BR112020019041A2 - variantes de ph20 ou fragmento da mesma, ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira e composição para tratamento de câncer - Google Patents

Abstract

VARIANTES DE PH20 OU FRAGMENTO DA MESMA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA E COMPOSIÇÃO PARA TRATAMENTO DE CÂNCER A presente invenção trata de variantes da hialuronidase PH20 ou fragmentos da mesma, que compreendem uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos na região correspondente à região de alfa-hélice e sua região ligante na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem de SEQ ID NO: 1 e em que um ou mais resíduos de aminoácidos no N-terminal e/ou C-terminal são seletivamente clivados adicionalmente. Especificamente, compreendem uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T341A, T341C, T341G, S343E, M345T, K349E, L353A, L354I, N356E e I361T em PH20 tipo selvagem tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e, adicionalmente, compreende a substituição de aminoácidos localizados na região alfa-hélice 8 e/ou uma região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem, e em que um ou mais aminoácidos localizados nas regiões N-terminal e C-terminal são deletados.

Description

VARIANTES DE PH20 OU FRAGMENTO DA MESMA, ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO RECOMBINANTE, CÉLULA HOSPEDEIRA E COMPOSIÇÃO PARA

TRATAMENTO DE CÂNCER Campo de Aplicação

[001] A presente invenção se refere a novas variantes de hialuronidase humana com atividade enzimática e estabilidade térmica aumentadas em comparação com a hialuronidase humana que é uma enzima que hidrolisa o ácido hialurônico e, mais particularmente, a variantes da hialuronidase PH20 ou fragmentos das mesmas, que compreendem uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos na região correspondente à região de alfa hélice e/ou sua região ligante em PH20 de tipo selvagem com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, de preferência PH20 de tipo selvagem maduro que consiste em resíduos de aminoácidos L36 a S490, e em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos N- terminal ou C-terminal são seletivamente deletados, um método para a produção dos mesmos e uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo.

Estado da Técnica

[002] A pele humana é composta de epiderme, derme e uma camada de gordura subcutânea, e existem seis tipos de glicosaminoglicanos na pele. Esses glicosaminoglicanos incluem ácido hialurônico, sulfato de condroitina, sulfato de dermatan, sulfato de heparan, heparina e sulfato de queratina.

[003] Esses glicosaminoglicanos são compostos de unidades de açúcar dissacarídeo repetidas. O número de unidades de açúcar dissacarídeo é diferente entre os glicosaminoglicanos, mas varia de várias centenas a milhares. Entre os glicosaminoglicanos, o ácido hialurônico está presente na pele em mais da metade de sua quantidade no corpo. O ácido hialurônico é sintetizado pela hialuronana sintetase presente na membrana celular, está presente sozinho sem se ligar a proteoglicanos e é o único glicosaminoglicano sem grupo sulfato. Outros glicosaminoglicanos se ligam aos proteoglicanos e possuem um grupo sulfato. O ácido hialurônico consiste em ácido glucurônico e N-acetilglucosamina ligados por meio de ligações alternadas β-1,4 e β-1,3, e é composto por cerca de 5.000 unidades repetidas desses dissacarídeos. Sabe-se que cerca de um terço (5 g) do ácido hialurônico no corpo humano é renovado todos os dias.

[004] As hialuronidases são enzimas que degradam o ácido hialurônico presente na matriz extracelular. Sabe-se que existem seis tipos de hialuronidases em humanos: são Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4, HyalPS1 e PH20/SPAM1. Hyal1 e Hyal2 humanos são expressos na maioria dos tecidos. PH20/SPAM1 (doravante referido como PH20) é expresso na membrana plasmática do esperma e na membrana acrossomal. No entanto, HyalPS1 não é expresso porque é um pseudogene. As hialuronidases estão divididos em, de acordo com um método de clivagem de ácido hialurônico, três tipos: enzimas (EC 3.2.1.35) que clivam β-1,4 ligases entre N- acetilglucosamina e ácido glucurônico pelo uso de H2O; enzimas (EC 3.2.1.36) que clivam β-1,3 ligases entre N-acetilglucosamina e ácido glucurônico pelo uso de H2O; e hialuronidases bacterianas (EC 4.2.99.1) que clivam β-1,4 ligações sem usar H2O.

[005] Os aminoácidos catalíticos de Hyal1 são D129 e E131, que hidrolisam o ácido hialurônico por catálise assistida por substrato. Hyal1 exibe a atividade ideal em um pH ácido de 3 a 4 e não tem atividade enzimática em pH 4,5 ou superior. Em contraste com Hyal1, PH20 exibe atividade enzimática em uma ampla faixa de pH de 3 a 8.

[006] Arming et al. identificaram que os aminoácidos catalíticos de PH20 são D111 e E113 (Arming et al., 1997). Arming et al. marcaram Leu como o primeiro aminoácido da proteína madura e, portanto, os aminoácidos catalíticos do PH20 de comprimento completo com o peptídeo sinal correspondem a D146 e E148, respectivamente.

[007] A hialuronidase hidrolisa o ácido hialurônico, reduzindo assim a viscosidade do ácido hialurônico na matriz extracelular e aumentando a permeabilidade do mesmo no tecido (pele). A área subcutânea da pele tem um pH neutro de cerca de 7,0 a 7,5. Assim, entre os vários tipos de hialuronidases, o PH20 é amplamente utilizado na prática clínica (Bookbinder et al., 2006). Em exemplos em que o PH20 é usado na prática clínica, o PH20 é usado como um relaxante ocular e um aditivo anestésico em cirurgia oftálmica, e também é coadministrado com um agente terapêutico de anticorpo que é injetado por via subcutânea (Bookbinder et al., 2006). Além disso, com base na propriedade do ácido hialurônico que é sobre-expresso em células tumorais, o PH20 é usado para hidrolisar o ácido hialurônico na matriz extracelular das células tumorais, aumentando assim o acesso de um agente terapêutico anticancerígeno às células tumorais. Além disso, também é usado para promover a reabsorção de fluidos corporais e sangue, que estão excessivamente presentes nos tecidos.

[008] O PH20 foi identificado pela primeira vez em espermatozoides de cobaias por Lathrop et al., e também é conhecido por ser expresso em espermatozoides de diferentes espécies. O gene PH20 humano foi clonado por Lin et al. e Gmachl et al. PH20 humano tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 que consiste em 509 resíduos de aminoácidos e exibe 60% de identidade de aminoácidos com o gene PH20 de cobaia. A enzima PH20 humana é codificada a partir do gene SPAM1 (molécula de adesão do espermatozoide-1), e o Ser490 do PH20 está presente como uma ligação ao glicosilfosfatidilinositol (GPI) na superfície da membrana plasmática do esperma e na membrana acrossomal. O espermatozoide hidrolisa o ácido hialurônico usando PH20 quando ele penetra oócitos através da camada cumulus rica em hialuronana dos oócitos. PH20 está presente na quantidade correspondente a 1% ou menos da quantidade de proteínas no esperma e tem seis sítios de N-glicosilação (N82, N166, N235, N254, N368 e N393).

[009] Atualmente disponível comercialmente, o PH20 é obtido por extração de testículos de bovinos ou ovinos. Exemplos destes incluem Amphadase® (hialuronidase bovina) e Vitrase® (hialuronidase ovina).

[010] A hialuronidase testicular bovina (BTH) é obtida removendo um peptídeo sinal e 56 aminoácidos no C-terminal do PH20 de tipo selvagem bovino durante a modificação pós-tradução. O BTH também é uma glicoproteína e tem um teor de manose de 5% e um teor de glucosamina de 2,2%, com base nos componentes totais, incluindo aminoácidos. Quando a hialuronidase de origem animal é repetidamente administrada ao corpo humano em uma dose elevada, pode ser produzido um anticorpo neutralizante. Como a hialuronidase de origem animal contém outros biomateriais além do PH20, ela pode causar uma reação alérgica quando administrada ao corpo humano (Bookbinder et al., 2006). Em particular, a produção e o uso de PH20 extraído de gado podem ser limitados devido a preocupações com a doença da vaca louca. A fim de superar este problema, estudos sobre a proteína recombinante do PH20 humano foram conduzidos.

[011] Foi relatado que a proteína recombinante do PH20 humano é expressa em leveduras (P. pastoris), células de inseto DS-2 e células animais. As proteínas PH20 recombinantes produzidas em células de inseto e levedura diferem do PH20 humano em termos do padrão de N-glicosilação durante a modificação pós-tradução.

[012] Entre as hialuronidases, apenas estruturas tridimensionais de Hyal1 (PDB ID: 2PE4) (Chao et al., 2007) e hialuronidase de veneno de abelha (PDB ID: 1FCQ, 1FCU, 1FCV) são determinados. Hyal1 é composto por dois domínios, um domínio catalítico e um domínio do tipo EGF. O domínio catalítico está na forma de (β/α)8 em que uma alfa-hélice e uma beta-fita, que caracterizam a estrutura secundária da proteína, são repetidas oito vezes cada uma (Chao et al., 2007). O domínio do tipo EGF é completamente conservado em variantes nas quais o C-terminal de Hyal1 é processado de forma diferente. As sequências de aminoácidos de Hyal1 e PH20 são 35,1% idênticas e a estrutura da proteína de PH20 ainda não foi encontrada.

[013] Uma proteína recombinante de PH20 humano foi desenvolvida pela Halozyme Therapeutic, Inc. e foi vendida sob o nome comercial Hylenex® (Bookbinder et al., 2006; Frost, 2007).

[014] Quando D146 e E148, que são os aminoácidos catalíticos de PH20, foram mutados para asparagina (D146N) e glutamina (E148Q), respectivamente, não houve atividade enzimática (Arming et al., 1997). Além disso, quando R246 de PH20 foi substituído por glicina, a atividade enzimática foi reduzida em 90%, e quando E319 foi substituído por glutamina e R322 foi substituído por treonina, a atividade enzimática desapareceu. Uma variante na qual 36 aminoácidos no C-terminal de PH20 foram removidos (truncamento de 474-509 aminoácidos) mostrou uma redução de 75% na atividade enzimática em comparação com PH20 de tipo selvagem. Esta variante não foi secretada extracelularmente e permaneceu em células HeLa. Quando os 134 aminoácidos do C-terminal foram removidos do PH20, o PH20 não teve atividade enzimática e não foi secretado extracelularmente. De acordo com Frost et al., a região C-terminal 477-483 de PH20 é essencial para a expressão solúvel (Frost, 2007). A atividade de PH20 de comprimento total (1 a 509) ou uma variante de PH20 com um C-terminal truncado na posição 467 foi apenas 10% de uma variante de PH20 com um C- terminal truncado em uma das posições 477 a 483 (Frost, 2007).

[015] Enquanto isso, o PH20 recombinante ainda tem estabilidade térmica insuficiente ou níveis de expressão nas células recombinantes. Portanto, existe uma grande demanda na indústria por uma hialuronidase recombinante com características biológicas e físico-químicas ainda melhoradas.

Descrição Geral da invenção

Problema Técnico

[016] É um objetivo da presente invenção fornecer uma variante de hialuronidase PH20 ou fragmento da mesma que é melhorada em estabilidade térmica, atividade enzimática e nível de expressão, em comparação com PH20 de tipo selvagem, preferencialmente PH20 de tipo selvagem maduro.

[017] Outro objetivo da presente invenção é fornecer uma composição para o tratamento de câncer compreendendo a variante PH20 de hialuronidase descrita acima ou um fragmento do mesmo, e um método para tratar o câncer usando o mesmo.

