JP2013505237A - ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリンの安定な共製剤およびそれらの使用方法 - Google Patents

ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリンの安定な共製剤およびそれらの使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、液体の形で室温で少なくとも６月、冷蔵庫内温度で１〜２年の保存安定性を有する免疫グロブリンとヒアルロニダーゼの安定な共製剤を提供する。そのような共製剤は、ＩＧで治療可能な疾患または病状の皮下投与による治療方法に用いることができる。

Description

関連出願
「ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリンの安定な共製剤（CO−FORMULATION）およびそれらの使用方法」と題された２００９年９月１７日の米国仮出願第６１／２７７，０４５号の優先権の利益を主張する。
本出願は、同日になされた米国出願第１２／８０７，９９１号に対応する、「ヒアルロニダーゼおよび免疫グロブリンの安定な共製剤、およびそれらの用途」と題された出願にも関連しており、該出願も米国仮出願第６１／２７７，０４５号の優先権の利益を主張する。
可能な限り、上述の各出願は、ここに完全に参照として組み込まれる。
本発明は、液体の形態で少なくとも６月間、室温において保存でき、冷蔵庫内温度において１−２年安定した保存がなされる、免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼの安定な共製剤を提供する。
そのような共製剤は、皮下投与により、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療を目的として用いられうる。
ヒト血漿由来の免疫グロブリン(ＩＧ)製剤は、免疫疾患の治療のために１９５２年に初めて生産された。当初は、筋肉内または皮下投与により、ＩＧは投与されていた。様々な疾患の有効な治療のため、より大きな用量のＩＧの注射が必要となる場合のために、より低濃度のＩＧ(５０ｍｇ／ｍＬ）の静脈内注射製剤が開発された。免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）の静脈内（IV）投与は、免疫不全の個体の一次治療法である。初期のＩＶＩＧ製剤は深刻な副作用を生じたが、現在利用手可能なＩＶＩＧ製剤は、免疫不全の患者の大部分に十分耐容される。それにも関わらず、一部分の患者は、頭痛、疲労および筋肉痛のような不快な、重症でさえある反応を生じた。特に患者が併発感染を有する場合に、発熱、悪寒が問題として残る。そのような反応は、他のＩＶＩＧ製剤の投与、またはアセトアミノフェン、ジフェンヒドラミン、およびコルチコステロイドコルチコステロイドを予め投与しておいても生じた。さらに、IV投与の必要性から、患者のコンプライアンスに問題があった。
免疫グロブリンの皮下（SQ）投与が、代わりの投与方法となった。IV注入に比べると、免疫グロブリンのSQ投与は、いくつかの利点があった。例えば、全身作用の発生率を減少し、ある場合には困難なIV投与の必要性をなくし、副作用の度合いを改善し、および患者の独立性を与える。
ＩＧ製剤の治療におけるいかなる使用においても、ＩＧ生産物（products）の保存安定性は、重要な考慮要素となる。タンパク質含有製剤の安全な取り扱いおよび投与においては、医薬製剤者に相当な困難がある。タンパク質は、安定性に関して単独の物理的および化学的性質を有し；タンパク質は様々な分解経路があるため、物理的および化学的な不安定性を示唆する。化学的不安定性には、脱アミノ化、凝集、ペプチド骨格のクリッピング（clipping）、およびメチオニン残基の酸化がある。物理的不安定性には、様々な現象があり、例えば、凝集がある。それゆえ、安定な免疫グロブリン製剤の調製が必要とされる。
本発明は、ＩＧによる治療が可能な疾患および状態の治療のための、安定な皮下投与可能な、液体共製剤の組成物、方法およびキットを提供する。本発明は、皮下投与のために製剤される、免疫グロブリン(ＩＧ）を少なくとも１０％ｗ／ｖ、可溶性ヒアルロニダーゼを少なくとも５０Ｕ／ｍＬを少なくとも１００単位／グラム(Ｕ／g)ＩＧ、およびＮａＣｌを少なくとも５０ｍＭで含み、ｐＨが、４〜５である、安定な、液体共製剤の組成物を提供する。該共製剤は、２８℃−３２℃において少なくとも６ヶ月安定である。
さらに、アミノ酸安定化剤を含んでいてもよく、例えば、アラニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グリシンまたはプロリンがある。ある例としては、アミノ酸を少なくとも１００ｍＭ含む。他の例としては、アミノ酸はグリシンであり、ちょうど、または少なくとも１００ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、３５０ｍＭ、４００ｍＭ、４５０ｍＭ、５００ｍＭまたはそれ以上含む。他の例としては、グリシンは、２５０ｍＭである。
本発明において、安定な液体共製剤は、ＩＧは少なくとも１０％ないし２２％、例えば１０％ｗ／ｖ、１１％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ、１３％ｗ／ｖ、１４％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、１６％ｗ／ｖ、１７％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、１９％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ、２１％ｗ／ｖ、２２％ｗ／ｖまたはそれ以上である。ある例としては、ＩＧは１０％ｗ／ｖまたは２０％ｗ／ｖである。共製剤に含まれるＩＧは、ヒト血漿由来であり、例えば、ヒト血漿から精製され、例えばアルコール分画（アルコール分画法）により行われる。ある例としては、ＩＧは、さらに1またはそれ以上の化学修飾による精製法としては、ｐＨ４.０において、ペプシンとともにまたはなしでインキュベートする、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、酵素開裂、溶媒／界面活性剤処理、ダイアフィルトレーションまたは限外濾過がある。本発明において共製剤は、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを含有するＩＧを用いる。
ある例としては、ＩＧは９５％以上のＩｇＧを含む。
さらに、共製剤は、ＮａＣｌを含んでいてもよい。ある例としては、ＮａＣｌは、５０ｍＭないし２２０ｍＭの濃度で存在し、例えば、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１１０ｍＭ、１２０ｍＭ、１３０ｍＭ、１４０ｍＭ、１５０ｍＭ、１６０ｍＭ、１７０ｍＭ、１８０ｍＭ、１９０ｍＭ、２００ｍＭ、２１０ｍＭ、２２０ｍＭまたはそれ以上の濃度である。一つの例としては、ＮａＣｌは、１５０ｍＭの濃度である。
本発明の共製剤は、可溶性ヒアルロニダーゼはＰＨ２０、またはそれらの切断形形態であってもよい。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは、ヒツジ、ウシまたは切断形ヒトＰＨ２０由来であってもよい。ある例としては、ＰＨ２０が切断形ヒトＰＨ２０である場合、切断形ヒトＰＨ２０は、アミノ酸配列番号：４−９のいずれのアミノ酸配列を有していてもよくまたは、対立変異体、またはそれらの他の変異体であってもよい。一つの例としては、可溶性ヒアルロニダーゼは、ｒＨｕＰＨ２０であってもよい。
さらに、可溶性ヒアルロニダーゼは、５０Ｕ／ｍＬないし５００Ｕ／ｍＬ、例えば、５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬまたはそれ以上であってもよい。例えば、可溶性ヒアルロニダーゼは、１００Ｕ／ｍＬまたは３００Ｕ／ｍＬの濃度であってもよい。本発明の共製剤は、可溶性ヒアルロニダーゼが、１００Ｕ／g ＩＧないし５０００Ｕ／g ＩＧ、例えば、１００Ｕ／g ＩＧ、１５０Ｕ／g ＩＧ、２００Ｕ／g ＩＧ、２５０Ｕ／g ＩＧ、３００Ｕ／g ＩＧ、４００Ｕ／g ＩＧ、５００Ｕ／g ＩＧ、６００Ｕ／g ＩＧ、７００Ｕ／g ＩＧ、８００Ｕ／g ＩＧ、９００Ｕ／g ＩＧ、１０００Ｕ／g ＩＧ、１２００Ｕ／g ＩＧ、１５００Ｕ／g ＩＧ、１８００Ｕ／g ＩＧ、２０００Ｕ／g ＩＧ、３０００Ｕ／g ＩＧ、４０００Ｕ／g ＩＧ、５０００Ｕ／g ＩＧまたはそれ以上であってもよい。ある例としては、可溶性ヒアルロニダーゼは、５００Ｕ／g ＩＧ、１０００Ｕ／g ＩＧ、１５００Ｕ／g ＩＧまたは３０００Ｕ／g ＩＧであってもよい。共製剤のｐＨは、濃縮製剤で４.４ないし４.９であってもよい。
本発明の共製剤は、複数回投与または単回投与のために製剤化されうる。さらに、例えば共製剤が単回投与である場合、ＩＧは、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療に必要な用量である。ＩＧは、毎日、毎週、隔週、２−３週間ごと、３−４週間ごと、または毎月、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療のために投与してもよい。共製剤の投与における、ＩＧ投与量は、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療のために、単回投与された場合の投与量と静脈内投与された場合と実質的に同一である。ある例としては、共製剤におけるＩＧの用量は、約１グラム（g）ないし２００g、例えば、１グラム（g）、２g、３g、４g、５g、１０g、２０g、３０g、４０g、５０g、６０g、７０g、８０g、９０g、１００ gまたは２００ gである。さらに、組成物におけるヒアルロニダーゼの用量は、約５００単位ないし１００，０００単位、例えば、 ５００単位、１０００単位、２０００単位、５０００単位、１０，０００単位、３０，０００単位、４０，０００単位、５０，０００単位、６０，０００単位、７０，０００単位、８０，０００単位、９０，０００単位、１００，０００単位またはそれ以上であってもよい。
本発明における液体共製剤、２８℃−３２℃において少なくとも６月ないし１年、例えば、６月、７月、８月、９月、１０月、１１月、１２月またはそれ以上であってもよい。さらに液体共製剤は、０℃−１０℃で少なくとも６月ないし２年、例えば、６月、１年、２年またはそれ以上安定である。
また本発明において、安定な液体共製剤を含有するキットおよび、任意に仕様の説明を提供する。
本発明は、安定な液体共製剤を含有する容器を提供する。容器は、チューブ、ボトル、バイアルまたはシリンジでありうる。容器がシリンジである場合、容器は更に注射のための針を含む。それゆえ、容器は、単回投与または複数回投与のための安定な液体共製剤を含む。
本発明は、可溶性ヒアルロニダーゼおよびＩＧを含有する安定な液体共製剤を皮下投与することによる、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療の方法を提供する。共製剤は、ＩＧの投与量は、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療のために静脈内投与される用量と実質的に同一である。
さらに、本発明は、原発性免疫不全疾患、続発性免疫不全全疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および急性感染症から選ばれる、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療の治療のための方法を提供する。
ある例としては、共製剤は、一次免疫不全疾患の治療のために、本発明の方法を用いて投与される。一次免疫不全疾患は、分類不能型免疫不全疾患(CVID）、選択的ＩｇＡ欠損症（selective ＩｇＡ deficiency）、ＩｇＧサブクラス欠損症（ＩｇＧ subclass deficiency）、特異的抗体欠乏症、補体疾患、先天性無ガンマグロブリン血症、毛細血管拡張性運動失調症、高ＩｇＭ症、ウイスコット−アルドリッチ（Wiskott−Aldrich）症候群、重症複合免疫不全(SCID）、原発性低ガンマグロブリン血症，抗体欠乏症による先天性免疫不全疾患、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA）または乳児低ガンマグロブリン血症である。
他の実施例としては、ＩＧで治療可能な疾患または病状は、血液悪性疾患による後天性免疫不全疾患である。該血液悪性疾患は、慢性リンパ性白血病(CLL）、多発性骨髄腫(MM）および非ホジキンリンパ腫(NHL）から選ばれる。
ＩＧで治療可能な疾患または病状の例は、炎症性疾患または自己免疫疾患であり、該炎症性疾患または自己免疫疾患は、川崎病、慢性炎症性脱髄性神経障害、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体性筋炎、ランバート−イートン（Lambert−Eaton）筋無力症候群、多病巣性運動神経疾患、重症筋無力症およびメルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltman）症候群から選ばれる。
ある例としては、共製剤は、細菌、ウイルスまたは真菌感染の治療に用いられ、例えば、B型インフルエンザ菌；AおよびB型緑膿菌；黄色ブドウ球菌；B群連鎖球菌；１、３、４、６、７、８、９、１２、１４、１８、１９および２３型肺炎連鎖球菌；２型および５型アデノウイルス；サイトメガロウイルス；エプスタイン−バー（Epstein−Barr）ウイルス VCA；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；１型単純ヘルペスウイルス；２型単純ヘルペスウイルス；Ａ型インフルエンザウイルス；麻疹ウイルス；１、２および３型パラインフルエンザウイルス；ポリオウイルス；水痘帯状疱疹ウイルス；アスペルギルス；およびカンジダアルビカンスがある。
さらに、ＩＧで治療可能な疾患または病状は、医原性免疫疾患；急性播種性脳脊髄炎；ANCA−陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡；エバンス症候群(自己免疫性溶血性貧血による免疫性血小板減少症を含む）；胎児母体同種免疫性血小板減少症／新生児同種免疫性血小板減少症（FMAIT／NAIT）；血球貪食症候群； 高リスク 同種造血幹細胞移植；ＩｇＭ パラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；オプソクローヌスミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑症；中毒性表皮壊死症／スティーブンジョンソン症候群(TEN／SJS）；毒素性ショック症候群；アルツハイマー病；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；Ｂ細胞腫瘍；無抗体性傍腫瘍性小脳変性症；および骨髄移植から選ばれる。
概略
A. 定義
B. 免疫グロブリン(ＩＧ）およびヒアルロニダーゼの安定な共製剤
１. 免疫グロブリン治療
２. 免疫グロブリン（ＩＧ）およびヒアルロニダーゼ製剤の皮下投与
３. 安定な共製剤
C. 免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの製造
１. 製造および精製
a. コーン−オンクレー（Cohn−Oncley）法
b. 修正コーン−オンクレー（Cohn−Oncley）工程
c. ウイルス・プロセシング
d. タンパク質濃度
e. ＩＧ製剤の例
i. １０％ ＩＧ
ii. 高濃度ＩＧ製剤(例えば２０％ ＩＧ）
２. 保存安定性
a. タンパク質安定化賦形剤
b. ｐＨ
D. ヒアルロニダーゼ
１. ＰＨ２０
２. 可溶性ヒアルロニダーゼ
a. 可溶性ヒトＰＨ２０
b. 可溶性遺伝子組換ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０）
３. グリコシル化
４. 薬力学的特性の改善のためのヒアルロニダーゼの修飾
E. 可溶性ヒアルロニダーゼおよびそれらのポリペプチドをコードする核酸の製造方法
１. ベクターおよび細胞
２. 発現
a. 原核細胞
b. イースト細胞
c. 昆虫細胞
d. 哺乳動物細胞
e. 植物
３. 精製技術
F. 免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドの精製、製剤および投与
１. 製剤および用量
a. 免疫グロブリン
b. ヒアルロニダーゼ
c. 塩化ナトリウム
d. アミノ酸安定化剤
e. 他の薬剤
２. 剤形
３. 投与
G. 活性、安定性、バイオアベイラビリティおよび薬力学的評価の方法
１. 分子の大きさ
２. 生物活性
a. 免疫グロブリン
b. ヒアルロニダーゼ
１. 薬力学および耐性
H. 処置および治療用途における方法
１. 一次および二次免疫
a. 一次免疫不全
b. 二次免疫不全
２. 炎症性疾患および自己免疫疾患
a. 川崎病
b. 慢性炎症性脱髄性神経障害
c. ギランバレー症候群
d. 特発性血小板減少性紫斑病
e. 炎症性筋障害
i. 皮膚筋炎
ii. 多発性筋炎
iii. 封入体性筋炎
f. ランバート−イートン（Lambert−Eaton）筋無力症候群
g. 多病巣性運動神経疾患
h. 重症筋無力症
i. メルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群
３. 急性感染症
４. 他の疾患および病状
I. 製品およびキット
J. 実施例
A. 定義
他に定義しない限り、本明細書中において用いられるすべての技術および化学用語は、本発明の属する分野の熟練者が通常理解する意味と同一の意味を有する。
他に示さない限り、本明細書において言及する、すべての特許、特許出願、公開特許出願および公報、ジーンバンク配列（Genbank）、データベース、ウェブサイトおよび他の刊行物は、本明細書の一部を構成する。本明細書中の用語に複数の定義がある場合には、この章にあるものが有効である。URLまたは他の識別子またはアドレスが引用されている場合には、そのような識別子は変更可能であり、そのような特定の情報がインターネットにおいて存在しうるが、等価な情報がインターネットを検索することによって見出される。引用は、そのような情報を入手でき公衆に頒布されている根拠となる。
本明細書中、「免疫グロブリン」、「免疫グロブリン」、「ガンマグロブリン」血漿タンパク製剤は、成人ドナーの血漿プールに由来することを意味する。ＩｇＧ抗体が主要であり；他の抗体サブクラス、例えばＩｇＡおよびＩｇＭが存在する。治療用免疫グロブリンは、循環するレシピエントの血清濃度を増加させることにより、受動免疫を形成しうる。ＩｇＧ抗体は、例えば、結合して、細菌毒素を中和し；病原体をオプソニン化し；補体を活性化し；病原性サイトカインおよび食細胞を、サイトカインおよびそれらの受容体、例えばCD５、インターロイキン−１a(IL−１a）、インターロイキン ６(IL−６）、腫瘍壊死因子α(TNF−α）、およびT細胞受容体との相互作用を通じて抑制する。治療用免疫グロブリンは、自己抗体の活性化を阻害しうる。以下に限られないが、免疫グロブリン製剤には、静脈注射(静注)用免疫グロブリン（ＩＧIV）、免疫グロブリンIV、治療用免疫グロブリンがある。免疫グロブリン製剤は、よく知られており、例えば、バイガム（BayGam(登録商標)）、ガムイミューン（Gamimune）(登録商標)N、ガンマルド（Gammagard）(登録商標))S／D、ガンマ（Gammar）(登録商標)−P、イビーガム（Iveegam）(登録商標)EN、パングロブリン（Panglobulin）(登録商標)、ポリガム（Polygam）(登録商標)S／D、サンドグロブリン（Sandoglobulin）(登録商標)、ベノグロブリン（Venoglobulin）(登録商標)−Ｉ、ベノグロブリン(登録商標)−S、ウィンロー（WinRho）(登録商標)SDF等の商品名のものがある。免疫グロブリン製剤は、ヒト血漿に由来するか、または遺伝子組換により製造される。
本明細書中、「静脈注射用ＩｇＧ」または「ＩＶＩＧ」治療は、一般に、病状、例えば、免疫不全、炎症性疾患、および自己免疫疾患の対象の治療のために、ＩｇＧ免疫グロブリンの組成物を静脈内に投与する治療方法を言う。ＩｇＧ免疫グロブリンは、典型的には血漿からプールされ、製造される。完全抗体（Whole antibodies）または断片が用いられる。本明細書中、ＩＧ治療可能な疾患または病状は、免疫グロブリン製剤が用いられるいかなる疾患または病状であってもよい。そのような疾患および病状は、以下に限られないが、循環する抗体が増加することが回復につながるいかなる疾患であってもよく、例えば、免疫疾患；血液悪性疾患による後天性低ガンマグロブリン血症；川崎病；慢性炎症性脱髄性神経障害(CIDP）；ギランバレー症候群；特発性血小板減少性紫斑病；炎症性筋障害；ランバート−イートン（Lambert−Eaton）筋無力症候群；多病巣性運動神経疾患；重症筋無力症；メルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群；二次低ガンマグロブリン血症(医原性免疫疾患を含む）；選択的抗体欠損症；急性播種性脳脊髄炎；ANCA−陽性全身性壊死性血管炎； 自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡； エバンス症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む）；胎児母体同種免疫性血小板減少症／新生児同種免疫性血小板減少症（FMAIT／NAIT）；血球貪食症候群； 高リスク 同種造血幹細胞移植；ＩｇＭパラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植； 多発性硬化症；オプソクローヌスミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑症；中毒性表皮壊死症／スティーブンジョンソン症候群(TEN／SJS）；毒素性ショック症候群； アルツハイマー病；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；Ｂ細胞腫瘍；トラウマ；および細菌、ウイルスまたは真菌感染がある。
本明細書中、室温とは、一般に１８℃または約１８℃ないし３２℃または約３２℃の範囲を言う。当該分野の熟練者は、地域および条件によって異なることを理解しているであろう。例えば、室温はイタリアまたはテキサスのような温暖な気候においては、高い。
本明細書中、ここに言及する共製剤についての「安定な」または「安定性」とは、タンパク（ＩＧおよびヒアルロニダーゼ）が、３２℃以下で少なくとも６月間、本質的に物理的および化学的に安定で完全性があることを言う。本明細書において、「室温で安定」とは、典型的な室温がより高い地域ではその温度での安定性を言う（イタリアまたはテキサスにおいては２８〜３２℃）。製剤は、冷蔵庫内および室内温度、すなわち、０〜３２℃、または３２℃以下で、少なくとも６月間安定である。共製剤中、ＩＧおよびヒアルロニダーゼは、３２℃または約３２℃における場合を含み、少なくとも６月間、室温において安定であった。それぞれの安定性を評価するアッセイは、当業者によく知られており、本明細書中に記載する。
本明細書中、ＩＧの安定性とは、ＩＧが実質的に凝集、変性または断片化しないことを言い、少なくとも９０％のＩＧがモノマーまたはオリゴ−／ダイマーで存在し、ＩＧの分子量が７０または約７０ｋＤａより大きく＜４５０または約４５０ｋＤａより小さいことを言う。それゆえ、製剤中、約１０％より少ない、例えば、約５％より少ない、約４％より少ない、約３％より少ない、約２％より少ない、約１％より少ない量のＩＧタンパクは、凝集していてもよい（すなわち、分子の大きさは４５０ｋＤａと同一かそれより大きい）。同様に、共製剤中、５％ないし７％よりも多くない、例えば、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％または０.５％またはそれ以下のＩＧは断片化しうる（すなわち、分子の大きさは７０ｋＤａより小さい）。
本明細書中、ヒアルロニダーゼの安定性は、原ヒアルロニダーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。ヒアルロニダーゼ活性の評価のアッセイは、当該分野の熟練者に知られており、本明細書に記載されている。
本明細書中、「保存」は、いったん調製された製剤が即時に投与されるのではなく、特定の条件下で使用前に一定期間保存した後に投与される（例えば、特定の温度で；液体または凍結乾燥形で）。例えば、液体製剤は、何日間、何週間、何月間または何年間にわたり保存でき、一般には少なくとも６月、対象に投与する前に様々な温度、例えば冷蔵庫（０℃ないし１０℃）または室温（例えば３２℃までの温度）で保存できる。
本明細書中、投与レジュメとは、投与する免疫グロブリンの用量および投与頻度を意味する。投与レジュメは、治療する疾患または病状に依存し、それゆえ様々である。
本明細書中、「静脈注射用ＩＧ(ＩＶＩＧ）と実質的に同一の投与レジュメ」とは、用量および／または頻度が、特定の疾患または病状の治療に有効な範囲内であり、典型的には、１０％または約１０％ＩＶの用量または頻度である。特定の疾患または病状の治療に有効なＩＶＩＧの用量は、当該分野における熟練者が経験的に決定できる。例えば、以下の例に示すとおり、３００ｍｇ／ｋｇ(すなわち、成人で体重７０ kgを想定した場合２１グラム）ないし６００ｍｇ／ｋｇ(すなわち、４２グラム）が、典型的な先天性免疫不全疾患の患者に投与する毎月のＩＶＩＧ用量である。それゆえ、ＩＧは、ヒアルロニダーゼと組み合わせた場合、先天性免疫不全疾患に投与するには３００または約３００ｍｇ／ｋｇ〜６００ｍｇ／ｋｇとなる。
本明細書中、投与の頻度は、免疫グロブリンの用量の継続的な投与の投与間隔を言う。例えば、頻度は、１、２、３、４週間であり得、治療される特定の疾患または病状に依存する。一般に、頻度は少なくとも２または３週間であり、典型的には、１ヶ月を超えない。
本明細書中、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素を言う。ヒアルロニダーゼには、細菌 ヒアルロニダーゼ(EC ４.２.９９.１）、ヒル由来のヒアルロニダーゼ、他の寄生虫、および甲殻類(EC ３.２.１.３６）、およびヒト型ヒアルロニダーゼ(EC ３.２.１.３５）がある。またヒアルロニダーゼは、非ヒト由来であってもよく、ネズミ、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、細菌、およびヒル科、他の寄生虫、および甲殻類がある。非ヒトヒアルロニダーゼには、ウシ(アミノ酸配列番号：１０および１１）、スズメバチ(アミノ酸配列番号：１２および１３）、ミツバチ(配列番号：１４）、米国産スズメバチ(配列番号：１５）、アシナガバチ(配列番号：１６）、マウス(アミノ酸配列番号：１７−１９、３２）、ブタ(アミノ酸配列番号：２０−２１）、ラット(アミノ酸配列番号：２２−２４、３１）、ウサギ(配列番号：２５）、ヒツジ(アミノ酸配列番号：２６ および ２７）、オランウータン(配列番号：２８）、カニクイザル(配列番号：２９）、モルモット(配列番号：３０）、黄色ブドウ球菌(配列番号：３３）、化膿連鎖球菌(配列番号：３４）、およびウェルシュ菌(配列番号：３５）由来のヒアルロニダーゼがある。またヒアルロニダーゼは、ヒト由来のものを含む。ヒトヒアルロニダーゼの例は、HYAL１(配列番号：３６）、HYAL２(配列番号：３７）、HYAL３(配列番号：３８）、HYAL４(配列番号：３９）、およびＰＨ２０(配列番号：１）がある。またヒアルロニダーゼには、ヒツジおよびウシＰＨ２０由来の可溶性ヒアルロニダーゼ、可溶性ヒトＰＨ２０および可溶性ｒＨｕＰＨ２０がある。
ヒアルロニダーゼは、前駆体ヒアルロニダーゼポリペプチドおよび成熟ヒアルロニダーゼポリペプチド（例えばシグナル配列が除去されているもの）、活性を有するそれらの切断形形態、および対立変異体および種変異体，スプライス変種でコードされる変異体および他の変異体を含み、アミノ酸配列番号：１および１０〜３９またはそれらの成熟形態と少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、 ６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の相同性の配列を有するものがある。また例えば、ヒアルロニダーゼは、アミノ酸配列番号：５０〜５１に記載のヒトＰＨ２０前駆体ポリペプチドを含む。またヒアルロニダーゼは、化学的または翻訳後修飾されたもの、および化学的または翻訳後修飾をされていないものも含む。そのような修飾は、以下に限られないが、ＰＥＧ化、アルブミン化、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシ化、ホスホリル化、および当該分野において知られた他のペプチド修飾がある。
本明細書中、可溶性ヒアルロニダーゼは、物理的条件下における溶解性によって特徴付けられるポリペプチドを言う。一般に、可溶性ヒアルロニダーゼは、グリコホスファチジルアンカー(GPI）のすべてまたは一部を有しない、または十分なアンカーとならない。それゆえ、細胞からの発現においては、可溶性ヒアルロニダーゼは、培地から分泌される。可溶性ヒアルロニダーゼは、例えば、３７℃のTriton X−１１４の水相に分配することにより見分けられる(Bordier et al.，(１９８１)J. Biol. Chem.、２５６：１６０４−７）。膜にアンカーされた、例えば、脂質がアンカーしたヒアルロニダーゼは、界面活性剤リッチな相に分配されるが、ホスホリパーゼ−Cで処置した場合には、界面活性剤プアまたは水相に分配される。可溶性ヒアルロニダーゼには、ヒアルロニダーゼの膜へのアンカリングに関連する領域が、切除または修飾され、可溶化形態がヒアルロニダーゼ活性を維持しているものが含まれる。可溶性ヒアルロニダーゼは、遺伝子組換可溶性ヒアルロニダーゼおよび天然由来のものに含まれるか精製され、例えば、ヒツジまたはウシの精巣抽出物がある。そのような可溶性ヒアルロニダーゼは、可溶性ヒトＰＨ２０がある。他の可溶性ヒアルロニダーゼにはヒツジ(配列番号：２７)およびウシ(配列番号：１１)ＰＨ２０がある。
本明細書中、可溶性ヒトＰＨ２０またはｓＨｕＰＨ２０は、発現の際には可溶性ポリペプチドであり、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI）C−末端結合部位のすべてまたは一部が欠如した成熟ポリペプチドが含まれる。ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドの実施例は、アミノ酸配列番号：４〜９および４７〜４８のいずれかに示されたアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドを含む。ｓＨｕＰＨ２０ポリペプチドの前駆ポリペプチドの例は、シグナル配列を含む。前駆体の例は、アミノ酸配列番号：３および４０〜４６に示され、それぞれ３５ アミノ酸シグナル配列をアミノ酸１〜３５位において有する。また可溶性ＨｕＰＨ２０ポリペプチドは、本明細書中に記載された製造および精製中に分解されたものが含まれる。
本明細書中、可溶性遺伝子組換ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０）はチャイニーズハムスター卵巣(CHO）細胞において遺伝子組換技術により発現されたヒトＰＨ２０の可溶化形態を言う。
可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、シグナル配列を含み配列番号：４９に示された核酸によりコードされる。また、それらの対立変異体および他の可溶性変異体であるDNA分子が含まれる。核酸は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０をコードする核酸は、CHOさいぼうにおいて発現され、成熟ポリペプチドとして分泌される。培地において製造されるが、C−末端においては不均一であるため、アミノ酸配列番号：４−９の様々な割合の1またはそれ以上を含む混合種の製品が含まれる。対応する対立変異体および他の変異体が含まれ、それにはアミノ酸配列番号：５０−５１で示される前駆ヒトＰＨ２０ポリペプチドに対応するものが含まれる。他の変異体は、ヒアルロニダーゼ活性を有するアミノ酸配列番号：４−９および４７−４８のいずれかと６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列相同性を有し、可溶性である。
本明細書中、活性はポリペプチドまたは全長（完全）タンパクに関連するその断片の機能活性を言う。機能活性は以下に限られないが、生物活性、触媒または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に結合するポリペプチドと結合または競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、およびポリペプチドの受容体またはリガンドに特異的に結合する能力を言う。
本明細書中、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼのヒアルロン酸を開裂する能力を言う。ヒアルロニダーゼのヒアルロニダーゼ活性を決定するインビトロアッセイは、例えば可溶性ｒＨｕＰＨ２０が当該分野において知られており、本明細書中に記載される。試験アッセイは、微小濁度アッセイを含み、以下に述べる（実施例３を参照）、ヒアルロン酸のヒアルロニダーゼによる開裂を測定する。非開裂ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合することにより形成される、不溶性沈殿を検出することにより間接的に測定される。
本明細書中、用語「限外濾過（UF）」は、静水圧が半透膜に対して作用する様々な膜ろ過法がある。高分子量の遊離固形分および溶質が維持されるのに対し、水および低分子量の溶質は、膜を通過する。この分離プロセスは、しばしば精製に用いられ、高分子溶液（１０３〜１０６Da）、特にタンパク溶液の濃縮に用いられる。保持する分子サイズに応じて多くの限外濾過膜が利用可能である。限外濾過は、典型的には膜のポアサイズ１〜１０００ｋＤａ、操作圧０.０１〜１０bar(バール)であることを特徴とし、糖および塩のような低分子からコロイド様タンパク質を分離するのに特に有用である。
本明細書において用語「ディアフィルトレーション(ダイアフィルトレーション)」は、限外濾過と同じ膜を用いて行われ、接線流(タンジェンシャルフロー)濾過である。ディアフィルトレーション中、濾液を単位操作から除去しながら、緩衝液をリサイクルタンク内に導入する。生成物が残存物中にある（例えば、ＩｇＧ）プロセスにおいて、ディアフィルトレーションは成分を生成物プールから濾液中に洗い流し、緩衝液を交換し、次いで望ましくない種の濃度を減少させる。
本明細書において用語「混合(する)」は、あらゆる形の撹拌により溶液または懸濁液中に2つ以上の異なる化合物または物質を均等に分散させる働きを表す。溶液または懸濁液中の全ての成分の完全に均等な分散は、該用語を本明細書において用いる限り「混合」の結果として必要ではない。
本明細書において用語「溶媒」は、1またはそれ以上の他の物質を溶解または分散することができるあらゆる液体物質を含む。溶媒は事実上無機(例えば水)であるか、または以下の有機液でありうる：エタノール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、ヘキサン、石油エーテルなど。用語「溶媒界面活性剤処理」中で用いている溶媒は有機溶媒（例えば、トリ−N−ブチルホスフェート）であり、これは溶液中の脂質エンベロープ型ウイルスを不活化するのに用いる溶媒界面活性剤の部分である。
本明細書で用いている用語「界面活性剤(detergent)」は、用語「surfactant」または「surface acting agent」と互換性に用いる。界面活性剤は、典型的には両親媒性、すなわち、界面活性剤を有機溶媒と水の両方に可溶性にする疎水性基(「尾部」)と親水性基(「頭部」)の両方を含む有機化合物である。界面活性剤は、その頭部に正式に荷電した基が存在することにより分類することができる。非イオン性界面活性剤は、その頭部に荷電基を持たないが、イオン性界面活性剤はその頭部に正味の荷電を有する。両イオン界面活性剤は2つの反対に荷電した基を有する頭部を含む。一般的界面活性剤の例には以下のものが含まれる：
陰イオン性（硫酸、スルホン酸、またはカルボン酸陰イオンに基づく)：パーフルオロオクタノエート(PFOAまたはPFO）、パーフルオロオクタンスルホネート（PFOS）、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、ラウリル硫酸ナトリウム、および他のアルキル硫酸塩、ラウレス硫酸ナトリウム（ラウリルエーテル硫酸ナトリウム、またはSLESとしても知られる）、アルキルベンゼンスルホン酸；陽イオン性（第4アンモニウム陽イオンに基づく）：セチルトリメチルアンモニウムブロミド（CTAB)a.k.a. ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、および他のアルキルトリメチルアンモニウム塩、セチルピリジニウムクロリド（CPC）、ポリエトキシル化獣脂アミン（POEA）、塩化ベンザルコニウム（BAC）、塩化ベンゼトニウム（BZT）；両イオン（両性）：ドデシルベタイン；コカミドプロピルベタイン；ココアムホグリシネート；非イオン性：アルキルポリ（エチレンオキシド）、アルキルフェノールポリ（エチレンオキシド）、ポリ（エチレンオキシド）とポリ（プロピレンオキシド）のコポリマー（PoloxamersまたはPoloxaminesとして市販されている）、アルキルポリグルコシド(オクチルグルコシドを含む)，デシルマルトシド、脂肪アルコール（例えばセチルアルコールまたはオレイルアルコールl）、コカミドMEA、コカミドDEA、ポリソルベート(Tween２０、Tween８０など）、Triton界面活性剤、およびドデシルジメチルアミンオキシド。
本明細書において天然α−アミノ酸の残基は、ヒトの同族mRNAコドンによる荷電tRNA分子の特異的認識によりタンパク質内に組み込まれる天然の２０種のα−アミノ酸残基を表す。
本明細書において核酸は、DNA、RNA、およびその類似体(ペプチド核酸(PNA)を含む)、およびその混合物を含む。核酸は、一本鎖または二本鎖でありうる。プローブまたはプライマー(所望により例えば検出可能な標識、例えば蛍光または放射性標識で標識されている)に言及する場合は、一本鎖分子が予期される。そのような分子は、典型的にはその標的が、ライブラリーをプロービングまたはプライミングするために統計的にユニークであるか、または低コピー数(典型的には5未満、一般的には3未満)であるような長さである。一般的には、プローブまたはプライマーは、目的とする遺伝と相補的または同一な配列の少なくとも１４、１６、または３０連続ヌクレオチドを含む。プローブおよびプライマーは長さ１０、２０、３０、５０、１００個またはそれ以上の核酸でありうる。
本明細書においてペプチドは、長さ２〜４０アミノ酸のポリペプチドを表す。
本明細書において、本発明が提供するアミノ酸の種々の配列中のアミノ酸は、その既知の3文字または1文字略号で示される(表1)。種々の核酸断片中のヌクレオチドは当該分野で通常用いられる標準的1文字表記で示される。
本明細書において「アミノ酸」は、アミノ基とカルボン酸基を含む有機化合物である。ポリペプチドは2つ以上のアミノ酸を含む。本発明の目的において、アミノ酸には、20種の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、およびアミノ酸類似体(すなわち、α−炭素が側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。
本明細書において「アミノ酸残基」は、ポリペプチドがそのペプチド結合で化学的に消化(加水分解)されると形成されるアミノ酸を表す。本明細書に記載のアミノ酸残基は、「L」異性体であると推定される。「D」異性体形の残基(そのように示される)は、該ポリペプチドが望む機能的特性を保持するかぎりあらゆるＬ−アミノ酸残基に置換することができる。NH２は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基を表す。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離カルボキシ基を表す。J. Biol. Chem.、２４３：３５５７−３５５９（１９６８）および３７ C.F.R. §§ １.８２１−１.８２２に記載の標準的ポリペプチド標記に基づくアミノ酸残基の略号を表1に示す。
表１ 対応表
Figure 2013505237
本明細書で式によって示される全てのアミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端の通常の方向で左から右方向であることに注意すべきである。さらに、用語「アミノ酸残基」は、対応表（表１）に記載のアミノ酸、および例えば３７ C.F.R. §§ １.８２１−１.８２２(この内容は本明細書の一部を構成する)に記載の修飾された通常でないアミノ酸を含むと広く定義される。さらに、アミノ酸残基配列の始めまたは終わりの―(ダッシュ)は、NH２などのアミノ末端基またはCOOHなどのカルボキシル末端基に対して、1またはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列と結合したペプチドを表すことに注意すべきである。
本明細書において「天然アミノ酸」はポリペプチド中にみられる２０種のL−アミノ酸を表す。
本明細書において「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸と同様の構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に修飾された有機化合物を表す。すなわち、非天然アミノ酸は、該20種の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸類似体を含み、限定されるものではないが、アミノ酸のD-立体異性体を含む。典型的な非天然アミノ酸は本明細書に記載されており、当業者に知られている。
本明細書において等速混合物は、アミノ酸のモル比がその報告された反応速度に基づいて調整されたものである（例えばOstresh et al.，(１９９４)Biopolymers ３４：１６８１参照）。
本明細書において修飾は、ポリペプチドのアミノ酸配列または核酸んぶんしのヌクレオチド配列を修飾することをいい、これにはそれぞれアミノ酸またはヌクレオチドの欠失、挿入、および置換が含まれる。ポリペプチドの修飾方法は、例えば組換えDNA方法論を用いることにより当業者にルーチン的である。
本明細書においてアミノ酸の適切な保存的置換は、当業者に知られており、一般的には得られる分子の生物活性を変化させずに行うことができる。当業者は、一般的にはポリペプチドの非必須領域中の1個のアミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させないと認識される(例えばWatson et al. Molecular Biology of the Gene、第４版、１９８７、The Benjamin／Cummings Pub. co.、p.２２４参照。）。そのような置換は、下記表1Aの記載に従って行うことができる。
表1A
Figure 2013505237
他の置換も許容され、実験的または既知の保存的置換に従って決定することができる。
本明細書においてDNA構築物は、天然にみられない方法で結合し、隣り合って並んだDNA断片を含む一本鎖もしくは二本鎖の直線状もしくは環状DNA分子である。DNA構築物は、ヒト操作の結果として存在し、操作した分子のクローンおよび他のコピーが含まれる。
本明細書においてDNA断片は、特定の特性を有するより大きいDNA分子の部分である。例えば、特定のポリペプチドをコードするDNA断片は、5'から3'方向に読むと特定ポリペプチドのアミノ酸配列をコードするプラスミドやプラスミド断片などのより大きなDNA分子の部分である。
本明細書において用語ポリヌクレオチドは、5'から3'末端に読んだデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド塩基の一本鎖もしくは二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドにはRNAおよびDNAが含まれ、天然供給源から単離するか、in vitroで合成されるか、または天然または合成分子の組み合わせから製造することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書ではヌクレオチド（「nt」と略す）または塩基対（「bp」と略す）について示される。用語ヌクレオチドは、文脈が許せば一本鎖および二本鎖分子について用いられる。該用語を二本鎖分子に適用する場合は、全体の長さを示すために用い、用語塩基対と等価であると理解されよう。当業者は、二本鎖ポリヌクレオチドの二本の鎖は長さがわずかに異なりうるし、その末端がずれていることがあり、二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドは対になっていないことがあると理解するだろう。そのような対になっていない末端は、一般的は長さが20ヌクレオチドを超えないだろう。
