CN104611245A - 在低等真核生物中产生半乳糖基化糖蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及在低等真核生物中产生半乳糖基化糖蛋白。本发明提供了产生人样糖蛋白的新型低等真核生物宿主细胞,所述糖蛋白的特征在于含有末端β-半乳糖残基并基本E缺少岩藻糖和唾液酸残基。本发明还提供了催化从UDP-半乳糖将半乳糖残基转移至重组低等真核生物宿主细胞的受体底物上的方法,所述底物可被用作治疗性糖蛋白。
Description
本申请是国际申请日为2005年4月15日的国际申请PCT/IB2005/051249进入中国、申请号为200580011116.4的题为“在低等真核生物中产生半乳糖基化糖蛋白”的发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请是美国申请号10/371,877(2003年2月20日提交)的部分接续申请,美国申请号10/371,877是美国申请号09/892,591(2001年6月27日提交)的部分接续申请,美国申请号09/892,591根据35U.S.C.§119(e)要求美国临时申请号60/214,358(2000年6月28日提交)、美国临时申请号60/215,638(2000年6月30日提交)和美国临时申请号60/279,997(2001年3月30日提交)的利益,上述各申请被全文引入此处以供参考。本申请还是PCT/US02/41510(2002年12月24日提交)的部分接续申请,PCT/US02/41510要求美国临时申请号60/344,169(2001年12月27日提交)的利益,上述各申请被全文引入此处以供参考。本申请还要求美国临时申请号60/562,424(2004年4月15日提交)的优先权,所述申请被全文引入此处以供参考。
技术领域
本发明涉及在低等真核生物中的蛋白质糖基化工程领域,特别地涉及产生含有末端半乳糖残基的糖蛋白。本发明进一步涉及新型宿主细胞,所述细胞包含酶编码基因,所述酶参与聚糖的半乳糖基转移以及尤其可用作治疗剂的糖蛋白的产生。
背景技术
酵母和丝状真菌均已被成功地用于生产重组蛋白质,包括细胞内和分泌型的(Cereghino,J.L.和J.M.Cregg 2000FEMS Microbiology Reviews 24(1):45-66;Harkki,A.等,1989Bio-Technology 7(6):596;Berka,R.M.等,1992Abstr.Papers Amer.Chem.Soc.203:121-BIOT;Svetina,M.等,2000J.Biotechnol.76(2-3):245-251)。多种酵母,诸如乳克鲁维氏酵母(K.Lactis)、巴斯德毕赤氏酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤氏酵母(Pichia methanolica)和多形汉逊氏酵母(Hansenulapolymorpha)作为真核生物表达系统已经有特别重要的作用,因为它们能够生长至高细胞密度并分泌大量的重组蛋白。同样,丝状真菌,诸如黑色曲霉(Aspergillus niger)、镰孢属物种(Fusarium sp)、粗糙链孢霉(Neurospora crassa)以及其它真菌已被用于以工业规模高效生产糖蛋白。但是,在任何这些真核生物微生物中表达的糖蛋白与动物中的糖蛋白在N-聚糖结构上存在相当大差异。这已妨碍了酵母或丝状真菌作为宿主在制备糖基化治疗性蛋白质中的应用。
目前,表达系统诸如酵母、丝状真菌、植物、藻类和昆虫细胞系(低等真核生物)正被研究用于生产治疗性蛋白质,这些系统与哺乳动物系统相比,更为安全、快速而且生产出的产物效价更高。这些系统共同具有N-连接的寡糖合成的共有分泌途径。近来,已表明巴斯德毕赤氏酵母的分泌途径可再进行基因工程改造以实现顺序糖基化反应,该反应模拟人类和其它高等哺乳动物中N-聚糖的早期加工(Choi等,Proc Natl Acad Sci USA.2003Apr 29;100(9):5022-7。此外,已显示了在巴斯德毕赤氏酵母中通过重新工程改造分泌途径以生产具有缺少半乳糖的复合N-聚糖的人类糖蛋白(Hamilton等,Science.2003Aug29;301(5637):1244-6)。在哺乳动物细胞中,进一步的成熟包括半乳糖转移。因此,来自酵母和低等真核生物的复合糖基化途径的成熟需要β1,4-半乳糖基转移酶的功能性表达。
在哺乳动物细胞、昆虫细胞(例如,Sf-9)和酵母细胞中已经证实了UDP-Gal:βGlcNAcβ1,4-半乳糖基转移酶(β1,4GalT)的重组表达。在甲基营养酵母巴斯德毕赤氏酵母中也已经表达了编码可溶形式的人类β1,4-半乳糖基转移酶I(EC 2.4.1.22)(缺少内源II型膜结构域)的cDNA。Malissard等,Biochem BiophysRes Commun.2000Jan 7;267(1):169-73。此外,编码与人β1,4-半乳糖基转移酶(Gal-Tf)催化结构域相融合的ScMntlp的基因融合体已被表达,从而在酵母高尔基体中显示出一些酶活性,尽管处于非常低的转化效率。Schwientek等,J BiolChem.1996Feb 16;271(7):3398-405。因此,将β1,4-半乳糖基转移酶(β1,4GalT)靶向产生包含末端GlcNAc的聚糖的宿主分泌途径,预期将导致一些半乳糖的转移。但是,在高等真核生物中复合聚糖的形成要涉及甘露糖苷酶II作用,该酶在哺乳动物细胞中已知与GalTI竞争作用(Fukuta等,Arch Biochem Biophys.2001Aug 1;392(1):79-86)。由此预期GalT的过早作用将阻止分泌途径中复合半乳糖基化糖蛋白的形成以及主要生产出杂合聚糖。
哺乳动物糖蛋白的N-聚糖一般包括半乳糖、岩藻糖和末端唾液酸。这些糖通常不会见于在酵母和丝状真菌中产生的糖蛋白。在人类中,核苷酸糖前体(例如UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-N-乙酰神经氨酸、UDP-半乳糖、GDP-岩藻糖等)在胞质中合成并被转运至高尔基体,在高尔基体它们由糖基转移酶掺入N-聚糖(Sommers和Hirschberg,1981J.Cell Biol.91(2):A406-A406;Sommers和Hirschberg 1982J.Biol.Chem.257(18):811-817;Perez和Hirschberg 1987Methods in Enzymology 138:709-715)。
在异种蛋白表达系统中的糖基化工程改造包括核苷酸糖前体合成中所涉及的各种酶的表达。酶UDP-半乳糖4-差向异构酶通过C4的差向异构化将糖核苷酸UDP-葡萄糖转变为UDP-半乳糖。该酶还可见于能将半乳糖用作为唯一碳源的生物中。近来,双功能性酶Gal10p已经在啤酒糖酵母(Saccharomycescerevisiae)中得到纯化,其有UDP-半乳糖4-差向异构酶和醛糖1-差向异构酶两种活性。Majumdar等,Eur J Biochem.2004Feb;271(4):753-759。
UDP-半乳糖转运蛋白(UGT)可将UDP-半乳糖从胞质转运至高尔基体腔。两种异源基因,即源自粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)的编码α1,2-半乳糖基转移酶(α1,2GalT)的gmal2(+)和编码人UDP-半乳糖转运蛋白的(hUGT2),已经在啤酒糖酵母中功能性表达,以检查半乳糖基化所需的细胞内条件。蛋白半乳糖基化作用与UDP-半乳糖转运活性之间的关联,表明UDP-Gal转运蛋白的外源供应在啤酒糖酵母有效半乳糖基化中发挥关键作用(Kainuma,1999Glycobiology 9(2):133-141)。同样地,来自粟酒裂殖糖酵母的UDP-半乳糖转运蛋白也已被克隆(Aoki,1999J.Biochem.126(5):940-950;Segawa,1999Febs Letters 451(3):295-298)。
糖基转移反应通常会产生副产物,所述副产物是核苷二磷酸或一磷酸。虽然一磷酸能够通过对向运输机理与核苷二磷酸糖交换直接输出,但二磷酸核苷(例如,GDP)在被输出之前必须通过磷酸酶(例如,GDP酶(GDPase))切割以产生核苷一磷酸和无机磷酸。该反应对有效糖基化是重要的;例如,源自啤酒糖酵母的GDP酶已被发现对于甘露糖基化是必需的。但是,GDP酶对UDP的活性减小90%(Berninsone等,1994J.Biol.Chem.269(1):207-211)。低等真核生物一般在高尔基体中缺少UDP-特异性二磷酸酶活性,因为它们在基于高尔基体的糖蛋白合成中不使用UDP-糖前体。已发现粟酒裂殖糖酵母,即发现能添加半乳糖残基至细胞壁多糖的酵母(由UDP-半乳糖),有特异性的UDP酶活性,从而显示了对这种酶的潜在需求(Berninsone等,1994)。
已知UDP是糖基转移酶的潜在抑制剂,且除去该糖基化副产物对防止高尔基体腔内糖基转移酶抑制作用是重要的(Khatara等,1974)。参见Berninsone,P.等,1995.J.Biol.Chem.270(24):14564-14567;Beaudet,L.等,1998Abc Transporters:Biochemical,Cellular,and Molecular Aspects.292:397-413。
因此,需要这样一种方法,所述方法催化将半乳糖残基从UDP-半乳糖的充足库转移至优选的受体底物,以用作治疗性糖蛋白。
发明内容
发明概述
本发明提供了产生人样糖蛋白的新型低等真核生物宿主细胞,所述糖蛋白特征在于含有末端半乳糖残基并基本上在糖蛋白上缺少岩藻糖和唾液酸残基。在一个实施方案中,本发明提供了产生人样糖蛋白的重组低等真核生物宿主细胞,所述宿主包含编码β-半乳糖基转移酶活性的分离的核酸分子和至少编码UDP-半乳糖转运活性、UDP-半乳糖C4差向异构酶活性、半乳糖激酶活性或半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的分离的核酸分子。本发明还提供了产生人样糖蛋白的重组低等真核生物宿主细胞,所述宿主细胞能够将β-半乳糖残基转移至包含末端GlcNAc残基的糖蛋白的N-连接的寡糖分支上,所述N-连接的寡糖分支选自三甘露糖核心上的GlcNAcβ1,2-Manα1,3、GlcNAcβ1,4-Manα1,3、GlcNAcβ1,2-Manα1,6、GlcNAcβ1,4-Manα1,6和GlcNAcβ1,6-Manα1,6。在另一实施方案中,本发明提供了产生糖蛋白的重组低等真核生物宿主细胞,所述糖蛋白是唾液酸转移的受体底物。
在本发明的另一方面中,其中提供了包含人样糖蛋白的组合物,所述糖蛋白特征在于含有末端β-半乳糖残基并基本上在糖蛋白上缺少岩藻糖和唾液酸残基。在一个实施方案中,所述糖蛋白包含N-连接的寡糖,所述N-连接的寡糖选自:GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAc3Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man5GlcNAc2和Gal3GlcNAc3Man5GlcNAc2。
在另一个实施方案中,提供了在低等真核生物宿主细胞中产生人样糖蛋白的方法,所述方法包括产生高于内源水平的UDP-半乳糖的步骤。
在另一个实施方案中,提供了在低等真核生物宿主细胞中产生人样糖蛋白组合物的方法,所述方法包括将半乳糖残基在不存在岩藻糖和唾液酸残基时转移至杂合或复合糖蛋白上的步骤。
根据本发明的方法,产生至少10%、优选33%、更优选60%或更高半乳糖基化的糖蛋白组合物。
本发明进一步提供了表达GalNAc转移酶活性的重组低等真核生物宿主细胞。
本发明还提供了表达编码异源UDP酶活性的基因的重组低等真核生物宿主细胞。
此外,本发明提供了分离的多核苷酸,所述多核苷酸包含或由选自下列的核酸序列组成:(a)SEQ ID NO:14;(b)与SEQ ID NO:13供体核苷酸结合位点的氨基酸残基至少约90%相似的;(c)与SEQ ID NO:14至少92%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.9%相同的核酸序列;(d)编码具有SEQ ID NO:13氨基酸序列的保守多肽的核酸序列;(e)编码与SEQ ID NO:13至少78%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99.9%相同的多肽的核酸序列;(f)在严格条件下与SEQ ID NO:13杂交的核酸序列;和(g)包含(a)-(f)中任一项的长度至少为60个连续核苷酸的片段的核酸序列。
本文中还提供了修饰的多核苷酸,所述多核苷酸包含或由选自SEQ IDNO:48-SEQ ID NO:52保守区的核酸序列组成,其中所编码的多肽参与催化UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖的相互转变以产生半乳糖基化的糖蛋白。
附图说明
图1A-1B描述了编码hGalTI的整合载体pXB53质粒图谱的构建。
图2描述了编码粟酒裂殖糖酵母Gal差向异构酶(SpGalE)和hGalTI的整合载体pRCD425质粒图谱的构建。
图3A-3B描述了编码黑腹果蝇(D.melanogaster)UDP-半乳糖转运蛋白(DmUGT)的整合载体pSH263质粒图谱的构建。
图4描述了编码hGalTI、SpGalE和DmUGT的整合载体pRCD465质粒图谱的构建。
图5描述了编码ScMnn2/SpGalE/hGalTI融合蛋白的整合载体pRCD461质粒图谱的构建。
图6A描述了SpGalE的氨基酸序列。图6B描述了SpGALE的编码序列。
图7描述了粟酒裂殖糖酵母、人、大肠杆菌(E.coli)和啤酒糖酵母差向异构酶的序列比对。
图8A是在RDP30-10(用pRCD257转化的RDP27)中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示出峰值位于1342m/z[A],对应于N-聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
图8B是在RDP37(用pXB53转化的RDP30-10)中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示出峰值位于1505m/z[B],对应于N-聚糖GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的质量,以及峰值位于1662m/z[C],对应于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
图9A是在用pXB53转化的YSH-44中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示出峰值位于1501m/z[B],对应于N-聚糖GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的质量,以及峰值位于1339m/z[A],对应于GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
图9B是在用pXB53和pRCD395转化的YSH-44中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示出峰值位于1501m/z[B],对应于N-聚糖GalGlcNAc2Man3GlcNAc2的质量;峰值位于1663m/z[C],对应于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量;和峰值位于1339m/z[A],对应于GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
图10A是在用pRCD352和pXB53转化的RDP 39-6(巴斯德毕赤氏酵母PBP-3(美国专利申请号20040018590))中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示出主要峰值位于1622m/z[K],对应于N-聚糖GalGlcNAcMan5GlcNAc2的质量,和峰值位于1460m/z[A],对应于GlcNAcMan5GlcNAc2的质量。
图10B是在用α1,2和β1,4-半乳糖苷酶消化后,在RDP 39-6中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示出主要峰值位于1461m/z[H],对应于N-聚糖GlcNAcMan5GlcNAc2的质量。
图11是在各种巴斯德毕赤氏酵母品系中产生的从K3所分离的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,其比较了UDP-半乳糖转运活性。A图显示了用编码Mnn2(s)/hGalTI和SpGalE的载体pRCD425转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP52)的N-聚糖特征。B图显示了用编码SpUGT的载体pRCD425和pRCD393转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP69)的N-聚糖特征。C图显示了用编码hUGT2的载体pRCD425和pSH262转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP70)的N-聚糖特征。D图显示了用编码hUGT1的载体pRCD425和pSH264转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP71)的N-聚糖特征。E图显示了用编码DmUGT的载体pRCD425和pSH263转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP57)的N-聚糖特征。
图12是在各种巴斯德毕赤氏酵母品系中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,其比较了β-1,4-半乳糖基转移酶的活性。A图显示了用编码DmUGT的载体pRCD425和pSH263转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP57)的N-聚糖特征。B图显示了用编码Mnn2(s)/hGalTII和SpGalE的载体pRCD440和编码DmUGT的载体pSH263转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP72)的N-聚糖特征。C图显示了用编码Mnn2(s)/hGalTIII和SpGalE的载体pRCD443和编码DmUGT的载体pSH263转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP73)的N-聚糖特征。
图13是在各种巴斯德毕赤氏酵母品系中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,其比较了差向异构酶活性。A图显示了用编码Mnn2(s)/hGalTI和ScGal10的载体pRCD424和编码DmUGT的载体pSH263转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP65)的N-聚糖特征。B图显示了用编码DmUGT载体pSH263和载体pRCD425顺次转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP74)的N-聚糖特征。C图显示了先用载体pRCD425然后用编码DmUGT的载体pSH263顺次转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP63)的N-聚糖特征。D图显示了用编码Mnn2(s)/hGalTI和hGalE的载体pXB53和pRCD438以及编码DmUGT的载体pSH263转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(其被命名为RDP67)的N-聚糖特征。