Solução Técnica

[018] Para alcançar os objetivos acima, a presente invenção fornece uma variante da hialuronidase PH20 ou fragmento da mesma, que compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos na região correspondente a uma região de alfa hélice e/ou sua região ligante na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem, de preferência PH20 de tipo selvagem maduro, e na qual um ou mais dos resíduos de aminoácidos N-terminal ou C- terminal são seletivamente deletados.

[019] A presente invenção também fornece uma composição para o tratamento de câncer compreendendo a variante de PH20 hialuronidase descrita acima ou um fragmento da mesma, e um método para tratar o câncer usando o mesmo.

Breve Descrição das Figuras

[020] A FIG. 1 mostra o modelo de estrutura terciária da proteína de PH20. A estrutura terciária da proteína de PH20 foi modelada usando, como um modelo (Chao et al., 2007), Hyal1 (PDB ID: 2PE4) (Chao et.al., 2007) cuja estrutura cristalina da proteína foi encontrada, no servidor Swiss-Model (https://swissmodel.expasy.org/).

[021] A FIG. 1A mostra o modelo de estrutura terciária da proteína de PH20 e indica D146 e E148 que são aminoácidos catalíticos. O modelo de estrutura terciária da proteína de PH20 é composto por oito repetições de uma fita beta e uma alfa- hélice.

[022] A FIG. 1B mostra um alça eta(η) 8 no qual a alfa hélice 8 de PH20 e G340 a I344 que formam uma região ligante na região N- terminal da alfa hélice 8 estão localizadas. Cada um dos resíduos G340, T341, L342, S343 e I344 é mostrado.

[023] A FIG. 1C mostra resíduos de aminoácidos (C351, Y357 e N363) que interagem com a estrutura secundária adjacente, entre os aminoácidos localizados na alfa-hélice 8 de PH20. C351 forma uma ligação dissulfeto com C60 localizado na alfa-hélice 1, Y357 hidrofobicamente interage com F315 localizado entre a fita beta 7 e alfa-hélice 7, e N363 forma uma ligação de hidrogênio com um resíduo D69 localizado na alfa-hélice 1.

[024] A FIG. 2 compara os níveis de expressão de proteína de WT (tipo selvagem) e variantes construídas na presente invenção. WT e variantes foram expressos por transfecção transitória em células ExpiCHO. WT teve um nível de expressão de 16,1 mg/L. Os níveis de expressão de proteínas de variantes com base nas variantes HM1 e HM6 foram maiores do que os de WT, e os níveis de expressão de proteínas de HM4 e HM7 foram os mais elevados. O nível de expressão da proteína de HM11 obtido pela introdução de substituições de aminoácidos adicionais (Y365F e I367L) na variante HM6 diminuiu para 6,4 mg/mL.

[025] A FIG. 3 mostra resultados experimentais para as variantes HM1 e HM6.

[026] A FIG. 3A mostra os resultados de SDS-PAGE após purificação de WT e as variantes HM1 e HM6. A purificação foi realizada usando uma coluna HisTrap e uma coluna Q Sepharose. WT e as variantes HM1 e HM6 tinham um peso molecular de ~ 70 kDa (legenda da figura: M, marcador de peso molecular; CS, sobrenadante; FT, fluxo direto; e Eluição, frações de eluição).

[027] A FIG. 3B mostra os valores de atividade enzimática de WT e as variantes HM1 e HM6, medidas por ensaio turbidimétrico em pH 7,0. Na presente invenção, o valor da atividade enzimática medido pelo ensaio turbidimétrico foi expresso como atividade específica.

[028] A FIG. 3C mostra as atividades enzimáticas de WT e as variantes HM1 e HM6, medidas por ensaio substrato-gel. Após o SDS ter sido removido com 2,5% Triton X-100 (p/v) a 4ºC, uma reação enzimática foi realizada a 37ºC por 1 a 4 h. A variante HM6 renaturou mais rápido do que WT e a variante HM1 e, portanto, hidrolisou mais rapidamente o ácido hialurônico em gel de poliacrilamida. A faixa branca mostra o ácido hialurônico degradado pelo WT e a proteína variante.

[029] A FIG. 3D mostra as atividades enzimáticas de WT e a variante HM1, medidas por ensaio de substrato-gel em pH de 5 a

8. WT e a variante HM1 exibem atividade na faixa de pH de 5 a 8,

e mostram a maior atividade enzimática em pH 5,0. A variante HM1 possui o peptídeo sinal de albumina de soro humano ou Hyal1 humano. A faixa branca mostra o ácido hialurônico degradado pelo WT e a proteína variante.

[030] A FIG. 3E mostra os resultados da separação de WT e as variantes HM1 e HM6 por uma coluna fenil. As variantes foram eluídas mais rápido do que WT da coluna fenil.

[031] A FIG. 4 mostra os resultados da análise do produto final do ácido hialurônico, degradado por WT e a variante HM6, após 10 min e 1 h por meio de uma coluna Amida-80.

[032] A FIG. 5 mostra resultados experimentais para mutações de aminoácidos G340 para I344 de PH20.

[033] A FIG. 5A mostra os resultados de SDS-PAGE após purificação em coluna HisTrap para as variantes HM7, HM8, HM9, HM10 e HM21.

[034] A FIG. 5B mostra os resultados da medição das atividades enzimáticas de WT e variantes HM6, HM8, HM9, HM10, HM21 e HM7 por ensaio turbidimétrico a pH 7,0.

[035] A FIG. 5C mostra os resultados da medição das atividades enzimáticas de WT e variantes HM6, HM8, HM9, HM10, HM21 e HM7 por ensaio de substrato-gel. O gráfico de barras na parte inferior da FIG. 5C mostra o grau de atividade enzimática obtido pela quantificação da banda após a coloração do gel com azul Alcian. A faixa branca mostra o ácido hialurônico degradado pelo WT e a proteína variante.

[036] A FIG. 5D mostra os resultados da análise de WT e variantes HM8, HM9, HM10, HM21 e HM7 por cromatografia em coluna de fenil.

[037] A FIG. 5E mostra os resultados da separação de WT e variantes HM6, HM8, HM9, HM10, HM21 e HM7 dependendo de seus pontos isoelétricos no pH de 3 a 7 por meio de gel de IEF.

[038] A FIG. 6 mostra resultados experimentais para a variante HM11.

[039] A FIG. 6A mostra os resultados da purificação de proteínas por cromatografia em coluna HisTrap para a variante HM11.

[040] A FIG. 6B mostra os resultados da medição das atividades enzimáticas de WT e a variante HM11 em pH 7,0 por ensaio turbidimétrico.

[041] A FIG. 7 mostra resultados experimentais para variantes de PH20 truncadas no N-terminal HM40, HM13, HM41, HM24, HM42 e HM25.

[042] A FIG. 7A mostra os resultados da purificação de proteínas por cromatografia em coluna HisTrap para as variantes de PH20 HM40, HM13, HM41, HM24, HM42 e HM25.

[043] A FIG. 7B mostra os níveis de expressão das variantes de PH20 HM40, HM13, HM41, HM24, HM42, HM25, HP61 e HP62 em células ExpiCHO.

[044] A FIG. 7C mostra as atividades enzimáticas das variantes de PH20 HM40, HM13, HM41, HM24, HM42 HM25, HP61 e HP62 medidas em pH 7,0 por ensaio turbidimétrico e expressas como atividades específicas.

[045] A FIG. 7D mostra as atividades enzimáticas das variantes de PH20 HM40, HM13, HM41, HM24 e HM42, medidas por ensaio de substrato-gel. A faixa branca mostra o ácido hialurônico degradado pelo WT e a proteína variante.

[046] A FIG. 7E mostra os resultados da análise de WT e as variantes HM40, HM13, HM41, HM24 e HM42 por cromatografia em coluna de fenil.

[047] A FIG. 7F mostra a mudança no tamanho de partícula com o aumento da temperatura para as variantes HM40, HM13, HM41 e HM42 do PH20.

[048] A FIG. 8 mostra resultados experimentais para variantes HM14, HM15 e HM16 truncadas no C-terminal construídas usando HM6 como modelo.

[049] A FIG. 8A mostra os resultados de SDS-PAGE após purificação de HisTrap para as variantes HM14, HM15 e HM16. Como controles, WT e a variante HM6 foram incluídos.

[050] A FIG. 8B mostra os resultados da medição das atividades enzimáticas de WT e as variantes HM6, HM14, HM15 e HM16 em pH 7,0 por ensaio turbidimétrico.

[051] A FIG. 8C mostra os resultados da medição das atividades enzimáticas de WT e as variantes HM6, HM14, HM15 e HM16 por 1, 2 e 4 h por ensaio substrato-gel. O gráfico da direita da FIG. 8C é um gráfico de barras que mostra as atividades enzimáticas medidas após a coloração com azul Alcian após 1 h de reação enzimática. A faixa branca mostra o ácido hialurônico degradado pelo WT e a proteína variante.

[052] A FIG. 8D mostra os resultados da análise de WT e as variantes HM6, HM14, HM15 e HM16 por cromatografia em coluna de fenil.

[053] A FIG. 8E mostra os resultados da separação das variantes HM14, HM15 e HM16 dependendo de seus pontos isoelétricos no pH de 3 a 7 por gel de IEF.

[054] A FIG. 9 mostra resultados experimentais para variantes de PH20 HM19 e HM20 construídas usando HM10 como modelo.

[055] A FIG. 9A mostra os resultados da proteína purificada por cromatografia em coluna HisTrap para as variantes HM19 e HM20 de PH20.

[056] A FIG. 9B mostra os resultados da comparação das atividades enzimáticas da variante PH20 HM19 e HM20 em pH 7,0 por ensaio turbidimétrico.

[057] A FIG. 9C mostra os resultados da coloração do gel SDS com corante azul Alcian após 1 h de reação enzimática a 37ºC por ensaio de gel de substrato para WT e as variantes HM10, HM19 e HM20. A faixa branca mostra o ácido hialurônico degradado pelo WT e a proteína variante.

[058] A FIG. 10 mostra os resultados da medição das temperaturas de agregação de WT e as variantes de PH20 por sistema de espalhamento de luz dinâmico (doravante referido como DLS). As medições foram realizadas em triplicata e expressas como valores médios ± S.E.

[059] A FIG. 11 mostra um gráfico de Stern-Volmer obtido após medir a mudança na fluorescência de resíduos de triptofano de variantes WT e PH20 por adição de acrilamida (0 a 0,5 M). Entre os aminoácidos, o triptofano é excitado em 295 nm e emite fluorescência máxima em 340 nm. A acrilamida é uma pequena molécula que pode penetrar na estrutura de uma proteína e extinguir a emissão de fluorescência do triptofano. Como a estrutura da proteína é mais flexível, a extinção da fluorescência pela acrilamida é maior. F0 é o valor de fluorescência na ausência de acrilamida e F é o valor de fluorescência na presença de acrilamida (0 a 0,5 M). A mudança no valor de fluorescência medido foi expressa como a razão F0/F.

[060] A FIG. 11A é um gráfico de Stern-Volmer para WT e variantes HM1, HM4, HM6 e HM7.

[061] A FIG. 11B é um gráfico de Stern-Volmer para WT e variantes HM14, HM15 e HM16.

[062] A FIG. 12 mostra os níveis de expressão de variantes de PH20 baseadas em HM10 em células ExpiCHO.

[063] A FIG. 12A mostra graficamente os níveis de expressão das respectivas variantes.

