 2005/123126 A2(Kasaian et al.)에 개시된 바와 같은 시험관내 유전자 조작을 이용한 사람화를 통해 제조했다.
용어 "카밧 번호매김(Kabat numbering)", "카밧 정의" 및 "카밧 표지화"는 호환적으로 본원에서 사용된다. 당해 분야에서 공인되어 있는 상기 용어들은 항체 또는 이의 항원결합부분의 중쇄 및 경쇄 가변 영역에서 다른 아미노산 잔기 보다 더 가변적인(즉, 초가변성) 아미노산 잔기의 번호를 매기는 시스템을 의미한다[Kabat et al. (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190: 382-391 and, kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242]. 중쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 31 내지 35번 위치, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56번 위치, 및 CDR3에 있어서 아미노산 95 내지 102번 위치의 범위이다. 경쇄 가변 영역에 있어서, 초가변 영역은 CDR1에 있어서 아미노산 24 내지 34번 위치, CDR2에 있어서 아미노산 50 내지 56번 위치, 및 CDR3에 있어서 아미노산 89 내지 97번 위치의 범위이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "어셉터" 및 "어셉터 항체"는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공하는 항체 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 언급한다. 몇몇 양태에서, 용어 "어셉터"는 불변 영역(들)을 제공하는 항체 아미노산 또는 이를 암화화하는 핵산 서열을 언급한다. 또 다른 양태에서, 용어 "어셉터"는 하나 이상의 프레임워크 영역 및 불변 영역(들)을 제공하는 항체 아미노산 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 언급한다. 특정 양태에서, 용어 "어셉터"는 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열을 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 100%를 제공하는 사람 항체 아미노산 또는 이를 암호화하는 핵산 서열을 언급한다. 당해 양태에 따라, 어셉터는 사람 항체의 하나 이상의 특정 위치에 존재하지 않는 1개 이상, 2개 이상, 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상 또는 10개 이상의 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 어셉터 프레임워크 영역 및/또는 어셉터 불변 영역(들)은 예를 들어, 배선 항체 유전자, 성숙 항체 유전자, 기능성 항체(예를 들어, 당업계에 널리 공지된 항체, 개발중인 항체 또는 시판되는 항체)로부터 유래되거나 수득될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "CDR"은 항체 가변 서열내 상보성 결정 영역을 언급한다. 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 영역에는 3개의 CDR이 있고 가변 영역 각각에 대해 CDR1, CDR2 및 CDR3으로서 명명된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "CDR 세트"는 항원에 결합할 수 있는 단일 가변 영역내 존재하는 3개의 CDR 그룹을 언급한다. 이들 CDR의 정확한 경계선은 상이한 시스템에 따라 상이하게 정의되었다. 문헌[Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987) and (1991)]에 기재된 시스템은 항체의 임의의 가변 영역에 적용될 수 있는 명확한 잔기 번호매김 시스템을 제공할 뿐만 아니라 3개의 CDR을 한정하는 정확한 잔기 경계선을 제공한다. 이들 CDR은 카밧 CDR로서 언급될 수 있다. 문헌[Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 및 Chothia et al., Nature 342:877-883 (1989)]에서는, 아미노산 서열 수준에서 다양성이 크다 할지라도 카밧 CDR내에 특정 하위부위(sub-portion)는 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 취하고 있음을 밝혔다. 이들 하위부위는 L1, L2 및 L3 또는 H1, H2 및 H3으로서 명명되었고 여기서, "L" 및 "H"는 각각 경쇄 및 중쇄 영역을 지칭한다. 이들 영역은 초티아(Chothia) CDR로서 언급될 수 있고 이는 카밧 CDR과 중복되는 경계선을 갖는다. 카밧 CDR과 중복하는 CDR을 한정하는 또 다른 경계선은 문헌[Padlan, FASEB J. 9:133-139 (1995) 및 MacCallum, J Mol Biol 262(5):732-45 (1996)]에 기재되어 있다. 또 다른 CDR 경계선 한정은 상기 시스템중 하나를 엄격하게 따르지는 않지만, 특정 잔기 또는 잔기 그룹 또는 심지어 전체 CDR이 항원 결합에 영향주지 않는다는 예측 또는 실험적 발견의 측면에서 이들이 단축되거나 연장될 수 있다 하더라도 카밧 CDR과 중복된다. 본원에 사용된 방법은 당해 시스템 중 어느 하나에 따라 정의된 CDR을 사용할 수 있지만 바람직한 양태는 카밧 또는 초티아 한정된 CDR을 사용하는 것이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "표준(canonical)" 잔기는 문헌[Chothia et al., J. Mol. <155> Biol. 196:901-907(1987); Chothia et al., J. Mol. Biol. 227:799 (1992); 이 둘다는 본원에 참조로서 인용된다]에 정의된 바와 같은 특정 표준 CDR 구조를 한정하는 CDR 또는 프레임워크내 잔기를 언급한다. 초티아 등에 따르면 많은 항체의 CDR의 결정적인 부위는, 아미노산 서열의 수준에서는 다양성이 크다 할지라도 거의 동일한 펩타이드 골격 형태를 갖는다. 각각의 표준 구조는 주로 루프를 형성하는 아미노산 잔기의 연속 절편에 대해 펩타이드 골격 비틀림각의 세트를 특정한다.
본원에 사용된 바와 같은, 용어 "공여자(donor)" 및 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 항체를 언급한다. 바람직한 양태에서, 공여자 항체는 프레임워크 영역이 수득되거나 유래되는 항체와 다른 종 기원의 항체이다. 사람화된 항체와 관련하여, 용어 "공여자 항체"는 하나 이상의 CDR을 제공하는 비-사람 항체를 언급한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "프레임워크(framework)" 또는 "프레임워크 서열"은 CDR을 제외한 가변 영역의 나머지 서열을 언급한다. CDR 서열의 정확한 정의는 상이한 시스템에 의해 결정될 수 있기 때문에, 프레임워크 서열의 의미는 이에 따라 상이하게 해석된다. 6개의 CDR (경쇄의 CDR-L1, -L2, 및 -L3 및 중쇄의 CDR-H1, -H2, 및 -H3)은 또한 경쇄 또는 중쇄상의 프레임워크 영역을 각 쇄상에 4개의 서브-영역(FR1, FR2, FR3 및 FR4)으로 나누고 여기서, CDR1은 FR1과 FR2 사이에 위치되고, CDR2는 FR2와 FR3 사이에 위치되고 CDR3은 FR3과 FR4 사이에 위치된다. FR1, FR2, FR3 또는 FR4로서 특정 서브-영역으로 특정화하는 것 없이, 다른 사람들에 의해 언급되는 것처럼 프레임워크 영역은 단일의 천연 면역글로불린 쇄의 가변 영역내에 조합 FR을 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같은 FR은 4개의 서브-영역중 하나를 나타내고 FR들은 프레임워크 영역을 구성하는 4개의 서브-영역중 2개 이상을 나타낸다.
사람 중쇄 및 경쇄 어셉터 서열은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 한가지 양태에서, 사람 중쇄 및 경쇄 어셉터 서열은 표 3 및 표 4에 기재된 서열로부터 선택된다.
[표 3]
Figure pat00007
[표 4]
Figure pat00008
본원에 사용된 바와 같은, "배선 항체 유전자" 또는 "유전자 단편"은 특정 면역글로불린의 발현을 위해 유전자 재배열 및 돌연변이를 유발하는 성숙 과정을 거치지 않는 비-림프성 세포에 의해 암호화된 면역글로불린 서열을 언급한다[Shapiro et al., Crit. Rev. Immunol. 22(3): 183-200 (2002); Marchalonis et al., Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001)]. 본 발명의 다양한 양태에 의해 제공되는 이점중 하나는 배선 항체 유전자가 성숙 항체 유전자 보다 종에서 개체에 특징적인 필수 아미노산 서열 구조를 보존할 가능성이 높음에 따라 당해 종에서 치료학적으로 사용되는 경우 외래 공급원으로서 인지될 가능성이 낮다는 사실에 기인한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "주요" 잔기는 항체, 특히 사람화된 항체의 결합 특이성 및/또는 친화성에 보다 많은 영향력을 갖는 가변 영역내 특정 잔기를 언급한다. 주요 잔기는 하나 이상의 하기 잔기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다: CDR에 인접한 잔기, 잠재적인 글리코실화 부위 (N- 또는 O-글리코실화 부위일 수 있다), 희귀 잔기, 항원과 상호작용할 수 있는 잔기, CDR과 상호작용할 수 있는 잔기, 표준 잔기, 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역 사이의 접촉 잔기, 버니어 영역내 잔기 및 가변 중쇄 CDR1의 초티아 정의와 제1 중쇄 프레임워크의 카밧 정의간에 중복되는 영역내 잔기.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "사람화된 항체"는 목적하는 항원과 면역특이적으로 결합하고 실질적으로 사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 프레임워크(FR) 영역 및 실질적으로 비-사람 항체의 아미노산 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함하는 항체 또는 이의 변이체, 유도체, 유사체 또는 단편이다. CDR과 관련하여 본원에 사용된 바와 같은 용어 "실질적으로"는 비-사람 항체 CDR과 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상 또는 99% 이상 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 언급한다. 사람화된 항체는 실질적으로 하나 이상 및 전형적으로 2개의 가변 도메인(Fab, Fab', F(ab')2, FabC, Fv)를 포함하고 여기서, CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비-사람 면역글로불린(즉, 공여자 항체)의 CDR에 상응하고 프레임워크 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 사람 면역글로불린 컨센서스 서열의 CDR이다. 바람직하게, 사람화된 항체는 또한 사람 면역글로불린의 전형적인 영역인 면역글로불린 불변 영역(Fc)의 하나 이상의 부분을 포함한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 적어도 중쇄의 가변 도메인 뿐만 아니라 경쇄 둘다를 함유한다. 당해 항체는 또한 중쇄의 CH1, 힌지, CH2, CH3 및 CH4 영역을 포함할 수 있다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 사람화된 경쇄만을 함유한다. 몇몇 양태에서, 사람화된 항체는 사람화된 중쇄만을 함유한다. 특정 양태에서, 사람화된 항체는 경쇄 및/또는 사람화된 중쇄의 사람화된 가변 도메인만을 함유한다.
사람화된 항체는 IgM, IgG, IgD, IgA 및 IgE를 포함하는 임의의 부류의 면역글로불린, 및 제한 없이 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는 임의의 이소형으로부터 선택될 수 있다. 사람화된 항체는 하나 이상의 부류 또는 이소형 기원의 서열을 포함할 수 있고 특정 불변 도메인은 당업계에 널리 공지된 기술을 사용하여 목적하는 효과기 기능을 최적화하기 위해 선택될 수 있다.
사람화된 항체의 프레임워크 및 CDR 영역은 정확하게 모 서열, 예를 들어, 공여자 항체 CDR과 정확하게 상응할 필요가 없거나 컨센서스 프레임워크는 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 삽입 및/또는 결실에 의해 돌연변이되어 당해 부위의 CDR 또는 프레임워크 잔기는 공여자 항체 또는 컨센서스 프레임워크에 상응하지 않는다. 바람직한 양태에서, 그러나 당해 돌연변이는 광범위하지 않다. 사람화된 항체 잔기의 보통 80% 이상, 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상 및 가장 바람직하게는 95% 이상은 모 FR 및 CDR 서열에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "컨센서스 프레임워크"는 컨센서스 면역글로불린 서열내 프레임워크 영역을 언급한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "컨센서스 면역글로불린 서열"은 관련 면역글로불린 서열 계열에서 가장 흔하게 존재하는 아미노산(또는 뉴클레오타이드)로부터 형성된 서열을 언급한다(Winnaker, From Genes to Clones (Verlagsgesellschaft, Weinheim, Germany 1987). 면역글로불린 계열에서, 컨센서스 서열내 각 위치는 당해 계열내 당해 위치에서 가장 흔하게 존재하는 아미노산이 차지한다. 2개의 아미노산이 동등하게 흔하게 존재하는 경우, 둘 중 하나가 컨센서스 서열에 포함될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "버니어" 영역은 문헌[Foote and Winter (1992, J. Mol. Biol. 224:487-499, 이는 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 바와 같이 항원에 맞도록 CDR 구조를 조정하고 세밀하게 가공될 수 있는 프레임워크 잔기의 서브세트를 언급한다. 버니어 영역 잔기는 CDR을 지탱하는 층을 형성할 수 있고 CDR의 구조 및 항체의 친화성에 영향을 줄 수 있다.
본 명세서에 사용된 "다가 결합 단백질"이란 용어는 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질을 의미하는 것이다. 다가 결합 단백질은 3개 이상의 항원 결하 부위를 보유하도록 조작된 것이 바람직하고, 일반적으로 자연 발생의 항체가 아니다. "다특이성 결합 단백질"이란 용어는 2개 이상의 관련 표적 또는 무관련 표적에 결합할 수 있는 결합 단백질을 의미한다. 본 명세서에 사용된, 이중 가변 도메인(DVD) 결합 단백질은 2개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 결합 단백질이고 4가 또는 다가 결합 단백질이다. 이러한 DVD는 단일특이성, 즉 하나의 항원에 결합할 수 있는 것이거나, 또는 다특이성, 즉 2개 이상의 항원에 결합할 수 있는 것이다. 2개의 중쇄 DVD 폴리펩타이드의 2개의 경쇄 DVD 폴리펩타이드를 포함하는 DVD 결합 단백질은 DVD Ig이라 한다. DVD Ig의 절반은 각각 중쇄 DVD 폴리펩타이드와 경쇄 DVD 폴리펩타이드, 및 2개의 항원 결합 부위를 포함한다. 각 결합 부위는 중쇄 가변 도메인과 경쇄 가변 도메인을 포함하고 항원 결합 부위마다 항원 결합에 관여하는 CDR이 총 6개 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "중화"는 결합 단백질이 사이토카인에 특이적으로 결합하는 경우 사이토카인의 생물학적 활성을 중화시킴을 언급한다. 바람직하게, 중화 결합 단백질은 hIL-13 및/또는 hIL-13에 결합하여 hIL-13 및/또는 hIL-13의 생물학적 활성을 억제하는 중화 항체이다. 바람직하게, 중화 결합 단백질은 hIL-13 및/또는 hIL-13에 결합하여 약 20% 이상, 40% 이상, 60% 이상, 80% 이상 또는 85% 이상으로 IL-13 및/또는 hIL-13의 생물학적 활성을 감소시킨다. 중화 결합 항체에 의한 hIL-13 및/또는 hIL-13의 생물학적 활성의 억제는 당업계에 널리 공지된 hIL-13 및/또는 hIL-13 생물학적 활성에 대한 하나 이상의 지표를 측정함에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 사람 IL-13에 의해 유도된, A-549 세포에 의한 TARC(CCL-17) 생산의 억제(실시예 1.1.C 참조).
용어 "활성"은 항원에 대한 항체, 예를 들어, IL-13 항원에 결합하는 항-hIL-13 항체의 결합 특이성/친화성, 및/또는 항체, 예를 들어, hIL-13에 결합하여 hIL-13의 생물학적 활성을 억제하는 항-hIL-13 항체의 중화 효능, 예컨대 A-549 세포에 의한 TARC(CCL-17)의 사람 IL-13 유도적 생산의 억제(실시예 1.1.C 참조)와 같은 활성을 포함한다.
"에피토프"란 용어는 면역글로불린 또는 T-세포 수용체에 특이적 결합이 가능한 임의의 폴리펩타이드 결정기를 포함한다. 특정 양태에서, 에피토프 결정기에는 아미노산, 당 측쇄, 포스포릴 또는 설포닐과 같은 분자의 화학적 활성 표면 기가 포함되고, 다른 특정 양태에서는 특이적인 입체 구조 특징, 및/또는 특이적 하전 특징을 갖는 것일 수 있다. 에피토프는 항체에 의해 결합되는 항원의 영역이다. 특정 양태에서, 항체는 단백질 및/또는 거대분자의 복합 혼합물에서 자신의 표적 항원을 우선적으로 인식할 때 항원에 특이적으로 결합한다고 한다.
본 명세서에 사용된 "표면 플라즈몬 공명"이란 용어는 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 등을 이용하여 바이오센서 매트릭스 내의 단백질 농도의 변경을 검출하여 생체특이적 상호작용을 실시간 분석할 수 있는 광학적 현상을 의미한다. 이에 대한 상세한 설명은 문헌[Jonsson, U., et al. (1993) Ann. Biol. Clin. 51: 19-26; Jonsson, U., et al. (1991) Biotechniques 11: 620-627; Johnsson, B., et al.(1995) J. Mol. Recognit. 8: 125-131; 및 Johnnson, B., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277]에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 "kon"이란 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체를 형성하기 위한 항원에 대한 항체의 결합을 나타내는 결합속도상수(on rate constant)를 의미하는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "koff"란 용어는 당업계에 공지된 바와 같이 항체/항원 복합체로부터 항체의 해리를 나타내는 해리속도상수(off rate constant)를 의미하는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "KD"란 용어는 당업계에 공지된 바와 같은 특정 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 의미하는 것으로 간주한다.
본 명세서에 사용된 "표지된 결합 단백질"이란 용어는 결합 단백질을 식별할 수 있게 하는 표지(label)가 혼입되어 있는 단백질을 의미한다. 표지는 검출가능한 마커, 예컨대 방사성동위원소 아미노산의 혼입 또는 표식된 아비딘에 의해 검출될 수 있는 비오틴 잔기(예컨대, 광학 또는 비색법으로 검출할 수 있는 형광 마커 또는 효소 활성을 포함하는 스트렙타비딘)의 폴리펩타이드에 대한 부착인 것이 바람직하다. 폴리펩타이드에 대한 표지의 예에는 다음과 같은 것이 있으나, 이에 국한되지 않는다: 방사능동위원소 또는 방사성핵종(예: 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 및 153Sm); 형광 표지(예를 들어, FITC, 로다민, 란타니드 인광체), 효소 표지(예: 양고추냉이 퍼옥시다제, 루시퍼라제, 알칼리성 포스파타제); 화학발광 마커; 비오틴 기; 2차 리포터에 의해 인식되는 소정의 폴리펩타이드 에피토프(예컨대, 류신 지퍼 쌍 서열, 2차 항체에 대한 결합 부위, 금속 결합 도메인, 에피토프 태그); 및 자성 제제, 예컨대 가돌리늄 킬레이트.
"항체 접합체"란 용어는 제2 화학 잔기, 예컨대 치료제 또는 세포독성제에 화학적으로 결합된 결합 단백질을 의미한다. 본 명세서에 사용된 "제제"라는 용어는 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 또는 생물학적 물질로부터 제조된 추출물을 의미한다. 바람직하게는, 치료제 또는 세포독성제는 백일해 독소, 탁솔, 시토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이의 유사체 또는 동족체가 포함되나, 이에 국한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "결정" 또는 "결정화된"은 결정 형태로 존재하는 항체 또는 항원 결합부를 의미한다. 결정은 고체 상태의 물질의 한가지 형태로서, 무정형 고체 상태 또는 액정 상태와 같은 다른 형태와 상이하다. 결정은 원자, 이온, 분자(예: 항체와 같은 단백질) 또는 분자 어셈블리(예: 항원/항체 복합체)의 규칙적이고 반복적인 입체 배열로 구성된다. 이러한 입체 배열은 당업계에 공지된 특이적인 수학적 관계에 따라 배열된다. 결정 중에서 반복되는 기본 유닛 또는 빌딩 블록은 비대칭 유닛이라 한다. 배열내 비대칭 유닛의 반복은 분명한 소정의 결정학적 대칭과 일치하게 하여 결정의 "유닛 셀"을 제공한다. 모든 3차원에서 규칙적 해독에 의한 유닛 셀의 반복은 결정을 제공한다[Giege, R. and Ducruix, A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a Practical Approach, 2nd ea., pp. 20 1-16, Oxford University Press, New York, New York (1999)].
본 명세서에 사용된 "폴리뉴클레오타이드"란 용어는 2개 이상의 뉴클레오타이드의 중합체 형태를 의미하는 것으로서, 리보뉴클레오타이드이거나 데옥시리보뉴클레오타이드 또는 어느 한 뉴클레오타이드의 변형된 형태를 의미한다. 이 용어에는 일본쇄 및 이본쇄 형태의 DNA가 포함되지만, 이본쇄 DNA인 것이 바람직하다.
본 명세서에 사용된 "분리된 폴리뉴클레오타이드"란 용어는 폴리뉴클레오타이드(예컨대, 게놈, cDNA 또는 합성 기원 또는 이의 일부 조합)를 의미하는데, 그 기원에 따라서, "분리된 폴리뉴클레오타이드"는 자연에서 발견되는 "분리된 폴리뉴클레오타이드"의 폴리뉴클레오타이드 전부 또는 일부와 관련되어 있지 않거나, 자연에서는 결합되지 않았던 폴리뉴클레오타이드에 작동가능하게 결합되거나; 또는 더 큰 서열의 일부로서 자연에서 발생되지 않는 폴리뉴클레오타이드이다.
본 명세서에 사용된 "벡터"라는 용어는 결합된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로 간주한다. 벡터의 한가지 형태는 추가 DNA 분절이 연결될 수 있는 원형의 이본쇄 DNA 루프를 의미하는 "플라스미드"이다. 다른 형태의 벡터는 추가 DNA 분절이 바이러스 게놈에 연결될 수 있는 바이러스 벡터이다. 특정 벡터는 도입된 숙주 세포에서 자율 복제할 수 있다(예컨대, 세균 복제 기원을 보유한 세균 벡터 및 에피좀성 포유동물 벡터). 다른 벡터(예컨대, 비에피좀성 포유동물 벡터)는 숙주 세포에 도입 시 숙주 세포의 게놈으로 통합될 수 있고, 이로써 숙주 게놈에 따라 복제된다. 더욱이, 특정 벡터는 작동가능하게 결합된 유전자의 발현을 유도할 수 있다. 이러한 벡터는 본 명세서에서 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히 "발현 벡터")라 한다. 일반적으로 재조합 DNA법에 유용한 발현 벡터는 흔히 플라스미드 형태이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문에 대체될 수 있다. 하지만, 본 발명은 동등한 기능을 하는 바이러스 벡터와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다.
"작동가능하게 결합된"이란 용어는 기술된 성분이 의도한 방식대로 기능할 수 있는 관계에 있는 병치 상태를 의미한다. 암호화 서열에 "작동가능하게 결합된" 조절 서열은 암호화 서열의 발현이 조절 서열에 적합한 조건 하에서 수행되도록 연결된다. "작동가능하게 결합된" 서열에는 당해 유전자에 근접한 발현 조절 서열 번호 및 당해 유전자를 조절하기 위하여 트랜스로 작용하거나 일정 거리에 있는 발현 조절 서열이 포함된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "발현 조절 서열"이란 용어는 이들이 연결된 암호화 서열의 발현과 프로세싱을 수행하는데 필요한 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 발현 조절 서열에는 적당한 전사 개시, 종결, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화 시그날과 같은 효율적인 RNA 프로세싱 시그날; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 해독 효율을 증강시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 증강시키는 서열; 필요한 경우 단백질 분비를 증강시키는 서열 등이 포함된다. 이러한 조절 서열의 성질은 숙주 유기체에 따라 다르며, 원핵생물인 경우, 이러한 조절 서열에는 일반적으로 프로모터, 리보좀 결합 부위 및 전사 종결 서열이 있고; 진핵생물인 경우, 이러한 조절 서열에는 프로모터 및 전사 종결 서열이 있다. "조절 서열"이란 용어는 그 존재가 발현 및 프로세싱에 필수적인 성분을 포함하는 것으로 간주하고, 리더 서열 번호 및 융합 파트너 서열과 같이 그 존재가 유리한 추가성분을 포함할 수도 있다. 본 발명의 단백질 작제물은 발현 카세트, 벡터, 재조합 숙주 세포 및 단일 개방 판독 프레임 유래의 재조합 폴리프로테인 및 프리프로테인의 재조합 발현 및 단백분해 가공하는 방법 등, 당업계에 공지된 발현 벡터와 숙주 세포를 이용하여 발현시켜 정제할 수 있다(본 명세서에 참고 인용된 WO 2007/014162 참조).
본 명세서에 정의된 바와 같은 "형질전환"은 외인성 DNA가 숙주 세포로 유입되는 임의의 과정을 의미한다. 형질전환은 당업계에 공지된 다양한 방법을 사용하여 자연 또는 인공 조건 하에서 실시될 수 있다. 형질전환은 이종 핵산 서열을 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포로 삽입하기 위한 임의의 공지된 방법에 따라 달라질 수 있다. 이러한 방법은 형질전환되는 숙주 세포에 따라 선택되는데, 그 예로는 바이러스 감염, 전기천공, 리포펙션 및 입자 충격이 있으나, 이에 국한되지는 않는다. 이러한 "형질전환된" 세포는 삽입된 DNA가 자율 복제성 플라스미드로서 또는 숙주 염색체의 일부로서 복제할 수 있는 안정적으로 형질감염된 세포를 포함한다. 또한, 이들 세포는 삽입된 DNA 또는 RNA를 한정된 시간 동안 일시적으로 발현하는 세포도 포함한다.
본 명세서에 사용된 "재조합 숙주 세포"(또는 간단히 "숙주 세포")란 용어는 외인성 DNA가 도입된 세포를 의미하는 것으로 간주한다. 이러한 용어는 특정 피검체 세포뿐만 아니라 이 세포의 자손도 의미하는 것으로 간주되어야 한다. 후속 세대에는 돌연변이 또는 환경적 영향으로 인해 특정 변형이 일어날 수 있기 때문에, 상기 자손은 사실상 모세포와 동일하지 않지만 본 명세서에 사용된 "숙주 세포"란 용어의 범위에는 포함되는 것으로 간주한다. 숙주 세포는 임의의 생물계에서 선택되는 원핵생물 및 진핵생물 세포를 포함하는 것이 바람직하다. 바람직한 진핵생물 세포에는 원생생물, 진균, 식물 및 동물 세포가 포함된다. 가장 바람직한 숙주 세포는 원핵생물 세포주 이.콜라이(E. coli); 포유동물 세포주 CHO, HEK 293 및 COS; 곤충 세포주 Sf9; 및 진균 세포 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함하며, 이에 국한되지는 않는다.
재조합 DNA, 올리고뉴클레오타이드 합성 및 조직 배양과 형질전환(예: 전기천공, 리포펙션)에는 표준 기술을 사용할 수 있다. 효소 반응과 정제 기술은 제조업자의 지침에 따라 수행하거나 당업계에서 일반적으로 수행하는 바와 같이 또는 본 명세서에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 상기 기술 및 절차들은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 또는 본 명세서에서 인용되고 논의된 각종 일반 문헌 및 특정 문헌들에 기술된 바와 같이 일반적으로 수행할 수 있다[본원에 임의의 목적상 참고인용된 문헌 Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989) 참조].
당업계에 공지되고 본 명세서에 사용된 바와 같은 "유전자도입(transgenic) 유기체"란 용어는 도입유전자(transgene)를 포함하는 세포를 가진 유기체를 의미하는 것으로서, 유기체(또는 이 유기체의 선조)에 도입된 도입유전자는 유기체에서 자연 발현되지 않는 폴리펩타이드를 발현한다. "도입유전자"는 유전자도입 유기체가 발생하는 세포의 게놈으로 안정적이고 작동가능하게 통합되어, 유전자도입 유기체의 하나 이상의 세포 형태 또는 조직에서 암호화된 유전자 산물의 발현을 유도하는 DNA 작제물이다.
본 명세서에 사용된 "조절하다" 및 "조정하다"란 용어는 당해 분자의 활성(즉, hIL-13의 생물학적 활성)에 있어서 변화 또는 변경을 의미한다. 조절은 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도에 있어서의 증가 또는 감소일 수 있다. 분자 활성 및 기능의 예에는 결합 특징, 효소 활성, 세포 수용체 활성화 및 시그날 전달 등이 있으나, 이에 국한되지는 않는다.