本明細書において、2つのタンパク質または核酸間の「類似性」は、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の関連性を表す。類似性は本明細書中に含まれる残基と残基の配列の同一性および/または相同性の程度に基づくことができる。タンパク質間または核酸間の類似性の程度の評価方法は、当業者に知られている。例えば、配列同一性を評価するある方法では、2つのアミノ酸またはヌクレオチド配列を配列間の同一性が最大レベルになるように並べる。例えば、「同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列が不変である程度をいう。アミノ酸配列およびある程度はヌクレオチド配列のアラインメントは、アミノ酸(またはヌクレオチド)の保存的相違および/または頻繁な置換も考慮することができる。保存的相違は、関与する残基の物理化学的特性を保存する相違である。アラインメントは、全体的(配列の全長にわたる全ての残基を含む比較する配列のアラインメント)または部分的(ほぼ同様の領域(単数または複数)のみを含む配列の部分のアラインメント)でありうる。
「同一性」それ自体は、当該分野で認識された意味を有し、公表された技術を用いて計算することができる(例えば、Computational Molecular Biology、Lesk、A.M.編、Oxford University Press、New York、１９８８；Biocomputing：Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.編、Academic Press、New York、１９９３；Computer Analysis of Sequence Data、Part I、Griffin、A.M.、およびGriffin、H.G.編、Humana Press、New Jersey、１９９４；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、１９８７；およびSequence Analysis Primer、Gribskov、M.、およびDevereux、J.編.、M Stockton Press、New York、１９９１参照。）。2本のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するための多くの方法があるが、用語「同一性」は当業者によく知られている（Carillo、H. & Lipton、D.、SIAM J Applied Math ４８：１０７３(１９８８））。
本明細書においてホモローガス（核酸および／またはアミノ酸配列に関して）は、２５％配列相同性に等しいかそれより大きい、典型的には２５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％配列相同性に等しいかそれより大きいことを意味し、必要ならば正確なパーセンテージを特定することができる。本発明の目的において、用語「相同性」および「同一性」は、特記しない限り、しばしば互換性に用いられる。一般的には、相同性または同一性パーセンテージを決定するには、最大の一致が得られるように配列を並べる(例えば、Computational Molecular Biology、Lesk、A.M.編、Oxford University Press、New York、１９８８；Biocomputing：Informatics and Genome Projects、Smith、D.W.編、Academic Press、New York、１９９３；Computer Analysis of Sequence Data、Part I、 Griffin、A.M.、and Griffin、H.G.編、Humana Press、New Jersey、１９９４；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、１９８７；およびSequence Analysis Primer、Gribskov、M. and Devereux、J.編、M Stockton Press、New York、１９９１；Carillo et al.(１９８８)SIAM J Applied Math ４８：１０７３参照）。配列相同性により、保存されたアミノ酸の数を標準アラインメントアルゴリズムプログラムにより決定し、これを各供給者が確立したデフォルトギャップペナルティと共に用いることができる。実質的にホモローガスな核酸分子は、典型的には目的とする核酸の長さの中で中等度のストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーでハイブリダイスするだろう。ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重コドンを含む核酸分子も予期される。
あらゆる2つの分子が少なくとも ６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％「同一」または「ホモローガス」なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するか否かは、既知のコンピューターアルゴリズム、例えば「FASTA」プログラム、例えば、Pearson et al.(１９８８)Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８５：２４４４(他のプログラムには、GCGプログラムパッケージ（Devereux、J.、et al.、Nucleic Acids Research １２（I）：３８７(１９８４））、BLASTP、BLASTN、FASTA(Atschul、S.F.、et al.、J Molec Biol ２１５：４０３(１９９０））；Guide to Huge Computers、Martin J. Bishop編、Academic Press、San Diego、１９９４、およびCarillo et al.(１９８８)SIAM J Applied Math ４８：１０７３が含まれる）に記載のデフォルトパラメーターを用いて決定することができる。例えば、National Center for Biotechnology InformationデータベースのBLAST機能を用いて同一性を決定することができる。他の市販されているかまたは公的に利用可能なプログラムには、DNAStar「MegAlign」プログラム（Madison、WI）、およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group(UWG)「Gap」プログラム（Madison WI）が含まれる。タンパク質および／または核酸分子の相同性または同一性パーセントは、例えばGAPコンピュータープログラム（例えば、Needleman et al.(１９７０)J. Mol. Biol. ４８：４４３(SmithおよびWatermanにより修正（（１９８１)Adv. Appl. Math. ２：４８２）)を用いて配列情報を比較することにより決定することができる。簡単には、GAPプログラムは、
the GAP program defines simi-lar-ity as the number of aligned symbols類似する並べたシンボル（すなわち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）数を2つの配列の短い方中のシンボルの総数で割った類似性を定義する。GAPプログラムのデフォルトパラメーターには以下のものが含まれる：（１）単項比較マトリックス（同一に１を非同一には０の値を含む）およびGribskov et al.の加重比較マトリックス(１９８６)Nucl. Acids Res. １４：６７４５(SchwartzおよびDayhoff編、ATLAS OF タンパク質 SEQUENCE AND STRUCTURE、National Biomedical Research Foundation、pp. ３５３−３５８(１９７９）に記載)；（２）各ギャップには３.０のペナルティおよび各ギャップ中の各シンボルにはさらに０.１０ペナルティ；および（３）末端ギャップにはペナルティ無し。
したがって、本明細書において用語「同一性」または「相同性」は、試験と参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチド間の比較を表す。本明細書において、用語少なくとも「〜と９０％同一」は、ポリペプチドの参照核酸またはアミノ酸配列と比較して９０〜９９.９９％の同一性を表す。９０％またはそれ以上のレベルの同一性は、例として、長さ100アミノ酸の試験および参照ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを比較することを示す。試験ポリペプチド中のアミノ酸の１０％（すなわち、100個のうち10個)未満が参照ポリペプチドと異なる。同様の比較を試験および参照ポリヌクレオチド間で行うことができる。そのような相違は、ポリペプチドの全長にわたり無作為に分布する点突然変異として表すか、許容される最大まで異なる長さの1またはそれ以上の位置に集めてひとまとめにすることができる(例えば１０／１００アミノ酸の相違（約９０％同一）)。相違は、核酸またはアミノ酸置換、挿入、または欠失として定義される。約85〜90％以上の相同性または同一性のレベルで、結果はプログラムおよびギャップパラメータセットと独立すべきであり、そのような高レベルの同一性はしばしばソフトウエアに頼らずに手作業のアラインメントにより容易に評価することができる。
本明細書においてアラインメントした配列は、相同性(類似性および/または同一性)を用いて表し、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列中の対応する位置に並べられる。典型的には、５０％またはそれ以上の同一性により関連する2またはそれ以上の配列を並べる。アラインメントした配列のセットは、対応する位置に並べられる1またはそれ以上の配列を表し、ゲノムDNA配列とアラインメントしたESTおよび他のcDNAなどのRNA由来のアラインメント配列を含むことができる。
本明細書において「プライマー」は、適切な温度で適切な緩衝液中、適切な条件下(例えば4つの異なるヌクレオシド三リン酸、および重合剤、例えばDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼ、または逆転写酵素の存在下)で鋳型指向性DNA合成の開始点として作くことができる核酸分子を表す。ある種の核酸分子は「プローブ」および「プライマー」として働くことができると理解される。しかしながら、プライマーは、伸長のための3'ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素（RT）-PCR、RNA PCR、LCR、多重PCR、パンハンドルPCR、捕捉PCR、発現PCR、３'および５'RACE、in situPCR、連結反応仲介PCR、および他の増幅プロトコールを含む種々の方法に用いることができる。
本明細書において「プライマー対」は、(例えばPCRにより)増幅する配列の5'末端とハイブリダイズする5'(上流)プライマー、および増幅する配列の3'末端の相補物とハイブリダイズする3'(下流)プライマーを含むプライマーセットを表す。
本明細書において「特異的にハイブリダイズする」は、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）と標的核酸分子の相補塩基ペアリングによりアニーリングすることを表す。当業者は、特定分子の長さおよび組成などの特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすin vitroおよびin vivoパラメーターを熟知している。in vitroハイブリダイゼーションに特に関連するパラメータには、さらにアニーリングおよび洗浄温度、緩衝剤組成、および塩濃度が含まれる。高ストリンジェンシーで非特異結合した核酸分子を除去するための洗浄条件の例には、０.１ x SSPE、０.１％ SDS、６５℃があり、中等度のストリンジェンシーでのそれは０.２ x SSPE、０.１％ SDS、５０℃である。等価なストリンジェンシー条件は当業者で知られている。当業者は、これらのパラメーターを容易に調整して核酸分子の特定の応用に適した標的核酸分子との特異的ハイブリダイゼーションを達成することができる。2つのヌクレオチド配列に言及するときは相補性は2つヌクレオチド配列が典型的には向かい合った遺伝子間のミスマッチが２５％、１５％、または５％以下でハイブリダイズすることができることを意味する。必要であれば相補性のパーセンテージを特定する。典型的には、2つの分子を高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように選択する。本明細書において、生成物と実質的に同一とは、目的とする特性が、実質的に同一の生成物を該生成物の代わりに用いることができるように充分に無変化であるように十分に類似していることを意味する。
本明細書において、用語「実質的に同一」または「同様」は、当業者が理解するように文脈によって変化すると理解される。
本明細書において、アレル変異体またはアレル変異は、同じ染色体座を占めるあらゆる2またはそれ以上の代替遺伝子を表す。アレル変異は突然変異により天然に生じ、ポピュレーション内で表現形的多形性をもたらすことができる。遺伝子の突然変異は、サイレント(コードされたポリペプチドに変化なし)か、または変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしうる。本明細書において用語「アレル変異体」は、遺伝子のアレル変異体をコードするタンパク質を表す。典型的には、参照形の遺伝子は、種のポピュレーションまたは単一参照メンバー由来のポリペプチドの野生型および/または主な形をコードする。典型的には、種間に変異体を含むアレル変異体は、典型的には同じ種の野生型および/または主な形と少なくとも ８０％、９０％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有し、同一性の程度は、遺伝子、および比較が種間または種内であるかどうかに依存する。一般的には、種内のアレル変異体は、ポリペプチドの野生型および/または主な形と少なくとも約８０％、８５％、９０％、または９５％またはそれ以上の同一性(ポリペプチドの野生型および/または主な形との９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の同一性を含む)を有する。本明細書においてアレル変異体への言及は、一般的に同じ種のメンバー間のタンパク質の変化を表す。
本明細書において「アレル(対立遺伝子)」は「アレル変異体」と互換性に用いられ、遺伝子またはその部分の代替型を表す。アレルは、ホモローガスな染色体上の同じ座または位置を占める。対象が遺伝子の2つの同じアレルを有するときは、該対象はその遺伝子またはアレルについてホモ接合性であるという。対象が遺伝子の2つの異なるアレルを有する場合は、対象はその遺伝子についてヘテロ接合性であるという。特定遺伝子のアレルは、単一ヌクレオチドまたは種々のヌクレオチドにおいて互いに異なり得、ヌクレオチドの置換、欠失、および挿入を含み得る。遺伝子のアレルは突然変異を含む遺伝子形でもあり得る。
本明細書において種変異体は、マウスやヒトなどの種々の哺乳動物種を含む異なる種間のポリペプチドの変異体を表す。
本明細書においてスプライス変異体は、mRNAの1またはそれ以上の形を生じるゲノムDNAの一次転写物のディファレンシャルプロセシングにより生じる変異体を表す。
本明細書において用語プロモーターは、RNA ポリメラーゼの結合および転写開始をもたらすDNA配列を含む遺伝子の部分を意味する。プロモーター配列は、常にではないが通常、遺伝子の5'非コーディング領域にみられる。
本明細書において単離または精製されたポリペプチドまたはタンパク質、またはその生理活性部分は、タンパク質が由来する細胞または組織由来の細胞物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成の場合は化学的前駆体や他の化学物質を実質的に含まない。当業者がそのような純度を評価するために用いる標準的分析方法、例えば薄層クロマトグラフィ(TLC）、ゲル電気泳動、および高速液体クロマトグラフィ（HPLC）により測定される容易に検出可能な不純物を含まないようであるか、またはさらなる精製が、または該物質の物理化学的特性、例えば酵素活性および生物活性を検出可能な変化をもたらさないように十分純粋である場合は、該調製物は実質的に含まないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物をもたらす化合物の精製方法は当業者に知られている。しかしながら、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物でありうる。その場合は、さらなる精製は化合物の特異活性を増大させるかもしれない。
用語、細胞物質を実質的に含まないには、タンパク質が単離または組換え的に生成される、細胞の細胞成分から分離されたタンパク質を製造することが含まれる。ある態様において、用語、細胞物質を実質的に含まないには、約３０％(乾燥重量)以下の非酵素タンパク質（本明細書では夾雑タンパク質ともいう)、一般的には約２０％以下の非酵素タンパク質もしくは１０％の非酵素タンパク質、または約５％以下の非酵素タンパク質を有する酵素タンパク質を製造することが含まれる。該酵素タンパク質を組換え的に製造する場合は、培養液も実質的に含まない。すなわち培養液は酵素タンパク質調製物の容量のちょうどまたは約２０％、１０％、または５％以下を示す。
本明細書において用語、化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まないには、酵素タンパク質が化学的前駆体、またはタンパク質の合成に関与する他の化学物質から分離される、酵素タンパク質の製造が含まれる。該用語には、約３０％(乾燥重量)、２０％、１０％、５％、またはそれ以下の化学的前駆体または非酵素化学物質または成分を有する酵素タンパク質の製造が含まれる。
本明細書において、例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドに関して合成は、組換え法および/または化学合成法により製造される核酸んぶんしまたはポリペプチド分子を表す。
本明細書において組換えDNA法を用いる組換え手段による製造は、クローン化DNAによってコードされるタンパク質を発現させるためのよく知られた分子化合物生物学的方法の使用を意味する。
本明細書においてベクター(またはプラスミド)は、ヘテロローガスな核酸をそれを発現もしくは複製するために細胞内に導入するのに用いる分離した要素を表す。典型的には、ベクターはエピソームのままであるが、遺伝子もしくはその部分をゲノムの染色体内に統合させるように設計することができる。人工染色体、例えば酵母人工染色体および哺乳動物人工染色体であるベクターも予期される。そのようなビークルの選択および使用は当業者によく知られている。
本明細書において、発現ベクターには、DNA断片を発現させることができる制御配列、例えばプロモーター領域と機能的に結合しているDNAを発現させることができるベクターが含まれる。そのようなさらなる部分は、プロモーターおよびターミネーター配列を含むことができ、所望により1またはそれ以上の複製起点、1またはそれ以上の選択可能なマーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなどを含むことができる。発現ベクターは、一般的にはプラスミドまたはウイルスDNA由来であるか、またはその両方の要素を含むことができる。すなわち、発現ベクターは、適切な宿主細胞に導入するとクローン化DNAの発現をもたらす組換えDNAまたはRNA構築物、例えばプラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターを表す。適切な発現ベクターは当業者によく知られており、真核細胞および／または原核細胞中で複製可能なもの、およびエピソームのままであるか宿主細胞ゲノム中に統合されるものが含まれる。本明細書においてベクターは、「ウイルス(virusまたはviral)ベクター」を含む。ウイルスベクターは、外来遺伝子と機能的に(operatively)連結し、外来遺伝子を細胞内に(ビークルまたはシャトルとして)伝達する操作されたウイルスである。
本明細書において、DNA断片に言及する場合に、操作可能にまたは機能的に連結したとは、該断片がその意図する目的のために共同して機能する、例えば転写がプロモーターで開始し、コーディング断片を通してターミネーターまで継続されるように配置されていることを意味する。
本明細書において用語、評価するは、試料中に存在するタンパク質、例えば酵素やプロテアーゼ、またはそのドメインの活性についての絶対値を得、該活性のレベルを示す指数、比、パーセンテージ、可視的もしくは他の値を得るという意味で定量的および定性的測定を含むことを意図する。評価は、直接または間接的であってよく、実際に検出される化学種は、もちろん反応の最終産物、例えばタンパク質分解産物自体である必要はないが、例えばその誘導体やあるさらなる物質でありうる。例えば、評価では、例えばSDS−PAGEおよびクーマシーブルーによるタンパク質染色によりタンパク質の開裂産物を検出することができる。
本明細書において生物活性は、化合物、組成物または他の混合物をin vivo投与すると生じる化合物のin vivo活性または生物学的反応を表す。すなわち、生物活性には、そのような化合物、組成物、および混合物の治療効果および医薬的活性が含まれる。生物活性は、該活性を試験または使用するように設計されたin vitro系で観察することができる。すなわち、本発明の目的において、プロテアーゼの生物活性は、ポリペプチドを加水分解する触媒活性である。
本明細書において核酸の2つの配列に言及する場合に等価であるとは、該2つの配列がアミノ酸の同じ配列または等価なタンパク質をコードすることを意味する。等価を2つのタンパク質またはペプチドについて言及する際に用いる場合は、該2つのタンパク質またはペプチドが該タンパク質またはペプチドの活性や機能を実質的に変化させないアミノ酸置換のみを有する実質的に同じアミノ酸配列を有することを意味する。等価が特性を表す場合は、特性は同じ程度に存在する必要はないが(例えば2つのペプチドは、異なる割合の同じ形の酵素活性を示すことができる)、該活性は通常実質的に同じである。
本明細書において「調節(変調)する」および「モジュレーション」または「変化させる」は、タンパク質などの分子の活性が変化することを表す。活性の例には、限定されるものではないが、生物活性、例えばシグナルトランスダクションが含まれる。モジュレーションは、該活性の増加(すなわち上方調節またはアゴニスト活性)、活性の減少(すなわち、下方調節または阻害)、または活性の他のあらゆる変化(例えば、周期性、頻度、持続時間、動力学、または他のパラメーターの変化)を含みうる。モジュレーションは、文脈に依存し、典型的にはモジュレーションは特定の状態、例えば野生型タンパク質、構成状態のタンパク質、または特定の細胞型または状態で発現するタンパク質と比較される。
本明細書において、組成物はあらゆる混合物を表す。組成物は溶液、サスペンジョン、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらのあらゆる組み合わせでありうる。
本明細書において、組み合わせは、2またはそれ以上の事項の間のあらゆる関連を表す。組み合わせは、2またはそれ以上の別個の事項、例えば2つの組成物または2つのコレクション、およびそれらの混合物、例えば2またはそれ以上の事項の単一混合物、またはそのあらゆる変化でありうる。組み合わせの要素は一般的に機能的に結合または関連している。
本明細書において、キットは、所望により他の要素、例えばさらなる試薬および該組み合わせまたはその要素の使用指示書を含む包装された組み合わせである。
本明細書において、「疾患または病状」は、限定されるものではないが、感染症、後天的病状、遺伝的病状を含む原因もしくは病状から生じる、同定できる症状により特徴づけられる、生物の病的状態を表す。
本明細書において、疾患または病状を有する対象を「治療(処置)する」は、対象の症状を一部または全体的に軽減するか、治療後静的なままであることを意味する。したがって、治療は、予防、治療、および/または治癒を含む。予防は、潜在的疾患の防止、および/または疾患の進行または症状の悪化の防止を表す。治療は、本発明が提供する免疫グロブリン製剤および組成物のあらゆる医薬的使用も含む。
本明細書において、医薬的に有効な物質には、限定されるものではないが、以下のものを含むあらゆる治療剤や生物活性物質が含まれる：例えば麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、従来の治療薬(低分子薬および治療用タンパク質を含む)。
本明細書において、治療は、病状、障害もしくは疾患の症状、または他の兆候を改善するかまたは有利に変化させるあらゆる方法を意味する。
本明細書において、治療効果は、疾患または病状の症状が変化する、典型的には改善または軽減するか、または疾患または病状が治癒する、対象の治療によって得られる効果を意味する。治療的有効量は、対象に投与した後に治療効果を生じる組成物、分子、または化合物の量を表す。
本明細書において用語「対象」は、哺乳動物、例えばヒトを含む動物を表す。
本明細書において患者はヒト対象を表す。
本明細書において、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、治療による特定疾患または病状の症状の改善は、該組成物または治療薬の投与によるかまたはそれに関連する症状の恒常的または一時的、永続的または一過性のあらゆる低減を意味する。
本明細書において、防止または予防は、疾患または病状が生じるリスクを減少させる方法を表す。
本明細書において「治療的有効量」または「治療的有効用量」は、少なくとも治療効果を生じるのに充分な薬剤、化合物、物質、または化合物を含む組成物の量を表す。したがって、治療的有効量または治療的有効用量は疾患または病状の症状を予防、治癒、改善、停止、または部分的に停止するのに必要な量である。
本明細書において単位剤形は、ヒトおよび動物対象に適した、当該分野で知られているように個々に包装されている物理的に分離した単位を表し、
本明細書において単用量製剤は直接投与するための製剤を表す。
本明細書において、「製品」は、製造販売される産物である。
本明細書全体で用いている用語は、包装品に含まれるIGおよびヒアルロニダーゼを含むことを意図する。
本明細書において流体は、流動可能なあらゆる組成物を表す。すなわち、流体は、半固体、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリーム、および他のそのような組成物の形である組成物を含む。
本明細書において「キット」は、本発明が提供する組成物と、限定されるものではないが、活性化、投与、診断、および生物活性または特性の評価のための別の要素の組み合わせを表す。キットは所望により使用指示書を含む。
本明細書において、細胞抽出物または溶解物は、溶解もしくは破壊した細胞から作製される調製物または分画を表す。
本明細書において、動物は、限定されるものではないが以下のものを含むあらゆる動物を含む：ヒト、ゴリラおよびサル；齧歯類、例えばマウスおよびラット；鳥類、例えばニワトリ；反芻動物、例えばヤギ、乳牛、シカ、ヒツジ；ヒツジ、例えばブタ、および他の動物。非ヒト動物は、予期される動物としてヒトを除く。本発明が提供する酵素は、あらゆる供給源、動物、植物、原核生物、および細菌由来である。ほとんどの酵素は、動物起源(哺乳動物起源を含む)である。
本明細書において、コントロールは、試験パラメーターで処置していない以外は試験試料と実質的に同一な試料を表し、それが血漿試料である場合は、目的とする病状に罹患していない正常ボランティア由来でありうる。コントロールは内部コントロールでもあり得る。
本明細書において、単数形「a」、「an」、および「the」には、文脈が明確にそうでないと示さない限り、複数形を含む。すなわち、例えば、「細胞外ドメイン」を含む化合物に対する言及には、1または複数の細胞外ドメインを含む化合物が含まれる。
本明細書において、範囲および量は、「約」特定値または範囲として表すことができる。約は正確な量も含む。したがって、「約5塩基」は「約5塩基」と「5塩基」も意味する。
本明細書において、「所望の」または「所望により」は、実質的に記載された事象または環境が起きるかまたは起きないこと、および該記載が該事象または環境が生じる場合と生じない場合を含むことを意味する。例えば、所望により置換された基は、該基が置換されていないか、または置換されていることを意味する。
本明細書において、あらゆる保護基、アミノ酸、および他の化合物の略号は、特記しない限り、通常の使用、認識された略号、またはIUPAC−IUB Commission on Biochemical Nomenclature(（１９７２)Biochem. １１：１７２６参照）に従う。
B. 免疫グロブリン（ＩＧ）およびヒアルロニダーゼの安定な共製剤
本発明は、免疫グロブリン（ＩＧ）およびヒアルロニダーゼを含む安定な強精剤を提供する。該共製剤は、室温（例えば２８〜３２℃）で少なくとも６月、液体形で長期間保存した後にＩＧ 分子の大きさ分布とヒアルロニダーゼ活性を保持する。一般的には、該共製剤は、標準的冷蔵温度で少なくとも1〜2年間、液体形で長期間保存した後にＩＧ 分子の大きさ分布とヒアルロニダーゼ活性を保持する。該共製剤は、ＩＧで治療可能な疾患および病状を治療するのに用いることができる。特に、本発明が提供する安定な共製剤は皮下投与用に製剤化される。
１. 免疫グロブリン治療
免疫グロブリンは、免疫不全の個体を治療するために主として投与される治療薬である。免疫グロブリン不全症は、血清免疫グロブリンが欠損しているか、またはそのレベルが減少し、特に洞肺部の細菌感染に対する感受性の増大が生じることを特徴とする免疫不全疾患のサブセットである。免疫不全疾患は、原発性(遺伝性)または続発性(後天性)である。先天性免疫不全疾患は希であり、X連鎖無ガンマグロブリン血症、免疫グロブリン重鎖欠損症、選択的免疫グロブリンG（ＩｇＧ）サブクラス欠損症、分類不能型免疫不全疾患、またはX連鎖高免疫グロブリンM症候群が含まれる。免疫グロブリンレベルの低下は、TおよびＢ細胞の欠損による複合免疫不全症(例えば、限定されるものではないが、重症複合免疫不全またはウイスコット−アルドリッチ（Wiskott−Aldrich）症候群(IUIS Scientific Committee、１９９９）)を有する個体にもみられる。より一般的なものには、限定されるものではないが、栄養不良、ウイルス、加齢、および白血病を含む因子により誘導される続発性免疫不全症がある。これらの疾患を有する個体には、感染を予防またはその重症度を低下させる免疫グロブリン製剤での置換療法が必要である。
免疫グロブリン置換療法は、1952年に最初に用いられ、筋肉内および皮下投与された。しかしながら、疾患を効果的に治療するには、大量のIGが必要であり、このことが、低IG濃度（５０〜１００ｍｇ／ｍＬ）の静脈内投与可能な製剤の開発をもたらした。1981年以来、米国で利用可能な免疫グロブリン製剤の大多数は、静脈内投与される。一般的には、ＩＧ製剤は、免疫グロブリンG(ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、またはこれらの組み合わせ）を含む無菌精製製剤である。典型的には、ＩＧ製剤は、９５〜９９％ＩｇＧとごく微量の免疫グロブリンA(ＩｇＡ）、M(ＩｇＭ）、D(ＩｇＤ）、およびE(ＩｇＥ）を含む。IV投与用のＧ製剤は、一般的には3〜12％IGで製剤化される。
より最近になって、皮下投与用の免疫グロブリン製剤が開発され（Gardulf et al.(２００６)Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. ６：４３４−４２；Gardulf et al.(２００６)J. Clin. Immunol. ２６：１７７−８５；Ochs et al.(２００６)J. Clin. Immunol. ２６：２６５−７３）、少なくとも1つの製剤であるVivaglobin(登録商標)は米国で皮下投与用に認可されている。IGの皮下投与経路は、IV経路に比べて耐用性が良いことや自宅治療が可能であるなどの種々の利点がある。
一般的に、皮下投与した免疫グロブリンのバイオアベイラビリティは、静脈内注入より低い。IV投与後、免疫グロブリンは血液中で急速に利用可能であり、3〜5日間かけて徐々に血管外コンパートメントと平衡化する（Schiff et al.(１９８６)J. Clin. Immunol. ６：２５６−６４）。皮下投与された免疫グロブリンは、皮下空間から血液内に徐々に吸収され、同時に細胞外コンパートメントと平衡化し、高IVスパイクはみられない。該バイオアベイラビリティは広範には研究されていないが、最近行われたZLB−Behring製剤（すなわち、Vivaglobin(登録商標)）の臨床試験において、曲線下面積(AUC)を測定することにより検討され、6〜7％の免疫グロブリンが吸収され、推奨用量はIV用量の１３７％であった（Ochs et al.(２００６)J. Clin. Immunol. ２６：２６５−７３）。2つの異なる投与経路および投与頻度を比較する技術的困難さがあるにもかかわらず、ウサギの皮内投与した免疫グロブリンの試験は、皮下経路ではバイオアベイラビリティの低下がみられることが示唆する。これは毛細管壁を通して容易に拡散できず、リンパ系を介して吸収される必要があるという第タンパク質分子の吸収方法によるかもしれない（Supersaxo et al.(１９９０)Pharm. Res. ７：１６７−９）。
現在、皮下投与に用いられる免疫グロブリン製剤はすべて、５〜1２％ＩＧで製剤化されるIVIG製剤に比べて16％IGで製剤化されている。IV製剤に比べて皮下製剤中のIG濃度が高いことでより小容量での注入を可能にするが、そのような製剤は静脈内に注入することができない。免疫グロブリン置換療法のそのような皮下投与法は、毎月のIV注入に比べて、全身的副作用のリスクが低く、より高いトラフ血清IgG濃度が得られるため、有効で安全であり患者にも喜ばれると考えられる（Gardulf et al.(１９９５)J. Adv. Nurs.、２１：９１７−２７；Gardulf et al.(１９９３)Clin. Exp. Immunol.、９２：２００−４；Gardulf et al.(１９９１)Lancet、３３８：１６２−６）。
IGの皮下投与によるバイオアベイラビリティの低下に加え、SC投与とIV投与のもう一つの違いは、小容量しか各部位に皮下注入することができないため、毎週または隔週で複数部位に用いる必要があることである。しかしながら、一般的に、成人には一投与部位に20〜40mLしか注入することができず、子供では一部位当たりの容量はより低い。現在、臨床的に許容されるIG投与量は、静脈内に３００〜６００ｍｇ／ｋｇを３〜４週間に1回、また皮下に１００〜２００ｍｇ／ｋｇ／wkである（Berger(２００８)Immunol. Allergy Clin. North Am. ２８（２）：４１３−４３８）。すなわち、15g以下のIGが1週間に1回皮下投与される。これは、１６〜２０％ＩＧ製剤の投与を1週間に少なくとも3部位にする必要があることを意味する。毎週または隔週投与でも毎月IV注入より良好なトラフレベルを維持するというさらなる利点があるが、注射針を複数回挿入する必要があるので多くの患者が嫌がる。
それにも関わらず、免疫グロブリン置換療法の皮下投与法は、IVIG療法に変わってますます一般的になりつつある。IVIG注入に対する重篤な反応がある患者は、しばしば皮下投与されたIGを許容することができる。皮下投与は、全身的有害反応のリスクが低く、自宅でも病因でも投与することができるので、有効で安全であり患者も高く評価すると考えられる（Gardulf et al.(１９９５)J. Adv. Nurs. ２１：９１７−２７；Gardulf et al.(１９９３)Clin. Exp. Immunol. ９２：２００−４；Gardulf et al.(１９９１)Lancet ３３８：１６２−６）。
２. 免疫グロブリン（ＩＧ）およびヒアルロニダーゼ製剤の皮下投与
皮下投与したIGのバイオアベイラビリティは、ヒアルロニダーゼ投与と組み合わせると増加し、これによりIVIG処置と同様の用量と頻度で免疫グロブリンの皮下投与が可能となる（例えば、米国特許出願No. ２０１０−００７４８８５、およびPCTNo. WO ２００９−１１７０８５参照(これらの内容は本明細書の一部を構成する))。ゲル様物質のヒアルロン酸で満たされたコラーゲンネットワークにより形成される皮下(SC)空間は、組織を通過する流体の流れに対する抵抗に大きく関与する。ヒアルロニダーゼは、細胞外マトリックス、および皮膚や眼などの身体全体の組織にみられる空間を満たす「ゲル」様物質であるヒアルロン酸を分解する天然酵素のファミリーである。
ヒアルロニダーゼは、N−アセチルグルコサミン部分のC１とグルクロン酸部分のC４の間でヒアルロン酸のグルコサミド結合を開裂させることにより作用する。これは、細胞セメント質の粘性を一時的に低下させ、注射した流体の拡散をもたらし、その吸収を促進する。次に、ヒアルロン酸は、24時間以内に自然に再生する。したがって、ヒアルロニダーゼを含む共製剤のバイオアベイラビリティ、薬物動態、および/または薬力学的特性が改善される。動物実験に基づいて、流体の拡散の増大はIV同様の流速である1L/時間以下の皮下経路での投与を可能にする。
ヒアルロニダーゼの存在下で、皮下投与したIGのバイオアベイラビリティは、典型的にはIVIG処置後のIGのバイオアベイラビリティの90％以上に増加する。さらに、可溶性ヒアルロニダーゼとの同時投与は、単一皮下部位への大容量の注入を可能にする。例えば、６００ｍＬまたはそれ以上の容量のIGを一回の投与で単一部位に投与することができ、例えば、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、またはそれ以上を一回の投与で単一部位に投与することができる。例えば、５〜１２％、例えば1０％タンパク質で製剤化したIG製剤(これは典型的にはＩＶＩＧ治療のみで用いられる)を毎月1回のIVIG用量と等価な用量で可溶性ヒアルロニダーゼと共に同時投与することができ、例えば、ちょうどまたは約１００ｍｇ／ｋｇ、２００ｍｇ／ｋｇ、３００ｍｇ／ｋｇ、４００ｍｇ／ｋｇ、５００ｍｇ／ｋｇ、６００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上であってもよい。より高濃度、例えば、１２〜２５％ ＩＧ、例えば１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％またはそれ以上のタンパク質を含むIG製剤を、ヒアルロニダーゼの存在下で皮下投与することもできる。該用量は単回用量として投与するか、複数用量に分けて、毎日または毎週、例えば1週間に1回、または2、3、または4週間に1回、またはそれらの組み合わせで投与することができる。すなわち、ヒアルロニダーゼの存在下で皮下投与すると、IGを、特定の兆候のために普及しているIVIG用量で毎月1回投与することができる。さらにヒアルロニダーゼは皮膚のフローチャンネルを開く様に作用するので、注入速度を増すことができる。したがって、ヒアルロニダーゼと共に投与する皮下投与IGは、注入速度が増加することにより、IG治療の送達回数を減少させる。
ヒアルロニダーゼの存在下でIGを皮下投与することにより、IGの皮下投与に関連する1つまたは全ての検討事項および問題に対処する。すなわち、ヒアルロニダーゼの分散特性により、可溶性ヒアルロニダーゼの存在下で皮下投与したIGは、IVIGのバイオアベイラビリティを維持しながら、毎月に1回のIVIGの頻度でIVIG用量の投与を可能にする。
３. 安定な共製剤
皮下投与可能な免疫グロブリン製剤は自宅治療できる利点があるので、IGとヒアルロニダーゼの安定ですぐ使える状態の製剤が予期される。治療に用いるタンパク質は、典型的には、低pH、温度変動、種々の緩衝成分およびイオン強度、およびしばしば最終製剤中の高タンパク質濃度を含む加工および保存時の種々の条件に置かれる。しかしながら、有効であるためには、該共製剤はIGとヒアルロニダーゼの充分な活性を保持しなければならない。すなわち、IGとヒアルロニダーゼの共製剤は、長時間劣化せずに水性溶液として保存するのに安定な溶液として提供する必要がある。したがって、本発明は、IGとヒアルロニダーゼの安定な液体共製剤を提供する。該共製剤は、直接注射するのに用いることができる、すなわち使用前に希釈されない剤形として提供される。
本願において、IGの調製物にヒアルロニダーゼを加えて製造した共製剤(ｒＨｕＰＨ２０という)は投与前に室温で安定でないことがわかった。塩の添加は、特に製剤中のヒアルロニダーゼの活性を維持することにより製剤の安定性を改善する。すなわち、有効量のIGおよびヒアルロニダーゼを含むのに加えて、本発明が提供する安定な共製剤は、少なくとも５０ｍＭのアルカリ金属塩化物塩、例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌも含む。典型的には、該安定な共製剤は、安定化剤としてアミノ酸(例えばグリシン)を含み、ちょうどまたは約4〜5のpHで提供される。一般的には、共製剤中のヒアルロニダーゼ/IG比は、同じ製剤（ＩＧおよびヒアルロニダーゼ）および同量のIGが例えば最新の投与では別々に皮下投与される比より大きい。
一般的に、安定な共製剤は液体製剤である。該共製剤を液体形で直接保存することは、液体形で保存安定性を有し、再構成せずに投与することができ、また予め充填した、すぐに使用できるシリンジ中の製剤、または複数用量製剤として供給することができるという利点がある。したがって、該液体共製剤は、該製剤を再構成することなく、該製剤を対象に投与する前に該溶液が澄むまでの時間待つことなしに、対象に正確に無菌的に皮下投与するためのすぐに使用できるIGおよびヒアルロニダーゼの製剤を提供する。それは、健康管理の専門家が対象に該政治亜を投与する手順を簡単にする。さらに、該液体製剤の製造のすべての段階が水性溶液で行われ、凍結乾燥(lyophilizationおよびfreeze−drying)などの乾燥プロセスを含まないため、該液体製剤の製造プロセスは簡単であり、凍結乾燥物の製造プロセスより効率的である。したがって、経済的でもある。安定な共製剤を容器またはシリンジ中の液体溶液として提供することができる。そのような共製剤は、さらに医師や患者が再構成することなく医薬としてヒトまたは他の哺乳動物種に好都合に投薬される。
さらに、保存中の安定性が高いため、該共製剤は、長期保存中にタンパク質の凝集および/または断片化によるIGの生物活性に有害な作用を生じることなく、タンパク質を約10％〜22％IG、例えば10％〜20％IGの範囲で高濃度に含むことができる。そのような安定性は、IG共製剤の有効性を保証するだけでなく、対象に有害作用を引き起こすリスクの可能性も減らす。したがって、本発明の該安定な共製剤は、IGの自己結合および凝集を最小限にしながらヒアルロニダーゼの酵素活性とIGの活性を保持する。一般的に、該活性は32℃以下、例えばちょうどまたは約0℃〜32℃、一般的にはちょうどまたは約28℃〜32℃の温度で維持される。該共製剤の安定性は、日、週、月、年またはそれ以上の長期間にわたり維持される。該共製剤は、少なくとも６月の長期間の保存中に液体形で安定しているという利点がある。一例として、該安定な共製剤は、標準的な冷蔵温度(約４±２℃または約２〜８℃、より一般的には約０〜１０℃の範囲）で、少なくとも１年間またはそれ以上、例えば１〜２年間、例えば1年間、2年間またはそれ以上液体で安定である。別の例では、該共製剤は、室温(１８〜３２℃、例えば２８℃〜３２℃の範囲）で少なくとも６月液体で安定である。例えば、該安定な共製剤の保存期間は、室温で保存する場合は一般的に少なくともまたは約６〜１８月間、例えば６月間、１２月間、１８月、またはそれ以上である。
以下の項に、該製剤中の免疫グロブリンとヒアルロニダーゼの例、その製造方法、および該安定な共製剤を用いるIGで治療可能な疾患および病状の治療方法を含めて本発明の製剤について記載する。
C. 免疫グロブリンおよび免疫グロブリンの製造
本発明は、ヒアルロニダーゼとともに安定な組成物に製剤化することができる免疫グロブリン（ＩＧ。免疫グロブリン、ガンマグロブリン、またはＩｇＧともいう）を提供する。該安定な共製剤を用いてIGで治療可能な疾患および病状を治療することができる。
免疫グロブリンは、高等動物の血漿中にみられる液性免疫系により産生されるガンマグロブリンタンパク質である。
ＩＧは、補体活性を調節し、自己抗体産生を抑制し、マクロファージとBリンパ球上のFcレセプターを飽和またはブロックし、炎症メディエータ、例えばサイトカイン、ケモカイン、またはメタロプロテアーゼの産生を抑制することにより免疫系を強くするように働く。IGには、抗体の5つのクラスまたはアイソフォーム（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、およびＩｇＥ）および種々のサブクラスがあり、それぞれ特異性が異なる。IgGは、血中にみられるIGの最も主なクラスであり、二次免疫反応および組織の感染からの保護に重要である。表２は、血清中にみられる免疫グロブリンの典型的な量を示すが、治療用のIGの製造では精製工程を用いて、特定の免疫グロブリンクラス(単数または複数)の割合を変えることができる。例えば、プロテインA、悪プロテインG、またはプロテインHセファロースクロマトグラフィを用いて、免疫グロブリン混合物のＩｇＧまたは特定のＩｇＧサブタイプを豊富化することができる(例えば、Harlow and Lane(１９９９)Using Antibodies、Cold Spring Harbor Laboratory Press；Harlow and Lane(１９８８)Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press；米国特許No. ５，１８０，８１０参照）。