图14A是在RDP80(用pRCD465转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44)中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示主要峰值位于1663m/z[C],对应于N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
图14B是在用β1,4-半乳糖苷酶消化后在RDP80(用pRCD465转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44)中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示主要峰值位于1340m/z[A],对应于N-聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
图14C是在RDP80中产生并在CMP-NANA存在时与唾液酸转移酶体外温育所得的从K3释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示主要峰值位于2227m/z[X],对应于N-聚糖NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
图15A是在巴斯德毕赤氏酵母YSH-44(对照)中产生的从K3所释放的N-聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2[A]的MALDI-TOF-MS分析。图15B是在RDP 86(用pRCD461(Mnn2(s)/SpGalE/hGalTI融合体)转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44)中产生的从K3所释放的N-聚糖的MALDI-TOF-MS分析,显示主要峰值位于1679m/z[C],对应于N-聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。
具体实施方案
除非本文另有定义,本发明相关使用的科学和技术术语具有本领域技术人员通常理解的含义。而且,除非上下文有其它规定,单数形式的术语应当包括复数,而复数形式的术语应当包括单数。本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行。通常,与本文记载相关使用的命名,以及本文记载的生物化学、酶学、分子和细胞生物学、微生物学、遗传学以及蛋白质和核酸化学及杂交技术是本领域中众所周知的而且普遍使用的。除非另有说明,本发明的方法和技术通常按照本技术领域中众所周知的以及如贯穿本说明书中所引用和讨论的各种一般性的以及更为具体的参考文献中所记载的常规方法进行。参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2d ed.,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989);Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992,以及2002增刊);Harlow和Lane Antibodies:A Laboratory Manual Cold Spring HarborLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990);Introduction to Glycobiology,Maureen E.Taylor,Kurt Drickamer,Oxford Univ.Press(2003);Worthington EnzymeManual,Worthington Biochemical Corp.Freehold,NJ;Handbook of Biochemistry:Section A Proteins Vol I 1976CRC Press;Handbook of Biochemistry:Section AProteins Vol II 1976CRC Press;Essentials of Glycobiology,Gold Spring HarborLaboratory Press(1999)。与本文记载相关使用的命名,以及本文记载的生物化学和分子生物学的实验室操作规程和技术是本领域中众所周知的而且普遍使用的。
本文所提及的所有出版物、专利和其它参考文献均被引入作为参考。
除非另有说明,下列术语应被理解成具有以下含义:
如本文使用的,术语“K3”是指人纤溶酶原的kringle 3结构域。
如本文使用的,术语“N-聚糖”是指N-连接的寡糖,例如,通过天冬酰胺-N-乙酰葡糖胺键与多肽天冬酰胺残基附着的寡糖。N-聚糖含有共同的Man3GlcNAc2五糖核心(“Man”表示甘露糖;“Glc”表示葡萄糖;而“NAc”是指N-乙酰基;GlcNAc是指N-乙酰葡糖胺)。N-聚糖的差别在于包含添加至Man3GlcNAc2(“Man3”)核心结构的外周糖(例如,GlcNAc、半乳糖、岩藻糖和唾液酸)的分支(触角)数目不同。N-聚糖可根据其分支的组分进行分类(例如,高甘露糖、复合或杂合)。“高甘露糖”型N-聚糖含有五个或更多个甘露糖残基。“复合”型N-聚糖通常含有至少一个与1,3甘露糖臂附着的GlcNAc和至少一个与“三甘露糖”核心的1,6甘露糖臂附着的GlcNAc。“三甘露糖核心”是具有Man3结构的五糖核心。其通常被称为“少甘露糖(paucimannose)”结构。复合N-聚糖还可含有半乳糖(“Gal”)残基,所述残基任选地被唾液酸或衍生物(“NeuAc”,其中“Neu”是指神经氨酸而“Ac”是指乙酰基)修饰。复合N-聚糖还可含有包含“二等分(bisecting)”GlcNAc和核心岩藻糖(“Fuc”)的链内取代。复合N-聚糖还可含有在“三甘露糖核心”上多个触角,其通常被称为“多触角性聚糖”。“杂合”N-聚糖在三甘露糖核心的1,3甘露糖臂末端至少有一个GlcNAc,且在三甘露糖核心的1,6甘露糖臂上有零个或多个甘露糖。
本文所使用的缩写具有本领域通用的用法,参见例如,上述糖的缩写。其它通用的缩写法包括“PNG酶(PNGase)”,其表示肽N-糖苷酶F(EC 3.2.2.18);“GalT”,其表示半乳糖基转移酶;“β1,4GalT”,其表示UDP-半乳糖:β-N-乙酰葡糖胺β1,4-半乳糖基转移酶。来源于各种物种的β-半乳糖基转移酶缩写如下:“hGalT”是指人β1,4-半乳糖基转移酶,“bGalT”是指牛β1,4-半乳糖基转移酶,“XlGalT”是指非洲爪蟾(Xenopus leavis)β1,4-半乳糖基转移酶而“CeGalT“是指秀丽隐杆线虫(C.elegans)β1,4-半乳糖基转移酶。“GalNAcT”是指UDP-GalNAc-GlcNAcβ-1,4-N-乙酰氨基半乳糖基转移酶。
如本文使用的,术语“UGT”是指UDP-半乳糖转运蛋白。术语“SpGalE”是指粟酒裂殖糖酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶,“hGalE”是指人UDP-半乳糖4-差向异构酶,“ScGal10”是指啤酒糖酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶而“EcGalE”是指大肠杆菌UDP-半乳糖4-差向异构酶。
如本文使用的,术语“UDP-Gal”是指UDP-半乳糖而术语“UDP-GalNAc”是指UDP-N-乙酰半乳糖胺。
N-连接的糖蛋白包含与蛋白质天冬酰胺残基的酰胺氮相连接的N-乙酰葡糖胺残基。在糖蛋白中发现的主要糖是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和唾液酸(例如,N-乙酰-神经氨酸(NANA))。糖基团加工在ER腔共翻译地发生,且在高尔基体中继续而成为N-连接的糖蛋白。
如本文使用的,术语“人样”糖蛋白是指与蛋白质共价附着的修饰的N-聚糖,其与在人N-连接的寡糖合成中发现的糖蛋白相似。复合和杂合N-聚糖是人糖基化中发现的中间体。这些中间体的共有结构是Man3GlcNAc2核心结构,也称少甘露糖核心、五糖核心或简称Man3或Man3。因此,人样糖蛋白具有至少Man3核心结构。
如本文使用的,术语“起始1,6甘露糖基转移酶活性”是指在由含α1,6键的Ochlp所起始的外链形成过程中,酵母特异性聚糖残基通常被添加至三甘露糖核心的Manα1,3臂上。
半乳糖残基至N-聚糖的摩尔%转移,如通过MALDI-TOF-MS以正模式测量的,是指相对于摩尔%总的中性N-聚糖转移的摩尔%半乳糖转移。某些阳离子加合物诸如K+和Na+,通常与洗脱峰有一定关系,从而通过各加合物的分子量增加N-聚糖的质量。
如本文使用的,术语“分泌途径”是指各种糖基化酶沿着新生多肽链从细胞质流向内质网(ER)和高尔基体区室的分子流的装配线,脂质连接的寡糖前体和N-聚糖底物顺次暴露于所述酶。这些酶据认为沿着该途径定位。在酶Y之前作用于脂质连接的聚糖或N-聚糖的酶X被称为位于或作用于酶Y的“上游”;相似地,酶Y位于或作用于酶X的“下游”。
如本文使用的,术语“突变”是指基因产物例如糖基化相关酶的核酸或氨基酸序列中的任何改变。
术语“多核苷酸”或“核酸分子”是指长度至少为10个碱基的核苷酸多聚形式。该术语包括DNA分子(例如,cDNA或基因组或合成DNA)和RNA分子(例如,mRNA或合成RNA),以及包含非天然核苷酸类似物、非天然核苷间键或二者兼有的DNA或RNA类似物。核酸可以是任何拓扑学构象。例如,核酸可以是单链、双链、三链、四元、部分双链、分支、发夹、环状或扣锁(padlocked)构象。该术语包括单链和双链形式的DNA。
除非另有说明,“包含SEQ ID NO:X的核酸”是指这样的核酸,该核酸的至少一部分含有(i)SEQ ID NO:X的序列,或者(ii)与SEQ ID NO:X互补的序列。在所述两者之间的选择由上下文确定。例如,如果核酸用作探针,则在所述两者之间的选择由探针与所需靶互补的要求来确定。
“分离的”或“基本上纯的”核酸或多核苷酸(例如,RNA、DNA或混合聚合物)是指基本与其它细胞成分分离的核酸或多核苷酸,其它细胞成分是在天然宿主细胞中与天然多核苷酸天然伴随的那些成分,例如与所述核酸天然结合的核糖体、聚合酶和基因组序列。该术语包括如下核酸或多核苷酸,所述核酸或多核苷酸(1)已从其天然存在的环境中取出,(2)与多核苷酸的全部或部分不结合,在自然界中从该多核苷酸发现“分离的多核苷酸”,(3)可操作地连接于其天然不相连接的多核苷酸,或(4)不存在于自然界中。术语“分离的”或“基本上纯的”还用于是指重组或克隆的DNA分离物、化学合成的多核苷酸类似物或异源系统生物合成的多核苷酸类似物。
然而,“分离的”并非一定要求所述核酸或多核苷酸自身已经从其天然环境中物理地取出。例如,如果存在下述情况,则生物基因组中的内源核酸序列则在本文中被认为是“分离的”,所述情况是将异源序列(即天然不与该内源核酸序列毗邻的序列)置于与所述内源核酸序列相毗邻,由此改变该内源核酸序列的表达。举例说明,可用非天然启动子序列取代(例如通过同源重组)人细胞基因组中基因的天然启动子,从而该基因具有改变的表达模式。该基因现在可成为“分离的”,因为其与至少部分其天然侧接序列相分离。
如果核酸包含在基因组中相应核酸天然不存在的任何修饰,则该核酸也被认为是“分离的”。例如,如果内源编码序列包含人工例如通过人为干预,导入的插入、缺失或点突变,则内源编码序列被认为是“分离的”。“分离的核酸”还包括被整合至宿主细胞染色体异源位点的核酸,即表现为附加体的核酸构建体。而且,“分离的核酸”当通过重组技术制备时可基本不含其它细胞材料或基本不含培养基,或当通过化学合成时基本不含化学前体或其它化学制剂。
如本文使用的,参照核酸序列的术语“简并变体”包括这样的核酸序列,该核酸序列可根据标准遗传密码进行翻译以提供与所述参照核酸序列翻译的相同的氨基酸序列。
核酸序列上下文中的术语“百分比序列同一性”或“同一性”是指当进行最大对应性比对时两条序列中相同的残基。序列同一性比较的长度可以在至少约9个核苷酸,通常至少约20个核苷酸,更通常至少约24个核苷酸,一般地至少约28个核苷酸,更一般至少约32个核苷酸,以及优选地至少约36个或更多个核苷酸的一段序列上。在本技术领域中有许多不同的算法可用于测量核苷酸序列的同一性。例如,多核苷酸序列可以利用FASTA、Gap或Bestfit来进行比较,FASTA、Gap或Bestfit是Wisconsin Package Version 10.0,GeneticsComputer Group(GCG),Madison,Wisconsin中的程序。FASTA提供了在查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson,1990,(在此引入本文作为参考)。例如,核酸序列之间的百分比序列同一性可以利用具有默认参数(字长为6和评分矩阵采用NOPAM因子)的FASTA确定或利用具有GCG Version 6.1所提供的具有其默认参数的Gap来确定,它们被引入本文作为参考。
当涉及核酸或其片段时,术语“相当大同源性”或“相当大相似性”是指当与另一个核酸(或其互补链)进行含有适当核苷酸插入或缺失的最佳序列对比时,如通过任一序列同一性的公知算法,如上述的FASTA、BLAST或Gap所测量的,核苷酸序列同一性至为少约50%,更优选60%的核苷酸碱基,通常至少约70%,更通常至少约80%,优选至少约90%,且更优选地至少约95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基。
可选地,当核酸或其片段与另一核酸、另一核酸的链或其互补链在严格杂交条件下杂交时,存在相当大的同源性或相似性。核酸杂交试验上下文中的“严格杂交条件”和“严格洗涤条件”依赖于大量不同的物理参数。核酸杂交会受到诸如盐浓度、温度、溶剂、杂交种类的碱基组成、互补区的长度以及杂交核酸之间核苷酸碱基错配数目的条件的影响,这一点本领域技术人员很容易理解。本领域普通技术人员知晓如何改变这些参数以实现特定杂交严格性。
一般而言,“严格杂交”在特定组的条件下在低于特定DNA杂交体热解链温度(Tm)约25℃下进行。“严格洗涤”在特定组的条件下在低于特定DNA杂交体Tm约5℃的温度下进行。Tm是50%的靶序列与完全匹配的探针杂交的温度。参见Sambrook等,如上文,9.51页,在此引入作为参考。为了本发明目的,“高严格条件”对溶液相杂交定义为于65℃在6X SSC(其中20X SSC包含3.0M NaCl和0.3M柠檬酸钠),1%SDS中水性杂交(即不含甲酰胺)8-12小时,之后为于65℃在0.2X SSC,0.1%SDS中的两次洗涤,20分钟。本领域技术人员可以理解于65℃的杂交依赖于多种因子,包括杂交序列的长度和百分比同一性而会以不同的速率发生。
本发明的核酸(也称为多核苷酸)可包括RNA、cDNA、基因组DNA,和上述的合成形式以及混合多聚体的有义链和反义链。它们可以被化学或生化修饰,或可以包含非天然或衍生的核苷酸碱基,本领域技术人员很容易理解这一点。所述修饰包括,例如,标记,甲基化,一个或多个天然存在的核苷酸被其类似物取代,核苷酸间的修饰,诸如非荷电的键(例如,甲基膦酸酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等),带电的键(例如,硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等),侧基部分(例如,多肽),嵌入剂(例如,吖啶、补骨脂素等),螯合剂,烷化剂,以及修饰的键(例如,α端基异构核酸等)。还包括在通过氢键和其它化学相互作用结合于指定序列的能力中模拟多核苷酸的合成分子。所述分子是本领域已知的,且包括例如其中分子骨架中磷酸酯键被肽键取代的那些分子。
当用于核酸序列时,术语“突变的”是指相对于参照核酸序列而言,核酸序列中的核苷酸可被插入、缺失和改变。可在基因座中作出单个改变(点突变),或可在单一基因座中插入、缺失或改变多个核苷酸。此外,可在核酸序列中任何数目基因座上作出一个或多个改变。核酸序列可采用本领域已知的任何方法进行突变,所述方法包括但不限于诱变技术,诸如“易错PCR”(在DNA聚合酶复制保真度低的条件下进行PCR以使沿PCR产物全长获得高点突变率的方法。参见例如,Leung,D.W.等,Technique,1,pp.11-15(1989)以及Caldwell,R.C.& Joyce G.F.,PCR Methods Applic.,2,pp.28-33(1992));和“寡核苷酸指导的诱变”(能够在任何克隆的目标DNA片段中产生位点特异性突变的方法。参见例如,Reidhaar-Olson,J.F.& Sauer,R.T.等,Science,241,pp.53-57(1988))。
本文所使用的术语“载体”是指能够转运已经与其连接的另一核酸的核酸分子。载体的一种类型是“质粒”,其是指其中可连接其它DNA片段的环状双链DNA环。其它载体包括粘粒、细菌人工染色体(BAC)和酵母人工染色体(YAC)。另一类型的载体是病毒载体,其中额外DNA片段可连接至病毒基因组中(下面有更详细的讨论)。特定载体能够在其导入的宿主细胞中自主复制(例如,含有能够在宿主细胞中发挥功能的复制起点的载体)。其它载体可在导入宿主细胞后被整合至宿主细胞基因组中,并由此随宿主基因组一起复制。此外,特定优选的载体能够指导与其可操作地连接的基因的表达。所述载体在本文中被称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。
“可操作地连接的”表达控制序列是指这样一种连接方式,其中表达控制序列邻接目标基因以控制目标基因,以及表达控制序列反式或在远处作用以控制目标基因。
本文所使用的术语“表达控制序列”是指影响与其可操作地连接的编码序列表达所必需的多核苷酸序列。表达控制序列是控制核酸序列转录、转录后事件及翻译的序列。表达控制序列包括适宜的转录起始、终止、启动子和增强子序列;有效的RNA加工信号,诸如剪接和多腺苷酸化信号;稳定细胞质mRNA的序列;增强翻译效率的序列(例如,核糖体结合位点);增强蛋白质稳定性的序列;以及在需要时,增强蛋白质分泌的序列。所述控制序列的性质依赖于宿主生物而不同;在原核生物中,所述控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列。术语“控制序列”最低限度地意欲包括表达必需的全部组分,且也可包括有益的其它组分,例如前导序列和融合配偶体序列(fusionparrner sequence)。
术语“重组低等真核宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”),如本文使用的,意指其中已经导入了重组载体的细胞。应当理解,所述术语不仅意指特定受试者细胞而且还意指该细胞的子代。因为由于突变或环境影响,某些修饰会在连续世代中发生,所以所述子代事实上与亲代细胞并不相同,但其仍包含在本发明术语“宿主细胞”范围内。重组宿主细胞可以是培养基中生长的分离的细胞或细胞系,或者可以是位于活体组织或生物中的细胞。重组宿主细胞包括酵母、真菌、领鞭毛虫(collar-flagellates)、微孢子虫、alveolates(例如,甲藻)、stramenopiles(例如,褐藻、原生动物)、红藻门(rhodophyta)(例如,红藻)、植物(例如,绿藻、植物细胞、藓类)以及其它原生生物。