마찬가지로, 본 명세서에 사용된 "조절인자"란 용어는 당해 분자의 활성 또는 기능(즉, hIL-13의 생물학적 활성)을 변화 또는 변경시킬 수 있는 화합물이다. 예를 들어, 조절인자는 이 조절인자의 부재 시 관찰되는 활성 또는 기능의 정도에 비교했을 때 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도에 있어서의 증가 또는 감소를 유발할 수 있다. 특정 양태에서, 조절인자는 분자의 하나 이상의 활성 또는 기능의 정도를 감소시키는 억제제이다. 억제제의 예에는 단백질, 펩타이드, 항체, 펩티바디(peptibody), 탄수화물 또는 유기 소분자가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 펩티바디는 WO 01/83525 등에 기술되어 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "효능제(agonist)"란 용어는 당해 분자와 접촉했을 때 효능제의 부재 시 관찰되는 활성 또는 기능의 정도와 비교하여 당해 분자의 특정 활성 또는 기능의 정도에 있어서의 증가를 유발하는 조절인자를 의미한다. 당해 효능제의 구체예에는 IL-13 폴리펩타이드 또는 hIL-13에 결합하는 폴리펩타이드, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자가 포함될 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 "길항제" 또는 "억제제"란 용어는 당해 분자와 접촉했을 때, 길항제의 부재 시 관찰되는 활성이나 기능의 정도와 비교하여 당해 분자의 특정 활성이나 기능의 정도에 있어서의 감소를 유발하는 조절인자를 의미한다. 당해 길항제의 구체예에는 hIL-13 및/또는 hIL-13의 생물학적 또는 면역학적 활성을 차단 또는 조절하는 물질이 포함된다. hIL-13 및/또는 hIL-13의 길항제 및 억제제에는 hIL-13 및/또는 hIL-13에 결합하는 단백질, 핵산, 탄수화물 또는 임의의 다른 분자가 포함되나, 이에 국한되지는 않는다.
"수용체에 대한 결합을 억제한다"란 용어는 하나 이상의 IL-13의 수용체에 대한 IL-13의 결합을 방해하는 결합 단백질의 능력을 의미한다. 이러한 수용체에 대한 결합 억제는 IL-13의 이의 수용체 또는 수용체들에 대한 결합을 통해 매개되는 생물학적 활성을 감소시키거나 제거할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "유효량"은 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 경감시키거나 완화시키거나 장애의 진행을 차단하거나, 장애를 퇴화시키거나, 재발, 발병, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 개시 또는 진행을 차단하거나, 장애를 검출하거나 또 다른 치료의 예방학적 또는 치료학적 효과(예를 들어, 예방학적 또는 치료학적 제제)를 증진시키거나 개선시키는데 충분한 치료양을 언급한다.
본 명세서에 사용된 "시료"란 용어는 가장 광범위한 의미로 사용되고 있다. 본 명세서에 사용된 "생물학적 시료"는 살아있거나 살아있었던 생물체에서 유래하는 임의의 양의 물질을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 생물체에는 사람, 마우스, 래트, 원숭이, 개, 토끼 및 다른 동물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 물질에는 혈액, 혈청, 뇨, 윤활액, 세포, 장기, 조직, 골수, 림프절 및 비장이 있으나, 이에 국한되지 않는다.
I. 사람 IL-13에 결합하는 항체
본 발명의 제1 측면은 고 친화성, 느린 해리 속도 및 고 중화 효능으로 IL-13에 결합하는 분리된 쥐 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합부위를 제공한다. 본 발명의 제2 측면은 IL-13에 결합하는 키메라 항체를 제공한다. 본 발명의 제3 측면은 IL-13에 결합하는 사람화된 항체 또는 이의 항원결합부분을 제공한다. 바람직하게는, 상기 항체 또는 이의 일부는 분리된 항체이다. 바람직하게는, 본 발명의 항체는 중화성 사람 항-IL-13 및/또는 사람 항-IL-13 항체이다.
A. 항 IL-13 항체의 제조 방법
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 다수의 기술중 어느 것에 의해 제조될 수 있다.
1. 하이브리도마 기술을 사용한 항-IL-13 모노클로날 항체
모노클로날 항체는 하이브리도마, 재조합 및 파아지 디스플레이 기술 또는 이의 조합을 포함하는 당업계에 공지된 광범위한 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 기술을 포함하여, 예컨대 문헌[Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988; Hammerling, et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, Elsevier, N.Y., 1981 (본 문헌은 이의 전반전인 내용이 본원에 참조로서 인용된다)]에 교시된 하이브리도마 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "모노클로날 항체"는 하이브리도마 기술을 통해 생산된 항체에 제한되지 않는다. 용어 "모노클로날 항체"는 임의의 진핵, 원핵 또는 파아지 클론을 포함하여 단일 클론으로부터 유래되지만 이를 생성시키는 방법에 의해 유래되지 않는 항체를 언급한다.
하이브리도마 기술을 사용한 특정 항체에 대한 생산 및 스크리닝 방법은 당업계에서 통상적이고 널리 공지되어 있다. 한가지 양태에서, 본 발명은 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마 세포를 배양함을 포함하는 방법에 의해 생산되는 항체 뿐만 아니라 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공하고, 여기서 바람직하게 하이브리도마는 골수종 세포와, 본 발명의 항원으로 면역화된 마우스로부터 분리된 비장세포를 융합시킴에 이어서 본 발명의 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체를 분비하는 하이브리도마 클론에 대한 융합으로부터 비롯되는 하이브리도마를 스크리닝함에 의해 제조된다(실시예 1.2 참조). 간략히 설명하면, 마우스는 IL-13 항원으로 면역화될 수 있다. 바람직한 양태에서, IL-13 항원은 애주번트(adjuvant)와 함께 투여되어 면역 반응을 자극시킨다. 당해 애주번트는 완전 또는 불완전 프로인트 애주번트, RIBI(무라밀 디펩타이드) 또는 ISCOM (면역자극 복합체)를 포함한다. 당해 애주번트는 이를 국소 침적물에 은폐시켜 폴리펩타이드가 신속하게 분산되는 것을 방지시킬 수 있거나 이들은 숙주를 자극하여 대식세포에 대한 화학주성 인자 및 면역계의 기타 성분을 분비시키는 물질을 함유할 수 있다. 바람직하게, 폴리펩타이드가 투여되는 경우, 면역화 스케줄은 몇주동안에 걸쳐 2회 이상의 폴리펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.
IL-13 항원으로 동물을 면역화시킨 후, 이 동물로부터 항체 및/또는 항체 생산 세포를 수득할 수 있다. 항-IL-13 항체-함유 혈청은 당해 동물로부터 채혈하거나 희생시켜 수득된다. 혈청은 동물로부터 수득되는 것으로 사용할 수 있거나, 이 혈청으로부터 면역글로불린 분획을 수득하거나, 혈청으로부터 항-IL-13 항체를 정제할 수 있다. 당해 방식으로 수득된 혈청 또는 면역글로불린은 폴리클로날이므로, 일련의 이종 성질을 갖는다.
일단 면역 반응이 검출되면, 예를 들어, 항원 IL-13에 특이적인 항체가 마우스 혈청에서 검출되면 마우스 비장을 수거하고 비장 세포를 분리한다. 이어서 비장 세포는 널리 공지된 기술로 임의의 적합한 골수종 세포, 예를 들어, ATCC로부터 입수가능한 세포주 SP20 유래의 세포와 융합시킨다. 하이브리도마를 선별하고 한계 희석법으로 클로닝한다. 이어서 하이브리도마 클론은 IL-13과 결합할 수 있는 항체를 분비하는 세포에 대해 당업계에 공지된 방법으로 분석한다. 일반적으로 고수준의 항체를 함유하는 자낭액은 마우스를 양성 하이브리도마 클론으로 면역화시킴에 의해 생산될 수 있다.
또 다른 양태에서, 항체 생산 불멸화된 하이브리도마는 면역화된 동물로부터 제조될 수 있다. 면역화 후, 동물을 희생시키고 당업계에 널리 공지된 바와 같이 비장 B 세포를 불멸화된 골수종 세포와 융합시킨다[Harlow and Lane, 상기 동일 문문헌 참조]. 바람직한 양태에서, 골수종 세포는 면역글로불린 폴리펩타이드(비-분비 세포주)를 분비하지 않는다. 융합 및 항생제 선별 후, 하이브리도마는 IL-13 또는 이의 일부 또는 IL-13을 발현하는 세포를 사용하여 스크리닝한다. 바람직한 양태에서, 초기 스크리닝은 효소-결합된 면역분석(ELISA) 또는 방사선면역분석법(RIA), 바람직하게는 ELISA를 사용하여 수행한다. ELISA의 예는 본원에 참조로서 인용되는 WO 00/37504에 제공된다.
항-IL-13 항체 생산 하이브리도마는 하기에 추가로 논의되는 바와 같이 선별하고 클로닝하고, 강한 하이브리도마 성장, 고 항체 생산 및 목적하는 항체 특성을 포함하는 목적하는 특성에 대해 추가로 스크리닝한다. 하이브리도마는 동일유전자계 동물, 면역계가 결핍된 동물, 예를 들어, 누드 마우스와 같은 생체내에서 또는 시험관내 세포 배양에서 배양하고 증식시킬 수 있다. 하이브리도마를 선별하고 클로닝하고 증식시키는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있다.
바람직한 양태에서, 하이브리도마는 상기 논의된 바와 같이 마우스 하이브리도마이다. 또 다른 바람직한 양태에서, 하이브리도마는 래트, 양, 돼지, 염소, 소 또는 말과 같은 비-사람, 비-마우스 종에서 제조된다. 또 다른 양태에서, 하이브리도마는 사람 하이브리도마이고 이때 사람 비-분비 골수종이 항-IL-13 항체를 발현하는 사람 세포와 융합된다.
특정 에피토프를 인지하는 항체 단편은 공지된 기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F(ab')2 단편은 파파인(Fab 단편 제조시) 또는 펩신(F(ab')2 단편 제조시)과 같은 효소를 사용하여, 면역글로불린 분자의 단백질 분해 절단에 의해 제조될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 영역, 경쇄 불변 영역 및 중쇄의 CHI 도메인을 포함한다.
2. SLAM을 사용한 항-IL-13 모노클로날 항체
본 발명의 또 다른 측면에서, 재조합 항체는 문헌[미국특허 5,627,052, PCT 공보 WO 92/02551 및 Babcock, J.S. et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:7843-7848]에 기재된 바와 같이 선택된 림프구 항체 방법(SLAM)과 같이 당업계에 언급된 과정을 사용하여 단일의 분리된 림프구로부터 생성된다. 본 방법에서, 목적하는 항체를 분비하는 단일 세포, 예를 들어, 섹션 1에 기재된 면역화된 동물의 임의의 하나로부터 유래된 림프구는 항원-특이적 적혈구 분해 플라크 분석법을 사용하여 스크리닝하고, 이 때 항원 IL-13, IL-13의 서브유닛 또는 이의 단편은 비오틴과 같은 링커를 사용하여 양 적혈구 세포에 커플링시키고 IL-13에 대해 특이성을 갖는 항체를 분비하는 단일 세포를 동정하는데 사용된다. 목적하는 항체 분비 세포를 동정한 후, 중쇄 및 경쇄 가변 영역 cDNA를 역전사효소 PCR에 의해 세포로부터 수득하고 이어서 이들 가변 영역을 적절한 면역글로불린 불변 영역(예를 들어, 사람 불변 영역)과 관련하여 COS 또는 CHO 세포와 같은 포유동물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있다. 생체내 선별된 림프구로부터 유래된 증폭된 면역글로불린 서열로 형질감염된 숙주 세포를 이어서 추가 분석하고 예를 들어, 형질감염된 세포를 선별하여 IL-13에 대한 항체를 발현하는 세포를 분리함에 의해 선별할 수 있다. 증폭된 면역글로불린 서열은 추가로 예를 들어, 문헌[PCT 공개번호 WO 97/29131 및 PCT 공개번호 WO 00/56772]에 기재된 바와 같은 시험관내 친화성 성숙화 방법에 의해 추가로 조작할 수 있다.
3. 유전자도입 동물을 사용한 항-IL-13 모노클로날 항체
본 발명의 또 다른 양태에서, 항체는 사람 면역글로불린 좌의 일부 또는 전부를 포함하는 비-사람동물을 IL-13 항원으로 면역화시켜 제조된다. 바람직한 양태에서, 비-사람 동물은 사람 면역글로불린 좌의 대형 단편을 포함하고 마우스 항체 생산이 결핍된 유전자 조작된 마우스 주(strain)인 XENOMOUSE 유전자도입 마우스이다[참조, 예컨대 Green et al. Nature Genetics 7: 13-21 (1994) 및 미국 특허 5,916,771, 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181, 6,091,001, 6,114,598 및 6,130,364]. 또한, 1991년 7월 25일에 공개된 WO 91/10741, 1994년 2월 3일에 공개된 WO94/02602, 1996년 10월 31일에 공개된 WO 96/34096 및 WO 96/33735, 1998년 4월 23일에 공개된 WO98/16654, 1998년 6월 11일에 공개된 WO 98/24893, 1998년 11월 12일에 공개된 WO 98/50433, 1999년 9월 10일에 공개된 WO 99/45031, 1999년 10월 21일에 공개된 WO 99/53049, 2000년 2월 24일에 공개된 WO 00 09560 및 2000년 6월 29일에 공개된 WO 00/037504도 참조한다. XENOMOUSE 유전자도입 마우스는 완전 사람 항체의 성인-유사 사람 레퍼토리를 생산하고, 항원 특이적인 사람 Mab를 생성한다. XENOMOUSE 유전자도입 마우스는 사람 중쇄 좌 및 x 경쇄 좌의 메가염기 크기의 배선 형태 YAC 단편의 도입을 통해 사람 항체 레퍼토리의 약 80%를 포함한다[본원에 참고인용된 Mendez et al., Nature Genetics 15: 146-156 (1997), Green and Jakobovits J.Exp. Med. 188: 483-495(1998) 참조].
4. 재조합 항체 라이브러리를 사용한 항-IL-13 모노클로날 항체
또한, 본 발명의 항체 제조에는 시험관내 방법도 사용할 수 있는데, 여기서 바람직한 결합 특이성의 항체 동정에는 항체 라이브러리를 선별하는 방법이 사용된다. 재조합 항체 라이브러리를 선별하는 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예컨대 문헌[Ladner et al. 미국 특허 5,223,409; Kang et al. PCT 공보 WO 92/18619; Dower et al. PCT 공보 WO 91/17271; Winter et al. PCT 공보 WO 92/20791; Markland et al. PCT 공보 WO 92/15679; Breitling et al. PCT 공보 WO 93/01288; McCafferty et al. PCT 공보 WO 92/01047; Garrard et al. PCT 공보 WO 92/09690; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; McCafferty et al., Nature (1990) 348:552-554; Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J. Mol.Biol. 226: 889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al.(1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; 및 Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982, 미국 출원 공개 20030186374, 및 PCT 공보 WO 97/29131(각각 본원에 참고인용됨)] 등에 설명된 방법을 포함한다.
재조합 항체 라이브러리는 IL-13 또는 IL-13으로 면역화된 피검체 또는 IL-13 또는 IL-13의 일부로 면역화된 피검체에서 유래할 수 있다. 또는, 재조합 항체 라이브러리는 미감작 피검체, 즉 사람 IL-13 또는 IL-13으로 면역화된 적이 없는 사람 피검체 유래의 사람 항체 라이브러리와 같은, IL-13 또는 IL-13으로 면역화된 적이 없는 피검체에서 유래할 수 있다. 본 발명의 항체는 IL-13을 인식하는 항체를 선별할 수 있도록 사람 IL-13을 포함하는 펩타이드를 이용하여 재조합 항체 라이브러리를 선별하여 선별한다. 이러한 선별 및 선별을 수행하는 방법은 당업계에 공지되어 있으며, 예컨대 앞의 문단에 기술된 문헌들에 설명되어 있다. hIL-13에 대해 특별한 결합 친화성을 가진 본 발명의 항체, 예컨대 특정 koff 속도 상수로 사람 IL-13으로부터 해리하는 항체를 선별하는 데에는 당업계에 공지된 표면 플라스몬 공명법을 사용하여 바람직한 koff 속도 상수를 가진 항체를 선별할 수 있다. hIL-13에 대해 특별한 중화 활성을 가진 본 발명의 항체, 예컨대 특별한 IC50을 가진 항체를 선별하는 데에는 hIL-13 활성의 억제를 평가하는 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
한가지 측면에서, 본 발명은 IL-13 및/또는 사람 IL-13과 결합하는 분리된 항체 또는 항원 결합 부위에 관한 것이다. 바람직하게, 항체는 중화 항체이다. 다양한 양태에서, 항체는 재조합 항체 또는 모노클로날 항체이다.
예를 들어, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 다양한 파아지 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 파아지 디스플레이 방법에서, 기능성 항체 도메인은 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 파아지 입자 표면상에 나타난다. 특히, 당해 파아지는 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 사람 또는 쥐)로부터 발현된 항원-결합 도메인을 나타내는데 사용될 수 있다. 목적하는 항원과 결합하는 항원 결합 도메인 발현 파아지는 예를 들어, 표지된 항원 또는 고형 표면 또는 비드에 결합되거나 포획된 항원을 사용하여 선별되거나 동정될 수 있다. 이들 방법에 사용되는 파아지는 통상적으로 파아지 유전자 III 또는 유전자 VIII 단백질에 재조합적으로 융합된 Fab, Fv 또는 디설파이드 안정화된 Fv 항체 도메인을 갖는 파아지로부터 발현된 fd 및 M13 결합 도메인을 포함하는 필라멘트형 파아지이다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 파아지 디스플레이 방법의 예는 문헌[Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); PCT 출원번호 PCT/GB91/01134; PCT 공개번호 WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; 및 미국 특허번호 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821,047; 5,571,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780, 225; 5,658,727; 5,733,743 및 5,969,108; 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 것들을 포함한다.
상기 문헌들에 기재된 바와 같이, 파아지 선별 후, 파아지로부터 항체 암호화 영역을, 하기에 상세히 기재되는 바와 같이 분리할 수 있고 이를 사용하여 포유동물 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 효모 및 세균을 포함하는 임의의 목적하는 숙주에서 발현되는 사람 항체 또는 임의의 다른 목적하는 항원 결합 단편을 포함하는 전체 항체를 생산할 수 있다. 예를 들어, Fab, Fab' 및 F(ab')2 단편을 재조합으로 생산하기 위한 기술은 또한 문헌[PCT 공개번호 WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); 및 Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); 및 Better et al., Science 240:1041-1043 (1988) (당해 문헌은 이의 전반적인 냉용이 본원에 참조로서 인용된다)]에 기재된 것들과 같은 방법을 당업계에 공지된 방법을 사용하여 사용될 수 있다. 단일쇄 Fv 및 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있는 기술의 예는 문헌[미국특허 4,946,778 및 5,258,498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); 및 Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988)]에 기재된 것들을 포함한다.
파아지 디스플레이에 의한 재조합 항체 라이브러리의 스크리닝에 대한 대안으로, 대형 조합 라이브러리에 대해 당업계에 공지된 기타 방법을 적용하여 본 발명의 이중 특이성 항체를 동정할 수 있다. 한가지 유형의 또 다른 발현 시스템은 문헌[PCT 공보 No. WO 98/31700 (Szostak and Roberts); Roberts, R.W. and Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302]에 기재된 바와 같이 재조합 항체 라이브러리가 RNA 단백질 융합으로서 발현되는 것이다. 당해 시스템에서, 공유결합 융합은 mRNA 및 3' 말단에 퓨로마이신, 펩티딜 수용체 항생제를 함유하는 합성 mRNA의 시험관내 해독에 의해, 암호화된 펩타이드 또는 반백질 사이에서 형성된다. 따라서, 특이적 mRNA는 암호화된 펩타이드 또는 단백질, 예를 들어, 항체 또는 이의 일부(예를 들어, 항체 결합부 또는 이의 일부)의 이중 특이성 항원에 대한 성질을 기준으로 mRNA의 배합 혼합물(예를 들어, 조합 라이브러리)로부터 집적될 수 있다. 당해 라이브러리의 스크리닝으로부터 회수된 항체 또는 이의 일부를 암호화하는 핵산 서열은 상기된 바와 같이(예를 들어, 포유동물 숙주 세포에서) 재조합 수단에 의해 발현될 수 있고 특히, 본래에 선별된 서열에 돌연변이가 도입된 mRNA-펩타이드 융합을 추가로 스크리닝함에 의해 또는 상기된 바와 같은 재조합 항체의 친화성 성숙화를 위한 기타 방법에 의해 친화성이 추가로 성숙화될 수 있다.
또 다른 접근법에서, 본 발명의 항체는 또한 당업계에 공지된 효모 디스플레이 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 효모 디스플레이 방법에서, 유전학적 방법을 사용하여 항체 도메인을 효모 세포벽에 부착시키고 이들을 효모의 표면상에 나타나게 할 수 있다. 특히, 당해 효모를 사용하여 레퍼토리 또는 조합 항체 라이브러리(예를 들어, 사람 또는 쥐)로부터 발현되는 항원 결합 도메인이 나타나게 할 수 있다. 본 발명의 항체를 제조하는데 사용될 수 있는 효모 디스플레이 방법의 예는 문헌[본원에 참조로서 인용된 Wittrup, et al. 미국 특허번호 6,699,658]에 기재된 것들을 포함한다.
B. 재조합 IL-13 항체의 생산
본 발명의 항체는 당업계에 공지된 임의의 다수의 기술을 통해 생산할 수 있다. 그 예에는, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 벡터가 표준 기술로 숙주 세포에 형질감염된 숙주 세포로부터의 발현이 있다. "형질감염"이란 용어의 다양한 형태는 원핵생물 또는 진핵생물 숙주 세포에 이종 DNA를 도입시키는데 일반적으로 사용되는 다양한 기술, 예컨대 전기천공, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란 형질감염 등을 포함하는 것으로 간주한다. 본 발명의 항체는 원핵생물 숙주 세포 또는 진핵생물 숙주 세포에서 발현시킬 수 있지만, 진핵생물 세포에서의 항체의 발현이 바람직하며, 특히 포유동물 숙주 세포에서의 발현이 가장 바람직한데, 그 이유는 이러한 진핵생물 세포(특히 포유동물 세포)는 적절하게 폴딩된 면역학적 활성 항체를 어셈블리하여 분비하는데 원핵생물 세포보다 더 적당하기 때문이다.
본 발명의 재조합 항체를 발현하기에 바람직한 포유동물 숙주 세포에는 중국 햄스터 난소(CHO 세포)(예컨대, R.J.Kaufman and P.A.Sharp (1982) Mol.Biol. 159:601-621에 기술된 바와 같은 DHFR 선별가능 마커와 함께 사용된, Urlaub and Chasin(1980) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 77:4216-4220에 기술된 dhfr-CHO 세포), NS0 골수종 세포, COS 세포 및 SP2 세포가 있다. 항체 유전자를 암호화하는 재조합 발현 벡터가 포유동물 숙주 세포에 도입되면, 항체는 숙주 세포에서 항체가 발현되기에 또는 바람직하게는 숙주 세포가 증식되는 배양 배지로 항체가 분비되기에 충분한 시간 동안 숙주 세포를 배양하여 생산한다. 항체는 표준 단백질 정제법을 사용하여 배양 배지로부터 회수할 수 있다.
또한, 숙주 세포는 기능성 항체 단편, 예컨대 Fab 단편 또는 scFv 분자를 생산하는 데에도 사용할 수 있다. 상기 절차의 변형 역시 본 발명의 범위에 속하는 것임은 자명하다. 예를 들어, 숙주 세포를 본 발명에 따른 항체의 경쇄 및/또는 중쇄의 기능성 단편을 암호화하는 DNA로 형질감염시키는 것이 필요할 수 있다. 또한, 재조합 DNA 기술을 사용하여 당해 항원에 대한 결합에 필요하지 않은 경쇄 및 중쇄 중 어느 하나 또는 둘 모두를 암호화하는 DNA의 일부 또는 전부를 제거할 수 있다. 이러한 절두된 DNA 분자로부터 발현된 분자도 역시 본 발명의 항체 범위에 속한다. 또한, 본 발명의 항체를 표준 화학적 가교법을 통해 제2 항체에 가교결합시켜 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄가 본 발명의 항체이고 다른 중쇄 및 경쇄가 당해 항원 이외의 다른 항원에 특이적인 이기능성 항체를 생산할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원 결합부의 재조합 발현에 바람직한 시스템에 따르면, 항체 중쇄 및 항체 경쇄를 모두 암호화하는 재조합 발현 벡터가 인산칼슘 매개 형질감염에 의해 dhfr-CHO 세포로 도입된다. 이러한 재조합 발현 벡터에서, 항체 중쇄 및 경쇄 유전자는 CMV 인핸서/AdMLP 프로모터 조절 요소에 각각 작동가능하게 결합되어 상기 유전자의 높은 전사율을 유도한다. 또한, 재조합 발현 벡터는 DHFR 유전자를 보유하며, 이 유전자는 메토트렉세이트 선별/증폭을 통해 상기 벡터로 형질감염된 CHO 세포를 선별할 수 있게 해준다. 선별된 형질전환 숙주 세포를 배양하여 항체 중쇄 및 경쇄가 발현되게 하고, 이러한 배양 배지로부터 완전한 항체를 회수한다. 재조합 발현 벡터 제조, 숙주 세포 형질감염, 형질전환체 선별, 숙주 세포 배양 및 배양 배지로부터 항체의 회수에는 표준 분자 생물학 기술을 사용한다. 또한, 본 발명은 본 발명의 숙주 세포를 본 발명의 재조합 항체가 합성될 때까지 적당한 배양 배지에서 배양하여 본 발명의 재조합 항체를 합성하는 방법을 제공한다. 이 방법은 배양 배지로부터 재조합 항체를 분리하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
1. 항-IL-13 항체
표 5는 본 발명의 바람직한 항-hIL-13 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열 목록이다.
[표 5a]
Figure pat00009
[표 5b]
Figure pat00010
[표 5c]
Figure pat00011
[표 5d]
Figure pat00012
[표 5e]
Figure pat00013
[표 5f]
Figure pat00014
[표 5g]
Figure pat00015
전술한 분리된 항-IL-13 항체 CDR 서열은 본 발명에 따라 분리되고 이하의 표 6에 정리된 CDR 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 포함하는 IL-13 결합 단백질의 신규 그룹을 구성한다. hIL-13 및 또는 hIL-13과 관련하여 바람직한 IL-13 결합 활성 및/또는 중화 활성을 갖는 본 발명의 CDR을 제조 및 선별하는 데에는 본 명세서에 구체적으로 기술된 방법에 한정됨이 없이 본 발명의 결합 단백질을 제조하고 이 결합 단백질의 IL-13 및 또는 IL-13 결합 및/또는 중화 특성을 평가하는 당업계에 공지된 표준 방법을 사용할 수 있다.
[표 6]
Figure pat00016
2. 항 IL-13 키메라 항체
키메라 항체는 항체의 상이한 부위가 상이한 동물 종으로부터 기원한 분자, 예를 들어, 쥐 모노클로날 항체로부터 기원하는 가변 영역 및 사람 면역글로불린 불변 영역을 갖는 항체이다. 키메라 항체를 생산하는 방법은 당업계에 공지되어 있고 실시예 2.1에서 상세히 논의된다[Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; 미국 특허번호 5,807,715; 4,816,567; 및 4,816,397, 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다]. 또한, 적정한 생물학적 활성의 사람 항체 분자 기원의 유전자와 함께 적정한 항원 특이성의 마우스 항체 분자 기원의 유전자를 스플라이싱함에 의한 "키메라 항체"의 생산을 위해 개발된 기술(Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. 81:851-855; Neuberger et al., 1984, Nature 312:604-608; Takeda et al., 1985, Nature 314:452-454, 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다)이 사용될 수 있다.
한가지 양태에서, 본 발명의 키메라 항체는 섹션 1에 기재된 쥐 모노클로날 항 사람 IL-13 항체의 중쇄 불변 영역을 사람 IgG1 불변 영역으로 대체하여 제조된다. 특정 양태에서, 본 발명의 키메라 항체는 서열번호 34; 서열번호 36; 서열번호 41; 서열번호 42; 서열번호 46의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역(VH) 및 서열번호 35; 서열번호 37; 서열번호 40; 서열번호 43; 또는 서열번호 47의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역(VL)을 포함한다.