[064] A FIG. 12B mostra os níveis de expressão das respectivas variantes na tabela. WT e as variantes de PH20 tinham um marcador 6xHis no C-terminal e os níveis de expressão da proteína após a purificação da coluna HisTrap foram expressos em mg/L. Variantes de HM30 a HM33 não foram expressas em células ExpiCHO.

[065] A FIG. 13 mostra os resultados de Western blot para culturas de células das variantes HM29, HM30, HM31, HM32 e HM33.

Os C-terminais das variantes baseadas em HM10 HM29, HM30, HM31, HM32 e HM33 foram clivados após A467, C464, D461, C358 ou C455, respectivamente. O HM29 clivado no C-terminal foi expresso em células ExpiCHO, mas as variantes com um C-terminal clivado em C464 ou menor em comprimento não foram expressas em células ExpiCHO. O anticorpo primário foi o anticorpo policlonal de coelho anti-PH20 (Abcam) diluído a 1: 500. O anticorpo secundário foi anti-IgG de coelho HRP de cabra diluído a 1:

2.000.

[066] A FIG. 14 mostra resultados experimentais para variantes truncadas no C-terminal construídas usando HM10 como um modelo.

[067] A FIG. 14A mostra os resultados da medição de atividades enzimáticas em pH 7,0 por ensaio turbidimétrico para variantes clivadas no C-terminal construídas usando HM10 como um modelo.

[068] A FIG. 14B compara atividades enzimáticas dependendo dos sítios de clivagem C-terminal de 17 variantes de PH20 (HM43, HM44, HM45, HM20, HM19, HM35, HM36, HM37, HM38, HM39, HM47, HM48, HM49, HM50, HM51, HM52 e HM10) construído usando HM10 como modelo.

[069] A FIG. 14C mostra os resultados da coloração de gel SDS com corante azul Alcian após 1 h de reação enzimática a 37ºC por ensaio de substrato-gel para algumas (HM29, HM35, HM36, HM37, HM38, HM39, HM43, HM44 e HM45) das variantes PH20 construídas usando HM10 como modelo. A faixa branca mostra o ácido hialurônico degradado pelo WT e a proteína variante.

[070] A FIG. 15 mostra o gel de SDS após a passagem por uma coluna final durante a purificação da proteína para o HP34 (FIG.

15A) e HP46 (FIG. 15B) expresso em células ExpiCHO. HP34 foi submetido a um procedimento de purificação por cromatografia de quatro etapas consistindo em colunas de Q Sepharose, Butil HP, Heparina e Blue Sepharose, e o gel SDS é um resultado obtido após cromatografia em coluna de Blue Sepharose. HP46 foi submetido a um procedimento de purificação por cromatografia de três etapas consistindo em colunas Q Sepharose, Butil HP e Heparina, e o gel SDS é um resultado obtido após cromatografia em coluna de heparina.

[071] A FIG. 16 mostra as atividades enzimáticas das variantes HP34 e HP46 sem tag 6xHis construídas usando HM21 como um modelo.

[072] A FIG. 16A mostra os resultados da medição das atividades enzimáticas de WT e as variantes HM21, HP34 e HP46 em pH 7,0 por ensaio turbidimétrico.

[073] A FIG. 16B mostra os resultados de medição das atividades enzimáticas de WT (HW2) e das variantes HM21, HP34 e HP46, a pH 5,3 por ensaio de Morgan-Elson (Km: Constante de Michaelis- Menten, kcat: número de rotatividade e kcat/Km: eficiência catalítica).

[074] A FIG. 17 mostra os resultados da caracterização de variantes PH20 baseadas em HM21.

[075] A FIG. 17A mostra os resultados da medição das temperaturas de agregação por DLS para as variantes de PH20 6xHis-livre de tag HP34 e HP46 construídas usando HM21 como um modelo. Como controles, as temperaturas de agregação de HW2 e HM21 são mostradas.

[076] A FIG. 17B mostra os resultados da medição de atividades enzimáticas por 1 h por ensaio de substrato-gel para HW2 e as variantes PH20 (HP20, HP34 e HP46).

[077] A FIG. 17C mostra os resultados da realização de um ensaio de substrato-gel após permitir que amostras variantes (HW2 e HP46) permaneçam em pH 3,0 e pH 7,0 por 14 h. Após SDS-PAGE, SDS foi removido com 2,5% Triton X-100 (w/v), e uma reação enzimática foi realizada a 37ºC por 1 h.

[078] A FIG. 17D mostra os níveis de expressão de variantes de PH20 HM21, HM53, HM54, HM55, HM56, HP59 e HP60 em células ExpiCHO.

[079] A FIG. 17E mostra a expressão do valor da atividade enzimática das variantes de PH20 HM21, HM53, HM54, HM55, HM56, HP59 e HP60, medido pelo ensaio turbidimétrico, como atividade específica em pH 5,3.

[080] A FIG. 18 mostra os resultados da medição do índice de estimulação de células T CD4+ em tratamento com PH20 e variante de PH20 em concentrações de 1,5 ng/mL e 15 ng/mL, respectivamente.

[081] A FIG. 19 mostra os resultados da medição do índice de estimulação de células T CD8+ em tratamento com PH20 e variante de PH20 em concentrações de 1,5 ng/mL e 15 ng/mL, respectivamente.

Melhor Modo de Realização da Invenção

[082] Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos científicos aqui utilizados possuem os mesmos significados que os comumente entendidos por um especialista na técnica aos quais a presente divulgação pertence. Geralmente, a nomenclatura aqui utilizada e os métodos experimentais, que serão descritos abaixo, são os bem conhecidos e comumente utilizados na técnica.

[083] A presente invenção fornece uma variante da hialuronidase PH20 ou fragmento do mesmo, que compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos na região correspondente a uma região de alfa hélice e/ou sua região ligante, de preferência uma região de alfa hélice 8 (S347 para C381) e/ou uma região ligante (A333 a R346) entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8, na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem, de preferência, PH20 de tipo selvagem maduro, e em que um ou mais dos resíduos de aminoácidos N-terminais ou C- terminais são seletivamente clivados e deletados.

[084] Na presente invenção, as posições de resíduos de aminoácidos em cada variante correspondem às posições de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem com a sequência de SEQ ID NO: 1.

[085] Além disso, na presente invenção, "PH20 de tipo selvagem maduro" significa uma proteína que consiste nos resíduos de aminoácidos L36 a S490 de SEQ ID NO: 1, que são desprovidos de M1 a T35, que formam um peptídeo sinal, e A491 a L509, que não estão relacionados com a função enzimática substancial de PH20, na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem com a sequência de SEQ ID NO: 1.

Tabela 1. Sequência de aminoácidos de tipo selvagem PH20 (SEQ ID NO: 1)

MGVLKFKHIFFRSFVKSSGVSQIVFTFLLIPCCLTLNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLG KFDEPLDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHL DKAKKDITFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSIELVQQQNVQLSLTEATE KAKQEFEKAGKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPGYNGSCFNVEIKRNDD LSWLWNESTALYPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSPLPVFAYTRIVFTD QVLKFLSQDELVYTFGETVALGASGIVIWGTLSIMRSMKSCLLLDNYMETILNPYIINVTLA AKMCSQVLCQEQGVCIRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLEDLEQFSEKFY CSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTLSATMFIV SILFLIISSVASL

[086] Especificamente, a variante PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, pode compreender uma ou mais mutações, de preferência substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T341A, T341C, T341G, S343E, M345T, K349E, L353A, L354I, N356E e I361T, mais preferencialmente selecionado do grupo que consiste em T341A, T341C, L354I e N356E em PH20 de tipo selvagem com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[087] Na presente invenção, o termo "variante de PH20" destina- se a incluir a mutação de um ou mais resíduos de aminoácidos, de preferência, a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem, bem como ocorrência de deleção de um ou mais resíduos de aminoácidos no N-terminal ou C-terminal em conjunto com a substituição dos resíduos de aminoácidos, e é usado substancialmente com o mesmo significado que a expressão "variante de PH20 ou fragmento do mesmo".

[088] Na presente invenção, a estrutura terciária da proteína de PH20 localizada fora do sítio ativo foi estudada através da modelagem da estrutura da proteína de PH20 humano com base em Hyal1 (SEQ ID NO: 2) que é uma hialuronidase humana cuja estrutura terciária da proteína é conhecida. Como resultado, os aminoácidos localizados na região alfa-hélice 8 de PH20 foram selecionados e substituídos pela sequência de aminoácidos da alfa-hélice 8 de Hyal1, tentando assim aumentar a estabilidade térmica da estrutura da proteína sem afetar a atividade catalítica de a enzima. Em particular, porque a alfa hélice 8 está localizada na porção externa da estrutura terciária da proteína de PH20, há menos interação com a alfa hélice adjacente ou fita beta do que as outras hélices alfa de PH20. De acordo com a presente invenção, verificou-se que quando a sequência de aminoácidos da região alfa-hélice 8 do PH20 humano e uma região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 é parcialmente substituída pela sequência de aminoácidos da região alfa-hélice 8 de Hyal1 altamente hidrofílica e uma região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 de Hyal1, a atividade enzimática em pH neutro e a temperatura de agregação de proteína (Tagg.) aumentam. Com base nestes resultados experimentais, verificou-se que uma nova variante de PH20 ou fragmento da mesma, que tem atividade enzimática e estabilidade térmica aumentadas em comparação com PH20 de tipo selvagem, pode ser fornecida.

[089] Assim, a variante PH20, de acordo com a presente invenção, compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em T341A, T341C, T341G, S343E, M345T, K349E, L353A, L354I, N356E e I361T, preferencialmente selecionados a partir de o grupo que consiste em T341A, T341C, L354I e N356E na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem (tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1), de preferência, PH20 de tipo selvagem maduro (tendo uma sequência que consiste nos resíduos de aminoácidos L36 a S490 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1).

[090] A variante PH20, de acordo com a presente invenção, também compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos na região correspondente a uma região de alfa hélice e/ou sua região ligante, de preferência, uma região de alfa hélice 8 (S347 a C381) e/ou a região ligante (A333 a R346) entre alfa- hélice 7 e alfa-hélice 8, mais preferencialmente, T341 a N363, T341 a I361, L342 a I361, S343 a I361, I344 a I361, M345 a I361, ou M345 a N363 em PH20 de tipo selvagem com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[091] Em particular, na variante PH20, de acordo com a presente invenção, a região alfa-hélice 8 (S347 a C381) e/ou a região ligante (A333 a R346) entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 de PH20 de tipo selvagem, de preferência, PH20 de tipo selvagem maduro pode ser substituído por um ou mais resíduos de aminoácidos da região correspondente (ver Tabelas 2 e 3) de Hyal1 tendo a sequência de SEQ ID NO: 2, mas não se limita a esta.

Tabela 2. Sequência de aminoácidos de Hyal1 de tipo selvagem (SEQ ID NO: 2)

MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANP GQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSG LAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGT LQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYM PAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGES AAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRR TSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSM

W Tabela 3. Comparação de alfa-hélices e sequência de aminoácidos entre PH20 e Hyal1 sequência de sequência de alfa-hélice aminoácidos de aminoácidos de PH20 Hyal1 alfa-hélice 1 P56~D65 N39~G48 alfa-hélice 3 S119~M135 S101~I117 alfa-hélice 4' K161~N176 K144~H159 alfa-hélice 4 S180-R211 P163~R194 alfa-hélice 5 F239~S256 P222~S239 alfa-hélice 6 A274~D293 K257~G277 alfa-hélice 7 S317~G332 P299~G314 alfa-hélice 8 S347~C381 T329~C363

[092] Mais especificamente, a nova variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, compreende preferencialmente uma substituição de resíduo de aminoácido de

L354I e/ou N356E na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem, de preferência, PH20 de tipo selvagem maduro, e compreende ainda pelo menos a substituição de resíduo de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas entre T341 a N363, particularmente uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T341, L342, S343, I344, M345, S347, M348, K349, L352, L353, D355, E359, I361 e N363, mas não está limitado aos mesmos.