本文使用的术语“肽”是指短多肽,例如长度通常小于约50个氨基酸以及更通常长度小于约30个氨基酸的肽。本文使用的该术语包括模拟结构并由此模拟生物学功能的类似物和模拟物。
术语“多肽”包括天然存在的和非天然存在的蛋白质,以及其片段、突变体、衍生物和类似物。多肽可以是单体或多聚体。而且,多肽可包括大量不同的结构域,每一结构域都具有一种或多种不同活性。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是这样的蛋白质或多肽,根据其起源或衍生来源,其(1)不与在天然状态中与其伴随的天然结合的组分结合,(2)当以未见于自然界的纯度存在时,其中纯度可参照其它细胞材料的存在而得以判定(例如,不含来自相同物种的其它蛋白),(3)被来自不同物种的细胞所表达,或者(4)不存在于自然界中(例如,其是在自然界中发现的多肽的片段或其包含未见于自然界的氨基酸类似物或衍生物或包含除标准肽键之外的其它键)。因此,通过化学合成或在与其天然起源的细胞不同的细胞系统合成的多肽,即为与其天然结合的组分“分离的”。还可采用本领域众所周知的蛋白质纯化技术,通过分离使多肽或蛋白质基本上不含天然结合的组分。由此定义,“分离的”并非必然要求所述蛋白质、多肽、肽或寡肽已经从其天然环境中物理地取出。
本文使用的术语“多肽片段”是指与全长多肽相比,含有氨基末端和/或羧基末端缺失的多肽。在优选的实施方案中,多肽片段是连续的序列,其中所述片段的氨基酸序列与天然存在的序列中的相应位置相同。片段长度通常为至少5、6、7、8、9或10个氨基酸,优选至少12、14、16或18个氨基酸,更优选至少20个氨基酸,更优选至少25、30、35、40或45个氨基酸,甚至更优选至少50或60个氨基酸,以及甚至更优选至少70个氨基酸。
“修饰的衍生物”是指一级结构序列基本上同源但包含例如体内或体外化学和生化修饰或掺入天然多肽中未见的氨基酸的那些多肽或其片段。所述修饰包括,例如乙酰化、羧基化、磷酸化、糖基化、遍在蛋白化、例如用放射性核素进行的标记、以及各种酶促修饰,这一点本领域技术人员很容易理解。标记多肽的多种方法以及用于该目的的多种取代基或标记是本领域众所周知的,且包括放射性同位素,诸如125I、32P、35S和3H、结合标记抗配体(antiligand)(例如抗体)的配体、荧光团、化学发光剂、酶以及可用作标记的配体的特异结合对成员的抗配体。标记的选择依赖于需要的灵敏度、与引物缀合的简易度、稳定性需要以及可用的手段。标记多肽的方法是本领域众所周知的。参见Ausubel等,1992,在此引入作为参考。
术语“融合蛋白”是指包含与异源氨基酸序列偶联的多肽或片段的多肽。融合蛋白是有用的,因为它们可被构建为含有来自两种或更多种不同蛋白的两种或更多种所需功能元件。融合蛋白包含来自目标多肽的至少10个连续氨基酸,更优选地至少20或30个氨基酸,甚至更优选地至少40、50或60个氨基酸,而更优选地至少75、100或125个氨基酸。融合蛋白可通过构建与编码不同蛋白或肽的核酸序列符合读框的编码多肽或其片段的核酸序列,然后表达融合蛋白而重组性生产。可选地,融合蛋白可通过将多肽或其片段与另一蛋白交联而化学生产。
术语“非肽类似物”是指特性与参照多肽特性相类似的化合物。非肽化合物还可被称为“肽的模拟物(peptide mimetic)”或“肽模拟物(peptidomimetic)”。参见例如,Jones,(1992)Amino Acid and Peptide Synthesis,Oxford University Press;Jung,(1997)Combinatorial Peptide and NonpeptideLibraries:A Handbook John Wiley;Bodanszky等,(1993)Peptide Chemistry--APractical Textbook,Springer Verlag;′Synthetic Peptides:A Users Guide′,G.A.Grant,Ed,W.H.Freeman and Co.,1992;Evans等,J.Med.Chem.30:1229(1987);Fauchere,J.Adv.Drug Res.15:29(1986);Veber和Freidinger TINS p.392(1985);以及上述文献中所引用的参考文献,所述参考文献在此引入作为参考。所述化合物通常借助计算机分子建模进行开发。与本发明有用的肽结构相似的肽模拟物可用于产生等同作用,并因此被认为构成本发明的一部分。
“多肽突变体”或“突变蛋白质”是指与天然或野生型蛋白质的氨基酸序列相比,序列包含一个或多个氨基酸的插入、重复、缺失、重排或取代的多肽。突变蛋白质可有一个或多个氨基酸点取代,其中一个位置上的单个氨基酸变成另一氨基酸;突变蛋白质可有一个或多个插入和/或缺失,其中在天然存在的蛋白序列中分别插入或缺失一个或多个氨基酸;和/或突变蛋白质可有在氨基或羧基末端或者两者的氨基酸序列的截短。突变蛋白质可具有与天然存在的蛋白质相同的生物学活性,但优选具有与之不同的生物学活性。
突变蛋白质具有与其野生型对应物至少70%的全长序列同源性。甚至更优选的是突变蛋白质具有与野生型蛋白质80%、85%或90%的全长序列同源性。在甚至更为优选的实施方案中,突变蛋白质表现出95%序列同一性,甚至更优选97%,甚至更优选98%以及甚至更优选99%、99.5%或99.9%的全长序列同一性。序列同源性可通过任何常规的序列分析算法,诸如Gap或Bestfit进行测量。
优选氨基酸取代是如下的取代,所述取代:(1)降低了对蛋白水解的易感性,(2)降低了对氧化的易感性,(3)改变了用于形成蛋白质复合物的结合亲和性,(4)改变了结合亲和性或酶活性,以及(5)赋予或修饰了所述类似物的其它理化或功能特性。
如本文使用的,二十个常规氨基酸及其缩写遵循常规用法。参见Immunology-A Synthesis(第二版,E.S.Golub和D.R.Gren编,Sinauer Associates,Sunderland,Mass.(1991)),其被引入本文作为参考。二十个常规氨基酸的立体异构体(例如D-氨基酸),非天然氨基酸如α-,α-双取代的氨基酸,N-烷基氨基酸,和其它非常规氨基酸也可以是本发明多肽的合适组分。非常规氨基酸的实例包括:4-羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N-乙酰丝氨酸、N-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟赖氨酸、s-N-甲基精氨酸和其它类似氨基酸和亚氨基酸(例如4-羟脯氨酸)。在本文使用的多肽符号中,按照标准用法和惯例,左手方向是氨基末端方向而右手方向是羧基末端方向。
如果编码蛋白质的核酸序列含有与编码第二种蛋白质的核酸序列相似的序列,则该蛋白质与第二种蛋白质有“同源性”或是“同源的”。可选地,如果两种蛋白质具有“相似的”氨基酸序列,则该蛋白质与第二种蛋白质有同源性。(因此,术语“同源的蛋白质”意指两种蛋白质有相似的氨基酸序列)。在优选实施方案中,同源的蛋白质是与野生型蛋白质表现出60%序列同源性的蛋白质,更优选表现出70%序列同源性的蛋白质。甚至更优选的是与野生型蛋白质表现出80%、85%或90%序列同源性的同源的蛋白质。而在更优选的实施方案中,同源的蛋白质表现出95%、97%、98%或99%的序列同一性。如本文使用的,两个氨基酸序列域之间的同源性(尤其是关于预测的结构相似性)被理解为暗示功能上的相似性。
当“同源”应用于蛋白质或肽时,应该认识到,不相同的残基位置通常差别在于保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中一氨基酸残基被另一具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。通常,保守氨基酸取代基本上不会改变蛋白质功能特性。当两个或更多个氨基酸序列由于保守取代而彼此不同时,百分比序列同一性或同源性程度可被上调以校正取代的保守特性。进行这种调整的手段是本技术领域技术人员所熟知的(参见例如,Pearson等,1994,引入本文作为参考)。
以下六组的每一组中包含彼此互为保守取代的氨基酸:1)丝氨酸(S),苏氨酸(T);2)天冬氨酸(D),谷氨酸(E);3)天冬酰胺(N),谷酰胺(Q);4)精氨酸(R),赖氨酸(K);5)异亮氨酸(I),亮氨酸(L),甲硫氨酸(M),丙氨酸(A),缬氨酸(V),和6)苯丙氨酸(F),酪氨酸(Y),色氨酸(W)。
多肽的序列同源性,也被称作百分比序列同一性,一般利用序列分析软件来测量。参见例如,Genetics Computer Group(GCG),University of WisconsinBiotechnology Center,910University Avenue,Madison,Wisconsin 53705的序列分析软件包。蛋白分析软件利用分配给各种取代、缺失和包括保守氨基酸取代在内的其它修饰的同源性量度来使相似序列匹配。例如,GCG包括诸如“Gap”和“Bestfit”这样的程序,该程序可用于在默认参数下确定密切相关的多肽之间(诸如来源于生物不同物种的同源多肽之间,或者野生型蛋白与其突变蛋白质之间)的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG 6.1版。
当将抑制性分子序列与含有源自不同生物的大量序列的数据库进行比较时,优选的算法是计算机程序BLAST(Altschul,S.F.等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410;Gish和States(1993)Nature Genet.3:266-272;Madden,T.L.等(1996)Meth.Enzymol.266:131-141;Altschul,S.F.等(1997)Nucleic AcidsRes.25:3389-3402;Zhang,J.和Madden,T.L.(1997)Genome Res.7:649-656),特别是blastp或tblastn(Altschul等,1997)。BLASTp的优选参数是:期望值(Expectationvalue):10(默认值);Filter:seg(默认值);打开缺口的成本(Cost to open a gap):11(默认值);延伸缺口的成本(Cost to extend a gap):1(默认值);最大比对(Max.alignments):100(默认值);字长(Word size):11(默认值);描述数目(No.ofdescriptions):100(默认值);罚分矩阵(Penalty Matrix):BLOWSUM62。
进行同源性比较的多肽序列的长度一般是至少约16个氨基酸残基,通常至少约20个残基,更通常地是至少约24个残基,一般至少约28个残基,以及优选地多于约35个残基。当检索包括源于大量不同生物的序列的数据库时,优选地是进行氨基酸序列比较。采用氨基酸序列的数据库检索可通过本领域中已知的除blastp之外的算法进行测量。例如,可以利用FASTA,一种GCG6.1版程序来比较多肽序列。FASTA可提供查询和检索序列之间最佳重叠区域的比对和百分比序列同一性(Pearson(1990),其被引入本文作为参考)。例如,氨基酸序列之间百分比序列同一性可用具有默认参数的FASTA(字长为2和评分矩阵PAM250)来确定,该程序提供在GCG Version 6.1中,引入本文作为参考。
本文使用的术语“结构域”是指对生物分子已知或推定功能有贡献的生物分子结构。结构域可以是与区域或其部分共生(coextensive)的;结构域也可包括生物分子不同的非连续区域。蛋白质结构域的实例包括,但不限于Ig结构域、胞外结构域、跨膜结构域和胞质结构域。
本文使用的,术语“分子”是指任何化合物,包括但不限于小分子、肽、蛋白质、糖、核苷酸、核酸、脂质等,且这种化合物可以是天然的或合成的。
在本说明书以及其实施方案通篇中,词语“包含(comprise)”或其变体形式诸如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”,应被理解为是指包含所述的整体或整体的组而并不排除任何其它整体或整体的组。
除非另有定义,本文所使用的所有技术和科学术语均具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。以下描述了示例性方法和材料,尽管与本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可用于实施本发明并且它们对于本领域技术人员而言是显而易见的。本文所述的所有出版物和其它参考文件均全文引入作为参考。如有冲突,以本说明书(包括定义)为准。材料、方法和实施例仅为例举说明而并非意在限制。
工程改造宿主以产生人样半乳糖基化糖蛋白
本发明提供了产生人样糖蛋白的重组低等真核宿主细胞,其中所述糖蛋白的特征在于含有末端β-半乳糖残基并基本上缺少岩藻糖和唾液酸。在一个实施方案中,本发明提供了低等真核生物宿主细胞,所述细胞包含编码UDP-半乳糖:β-N-乙酰葡糖胺β1,4-半乳糖基转移酶(β1,4GalT)的分离的核酸分子与至少第二种编码UDP-半乳糖转运蛋白的分离的核酸分子、编码UDP-半乳糖4-差向异构酶的分离的核酸或编码半乳糖激酶或半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的分离的核酸的组合。在另一实施方案中,β1,4GalT与编码UDP-半乳糖转运蛋白的分离的核酸分子和编码UDP-半乳糖4-差向异构酶的分离的核酸分子组合表达。还提供了编码上述酶的核酸序列的变体和片段、重组DNA分子和包含用于转化的酶的表达载体。
本发明的一个方面,提供在低等真核生物宿主细胞中产生人样糖蛋白的方法,所述方法包括如下步骤:通过表达β1,4GalT活性,催化半乳糖残基以β-键从UDP-半乳糖转移至受体底物上,和向宿主中导入UDP-半乳糖4-差向异构酶活性、半乳糖激酶活性、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性或UDP-半乳糖转运活性。受体底物优选为包含末端GlcNAc残基的寡糖组合物,例如,三甘露糖核心上的GlcNAcβ1,2-Manα1,3;GlcNAcβ1,4-Manα1,3;GlcNAcβ1,2-Manα1,6;GlcNAcβ1,4-Manα1,6;或GlcNAcβ1,6-Manα1,6分支。
受体底物更为优选为与目标蛋白质共价连接(N-连接)的复合聚糖(例如,GlcNAc2Man3GlcNAc2)、杂合聚糖(例如,GlcNAcMan5GlcNAc2)或多触角聚糖(例如,GlcNAc4Man3GlcNAc2)。β-半乳糖残基被转移至受体底物上从而形成β-糖苷键,所述受体底物包含2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(GlcNAc)碳原子4位的羟基。包含能够接受半乳糖残基的末端GlcNAc残基的N-连接的受体底物包括,但不限于,GlcNAcMan3GlcNAc2、GlcNAc2Man3GlcNAc2、GlcNAc3Man3GlcNAc2、GlcNAc4Man3GlcNAc2、GlcNAc5Man3GlcNAc2、GlcNAc6Man3GlcNAc2、GlcNAcMan4GlcNAc2、GlcNAcMan5GlcNAc2、GlcNAc2Man5GlcNAc2和GlcNAc3Man5GlcNAc2。
β1,4-半乳糖基转移酶基因的克隆
采用引物RCD192(SEQ ID NO:1)和RCD186(SEQ ID NO:2)从人肾cDNA(marathon ready cDNA,Clontech)PCR扩增人b-1,4-半乳糖基转移酶I基因(hGalTI,Genbank AH003575)。将该PCR产物克隆至克隆的pCR2.1(Invitrogen)并测序。从该克隆实施PCR重叠诱变(overlap mutagenesis)。基因5′末端至NotI位点采用引物RCD198(SEQ ID NO:3)和RCD201(SEQ ID NO:4)进行扩增,而3′末端采用引物RCD200(SEQ ID NO:5)和RCD199(SEQ ID NO:6)进行扩增。采用RCD198(SEQ ID NO:3)和RCD 199(SEQ ID NO:6)将产物重叠在一起以重新合成含有野生型氨基酸(除N-端缺失43个氨基酸外)序列但除去了NotI位点的ORF。新的截短的hGalTI PCR产物在pCR2.1中克隆并测序。导入的AscI/PacI位点然后被用于将片段亚克隆至质粒pRCD259(图1)(PpURA3/HYGRroll-in载体),从而产生pRCD260(图1)(实施例4)。
使用相同的策略克隆人β1,4GalTII和人β1,4GalTIII。实施例4描述了采用基因特异性引物通过PCR扩增人β1,4-半乳糖基转移酶II和III并随后将其克隆至载体。
在低等真核生物中表达β1,4-半乳糖基转移酶活性
在低等真核生物宿主细胞(例如巴斯德毕赤氏酵母)中导入并表达编码β1,4GalT活性的基因或编码β1,4-半乳糖基转移酶活性的重组核酸分子,编码β1,4GalT活性的基因融合体(例如,pXB53)(图1)或从编码β1,4-半乳糖基转移酶的核酸分子(Genbank AH003575)的表达,以生成半乳糖基化糖蛋白。可选地,通过激活β-半乳糖基转移酶活性,低等真核生物宿主细胞可进行工程改造以生产半乳糖基化糖形(galactosylated glycoform)。催化活性的β1,4-半乳糖基转移酶结构域或其部分催化半乳糖残基从UDP-半乳糖转移至寡糖受体底物(例如,GlcNAc2Man3GlcNAc2)的末端GlcNAc残基上,从而形成β1,4Gal糖苷键。根据本发明产生的复合半乳糖基化N-聚糖基本上缺少岩藻糖和唾液酸(例如,Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)。包含复合半乳糖基化、无岩藻糖化以及无唾液酸化N-聚糖的所述糖蛋白组合物可以用作治疗剂。
新形成的底物还是在低等真核生物宿主中生产的唾液酸化糖蛋白形成中的优选前体。因此本发明提供了生产人样糖蛋白的方法,其中所述糖蛋白的特征在于含有末端半乳糖残基,所述半乳糖残基是用于在低等真核生物中转移唾液酸的受体底物。
β1,4-半乳糖基转移酶的组合DNA文库
在本发明的相关方面,β1,4-半乳糖基转移酶和酵母靶向序列跨膜结构域的组合DNA文库在低等真核生物宿主细胞中生成并表达,如WO 02/00879中所述。
因此,生成了与长度:短、中、长靶向肽亚文库相融合的hGalTI(例如Genbank登录号X55415)亚文库,如WO 02/00879中所述。靶向肽亚文库包括编码靶向信号肽的核酸序列,所述靶向信号肽将使蛋白质在ER、高尔基体或高尔基体外侧网络中的特定位置定位。这些靶向肽选自要工程改造的宿主生物以及其它相关或不相关的生物。通常,所述序列可分为如下三类:(1)N-末端序列,该序列编码胞质尾(ct)、跨膜结构域(tmd)以及部分或全部的茎区(sr),其一同或独立地将蛋白质锚定在高尔基体内(腔的)膜上;(2)回收信号,其通常见于C-端,诸如HDEL或KDEL四肽;和(3)来自各种蛋白质的膜跨越区,例如,核苷酸糖转运蛋白,其已知定位于高尔基体。
靶向肽在本文中相对于II型膜蛋白的部分而被描述为短(s)、中(m)和长(l)的。描述为短(s)的靶向肽序列对应于膜结合蛋白的跨膜结构域(tmd)。描述为长(1)的靶向肽序列对应于跨膜结构域(tmd)和茎区(sr)的长度。被描述为中(m)的靶向肽序列对应于跨膜结构域(tmd)和茎区(sr)大约一半的长度。在本文中根据相对于其野生型糖基化酶缺失的核苷酸数目而对催化结构域区进行描述。