表２. 血清免疫グロブリン
Figure 2013505237
 １. 製造および精製
本発明が提供する免疫グロブリン製剤は、あらゆる安定な出発物質から製造することができる。例えば、免疫グロブリンはヒトまたは動物の血液、例えばヒトドナー血清から単離するか、または他の手段、例えば組換えDNA技術もしくはハイブリドーマ技術により製造することができる。したがって、免疫グロブリン製剤は、モノクローナルまたは組換え免疫グロブリンを含むことができる。例えば、免疫グロブリンは組織、リンパ球ハイブリドーマ培養、血漿または血清、または組換え細胞培養から、例えば以下のあらゆる安定な方法を用いて単離することができる：沈殿法（Cohnアルコール分画法またはポリエチレングリコール分画法）；クロマトグラフィ法（イオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、イムノアフィニティクロマトグラフィ)；超遠心分離法；または電気泳動法など（例えば、Cohn et al.(１９４６)J. Am. Chem. Soc. ６８：４５９−７５；Oncley et al.(１９４９)J. Am. Chem. Soc.、７１：５４１−５０；Barandern et al.(１９６２)Vox Sang.、７：１５７−７４；Koblet et al.(１９６７)Vox Sang.、１３：９３−１０２；米国特許No. ５，１２２，３７３および５，１７７，１９４参照）。典型的には、免疫グロブリンは、当業者によく知られたアルコール分画法および／またはイオン交換およびアフィニティクロマトグラフィ法によりガンマグロブリン含有生成物から製造される。
製造工程を用いて、免疫グロブリンの特定のアイソフォームやサブタイプを豊富化することができる。例えば、プロテインA、悪プロテインG、またはプロテインHセファロースクロマトグラフィを用いて免疫グロブリン混合物のＩｇＧまたは特定のＩｇＧサブタイプを豊富化することができる（一般的には、Harlow and Lane、Using Antibodies、Cold Spring Harbor Laboratory Press(１９９９）；Harlow and Lane、Antibodies、A Laboratory Manual、Cold Spring Harbor Laboratory Press(１９８８）；米国特許No. ５，１８０，８１０参照）。
a. Cohn−Oncley(コーン−オンクレー)法
血漿からの免疫グロブリンの常套的産業的精製法は、最初にCohnが用い、Oncleyが改良した零度以下の温度で特定のアルコール濃度でその等電点に基づいてタンパク質群を共沈殿させる冷エタノール分画法に基づく（例えば、Cohn et al.(１９４６)J. Am. Chem. Soc. ６８：４５９−７５；Oncley et al.(１９４９)J. Am. Chem. Soc. ７１：５４１−５０参照）。精製プロセスでアルコールを用いると、汚染している可能性があるウイルスを不活化することができるが、温度とアルコール濃度を増加させるとCohn−Oncley法はタンパク質の変性と凝集を生じうる。この高分子量形は、補体を自由に固定する能力を有する抗体-抗原複合体として作用しうる。
b. 修正Cohn−Oncley工程
Cohn−Oncley法の望ましくない効果を防ぐため、IGの製造および精製のための修正Cohn−Oncley法が開発された。種々のそのような方法は、既知であり、本発明のIG製剤を製造するために適合させ改良することができる。当該分野で知られ利用可能な詳細な方法に照らしてIG製剤を製造することは当該分野の技術の範囲内である。
典型的には、IGは一次冷エタノール分画法および以下のものを含む第2分画法を用いて製造される：例えば、あらゆる1またはそれ以上の低抗補体（ACA）の生成物を得るための下記工程：常套的技術によるIG凝集物の分離、例えば超遠心分離または排除クロマトグラフィ；アルコール化、アルキル化、スルホン化、および還元剤による処理によるIG分子の化学修飾(例えば、米国特許６，８７５，８４８参照）；ペプシン、プラスミン、および固定化トリプシンの存在下または非存在下で穏やかな酸性ｐＨ（ｐＨ４.０）でインキュベーション；エチレングリコールポリマーによるヒト血漿の分画化（Polson et al.(１９６４)Biochim. Biophys. Acta. ８２：４６３−４７５）、Cohn分画法から分離した物質に精製剤としてポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を組み入れ（分画IIまたはII + III、例えば米国特許No. ４，０９３，６０６および４，１６５，３７０参照）、ポリエチレングリコールを沈殿剤として用いる分画法、および米国特許No. ４，０９３，６０６、４，１２６，６０５、３，９６６，９０６、および４，１２４，５７６に記載の他の技術、およびポリエチレングリコールを用いる精製プロセスの他の同様な方法（EP ０２４６５７９）；B−プロピオラクトン処理；イオン交換クロマトグラフィにてＩＧ製剤を得るのに用いた出発物質から望ましくない汚染物質を除去(例えば、米国特許No. ３，８６９，４３６、EP ９１３００７９０ and WO ９４／２９３３４参照）。EP ０４４０４８３は、イオン交換クロマトグラフィおよび弱酸性pHでのディアフィルトレーション；酵素開裂；溶媒／界面活性剤処理；およびディアフィルトレーションおよび限外濾過に基づく、該生成物を静脈内用に調製するのを容易にするのに有用な技術の組み合わせを記載している。他の方法も当該分野で記載され、当業者に知られている（例えば、米国特許５，１７７，１９４および６，８７５，８４８参照）。
通常、精製したCohn分画IIを用いる。出発Cohn分画IIペーストは、典型的には約95％IgGであり、4つのIGサブタイプも含む。種々のサブタイプが、それらが得られるプールヒト血漿中とほぼ同じ割合で分画II中に存在する。分画IIをさらに精製し、次いで製剤化して投与可能な製品とする。例えば、分画IIを冷精製水性アルコール溶液に溶解し、次いで不純物を沈殿および濾過により除去することができる。最終濾過後、免疫グロブリンサスペンジョンを透析またはディアフィルトレーションして(例えば、分画分子量(nominal molecular weight limit)が１００，０００ダルトンまたはそれ以下の限外濾過膜を用いる)アルコールを除去することができる。該溶液を濃縮または希釈して目的とするタンパク質濃度を得、これをさらに当業者によく知られた技術により精製することができる。
c. ウイルス処理
ＩＧ製剤を処理してウイルス負荷を除去すべきである。ウイルス処理には、ウイルスの不活化とウイルス分割または除去の二つの方法がある。ウイルスの不活化は、例えば、脂質またはタンパク質コートを化学変化させるか、またはウイルスを完全に変性させることによりウイルスを不活性にする。ウイルス不活化の例には、限定されるものではないが、加熱(殺菌)、溶媒／界面活性剤(S／D）処理、および酸環境(低pH)への暴露が含まれる。S／D処理は、脂質コートを含むウイルスを不活化するのに用いる血漿産業で最も広く用いられているウイルス不活化法である。例えば、S／D処理は、VSV(水疱性口内炎ウイルス）、シンドビス(Sindbis)ウイルス、HIV、HBV(Ｂ型肝炎ウイルス）、およびHCV(C型肝炎ウイルス）に対して殺ウイルス作用があることがわかっている。ウイルス除去は、試料から全てのウイルスを完全に除去する方法である。ウイルス分割または除去の例には、限定されるものではないが、冷エタノール分画法、相分割またはＰＥＧ 沈殿、アフィニティクロマトグラフィ、イオン交換もしくはゲル排除クロマトグラフィ、およびナノ濾過が含まれる。
d. タンパク質濃度
免疫グロブリンは種々の濃度で製造することができる。例えば、ＩＧ以下の範囲のタンパク質濃度で製造することができる：ちょうどまたは約３〜２５％ ＩＧ、典型的にはちょうどまたは約１０％〜２２％、例えば１０％〜２０％ｗ／ｖ。例えば、ＩＧ製剤は、ちょうどまたは約１８％〜２２％ＩＧw／vでありうる。本発明のＩＧ製剤は、一般的には以下のIG濃度で製造される：ちょうどまたは約１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％またはそれ以上。最終タンパク質濃度は、生成および精製方法に大きく左右される。本明細書において、あらゆる免疫グロブリン調製物をヒアルロニダーゼを含む安定な共製剤に用いることができると予期される。本明細書において安定な共製剤中に含まれるIGの適切な濃度を経験的に決定することは当業者の水準内である。IG製剤の選択は、種々の因子、例えば投与経路、治療する患者、および治療する病状のタイプに依存するだろう。
例えば、あらゆる既知または存在するIG調製物を用いることができる。これには、典型的にはIV投与に用いるIG調製物(IVIG)が含まれる。一般的には、静脈内投与用の最終IG製剤のタンパク質濃度は、約３〜１２％ｗ／ｖ、典型的には１０％ｗ／ｖである。例えば、ＩＶＩＧは以下の製品として市販されている：Carimune(登録商標)NF、Flebogamma(登録商標)５％、Gammagard(登録商標)Liquid、Gammagard(登録商標)S／D、Gamunex(登録商標)、Iveegam(登録商標)EN、Octagam(登録商標)、およびPolygam(登録商標)S／D。典型的には、そのような製剤には冷アルコール分画法を用いるが、免疫グロブリンの単離および精製方法と潜在的ウイルス汚染を減らす方法が異なる。
さらに、筋肉内または皮下投与用に現在製剤化されている他の調製物を本明細書に記載の組成物および方法に用いることができる。例えば、筋肉内投与および皮下投与用のIG製剤は、それぞれGamaSTAN(登録商標)S／DおよびVivaglobin(登録商標)として市販されている。 典型的には、そのような製剤にはヒト血漿からの冷エタノール分画法を用い、そのＩｇＧ濃度はそれぞれ約１５〜１８％または１０〜２２％である。米国仮出願No. ６１／１８１，６０６は、皮下投与用のプール血漿からの高度に精製および濃縮された免疫グロブリン組成物の生成について記載している。
e. ＩＧ製剤の例
i. １０％ＩＧ
ＩＧ製剤の例には、IgGサブクラスの分布が正常血漿と同様である液体非修飾IgG製剤である静脈注射用免疫グロブリン（ヒト）１０％(ＩＶＩＧ、１０％、Gammagard(登録商標)液(Baxter Healthcare Corporation）として市販されている)がある。該製剤は完全なFc(結晶可能断片）およびFab(抗原結合断片）領域を含む。該製剤は、１００ｍｇ／ｍＬ タンパク質を含み、その少なくとも９８％はＩｇＧであり、ＩｇＡは３７μg／ｍＬの濃度で存在し、ＩｇＭは微量だけ存在する。該製剤は、生理学的重量オスモル濃度と同様の重量オスモル濃度を有し、糖、ナトリウム、または保存料などの添加物を含まない。該製剤は、ｐＨ４.６〜５.１で安定化させるためにグリシンを用いて製剤化される。製造プロセスでは、修正Cohn−Oncley冷アルコール分画法を用い、さらに弱陽イオン交換クロマトグラフィおよび弱陰イオン交換クロマトグラフィを用いる連続プロセスによりさらに精製される。製造プロセスには、以下の3つの独立したウイルス不活化または除去工程が含まれる：溶媒／界面活性剤(S／D）処理、ナノ濾過、および低pHおよび上昇した温度でのインキュベーション。１０％ ＩＶＩＧ製剤の製造は実施例1に記載している。
ii. 高濃度ＩＧ製剤(例えば２０％ＩＧ）
高濃度免疫グロブリン製剤の製造は、米国仮出願No. ６１／１８１，６０６に記載されている。１８〜２２％ ＩＧを含む製剤の例は、下記実施例に示すｐＨ４.４〜４.９の０.２５ｍＭ グリシン中で製剤化された高度精製等張液体免疫グロブリン製剤(少なくとも ９５％ ＩｇＧ）がある。
本明細書に記載の高濃度IgG生成物は、伝統的ＩＶＩＧ製剤（例えば１０％ ＩＧ）の製造方法と同一または同様の多くの工程により生成される。さらなる工程、オープンチャンネル膜を用いる限外濾過／ディアフィルトレーション、および製造プロセスの終わり近くに特に設計された後洗浄および製剤化により、収量や保存安定性に影響を与えずに最新のIVIG(例えばGammagard Liquid）に比べてタンパク質濃度が約2倍高い（２００ｍｇ／ｍＬ）IG組成物が得られる。ほとんどの市販の限外濾過膜を用いても主要タンパク質の損失なしに２００ｍｇ／ｍＬ のＩｇＧ濃度に達することはできない。これらの膜は早く詰まるので適切な後洗浄を行うのが難しい。したがって、オープンチャンネル膜構成(configuration)を用いる必要がある。さらに、特に設計された後洗浄工程を用いて著しいタンパク質損失なしに(損失は2％以下)必要なIG濃度が得られ、２００ｍｇ／ｍＬのより高いタンパク質濃度は、低pH保存工程のウイルス不活化能力に影響を与えない。
高濃度IG組成物の一般的製造プロセスは、実施例2にさらに詳述する下記工程を含む。最初に予め凍結した血漿から寒冷沈降物を分離して、液体の「寒冷沈降物に乏しい(cryo-poor)血漿」を得、これを次の工程で処理して上清を得る(または分画法I)。pHとエタノール濃度を典型的にはそれぞれ7および２０〜２５％ v／vに調整し、次いで低温度でさらに遠心分離して液体と固体を分離する。次に、この工程から得られる沈殿物を抽出し、ヒュームドシリカと混合し、次いで濾過するが、全ての工程を低温、典型的には2〜8℃で行う。次に、濾液を2〜8℃で撹拌しながらポリソルベート−８０および無水クエン酸ナトリウムと混合する。次に、Cohn IIの沈殿工程と同様な方法で沈殿物Gを得、pHとアルコール濃度を調整する。沈殿物Gを溶解し、次いで名目ポササイズ０.２μmのデプスフィルター（例えばCuno VR０６フィルターまたは等価物）で濾過して透明な濾液を得る。次に、典型的には１.０％(v／v)Triton X−１００、０.３％(v／v)Tween−８０、および０.３％(v／v)TNBPを用い、１８〜２５℃で少なくとも６０分間溶媒／界面活性剤処理し、次いで陽イオン交換クロマトグラフィ、陰イオン交換クロマトグラフィ、およびAsahi Planova ３５Nフィルターまたは等価物を用いるナノ濾過を行う。ナノ濾過後、濾液を限外濾過でタンパク質濃度５±１％ｗ／ｖに濃縮する。ある例としては、限外濾過は、オープンチャンネルスクリーンを付けたカセットを用いて行い、限外濾過膜の名目分子量カットオフ（NMWCO）は５０ｋＤａまたはそれ以下である。限外濾過工程が完結したら、濃縮物を低pHの０.２５Mグリシン溶液でディアフィルトレーションする。典型的には、最小交換容量は元の濃縮物の容量の6倍であり、該溶液は２０％ｗ／ｖ以上のタンパク質濃度に濃縮される。ディアフィルトレーションおよび濃縮プロセスの終了時の溶液のpHは典型的には４.４〜４.９である。次に、製剤化するために、溶液のタンパク質濃度をディアフィルトレーション緩衝液を用いて２０％ｗ／ｖよりわずか上、例えば２０.４±０４％ｗ／ｖに調整する。製剤化したバルク溶液を最初に絶対ポアサイズ０.２ミクロンまたはそれ以下の膜フィルターで濾過してさらに滅菌する。次に、該溶液を最終容器に無菌的に分注して適切に密封し、試験用の試料を得る。最終工程では密封容器を30〜32℃で長期間、例えば２１〜２２日間保存する。
製造プロセスに限外濾過および製剤化工程を組み込むと、以前に用いられたIG精製法や濃縮法より改善がみられ、最終製剤を低pHに維持したままで有意なIG活性の損失なしに高いIG濃度の製剤が得られる。典型的には、該製剤は、そのタンパク質濃度が少なくとも１８％(重量／容量（w／v）)であり、その大部分(典型的には95％以上)がＩｇＧである。pHはｐＨ３〜６の範囲であり、血漿中に存在しうるウイルスのような病原体の不活化を促す。高IG濃度により投与容量が減少するので高濃度調製物は皮下投与に適している。ある態様において、IG製剤は、１８mパスカル/秒以下の粘度を有し、静脈内投与にも適していることがある。希釈するだけでも静脈内投与できることもある。
２. 保存安定性
最後に、精製IG製剤は、IGの活性を保持し、過剰な凝集を避けるように製造する必要がある。IG製剤を保存すると、例えばタンパク質安定化賦形剤を添加し、溶液のpHを調整することにより、凝集を最小限にし、安定性を改善することができる。
a. タンパク質安定化賦形剤
当該分野でよく知られているIG製剤の安定性を増大させる方法は、IG製剤にタンパク質安定化賦形剤を加えることである。既知の賦形剤には、限定されるものではないが、糖、ポリオール、アミノ酸、アミン、円、ポリマー、および界面活性剤がある。例えば、米国特許４，４９９，０７３には保存溶液のイオン強度およびpHの結果としての安定化が記載され、日本国特許５４０２０１２４には、筋肉内注射用製剤へのアミノ酸の添加は製剤の保存安定性および安全性をもたらすことが記載され、JP５７０３１６２３およびJP５７１２８６３５には、５〜１５％ＩＧ製剤へのアルギニンおよび／またはリジンおよびＮａＣｌの使用は筋肉内注射用製剤の長期間安定性をもたらすことが記載され；JP ４３４６９３４は、低伝導率(１mmho以下）、ｐＨ５.３〜５.７、および所望により1またはそれ以上の安定化剤(ＰＥＧ，ヒト血清アルブミン、およびマンニトールを含む)の使用を開示し；US ４，４３９，４２１は、親水性高分子、ポリオール、および抗補体発生に対して安定させる別のタンパク質の添加を開示し；US ５，９４５，０９８は、アミノ酸（０.１〜０.３Mグリシン）および非イオン性界面活性剤（ポリソルベートおよびＰＥＧ）の添加による等張溶液の安定化を開示し；US ４，１８６，１９２は、アミノ酸を含む種々の添加剤を開示し；WO ２００５／０４９０７８は、マルトースおよびさらにグリシン(0.1M)による安定化を開示し；US ４，３６２，６６１は、中性および塩基性アミノ酸を用いる５％ＩＧ製剤の安定化について開示している。安定な液体製剤は、非常に低いイオン強度およびｐＨ４.２５(米国特許No. ４，３９６，６０８）または弱酸性ｐＨ５〜６（EP ０２７８４２２）の水性媒質中の炭水化物を用いて製造することもできる。
IG製剤の二量体形成も調節することができる。例えば、米国特許No. ５，８７１，７３６は、二量体形成に対する1またはそれ以上の両親媒性安定化剤を含むIG製剤、特に液体製剤を開示している。両親媒性安定化剤は、ニコチン酸およびその誘導体、特にニコチンアミドを、主として非荷電の脂溶性側鎖を有するアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、メチオニン，ロイシン、イソロイシン、プロリン、およびバリンと共に含む。
b. ｐＨ
ＩＧ製剤は、例えば本明細書に記載の当該分野で知られた方法により製造することができる。しかしながら、一般的には最終製剤のpHは比較的高いpH、すなわち約ｐＨ４.０〜７.４の範囲に調整される。免疫グロブリン製剤のpHは最終産物のIgG含有量に対して重要な因子であることがわかった。一般的には、5％免疫グロブリン製剤のpHは４.２±０.５である。10％製剤はｐＨ５.２±０.２で最も安定である。最適pHは当業者によく知られた製剤技術により得られる。例えば、最適pHは、種々のpH条件下での種々の製剤の熱安定性データおよび抗補体価、およびサイズ排除クロマトグラフィ測定値から決定することができる。
D. ヒアルロニダーゼ
本発明は、免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼ、典型的には可溶性ヒアルロニダーゼを含む安定な共製剤を提供する。ヒアルロニダーゼは、細胞内マトリックスの必須成分であり、間質障壁の主要構成要素であるヒアルロン酸を分解する酵素の大きなファミリーのメンバーである。間質障壁の主要構成要素のヒアルロン酸の加水分解を触媒することにより、ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、組織の透過性を増大させる。したがって、ヒアルロニダーゼは、例えば分散と送達を増大させる他の物質、薬剤、およびタンパク質と組み合わせて拡散もしくは分散剤として用いられる。本発明の共製剤中のヒアルロニダーゼの活性の例には可溶性ヒアルロニダーゼがある。
ヒアルロニダーゼには大きく以下の3つのクラスがある；哺乳類ヒアルロニダーゼ、細菌ヒアルロニダーゼ、およびヒル、他の寄生生物および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ。
哺乳類型ヒアルロニダーゼ（EC ３.２.１.３５）は、ヒアルロナンのβ１→４グリコシド結合を加水分解して種々の長さのオリゴ糖、例えば4糖類および6糖類にするエンド−β−N−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。該酵素は加水分解活性とトランスグリコシダーゼ活性の両方を持ち、ヒアルロナンとコンドロイチン硫酸(CS)、一般的にはC４−SおよびC６−Sを分解することができる。この種のヒアルロニダーゼには、限定されるものではないが、乳牛（ウシ）（アミノ酸配列番号：１０および１１）、マウス（アミノ酸配列番号：１７−１９、３２）、ブタ（アミノ酸配列番号：２０−２１）、ラット（アミノ酸配列番号：２２−２４、３１）、ウサギ（配列番号：２５）、ヒツジ（ヒツジ）（アミノ酸配列番号：２６ and ２７）、オランウータン（配列番号：２８）、カニクイザル（配列番号：２９）、モルモット（配列番号：３０）由来のヒアルロニダーゼ、およびヒトヒアルロニダーゼが含まれる。
ほ乳類ヒアルロニダーゼは、さらに、主に精巣抽出物にみられる中性で活性なものと主に肝臓などの器官でみられる酸で活性なものに細分することができる。中性で活性なヒアルロニダーゼの例には、限定されるものではないが、ヒツジ(配列番号：２７）、ウシ(配列番号：１１）、およびヒト（配列番号：１）などの種々の種由来のＰＨ２０を含むＰＨ２０が含まれる。ヒトＰＨ２０（SPAM１または精子表面タンパク質ＰＨ２０としても知られる）は、一般的にはグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーを介して原形質膜と結合している。該ＰＨ２０は、天然には精子と卵の付着、およびヒアルロン酸の消化により卵丘細胞の層の精子による酸浸透に関与する。
ヒトＰＨ２０（SPAM１ともいう）に加えて、以下の5つのヒアルロニダーゼ様遺伝子がヒトゲノムで同定されている：HYAL１、HYAL２、HYAL３、HYAL４、およびHYALP１。HYALP１は偽遺伝子であり、HYAL３（配列番号：３８）はいかなる既知の基質に対する酵素活性も示されていない。HYAL４（配列番号：３９で示される前駆体ポリペプチド）は、コンドロイチナーゼであり、ヒアルロナンに対する活性はほとんど無い。HYAL１（配列番号：３６で示される前駆体precursor ポリペプチド）は典型的酸活性酵素であり、ＰＨ２０（配列番号：１で示される前駆体ポリペプチド）は典型的中性活性酵素である。酸活性ヒアルロニダーゼ、例えばHYAL１およびHYAL２（配列番号：３７で示される前駆体ポリペプチド）は、一般的には中性pH(すなわちpH7)で触媒活性がない。例えば、HYAL１は、ｐＨ４.５以上ではin vitroで触媒活性がほとんどない（Frost et al.(１９９７)Anal. Biochemistry、２５１：２６３−２６９）。HYAL２は、in vitroでの特異活性が非常に低い酸活性酵素である。ヒアルロニダーゼ様酵素は、一般的にヒトHYAL２およびヒトＰＨ２０などのグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを介して原形質膜と結合するもの（Danilkovitch−Miagkova et al.(２００３)Proc Natl Acad Sci USA. １００（８）：４５８０−５）、および一般的にヒトHYAL１などの可溶性のもの（Frost et al.，(１９９７)Biochem Biophys Res Commun. ２３６（１）：１０−５）によって特徴づけることもできる。
１. ＰＨ２０
ＰＨ２０は、他のほ乳類ヒアルロニダーゼのように、ヒアルロン酸のβ１→４グリコシド結合を加水分解して種々の長さのオリゴ糖、例えば4糖類および6糖類にするエンド−β−N−アセチル−ヘキソサミニダーゼである。該酵素は加水分解活性とトランスグリコシダーゼ活性の両方を持ち、ヒアルロン酸とコンドロイチン硫酸、例えばC４−SおよびC６−Sを分解することができる。該ＰＨ２０は、天然には精子と卵の付着、およびヒアルロン酸の消化により卵丘細胞の層の精子による酸浸透に関与する。ＰＨ２０は精子表面、およびリソゾーム由来アクロソーム(内部アクロソーム膜と結合する)に位置する。原形質膜ＰＨ２０は、中性pHでのみヒアルロニダーゼ活性を有するが、内部アクロソーム膜ＰＨ２０は、中性および酸pHの両方で活性である。ヒアルロニダーゼであるのに加え、ＰＨ２０は、HA誘導細胞シグナリングのレセプターおよび卵母細胞周囲の透明帯のレセプターでもあるようである。
ＰＨ２０タンパク質の例には、限定されるものではないが、ヒト(配列番号：１で示される前駆体ポリペプチド、配列番号：２で示される成熟ポリペプチド）、ウシ(アミノ酸配列番号：１１）、ウサギ（配列番号：２５）、ヒツジ ＰＨ２０(アミノ酸配列番号：２７）、カニクイザル（配列番号：２９）、モルモット（配列番号：３０）、ラット（配列番号：３１）、およびマウス（配列番号：３２)ＰＨ２０ポリペプチドが含まれる。ウシ ＰＨ２０は５５３アミノ酸の前駆体ポリペプチド（配列番号：１１）である。ウシＰＨ２０とヒトＰＨ２０のアラインメントは、わずかな同一性しか示さず、ウシ ポリペプチド中にGPIアンカーが存在しないことによりアミノ酸４７０〜各カルボキシ末端に複数のギャップが存在する（例えば、Frost GI(２００７)Expert Opin. Drug. Deliv. ４：４２７−４４０参照）。実際に、明確なGPIアンカーは、ヒト以外の他の多くのＰＨ２０種では予測されない。すなわち、ヒツジおよびウシ由来のＰＨ２０ポリペプチドは、天然には可溶性形で存在する。ウシ ＰＨ２０は、原形質膜と非常に緩く結合して存在するが、ホスホリパーゼ感受性アンカーを介して固定されない（Lalancette et al.(２００１)Biol Reprod. ６５（２）：６２８−３６）。ウシヒアルロニダーゼのこの独特な特徴は、臨床使用のための抽出物として可溶性ウシ精巣ヒアルロニダーゼ酵素を使用することを可能にした（Wydase(登録商標)、Hyalase(登録商標)）。
ヒトＰＨ２０mRNA転写物は正常に翻訳されて、N末端に35アミノ酸シグナル配列(アミノ酸残基1〜35位)およびC末端に19アミノ酸のグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカー結合シグナル配列(アミノ酸残基４９１〜５０９位)を含む５０９アミノ酸の前駆体ポリペプチド(配列番号：１）を生じる。従って成熟PH20は、 配列番号：２で示される４７４アミノ酸のポリペプチドである。前駆体ポリペプチドがERに運ばれ、シグナルペプチドが除去された後、C末端GPI結合シグナルペプチドは開裂し、配列番号：１で示される前駆体ポリペプチドの490位に対応するアミノ酸位置に新たに形成されたC末端アミノ酸にGPIアンカーが共有結合するのを促す。このように、配列番号：２で示されるアミノ酸配列を有する４７４アミノ酸のGPI固定成熟ポリペプチドが生成される。ハチおよび蜂蜜毒液ヒアルロニダーゼ、およびマウス、サル、およびモルモットＰＨ２０を含む他のヒアルロニダーゼに比べてヒトＰＨ２０は、５７の保存されたアミノ酸を含む340アミノ酸の共通領域を含む（例えば、Arming et al.(１９９７)Eur. J. Biochem.、２４７：８１０−８１４を含む）。該保存されたアミノ酸は、配列番号：２で示されるアミノ酸配列中のアミノ酸残基 ２５、１８９、２０３、および３１６にジスルフィド架橋を形成する4つのシステイン残基を含む(配列番号：１で示されるアミノ酸配列中の残基 ６０、２２４、２３８、および３５１に対応する）。システイン残基 C６０とC３５１およびC２２４どC２３８にジスルフィド結合が形成され、コアヒアルロニダーゼドメインが形成される。しかしながら、配列番号：１のアミノ酸３６〜４６４が最小限活性なヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼドメインを含むために中性酵素触媒活性のためにカルボキシ末端にさらなるシステインが必要である。配列番号：１に示すポリペプチドのシステイン残基 C３７６とC３８７、C３８１とC４３５、C４３７とC４４３、およびC４５８とC４６４の間にさらに4つのジスルフィド結合が形成される(それぞれ配列番号：２で示される成熟ポリペプチドの残基C３４１とC３５２、C３４６とC４００、C４０２とC４０８、およびC４２３とC４２９の間に対応する）。
さらに、他の保存された残基は、基質の結合および触媒作用に関与するようである。配列番号：２の残基に対応するアミノ酸位１１１、１１３、１７６、２４９、および２５２のアミノ酸残基は、これらの位置の突然変異では、突然変異を含まない野生型ＰＨ２０に比べて酵素活性が消失するかまたはわずかな活性が残るのみであるので、PH20の活性に関与するようである（例えば、Arming et al.(１９９７)Eur. J. Biochem.、２４７：８１０−８１４参照）。
配列番号：１に示すヒトPH20の N８２、N１６６、N２３５、N２５４、N３６８、N３９３、N４９０に7つの潜在的N結合グリコシル化部位がある。システイン残基 C６０とC３５１、およびC２２４とC２３８の間にジスルフィド結合が形成され、コアヒアルロニダーゼドメインが形成される。配列番号：１のアミノ酸３６〜４６４は、最小限の活性ヒトＰＨ２０ ヒアルロニダーゼドメインを含むので、N結合グリコシル化部位N490は適切なヒアルロニダーゼ活性には必要でない。
２. 可溶性ヒアルロニダーゼ
一般的には、本発明の安定な共製剤中のヒアルロニダーゼは可溶性ヒアルロニダーゼである。可溶性ヒアルロニダーゼは、細胞中で発現すると培地中に分泌される。溶解性は、該タンパク質をTriton X−１１４溶液の水性相に分配することにより証明することができる。したがって、可溶性ヒアルロニダーゼは、該ポリペプチドを細胞膜に結合させるGPIアンカーを含むいかなるヒアルロニダーゼも含まないと理解される。例えば、完全長ヒトＰＨ２０（成熟形を配列番号：２に示す）は、GPIアンカーアンカーを含み、可溶性ではない。反対に、ウシおよびヒツジＰＨ２０ ポリペプチドは、GPIアンカーとの結合に十分であるGPIアンカーを含まず、可溶性タンパク質であると考えられる。さらに、本発明の共製剤中に含まれる可溶性ヒアルロニダーゼは、一般的には実質的に精製されたタンパク質である。また、可溶性ヒアルロニダーゼはヒアルロニダーゼ活性を保持する。例えば、可溶性ヒトＰＨ２０は中和活性を保持する。
可溶性ヒアルロニダーゼは、天然にGPIアンカーまたは膜と結合するのに充分なアンカーを含まないヒアルロニダーゼを含み、これには限定されるものではないが、Hyal１、ウシ ＰＨ２０、およびヒツジ ＰＨ２０、そのアレル変異体、および他の変異体が含まれる。可溶性ヒアルロニダーゼには、可溶性であるように修飾されたあらゆるヒアルロニダーゼがある。例えば、正常にはGPIアンカーを介して膜に固定されているヒトＰＨ２０を、C末端のGPIアンカーのすべてまたは部分を切断または除去することにより可溶性にすることができる。可溶性ヒアルロニダーゼは、中性活性および酸活性ヒアルロニダーゼも含むが、中性活性ヒアルロニダーゼは皮下投与のために本発明において使用することが予期される。
すなわち、可溶性ヒアルロニダーゼの例には、例えば、アミノ酸配列番号：１、２、１１、２５、２７、３０、３１、および３２のいずれかに記載のあらゆる種由来のＰＨ２０、または該ヒアルロニダーゼが可溶性であり、ヒアルロニダーゼ活性を保持する限り、C末端GPIアンカーのすべてまたは部分を欠くその切断形がある。可溶性ヒアルロニダーゼには、アミノ酸配列番号：１、２、１１、２５、２７、３０、３１、および３２のいずれかの可溶性形のアレル変異体もしくは他の変異体、例えばその切断形も含まれる。アレル変異体および他の変異体は当業者に知られており、これにはアミノ酸配列番号：１、２、１１、２５、２７、３０、および３１のいずれかと６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチド、またはその切断形が含まれる。典型的には、本発明の共製剤は可溶性ヒトＰＨ２０を含む。他の動物由来のＰＨ２０が利用可能であるが、そのような調製物は動物タンパク質であるので潜在的に免疫原性である。例えば、かなりの割合の患者に、摂取した食物に対する二次的な過去の感作がみられ、該食物は動物タンパク質であるから、すべての患者に二次感作のリスクがある。すなわち、非ヒト調製物は慢性使用に適さないかもしれない。非ヒト調製物を望む場合は、本明細書ではそのようなポリペプチドの免疫原性を減少させるように製造することができると予期される。そのような修飾は当業者の水準内である。
a. 可溶性ヒトＰＨ２０
可溶性ヒアルロニダーゼの例には可溶性ヒトＰＨ２０がある。可溶性形の組換えヒトＰＨ２０を製造し、本明細書に記載の共製剤中に含ませることができる。そのような可溶性形のPH20の製造方法は、米国特許出願Nos. ２００５−０２６０１８６および２００６−０１０４９６８に記載されている。可溶性形には、限定されるものではないが、アミノ酸配列番号１に記載のアミノ酸配列のポリペプチド、またはアミノ酸1〜464を含むポリペプチドを生じるC末端切断を有するものが含まれる。例えば、可溶性形には、限定されるものではないが、アミノ酸１からアミノ酸４６７〜４８３(例えば、４６７、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、および４８３)までを含むポリペプチドを生じるC末端切断を有するものが含まれる。哺乳動物細胞中で発現する場合は、３５アミノ酸N末端シグナル配列がプロセシング中に開裂し、成熟形の該タンパク質が分泌される。すなわち、成熟可溶性ポリペプチドは配列番号：１の少なくともアミノ酸３６〜４６４を含む。例えば、成熟ポリペプチドは配列番号：１のアミノ酸３６〜４６７から３６〜４８３まで、例えば、配列番号：１のアミノ酸３６〜４６７、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、および４８３を含む。アミノ酸位４７７〜４８３（配列番号：１に示す前駆体ポリペプチドに対応する）で終わる欠失突然変異は、完全長GPI固定形より高い分泌ヒアルロニダーゼ活性を有する。したがって、可溶性ヒアルロニダーゼの例には、アミノ酸配列番号：４−９のいずれかに記載しているような長さ４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、または４４７アミノ酸のもの、またはそのアレルもしくは種変異体、または他の変異体がある。
b. 組換え可溶性ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０）
組換え可溶性形のヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０で表す)が生成され、本明細書に記載の方法を用いて製造および精製することができる。そのような可溶性形のｒＨｕＰＨ２０の生成は、米国特許出願No. １１／０６５，７１６および１１／２３８，１７１（米国特許出願公開公報No. US２００５０２６０１８６およびUS ２００６０１０４９６８）、および下記実施例3に記載されている。そのようなポリペプチドの例には、配列番号：３に記載のアミノ酸１−４８２をコードする核酸分子から生成されるものがある。翻訳後プロセシングは３５アミノ酸シグナル配列を除去し、４４７アミノ酸の可溶性ｒＨｕＰＨ２０（配列番号：４）の分泌をもたらす。得られる精製ｒＨｕＰＨ２０は、生成および精製時に培養液中に存在するペプチダーゼにより異種性でありうる。典型的には、ｒＨｕＰＨ２０は、活性を保持するために正しいN−グリコシル化を促す細胞、例えばCHO細胞（例えばDG４４CHO細胞）中で生成される。
３. グリコシル化
あるヒアルロニダーゼのNおよびO結合グリコシル化を含むグリコシル化は、その触媒活性と安定性に非常に重要でありうる。糖タンパク質を修飾するグリカンの形の変化は、タンパク質の抗原性、構造的フォールディング、可溶性、および安定性に顕著な影響を及ぼしうるが、ほとんどの酵素において、最適な酵素活性のためにグリコシル化が必要であるとは考えられていない。そのようなヒアルロニダーゼは、これに関して、N結合グリコシル化の除去がヒアルロニダーゼ活性のほぼ完全な不活化をもたらしうる点で独特である。そのようなヒアルロニダーゼにおいてN結合グリカンの存在は活性酵素を生じるために重要である。
N結合オリゴ糖は、種々の主要な型（オリゴマンノース、複合体、ハイブリッド、硫酸化型）に分類され、それらすべてが−Asn−Xaa−Thr／Ser−配列（ここで、XaaはProではない）に属するAsn残基のアミド窒素を介して結合した（Man）３−GlcNAc−GlcNAc−コアを有する。−Asn−Xaa−Cys−部位のグリコシル化は凝固プロテインCで報告された。例えば、該ヒアルロニダーゼは、Nグリコシド結合およびOグリコシド結合の両方を含むことができる。例えば、ＰＨ２０は、O結合オリゴ糖およびN結合オリゴ糖を含む。配列番号：１で示されるヒトＰＨ２０のN８２、N１６６、N２３５、N２５４、N３６８、N３９３、N４９０に7つの潜在的N結合グリコシル化部位がある。上記の通り、N490のN結合グリコシル化はヒアルロニダーゼ活性に必要ではない。
４. ヒアルロニダーゼの修飾によるその薬力学的特性の改善
該共製剤において提供されるヒアルロニダーゼを修飾して、in vivoの半減期および/または活性を増加させるなど、薬力学的特性を改善することができる。本発明の共製剤に用いるヒアルロニダーゼの修飾には、直接的またはリンカーを介する間接的結合(例えば共有結合または他の安定な結合による)、ポリマー、例えばデキストラン、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ化（ＰＥＧ））もしくはシアリル部分、または他のそのようなポリマー、例えば天然もしくは糖ポリマーが含まれる。
治療薬のＰＥＧ化は、タンパク質分解に対する抵抗性を増加し、血漿中半減期を増大し、抗原性および免疫原性を減少させることが知られている。ポリマー分子、例えばポリエチレングリコール部分（ＰＥＧ）のヒアルロニダーゼとの共有結合もしくはたの安定な結合(コンジュゲーション)は、得られる酵素−ポリマー組成物に有益な特性をもたらし得る。そのような特性には、生体適合性の改善、対象の血、細胞および/または他の組織中のタンパク質(および酵素活性)半減期の延長、プロテアーゼおよび加水分解からの該タンパク質の効果的な保護、生体分布の改善、薬物動態および/または薬力学の向上、および水溶性の増加が含まれる。
ヒアルロニダーゼと結合することができる典型的ポリマーには、天然および合成ホモポリマー、例えばポリオール（すなわち、ポリ−OH）、ポリアミン（すなわち、ポリ−NH２）、およびポリカルボキシル酸（すなわち、ポリ−COOH）、およびさらなるヘテロポリマー、すなわち、1またはそれ以上の異なるカップリング基、例えばヒドロキシル基およびアミン基を含むポリマーが含まれる。安定なポリマー分子の例には以下から選ばれるポリマー分子が含まれる：ポリアルキレンオキシド（PAO）、例えば、ポリアルキレングリコール（PAG）(ポリプロピレングリコール(ＰＥＧ）、メトキシポリエチレングリコール(mＰＥＧ）、およびポリプロピレングリコールを含む)、ＰＥＧ−グリシジルエーテル(Epox−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(CDI−ＰＥＧ）分枝ポリエチレングリコール(ＰＥＧs）、ポリビニルアルコール(PVA）、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン、ポリ−D，L−アミノ酸、ポリエチレン−コ−マレイン酸無水物、ポリスチレン−コ−マレイン酸無水物、デキストラン(カルボキシメチルデキストランを含む)、ヘパリン、ホモローガスアルブミン、セルロース(メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース カルボキシエチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロースを含む)、キトサンの加水分解物、デンプン(例えばヒドロキシエチルデンプンおよびヒドロキシプロピルデンプン)、グリコーゲン、アガロースおよびその誘導体、グアーガム、プルラン、インスリン、キサンタンガム、カラギーナン、ペクチン、アルギン酸加水分解物、およびバイオポリマー。
典型的には、該ポリマーは、ポリアルキレンオキシド（PAO）、例えばポリエチレンオキシド、例えばＰＥＧ、典型的にはmＰＥＧがあり、これらは多糖、例えばデキストラン、プルランなどに比べて架橋することができる数個の反応基を有する。典型的には、該ポリマーは、比較的簡単な化学を用いてヒアルロナンを分解する酵素と共有結合させることができる(例えば該タンパク質表面上の結合基と)非毒性ポリマー分子、例えば（m）ポリエチレングリコール(mＰＥＧ）がある。
ヒアルロナン分解酵素に結合するのに適したポリマー分子には、例えば、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ）、およびＰＥＧ誘導体、例えばメトキシ−ポリエチレングリコールs(mＰＥＧ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル(Epox−ＰＥＧ）、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール(CDI−ＰＥＧ）、分枝ＰＥＧ、およびポリエチレンオキシド（PEO）（例えば、Roberts et al.、Advanced Drug Delivery Review ２００２、５４：４５９−４７６；Harris and Zalipsky、S(編)「Poly（ethylene glycol）、Chemistry and Biological Applications」 ACS Symposium Series ６８０、１９９７；Mehvar et al.、J. Pharm. Pharmaceut. Sci.、３（１）：１２５−１３６、２０００；Harris、Nature Reviews ２：２１５ et seq.(２００３）；およびTsubery、J Biol. Chem ２７９（３７）：３８１１８−２４、２００４参照）。該ポリマー分子は、典型的には分子量が約３ｋＤａ〜約６０ｋＤａでありうる。ある態様において、ｒＨｕＰＨ２０のようなタンパク質と結合するポリマー分子の分子量は、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０ｋＤａ、またはそれ以上である。
ＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体と共有結合(コンジュゲート)することによりポリペプチドを修飾する種々の方法（すなわち、「ＰＥＧ化」）が当該分野で知られている（例えば、U.S. ２００６／０１０４９６８；U.S. ５，６７２，６６２；U.S. ６，７３７，５０５；およびU.S. ２００４／０２３５７３４参照）。ＰＥＧ化の技術には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：特殊なリンカーおよび結合化学（例えば、Harris、Adv. Drug Deliv. Rev. ５４：４５９−４７６、２００２参照）、複数のPEG部分と単一結合部位との結合(例えば分枝PEGの使用による；例えばVeronese et al.、Bioorg. Med. Chem. Lett. １２：１７７−１８０、２００２参照）、部位特異的ＰＥＧ化 および／またはモノＰＥＧ化（例えば、Chapman et al.、Nature Biotech. １７：７８０−７８３、１９９９参照）、および部位指向性酵素的ＰＥＧ化（例えば、Sato、Adv. Drug Deliv. Rev.、５４：４８７−５０４、２００２参照）（例えば、Lu and Felix(１９９４)Int. J. Peptide Protein Res. ４３：１２７−１３８；Lu and Felix(１９９３)Peptide Res. ６：１４２−６、１９９３；Felix et al.(１９９５)Int. J. Peptide Res. ４６：２５３−６４；Benhar et al.(１９９４)J. Biol. Chem. ２６９：１３３９８−４０４；Brumeanu et al.(１９９５)J Immunol. １５４：３０８８−９５；Caliceti et al.(２００３)Adv. Drug Deliv. Rev. ５５（１０）：１２６１−７７、およびMolineux(２００３)Pharmacotherapy ２３(８ Pt ２）：３S−８Sも参照）。従来技術に記載の方法および技術は、単一タンパク質分子と結合した１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＰＥＧまたはＰＥＧ誘導体を有するタンパク質を製造することができる（例えば、U.S. ２００６／０１０４９６８参照）。多くのＰＥＧ化のための試薬が従来技術に記載されている。そのような試薬には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：N−ヒドロキシスクシニミジル(NHS）活性化ＰＥＧ、スクシニミジル mＰＥＧ、mＰＥＧ２−N−ヒドロキシスクシニミド、mＰＥＧ スクシニミジル α−メチルブタノエート、mＰＥＧ スクシニミジルプロピオネート、mＰＥＧ スクシニミジル ブタノエート、mＰＥＧ カルボキシメチル ３−ヒドロキシブタン酸 スクシニミジルエステル、ホモ二機能性ＰＥＧ−スクシニミジルプロピオネート、ホモ二機能性ＰＥＧプロピオンアルデヒド、ホモ二機能性ＰＥＧブチルアルデヒド、ＰＥＧマレイミド、ＰＥＧヒドラジド、p−ニトロフェニル−カーボネートＰＥＧ、mＰＥＧ−ベンゾトリアゾールカーボネート，プロピオンアルデヒド ＰＥＧ、mＰＥＧブチルアルデヒド、分枝mＰＥＧ２ブチルアルデヒド、mＰＥＧアセチル、mＰＥＧピペリドン、mＰＥＧ メチルケトン、mＰＥＧ 「無リンカー」マレイミド、mＰＥＧビニルスルホン、mＰＥＧチオール、mＰＥＧオルソピリジルチオエステル、mＰＥＧオルソピリジルジスルフィド、Fmoc−ＰＥＧ−NHS、Boc−ＰＥＧ−NHS、ビニルスルホンＰＥＧ−NHS、アクリレートＰＥＧ−NHS、フルオレセインＰＥＧ−NHS、およびビオチンＰＥＧ−NHS(例えば、Monfardini et al.、Bioconjugate Chem. ６：６２−６９、１９９５；Veronese et al.、J. Bioactive Compatible ポリマー １２：１９７−２０７、１９９７；U.S. ５，６７２，６６２；U.S. ５，９３２，４６２；U.S. ６，４９５，６５９；U.S. ６，７３７，５０５；U.S. ４，００２，５３１；U.S. ４，１７９，３３７；U.S. ５，１２２，６１４；U.S. ５，１８３，５５０；U.S. ５，３２４、８４４；U.S. ５，４４６，０９０；U.S. ５，６１２，４６０；U.S. ５，６４３，５７５；U.S. ５，７６６，５８１；U.S. ５，７９５、５６９；U.S. ５，８０８，０９６；U.S. ５，９００，４６１；U.S. ５，９１９，４５５；U.S. ５，９８５，２６３；U.S. ５，９９０、２３７；U.S. ６，１１３，９０６；U.S. ６，２１４，９６６；U.S. ６，２５８，３５１；U.S. ６，３４０，７４２；U.S. ６，４１３，５０７；U.S. ６，４２０，３３９；U.S. ６，４３７，０２５；U.S. ６，４４８，３６９；U.S. ６，４６１，８０２；U.S. ６，８２８，４０１；U.S. ６，８５８，７３６；U.S. ２００１／００２１７６３；U.S. ２００１／００４４５２６；U.S. ２００１／００４６４８１；U.S. ２００２／００５２４３０；U.S. ２００２／００７２５７３；U.S. ２００２／０１５６０４７；U.S. ２００３／０１１４６４７；U.S. ２００３／０１４３５９６；U.S. ２００３／０１５８３３３；U.S. ２００３／０２２０４４７；U.S. ２００４／００１３６３７；US ２００４／０２３５７３４；U.S. ２００５／０００３６０；U.S. ２００５／０１１４０３７；U.S. ２００５／０１７１３２８；U.S. ２００５／０２０９４１６；EP ０１０６４９５１；EP ０８２２１９９；WO ００１７６６４０；WO ０００２０１７；WO ０２４９６７３；WO ９４２８０２４；およびWO ０１８７９２５参照）。