[093] Mais preferencialmente, a substituição do resíduo de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T341, L342, S343, I344, M345, S347, M348, K349, L352, L353, D355, E359, I361 e N363 pode ser uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas a partir do grupo que consiste em T341A, T341C, T341D, T341G, T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, D355K, E351D, E351D, mas não se limita a estes.

[094] De preferência, a nova variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, pode compreender uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T, e pode ainda compreender uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T341A, T341C, T341D, T341G, T341S, L342W, S343E, I344N e N363G, mas não está limitado a estes.

[095] Mais preferencialmente, a nova variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, pode compreender qualquer substituição de resíduo de aminoácido selecionada a partir dos seguintes grupos de substituição de resíduo de aminoácido, mas não está limitada a estes: (a) T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (b) L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (c) M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, I361T e N363G; (d) T341G, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (e) T341A, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (f) T341C, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (g) T341D, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (h) I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; e (b) S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T.

[096] Na presente invenção, uma expressão descrita por um código de resíduo de aminoácido de uma letra juntamente com números, como "S347", significa o resíduo de aminoácido em cada posição na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

[097] Por exemplo, "S347" significa que o resíduo de aminoácido na posição 347 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é serina.

[098] Além disso, "S347T" significa que serina na posição 347 de SEQ ID NO: 1 é substituído por treonina.

[099] A variante de PH20, de acordo com a presente invenção, é interpretada como incluindo variantes ou fragmentos dos mesmos em que o resíduo de aminoácido na posição de resíduo de aminoácido específico é substituído de modo conservador.

[0100] Como usado aqui, o termo “substituição conservadora” se refere às modificações de uma variante de PH20 que envolve a substituição de um ou mais aminoácidos tendo propriedades bioquímicas que não resultam em perda de função biológica ou bioquímica da variante de PH20.

[0101] Uma "substituição conservadora de aminoácido" é aquela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de aminoácido com uma cadeia lateral semelhante. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais semelhantes foram definidas e são bem conhecidas na técnica à qual a presente invenção pertence. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina e histidina), aminoácidos com cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico e ácido glutâmico), aminoácidos com cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina e cisteína), aminoácidos com cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,

metionina e triptofano), aminoácidos com cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina e isoleucina) e aminoácidos com cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano e histidina).

[0102] Prevê-se que a variante de PH20 ou fragmentos da mesma da presente invenção podem ainda reter a atividade, embora tenha substituições conservadoras de aminoácidos.

[0103] Além disso, a variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, é interpretada como incluindo variantes de PH20 ou fragmentos das mesmas tendo substancialmente a mesma função e/ou efeito com aqueles/aquele da variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com o presente invenção, e tendo uma homologia de sequência de aminoácidos de pelo menos 80% ou 85%, preferencialmente, pelo menos 90%, mais preferencialmente, pelo menos 95%, mais preferencialmente, pelo menos 99% com a variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção.

[0104] As variantes de PH20, de acordo com a presente invenção, aumentaram os níveis de expressão e a taxa de redobramento da proteína, aumentando assim a alta estabilidade térmica, em comparação com o PH20 de tipo selvagem maduro. Além disso, a atividade enzimática das variantes de PH20 foi mais aumentada do que ou semelhante à de PH20 de tipo selvagem maduro, apesar de um aumento na estabilidade térmica.

[0105] Enquanto isso, mesmo se as variantes de PH20 de tipo selvagem maduro com a deleção C-terminal mostrassem a diminuição nas atividades enzimáticas, com base na presente invenção, as variantes C-terminal deletadas de PH20 mostravam atividades enzimáticas semelhantes ou aumentadas devido a mais redobramento rápido de proteínas e estabilidade térmica. Além disso, as variantes de PH20 na presente invenção mantiveram as atividades enzimáticas quando os aminoácidos N-terminais foram deletados em até cinco resíduos de aminoácidos. Isto indicou que para a expressão da proteína e atividades enzimáticas P41 do N-terminal era importante.

[0106] Por conseguinte, a variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, é caracterizada por compreender uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos na região de alfa hélice 8 (S347 a C381) e/ou na região ligante (A333 a R346) entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem, e um ou mais dos resíduos de aminoácidos N-terminal e/ou C-terminal são adicionalmente deletados, mas não estão limitados aos mesmos.

[0107] Em um aspecto, a variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, pode ser aquele em que a clivagem ocorre antes de um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em M1 a P42 da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, de preferência, antes de um resíduo de aminoácido L36, N37, F38, R39, A40, P41 ou P42 no N-terminal, de modo que um ou mais resíduos de aminoácido no N-terminal sejam deletados e/ou a clivagem ocorre após um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em V455 a L509, de preferência, após um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em V455 a S490, mais preferencialmente, após um resíduo de aminoácido V455, C458, D461, C464, I465, D466, A467 , F468, K470, P471,

P472, M473, E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486, T488 ou S490 no C-terminal, de modo que um ou mais resíduos de aminoácidos no C-terminal são deletados.

[0108] A expressão "a clivagem ocorre antes de um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em M1 a P42 no N- terminal" significa que um resíduo de aminoácido imediatamente antes de um resíduo de aminoácido selecionado entre M1 a P42 no N-terminal ser clivado e excluído.

[0109] Por exemplo, a expressão "a clivagem ocorre antes de um resíduo de aminoácido L36, N37, F38, R39, A40, P41 ou P42", respectivamente, significa que todos os resíduos de aminoácidos de M1 a T35 imediatamente antes de L36, todos os resíduos de aminoácidos de M1 a L36 imediatamente antes de N37, todos os resíduos de aminoácidos de M1 a N37 imediatamente antes de F38, todos os resíduos de aminoácidos de M1 a F38 imediatamente antes de R39, todos os resíduos de aminoácidos de M1 a R39 imediatamente antes de A40, todos os resíduos de aminoácidos de M1 a A40 imediatamente antes de P41, ou todos os resíduos de aminoácidos de M1 a P41 imediatamente antes de P42 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é clivado e removido, respectivamente.

[0110] Além disso, a expressão "a clivagem ocorre após um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em V455 a L509 no C-terminal" significa que um resíduo de aminoácido imediatamente após um resíduo de aminoácido selecionado entre V455 a L509 no C-terminal ser clivado e deletado.

[0111] Por exemplo, a expressão "a clivagem ocorre após um resíduo de aminoácido V455, C458, D461, C464, I465, D466, A467, F468, K470, P471, P472, M473, E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486, T488 ou S490 no C-terminal "significa que um resíduo de aminoácido após o resíduo de aminoácido V455, C458, D461, C464, I465, D466, A467, F468, K470, P471, P472, M473, E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486, T488 ou S490 na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ser clivado e removido.

[0112] De preferência, a nova variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, pode ser selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 60 a 115, mas não se limita a estas.

[0113] Mais preferencialmente, a nova variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, pode ter a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99. A nova variante de PH20 ou fragmento da mesma tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99 pode compreender 15 substituições de aminoácidos de T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T, e deleção antes de F38 no N-terminal, e após F468 no C-terminal.

[0114] As sequências dos aminoácidos substituídos ou clivados nas variantes de PH20 construídas na modalidade específica, de acordo com a presente invenção, são mostradas na Tabela 11.

[0115] Um estudo focado no aumento da atividade enzimática e estabilidade térmica de PH20 pela substituição de aminoácidos de uma alfa-hélice e sua região ligante, que são estruturas secundárias que formam a estrutura terciária da proteína,

conforme divulgado na presente invenção, não foi relatado anteriormente. Estudos anteriores relataram que a atividade enzimática de PH20 de tipo selvagem muda dependendo das posições de clivagem dos resíduos de aminoácidos localizados na região C- terminal. No entanto, na presente invenção, uma alfa-hélice específica formando a estrutura secundária de PH20 foi substituída pela alfa-hélice de outra hialuronidase humana, construindo assim variantes de PH20 com maior estabilidade do que o PH20 de tipo selvagem. Estas variantes podem ser variantes em que a interação do domínio de alfa hélice substituído com porções que formam outras estruturas secundárias de PH20 mostra um padrão diferente daquele de PH20 de tipo selvagem, indicando que as variantes têm atividade enzimática consistente, independentemente da posição de clivagem em C-terminal.

[0116] Em modalidade específica, a nova variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, que tem atividade enzimática aumentada e estabilidade térmica em comparação com PH20 de tipo selvagem maduro, pode ser uma que compreende uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T341A, T341C, T341G, S343E, M345T, K349E, L353A, L354I, N356E e I361T, e em que um ou mais aminoácidos localizados em uma região de alfa-hélice 8 (S347 a C381) e/ou a região ligante (A333 a R346) entre alfa- hélice 7 e alfa-hélice 8 na sequência de aminoácidos de PH20 de tipo selvagem, de preferência, PH20 de tipo selvagem maduro, são substituídas por outros aminoácidos.

[0117] Especificamente, a substituição de aminoácidos na região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 compreende a substituição de um ou mais resíduos de aminoácidos na região que consiste nos resíduos de aminoácidos T341 a N363, T341 a I361, L342 a I361, L342 a I361, S343 a I361, I344 a I361, M345 a I361 ou M345 a N363.

[0118] A fim de examinar o efeito do truncamento em C-terminal em variantes PH20 em que alfa-hélice 8 e uma região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 são substituídas, três variantes de PH20 (HM6, HM10 e HM21) foram selecionados como modelos.

[0119] HM6 é uma variante na qual os aminoácidos na região M345 a N363 são substituídos pela sequência de aminoácidos de Hyal1 (M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T em SEQ ID NO: 1 são substituídos). Além disso, HM6 é uma variante em que a substituição de alfa-hélice 8 e uma região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 é a variante menos substituída entre as variantes de PH20, de acordo com a presente invenção, que não compreendem clivagem adicional de C- terminal (isto é, uma forma em que o resíduo de aminoácido do C- terminal é S490, como o PH20 de tipo selvagem maduro).

[0120] HM10 é uma variante em que os aminoácidos da região L342 a I361 são substituídos com a sequência de aminoácidos de Hyal1 (L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T em SEQ ID NO: 1 são substituídos), e que tem a estabilidade térmica mais elevada, embora tenha uma atividade enzimática semelhante à de PH20 de tipo selvagem maduro entre as variantes de PH20, de acordo com a presente invenção, que não compreendem truncamento C-terminal adicional.

[0121] HM21 é uma variante em que os aminoácidos na região T341 a I361 são substituídos com a sequência de aminoácidos de Hyal1 (T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T em SEQ ID NO: 1 são substituídos), e que tem uma atividade enzimática que é cerca de duas vezes mais alta do que PH20 do tipo selvagem em pH 7,0 entre as variantes de PH20, de acordo com a presente invenção, que não compreendem truncamento C-terminal adicional.