3. 항 IL-13 사람화된 항체
사람화된 항체는 비-사람 종 기원의 하나 이상의 상보성 결정 영역(CDR) 및 사람 면역글로불린 분자 기원의 프레임워크 영역을 갖는, 목적하는 항원에 결합하는 비-사람 종 항체 기원의 항체 분자이다. 공지된 사람 Ig 서열은, 예를 들어,
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi; www.atcc.org/phage/hdb.html; www.sciquest.com/; www.abcam.com/; www.antibodyresource.com/onlinecomp.html; www.public.iastate.edu/.about.pedro/research_tools.html; www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/IT.html; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/kuby05.htm; www.library.thinkquest.org/12429/Immune/Antibody.html; www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m- ikeimages.html; www.antibodyresource.com/; mcb.harvard.edu/BioLinks/Immuno- logy.html.www.immunologylink.com/; pathbox.wustl.edu/.about.hcenter/index.- html; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/; www.pebio.com/pa/340913/340913.html- ; www.nal.usda.gov/awic/pubs/antibody/; www.m.ehimeu. acjp/.about.yasuhito- /Elisa.html; www.biodesign.com/table.asp; www.icnet.uk/axp/facs/davies/links.html; www.biotech.ufl.edu/.about.fccl/protocol.html; www.isac-net.org/sites_geo.html; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP- Start.html; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html; www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/; www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu- blic/INTRO.html; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html; imgt.cnusc.fr:8104/; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html; antibody.bath.ac.uk/; abgen.cvm.tamu.edu/lab/wwwabgen.html; www.unizh.ch/.about.honegger/AHOsem- inar/Slide01.html; www.cryst.bbk.ac.uk/.about.ubcg07s/; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm; www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/h- umanisation/TAHHP.html; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html; www.cryst.bioc.cam.ac.uk/.abo- ut.fmolina/Webpages/Pept/spottech.html; www.jerini.de/fr roducts.htm; www.patents.ibm.com/ibm.html. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983) (본원에 전반적인 내용이 참조로서 인용됨)에 기재되어 있다. 이러한 입수된 서열을 사용하여 당업계에 공지된 바와 같이 면역원성을 감소시키거나, 결합, 친화도, 결합속도, 해리속도, 결합성, 특이성, 반감기 또는 임의의 기타 적합한 특징을 감소시키거나 증진시키거나 변형시킬 수 있다.
사람 프레임워크 영역내 프레임워크 잔기는 상응하는 CDR 공여자 항체로 대체하여 항원 결합을 변화, 바람직하게는 개선시킬 수 있다. 이들 프레임워크 대체는 예를 들어, CDR 및 프레임워크 잔기의 상호작용에 대해 모델링하여 항원 결합과 서열 비교에 중요한 프레임워크 잔기를 동정하여 특정 위치에서의 특정 프레임워크 잔기를 동정함에 의해 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 동정된다(Queen et al., 미국 특허번호 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988), 이의 전반적인 내용이 본원에 참조로서 인용된다). 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 유용하고 당업자에게 익숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 가능한 3차원 형태 구조를 설명하고 디스플레이하는 컴퓨터 프로그램은 유용하다. 이들 디스플레이의 조사는 후보 면역글로불린 서열의 기능에 있어서 가능한 잔기의 역할에 대한 분석, 즉, 항원에 결합하는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능하게 한다. 이러한 방식으로, FR 잔기가 선별될 수 있고 컨센서스 및 입수 서열로부터 조합될 수 있어 표적 항원에 대한 증가된 친화성과 같은 목적하는 항체 특성이 달성된다. 일반적으로, CDR 잔기는 직접적으로 및 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 관여한다. 항체는 문헌[Jones et al., Nature 321:522 (1986); Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), Sims et al., J. Immunol. 151: 2296 (1993); Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987), Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151:2623 (1993), Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al. , PNAS 91:969-973 (1994); PCT 공개번호 WO 91/09967, PCT/US98/16280, US96/18978, US91/09630, US91/05939, US94/01234, GB89/01334, GB91/01134, GB92/01755; WO90/14443, WO90/14424, WO90/14430, EP 229246, EP 592,106; EP 519,596, EP 239,400, 미국 특허번호 5,565,332, 5,723,323, 5,976,862, 5,824,514, 5,817,483, 5814476, 5763192, 5723323, 5,766886, 5,714,352, 6,204,023, 6,180,370, 5,693,762, 5,530,101, 5,585,089, 5,225,539; 4,816,567, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]에 기재된 것들을 제한 없이 포함하는 당업계에 공지된 다양한 기술을 사용하여 사람화될 수 있다.
C. 항체 및 항체 생산 세포주의 제조
바람직하게, 본 발명의 항-IL-13 항체는 예를 들어, 당업계에 공지된 다양한 시험관내 또는 생체내 분석법(예를 들어, 실시예 1.1.C)중 임의의 하나에 의해 평가되었을때 IL-13 활성을 감소시키거나 중화시키는 높은 능력을 나타낸다. 예를 들어, 당해 항체는 약 10-8M 이상, 약 10-9M 이상 또는 약 10-10M 이상의 범위의 IC50값으로 A-549 세포에 의한 TARC의 IL-13 유도된 생산을 중화시킨다.
바람직한 양태에서, 분리된 항체 또는 이의 항원결합부분은 사람 IL-13에 결합하되, 상기 항체 또는 이의 항원결합부분은 표면 플라즈몬 공명법으로 측정했을 때, 약 0.1s-1 이하의 koff 속도 상수를 나타내며 사람 IL-13으로부터 해리하거나, 또는 약 1x10-6M 이하의 IC50을 나타내며 사람 IL-13 및/또는 사람 IL-13 활성을 억제한다. 또는, 상기 항체 또는 이의 항원 결합부위는 표면 플라스몬 공명법으로 측정했을 때, 약 1x10-2s-1 이하의 koff 속도 상수를 나타내며 사람 IL-13으로부터 해리할 수 있거나, 또는 약 1x10-7M 이하의 IC50을 나타내며 사람 IL-13 및/또는 사람 IL-13 활성을 억제할 수 있다. 또는, 상기 항체 또는 이의 항원결합부분은 표면 플라스몬 공명법으로 측정했을 때, 약 1x10-3s-1 이하의 koff 속도 상수를 나타내며 사람 IL-13으로부터 해리할 수 있거나, 또는 약 1x10-8M 이하의 IC50을 나타내며 사람 IL-13 및/또는 사람 IL-13 활성을 억제할 수 있다. 또는, 상기 항체 또는 이의 항원결합부분은 표면 플라스몬 공명법으로 측정했을 때, 약 1x10-4s- 1이하의 koff 속도 상수를 나타내며 사람 IL-13으로부터 해리할 수 있거나, 또는 약 1x10-8M 이하의 IC50을 나타내며 IL-13 및/또는 사람 IL-13 활성을 억제할 수 있다. 또는, 상기 항체 또는 이의 항원결합부분은 표면 플라스몬 공명법으로 측정했을 때, 약 1x10-5s-1 이하의 koff 속도 상수를 나타내며 사람 IL-13으로부터 해리할 수 있거나, 또는 약 1x10-10M 이하의 IC50을 나타내며 IL-13 및/또는 사람 IL-13 활성을 억제할 수 있다. 또는, 상기 항체 또는 이의 항원결합부분은 표면 플라스몬 공명법으로 측정했을 때, 약 1x10-5s-1 이하의 koff 속도 상수를 나타내며 사람 IL-13으로부터 해리할 수 있거나, 또는 약 1x10-11M 이하의 IC50을 나타내며 IL-13 및/또는 사람 IL-13 활성을 억제할 수 있다.
IL-13은 세포 표면에 존재하는, IL-13Rα1쇄(IL-13Rα1)과 IL-4R쇄(IL-4R)로 이루어진 이종이량체인 IL-13 수용체(IL-13R)에 결합하여 자신의 작용을 발휘한다. IL-13은 먼저 IL-13Rα1에 낮은 친화도(KD = 2-10nM)로 결합한 뒤, IL-4R을 모아서 복합체가 되어 높은 친화도의 수용체(KD = 0.03-0.4nM)를 생성한다(Aman, M.J., et al. 1996 J Biol.Chem. 271, 29265-29270; Miloux, et al. 1997 FEBS Lett. 401, 163-166; Andrews, et al 2002 J. Biol. Chem. 277, 46073-46078). IL-13R의 이종이량체화는 IL-13Rα1 및 IL-4R과 각각 구성적으로 연결되는 야누스 키나제, TYK2 및 JAK1의 활성화와 이어서 전사 신호 전달인자 및 활성화인자 6(STAT6)의 활성화를 유발한다(Izuhara, K., and Arima, K. 2004 Drug News Perspect. 17, 91-98). IL-13에 높은 친화도(0.25-1.2nM)로 결합하는 또 다른 IL-13 결합 단위인, IL-13Rα2 쇄(IL-13Rα2)가 있다(Caput, et al 1996 J.Biol.Chem. 271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J.Immunol. 161, 2317-2324). IL-13·IL-13Rα2 복합체에 관련된 것으로 알려진 다른 수용체 분자는 없다. 처음에 IL-13Rα2는 비신호화 "유인" 수용체로서 작용한다고 생각되었다. 하지만, 이후에 IL-13에 결합할 수 있고 AP-1 경로를 통해 신호를 보내서 대식세포를 비롯한 특정 세포 유형에서 TNF-β 생산을 유도하며, 결국 폐 섬유증을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Fichtner-Feigl, 2006 Nat Med 12: 99-106). 따라서, IL-13Rα1/IL-4Rα 및 IL-13Rα2 경로는 모두 천식 및 다른 폐 염증 병태의 전반적인 병태생리에 기여한다. 따라서, 상기 두 수용체에 대한 IL-13 결합을 차단하는 치료적 항-IL-13 항체는 하나의 수용체만을 차단하는 것보다 더 효과적일 것이다.
본 발명자들은 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2 모두에 대한 IL-13 결합을 차단하는 모노클로날 항체를 분리했다. 세포 표면에서의 ELISA 기반 수용체 결합 분석 및 125-I-표지된 IL-13 결합 분석은 쥐형과 사람화된 형(즉, 13C5.5)인 13C5 모두가 상기 두 수용체에 대한 IL-13 결합을 효과적으로 차단할 수 있다는 것을 입증했다. 13C5와 동일한 계통의 항체, 예컨대 25C8 및 33C3도 두 수용체에 대한 IL-13 결합을 차단할 수 있었다. 13C5의 에피토프 매핑은 그 결합 부위(들)에 사람 IL13의 C-말단 나선 D 영역이 포함되어 있음을 나타냈다(서열번호 1의 아미노산 104-130에 상응하는 잔기 VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR). 이러한 c-말단 나선 D 영역은 IL-13 수용체와 상호작용에 관련이 있는 것으로 제안된 바 있다(Zuegg et al 2001 Immunol Cell Biol. 79:332-9). 13C5.5 항체의 Fab 부위와 복합된 사람 IL-13의 결정 구조는 13C5.5가 C-말단 나선 D 영역은 물론 사람 IL-13의 N-말단 나선 A 영역에 결합하고 있음을 시사했다. 항체 또는 이의 항원결합단편은, 서열번호 1의 국소 영역 Ser26-Thr27-Ala28-Leu29-Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 및 Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127-Glu128-Gly129-Arg130으로 정의된 에피토프에 결합된 상기 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-13이 IL-13 수용체에 대한 결합을 억제하도록, 사람 IL-13에 결합하는 것이 바람직하다. 항체 또는 이의 항원결합단편은, 서열번호 1의 국소 영역 Arg30-Glu31-Leu32-Ile33-Glu34-Glu35-Leu36-Val37-Asn38 및 Lys123-Lys124-Leu125-Phe126-Arg127로 정의된 에피토프에 결합된 상기 항체 또는 이의 항원결합단편과 IL-13이 IL-13α2 수용체에 대한 결합을 억제하도록, 사람 IL-13에 결합하는 것이 바람직하다.
특정 양태에서, 상기 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM 또는 IgD 불변 영역과 같은 중쇄 불변 영역을 포함한다. 중쇄 불변 영역은 IgG1 중쇄 불변 영역 또는 IgG4 중쇄 불변 영역인 것이 바람직하다. 또한, 항체는 카파 경쇄 불변 영역 또는 람다 경쇄 불변 영역 중 어느 하나인 경쇄 불변 영역을 포함할 수 있다. 항체는 카파 경쇄 불변 영역을 포함하는 것이 바람직하다. 또는, 항체부는 Fab 단편 또는 단일쇄 Fv 단편과 같은 것일 수 있다.
항체 효과기 기능을 변경시키기 위한 Fc부 내의 아미노산 잔기의 치환은 당업계에 공지되어 있다(Winter et al., 미국 특허 5,648,260; 5624821). 항체의 Fc 부는 여러 중요한 효과기 기능, 예컨대 사이토카인 유도, ADCC, 식세포작용, 보체 의존적 세포독성(CDC) 및 항체와 항원-항체 복합체의 반감기/제거율 등을 매개한다. 몇몇 경우에는 이러한 효과기 가능이 치료 항체에 바람직하지만, 어떤 다른 경우에는 치료 목적에 따라서 불필요하거나 심지어 유해할 수도 있다. 특정 사람 IgG 이소형, 구체적으로 IgG1 및 IgG3은 각각 FcγR 및 보체 C1q에 대한 결합을 통해 ADCC 및 CDC를 매개한다. 신생 Fc 수용체(FcRn)는 항체의 혈행 반감기를 결정하는 중요한 성분이다. 또 다른 양태에서는, 항체의 불변 영역, 예컨대 항체의 Fc 영역에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기가 교체되어 효과기 기능이 변경된 항체가 제공된다.
한가지 양태는 본 발명의 항체 또는 항체 일부가 유도체화되거나 또는 다른 기능성 분자(예컨대, 다른 펩타이드 또는 단백질)에 결합된 표지된 결합 단백질을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 표지된 결합 단백질은 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 하나 이상의 다른 분자 실체, 예컨대 다른 항체(예: 이특이적 항체 또는 디아바디), 검출가능한 제제, 세포독성제, 약제 및/또는 다른 분자와 항체 또는 항체 일부의 연결을 매개할 수 있는 단백질이나 펩타이드(예컨대, 스트렙타비딘 코어 영역 또는 폴리히스티딘 태그) 등에 기능적으로 연결(화학적 커플링, 유전자 융합, 비공유 연결 등에 의해)시켜 수득할 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부가 유도체화될 수 있는 유용한 검출가능한 제제에는 형광 화합물이 포함된다. 검출가능한 형광 제제의 예에는 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 5-디메틸아민-1-나프탈렌설포닐 클로라이드, 피코에리트린 등이 있다. 또한, 항체는 검출가능한 효소, 예컨대 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제 등에 의해 유도체화될 수 있다. 항체가 검출가능한 효소로 유도체화된 경우에는, 효소가 검출가능한 반응 산물을 생산하기 위해 사용하는 추가 시약을 첨가하여 검출한다. 예를 들어, 검출가능한 제제인 양고추냉이 퍼옥시다제가 존재하는 경우, 과산화수소와 디아미노벤지딘을 첨가하면 색을 띤 반응 산물이 생성되어 검출할 수 있다. 항체는 또한 비오틴으로 유도체화될 수 있고, 이 경우 아비딘이나 스트렙타비딘 결합의 간접 측정을 통해 검출한다.
본 발명의 다른 양태는 결정화된 결합 단백질을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 본 명세서에 개시된 바와 같은 전체 항-IL-12p40 항체 및 이의 단편의 결정, 및 이러한 결정을 포함하는 배합물 및 조성물을 제공한다. 한가지 양태에서, 결정화된 결합 단백질은 이에 대응하는 용해성 결합 단백질보다 생체내 반감기가 더 길다. 다른 양태에서, 결합 단백질은 결정화 후 생물학적 활성을 보유한다.
본 발명의 결정화된 결합 단백질은 당업계에 공지되고 본원에 참고인용된 WO 02072636에 개시된 바와 같이 생산할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는 항체 또는 이의 항원 결합부가 하나 이상의 탄수화물 잔기를 포함하는 글리코실화된 결합 단백질을 제공한다. 생체내 생산된 초기 단백질은 해독후 변형으로 알려진 추가 프로세싱으로 처리될 수 있다. 구체적으로, 당(글리코실) 잔기는 글리코실화로 알려진 방법에 의해 효소적으로 첨가될 수 있다. 그 결과 수득되는 공유결합된 올리고사카라이드 측쇄를 보유한 단백질은 글리코실화된 단백질 또는 당단백질로서 공지되어 있다. 항체는 가변 도메인 뿐만 아니라 Fc 도메인에 하나 이상의 탄수화물 잔기를 갖는 당단백질이다. Fc 도메인내 탄수화물 잔기는 Fc 도메인의 효과기 기능에 중요한 효과를 나타내고 항체의 항원 결합 또는 반감기에 최소의 효과를 나타낸다(R. Jefferis, Biotechnol. Prog. 21 (2005), pp. 11 - 6). 대조적으로, 가변 도메인의 글리코실화는 항체의 항원 결합 활성에 효과를 가질 수 있다. 가변 도메인내 글리코실화는 항체 결합 친화성에 대해 음성 효과를 나타낼 수 있고 이는 입체장애 때문이거나(Co, M.S., et al., Mol. Immunol. (1993) 30:1361- 1367), 항원에 대한 친화성을 증가시키기 때문이다(Wallick, S.C., et al., Exp. Med. (1988) 168:1099-1109; Wright, A., et al., EMBO J. (1991) 10:2717 2723).
본 발명의 한가지 측면은 결합 단백질의 O- 또는 N- 결합된 글리코실화 부위가 돌연변이된 글리코실화 부위 돌연변이체를 제조하는 것에 관한 것이다. 당업자는 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 당해 돌연변이체를 제조할 수 있다. 생물학적 활성을 보유하지만 결합 활성이 증가되거나 감소된 글리코실화 부위 돌연변이체는 본 발명의 또 다른 목적이다.
또 다른 양태에서는 본 발명의 항체 또는 항원 결합부위의 글리코실화가 변형된다. 예를 들어, 글리코실화되지 않은 항체가 제조될 수 있다(즉, 항체는 글리코실화되어 있지 않다). 항원에 대한 항체의 특이성을 증가시키기 위해 글리코실화가 변형될 수 있다. 당해 글리코실화 변형은 예를 들어, 항체 서열내 하나 이상의 글리코실화 부위를 변형시킴에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산이 치환되어 하나 이상의 가변 영역 글리코실화 부위가 제거됨으로써 그 부위에서의 글리코실화가 제거된다. 당해 글리코실화 제거는 항원에 대한 항체의 친화성을 증가시킬 수 있다. 당해 방법은 문헌[PCT 공보 WO2003016466A2, 및 미국특허 제5,714,350호 및 제6,350,861호, 이의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]에 상세하게 추가로 기재되어 있다.
추가로 또는 대안적으로, 본 발명의 변형된 항체는 푸코실 잔기의 양이 감소된 저푸코실화된 항체 또는 GlcNAc 구조의 2등분이 증가된 항체와 같은 변형된 유형의 글리코실화를 가질 수 있다. 당해 변형된 글리코실화 패턴은 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 것으로 입증되었다. 당해 탄수화물 변형은 예를 들어, 변형된 글리코실화 기구를 갖는 숙주 세포에서 항체를 발현시켜 달성할 수 있다. 변형된 글리코실화 기구를 갖는 세포는 당업계에 보고되어 있고 본 발명의 재조합 항체를 발현시켜 변형된 글리코실화를 갖는 항체를 제조하기 위한 숙주 세포로서 사용될 수 있다[Shields, R. L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, 유럽 특허번호 EP 1,176,195; PCT 공개번호 WO 03/035835; WO 99/54342 80, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다].
단백질 글리코실화는 당해 단백질의 아미노산 서열, 및 단백질이 발현되는 숙주 세포에 따라 달라진다. 다른 유기체는 다른 글리코실화 효소(예컨대, 글리코실트랜스퍼라제 및 글리코시다제)를 생산하고, 이용할 수 있는 기질(뉴클레오타이드 당)이 다를 수 있다. 이러한 요인으로 인해, 단백질 글리코실화 패턴 및 글리코실 잔기의 조성은 특정 단백질이 발현되는 숙주계에 따라 다를 수 있다. 본 발명에 유용한 글리코실 잔기는 글루코스, 갈락토스, 만노스, 푸코스, n-아세틸글루코사민 및 시알산 등을 이에 국한됨이 없이 포함할 수 있다. 이러한 글리코실화된 결합 단백질은 글리코실화 패턴이 사람이도록 글리코실 잔기를 포함하는 것이 바람직하다.
당업자에게 공지된 바와 같이, 상이한 단백질 글리코실화는 상이한 단백질 특징을 제공할 수 있다. 예를 들어, 효모와 같은 미생물 숙주에서 생산되고 효모 내인성 경로를 이용하여 글리코실화된 치료 단백질의 효능은 CHO 세포주와 같은 포유동물 세포에서 발현된 동일 단백질 효능에 비해 저하될 수 있다. 이러한 당단백질은 또한 사람 중에서 면역원성일 수 있고 투여 후 생체내 반감기가 감소될 수 있다. 사람 및 다른 동물에 존재하는 특정 수용체는 특정 글리코실화 잔기를 인식하고 혈류로부터 그 단백질의 신속 제거를 촉진할 수 있다. 다른 부작용으로, 단백질 폴딩, 용해성, 프로테아제에 대한 민감성, 트래픽킹(trafficking), 수송, 구획화, 분비, 다른 단백질이나 인자에 의한 인식, 항원성 또는 알레르기원성 등의 변화를 포함할 수 있다. 따라서, 당업자는 특정 조성과 글리코실화 패턴을 가진 치료 단백질, 예컨대 사람 세포 또는 의도된 피검체 동물의 종 특이적 세포에서 생산되는 것과 동일하거나 적어도 유사한 글리코실화 조성 및 패턴을 가진 치료 단백질을 선호할 수 있다.
숙주 세포와 상이한 글리코실화된 단백질의 발현은 숙주 세포의 유전자 변형을 통해 이종 글리코실화 효소를 발현하도록 함으로서 수득될 수 있다. 사람 단백질 글리코실화를 나타내는 항체 또는 항원 결합부는 당업계에 공지된 기술을 이용하여 당업자라면 제조할 수 있다. 예를 들어, 효모 균주는 비자연발생의 글리코실화 효소를 발현하도록 유전자 변형되어, 이 효모 균주에서 생산된 글리코실화된 단백질(당단백질)이 동물 세포, 특히 사람 세포에서 생산된 것과 동일한 단백질 글리코실화가 수득된 바 있다(미국 특허 출원 20040018590 및 20020137134, 및 PCT 공개번호 WO2005100584 A2).
결합 단백질 외에도, 본 발명은 또한 본 발명의 당해 결합 단백질에 특이적인 항-이디오타입(항-Id) 항체에 관한 것이다. 항-Id 항체는 일반적으로 또 다른 항체의 항원 결합 영역과 연결된 유일한 결정기를 인지하는 항체이다. 항-Id는 결합 단백질 또는 CDR 함유 영역으로 동물을 면역화시켜 제조될 수 있다. 면역화된 동물은 면역화 항체의 이디오타입 결정기를 인지하고 이에 반응하여 항-Id 항체를 생산한다. 또한, 항-Id 항체는 소위 항-항-Id 항체를 생산하는 또 다른 동물에서 면역반응을 유도하기 위한 "면역원"으로서 사용될 수 있다.
또한, 목적하는 단백질은 다양한 글리코실화 효소를 발현하도록 유전자 조작된 숙주 세포의 라이브러리를 사용하여 발현시킬 수 있음을 당업자라면 잘 알고 있을 것이며, 이에 따라 상기 라이브러리의 구성 숙주 세포는 변형된 글리코실화 패턴을 가진 당해의 단백질을 생산한다. 그 다음, 당업자는 새로운 특정 글리코실화 패턴을 가진 당해의 단백질을 선별하여 분리할 수 있다. 특별하게 선별된 신규 글리코실화 패턴을 가진 단백질은 생물학적 성질이 개선되거나 변경된 단백질인 것이 바람직하다.
D. 항-IL-13 항체의 용도
본 발명의 항-사람 IL-13 항체 또는 이의 일부는 사람 IL-13에 결합하는 능력이 있으므로, 통상의 면역분석법, 예컨대 효소 결합된 면역흡착분석법(ELISA), 방사선면역분석법(RIA) 또는 조직 면역조직화학법을 통해 사람 IL-13(예컨대 혈청이나 혈장과 같은 생물학적 시료에서)을 검출하는데 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항체 일부와 생물학적 시료를 접촉시키는 단계 및 사람 IL-13에 결합된 항체(또는 항체 일부) 또는 미결합된 항체(또는 항체 일부)를 검출하여 생물학적 시료 중의 사람 IL-13을 검출하는 단계를 포함하여 생물학적 시료 중의 사람 IL-13을 검출하는 방법을 제공한다. 항체는 결합된 항체 또는 미결합된 항체의 검출을 용이하게 하기 위한 검출가능한 물질로 직접 또는 간접적으로 표지된다. 적당한 검출가능한 물질에는 각종 효소, 보결분자단, 형광 물질, 발광 물질 및 방사능 물질이 있다. 적당한 효소의 예에는 양고추냉이 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제 또는 아세틸콜린에스테라제가 있고; 적당한 보결분자단 복합체의 예에는 스트렙타비딘/비오틴 및 아비딘/비오틴이 있으며; 적당한 형광 물질의 예에는 움벨리페론, 플루오레세인, 플루오레세인 이소티오시아네이트, 로다민, 디클로로트리아지닐아민 플루오레세인, 단실 클로라이드 또는 피코에리트린이 있고; 발광 물질의 예에는 루미놀이 있으며; 적당한 방사능 물질의 예에는 3H, 14C, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I, 177Lu, 166Ho 또는 153Sm이 있다.
항체 표지화의 대안으로서, 사람 IL-13은 검출가능한 물질로 표지된 rhIL-13 표준물질과 미표지된 항-사람 IL-13 항체를 이용한 경쟁 면역분석법을 통해 생물학적 유체 중에서 분석될 수 있다. 이 분석법에 따르면, 생물학적 시료, 표지된 rhIL-12 표준물질 및 항-사람 IL-12p40 항체가 혼합되고, 미표지된 항체에 결합된 표지된 rhIL-13 표준물질의 양이 측정된다. 생물학적 시료에 존재하는 사람 IL-13의 양은 항-IL-13 항체에 결합된 표지된 rhIL-13 표준물질의 양에 반비례한다. 유사하게, 사람 IL-23은 또한 검출가능한 물질로 표지된 rhIL-13 표준물질 및 미표지된 항-사람 IL-13 항체를 사용한 경쟁 면역분석법에 의해 생물학적 유체에서 분석될 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 일부는 시험관내 및 생체내 모두에서 사람 IL-13 활성을 중화시킬 수 있는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 본 발명의 항체 및 항체 일부는 예컨대 hIL-13을 포함하는 세포 배양물에서 또는 본 발명의 항체가 교차반응하는 IL-13을 갖는 사람 피검체 또는 다른 포유동물 피검체에서 hIL-13 활성을 억제하는데 사용될 수 있다. 한가지 양태에서, 본 발명은 hIL-13 활성이 억제되도록 본 발명의 항체 또는 항체 일부와 hIL-13을 접촉시키는 것을 포함하여 hIL-13 활성을 억제하는 방법을 제공한다. 예를 들어, hIL-13을 포함하거나 포함할 것으로 추정되는 세포 배양물에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 상기 배양 배지에 첨가되어 배양물에 존재하는 hIL-13의 활성을 억제할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 피검체 또는 유리하게는 IL-13 활성이 유해한 질병 또는 질환을 앓고 있는 피검체의 hIL-13 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 피검체의 IL-13 활성이 감소되도록 본 발명의 항체 또는 항체 일부를 피검체에게 투여하는 것을 포함하여, 상기 질환이나 질병을 앓고 있는 피검체의 IL-13 활성을 감소시키는 방법을 제공한다. IL-13은 사람 IL-13이고, 피검체는 사람 피검체인 것이 바람직하다. 또는, 피검체는 본 발명의 항체가 결합할 수 있는 IL-13을 발현하는 포유동물일 수 있다. 또한, 피검체는 IL-13이 도입된 포유동물(예컨대, IL-13을 투여하거나 또는 IL-13 도입유전자의 발현에 의해)일 수 있다. 본 발명의 항체는 치료학적 목적으로 사람 피검체에게 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 수의학적 목적에서 또는 사람 질병의 동물 모델로서 상기 항체가 결합할 수 있는 IL-13을 발현하는 비-사람 포유동물에게 투여될 수 있다. 후자인 경우에, 이러한 동물 모델은 본 발명의 항체의 치료학적 효능을 평가하는 데 유용할 수 있다(예컨대, 투여량 검사 및 투여 시간 검사).