在一个实施方案中,将文库转化至巴斯德毕赤氏酵母中然后在包含潮霉素的基本培养基上选择转化体。与各种前导序列(如下述)融合的β1,4-半乳糖基转移酶I活性通过半乳糖基化N-聚糖的生成作为以正模式进行的MALDI-TOF MS的读数来进行分析。
□-半乳糖基转移酶融合构建体
将分离的酵母靶向序列跨膜结构域文库(由48个前导序列组成(WO02/00879))连接至pRCD260中的NotI/AscI位点,所述位点位于hGalTI基因的上游,以生成质粒pXB20-pXB67(每个质粒包含一种前导序列)。
本发明源自组合DNA文库的GalT融合构建体的代表性实例是pXB53(图1),其是截短的啤酒糖酵母Mnn2(s)靶向肽(来自Genbank NP_009571MNN2的1-108位核苷酸),其与N-端43个氨基酸缺失的人β1,4-半乳糖基转移酶I(Genbank AH003575)符合读框地连接。因此本文使用的命名,将靶向肽/糖基化酶催化结构域区命名为啤酒糖酵母Mnn2(s)/hGalTIΔ43。但是,编码的融合蛋白单独不足以生成有大部分半乳糖基化聚糖的N-聚糖,如图9A所示。虽然与N-聚糖GalGlcNAc2Man3GlcNAc2[B]质量相符的峰值在巴斯德毕赤氏酵母YSH-44中有hGalTI导入时显示,然而,随后消化所述样品显示该峰值与b-1,4-半乳糖苷酶并不相符(实施例7)。
此外,β-1,4-半乳糖基转移酶活性可能对特定目标蛋白是特异性的。因此,可以进一步理解并非所有靶向肽/半乳糖基转移酶催化结构域融合构建体都同样好地发挥功能以在目标糖蛋白上生成正确的糖基化。因此,目标蛋白质可被导入用组合DNA文库转化的宿主细胞以鉴定出一种或多种表达最适于目标蛋白的半乳糖基转移酶活性的融合构建体。本领域技术人员能够采用本文所述的组合DNA文库方法构建并选择最优的融合构建体。
此外,展示出局部化活性的半乳糖基转移酶催化结构域(或更通常地,任何酶的结构域)的其它这种融合构建体可采用本文所述技术进行制备,这是显而易见的。制备和使用本发明的组合DNA文库以例如,在导入特定宿主细胞的特定表达载体中最优化从融合构建体文库中生产Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,这是本领域技术人员的常规试验。
在基因改变的巴斯德毕赤氏酵母中产生半乳糖基化N-聚糖
根据本发明方法产生的人样半乳糖基化糖蛋白包括GalGlcNAcMan3GlcNAc2、GalGlcNAc2Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2、GalGlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc3Man3GlcNAc2、GalGlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal2GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal3GlcNAc4Man3GlcNAc2、Gal4GlcNAc4Man3GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAcMan5GlcNAc2、GalGlcNAc2Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc2Man5GlcNAc2、GalGlcNAc3Man5GlcNAc2、Gal2GlcNAc3Man5GlcNAc2和Gal3GlcNAc3Man5GlcNAc2。
在本发明的一个实施方案中,将包含MNN2(s)/hGalTI的质粒pXB53转化至巴斯德毕赤氏酵母RDP30-10,产生GlcNAc2Man3Glc NAc2的宿主中(实施例5)。催化活性的β-半乳糖基转移酶结构域催化半乳糖残基转移至含有末端GlcNAc残基的受体底物(例如,GlcNAc2Man3GlcNAc2),以产生半乳糖基化糖形。采用MALDI-TOF MS,来自巴斯德毕赤氏酵母RDP37报告蛋白质所释放的N-聚糖,显示出峰值位于1505m/z,该峰值与GalGlcNAc2Man3GlcNAc2[B]的质量相符(图8B)。通过包含人啤酒糖酵母Mnn2(s)/β1,4-半乳糖基转移酶融合构建体,将半乳糖残基转移至受体底物GlcNAc2Man3GlcNAc2,从而产生GalGlcNAc2Man3GlcNAc2显示为大约有10-20%。图8B显示了Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2在1662m/z的对应质量[C]。因此,两个半乳糖残基转移至GlcNAc2Man3GlcNAc2底物从而产生Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2是显而易见的。因此,本发明的宿主表现出人样N-聚糖上至少10摩尔%的半乳糖部分。
应当认识到GalTI能够将第二个半乳糖残基转移至宿主内的受体底物上,所述受体底物含有第二个末端GlcNAc残基,从而产生复合(例如,双触角)聚糖。例如,Mnn2(s)/hGalTI融合体,其能在聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2的GlcNAcβ1,2Manα1,3臂上用半乳糖残基对末端GlcNAc加帽,能在暴露有末端GlcNAc残基的其它臂上(例如,GlcNAcβ1,2Manα1,6)形成至少一个额外的β-糖苷键,由此在不表达后续半乳糖基转移酶的情况下,产生了半乳糖基化糖形。图12显示了MALDI-TOF MS所示峰值位于1663m/z[C],其与Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2相对应。结果显示,特定β1,4-GalT的底物特异性并不限于催化仅将半乳糖残基转移至聚糖特定臂上,因此第二种半乳糖基转移酶可以不用。因此,在本发明的一个实施方案中,仅表达一个β1,4-GalT活性即能够产生单-、双-、三-和四-触角半乳糖基化糖形。在所述实施方案中,聚糖上的半乳糖残基和GlcNAc残基之间的所有糖苷键都是相同的。例如,hGalT1在产生双触角聚糖的宿主中的表达将展示两个末端Galβ1,4-GlcNAcβ1,2键。
可选地,不同的β-半乳糖基转移酶活性(例如hGalT II)或其催化性活化部分,可在低等真核生物宿主细胞中表达。在一个实施方案中,包含MNN2(s)/hGalTII和SpGALE的载体pRCD440以及包含DmUGT的载体pSH263(图3B)被转化至宿主巴斯德毕赤氏酵母YSH-44中(图12B)。转化体的N-聚糖分析显示,产生了Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2糖形,从而提示hGalTII将两个半乳糖残基转移至受体底物上(图12B)。二-半乳糖基化结构(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)占主要部分。关于%中性聚糖,半乳糖基部分的转移大约是75%。
在另一实施方案中,在低等真核生物宿主细胞中表达编码hGalTIII的序列。图12C显示了组合的单-和双-半乳糖基化聚糖的半乳糖转移,达到了约50至60摩尔%。HGalTI、hGalTII和hGalTIII的比较显示出各种水平的半乳糖转移(图12A-C)。来自巴斯德毕赤氏酵母RDP71的N-聚糖特征(图12A)显示,hGalTI表达所产生的半乳糖残基转移对于K3报告蛋白质是最佳的(大约80摩尔%)。
另外的β1,4-半乳糖基转移酶的表达
在另一实施方案中,分别采用中期和晚期高尔基体靶向序列依次定位和表达hGalTI和hGalTII。例如,hGalTI定位中期高尔基体,而hGalTII定位晚期高尔基体。可选地,为了避免底物与甘露糖苷酶II竞争,在另一实施方案中,针对β-半乳糖基转移酶使用晚期高尔基体前导序列。
半乳糖基转移酶活性的表达通常产生单-和双半乳糖基化聚糖。除单-半乳糖基化糖形之外,多触角半乳糖基化糖形通常可在表达半乳糖基转移酶活性的宿主细胞中生成。
对本领域技术人员而言,通过采用各种启动子和各种表达载体在重组宿主细胞中最优化半乳糖基转移酶活性或编码蛋白的基因的表达是常规试验。
在N-聚糖产生中定制半乳糖基化糖苷键
在本发明的另一方面,采用不同GalT产生多触角半乳糖基化糖蛋白,会产生不同的β-糖苷键。在一个实施方案中,优选所需的β-糖苷键在低等真核生物宿主细胞中产生。例如,表达β1,4GalT家族中任一种(例如,hGalTI、hGalT2、hGalT3、hGalT4、hGalT5、hGalT6、hGalT7、bGalTI、XlGalT、CeGalTII),以用于产生特征在于含有β1,4Gal糖苷键的半乳糖基化糖蛋白。
可选地,通过在低等真核生物宿主细胞(例如巴斯德毕赤氏酵母)中表达其它半乳糖基转移酶,诸如β1,3GalT或β1,6GalT活性(酶、同源物、变体、衍生物及其催化性活化片段),半乳糖残基被转移至中间寡糖受体底物上,从而形成具体所需的βGal-糖苷键。作为所需β-半乳糖基转移酶活性表达的结果,形成了各种末端半乳糖键(例如,β1,3、β1,4或β1,6)。
GalNAcT在低等真核生物中的表达
已经在人特异性蛋白质上观测到GalNAc加帽的聚糖。在本发明的另一方面,编码GalNAc转移酶(GalNAcT)的基因在低等真核生物宿主细胞中表达,其将GalNAc残基转移至含有末端GlcNAc残基的底物上。在一个实施方案中,编码秀丽隐杆线虫GalNAcT的基因(Genbank AN NP_490872)催化GalNAc残基转移至含有末端GlcNAc残基的底物上,从而延伸宿主细胞中所产生的聚糖的寡糖分支。
增强的半乳糖基转移
如图12所示,hGalTI表达比较显示,β-半乳糖基转移酶的单独表达可能不足以在低等真核生物受体底物上形成βGal-糖苷键。通过加入编码差向异构酶或半乳糖激酶、半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的异源基因和/或编码UGT的基因,可增强半乳糖残基的转移。足量的半乳糖基化糖形(例如,Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2)适宜用作治疗性糖蛋白。因此,本发明的一个特征是通过另外表达转运活性和/或提升内源UDP-半乳糖水平,来增强半乳糖基至聚糖的转移。在一个实施方案中,在宿主细胞中导入差向异构酶活性以增加UDP-半乳糖水平。在另一实施方案中,通过半乳糖激酶或半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性介导增加的UDP-半乳糖水平。因此,本发明提供了通过导入和表达β-半乳糖基转移酶活性组合UDP-Gal转运活性和/或通过借助差向异构酶或半乳糖激酶或半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶提高内源性UDP-半乳糖的水平,来而增强半乳糖转移的方法。
在人样糖蛋白生产中UDP-半乳糖转运蛋白(UGT)在低等真核生物宿主中的克隆和表达
本说明书中,还公开了在低等真核生物细胞(例如巴斯德毕赤氏酵母)中导入和表达编码UDP-半乳糖转运蛋白的基因以用于产生人样半乳糖基化糖蛋白的方法。
粟酒裂殖糖酵母UDP-半乳糖转运蛋白的克隆和表达
可以设计与粟酒裂殖糖酵母UDP-半乳糖转运蛋白基因(GenbankAL022598)同源区互补的基因特异性引物并从除去单内含子的粟酒裂殖糖酵母基因组DNA(ATCC24843)进行PCR扩增。引物RCD164(SEQ ID NO:7)和RCD177(SEQ ID NO:8)用于扩增基因的5′96bp。引物RCD176(SEQ ID NO:9)和RCD165(SEQ ID NO:10)用于扩增3′966bp。引物RCD164(SEQ ID NO:7)和RCD165(SEQ ID NO:10)用于将两个扩增产物重叠成单个PCR片段,所述片段包含一个末端导入有NotI和PacI位点的连续ORF。将PCR产物克隆至pCR2.1TA(Invitrogen)中并测序。将基因产物亚克隆至包含巴斯德毕赤氏酵母GAPDH启动子的质粒pJN335中(实施例2)。
因此,在一个实施方案中,在产生末端GlcNAc残基的宿主(巴斯德毕赤氏酵母RDP-27(例如GlcNAcMan3GlcNAc2))中构建并表达编码粟酒裂殖糖酵母UDP-半乳糖转运蛋白(Genbank AB023425)的质粒pRCD257。
各种UDP-半乳糖转运蛋白的克隆和表达
在优选的实施方案中,在低等真核生物宿主细胞中导入并表达编码黑腹果蝇UDP-半乳糖转运蛋白的基因。从黑腹果蝇cDNA文库(UC BerkeleyDrosophila Genome Project,卵巢λ-ZAP文库GM)PCR扩增黑腹果蝇UGT,然后将其克隆至pCR2.1PCR克隆载体并测序。引物DmUGT-5′(SEQ ID NO:11)和DmUGT-3′(SEQ ID NO:12)用于扩增基因,从而导入NotI和PacI位点。NotI和PacI位点用于在pRCD393NotI/PacI位点处亚克隆该基因,从而使其融合至PpOCH1启动子下游,以产生pSH263(图3B)。实施例2描述了各种其它UDP半乳糖转运蛋白的克隆。
图11显示了UDP-转运蛋白活性关于增强半乳糖转移的比较。作为本发明的最佳模式,从黑腹果蝇中分离的UDP-半乳糖转运蛋白在巴斯德毕赤氏酵母中表达。图11E中显示了与黑腹果蝇UDP-半乳糖转运蛋白(DmUGT)共表达的人GalTI基因融合体的活性。令人惊讶地,表达黑腹果蝇UGT的宿主细胞主要产生半乳糖基化糖形,然而,来自粟酒裂殖糖酵母(图11B)、人I(图11C)和人II(图11D)的UGT显示出低于最优转移。双-半乳糖基化、无岩藻糖化且无唾液酸化的糖形Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的产生有显著增加。均一峰值位于1664m/z[C],对应于聚糖Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量。与其它UDP-半乳糖转运蛋白相比,表达DmUGT的宿主细胞(例如,巴斯德毕赤氏酵母)表现出至少90摩尔%的半乳糖转移。
UDP-半乳糖转运蛋白多肽
本发明另外提供了在低等真核生物宿主细胞(例如,巴斯德毕赤氏酵母)中表达的转运蛋白-转移酶融合体的各种组合。因此,在一个实施方案中,本发明提供了一种低等真核生物宿主,其包含与催化活性的β-半乳糖基转移酶结构域框内融合的UDP-半乳糖转运蛋白。在另一实施方案中,产生人样糖蛋白的宿主细胞包含从粟酒裂殖糖酵母中分离的UDP-半乳糖转运蛋白和与hGalTI催化结构域框内融合的啤酒糖酵母Mnn2(s)靶向肽。
在人样糖蛋白产生中UDP-半乳糖4-差向异构酶在低等真核生物宿主中的表达
在本发明的另一方面,提供了通过表达β1,4-半乳糖基转移酶活性和至少UDP-半乳糖4-差向异构酶活性(酶、同源物、变体、衍生物及其催化活性片段)在低等真核生物(例如巴斯德毕赤氏酵母)中产生人样糖蛋白的方法。差向异构酶是催化UDP-半乳糖和UDP-葡萄糖相互转变的酶。使用本领域众所周知的技术,可以设计与差向异构酶基因(例如ScGAL10、SpGALE、hGALE)同源区互补的基因特异性引物并进行PCR扩增(实施例3)。在一个实施方案中,在低等真核生物宿主细胞(例如巴斯德毕赤氏酵母)中导入并表达编码啤酒糖酵母Gal10活性的基因或编码差向异构酶的重组核酸分子或从编码差向异构酶活性的核酸分子的表达,以产生特征在于含有末端β-半乳糖残基的人样糖蛋白。可选地,通过激活差向异构酶活性,宿主细胞经工程改造以产生水平增高的半乳糖基化糖形。
在复合N-聚糖的产生中表达UDP-半乳糖4-差向异构酶
在一个实施方案中,表达编码差向异构酶活性的基因以将UDP-葡萄糖转变为UDP-半乳糖,从而产生水平增高的UDP-半乳糖用于宿主细胞中的半乳糖基转移。除β-1,4-半乳糖基转移酶活性之外差向异构酶活性的表达增加半乳糖基化N-聚糖的生成。图9B显示了用Mnn2(s)/hGalTI融合体组合pRCD395(编码ScGal10的质粒)转化的、产生复合聚糖的酵母品系(例如,巴斯德毕赤氏酵母YSH-44)。添加ScGal10差向异构酶增加对于半乳糖转移可用的UDP-半乳糖。位于1501m/z[B]的峰值对应于聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2上的一个半乳糖残基转移,而位于1663m/z[C]的峰值对应于聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2上的两个半乳糖残基转移。优选地,关于%总中性聚糖,至少60摩尔%的半乳糖被转移。因此,在一个实施方案中,β-1,4-半乳糖基转移酶活性与差向异构酶活性组合在宿主细胞中表达以产生半乳糖基化糖蛋白(实施例7)。
在杂合N-聚糖的产生中表达UDP-半乳糖4-差向异构酶
在另一实施方案中,导入并表达ScGAL10增加了低等真核生物中半乳糖向杂合糖蛋白的转移(实施例6)。图10A显示了表达Mnn2(m)/hGalTI融合体组合ScGal10差向异构酶的巴斯德毕赤氏酵母品系RDP39-6,从而产生杂合半乳糖基化N-聚糖。N-聚糖分析显示峰值位于1622m/z[K],其对应于聚糖GalGlcNAcMan5GlcNAc2的质量,从而证实了有一个半乳糖残基的转移,以及峰值位于1460m/z[H],其对应于杂合聚糖GlcNAcMan5GlcNAc2的质量。随后的β1,4-半乳糖苷酶消化证实了单半乳糖残基的存在(图10B)。优选地,关于%总中性聚糖,检测到至少70摩尔%的半乳糖转移。
在宿主细胞中还表达了其它差向异构酶以增加半乳糖转移。实施例3描述了构建差向异构酶构建体,而图13显示了各种差向异构酶在产生人样N-聚糖中的活性。图13A中ScGal10连同Mnn2(s)/hGalTI和DmUGT的表达,表现出主要的双-半乳糖基化糖形Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。相似地,SpGalE、Mnn2(s)/hGalTI和DmUGT任一次序的转化导致产生出双-半乳糖基化糖形(图13B和C)。加入hGalE具有相同的作用(图13D)。优选地,差向异构酶选自啤酒糖酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶、粟酒裂殖糖酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶、大肠杆菌UDP-半乳糖4-差向异构酶和智人(H.sapiens)UDP-半乳糖4-差向异构酶。应当预期的是,在宿主细胞中也可以不受限制地选择和表达其它差向异构酶不受限制。
编码SpGALE的核酸序列
本发明还提供了分离的核酸分子,所述核酸分子包括来自粟酒裂殖糖酵母的GALE基因及其变体。该基因(编码酶UDP-半乳糖4-差向异构酶)的全长核酸序列已经被测序和鉴定,如Genbank NC_003423所示。用于扩增来自粟酒裂殖糖酵母基因组DNA的SpGALE的引物揭示了175bp内含子,所述内含子被除去(实施例3)。克隆的基因组序列中包含粟酒裂殖糖酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶编码序列。编码的氨基酸序列同样如SEQ ID NO:13所示。SpGALE基因尤其可用于在宿主细胞中产生用于将半乳糖转移至N-聚糖上的充足UDP-半乳糖库。在低等真核生物中表达SpGALE基因提供N-连接的寡糖合成中增加的且有效的半乳糖转移。