[0122] As variantes de PH20 baseadas em HM6 construídas na presente invenção têm o N-terminal começando em L36 e o C- terminal terminando em I465, F468 ou P471 como mostrado na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4. Variantes de PH20 truncadas de aminoácido C-terminal construídas usando HM6 como um modelo Variante Comprimento Substituído Número de Número de total região aminoácidos aminoácidos substituídos truncados HM6 36~490 11 0 HM14 36~465 11 25 M345~I361 HM15 36~468 11 22 HM16 36~471 11 19

[0123] As variantes de PH20 à base de HM10 comumente têm o N- terminal clivado antes do resíduo F38 e o C-terminal clivado após o V455, C458, D461, C464, I465, D466, A467, F468, K470,

P472, M473, Resíduo E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486 ou T488 como mostrado na Tabela 5 abaixo.

Tabela 5 Variantes de PH20 truncadas de aminoácido C-terminal construídas usando HM10 como um modelo Variante Comprimento Substituído Número de Número de total região aminoácidos aminoácidos substituídos truncados HM10 36~490 14 0 HM52 38~488 14 4 HM51 38~486 14 6 HM50 38~484 14 8 HM49 38~482 14 10 HM48 38~480 L342~I361 14 12 HM47 38~478 14 14 HM39 38~476 14 16 HM38 38~475 14 17 HM37 38~474 14 18 HM36 38~473 14 19

HM35 38~472 14 20 HM19 38~470 14 22 HM20 38~468 14 24 HM45 38~467 14 25 HM29 36~467 14 23 HM44 38~466 14 26 HM43 38~465 14 27 HM30 36~464 14 26 HM31 36~461 14 29 HM32 36~458 14 32 HM33 36~455 14 35 HP19 38~470 14 22 HP20 38~468 14 24

[0124] Como mostrado nos exemplos de variantes que compreendem substituições de aminoácidos na região L342 a I361 correspondendo à região da alfa hélice 8 e a região ligante entre a alfa hélice 7 e a alfa hélice 8 de HM10 como um modelo e em que o N-terminal foi clivado antes do resíduo F38 e o C- terminal foi clivado em I465, D466, A467, F468, K470, P472,

M473, E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486 ou T488, as variantes de PH20, de acordo com a presente invenção, exibiram uma atividade enzimática semelhante à de PH20 de tipo selvagem maduro, independentemente da posição de clivagem C-terminal.

[0125] Como mostrado na Tabela 6 abaixo, duas variantes de PH20 baseadas em HM21 geralmente têm o N-terminal clivado antes do resíduo F38 e o C-terminal clivado após o resíduo F468 ou K470.

Tabela 6. Variantes de PH20 truncadas de aminoácido C-terminal construídas usando HM21 como um modelo Variante Comprimento Substituído Número de Número de total aminoácidos região aminoácidos truncados substituídos HM21 38~490 15 2 T341~I361 HP34 38~470 15 22 HP46 38~468 15 24

[0126] As variantes foram construídas usando, como um modelo, HM21 tendo uma atividade enzimática que é cerca de duas vezes maior do que a de PH20 de tipo selvagem maduro. Estas variantes são aquelas que compreendem substituições de aminoácidos na região T341 a I361 correspondendo à região alfa-hélice 8 e a região ligante entre alfa hélice 7 e alfa-hélice 8 e em que o N- terminal foi clivado antes do resíduo F38 e o C-terminal foi clivado após F468 ou K470. Surpreendentemente, essas variantes mantiveram a alta atividade enzimática de HM21, independentemente da posição de clivagem C-terminal.

[0127] No estudo conduzido por Frost et al., quando o comprimento de PH20 é menor devido à clivagem antes da posição do aminoácido de 477, a atividade enzimática diminuiu para cerca de 10% de uma variante com um C-terminal clivado após a posição 477 (Frost, 2007). No entanto, na presente invenção, quando um ou mais aminoácidos na alfa-hélice 8 de PH20 e sua região ligante foram substituídos, a atividade enzimática foi mantida devido ao aumento na estabilidade da proteína, independentemente da posição de clivagem do C-terminal. Este resultado é muito significativo porque resolve o problema de que a atividade enzimática de PH20 de tipo selvagem é reduzida devido ao truncamento C-terminal de PH20 de tipo selvagem.

[0128] Além disso, na presente invenção, o efeito dos aminoácidos N-terminais de PH20, que não era conhecido anteriormente, foi estudado.

[0129] A fim de examinar os efeitos dos sítios de clivagem N- terminal em variantes de HM6 em que um ou mais resíduos de aminoácidos na região (M345 a I361) correspondendo à região de alfa hélice 8 de PH20 de tipo selvagem e o ligante região entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 (substituída com M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D ou I361T em SEQ ID NO: 1 e não compreendendo clivagem C-terminal adicional) foram substituídos por resíduos de aminoácidos da região alfa-hélice 8 correspondentes de Hyal1 e a região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8, variantes, em que os resíduos de aminoácidos L36 a V47 na SEQ ID NO: 1 foram substituídos por FRGPLLPNR ou resíduos de aminoácidos L36 a A52 na SEQ ID NO: 1 foram substituídos por FRGPLLPNRPFTTV, foram construídos usando HM6 como um modelo. Além disso, usando HM6 como um modelo, as variantes HM40, HM13, HM41, HM24, HM42 e HM25 foram construídas em que o N-terminal na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 foi clivado antes do resíduo N37, F38, R39, A40, P41 ou P42 (ver Tabela 7).

Tabela 7. Variantes clivadas de aminoácidos N-terminal com base em HM6 Variante Comprimento Região Número de Número de total substituída aminoácidos aminoácidos substituídos truncados HM6 36~490 11 0 HM40 37~490 11 1 HM13 38~490 11 2 HM41 39~490 M345~I361 11 3 HM24 40~490 11 4 HM42 41~490 11 5 HM25 42~490 11 6

HM17 L36~V47, 23 M345~I361 HM18 L36~A52, 28 M345~I361

[0130] Como resultado, foi mostrado que quando o N-terminal de HM6 foi clivado antes do resíduo N37, F38, R39, A40 ou P41, a atividade enzimática não foi muito influenciada; no entanto, quando o N-terminal foi clivado antes do resíduo P42, a atividade enzimática diminuiu significativamente, indicando que a região N-terminal de PH20, localizada após P41, é importante para a expressão da proteína e atividade enzimática. Além disso, quando um ou mais aminoácidos na região N-terminal de L36 a V47 ou L36 a A52 de HM6 foram substituídos pelos aminoácidos de Hyal1, a proteína variante não foi expressa em células ExpiCHO, indicando que a região N-terminal é importante para a expressão de proteínas.

[0131] Além disso, na presente invenção, foi tentado aumentar a expressão de uma proteína PH20 recombinante em células animais usando o peptídeo sinal de outras proteínas, em vez de usar o peptídeo sinal original de PH20.

[0132] Portanto, em outro aspecto, a nova variante de PH20, de acordo com a presente invenção, pode ser uma em que o N-terminal compreende ainda um peptídeo sinal de hormônio de crescimento humano tendo uma sequência de aminoácidos MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA da SEQ ID NO: 3, um peptídeo sinal de albumina sérica humana possuindo uma sequência de aminoácidos MKWVTFISLLFLFSSAYS da SEQ ID NO: 4, ou um peptídeo sinal de

Hyal1 humano tendo uma sequência de aminoácidos MAAHLLPICALFLTLLDMAQG da SEQ ID NO: 5 como mostrado na Tabela 8 abaixo, em vez do peptídeo sinal de PH20 de tipo selvagem, que consiste em M1 a T35, mas não está limitado a estes.

[0133] A expressão "em vez do peptídeo sinal de PH20 de tipo selvagem, que consiste em M1 a T35" significa um caso em que o peptídeo sinal de PH20 de tipo selvagem é parcial ou completamente deletado; portanto, não executa sua função. Além disso, a expressão pretende incluir um caso em que uma porção do N-terminal é ainda deletada, por exemplo, um caso em que a clivagem ocorre antes do resíduo N37, F38, R39, A40, P41 ou P42 ocorre de modo que uma deleção adicional do N-terminal juntamente com a deleção do peptídeo sinal de PH20 de tipo selvagem ocorre.

Tabela 8. Sequências de aminoácidos de peptídeo sinal de hormônio de crescimento humano, albumina sérica humana ou Hyal1 humano Sequência de aminoácidos SEQ NO.

hormônio de MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA 3 crescimento humano albumina sérica MKWVTFISLLFLFSSAYS 4 humana Hyal1 humano MAAHLLPICALFLTLLDMAQG 5

[0134] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição para o tratamento do câncer que compreende a nova variante de PH20, de acordo com a presente invenção, e um método para o tratamento do câncer usando a mesma.

[0135] Cânceres ou carcinomas que podem ser tratados pela nova variante de PH20, de acordo com a presente invenção, não são limitados particularmente, mas incluem ambos os cânceres sólidos e cânceres do sangue. O câncer incluem pode ser selecionado a partir do grupo que consiste em câncer de fígado, carcinoma hepatocelular, câncer gástrico, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer brônquico, câncer nasofaríngeo, câncer de laringe, câncer de pâncreas, câncer de bexiga, câncer colorretal , câncer de cólon, câncer de cérvice uterino, câncer cerebral, câncer de próstata, câncer ósseo, câncer de tireoide, câncer de paratireoide, câncer esofágico, câncer do trato biliar, câncer de testículo, câncer retal, câncer de cabeça e pescoço, câncer ureteral, osteossarcoma, neurocitoma, fibrossarcoma, rabdomiossarcoma, astrocitoma, neuroblastoma e glioma, mas não estão limitados a esses. De preferência, os cânceres que podem ser tratados de acordo com a presente invenção são selecionados do grupo que consiste em câncer colorretal, câncer de mama, câncer de pulmão e câncer de rim, mas não está limitado a estes.

[0136] A composição da presente invenção pode ser uma composição farmacêutica. A composição farmacêutica pode ainda compreender um componente farmaceuticamente aceitável. O componente que é tipicamente usado na formulação de drogas pode ser um ou mais selecionados do grupo que consiste em, mas não se limitando a, lactose, dextrose, sacarose, sorbitol, manitol, amido, goma de acácia, fosfato de cálcio, alginato, gelatina, silicato de cálcio, celulose microcristalina, polivinilpirrolidona, celulose, água, xaropes, metilcelulose, metil-hidroxibenzoato, propil-hidroxibenzoato, talco, estearato de magnésio e óleo mineral. Além disso, a composição farmacêutica pode ainda compreender um ou mais selecionados do grupo que consiste em diluentes, excipientes, lubrificantes, agentes umectantes, adoçantes, aromáticos, emulsificantes, suspensões e conservantes.

[0137] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por via oral ou por via parenteral. A administração parenteral é realizada por injeção intravenosa, injeção subcutânea, injeção intramuscular, injeção intraperitoneal, administração endotelial, administração tópica, administração intranasal, administração intrapulmonar, administração retal e semelhantes. Para a administração oral, o ingrediente ativo na composição precisa ser formulado em uma forma de dosagem revestida ou em uma forma de dosagem que pode proteger o ingrediente ativo de ser desintegrado no estômago, considerando que os peptídeos e proteínas são digeridos no estômago. Alternativamente, a presente composição pode ser administrada através de qualquer dispositivo pelo qual o ingrediente ativo pode se mover para a célula alvo de interesse.

[0138] A composição farmacêutica pode ser formulada na forma de soluções, suspensões, xaropes ou emulsões em óleos ou meios aquosos, ou na forma de extratos, grãos, supositórios, pós, grânulos, comprimidos ou cápsulas, e pode incluir adicionalmente dispersantes ou agentes estabilizadores para fins de formulação.