본 명세서에 사용된 바와 같은, "IL-13 활성이 유해한 장애"란 용어는 이 질환을 앓고 있는 피검체 중의 IL-13의 존재가 이 질환의 병태생리학의 원인이거나 이 질환의 악화에 기여하는 인자인 것으로 밝혀졌거나 의심되는 질병 및 다른 질환을 포함하는 것으로 간주한다. 따라서, IL-13 활성이 유해한 장애는 IL-13 활성의 감소로 그 증후군 및/또는 그 질환의 진행이 경감될 것으로 예상되는 장애이다. 이러한 장애는 예컨대 이 질병을 앓고 있는 피검체의 생물학적 유체에 존재하는 IL-13의 농도의 증가(예컨대, 피검체의 혈청, 혈장, 윤활액 등에 존재하는 IL-13 농도의 증가)를 통해 확인할 수 있으며, 상기 농도는 예컨대 전술한 바와 같은 항-IL-13 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 본 발명의 항체로 치료될 수 있는 질환의 비제한적 예에는 본 발명의 항체를 포함한 약제학적 조성물에 관한 이하의 문단에 논의되는 질환이 포함된다.
IL-13은 천식과 관련된 병리적 반응을 유발하는데 중요한 역할을 하는 것으로 관련되어 생각된 바 있다. 하지만, 다른 면역학적 경로의 다른 매개인자들도 천식 발병에 관련이 있고, 이러한 매개인자와 함께 IL-13의 차단은 추가로 치료적 이익을 제공할 수 있다. 즉, 본 발명의 결합 단백질은 DVD가 IL-13 및 전염증성 사이토카인, 예컨대 종양괴사인자-α(TNF-α) 등을 포함한, 이에 국한되지 않는 표적 쌍에 결합할 수 있는, DVD-Ig 단백질에 혼입될 수 있다. TNF-α는 천식에서 염증성 반응을 증폭시킬 수 있고 질병 중증도와 관련될 수 있다(McDonnell, et al., Progress in Respiratory Research (2001), 31(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250). 이것은 IL-13과 TNF-α를 차단하면 특히 심각한 기도 질환에 유익한 효과가 있을 수 있음을 시사한다. 바람직한 양태에서, 본 발명의 DVD-Ig은 표적 IL-13 및 TNFα에 결합하고 천식을 치료하는데 사용된다.
다른 양태에서, 본 발명의 결합 단백질은 IL-13과 IL-1β, IL-13 및 IL-9; IL-13 및 IL-4; IL-13 및 IL-5; IL-13 및 IL-25; IL-13 및 TARC; IL-13 및 MDC; IL-13 및 MIF; IL-13 및 TGF-β; IL-13 및 LHR 효능제; IL-13 및 CL25; IL-13 및 SPRR2a; IL-13 및 SPRR2b; 및 IL-13 및 ADAM8에 결합하는 DVD-Ig 분자를 생성하는데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 CSF1 (MCSF), CSF2 (GM-CSF), CSF3 (GCSF), FGF2, IFNA1, IFNB1, IFNG, 히스타민 및 히스타민 수용체, IL1A, IL1B, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6, IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12A, IL12B, IL14, IL15, IL16, IL17, IL18, IL19, IL-20, IL-21, IL-22, IL-23, IL-24, IL-25, IL-26, IL-27, IL-28, IL-30, IL-31, IL-32, IL-33, KITLG, PDGFB, IL2RA, IL4R, IL5RA, IL8RA, IL8RB, IL12RB1, IL12RB2, IL13RA1, IL13RA2, IL18R1, TSLP, CCL1, CCL2, CCL3, CCL4, CCL5, CCL7, CCL8, CCL13, CCL17, CCL18, CCL19, CCL20, CCL22, CCL24,CX3CL1, CXCL1, CXCL2, CXCL3, XCL1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CX3CR1, GPR2, XCR1, FOS, GATA3, JAK1, JAK3, STAT6, TBX21, TGFB1, TNFSF6, YY1, CYSLTR1, FCER1A, FCER2, LTB4R, TB4R2, LTBR 및 키티나제로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 천식에 관련된 하나 이상의 표적과 IL-13에 결합할 수 있는 DVD-Ig을 제공한다.
D. 약제학적 조성물
또한, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 항원결합부분과 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 항체를 포함하는 약제학적 조성물은 장애를 진단, 검출 또는 모니터하거나 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 완화시키고/시키거나 연구에 사용하기 위한 것이다. 특정 양태에서, 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체를 포함한다. 또 다른 양태에서, 약제학적 조성물은 본 발명의 하나 이상의 항체, 및 본 발명의 항체 이외에 IL-13 활성이 유해한 장애를 치료하기 위한 하나 이상의 예방제 또는 치료제를 포함한다. 바람직하게, 예방제 또는 치료제는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 또는 완화시키는데 유용한 것으로 공지되거나 이에 사용되었거나 현재 사용중인 것들이다. 이들 양태에 따라, 당해 조성물은 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 일부는 피검체에 투여하기에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부와 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 "약제학적으로 허용되는 담체"란 용어에는 생리학적으로 적합성인 임의의 모든 용매, 분산 매질, 피복, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡수 지연제 등이 포함된다. 약제학적으로 허용되는 담체의 예에는 물, 식염수, 인산염완충 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등 중의 하나 이상 또는 이의 조합물이 포함된다. 대부분의 경우에는 조성물에 당과 같은 등장제, 만니톨, 소르비톨과 같은 다알콜 또는 염화나트륨이 포함되는 것이 바람직하다. 약제학적으로 허용되는 담체는 추가로 항체 또는 항체 일부의 보관 수명이나 효과를 증강시키는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충액과 같은 보조 물질을 소량 포함할 수도 있다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방하거나 처리하거나 치료하거나 완화시키는데 유용한 본 발명의 하나 이상의 항체 또는 본 발명의 조합된 하나 이상의 항체 및 예방제 또는 치료제를 투여하는데 사용될 수 있고, 리포좀내 캅셀화제, 미세입자, 미세캅셀제, 항체 또는 항체 단편을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체 매개된 세포내이입[Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)], 레트로바이러스 또는 기타 벡터 등의 일부로서 핵산의 작제를 예로 들 수 있다. 본 발명의 예방제 또는 치료제를 투여하는 방법은 비경구 투여(예를 들어, 피부내, 근육내, 복강내, 정맥내 및 피하내), 뇌척수 경막외 투여, 종양내 투여 및 점막 투여(예를 들어, 비내 및 경구 경로)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 흡입기 또는 분무기 및 분무제를 갖는 제형을 사용하는 폐 투여가 사용될 수 있다[미국특허 6,019,968, 5,985,320, 5,985,309, 5,934, 272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 및 4,880,078; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903, 각각의 문헌의 전체 내용은 본원에 참조로서 인용된다]. 하나의 양태에서, 본 발명의 항체, 병용 치료제 또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술 (Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 사용하여 투여된다. 특정 양태에서, 본 발명의 예방 또는 치료제는 근육내, 정맥내, 종양내, 경구적으로, 비내, 폐 또는 피하내로 투여된다. 예방제 또는 치료제는 임의의 간편한 경로, 예를 들어, 주입 또는 응괴 주사, 상피 또는 점막 내층(예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장내 점막등)에 의해 투여될 수 있고 기타 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신성 또는 국소적일 수 있다.
특정 양태에서, 치료를 필요로 하는 영역에 본 발명의 예방제 또는 치료제를 국소적으로 투여하는 것이 요구될 수 있다. 이것은 예를 들어, 비제한적으로, 국소 주입, 주사 또는 임플란트에 의해 달성될 수 있고 당해 임플란트는 막 및 매트릭스, 예를 들어, 시알라스틱 막, 중합체, 섬유성 매트릭스(예를 들어, Tissuel®) 또는 콜라겐 매트릭스를 포함하는 다공성 또는 비-다공성 물질로 이루어진다. 한가지 양태에서, 본 발명의 길항제인 유효량의 하나 이상의 항체는 장애 또는 이의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 완화시키기 위해 피검체의 환부에 국소적으로 투여된다. 또 다른 양태에서, 본 발명의 유효량의 하나 이상의 항체는 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 관리 및/또는 완화시키기 위해 본 발명의 피검체 외에도 유효량의 하나 이상의 치료제(예를 들어, 하나 이상의 예방제 또는 치료제)와 병용하여 피검체의 환부에 국소적으로 투여된다.
또 다른 양태에서, 예방제 또는 치료제는 제어 방출 또는 지연 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한가지 양태에서, 펌프를 사용하여 제어 또는 지연 방출을 달성할 수 있다(Langer, 상기 참조; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88:507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321:574). 또 다른 양태에서, 중합재를 사용하여 본 발명의 치료제의 제어 또는 지연 방출을 달성할 수 있다[Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball(eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; 및 Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); 미국 특허번호 5,679,377; 미국 특허번호 5, 916,597; 미국 특허번호 5,912,015; 미국 특허번호 5,989,463; 미국 특허번호 5,128,326; PCT 공개번호 WO 99/15154; 및 PCT 공개번호 WO 99/20253]. 지연 방출 제형에 사용되는 중합체의 예는 폴리(2-하이드록시 에틸 메타크릴레이트), 폴리(메틸 메타크릴레이트), 폴리(아크릴산), 폴리(에틸렌-코-비닐 아세테이트), 폴리(메타크릴산), 폴리글리콜리드(PLG), 폴리언하이드라이드, 폴리(N- 비닐 피롤리돈), 폴리(비닐 알콜), 폴리아크릴아미드, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리락티드(PLA), 폴리(락티드-코-글리콜리드) (PLGA) 및 폴리오르토에스테르를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 바람직한 양태에서, 지연 방출 제형에 사용되는 중합체는 불활성이고, 누출되는 불순물이 없고, 저장시 안정하고 생분해성이다. 또 다른 양태에서, 제어 또는 지연 방출 시스템은 예방제 또는 치료제와 근접하게 위치됨에 따라서 전신 투여량의 일부만을 필요로 한다(Goodson, Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)).
제어 방출 시스템은 문헌[Langer (1990, Science 249:1527-1533)]에서 논의되었다. 당업자에게 공지된 임의의 기술을 사용하여 본 발명의 하나 이상의 치료제를 포함하는 지연 방출 제형을 제조할 수 있다[미국 특허번호 4,526, 938, PCT 공개번호 WO 91/05548, PCT 공개번호 WO 96/20698, Ning et al., 1996, "Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel," Radiotherapy & Oncology 39:179-189, Song et al., 1995, "Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions," PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, "Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application," Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, 및 Lam et al., 1997, "Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery," Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다].
본 발명의 조성물이 예방제 또는 치료제를 암호화하는 핵산인 특정 양태에서, 핵산은 생체내 투여되어 암호화된 예방제 또는 치료제의 발현을 촉진시킬 수 있고 당해 핵산은 적당한 핵산 발현 벡터의 일부로서 구성되고 이것이 세포내로 투여되도록 하며, 예를 들어, 레트로바이러스 벡터(미국 특허번호 4,980,286) 또는 직접 주사 또는 미세입자 충격(예를 들어, 유전자 총; 바이올리스틱, 듀폰트) 또는 지질 또는 세포 표면 수용체 또는 형질감염제로의 피복을 투여에 사용하거나 핵으로 진입하는 것으로 공지된 호메오박스형 펩타이드에 연결시켜 투여한다(Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868). 또한, 핵산은 세포내로 도입되고 발현을 위해 상동성 재조합에 의해 숙주 세포 DNA 내로 통합된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 이의 의도된 투여 경로에 적합할 수 있도록 제형화된다. 투여 경로의 예는 비경구, 예를 들어, 정맥내, 피내, 피하, 경구, 비내(예를 들어, 흡입), 경피(예를 들어, 국소), 경점막 및 직장 투여를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 특정 양태에서, 당해 조성물은 사람에게 정맥내, 피하, 근육내, 경구, 비내 또는 경구 투여용으로 채택된 약제학적 조성물로서 통상적인 과정에 따라 제형화된다. 통상적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장 수성 완충액중의 용액이다. 필요한 경우, 당해 조성물은 또한 가용화제 및 주사 부위에서 통증을 완화하기 위한 리그노캠과 같은 국소 마취제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물이 국소적으로 투여되어야만 하는 경우, 당해 조성물은 연고, 크림, 경피 패취, 로션, 젤, 샴프, 분무제, 에어로졸 또는 당업자에게 널리 공지된 기타 형태로 제형화될 수 있다[Remington's Pharmaceutical Sciences and Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms, 19th ed., Mack Pub. Co., Easton, Pa. (1995)]. 분무 불가능한 국소 투여 형태를 위해, 통상적으로 국소 적용에 적합할 수 있는 담체 또는 하나 이상의 부형제를 포함하고 바람직하게 물 보다 큰 역학 점도를 갖는 조성물이 사용될 수 있다. 적합한 제형은 제한없이 용제, 현탁제, 유제, 크림, 연고, 산제, 도찰제, 고약등을 포함하고 경우에 따라 이들은 예를 들어, 삼투압과 같은 다양한 성질에 영향을 미치기 위해 보조제(에를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제, 완충제 또는 염)과 함께 멸균되거나 혼합된다. 기타 적합한 국소 투여 형태는 바람직하게 고체 또는 액체 불활성 담체와 배합된 활성 성분이 가압된 휘발성 물질(예를 들어, 가스 분사제, 예를 들어, 프레온)과의 혼합물 또는 압착병에 팩키징된 분무 가능한 에어로졸 제제를 포함한다. 보습제 또는 습윤제가 또한 경우에 따라 약제학적 조성물 및 투여 형태에 첨가될 수 있다. 당해 추가의 성분의 예는 당업계에 널리 공지되어 있다.
본 발명의 방법이 조성물의 비내 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 에어로졸 형태, 분무, 연무 또는 점적 형태로 제형화될 수 있다. 특히, 본 발명에 다라 사용하기 위한 예방제 또는 치료제는 간편하게 가압된 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분무 제공 형태로 적합한 분사제(예를 들어, 디클로로디플루오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클로로테트라플루오로에탄, 이산화탄소 또는 기타 적합한 가스)의 사용과 함께 전달될 수 있다. 가압된 에어로졸의 경우에, 용량 단위는 계량된 양이 전달되도록 밸브를 설치하여 측정될 수 있다. 흡입기 또는 취입기에 사용하기 위한 캅셀제 및 카트릿지(예를 들어, 젤라틴으로 구성된)는 화합물 및 락토스 또는 전분과 같은 적합한 분말 기제의 분말 혼합물을 함유하도록 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법이 경구 투여를 포함하는 경우, 당해 조성물은 정제, 캅셀제, 카쉐제, 젤캡, 용제, 현탁제의 형태로 경구적으로 제형화될 수 있다. 정제 또는 캅셀제는 결합제(예를 들어, 예비젤화된 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 하이드록시프로필 메틸셀룰로스); 충전재(예를 들어, 락토스, 미세결정 셀룰로스 또는 인산수소칼슘); 윤활제(예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 탈크 또는 실리카); 붕해제(예를 들어, 감자 전분 또는 나트륨 전분 글리콜레이트) 또는 습윤제(예를 들어, 나트륨 라우릴 설페이트)와 같은 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 통상적인 수단으로 제조될 수 있다. 정제는 당업자에게 널리 공지된 방법으로 피복될 수 있다. 경구 투여용 액상 제제는 제한 없이 용제, 시럽 또는 현탁제 형태를 취할 수 있거나 이들은 사용전에 물 또는 기타 적합한 비히클과의 구성을 위해 무수 생성물로서 제공될 수 있다. 당해 액상 제제는 현탁화제(예를 들어, 소르비톨 시럽, 셀룰로스 유도체 또는 수소화된 식용 지방); 유화제(예를 들어, 렉시틴 또는 아카시아); 비-수성 비히클(예를 들어, 아몬드유, 오일 에스테르, 에틸 알콜 또는 분획화된 식물성 오일) 및 보존제(예를 들어, 메틸 또는 프로필-p-하이드록시벤조에이트 또는 소르브산)와 같은 약제학적으로 허용되는 첨가제를 사용한 통상적인 수단에 의해 제조될 수 있다. 당해 제제는 또한 적절하게 완충염, 향제, 착색제 및 감미제를 함유할 수 있다. 경구 투여용 제제는 적합하게 예방제 또는 치료제의 서방출, 제어 방출 또는 지연 방출용으로 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 예를 들어, 흡입기 또는 분무기를 사용함에 의해 분무제로 제형화된 조성물을 폐 투여함을 포함할 수 있다[미국 특허번호 6,019,968, 5,985, 320, 5,985,309, 5,934,272, 5,874,064, 5,855,913, 5,290,540 및 4,880,078; 및 PCT 공개번호 WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 및 WO 99/66903, 이의 각각의 전반적인 내용은 본원에 참조로서 인용된다]. 특정 양태에서, 본 발명 항체, 병용 치료제 및/또는 본 발명의 조성물은 Alkermes AIR® 폐 약물 전달 기술(Alkermes, Inc., Cambridge, Mass.)을 사용하여 투여된다.
본 발명의 방법은 주사(예를 들어, 일시 주사 또는 연속 주입)에 의해 비경구 투여용으로 제형화된 조성물을 투여함을 포함할 수 있다. 주사용 제형은 보존제 첨가와 함께 단위 용량 형태(예를 들어, 앰풀 또는 다용량 컨테이너)로 제공될 수 있다. 당해 조성물은 현탁제, 용제 또는 유제와 같은 형태를 취할 수 있고 현탁화제, 가용화제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 함유할 수 있다. 또는, 활성 성분은 사용전에 적합한 비히클(예를 들어, 멸균 발연원 부재 물)과의 구성을 위한 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 방법은 추가로 데포 제제로서 제형화된 조성물의 투여를 포함할 수 있다. 당해 오래 지속적인 제제는 이식(예를 들어, 피하 또는 근육내)에 의해 또는 근육내 주사에 의해 투여될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 당해 조성물은 적합한 중합재 또는 소수성 물질(예를 들어, 허용되는 오일중 유제로서) 또는 이온 교환 수지, 또는 불량한 가용성 유도체 (예를 들어, 불량한 가용성 염으로서)로 제형화될 수 있다.
본 발명의 방법은 중성 또는 염 형태로서 제형화된 조성물의 투여를 포함한다. 약제학적으로 허용되는 염은 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산등으로부터 유래된 것들과 같은 음이온과 함께 형성된 것들 및 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 제2 수산화철, 이소프로필아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인등으로부터 유래된 것들과 같은 양이온과 함께 형성된 것들을 포함한다.
일반적으로, 조성물의 성분은 별도로 함께 혼합하여, 예를 들어, 앰풀 또는 사쉐트(활성제의 양을 나타냄)와 같은 밀폐된 컨테이너에서 무수 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 단위 용량 형태로 공급된다. 투여 방식이 주입인 경우, 조성물은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입 병으로 분배될 수 있다. 투여 방식이 주사에 의한 것인 경우, 멸균 주사용수 또는 식염수의 앰풀을 제공하여 성분들이 투여 전에 혼합될 수 있다.
특히, 본 발명은 또한 예방제 또는 치료제, 또는 본 발명의 약제학적 조성물이 제제의 양을 나타내는 앰풀 또는 사쉐트와 같은 밀폐된 컨테이너에 팩키징된 것을 제공한다. 한가지 양태에서, 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 밀폐된 컨테이너에서 무수 멸균된 동결건조된 분말 또는 물 부재 농축물로서 공급되고 피검체 투여용으로 적당한 농도로 재구성(예를 들어, 물 또는 식염수와 함께)될 수 있다. 바람직하게, 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 밀폐된 컨테이너에 무수 멸균 동결건조된 분말로서 제공되고 단위 용량은 5 mg 이상, 보다 바람직하게는 10 mg 이상, 15 mg 이상, 25 mg 이상, 35 mg 이상, 45 mg 이상, 50 mg 이상, 75 mg 이상 또는 100 mg 이상이다. 동결건조된 예방제 또는 치료제 또는 본 발명의 약제학적 조성물은 이의 본래의 컨테이너에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야만 하고 본 발명의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 재구성된 후 1주 이내, 바람직하게는 5일 이내, 72시간 이내, 48시간 이내, 24시간 이내, 12시간 이내, 6시간 이내, 5시간 이내, 3시간 이내, 1시간 이내에 투여되어야만 한다. 또 다른 실험에서, 본 발명의 하나 이상의 예방제 또는 치료제 또는 약제학적 조성물은 제제의 양 및 농도를 나타내는 밀폐된 용기에서 액체 형태로 공급된다. 바람직하게, 투여된 조성물의 액체 형태는 밀폐된 용기에 0.25 mg/ml 이상, 보다 바람직하게는 0.5 mg/ml 이상, 1 mg/ml 이상, 2.5 mg/ml 이상, 5 mg/ml 이상, 8mg/ml 이상, 10 mg/ml 이상, 15 mg/kg 이상, 25 mg/ml 이상, 50 mg/ml 이상, 75 mg/ml 이상 또는 100 mg/ml 이상으로 공급된다. 액체 형태는 이의 원 용기에 2℃ 내지 8℃에서 저장되어야만 한다.
본 발명의 항체 및 항체 일부는 비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물에 혼입될 수 있다. 여기서, 항체 또는 항체 일부는 항체 0.1 내지 250mg/ml를 포함하는 주사 용액으로 제조하는 것이 바람직하다. 주사 용액은 플린트 또는 호박색 바이알, 앰풀 또는 사전충진 주사기 중의 액체 또는 동결건조 투여 형태로 구성될 수 있다. 완충액은 pH 5.0 내지 7.0(최적으로는 pH 6.0)의 L-히스티딘(1-50mM), 최적으로는 5-10mM일 수 있다. 다른 적당한 완충액으로는 석신산나트륨, 구연산나트륨, 인산나트륨 또는 인산칼륨이 있으나, 이에 국한되지 않는다. 염화나트륨은 0 내지 300mM(액체 투여 형태인 경우 최적으로는 150mM)의 농도로 용액의 독성을 개질하는데 사용될 수 있다. 동결건조 투여 형태에는 동결방지제, 주로 0 내지 10% 슈크로스(최적으로는 0.5 내지 1.0%)가 첨가될 수 있다. 다른 적당한 동결방지제에는 트레할로스 및 락토스가 있다. 동결건조 투여 형태에는 증량제, 주로 1 내지 10% 만니톨(최적으로는 2 내지 4%)이 첨가될 수 있다. 액체 및 동결건조 투여 형태에는 안정화제, 주로 1 내지 50mM L-메티오닌(최적으로는 5 내지 10mM)이 첨가될 수 있다. 다른 적당한 증량제에는 글리신, 아르기닌이 있으며, 이는 0 내지 0.05% 폴리소르베이트-80(최적으로는 0.005 내지 0.01%)으로서 포함될 수 있다. 또 다른 계면활성제에는 폴리소르베이트 20 및 BRIJ 계면활성제가 있으나, 이에 국한되지 않는다. 비경구 투여용의 주사가능한 용액으로 제조된 본 발명의 항체 및 항체 일부를 포함하는 약제학적 조성물은 보조제로서 유용한 제제, 예를 들어, 치료학적 단백질(예를 들어, 항체)의 흡수 또는 분산을 증가시키는데 사용되는 것들을 추가로 포함할 수 있다. 특히 유용한 보조제는 Hylenex®과 같은 히알루로니다제(재조합 사람 히알루로니다제)이다. 주사가능한 용액중에 히알루로니다제의 첨가는 비경구 투여 후, 특히 피하 투여 후 사람 생물유용성을 개선시킨다. 이는 또한 보다 큰 주사 부위 용적(즉 1ml 초과)을 가능하게 하고 통증 및 불괘감이 덜하고 주사 부위 반응이 최소로 발생한다(본원에 참조로서 인용되는 WO2004078140, US2006104968).
본 발명의 조성물은 다양한 형태일 수 있다. 이러한 형태에는 예컨대 액체, 반고체 및 고체 투여 형태, 예컨대 액체 용액(예: 주사 용액 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 환제, 산제, 리포좀 및 좌약 등이 포함된다. 바람직한 형태는 의도하는 투여 방식 및 치료 용도마다 다르다. 일반적으로 바람직한 조성물은 주사 용액 또는 주입 용액 형태, 예컨대 다른 항체로 사람을 수동 면역화하는데 사용되는 조성물과 유사한 조성물이다. 바람직한 투여 방식은 비경구(예컨대, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다. 바람직한 양태에서, 항체는 정맥내 주입 또는 주사로 투여된다. 또 다른 바람직한 양태에서, 항체는 근육내 또는 피하 주사로 투여된다.
치료학적 조성물은 일반적으로 멸균될 수 있고 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 한다. 이러한 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 높은 약물 농도에 적당한 다른 정렬된 구조로 조제될 수 있다. 멸균 주사 용액은 필요량의 활성 화합물(즉, 항체 또는 항체 일부)을, 필요에 따라 앞에서 열거한 성분 중 하나 또는 성분의 조합과 함께 적당한 용매에서 혼합한 다음, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질과 필요에 따라 전술한 다른 성분을 포함하는 멸균 비히클에 활성 화합물을 첨가하여 제조한다. 멸균 주사 용액의 제조에 유용한 멸균 동결건조 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 전술한 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분과 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 분무 건조이다. 용액의 적당한 유체성은 예컨대 레시틴과 같은 피복의 사용, 분산액의 경우에 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 유지될 수 있다. 주사 조성물의 지속적 흡수는 조성물에 흡수 지연제, 예컨대 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 첨가하여 제공할 수 있다.
본 발명의 항체 및 항체 일부는 당업계에 공지된 다양한 방법으로 투여할 수 있지만, 다양한 치료학적 용도에서 바람직한 투여 경로/방식은 피하 주사, 정맥내 주사 또는 주입이다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, 투여 경로 및/또는 방식은 원하는 결과에 따라 달라진다. 특정 양태에서, 활성 화합물은 이 화합물이 신속 방출되지 않게 하는 담체와 함께 조제될 수 있으며, 그 예에는 임플란트, 경피 패치 및 마이크로캡슐화된 전달 시스템을 비롯한 제어 방출 제형이 있다. 여기에는 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산과 같은 생체분해성, 생체적합성 중합체가 사용될 수 있다. 이러한 제형을 제조하는 다수의 방법은 특허되어 있거나 당업자에게 일반적으로 공지되어 있다[예컨대, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R.Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978].
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 예컨대 불활성 희석제 또는 동화성 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있다. 이러한 화합물(및 필요한 경우 다른 성분)은 또한 경질 또는 연질 외피의 젤라틴 캡슐에 충진되거나, 정제로 압착되거나 또는 피검체 식이에 직접 첨가될 수도 있다. 경구 치료 투여용인 경우, 상기 화합물은 부형제와 혼합되어 섭취가능한 정제, 구강 정제, 트로키, 캡슐; 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 비경구 투여외 다른 방식으로 본 발명의 화합물을 투여하기 위해서는 화합물을 불활성화 방지용 물질로 피복하거나 또는 상기 방지용 물질과 함께 공동 투여할 필요가 있을 수 있다.
또한, 보충적 활성 화합물이 상기 조성물에 첨가될 수도 있다. 특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 항체 일부는 IL-13 활성이 유해한 질환의 치료에 유용한 하나 이상의 추가 치료제와 함께 공동조제되고(되거나) 공동투여된다. 예를 들어, 본 발명의 항-hIL-13 항체 또는 항체 일부는 다른 표적(예컨대, 다른 사이토카인에 결합하거나 세포 표면 분자에 결합하는 항체)에 결합하는 하나 이상의 추가 항체와 공동조제 및/또는 공동투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 하나 이상의 항체는 전술한 치료제 2종 이상과 함께 사용될 수 있다. 이러한 복합 치료는 투여되는 치료제를 보다 낮은 투여량으로 사용할 수 있게 하여 각종 단독치료법과 관련된 가능한 독성 또는 합병증을 피할 수 있으므로 바람직하다.