E. 可溶性ヒアルロニダーゼおよびそれらのポリペプチドをコードする核酸の製造方法
本明細書に記載の可溶性ヒアルロニダーゼのポリペプチドは、タンパク質の精製および組換えタンパク質の発現のための当業者でよく知られた方法により得ることができる。目的とする遺伝子をコードする核酸を同定するための当業者に知られたあらゆる方法を用いることができる。当該分野で利用可能なあらゆる方法を用いて、細胞または組織供給源から完全長(すなわち、完全なコーディング領域を含む)cDNA、またはヒアルロニダーゼをコードするゲノムDNAクローンを得ることができる。修飾もしくは変異体可溶性ヒアルロニダーゼを、例えば部位指向性突然変異誘発により野生型ポリペプチドから操作することができる。典型的には、本発明の共製剤に用いるｒＨｕＰＨ２０などの可溶性ヒアルロニダーゼを含むヒアルロニダーゼは、組換えにより製造するか、または天然供給源、例えば精巣抽出物から精製もしくは部分精製することができる。
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するための当該分野で知られたあらゆる利用可能な方法を用いてクローニングまたは単離することができる。そのような方法には、核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体ベースのスクリーニング、および活性ベースのスクリーニングを含むライブラリーのスクリーニング、および核酸のPCR増幅が含まれる。
例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法を含む核酸の増幅方法を用いて目的とするポリペプチドをコードする核酸分枝を単離することができる。核酸を含む物質を、目的とするポリペプチドをコードする核酸分子を単離するための出発物質として用いることができる。例えば、DNAおよびmRNA調製物、細胞抽出物、組織抽出物、液体試料(例えば血液、血清、唾液)、健康および/または病的対象由来の試料を増幅法に用いることができる。核酸ライブラリーも出発物質の供給源として用いることができる。プライマーは、目的とするポリペプチドを増幅するために設計することができる。例えばプライマーは、目的とするポリペプチドを生成する発現配列に基づいて設計することができる。プライマーは、ポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅により生成した核酸分子をシーケンシングして、目的とするポリペプチドをコードすることを確認することができる。
さらなるヌクレオチド配列を、合成遺伝子をベクター(例えば、タンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質得DNA配列を増幅するために設計されたベクター)中にクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を含むリンカー配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列と結合することができる。さらに、機能的DNA要素を特定するさらなるヌクレオチド配列を、ポリペプチドをコードする核酸分子と機能的に(operatively)連結することができる。そのような配列の例には、限定されるものではないが、細胞内タンパク質発現を促すように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質の分泌を促進するように設計された分泌配列、例えばヘテロローガスなシグナル配列が含まれる。そのような配列は当業者に知られている。タンパク質結合領域を特定する塩基配列のようなさらなるヌクレオチド残基配列を酵素をコードする核酸分子と結合させることもできる。そのような領域には、限定されるものではないが、特定の標的細胞内への酵素の取り込みを促進するかまたは合成遺伝子の産物の薬物動態を変化させるタンパク質をコードするかまたは促進する残基の配列が含まれる。例えば、酵素はＰＥＧ部分と結合することができる。
さらに、タグまたは他の部分を、例えば該ポリペプチドの検出またはアフィニティ精製を助けるために加えることができる。例えば、さらなるヌクレオチド残基配列、例えばエピトープタグまたは他の検出可能なマーカーを特定する塩基の配列を酵素をコードする核酸分子と結合することができる。そのような配列の例には、Hisタグをコードする核酸配列(例えば、６xHis、HHHHHH；配列番号：５４）またはFlagタグ（DYKDDDDK；配列番号：５５）が含まれる。
次に、同定され単離された核酸を適切なクローニングベクターに挿入することができる。当該分野で知られた多数のベクター−宿主系を用いることができる。考えられるベクターには、限定されるものではないが、プラスミドまたは修飾ウイルスが含まれるが、ベクター系は、用いる宿主細胞と適合性でなければならない。そのようなベクターには、限定されるものではないが、バクテリオファージ、例えばラムダ油魚づたい、またはプラスミド、例えばpCMV４、pBR３２２、またはpUCプラスミド誘導体、またはBluescriptベクター（Stratagene、La Jolla、CA）が含まれる。他の発現ベクターには、本明細書に記載のHZ２４発現ベクターが含まれる。クローニングベクター内への挿入は、例えば、DNA断片を相補的粘着末端を有するクローニングベクター内に結合することにより達成される。挿入は、TOPOクローニングベクター（INVITROGEN、Carlsbad、CA）を用いて行うことができる。DNAを断片化するのに用いる相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、DNAを断片化するのに用いる相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、DNA分子の末端を酵素的に修飾することができる。あるいはまた、あらゆる望ましい部位をヌクレオチド配列（リンカー）をDNA末端に結合することにより生成することができ、これらの結合リンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的化学合成オリゴヌクレオチドを含むことができる。別の方法において、開裂ベクターおよびタンパク質遺伝子をホモポリマーテイリングにより修飾することができる。組換え分子を、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポーレーション、およびソノポーレーションにより宿主細胞に導入し、多コピーの遺伝子配列を生じさせることができる。
具体的態様において、単離されたタンパク質遺伝子、cDNA、または合成DNAを組み込む組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換は、多コピーの遺伝子の生成をもたらす。すなわち、形質転換体を増殖させて形質転換体から組換えDNA分子を単離し、必要であれば単離された組換えDNAから挿入遺伝子を回収することにより該遺伝子を大量に得ることができる。一般的には、グリコシル化はヒアルロニダーゼの触媒活性および安定性に重要であるから、可溶形のPH20を含むヒアルロニダーゼを、該ポリペプチドが活性を保持するのを保証する正しいNグリコシル化を促進するタンパク質発現系を用いて生成する。そのような細胞には、例えば、チャイニーズハムスター卵巣(CHO）細胞（例えばDG４４ CHO細胞）が含まれる。
１. ベクターおよび細胞
例えば本明細書に記載の目的とする1またはそれ以上のタンパク質を組換え発現させるために、該タンパク質をコードするヌクレオチド配列の全てまたは部分を含む核酸を、適切な発現ベクター、すなわち、挿入タンパク質をコードする配列の転写および翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入することができる。必要な転写シグナルおよび翻訳シグナルも酵素遺伝子および/またはその隣接領域の天然のプロモーターにより供給することもできる。
該酵素をコードする核酸を含むベクターも提供する。該ベクターを含む鎖いぼ言うも提供する。該細胞には真核細胞および原核細胞が含まれ、該ベクターはその中で用いるのに適したものである。
該ベクターを含む内皮細胞を含む原核細胞および真核細胞を提供する。そのような細胞には、細菌細胞、イースト細胞、細菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞、および動物細胞が含まれる。該細胞を用いて、該細胞がコードされたタンパク質を発現する条件下で該細胞を増殖させ、次いで、発現タンパク質を回収することにより該タンパク質を生成する。本発明の目的において、例えば該酵素を培地中に分泌させることができる。
天然またはヘテロローガスなシグナル配列と結合した可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、およびその複数コピーを含むベクターを提供する。該ベクターは該細胞中で酵素タンパク質を発現させるか、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。
種々の宿主−ベクター系を用いて該タンパク質をコードする配列を発現させることができる。これには、限定されるものではないが、ウイルス(例えば、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、または他のウイルス)を感染させた哺乳動物細胞系、ウイルス(例えばバクロウイルス)を感染させた昆虫細胞系、微生物、例えば酵母ベクターを含む酵母、またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換した細菌が含まれる。ベクターの発現要素は、その強度や特異性が異なる。用いる宿主−ベクター系に応じて、多くの適切な転写および翻訳要素のいずれかを用いることができる。
DNA断片をベクター中に挿入するための当業者に知られたあらゆる方法を用いて、適切な転写／翻訳調節シグナルとタンパク質をコードする配列を含むキメラ遺伝子を含む発現ベクターを構築することができる。この方法は、in vitro組換えDNAおよび合成技術、およびin vivo組換え(遺伝子組み換え)を含むことができる。タンパク質、またはそのドメイン、誘導体、断片、または類似体をコードする核酸の発現を二次核酸配列により調節し、遺伝子またはその断片を組換えDNA分子で形質転換した宿主中で発現させることができる。例えば、該タンパク質の発現を当該分野で知られたあらゆるプロモーター/エンハンサーにより調節することができる。ある態様において、該プロモーターは目的とするタンパク質の遺伝子に対して天然ではない。用いることができるプロモーターには、限定されるものではないが以下のものが含まれる：SV４０初期プロモーター（Bernoist and Chambon、Nature ２９０：３０４−３１０(１９８１））、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復配列中に含まれるプロモーター（Yamamoto et al. Cell ２２：７８７−７９７(１９８０））、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８：１４４１−１４４５(１９８１））、メタロチオネイン遺伝子の制御配列（Brinster et al.、Nature ２９６：３９−４２(１９８２））；原核性発現ベクター、例えばβラクタマーゼプロモーター(Jay et al.，(１９８１)Proc. Natl. Acad. Sci. USA ７８：５５４３）もしくはtac プロモーター(DeBoer et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA ８０：２１−２５(１９８３））；「Useful Protein from Recombinant Bacteria」：Scientific American、 ２４２：７９−９４(１９８０））も参照；ノパリンシンセターゼプロモーターを含む植物発現ベクター（Herrara−Estrella et al.、Nature ３０３：２０９−２１３(１９８４））、またはカリフラワーモザイクウイルス３５S RNA プロモーター(Garder et al.，Nucleic acids Res. ９：２８７１(１９８１））、および光合成酵素リブロースビホスフェートカルボキシラーゼのプロモーター（Herrera−Estrella et al.、Nature ３１０：１１５−１２０(１９８４））；酵母および他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal４プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を有し、トランスジェニック動物に用いられる以下の動物転写調節領域：膵腺房細胞中で活性なエラスターゼI遺伝子調節領域（Swift et al.、Cell ３８：６３９−６４６(１９８４）；Ornitz et al.、Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. ５０：３９９−４０９(１９８６）；MacDonald、Hepatology ７：４２５−５１５(１９８７））、膵β細胞中で活性なインスリン遺伝子調節領域（Hanahan et al.、Nature ３１５：１１５−１２２(１９８５））、リンパ系細胞中で活性な免疫グロブリン遺伝子調節領域（Grosschedl et al.、Cell ３８：６４７−６５８(１９８４）；Adams et al.、Nature ３１８：５３３−５３８(１９８５）；Alexander et al.、Mol. Cell Biol. ７：１４３６−１４４４(１９８７））、精巣細胞、乳腺細胞、リンパ系細胞、および肥満細胞中で活性なマウス乳癌ウイルス調節領域（Leder et al.、Cell ４５：４８５−４９５(１９８６））、肝臓中で活性なアルブミン遺伝子調節領域（Pinckert et al.、Genes and Devel. １：２６８−２７６(１９８７））、肝臓中で活性なα−フェトタンパク質遺伝子調節領域（Krumlauf et al.、Mol. Cell. Biol. ５：１６３９−１６４８(１９８５）；Hammer et al.、Science ２３５：５３−５８ １９８７））、肝臓中で活性なα−１抗トリプシン遺伝子調節領域（Kelsey et al.、Genes and Devel. １：１６１−１７１(１９８７））、骨髄性細胞中で活性なβグロビン遺伝子調節領域（Magram et al.、Nature ３１５：３３８−３４０(１９８５）；Kollias et al.、Cell ４６：８９−９４(１９８６））、脳のオリゴデンドロサイト細胞中で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Readhead et al.、Cell ４８：７０３−７１２(１９８７））、骨格筋中で活性なミオシン軽鎖２遺伝子調節領域（Shani、Nature ３１４：２８３−２８６(１９８５））、および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞中で活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節領域（Mason et al.、Science ２３４：１３７２−１３７８(１９８６））。
具体的態様において、目的とするタンパク質、またはそのドメイン、断片、誘導体、または相同体をコードする核酸と機能的に結合したプロモーター；1またはそれ以上の複製起点；および所望により1またはそれ以上の選択可能マーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)を含むベクターを用いる。E.coli細胞を形質転換するための典型的プラスミドベクターには、例えば、pQE発現ベクター（Qiagen、Valencia、CAから利用可能。該系を説明するQiagenが発表した文献も参照)が含まれる。pQEベクターは、ファージT５プロモーター（E. coli RNA ポリメラーゼにより認識される）およびE.coli中で組換えタンパク質の厳密に調節された高レベルの発現をもたらす二重lacオペレーター抑制モジュール、効率的な翻訳のための合成リボソーム結合部位（RBS II）、６XHis tagコーディング配列、t０およびT１転写ターミネーター、ColE１複製起点、およびアンピシリン耐性をもたらすβラクタマーゼ遺伝子を有する。pQEベクターは、組換えタンパク質のN末端またはC末端の６xHis tagを置換することができる。そのようなプラスミドには、pQE ３２、pQE ３０、およびpQE ３１が含まれ、これらは、3つ全てのリーディングフレームの複数のクローニング部位をもたらし、N末端６xHis標識タンパク質の発現をもたらす。E.coli細胞の形質転換のための他のプラスミドベクターの例には、例えばpET発現ベクターが含まれる（米国特許４，９５２，４９６参照。NOVAGEN、Madison、WIから利用可能。該系を説明するNovagenが発表した文献も参照。)。そのようなプラスミドには以下のものが含まれる：T７lac プロモーター、T７ターミネーター、誘導性E. coli lacオペレーター、およびlacリプレッサー遺伝子を含むpET １１a；T７ プロモーター、T７ターミネーター、およびE. coli ompT分泌シグナルを含むpET １２a−c；およびHisカラムによる精製に用いるためのHis−Tag(登録商標)リーダー配列、および該カラムで精製した後の開裂を可能にするトロンビン開裂部位、、T７−lac プロモーター領域、およびT７ターミネーターを含む、pET１５bおよびpET１９b(NOVAGEN、Madison、WI）。
哺乳動物細胞を発現させるためのベクターの例にはHZ２４発現ベクターがある。HZ２４発現ベクターはpCIベクターバックボーン（Promega）から誘導した。該ベクターは、βラクタマーゼ耐性遺伝子（AmpR）、F１複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター領域（CMV）、およびSV４０後期ポリアデニル化シグナル（SV４０）をコードするDNAを含む。該発現ベクターは、ECMVウイルス（Clontech）由来の内部リボソーム進入部位（IRES）およびマウスジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）遺伝子も有する。
２. 発現
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドは、in vitroおよびin vivo法を含む当業者に知られたあらゆる方法により生成することができる。目的とする(登録商標)は、例えば投与および治療に必要なタンパク質の必要な量および形を生成するのに適したあらゆる生物中で発現させることができる。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えばE.coli、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞(ヒト細胞株を含む)、およびトランスジェニック動物が含まれる。発現宿主は、タンパク質の生成レベルと発現タンパク質に存在する翻訳後修飾のタイプが異なりうる。発現宿主は、これらおよび他の因子、例えば規制および安全性的配慮、生産コスト、および精製の必要性と精製方法に基づいて選択することができる。
多くの発現ベクターが当業者に知られ利用可能であり、タンパク質の発現に用いることができる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって影響を受ける。一般的に、発現ベクターは、転写プロモーター、および所望によりエンハンサー、翻訳シグナル、および転写および翻訳終止シグナルを含むことができる。安定な形質転換に用いる発現ベクターは、典型的には、形質転換細胞の選択と維持を可能にする選択可能マーカーを有する。ある場合には、複製起点を用いてベクターのコピー数を増幅することができる。
可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドは、タンパク質融合物として利用または発現することもできる。例えば、酵素融合物を生成し、酵素にさらなる機能性を加えることができる。酵素融合タンパク質の例には、限定されるものではないが、シグナル配列タンパク質、局在化などのためのtag(例えばhis６ tagまたはmyc tag)、または精製用のtag(例えば、GST融合)、およびタンパク質分泌および/または膜結合を指示する配列が含まれる。
a. 原核細胞
原核細胞、特にE.coliは、大量のタンパク質を製造するためのシステムを提供する。E.coliの形質転換は、当業者によく知られた簡単で速やかな技術である。E.coliのための発現ベクターには誘導性プロモーターが含まれ、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導し、宿主細胞にいくらかの毒性を示すタンパク質を発現させるのに有用である。誘導性プロモーターの例には、lac プロモーター、trp プロモーター、ハイブリッドtac プロモーター、T７およびSP６ RNAプロモーター、および温度調節性λPLプロモーターが含まれる。
本発明が提供するあらゆるタンパク質は、E.coliの細胞質環境で発現させることができる。細胞質は還元環境であり、このことは、ある分子では不溶性封入帯の形成をもたらしうる。還元剤、例えばジチオスレイトールおよびβ−メルカプトエタノール、および変性剤、例えばグアニン-HCl、および尿素を用いて、タンパク質を再可溶化することができる。別のアプローチには、酸化環境およびシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼをもたらし、可溶性タンパク質の生成をもたらすことができる細菌のペリプラズムスペースにおけるタンパク質の発現がある。典型的には、リーダー配列を発現するタンパク質と融合させて該タンパク質をペリプラズムに移動させる。次に、該リーダーは、ペリプラズムの中にあるシグナルペプチダーゼにより除去される。ペリプラズム標的化リーダー配列の例には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のpelBリーダーおよびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーが含まれる。ある場合には、ペリプラズムでの発現は、発現タンパク質の培養液への漏出をもたらす。タンパク質の分泌は、培養上清からの速やかで簡単な生成をもたらす。分泌されないタンパク質は、浸透圧溶解によりペリプラズムから得ることができる。ペリプラズムでの発現と同様に、ある場合には、タンパク質は不溶性になりうるので、変性剤と還元剤を用いて可溶化と再ホールディングを促進することができる。導入および増殖温度も発現レベルと可溶性に影響を与える可能性があり、典型的には25℃〜37℃の温度を用いる。典型的には、細菌は非グリコシル化(aglycosylated)タンパク質を生成する。すなわち、タンパク質が機能するためにグリコシル化が必要である場合は、宿主細胞から精製した後にin vitroでグリコシル化を付加することができる。
b. 酵母細胞
酵母、例えば、Saccharomyces cerevisae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyces lactis、およびPichia pastorisは、本明細書に記載しているようなタンパク質の製造に有用でありうるよく知られた酵母発現宿主である。酵母は、エピソーマル複製ベクターを用いるか、またはホモローガスな組換えによる安定な染色体統合により形質転換するこごができる。典型的には、誘導性プロモーターを用いて、遺伝子発現を調節する。そのようなプロモーターの例には、GAL１、GAL７、およびGAL５、およびメタロチオネインプロモーター、例えばCUP１、AOX１、または他のPichia(ピキア)、または他の酵母プロモーターが含まれる。発現ベクターは、形質転換DNAを選択し、維持するための選択可能なマーカー、例えばLEU２、TRP１、HIS３、およびURA３を含むことが多い。酵母中で発現するタンパク質はしばしば可溶性である。シャペロニン、例えばBipとタンパク質ジスルフィドイソメラーゼの同時発現は発現レベルと可溶性を改善することができる。さらに、酵母中で発現したタンパク質は、Saccharomyces cerevisae由来の酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物、および酵母細胞表面タンパク質、例えばAga２p 接合付着レセプターまたはArxula adeninivoransグルコアミラーゼとの融合物を用いて分泌させることができる。Kex−２プロテアーゼなどのプロテアーゼの開裂部位を操作して融合配列を発現ポリペプチドから除去することができ、それにより発現ポリペプチドは分泌経路を出る。酵母もAsn−X−Ser／Thrモチーフでグリコシル化することができる。
c. 昆虫細胞
昆虫細胞は、特にバクロウイルス発現を用いてヒアルロニダーゼポリペプチドなどのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は、高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物により用いたほとんどの翻訳後修飾を可能にする。バクロウイルスは、宿主範囲が制限されており、真核性発現の安全性を改善し、その規制的懸念を減少させる。典型的発現ベクターには、高レベル発現用のプロモーター、例えばバクロウイルスのポリヘドリンプロモーターを用いる。一般的に用いるバクロウイルス系には、バクロウイルス、例えばAutographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）およびBombyx mori 核多角体病ウイルス（BmNPV）、ならびに昆虫細胞系、例えばSpodoptera frugiperda由来Sf9、Pseudaletia unipuncta(A７S）、およびDanaus plexippus(DpN１）が含まれる。高レベルの発現では、発現させる分子のヌクレオチド配列を該ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合させる。哺乳動物分泌シグナルは、昆虫細胞中で正しくプロセシングされ、発現タンパク質を培養液中に分泌させるのに用いることができる。さらに、細胞系Pseudaletia unipuncta(A７S）およびDanaus plexippus(DpN１）は、哺乳動物細胞系と同様のグリコシル化パターンでタンパク質を生成する。
昆虫細胞の別の発現系では安定な形質転換細胞を用いる。細胞系、例えばSchneider２（S２）およびKc細胞（Drosophila melanogaster）およびC７細胞（Aedes albopictus）を発現に用いることができる。Drosophilaメタロチオネインプロモーターは、を用いて、カドミウムや銅による重金属誘導の存在下で高レベルの発現を誘導することができる。発現ベクターは、典型的にはネオマイシンやヒグロマイシンなどの選択可能マーカーの使用により維持される。
d. 哺乳動物細胞
哺乳動物発現系を用いて、可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドを含むタンパク質を発現させることができる。発現構築物は、アデノウイルスなどのウイルス感染、または直接DNA伝達、例えば、リポソーム、リン酸カルシウム、DEAEデキストラン、および物理的手段、例えばエレクトロポーレーションおよびミクロインジェクションにより哺乳動物細胞に伝達することができる。典型的には、哺乳動物細胞用の発現ベクターは、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列（Kozakコンセンサス配列）、およびポリアデニル化要素を含む。IRES要素を加えて、選択可能マーカーなどの別の遺伝子との2シストロン性発現を可能にすることができる。そのようなベクターは、高レベル発現用の転写プロモーター−エンハンサー、例えば、SV４０プロモーター−エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーター、およびラウス肉腫ウイルス（RSV）の長い末端反復配列を含むことが多い。これらのプロモーター−エンハンサーは、多くの細胞種で活性である。組織および細胞形のプロモーターおよびエンハンサー領域を用いて発現させることもできる。典型的なプロモーター／エンハンサー領域には、限定されるものではないが以下のような遺伝子由来のものが含まれる：エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳癌ウイルス、アルブミン、αフェトタンパク質、α1抗トリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子調節。選択可能マーカーを用いて、発現構築物を有する細胞を選択し、維持することができる。選択可能マーカー遺伝子の例には、限定されるものではないが、ヒグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、およびチミジンキナーゼが含まれる。例えば、メトトレキサートの存在下で発現を行い、DHFR遺伝子を発現する細胞のみを選択することができる。例えば、TCR−ζおよびFcεRI−γなどの細胞表面シグナル伝達分子との融合は、細胞表面上で該タンパク質を活性状態で発現させることができる。
マウス、ラット、ヒト、サル、ニワトリ、およびハムスター細胞を含む多くの細胞系を哺乳動物での発現に用いることができる。典型的な細胞系には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：CHO、Balb／３T３、HeLa、MT２、マウスNS０（非分泌）および他のミエローマ細胞系、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞系、リンパ球、繊維芽細胞、Sp２／０、COS、NIH３T３、HEK２９３、２９３S、２B８、およびHKＢ細胞。分泌されたタンパク質の細胞培養液からの精製を促進する無血清培地に適応した細胞系も利用できる。例には、CHO−S細胞（Invitrogen、Carlsbad、CA、cat # １１６１９−０１２）および無血清EBNA−１細胞系（Pham et al.，(２００３)Biotechnol. Bioeng. ８４：３３２−４２.）が含まれる。最大発現用に最適化された特別な培地中で増殖するのに適合した細胞系も利用可能である。例えば、DG４４CHO細胞は、動物生成物不含既知組成培地中で浮遊培養で増殖させるのに適合している。
e. 植物
トランスジェニック植物再位房および植物を用いて本明細書に記載しているようなタンパク質を発現させることができる。典型的には、直接DNA導入、例えばプロトプラストへの微粒子銃およびPEG介在導入、およびアグロバクテリウム介在形質転換を用いて発現構築物を植物に導入する。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終止要素、および翻訳調節要素を含み得る。発現ベクターおよび形質転換技術は、通常、双子葉植物宿主、例えばArabidopsisおよびタバコ、および単子葉植物宿主、例えばトウモロコシおよびコメに分けられる。発現に用いる植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボースビスホスフェートカルボキシラーゼプロモーターおよびユビキチン、およびUBQ３プロモーターが含まれる。選択可能マーカー、例えばヒグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼ、およびネオマイシンホスホトランスフェラーゼを用いて、形質転換細胞の選択および維持を促進することが多い。形質転換植物細胞は、細胞、凝集物(カルス組織)として培養中で維持するか、または全植物に再生することができる。トランスジェニック植物細胞は、ヒアルロニダーゼポリペプチドを生成するよう操作された藻類も含みうる。植物は哺乳動物細胞と異なるグリコシル化パターンを有するので、このことはこれら宿主中で生成されるタンパク質の選択に影響を及ぼしうる。
３. 精製技術
可溶性ヒアルロニダーゼ ポリペプチドまたは他のタンパク質を含むポリペプチドの宿主細胞からの精製方法は、選んだ宿主細胞と発現系に依存するだろう。分泌された分子については、タンパク質を、一般的に細胞を除去した後に培養液から精製する。細胞内発現では、細胞を溶解し、蛋白質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック生物、例えばトランスジェニック植物および動物を発現に用いる場合は、組織または器官を出発物質に用いて溶解細胞抽出物を作製することができる。さらに、トランスジェニック動物での生成は乳または卵中でのポリペプチドの生成も含み、これを回収し、必要であれば、該タンパク質を抽出し、さらに当該分野の標準的方法を用いて精製することができる。
タンパク質、例えば可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドは、限定されるものではないが以下のものを含む当該分野で知られた標準的タンパク質精製技術を用いて精製することができる：SDS−PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿、およびイオン交換クロマトグラフィ、例えば陰イオン交換。アフィニティ精製技術を用いて製造効率と純度を改善することもできる。例えば、ヒアルロニダーゼ酵素と結合する抗体、レセプター、および他の分子をアフィニティ精製に用いることができる。発現構築物を操作し、タンパク質にアフィニティタグ、例えばmycエピトープ、GST融合物またはHis６を加え、それぞれmyc抗体、グルタチオン樹脂、およびNi樹脂を用いるアフィニティ精製することができる。ゲル電気泳動、および染色、および分光光度法を含む当該分野で知られたあらゆる方法を用いて純度を評価することができる。
F. 免疫グロブリンおよび可溶性ヒアルロニダーゼポリペプチドの精製、製剤および投与
本発明は、32℃以下、例えば0℃〜32℃または約0℃〜32℃の範囲の温度で少なくとも6月間の長期間、液体製剤として安定なIGとヒアルロニダーゼの共製剤を提供する。安定性の増加は、IGとヒアルロニダーゼの活性を保持したままで、保存時間が改善し、断片化が減少し、凝集形成が減少し、二量体形成が減少し、および/または変色が減少することで特徴づけられる。そのような共製剤は、さらに再構成せず、および/またはさらに希釈する必要なしに「すぐに用いることができる(ready−to−use)」液体製剤として提供することができる。得られる安定な共製剤は、直接注射または投与するための剤形で医師または患者に好都合に分配することができる。例えば、該共製剤は、家やどこででも注入または注射することができる。
免疫グロブリンと共製剤化される可溶性ヒアルロニダーゼは、免疫グロブリンのバイオアベイラビリティを増加させることにより身体内の目的とする部位への免疫グロブリンの送達を増大させことができる。すなわち、該共製剤は、通常の皮下投与法に比べて皮下投与後の免疫グロブリンの上昇したおよび/またはより急速に達成される濃度を達成し、例えば、所定用量に対するより強力でおよび/またはより急速な反応をもたらす。さらに、可溶性ヒアルロニダーゼ含有IG共製剤は、低用量のIGの投与も可能にし、低用量のIG投与による所定の反応を達成する。最後に、注射または注入部位またはその近くでのバルク液体流量を増強する可溶性ヒアルロニダーゼの能力は、関連する薬理学的送達の他の局面も改善することができる。例えば、バルク液体流量の増加は、注射した流体の容量が注射部位からより急速に分散する(注射の疼痛もしくは他の有害事象の可能性を減少させる)のを助けることができる。これは皮下注入においてより高用量の投与を可能にするために特に重要である。バイオアベイラビリティの増加に加え、IGとヒアルロニダーゼの共製剤は、常套的静脈内投与経路に比べてより安全またはより好都合な投与経路を提供する。
本発明の共製剤は、種々の温度を含めて長期間にわたり安定である。例えば、本発明の共製剤は、32℃以下の温度で少なくとも6月間、IGとヒアルロニダーゼの活性を保持し、安定である。例えば、該共製剤は、「冷蔵(庫の)」温度、例えば2℃〜8℃、例えば約4℃で少なくとも6月間〜4年間、例えば1〜2年間、例えば、6月間、例えば1年間、少なくとも2年間、少なくとも3年間、または少なくとも4年間またはそれ以上安定である。別の例において、該共製剤は、室温、例えば、１８℃〜３２℃、一般的には２０℃〜３２℃、例えば２８℃〜３２℃で、少なくとも６月間〜1年間、例えば、６月間、少なくとも７月間、少なくとも８月間、少なくとも９月間、または少なくとも１年間、またはそれ以上活性を保持し、安定である。
特に、該安定な共製剤は、所定の期間保存後のIGの凝集および/または断片化が低〜検出不能レベルである。凝集および断片化の評価方法は当業者に知られており、下記G項に例示している。一般的には、上記の所定の期間保存後の、該共製剤中のIGの凝集物の形成は、０.５％〜５％以下、例えば、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、一般的には０.５％以下である(HPSECまたは他の方法で測定)。
さらに、本発明の安定な共製剤中のIGおよびヒアルロニダーゼは、保存前のIGおよびヒアルロニダーゼの最初の活性の1またはそれ以上の活性を保持する。当業者は、IGとヒアルロニダーゼの活性を熟知しており、そのような活性を評価することができる。G項は、典型的活性および活性を評価するためのアッセイを示す。典型的には、本発明の安定な液体共製剤は、保存後に、保存前のタンパク質の初期活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれ以上、一般的には初期活性の少なくとも７０％〜９５％が保持される。例えば、該安定な液体共製剤は、保存後に、保存前の各タンパク質の初期活性の７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または９９.５％以上を保持する。
１. 製剤および用量
本発明の共製剤は液体として製剤化される。該共製剤は、免疫グロブリン、ヒアルロニダーゼ、少なくとも０.０５Mのアルカリ金属塩化物塩、例えば、少なくとも０.０５Mの塩化ナトリウム（ＮａＣｌまたは塩）、または０.０５M塩化カリウム（ＫＣｌ）を含む。該共製剤もIGおよびヒアルロニダーゼの凝集を制限し、活性を保持するpHに調整される。ある例としては、該共製剤は、水または適切な溶媒以外の他の成分を含まない。他の例では、該共製剤は、さらに棄却剤、担体、または他の賦形剤を含む。
典型的には、該化合物は、当該分野でよく知られた技術と方法を用いて医薬組成物に製剤化される（例えば、Ansel Introduction to Pharmaceutical Dosage forms、第4版、１９８５、１２６参照）。医薬的に許容される組成物は、動物およびヒトで使用するために、一般に認められた薬局方に従って規制官庁または他の官庁の承認を考慮して製造される。該製剤は投与方法に適するべきである。
該共製剤は、液体形の医薬製剤、溶液、シロップ、またはサスペンジョンとして提供することができる。液体形の医薬製剤は、使用前に治療的有効濃度に希釈する濃縮製剤として提供することができる。一般的には、該製剤は、使用するために希釈する必要がない剤形で提供される。そのような液体製剤は、常套的方法により、医薬的に許容される添加剤、例えば懸濁化剤(例えば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体、または硬化(水素化)食用油脂)；乳化剤(例えば、レシチンまたはアカシア)；非水性ビークル(例えば、アーモンド油、油状エステル、または分画植物油)；および保存料(例えば、メチルまたはプロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸)を用いて製造することができる。別の例では、医薬製剤は凍結乾燥形で存在し、使用前に水または他の適切なビークルで再構成することができる。
本発明の安定な共製剤のpHは、G項に記載するように、該共製剤中のIGが凝集せず、および/またはIGとヒアルロニダーゼが活性を保持するものである。最適pHは、当業者に知られた製剤技術により得ることができる。例えば、最適pHは、例えば、G項に記載するように、当業者に知られた種々の方法を用いて種々のpH条件下で凝集と活性を評価することにより決定することができる。そのようなアッセイまたは評価は、限定されるものではないが、サイズ排除クロマトグラフィ、HSPEC測定法、熱安定性データ、種々の製剤の抗補体力価、および/またはヒアルロニダーゼ活性アッセイが含まれる。典型的には、本発明の共製剤のｐＨは、該共製剤の濃縮溶液で測定すると４.０〜８.０の範囲であり得る。しかしながら、一般的には、モノマー含有量を最大にするのを保証するためにこの範囲内でより低いpHが望ましい。したがって、本発明の共製剤は、典型的には、少なくともまたは約４.０〜７.４、一般的には少なくともまたは約４.０〜６.０、典型的には４.４〜４.９のpHを有する。記載したように、示したpHは、該製剤の濃縮溶液で測定する。pHの調整は、酸性化剤を用いてpHを下げるか、またはアルカリ化剤を用いてpHを上げることができる。典型的酸性化剤には、限定されるものではないが、酢酸、クエン酸、硫酸、塩化水素酸、リン酸一ナトリウム溶液、またはリン酸が含まれる。典型的アルキル化剤には、限定されるものではないが、リン酸二ナトリウム溶液、炭酸ナトリウム、または水酸化ナトリウムが含まれる。
該製剤の安定性に有害な影響を及ぼさず、必要なpH範囲を支持する限り、あらゆる緩衝剤を、本発明が提供する液体製剤の製造に用いることができる。特に適した緩衝剤の例には、コハク酸塩、酢酸塩、リン酸塩緩衝剤、クエン酸塩、アコニテート、リンゴ酸塩、および炭酸塩が含まれる。しかしながら、当業者は、本発明の製剤は、緩衝剤が示した範囲の許容できる程度のpH安定性や「緩衝能」を提供するかぎり、特定の緩衝剤に限定されないと理解するだろう。一般的には、緩衝剤は、そのpKの約1pH単位内の適切な緩衝能を有する（Lachman et al. １９８６）。緩衝剤安定性は、公表されたpK集計に基づいて推定するか、または当該分野でよく知られた方法により実験的に決定することができる。該溶液にpHは、例えばあらゆる許容される酸または塩基を用いて上記範囲内の目的とするエンドポイントに調整することができる。
a. 免疫グロブリン
該強制剤中のIGは、ちょうどまたは約５％〜２２％ｗ／ｖ、例えば、ちょうどまたは約５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、１００ｍｇ／ｍＬ、１２０ｍｇ／ｍＬ、１５０ｍｇ／ｍＬ、１８０ｍｇ／ｍＬ、２００ｍｇ／ｍＬ、２２０ｍｇ／ｍＬ、２５０ｍｇ／ｍＬまたはそれ以上の濃度で提供される。一般的には、該共製剤中のIGは、少なくとも １０％(１００ｍｇ／ｍＬ）〜２０％(２００ｍｇ／ｍＬ）、例えば、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％またはそれ以上の量で提供される。