[0139] Em particular, a composição para o tratamento do câncer, de acordo com a presente invenção, pode ser usada para o tratamento combinado com outras drogas anticancerígenas.

[0140] Uma droga anticancerígena que pode ser usada para tratamento combinado com a nova variante de PH20, de acordo com a presente invenção, é de preferência uma droga anticancerígena química, uma droga anticancerígena à base de anticorpo, uma droga anticancerígena biológica, um RNAi ou um agente terapêutico celular, mas não se limita a estas.

[0141] De preferência, a droga anticancerígena que pode ser usada para tratamento combinado com a nova variante de PH20, de acordo com a presente invenção, é de preferência um agente imuno- oncológico, mais preferencialmente, um inibidor de ponto de verificação imunológico, mas não está limitado a estasele.

[0142] Em outro aspecto, a presente divulgação é direcionada a um ácido nucleico que codifica a variante de PH20 ou um fragmento da mesma.

[0143] Os ácidos nucleicos, tal como aqui utilizados, podem estar presentes nas células, no lisado celular ou na forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. "Isolado" ou "substancialmente puro", quando se refere a ácidos nucleicos, se refere àqueles que foram purificados de outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, Bandas de CsCl, cromatografia em coluna, eletroforese em gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Os ácidos nucleicos da presente invenção podem ser DNA ou RNA.

[0144] Em ainda outro aspecto, a presente invenção se refere é direcionada a um vetor de expressão recombinante compreendendo o ácido nucleico. Para a expressão da variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção, um DNA que codifica a variante de PH20 pode ser obtido por técnicas de biologia molecular padrão (por exemplo, amplificação por PCR ou clonagem de cDNA usando um hibridoma que expressa a variante de PH20), e o DNA pode ser inserido em um vetor de expressão de modo que seja "operacionalmente ligado" a sequências de controle transcricional e translacional.

[0145] Tal como aqui utilizado, o termo "operativamente ligado" pretende significar que um gene que codifica a variante de PH20 ou fragmento do mesmo é ligado a um vetor de modo que as sequências de controle da transcrição e tradução cumpram a função pretendida de regular a transcrição e tradução do gene que codifica a variante de PH20 ou fragmento do mesmo. O vetor de expressão e as sequências de controle de expressão são escolhidos com a célula hospedeira de expressão. Os genes que codificam o PH20 são inseridos no vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de enzima de restrição complementar em um fragmento do gene que codifica a variante de PH20 ou fragmento do mesmo e vetor, ou ligação de ponta cega se nenhum sítio de enzima de restrição estiver presente)

[0146] Além disso, os vetores de expressão recombinantes possuem sequências regulatórias que controlam a expressão de um gene que codifica a variante de PH20 nas células hospedeiras. O termo

“sequência regulatória” pretende incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou tradução dos genes que codificam a variante de PH20 ou fragmento da mesma. Será apreciado por aqueles especialista na técnica que o projeto do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, pode depender de fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc.

[0147] Em ainda outro aspecto, a presente invenção é direcionada a uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico ou o vetor. A célula hospedeira, de acordo com a presente invenção, é preferencialmente selecionada do grupo que consiste em células animais, células vegetais, leveduras, E. coli e células de insetos, mas não está limitada a estas.

[0148] Especificamente, a célula hospedeira, de acordo com a presente invenção inclui células procarióticas como, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces sp., Pseudomonas sp., Proteus mirabilis ou Staphylococcus sp., fungos como Aspergillus sp., leveduras como Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces sp. E Neurospora crassa, e células eucarióticas como células eucarióticas inferiores, e outras células eucarióticas superiores como as células de insetos.

[0149] Além disso, as células hospedeiras que podem ser utilizadas na presente invenção podem ser derivadas de plantas ou mamíferos. Preferencialmente, exemplos das células hospedeiras incluem, entre outras, células de rim de macaco (COS7), células NSO, SP2/0, células de ovário de hamster chinês

(CHO), W138, células de rim de hamster bebê (BHK), MDCK, células de mieloma, células HuT 78 e células HEK293. Mais preferencialmente, podem ser utilizadas células CHO.

[0150] O ácido nucleico ou o vetor é transfectado para uma célula hospedeira. Transfecção pode ser realizada usando várias técnicas que são geralmente usadas para introduzir ácidos nucleicos estranhos (DNA ou RNA) em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas, por exemplo, eletroforese, precipitação com fosfato de cálcio, transfecção com DEAE- dextrano ou lipofecção. A fim de expressar a variante de PH20 ou fragmento da mesma da presente invenção, várias combinações de vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras podem ser empregadas. O vetor de expressão preferencial para células eucarióticas compreende sequências regulatórias de expressão gênica derivadas de, mas não limitadas a, SV40, papilomavírus bovino, adenovírus, vírus adeno-associado, citomegalovírus e retrovírus. O vetor de expressão, que pode ser usado para hospedeiros bacterianos compreende plasmídeos bacterianos como pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC vector, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 e os derivados dos mesmos, obtidos a partir de E. coli; um plasmídeo tendo amplo espectro de hospedeiro, como, RP4; fagos de DNAs exemplificados por vários derivados de lambda de fago, como, λgt10, λgt11 e NM989; e outros fagos de DNA, como, M13 e fago de DNA de fita simples filamentoso. O vetor de expressão disponível para células de levedura pode ser um plasmídeo de 2 µm e seus derivados. O vetor de expressão útil para células de inseto inclui pVL941.

[0151] Em um outro aspecto, a presente invenção é direcionada a um método para a produção de uma variante de PH20 ou fragmento da mesma, o método compreendendo uma etapa de cultura da célula hospedeira e expressão da variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a presente invenção.

[0152] Quando um vetor de expressão recombinante capaz de expressar a variante de PH20 ou fragmento do mesmo é introduzido em células hospedeiras de mamíferos, a variante de PH20 ou fragmento do mesmo pode ser produzida cultivando as células hospedeiras por um período de tempo tal que a variante de PH20 ou fragmento da mesma seja expresso nas células hospedeiras, de preferência, um período de tempo tal que a variante de PH20 seja secretada para o meio durante a cultura das células hospedeiras.

[0153] Em alguns casos, a variante de PH20 expressa pode ser isolada e purificada a partir das células hospedeiras. O isolamento ou purificação da variante de PH20 pode ser realizado por métodos convencionais de isolamento/purificação (por exemplo, cromatografia) que são usados para proteínas. A cromatografia pode incluir uma ou mais combinações selecionadas de cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica e cromatografia hidrofóbica, mas não está limitada a estas. Além da cromatografia, uma combinação de filtração, ultrafiltração, salting out, diálise e semelhantes pode ser usada para isolar e purificar o anticorpo.

EXEMPLOS

[0154] A seguir, a presente invenção será descrita em maiores detalhes com referência aos exemplos. Será óbvio para um especialista na técnica que estes exemplos são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretados para limitar ou alterar o escopo da presente invenção.

Exemplo 1. Construção de variantes PH20

[0155] Para a construção de variantes do PH20, o cDNA (ID do clone: hMU002604) de PH20 de tipo selvagem foi adquirido do Korean Human Gene Bank. O PH20 de tipo selvagem codifica os aminoácidos de L36 a S490. O gene PH20 foi amplificado pela reação em cadeia da polimerase (doravante referida como PCR) e inserido nos sítios das enzimas de restrição XhoI e NotI de um vetor pcDNA3.4-TOPO. Para a expressão em células ExpiCHO, o peptídeo sinal do hormônio do crescimento humano, hormônio do soro humano ou Hyal1 humano foi usado como um peptídeo sinal em vez do peptídeo sinal original de PH20. Para a purificação de proteínas usando uma coluna HisTrap, a sequência de DNA de uma tag 6xHis foi localizada na extremidade 3’ do cDNA de PH20. A substituição de aminoácidos de variantes de PH20 foi realizada usando o método de PCR, e a substituição de aminoácidos foi confirmada por sequenciamento de DNA.

[0156] A lista de iniciadores usados na clonagem das variantes de PH20 está resumida na Tabela 9 abaixo, e as sequências específicas dos iniciadores estão resumidas na Tabela 10 abaixo.

Tabela 9 Lista de iniciadores usados na clonagem de variantes de PH20 Iniciador Clone 1 2 3 cB4202 ALB-SP-Xho ALB-PH20-MR SPAM1-6H-Not cB4203-HM1 ALB-SP-Xho PH20_M345-364-F SPAM1-6H-not cB4203-HM2 ALB-SP-Xho PH20_Y365-L380-F SPAM1-7H-not cB4203-HM3 ALB-SP-Xho PH20_M345-L380-F SPAM1-8H-not cB4203-HM4 ALB-SP-Xho B4203-HM4-F SPAM1-9H-not cB4203-HM5 ALB-SP-Xho B4203-HM5-F SPAM1-10H-not cB4203-HM6 ALB-SP-Xho PH20-G363N SPAM1-6H-not cB4203-HM7 ALB-SP-Xho PH20-G363N SPAM1-12H-not cB4203-HM8 ALB-SP-Xho cB4203-HM8-M SPAM1-13H-not cB4203-HM9 ALB-SP-Xho cB4203-HM9-M SPAM1-14H-not cB4203-HM10 ALB-SP-Xho cB4203-HM10-M SPAM1-6H-Not cB4203-HM11 ALB-SP-Xho 4203-HM11 SPAM1-16H-not cB4203-HM12 ALB-SP-Xho 4203-HM12 SPAM1-17H-not cB4203-HM13 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R SPAM1-18H-not cB4203-HM14 ALB-SP-Xho - I465-6H-not cB4203-HM15 ALB-SP-Xho - F468-6H-not cB4203-HM16 ALB-SP-Xho - P471-6H-not cB4203-HM17 ALB-SP-Xho PH20-HM17 SPAM1-22H-not cB4203-HM18 ALB-SP-Xho PH20-HM18 SPAM1-23H-not cB4203-HM19 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R K470-6H-not cB4003-HP19 ALB-SP-Xho K470-not cB4203-HM20 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R F468-6H-not cB4003-HP20 ALB-SP-Xho F468-not cB4203-HM21 ALB-SP-Xho M21-mega-F SPAM1-6H-Not cB4203-HM24 ALB-SP-Xho M24-R SPAM1-6H-not cB4203-HM25 ALB-SP-Xho M25-R SPAM1-6H-not cB4203-HM26 ALB-SP-Xho B4-HM26 SPAM1-6H-not cB4203-HM27 ALB-SP-Xho B4-HM27 SPAM1-6H-not cB4203-HM28 ALB-SP-Xho B4-HM28 SPAM1-6H-not cB4203-HM29 ALB-SP-Xho B4-HM29 cB4203-HM30 ALB-SP-Xho B4-HM30 cB4203-HM31 ALB-SP-Xho B4-HM31 cB4203-HM32 ALB-SP-Xho B4-HM32 cB4203-HM33 ALB-SP-Xho B4-m33 cB4003-HP34 ALB-SP-Xho M21-mega-F K470-not cB4203-HM35 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R P472-6H-not cB4003-HP35 ALB-SP-Xho P472-not cB4203-HM36 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R M473-6H-not cB4003-HP36 ALB-SP-Xho M473-not cB4203-HM37 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R E474-6H-not cB4003-HP37 ALB-SP-Xho E474-not cB4203-HM38 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R T475-6H-not cB4003-HP38 ALB-SP-Xho T475-not cB4203-HM39 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R E476-6H-not cB4003-HP39 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R E476-not cB4203-HM40 ALB-SP-Xho M40-mega SPAM1-6H-Not cB4203-HM41 ALB-SP-Xho M41-mega SPAM1-6H-Not cB4203-HM42 ALB-SP-Xho m42-mega SPAM1-6H-not cB4203-HM43 ALB-SP-Xho I465-6H-not cB4203-HM44 ALB-SP-Xho D466-6H-not cB4203-HM45 ALB-SP-Xho B4-HM29 cB4003-HP46 ALB-SP-Xho F468-Not cB4203-HM47 ALB-SP-Xho P478-H-Not cB4203-HM48 ALB-SP-Xho I480-H-Not cB4203-HM49 ALB-SP-Xho Y482-H-Not cB4203-HM50 ALB-SP-Xho A484-H-not cB4203-HM51 ALB-SP-Xho P486-H-not cB4203-HM52 ALB-SP-Xho SASP-LN-del-R T488-H-not Tabela 10 Sequências de iniciador usadas na clonagem de variantes de PH20

SEQ Iniciador Sequências de nucleotídeos (5'-> 3') NO.