특정 양태에서, IL-13에 대한 항체 또는 이의 단편은 당업계에 공지된 반감기 연장 비히클에 결합되기도 한다. 이러한 비히클에는 Fc 도메인, 폴리에틸렌 글리콜 및 덱스트란이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 비히클은 본원에 참고인용된 미국 출원 일련번호 09/428,082 및 공개된 PCT 출원 WO 99/25044에 기술되어 있다.
특정 양태에서, 본 발명의 항체 또는 또 다른 예방제 또는 치료제를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산 서열은 유전자 치료에 의해 장애 또는 이의 하나 이상의 증상을 치료, 예방, 관리하거나 완화시키기 위해 투여된다. 유전자 치료법은 피검체에게 발현되거나 발현 가능한 핵산을 투여함에 의해 수행되는 치료법을 언급한다. 본 발명의 당해 양태에서, 핵산은 예방 또는 치료 효과를 매개하는 이의 암호화된 본 발명의 항체 또는 예방제 또는 치료제를 생산한다.
당업계에서 유용한 임의의 유전자 치료법이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 유전자 치료법의 일반적인 검토를 위해 문헌[Goldspiel et al., 1993, Clinical Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3:87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan, Science 260:926- 932 (1993); and Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIBTECH 11(5):155-215]을 참조한다. 사용될 수 있는 재조합 DNA 기술에 관해 당업계에 일반적으로 공지된 방법은 문헌[Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993); and Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)]에 기재되어 있다. 다양한 유전자 치료법에 대한 상세한 설명은 본원에 참조로서 인용된 문헌[US20050042664 A1]에 기재되어 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 피검체의 IL-13 관련 장애를 치료하거나(또는 치유, 억제, 경감, 지연 또는 개시 방지, 또는 재발 방지), 또는 예방하는 방법을 특징으로 한다. 이러한 방법은 피검체에게 IL-13 결합 제제(특히, 길항제), 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 IL-13 관련 장애의 치료 또는 예방에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함한다. IL-13 길항제, 예컨대 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 피검체에게 단독으로 투여할 수도 있고, 또는 본 명세서에 기술된 다른 치료 방식과 함께 투여될 수도 있다.
한가지 양태에서, 피검체는 포유동물, 예컨대 하나 이상의 IL-13 관련 장애, 예컨대 호흡기 장애(예: 천식(예: 알레르기성 및 비알레르기성 천식)), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 및 기도 염증, 호산구 증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 다른 병태; 아토피 장애(예: 아토피 피부염 및 알레르기성 비염); 피부, 위장 기관(예: 염증성 장 질환(IBD), 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병) 및 간(예: 경변증, 섬유증)의 염증성 및/또는 자가면역 병태; 경피증; 종양 또는 암, 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 호지킨 림프종을 앓고 있는 사람이다. 따라서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 치료에 사용되는 IL-13 결합 제제(예컨대, 본 명세서에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)의 용도 및 본 명세서에 기술된 치료용 약제의 제조에 사용되는 IL-13 결합 제제(예컨대, 본 명세서에 기술된 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)의 용도를 포함한다.
IL-13 관련 장애의 예에는, 본 명세서에 기술된 바와 같은 다음과 같은 장애 중 하나 이상에서 선택되는 장애가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다: 호흡기 장애, 예컨대 천식(예: 알레르기성 및 비알레르기성 천식(예: 유아 등의 호흡기 세포융합 바이러스(RSV) 감염으로 인한 천식)), 만성 폐색성 폐질환(COPD), 및 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 다른 병태, 예컨대 낭성 섬유증 및 폐 섬유증; 아토피 장애, 예컨대 IL-13에 대한 증가된 민감성으로 인한 장애(예: 아토피 피부염, 두드러기, 습진, 알레르기성 비염, 및 알레르기성 위창자염); 피부의 염증성 및/또는 자가면역 병태(예: 아토피성 피부염), 위장 기관의 염증성 및/또는 자가면역 병태(예: 염증성 장 질환(IBD), 예컨대 궤양성 대장염 및/또는 크론병), 간의 염증성 및/또는 자가면역 병태(예: 경화증, 간세포 암종), 및 경피증; 종양 또는 암(예: 연조직 또는 고형 종양), 예컨대 백혈병, 아교모세포종 및 림프종, 예 호지킨 림프종; 바이러스 감염(예: HTLV-1 감염); 다른 장기의 섬유증, 예컨대 간 섬유증(예: B형 및/또는 C형 간염 바이러스에 의한 섬유증); 및 보호성 1형 면역 반응의 발현 억제(예컨대, 백신접종 동안).
다른 양태에서, 본 발명은 호흡기 장애, 예컨대 천식(예: 알레르기성 및 비알레르기성 천식); 알레르기; 만성 폐색성 폐질환(COPD); 기도 염증, 호산구증가증, 섬유증 및 과다 점액 생산을 수반하는 병태, 예컨대 낭성 섬유증 및 폐 섬유증과 관련 있는 하나 이상의 증상을 치료(예컨대, 감소, 경감)하거나 예방하는 방법을 제공한다. 예를 들어, 천식의 증상으로는, 쌕쌕거림, 숨참, 기관지수축, 기도 과다반응, 폐용량 감소, 섬유증, 기도 염증 및 점액 생산을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 방법은 IL-13 길항제, 예컨대 IL-13 항체 또는 이의 단편을 하나 이상의 증상을 치료(예: 감소, 경감)하거나 예방하기에 충분한 양으로 피검체에게 투여하는 것을 포함한다. IL-13 항체는 치료 또는 예방적으로, 또는 양자의 용도로 투여될 수 있다. IL-13 길항제, 예컨대 항-IL-13 항체 또는 이의 단편은 피검체에게 단독으로 또는 본 명세서에 기술된 다른 치료법과 함께 투여될 수 있다. 피검체는 포유동물, 예컨대 본 명세서에 기술된 바와 같은 IL-13 관련 장애를 앓고 있는 사람인 것이 바람직하다.
다른 관점에서, 본 발명은 시험관내에서 시료(예컨대, 생물학적 시료, 예컨대 혈청, 혈장, 조직, 생검) 중의 IL-13의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 본 방법은 장애, 예컨대 면역 세포 관련 장애를 진단하는데 사용될 수 있다. 본 방법은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 시료 또는 대조 시료를 접촉시키는 단계; 및 (ii) 상기 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 상기 시료 또는 대조 시료 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 대조 시료 대비, 당해 시료 중의 복합체 형성의 통계적으로 유의적인 변화가 시료 중의 IL-13의 존재를 나타낸다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 생체내에서 IL-13의 존재를 검출하는 방법(예컨대, 피검체의 생체내 영상화)을 제공한다. 당해 방법은 IL-13 관련 장애 등의 장애를 진단하는데 사용될 수 있다. 이 방법은 (i) 본 명세서에 기술된 바와 같은 항-IL-13 항체 또는 이의 단편을 이 항체 또는 단편의 IL-13에 대한 결합을 허용하는 조건 하에 피검체 또는 대조 피검체에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 항체 또는 단편과 IL-13 사이의 복합체 형성을 검출하는 단계를 포함하며, 이 때 대조 피검체 대비, 피검체 중의 복합체 형성의 통계적으로 유의적인 변화가 IL-13의 존재를 나타낸다.
본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부분은 당해 질환의 치료에 단독으로 사용되거나 또는 조합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부분은 단독으로 사용되거나 추가 제제, 예컨대 치료제와 함께 사용될 수 있으며, 이러한 치료제는 의도한 목적에 따라 당업자가 선택할 수 있는 것이다. 예를 들어, 추가 제제는 본 발명의 항체가 치료하는 질환 또는 병태를 치료하는데 유용한 것으로 공인된 치료제일 수 있다. 또한, 추가 제제는 치료 조성물에 유익한 특성을 부여하는 제제, 예컨대 조성물의 점도에 영향을 미치는 제제일 수 있다.
또한, 본 발명에 포함되어야 하는 배합물은 의도한 목적에 유용한 배합물이라는 것은 당연한 것이다. 이하에 제시된 제제는 예시하기 위한 것이지 제한하기 위한 것이 아니다. 본 발명의 일부인 배합물은 본 발명의 항체와 이하의 목록 중에서 선택되는 하나 이상의 추가 제제일 수 있다. 또한, 배합물은 형성된 조성물이 의도한 기능을 수행할 수 있을 정도이면 하나보다 많은 추가 제제, 예컨대 2종 또는 3종의 추가 제제를 포함할 수 있다.
복합 치료는 하나 이상의 IL-13 길항제(예: 항-IL-13 항체 또는 이의 단편)과 공동투여 및/또는 공동조제될 수 있는, 본 명세서에 더 많이 기술된 바와 같은 하나 이상의 추가 치료제, 예컨대 하나 이상의 사이토카인 및 성장인자 억제제, 면역억제제, 항염증제(예: 전신성 항염증제), 항섬유증제, 대사 억제제, 효소 억제제 및/또는 세포독성제 또는 세포정지제를 포함할 수 있다.
하나 이상의 IL-13 길항제, 예컨대 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 공동투여 및/또는 공동조제될 수 있는 바람직한 추가 치료제의 예에는 흡입형 스테로이드; 베타 효능제; 속효성 또는 지속성 베타 효능제; 류코트리엔 또는 류코트리엔 수용체의 길항제; ADVAIR와 같은 복합 약물; IgE 억제제; 항IgE 항체(예: XOLAIR); 포스포디에스테라제 억제제(예: PDE4 억제제); 잔틴; 항콜린작동성 약물; 비만세포 안정화제, 예컨대, 크로몰린; IL-4 억제제; IL-5 억제제; 에오탁신/CCR3 억제제; 히스타민 또는 이의 수용체, 예컨대 H1, H2, H3 및 H4의 길항제; 및 프로스타글란딘 D 또는 이의 수용체(DP1 및 CRTH2)의 길항제 중 하나 이상이 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 배합물은 천식 및 다른 호흡기 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 하나 이상의 항-IL-13 항체 또는 이의 단편과 공동투여 및/또는 공동조제될 수 있는 추가 치료제의 예에는 TNF 길항제(예: TNF 수용체의 가용성 단편, 예: p55 또는 p75 사람 TNF 수용체 또는 이의 유도체, 예: 75kD TNFR-IgG(75kD TNF 수용체-IgG 융합 단백질, ENBREL)); TNF 효소 길항제, 예컨대, TNF 전환 효소(TACE) 억제제; 무스카린성 수용체 길항제; TGF-β 길항제; 인터페론 감마; 퍼페니돈; 화학요법제, 예컨대 메토트렉세이트; 레플루노마이드; 시롤리무스(라파마이신) 또는 이의 유사체; CCI-779; COX2 및 cPLA2 억제제; NSAID; 면역조절제; p38 억제제; TPL-2, MK-2 및 NFkB 억제제 등 중 하나 이상이 포함된다.
다른 바람직한 배합물은 사이토카인 억제성 항염증성 약물(들)(CSAID); 다른 사람 사이토카인 또는 성장인자에 대한 항체 또는 길항제, 예컨대 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-15, IL-16, IL-18, IL-21, IL-31, 인터페론, EMAP-II, GM-CSF, FGF, EGF, PDGF 및 에도텔린-1의 항체 또는 길항제, 및 이러한 사이토카인과 성장인자의 수용체이다. 본 발명의 항체 또는 이의 항원결합부분은 세포 표면 분자, 예컨대 CD2, CD3, CD4, CD8, CD25, CD28, CD30, CD40, CD45, CD69, CD80(B7.1), CD86(B7.2), CD86(B7.2), CD90, CTLA 또는 이의 리간드, 예컨대 CD154(gp39 또는 CD40L)에 대한 항체와 배합될 수 있다.
치료제의 바람직한 배합물은 염증성 캐스캐이드의 다른 지점에서 간섭할 수 있다; 바람직한 예에는 키메릭, 사람화된 또는 사람 TNF 항체와 같은 TNF 길항제; D2E7(PCT 공개번호 WO 97/29131), CA2(RemicadeTM), CDP571 및 가용성 p55 또는 p75 TNF 수용체, 이의 유도체(p75TNFR1gG(EnbrelTM) 또는 p55TNFR1gG(Lenercept), 및 TNF 전환 효소(TACE) 억제제가 있고; 이와 마찬가지로 IL-1 억제제(인터루킨-1 전환효소 억제제 IL-1RA 등)도 같은 이유로 인해 효과적일 수 있다. 다른 바람직한 배합물에는 인터루킨 4가 포함된다. 또 다른 바람직한 배합물은 IL-13 기능과 병행하여 작용하거나, IL-13 기능에 의존적이거나, IL-13 기능과 협동하여 작용할 수 있는 천식성 반응의 다른 주요 약물이다. IL-13과 IL-9는 기능이 중복되지만 차이가 분명한 바, IL-13과 IL-9에 대한 길항제의 배합물이 가장 효과적일 수 있음이 밝혀져 있다. 또 다른 바람직한 배합물은 항-IL-5 항체이다. 또 다른 바람직한 배합물에는 MCP-1, MCP-4, 에오탁신, RANTES, MDC, CCL-12 및 CCL-17(TARC)을 비롯한 케모카인의 길항제 및 CCR2, CCR3, CCR4 및 CXCR4를 비롯한 케모카인 수용체의 길항제가 포함된다. 또 다른 배합물은 산성 포유동물 키티나제, CRHT2, 키마제, S1P1, S1P2, Tyk2, ROCKII, Stat6, p38, NFkB, 포스포디에스테라제 4(PDE-4), 비만세포 트리타제, NO, 아데노신, IKK2, GATA3, ICAM-1, VCAM-1 및 ICOS를 비롯한 천식 매개인자에 대한 길항제를 포함할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항체 또는 항체 일부의 "치료학적 유효량" 또는 "예방학적 유효량"을 포함할 수 있다. "치료학적 유효량"이란 용어는 원하는 치료 결과를 얻기 위한 투여량과 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 상기 항체 또는 항체 일부의 치료학적 유효량은 당업자라면 결정할 수 있는 것으로서, 질병 상태, 연령, 성별 및 개체의 체중과 개체 내에서 원하는 반응을 유도해내는 항체 또는 항체 일부의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 또한, 치료학적 유효량은 치료학적 유익 효과가 항체 또는 항체 일부의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다. "예방학적 유효량"은 원하는 예방학적 결과를 얻기 위한 투여량 및 필요 기간 동안의 유효한 양을 의미한다. 일반적으로, 예방학적 용량은 질병의 초기 단계전이나 초기 단계에 피검체에 사용되기 때문에 예방학적 유효량은 치료학적 유효량보다 적은 양일 것이다.
투여 계획은 원하는 최적 반응(예컨대, 치료학적 또는 예방학적 반응)을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 일시 투여할 수도 있고, 여러 분할 용량을 경시적으로 투여할 수도 있으며 또는 치료 상황의 위급성에 따라 비례하여 감소 또는 증가된 용량을 투여할 수도 있다. 특히, 투여 용이성과 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물을 투여 단위 형태로 조제하는 것이 유리하다. 본 명세서에 사용된 투여 단위 형태는 치료하는 포유동물 피검체에 대하여 단일 투여량으로서 적당한 물리적으로 분리된 단위를 의미한다. 따라서, 각 단위는 필요한 약제학적 담체와 관련하여 원하는 치료 효과를 제공하도록 계산된 소정 양의 활성 화합물을 포함한다. 본 발명의 투여 단위 형태에 대한 세부사항은 (a) 활성 화합물의 독특한 특징 및 수득하고자 하는 특정 치료 또는 예방학적 효과, 및 (b) 개체의 민감도 치료에 있어서 상기 활성 화합물을 배합하는 기술 고유의 제한에 따라 결정되고 직접 좌우된다.
본 발명의 항체 또는 항체 일부의 치료학적 또는 예방학적 유효량에 대한 비제한의 예시적 범위는 0.1 내지 20mg/kg, 더 바람직하게는 1 내지 10mg/kg이다. 투여량 값은 완화될 병태의 유형 및 중증도에 따라 달라질 수 있음을 유의해야 한다. 또한, 투여량 값은 개체의 필요 및 조성물 투여를 관리하거나 감독하는 자의 전문가적 판단에 따라 경시적으로 조정되어야 하며, 본 명세서에 제시된 투여량 범위는 예시적일뿐이며 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 하는 것이 아님을 이해해야 한다.
본원에 기재된 발명의 방법이 기타 적합하게 변형되고 적용될 수 있고 본 발명의 범위 또는 본원에 기재된 양태로부터 벗어나지 않고서도 적합한 등가물을 사용하여 변형되고 적용될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다. 이상 본 발명을 상세하게 설명했고 이와 동일하게 하기의 실시예를 참조로 보다 명백하게 이해될 수 있을 것이고 당해 실시예는 설명을 목적으로 포함된 것이며 본 발명을 제한하고자 한 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 항 사람 IL-13 모노클로날 항체의 생성 및 분리
실시예 1.1: 항 사람 IL-13 항체를 동정하기 위한 분석
실시예 1 전반에 걸쳐 달리 특정되지 않는 경우 하기의 분석을 사용하여 항 사람 IL-13 항체를 동정하고 이의 특성을 분석하였다.
실시예 1.1.A: ELISA
사람 IL-13과 결합하는 항체를 스크리닝하기 위한 효소 결합된 면역흡착 분석을 하기와 같이 수행하였다.
4℃에서 밤새 인산염 완충 식염수(PBS)중의 5㎍/ml의 염소 항-마우스 IgG Fc 특이적 항체(Pierce # 31170, Rockford, IL.)를 웰당 50㎕씩 사용하여 ELISA 플레이트(Corning Costar, Acton, MA)를 피복시켰다. 플레이트를 0.05% Tween-20 함유 PBS로 1회 세척하였다. 실온에서 1시간동안 PBS(BioRad #170-6404, Hercules, CA.)중에서 2%로 희석된 200㎕/웰 차단 용액을 첨가하여 플레이트를 차단시켰다. 차단한 후 플레이트를 0.05% Tween-20 함유 PBS로 1회 세척하였다.
0.1% 소 혈청 알부민(BSA) (Sigma, St. Louis, MO.) 함유 PBS로 희석한 마우스 혈청 또는 하이브리도마 상청액을 웰당 50 마이크로리터씩 상기된 바와 같이 제조된 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 웰을 0.05% Tween-20 함유 PBS로 3회 세척하였다. 0.1% BSA 함유 PBS로 100ng/ml로 희석한 비오티닐화된 재조합 정제된 사람 IL-13 변이체(R110Q) 50㎕를 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20 함유 PBS로 3회 세척하였다. 스트렙타비딘 HRP(Pierce # 21126, Rockland, IL.)를 0.1% BSA 함유 PBS 중에서 1:20000으로 희석하였다. 50 ㎕/웰을 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 플레이트를 0.05% Tween-20 함유 PBS로 3회 세척하였다. TMB 용액(Sigma #T0440, St. Louis, MO.) 50 마이크로리터를 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리하였다. 1N 황산을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 450nm의 파장에서 분광광도계로 플레이트를 판독하였다.
실시예 1.1.B: BIACORE 기술을 사용한 친화성 측정
BIACORE 분석(Biacore, Inc, Piscataway, NJ)은 결합, 해리속도상수의 속도론적 측정으로 항체의 친화성을 측정한다. 재조합 정제된 사람 IL-13 또는 재조합 정제된 사람 IL-13 변이체(R110Q)에 대한 항체의 결합은 25℃에서 전개 HBS-EP(10 mM HEPES [pH 7.4], 150mM NaCl, 3 mM EDTA, 및 0.005% 계면활성제 P20)를 사용하여 Biacore®3000 장치(Biacore®AB, Uppsala, Sweden)를 사용한 표면 플라스몬 공명 기반 측정에 의해 측정하였다. 모든 화학물질은 Biacore® AB(Uppsala, Sweden)에서 구입하거나 문헌에 기재된 바와 같은 상이한 공급원으로부터 구입하였다. 10mM 나트륨 아세테이트(pH 4.5)중에 희석된 단편 특이적 폴리클로날 항체(Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL), 염소 항-마우스 IgG의 약 5000RU(Fcg)를 25㎍/ml에서 제조업자의 지침 및 과정에 따른 표준 아민 커플링 키트를 사용하여 CM5 연구 등급의 바이오센서 칩에 직접 고정화시켰다. 바이오센서 표면상에 반응되지 않은 잔기는 에탄올아민으로 차단시켰다. 유동셀 2 및 4중에 변형된 카복시메틸 덱스트란 표면을 반응 표면으로서 사용하였다. 유동셀 1 및 3에서 염소 항-마우스 IgG 없이 비변형된 카복시메틸 덱스트란을 표준 표면으로서 사용하였다. 속도론적 분석을 위해, 1:1 랑그무이르 결합 모델로부터 유래하는 속도 방정식은 Biaevaluation 4.0.1 소프트웨어의 사용으로 모든 8개의 주사의 결합 및 해리 상과 유사하게 조정하였다. 정제된 항체는 염소 항마우스 IgG 특이적 반응 표면에 포획하기 위해 HEPES 완충 식염수로 희석하였다. 리간드(25 ㎍/ml)로서 포획된 마우스 항체를 5㎕/분의 유속으로 반응 매트릭스상에 주사하였다. 결합 및 해리속도상수 kon(단위 M-1s-1) 및 koff(단위 s-1)는 25㎕/분의 연속 유속하에 측정하였다. 속도 상수는 10 내지 200nM에 이르는 10개의 상이한 항원 농도 범위에서 속도론적 결합 측정을 수행하여 유도하였다. 이어서 마우스 항체와 재조합 정제된 사람 IL-12 p70 또는 재조합 정제된 사람 IL-12 p40간의 반응 평형 해리 상수 (단위 M)는 하기 식의 속도론적 속도 상수로부터 계산하였다: KD = koff/kon. 결합은 시간의 함수로서 기록하고 속도론적 속도 상수를 계산하였다. 당해 분석에서, 결합속도는 106M-1s-1 정도로 신속하고 해리속도는 10-6s-1 정도로 느린 것으로 측정될 수 있다.
실시예 1.1.C: 항 사람 IL-13 항체의 기능적 활성
본 발명의 항-사람 IL-13 항체의 기능적 활성을 조사하기 위해, IL-13 활성을 억제하는 항체의 능력을 측정하는 분석에 항체를 사용하였다.
실시예 1.1.C 1: A-549 생물학적 분석
A-549 세포에 의해 TARC(CC:-17)의 사람 IL-13 유도 생산을 억제하는 항-사람 IL-13 항체의 능력은 다음과 같이 분석했다. A-549 세포는 RPMI 증식 배지(+10% FBS) 중에서 96웰 평판(2E5 세포/웰)에서 1일째 접종했다. 2일째, 배지는 400ng/ml rhTNF(100㎕/ml)를 함유하는 새로운 RPMI 성장 배지로 교체했다. 한편, 다양한 농도의 면역화된 마우스 혈청, 쥐 하이브리도마 상청액 또는 정제된 항-사람 IL-13 항체를, 미세역가 플레이트(U형 바닥, 96웰, Costar)에서 100㎕ RPMI 완전 배지 중의 10ng/ml 재조합 정제된 사람 IL-13 또는 IL-13 변이체와 37℃에서 1시간 동안 예비항온처리했다. 그 다음, 항체+재조합 정제된 사람 IL-13 혼합물을 상기 TNF 처리된 A-549 세포에 첨가하여(100㎕/웰) 최종 용적을 200㎕/웰(최종 IL-13 및 TNF 농도는 각각 5ng/ml 및 200ng/ml이다)로 만들고 37℃에서 18시간 동안 항온처리했다. 항온처리 후, 각 웰로부터 무세포 상청액을 150㎕씩 취해, 사람 TARC ELISA(R&D Systems Cat# DDN00)를 이용하여, 생성된 사람 TARC 수준을 측정했다.
또한, A-549 세포는 사이노몰거스 원숭이, 마우스, 래트 및 양을 비롯한 다른 종의 IL-13에도 사람 IL-13과 유사한 ED50 값으로 반응한다. 따라서, 동일한 실험 프로토콜을 이용하여 다른 종의 IL-13에 대한 항-hIL-13 mAb의 교차반응 분석을 실시했다.
실시예 1.2: 항 사람 IL-13 모노클로날 항체의 생성
항 사람 IL-12 마우스 모노클로날 항체는 하기와 같이 수득하였다:
실시예 1.2.A: 사람 IL-13 항원을 사용한 마우스의 면역화
완전 프로인트 애주번트 또는 Immunoeasy 애주번트(Qiagen, Valencia, CA)와 혼합된 20㎍의 재조합 정제된 사람 IL-13 변이체(Peprotech)를 제1일에 6 내지 8주된 Balb/C 및 5AJ 마우스 5마리, C57B/6 마우스 5마리 및 AJ 마우스 5마리의 피하로 주사하였다. 제24일, 제38일 및 제49일에 불완전 프로인트 애주번트 또는 Immunoeasy 애주번트와 혼합된 20㎍의 재조합 정제된 사람 IL-13 변이체를 동일한 마우스에 피하 주사하였다. 제84일 또는 제112일 또는 144일에 1㎍의 재조합 정제된 사람 IL-13 변이체를 마우스에 정맥내 주사하였다.
실시예 1.2.B: 하이브리도마의 생성
실시예 1.2.A에 기재된 면역화된 마우스로부터 수득한 비장세포를 문헌[Kohler, G. and Milstein 1975, Nature, 256:495]에 기재된 확립된 방법에 따라 5:1의 비율로 SP2/O-Ag-14 세포와 융합시켜 하이브리도마를 생성시켰다. 융합 생성물을 96웰 플레이트에 웰당 2.5 x 106개 비장 세포 밀도로 아자세린 및 하이포산틴을 함유하는 선별 배지에 분주하였다. 융합 후 7일 내지 10일째에, 육안으로 하이브리도마 콜로니가 관찰되었다. 하이브리도마 콜로니를 함유하는 각각의 웰 기원의 상청액을 IL-13 변이체에 대한 항체의 존재에 대해 ELISA로 시험하였다(실시예 1.1.A에 기재된 바와 같음). 이어서 IL-13 변이체 특이적 활성을 나타내는 상청액을, TARC에 대한 A-549 생물학적 분석법에서 IL-13 변이체와 IL-13 야생형을 중화시키는 능력에 대해 검사했다(실시예 1.1.C에 기술된 바와 같음).
실시예 1.2.C: 항 사람 IL-13 모노클로날 항체의 동정 및 특성 분석
실시예 1.2.B 및 1.2.C에 따라 생성된 IL-13 변이체에 결합되고, IL-13 변이체에 특이적으로 결합할 수 있는 항체, 특히 IC50 값이 A-549 생물분석법에서 5nM 또는 5nM 미만인 항체를 생산하는 하이브리드마를 증량시키고 한계 희석법으로 클로닝하였다.
하이브리도마 세포는 10% 낮은 IgG 태아 소 혈청(Hyclone #SH30151, Logan, UT.)을 함유하는 배지에서 확장시켰다. 평균적으로, 250 mL의 각각의 하이브리도마 상청액(클론 집단으로부터 유래됨)을 수거하고 농축시키고 문헌[Harlow, E. and Lane, D. 1988 "Antibodies": A Laboratory Manual"]에 기재된 바와 같은 단백질 A 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. IL-13의 활성을 억제하는 정제된 mAb의 능력은 실시예 1.1.C에 기재된 바와 같은 A-549 생물분석법을 사용하여 측정하였다. 표 7은 17개의 모노클로날 항체에 대한 A-549 생물분석법의 결과인 IC50 값을 보여준다.
[표 7]
Figure pat00017
재조합 정제된 사람 IL-13 변이체 및 야생형에 대한 모노클로날 항체의 결합 친화성은 실시예 1.1.B에 기재된 바와 같은 표면 플라즈몬 공명(Biacore®) 측정을 사용하여 측정하였다. 표 8은 사람 IL-13에 대해 상기된 18개의 모노클로날 항체의 친화성을 보여준다.