本発明の免疫グロブリン製剤は、単回または複数回投与用の医薬組成物として製剤化することができる。典型的には、特記しない限り、該表製剤のIGは、すぐに使用でき、さらに希釈する必要がない量で製剤化される。該共製剤が単回もしくは複数回投与製剤として提供されるか否かに応じて、当業者は該共製剤中のIGの正確な量を実験的に決定することができる。
一般的には、免疫グロブリンは、特定の投与計画のための治療的有効量で提供される。治療的有効濃度は、既知のin vitroおよびin vivo系、例えば本明細書に記載のアッセイで化合物を試験することにより実験的に決定することができる。該組成物中の選択した免疫グロブリンの濃度は、該複合体の吸収、不活化、および排泄速度、該複合体の物理化学的特性、投与スケジュール、および投与量、ならびに当業者に知られた他の因子に依存する。例えば、正確な用量および治療期間は、治療する組織により、既知の試験プロトコールを用いて、またはin vivoまたはin vitro試験データから推定により経験的に決定することができると理解される。濃度および投与容量も治療する個体の年齢によって変化しうることに注意すべきである。さらに、あらゆる特定の対象のための特定の投与計画は、個々の要求および該製剤を投与する者または投与を管理する者の専門的判断に従って時間と共に調整すべきであり、本明細書に記載の濃度範囲は単に例示であって本発明の範囲を限定するものではないと理解すべきである。疾患または病状、例えば、ＩＧで治療可能な疾患または病状を治療するために投与する選択した免疫グロブリン製剤の量は、標準的臨床技術により決定することができる。さらに、in vitroアッセイおよび動物モデルを用いて最適用量範囲の確認を促すことができる。したがって、経験的に決定することができる正確な用量は、特定の免疫グロブリン製剤、可溶性ヒアルロニダーゼの投与計画および投与スケジュール、投与経路、治療する疾患の種類、および疾患の重症度に依存しうる。例えば、ＩＧ製剤を、最新の静脈内投与用(IVIG)製剤を製造し、特定のＩＧ治療可能な疾患または病状に投与するための投与計画(用量および頻度)を達成するための医薬組成物に製剤化することができる。当業者は、特定の疾患または病状のIVIG投与のための投与計画に精通している。例えば、下記H項に、特定疾患および病状のためのIGの典型的投与計画(用量および頻度)を記載する。他の投与計画は当業者によく知られている。必要であれば、特定の用量および継続期間、および治療プロトコールを経験的に決定または推定することができる。
例えば、静脈内投与する免疫グロブリンの典型的用量を出発点に用いて適切な用量を決定することができる。投与レベルは、種々の因子、例えば期待の体重、一般的健康状態、年齢、用いる特定化合物の活性、性別、食事、投与回数、排泄速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度と経過、および患者の疾患に対する素因、および治療する医師の判断に基づいて決定することができる。一般的には、免疫グロブリンの用量は、ちょうどまたは約１００ｍｇ/kg体重（すなわち１００ｍｇ／ｋｇ BW）〜２g／kg BWである。投与量は、治療する兆候(適応症)、および耐容される考えられる副作用に依存すると理解される。用量は、一般に承認された各障害のモデルを用いて実験的に決定することができる。
一例として、ＩＧは、治療する特定の兆候のための毎月1回のIV用量と等価な用量の皮下投与を可能にする量で与えられる。そのような例において、免疫グロブリン製剤は、毎月1回の用量をもたらすのに充分な量の単回投与用に製剤化することができるが、複数回投与用により少ない量で提供することができる。例えば、IG製剤の毎月1回の用量を、毎日、毎週、隔週、または毎月1回投与することができる。投与計画は、月または年にわたり継続することができる。特に毎月1回のIV用量は、治療する疾患に依存し、変化しうる。
特にIGの皮下投与のための典型的単回用量範囲は、ちょうどまたは約１グラム（g）〜２００g、例えば、１グラム（g）、５g、１０g、２０g、３０g、４０g、５０g、６０g、７０g、８０g、９０g、１００g、または２００gである。特定の用量またはその処方は、兆候および個体に依存する。例えば、５０ｍｇ／ｋｇ重量（BW）〜６００ｍｇ／ｋｇ BW、例えば、５０ｍｇ／ｋｇ体重（BW）、１００ｍｇ／ｋｇ BW、２００ｍｇ／ｋｇ BW、３００ｍｇ／ｋｇ BW、４００ｍｇ／ｋｇ BW、５００ｍｇ／ｋｇ BW、６００ｍｇ／ｋｇ BW，またはそれ以上の用量で投与することができる。必要により用量を経験的に決定することができる。そのような用量を達成するために皮下投与されるIG含有共製剤の容量は、ちょうどまたは約１０ｍＬ〜７００ｍＬ、例えば１００ｍＬ〜５００ｍＬ、例えば２００ｍＬ〜４００ｍＬでありうる。例えば、皮下投与されるIG含有共製剤の容量は、単回投与において、ちょうどまたは約１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、またはそれ以上である。例えば、本明細書に記載の適応症のための１０％液体ＩＧ共製剤（１００ｍｇ／ml）を２００ ml〜７００mlの容量で投与し、IG２０g〜７０gの単回投与が達成される。別の例では、本明細書に記載の２０％液体ＩＧ共製剤(２００ｍｇ／ｍＬ）を、２０g〜７０gのIGの同様の単回用量が達成されるように容量１００ｍＬ〜３５０ｍＬで投与することができる。記載したように、IGは複数回投与のために該共製剤中により少ない量で提供することができる。
b. ヒアルロニダーゼ
選択したヒアルロニダーゼ、特に可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０は、ちょうどまたは約５０Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬ、例えば、５０Ｕ／ml、７５Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ml、１５０Ｕ／ml、２００Ｕ／ml、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ml or ５００Ｕ／ml、典型的には少なくとも １００Ｕ／ｍＬ〜３００Ｕ／ｍＬの濃度、一般的には７５Ｕ／ｍＬ〜３５０Ｕ／ｍＬの濃度で、該共製剤中に含まれる。所望により、ヒアルロニダーゼを、より濃縮形で、例えば、ちょうどまたは約１０００Ｕ／ｍＬ〜５０００Ｕ／ｍＬ、例えば１０００Ｕ／ml、１５００単位／ml、２０００Ｕ／ml、４０００Ｕ／ml、または５０００Ｕ／mlので提供することができる。
該共製剤中のヒアルロニダーゼは、単回または複数回投与用の医薬組成物として製剤化することができる。IGについて上記したように、該共製剤中のヒアルロニダーゼは、典型的にはさらに希釈する必要がなく、すぐに使用できる量で製剤化される。該製剤が単回投与形または複数回投与形として提供されるか否かに応じて、当業者は該共製剤中に含まれるヒアルロニダーゼの正確な量を経験的に決定することができる。
一般的には、選択したヒアルロニダーゼ、特に可溶性ヒアルロニダーゼ、例えばｒＨｕＰＨ２０は、治療する患者に対する望ましくない副作用なしにIGの治療的に有用な効果をもたらすのに充分な量で該共製剤中に含まれる。治療的有効濃度は、既知のin vitroおよびin vivo系、例えば当該分野で知られているか本明細書に記載のアッセイを用いて該ポリペプチドを試験することにより実験的に決定することができ（例えば、Taliani et al.(１９９６)Anal. Biochem.、２４０：６０−６７；Filocamo et al.(１９９７)J Virology、７１：１４１７−１４２７；Sudo et al.(１９９６)Antiviral Res. ３２：９−１８；Buffard et al.(１９９５)Virology、２０９：５２−５９；Bianchi et al.(１９９６)Anal. Biochem.、２３７：２３９−２４４；Hamatake et al.(１９９６)Intervirology ３９：２４９−２５８；Steinkuhler et al.(１９９８)Biochem.、３７：８８９９−８９０５；D’Souza et al.(１９９５)J Gen. Virol.、７６：１７２９−１７３６；Takeshita et al.(１９９７)Anal. Biochem. ２４７：２４２−２４６；例えばShimizu et al.(１９９４)J. Virol. ６８：８４０６−８４０８も参照のこと；Mizutani et al.(１９９６)J. Virol. ７０：７２１９−７２２３；Mizutani et al.(１９９６)Biochem. Biophys. Res. Commun.、２２７：８２２−８２６；Lu et al.(１９９６)Proc. Natl. Acad. Sci(USA）、９３：１４１２−１４１７；Hahm et al.，(１９９６)Virology、２２６：３１８−３２６；Ito et al.(１９９６)J. Gen. Virol.、７７：１０４３−１０５４；Mizutani et al.(１９９５)Biochem. Biophys. Res. Commun.、２１２：９０６−９１１；Cho et al.(１９９７)J. Virol. Meth. ６５：２０１−２０７参照)、それからヒトの用量を推測することができる。
例えば、単回投与用のヒアルロニダーゼの治療的有効用量は、ちょうどまたは約５００単位〜５００，０００単位、例えば、１０００単位〜１００，０００単位である。例えば、ヒアルロニダーゼは、特に皮下投与のためには、ちょうどまたは約５００単位、１０００単位、２０００単位、５０００単位、１０，０００単位、３０，０００単位、４０，０００単位、５０，０００単位、６０，０００単位、７０，０００単位、８０，０００単位、９０，０００単位、１００，０００単位またはそれ以上を投与することができる。記載したように、ヒアルロニダーゼは、複数回投与のために該共製剤中により少ない量で提供することができる。
ある例としては、用量は、投与するIGとの比で与えることができる。例えば、ヒアルロニダーゼは、１０Ｕ／グラム（g）〜２０００Ｕ／gＩＧまたはそれ以上、例えば、ちょうどまたは約１０Ｕ／g、２０Ｕ／g、３０Ｕ／g、４０Ｕ／g、５０Ｕ／g、６０Ｕ／g、７０Ｕ／g、８０Ｕ／g、９０Ｕ／g、１００Ｕ／g、１５０Ｕ／g、２００Ｕ／g、２５０Ｕ／g、３００Ｕ／g、４００Ｕ／g、５００Ｕ／g、１０００Ｕ／g、１５００Ｕ／g、２０００Ｕ／g、３０００Ｕ／g ＩＧまたはそれ以上で投与することができる。一般的には、共製剤製品中のヒアルロニダーゼとIGの比は、同じ生成物(ＩＧおよびヒアルロニダーゼ）および同量のIGが、例えば最新の投与において別個に皮下投与される場合の比より大きい。すなわち、一般的に、該比は、少なくとも１００Ｕ／g、一般的には２５０Ｕ／gまたはそれ以上、例えば、１００Ｕ／g〜３０００Ｕ／g ＩＧ、例えば２５０Ｕ／g〜１０００Ｕ／g、特に２５０Ｕ／g〜７５０Ｕ／g、例えば５００Ｕ／g ＩＧである。例えば、１００Ｕ／ｍＬ ヒアルロニダーゼを含有する共製剤は、２０％ ＩＧ(２００ｍｇ／ｍＬ）と共製剤化する場合には、ちょうどまたは約５００Ｕ／g ＩＧで提供される。典型的には、皮下投与する容量は、単回投与では、ちょうどまたは約１０ｍＬ〜７００ｍＬ、例えば５０ｍＬ〜５００ｍＬ、例えば、１００ｍＬ〜４００ｍＬである。例えば、皮下投与する容量は、単回投与では、ちょうどまたは約１０ｍＬ、２０ｍＬ、３０ｍＬ、４０ｍＬ、５０ｍＬ、１００ｍＬ、２００ｍＬ、３００ｍＬ、４００ｍＬ、５００ｍＬ、６００ｍＬ、７００ｍＬ、またはそれ以上である。
c. アルカリ金属塩化物塩
本発明の共製剤は、少なくとも０.０５Mのアルカリ金属塩化物塩を含む。アルカリ金属塩化物塩には、限定されるものではないが、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）もしくは塩化カリウム（ＫＣｌ）が含まれる。典型的には、該アルカリ金属塩化物塩、例えば、ＮａＣｌまたはＫＣｌは、ヒアルロニダーゼの安定性と活性を保持するために与えられる。塩の正確な量は、当業者が経験的に決定することができる。例えば、該製剤中の塩の量は、当業者に知られた、例えばG項に記載の種々の方法を用い、種々の条件下で凝集および活性を評価することにより決定することができる。典型的には、本発明の共製剤中の塩化ナトリウムは、ちょうどまたは約０.０５M〜０.３M、例えば、ちょうどまたは約０.０５M、０.０６M、０.０７M、０.０８M、０.０９M、０.１M、０.１５M、０.２M、０.２５Mまたはそれ以上であってもよい。典型的には、塩の量は、０.０５M〜０.２５M、例えば０.１５Mである。
d. アミノ酸安定化剤
本発明の共製剤は、該製剤の安定性に寄与するアミノ酸安定化剤を含む。安定化剤は、非極性および塩基性アミノ酸でありうる。典型的非極性および塩基性アミノ酸には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：アラニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グリシン、およびプロリン。例えば、アミノ酸安定化剤はグリシンまたはプロリン、典型的にはグリシンである。安定化剤は、単一アミノ酸であるか、または2またはそれ以上のアミノ酸の組み合わせでありうる。アミノ酸安定化剤は、天然アミノ酸、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸、またはアミノ酸等価物でありうる。一般的には、アミノ酸はL−アミノ酸である。例えば、プロリンを安定化剤として用いる場合は、一般的にはL−プロリンである。アミノ酸等価物、例えばプロリン類似体を用いることもできる。
一般的には、モノマー形の免疫グロブリンを維持するのに有効な1またはそれ以上のアミノ酸の量を該溶液に加える。液体共製剤中に含まれるアミノ酸安定化剤、例えばグリシンの濃度は、０.１M〜１Mアミノ酸、例えば０.１M〜０.７５M、一般的には、０.２M〜０.５M、例えば、少なくともちょうどまたは約０.１M、０.１５M、０.２M、０.２５M、０.３M、０.３５M、０.４M、０.４５M、０.５M、０.６M、０.７M、０.７５Mまたはそれ以上であってもよい。アミノ酸、例えばグリシンは、医薬的に許容される塩、例えば塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩などの形で用いることができる。アミノ酸、例えばグリシンの純度は、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９.５％またはそれ以上であるべきである。
e. 他の薬剤
所望により、該共製剤は、担体、例えば希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはヒアルロニダーゼまたはIGを投与するビークルを含むことができる。適切な医薬的担体の例は、E. W. Martin、「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、一般的には精製された形または部分精製形の治療的有効量の化合物を、患者に適切に投与するための形をもたらすために適切な量の担体と共に含むだろう。そのような医薬的担体は、無菌の液体、例えば水および油(以下のものを含む)を含みうる：石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油。水は、医薬組成物を静脈内投与するときの典型的担体である。生理食塩水溶液および水性デキストラン、およびグリセロール溶液も特に注射可能溶液のための液体担体として用いることもできる。
例えば、非経口投与用製剤に用いる医薬的に許容される担体には以下のものが含まれる：水性ビークル、非水性ビークル、抗微生物薬、等張化剤、緩衝剤、抗酸化剤、局所麻酔薬、懸濁化および分散剤、乳化剤、封鎖もしくはキレート剤、および他の医薬的に許容される物質。水性ビークルの例には以下のものが含まれる：注射用塩化ナトリウム、注射用リンゲル液、注射用等張デキストロース、注射用無菌水、注射用デキストロース、および乳酸加リンゲル液。非水性非経口投与用ビークルには、植物起源の固定油、綿実油、コーン油、ゴマ油、およびピーナッツ油が含まれる。静菌または静真菌的濃度の抗微生物薬を、以下のものを含む複数用量容器に充填された非経口投与用製剤に加えることができる：フェノールもしくはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルp−ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウム、および塩化ベンゼトニウム。等張化剤には、塩化ナトリウムとデキストロースが含まれる。緩衝剤には、リン酸塩とクエン酸塩が含まれる。抗酸化剤には、重硫酸ナトリウムが含まれる。局所麻酔剤には、塩酸プロカインが含まれる。懸濁化および分散剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロール、ヒドロキシプロピル メチルセルロース、およびポリビニルピロリドンが含まれる。乳化剤には、ポリソルベート８０（TWEEN８０）が含まれる。金属イオンの封鎖もしくはキレート剤にはEDTAが含まれる。医薬的担体には、水混和性ビークル用のエチルアルコール、ポリエチレングリコール、およびプロピレングリコール、ならびにpH調整用の水酸化ナトリウム、塩化水素酸、クエン酸、または乳酸が含まれる。
組成物は、活性成分と共に以下のものを含むことができる：希釈剤、例えばラクトース、ショ糖、第二リン酸カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、およびタルク；および結合剤、例えばデンプン、天然ゴム、例えばガムアカシアゼラチン、グルコース、糖液、ポリビニルピロリドン、セルロース、およびその誘導体、ポビドン、クロスポビドン、および当業者に知られた他のそのような結合剤。
例えば、賦形剤タンパク質は、多くのあらゆる医薬的に許容されるタンパク質またはペプチドのいずれかでありうる該共製剤に加えることができる。一般的には、賦形剤タンパク質は、免疫反応を引き起こさずに哺乳動物対象に投与される能力で選択される。例えば、ヒト血清アルブミンは、医薬製剤に使用するのに非常に適している。他の既知の医薬的タンパク質賦形剤には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：デンプン、グルコース、ラクトース、ショ糖、ゼラチン、麦芽、コメ、花、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノール。賦形剤は、収容容器またはバイアルに該タンパク質が吸収されるのを予防するのに充分な濃度で製剤中に含まれる。賦形剤の濃度は、賦形剤の性質と該共製剤中のタンパク質濃度に従って変化するだろう。
組成物は、所望により、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、トリエタノールアミンオレエート、および他のそのような薬剤も含むことができる。
２. 剤形
本発明の共製剤は、単回または複数回(投与用)剤形として製剤化することができる。例えば、本発明の共製剤は長期間にわたり安定であるので、該共製剤は、日、週、月、または年の間隔で投与するための複数回剤形で提供することができる。すなわち、該液体共製剤を単位剤形として製剤化することができる。医薬活性化合物の濃度は、注射が目的とする薬理学的効果をもたらす有効量を提供するように調整する。例えば、各単位用量は、目的とする治療効果を生じるのに充分な治療的活性化合物の予め決定された量を、必要な医薬的担体、ビークル、または希釈剤と共に含む。正確な容量は、当該分野で知られているように患者と動物の年齢、体重、および状態に依存する。
単位剤形はその一部または複数を投与することができる。複数回剤形は、分離した単位剤形で投与するために単一容器に包装された複数の同一単位剤形である。したがって、複数回剤形は、包装中で分離していない複数の単位用量である。
単位用量非経口投与用製剤は、アンプル、バイアル、または針付きシリンジに包装される。医薬的活性化合物を含む液体溶液の容量は、治療する疾患と、包装のために選択した特定の製品に依存する。非経口投与用の全ての製剤は、当該分野で知られ、実施されているように滅菌されなければならない。複数用量製剤として提供する場合は、外征剤は静菌剤を含むことができる。
３. 投与
本発明の共製剤組成物は、典型的には、皮下経路などによる非経口投与のために製剤化される。ヒアルロニダーゼを含む表製剤中のIGのバイオアベイラビリティの増大により、免疫グロブリンを現在の静脈内投与用（ＩＶＩＧ）製剤を製造し、投与する用量と頻度で皮下投与することができる。現在のIGの皮下投与用製剤に対する利点は、共製剤したヒアルロニダーゼ／ＩＧは、より好ましい投与レジュメ、例えば投与頻度の減少をもたらすことができることである。投与頻度の減少または投与量の減少により、毒性に関連する副作用も減少させることができる。一般的には、皮下IG治療の薬物動態および/または薬力学が改善される。さらに、IGの皮下投与も、現在の静脈内注入より有利である。例えば、皮下注入は、熟練した看護士ではなく患者や家族が注入可能であり、より速い速度で注入することができ(常套的IVIG両方の5〜10時間に比べて1〜3時間で注入される)；機能的静脈を必要とせず；注入に関連した副作用、例えば血栓形成、頭痛、静脈血栓症、および悪心がなく、有害事象の確率が低く；注入を自宅や何処ででも行うことができる。
ヒアルロニダーゼを投与し、ヒアルロニダーゼが皮膚や組織の間質に達し、続いて免疫グロブリンが送達されるように間質腔で分解することを確実にするためにも、皮下投与が望ましい。すなわち、例えば皮下投与法により皮下に直接投与することが予期される。
投与は、治療部位に応じて局所的、外用的(topical)、または全身的でありうる。治療が必要な領域への局所投与は、例えば、限定されるものではないが、局所注入、外用適用(例えば外科手術後の創傷包帯とともに)、注射、カテーテル、坐剤、またはインプラントにより達成することができる。一般的には、局所投与は、例えばシリンジまたは針のような注射装置を含む他の製品から注射することにより達成される。別の例において、局所投与は注入により達成され、注入はポンプや他の同様の装置を用いて促進することができる。
他の投与方法も予期される。医薬組成物は、各投与経路に適した剤形に製剤化することができる。あらゆる特定の症例に最も適した経路は、種々の因子、例えば疾患の性質、疾患の進行、疾患の重症度、用いる具体的組成物に依存する。他の投与経路、例えば当業者に知られたあらゆる経路には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：筋肉内、静脈内、皮内、病変内、腹腔内注射、硬膜外、経鼻、経口、経膣、直腸、外用、局所、耳、吸入、バッカル(例えば舌下)、および経皮投与、またはあらゆる経路。そのような経路に適した製剤は、当業者に知られている。
組成物は、他の生物学的活性物質と共に、連続的に、間欠的に、または同じ組成物で投与することもできる。投与には、制御放出製剤、およびポンプなどによる装置制御放出を含む制御放出系も含まれる。本発明では一般的に注射または注入により特徴づけられる皮下投与が予期される。注射剤は、以下の常套的形で製造することができる：液体溶液もしくはサスペンジョン、注射前に液体で溶液やサスペンジョンにするのに適した固体形、またはエマルジョン。一般的には、本発明の共製剤は液体として製造される。注射剤は、局所および全身投与用に設計される。本発明の目的において、罹患した間質に直接投与するには局所投与が望ましい。非経口投与用の製剤には以下のものが含まれる：注射できる状態の無菌溶液、使用直前に溶媒と混合することができる状態の無菌乾燥可溶性生成物、例えば凍結乾燥粉末(皮下注射錠(lyophilized powder)を含む)、注射できる状態のサスペンジョン、使用直前にビークルと混合することができる状態の無菌乾燥不溶性生成物、および無菌エマルジョン。該溶液は水性または非水性であってよい。静脈内注射する場合に適した担体には、生理食塩水もしくはリン酸緩衝生理食塩水（PBS）、増粘剤と可溶化剤を含む溶液、例えばグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコール、およびその混合物が含まれる。
投与方法を用いて、選択した化合物の分解プロセス(例えば蛋白質分解、および抗原性反応および免疫原性反応による免疫学的介入)への暴露を減少させることができる。そのような方法の例には、治療部位への局所投与が含まれる。治療薬のPEG化は、タンパク質分解に対する抵抗を増大し、血漿中半減期を増加させ、抗原性と免疫原性を減少させることが報告されている。PEG化方法論の例は当該分野で知られている(例えば、 Lu and Felix、Int. J. Peptide Protein Res.、４３：１２７−１３８、１９９４；Lu and Felix、Peptide Res.、６：１４２−６、１９９３；Felix et al.、Int. J. Peptide Res.、４６ ：２５３−６４、１９９５；Benhar et al.、J. Biol. Chem.、２６９：１３３９８−４０４、１９９４；Brumeanu et al.、J Immunol.、１５４：３０８８−９５、１９９５；Caliceti et al.(２００３)Adv. Drug Deliv. Rev. ５５（１０）：１２６１−７７、およびMolineux(２００３)Pharmacotherapy ２３(８ Pt ２）：３S−８S参照）。PEG化は、in vivoでの核酸分子の送達にも用いることができる。例えば、アデノウイルスのPEG化は安定性と遺伝子伝達を増大することができる（例えば、Cheng et al.(２００３)Pharm. Res. ２０（９）：１４４４−５１参照）。
大容量を投与する場合は、投与は典型的には注入による。対象に以下の注入速度で投与することができる：ちょうどまたは約０.５ml／kg／BW／h〜５ml／kg／BW／h、例えば、ちょうどまたは約０.５ml／kg／BW／h、１ml／kg／BW／h、２ml／kg／BW／h、３ml／kg／BW／h、４ml／kg／BW／h、または５ml／kg／BW／h。注入速度は、経験的に決定することができ、典型的には対象の耐容性に依存する。有害反応が注入中に起きる場合は、注入速度を、有害事象が生じる速度よりわずかに低い速度に下げることができる。有害事象が速度を下げることで解決する場合は、注入速度を医師の裁量で徐々に上げることができる。IG共製剤の皮下注入は、重力、望む用量(例えば、全用量で２０〜３０グラム)のポンプ注入または注射により促進することができる。一般的には、注入には静脈内注入ポンプを用いることができる。ＩＧ／ヒアルロニダーゼ共製剤は、ちょうどまたは約５ml／h、１０ml／h、３０ml／h、６０ml／h、１２０ml／h、２４０ml／h、または３００ml／hの速度で注入することができる。患者が注入に耐える限り、治療のコース中に注入速度を増加することができる。一般的には、注入の投与時間は、ちょうどまたは約０.５h、１h、１.５h、２h、２.５h、３h、４ hまたはそれ以上である。ヒアルロニダーゼと共製剤化したIGの皮下投与により高速度での注入が達成されることにより、注入時間は常套的IVIG療法よりきわめて短い。注入時間が望ましい限度を超える場合は、医師や対象の裁量で第2の注入部位を開始することができる。典型的には、第2部位は、最初の部位から少なくとも10cmで開始する。
注入技術は、当業者に知られており、治療する医師の技術の範囲内である。一般的には、ＩＧ／ヒアルロニダーゼ共製剤の適切な用量を標準的IVバッグにプールすることができる。例えば、末端付近にYポートを有する無通気口注入セットを用いることができる。24ゲージの皮下注入針を対象の好みの部位に挿入することができるが、注入する溶液の容量のため、腹部、第2番目は大腿部が推奨される。ヒアルロニダーゼおよびIGを同じYポート装置に供給することができる。本発明では重力やポンプで注入するために他の製品を用いることもでき、これには限定されるものではないが、チューブ、ボトル、シリンジ、または他の容器が含まれる。
注入に耐えられない場合(例えば、中等度〜重度の局所反応が生じる)は、対象が全用量を受け取るように第2注入部位を開始することができる。
さらに、本発明の安定な共製剤は、周期的な投与頻度を含む投与計画に受け入れられる。例えば、投与頻度は、連日または隔日、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０日、またはそれ以上の一定の時間間隔にわたり1日1回でありうる。他の例では、投与計画は、毎週、例えば毎週、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、またはそれ以上に1回である。すなわち、ＩＧ／ヒアルロニダーゼ製剤は、一度に投与するか、または時間間隔で投与する多くの小用量に分割することができる。選択したＩＧ／ヒアルロニダーゼ製剤は、治療時間の経過にわたり、例えば数時間、数日間、数週間、または数ヶ月間にわたり1またはそれ以上の用量を投与することができる。正確な用量および投与方針は、適応症と患者の耐容性に依存すると理解される。
正確な用量と治療期間は治療する疾患により、既知の試験プロトコールを用いるか、in vivoまたはin vitro試験データからの推測により経験的に決定することができると理解される。濃度および投与量の値も軽減すべき病状の重症度によって変化しうることに注意すべきである。あらゆる特定の対象に対する具体的投与計画は、個体の供給と該組成物の投与者または投与管理者の専門的判断に従って経時的に調整すべきであり、本明細書に記載の濃度範囲は、単に例示であって、組成物やそれを含む混合物の範囲や使用を限定するものではないことも理解すべきである。該組成物は、毎時間、毎日、毎週、毎月、毎年、または1回投与することができる。一般的には、毒性を制限するために投与計画を選択する。担当医は、毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓、または他の組織の機能不全により用量を下げるために治療を終了、中断、または調整する方法と時がわかるであろうことに注目すべきである。反対に、担当医は、臨床反応が適切ではない場合に治療をより高レベルに調整する(毒性副作用が起きないようにする)方法と時も知っているだろう。
G. 安全性、活性、バイオアベイラビリティ、および薬物動態の評価方法
該製剤中のIGおよびヒアルロニダーゼの安定性と活性は、当業者に知られた種々のin vitroおよびin vivoアッセイを用いて評価することができる。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術が当該分野で利用可能であり、Peptide and Protein Drug Delivery、２４７−３０１、Vincent Lee編、Marcel Dekker、Inc.、New York、N.Y.、Pubs.(１９９１）、およびJones、A. Adv. Drug Delivery Rev. １０：２９−９０(１９９３）に記載されている。安定性は、選択した期間、選択した温度で測定することができる。
IGの分子の大きさ（例えば、凝集、変性および／または断片化によって生じる）を評価するアッセイは、該共製剤の安定性を評価するための重要な検討事項である。さらに、液体製剤の安定性は、該製剤中のIGおよびヒアルロニダーゼの生物活性を測定するあらゆるアッセイにより評価することもできる。そのようなアッセイは当該分野でよく知られている。該共製剤の安定性を評価するのに加えて、そのようなアッセイは、例えば、治療のための免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼの適切な用量と投与頻度を決定するのに用いることもできる。さらに、当業者に知られたアッセイを、皮下投与した免疫グロブリンのバイオアベイラビリティと耐容性を含む薬力学的特性を評価するのに用いることもできる。
１. 分子の大きさ
主な安定性を示すパラメータは分子の大きさであり、サイズ変化は変性、凝集、または断片化による分解の結果でありうる。IGの凝集は、IG生成物の保存中の一般的問題である。凝集物は、患者血液中の補体と結合し、抗補体反応をもたらすため問題である。IGの補体と結合する能力は、特に高分子種との凝集による変性の結果として顕著に増加する。この凝集物の補体結合メカニズムは、抗原−抗体複合体のそれと同じようである。Marcus、D. M.，(１９６０)J. Immunol. ８４：２７３−２８４。IgGの場合は、補体結合部位には互いに近接した2分子が必要であることが知られている。したがって、いかなる必要な構造変化よりも分子の重要なパッキングが必要である可能性がある。
本明細書および本明細書の実施例に記載の方法を含むIGの安定性をモニターする方法が当該分野で利用可能である。タンパク質の物理および化学的構造、およびその生物活性に基づく、抗体または免疫グロブリン製剤を含むタンパク質製剤の安定性を評価するために種々の方法が利用可能である。例えば、タンパク質の凝集、断片化、および変性について試験するために、荷電移動吸収、熱分析、蛍光分光法、円偏光二色性、NMR、還元キャピラリーゲル電気泳動（rCGE）、および高速サイズ排除クロマトグラフィ（HPSEC）などの方法が利用できる。例えば、Wang et al.、１９８８、J. of Parenteral Science & Technology ４２（supp）：S４−S２６参照。rCGEおよびHPSECは、タンパク質凝集物の形成、タンパク質分解、およびタンパク質断片化による分子の大きさを評価するための最も一般的で簡単な方法である。さらに、抗補体活性(ACA)を直接測定することができる。例えば、液体製剤の安定性は、HPSECまたはrCGEにより評価することができ、ピークの面積パーセントは非分解タンパク質を表す。一つの例として、タンパク質をTosoH Biosep TSK G３０００ SW ６００ x ７.５ mmカラムに注射する。タンパク質を溶出し、溶出されたタンパク質を280nmのUV吸収を用いて検出する。アッセイでは標準品をコントロールとして操作し、結果を、含まれる容量ピークを除く全ての他のピークと比べた生成物のモノマーピークの面積パーセントをして報告する。モノマーピークより早く溶出されるピークを凝集物パーセントとして記録する。
ACA価を欧州薬局方に記載のごとく決定することができる（European Pharmacopeia、１９９７，第２版、Part II. Maisonneuve、S.A.、Saint Ruffine、France）。一般的には、ACA価は、静脈内(IV)投与のための指定指標であり、該共製剤の皮下投与とは関連がない。すなわち、本発明の目的において、一般的に、ACA値は皮下投与用に製剤化された共製剤に対する決定指標ではない。
一般的には、ACAアッセイは、標準化した量の補体とタンパク質の混合物により結合した補体の量を測定する（例えば、Palmer、D. F. and Whaley、S. D.、Complement Fixation Test、Manual of Clinical Laboratory Immunology中(N. R. Rose、et al.編、American Society for Microbiology、Washington、D. C.、１９８６)pp. ５７−６６.；Mayer、M. M.、Quantitative C' Fixation Analysis、Complement and Complement Fixation、Experimental Immunochemistry中（E. A. Kabat and M. M. Meyer編、Thomas、Springfield、III.、１９６１）、pp. ２１４−２１６、２２７−２２８参照）。簡単には、赤血球抗体とプレインキュベーションして感作した赤血球を補体／タンパク質混合物に加える。遊離補体(すでにタンパク質と結合していない)の存在下でこの感作した細胞は溶解してヘモグロビンを放出し、これを溶解度の尺度として定量することができる。並行して、感作した赤血球を、緩衝コントロール−補体混合物にも加え、その溶解度を100％と定義する。100％の溶解をもたらすのに必要な補体の実際の量とタンパク質の存在下で結合しないままの補体の量の差は、タンパク質に実際に結合した補体の量、すなわち抗補体活性に等しい。ACA活性の1単位(1CH５０単位）は、最適に力価測定した補体および赤血球／ヘモリシン系中の補体の50％を活性化することができるタンパク質の量である。一般的には、許容されるACA価は、消費されるCH５０単位／mgタンパク質が50％以下である。
別の例において、例えば、液体共製剤の保存中の凝集物形成による分子の大きさの分布は、経時的に溶液中の可溶性タンパク質の変化を測定することにより腰囲に決定することができる。溶液中の可溶性ポリペプチドのりょうは、多くの分析的アッセイにより定量することができる。そのようなアッセイには、例えば逆相(RP)−HPLCおよびUV吸収分光法が含まれる。液体製剤の保存中の可溶性および不溶性凝集物の測定は、例えば可溶性凝集物として存在する可溶性ポリペプチドの部分と非凝集物(生物活性分子の形)で存在する部分を区別するための分析的超遠心分離を用いて達成することができる。
さらなる例では、共製剤の安定性は、完成した生成物を57℃に加熱し、その温度に4時間保ちながら、目に見える沈殿物を観察することにより評価することができる。（例えば、Code of Federal Regulations ２１、Food and Drugs、６４０. １０１a(１９７８年4月改訂）参照）。該方法の改良法(例えば、Fernandes and Lundblad、Vox Sang ３９：１０１−１１２（１９８０）参照）、約2mlの被験生成物を4時間57℃に加熱し、次いで実験用分光光度計で580nmの透過率を記録することにより測定される乳光度の変化パーセントを評価する（米国特許No. ４，５９７，９６６も参照のこと）。
SDS−PAGEを用いて凝集および／または断片化を評価することもできる。放射性同位元素でまたは標識した各バンドの密度または放射能を測定し、非分解タンパク質を示すバンドの密度％または放射能％を得ることができる。
一般的には、該共製剤は、上記のあらゆるアッセイ(例えば、HPSECまたはrCGE)で測定して低〜検出不能レベルの凝集を示す。例えば、凝集は、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、および一般的には０.５％(タンパク質重量)以下であり、および低〜検出不能レベルの断片化、すなわち、ピークの総ピーク面積の８０％またはそれ以上、８５％またはそれ以上、９０％またはそれ以上、９５％またはそれ以上、９８％またはそれ以上、または９９％またはそれ以上、または９９.５％またはそれ以上は完全な抗体またはその断片を示す。例えば、典型的には、許容される凝集は、＞９０％モノマーおよびオリゴ−／ダイマー；＜５％凝集物、および＜５％断片である。
２. 生物活性
a. 免疫グロブリン
治療薬として作用する免疫グロブリンの能力は、in vitroまたはin vivoで評価することができる。例えば、in vitroアッセイを実施し、ウイルスまたは細菌の感染力を中和する免疫グロブリンの能力を評価することができる（Hiemstra et al.，(１９９４)J Lab Clin Med １２３：２４１−６）。他のin vitroアッセイを利用して、免疫グロブリンの他の生物活性を評価することができる。例えば、補体活性化生成物と相互作用してそれを調節し、イデオタイプ抗体と結合し、マクロファージ上のFcレセプターと結合し、サイトカイン、ケモカイン、およびメタロプロテアーゼをふくむ種々の炎症メディエーターを抑制する免疫グロブリン製剤の能力は、限定されるものではないが、ELISA、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、およびマーカー発現を評価するためのフローサイトメトリーを含む当該分野で知られたあらゆる方法を用いて評価することができる。例えば、末梢血単核細胞上のケモカインレセプターの発現に対する免疫グロブリンの作用はフローサイトメトリーを用いて評価することができる（Trebst et al.，(２００６)Eur J Neurology １３（１２）：１３５９−６３）。別の例において、マクロファージにおけるメタロプロテアーゼの発現に対する免疫グロブリンの作用は、ノーザンブロット分析を用いて評価することができる（Shapiro et al.，(２００２)Cancer ９５：２０３２−２０３７）。
動物モデルを用いるin vivo試験を実施して免疫グロブリンの治療活性を評価することもできる。免疫グロブリンを1またはそれ以上の微生物を感染させた動物モデルに投与し、感染の進行に対する効果を、例えば微生物数を測定するか、または罹患率のマーカーとして重量を測定することにより評価することができる。免疫グロブリンの治療効果は、免疫グロブリンを用いる治療が考慮されるシッパンおよび病状の動物モデルを用いて評価することもできる。そのような動物モデルは当該分野で知られており、限定されるものではないが、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA）、SCID、ウイスコット−アルドリッチ（Wiskott−Aldrich）症候群、川崎病、ギランバレー症候群、ITP、多発性筋炎、ランバート−イートン（Lambert−Eaton）筋無力症候群、重症筋無力症、およびメルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群 の小動物モデルが含まれる（Czitrom et al.(１９８５)J Immunol １３４：２２７６−２２８０、Ellmeier et al.，(２０００)J Exp Med. １９２：１６１１−１６２４、Ohno(２００６)Drug Discovery Today：Disease Models ３：８３−８９、Oyaizu et al.(１９８８)J Exp Med ２０１７−２０２２、Hansen et al.，(２００２)Blood １００：２０８７−２０９３、Strongwater et al.，(１９８４)Arthritis Rheum. ２７：４３３−４２、Kim et al.(１９９８)Annals NY Acad Sci ８４１：６７０−６７６、Christadoss et al.(２０００)Clin. Immunol. ９４：７５−８７、Sommer et al.，(２００５)Lancet ３６５：１４０６−１４１１、および米国特許No.７，３０９，８１０）。
b. ヒアルロニダーゼ
ヒアルロニダーゼ活性は、当該分野でよく知られた方法を用いて評価することができる。一つの例としては、微小濁度アッセイを用いて活性を測定することができる。これは、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合する時に不溶性沈降物が形成されることに基づく。該活性は、ヒアルロニダーゼをヒアルロン酸ナトリウム（ヒアルロン酸）と一定期間(例えば10分間)インキュベーションし、次いで酸性化血清アルブミンを添加して非消化ヒアルロン酸ナトリウムを沈降させることにより測定することができる。得られた試料の濁度を、さらなる発生期間後に640nmで測定する。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対するヒアルロニダーゼ活性から生じる濁度の減少は、ヒアルロニダーゼの酵素活性の尺度である。別の例において、ヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼとインキュベーションした後に残存するビオチン化ヒアルロン酸を測定するマイクロタイターアッセイを用いて測定する（例えば、Frost and Stern(１９９７)Anal. Biochem. ２５１：２６３−２６９、米国特許Publication No. ２００５０２６０１８６参照）。ヒアルロン酸のグルクロン酸残基上の遊離カルボキシル基をビオチン化し、ビオチン化ヒアルロン酸基質をマイクロタイタープレートと共有結合させる。ヒアルロニダーゼとインキュベーションした後、残りのビオチン化ヒアルロン酸基質をアビジン−パーオキシダーゼを用いて検出し、既知の活性のヒアルロニダーゼ標準品との反応後に得られるものと比較した。他のヒアルロニダーゼ活性を測定するアッセイも当該分野で知られており、本発明の方法に用いることができる（例えば、Delpech et al.，(１９９５)Anal. Biochem. ２２９：３５−４１；Takahashi et al.，(２００３)Anal. Biochem. ３２２：２５７−２６３参照）。
拡散(spreadingまたはdiffusing)剤として作用するヒアルロニダーゼの能力も評価することができる。例えば、トリパンブルー色素を、ヌードマウスの両外側部にヒアルロニダーゼと共に、またはヒアルロニダーゼなしで皮下注射することができる。次に染色領域を、例えばマイクロキャリパーを用いて測定し、ヒアルロニダーゼの拡散剤として作用するヒアルロニダーゼの能力を決定することができる(米国特許No.２００６０１０４９６８）。
３. 薬力学および耐性
薬物動態試験および耐容性試験を動物モデルを用いて実施するか、または患者を用いた臨床試験中に実施することができる。動物モデルには、限定されるものではないが、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、モルモット、および非ヒト霊長類モデル、例えばカニクイザルもしくはアカゲザルが含まれる。ある場合には、薬物動態および耐容性試験は健康な動物を用いて行う。別の例では、該試験を、免疫グロブリンによる治療が考えられる疾患の動物モデル、例えば下記疾患および病状のいずれかを用いて行うことができる。