GAA TAT CTC GAG GCC ACC ATG AAG TGG GTT ALB-SP-Xho 6

ACA

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG SPAM1-6H-Not 7

TGA TGA TGG AAG AAA CCA ATT CTG C

TAA CAG GAG GTG CTC TGA AAT TCA GAG AGT ALB-PH20-MR 8

AAG CAG AGG AG

ATG GGG AAC CCT CAG TAT AAC AAG AAC CAA PH20_M345- GGA ATC ATG TCA GGC CAT CAA GGA GTA TAT 9 P364-F GGA CAC TAC ACT GGG GCC CTA CAT AAT CAA

CGT CAC AC

ATG GAG ACT ATA CTG AAT CCT TTC ATC CTG PH20_Y365- 10 AAC GTG ACC AGT GGG GCC CTT CTC TGC AGT L380-F

CAA GCC CTG TGC CAG GAG CAA GGA GTG TG

ATG GAC ACT ACA CTG GGG CCC TTC ATC CTG PH20_M345- 11 AAC GTG ACC AGT GGG GCC CTT CTC TGC AGT L380-F*

CAA GCC CTG TGC CAG GAG CAA GGA GTG TG

ACT GTT GCT CTG GGT GCT TCT GGA ATT GTA B4203-HM4-F 12 ATA TGG GTA AGC TGG GAA AAT ACA AGA ACC

AAG GAA TCA TGT CA

AGC AAG GAG TGT GTA TAA GGA AAA CCA GCC B4203-HM5-F 13 ACC CAA AAG ACT ATC TTC ACC TCA ACC CAG

A

AGT ATA TGG ACA CTA CAC TGA ACC CCT ACA PH20-G363N 14

TAA TCA ACG TCA C

ATT GTA ATA TGG GGA ACC CTC AGT AAT ACA cB4203-HM8-M 15

AGA ACC AAG GAA TC

ATT GTA ATA TGG GGA ACC CTC GAA AAT ACA cB4203-HM9-M 16

AGA ACC AAG GAA TC cB4203- HM10- ATT GTA ATA TGG GGA ACC TGG GAA AAT ACA 17

M AGA ACC AAG GAA TC

ACA CTA CAC TGA ACC CCT TCA TAC TCA ACG 4203-HM11 18

TCA CCC TAG CAG CCA

ACA CTA CAC TGA ACC CCT TCA TAC TCA ACG 4203-HM12 19 TCA CCC TAT CAG GCA AAA TGT GTA GCC AAG

TGC SASP-LN-del-R 20 TAA CAG GAG GTG CTC TGA AAG AGT AAG CAG

AGG AG

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG I465-6H-not 21

TGA TGA TGT ATA CAG ACA CCA TCA GC

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG F468-6H-not 22

TGA TGA TGA AAA GCA TCT ATA CAG ACA CC

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG P471-6H-not 23 TGA TGA TGA GGT TTT AGA AAA GCA TCT ATA

C

TCC AGG CCC AGA GGA AAG GCC GGT TGG GTA PH20-HM17 24 GCA AGG GGC CCC TAA AAG AGT AAG CAG AGG

AG

TCA CTT GGG GCA TTC CAG ACG GTG GTG AAG PH20-HM18 25 GGC CGG TTG GGT AGC AAG GGG CCC CTA AAA

GAG TAA GCA GAG GAG

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG K470-not 26

TGA TGA TGT TTT AGA AAA GCA TCT ATA C

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAA AAA GCA TCT F468-not 27

ATA CAG ACA CC

AAT TGT AAT ATG GGG AAG CTG GGA AAA TAC M21-mega-F 28

AAG AA

TGG AAT AAC AGG AGG TGC AGA GTA AGC AGA M24-R 29

GGA GA

TTT GGA ATA ACA GGA GAG TAA GCA GAG GAG M25-R 30

A

AGT TTT GAA ATT CCT TTC TCT GGA TGA GCT B4-HM26 31 GGA GCA CAG CCT GGG GGA GAG TGC GGC CCA

GGG TGC TTC TGG AAT TG

ATG AGC TGG AGC ACA GCT TTG GGG AGA GTG B4-HM27 32

CGG CCC AG

ATT CCT TTC TCA AGA TGA ACT TGA GCA CAG B4-HM28 33

CTT TGG CGA AAC TGT TGC

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG B4-HM29 34

TGA TGA TGA GCA TCT ATA CAG ACA CC

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG B4-HM30 35

TGA TGA TGA CAG ACA CCA TCA GCA ATA C

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG B4-HM31 36

TGA TGA TGA TCA GCA ATA CAC ACA TC

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG B4-HM32 37

TGA TGA TGA CAC ACA TCA ACA GCA TC

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG B4- HM33 38

TGA TGA TGA ACA GCA TCA GTG TCT TTT AC

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAG GGA GGT TTT P472-not 39

AGA AAA GCA TC

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAC ATG GGA GGT M473-not 40

TTT AGA AAA GCA TC

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAC TCC ATG GGA E474-not 41

GGT TTT AGA AAA GC

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAT GTC TCC ATG T475-not 42

GGA GGT TTT AG

TAA CAG GAG GTG CTC TGA AAT TAG AGT AAG M40-mega 43

CAG AGG AG

TGG AAT AAC AGG AGG TGC TCT AGA GTA AGC M41-mega 44

AGA GGA G

TTT GGA ATA ACA GGA GGA GAG TAA GCA GAG M42-mega 45

GAG

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG D466-6H-not 46

TGA TGA TGA TCT ATA CAG ACA CCA TCA GC P478-H-Not 47 GAT AAT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG

TGA TGA TGA GGT TCT TCT GTC TCC ATG GG

GAT AAT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG I480-H-Not 48

TGA TGA TGA ATT TGA GGT TCT TCT GTC TCC

GAT AAT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG Y482-H-Not 49 TGA TGA TGG TAG AAA ATT TGA GGT TCT TCT

G

GAT AAT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG A484-H-not 50 TGA TGA TGA GCA TTG TAG AAA ATT TGA GGT

TC

GAT AAT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG P486-H-not 51 TGA TGA TGG GGT GAA GCA TTG TAG AAA ATT

TGA GG

GAT AAT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG T488-H-not 52

TGA TGA TGT GTG GAG GGT GAA GCA TTG TAG

CTA ATT GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG K470-6H-not 53

TGA TGA TGT TTT AGA AAA GCA TCT ATA C

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG P472-6H-not 54

TGA TGA TGG GGA GGT TTT AGA AAA GCA TC

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG M473-6H-not 55 TGA TGA TGC ATG GGA GGT TTT AGA AAA GCA

TC

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG E474-6H-not 56 TGA TGA TGC TCC ATG GGA GGT TTT AGA AAA

GC

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG T475-6H-not 57

TGA TGA TGT GTC TCC ATG GGA GGT TTT AG

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAG TGG TGA TGG E476-6H-not 58

TGA TGA TGT TCT GTC TCC ATG GGA GG

GTT ATA GCG GCC GCT CAT TAT TCT GTC TCC E476-not 59

ATG GGA GG

[0157] Depois de encontrar a variante de PH20 com atividade enzimática aumentada e estabilidade térmica, o cDNA livre de tag 6xHis da variante de PH20 também foi construído.

[0158] Quando a densidade celular das células ExpiCHO atingiu 6 106/mL, um plasmídeo compreendendo o cDNA de PH20 de tipo selvagem ou variante inserido no vetor pcDNA3.4-TOPO foi transfectado nas células ExpiCHO pelo reagente de ExpiFectamine CHO. Como meio de cultura de células, foi utilizado meio de expressão ExpiCHO (100 a 500 mL). Após a transfecção, as células ExpiCHO foram cultivadas com agitação a 130 rpm por um total de 6 dias, durante os quais as células foram cultivadas a 37ºC por 1 dia e posteriormente cultivado em temperatura inferior de 32ºC por 5 dias. Após a conclusão da cultura, o sobrenadante celular foi coletado por centrifugação a 10.000 rpm por 30 min.

[0159] As proteínas recombinantes de PH20 de tipo selvagem 6xHis- C-terminal-terminal e de PH20 variante, produzidas nas células ExpiCHO, foram purificadas em três etapas (realizadas usando uma coluna HisTrap, uma coluna Q Sepharose e uma coluna Fenil, respectivamente) por um sistema AKTA prime.

[0160] Para purificação de proteínas usando a coluna HisTrap, o tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M) e o tampão B (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M, imidazol 0,5 M) foram preparados. A proteína foi ligada à coluna HisTrap e a coluna foi lavada com 5 volumes de coluna (CV) de tampão A para remover proteínas não especificamente ligadas. Foi confirmada que a condutividade foi mantida em nível constante, a coluna foi lavada com 5 CV de tampão B a 20% para eluir a proteína. A proteína eluída foi dialisada com tampão de diálise (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 50 mM). Para a purificação da proteína usando a coluna Q Sepharose, foram preparados tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5) e tampão B (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,5, NaCl 0,5 M). A proteína foi ligada à coluna Q Sepharose, e a coluna foi lavada com 5 CV de tampão A para remover proteínas não especificamente ligadas e, em seguida, 5 CV de tampão B foram lavadas em gradiente de concentração de 0 a 100% para eluir a proteína.

[0161] Para a purificação de proteínas usando a coluna fenil, o tampão A (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0, (NH4)2SO4 1,5 M) e o tampão B (fosfato de sódio 20 mM, pH 7,0) foram preparados. A proteína foi ligada à coluna de fenil e a coluna foi lavada com 5 CV de tampão A para remover proteínas não especificamente ligadas e, em seguida, 5 CV de tampão B foram lavadas em gradiente de concentração de 0 a 100% para eluir a proteína.

[0162] As atividades enzimáticas de PH20 de tipo selvagem e da variante de PH20 foram medidas por ensaio turbidimétrico, ensaio de substrato-gel e ensaio de Morgan-Elson.