[표 8]
Figure pat00018
실시예 1.2.C.1: 쥐 모노클로날 항-사람 IL-13 항체의 종 특이성
상기된 17개의 모노클로날 항체가 쥐 IL-13을 인식하는지를 측정하기 위해 간접 ELISA를 ELISA 플레이트에 5㎍/ml의 염소 항마우스 IgG, Fc 단편 특이적 항체(Pierce #31170, Rockland, IL)를 코팅하여 세팅하였다. 쥐 항-사람 IL-13 mAb는 0.1% BSA를 함유하는 PBS로 0.1 내지 100ng/ml 범위의 다양한 농도로 제조하였고, 각각의 항체 희석물 50 ㎕를 피복된 ELISA 플레이트에 첨가하고 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 웰을 0.05% Tween-20을 함유하는 PBS로 3회 세척하였다. 재조합 비오틴화된 마우스 IL-13(R&D Systems)을 0.1% BSA을 함유하는 PBS로 0.1㎍/ml로 희석하고; 50 ul/웰을 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간동안 항온처리하였다. 웰을 0.05% Tween-20 함유 PBS로 3회 세척했다. 스트렙타비딘 HRP(Pierce # 21126, Rockland, IL)를 0.1% BSA 함유 PBS로 1:20000으로 희석하고; 50ml/웰을 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 항온처리했다. 평판을 0.05% Tween-20 함유 PBS로 3회 세척했다. TMB 용액(Sigma # T0440, St. Louis, MO.) 50㎕를 각각의 웰에 첨가하고 실온에서 10분동안 항온처리하였다. 1N 황산을 첨가하여 반응을 종료시켰다. 450nm의 파장에서 플레이트를 분광광도계로 판독하였다. 이러한 간접 ELISA 유래의 결과는, mAb 3H7이 mIL-13에 결합할 수 있음을 시사했다. 후속 생물분석법에서는 3H7이 용량 의존적 방식으로 mIL-13 자극된 TARC 생산을 억제할 수 있고 IC50이 2.4nM인 것으로 확인되었다. 또한, 비아코어(Biacore) 분석은 mIL-13에 대한 3H7의 양성 결합도 입증했고, KD가 12nM이었다. 표 8의 다른 mAb들은 모두 마우스 IL-13pd 대한 어떠한 양성 결합도 나타내지 않았다.
비-사람 영장류(사이노몰거스) IL-13 및 양의 IL-13에 대한 항-hIL-13 mAb의 중화능도 A-548 생물분석으로 측정했다. 사이노몰거스 및 양의 IL-13을 수득하기 위해, 각 단백질의 cDNA를 사람 IL-13 서열에 기초한 축퇴성 프라이머를 이용하여 게놈 DNA 주형 상에서의 PCR로 수득했다. 이어서 일시 형질감염된 COS 세포에서 재조합 사이노몰거스 및 양의 IL-13 단백질을 발현시켰다. 야생형 사람 IL-13도 모든 기능성 연구에서 대조군으로서 병행해서 수득했다. A-549 세포는 사이노몰거스 및 양의 IL-13 모두에 사람 IL-13의 ED50과 유사한 ED50으로 반응했다. mAb의 대부분은 사이노몰거스 IL-13의 활성을 중화시켰고, 이는 사이노몰거스 IL-13에 대한 교차반응성을 입증했다(표 7). 하지만, 어떠한 항체도 양의 IL-13을 유의적으로 중화시키지는 못했다.
실시예 1.2.C.2: 쥐 모노클로날 항-사람 IL-13 항체는 IL-13 수용체(IL-13R α1 및 IL-13Rα2)에 대한 IL-13 결합을 차단한다.
IL-13 활성은 IL-13Rα1 및 IL-4Rα쇄로 이루어진 수용체 복합체를 통해 매개된다. 이 사이토카인은 먼저 비교적 낮은 친화도로 세포 표면 상의 IL-13Rα1과 상호작용한다. 그다음, IL-13/IL-13Rα1 복합체는 IL-4Rα를 동원해서, 높은 친화도로 리간드(IL-13)에 결합하는 완전한 IL-13 수용체를 형성한다(Zurawski et al.(1993) EMBO J. 12:2663; Zurawski et al.(1995) J.Biol.Chem. 270: 23869). 높은 친화도 수용체와 IL-13의 결합은 그 다음, IL-13에 대한 최초의 세포 반응의 하나로서 모니터될 수 있는(Murata et al., 상기 문헌 참조) 야누스 키나제-전사 신호 전달인자 및 활성화인자(JAK-STAT) 경로를 수반하는 IL-4Rα 쇄를 통해, 예컨대 STAT6의 인산화를 통해 신호를 하류로 보낸다.
IL-13에 높은 친화도(0.25-1.2nM)로 결합하는 또 다른 IL-13 결합 수용체인, IL-13Rα2 쇄(IL-13Rα2)가 있다(Caput, et al 1996 J.Biol.Chem. 271, 16921-16926; Donaldson et al 1998 J.Immunol. 161, 2317-2324). IL-13/IL-13Rα2 복합체에 관련된 것으로 알려진 다른 수용체 분자는 없다. 맨처음 IL-13Rα2는 비신호화 "유인" 수용체로서 작용한다고 생각했다. 하지만, 이후에 IL-13에 결합할 수 있고 AP-1 경로를 통해 신호를 보내서 대식세포를 비롯한 특정 세포 유형에서 TNF-β 생산을 유도하며, 결국 폐 섬유증을 유도하는 것으로 밝혀졌다(Fichtner-Feigl, 2006 Nat Med 12: 99-106). 따라서, IL-13Rα1/IL-4R 복합체 및 IL-13Rα2 경로는 모두 천식 및 다른 IL-13 매개 질환의 전반적인 병태생리에 기여한다. 본 발명의 항-IL-13 항체와 사람 IL-13 사이의 상호작용을 밝히기 위해 에피토프 매핑, 수용체 결합 분석, 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 추가 BIACORE 분석과 같은 여러 시도를 사용했다.
전술한 모노클로날 항체가 IL-13 수용체(IL-13Rα1 및 IL-13Rα2)에 대한 IL-13 결합을 차단할 수 있는지를 측정하기 위해, 다음과 같은 수용체 결합 ELISA를 개발했다. 높은 결합성의 96웰 ELISA 플레이트에 100㎕/웰 코팅 완충액(탄산염-중탄산염 완충액, Pierce) 중의 4㎍/ml의 재조합 IL-13Rα1/Fc 또는 IL-13Rα2/Fc(R&D Systems)를 4℃에서 코팅시켰다. 16시간 후에 코팅 용액은 가라앉은 플레이트의 내용물을 털어내어 제거하고, 플레이트를 Superblock 차단 완충액(240㎕/웰)(Pierce)으로 4회 세척 및 차단시켰다. 항-IL13 mAb(40㎍/ml부터 연속 희석한 1:4 희석물, 50㎕/웰) 및 비오틴-IL-3(50㎕/웰, hIL-13Rα1/Fc의 최종 농도는 5nM, hIL-13Rα2/Fc는 0.5nM)을 첨가하고, 실온(RT)에서 2시간 동안 항온처리했다. 플레이트를 0.1% PBST 300㎕로 5회 세척한 뒤, 1:5000 희석된 마우스 항-비오틴 MAb(Jackson Immunosciences) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 45분 동안 항온처리했다. 이 플레이트를 다시 300㎕ 0.1% PBST로 5회 세척한 뒤, TMB 기질 시약(100㎕/웰, Pharmingen)을 첨가하고; 5분 동안 발색시킨 다음, 2M H2SO4(VWR) 50㎕를 첨가하여 반응정지시켰다. 450nm에서의 OD는 분광분석법으로 측정했다.
또한, mAb의 수용체 차단성을 IL-13Rα2 형질감염된 COS 세포를 이용한 수용체 결합 분석으로도 평가했다. 재조합 사람 IL-13은 종래 기술된 바와 같이(Obiri NI et al., (1995) J Biol Chem. 270: 8797-8804), IODO-GEN 시약(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 125I(Amersham, Arlington Heights, IL)로 표지했다. 방사능표지된 IL-13의 비활성은 158μCi/㎍ 단백질인 것으로 추정되었다. 표지된 IL-13은 A-549 생물분석으로 평가했을 때 미표지된 IL-13과 유사한 생물활성을 나타냈다. 결합 실험을 위해, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 COS 세포를 사람 IL-13Rα2로 일시적으로 형질감염시키고, 48시간 동안 항온처리했다. 형질감염된 COS 세포(100㎕ 결합 완충액: 0.2% 사람 혈청 알부민 및 10mmol HEPES 함유 RPMI 1640 중에 5 x 105개 세포)를 미표지된 IL-13 1μM 의 존재 또는 부재 하에 1.0nM 125I-IL-13과 함께 4℃에서 2시간 동안 항온처리했다. 세포에 결합된 125I-IL-13은 프탈레이트 오일 구배를 통한 원심분리를 이용하여 미결합된 125I-IL-13으로부터 분리했고, 방사능활성은 감마 계수기(Wallac, Gaithersburg, MD)로 측정했다. 항체 치환 분석에서, 형질감염된 COS 세포는 전술한 바와 같이 증가하는 농도(최고 50㎍/ml)의 항-IL-13 항체의 존재 또는 부재 하에 125I-IL-13(1.0nM)과 함께 항온처리했다. 수용체 결합 분석의 두 방식은 다음을 증명했다: 첫째, 13C5와 9C11은 IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 차단했다; 둘째, 13C5는 IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합을 강하게 차단하는 반면(세포 표면 RBA 및 RB ELISA 모두에서 IC50 = 약 1-3nM), 9C11은 더 낮은 효능(IC50 > 10nM)으로 IL-13Rα2의 IL-13 결합을 차단했다; 셋째, 5G1 및 3E5는 IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합을 차단하지 못했다. 다른 3가지 항-IL-13 항체, BAK502G9(CAT PCT WO 2005/007699), mAb13.2(Wyeth PCT WO 2005/123126A2) 및 MJ2-7(Wyeth PCT WO 2006/0073148A1)도 수용체 결합 ELISA 및 세포 표면 RBA에서 사람 IL-13 Rα2에 대한 사람 IL-13을 차단하는 능력에 대해 분석했다. 항체 mAb13.2는 IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합을 차단하지 못했다. BAK502G9 및 MJ2-7은 IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 차단할 수 있었으나, 50㎍/ml(330nM) 이하의 항체 농도에서 IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합을 차단하는 효능이 낮았다(330nM).
항-IL-13 mAb의 존재 하에 IL-13과 IL-13Rα1/α2 사이의 상호작용도 BIACORE로 분석했다. 이 분석은 여러 가지 방식으로 수행했다. 첫째, IL-13Rα1/Fc를 비아코어 칩에 결합시키고, 이 칩 위로 IL-13을 항-IL-13 mAb의 존재 및 부재 하에 이동시켰다. 특히, mAb 13C5 및 9C11은 IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 차단할 수 있는데 반해, 5G1 및 3E5는 수용체 결합 분석과 마찬가지로 IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 억제하지 못했다. 둘째, IL-4R을 BIACORE 칩에 결합시켰고, IL-13Rα1에 미리 결합시켜 둔 IL-13의 복합체를 칩 위로 이동시켰다. 항-IL-13 mAb의 부재 시에는 3분자 복합체의 형성이 입증되었다. 하지만, IL-13Rα1에 미리 결합시켜 둔 IL-13의 혼합물에 항-IL-13 항체의 첨가는 칩 위의 IL-4R에 대한 결합을 방해했다. 이것은 5G1이 IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 차단할 수 없을 지라도, IL-4R에 대한 IL-13 결합은 차단할 수 있으며, 이것이 IL-13 중화 활성 기전의 기본을 마련한다는 것을 시사했다. 이러한 관찰 결과는 또한 이종삼량체 복합체(mAb-IL-13-IL-13-Rα1/Fc)가 5G1에서 관찰되지만 13C5에서는 관찰되지 않는 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에 의해서도 확인되었다. mAb-IL-13 복합체의 프로테이나제 처리뒤, 질량분광 분석을 이용한 후속 에피토프 매핑 연구는 다음과 같은 결과를 시사했다: 첫째, 5G1은 IL-4R과 상호작용하는 것으로 밝혀진 바 있는(Moy et al 2001 J Mol Biol. 310: 219 및 Horita et al.(2001) J Mol Biol. 310:231) 나선 A 영역의 일부를 포함하고 있는 N-말단 11 aa 펩타이드(GPVPPSTALRE)를 포함한 IL-13 잔기에 결합하고; 둘째, 항체 9C11은 나선 C와 나선 D 사이의 영역(VSAGQFSSLHVR)과 상호작용하며; 셋째, 항체 13C5는 나선 D를 포함하는 영역(서열번호 1의 아미노산 104-130에 상응하는 VRDTK IEVAQ FVKDL LLHLK KLFRE GR)을 포함한 IL-13 잔기와 상호작용한다. 나선 D가 IL-13 수용체와 상호작용한다는 것은 밝혀져 있다(Moy et al 2001 J Mol Biol. 310: 219; Horita et al 2001 J Mol Biol. 310:231; 및 Madhankumar et al 2002 JBC 277:43194). 13C5는 사이노몰거스 IL-13(KD=1800pM)보다 사람 IL-13 변이체(KD=50pM)에 훨씬 더 강하게 결합하고, 이러한 잠재적인 13C5 에피토프 영역 내에서 사람 IL-13 변이체와 사이노몰거스 IL-13 사이의 유일한 서열 차이는 위치 120에서 사이노몰거스 IL-13의 V와 달리 사람에서는 L이기 때문에, V120L 돌연변이 사이노몰거스 IL-13을 만들어서, 이 돌연변이가 야생형 사이노몰거스 IL-13보다 13C5에 대한 증가된 결합 친화성을 나타내는지를 검사했다. 비아코어 및 생물분석 결과를 기초로 할 때, V120L 돌연변이 사이노몰거스 IL-13의 13C5의 중화 효능뿐만 아니라 결합 친화도는 야생형 사이노몰거스 IL-13와 동등했고, 이것은 C-말단 영역 내의 위치 120에서의 V/L 차이가 사람 IL-13 변이체 대 사이노몰거스 IL-13의 13C5 친화도 차이에 기여하지 않으며, 분명히 C-말단 영역 외의 다른 잔기가 사람 및 사이노몰거스 IL-13에 대한 13C5의 다른 결합 친화도에 기여할 것이라는 것을 시사한다. 이것은 13C5가 웨스턴 블롯 분석에서 변성된 사람 IL-13을 인식하지 못한다는 관찰과 일치하는 것으로서, 사람 IL-13에 존재하는 13C5의 결합 에피토프는 강한 입체형태성임을 시사한다.
결합성 및 에피토프 매핑 연구는 5G1이 IL-13Rα1과 IL-13의 상호작용을 억제하지 않지만, IL-4Rα와 IL-13/IL-13Rα1의 상호작용을 방해한다는 것을 시사했다. 이러한 방해는 기능성 IL-13 신호 복합체의 형성을 방해한 것으로 생각된다. 이러한 관찰은 A-549 세포와 같은 IL-13Rα1/IL-4R 매개의 시스템에서 상기 항체의 중화 활성의 이론적 모델을 제공한다. 이에 반해, 13C5는 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2 모두에 대한 IL-13의 결합을 차단했다. 흥미로운 것은, 9C11이 IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 차단할 수 있지만, IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합의 부분(또는 낮은 효능) 억제만을 보여주었다. IL-13Rα1 및 Rα2는 유사한 3차원 폴드와 IL-13 결합 배향을 갖고 있지만, 서열 동일성은 낮아서 IL-13 결합에 영향을 미치는 특이적 잔기는 다를 수 있다(Arima 2005 JBC 280: 24915; 및 Madhankumar et al 2002 JBC 277: 43194). 결론적으로, IL-13Rα1 및 IL-13Rα2에 결합하는데 사용되는 IL-13 상의 특정 잔기는 상이할 수 있고, 이것은 9C11의 다른 수용체 차단성을 설명할 수 있다.
이상 설명한 수용체 결합 분석, 에피토프 매핑, 비아코어 및 생물분석을 종합해보면, 중화성 항-IL-13 항체가 다음과 같은 기전을 통해 IL-13 관련 활성을 억제할 수 있음을 시사한다:
1) IL-13Rα1 및 IL-13Rα2에 대한 수용체 결합에 관련된 영역에서 IL-13과의 상호작용에 의한 IL-13Rα1과 IL-13Rα2 모두에 대한 IL-13 결합의 억제. 이러한 항체의 일 예는 13C5이다. 이러한 항체는 IL-13Rα1/IL-4R 복합체와 IL-13Rα2 양자를 통해 IL-13 신호를 억제할 것이다.
2) IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합을 억제하지 않는다. 하지만, 이 항체는 IL-4 수용체와의 상호작용을 억제하여, IL-13Rα1/IL-4R 복합체를 통한 IL-13 신호를 억제한다. 이러한 항체는 IL-13Rα2 신호를 억제하지 않을 수 있다. 이러한 항체의 예는 5G1 및 mAb3.2(Wyeth PCT WO 2005/123126)이다.
3) IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 억제하나, IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합은 효과적으로 억제하지 않는다. 이것은 다음과 같은 이유로 인해 일어날 수 있다: a) 에피토프: IL-13Rα1 결합에 관련이 있지만 IL-13Ra2 결합에는 관련이 없거나 또는 IL-13Rα2 결합에 그다지 강하게 관련이 없는 영역. 일 예는 9C11이다; b) 친화도: IL-13Rα2가 IL-13Rα1보다 IL-13에 대해 친화도가 훨씬 높기 때문에, 저친화도 항체는 치료적 항체의 생리적 농도에서 IL-13Rα2가 아닌 IL-13Rα1에 대한 IL-3의 결합을 차단할 수 있다. 일 예는 BAK502G9이며, 이것은 비아코어로 평가했을 때 재조합 야생형 사람 IL-13에 대한 2.11nM 친화도를 나타냈다(CAT PCT WO 2005/007699). 다른 예는 MJ2-7로서, 비아코어로 평가했을 때 재조합 야생형 사람 IL-13에 대해서는 1.4nM 친화도를 나타내고 원숭이 IL-13에 대해서는 더 높은 친화도(43pM)를 나타냈다(Wyeth PCT WO 2006/0073148A1). 친화도 차이로 인해, 이 mAb는 IL-13Rα2에 대한 원숭이 IL-13 결합을 효과적으로 억제할 수 있으나, 동일 수용체에 대한 사람 IL-13의 결합은 훨씬 적은 효능으로 억제한다.
mAb인 BAK502G9와 MJ2-7은 유사한 에피토프(CAT PCT WO 2005/007699 및 Wyeth PCT WO 2006/0073148A1)를 보유하며 경쟁 ELISA로 평가했을 때 IL-13에 대한 결합에 대해 경쟁한다. 간략히 설명하면, BAK502G9를 ELISA 플레이트에 고정시킨 뒤, 세척 및 차단했다. 그 다음, 비오틴화된 사람 IL-13(10ng/ml)을 다양한 농도의 MJ2-7(0.2ng/ml 내지 20㎍/ml)의 존재 하에 플레이트에 첨가한 뒤, 세척하고 HRP 접합 항비오틴 항체로 검출했다. 본 연구는 MJ2-7이 사람 IL-13에 결합하는데 있어서 BAK502G9와 용량 의존적으로 경쟁함을 입증했다. 음성 대조군 IgG는 BAK502G9와의 경쟁을 나타내지 않았다.
실시예 1.2.D: 각각의 쥐 항-사람 IL-13 mAb 에 대한 가변 영역의 아미노산 서열 결정
각각의 아미노산 서열 결정을 위해, 제조업자의 지침에 따라 약 10 x 106개 하이브리도마 세포를 원심분리로 분리하고 트리졸(Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad, CA.)로 처리하여 총 RNA를 분리하였다. 전체 RNA를 제조업자의 지침에 따라 슈퍼스크립트 제1 쇄 합성 시스템(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제1 쇄 DNA 합성에 사용했다. 올리고(dT)를 사용하여 제1 쇄 합성을 프라이밍하여 폴리(A)+ RNA를 선별하였다. 이어서, 제1쇄 cDNA 작제물은 쥐 면역글로불린 가변 영역 증폭용으로 디자인된 프라이머(Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, WI)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. PCR 생성물을 아가로스 겔상에서 분리하고 절단하고 정제함에 이어서 TOPO 클로닝 키트를 사용하여 pCR2.1-TOPO 벡터(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 서브클로닝하고 TOP10 화학적 컴피턴트 이.콜라이(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 형질전환시켰다. 콜로니 PCR을 형질전환체에 대해 수행하여 삽입체 함유 클론을 동정하였다. 플라스미드 DNA는 QIAprep 미니프렙 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 사용하여 삽입체 함유 클론으로부터 분리하였다. 플라스미드내 삽입체의 양 쇄를 서열분석하고 M13 정방향 및 M13 역방향 프라이머(Fermentas Life Sciences, Hanover MD)를 사용하여 가변 중쇄 또는 가변 경쇄 DNA 서열을 결정하였다. 실시예 1.2.C에 기재된 17개의 모노클로날 항체의 가변 중쇄 및 가변 경쇄 서열은 표 5에 기재한다.
실시예 2: 재조합 항 사람 IL-13 항체
실시예 2.1: 재조합 키메라 항 사람 IL-13 항체의 작제 및 발현
쥐 항 사람 IL-13 모노클로날 항체 5G1, 13C5, 9C11, 21D9 및 3H7의 중쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA는 세균에서 상동성 재조합에 의해 2개의 힌지 영역 아미노산 돌연변이를 함유하는 사람 IgG1 불변 영역을 암호화하는 cDNA 단편으로 대체하였다. 이들 돌연변이는 234번(EU 번호매김) 위치에서 류신이 알라닌으로 변화되고 235번 위치에서 류신이 알라닌으로 변화된 것이다(Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). 이들 항체 각각의 경쇄 불변 영역은 사람 카파 불변 영역으로 대체하였다. 전장 키메라 항체는 pBOS 발현 플라스미드(Mizushima and Nagata, Nucleic Acids Research 1990, Vol 18, pg 5322)에 연결된 키메라 중쇄 및 경쇄 cDNA의 동시 형질감염에 의해 COS 세포에서 일시적으로 발현되었다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상청액은 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체는 산 완충액을 첨가하여 용출시켰다. 항체를 중화시키고 PBS로 투석시켰다.
이어서 정제된 키메라 항-사람 IL-13 모노클로날 항체는 실시예 1.1.C2 및 1.1.C3에 기재된 바와 같이 A-549 세포에 의한 TARC의 IL-13 유도 생산을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 표 9는 3개의 키메라 항체에 대한 A-549 생물검정으로부터의 IC50 값을 나타낸다.
[표 9]
Figure pat00019
실시예 2.2: 사람화된 항 사람 IL-13 항체의 작제 및 발현
실시예 2.2.1: 사람 항체 프레임워크의 선택
각각의 쥐 가변 중쇄 및 가변 경쇄 유전자 서열(표 3에 기재된 바와 같음)은 각각 벡터 NTI 소프트웨어를 사용하여 44개의 사람 면역글로불린 배선 가변 중쇄 또는 46개의 배선 가변 경쇄 서열(NCBI Ig Blast 웹사이트 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html로부터 유래)에 대해 정렬시켰다.
사람화는 아미노산 서열 상동성, CDR 클러스터 분석, 발현된 사람 항체중에서의 사용 빈도 및 사람 항체의 결정 구조에서의 이용가능한 정보를 기초로 했다. 항체 결합, VH-VL 쌍형성 및 기타 요인에 미치는 가능한 효과를 고려하여, 쥐와 사람 프레임워크 잔기가 몇몇을 제외하고는 상이한, 쥐의 잔기를 사람 잔기로 변이시켰다. 쥐 항체 가변 영역의 실제 아미노산 서열과 고도의 상동성, 즉 서열 유사성을 보유하는 사람 배선 항체 서열 또는 이의 하위그룹의 분석에 기초하여 추가 사람화 전략도 설계했다.
상동성 모델링을 사용하여, 항체 결합 부위(CDR)의 구조에 중요한 것으로 예상되는 쥐 항체 서열에 고유한 잔기를 동정했다. 상동성 모델링은 계산적 방법으로서, 대략적인 3차원 좌표가 단백질을 생성했다. 초기 좌표의 근원과 이에 대한 추가 보정의 지침은 3차원 좌표가 공지되어 있고 그 서열이 최초 단백질의 서열과 관련이 있는 참조 단백질인 제2 단백질이다. 두 단백질의 서열 간의 관계를 사용하여 참고 단백질과 원하는 좌표의 단백질, 즉 표적 단백질 간의 상응성을 얻었다. 참조 단백질과 표적 단백질의 1차 서열은 참조 단백질로부터 표적 단백질로 직접 전달된 두 단백질의 동일 부위의 좌표와 정렬시킨다. 잔기 돌연변이, 삽입 또는 결실 등으로 인한 두 단백질의 부정합 부위의 좌표는 이미 전달된 모델 좌표와 확실하게 일치하도록 세분된 에너지와 유전자 구조 주형으로부터 제작된다. 이러한 계산적 단백질 구조는 다시 세분되거나 또는 모델링 연구에 직접 이용할 수 있다. 이러한 설명으로부터 모델 구조의 품질이 참조 단백질과 표적 단백질의 관련성 주장의 정확도와 서열 정렬이 제작되는 정밀도에 의해 결정된다는 것을 분명하게 알 수 있다.
쥐 서열 5G1, 13C5 및 9C11에 대해서는 적당한 참조 구조를 동정하기 위해 BLAST 조사 및 육안검사를 함께 사용했다. 참조 아미노산 서열과 표적 아미노산 서열 간에 25%의 서열 동일성은 상동성 모델링 연습을 시도하는데 필수적인 최소값으로 생각된다. 서열 정렬은 수작업으로 구축하며, 모델 좌표는 프로그램 자칼(Jackal, 참조: Petrey, D., Xiang, Z., Tang, C.L., Xie, L., Gimpelev, M., Mitros, T., Soto, C.S., Goldsmith-Fischman, S., Kernytsky, A., Schlessinger, A., et al. 2003, Using multiple structure alignments, fast model building and energetic analysis in fold recognition and homology modeling. Proteins 53(Suppl. 6): 430-435)로 얻었다.
선택한 항체의 쥐 및 사람 프레임워크 영역의 1차 서열은 상당한 동일성을 공유한다. 상이한 잔기의 위치는 쥐 항체의 관측된 결합 효능을 유지하기 위해 사람화된 서열에 포함시킬 쥐 잔기의 후보이다. 사람과 쥐 서열 간에 상이한 프레임워크 잔기의 목록을 수작업으로 구축했다.
주어진 프레임워크 잔기가 항체의 결합성에 영향을 미칠 수 있는 가능성은 CDR 잔기에 대한 근접성에 의존적이다. 따라서, 모델 구조를 이용하여 CDR 내의 임의의 원자로부터 떨어진 거리에 따라서 쥐 서열과 사람 서열 간에 상이한 잔기의 순위를 매겼다. 임의의 CDR 원자의 4.5Å 내에 위치한 잔기는 가장 중요한 잔기로 확인되었고, 사람화된 항체에서 유지시켜야 하는 쥐 잔기의 후보인 것으로 권장되었다(즉, 역 돌연변이).