在一个实施方案中,本发明提供了含有核酸序列的分离的核酸分子,所述核酸序列包括或由SEQ ID NO:14所示的SpGALE编码序列、其同源物、变体和衍生物组成。在其它实施方案中,本发明提供了核酸分子,所述核酸分子包含如下序列或由如下序列组成,所述序列是具有与野生型基因至少53%同一性的SpGALE基因的变体。所述核酸序列可优选具有与野生型基因至少70%、75%或80%同一性。甚至更优选地,所述核酸序列可具有与野生型基因85%、90%、95%、98%、99%、99.9%或甚至更高的同一性。
在另一实施方案中,本发明的核酸分子编码具有SEQ ID NO:13氨基酸序列的多肽。还提供了编码多肽序列的核酸分子,所述多肽序列与SEQ ID NO:13至少60%相同。通常,本发明的核酸分子编码与SEQ ID NO:13有至少70%、75%或80%同一性的多肽序列。优选地,所编码的多肽与SEQ ID NO:13为85%、90%或95%相同的,且所述同一性可甚至更优选地为98%、99%、99.9%或甚至更高。
用于产生半乳糖基化糖蛋白的UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖相互转变
中所涉及的差向异构酶保守区
来自粟酒裂殖糖酵母、人、大肠杆菌的差向异构酶与啤酒糖酵母的起始362个氨基酸残基的序列比对,显示出指示存在有若干基序和潜在活性位点的高度保守区(图7)(实施例11)。在一个实施方案中,本发明包括多肽,所述多肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列,其在下述序列上含有潜在的UDP-半乳糖或UDP-葡萄糖结合基序:
9-VLVTGGXGYIGSHT-22(SEQ ID NO:48),
83-VIHFAGLKAVGESXQXPLXYY-103(SEQ ID NO:49),
127-FSSSATVYGX-136(SEQ ID NO:50),
184-LRYFNPXGAHXSGXXGEDPXGIPNNLXPYXXQVAXGRX-221(SEQ ID NO:51),或
224-LXXFGXDYXXXDGTXXRDYIHVXDLAXXHXXAX-256(SEQ IDNO:52)。
在另一优选的实施方案中,第一序列15位上的氨基酸残基选自S和A。
在另一优选的实施方案中,第二序列96位上的氨基酸残基选自T和V。
在另一优选的实施方案中,第二序列98位上的氨基酸残基选自V、K和I。
在另一优选的实施方案中,第二序列101位上的氨基酸残基选自S、D、E和R。
在另一优选的实施方案中,第三序列136位上的氨基酸残基选自D和N。
在另一优选的实施方案中,第四序列190位上的氨基酸残基选自G、T、V和I。
在另一优选的实施方案中,第四序列194位上的氨基酸残基选自P和A。
在另一优选的实施方案中,第四序列197位上的氨基酸残基选自E、C、D和L。
在另一优选的实施方案中,第四序列198位上的氨基酸残基选自L、I和M。
在另一优选的实施方案中,第四序列203位上的氨基酸残基选自L和Q。
在另一优选的实施方案中,第四序列210位上的氨基酸残基选自L和M。
在另一优选的实施方案中,第四序列213位上的氨基酸残基选自I、V和M。
在另一优选的实施方案中,第四序列214位上的氨基酸残基选自A和S。
在另一优选的实施方案中,第四序列218位上的氨基酸残基选自V和I。
在另一优选的实施方案中,第四序列221位上的氨基酸残基选自L和R。
在另一优选的实施方案中,第五序列225位上的氨基酸残基选自N、A和Y。
在另一优选的实施方案中,第五序列226位上的氨基酸残基选自V和I。
在另一优选的实施方案中,第五序列229位上的氨基酸残基选自D和N。
在另一优选的实施方案中,第五序列232位上的氨基酸残基选自P和D。
在另一优选的实施方案中,第五序列233位上的氨基酸残基选自T和S。
在另一优选的实施方案中,第五序列234位上的氨基酸残基选自S、E和R。
在另一优选的实施方案中,第五序列238位上的氨基酸残基选自P和G。
在另一优选的实施方案中,第五序列239位上的氨基酸残基选自I和V。
在另一优选的实施方案中,第五序列246位上的氨基酸残基选自C、V和M。
在另一优选的实施方案中,第五序列250位上的氨基酸残基选自E、K和D。
在另一优选的实施方案中,第五序列251位上的氨基酸残基选自A和G。
在另一优选的实施方案中,第五序列253位上的氨基酸残基选自V和I。
在另一优选的实施方案中,第五序列254位上的氨基酸残基选自A和V。
在另一优选的实施方案中,第五序列256位上的氨基酸残基选自L和M。
分离的多肽
根据本发明的另一方面,提供了本发明核酸分子编码的分离的多肽(包括突变蛋白质、等位基因变体、片段、衍生物和类似物)。在一个实施方案中,分离的多肽包含与SEQ ID NO:13相应的多肽序列。在本发明可选的实施方案中,分离的多肽包含具有与SEQ ID NO:13至少60%同一性的多肽序列。优选地,本发明分离的多肽具有与SEQ ID NO:13至少70%、75%或80%的同一性。更优选地,同一性为85%、90%或95%,但与SEQ ID NO:13的同一性可以是98%、99%、99.9%或甚至更高。
根据本发明的其它实施方案,提供了包含上述多肽序列的片段的分离的多肽。这些片段优选包含至少20个连续的氨基酸,更优选至少25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100或甚至更多个连续的氨基酸。
本发明的多肽还包含上述多肽序列和异源多肽之间的融合体。例如,异源序列可以包括经设计促进重组表达的蛋白纯化和/或显现的异源序列。蛋白融合体的其它非限制性实例包括允许在噬菌体或细胞表面展示编码的蛋白的融合体,与固有荧光蛋白诸如绿色荧光蛋白(GFP)的融合体,以及与IgG Fc区的融合体。
UDP-半乳糖4-差向异构酶/β1,4-半乳糖基转移酶融合多肽
在本发明的其它方面,生成编码包含差向异构酶和半乳糖基转移酶活性的多肽的基因融合体。在一个实施方案中,生成包含UDP-半乳糖4-差向异构酶和β1,4-GalTI的融合多肽并将其导入宿主细胞。在更优选的实施方案中,融合多肽进一步包含前导序列。例如,将编码靶向肽的前导序列文库框内连接至SpGalE/hGalTI融合体。在甚至更优选的实施方案中,融合多肽包含ScMnn2(s)前导序列、SpGalE差向异构酶和hGalTI。将融合多肽插入包含HYG标记的酵母整合质粒。图5中显示了差向异构酶-半乳糖基转移酶整合质粒的一个实例,命名为pRCD461(实施例8)。差向异构酶-半乳糖基转移酶融合转化体产生大约70%半乳糖基化的人样糖蛋白Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(图15B)。
B1,4-半乳糖基转移酶;UDP-半乳糖4-差向异构酶;UDP-半乳糖转运
蛋白多肽
在本发明的另一方面中,生成了编码多肽的单一构建体,所述多肽包含β-半乳糖基转移酶、差向异构酶和UDP-半乳糖转运蛋白活性。在一个实施方案中,构建包含人β1,4GalT、SpGalE和DmUGT(“三元(triple)”)的质粒(实施例9)。在优选的实施方案中,转移酶多肽进一步包含前导序列,例如,框内连接于hGalTI的ScMnn2(s)。将三种多肽全部插入包含KANR标记的酵母整合质粒,所述质粒优选含有自身的启动子和终止子。图4中显示了该“三元”整合质粒的实例,命名为pRCD465。在一个实施方案中,在产生末端GlcNAc残基的宿主细胞中导入并表达包含融合多肽的“三元”整合质粒。用“三元”整合质粒转化巴斯德毕赤氏酵母YSH-44并将其命名为RDP80。
为了评价在品系RDP80中产生的N-聚糖是否为预期的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2种类,在存在CMP-NANA的条件下,将RDP80所分泌的纯化的K3与唾液酸转移酶于体外温育,然后释放所得到的N-聚糖。N-聚糖的MALDI-TOF MS分析显示,主要峰值位于2227m/z[X],其对应于复合物末端唾液酸化的N-聚糖NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量(图14C)。
UDP-Gal的可选择的产生
如前所述,半乳糖残基转移至N-聚糖上需要活化的半乳糖(UDP-Gal)库。在低等真核生物中产生高于内源性水平的所述库的方法之一是表达UDP-半乳糖4差向异构酶。可选的方法包括在不存在UDP-半乳糖4差向异构酶的情况下,表达三个独立的基因:质膜半乳糖通透酶、半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶。在不存在UDP-半乳糖4差向异构酶而存在外源半乳糖来源的情况下,表达LeLoir途径的其它三种基因,将可以升高UDP-半乳糖的内源性水平(Ross等,2004)。此外,在该实施方案中,不存在UDP-半乳糖4差向异构酶将允许UDP-半乳糖水平可通过控制外源半乳糖浓度而得以调节,因为所产生的UDP-半乳糖除加入至底物诸如N-聚糖之外,其并不能被代谢。
半乳糖通透酶是一种质膜己糖转运蛋白,其可从外源性来源中输入半乳糖。在一个实施方案中,使用来自啤酒糖酵母的半乳糖通透酶基因,GAL2(Genbank:M81879),或编码能够输入半乳糖的质膜己糖转运蛋白的任何基因。
半乳糖激酶是一种催化半乳糖代谢第一步骤(即半乳糖至半乳糖-1-磷酸的磷酸化)的酶。在另一实施方案中,使用来自啤酒糖酵母的GAL1基因(Genbank:X76078)。
半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶催化半乳糖代谢的第二步骤,所述步骤是将UDP-葡萄糖和半乳糖-1-磷酸转化为UDP-半乳糖和葡萄糖-1-磷酸。在另一实施方案中,可以使用编码半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性的任何基因,包括啤酒糖酵母GAL7(Genbank:M12348)。
在优选的实施方案中,从能够通过LeLoir途径代谢半乳糖的低等真核生物中缺失UDP-半乳糖4差向异构酶编码基因。
在更优选的实施方案中,在gal(-)并且不能内源性表达LeLoir途径基因的低等真核生物宿主细胞中,表达半乳糖通透酶、半乳糖激酶和半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶的编码基因(Hittinger等,2004)。
该可选实施方案的优势在于UDP-半乳糖4-差向异构酶的不存在允许通过对低于生长抑制浓度水平的外部半乳糖进行调节来特异性控制内部UDP-半乳糖浓度。
在基因改变的酵母细胞中提高半乳糖基化N-聚糖的生成
WO 00200879A3和WO 03056914A1中提供了在酵母和真菌宿主中产生人样N-聚糖的方法,所述文件被引入此处。本领域技术人员能够认识到本文所描述方法的常规修饰组合上述方法可以对目标糖蛋白的产生提供改进的结果。
根据本发明的方法,用至少β-半乳糖基转移酶融合构建体pXB53(实施例4)(图12)转化的巴斯德毕赤氏酵母,在可检测部分产生了复合半乳糖基化聚糖。至少10%的半乳糖残基被转移至宿主细胞中的糖蛋白上。在另一实施方案中,至少40%的半乳糖残基被转移至宿主细胞中的糖蛋白上。差向异构酶的表达同样增加了半乳糖转移的水平(图13)。优选地,至少60%的半乳糖残基被转移至宿主细胞中的糖蛋白上。另一异源糖基化酶诸如UGT的表达进一步增强了所需半乳糖化糖蛋白的细胞生产。令人惊奇地是,一种所述转运蛋白DmUGT的表达非常显著地增加了半乳糖转移(图11)。在实施方案的最佳模式中,用DmUGT转化的宿主细胞显示出至少90%或更高的半乳糖转移。
优选地,将酵母宿主细胞的温度保持在37℃以符合酶的最适温度。
此外,所述方法还包括分离这些糖蛋白。
UDP酶活性的表达
如WO 02/00879中所述,在人中,核苷酸糖前体(例如UDP-N-乙酰葡糖胺、UDP-N-乙酰半乳糖胺、CMP-N-乙酰基神经氨酸、UDP-半乳糖等)通常在胞质中合成并被转运至高尔基体中,在那里它们被糖基转移酶附着至核心寡糖。为了在低等真核生物中复制该过程,必须在高尔基体中表达糖核苷特异性转运蛋白以确保足够水平的核苷糖前体(Sommers,1981;Sommers,1982;Perez,1987)。糖转移至N-聚糖上的副产物是核苷二磷酸或一磷酸。虽然一磷酸可通过对向运输机制与核苷三磷酸糖交换而被直接输出,但是二磷酸核苷(例如,GDP)在被输出之前必须通过磷酸酶(例如,GDP酶)进行切割以产生核苷一磷酸和无机磷酸。该反应对有效糖基化是重要的,因为已发现源自啤酒糖酵母的GDP酶对于甘露糖基化是必需的。但是,该酶对UDP的活性仅为10%(Berninsone,1994)。由于低等真核生物在高尔基中的糖蛋白合成中不使用UDP-糖前体,故低等真核生物一般在高尔基体中不具有UDP特异性二磷酸酶活性。
工程改造的酵母品系包含多个使用UDP-GlcNAc或UDP-半乳糖作为底物的转移酶。这需要在酵母高尔基体中工程改造合适的底物库,所述酵母高尔基体在大多数种类中不含这些底物。但是,使用UDP-GlcNAc或UDP-半乳糖的转移酶反应的终产物包括游离的UDP。该UDP可作为使用这些糖核苷酸的大多数转移酶的潜在抑制剂发挥作用。啤酒糖酵母表达具有核苷二磷酸酶活性的两种高尔基体蛋白质。一种(ScGDA1)对GDP高度特异(Abeijon等,1993)。第二种(ScYND1)是腺苷三磷酸双磷酸酶,并因此能够水解核苷三磷酸和核苷二磷酸,且对ADP/ATP、GDP/GTP和UDP/UTP具有相等的特异性(Gao等,1999)。然而,因为在野生型高尔基体中缺少UDP缀合的糖,且同时缺少产生UDP作为终产物的转移酶,所以,在工程改造的酵母品系中UDP的可能升高的累积是一个值得关心的问题。
因为缺少UDP酶会防碍半乳糖残基从胞质转移至高尔基体,故对于在低等真核生物宿主细胞中有效的半乳糖转移需要基因操作以表达UDP酶。因此,在本发明的另一方面中,提供了表达,优选超表达编码UDP酶基因的方法。应当预期的是编码UDP酶活性的基因的超表达,增加了半乳糖转移至高尔基体中的受体底物上所需的糖核苷酸UDP-半乳糖的可用性。为了在酵母高尔基体中升高UDP酶活性水平,存在若干种可能性。在一个实施方案中,超表达编码UDP酶活性的基因,例如ScGDA1(NP_010872),其具有某些(大约10%)针对UDP的活性。在另一实施方案中,超表达编码核苷二磷酸酶活性的基因,例如ScYND1NP_010920),该酶对UDP的活性比对GDP的活性更高,尽管其对于核苷酸二磷酸并非具有特异性。此外,在另一实施方案中,为了在巴斯德毕赤氏酵母中实现较高UPD酶活性的目标,表达啤酒糖酵母GDA1或YND1或超表达这些基因的巴斯德毕赤氏酵母同源物,这些通过BLAST同源性检索可很容易得以鉴定。
此外,使用这些糖核苷酸的生物能够通过特异针对UDP的核苷酸二磷酸酶作用,将UDP转化为UMP。一个实例是由Wang以及Guidotti鉴定出的人尿苷二磷酸酶(uridine diphosphatase)(UDP酶)(AF016032)。然而,该蛋白质包含两个推定的跨膜结构域,一个位于C-端而一个位于N-端。因此,该蛋白质在酵母高尔基体中的定位,需要将该蛋白质催化结构域与酵母靶向结构域融合。
包括乳克鲁维氏酵母和粟酒裂殖糖酵母的其它酵母在其高尔基体中使用UDP-糖将GlcNAc和半乳糖分别添加至其N-聚糖。乳克鲁维氏酵母和粟酒裂殖糖酵母都表达ScGDA1的同源物,其分别被命名为KlGDA1(Lopez-Avalos等,2001;CAC21576)和Spgda1(D′Alessio等,2003;NP_593447),其同样具有UDP酶活性。在UDP在工程改造的酵母品系中累积且证明对工程改造的转移酶有害的情况下,任一或多种上述这些蛋白质的表达可用于增加UDP酶活性到可接受的水平。
对无唾液酸糖蛋白受体(ASGR)的结合亲和性
本发明的另一方面提供了针对ASGR较低的结合亲和性,ASGR已知能够清除无唾液酸化糖蛋白以及降低循环系统中治疗性蛋白的半衰期。先前的研究已显示,具有双触角结构的聚糖的清除速度低于具有三或四触角结构的聚糖(Stockert,Physiol Rev.1995Jul;75(3):591-609)。在本发明的一个方面中,提供了具有单糖形的目标蛋白上的聚糖(例如,双触角结构),其特征在于含有末端半乳糖残基。所述双触角结构并不易于在哺乳动物细胞中产生,因为其它GnT催化产生三-和四-触角分支的反应。通过用半乳糖残基对含有末端GlcNAc残基的底物加帽,其它GnT(例如,GnT IV、GnT V)就不能再催化GlcNAc转移至半乳糖基化底物上。因此,本发明提供了一种方法,该方法用于产生无唾液酸化糖蛋白,所述无唾液酸化糖蛋白相对于在哺乳动物宿主中产生的那些糖蛋白而言具有针对ASGR的较低结合亲和性。在更优选的实施方案中,无唾液酸化糖蛋白的特征在于相对于在哺乳动物中产生的异源糖蛋白而言,其循环半衰期和体内生物活性增高,
整合位点
优选在基因座中整合编码UGT、差向异构酶和β1,4GalT的核酸,所述基因座负责甘露糖基转移酶,诸如1,3甘露糖基转移酶(例如啤酒糖酵母中的MNN1)(Graham,1991)、1,2甘露糖基转移酶(例如来自啤酒糖酵母的KTR/KRE家族)、1,6甘露糖基转移酶(来自啤酒糖酵母或巴斯德毕赤氏酵母的OCH1)、甘露糖基磷酸转移酶及其调节物(来自啤酒糖酵母的MNN4、PNO1和MNN6)、液泡蛋白酶(vacuolar proteinase)A(PEP4)、液泡蛋白酶B(PRB1)GPI-锚定的天冬氨酸蛋白酶(YPS1),以及涉及异常、免疫原性即非人糖基化反应的其它酶。
基因座破坏的突变导致酶活性降低或酶活性完全消除的存活表型。优选地,编码初始α-1,6甘露糖基转移酶活性的基因座是编码糖基转移酶活性的基因初始整合的最佳靶位。以相似的方式,人们可以选择其它染色体整合位点的范围,所述整合位点基于在该基因座中的基因破坏事件,预期可以:(1)改善细胞在更多人样型式中进行糖基化的能力,(2)改善细胞分泌蛋白质的能力,(3)降低外源蛋白质的蛋白酶解以及(4)改善促进纯化过程或发酵过程本身的方法的其它特性。
在特别优选的实施方案中,将文库DNA整合至宿主染色体非所需基因位点,从而对该基因的破坏或缺失造成影响。例如,整合至OCH1、MNN1或MNN4基因位点,使所需文库DNA能够表达,而抑制酵母中糖蛋白高甘露糖基化(hypermannosylation)所涉及的酶的表达。在其它实施方案中,文库DNA可通过核酸分子、质粒、载体(例如,病毒或逆转录病毒载体)、染色体被导入至宿主,并可作为自主核酸分子或通过同源或随机整合至宿主基因组而导入。在任何情况下,通常需要每一文库DNA构建体都包含至少一个选择标记基因以便于选择稳定转化的宿主生物。尤其适用的是可再循环标记基因,诸如URA5(Yeast.2003Nov;20(15):1279-90),其可被选择或针对其进行选择。
产生额外序列多样性
当转化至宿主的核酸,例如DNA文库包含大量多样性序列,由此增加至少一个转化体表现出所需表型的概率时,本实施方案的方法是最有效的。例如,单氨基酸突变可巨大地改变糖蛋白加工酶的活性(Romero等,2000)。因此,在转化之前,可对DNA文库或细分亚文库实施一种或多种技术以产生额外序列多样性。例如,可以实施一轮或多轮的基因改组(gene shuffling)、易错PCR、体外诱变或产生序列多样性的其它方法,以获得在融合构建体库中序列的高多样性。
密码子最优化
还应当预期,还可以对本发明核酸实施导致一级氨基酸序列一种或多种改变的密码子最优化,例如保守氨基酸取代、添加、缺失或其组合。
表达控制序列
除了上述可读框序列之外,通常优选给每一文库提供含有表达控制序列的构建体,所述表达控制序列诸如启动子、转录终止子、增强子、核糖体结合位点以及确保融合构建体在转化至宿主生物后融合蛋白的有效转录和翻译所需的其它功能性序列。