皮下投与した免疫グロブリンの薬物動態は、投与後に、最大(ピーク)血漿免疫グロブリン濃度（Cmax）、ピーク時間（すなわち、最大血漿免疫グロブリン濃度が生じるとき(Tmax）、最小血漿免疫グロブリン濃度（すなわち、免疫グロブリンの用量間の最小血漿濃度；Cmin）、排出半減期（T１／２）、および曲線下面積（すなわち、時間対血漿免疫グロブリン濃度をプロッティングして得られる曲線下面積；AUC）などのパラメーターを測定することにより評価することができる。皮下投与した免疫グロブリンの絶対的バイオアベイラビリティを、皮下送達後の免疫グロブリンの曲線下面積（AUCsc）を静脈内送達後の免疫グロブリンのAUC（AUCiv）を比較して測定する。絶対的バイオアベイラビリティ（F）は、式：F =(［AUC］sc × 用量sc)／(［AUC］iv × 用量iv）を用いて計算することができる。皮下投与後の血漿中の免疫グロブリン濃度は、血液試料中の免疫グロブリンの濃度を評価するのに適した当該分野で知られたあらゆる方法を用いて測定することができる。典型的な方法には、限定されるものではないが、ELISAおよび比濁法が含まれる。
薬物動態試験において、ある範囲の用量および種々の投与頻度で投与し、用量中の免疫グロブリンおよび／またはヒアルロニダーゼの濃度の増加または減少の影響を評価することができる。皮下投与した免疫グロブリンの薬力学的特性、例えばバイオアベイラビリティも、ヒアルロニダーゼの同時投与を行うかまたは行わないことで評価することができる。例えば、イヌ、例えばビークルに免疫グロブリンを単独またはヒアルロニダーゼと組み合わせて投与することができる。免疫グロブリンの静脈内投与も別のビークル群に投与する。次に、血液試料を種々の時点で得、血漿中の免疫グロブリンの量を比濁法などにより測定する。次に、AUGを測定し、ヒアルロニダーゼと共にかまたは単独で皮下投与した免疫グロブリンのバイオアベイラビリティを測定することができる。そのような試験を実施し、皮下投与した免疫グロブリンの薬力学的特性、例えばバイオアベイラビリティに対するヒアルロニダーゼの同時投与の影響を評価することができる。
安全性と耐容性を評価するための試験も当該分野で知られており、本発明において用いることができる。ヒアルロニダーゼの同時投与を伴うか伴わない免疫グロブリンの皮下投与後の有害反応の発現をモニターすることができる。有害反応には、限定されるものではないが、注射部位の反応(例えば浮腫または腫脹)、頭痛、発熱、疲労、悪寒、紅潮、めまい、蕁麻疹、喘鳴もしくは胸部圧迫感、悪心、嘔吐、硬直、腰痛、胸痛、筋痙攣、発作または痙攣、血圧変化、およびアナフィラキシーもしくは重度の過敏性反応も含まれうる。典型的には、安全性および耐容性試験においてある範囲の用量および種々の投与頻度で投与し、用量中の免疫グロブリンおよび/またはヒアルロニダーゼの濃度の増加または減少の効果を評価する。
H. 処置方法および治療用途
本明細書に記載のＩＧ／ヒアルロニダーゼ共製剤を、免疫グロブリンを用いるあらゆる病状の治療に用いることができる。免疫グロブリン（ＩＧ）を、ヒアルロニダーゼとの共製剤で皮下投与し、免疫グロブリンを用いて治療することができるあらゆる病状を治療することができる。本項は、ＩＧ／ヒアルロニダーゼ共製剤の典型的治療的使用を示す。本発明のＩＧ／ヒアルロニダーゼ共製剤を、下記疾患および病状ならびにIGで治療可能な当業者に知られた他の疾患および病状を治療するための方法、プロセス、もしくは用途に用いることができると理解される。特に、該共製剤の皮下投与が予期される。投与するIGの用量は、当業者に知られた静脈内投与の用量と同じかまたは同様である。投与計画および頻度は、本明細書の他所に記載のように静脈内投与計画と異なり得る。下記に治療的使用を例示するが、本明細書に記載の方法の適用を制限するものではない。
例えば、本明細書に記載の共製は、免疫不全、例えば一次免疫不全、例えばX連鎖無ガンマグロブリン血症、低ガンマグロブリン血症、および後天性免疫不全病状（二次免疫不全）、例えば低抗体レベルを特徴とするもの；炎症性疾患および自己免疫疾患；および急性感染症の治療に用いることができる。治療的使用には、限定されるものではないが、種々の免疫学的、血液学的、神経学的、炎症性、皮膚、および/または感染性疾患および病状のための免疫グロブリン補充療法および免疫修飾治療が含まれる。ある例としては、免疫グロブリンを投与して、感染性疾患に曝された可能性がある場合(事故的針刺し損傷後など)などの健康な患者の免疫反応を増強する。本発明のＩＧ共製剤は、多発性硬化症（特に、再発寛解型多発性硬化症またはRRMS）、アルツハイマー病、およびパーキンソン病を治療するために用いることもできる。そのような疾患または病状を特定することは治療する医師の技術内である。
免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤は、これら疾患および病状の治療に用いる他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、投与することができる他の薬剤には、限定されるものではないが、抗生物質、化学療法剤、ステロイド性抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症剤、および他の免疫調節剤、例えばサイトカイン、ケモカイン、および成長因子が含まれうる。
必要であれば、特定の用量および継続期間、および治療プロトコールを経験的に決定または外挿することができる。例えば、静脈内投与する免疫グロブリンの典型的用量を適切な用量を決定するための出発点として用いることができる。用量レベルは、以下の種々の因子に基づいて決定することができる：例えば、個体の体重、一般的健康状態、年齢、用いる具体的化合物の活性、性別、食事、投与回数、排泄速度、薬剤の組み合わせ、疾患の重症度と経過、および患者の疾患に対する素因、ならびに治療する医師の判断。免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼの典型的用量は本明細書の他の箇所に記載している。投与量は、治療する兆候、および耐容される考えられる副作用に依存するだろう。用量は、各疾患に対する認められたモデルを用いて実験的に決定することができる。
患者の病状が改善したら、免疫グロブリンの維持用量を必要であればヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができ、用量、剤形、または投与頻度、またはそれらの組み合わせを修飾することができる。ある場合には、対象は、疾患の症状が再発すると長期にわたり間欠的治療が必要となることがある。
１. 一次および二次免疫
a. 一次免疫不全
８０以上の原発性免疫不全疾患が世界保健機構により認められており、10,000人の個体の約1人に生じる。これらの疾患は、ある場合には、身体は感染症に対する抗体を全くまたは充分に産生することができない免疫系の固有の欠陥を特徴とする。他の場合には、感染症に対する細胞性防御が適切に機能しない。免疫グロブリンを用いて抗体欠乏症を伴う一次免疫不全を治療することができる。すなわち、免疫グロブリンを、そのような疾患を示す患者に免疫グロブリン補充療法として投与することができる。
典型的には、一次免疫不全は遺伝疾患である。一次免疫不全の例には、限定されるものではないが以下のものが含まれる：分類不能型免疫不全症（CVID）、選択的ＩｇＡ欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症、X連鎖無ガンマグロブリン血症（XLA）、重症複合型免疫不全(SCID）、補体疾患、毛細血管拡張性運動失調症、高ＩｇＭ症、およびWiskott−Aldridge症候群。免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤を、免疫グロブリンの静脈内投与に用いる用量と同様の用量で抗体欠乏症を伴う原発性免疫不全疾患の患者に皮下投与することができる。典型的用量には、例えば、１００ｍｇ／ｋｇBW〜８００ｍｇ／ｋｇBW免疫グロブリン(4週間間隔)が含まれる。臨床反応に応じて用量および投与頻度を増減することができる。
b. 二次免疫不全
二次または後天性免疫不全は、遺伝的遺伝子異常の結果ではなく、むしろ免疫系が免疫系以外の因子により危険にさらされている個体に生じる。例には、限定されるものではないが、外傷、ウイルス、化学療法、毒素、および汚染が含まれる。後天性免疫不全症候群(AIDS)は、Tリンパ球の枯渇により身体が感染と戦うことができなくなるヒト免疫不全ウイルス(HIV)により生じる二次免疫不全障害の例である。
別の例の低ガンマグロブリン血症は、Bリンパ球の欠乏により生じ、血中の抗体レベルが低いことを特徴とし、慢性リンパ性白血病（CLL）、多発性骨髄腫（MM）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、および白血病関連免疫機能不全と治療関連免疫抑制の両方の結果としての他の関連悪性腫瘍の患者に生じうる。そのような血液悪性疾患に続発する後天性低ガンマグロブリン血症の患者、および造血幹細胞移植後の患者は細菌感染に感受性である。液性免疫の不全は、特に被嚢性微生物によるこれらの患者における感染関連罹病率と罹患率が増加する危険性に大きな役割を果たす。例えば、肺炎連鎖球菌、インフルエンザ菌、および黄色ブドウ球菌、ならびにレジオネラおよびノカルジア種は、CLLの患者に肺炎を起こすよく見られる細菌病原体である。Pneumocystis carinii、真菌、ウイルス、およびミコバクテリアなどの日和見感染を観察されている。これら患者における感染の数と重症度を、免疫グロブリンの投与により顕著に低下させることができる（Griffiths et al.(１９８９)Blood ７３：３６６−３６８；Chapel et al.(１９９４)Lancet ３４３：１０５９−１０６３）。
したがって、免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤をそのような患者に皮下投与し、再発性感染症を抑制することができる。典型的用量には、血液悪性疾患に続発する後天性低ガンマグロブリン血症の患者に対する免疫グロブリンの静脈内投与に用いる用量が含まれる。例えば、約４００ｍｇ／ｋｇ BW免疫グロブリンを含む共製剤は3〜4週間毎に皮下投与することができる。さらなる例において、４００ｍｇ／ｋｇ BWのさらなる用量を、患者の血清IgGが４g／L以下である場合に治療の最初の月に投与することができる。投与する免疫グロブリンの量および投与頻度は適宜増減することができる。
2． 炎症性疾患および自己免疫疾患
a. 川崎病
川崎病は、しばしば冠状動脈を侵す子供と年少乳児の急性発熱性多系統疾患である。川崎病は、リンパ節症候群、皮膚粘膜リンパ節疾患、幼児多発動脈炎、および川崎症候群としても知られる。川崎病は、皮膚、粘膜、リンパ節、血管壁および心臓を含む多器官を侵す、ほとんど解明されていない自己限定性血管炎である。冠状動脈瘤が、回復期の疾患の第2週目から生じうる。該病状の原因は不明であるが、特徴的な血管炎が未知の抗原に対するT細胞とマクロファージの活性化、サイトカインの分泌、ポリクローナルB細胞活性過剰、および内皮細胞と平滑筋細胞に対する自己抗体の形成を特徴とする免疫反応から生じる証拠がある。遺伝子的に感受性のある個体において、おそらく超抗原活性を有する1またはそれ以上の未同定の一般的感染性物質が該疾患を引き起こすかもしれない。
川崎病の初期に投与した免疫グロブリンは、冠状動脈の病変を予防しうる。川崎病に伴う炎症が継続している患者に対する免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤の皮下投与は、症状を改善させることができる。典型的用量には、川崎病の患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、川崎病の患者に約1〜2g／kg患者体重の免疫グロブリンを投与することができる。これは、約４００ｍｇ／ｋｇ BWの4用量を4日間連続で投与することができる。別の例では、１g／kg BWの免疫グロブリンを単用量として10時間にわたり投与する。投与する免疫グロブリンの量は適宜増減することができる。
b. 慢性炎症性脱髄性神経障害
慢性炎症性脱髄性神経障害（CIDP）は、脚と腕の感覚機能低下と脆弱化を特徴とする神経学的障害である。慢性再発性多発ニューロパシーともいうことがある該疾患は、末梢神経のミエリン鞘に対する障害により引き起こされる。該疾患は、あらゆる年齢の両方の性に生じ得るが、CIDFは若年でより一般的であり、女性より男性でより多い。該疾患は、刺痛または無感覚(つま先と指に始まる)、腕と脚の脆弱化、深部腱反射の消失(反射消失)、疲労、および知覚異常を含む症状を示す。CIDPは、ギランバレー症候群と密接な関連があり、その急性疾患の慢性的対応物であると考えられる。特定の診断試験はないが、特徴的臨床的または研究室的知見は、本疾患を他の免疫性ニューロパシー症候群と区別するのを助ける。
試験は、免疫グロブリンによる治療は、症状を減少させることを示すvan Schaikら（２００２)Lancet Neurol. １：４９７−４９８）。すなわち、免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤を本明細書に記載の方法を用いてCIDPの患者に皮下投与することができる。例示的用量には、CIDP患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。一つの例としては、CIDP患者には、約２g／kg BWの免疫グロブリンをヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与する。これは、例えば４００ｍｇ／ｋｇ BWの5用量を5日間連続で投与することができる。投与する免疫グロブリンの量は適宜増減することができる。
c. ギランバレー症候群
ギランバレー症候群は、末梢神経の炎症性脱髄を伴う神経学的自己免疫疾患である。第1症状は、種々の程度の脚部の脆弱化またはヒリヒリ感を含み、これは腕や上体に広がりうる。該症状は、筋肉を全く使えなくなるまで強度が増しうるし、該患者はほとんど完全に麻痺し、生命を脅かす状態をもたらす。快復は大多数の患者で一般的に良好であるか完全であるが、永続的な障害が全患者の約20％に、死亡が患者の4〜15％に報告されている。ギランバレー症候群は、呼吸器または消化管のウイルス感染の症状の後数日または数週間に生じうる。例えば、外科手術やワクチン接種が症状を引き起こしうる。該障害は、数時間または数日間の経過にわたり発現することがあり、また3〜4週間かかることがある。神経伝導速度(NCV)試験は、医師に診断を助けるヒントを与えることができる。例えば、典型的にはギランバレー症候群の患者の脳脊髄液は典型的には清浄対象より多くのタンパク質を含むので腰椎穿刺を診断に用いることができる。
ギランバレー症候群に対する治療法は知られていないが、免疫グロブリンを用いる治療は、該疾患の重症度を弱め、快復を促すことができる。免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤を、IGの適切な用量、例えばギランバレー症候群の患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量と同様の用量で皮下投与することができる。例えば、ギランバレー症候群の患者に、約２g／kg BWの免疫グロブリンをヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。該製剤は、例えば４００ｍｇ／ｋｇ BWの5用量を5日間連続で投与することができる。投与する免疫グロブリンの量は、例えば疾患の重症度や当業者が容易に評価することができる治療の臨床反応に応じて増減することができる。
d. 特発性血小板減少性紫斑病
原発性免疫性血小板減少性紫斑病および自己免疫性血小板減少性紫斑病としても知られる特発性血小板減少性紫斑病（ITP）は、抗血小板抗体による血小板生存の短縮によって生じる血小板数の減少(血小板減少症)である。血小板数が非常に低い(例えば＜３０×１０９／L）場合は、皮膚(紫斑)や粘膜内に出血が生じうる。ITP患者の骨髄血小板産生(巨核球増生)は形態学的に清浄である。例えば、血小板表面上の糖タンパク質と結合する抗体に関連する血小板機能のさらなる不全がある。ITPは、慢性型と急性型がありうる。ITPの成人の約80％は慢性型である。慢性ITPの発生率が最も高いのは15〜50歳の女性であり、いくつかの報告は年齢と共に発生率が増加することを示唆している。ITPは、HIV患者に比較的一般的である。ITPは感染症のあらゆる段階でみることができるが、その有病率はHIV病の進行につれて増加する。
研究は、免疫グロブリンを用いてITP患者を治療することができることを証明している（Godeau et al.(１９９３)Blood ８２（５）：１４１５-２１；Godeau et al.(１９９９)Br. J. Haematol. １０７（４）：７１６-９）。免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤はITP患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量と同様のIg用量で患者に皮下投与することができる。例えば、ITP患者に、約１〜２g／kg BWの免疫グロブリンをヒアルロニダーゼと組み合わせて皮下投与することができる。該製剤は、数日間にわたり投与するか、または1回用量で投与することができる。ある例としては、5用量の４００ｍｇ／ｋｇ BW 免疫グロブリンを連日投与する。別の例では、1g／kg BWを、血小板数と臨床反応に応じて1〜2日間連日で投与する。投与する免疫グロブリンの量と投与頻度は、血小板数と当業者が容易に評価することができる治療に対する臨床反応に応じて増減することができる。
e. 炎症性筋障害
炎症性筋障害は、骨格筋組織の炎症と変性を伴う一群の筋疾患である。これらの後天性障害はすべて、顕著な筋肉の脆弱化と筋肉内の炎症反応の存在を示す。
i. 皮膚筋炎
皮膚筋炎（DM）は、瞼、頬、および鼻梁、ならびに背中または上胸部、肘、膝、および指関節の斑状、色の濃い(dusky)、赤みを帯びた、または薄紫色の発疹として生じる特徴的な発疹により最も容易に認識される炎症性筋障害である。患者によっては、皮下に灰化結節や硬い瘤ができる。発疹は、筋肉の脆弱化に先立つことが多く、典型的には数週間にわたり発現するが、数カ月間に及ぶことも数日間のこともある。皮膚筋炎は、子供から大人まであらゆる年齢に生じ、男性より女性によく見られる。DM患者の約1/3に燕下困難が報告されている。DMの子供の50％以上が筋痛と圧痛を訴えるが、一般的にこの発生はDMの成人では25％以下である。
ii. 多発性筋炎
多発性筋炎（PM）には皮膚筋炎の特徴的な発疹がなく、筋肉の脆弱化の発現は通常DMより遅く進行する。多くのPM患者は燕下困難を示す。ある場合では、患者は筋不全により呼吸困難も呈する。PM患者の1/3に筋痛がある。該疾患は男性より女性に多く、20歳以下のヒトでは希であるが、幼児と乳幼児の多発性筋炎の症例が報告されている。
iii. 封入体性筋炎
封入体性筋炎（IBM）は多発性筋炎とよく似ている。IBMにおける筋肉の脆弱化の発生は、通常非常に緩やかであり、数カ月や数年間かけて発生する。一般的に、PMでは近位筋のみが罹患するが、IBMでは、近位筋と遠位筋の両方が罹患する点でPMと異なる。典型的な所見には、手関節屈筋群と指の屈筋群の脆弱化が含まれる。前腕の筋肉と大腿四頭筋の萎縮が本疾患の特徴であり、他の筋肉の脆弱化の程度は様々である。IBM患者の約半分に燕下困難がある。IBMの症状は通常、50歳後に始まるが、除外される年齢群はない。IBMは女性より男性により頻繁に生じる。IBM症例の10例中約1例が遺伝性かもしれない。
研究は、免疫グロブリンの投与がこれらの炎症性筋障害の患者に有益でありうることを示唆する。免疫グロブリンは筋肉の強度を改善し、炎症を減少させ、疾患の進行と重症度を減少させることができる（Dalakas et al.(１９９３)N. Engl. J. Med. ３２９（２７）：１９９３-２０００；Dalakas et al.(２００１)Neurology ５６（３）：３２３-７； Dalakas(２００４)Pharmacol. Ther. １０２（３）：１７７-９３；Walter et al.(２０００)J. Neurol. ２４７（１）：２２-８）。免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤は、DM、PM、またはIBMの患者に、免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量と同様のIG用量で皮下投与することができる。例えば、２g／kg BWの免疫グロブリンを典型的には数日間かけて、例えば４００ｍｇ／ｋｇ BWの5用量を連日投与することができる。
f. ランバート−イートン（Lambert−Eaton）筋無力症候群
ランバート−イートン（Lambert−Eaton）筋無力症候群（LEMS）は、希な自己免疫性の神経筋伝達障害であり、最初は肺癌と合併して、次いで新生物が検出されない症例で臨床的に確認された。LEMSの患者には、シナプス前神経筋接合部異常がある。該疾患は、臨床的に、近位筋の脆弱化、運動後の強度の増大、軽度の眼球運動兆候、深部腱反射の低下、および自律神経機能障害（ドライマウス、便秘、勃起不全）を特徴とする。
LEMS患者に対する免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤の皮下投与は、症状を改善させることができる。該共製剤のIGの典型的用量には、LEMS患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、LEMS患者に２g／kg BWの免疫グロブリンを数用量で投与することができる。例えば、４００ｍｇ／ｋｇ BW 免疫グロブリンの5用量を5日間連続で投与することができる。投与する免疫グロブリンの量は適宜増減することができる。
g. 多病巣性運動神経疾患
伝導ブロックを伴う多病巣性運動神経疾患（MMN）は、後天性免疫性脱髄性ニューロパシーであり、脆弱化の進行度は遅く、線維束性攣縮、および筋痙攣を伴い、顕著な感覚障害はみられない。疾患が数カ月間から15年間以上持続した後に疾患が診断される。MMNの正確な原因はわかっていない。組織病理学的検査および電気診断検査は、脱髄と軸索傷害の両方が存在することを示している。運動神経が主に冒されるが、知覚神経にも軽度の脱髄がみられる。免疫調節治療と免疫抑制治療の有効性は、MMNの免疫的特質をさらに裏付ける。MMN患者の半分以上で抗GM1抗体の力価が上昇する。該疾患における抗GM1抗体の役割は解っていないが、その存在はMMNの診断マーカーとして用いることができる。
MMN患者に対する免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤の皮下投与は、症状を改善させることができる。該共製剤中のIGの典型的用量には、MMN患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、MMN患者に２g／kg BWの免疫グロブリンを数用量で投与することができる。例えば、４００ｍｇ／ｋｇ BW 免疫グロブリンの5用量を5日間連続で投与することができる。別の例では、１g／kg BWを2日間連続で投与することができる。ある患者は維持療法を受けることができ、維持療法には、例えば４００ｍｇ／ｋｇ BW〜２g／kg BWの用量を2〜6週間毎に投与することが含まれうる。投与する免疫グロブリンの量は患者の反応を考慮して適宜増減することができる。
h. 重症筋無力症
重症筋無力症(MG）は、様々な程度の身体の骨格筋の脆弱化を特徴とする慢性自己免疫性神経筋疾患である。MGは、神経筋接合部の筋特異的チロシンキナーゼ(MuSK）またはアセチルコリンレセプター(AChR）に対する抗体の存在を伴うが、いくらかの患者は抗体陰性である。MGの臨床的特徴には、随意筋、特に眼瞼挙筋、外眼筋、眼球筋、四肢の筋肉、および呼吸筋の変動する脆弱化と易疲労感が含まれる。通常、患者には、瞼の片側または両側の下垂(下垂)、複視(二重視)、燕下困難(燕下障害)、および近位筋の脆弱化がみられる。呼吸筋の脆弱化は、重症例における呼吸不全や急性の重度の再燃(筋無力症クリーゼ)を生じうる。重症筋無力症は、すべての人種群の男女に生じる。最も一般的には、40歳前の若い成人女性と60歳以上の高齢男性に生じるが、あらゆる年齢に生じうる。ある場合には、症状を緩和するために胸腺摘出を行う。
免疫グロブリンは、例えば、典型的には他の治療が有効でないか、重度の副作用が生じている場合に、中等度〜重症のMG患者の維持療法として用いることができ、胸腺摘出前や該疾患の急性再燃時(筋無力症クリーゼ)に投与することもできる。免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤は、本明細書に記載の方法を用いてMG患者に皮下投与することができる。該共製剤のIGの典型的用量には、MG患者に免疫グロブリンを静脈内投与するのに用いる用量が含まれる。例えば、MG患者に、４００ｍｇ／ｋｇ BW〜２g／kg BWの用量を4〜6週間毎に維持療法として投与することができる。胸腺摘出前または筋無力症クリーゼ時に、１〜２g／kg BWを数用量で、例えば４００ｍｇ／ｋｇ BWの5用量を5日間連続で投与することができる。別の例では、１g／kg BWを2日間連続で投与することができる。
i. メルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群
全身硬直症候群(SPS)またはスティッフマン症候群としても知られるメルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群は、自己免疫疾患の特徴を示す希な神経疾患である。患者は、筋硬直と混合型一時的痙攣に関連する症状を示す。筋硬直は、主に腹部と胸腰部の体軸筋や四肢近位筋に広がる。典型的には、体幹の主動筋と拮抗筋の同時収縮は、脊柱前弯過度を伴う板様外観(board−like appearance)をもたらす。それほど多くはないが、呼吸筋に合併すると呼吸困難を、顔面筋に合併すると仮面様顔貌をもたらす。
免疫グロブリンによる治療は、メルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群の患者に硬直の減少と高い感受性スコアをもたらすことができる(Dalakas et al.(２００１)N. Engl. J. Med. ３４５（２６）：１８７０-６）。免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤は、本明細書に記載の方法を用いてメルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群の患者に皮下投与することができる。該共製剤のIGの典型的用量には、メルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltmann）症候群の患者に免疫グロブリンを静脈内投与するために用いる用量が含まれる。例えば、免疫グロブリンは、４００ｍｇ／ｋｇ BWの用量で5日間連続して投与することができる。ある患者には、例えば、4〜6週間毎の１〜２g／kg BW 免疫グロブリンを含む維持療法を施すことができる。免疫グロブリンの投与量は適宜増減することができる。
３. 急性感染症
免疫グロブリンは、限定されるものではないが以下のものを含む多くの細菌、ウイルス、および真菌の感染症に対する抗微生物作用を有することも示された：B型インフルエンザ菌；緑膿菌AおよびB型；黄色ブドウ球菌；B群連鎖球菌；肺炎連鎖球菌１、３、４、６、７、８、９、１２、１４、１８、１９、および２３型；アデノウイルス2および5型；サイトメガロウイルス；エプスタイン−バー（Epstein−Barr）ウイルス VCA；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；１型単純ヘルペスウイルス；２型単純ヘルペスウイルス；Ａ型インフルエンザウイルス；麻疹ウイルス；パラインフルエンザウイルス１、２、および３型；ポリオウイルス；水痘帯状疱疹ウイルス；アスペルギルス；およびカンジダアルビカンス。したがって、免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤を細菌、ウイルス、および真菌感染症の患者に皮下投与し、患者の免疫系を増強し、該疾患を治療することができる。ある例では、公知亜または他の抗微生物薬も投与することができる。
４. 他の疾患および病状
IG治療により治療可能な上記以外の他の疾患および病状の例には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる： 医原性免疫疾患；選択的抗体欠損症；急性播種性脳脊髄炎；ANCA−陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡； エバンス症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む）；胎児母体／新生児同種免疫性血小板減少症免疫性血小板減少症(FMAIT／NAIT）；血球貪食症候群；高リスク同種造血幹細胞移植；ＩｇＭ パラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；オプソクローヌスミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑症；中毒性表皮壊死症／スティーブンジョンソン症候群(TEN／SJS）；毒素性ショック症候群；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；骨髄移植；Ｂ細胞腫瘍；およびアルツハイマー病。
例えば、アルツハイマー病は、静脈内免疫グロブリン処置を含む(例えば、Dodel et al.(２００４)J. Neurol. Neurosurg. Psychiatry ７５：１４７２−４；Solomon et al.(２００７)Curr. Opin. Mol. Ther. ９：７９−８５；Relkin et al.(２００８)Neurobiol Aging参照）。IGには、アルツハイマー病患者の脳内のプラークの主要成分であるβアミロイド(AB)と結合する抗体が含まれる。したがって、IGは、脳からのABの除去を促進し、脳細胞に対するABの毒性作用を阻害するのを助けることができる。しがたって、免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤を本明細書に記載の方法を用いてアルツハイマー病の患者に皮下投与することができる。治療する対象には、軽度、中等度、または進行したアルツハイマー病の患者が含まれる。治療するための患者を同定することは当業者の水準の範囲内である。免疫グロブリン／ヒアルロニダーゼ共製剤は、毎週、2週間毎に、または1月に1回投与することができる。治療は数カ月間または数年間続けることができる。該共製剤は、２００ｍｇ／ｋｇ BW〜２g／kg BWのIG用量で毎週または2週間毎に、一般的には少なくとも２００ｍｇ／ｋg〜２g／kg BWを少なくとも1月に1回投与することができる。免疫グロブリンによる治療は、患者の抗アミロイドβ抗体レベルを治療前のレベルに比べて増加させることができる。
I. 製品およびキット
免疫グロブリンおよびヒアルロニダーゼ共製剤の医薬組成物は、包装材料、ＩＧで治療可能な疾患または病状を治療するのに有効な医薬組成物、および該組成物をIGで治療可能な疾患および病状を治療するために用いることを示すラベルを含む製品として包装することができる。製品の例には、一室容器と二室容器を含む容器がある。該容器には、限定されるものではないが、チューブ、ボトル、およびシリンジが含まれる。該容器はさらに皮下投与用の針を含むことができる。
本発明が提供する製品は、包装材料を含む。医薬製品を包装するのに用いる包装材料は当業者によく知られている。例えば、米国特許No. ５，３２３，９０７、５，０３３，２５２、および５，０５２，５５８参照(これらの内容は本明細書の一部を構成する)。医薬包装材料の例には、限定されるものではないが、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、ボトル、および選択した製剤と目的とする投与および治療方法に適したあらゆる包装材料が含まれる。ＩＧで治療可能な疾患または病状の種々の治療法があるので、多くの本発明が提供する化合物および組成物の製剤が予期される。
免疫グロブリンと可溶性ヒアルロニダーゼの共製剤の組成物もキットとして提供することができる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物と投与用アイテムを含むことができる。例えば、組成物は投与用の用具、例えばシリンジ、吸入器、投与カップ、ドロッパー、またはアプリケーターを用いて供給することができる。該キットは、所望により、用量、投与計画、および投与方法の指示書を含む適用のための指示書を含むことができる。キットは、本明細書に記載の医薬組成物と診断用アイテムを含むこともできる。例えば、そのようなキットは、IGの濃度、量、または活性を測定するアイテムを含むことができる。
J. 実施例
下記の実施例は、単に例示であって、本発明の範囲を限定するものではない。
Gammagard Liquid(ガンマガード液)(１０％ 免疫グロブリン(ＩＧ）製剤）の製造
Gammagard Liquid(１０％ ＩＧ）を、感染性物質についてスクリーニングしたヒト血漿の大プールから製造した。免疫グロブリンを、改良Cohn−Oncley冷エタノール分画法(Cohn et al.(１９４６)J. Am. Chem. Soc. ６８：４５９−４６７）、および陽および陰イオン交換クロマトグラフィ(Teschner et al.(２００７)Vox Sang. ９２：４２−５５）を用いて血漿プールから精製した。精製タンパク質をさらに以下の3つの独立したウイルス不活化／除去工程にかけた：溶媒／界面活性剤(S／D）処理(Horowitz et al.(１９９４)Blood Coagul. Fibrin. ５（３）：S２１−S２８；Kreil et al.(２００３)Transfusion ４３：１０２３−１０３８）、３５nmナノ濾過(Hamamoto et al.(１９８９)Vox Sang. ５６：２３０−２３６；Yuasa et al.(１９９１)J. Gen. Virol. ７２：２０２１−２０２４）、および高温低ｐＨでインキュベーション(Kempf et al.(１９９１)Transfusion ３１：４２３−４２７；Louie et al.(１９９４)Biologicals ２２：１３−１９）。S／D法には、トリ−n−ブチルホスフェート、オクトキシノール−９、およびポリソルベート−８０の有機混合物で18〜25℃で最低６０分間での処理が含まれた(Poelsler et al.，(２００８)Vox Sang. ９４：１８４−１９２）。
試験に用いる最終調製物は、０.２５ｍＭグリシンを用いて製剤化したｐＨ４.６〜５.１(濃縮溶液で測定）の高度に精製された濃縮免疫グロブリンG(IG)抗体の10％液体調製物であった。グリシンは、安定化剤および緩衝剤として働き、糖、ナトリウムまたは保存料は加えなかった。１０％ ＩＧのすべてのロット(例えば、ロットLE１２H０２０、LE１２H０６２、LE１２H１７３、LE１２F０４７）は実質的に同様であった。浸透圧は、２４０〜３００mOsmol／kgであり、生理的浸透圧と同様である。上記の方法に従って製造した製剤のIGサブクラスの分布は、正常血漿のそれと同様であり、タンパク質調製物の少なくとも９８％がＩｇＧであり、平均ＩｇＡ濃度は３７μg／ｍＬ(これらのロットはＩｇＡ濃度が>１４０μg／ｍＬのものはなかった）、またＩｇＭはごく微量であった。FcおよびFab機能は維持された。プレカリクレイン活性化因子活性は検出不能であった。
SUBQ NG ２０％(２０％ ＩＧ）の製造
A. 濃縮、精製ＩＧ組成物の製造
a. 要約
予め凍結した血液ドナー由来プール血漿を種々の粗凝集因子および阻害剤を単離するために脱クリオ(cryo-poor)血漿試料に分け、次いで、Teschner et al.(２００７)Vox Sang. ９２：４２−５５に記載の改良Cohn分画法を用いて冷アルコール分画法を行った。アルコール分画法により主要な中間IG分画(沈降物Gともいう)を得、これをさらにクロマトグラフィ精製法を用いて処理し最終産物を得た。ダウンストリーム製造法には、陽イオン交換(CM−セファロース高速流）および陰イオン交換クロマトグラフィ(ANX−Sepharose高速流）が含まれた。潜在的ウイルス感染に対する高い安全性の余地を得るため、作用方法が互いに補足的である以下の3つの専用のウイルス不活化／除去工程を製造工程に組み入れた：溶媒／界面活性剤処理(１％ Triton X−１００、０.３％トリ−n−ブチルホスフェート、および０.３％ ポリソルベート−８０の混合物）、ナノ濾過(Asahi Planova ３５nm）、および高温で3週間低ｐＨ(４.７）保存。
b. 寒冷沈降物の分離
安全性と品質について検査済みの、予め凍結した血液ドナー由来プール血漿を6℃以下の温度で解凍した。低温で遠心分離し、血漿を解凍すると形成される固体と液体を分離した。次に、液体部分(低温不溶性タンパク質を新鮮解凍血漿から遠心分離により除去した後のもので、「脱クリオ血漿」ともいう)を０±１℃に冷却し、ｐＨを7に調整した。脱クリオ血漿を用いて種々の粗凝集因子と阻害因子を単離し、次いで冷アルコール分画法を行った。7つの経路を、脱クリオ血漿から粗凝集因子と阻害因子をバッチ吸着するために選択し、次いでSUBQ NG ２０％精製を行った(表3では経路1〜7という)。
表３ 凝集因子バッチ吸着経路および脱クリオ血漿阻害剤
Figure 2013505237
前臨床SUBQ NG ２０％生成物については、経路１(吸着工程のない米国起源の血漿）、３(FEIBA、AT−III吸着後の米国起源の血漿）、および６(F−IX、F−VII、AT−III吸着後の米国起源の血漿）から得たCohn出発物質を、アルコール分画法前の種々の異なる吸着工程をカバーするために選択した。種々の吸着プロセスがTeschner et al.(２００７)Vox Sang. ９２：４２−５５；Polsler et al.(２００８)Vox Sang. ９４：１８４−１９２；米国特許Nos. ６，３９５，８８０ and ５，４０９，９９０；およびProthrombin complex：Brummelhuis in Methods of Plasma Protein Fractionation(J.M. Curling Editor、Academic Press、１９８０）に記載されている。
c. 分画法
i. 分画Iの上清の取得
血漿を撹拌しながら、予め冷却したエタノールを加えて８％ v／vエタノールの目標濃度とし、温度をさらに−２〜０℃に下げて沈殿させた。遠心分離して上清(または分画I)を回収した。
ii. 分画IIおよびIIIの沈殿物
温度をさらに下げながら、分画IをｐＨ７および２０〜２５％v／vエタノール濃度に調整した。次に、遠心分離して液体(分画II＋III上清)と固体に分離した。
iii. 分画IIおよびIII沈殿物からの抽出
冷抽出緩衝液(５ｍＭ リン酸一ナトリウム、５ｍＭアセテート、ｐＨ４.５±０.２、伝導度０.７〜０.９mS／cm）を用いて分画II＋IIIを沈殿物：抽出用緩衝液の比が１：１５となるよう再懸濁した。抽出工程を2〜8℃で行った。
iv. ヒュームドシリカ処理および濾過
ヒュームドシリカ(例えば、Aerosil３８０または等価物）を約４０g／kg懸濁液(または１.８g／L脱クリオ血漿と等価）の濃度になるよう懸濁液に加え、2〜8℃で50〜70分間混合した。液体と固体をフィルターを用いて2〜8℃で濾過して分離し(Hyflo Super−Cel、World Minerals Inc.、０.５kg／kg懸濁液）、次いで、加圧濾過器を抽出用緩衝液で後洗浄した。
v. 沈殿物Gの分画
濾液をポリソルベート−８０と混合して濃度約０.２％ｗ／ｖとし、2〜8℃で少なくとも30分間撹拌した。次に、クエン酸ナトリウム無水物を加えて８g／Lの溶液とし、さらに2〜8℃で30分間撹拌した。次に、pHを1M水酸化ナトリウムまたは1M酢酸で７.０±０.１に調整した。次に、冷アルコールを該溶液に加えて濃度約２５％v／vとし、CohnIIと同様の沈殿工程を行った(Cohn et al.(１９４６)J. Am. Chem. Soc. ６８：４５９−４６７）。
vi. 沈殿物Gの懸濁液、および溶媒／界面活性剤処理
沈殿物を溶解し、名目ポアサイズ０.２μmのデプスフィルター(depth filter)(例えば、Cuno VR０６フィルターまたは等価物）で濾過して透明な濾液を得、これを溶媒／界面活性剤(S／D）処理に用いた。
ウイルス不活化の第1工程は、再懸濁した沈殿物GのS／D処理である。S／D処理混合物は、１.０％(v／v)Triton X−１００、０.３％(v／v)Tween−８０、および０.３％(v／v）トリ−n−ブチルホスフェートであり、該混合物を少なくとも60分間１８〜２５℃に保った。
d. 陽イオン交換クロマトグラフィ
次にS／D含有タンパク質溶液を陽イオン交換カラム(カルボキシメチル(CM）−Sepharose fast flow）に通して溶媒と界面活性剤を除去した。S／D試薬を洗浄除去し、次いで吸着したタンパク質を高pH溶出様緩衝液(ｐＨ８.５±０.１）で溶出した。
e. 陰イオン交換クロマトグラフィ
次に、溶出液をｐＨ６に調整し、さらに希釈して適切な伝導度とし、次いで該溶液を平衡化陰イオン交換カラム(ANX−Sepharose fast flow）に通した。ローディングおよび洗浄中のカラムからのフロースルーを回収してさらに処理した。
f. ナノ濾過
3つのウイルス不活化工程の2番目で、最終工程からのカラム流出液をナノ濾過(Asahi Planova ３５nmフィルター）してナノ濾液を得た。
g. 限外濾過およびディアフィルトレーション
ナノ濾液のグリシン濃度を０.２５Mに調整し、さらにナノ濾液を限外濾過によりタンパク質濃度５±１％ｗ／ｖに調整し、次いでｐＨを５.２±０.２に調整した。皮下適用のためのより高いタンパク質濃度になるように、オープンチャンネルスクリーンと、高粘性生成物用に特に設計された名目分子量カットオフ(NMWCO）が５０ｋＤａの限外濾過膜(Millipore Pellicon Biomax）を備えたカセットを用いて限外濾過を行った。
濃縮物をｐＨ４.２±０.２の０.２５Mグリシン溶液に対してディアフィルトレーションした。最小交換容量は初期濃縮物容量の10倍であった。限外濾過／ディアフィルトレーション操作を通して、溶液を4〜20℃に維持した。ディアフィルトレーション後、溶液を最低２２％ｗ／ｖのタンパク質濃度に濃縮し、２〜８℃に調整した。
該システム中の完全に残ったタンパク質(タンパク質濃度は増加している)を回収するため、最初の大きい限外濾過システムの後洗浄を、全てのタンパク質が確実に洗い流されるように再循環モードでデッドボリュームの少なくとも2倍を用いて行った。次に、第1限外濾過システムの後洗浄液を、寸法が最初のものの1／10またはそれ以下の、同じ型の膜を取り付けた第2の限外濾過／ディアフィルトレーションシステムを用いて少なくとも２２％ｗ／ｖのタンパク質濃度に濃縮した。後洗浄濃縮液をバルク溶液に加えた。次に、第2限外濾過システムを後洗浄し、次いで溶液温度を2〜8℃に調整した。
h. 製剤化
製剤化するために、該溶液のタンパク質濃度を、第2の小さい限外濾過システムの後洗浄液および/またはディアフィルトレーション用緩衝液を用いて２０.４±０.４％ｗ／ｖに調整した。必要に応じてpHを４.４〜４.９に補正した。
i. さらなる滅菌
処方したバルク溶液を、さらに絶対ポアサイズ０.２ミクロンまたはそれ以下の膜フィルターで最初に濾過して滅菌し、次いで、最終容器に無菌的に分配して適切に密封し、試験用の試料を得た。最終のウイルス複活化／除去工程は、密封容器を30〜32℃で21〜22日間保存することにより行った。
したがって、得られた２０％ＩＧ製剤は、ｐＨ４.４〜４.９の０.２５ｍＭグリシンを用いて処方した高純度の免疫グロブリン(少なくとも ９５％ ガンマグロブリン）の等張液製剤であった。試験に用いた最終調製物はロットSC００１０７NG、SC００２０７NG、およびSC００３０７NGであった。
B. 前臨床バッチの特徴付け
前臨床ロットSC００１０７NG、SC００２０７NG、およびSC００３０７NGを200L規模で製造し、表4に従って特徴付けた。最終バルクレベルの該調製物の純度は、主な不純物が低レベルであることにより示され、総IgGの0.1%をはるかに下回った。該プロセスの最終段階における20％IG生成物中の分子の大きさ分布(MSD)は、１０％ＩＧ(Gammagard Liquid）最終容器のMSDと同様であった。このことは、濃度を２０％タンパク質に増加してもIgG分子の完全性に悪影響がなかったことを示す。
表４ SUBQ NG ２０％ロットの特徴付け
Figure 2013505237
予備最終容器放出基準は、皮下投与用ヒト免疫グロブリンに対する米国と欧州の機関(FDAおよびEMEA）の要求、現在ある皮下投与用製品(欧州で皮下投与用に認可されたSUBCUVIA)の最終容器仕様、およびGammagard Liquid仕様に基づいて定義した。3つの最終容器の関連抗体スペクトラムの特徴付けを完了し、前臨床１０％ＩＧ Triple Virally Reduced(3重ウイルス減少)(TVR）ロットの結果と比較した。表５は、3つの前臨床SUBQ NG ２０％最終容器と前臨床Gammagard Liquidロットの抗体価と濃縮係数の結果を比較する。結果は、両ロットとも同じ桁数である。
表５. SUBQ NG ２０％および１０％ＩＧ TVR放出データの比較
Figure 2013505237