5G1 가변 영역의 사람화를 위해서, 본 발명에서 제공된 일반적 시도를 따랐다. 먼저, 5G1 가변 영역의 분자 모델은 컴퓨터 프로그램 ABMOD와 ENCAD(Levitt, M., J.Mol.Biol. 168: 595-620(1983))의 도움으로 작제했다. 그 다음, 사람 V 및 J 분절 서열에 대한 상동성 조사에 기초하여, VH 분절 21/28(Dersimonian, H., et al., J.Immunol. 139: 2496-2501(1987)) 및 J 분절 JH4(Ravetch, J.V., et al., Cell 27: 583-591(1981))를 선택하여 Hu5G1 중쇄 가변 영역의 프레임워크를 만들었다. 5G1 경쇄가변 영역으로는 VL 분절 HF-21/28(Chastagner, P., et al., Gene 101: 305-306(1991)) 및 J 분절 JK4(Hieter, P.A., et al., J.Biol.Chem. 257: 1516-1522(1982))를 사용했다. 5G1 VH와 수용체 사람 21/28 및 JH4 분절 사이의 프레임워크 아미노산의 동일성은 72%였고, 이에 반해 5G1 VL과 사람 HF 21/28 및 JK4 분절 사이의 동일성은 83%였다. 컴퓨터 모델에서 CDR과 상당히 접촉되어 있음을 시사한 프레임워크 위치에서, 본래의 사람 프레임워크 아미노산을 마우스 V 영역 유래의 아미노산으로 교체했다. 이것은 중쇄의 잔기 48, 67, 68, 70, 72, 74 및 97에서 이루어졌다. 경쇄에 대해서는 잔기 50에서 교체가 이루어졌다. 대응하는 사람 V 영역 하위그룹에 각각의 위치마다 드물게 나타나는 프레임워크 잔기는 이들 위치에 해당하는 사람 컨센서스 아미노산으로 교체했다. 이것은 중쇄의 잔기 44와 76에서 이루어졌고, 경쇄의 잔기 2, 15, 41, 42, 44 및 51에서 이루어졌다.
13C5 가변 영역의 사람화를 위해, 본 발명에 제시된 일반적 시도를 따랐다. 먼저, 13C5 가변 영역의 분자 모델은 컴퓨터 프로그램 ABMOD와 ENCAD(Levitt, M., J.Mol.Biol. 168: 595-620(1983))의 도움으로 작제했다. 그 다음, 사람 V 및 J 분절 서열에 대한 상동성 조사에 기초하여, VH 분절 M60(Schroeder, Jr., H.W. and Wang, J.Y., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6146-64150(1990)) 및 J 분절 JH4(Ravetch, J.V., et al., Cell 27: 583-591(1981))를 선택하여 Hu13C5 중쇄 가변 영역의 프레임워크를 만들었다. Hu13C5 경쇄 가변 영역으로는 VL 분절 III-3R(Manheimer-Lory, A., et al., J.Exp.Med. 174: 1639-1652(1991)) 및 J 분절 JK4(Hieter, P.A., et al., J.Biol.Chem. 257: 1516-1522(1982))를 사용했다. 13C5 VH와 수용체 사람 M60 및 JH4 분절 사이의 프레임워크 아미노산의 동일성은 74%였고, 이에 반해 13C5 VL과 사람 III-3R 및 JK4 분절 사이의 동일성은 75%였다.
컴퓨터 모델에서 CDR과 상당히 접촉되어 있음을 시사한 프레임워크 위치에서, 본래의 사람 프레임워크 아미노산을 마우스 V 영역 유래의 아미노산으로 교체했다. 이것은 경쇄의 잔기 22, 49 및 71에서 이루어졌다. 대응하는 사람 V 영역 하위그룹에서 각각의 위치마다 드물게 나타나는 프레임워크 잔기는 이들 위치에 해당하는 사람 컨센서스 아미노산으로 교체했다. 이것은 중쇄의 잔기 10, 46, 83, 84, 86 및 87에서 이루어졌고, 경쇄의 잔기 62 및 73에서 이루어졌다.
사람화된 mAb의 VL 및 VH의 아미노산 서열은 표 10에 제시했다.
[표 10a]
Figure pat00020
[표 10b]
Figure pat00021
실시예 2.2.2: 사람화된 항체의 작제
상기된 바와 같이 컴퓨터 모의 실험 하에(in silico) 작제된 사람화된 항체는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 새롭게 작제하였다. 각각의 가변 영역 cDNA로, 각각 60 내지 80개의 뉴클레오타이드를 갖는 6개의 올리고뉴클레오타이드는 서로 각각의 5' 및 3' 말단에서 20개의 뉴클레오타이드가 중복하도록 디자인하였다. 어닐링 반응에서, 모든 6개의 올리고를 합하여 비등시키고 dNTP의 존재하에 어닐링하였다. 이어서, DNA 폴리머라제 I, 대형 (클레노우) 단편(New England Biolabs #M0210, Beverley, MA.)을 첨가하여 중복 올리고뉴클레오타이드간의 약 40bp 빈틈을 채웠다. 이어서 변형된 pBOS 벡터에서 다중 클로닝 부위에 상보적인 오버행 서열을 함유하는 2개의 최외곽 프라이머를 사용하는 PCR을 수행하여 전체 가변 영역 유전자를 증폭시켰다(Mizushima, S. and Nagata, S., (1990) Nucleic acids Research Vol 18, No. 17)). 각각의 cDNA 어셈블리로부터 유래된 PCR 생성물을 아가로스 겔상에 분리하고 예측된 가변 영역 cDNA 크기에 상응하는 밴드를 절개하여 정제하였다. 가변 중쇄 영역을 세균에서 상동성 재조합에 의해 2개의 힌지-영역 아미노산 돌연변이를 함유하는 사람 IgG1 불변 영역을 암호화하는 cDNA 단편에 프레임에 맞게 삽입했다. 이들 돌연변이는 234번 위치(EU 번호매김)에서 류신이 알라닌으로 변화하고 235번 위치에서 류신이 알라닌으로 변화된 것이다(Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657). 가변 경쇄 영역은 상동성 재조합에 의해 사람 카파 불변 영역과 프레임이 맞게 삽입하였다. 세균 콜로니를 분리하고 플라스미드 DNA를 추출하여, cDNA 삽입체를 전체적으로 서열분석하였다. 각각의 항체에 상응하는 올바른 사람화된 중쇄 및 경쇄로 COS 세포를 공동형질감염시켜 전장 사람화된 항-사람 IL-13 항체를 일시적으로 생산하였다. 13C5에 대해서는 13C5 중쇄 이식된 cDNA와 13C5 경쇄 이식된 cDNA를 함유하는 pBOS 벡터로 COS 세포를 공동형질감염시켰다. 재조합 키메라 항체를 함유하는 세포 상청액은 단백질 A 세파로스 크로마토그래피로 정제하고 결합된 항체는 산 완충액을 첨가하여 용출시켰다. 항체는 중화하고 PBS내로 투석하였다. 7개의 사람화된 항체는 표 10에 나타낸다.
IL-13 활성을 억제하는 정제된 사람화된 항체의 능력은 실시예 1.1.C에 기재된 바와 같은 A-549 생물검정으로 측정하였다. 재조합 사람 IL-13에 대한 사람화된 항체의 결합 친화도는 실시예 1.1.B에 기재된 바와 같이 표면 플라스몬 공명(Biacore®)을 사용하여 측정하였다. 표 11은 A-549 생물검정으로부터의 IC50 값 및 사람 IL-13wt 및 변이체에 대한 표 10에 제시된 처음 6개 사람화된 항체의 친화도를 보여준다.
[표 11]
Figure pat00022
사람화된 항체 13C5.5의 CDR 서열은 다시 당업계에 공지된 기술로 돌연변이시켜, 3개의 추가 사람화된 항체를 만들었다. 이러한 추가 사람화된 항체가 사람, 사이노몰거스 및 리서스 IL-13 활성을 억제하는 능력은 실시예 1.1.C에 기술된 바와 같은 A-549 생물검정으로 측정했다. 추가 사람화된 항체의 재조합 사람, 사이노몰거스 및 리서스 IL-13에 대한 결합 친화도는 실시예 1.1.B에 기술된 바와 같이 표면 플라즈몬 공명(Biacore®) 측정법으로 측정했다. 사람 IL-13에 결합 및 억제하는 것 외에도, 상기 3가지 추가 항체는 사이노몰거스 및 리서스 IL-13에 대해서는 향상된 친화도를 나타냈다. 표 12는 A-549 생물검정 유래의 IC50 값을 나타내고, 표 13은 상기 추가 사람화된 항체의 사람, 사이노몰거스 및 리서스 IL-13에 대한 친화도를 나타낸다.
[표 12]
Figure pat00023
[표 13]
Figure pat00024
실시예 2.2.3: 사람화된 항 IL-13 항체의 특성분석
본 발명자들은 IL-13Rα1 및 IL-13Rα2에 대한 IL-13 결합을 차단하는 모노클로날 항체를 분리했다. ELISA 기반 수용체 결합 분석 및 세포 표면에서의 125-I-표지된 IL-13 결합 분석은 쥐형 및 사람화된 형(즉, 13C5.5) 양자의 13C5가 양자의 수용체에 대한 IL-13의 결합을 효과적으로 차단할 수 있음을 입증했다. 13C5와 동일한 계통의 항체, 예컨대 25C8 및 33C3도 양자의 수용체에 대한 IL-13 결합을 차단할 수 있었다.
실시예 2.2.3.a: 사람화된 항 IL-13 항체는 IL-13 수용체에 대한 IL-13의 결 합을 차단한다.
IL-13 수용체(IL-13Rα1 및 IL-13Rα2)에 대한 IL-13 결합을 차단하는 사람화된 항체 13C5.5의 능력을 측정하기 위해, ELISA 기반의 수용체 결합 분석을 사용했다. 높은 결합성의 96웰 ELISA 플레이트는 100㎕/웰 코팅 완충액(탄산염-중탄산염 완충액, Pierce) 중의 재조합 사람 IL-13Rα1/Fc 또는 IL-13Ra2/Fc(R&D Systems) 4㎍/ml으로 4℃에서 코팅했다. 16시간 후에 코팅 용액은 가라앉은 플레이트의 내용물을 털어내어 제거하고, 플레이트를 Superblock 차단 완충액(240㎕/웰)(Pierce)으로 4회 세척 및 차단시켰다. 사람화된 항-IL13 mAb 13c5.5 및 대조용 mAb(40㎍/ml부터 연속 희석한 1:4 희석물, 50㎕/웰) 및 비오틴-IL-3(50㎕/웰, hIL-13Rα1/Fc의 최종 농도는 5nM, hIL-13Rα2/Fc는 0.5nM)을 첨가하고, 실온(RT)에서 2시간 동안 항온처리했다. 플레이트를 0.1% PBST 300㎕로 5회 세척한 뒤, 100㎕의 1:5000 희석된 마우스 항-비오틴 MAb(Jackson Immunosciences)를 첨가하고 실온에서 45분 동안 항온처리했다. 플레이트를 300㎕의 0.1% PBST로 다시 5회 세척한 뒤, TMB 기질 시약(100㎕/웰, Pharmingen)을 첨가하고; 5분 동안 발색시킨 다음, 2M H2SO4(VWR) 50㎕를 첨가하여 반응정지시켰다. 450nm에서의 OD는 분광분석법으로 측정했다. 결과는 표 14에 제시했다.
또한, 사람화된 mAb의 수용체 차단성은 IL-13Rα2 형질감염된 COS 세포를 이용한 세포표면 기반 수용체 결합 분석으로도 평가했다. 재조합 사람 IL-13은 종래 기술된 바와 같이(Obiri NI et al., (1995) J Biol Chem. 270: 8797-8804), IODO-GEN 시약(Pierce, Rockford, IL)을 이용하여 125I(Amersham, Arlington Heights, IL)로 표지했다. 방사능표지된 IL-13의 비활성은 158μCi/㎍ 단백질인 것으로 추정되었다. 표지된 IL-13은 A-549 생물분석으로 평가했을 때 미표지된 IL-13과 유사한 생물활성을 나타냈다. 결합 실험을 위해, 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 COS 세포를 사람 IL-13Rα2로 일시적으로 형질감염시키고, 48시간 동안 항온배양했다. 형질감염된 COS 세포(100㎕ 결합 완충액: 0.2% 사람 혈청 알부민 및 10mmol HEPES 함유 RPMI 1640 중에 5 x 105 세포)를 미표지된 IL-13 1μM 의 존재 또는 부재 하에 1.0nM 125I-IL-13과 함께 4℃에서 2시간 동안 항온처리했다. 세포에 결합된 125I-IL-13은 프탈레이트 오일 구배를 통한 원심분리를 이용하여 미결합된 125I-IL-13으로부터 분리했고, 방사능활성은 감마 계수기(Wallac, Gaithersburg, MD)로 측정했다. 항체 치환 분석에서, 형질감염된 COS 세포는 전술한 바와 같이 증가하는 농도(최고 50㎍/ml)의 항-IL-13 항체의 존재 또는 부재 하에 125I-IL-13(1.0nM)과 함께 항온처리했다. 그 결과는 표 14에 제시했다.
[표 14]
Figure pat00025
표 15는 사람화된 13C5.5 항체 및 다른 항-IL-13 항체의 결합 친화도를 나타낸다.
[표 15]
Figure pat00026
세포표면 기반 및 ELISA 기반의 수용체 결합 분석에서, 13C5.5는 1 내지 3nM 사이의 IC50으로, 사람 IL-13Rα2에 대한 사람 IL-13의 결합을 차단하는데 있어서 높은 효능을 나타낸다. 또한, BAK502G9 및 MJ2-7도 결합 신호를 감소시킬 수 있었지만, 이들의 효능은 13C5.5의 효능보다 훨씬 낮았고(표 14 참조), 이는 적어도 부분적으로는 사람 wt IL-13에 대한 낮은 친화도때문이었다(표 15 참조). mAb13.2는 이의 에피토프가 일치하는 IL-13Ra2에 대한 IL-13의 결합을 억제할 수 없었다. 또한, 13C5.5는 100nM(또는 15㎍/ml)의 농도에서 양 분석법에서 100% 억제를 달성할 수 있다. 동일한 농도에서, BAK502G9 및 MJ2-7은 세포표면 기반 수용체 결합 분석에서 각각 겨우 40% 및 70% 억제를 나타냈고, ELISA 기반 수용체 결합 분석에서는 둘다 겨우 60%의 억제를 나타냈다.
사람에서 혈청 반감기가 10 내지 20일인 치료용 mAb는 매주 또는 격주마다의 IV 또는 SC 3mpk 이하의 투여 방법에 의해 혈청 농도가 보통 내지 15㎍/ml이다. 이러한 계산에 기초할 때, 13C5.5는 모노클로날 항체의 통상적인 투여 방법 하에 100nM(또는 15㎍/ml)의 혈청 농도에서 치료용 mAb로서 생체 내에서 IL-13Rα2에 대한 사람 IL-13의 결합을 완전히(100%) 차단할 수 있을 것 같은 현재 유일한 항-IL-13 mAb이다.
실시예 2.2.3.b: IL-13 상의 특이적인 에피토프에 대한 항 IL-13 항체의 결 합
항-IL-13 mAb인, 13C5, 13C5.5, 9C11 및 5G1이 결합하는 사람 IL-13의 에피토프는 에피토프 절제 기술, 그 다음 질량분광분석(MS)과 함께 펩타이드 분석을 이용하여 매핑했다. 에피토프 절제에서, 단백질은 먼저 고정화된 mAb에 결합시켰고, 그 다음 단백분해 효소로 절단했다. 단백질 상의 에피토프 영역은 MS 및 MS/MS를 이용하여 에피토프 함유 펩타이드를 동정했다. CNBr-활성화된 세파로스 비드(Amersham Biosciences, 10mg/반응)는 0.1M HCl 500㎕에 현탁시키고 15분 동안 평형화시켰다. 비드를 치밀한 반응 컬럼(USB Corporation)으로 이동시킨 후, 0.1M HCl과 이어서 0.1M NaHCO3 커플링 완충액으로 세척했다. 이 현탁액에 mAb(100㎍)를 첨가하고 실온에서 천천히 회전시키면서 2시간 동안 항온처리했다. mAb가 공유 부착된 비드는 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 약 8.0)으로 세척했다. CNBr 세파로스 비드 상의 미반응 그룹의 차단은 0.1M Tris-HCl 완충액(pH 약 8.0)으로 2시간 동안 항온처리하여 달성했다. 미커플링된 mAb는 다른 pH의 2가지 완충액, 1) 0.1M Na 아세테이트, 0.5M NaCl pH 약 4.0 완충액 및 2) 0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl pH 약 8.0 완충액으로 연속 세척하여 제거했다. 이 비드를 PBS 약 0.14M NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na2HPO4, 1.5mM KH2PO4, pH 7.2에서 평형화시키고, IL-13의 존재 및 부재 하에 실온에서 2시간 동안 항온처리했다. 비드를 PBS pH 약 7.2로 세척한 후, 현탁액의 일정량을 MALDI-TOF 분석을 위해 분취했다.
친화도 결합된 단백질은 여러 프로테아제(1:100 내지 1:20 효소:기질 비)로 12시간 동안 분해했다. 사용된 프로테아제는 다음과 같다: 트립신, GluC, 키모트립신, 카르복시펩티다제 Y 및 아미노펩티다제 M. 단백분해 후, 비드는 분해 완충액 500㎕로 세척했다. 마지막 100㎕의 세척 용액을 대조군으로 모아두었다. 이 비드에 2% TFA 약 100㎕를 첨가하여 수집했다. 대조군 및 산 세척 용액은 먼저 진공 하에 약 20㎕로 농축했다. 그 다음, 펩타이드는 C18 집팁(ziptip)으로 탈염시켰다. 샘플은 Voyager DE 또는 Voyager DE-Pro 시스템을 이용하여 MALDI-ToF MS로 분석했다. 나노-ESI-LC-MS/MS에 의한 분석은 Sciex Q-Star Pulsar i MS 시스템에 접속된 Agilent 1100 Capillary HPLC 시스템에서 수행했다.
13C5의 에피토프 연구에 있어서, 후속 단계들에 사용된 2가지 프로테아제가 최상의 결과를 제공했다. 키모트립신은 서열번호 1의 아미노산 잔기 100-130으로 이루어진 주요 펩타이드를 검출했고, 에피토프(들)를 포함하고 있을 수 있음을 시사했다. 서열번호 1의 아미노산 잔기 103-130 및 104-130의 펩타이드도 소량 검출되었다. 키모트립신 분해 후에는 아미노펩티다제 M을 사용했다. 검출된 주요 펩타이드는 서열번호 1의 아미노산 잔기 104-130이었고, 이는 4개의 N-말단 아미노산 잔기(80-83)는 에피토프의 일부가 아님을 시사했다. 카르복시펩티다제 Y에 의한 추가 분해는 친화도 상실을 초래했다. 분해 및 세척 후에는 펩타이드가 전혀 관찰되지 않았다. 모든 펩타이드 서열은 나노-ESI-LC-MS/MS를 사용하여 확인했다.
13C5 및 13C5.5의 에피토프 매핑은 이의 결합 부위(들)가 사람 IL-13의 C-말단 나선 D 영역(잔기 VRDTK IEVAQ FVKDL LL HLK KLFRE GR, 서열번호 1의 아미노산 104-130에 해당)을 포함한다는 것을 나타냈다. c-말단 나선 D 영역은 IL-13 수용체와의 상호작용에 관련되는 것으로 제안된 바 있다(Zuegg et al 2001 Immunol Cell Biol. 79: 332-9).
실시예 2.3: IL-13과 복합체를 형성한 항-IL-13의 결정화
13C5.5의 Fab 부위는 사람 IL-13과 복합체를 형성했고, 이 복합체의 결정은 다음과 같이 생성시켰다.
실시예 2.3.1: 13 C5 .5 Fab 단편의 제조 및 정제
13C5.5 Fab 단편을 제조하기 위해, 0.15M PBS 완충액 중의 13C5.5 IgG를 먼저 Ultrafree-15 Biomax 10kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심분리 필터 장치(Millipore)를 이용하여 2mg/ml로 농축했다. 파파인 겔 슬러리(Pierce)를 1:1 용적 비의 완충액 A(20mM NaHPO, 10mM EDTA, 20mM 시스테인)로 2-3X 예비세척하고 주입했다. 그 다음, 50% 파파인 겔 슬러리와 농축된 항체를 혼합하고 강력한 진탕 하에 37℃에서 24시간 동안 항온처리했다. 항체/슬러리 혼합물은 원심분리하고(Beckman 6KR), 상청액은 PBS 예비평형화된 Superdex 75 위에 로딩했다. 주요 피크가 용출되었고, 단백질을 모았다. 25ml Protein A Sepharose 4 Fast Flow 친화도 컬럼(Amersham Pharmacia)은 PBS 100ml로 세척하여 준비했다. 모은 항체 단편을 친화도 컬럼(2ml/min 유속)에 적용했다. 13C5.5 Fab 단편을 함유하는 분획(280nm에서 UV 흡광도에 의해 모니터됨)을 관통물로 수집했다. 13C5.5 Fab 단편 농도가 0.3mg/ml 보다 큰 분획(280nm에서 UV 흡광도로 측정)을 모아서 -80℃에서 동결시켰다. 시료 순도는 SDS-PAGE로 평가했다.
실시예 2.3.2: IL-13/13 C5 .5 Fab 복합체 제조
재조합 사람 IL-13은 포유동물 발현 시스템에서 발현시키고, 이어서 당업계에 공지된 기술을 이용하여 정제했다. 재조합 사람 IL-13 및 13C5.5 Fab 단백질은 1:1 몰비로 혼합하고 4℃에서 1시간 동안 항온처리했다. 복합체 시료를 예비평형화된(20mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl) Superdex 200 컬럼 위에 0.5ml/min으로 로딩했다. 복합체를 모아서, Ultrafree-15 Biomax 10 kDa 분자량 컷오프(MWCO) 원심분리 필터 장치(Millipore)를 이용하여 24mg/ml로 농축하고 -80℃에서 동결시켰다. 시료 순도는 SDS-PAGE로 평가했다.
실시예 2.3.3: IL-13/13 C5 .5 Fab 복합체의 결정화
동결된 IL-13/13C5.5 복합체 스톡(약 24mg/ml)은 얼음 위에서 해동시켰다. 복합체(1.0㎕)를 저장 용액(1.75M 황산암모늄, 100mM MES pH 6.5, 10mM CaCl2)과 혼합했다. 수득되는 방울을 약 18℃에서 저장기 상의 싯팅 드랍 웰(sitting drop well)(CrysChem sitting-drop 플레이트)에서 혼합했다. 1주 이내에 다이아몬드와 같은 결정을 나타났다.
실시예 2.3.4: IL-13/13 C5 .5 Fab 복합체 결정의 동결보호 및 급속 냉각
IL-13/13C5.5 Fab 복합체의 결정은 모액+20% 글리세롤에서 파이버 루프를 이용하여 수거했다. 이어서, 결정은 액체 질소 내에 투하해서 급속 냉각했다.
실시예 2.3.5: IL-13/13 C5 .5 Fab 복합체의 X선 회절 데이터 수집
IL-13/13C5.5 Fab 결정의 X선 회절 데이터는 Advanced Photon Source(일리노이주 아르곤느에 소재함)의 IMCA 빔라인에서 수집했다. 결정은 데이터 수집 동안 옥스포드 크리오시스템스 크리오스트림 냉각기로 100K의 온도에서 유지시켰다. 총 180 프레임이 1.0°진동 범위에서 수집되었다. 데이터는 HKL2000 세트의 프로그램(Otwinowski and Minor, 1997)으로 처리했다. 결정 배향을 측정한 후, 데이터는 DENZO로 통합하고, SCALEPACK으로 스케일화 및 병합하고, 절대 스케일로 나타낸 후, TRUNCATE로 구조 인자 진폭으로 축소시켰다(French and Wilson, 1978). 고유 반사값의 5%는 무작위 방식으로 자유 R 인자(Rfree)(Brunger, 1992)를 계산하기 위한 "프리" 세트로 지정하고; 나머지 95%의 반사값은 R 인자(R)를 계산하기 위한 "워킹(working)" 세트를 구성했다. x선 회절 데이터는 표 16에 정리했다. 다음은 결정형의 인덱싱을 열거한다: (1) IL-13/13C5.5 Fab: 공간 그룹 P2(1)2(1)2(1), a = 163.578Å, b = 163.318Å, c=228.627Å, α=90.0°, β=90.0°, γ=90.0°. 표 17은 데이터세트의 x선 회절 통계값을 열거한 것이다.
[표 16]
Figure pat00027
[표 17]
Figure pat00028
실시예 2.3.6: IL-13/13 C5 .5 Fab 복합체 결정 구조의 분자 교체 솔루션 및 세분
최대 유사성의 분자 교체 솔루션은 프로그램 PHASER(Read, 2001)를 사용하여 결정했다. 총 6개의 13C5.5 단량체를 공간 그룹 P2(1)2(1)2(1)에서 3.0Å 해상도 하에 해명되었다. 조사 모델은 종래 보고된 Fab의 결정 구조였다(Protein Data Bank entry 1BJ1; Muller et al. 1998). 좌표는 분자 교체 솔루션에 기초하여 얻었다.
IL-13/13C5.5 Fab 복합체 결정 구조의 세분은 공간 그룹 P2(1)2(1)2(1)에서 전술한 분자 교체 솔루션 좌표부터 시작했다. CCP4 세트의 프로그램(Murchudov et al., 1997, Collaborative Computational Project, 1994)에서 이용가능한 프로그램 REFMAC에 의한 강체 세분(rigid-body refinement)으로 시작했고, 그 결과 2.6Å에서 다음과 같은 통계값이 얻어졌다: R 40.00%(Rfree 39.00%). 새로운 IL-13 전자 밀도가 관찰되었다. 6개 IL-13 단량체의 수동 구축은 분자 그래픽 프로그램 O(Jones et al. 1991)를 이용한 공개된 IL-13 NMR 구조 1IJZ(Moy et al., 2001) 및 2Fo-Fc 및 Fo-Fc 전자 밀도 지도 조사로 안내되었다. 세분 프로그램 REFMAC(Murshudov et al., 1997)은 반복적인 제한적 세분 라운드마다 사용하여 다음과 같은 통계값을 얻었다: R 25.8%(Rfree 30.5%). 결과는 표 18에 제시했다.
[표 18]
Figure pat00029
실시예 2.3.6: IL-13/13 C5 .5 Fab 복합체 구조
사람 IL-13과 다수의 13C5.5 CDR 사이에서는 광범위한 접촉이 관찰된다. 항체-항원 계면에서 매립된 표면적은 1415.50Å2이다. 접촉은 계면을 안정시키는 결정적인 수소 결합과 소수성 상호작용으로 이루어진다. 계면 접촉의 대부분을 구성하는 최소 서열 분절은 IL-13 나선 A와 D이다(IL-13의 구조에 대해서는 본 발명에 참고인용된 미국 특허 공개번호 2003-0013851 A1을 참조한다). 이러한 접촉면에는 CDR의 L1과 L3 및 H2와 H3이 포함되어 있다. 전술한 것에 기초할 때, 에피토프 13C5.5 결합 범위는 서열번호 1의 Ser26-Asn38, Lys123-Arg130에 의해 한정된 국소 영역을 포함한다. 에피토프 13C5.5 결합 범위는 서열번호 1의 Arg30-Asn38, Lys123-Arg127에 의해 한정된 국소 영역을 포함한다.
실시예 2.4: 사람화된 IL-13 항체의 생체내 효능
항-hIL-13 항체의 생체내 효능은 다음과 같이 평가했다.