适宜的载体组分,例如选择标记、表达控制序列(例如,启动子、增强子、终止子等)以及,任选地,宿主细胞自主复制所需序列,可根据所选特定宿主细胞而进行选择。用于特定哺乳动物或低等真核生物宿主细胞的适宜载体组分的选择标准是常规的。本发明优选的低等真核生物宿主细胞包括,巴斯德毕赤氏酵母、Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母(Pichia trehalophila)、Pichiakoclamae、膜醭毕赤氏酵母(Pichia membranaefaciens)、Pichia minuta(Ogataeaminuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichia thermotolerans、柳毕赤氏酵母(Pichia salictaria)、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母(Pichia pijperi)、具柄毕赤氏酵母(Pichia stiptis)、甲醇毕赤氏酵母、毕赤氏酵母属物种(Pichiasp.)、啤酒糖酵母、糖酵母属物种(Saccharomyces sp.)、多形汉逊氏酵母、克鲁维氏酵母属物种(Kluyveromyces sp.)、乳克鲁维氏酵母、白色假丝酵母(Candida albicans)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑色曲霉、米曲霉(Aspergillus oryzae)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、Chrysosporiumlucknowense、镰孢属物种(Fusarium sp.)、禾赤镰孢(Fusarium gramineum)、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙链孢霉。
当宿主是巴斯德毕赤氏酵母时,适宜的启动子包括,例如,AOX1、AOX2、GAPDH、OCH1、SEC4、D2和P40启动子。
选择标记
还优选为每一构建体提供至少一个选择标记,诸如赋予抗药性的基因或补足宿主代谢损伤的基因。标记的存在可用于随后转化体的选择;例如在酵母中,可使用URA5、URA3、HIS4、SUC2、G418、BLA或SH BLE基因。多种选择标记是已知的并适用于酵母、真菌、植物、昆虫、哺乳动物和其它真核生物宿主细胞。
转化
在酵母菌中,可以使用任何方便的DNA转移方法,诸如电穿孔、氯化锂法或原生质球法。在丝状真菌和植物细胞中,方便的方法包括粒子轰击、电穿孔和农杆菌介导的转化。为了制备适于高密度培养(例如,酵母发酵)的稳定品系,需要将融合构建体整合至宿主染色体中。在优选的实施方案中,采用本领域众所周知的技术,通过同源重组进行整合。优选地,通过双交换事件对巴斯德毕赤氏酵母进行稳定的基因修饰。Nett等,Yeast.2003Nov;20(15):1279-90。例如,给异源酶活性提供与宿主生物序列同源的侧翼序列,接着使用单一标记进行转化。以这种方式,整合发生在利用可再循环标记的宿主基因组的确定位点。
筛选和选择方法
用异源酶转化宿主品系后,表现所期望糖基化表型的转化体被选择。选择可采用众多测定或检测方法中的任一种,通过单一步骤或一系列表型富集和/或排除步骤来进行。可以手动或采用自动化高通量筛选设备进行表型表征。通常,宿主微生物在细胞表面(其上定位有各种糖蛋白)展示蛋白质N-聚糖。
例如,人们可以筛选细胞表面有最高浓度末端GlcNAc的那些细胞,或可以筛选能分泌具有最高末端GlcNAc含量的蛋白的那些细胞。所述筛选可以基于可视化方法,如基于染色方法,基于结合特异性末端GlcNAc结合抗体或缀合至标记的凝集素(诸如可购自E.Y.Laboratories Inc.,San Mateo,CA的凝集素)的能力,基于特异性凝集素结合末端甘露糖残基降低的能力,基于体外整合放射性标记的糖的能力,或基于与染料或带电表面结合的改变,或者可通过荧光辅助细胞分选(Fluorescence Assisted Cell Sorting(FACS))设备联合荧光团标记的凝集素或抗体(Guillen,1998)来实现。
因此,可通过将细胞暴露于特异性结合所需N-聚糖的凝集素或抗体,而对完整细胞筛选所需的糖基化表型。多种寡糖特异性凝集素可在商业上获得(例如,购自EY Laboratories,San Mateo,CA)。可选地,针对特异性人或动物N-聚糖的抗体可在商业上获得或可采用标准技术制得。适宜的凝集素或抗体可以缀合至报告分子,诸如生色团、荧光团、放射性同位素或具有产色底物的酶(Guillen等,1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(14):7888-7892))。
接着,可采用分析方法,诸如分光光度法、荧光测定法、荧光激活细胞分类术或闪烁计数实施筛选。在其它情况中,需要分析从转化的细胞中分离的糖蛋白或N-聚糖。可采用本领域已知的技术实施蛋白质分离。在优选的实施方案中,报告蛋白质被分泌至培养基中,然后通过亲和层析(例如Ni-亲和或谷胱甘肽-S-转移酶亲和层析)进行纯化。在优选分离的N-聚糖的情况中,酶诸如内切-b-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Genzyme Co.,Boston,MA;New England Biolabs,Beverly,MA)可用于从糖蛋白切割N-聚糖。然后,可通过液相层析(例如HPLC)、质谱法或其它适宜的方法,分析分离的蛋白质或N-聚糖。美国专利号5,595,900教导了几种可用于鉴定具有所需胞外糖结构的细胞的方法。在优选的实施方案中,MALDI-TOF质谱分析法用于分析切割的N-聚糖。
在选择所需转化体之前,需要排除具有非所需表型的细胞转化群体。例如,当所述方法用于将功能性甘露糖苷酶活性工程改造至细胞中时,所需转化体细胞糖蛋白将有低水平的甘露糖。将转化的群体在培养基中暴露于甘露糖的致死放射性同位素排除了具有非所需表型即高水平掺入的甘露糖的转化体群体(Huffaker TC和Robbins PW.,Proc Natl4cad Sci USA.1983Dec;80(24):7466-70)。可选地,针对非所需N-聚糖的细胞毒性凝集素或抗体,可被用于排除具有非所需表型的转化群体(例如,Stanley P和Siminovitch L.Somatic CellGenet 1977Jul;3(4):391-405)。美国专利号5,595,900教导了几种可用于鉴定具有所需胞外糖结构的细胞的方法。重复实施该策略使得能够实现低等真核生物越来越多复合聚糖的顺序工程改造。
例如,为了检测在其表面上具有高程度人样N-聚糖中间体Gal2GlcNAc2Man3GlcNac2的宿主细胞,人们可以选择这样的转化体,所述转化体在体外细胞测定中允许半乳糖被GalT从UDP-半乳糖最有效的转移。该筛选可通过在选择压力下在琼脂平板上生长含有转化的文库的细胞以及将单个克隆转移至96-孔微量滴定板而进行。细胞生长后,离心细胞,在缓冲液中重悬细胞,并在加入UDP-半乳糖和GalT之后,通过HPLC或UDP酶联测定确定UDP的释放。可选地,人们可以使用放射性标记的UDP-半乳糖和GalT,洗涤细胞,然后观测由β-半乳糖苷酶导致的放射性半乳糖的释放。所有这些均可以手动或通过使用高通量筛选设备自动进行。在第一种测定法中释放更多UDP的转化体,或在第二种测定法中释放更多放射性标记的半乳糖的转化体,预期在其表面上有较高程度的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,且由此构成所需表型。相似的测定法同样适用于观测分泌的蛋白上的N-聚糖。
可选地,人们可以使用任何其它适宜的筛选,例如凝集素结合测定,所述方法能揭示转化的细胞表面上改变的糖基化模式。在该情况中,凝集素与末端甘露糖特异性结合的降低可以作为适宜的选择工具。雪化莲(Galantusnivalis)凝集素特异性结合末端a-1,3甘露糖,如果高尔基体中存在充足的甘露糖苷酶II活性则所述结合预期被降低。人们还可以通过实施层析分离步骤以允许除去具有高末端甘露糖含量的细胞从而富集所需转化体。可采用凝集素柱实施所述分离步骤,所述凝集素柱对具有高末端甘露糖含量的细胞的结合特异性超过对具有低末端甘露糖含量的那些细胞的结合特异性(例如,结合于琼脂糖的雪化莲凝集素,Sigma,St.Louis,MO)。
宿主细胞
虽然本发明采用巴斯德毕赤氏酵母作为宿主生物进行举例说明,但本领域技术人员能够理解的是,其它真核生物宿主细胞,包括其它酵母和真菌宿主物种,可按照本文所述进行改变以用于产生人样糖蛋白。所述宿主优选包括Pichia finlandica、喜海藻糖毕赤氏酵母、Pichia koclamae、膜醭毕赤氏酵母、Pichia minuta(Ogataea minuta、Pichia lindneri)、Pichia opuntiae、Pichiathermotolerans、柳毕赤氏酵母、Pichia guercuum、皮杰普氏毕赤氏酵母、具柄毕赤氏酵母、甲醇毕赤氏酵母、毕赤氏酵母属物种、啤酒糖酵母、糖酵母属物种、多形汉逊氏酵母、克鲁维氏酵母属物种、乳克鲁维氏酵母、白色假丝酵母、构巢曲霉、黑色曲霉、米曲霉、里氏木霉、Chrysosporium lucknowense、镰孢属物种、禾赤镰孢、Fusarium venenatum、Physcomitrella patens和粗糙链孢霉。
本文所描述的用于鉴定和破坏非所需宿主细胞糖基化基因(例如OCH1)的技术,应被理解为可用于其它真核生物宿主细胞,诸如其它酵母和真菌品系中这些基因和/或其它同源性或功能性相关基因(参见WO 02/00879)。此外,其它优选的宿主细胞在Alg3p中有缺陷,其编码Dol-P-Man:Man5GlcNAc2-PP-Dol甘露糖基转移酶活性(参见WO03/056914)。
优选的宿主细胞是酵母和丝状真菌宿主,其固有缺少β1,4-半乳糖键、岩藻糖和末端唾液酸。与哺乳动物糖蛋白的N-聚糖不同,这些糖通常不存在于酵母和丝状真菌所产生的糖蛋白上。本发明提供了工程改造宿主细胞以在糖蛋白上产生半乳糖残基并且在所述糖蛋白上基本缺少岩藻糖和唾液酸残基的方法。在另一实施方案中,产生岩藻糖或唾液酸的那些宿主细胞可经过修饰以具有降低的或消除的岩藻糖基转移酶活性或唾液酸转移酶活性。因此,由本发明宿主所产生的糖蛋白组合物基本上不含岩藻糖和唾液酸残基。本发明显著的优势在于,无须转体内(ex vivo)用岩藻糖苷酶和唾液酸酶处理进行修饰,宿主细胞即可产生半乳糖基化、无岩藻糖和无唾液酸的糖蛋白。
其它优选的宿主细胞包括缺少关于聚糖的甘露糖基磷酸化的真菌宿主(USSN 11/020,808)。而其它优选的宿主细胞包括缺少关于聚糖的β-甘露糖基化的真菌宿主(USSN 60/566,736)。
因此,本发明的另一方面涉及表达糖蛋白的非人真核宿主品系,所述糖蛋白包含修饰的N-聚糖,其与人类细胞所产生的相似。因此,本发明预期且包括在除酵母和真菌细胞之外的物种中实施本发明的方法。应当预期,本发明的组合核酸文库可被用于选择在任何真核宿主细胞系统中修饰糖基化途径的构建体。例如,本发明组合文库还可被用于植物、藻类和昆虫以及包括哺乳动物和人类细胞的其它真核宿主细胞中,以将包括糖基化酶或其催化结构域的蛋白质定位在沿宿主细胞分泌途径的所需位置上。优选地,将糖基化酶或催化结构域等靶向沿宿主细胞分泌途径的亚细胞位置,在那里它们能发挥功能,且优选它们被设计或选择以最有效地发挥功能。
能用根据本发明实施方案的方法改变的糖基化修饰的实例是:(1)工程改造真核宿主细胞,以从Man8GlcNAc2修整甘露糖残基以产生Man5GlcNAc2N-聚糖;(2)工程改造真核宿主细胞,以通过GlcNAc转移酶I的作用在Man5GlcNAc2上添加N-乙酰葡糖胺(GlcNAc);(3)工程改造真核宿主细胞,以功能性表达酶,诸如N-乙酰葡糖胺基转移酶(GnTI、GnTII、GnTIII、GnTIV、GnTV、GnTVI、GnTIX)、甘露糖苷酶II、岩藻糖基转移酶(FT)、半乳糖基转移酶(GalT)或唾液酸转移酶(ST)。
通过重复所述方法,更加复杂的糖基化途径可在靶宿主,诸如低等真核微生物中被工程改造。在一个优选的实施方案中,用包含编码糖基化活性的序列的DNA文库转化宿主生物两次或更多次。可以在每轮转化之后或可选地在已进行若干次转化之后,实施所需表型选择。以这种方式可以对复合糖基化途径进行快速工程改造。
靶糖蛋白
本文所述的方法可用于产生糖蛋白,尤其是治疗性用于人的糖蛋白。例如,具有特定糖形的糖蛋白在治疗性蛋白靶向中尤为有用。例如,甘露糖-6-磷酸已经显示出可指导蛋白质至溶酶体,所述溶酶体是几种溶酶体贮积病相关酶的正确功能所必需的,所述溶酶体贮积病诸如Gaucher氏病、Hunter氏病、Hurler氏病、Scheie氏病、Fabry氏病和Tay-Sachs病,所描述的仅为少数几个。同样,在聚糖侧链上加入一个或多个唾液酸残基,可以增加治疗性糖蛋白施用后的体内半衰期。因此,宿主细胞(例如,低等真核生物或哺乳动物)可经过基因工改造以增加细胞所表达的糖蛋白中末端唾液酸的程度。可选地,在施用前,可以采用唾液酸转移酶和适宜的底物将唾液酸与目标蛋白质体外缀合。除了表达人样糖基化所涉及的酶活性之外,可对生长培养基组成进行改变以产生更接近地类似人形式的糖蛋白(S.Weikert等,Nature Biotechnology,1999,17,1116-1121;Werner,Noe等,1998Arzneimittelforschung 48(8):870-880;Weikert,Papac等,1999;Andersen和Goochee 1994Cur.Opin.Biotechnol.5:546-549;Yang和Butler 2000Biotechnol.Bioengin.68(4):370-380)。对单克隆抗体的特异性聚糖修饰(例如加入二等分GlcNAc)已经显示,可以改善依赖抗体的细胞毒性(UmanaP.等人,1999),该改善是抗体或其它治疗性蛋白质生产所需的。
治疗性蛋白质通常采用注射、经口、经肺或其它方式施用。可根据本发明生产的适宜靶糖蛋白的实例包括,但不限于:促红细胞生成素,细胞因子诸如干扰素-a、干扰素-b、干扰素-g、干扰素-w,和粒细胞-CSF、GM-CSF,凝固因子诸如因子VIII、因子IX,和人C蛋白、抗凝血酶III、凝血酶、可溶性IgE受体a-链、IgG、IgG片段、IgG融合体、IgM、白细胞介素、尿激酶、糜蛋白酶,和脲胰蛋白酶抑制剂、IGF-结合蛋白、表皮生长因子、生长激素释放因子、膜联蛋白V融合蛋白、制管张素、血管内皮生长因子-2、骨髓祖先抑制因子-1(myeloid progenitor inhibitory factor-1)、骨保护素(osteoprotegerin)、a-1-抗胰蛋白酶、甲胎蛋白、DNA酶II、人纤溶酶原kringle 3、葡糖脑苷脂酶、TNF结合蛋白1、促卵泡激素、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-Ig、跨膜激活剂及钙调节剂及亲环蛋白(cyclophilin)配体、可溶性TNF受体Fc融合体、胰高血糖素样蛋白1以及IL-2受体激动剂。
分泌性信号序列
还优选将编码分泌性信号的核酸序列与编码糖蛋白的目标序列相结合。术语“分泌性信号序列”是指编码多肽(“分泌性肽”)的DNA序列,所述多肽作为更大多肽的组分指导该更大多肽通过合成所述多肽的细胞的分泌途径。所述更大多肽在通过分泌途径转运期间通常被切割以除去所述分泌性肽。为了将多肽指导至宿主细胞的分泌途径中,在表达载体中提供分泌性信号序列(也称为前导序列、前原序列(prepro sequence)或前序列)。分泌性信号序列可以是(但不限于)与糖蛋白相关的野生型序列、啤酒糖酵母Suc2信号序列的编码序列、毕赤氏酵母属Pho2信号序列的编码序列、毕赤氏酵母属Prc1信号序列的编码序列、啤酒糖酵母α-交配因子(αMF)信号序列的编码序列、牛溶菌酶C信号序列的编码序列。分泌性信号序列可操作地连接于核酸序列,亦即两个序列以正确读框连接,并进行定位以指导新合成多肽进入宿主细胞的分泌途径。分泌性信号序列通常位于编码目标多肽的DNA序列的5′,尽管某些分泌性信号序列位于目标DNA序列的其它位置(参见例如,Welch等,美国专利号5,037,743;Holland等,美国专利号5,143,830)。
可选地,本发明多肽所包含的分泌性信号序列可用于指导其它多肽进入分泌途径。本发明提供了所述融合多肽。本发明融合多肽中所包含的分泌性信号序列,优选与其它肽的氨基末端融合以指导该其它肽进入分泌途径。所述构建体可用于本领域已知的多种应用中。例如,这些新分泌性信号序列融合构建体可指导正常非分泌蛋白活性组分的分泌,例如受体。所述融合体可在体内或体外使用,以指导肽通过分泌途径。
本发明方法所产生的糖蛋白可通过本领域众所周知的技术进行分离。所需糖蛋白通过诸如分级分离、离子交换、凝胶过滤、疏水性层析以及亲和层析的方法进行纯化和分离。
以下是说明本发明组合物和方法的实施例。这些实施例不应被理解为是限制性的:包含该实施例的目的仅在于举例说明。
实施例1
构建启动子盒和表达载体
使用引物RCD48(SEQ ID NO:15)(5′-TATGCGGCCGCGGCTGATGATATTTGCTACGA-3′)和RCD134(SEQ IDNO:16)(5′-CCTCTCGAGTGGACACAGGAGACTCAGAAACAG-3′),扩增PpOCH1基因800bp的启动子,和使用引物RCD156(SEQ IDNO:17)(5′-CTTCTCGAGGAAGTAAAGTTGGCGAAACTT-3′)和RCD157(SEQID NO:18)(5′-CTTAGCGGCCGCGATTGTTCGTTTGAGTAGTTT-3′),扩增PpSEC4基因400bp的启动子。PCR产物被克隆到pCR2.1克隆载体(Invitrogen)并测序。然后使用导入的XhoI/NotI限制位点,将OCH1和SEC4启动子亚克隆到载体pJN261(Nett等,Yeast.2003Nov;20(15):1279-90)中取代GAPDH启动子,以分别生成质粒pRCD360和pRCD362。
使用引物RCD152(SEQ ID NO:19)(5′-CTTCTCGAGGGCATTCAAAGAAGCCTTGGG-3′)和RCD153(SEQ ID NO:20)(5′-CTTAGCGGCCGCTGAGTGGTCATGTGGGAACTT-3′)PCR扩增PpHIS3启动子,然后克隆到质粒pCR2.1并测序。然后将XhoI/NotI位点用于将PpHIS3启动子亚克隆到质粒pTA18,以用较弱的PpHIS3启动子替换PpPMA1强启动子并生成质粒pRCD351,该质粒是滚动入(roll into)PpHIS3启动子的NATR质粒。
使用引物RCD301(SEQ ID NO:21)(5′-CCTGGATCCAACAGACTACAATGACAGGAG-3′)和RCD302(SEQ IDNO:22)(5′-CCTGCATGCCTCGAGCTTGCCGGCGTCTAAATAGCCGTTGAAG-3′)扩增部分PpHIS3基因,并使用BamHI/SphI限制位点将其插入至pUC19以生成质粒pRCD391。该载体包含PpHIS3基因座的1.2Kb部分以及工程改造导入至引物RCD302(SEQ ID NO:22)内的XhoI和NgoMIV位点。G418R基因作为来自pUG6(Wach等,1994)的BglII/SacI片段插入至pRCD391的BamHI/SacI位点以生成pRCD392。