さらなる品質管理試験を行って、製品および/または製品関連不純物のレベルを評価した。表６に3つのSUBQ NG ２０％最終容器の品質管理データを示す。製品と製品関連不純物の除去は十分であり、すべての製品に関する予備仕様は3ロットすべてに適合する。
表６. SUBQ NG ２０％最終容器の品質管理試験
Figure 2013505237
Figure 2013505237
前臨床精製中にモニターした製造過程のパラメータ、および中間体および最終産物の特徴付けは、3ロット間に検出可能な明らかな差はないことを示した。全ての最終容器は、どの出発物質(沈降物G VNELG１７１、VNELG１７３、またはLB０７９０３０１）を選んでも製品に関する予備仕様に適合した。
C. ２０％ＩＧ製剤の保存試験
２０％IG最終容器の保存安定性を評価するため、上記の３つの前臨床ロット(SC００１０７NG、SC００２０７NG、SC００３０７NG）と1つのフィージビリティロット(ＩｇＧSC ６２／１）を2〜8℃と28〜30℃(フィージビリティロットのみ)で18月間まで保存した。高速サイズ排除クロマトグラフィを用いて分子の大きさ分布(MSD）と試料の安定性を測定した。主な安定性を示すパラメータは分子の大きさであり、サイズ変化は、変性、凝集、または断片化による分解の結果でありうる。
2〜8℃で12月間まで保存した後の前臨床最終容器のMSDを表7に示す。表8に、フィージビリティロットＩｇＧSC ６２／１を2〜8℃と28〜30℃で18月間まで保存した後の前臨床最終容器のMSDを示す。該製品の2〜8℃と28〜30℃で18月間まで保存した時に観察されるパラメータが予め定義した仕様書に適合することがデータから確認された。
表７ ２〜８℃での前臨床２０％ＩＧバッチのＭＳＤ
Figure 2013505237
 表８ ２〜８℃および２８〜３０℃でのフィージビリティロットＩｇＧ ＳＣ６２／１のＭＳＤ
Figure 2013505237
 D. 種々のＩＧ濃度および製剤の安定性試験
低ｐＨ(０.２５Mグリシン、ｐＨ４.４〜４.９）の高タンパク質濃度製剤(１４〜２０％）の保存安定性を、現在、筋肉内および皮下注射可能免疫グロブリンとして使用されている中性ｐＨ(２２.５g／Lグリシン、３g／L ＮａＣｌ、ｐＨ７.０）の高タンパク質濃度製剤と比較した。
すべての操作は、５％タンパク質のナノ濾過液濃度で出発した。０.１５Mグリシン(試験した最低グリシン濃度）に対して10倍緩衝液交換を行い、次いで分子カットオフ30K(標準スクリーン)の0.5m2ポリエーテルスルホンMillipore膜を用いて最終濃度を20％タンパク質以上の目標値とした。最終容器を低ｐＨ(４.７）で処方して保存するか、または低pH保存をバルクで行い、次いで中性ｐＨ(７.０）で最終容器を処方し、次いで2〜8℃または28〜30℃で3月間保存した。３月間後、分子の大きさ分布を高速サイズ排除クロマトグラフィにより測定し、凝集物と断片の含有量を測定した。合格基準を、モノマーおよびオリゴ−／ダイマーが＞９０％、凝集物が＜５％、断片が＜５％と定義した。ACA価を欧州薬局方に記載のごとく試験した。合格ACA価を、1mgタンパク質当たりの消費されたCH５０単位が50％以下と定義した。
表９および１０は、種々のタンパク質濃度の標準製剤(ｐＨ４.７、０.２５Mグリシン；またはｐＨ７.０、２２.５ g／Lグリシン、３g／L ＮａＣｌ）についてそれぞれ28〜30℃および2〜8℃で3月間保存後の凝集物および断片含有量とACA価を示す。データは、低pH製剤では28〜30℃で3月間保存した後に凝集物とACA価が低かったことを明確に示す。pH7.0製剤のすべてのACA価は、本試験のために定義した合格基準以上であった。
2〜8℃の結果は、28〜30℃でみられる傾向を確認する。ACA価は、すべて合格基準として定義した限界以下であったが、pH7.0製剤はより高い値を示すようである。該タンパク質値は、試験したパラメータの結果に影響を及ぼさない。
表９ 種々のタンパク質濃度で、２８〜３０℃、ｐＨ４.７およびｐＨ７.０で３月保存後の断片、凝集物、およびACA値
Figure 2013505237
 表１０ 種々のタンパク質濃度で、２〜８℃、ｐＨ４.７およびｐＨ７.０で３月保存後の断片、凝集物、およびACA値
Figure 2013505237
MSDおよびACA価に対する種々の濃縮手順の影響を検討した。第1手順では、上記の分子カットオフ30K(標準スクリーン)の0.5m2ポリエーテルスルホンMillipore膜を用い、第2手順では、高粘性溶液に適したオープンスクリーンの0.5m2ポリエーテルスルホンMillipore膜を用いた。後洗浄分画を、収量損失を減らすために低膜表面積(0.1m2、オープンスクリーン)の第2限外濾過／ディアフィルトレーション装置で濃縮した。
表11および12は、種々のタンパク質濃度の低pH(4.7)製剤をそれぞれ28〜30℃または2〜8℃で3月間保存後のMSDおよびACA価を示す。データは、3月間保存後の結果が両濃縮法で同様であることを示した。2〜8℃で得られた値は、28〜30℃で得られた値を裏付けた。濃縮法は製品の安定性に影響を及ぼさないが、適切な後洗浄(post−wash)はオープンスクリーン膜でのみ得ることができる。
表１１ 種々のタンパク質濃度で２８〜３０℃、ｐＨ４.７で３月間保存後の断片、凝集物、およびACA値
Figure 2013505237
 表１２ 種々のタンパク質濃度で２〜８℃、ｐＨ４.７で３月間保存後の断片、凝集物、およびACA値
Figure 2013505237
可溶性遺伝子組換ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０）の製造
A. 可溶性ｒＨｕＰＨ２０発現細胞系の作製
HZ２４プラスミド(配列番号：５２で示す）を用いて、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞を形質転換した(例えば、出願No.１０，７９５，０９５、１１／０６５，７１６、および１１／２３８，１７１参照）。可溶性ｒＨｕＰＨ２０を発現させるためのHZ２４プラスミドベクターは、pCIベクター骨格(バックボーン)(Promega）、ヒトＰＨ２０ヒアルロニダーゼのアミノ酸１−４８２をコードするDNA(配列番号：４９、ECMVウイルス(Clontech）由来の内部リボソーム侵入部位(IRES）、およびマウスジヒドロ葉酸還元酵素(DHFR）遺伝子を含む。pCIベクター骨格は、βラクタマーゼ耐性遺伝子(AmpR）をコードするDNA、f１複製起点、サイトメガロウイルス最初期エンハンサー／プロモーター領域(CMV）、キメライントロン、およびSV４０後期ポリアデニル化シグナル(SV４０）も含む。可溶性ｒＨｕＰＨ２０構築物をコードするDNAは、ヒトＰＨ２０の天然35アミノ酸シグナル配列のアミノ酸1位のメチオニンをコードするDNAの前にNheI部位およびKozakコンセンサス配列、およびヒトＰＨ２０ ヒアルロニダーゼ(配列番号：１で示す）のアミノ酸482位に対応するチロシンをコードするDNAの後に終止コドン、次いでBamHI制限部位を含む。したがって、構築物pCI−ＰＨ２０−IRES−DHFR−SV４０pa(HZ２４）は、内部リボソーム侵入部位(IRES）により分離されたヒトＰＨ２０のアミノ酸１−４８２(配列番号：３で示す）およびマウスジヒドロ葉酸還元酵素のアミノ酸１−１８６(配列番号：５３で示す）をコードするCMV プロモーターによって誘導される単一mRNA種を生じる。
DHFR（−）用の、４ｍＭ グルタミンおよび１８ｍＬ／L Pluronic F６８／L(Gibco）添加GIBCO変法CD−CHO培地中で増殖する非トランスフェクションDG４４ CHO細胞をトランスフェクションのために振盪フラスコに０.５ x １０６細胞／ｍＬで接種した。細胞を加湿インキュベーター中、37℃、5％CO2で120rpmで振盪しながら増殖させた。対数増殖期の非トランスフェクションDG４４ CHO細胞の生存率をトランスフェクション前に試験した。
非トランスフェクションDG44CHO細胞培養の6x107個の生細胞をペレットにし、２×０７細胞の密度で、０.７ｍＬの2xトランスフェクション用緩衝液(２x HeBS：４０ｍＭ Hepes、ｐＨ７.０、２７４ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＫＣｌ、１.４ｍＭ Na２HPO４、１２ｍＭデキストロース）に再浮遊させた。再浮遊細胞の各アリコートに０.０９ｍＬ(２５０μg）の線状HZ２４プラスミド(Cla I(New England Biolabs）で一夜消化して線状化）を加え、細胞／DNA溶液を、室温で０.４cmギャップBTX(Gentronics）エレクトロポーレーションキュベット中に移した。陰性コントロールエレクトロポーレーションを細胞とプラスミドDNAを混合せずに行った。細胞／プラスミド混合物を３３０Vおよび９６０μF、または３５０Vおよび９６０μFのコンデンサ放電を用いてエレクトロポーレーションした。
該細胞をエレクトロポーレーション後にキュベットから取り出し、DHFR（−）細胞用の５ｍＬの４ｍＭグルタミンおよび１８ｍＬ／L Pluronic F６８／L(Gibco）添加変法CD−CHO培地に移し、加湿インキュベーター中、37℃、5％CO2で2日間、選択せずに6ウェル組織培養プレート中で増殖させた。
エレクトロポーレーションの2日後に、０.５ｍＬの組織培養液を各ウェルから取り出し、ヒアルロニダーゼ活性の存在を実施例4に記載の微小濁度アッセイを用いて試験した。
表１３ トランスフェクトの４０時間後のＨＺ２４トランスフェクトDG４４ CHO細胞の初期ヒアルロニダーゼ活性
Figure 2013505237
トランスフェクション２(３５０V）の細胞を組織培養ウェルから回収し、カウントし、１×１０４〜２×１０４生細胞／ｍＬに希釈した。細胞浮遊液の０.１ｍＬアリコートを5つの９６ウェル丸底組織培養プレートの各ウェルに移した。ヒポキサンチンとチミジンを添加していない、４ｍＭ GlutaMAX(登録商標)１サプリメント(GIBCO(登録商標)、Invitrogen Corporation）を含むCD−CHO培地(GIBCO）100μLを細胞を含むウェルに加えた(最終容量０.２ｍＬ）。
10クローンを、メトトレキサートなしで増殖させた5プレートから同定した。
表１４ 同定したクローンのヒアルロニダーゼ活性
Figure 2013505237
6個のHZ２４クローンを培養中で増殖させ、単細胞浮遊液として撹拌フラスコ中に移した。クローン３D３、３E５、２G８、２D９、１E１１、および４D１０を、2次元無限希釈ストラテジーを用いて96ウェル丸底組織培養プレートに接種し、細胞を、上左側のウェルから5000細胞で出発し、プレートの下に向かって１：２に、プレートを横に１：３に希釈した。希釈したクローンを５００非トランスフェクションDG44CHO細胞／ウェルのバックグラウンドで増殖させ、培養に最初の数日間必要な成長因子を得た。1サブクローンあたり10プレートとし、5プレートは５０nMメトトレキサートを含み、５プレートはメトトレキサートを含まなかった。
クローン３D３は２４個の目に見えるサブクローンを生じた(無メトトレキサート処理から13個、５０nMメトトレキサート処理から11個）。２４サブクローンのうちの8サブクローンの上清に顕著なヒアルロニダーゼ活性がみられ(>５０単位／ｍＬ）、これら８サブクローンをT-25組織培養フラスコ中で拡大増殖(expand)させた。メトトレキサート処理プロトコールから単離したクローンを５０nMメトトレキサート中で拡大増殖させた。クローン３D３５Mをさらに５００nMメトトレキサート中で増殖させ、撹拌フラスコ中で１，０００単位／ｍＬ以上を産生するクローンを得た(クローン３D３５MまたはGen１ ３D３５M）。次に、３D３５M細胞のマスター細胞バンク(MCB）を作製した。
B. Gen１ヒトＰＨ２０の産生および精製
a. ５Lバイオリアクタープロセス
３D３５Mのバイアルを解凍し、撹拌フラスコから、１００nMメトトレキサートおよびGlutaMAX(登録商標)−１(Invitrogen）添加CD−CHO培地(Invitrogen、Carlsbad Calif.）を入れた1Lスピナーフラスコに拡大増殖させた。細胞をスピナーフラスコから播種密度４×１０５生細胞／ｍＬで5Lバイオリアクター(Braun）に移した。パラメータは、温度設定値３７℃、ｐＨ７.２(出発設定値）、溶存酸素設定値２５％、および空気重層０〜１００cc／min。１６８時間で、２５０ｍＬのフィード#１培地(５０g／Lグルコース含有CD CHO）を加えた。２１６時間で、２５０ｍＬのフィード#２培地(５０g／Lグルコースおよび１０ｍＭ酪酸ナトリウム含有CD CHO）を加え、２６４時間に、２５０ｍＬのフィード#２培地を加えた。このプロセスでは、最終生産性が１６００単位／ｍＬ、最大細胞密度が６×１０６細胞／ｍＬとなった。酪酸ナトリウムの添加は、最終産生段階で可溶性ｒＨｕＰＨ２０の産生を顕著に増強した。
３D３５Mクローンの順化培地を深層濾過および接線流ディアフィルトレーションで１０ｍＭ Hepes ｐＨ７.０にて浄化した。次に、可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、Q Sepharose(Pharmacia）イオン交換、フェニルSepharose(Pharmacia）疎水性相互作用クロマトグラフィ、フェニルボロン酸(Prometics）、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィ(Bio−Rad、Richmond、CA）を用いる連続クロマトグラフィにより精製した。
可溶性ｒＨｕＰＨ２０はQ Sepharoseと結合し、同じ緩衝液中の４００ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出液を2M硫酸アンモニウムで希釈して最終濃度５００ｍＭ硫酸アンモニウムとし、フェニルSepharose(low sub）カラムを通し、次いで同じ条件下でフェニルボロン酸樹脂と結合させた。可溶性ｒＨｕＰＨ２０を、硫酸アンモニウムを含まない５０ｍＭビシンを用いてpH9.0で洗浄し、次いでHepes ｐＨ６.９を用いてフェニルSepharose樹脂から溶出した。溶出液を５ｍＭリン酸カリウムおよび１ｍＭ CaCl２を用いpH6.9でセラミックヒドロキシアパタイト樹脂にロードし、ｐＨ７.４の０.１ｍＭ CaCl２含有80mMリン酸カリウムで溶出した。
得られた精製可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、USP標準品を用いる微小濁度アッセイ(実施例４）により６５，０００USP単位／mg タンパク質以上の比活性を示した。精製可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、０.１％ TFA／H２O〜０.１％ TFA／９０％アセトニトリル／１０％ H２０の勾配でPharmacia ５RPCスチレンジビニルベンゼンカラムから24〜26分間で単一ピークとして溶出され、SDS電気泳動により単一の広い６１ｋＤａバンドがみられ、これはPNGASE−Fで処理すると還元されてシャープな５１ｋＤａバンドになった。N末端アミノ酸のシーケンシングは、リーダーペプチドが効率的に除去されたことを示した。
b. 開始時細胞培養の100Lバイオリアクター細胞培養への拡大培養
スケールアッププロセスを用いて３D３５M細胞の4つの異なるバイアルから可溶性ｒＨｕＰＨ２０を別々に精製し、可溶性ｒＨｕＰＨ２０の以下の4つの独立したバッチを得た：HUA０４０６C、HUA０４１０C、HUA０４１５C、およびHUA０４２０C。各バイアルを別々に拡大培養し、１２５Lバイオリアクターで培養し、次いでカラムクロマトグラフィで精製した。試料をプロセス全体から得て酵素収量などのパラメータを評価した。下記プロセスの説明は、バイオリアクターの出発およびフィード培地容量、移入細胞密度、ならびに洗浄および溶出容量などの典型的仕様を示す。正確な数は、バッチ毎にわずかに異なり、表15〜22に詳述している。
３D３５M細胞の4つのバイアルを３７℃水浴中で解凍し、１００nMメトトレキサートおよび４０ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１を含むCD CHOを加え、次いで細胞を遠心分離した。細胞を125mL振盪フラスコ中の２０ｍＬの新鮮培地に再浮遊し、３７℃、７％CO２インキュベーター中に置いた。細胞を１２５ｍＬ振盪フラスコ中で40mLまで拡大培養した。細胞密度が１.５〜２.５ x １０６細胞／ｍＬに達したら、培養を100mL培養容量の125mLスピナーフラスコ中で拡大培養した。フラスコを３７℃、７％CO２でインキュベーションした。細胞密度が１.５〜２.５ x １０６細胞／ｍＬに達したら、培養を800mL培養容量の1Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7％CO2でインキュベーションした。細胞密度が１.５〜２.５ x １０６細胞／ｍＬに達したら、培養を5L培養容量の6Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7％CO2でインキュベーションした。細胞密度が１.５〜２.５ x １０６細胞／ｍＬに達したら、培養を20L培養容量の36Lスピナーフラスコ中で拡大培養し、37℃、7％CO2でインキュベーションした。
１２５Lリアクターを１２１℃、２０psiの蒸気で滅菌し、次いで６５LのCD CHO培地を加えた。使用前に該リアクターの汚染を検査した。36Lスピナーフラスコ中の細胞密度が１.８〜２.５ x １０６細胞／ｍＬに達したら、２０Lの細胞培養を３６Lスピナーフラスコから１２５Lバイオリアクター(Braun）に移し、最終容量85Lおよび接種密度約４×１０５細胞／ｍＬを得た。パラメータは、温度設定値３７℃、ｐＨ７.２、溶存酸素２５％±１０％、インペラ速度５０rpm、容器圧３psi、空気スパージ：１L／ min、空気のオーバーレイ１L／min。細胞係数、pH検査、培地分析、タンパク質産生、および保持の試験用に毎日該リアクターから試料を得た。操作中に栄養を加えた。第6日に、３.４Lのフィード#１培地(CD CHO + ５０ g／Lグルコース + ４０ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１）を加え、培養温度を３６.５℃に変更した。第9日に、３.５Lのフィード#２(CD CHO + ５０ g／Lグルコース + ４０ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１ + １.１ g／L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３６℃に変更した。第11日に、３.７Lのフィード#３(CD CHO + ５０ g／Lグルコース + ４０ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１ + １.１ g／L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を３５.５℃に変更した。14日または細胞の生存率が50％以下に低下した時に該リアクターを回収した。該プロセスは、最大細胞密度８x106細胞／ｍＬで酵素活性１６００単位／ｍＬの可溶性ｒＨｕＰＨ２０の産生をもたらした。回収時に培養から、in vitroおよびin vivoのマイコプラズマ、細菌、真菌、エンドトキシン、およびウイルス、ウイルス粒子のための透過型電子顕微鏡(TEM）、および酵素活性について培養をサンプリングした。
１００Lバイオリアクター細胞培養回収物を、ポリエーテルスルホン培地(Sartorius）を含む以下の一連の使い捨てカプセルを用いて濾過した：すなわち、最初に８.０μmデプスカプセル、次いで０.６５μmデプスカプセル、０.２２μmカプセル、および最後に０.２２μm Sartopore ２０００cm２フィルター、および１００L無菌保存バッグ。培養液を、らせん状ポリエーテルスルホン３０ｋＤａ MWCOフィルター(Millipore）を用い、2回のTFF、次いで１０ｍＭ HEPES、２５ｍＭ Na２SO４、ｐＨ７.０を用いる６×緩衝液交換で10×濃縮し、次いで０.２２μm最終フィルターを通し、２０L無菌保存バッグに保存した。表15に、細胞培養、回収、濃度、および緩衝液交換工程に関するモニタリングデータを示す。
表１５ 細胞培地、収穫、濃度および緩衝液交換過程のモニタリングデータ
Figure 2013505237
Q Sepharose(Pharmacia）イオン交換カラム(３L樹脂、高さ=２０cm、直径＝１４cm）を調製した。洗浄試料をｐＨ、伝導度の測定、およびエンドトキシン(LAL）アッセイ用に回収した。カラムを、５カラム容量の１０ｍＭ Tris、２０ｍＭ Na２SO４、ｐＨ７.５で平衡化した。濃縮したディアフィルトレーション回収物を、１００cm／hrの流速でQカラムにロードした。カラムを、５カラム容量の１０ｍＭ Tris、２０ｍＭ Na２SO４、ｐＨ７.５および１０ｍＭ Hepes、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０で平衡化した。タンパク質を１０ｍＭ Hepes、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０で溶出し、０.２２μm最終フィルターで濾過し、無菌バッグに入れた。
次に、フェニルSepharose(Pharmacia）疎水性相互作用クロマトグラフィを行った。フェニルSepharose(PS）カラム(９.１ L樹脂、高さ＝２９cm、直径＝２０cm）を調製した。カラムを５カラム容量の５ｍＭリン酸カリウム、０.５M硫酸アンモニウム、０.１ｍＭ CaCl２、ｐＨ７.０で平衡化した。上記から得られるタンパク質溶出液に、２M硫酸アンモニウム、１Mリン酸カリウム、および１M CaCl２ストック溶液を添加し、それぞれ最終濃度５ｍＭ、０.５M、および０.１ｍＭとした。タンパク質を１００cm／hrの流速でPSカラムのロードした。５ｍＭリン酸カリウム、０.５ M硫酸アンモニウム、および０.１ｍＭ CaCl２、ｐＨ７.０を１００cm／hrで加えた。フロースルーを０.２２μm最終フィルターに通し、無菌バッグに入れた。
次に、PS−精製タンパク質を、５カラム容量の５ｍＭリン酸カリウム、０.５ M硫酸アンモニウムで平衡化したアミノフェニルボロン酸カラム (ProMedics）(６.３ L樹脂、高さ＝２０cm、直径＝２０cm）にロードした。タンパク質を１００ cm／hrの流速でカラムに通し、次いでカラムを５ｍＭリン酸カリウム、０.５ M硫酸アンモニウム、ｐＨ７.０で洗浄した。次に、カラムを２０ｍＭビシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９.０で洗浄し、タンパク質を５０ｍＭ Hepes、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６.９で溶出し、次いで無菌フィルターを通し20L滅菌バッグに入れた。溶出液の、バイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
ヒドロキシアパタイト(HAP）カラム(Bio−Rad）(１.６ L樹脂、高さ＝１０ cm、直径＝１４cm）を５ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ CaCl２、ｐＨ７.０で平衡化した。洗浄試料を回収し、pH、伝導度、およびエンドトキシン(LALアッセイ)について試験した。アミノフェニルボロン酸−精製タンパク質にリン酸カリウムおよびCaCl２を添加し、最終濃度５ｍＭリン酸カリウムおよび０.１ｍＭ CaCl２とし、次いでHAPカラムに１００ cm／hrの流速でロードした。カラムを５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７.０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ CaCl２、次いで１０ｍＭ リン酸カリウム、ｐＨ７.０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ CaCl２ ｐＨで洗浄した。タンパク質を７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７.０で溶出し、０.２２μmフィルターで濾過し、５L滅菌保存バッグに入れた。溶出液のバイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
次に、HAP−精製タンパク質を加圧タンクを介して２０nMウイルス除去フィルターに通した。タンパク質をDV２０加圧タンクおよびフィルター(Pall Corporation）に加え、次いで２０nmポアのUltipor DV２０フィルター(Pall Corporation）を通して無菌２０L保存バッグに入れた。
濾液のタンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖、およびシアル酸プロファイリング、およびプロセス関連不純物を試験した。次に、濾液中のタンパク質を、１０ｋＤａ分子量カットオフ(MWCO）のSartocon Slice 接線流濾過(TFF）システム(Sartorius）を用いて１ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最初に、フィルターをHepes／生理食塩水溶液(１０ｍＭ Hepes、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０）で洗浄し、透過物の試料をとってpHと伝導度を調べた。濃縮後、濃縮タンパク質の試料を取ってタンパク質濃度と酵素活性を試験した。濃縮タンパク質の６×緩衝液交換を行い、最終緩衝液：１０ｍＭ Hepes、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０とした。濃縮タンパク質を０.２２μmフィルターに通し、２０L滅菌保存バッグに入れた。該タンパク質をサンプリングしてタンパク質濃度、酵素活性、遊離スルフヒドリル基、オリゴ糖プロファイリング、および浸透圧について試験した。
表16〜22に、各3D35M細胞ロットの上記各精製工程のモニタリングデータを示す。
表１６ Q セファロースカラムデータ
Figure 2013505237
 表１７ フェニルセファロースカラムデータ
Figure 2013505237
 表１８ アミノフェニルボロネートカラムデータ
Figure 2013505237
 表１９ ヒドロキシアパタイトカラムデータ
Figure 2013505237
 表２０ DV２０ろ過データ
Figure 2013505237
 表２１ 最終濃度データ
Figure 2013505237
 表２２ 最終製剤への緩衝液交換データ
Figure 2013505237
精製および濃縮可溶性ｒＨｕＰＨ２０タンパク質を、5mL滅菌バイアルに1mL充填容量で無菌的に充填した。タンパク質を０.２２μmフィルターに通し、次いで操作制御ポンプを用い、重量計測値を用いてバイアルに充填した。バイアルを栓で密閉し、圧着キャップで締め付けた。密閉したバイアルの異物を目視検査し、次いでラベルを貼った。ラベルを貼った後、バイアルを液体窒素で1分間以内に急速凍結し、＜−１５℃（−２０±５℃）で保存した。
C. 可溶性ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０）含有Gen2細胞の製造
上記 Gen１ ３D３５M細胞系を高メトトレキサートレベルに適応させ、2世代(Gen２）クローンを製造した。３D３５M細胞を樹立メトトレキサート含有培養から４mM GlutaMAX(登録商標)−１および１.０μMメトトレキサート含有CD CHO培地に播種した。細胞を、37℃、7％CO2加湿インキュベーター中で46日間にわたり9代継代増殖させて高メトトレキサートレベルに適合させた。増幅した細胞ポピュレーションを２.０μM メトトレキサート含有培地を含む96ウェル組織培養プレート中で限界希釈によりクローニングした。約4週間後に、クローンを同定し、クローン３E１０Bを拡大増殖用に選択した。３E１０Ｂ細胞を、４ｍＭ GlutaMAX(登録商標)−１および２.０μMメトトレキサート含有CD CHO培地で20代継代増殖させた。３E１０B細胞系のマスター細胞バンク(MCB）を作製し、凍結して次の試験に用いた。
４ｍＭ GlutaMAX(登録商標)−１および４.０μMメトトレキサート含有CD CHO培地中で３E１０Ｂ細胞を培養して該細胞系を増幅し続けた。12代継代後、細胞をバイアル中でリサーチ細胞バンク(RCB）として凍結した。RCBの1バイアルを解凍し、８.０μMメトトレキサート含有培地中で培養した。5日間後、培地中のメトトレキサート濃度を１６.０μM、次いで18日後に２０.０μMに増加させた。２０.０μMメトトレキサート含有培地中で8代継代した細胞を４ｍＭ GlutaMAX(登録商標)−１および２０.０μMメトトレキサート含有CD CHO培地を含む96ウェル組織培養プレート中で限界希釈によりクローニングした。クローンを5〜6週間後に同定し、クローン２B２を２０.０μM メトトレキサート含有培地中で拡大増殖用に選択した。7代継代後に２B２細胞をリサーチ細胞バンク(RCB)としてバイアル中で凍結した。
得られた２B２細胞は、可溶性遺伝子組換ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０）を発現するデヒドロ葉酸還元酵素欠損(dhfr−）DG４４ CHO細胞である。可溶性ｒＨｕＰＨ２０は、2B2細胞中に、約206コピー／細胞のコピー数で存在する。ｒＨｕＰＨ２０特異的プローブを用いるSpe I、Xba I、およびBamH I／Hind III消化ゲノム２B２細胞DNAのサザンブロット分析により以下の制限消化プロフィールが示された：SpeI消化DNAに〜７.７kbの1つの主なハイブリダイズバンドと4つの小さなハイブリダイズバンド(〜１３.９、〜６.６、〜５.７、および〜４.６kb）；Xba I消化DNAに〜５.０ kbの1つの主要なハイブリダイズバンドと2つの小さなハイブリダイズバンド(〜１３.９および〜６.５kb）；およびBamH I／Hind III消化2B2DNAに〜１.４kbの1つの単一ハイブリダイズバンドが観察された。mRNA転写物の配列分析は、誘導されたcDNA(配列番号：５６）が1131位の1塩基対が異なる(予期されたシトシン(C)の代わりにチミジン(T)がみられた)他は基準配列(配列番号：４９）と同一であった。これはアミノ酸配列に対する影響のないサイレント突然変異である。
D. ３００Lバイオリアクター細胞培養中のGen２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の産生
HZ２４−２B２のバイアルを解凍し、撹拌フラスコから２０μM メトトレキサートおよびGlutaMAX(登録商標)−１(Invitrogen）添加CD−CHO培地(Invitrogen、Carlsbad、CA）を入れた３６Lスピナーフラスコに拡大増殖した。簡単には、細胞のバイアルを37℃水浴中で解凍し、培地を加え、細胞を遠心分離した。細胞を125mL撹拌フラスコ中の20mLの新鮮培地に再浮遊させ、37℃、７％CO２インキュベーター中に置いた。細胞を125mL撹拌フラスコ中で40mLまで拡大増殖した。細胞密度が１.５ x １０６細胞／ｍＬ以上に達したら、培養を100mL培養容量の125mLスピナーフラスコ中で拡大増殖させた。フラスコを37℃、7％CO2でインキュベーションした。細胞密度が１.５ x １０６細胞／ｍＬ以上に達したら、培養を200mL培養容量の250mLスピナーフラスコ中で拡大増殖させ、フラスコを37℃、7％CO2でインキュベーションした。細胞密度が１.５ x １０６細胞／ｍＬ以上に達したら、培養を800mL培養容量の1Lスピナーフラスコ中で拡大増殖させ、37℃、7％CO2でインキュベーションした。細胞密度が１.５ x １０６細胞／ｍＬ以上に達したら、培養を5000mL培養容量の6Lスピナーフラスコ中で拡大増殖させ、37℃、7％CO2でインキュベーションした。細胞密度が１.５ x １０６細胞／ｍＬ以上に達したら、培養を32L培養容量の36Lスピナーフラスコ中で拡大増殖させ、37℃、7％CO2でインキュベーションした。
４００Lリアクターを滅菌し、２３０ｍＬのCD CHO培地を加えた。使用前に、該リアクターの汚染を検査した。約30Lの細胞を３６Lスピナーフラスコから播種密度４.０×１０５生細胞／ｍＬおよび総容量２６０Lで４００Lバイオリアクター(Braun）に移した。パラメーターは、温度設定値３７℃；インペラー速度４０〜５５rpm；容器圧３psi；空気スパージ０.５〜１.５L／Min；空気重層３L／minであった。リアクターから毎日サンプリングして、細胞数、pH確認、培地分析、(登録商標)産生および保持を検査した。操作中に栄養フィードも加えた。120時間(第5日)で、１０.４Lのフィード#１培地(４×CD CHO + ３３g／Lグルコース + １６０ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１ + ８３ｍＬ／Lイーストレート + ３３ｍｇ／L rHuインスリン）を加えた。 １６８時間(第７日）で、１０.８Lのフィード#２(２× CD CHO + ３３ g／Lグルコース + ８０ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１ + １６７ｍＬ／Lイーストレート + ０.９２ g／L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を36.5℃に変更した。２１６時間(第９日）で、１０.８Lのフィード#３(１× CD CHO + ５０ g／Lグルコース + ５０ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１ + ２５０ｍＬ／Lイーストレート + １.８０ g／L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を36℃に変更した。２６４時間(第１１日）で、１０.８Lのフィード#４(１× CD CHO + ３３ g／Lグルコース + ３３ｍＬ／L GlutaMAX(登録商標)−１ + ２５０ｍＬ／Lイーストレート + ０.９２ g／L酪酸ナトリウム）を加え、培養温度を35.5℃に変更した。フィード培地の添加により最終生産段階で可溶性ｒＨｕＰＨ２０産生の劇的な増加がみられた。リアクターを１４または１５日間、または細胞の生存率が40％以下に低下した時に収穫した。該プロセスは、最終生産性１７，０００単位／ｍＬで最大細胞密度は12x106細胞／ｍＬであった。収穫時に、培養からサンプリングしてin vitroおよびin vivoのマイコプラズマ、バイオバーデン、エンドトキシン、およびウイルス、透過型電子顕微鏡検査(TEM)、および酵素活性を検査した。
培養をペリスタポンプで送り出して、４〜８μmグレードの珪藻土の層と１.４〜１.１μmグレードの珪藻土の層、次いでセルロース膜をそれぞれ含む、並列した4つのMillistak濾過システムモジュール(Millipore）を通し、次いで、０.４〜０.１１μmグレードの珪藻土の層と＜０.１μmグレードの珪藻土の層、次いでセルロース膜を含む第2の1つのMillistak濾過システム(Millipore）を通し、次いで０.２２μm最終フィルターを通して容量350Lの無菌単回使用フレキシブルバッグに入れた。収穫した細胞培養液に１０ｍＭ EDTAおよび１０ｍＭ Trisを加えてｐＨ７.５とした。培養液を、4つのSartoslice TFF ３０ｋＤａ分子量カットオフ(MWCO）ポリエーテルスルホン(PES）フィルター(Sartorious）を用いる接線流濾過(TFF）装置で10倍に濃縮し、次いで１０ｍＭ Tris、２０ｍＭ Na２SO４、ｐＨ７.５を用いて10×緩衝液交換し、次いで０.２２μm最終フィルターを通して５０L滅菌保存バッグに入れた。
濃縮ディアフィルトレーション収穫物のウイルスを不活化した。ウイルス不活化前に、１０％ Triton X−１００、３％トリ−n−ブチルホスフェート(TNBP）溶液を調製した。濃縮ディアフィルトレーション収穫物を36Lガラス反応容器中で1時間、１％ Triton X−１００、０.３％ TNBPに暴露し、次いで直ちにQカラムで精製した。
E. Gen２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の精製
Q Sepharose(Pharmacia）イオン交換カラム(９L樹脂、H＝２９ cm、D＝２０ cm）を調製した。洗浄試料を回収して、pH測定、伝導度、およびエンドトキシン(LAL)アッセイを行った。カラムを５カラム容量の１０ｍＭ Tris、２０ｍＭ Na２SO４、ｐＨ７.５で平衡化した。ウイルス不活化後、濃縮ディアフィルトレーション収穫物を１００cm／hrでQカラムにロードした。カラムを５カラム容量の１０ｍＭ Tris、２０ｍＭ Na２SO４、ｐＨ７.５、および１０ｍＭ Hepes、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０で洗浄した。(登録商標)を、１０ｍＭ Hepes、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７.０で溶出し、０.２２μm最終フィルターを通して無菌バックに入れた。溶出液の試料についてバイオバーデン、タンパク質濃度、およびヒアルロニダーゼ活性を検査した。Ａ２８０吸収の測定値を交換の前と後に得た。
次に、フェニルSepharose(Pharmacia）疎水性相互作用クロマトグラフィを行った。フェニルSepharose(PS）カラム(１９−２１ L樹脂、H=２９ cm、D＝３０ cm）を調製した。洗浄液を回収し、試料をとってpH、伝導度、およびエンドトキシン(LALアッセイ)を測定した。カラムを、５カラム容量の５ｍＭリン酸カリウム、０.５ M硫酸アンモニウム、０.１ｍＭ CaCl２、ｐＨ７.０で平衡化した。Q Sepharoseカラムからのタンパク質溶出液に、２M硫酸アンモニウム、１Mリン酸カリウム、および１M CaCl２ストック溶液を添加し、最終濃度をそれぞれ５ｍＭ、０.５M、および０.１ｍＭとした。タンパク質を流速１００cm／hrでPSカラムにロードし、カラムのフロースルーを回収した。カラムを、５ｍＭリン酸カリウム、０.５M硫酸アンモニウム、および０.１ｍＭ CaCl２、ｐＨ７.０で流速１００cm／hrで洗浄し、洗浄液を回収したフロースルーに加えた。カラム洗浄液と混合したフロースルーを０.２２μm最終フィルターに通し、無菌バッグに入れた。フロースルーの試料を取り、バイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性について試験した。
アミノフェニルボロン酸カラム(ProMetic）を調製した。洗浄液を回収し、試料を取り、バイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性(LALアッセイ)について試験した。カラムを５カラム容量の５ｍＭリン酸カリウム、０.５ M硫酸アンモニウムで平衡化した。精製タンパク質を含むPSフロースルーを流速１００ cm／hrでアミノフェニルボロン酸カラムにロードした。カラムを、５ｍＭリン酸カリウム、０.５M硫酸アンモニウム、ｐＨ７.０で洗浄した。カラムを、２０ｍＭビシン、０.５M硫酸アンモニウム、ｐＨ９.０で洗浄した。カラムを、２０ｍＭビシン、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ９.０で洗浄した。タンパク質を５０ｍＭ Hepes、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６.９で溶出し、次いで無菌フィルターを通して無菌バッグにいれた。溶出した試料のバイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
ヒドロキシアパタイト(HAP）カラム(Bio−Rad）を調製した。洗浄液を回収し、pH、伝導度、およびエンドトキシン(LALアッセイ)について試験した。カラムを５ｍＭリン酸カリウム、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ CaCl２、ｐＨ７.０で平衡化した。アミノフェニルボロン酸−精製タンパク質に最終濃度５ｍＭリン酸カリウムおよび０.１ｍＭ CaCl２を加え、流速100cm／hrでHAPカラムにロードした。カラムを５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７.０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ CaCl２で洗浄した。次に、カラムを１０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７.０、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０.１ｍＭ CaCl２で洗浄した。タンパク質を７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７.０で溶出し、０.２２μm無菌フィルターを通して無菌バッグに入れた。溶出した試料のバイオバーデン、タンパク質濃度、および酵素活性を試験した。
次に、HAP−精製タンパク質をウイルス除去フィルターに通した。最初に、滅菌Viosartフィルター(Sartorius）を２Lの７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７.０で洗浄して調製した。使用前に、濾過した緩衝液の試料をとり、pHと伝導度を試験した。HAP−精製タンパク質をペリスタポンプで注入して２０nMウイルス除去フィルターに通した。７０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７.０中の濾過タンパク質を０.２２μm最終フィルターに通して無菌バッグに入れた。ウイルス濾過した試料の、タンパク質濃度、酵素活性、オリゴ糖、単糖、およびシアル酸プロファイリングを試験した。
次に、濾液中のタンパク質を、１０kD分子量カットオフ(MWCO)Sartocon Slice 接線流濾過(TFF）システム(Sartorius）を用いて１０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。最初に、フィルターを１０ｍＭ ヒスチジン、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６.０で洗浄して調製し、透過液の試料をとってpHと伝導度を測定した。濃縮後、濃縮タンパク質の試料を取り、タンパク質濃度と酵素活性を測定した。濃縮タンパク質を６×緩衝液交換し、最終緩衝液：１０ｍＭ ヒスチジン、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６.０とした。緩衝液交換後、濃縮タンパク質を０.２２μmフィルターに通し、２０L滅菌保存バッグに入れた。タンパク質の試料を取り、タンパク質濃度、酵素活性、遊離スルホヒドリル基、オリゴ糖プロファイリング、および浸透圧を測定した。
次に、無菌濾過したバルクタンパク質を３０ｍＬ無菌テフロンバイアル(Nalgene）に20mLずつ無菌的に分注した。次に、バイアルを急速凍結し、−２０±５℃で保存した。
F. Gen１可溶性ｒＨｕＰＨ２０およびGen２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造と精製の比較
３００Lバイオリアクター細胞培養中のGen２可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製には、１００Lバイオリアクター中のGen１可溶性ｒＨｕＰＨ２０の製造および精製と比べてプロトコールの変更が含まれた。表２３に、方法間の単純なスケールアップ変化に加えて典型的な違いを示す。
表２３ Gen１およびGen２法の比較
Figure 2013505237
Figure 2013505237
Figure 2013505237
Figure 2013505237
微小濁度アッセイを用いる可溶性ｒＨｕＰＨ２０のヒアルロニダーゼ活性の測定
細胞培養、精製分画、および精製溶液などの試料中の可溶性遺伝子組換ヒトＰＨ２０(ｒＨｕＰＨ２０)のヒアルロニダーゼ活性を、ヒアルロン酸が血清アルブミンと結合したときの不溶性沈降物の形成に基づく比濁分析を用いて測定した。該活性は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０をヒアルロン酸ナトリウム(ヒアルロン酸)と一定時間(１０分間)インキュベーションし、次いで非消化ヒアルロン酸ナトリウムを酸性化血清アルブミンを加えて沈殿させることにより測定した。得られた試料の濁度を３０分間発現させた後に６４０nmで測定した。ヒアルロン酸ナトリウム基質に対する酵素活性から得られた濁度の低下が、可溶性ｒＨｕＰＨ２０ ヒアルロニダーゼ活性の尺度である。該方法は、可溶性ｒＨｕＰＨ２０アッセイの参照標準の希釈で得た校正曲線を用いて行い、試料の活性測定値をその校正曲線と比較した。
試料の希釈物は酵素希釈物溶液を用いて調製した。酵素希釈物溶液(EDS)は、２５.０ｍＬの５０ｍＭ PIPES反応緩衝液(１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ PIPES、ｐＨ５.５)および２５.０ｍＬの無菌洗浄水(SWFI)に３３.０±０.０５ｍｇの加水分解ゼラチンを溶解し、混合物を０.２ｍＬの２５％ヒト血清アルブミン溶液で希釈し、３０秒間撹拌（ボルテックス）した。これを、使用する２時間以内に行い、必要となるまで氷上で保存した。試料をEDSで推定１〜２Ｕ／ｍＬに希釈した。一般的には、最大希釈／工程は、１：１００以下であり、第一希釈の初期試料サイズは、２０μL以上であった。アッセイを行うのに必要な最小試料容量は、プロセス中試料、FPLC分画８０μL、組織培養上清１ｍＬ、濃縮物質８０μL、精製または最終段階物質８０μLであった。低タンパク質結合９６ウェルプレート中でトリプリケートで希釈し、３０μLの各希釈液をOptiluxブラック／透明底プレート(BD BioSciences)に移した。