실시예 2.4.1: 사람 IL-13 유도된 천식 모델에서 사람화된 IL-13 항체의 생 체내 효능
항-hIL-13 항체 5G1, 13C5 및 13C5.5의 효능은 마우스에 사람 IL-13으로 유도된 천식 모델에서 시험했다. 마우스에게 재조합 사람 IL-13을 50㎕ 멸균 PBS 중의 1㎍ 용량으로서, 기관지 개구를 보기 위한 설치류 후두경을 이용하여 미량분무기로 기관지로 전달하여 챌린지했다. IL-13의 총 2회 용량을 연구 1일 및 2일째 제공하고, 기도 과민성(AHR; Hoymann, H.G.: J Pharmacol Toxicol Methods/ 2007 Jan-Feb; 55(1): 16-26) 및 점액, 산성 포유동물 키티나제(AMCase, Donnelly LE, Barnes PJ., 1: Trends Pharmacol Sci. 2004 Oct; 25(10): 509-11) 및 흉선 및 활성화 조절된 케모카인(TARC; Bisset LR, Schmid-Grendelmeier P., Curr Opin Pulm Med. 2005 Jan; 11(1): 35-42)은 최종 챌린지 24시간 후에 기관지-폐포 세척액에서 측정했다. IL-13의 1차 챌린지 1일 전에 복강내 주사로 100, 300 및 1000㎍의 항체 용량을 투여하고, 그 결과는 표 19에 정리했다. IL-13Rα1 또는 IL-13Rα2에 대한 IL-13의 결합을 차단하지 않는 5G1 항체는, PBS 처리된 대조군 동물과 5G1로 처리된 동물에서 검출되는 AHR, AMCase 및 Muc5ac의 수준이 비슷한 것으로 볼 때, 이 생체내 모델에서 IL-13 생체활성을 중화시킬 수 없었다. 이에 반해, α1 및 α2 수용체에 대한 결합을 차단하는 13C5 항체는 모든 매개변수를 감소시키는데 있어서 효과적이었다. IL-13으로의 처리는 기도 저항을 3.6cm H2O/ml/sec에서 5.7cm H2O/ml/sec로 증가시켰다. 13C5(1000㎍)로의 처리는 기도 저항을 4.3cm H2O/ml/sec로 감소시켰다. muc5ac 수준에 의해 측정된 바와 같은 점액 과다분비는 항체 처리에 의해 356.5 단위에서 최대 211U로 저하되었고, 이는 40% 감소에 해당하는 것이었다. 이와 유사하게, AMCase 수준은 TARC 수준에서 관찰되는 비슷한 감소로 인해 66% 감소에 해당하는 202U에서 68U로 감소했다(n=10, p < .05, 모든 용량). 재조합 사람화된 항체 13C5.5는 이러한 모델에서 유사한 결과를 증명했다. IL-13은 30㎍/ml 메타콜린의 챌린지 후에 3.9에서 5.5cm H2O/ml/sec로의 기도 저항의 증가를 유도했다. 항체 13C5.5는 100, 300 및 1000㎍ 용량에서 각각 4.1, 4.45 및 4.3cm H2O/ml/sec로 기도 저항을 억제했다. muc5ac 수준에 의해 측정되는 바와 같은 점액 과다분비는 IL-13 처리에 의해 유도된 247U를 100, 300 및 1000㎍ 용량의 항체 처리에서 각각 154, 30.2 및 11.1U로 감소시켰다. 이것은 이 항체에 의한 점액 생산의 38, 88 및 96% 억제를 나타낸다. IL-13 처리는 130U AMCase 활성을 유도했고, 항체 처리(100, 300 및 1000㎍ 용량)에 의해 113, 98 및 55U로 감소하여 14, 24 및 68% 억제율을 나타낸다. 이러한 데이터는 IL-13Rα1 및 α2에 대한 IL-13의 결합을 차단하는 재조합 사람화된 항체 13C5.5 및 13C5가 폐에서 AHR, 점액 및 AMCase 생산 반응을 유도한 IL-13을 중화시킬 수 있는 반면, α1 및 α2 수용체에 대한 IL-13의 결합을 차단하지 않는 항체는 상기 모든 생물학적 반응을 차단하는데 효과적이지 않다는 것을 증명한다.
[표 19]
Figure pat00030
다른 연구로, 항-hIL-13 항체 BAK502G9, MJ2-7 및 13C5.5의 효능을 마우스의 사람 IL-13 유도된 천식 모델에서 비교했다. 마우스에게 재조합 사람 IL-13을 50㎕ 멸균 PBS 중의 1㎍ 용량으로서, 광 진정 하에 비내로 전달하여 챌린지했다. IL-13의 총 2회 용량을 연구 1일 및 2일째 제공하고, 기도 과민성 및 점액, AMCase는 최종 챌린지 24시간 후에 기관지-폐포 세척액에서 측정했다. IL-13의 1차 챌린지 1일 전에 복강내 주사로 1000㎍의 항체 용량을 투여했다. 연구 결과는 표 20에 정리했다. IL-13α1 및 α2 수용체에 대한 IL-13의 결합을 차단하는 13C5.5 항체는 모든 매개변수를 유의적으로 감소시키는데 있어서 효과적이었다. IL-13으로의 처리는 30mg/ml 메타콜린 챌린지 후, 기도 저항을 4.2cm H2O/ml/sec에서 7.2cm H2O/ml/sec로 증가시켰다. 13C5(1000㎍)로의 처리는 기도 저항을 4.6cm H2O/ml/sec로 86.8% 감소시켰다. muc5ac 수준에 의해 측정된 바와 같은 점액 과다분비는 항체 처리에 의해 768.2 단위에서 412.9U로 58.8% 저하되었다. 이와 유사하게, AMCase 수준은 52% 감소에 해당하는 316.5U에서 147U로 감소했다(n=10, p < .001). IL-13Rα2에 대한 IL-13의 결합을 효과적으로 억제하지 않고 IL-13Rα1에 대한 IL-13 결합을 억제하는 BAK502G9 및 MJ2-7 항체는 당해 모델에서 IL-13 유도된 AHR을 중화시키는 능력이 비슷했다. 항체 BAK502G9 및 MJ2-7는 기도 저항을 7.2cm H2O/ml/sec에서 각각 5.96cm H2O/ml/sec 및 5.93cm H2O/ml/sec로 억제하여 AHR의 42% 및 41.5% 감소를 나타낸다. muc5ac 수준에 의해 측정되는 바와 같은 점액 과다분비는 IL-13 처리에 의해 유도된 768.2U를 1000㎍ 용량의 항체 처리에서 627.8 및 380U로 감소시켜, BAK502G9 또는 MJ2-7 항체에 의한 23% 및 64% 억제를 나타낸다. BAK502G9 항체는 13C5.5 또는 MJ2-7 항체에 비해 AMCase 억제에 있어서 덜 효과적이었다. IL-13 처리는 316.5U AMCase 활성을 유도했고, 이것은 BAK502G9 또는 MJ2-7 항체 처리(1000㎍ 용량)에 의해 279 및 169U로 감소하여, 각각 8% 및 45% 억제를 나타냈다. 이러한 데이터는 IL-13Rα1 및 α2에 대한 IL-13의 결합을 차단하는 재조합 사람화된 항체 13C5.5가 폐에서 AHR, 점액 및 AMCase 생산 반응을 유도한 IL-13을 중화시키는데 있어서 가장 효과적인 반면, IL-13α2 수용체에 대한 IL-13의 결합을 낮은 친화도로 차단하는 항체는 천식의 발병에 기여하는 상기 생물학적 반응을 차단하는데 효과적이지 않다는 것을 증명한다.
[표 20]
Figure pat00031
실시예 2.4.2: OVA 유도된 천식 마우스 모델에서 IL-13 항체의 생체내 효능
수용체 차단성(특히 IL-13Rα2에 대한)이 천식 마우스 모델에서 mAb의 생체내 효능에 영향을 미치는 지를 측정하기 위해, mIL-13Rα1/Fc 및 mIL-13Rα2/Fc 단백질(R&D Systems)을 이용한 수용체 결합 ELISA에 의해 측정되는 바와 같은 수용체 차단성이 상이한 래트 항마우스 IL-13 항체 패널을 생성시켰다(표 21 참조). 또한, 표 21에는 항-hIL-13 mAb 3H7이 마우스 IL-13과 교차반응하기 때문에 항-mIL-13 성질도 함께 제시했다. 마우스 IL-13에 대한 항체들의 결합 친화도는 재조합 마우스 IL-13(R&D Systems)에 대한 BIACORE 분석으로 측정하고, 마우스 IL-13에 대한 항체의 효능(IC50)도 재조합 마우스 IL-13에 대한 A-549 생물검정으로 측정했다. 51D9 및 48D3의 가변 도메인 서열은 표 22에 제시했다.
[표 21]
Figure pat00032
[표 22]
Figure pat00033
쥐 천식 모델에서 생체내 효능 연구를 위해, 동물(Balb/c 마우스 암컷)을 아보트 바이오리서치 센터에 소재하는 타코닉에서 구입하여 8 내지 12주령째 이용했다. 모든 프로토콜은 IACUC의 승인을 받았다. 마우스에게 0일과 7일째 2mg 명반(Pierce) 중의 8㎍ OVA를 복강내 주사하여 OVA(Sigma, 오브알부민 유래의 내독소는 DetoxiGel(Pierce)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 제거하고, 최종 물질에는 0.1EU/mg(단백질) 미만이 함유되어 있었다)에 대해 민감화시켰다. 14일과 16일 째에, 동물에게 50ml 멸균 PBS 중의 0.3mg OVA를 비내 챌린지했다. 항체 51D9 및 48D3(하이브리도마 클론 51D9 및 48D3의 상청액으로부터 표준 절차에 따라 정제함, 0.1 EU/mg(단백질) 미만이며, PCR 검사 시에 설치류 병원균 음성임)을 멸균 PBS 중의 1회 복강내 주사로서 13일째 투여했다. 덱사메타손(Sigma)은 13 내지 17일째 3mg/kg의 용량으로 1회 경구 투여했다. 모든 종점은 2차 OVA 챌린지 후 24시간 후인, 17일째 분석했다. 기도 과민성(AHR)은 전신 체적변동기록법을 이용하여 평가했다. 간단히 설명하면, 마취 수술면을 케타민 및 자일라진의 복강내 주사로 유도했다. 기관지 캐뉼라를 3번째와 4번째 기관 연골 고리사이에 수술로 삽입했다. 자발적 호흡은 판쿠로늄 브로마이드의 목정맥내 주사로 차단하고, 동물을 전신 체적변동기록기(Buxco)에 위치시킨 후, 용적 조절식 인공호흡기(Harvard Apparatus)로 분당 150 호흡이 되게 0.2ml 실내공기로 강제 환기시켰다. 폐 내의 압력과 체적변동기록기 내의 흐름은 변환기를 사용하여 측정하고 폐 저항은 Biosystem Xa 소프트웨어를 이용하여 압력/흐름으로서 계산했다. 기준 저항 및 직렬 초음파 분무기로 전달한 메타콜론(3, 10 및 30mg/ml)의 챌린지 후 저항을 측정했다. 폐 기능 검사 완료 후, 폐를 0.5ml 멸균 PBS로 4회 세척했다. 세척액을 TARC, AMCase 및 세포 침윤물에 대해 분석했다. 연구 마지막에 항체 수준의 정량을 위해 혈청을 수집했다.
쥐 TARC 수준은 ELISA(R&D)로 제조자의 프로토콜에 따라 측정했다. AMCase 활성은 기관지폐포 세척액(BAL)(0.01% BSA, 30mM 구연산나트륨, 60mM 인산나트륨, pH5.2으로 1 내지 10배 희석)에서 80μM 4-메틸움벨리페릴 β-D-N,N'-디아세틸키토바이오사이드의 존재 하에 측정했다. 반응은 실온에서 15분 동안 항온처리하고 100㎕의 1M 글리신/NaOH pH 10.6을 첨가하여 반응정지시켰다. 산물 형성은 Fluoroskan Ascent 형광측정기에서 385nm 여기를 이용하여 460nm에서의 형광 방출도로 측정했다. 배상세포 비대를 평가하기 위해, 폐를 20% 중성 완충된 포르말린으로 15분 동안 22cm 높이로 팽창시켜 폐 표면의 일정 면적을 달성했다. 절편을 파라핀으로 포매시키고, 구획화한 후, 과요오드산 쉬프(PAS)로 염색했다. 좌측 폐의 주 기관지를 따라 PAS 양성 세포의 면적은 ImagePro Plus 소프트웨어를 사용하여 정량분석했다. Muc5ac 수준은 ELISA로 측정했다. 96웰 플레이트는 BAL 액으로 코팅하고 밤새 건조한 뒤, 비오틴화된 항-Muc5ac 항체를 첨가하고 HRP 접합된 스트렙타비딘으로 검출한 뒤, 비색용 기질 TMB를 절단시켰다.
천식의 발병에 대한 IL-13Rα1 및 α2의 상대적 기여도는 마우스의 표준 오브알부민 유도 천식 모델에서 시험했다. α1 및 α2 수용체 모두에 대한 IL-13의 결합을 차단한 항체(51D9, 54D1 및 3H7, 각각 340, 24 및 2430pM의 효능으로) 및 α1 수용체에 대해서만 IL-13의 결합을 차단한 항체(48D3, 50pM의 효능)로 오브알부민의 국소 챌린지 1일 전에 동물을 처리하여 시험했고, 그 결과는 표 23에 제시했다. OVA 챌린지는 메타콜린 항원 투여 후 폐 저항의 증가, BLA 액에서 Muc5ac의 수준 증가에 의해 측정되는 바와 같은 점액 과다분비, 및 조직학적 평가 시에 상피 세포의 증가된 PAS 양성 염색, 호산구 및 T 세포에 의해 폐의 침윤, 및 천식 관련 단백질 AMCase 및 TARC의 생산을 유도했다.
IL-13 Rα1 및 α2의 결합을 차단한 항체는 모두 이 시약들의 시험관내 측정된 효능에 따라 전환된 생체내 효능 및 효능을 입증했다. 51D9는 100, 300 및 1000㎍/마우스의 용량으로 시험했다. OVA 처리는 30mg/ml 메타콜린의 챌린지 후 기도 저항의 증가를 6.2cm H2O/ml/sec로 유도한 반면, 비천식성 동물에서는 3.6cm H2O/ml/sec로 유도했다. 51D9로의 마우스 처리는 100, 300 및 1000㎍ 용량에서 폐 저항의 증가를 비천식성 대조용 동물에서와 비슷한 값인 4.1, 4.0 및 3.5cm H2O/ml/sec로 각각 억제했다(n=8-10/그룹; p< .05). 51D9에 의해 관찰된 억제 양은 스테로이드 처리에 의해 달성되는 것(3.3cm H2O/ml/sec)과 비슷했다. 51D9 처리는 또한 51D9 1000㎍이 처리된 동물에서 점액 과다분비를 404 단위 Muc5ac에서 55U까지 용량 의존적으로 억제했다. 점액 과다분비의 억제는 또한 PAS 반응성 상피 세포의 조직 평가에서도 관찰되었다. 양성 세포의 면적 %는 51D9 항체 300 및 1000㎍ 용량에 의해 1.0%에서 0.6%와 0.5%로 감소하여 각각 47 내지 65%의 감소를 나타냈다(n=8, p<.01). 51D9 처리 역시 TARC 및 AMCase를 억제했다. OVA 챌린지는 61pg/ml의 TARC를 유도했고, 이것은 1000㎍ 51D9 처리에 의해 7.8pg/ml로 감소했다(n=10, p<.05). OVA 챌린지는 96 임의 단위의 AMCase 활성을 유도했고, 이 활성은 100, 300 및 1000㎍의 51D9 항체 처리에 의해 각각 52, 45 및 21U로 감소했다(n=9-10, p< .01). 시험관내 효능이 10배 더 큰(24pM) 54D1은 30㎍ 용량에서 기도 저항을 6.58cm H2O/ml/sec에서 4.4cm H2O/ml/sec로 감소시켜 AHR의 억제를 입증했고, 관찰된 최대 억제는 기도 저항을 3.65cm H2O/ml/sec의 값으로 감소시키는 300㎍의 항체 처리 시에 관찰되었다. 점액, AMCase 및 TARC 생산의 억제에서도 유사한 효능이 관찰되었다. 2.5nM의 효능이 있는 제3 항체 3H7도 역시 AHR, 점액 및 AMCase 수준의 억제를 입증했지만, 시험관내 생물분석에 기술된 효능의 10배 전환에 일치하는 1000㎍ 항체 처리 용량에서만 입증했다.
IL-13Rα1에 대한 IL-13의 결합만을 차단하는 항체의 효능은 항체 48D3으로 시험했다. 동물을 30, 100, 300 및 1000㎍/마우스의 용량으로 처리했다. OVA 챌린지는 기도 저항을 비천식성 PBS 처리된 동물의 4.1cm H2O/ml/sec에 비해 증가된 5.69cm H2O/ml/sec로 유도했다. 30㎍ 48D3의 처리는 OVA 유도된 폐 저항에 어떠한 효과도 없는 반면, 100, 300 및 1000㎍ 48D3은 폐 저항의 OVA 유도된 변화를 최대 4.4cm H2O/ml/sec까지 또는 OVA 대조군 수준의 약 80%까지 억제했다(n=10, p< .05). 51D9에 의해 관찰된 효과와는 반대로, 48D3은 Muc5ac ELISA 또는 PAS 반응성 상피 세포에 의해 측정되는 바와 같은 OVA 유도된 점액 과다분비를 억제하지 않았다. 약간이지만 통계적으로 유의적인 점액 감소(30%)는 30㎍ 용량의 48D3 처리에 의해 관찰된 반면, 모든 다른 용량에서는 OVA 챌린지된 동물과 동등했다. PAS 양성 염색의 조직학적 정량 검사는 OVA 챌린지된 동물에서 0.6%이고, OVA로 챌린지되고 1000㎍ 48D3으로 처리된 동물에서 0.8%임을 입증했다. 이러한 연구들에서, 48D3은 OVA 유도된 AMCase 발현을 OVA 처리된 동물에서 검출된 196U로부터, 30, 100, 300 및 1000㎍ 용량에서 각각 63, 90, 87 및 96U로 억제했다. 항체 수준의 분석은 항체 처리된 마우스의 혈청과 BAL 액 모두에서 48D3과 51D9가 비슷한 수준으로 검출될 수 있음을 시사했다. 51D9 항체에 비해 7배 더 큰 48D3 항체의 효능 및 두 항체의 동등한 노출에도 불구하고, 48D3 항체는 IL-13Rα1 및 α2에 대한 IL-13의 결합을 차단하는 항체와 동일한 정도로 AHR 또는 AMCase를 억제할 수 없었고 점액 생산을 약화시킬 수 없었다. 이러한 데이터를 종합해보면, IL-13Rα2는 OVA 유도된 점액 과다분비를 매개하는데 있어서 중심 역할을 하고 IL-13Rα2가 생체내 천식성 표현형을 조절하는데 기여한다는 것을 시사한다.
[표 23]
Figure pat00034
<110> Abbott Laboratories <120> Interleukin-13 binding proteins <130> 8370 US P1 <150> US 60/843,249 <151> 2006-09-08 <160> 94 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 132 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Ala Leu Leu Leu Thr Thr Val Ile Ala Leu Thr Cys Leu Gly Gly 1 5 10 15 Phe Ala Ser Pro Gly Pro Val Pro Pro Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu 20 25 30 Ile Glu Glu Leu Val Asn Ile Thr Gln Asn Gln Lys Ala Pro Leu Cys 35 40 45 Asn Gly Ser Met Val Trp Ser Ile Asn Leu Thr Ala Gly Met Tyr Cys 50 55 60 Ala Ala Leu Glu Ser Leu Ile Asn Val Ser Gly Cys Ser Ala Ile Glu 65 70 75 80 Lys Thr Gln Arg Met Leu Ser Gly Phe Cys Pro His Lys Val Ser Ala 85 90 95 Gly Gln Phe Ser Ser Leu His Val Arg Asp Thr Lys Ile Glu Val Ala 100 105 110 Gln Phe Val Lys Asp Leu Leu Leu His Leu Lys Lys Leu Phe Arg Glu 115 120 125 Gly Arg Phe Asn 130 <210> 2 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Phe Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 3 <211> 330 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 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Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Thr Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Lys Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Ile Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Gly Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 56 <211> 118 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 56 Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Gly Ser 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Asn Ser Val Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Met Asn Ser Leu Gln Ala Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala 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Ser Leu Thr Gly Tyr 20 25 30 Asn Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Leu Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Ala Phe Asn Ser Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Tyr Pro Tyr Ala Ile Lys Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 61 Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Thr Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Asn Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Asp Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 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Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Glu Ala Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn 85 90 95 Glu Gly Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Ser Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 110 <210> 64 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus IL-13 CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=T,D,G,S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=M,S,Y,L,H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X=G,W,Y,A,S,N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X=V,I,M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X=D,H,S,Y,N,G <400> 64 Xaa Ser Asp Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 65 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus IL-13 CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=M,E,H,R,S,G,L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X=I or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=H,Y,A,D,S,W <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=P,S,W,G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X=S,G,E,D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X=D,G,S,E,N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X=S,Y,G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X=E,N,Y,V,R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X=T,I,K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X=R,Y,I,D,A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X=L,Y,D,F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X=N,P,S,D <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X=Q,E,D,P,S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X=K,M,S,T,A,V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X=F,L,V,M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X=K,R,Q <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X=D,G,S <400> 65 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus IL-13 CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=W,T,G,Y,D,I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X=R,A,S,G,V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=T,F,Y,S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=S,T,Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X=Y,F,G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X=F,Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X=S,Y,I,F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X=D,L,Y,P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X=Y,A,P,E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (12)..(12) <223> X=F,M,S,L,I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X=D,V,N,K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X=Y,F <400> 66 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Gly Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 <210> 67 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus IL-13 CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=K,R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X=S,A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=S,T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=Q,K,I <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X=N,S,T,G,E <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X=L,T,S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X=L,Q,V <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X=Y,N,H,D,T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X=S,I,T <220> <221> MISC_FEATURE <222> (10)..(10) <223> X=S,D,N,H,Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (11)..(11) <223> X=N,G <220> <221> MISC_FEATURE <222> (13)..(13) <223> X=K,F,N,E,S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (14)..(14) <223> X=N,T,S <220> <221> MISC_FEATURE <222> (15)..(15) <223> X=Y,F <220> <221> MISC_FEATURE <222> (16)..(16) <223> X=L,A,M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (17)..(17) <223> X=A,D,E,H,N <400> 67 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Gln Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa <210> 68 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus IL-13 CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=L,S,K,T,W,Y <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X=V,T,A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=S,N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=N,K,T,R,M <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X=R,L,K <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X=F,D,E,H,A,P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X=S,P,R <400> 68 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 69 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> consensus IL-13 CDR <220> <221> MISC_FEATURE <222> (1)..(1) <223> X=F,W,Q,A <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(2) <223> X=Q,L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (3)..(3) <223> X=H,G,Y,W,N <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(4) <223> X=N,S,T,Y,L <220> <221> MISC_FEATURE <222> (5)..(5) <223> X=Y,T,S,E,H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (6)..(6) <223> X=L,V,F,Y,N,G,D,P <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(7) <223> X=P,H <220> <221> MISC_FEATURE <222> (8)..(8) <223> X=L,F,Y,W,R <220> <221> MISC_FEATURE <222> (9)..(9) <223> X=T,V <400> 69 Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 <210> 70 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 5G1.1 variable region <400> 70 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Tyr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Arg Thr Ser Tyr Phe Ser Asp Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 5G1.1 variable region <400> 71 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 His Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 72 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chaing 5G1.2 variable region <400> 72 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Tyr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Arg Thr Ser Tyr Phe Ser Asp Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 73 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 5G1.2 variable region <400> 73 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 His Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 74 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 5G1.3 variable region <400> 74 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Tyr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Arg Thr Ser Tyr Phe Ser Asp Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 5G1.3 variable region <400> 75 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 His Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 76 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 13C5.1 variable region <400> 76 Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Asp Met Gly Val Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Val Ser Ser Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 77 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 13C5.1 variable region <400> 77 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Val Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 78 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 13C5.2 variable region <400> 78 Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Asp Met Gly Val Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Val Ser Ser Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 13C5.2 variable region <400> 79 Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Lys Val Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 80 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 13C5.5 variable region <400> 80 Glu Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Thr Gln 1 5 10 15 Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Leu Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Asp Met Gly Val Asp Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60 Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val 65 70 75 80 Val Leu Lys Leu Thr Ser Val Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Thr Val Ser Ser Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 81 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 13C5.5 variable region <400> 81 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 82 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 9C11.1 variable region <400> 82 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Arg Ala Thr Met Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Thr Ala Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 83 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 9C11.1 variable region <400> 83 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Gln Thr Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asn 85 90 95 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 84 <211> 116 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 9C11.2 variable region <400> 84 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser 20 25 30 Trp Ile His Trp Val Asn Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Thr Ala Thr Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 85 <211> 113 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 9C11.2 variable region <400> 85 Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Thr Gln Thr Leu Leu Asn Ser 20 25 30 Asp Gly Phe Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Asn 85 90 95 Asn Tyr Leu Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg <210> 86 <211> 123 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 86 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45 Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Lys Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Glu Ala Ser Ala Ser Thr Ala Thr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Ala Gly Arg Thr Glu Gly Thr His Tyr Tyr Ala Met Asp Ala 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 87 <211> 111 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 87 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Ser 20 25 30 Ser Asp Leu Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly His Gln Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Arg Thr Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro 65 70 75 80 Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Ala Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Arg Glu 85 90 95 Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 100 105 110 <210> 88 <211> 119 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 88 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ser Ile Ser Asn Asp Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Lys Ala Lys Ser Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Thr Trp Asn Trp Glu Phe Gly Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Val Met Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 89 <211> 111 <212> PRT <213> Rattus sp. <400> 89 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Leu Gly Gln 1 5 10 15 Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ile Ser Arg 20 25 30 Tyr Asn Arg Met His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Gln Gln Pro Lys 35 40 45 Leu Leu Ile Tyr Arg Ser Ser Tyr Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg 50 55 60 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Tyr Pro 65 70 75 80 Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Arg Glu 85 90 95 Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Asn Arg 100 105 110 <210> 90 <211> 123 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized heavy chain 5G1.5 variable region <400> 90 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30 Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Glu Ile Tyr Pro Gly Asn Tyr Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Arg Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ser Arg Trp Arg Thr Ser Tyr Phe Ser Asp Tyr Gly Tyr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 91 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 5G1.5 <400> 91 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 His Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Thr Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Ser 85 90 95 Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 92 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 13C5.5L2E variable region <400> 92 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Tyr Thr Ser Met Lys Pro Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 93 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 13C5.5L3F <400> 93 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Tyr Thr Ser Lys Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Thr Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 94 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized light chain 13C5.5L2EL3F variable region <400> 94 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Phe Tyr Thr Ser Met Lys Pro Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Leu Thr Pro Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105

Claims (18)

  1. 항원-결합 도메인을 포함하는 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서, 상기 항원-결합 도메인이 6개의 CDR: CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3을 포함하고, 여기서,
    CDR-H1이 서열번호 80의 잔기 31-37을 포함하고,
    CDR-H2가 서열번호 80의 잔기 52-67을 포함하고,
    CDR-H3가 서열번호 80의 잔기 100-112를 포함하고,
    CDR-L1이 서열번호 81의 잔기 24-34를 포함하고,
    CDR-L2가 서열번호 81의 잔기 50-56을 포함하고,
    CDR-L3이 서열번호 81의 잔기 89-97을 포함하고;
    여기서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 234번 위치에서 류신이 알라닌으로 변화되고 235번 위치에서 류신이 알라닌으로 변화된 것을 포함하는 힌지 영역을 포함하는 사람 IgG1 중쇄 불변 영역을 포함하고 사람 카파 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하고;
    여기서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 사람 IL-13과 결합할 수 있고 서열번호 1의 130번 위치에서 아르기닌 잔기가 글루타민 잔기로 대체된 사람 IL-13 변이체에 결합할 수 있는, 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  2. 제1항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 (VH) 도메인 및 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 (VL) 도메인을 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 각각 서열번호 80의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 중쇄 가변(VH) 도메인을 포함하고 각각 서열번호 81의 아미노산 서열을 포함하는 2개의 경쇄 가변(VL) 도메인을 포함하는, 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는, 천식, 호산구 증가증, 아토피 피부염, 두드러기 또는 알레르기성 비염을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 따른 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 분리된 핵산.
  6. 제5항에 따른 핵산을 포함하는 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 벡터가 pcDNA, pTT, pTT3, pEFBOS, pBV, pJV 및 pBJ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 벡터.
  8. 제6항 또는 제7항에 따른 벡터를 포함하는 분리된 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 상기 숙주 세포가 원핵생물 세포인, 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 상기 원핵생물 세포가 이. 콜라이(E. coli)인, 숙주 세포.
  11. 제8항에 있어서, 상기 숙주 세포가 진핵생물 세포인, 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 원생생물 세포, 동물 세포, 식물 세포 및 진균 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 숙주 세포.
  13. 제12항에 있어서, 상기 진핵생물 세포가 포유동물 세포, 조류 세포 및 곤충 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 동물 세포인, 숙주 세포.
  14. 제13항에 있어서, 상기 포유동물 세포가 CHO 세포 또는 COS 세포인, 숙주 세포.
  15. 제12항에 있어서, 상기 진균 세포가 효모 세포인, 숙주 세포.
  16. 제15항에 있어서, 상기 효모 세포가 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)인, 숙주 세포.
  17. 제13항에 있어서, 상기 곤충 세포가 곤충 Sf9 세포인, 숙주 세포.
  18. 제8항에 따른 숙주 세포를 배양함을 포함하는 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법.
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