用引物RCD307(SEQ ID NO:23)(5′-CCTGTCGACGCTGC CGGCAAGCTCGAGTTTAAGCGGTGCTGC-3′)和RCD308(SEQ ID NO:24)(5′-CCTGGATCCTTTGGCAAAAACCAGCCCTGGTGAG-3′)从巴斯德毕赤氏酵母基因组DNA中扩增1.2Kb部分的PpTRP1基因。使用BamHI/SalI位点将扩增的片段插入到pUC19以生成质粒pRCD399。使用BglII/SacI从质粒pAG29(Goldstein和McCusker,1999)释放赋予对膦丝菌素抗性的PAT基因,并将其插入到用BamHI/SacI消化的pRCD399以生成PpTRP1/PAT roll-in质粒pRCD401。
实施例2
克隆半乳糖转运蛋白
粟酒裂殖糖酵母UDP半乳糖转运蛋白
以两个片段从粟酒裂殖糖酵母基因组DNA(ATCC24843)PCR扩增编码UDP半乳糖转运蛋白(SpGMS1+,Genbank AL022598)的被称为SpUGT的粟酒裂殖糖酵母基因,以除去单个内含子。使用引物RCD164(SEQ ID NO:7)(5′-CCTTGCGGCCGCATGGCTG TCAAGGGCGACGATGTCAAA-3′)和RCD177(SEQ IDNO:8)(5′-ATTCGAGAATAGTTAAGTGTCAAAATCAATGCACTATTTT-3′)扩增基因的5′端96bp,且使用引物RCD176(SEQ ID NO:9)(5′-AAAATAGTGCATTGATTTTGACACTTAACTATTCTCGAAT-3′)和RCD165(SEQ ID NO:10)(5′-CCTTTTAATTAATTAATGCTTATGATCAACGTCCTTAGC-3′)扩增3′端966bp。随后,使用引物RCD164(SEQ IDNO:7)和RCD165(SEQ ID NO:10)将两个扩增的产物重叠成单个PCR片段,所述PCR片段包含一个在末端导入了NotI和PacI位点的连续可读框。将该PCR产物克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)中并测序。然后使用NotI和PacI位点将该基因亚克隆至质粒pJN335中,所述质粒包含融合有巴斯德毕赤氏酵母GAPDH启动子下游基因的表达盒。然后使用引物RCD202(SEQ IDNO:25)(5′-TCCTTAATTAAAGAAAGCTAGAGTAAAATAGAT-3′)和RCD203(SEQ ID NO:26)(5′-TCCCTCGAGGATCATGTTGATCAACTGAGACCG-3′)PCR扩增400bp PpOCH1转录终止子,并克隆到pCR2.1中。随后,实施三重连接以作为XhoI/PacI片段将GAPDH启动子/SpUGT基因融合体以及作为PacI/XhoI片段将PpOCH1-TT插入至质粒pTA18的单XhoI位点,以生成质粒pRCD257。新质粒pRCD257,是含NATR的载体,该载体包含GAPDH-SpGALE-OCH1TT融合体及第二个盒,所述第二个盒包含由PpPMAI启动子所驱动、与ScVAN1跨膜结构域相融合的截短型人GnTII基因。
SpUGT基因也被插入到pRCD360(具有OCH1启动子)以及pRCD362(具有SEC4启动子)的NotI/PacI位点以分别生成质粒pRCD385和pRCD387。使用XhoI/NgoMIV将来自pRCD385的POCH1-SpUGT-PpCYC1TT盒和来自pRCD387的PSEC4-SpUGT-PpCYC1TT盒插入到pRCD392HIS3/G418Rroll-in载体,以分别生成巴斯德毕赤氏酵母HIS3/G418Rroll-in表达质粒pRCD393和pRCD394。
黑腹果蝇UDP半乳糖转运蛋白
从黑腹果蝇cDNA文库(UC Berkeley Drosophila Genome Project,卵巢1-ZAP文库GM)PCR扩增编码UDP半乳糖转运蛋白的称为DmUGT的黑腹果蝇基因(Genbank BAB62747),并将其克隆到pCR2.1PCR克隆载体并测序。使用引物DmUGT-5′(SEQ ID NO:11)(5′-GGCTCGAGCGGCCGCCACCATGAATAGCATACACAT-GAACGCCAATACG-3′)和DmUGT-3′(SEQ ID NO:12)(5′-CCCTCGAGTTAAT-TAACTAGACGCGCGGCAGCAGCTTCTCCTCATCG-3′)扩增所述基因,其分别在5′末端和3′末端导入NotI和PacI位点。然后使用NotI和PacI位点将融合于PpOCH1及启动子下游的该基因亚克隆至pRCD393NotI/PacI位点以生成质粒pSH263。
智人UDP半乳糖转运蛋白
从人前列腺cDNA(marathon ready dDNA,Clontech)扩增编码UDP半乳糖转运蛋白1(Genbank#BAA95615)和UDP半乳糖转运蛋白2(Genbank#BAA95614)的智人基因,该基因分别称为hUGT1和hUGT2。使用引物hUGT 1-5′(SEQ ID NO:27)(5′-GGCTCGAGCGGCCGCCACCATG-GCAGCGGTTGGGGCTGGTGGTTC-3′)和hUGT1-3′(SEQ ID NO:28)(5′-CC-CTCGAGTTAATTAATCACTTCACCAGCACTGACTTTGGCAG-3′)扩增hUGT1基因,并使用引物hUGT2-5′(SEQ IDNO:29)(5′-GGCTC-GAGCGGCCGCCACCATGGCAGCGGTTGGGGCTGGTGGTTC-3′)和hUGT2-3′(SEQ ID NO:30)(5′-CCCTCGAGTTAATTAACTAGGAACCCTTCACCTTG-GTGAGCAAC-3′)扩增hUGT2基因。将PCR产物克隆到pCR2.1载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)并测序。随后使用NotI/PacI将hUGT1和hUGT2基因插入到pRCD393的PpOCH1启动子的下游,以分别生成质粒pSH264和pSH262。
实施例3
克隆UDP-半乳糖-4-差向异构酶基因
啤酒糖酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶
使用引物RCD270(SEQ ID NO:31)(5′-TAGCGGCCGCATGACAGCTCAGTTACAAAGTGAAAG-3′)和RCD271(SEQ IDNO:32)(5′-CGTTAATTAATCAGGAAAATCTGTAGACAATCTTGG-3′)从啤酒糖酵母基因组DNA PCR扩增编码UDP-半乳糖4-差向异构酶的啤酒糖酵母基因(ScGAL10)。将得到的PCR产物克隆到pCR2.1并测序。
然后使用NotI/PacI位点将ScGAL10基因分别亚克隆到质粒pRCD393和pRCD394,以生成质粒pRCD395和pRCD396,并且同样将其分别亚克隆到质粒pRCD402和pRCD403,以生成质粒pRCD404和pRCD405。质粒pRCD402和pRCD403是表达载体,它们分别包含巴斯德毕赤氏酵母OCH1和SEC4启动子,以及PpCYC1终止子以及方便的限制位点,所述位点可用于将差向异构酶与这些启动子融合以及可用于生成能整体移动至另一质粒的盒。
智人UDP-半乳糖4-差向异构酶
使用分别带有NotI和PacI位点的引物GD7(SEQ ID NO:33)和GD8(SEQ ID NO:34),从人肾cDNA(marathon ready cDNA,Clontech)PCR扩增编码UDP-半乳糖4-差向异构酶的称为hGALE的智人基因(Thoden等,(2001)JBC Vol.276(18)15131-15136),将其克隆到pCR2.1并测序。然后使用NotI/PacI位点将hGALE基因亚克隆到质粒pRCD406和pRCD407,以分别生成质粒pRCD427和pRCD428。
粟酒裂殖糖酵母UDP-半乳糖4-差向异构酶
使用引物GALE2-L(SEQ ID NO:35)和GALE2-R(SEQ ID NO:36),从粟酒裂殖糖酵母(ATCC24843)基因组DNA扩增SpGALE基因。将扩增的产物克隆到pCR2.1并测序。测序显示在+66位存在内含子(175bp)。
为了除去内含子,设计上游引物GD1(SEQ ID NO:37)(94个碱基)。其具有NotI位点(内含子上游66个碱基),随后是内含子之前的20个碱基。GD2(SEQ ID NO:38)是下游引物而且具有PacI位点。使用引物GD1(SEQ ID NO:37)和GD2(SEQ ID NO:38)从pCR2.1亚克隆扩增SpGALE无内含子基因,并将产物再次克隆到pCR2.1并测序。
实施例4
克隆b-1,4-半乳糖基转移酶基因
智人b-1,4-半乳糖基转移酶I
使用引物RCD 192(SEQ ID NO:1)(5′-GCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCCCAAC-3′)和RCD 186(SEQ ID NO:2)(5′-CTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCACTGT-3′),从人肾cDNA(marathon ready cDNA,Clontech)PCR扩增智人b-1,4-半乳糖基转移酶I基因(hGalTI,GenbankAH003575)。将该PCR产物克隆到pCR2.1载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)并测序。从该克隆实施PCR重叠诱变以实现以下三目的:1)除去可读框内的NotI位点同时保持野生型蛋白序列,2)在紧靠内源跨膜结构域下游处截短蛋白,3)以及在5′和3′末端导入AscI和PacI位点以用于模块克隆。为此,使用引物RCD 198(SEQ ID NO:3)(5′-CTTAGGCGCGCCGGCCGCGACCTGAGCCGCCTGCCC-3′)和RCD201(SEQ ID NO:4)(5′-GGGGCATATCTGCCGCCCATC-3′)扩增基因5′末端直至NotI位点,并使用引物RCD200(SEQ IDNO:5)(5′-GATGGGCGGCAGATATGCCCC-3′)和RCD199(SEQ IDNO:6)(5′-CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3′)扩增3′末端。用引物198和199将产物重叠在起以重新合成具有野生型氨基酸序列的ORF,同时除去了NotI位点。新截短的hGalTIPCR产物被克隆到pCR2.1载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)并测序。然后使用导入的AscI/PacI位点将片段亚克隆到质粒pRCD259(其是PpURA3/HYGRroll-in载体),以生成pRCD260。将WO02/00879中所记载的(引入作为参考)酵母靶向序列跨膜结构域文库连接到位于hGalTI基因上游的NotI/AscI位点,以生成质粒pXB20-pXB67。
智人b-1,4-半乳糖基转移酶II
使用引物RCD292(SEQ ID NO:39)(5′-CTTAGGCGCGCCCAGCACCTGGCCTTCTTCAGC-3′)和RCD293(SEQ ID NO:40)(5′-CTTGTTAATTAATCAGCCCCGAGGGGGCCACGACGG-3′),从人肾cDNA(marathon ready cDNA,Clontech)PCR扩增截短型智人b-1,4-半乳糖基转移酶II基因(hGalTII,Genbank AF038660),将该基因克隆到质粒pCR2.1并测序。使用导入的AscI/PacI位点将该截短克隆(除去了编码N-末端跨膜结构域的基因部分)亚克隆到载体pXB53以替代hGalTI,以生成质粒pRCD378。该质粒包含截短的hGalTII与啤酒糖酵母MNN2基因的跨膜结构域/前导序列编码部分的基因融合体,该质粒由PpGAPDH启动子驱动。
智人b-1,4-半乳糖基转移酶III
使用引物RCD294(SEQ ID NO:41)(5′-CTTAGGCGCGCCCGAAGTCTCAGTGCCCTATTTGGC-3′)和RCD295(SEQ IDNO:42)(5′-CTTGTTAATTAATCAGTGTGAACCTCGGAGGGCTGT-3′),从人肾cDNA(marathon ready cDNA,Clontech)PCR扩增截短型智人b-1,4-半乳糖基转移酶III基因(hGalTIII,Genbank AF038661),将该基因克隆到质粒pCR2.1并测序。使用导入的AscI/PacI位点将该截短的克隆(除去了编码N-末端跨膜结构域的基因部分)亚克隆到载体pXB53以代替hGalTI,以生成质粒pRCD381。现在,该质粒含有由PpGAPDH启动子驱动的截短的hGalTIII与啤酒糖酵母MNN2基因的跨膜结构域/前导序列编码部分的基因融合体。
实施例5
在产生复合N-聚糖的品系中表达hGalTI及SpUGT
将包含人GnTH基因和SpGMS1+基因(SpUGT)的pRCD257质粒导入到品系RDP27中。RDP27是巴斯德毕赤氏酵母的具有och1和alg3缺失的突变株,且该突变株已转化有质粒pSH49和pPB104(所述质粒分别包含小鼠甘露糖苷酶IB和人GnTI活性融合构建体),以及质粒pPB103(所述质粒包含乳克鲁维氏酵母UDP-GlcNAc转运蛋白)和pBK64(所述质粒含有报告蛋白K3)(Choi等2003)。在诺尔丝菌素上选择之后,16个转化体被选择用于测定所表达的报告蛋白K3的糖基化。在两个该转化体中,观察到预期的复合人糖基化结构GlcNAc2Man3GlcNAc2,且将这些品系命名为RDP30-10(图8A)和RDP30-13。将部分hGalTI基因/前导序列融合体质粒文库转化到品系RDP30-10中,并在含有潮霉素的基本培养基上选择转化体。用MALDI-TOF MS分析由所得品系分泌的K3所释放的N-聚糖。在来自两个不同前导序列构建体pXB53和pXB65的转化体的N-聚糖上观察到与添加一个半乳糖相一致质量的分子移动。第一个pXB53由与ScMnn2(s)前导序列融合的hGalTI组成(此处称为ScMnn2(s)/ hGalTI),而另一个则是与ScMnn1(m)前导序列的融合体。通过MALDI-TOF分析来自RDP37(用pXB53转化的RDP30-10)的K3所释放的N-聚糖,揭示约10-20%GlcNAc2Man3GlcNAc2被转化为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2而较少量(1-2%)转化为Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(pXB53,图8B)。对于第二个融合体(pXB65),观察到较小量(3-5%)转化为GalGlcNAc2Man3GlcNAc2,但没有观察到可观测的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
实施例6
在产生杂合N-聚糖的品系中表达hGalTI和ScGAL10
用NotI/PacI将编码UDP-半乳糖4-差向异构酶的ScGAL10基因亚克隆到NATR载体pTA18和pRCD351中以替代hGnTII,这将差向异构酶基因分别插入在强PMAI启动子和较弱PpHIS3启动子前面,以分别生成质粒pRCD331(PPMAI-ScGAL10)和pRCD352(PHIS3-ScGAL10)。将质粒线性化(pRCD331在PpPMA1启动子中带有SacI,而pRCD352在PpHIS3启动子中带有BglII),然后转化至品系PBP-3(美国专利申请号No.20040018590)。品系PBP-3是巴斯德毕赤氏酵母突变株,其缺失och1并已被质粒pSH49和pPB104(分别含有小鼠甘露糖苷酶IB和人GnTI活性融合构建体),以及质粒pPB103(包含乳克鲁维氏酵母UDP-GlcNAc转运蛋白)和质粒pBK64(包含报告蛋白K3)转化(Choi等)。该品系产生位于分泌的蛋白上的结构为GlcNAcMan5GlcNAc2的杂合N-聚糖。将在含有诺尔丝菌素的YPD培养基上选择得到的转化体,通过利用引物RCD285(SEQ ID NO:43)(5′-TACGAGATTCCCAAATATGATTCC-3′)和RCD286(SEQ ID NO:44)(5′-ATAGTGTCTCCATATGGCTTGTTC-3′)的PCR、表达报告蛋白K3和分析释放的N-聚糖进行分析,以确定所述品系维持了杂合GlcNAcMan5GlcNAc2聚糖结构。将用pRCD352(PHIS3-ScGAL10)构建体转化的一个品系命名为RDP38-18。在用SalI(位于PpURA3内)线性化后,用质粒pXB53(包含Mnn2(s)/hGalTI融合构建体和HYGR和PpURA3基因)转化该品系。在含有潮霉素的YPD培养基上选择转化体并通过表达K3和测定N-聚糖的大小进行筛选。与来自RDP38-18的那些聚糖相比(其大多是GlcNAcMan5GlcNAc2),从RDP39-6品系纯化的K3所释放的N-聚糖的大部分(~2/3)(图10A)包含一个额外的己糖(HexGlcNAcMan5GlcNAc2)。此外,额外的己糖残基可以通过随后与可溶性b-1,4-半乳糖苷酶(但不是a-1,3-半乳糖苷酶或a-1,2-甘露糖苷酶)温育而被除去,这表明在该品系中通过hGalTI催化而在GlcNAc末端以特异键(b-1,4)添加单个半乳糖。
实施例7
在产生复合N-聚糖的品系中表达hGalTI和ScGAL10
构建巴斯德毕赤氏酵母品系YSH-44,该品系展示具有GlcNAc2Man3GlcNAc2结构的复合N-聚糖。YSH-44是巴斯德毕赤氏酵母突变株,其缺失och1并用质粒pSH49、pPB104、pKD53和pTC53(分别含有小鼠甘露糖苷酶IB、人GnTI、黑腹果蝇甘露糖苷酶II和人GnTII的活性融合构建体)以及质粒pPB103(含有乳克鲁维氏酵母UDP-GlcNAc转运蛋白)和质粒pBK64(含有报告蛋白K3)转化(Hamilton等,Science.2003Aug 29;301(5637):1244-6)。该品系用含有Mnn2(s)/hGalTI融合构建体的pXB53质粒进行转化,并在含有潮霉素的YPD培养基上选择转化体。采用MALDI-TOF MS通过纯化K3和分析释放的N-聚糖来分析几个转化体。经分析的各转化体产生的大部分N-聚糖具有GlcNAc2Man3GlcNAc2结构,且少数(~5%)与单个己糖添加(YSH-71)一致。然而,虽然该峰值始终与hGalTI的导入相关联,但其完全与b-1,4-半乳糖苷酶不符。随后,若干该品系用BglII线性化后的质粒pRCD395和pRCD396(分别包含POCH1-ScGAL10和PSEC4-ScGAL10的PpHIS3/G418R质粒)进行转化,在G418上选择,并将得到的品系分别命名为YSH-83和YSH-84。从分泌的K3释放的N-聚糖用MALDI-TOF MS进行分析。得到的转化体在含有G418的YPD培养基上选择,并使用MALDI-TOF MS分析来自这些品系的纯化的分泌的K3所释放的N-聚糖。来自这些转化体的大部分N-聚糖具有三种结构,Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2(~0-25%)或GalGlcNAc2Man3GlcNAc2(~40-50%),剩余N-聚糖保持亲本YSH-44品系所展示的GlcNAc2Man3GlcNAc2结构。剩余的N-聚糖的相对量没有变化,其与ScGAL10差向异构酶基因是由PpOCH1启动子(YSH-83)驱动还是由PpSEC4启动子(YSH-84)驱动并不相关。
图9B显示了从YSH-84释放的N-聚糖的MALDI-TOF MS。
实施例8
构建差向异构酶/转移酶融合构建体