濃度２.５Ｕ／ｍＬの既知可溶性ｒＨｕＰＨ２０希釈物を標準曲線を得るために酵素希釈物溶液中で調製し、Optiluxプレートにトリプリケートで加えた。希釈には、０Ｕ／ｍＬ、０.２５Ｕ／ｍＬ、０.５Ｕ／ｍＬ、１.０Ｕ／ｍＬ、１.５Ｕ／ｍＬ、２.０Ｕ／ｍＬ、および２.５Ｕ／ｍＬが含まれた。６０μLの酵素希釈物溶液を加えた「試薬ブランク」を陰性コントロールとしてプレートに加えた。次に、プレートを覆い、３７℃で５分間加熱ブロック上で暖めた。覆いをとり、プレートを１０秒間震盪させた。震盪後、プレートを加熱ブロックに戻し、MULTIDROP ３８４ Liquid Handling Deviceを温０.２５ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸ナトリウム溶液（１００ｍｇのヒアルロン酸ナトリウム(LifeCore Biomedical)を２０.０ｍＬのSWFIに溶解して調製）を用いて準備した。これを静かに撹拌し、および/または２〜８℃で２〜４時間または完全に溶解するまで振動させて混合した。基質溶液は９ｍＬ SWFI、１０ｍＬ PIPES、および１ｍＬの５ｍｇ／ｍＬヒアルロン酸塩を混合して調製した）。反応プレートをMULTIDROP ３８４に移し、スタートキーを押して各ウェルに３０μLヒアルロン酸ナトリウム基質溶液を分注して反応を開始した。次に、プレートをMULTIDROP ３８４から取り出し、１０秒間震盪させ、次いでプレートカバーをして加熱ブロックに移した。プレートを３７℃で１０分間インキュベーションした。
MULTIDROP ３８４を調整して、血清ワーキング溶液(７５ｍＬの５００ｍＭ酢酸緩衝液溶液（ｐＨ４.３）中の２５ｍＬの血清ストック溶液［１容量のウマ血清(Sigma)を９容量の５００ｍＭ酢酸緩衝液溶液（ｐＨ４.３）で希釈し、pHを塩酸で３.１に調整した。］で機械を準備し、次いで容量設定を２４０μLに変更することにより反応を止めた。プレートを加熱ブロックから除去してMULTIDROP ３８４上に置き、２４０μLの血清ワーキング溶液をウェルに分注した。プレートを取り出し、プレートリーダー上で１０秒間震盪させた。さらに１５分間後、試料の濁度を６４０nmで測定し、各試料のヒアルロニダーゼ活性(Ｕ／ｍＬ)を標準曲線に当てはめて決定した。比活性(単位／mg)を、ヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)をタンパク質濃度(mg／ｍＬ)で割って計算した。
ｒＨｕＰＨ２０安定性に対する塩化ナトリウムの効果
ｒＨｕＰＨ２０をヒスチジン／HClおよび１３０ｍＭ塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)中の１０ｍｇ／ｍＬ溶液（ｐＨ６.５）とした。表２４に示すように、下記成分を含む６種の異なる製剤を作製した：２５ｍＭ Tris、ｐＨ７.３、１００μg／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０、０.０１％ Tween ８０、およびＮａＣｌ(０、５０、１００、１５０、２００、または２５０ｍＭ)。溶液をゴム栓付き２ｍＬ I型ガラスバイアルに等分し、アルミニウムキャップで密封した。１組のバイアルを４０℃で４日間保存し、別の組を２〜８℃で冷蔵した。
表２４ ＮａＣｌ含有ｒＨｕＰＨ２０製剤
Figure 2013505237
４日間保存した後、表２４に記載の各製剤のヒアルロニダーゼ酵素活性を実施例４に吉舎の微小濁度分析を用いて試験した。サイズ排除クロマトグラフィ （SEC）を行って、下記条件での凝集物レベルを評価した：１X PBS、Toso BioScience G２０００ SWXLカラム、流速＝１ｍＬ／min。
表２５は、各製剤の、ヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)，％主要ピーク面積(主要ピーク面積中に含まれるｒＨｕＰＨ２０の割合)、および％凝集物ピーク面積(凝集物に起因するピーク面積に含まれるｒＨｕＰＨ２０の割合)を含む試験結果である。結果は、４０℃でインキュベーションしたときのｒＨｕＰＨ２０の安定性はＮａＣｌ濃度に依存することを示し、ＮａＣｌ濃度の増加はｒＨｕＰＨ２０の酵素活性の増加をもたらした。２〜８℃で保存した試料は、製剤に関わらず試験経過中を通して同レベルのｒＨｕＰＨ２０の酵素活性を保持した。上昇した温度(４０℃)でＮａＣｌを欠くと、ｒＨｕＰＨ２０の酵素活性は完全に消失した。
表２５の結果は、ｒＨｕＰＨ２０の凝集物レベルに対するＮａＣｌ濃度の効果も示す。凝集物レベルは４０℃で保存した試料中のＮａＣｌ濃度の低下に伴って増加した。２〜８℃で保存した試料に実質的な違いはなかった。
すなわち、この結果は、試験したＮａＣｌ濃度範囲内(０〜２５０nM)では、ＮａＣｌ濃度とｒＨｕＰＨ２０の安定性増加には直接の関係があり、上昇した温度でｒＨｕＰＨ２０の安定性を増加させるためには溶解度と等張性の限度内でできるだけＮａＣｌ濃度を高く維持すべきであることを示唆した。
表２５ ４０℃および２８℃で４日間保存した試料の酵素活性およびSECの結果
Figure 2013505237
共製剤化したｒＨｕＰＨ２０とＩＧの安定性
A. 共製剤化した１０％ ＩＧまたは２０％ ＩＧとｒＨｕＰＨ２０の安定性
ｒＨｕＰＨ２０を以下のごとく製剤化した：１０ｍＭ ヒスチジンおよび１３０ｍＭ 塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)（ｐＨ６.０）中のロットHUB０７０２CA（実施例３に記載のGen２生成物を用いて作製）の組換えヒトヒアルロニダーゼ１０４８０７１単位を１mLに含む。ｒＨｕＰＨ２０を、１０ｍＭ ヒスチジン + １３０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６.０で１０００００Ｕ／ｍＬに希釈し、次いで免疫グロブリンと混合した。このために、２００μLのｒＨｕＰＨ２０ストック溶液を１８９６μLのヒスチジン／ＮａＣｌ緩衝液、ｐＨ６.０で希釈した。
予め希釈したｒＨｕＰＨ２０をｐＨ４.４〜４.９の０.２５ M グリシン中で処方した種々のイG製剤に加え、溶液中の最終濃度を１００Ｕ／ｍＬまたは３００Ｕ／ｍＬとした。
大規模製造で得た３つの異なる１０％ ＩＧロット(LE１２H０２０、LE１２H０６２、およびLE１２H１７３)の１つ、または３つの異なる前臨床 ２０％ ＩＧロット(SC００１０７NG、SC００２０７NG、およびSC００３０７NG)のうちの１つを、表２６にしたがって用いた。該溶液を０.２μmフィルターで濾過し、１mL部分を無菌５mLガラスバイアルに移した。バイアルを２〜８℃または２８〜３２℃で保存した。したがって、得られたｒＨｕＰＨ２０とＩＧの共製剤をｐＨ４.４〜４.９の０.２５ M グリシンを用いて製剤化した。
表２６ ｒＨｕＰＨ２０および１０％ＩＧまたは２０％ＩＧの共製剤
Figure 2013505237
０(出発)、１、３、６、１２、２４、および３６週間(２〜８℃のみ)保存後、表２６に記載の６製剤のそれぞれから、および各保存チャンバー（２〜８℃および２８〜３２℃）からの１試料をインキュベーションから取り出し、そのヒアルロニダーゼ活性を実施例４に記載の微小濁度分析で分析した。IGに対する効果を評価するため、２０％ ＩＧ含有製剤中のIGの分子のサイズ分布を、高速サイズ排除クロマトグラフィ（HP−SEC）(TSK G ３０００ SW ６００ x ７.５ mmカラム(Tosoh Bioscience)およびDMSO含有緩衝液系(Kolarich et al.(２００６)Transfusion、４６：１９５９−１９７７)を使用)により０（出発）および６月で試験した。
表２７は、２〜８℃で保存した各強精剤の７時点(０、１、３、６、１２、２４、および３６週間)におけるヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)を示す。表２８は、２８〜３２℃で保存した共製剤の６時点(０、１、３、６、１２、および２週間)におけるヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)を示す。ヒアルロニダーゼ活性の有意な一定な損失が、２８〜３２℃で保存した２４週間後の１０％および２０％ＩＧ共製剤の存在下で認められ、ｒＨｕＰＨ２０の不安定性を示した。１０％ ＩＧ共製剤は２〜８℃保存で９月後に安定であったが、rＨｕＰＨ２０活性は２０％ＩＧ共製剤でわずかに低下した。２０％ＩＧ含有製剤中のIGの分子のサイズ分布は、両温度で保存６月後に変化がなかった（表２９および３０）。
表２７ ２−８℃で保存した後の共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表２８ ２８−３２℃で保存した後の共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表２９ ２０％ ＩＧとｒＨｕＰＨ２０の共製剤の２−８℃保存後の分子のサイズ分布
Figure 2013505237
表３０ ２０％ＩＧとｒＨｕＰＨ２０の共製剤の２８−３２℃保存後の分子のサイズ分布
Figure 2013505237
 B. 塩化ナトリウム(０−１５０ｍＭ)を含む１０％ＩＧとｒＨｕＰＨ２０の共製剤の安定性
該共製剤のｒＨｕＰＨ２０の安定性を改善するための塩化ナトリウム(ＮａＣｌ)添加の効果を検討した。１０％ ＩＧ(ロットLE１２F０４７)を含む３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０ (ロットHUB０７０２CA；実施例３に記載のGen2製造法を用いて製造)の共製剤を、実施例７Aに記載のごとく異なる４濃度(０、５０、１００、および１５０ｍＭ)のＮａＣｌを加えて製造した。該共製剤を２〜８℃または２８〜３２℃で保存した。すなわち、得られたｒＨｕＰＨ２０とＩＧの共製剤を種々の濃度のＮａＣｌの存在下、ｐＨ４.６〜５.１の０.２５ M グリシン(希釈溶液で測定)を用いて製剤化した。０(出発)、１、３、６、１２、１８、および２４週間保存後、各共製剤(ＮａＣｌ濃度 ０、５０、１００、および１５０ｍＭ)および各保存チャンバー(２〜８℃および２８〜３２℃)から１試料をインキュベーションから取り出し、実施例４に記載の微小濁度アッセイを用いてヒアルロニダーゼ活性を測定した。IG凝集をTSK G ３０００ SW ６００ x ７.５mmカラムおよびDMSO含有緩衝液系（Kolarich et al.(２００６)Transfusion、４６：１９５９−１９７７）を用いる高速サイズ排除クロマトグラフィ(HP−SEC)による分子のサイズ分布(MSD)により測定した。表３１および３２は、各共製剤の７時点(０、１、３、６、１２、１８、および２４週間)でのヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)を示す。結果は、５０、１００、または１５０ｍＭ ＮａＣｌ存在下で１０％ ＩＧと共製剤化したｒＨｕＰＨ２０の安定性が２〜８℃保存では２４週間まで変化しないままであり、２８〜３２℃で保存した試料ではｒＨｕＰＨ２０の安定性が改善されたことを示す。 しかしながら、２８〜３２℃で保存したＮａＣｌ濃度０ｍＭの共製剤でではヒアルロニダーゼ活性が急速に低下した。
表３３および３４は、ＮａＣlは、両保存温度でＩｇのダイマー化(〜３５０ｋＤａ)および２８〜３２℃でＩＧ 凝集(>４５０ｋＤａ)をわずかに増加させ、すべての値は６月後にMSD仕様限界(＞９０％ モノマー／ダイマー、＜５％凝集物、＜５％断片)内であった。
ＮａＣｌの添加は２８〜３２℃で保存したIG製剤の抗補体(ACA)価に悪影響を及ぼした（増加した）が、ACA価は静脈内(IV)投与の仕様指標であり、該共製剤の皮下投与と関連がない。
表３１ ２−８℃で保存したＮａＣｌ含有１０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表３２ ２８−３２℃で保存したＮａＣｌ含有１０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表３３ ２−８℃で保存後のＮａＣｌ含有１０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤におけるIGの分子サイズ分布
Figure 2013505237
表３４ ２８−３２℃で保存後のＮａＣｌ含有１０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤におけるIGの分子サイズ分布
Figure 2013505237
 C. ｒＨｕＰＨ２０および塩化ナトリウム(０−５０ｍＭ)を含む１０％ ＩＧまたは２０％ＩＧ共製剤の安定性
２８〜３２℃で保存したｒＨｕＰＨ２０と１０％ＩＧまたは２０％ＩＧの共製剤に塩化ナトリウムを添加する効果を検討した。１０％ＩＧ(ロットLE１２F０４７)を含む３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０ (ロットHUB０７０２CA；実施例１に記載のGen2製造法を用いて製造)の共製剤、および２０％ＩＧ(ロットSC00108NG)を含む３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０ (ロットHUB０７０２CA；実施例１に記載のGen2製造法を用いて製造)の共製剤を、実施例6Bに記載のごとくＮａＣｌ濃度０、５、１０、２０、３０、４０、および５０ｍＭで製造した。すなわち、得られたｒＨｕＰＨ２０とＩＧの共製剤を種々の濃度のＮａＣｌの存在下、ｐＨ４.６〜５.１の０.２５Mグリシン(希釈溶液で測定)を用いて製剤化した。
０(出発)、１、３、６、１２、および２４週間保存後、各共製剤(ＮａＣｌ濃度０、５、１０、２０、３０、４０、および５０ｍＭ)から１試料をインキュベーションから取り出し、実施例４に記載の微小濁度アッセイを用いてヒアルロニダーゼ活性を測定した。IG凝集をTSK G ３０００ SW ６００ x ７.５mmカラムおよびDMSO含有緩衝液系を用いる高速サイズ排除クロマトグラフィ(HP−SEC)による分子のサイズ分布(MSD)により測定した。
表３５および３６は、各共製剤の種々の時点(０、１、３、６、１２、および２４週間)でのヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)を示す。結果は、より高いＮａＣｌ濃度（２０、３０、４０、および５０ｍＭ）存在下で１０％ ＩＧと共製剤化したｒＨｕＰＨ２０の安定性が２８〜３２℃保存で２４週間を通して比較的変化しないままであった。２８〜３２℃で保存したＮａＣｌ濃度が２０ｍＭ未満の共製剤ではヒアルロニダーゼ活性が急速に低下した。２０％ ＩＧと共製剤化したｒＨｕＰＨ２０の安定性は、すべてのＮａＣｌ濃度で２８〜３２℃保存で２４週間にわたり比較的変化がなかった。
塩化ナトリウムは、２８〜３２℃で１０％および２０％ＩＧ共製剤におけるＩｇのダイマー化(〜３５０ｋＤａ)と凝集をわずかに増加させた。該効果は、ＩＧ凝集に関して２０％ ＩＧ(すなわち、より高いＩＧ濃度)において顕著でなかった（表３７および３８）。
表３５ ２８−３２℃で保存した後のＮａＣｌ含有１０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表３６ ２８−３２℃で保存した後のＮａＣｌ含有２０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表３７ ２８−３２℃で保存した後のＮａＣｌ含有１０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤のIGの分子サイズ分布
Figure 2013505237
表３８ ２８−３２℃で保存した後のＮａＣｌ含有２０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤のIGの分子サイズ分布
Figure 2013505237
 D. 塩化ナトリウム(１００−２５０ｍＭ)またはアミノ酸(５００ｍＭ)存在下での１０％ ＩＧまたは２０％ ＩＧと共製剤化したｒＨｕＰＨ２０の安定性
塩化ナトリウムまたはアミノ酸安定化剤を含むｒＨｕＰＨ２０と１０％ ＩＧまたは２０％ ＩＧ含有共製剤のｒＨｕＰＨ２０の安定性に対する効果について試験した。１０％ ＩＧ(０.２５ M グリシン、ｐＨ４.４)(ロット LE１２F０４７)または２０％ ＩＧ(ロット SC００１０８NG)と１００Ｕ／ｍＬまたは３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０(ロットHUB０７０２CA；実施例３に記載のGen２製造法を用いて製造)の共製剤を上記実施例６Aに記載のごとく製造した。試料は、ＮａＣｌ(濃度１００、１５０、または２５０ｍＭ)、グリシン(５００ｍＭ)、またはプロリン(５００ｍＭ)のいずれかを含んだ。該共製剤を２〜８℃または２８〜３２℃で保存した。すなわち、得られたｒＨｕＰＨ２０とIＧの共製剤を、種々の量のＮａＣｌ、グリシン、またはプロリンの存在下、ｐＨ４.６〜５.１で０.２５ M グリシンを用いて製剤化した。
０(出発)、１、２、３、６、および１２(３００Ｕ／ｍＬのみ)週間保存後、各共製剤(ＮａＣｌ濃度１００、１５０、または２５０ｍＭ、グリシン濃度５００ｍＭ、またはプロリン濃度５００ｍＭのいずれかを含む)から１試料をインキュベーションから取り出し、実施例４に記載の微小濁度アッセイを用いてヒアルロニダーゼ活性を分析した。IGの凝集を、TSK G ３０００ SW ６００ x ７.５ mmカラムおよびDMSO含有緩衝液系(Kolarich et al.(２００６)Transfusion、４６：１９５９−１９７７)を用いる高速サイズ排除クロマトグラフィ(HP−SEC)により０（出発）および１２週間で分子サイズ分布により測定した。
表３９および４１は、１００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０および１０％または２０％ＩＧを含む共製剤について５時点（０、１、２、３、および６週間)でのヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)を示す。表４０および４２は、３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０および１０％または２０％ ＩＧを含む共製剤について６時点(０、１、２、３、６、および１２週間)でのヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)を示す。結果は、高アミノ酸濃度(５００ｍＭ グリシンまたは５００ｍＭ プロリン)は、ＮａＣｌより、ｒＨｕＰＨ２０と１０％ ＩＧまたは２０％ＩＧの共製剤におけるｒＨｕＰＨ２０の安定化に対する効果が低かった。
塩化ナトリウムは、試験したすべての濃度ですべての共製剤で２８〜３２℃で保存後にＩＧ 凝集(>４５０ｋＤａ)を増強した。５００ｍＭ プロリンを含むすべての共製剤で、２８〜３２℃で６週間保存後にＩｇダイマー含有量(〜３５０ｋＤａ)が減少し、モノマー含有量(〜１６０ｋＤａ)を増加した。Ｉｇダイマー含有量はグリシンとの共製剤でも減少したが、プロリン共製剤では顕著ではなかった(表４３および４４)。高濃度のプロリンは、タンパク質間の非特異的疎水性相互作用を効果的にブロックすることにより再ホールディング中のタンパク質凝集を阻害するのに有効であることが証明された（Kumar et al.(１９９８)Biochem. Mol. Biol. Int. ４：５９−５１７）。
表３９ ２８−３２℃で保存後の安定化剤を含む１０％ ＩＧおよび１００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表４０ ２８−３２℃で保存後の安定化剤を含む１０％ ＩＧおよび３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表４１ ２８−３２℃で保存後の安定化剤を含む２０％ ＩＧおよび１００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表４２ ２８−３２℃で保存後の安定化剤を含む２０％ ＩＧおよび３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０共製剤のヒアルロニダーゼ活性(U／ｍＬ)
Figure 2013505237
表４３ ２８−３２℃で保存後のＮａＣｌ、グリシン、またはプロリンを含む１０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤におけるIGの分子サイズ分布
Figure 2013505237
表４４ ２８−３２℃で保存後のＮａＣｌ、グリシン、またはプロリンを含む２０％ ＩＧ／ｒＨｕＰＨ２０ 共製剤におけるIGの分子サイズ分布
Figure 2013505237
ｒＨｕＰＨ２０および１０％ ＩＧまたは２０％ ＩＧ共製剤のユカタンミニブタにおける効果
A. 実験計画
ユカタンミニブタに皮下投与した１０％または２０％ 免疫グロブリン(ＩＧ)と共製剤化したｒＨｕＰＨ２０溶液(１３０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ヒスチジン、ｐＨ６.６)の実現可能性を検討し、最先端の投与法(ｒＨｕＰＨ２０、次いでＩＧ溶液を連続投与)と比較した。種々の濃度のｒＨｕＰＨ２０を用いた投与反応を、各IG溶液についても評価した。１８頭の雄ユカタンミニブタ（１８.４〜２３.２kg(SNS Farms)を表４５に示す１１処置群の１または２に割当て、各群に３頭のブタを用いた。すべての製剤を、麻酔した雄ブタの背中に１０ゲージ９０度の柔軟に曲がるHuber針を用いて皮下投与した。最先端投与法については、ｒＨｕＰＨ２０、次いでＩｇＧを正確な位置に同じ針を用い、簡単なシリンジスイッチを用いて連続的に注射した。ｒＨｕＰＨ２０とＩｇＧの投与間の遅延は必要ないか、または遅延させなかった。それぞれ異なる処置群から最大２つの異なる製剤を、最大容量１１０ｍＬ／注射部位で各ブタで試験した。注入は、共製剤で約２９分間、最新の製剤で２２〜２８分間持続した。gh
表４５ 実験計画のまとめ
Figure 2013505237
投与後に注射部位の観察を行った。変換機を用いて各製剤を投与するのに用いた連続圧(mmHg)を測定し、血液を全血球計算(CBC)およびガンマ免疫グロブリン(ＩｇＧ)分析用に回収した。試験終了（投与の３日後）時に、すべての動物を麻酔し、２つの試料切片（AおよびB）を注射部位１、注射部位２、およびコントロール（２注射部位から離れた部位から回収）のそれぞれから回収し、１０％中性緩衝ホルマリン中で保存し、光学顕微鏡 (Nova Pathology、PC、San Diego、CA)で評価した。部位Aは、注射部位の中心を通る２−３mm厚切片であり、部位Bは回収した注射部位の端から得た。
B. 注射部位の観察
１０％ＩＧ単独投与(〜２５ｍＬ注入；１群)の５分以内に、明らかな「水疱」がブタ３頭すべてにみられた。２０％ＩＧ単独投与の約１０分に(〜２５ｍＬ注入；５群)明確な水疱がみられた。観察された水疱形成面積は、Ig単独投与に比べてすべてのｒＨｕＰＨ２０(最新を含む)含有製剤で増加し、ｒＨｕＰＨ２０を用いたときに液のより大きな分散を示した(表４６)。
共製剤 of ｒＨｕＰＨ２０と１０％および２０％ＩＧとの共製剤は、すべてのｒＨｕＰＨ２０濃度で皮膚の硬化の有意な減少(部位は柔軟なままであった)、およびすべてのｒＨｕＰＨ２０濃度で皮膚のピンク／赤みの減少をもたらした。最新の比較投与は、共製剤と同様のピンク／赤みをもたらした。投与後にみられた注射部位のピンク／赤みの発生は、すべての群で２４時間以内で完全な回復を示した(表４６)。
表４６ 注射部位の外観と分析
Figure 2013505237
 C. 圧測定結果
表４７に平均圧測定値をまとめる。２０％ＩＧ単独投与後2.5分間または直後に(第５群）すべての3頭のブタについて圧は測定範囲外(>４６０mmHg）であった。3頭のブタのうち2頭は、第6群において測定可能な圧範囲外であった。1頭は、第7群と第8群のそれぞれで範囲外であった。第1群と第2群はそれぞれ1頭が範囲外であった。結果は、ｒＨｕＰＨ２０を含む全ての共製剤で注射の減少を達成するのに該圧が必要であることを示した。
表４７ 平均圧測定分析
Figure 2013505237
 D. 全血球数およびＩｇＧ血漿分析
全血球数(CBC）分析用に投与前(〜２.０ｍＬ）および投与後30分(〜２.０ｍＬ）に、血液をK３EDTAチューブに回収した。試料を分析するまで4℃に保存した(Bioquant、Inc.、San Diego、CA）。CBCの結果は、いかなる生成物に関連する特定の安全性に関する心配ももたらさない。大部分のブタは正常CBCのレベル(正常CBC範囲はSNSファームから参照した)以内であった。18頭のブタのうち5頭は、試料中に可視的凝塊を示さず、評価できなかった。
投与前(〜２.０ｍＬ）および試験終了時(〜４.０ｍＬ）に、ガンマ免疫グロブリン(ＩｇＧ）分析用の血液をクエン酸ナトリウムチューブに回収し、ヒトＩｇＧの皮下投与後の全身的バイオアベイラビリティを確認した。試料を３０００rpmで4℃、10分間遠心分離し、血漿を等分し、分析するまで試料を−２０℃に保存した。表48に示すように、IgGの全般的増加が投与後3日の全ての動物でみられた。各ブタのＩｇＧ血漿レベルは、各ブタが投与された2つの異なる処置の平均を反映する(単回処置のみを受けた第7〜9番のブタを除く)。
表４８ ＩｇＧ分析
Figure 2013505237
 E. 組織病理学的結果
組織学的所見は、表皮、真皮、および皮下組織にみられ、複合白血球炎症、水腫、および出血が含まれた。各組織学的所見は、下記スキームに基づいて重症度を割り当てた：存在せず＝0；存在する場合、グレードなし＝0、最小＝1、軽度＝2、中等度＝3、顕著＝4。
表49〜51に、組織学的所見を発生率と平均群重症スコアによりまとめた。
表４９ 組織学的所見のまとめ：１０％ ＩＧ + ｒＨｕＰＨ２０
Figure 2013505237
表５０ 組織学的所見のまとめ：２０％ ＩＧ + ｒＨｕＰＨ２０
Figure 2013505237
表５１ 組織学的所見のまとめ：最新の投与
Figure 2013505237
ＩＧおよびｒＨｕＰＨ２０の投与に対する反応は、この試験の各投与群で定性的に同様であった。これらの反応は、注射部位の皮膚組織の複合白血球炎症、水腫、および出血によって特徴づけられた。表５２に、すべての投与群の平均群重症スコアを比較する。
表５２ 平均群重症スコアのまとめ
Figure 2013505237
平均群重症スコアに基づいて、最も重症の注射部位反応は、１００ｍＬの１０％ＩＧ単独投与(第１群）および５０ｍＬの３００Ｕ／ｍＬ ｒＨｕＰＨ２０と共製剤化した２０％ＩＧの投与(第８群）と関連があった。１００ｍＬのｒＨｕＰＨ２０と共製剤化した１０％ＩＧ(５０、１００、および３００Ｕ／ｍＬの１０％ＩＧ(第２〜４群）)の投与に対する反応は、５０ｍＬの２０％ ＩＧ単独投与(第５群）、ｒＨｕＰＨ２０と共製剤化した５０および１００Ｕ／ｍＬの２０％ＩＧの投与(第６および７群）、ならびに１０ｍＬのｒＨｕＰＨ２０(１５０Ｕ／ｍＬ）、次いで１００ｍＬの１０％ＩＧの最新の投与(第９群）に対する反応と同様であった。しかしながら、１０または２０ｍＬのｒＨｕＰＨ２０(１５０Ｕ／ｍＬ）、次いで５０ｍＬの２０％ ＩＧの最新の投与(第１０および１１群）は、同様の共製剤(第6および7群)より重症の反応を生じた。コントロール皮膚の切片は、被験製品の注射部位からの注さした製剤の拡散に起因しうる少数の組織学的所見と、製剤とは無関係の偶発的所見を含んだ。
F. まとめ
結果は、ユカタンミニブタへの１０％および２０％ＩＧと共製剤化したｒＨｕＰＨ２０の皮下投与の実現可能性を証明した。ＩＧ(１０％または２０％）の単独投与は実現可能であるが、中等度〜重度の皮膚の硬化とピンク／赤みを生じた。ｒＨｕＰＨ２０との共製剤は、注射を達成するのに必要な圧の低下と、皮膚の硬化の顕著な減少、ならびに皮膚のピンク／赤みに減少をもたらした。観察された水疱形成の面積は、Ig単独に比べてｒＨｕＰＨ２０を含むすべての製剤で同様または増加し、ｒＨｕＰＨ２０を利用した時の液の分散がより大きいことを確認した。最新の投与は実現可能であり、同様の圧、ピンク／赤み、および水疱領域が共製剤で観察された。組織病理学的所見は、投与に起因して深部皮下組織に存在し、複合白血球炎症、水腫、および出血が含まれ、最も重症の反応は、１０％ ＩＧの単独投与およびｒＨｕＰＨ２０(３００Ｕ／ｍＬ）と共製剤化した２０％ ＩＧの投与と関連があった。
修飾は当業者に明らかであるので、本発明は、特許請求の範囲によってのみ限定されることを意図する。

Claims (55)

  1. 皮下投与用に製剤化された安定な液体共製剤組成物であって、
    ｐＨが４または約４〜５または約５であり：
    少なくとも１０％ｗ／ｖの濃度の免疫グロブリン（ＩＧ）；
    少なくとも５０Ｕ／ｍＬの濃度の、静脈内注射用免疫グロブリンの静脈内注入と同じかまたはそれより大きい注入速度で該組成物を単一注射部位に皮下投与するのを可能にするのに充分な量で存在する濃度の可溶性ヒアルロニダーゼ；および
    少なくとも０.０５Mの濃度のアルカリ金属塩化物塩を含み、
    ３２℃以下の温度で少なくとも６月安定である、安定な液体共製剤組成物。
  2. 皮下投与のために製剤された安定な液体共製剤組成物であって、
    ｐＨが４または約４〜５または約５であり：
    少なくとも１０％ｗ／ｖの濃度の免疫グロブリン（ＩＧ）；
    少なくとも５０Ｕ／ｍＬの、少なくとも１００単位／グラム（Ｕ／g）ＩＧの比で存在する濃度の可溶性ヒアルロニダーゼ；および
    少なくとも０.０５Mの濃度のアルカリ金属塩化物塩を含み、
    ３２℃以下の温度で少なくとも６月安定である、安定な液体共製剤組成物。
  3. さらに少なくとも０.１Mの量のアミノ酸安定化剤を含む請求項１または２記載の安定な液体共製剤。
  4. 該アミノ酸安定化剤が、アラニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、イソロイシン、バリン、メチオニン、グリシンおよびプロリンから選ばれる請求項３記載の安定な液体共製剤。
  5. 該アミノ酸安定化剤が、グリシンまたはプロリンである請求項３または４記載の安定な液体共製剤。
  6. 該アミノ酸安定化剤が、ちょうどまたは少なくとも０.１M、０.１５M、０.２M、０.２５M、０.３M、０.３５M、０.４M、０.４５M、０.５M、０.６M、０.７Mまたは０.７５Mである請求項１〜５のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  7. 該アミノ酸安定化剤の量が０.２５Mである請求項１〜６のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  8. 該ＩＧが、少なくとも１０％ｗ／ｖ、１１％ｗ／ｖ、１２％ｗ／ｖ、１３％ｗ／ｖ、１４％ｗ／ｖ、１５％ｗ／ｖ、１６％ｗ／ｖ、１７％ｗ／ｖ、１８％ｗ／ｖ、１９％ｗ／ｖ、２０％ｗ／ｖ、２１％ｗ／ｖ、２２％ｗ／ｖまたはそれ以上である請求項１〜７のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  9. 該ＩＧが、１０％ｗ／ｖまたは約１０％ｗ／ｖ〜２０％ｗ／ｖまたは約２０％ｗ／ｖである請求項１〜８のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  10. 該ＩＧが、ヒト血漿由来である請求項１〜９のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  11. 該ＩＧが、ヒト血漿から、アルコール分画法を含む精製法により精製される請求項１〜１０のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  12. 該ＩＧが、さらにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、イオン交換クロマトグラフィ、酵素的開裂、ディアフィルトレーションまたは限外濾過の1またはそれ以上によって精製される請求項１〜１１のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  13. 該ＩＧを、ペプシン含有または非含有でｐＨ４．０でのインキュベーション、溶媒・界面活性剤処置およびナノ濾過から選ばれるウイルス減少工程にかける、請求項１〜１２のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  14. 該ＩＧが、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭを含む請求項１〜１３のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  15. 該ＩＧの９５％以上がＩｇＧである請求項１〜１４のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  16. 該アルカリ金属塩化物塩が、ＫＣｌおよびＮａＣｌから選ばれる請求項１〜１５のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  17. 該アルカリ金属塩化物塩がＮａＣｌであり、該ＮａＣｌが０.０２５M、０.０３M、０.０４M、０.０５M、０.０８M、０.０９M、０.１M、０.１５M、０.２Mまたは０.２５Mの濃度である請求項１〜１６のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  18. 該ＮａＣｌが０.１５Mの濃度である請求項１〜１７のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  19. 該可溶性ヒアルロニダーゼが、ＰＨ２０またはその切断形である請求項１〜１８のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  20. 該ＰＨ２０が、ヒツジ、ウシまたは切断形ヒトＰＨ２０から選ばれる請求項１〜１９のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  21. 該ＰＨ２０が、切断形ヒトＰＨ２０であり、該切断形ヒトＰＨ２０が、配列番号：４〜９のいずれかに記載のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのアレル変異体または他の変異体から選ばれる、請求項１〜２０のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  22. 該可溶性ヒアルロニダーゼが、ｒＨｕＰＨ２０である請求項１〜２１のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  23. 該可溶性ヒアルロニダーゼの濃度が、５０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、３００Ｕ／ｍＬ、４００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬまたはそれ以上である請求項１〜２２のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  24. 該可溶性ヒアルロニダーゼの濃度が、７５Ｕ／ｍＬまたは約７５Ｕ／ｍＬ〜３５０Ｕ／ｍＬまたは約３５０Ｕ／ｍＬである請求項１〜２３のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  25. 該可溶性ヒアルロニダーゼの比が、１００Ｕ／g ＩＧ、１５０Ｕ／g ＩＧ、２００Ｕ／g ＩＧ、２５０Ｕ／g ＩＧ、３００Ｕ／g ＩＧ、４００Ｕ／g ＩＧ、５００Ｕ／g ＩＧ、６００Ｕ／g ＩＧ、７００Ｕ／g ＩＧ、８００Ｕ／g ＩＧ、９００Ｕ／g ＩＧ、１０００Ｕ／g ＩＧ、１２００Ｕ／g ＩＧ、１５００Ｕ／g ＩＧ、１８００Ｕ／g ＩＧ、２０００Ｕ／g ＩＧ、３０００Ｕ／g ＩＧ、４０００Ｕ／g ＩＧまたは５０００Ｕ／g ＩＧである請求項１〜２４のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  26. 該可溶性ヒアルロニダーゼの比が、２５０Ｕ／g、５００Ｕ／g ＩＧ、１０００Ｕ／g ＩＧ、１５００Ｕ／g ＩＧまたは３０００Ｕ／g ＩＧである請求項１〜２５のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  27. ｐＨ４.４〜４.９の濃縮形の、請求項１〜２６のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  28. 複数回投与用の請求項１〜２７のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  29. 単回投与用の請求項１〜２８のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  30. 該ＩＧが、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療のための単回投与に十分な量である、請求項１〜２７および２９のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  31. 該ＩＧの量が、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療のために、毎日、毎週、隔週、２〜３週間ごと、３〜４週間ごとまたは毎月一回の単回投与に十分な量である、請求項１〜２７および２９〜３０のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  32. 該共製剤中のＩＧの量が、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療のために静脈内投与される場合の単回投与量と実質的に同一である、請求項１〜３１のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  33. 単回投与用であり、ＩＧの量が、ちょうど、約、または少なくとも１グラム（g）、２g、３g、４g、５g、１０g、２０g、３０g、４０g、５０g、６０g、７０g、８０g、９０g、１００gまたは２００g、またはちょうどまたは約１〜２００、１〜１００、１０〜１００、５〜５０、６〜５０、５〜１００gである請求項１〜３２のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  34. 単回投与用であり、ヒアルロニダーゼの量が、ちょうど、約、または少なくとも約５００単位、１０００単位、２０００単位、５０００単位、１０，０００単位、３０，０００単位、４０，０００単位、５０，０００単位、６０，０００単位、７０，０００単位、８０，０００単位、９０，０００単位、１００，０００単位またはそれ以上である、請求項１〜３３のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  35. ２８℃〜３２℃で６月間、７月間、８月間、９月間、１０月間、１１月間、１２月間またはそれ以上安定である請求項１〜３４のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  36. ０℃〜１０℃で６月間、１年間、２年間またはそれ以上安定である、請求項１〜３５のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  37. 請求項１〜３６のいずれかに記載の安定な液体共製剤および所望により使用説明書を含むキット。
  38. 請求項１〜３６のいずれかに記載の安定な液体共製剤を含む容器。
  39. チューブ、ボトルまたはバイアルである請求項３８記載の容器。
  40. シリンジである請求項３８記載の容器。
  41. さらに注射針を有する請求項３８〜４０のいずれかに記載の容器。
  42. 該安定な液体共製剤が、単回投与または複数回投与で提供される請求項３８〜４１のいずれかに記載の容器。
  43. 請求項３８〜４２のいずれかに記載の容器、および該組成物を注入するための手段を含むキット。
  44. 対象に、請求項１〜３６のいずれかに記載の安定な液体共製剤を皮下投与することを含む、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療方法。
  45. 該共製剤において、投与されるＩＧの量が、ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療のために静脈内投与される場合と実質的に同じである請求項４４に記載の方法。
  46. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、原発性免疫応答不全疾患、続発性免疫応答不全疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および急性感染症から選ばれる請求項４４または４５に記載の方法。
  47. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、原発性免疫不全疾患であり、該原発性免疫不全疾患が、分類不能原発性免疫不全疾患(CVID）、選択的ＩｇＡ欠損症、ＩｇＧサブクラス欠損症、特異的抗体欠乏症、補体疾患、先天性無ガンマグロブリン血症、毛細血管拡張性運動失調症、高ＩｇＭ症、ウイスコット−アルドリッチ（Wiskott−Aldrich）症候群、重症複合免疫不全(SCID）、原発性低ガンマグロブリン血症、抗体の欠損を伴う原発性免疫不全疾患、X連鎖無ガンマグロブリン血症(XLA）および乳児の低ガンマグロブリン血症から選ばれる請求項４４〜４６のいずれかに記載の方法。
  48. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、血液悪性疾患に伴う後天性免疫不全疾患であり、該血液悪性疾患が、慢性リンパ性白血病(CLL）、多発性骨髄腫(MM）および非ホジキンリンパ腫(NHL）から選ばれる、請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。
  49. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、炎症性疾患または自己免疫疾患であり、該炎症性疾患または自己免疫疾患が、川崎病、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、ギランバレー症候群、特発性血小板減少性紫斑病、多発性筋炎、皮膚筋炎、封入体性筋炎、ランバート−イートン（Lambert−Eaton）筋無力症候群、多病巣性運動神経疾患、重症筋無力症およびメルシュ−ボルトマン（Moersch−Woltman）症候群から選ばれる、請求項４４〜４８のいずれかに記載の方法。
  50. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、急性細菌、ウイルスまたは真菌感染であり、該急性細菌、ウイルスまたは真菌感染が、B型インフルエンザ菌；AおよびB型緑膿菌；黄色ブドウ球菌；B群連鎖球菌；１、３、４、６、７、８、９、１２、１４、１８、１９および２３型肺炎連鎖球菌；２および５型アデノウイルス；サイトメガロウイルス；エプスタイン−バー（Epstein−Barr）ウイルス VCA；Ａ型肝炎ウイルス；Ｂ型肝炎ウイルス；１型単純ヘルペスウイルス；２型単純ヘルペスウイルス；Ａ型インフルエンザ；麻疹；１、２および３型パラインフルエンザ；ポリオ；水痘帯状疱疹ウイルス；アスペルギルス；およびカンジダアルビカンスから選ばれる請求項４４〜４９のいずれかに記載の方法。
  51. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、医原性免疫不全；急性播種性脳脊髄炎；ANCA−陽性全身性壊死性血管炎；自己免疫性溶血性貧血；水疱性類天疱瘡；瘢痕性類天疱瘡；エバンス症候群(免疫性血小板減少症を伴う自己免疫性溶血性貧血を含む）；胎児母体同種免疫性血小板減少症／新生児同種免疫性血小板減少症（FMAIT／NAIT）；血球貪食症候群；高リスク同種造血幹細胞移植；ＩｇＭ パラプロテイン血症性ニューロパシー；腎臓移植；多発性硬化症；オプソクローヌスミオクローヌス運動失調；落葉状天疱瘡；尋常性天疱瘡；輸血後紫斑症；中毒性表皮壊死症／スティーブンジョンソン症候群(TEN／SJS）；毒素性ショック症候群；アルツハイマー病；全身性エリテマトーデス；多発性骨髄腫；敗血症；Ｂ細胞腫瘍；無抗体性傍腫瘍性小脳変性症；および骨髄移植から選ばれる請求項４４〜５０のいずれかに記載の方法。
  52. ＩＧで治療可能な疾患または病状を治療するための医薬を製造するための請求項１〜３６のいずれかに記載の安定な液体共製剤の使用。
  53. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、原発性免疫不全疾患、続発性免疫不全疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および急性感染症から選ばれる請求項５２に記載の使用。
  54. ＩＧで治療可能な疾患または病状の治療に使用するための、請求項１〜３６のいずれかに記載の安定な液体共製剤。
  55. 該ＩＧで治療可能な疾患または病状が、原発性免疫不全疾患、続発性免疫不全全疾患、炎症性疾患、自己免疫疾患および急性感染症から選ばれる請求項５４の安定な液体共製剤。
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