使用引物RCD326(SEQ ID NO:45)(5′-CTTGGCGCGCCATGACTGGTGTTCATGAAGGGACT-3′)和RCD329(SEQ ID NO:46)5′-CCTGGATCCCTTATATGTCTTGGTATGGGTCAG-3′)扩增SpGALE基因,将其克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)并测序。使用引物RCD328(SEQ IDNO:47)(5′-CTTGGATCCGGTGGTGGCCGCGACCTGAGC-CGCCTGCCC-3′)和RCD199(SEQ ID NO:48)(5′-CTTCTTAATTAACTAGCTCGGTGTCCCGATGTCCAC-3′)扩增消除了前43个氨基酸的hGalTI基因截短部分(hGalTIΔ43),将其克隆到pCR2.1载体(Invitrogen)并测序。然后用AscI/BamHI消化SpGALE克隆,用BamHI/PacI消化hGalTI克隆,并将两者插入到用AscI/PacI消化的pRCD452中。质粒pRCD452包含G418抗性标记和含有ScMNN2(s)/hGalTI融合体的GAPDH/CYC1盒。AscI/BamHI SpGALE和BamHI/PacI hGalTIΔ43片段被连接到置换AscI/PacI释放的hGalTI以生成pRCD461。该新质粒pRCD461包含ScMNN2(s)/SpGALE/hGalTI融合体,其中SpGalE和hGalTI蛋白编码在单一多肽中,其中所述多肽由含有BamHI位点的四氨基酸(GSGG)接头分离并由PpGAPDH启动子驱动。
实施例9
在产生复合N-聚糖的品系中表达半乳糖基转移酶、差向异构酶和转运蛋白
用与HYGR标记邻近的XhoI线性化含有活性hGalTI-53基因融合体的质粒pXB53以及含有hGalTII-53融合体的pRCD378,并用T4DNA聚合酶(New England Biolabs,Beverly,MA)将其平端化。使用与URA3基因邻近的HindIII线性化含有hGalTIII-53基因融合体的质粒pRCD381,并用T4聚合酶使其平端化。然后使用XhoI/SphI分别从质粒pRCD404、pRCD406和pRCD427消化三个差向异构酶基因ScGAL10、SpGALE和hGALE,用T4DNA聚合酶使其平端化,并插入到三个线性化的转移酶质粒中。这产生了九个新的二元转移酶/差向异构酶HYGR质粒:含有hGalTI-53和ScGAL10的pRCD424、含有hGalTI-53和SpGALE的pRCD425、含有hGalTI-53和hGALE的pRCD438、含有hGalTII-53和ScGAL10的pRCD439、含有hGalTII-53和SpGALE的pRCD440、含有hGalTII-53和hGALE的pRCD441、含有hGalTIII-53和ScGAL10的pRCD442、含有hGalTIII-53和SpGALE的pRCD443以及含有hGalTIII-53和hGALE的pRCD447。随后,用这些二元HYGR质粒(用XbaI线性化的)和分别包含SpUGT、hUGT2、DmUGT和hUGT1UDP-Gal转运蛋白编码基因的G418R质粒pRCD393、pSH262、pSH263和pSH264(用AgeI线性化的)顺次转化品系YSH44。由此,生成了一系列品系,其中各品系包含转移酶、差向异构酶和转运蛋白的不同组合。首先,在包含hGalTI-53和SpGALE的品系中比较不同的UDP-Gal转运蛋白。导入DmUGT基因基本产生所有具有两个末端半乳糖残基的复合聚糖(Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2),而其它三个转运蛋白基因产生的复合聚糖特征实际上与仅使用转移酶和差向异构酶所获得的特征相同(图11A-11E)。其次,通过将pSH263导入到含pRCD424、pRCD425或pRCD438的品系而在含有hGalTI-53融合体和活性DmUGT基因的品系中比较差向异构酶基因。Gal基因与三个差向异构酶基因每一个的组合,在分泌的K3上产生Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2复合N-聚糖方面是等同的。最后,通过将pRCD425、pRCD440和pRCD443导入到转化有pSH263的品系而在含有DmUGT和SpGALE的品系中比较三个人转移酶融合构建体hGalTI-53、hGalTII-53和hGalTIII-53。此处,因为在含有hGalTI-53的品系中约10%复合N-聚糖仅具有单个半乳糖(GalGlcNAc2Man3GlcNAc2),而含有hGalTI-53的品系中全部可以观察到的复合N-聚糖均为双-半乳糖基化的Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,故此hGalTII-53转移Gal的效率轻微较低(图12A-12B)。此外,由于60-70%的复合N-聚糖包含0-1个半乳糖残基(GlcNAc2Man3GlcNAc2或GalGlcNAc2Man3GlcNAc2),而仅30-40%是Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2,故此hGalTIII-53的效率显著低于hGalTI-53或hGalTII-53(图12A-12C)。
实施例10
使用单个质粒构建体表达半乳糖基转移酶、差向异构酶和转运蛋白
通过用SacI消化将包含POCHI-DmUGT的G418R质粒pSH263线性化,然后用T4DNA聚合酶(□□□□□□□□□□□□New England Biolabs)平端化。用XhoI/SphI消化质粒pRCD405得到PSEC4-SpGALE基因,并用T4DNA聚合酶平端化。然后将平端化的SpGALE插入到pSH263的平端化SacI位点以生成质粒pRCD446,该质粒是二元转运蛋白/差向异构酶G418R质粒。然后用EcoRI将pRCD446线性化并用T4DNA聚合酶平端化。使用BglII/BamHI从pXB53释放PGAPDHScMNN2(s)/hGalTI融合构建体并用T4DNA聚合酶使其平端化。然后将平端化的ScMNN2(s)/hGalTI插入到pRCD446的平端化EcoRI位点,以生成质粒pRCD465,该质粒是包含ScMNN2(s)/hGalTI、SpGALE和DmUGT的三元G418R质粒。用pRCD465转化的巴斯德毕赤氏酵母YSH-44被命名为RDP80。N-聚糖特征显示位于1663m/z的单峰值,其对应于Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2[C]的质量(图14A)。
用AflII线性化包含hGalTI-53和SpGALE的HYGR质粒pRCD425并用T4DNA聚合酶将其平端化。使用NotI/PacI从pSH263释放DmUGT基因,然后将其插入到用NOtI/PacI消化的质粒pRCD405以生成质粒pRCD468,该质粒包含可作为单个盒释放的PSEC4-DnUGT-CYC1-TT融合体。用XhoI/SalI消化pRCD468以释放DmUGT盒,然后用T4DNA聚合酶平端化。将平端化的DmUGT插入到pRCD425的平端化的AflII位点以生成质粒pRCD466,该质粒是hGalTI-53、SpGALE和DmUGT的HYGR三元质粒。
用AflII线性化包含hGalTI-53和hGALE的HYGR质粒pRCD438并用T4DNA聚合酶将其平端化。用XhoI/SalI消化pRCD468以释放DmUGT盒,并用T4DNA聚合酶将其平端化。将平端化的DmUGT插入到pRCD438的平端化的AflII位点以生成质粒pRCD467,该质粒是hGalTI-53、hGALE和DmUGT的HYGR三元质粒。
体外b-半乳糖苷酶消化
将来自巴斯德毕赤氏酵母品系RDP80的N-聚糖(2μg)与3mUβ1,4半乳糖苷酶(QA bio,San Mateo,CA)在50mMNH4HCO3,pH6.0于37℃下温育16-20小时。图14B中的N-聚糖分析表明主要峰值位于1430m/z[A],该峰值对应于N-聚糖GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量,从而证实图14A中的半乳糖转移。
体外唾液酸转移酶反应
将从品系RDP80纯化得到的K3(200g)与50mg CMP-唾液酸和15mU大鼠重组体a□(2,6)-(N)-唾液酸转移酶(Calbiochem)在50mM NH4HCO3,pH6.0于37℃下温育16-20小时。然后通过PNG酶(PNGase)F消化释放N-聚糖,并在MALDI-TOF MS上检测。当与来自RDP80的那些聚糖(图14A)比较时,聚糖谱显示在唾液酸转移酶处理后质量增加(图14C)。如图14C所示的谱显示出主要峰值位于2227m/z[X],该峰值对应于N-聚糖NANA2Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2的质量,从而进一步证实品系RDP80产生的N-聚糖是人型Gal2GlcNAc2Man3GlcNAc2。
实施例11
差向异构酶序列比对
使用CLUSTAL实施差向异构酶的序列比对。使用序列表核苷酸序列和/或氨基酸序列在GenBank、SwissProt、BLOCKS和Pima II数据库中查询序列。搜索这些数据库(其中包含先前鉴定的和注释的序列),使用BLAST(BasicLocal Alignment Search Tool)寻找同源性的区域。(参见例如,Altschul,S.F.(1993)J.Mol.Evol 36:290-300;和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215:403-410)。BLAST生成核苷酸序列和氨基酸序列比对以测定序列相似性。当处理一级序列模式和二级结构缺口罚分时,已可以使用其它算法。(参见例如,Smith,T.等(1992)Protein Engineering 5:35-51)。
实施例12
材料
MOPS、二甲胂酸钠、二氯化锰、UDP-半乳糖和CMP-N-乙酰神经氨酸购自Sigma。TFA购自Aldrich。来自牛乳的b1,4-半乳糖基转移酶购自Calbiochem。蛋白N-糖苷酶F、甘露糖苷酶和寡糖购自Glyko(San Rafael,CA)。DEAE ToyoPearl树脂购自TosoHaas。金属螯合的“HisBind”树脂购自Novagen(Madison,WI)。96-孔裂解物清除(lysate-clearing)平板购自Promega(Madison,WI)。蛋白结合96-孔平板购自Millipore(Bedford,MA)。盐和缓冲试剂购自Sigma(St.Louis,MO)。MALDI基质购自Aldrich(Milwaukee,WI)。
摇瓶培养
从包含目标品系的YPD平板(<2周)挑取单菌落,并接种到50ml“Falcon”离心管中的10ml BMGY培养基中。使培养物在24℃下生长至饱和(约48小时)。将种子培养物转移到包含150ml BMGY培养基的500ml带挡板的容量瓶中,并于24℃生长至OD600为5±2(约18小时)。细胞的生长速率作为OD600的自然对数对时间的图的斜率来确定。通过于3000g离心10分钟从生长培养基(BMGY)收获细胞,用BMMY洗涤,然后悬浮于250ml带挡板的容量瓶中的15ml BMMY中。24小时后,通过离心收获表达培养基瓶(3000g 10分钟),并对上清液分析K3的产生。
生物反应器培养
在含有150ml BMGY培养基的500ml带挡板的容量瓶中接种1ml种子培养物(参见瓶培养)。使接种物于24℃生长至OD600为4-6(大约18小时)。然后离心来自接种物培养物的细胞并将其重悬于50ml发酵培养基中(每升培养基:CaSO4.2H3O 0.30g,K2SO46.00g,MgSO4.7H2O 5.00g,甘油40.0g,PTM盐2.0ml,生物素4×10-3g,H3PO4(85%)30ml,PTM1盐每升:CuSO4.H2O 6.00,NaI 0.08g,MnSO4.7H2O 3.00g,NaMoO4.2H2O 0.20g,H3BO30.02g,CoCl2.6H2O0.50g,ZnCl220.0g,FeSO4.7H2O 65.0g,生物素0.20g,H2SO4(98%)5.00ml)。
在3升中凹底(1.5升初始进料体积)Applikon生物反应器中实施发酵。发酵罐在温度24℃补料分批模式(fed-batch mode)下进行,且采用30%氢氧化铵将pH控制在4.5±0.1。通过调整搅拌速度(450-900rpm)和纯氧供应,将溶解氧保持在相对于1大气压(atm)的空气中饱和度的40%以上。将空气流速保持在1vvm。当批次相中初始甘油(40g/l)被耗尽时(这可由DO的增加得以指示),以12ml/l/h的给料速度添加包含12ml/l PTM盐的50%甘油溶液,直至达到所需生物量(biomass)浓度。在半小时饥饿相(starvation phase)之后,开始甲醇给料(含有12ml/l PTM的100%甲醇)。用甲醇给料速度将发酵罐中的甲醇浓度控制在0.2和0.5%之间。采用位于发酵罐的出口气(offgass)的TGS气体传感器(购自Figaro Engineering Inc.的TGS822)在线测量甲醇浓度。每隔八小时对发酵罐取样并分析生物量(OD600,细胞湿重和细胞计数)、残余碳源水平(采用Aminex 87H通过HPLC分析甘油和甲醇)和细胞外蛋白含量(通过SDS page,和Bio-Rad蛋白质测定法)。
报告蛋白表达、纯化和N-连接的聚糖的释放
如先前所报道的,将K3结构域(处于醇氧化酶1(AOXI)启动子控制下)被用作模型蛋白,并使用6x组氨酸标记进行纯化(Choi等,Proc Natl Acad SciU S A.2003Apr 29;100(9):5022-7)。通过改进先前报道的方法从糖蛋白释放和分离聚糖(Papac和Briggs 1998)。在还原和羧甲基化蛋白,并封闭膜之后,用水洗涤孔三次。通过加入含有1毫单位N-聚糖酶(Glyko)的30ml 10mM NH4HCO3pH 8.3,使蛋白去糖基化。于37℃16小时后,通过离心取出包含聚糖的溶液,并蒸发至干燥。
蛋白纯化
在Beckman BioMek 2000样品处理机器人(Beckman/Coulter RanchCucamonga,CA)上以96-孔格式纯化Kringle 3。使用C-末端六组氨酸标记从表达培养基中纯化Kringle 3。机器人纯化是对Novagen所提供的规程的HisBind树脂的改进。简言之,将150uL(μL)固定体积的树脂注入96-孔裂解物结合平板的孔中,用3体积的水洗涤,用5体积的50mM NiSO4加载,然后用3体积的结合缓冲液(5mM咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCl pH7.9)洗涤。蛋白表达培养基以培养基/PBS(60mM PO4,16mMKCl,822mM NaCl pH7.4)3∶2稀释,并加载到柱上。引流后,用10体积的结合缓冲液和6体积的洗涤缓冲液(30mM咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCl pH7.9)洗涤柱,并用6体积的洗脱缓冲液(1M咪唑,0.5M NaCl,20mM Tris-HCl pH7.9)洗脱蛋白。通过冷冻干燥将洗脱的糖蛋白蒸发至干燥。
N-连接的聚糖的释放
通过改进先前报道的方法从糖蛋白释放和分离聚糖(Papac等,A.J.S.(1998)Glycobiology 8,445-454)。将96-孔MultiScreen IP(Immobilon-P膜)板(Millipore)的孔用100uL甲醇弄湿,用3×150uL水和50uL RCM缓冲液(8M脲,360mM Tris,3.2mM EDTA pH8.6)洗涤,在各次添加之后采用温和真空进行引流。干燥的蛋白样品在30uL RCM缓冲液中溶解,并转移至含有10uL RCM缓冲液的孔中。对孔进行引流,并用RCM缓冲液洗涤两次。通过加入60uL溶于RCM缓冲液中的0.1M DTT于37℃还原蛋白质1小时。用300uL水洗涤孔三次,然后通过加入60uL 0.1M碘乙酸于室温下于黑暗中羧甲基化30分钟。用水再洗涤孔三次,并通过加入100uL溶于水中的1%PVP360于室温封闭膜1小时。对孔进行引流,然后用300uL水洗涤三次,并通过加入包含一毫单位N-聚糖酶(Glyko)的30uL 10mM NH4HCO3pH 8.3使之去糖基化。于37℃16小时后,通过离心取出包含聚糖的溶液,并蒸发至干燥。
其它:根据Laemmli(Laemmli1970)通过SDS/PAGE分离蛋白。
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱分析法
采用Voyager DE PRO线性MALDI-TOF(Applied Biosciences)质谱仪利用延迟的提取(Delayed Extraction)来测定聚糖的分子量。来自各孔的干燥聚糖在15uL水中溶解,将0.5uL点样于不锈钢样品平板上,并与0.5uL S-DHB基质(溶于1∶1水/乙腈0.1%TFA中的9mg/mL二羟基苯甲酸,1mg/mL 5-甲氧基水杨酸)混合,并使之干燥。
通过使用4ns脉冲时间的脉冲氮激光器(337nm)照射产生离子。采用延迟的提取模式(125ns延迟,且加速电压为20kV)操作所述仪器。栅压(gridvoltage)为93.00%,导线电压(guide wire voltage)为0.10%,内压(internal pressure)小于5×10-7托,低质量闸门(low mass gate)为875Da。由总共100-200次激光脉冲生成谱,并用2GHz数字转换器获取所述谱。Man5GlcNAc2寡糖用作外部分子量标准。采用所述仪器以正离子模式生成全部谱。谱的估计质量精确度为0.5%。
序列表正文
Claims (10)
1.一种产生人样糖蛋白的重组低等真核生物宿主细胞,所述糖蛋白的特征在于含有末端β-半乳糖残基并基本上在糖蛋白上缺少岩藻糖和唾液酸残基。
2.一种产生人样糖蛋白的重组低等真核生物宿主细胞,所述宿主包含编码β-半乳糖基转移酶活性的分离的核酸分子和至少编码UDP-半乳糖转运活性、UDP-半乳糖C4差向异构酶活性或半乳糖激酶活性或半乳糖-1-磷酸尿苷酰转移酶活性的分离的核酸分子。
3.一种产生人样糖蛋白的重组低等真核生物宿主细胞,所述宿主细胞能够将β-半乳糖残基转移至糖蛋白的N-连接的寡糖分支上,所述糖蛋白包含末端GlcNAc残基,所述N-连接的寡糖分支选自三甘露糖核心上的GlcNAcβ1,2-Manα1,3、GlcNAcβ1,4-Manα1,3、GlcNAcβ1,2-Manα1,6、GlcNAcβ1,4-Manα1,6和GlcNAcβ1,6-Manα1,6。
4.如权利要求1中所产生的重组低等真核生物宿主细胞,其中所述宿主细胞产生作为唾液酸的受体底物的糖蛋白。
5.一种包含人样糖蛋白的组合物,所述糖蛋白的特征在于含有末端β-半乳糖残基,并基本上在糖蛋白上缺少岩藻糖和唾液酸残基。
6.一种在低等真核生物宿主细胞中产生人样糖蛋白的方法,所述方法包括产生高于内源水平的UDP-半乳糖的步骤。
7.如权利要求6所述的方法所制备的宿主细胞。
8.一种在低等真核生物宿主细胞中产生人样糖蛋白的方法,所述方法包括将半乳糖残基在不存在岩藻糖和唾液酸残基时转移至杂合或复合糖蛋白上的步骤。
9.如权利要求8所产生的糖蛋白组合物。
10.如权利要求8所产生的糖蛋白组合物,其中所述糖蛋白组合物是唾液酸的受体底物。
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