[0163] O ensaio turbidimétrico é um método de medição da absorbância no precipitado produzido quando o ácido hialurônico é misturado com albumina (BSA). Quando o ácido hialurônico é hidrolisado pelo PH20, a absorbância do precipitado produzido quando misturado à albumina diminui. A hialuronidase PH20 (Sigma) foi diluída para 1, 2, 5, 7,5, 10, 15, 20, 30, 50 e 60 unidades/mL e preparada em cada tubo. A amostra de proteína purificada foi dissolvida em tampão de diluente de enzima (Tris 20 mM⋅HCl, pH 7,0, 77 mM NaCl, 0,01% (p/v) de albumina sérica bovina) e diluído para 100X, 300X, 600X, 1200X e 2400X e preparado em cada tubo. Em tubos novos, a solução de ácido hialurônico com uma concentração de 3 mg/mL foi diluída 10 vezes para uma concentração de 0,3 mg/mL de modo que o volume de cada tubo tornou-se 180 µL. 60 µL de enzima foram adicionados e misturados com a solução diluída de ácido hialurônico e deixados reagir a 37ºC por 45 min. Após a conclusão da reação, 50 L da enzima reagida e 250 L de solução de albumina ácida foram adicionados a cada poço de uma placa de 96 poços e agitados por 10 min, e então a absorbância foi medida a 600 nm por espectrofotômetro.

[0164] No ensaio de substrato-gel, a proteína foi submetida a eletroforese em gel de SDS a 10% (incluindo 0,17 mg/mL de ácido hialurônico) por 1 h, e o SDS foi removido com Triton X-100 a

2,5% (p/v) a 4º C por 2 h. Depois disso, uma reação enzimática foi realizada no tampão (fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0, NaCl 150 mM) a 37º C (que é a temperatura ideal para PH20) por 1 a 4 h, e a proteína foi corada com reagente azul Alcian a 0,5%. O reagente azul Alcian não ligado ao ácido hialurônico foi removido usando solução de remoção de manchas. O gel SDS corado com azul Alcian foi fotografado e, em seguida, a banda foi quantificada.

[0165] A estabilidade térmica da proteína foi medida por um método de medição da temperatura da agregação por dispersão de luz dinâmica (DLS), um método de medição da temperatura de fusão (Tm) em PCR em tempo real usando corante Sypro-alaranjado, um método de medição da atividade enzimática após deixar a proteína repousar em uma temperatura predeterminada por um tempo predeterminado, etc. No método de medição da temperatura de agregação por DLS, a agregação de moléculas é medida usando dispersão de luz e, portanto, a sensibilidade é alta e a temperatura de agregação é geralmente mais baixa do que a temperatura de fusão da proteína.

[0166] As sequências dos aminoácidos substituídos ou clivados nas variantes de PH20 construídas na presente invenção são mostradas na Tabela 11 abaixo.

[0167] Entre as variantes, de acordo com a presente invenção, a variante com a tag 6xHis ligada ao C-terminal de PH20 foi denominada HM; a variante livre da tag 6xHis foi denominada HP; PH20 maduro (L36 a S490) tendo a tag 6xHis anexada ao C-terminal sido denominada WT; e PH20 de tipo selvagem maduro (L36 a Y482)

tendo o C-terminal clivado após Y482 enquanto estava livre da tag 6xHis sido denominado HW2.

Tabela 11 Sequências de aminoácidos de variantes de PH20, de acordo com a presente invenção, e suas características de substituição/clivagem

SEQ Nome Substituição Sequência de aminoácidos NO.

LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI

TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV Substituição de

YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA 12 aminoácidos

GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH de M345T, S347T,

HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL M348K, K349E, HM1 60 YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI L352Q, L353A,

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY L354I, D355K,

TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK N356E, E359D,

EYMDTTLGPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC I361T e N363G.

IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP

LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY Substituição de PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI 7 aminoácidos de TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV Y365F, I367L, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA HM2 61 L371S, A372G, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH K374L, M375L e HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL V379A YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK EYMDTTLNPFILNVTSGALLCSQALCQEQGVC IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP

LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY Substituição de

PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI 19 aminoácidos

TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV de M345T, S347T,

YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA M348K, K349E,

GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A,

HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL L354I, D355K, HM3 62 YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI N356E, E359D,

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T, N363G,

TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK Y365F, I367L,

EYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCQEQGVC L371S, A372G,

IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG K374L, M375L e

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD V379A

TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP

LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY Substituição de PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI 17 aminoácidos TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV de G340V, T341S, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA L342W, S343E, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH I344N, M345T, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM4 63 S347T, M348K, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI K349E, L352Q, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY L353A, L354I, TFGETVALGASGIVIWVSWENTRTKESCQAIK D355K, N356E, EYMDTTLGPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC E359D, I361T e IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG N363G KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD

TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI

TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV Substituição de

YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA 11 aminoácidos

GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH de M345T, S347T,

HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL M348K, K349E, HM6 64 YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI L352Q, L353A,

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY L354I, D355K,

TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK N356E, E359D e

EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC I361T

IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY

PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI Substituição de

TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV 16 aminoácidos

YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA de G340V, T341S

GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L342W, S343E,

HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL I344N, M345T, HM7 65 YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI S347T, M348K,

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY K349E, L352Q,

TFGETVALGASGIVIWVSWENTRTKESCQAIK L353A, L354I,

EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC D355K, N356E,

IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG E359D e I361T

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN

ASPSTLS Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 12 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY HM8 66 de I344N, M345T, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI S347T, M348K, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV K349E, L352Q, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA

L353A, L354I, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH D355K, N356E, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL E359D e I361T YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY TFGETVALGASGIVIWGTLSNTRTKESCQAIK EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY

PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI Substituição de TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV 13 aminoácidos YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA de S343E, I344N, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH M345T, S347T, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM9 67 M348K, K349E, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI L352Q, L353A, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY L354I, D355K, TFGETVALGASGIVIWGTLENTRTKESCQAIK N356E, E359D e EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC I361T IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN

ASPSTLS Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 14 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de L342W, S343E, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI I344N, M345T, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV HM10 68 S347T, M348K, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA K349E, L352Q, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L353A, L354I, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL D355K, N356E, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI E359D e I361T PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY

TFGETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIK EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY

PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI Substituição de TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV 13 aminoácidos YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA de M345T, S347T, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH M348K, K349E, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM11 69 L352Q, L353A, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI L354I, D355K, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY N356E, E359D, TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK I361T, Y365F e EYMDTTLNPFILNVTLAAKMCSQVLCQEQGVC I367L IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY

PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI Substituição de

TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV 15 aminoácidos

YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA de M345T, S347T,

GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH M348K, K349E,

HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL L352Q, L353A, HM12 70 YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI L354I, D355K,

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY N356E, E359D,

TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK I361T, Y365F,

EYMDTTLNPFILNVTSGAKMCSQVLCQEQGVC I367L, L371S e

IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG A372G

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD

MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY Substituição de IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF 11 aminoácidos YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK de M345T, S347T, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK M348K, K349E, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L352Q, L353A, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM13 71 L354I, D355K, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD N356E, E359D e AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF I361T, e GETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD

AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNAS PSTLS LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP

LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY Substituição de

PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI 11 aminoácidos

TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV de M345T, S347T,

YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA M348K, K349E,

GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A,

HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM14 72 L354I, D355K,

YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI N356E, E359D e

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T e

TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK truncamento após

EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC I465 no C-

IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG terminal

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD

TDAVDVCIADGVCI Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 11 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY HM15 73 de M345T, S347T, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI M348K, K349E, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV L352Q, L353A, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA L354I, D355K, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH

N356E, E359D e HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL I361T, e YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI truncamento após PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY F468 no C- TFGETVALGASGIVIWGTLSI T R TKE SC terminal QAIKE YM D T T

LNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWN SSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLED LEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDV CIADGVCIDAF LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP

LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY Substituição de

PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI 11 aminoácidos

TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV de M345T, S347T,

YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA M348K, K349E,

GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A,

HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM16 74 L354I, D355K,

YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI N356E, E359D e

PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T, e

TFGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIK truncamento após

EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC P471 no C-

IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG terminal

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD

TDAVDVCIADGVCIDAFLKP Substituição de FRGPLLPNRPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM L36 ~ V47 por SLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYI FRGPLLPNR e DSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFY substituição de MPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKN aminoácidos de RSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKD HM17 75 M345T, S347T, FLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYK M348K, K349E, KPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPS L352Q, L353A, IYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDA L354I, D355K, KSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFG N356E, E359D e ETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKEYM I361T DTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRK

NWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPT LEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDA VDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASP STLS LNFRAPPVIPNVPFLW FRGPLLPNRPFTTVWNAPSEFCLGKFDEPLDM AWNAPSEFCLGKFDEP SLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYI LDMSLFSFIGSPRINA DSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFY TGQGVTIFYVDRLGYY MPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKN PYIDSITGVTVNGGIP RSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKD QKISLQDHLDKAKKDI FLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYK TFYMPVDNLGMAVIDW KPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPS EEWRPTWARNWKPKDV IYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDA YKNRSIELVQQQNVQL KSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFG SLTEATEKAKQEFEKA ETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKEYM GKDFLVETIKLGKLLR DTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRK PNHLWGYYLFPDCYNH NWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPT HYKKPGYNGSCFNVEI LEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDA

KRNDDLSWLWNESTAL VDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASP HM18 76

YPSIYLNTQQSPVAAT STLS LYVRNRVREAIRVSKI PDAKSPLPVFAYTRIV FTDQVLKFLSQDELVY TFGETVALGASGIVIW GTLSI T R TKE SC QAIKE YM D T T LNPYIINVTLAAKMCS QVLCQEQGVCIRKNWN SSDYLHLNPDNFAIQL EKGGKFTVRGKPTLED LEQFSEKFYCSCYSTL SCKEKADVKDTDAVDV

CIADGVCIDAFLKP Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD HM19 77 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK

S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no

KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLK K470 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM20 78 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento

MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAF F468 no C- terminal Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 15 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de T341S, L342W, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI HM21 79 S343E, I344N, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV M345T, S347T, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA M348K, K349E, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL L354I, D355K, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI

N356E, E359D e PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T TFGETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIK

EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN ASPSTLS APPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMS

LFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYID Substituição de SITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYM 11 aminoácidos PVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNR de M345T, S347T, SIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDF M348K, K349E, LVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKK L352Q, L353A, PGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSI HM24 80 L354I, D355K, YLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAK N356E, E359D e SPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGE I361T, e TVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKEYMD truncamento TTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKN antes de A40 no WNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTL N-terminal EDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAV

DVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPS TLS

PVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSLF Substituição de SFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDSI 11 aminoácidos TGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMPV de M345T, S347T, DNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRSI M348K, K349E, ELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFLV L352Q, L353A, ETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKPG HM25 81 L354I, D355K, YNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIYL N356E, E359D e NTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKSP I361T, LPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGETV truncamento ALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKEYMDTT antes de P42 no LNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNWN N-terminal SSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLED

LEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVDV CIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPSTL

S Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 14 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de L342W, S343E, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI I344N, M345T, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV S347T, M348K, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA K349E, L352Q, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L353A, L354I, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM29 82 D355K, N356E, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI E359D e I361T, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY truncamento TFGETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIK antes de L36 no EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC N-terminal, e IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG truncamento após KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD C-terminal TDAVDVCIADGVCIDA Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 14 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de L342W, S343E, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI I344N, M345T, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV S347T, M348K, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA K349E, L352Q, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L353A, L354I, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM30 83 D355K, N356E, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI E359D e I361T, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY

TFGETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIK truncamento EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC antes de L36 no IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG N-terminal e

KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD truncamento após TDAVDVCIADGVC C464 no C- terminal HM31 84 Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 14 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de L342W, S343E, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI I344N, M345T, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV S347T, M348K, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA K349E, L352Q, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L353A, L354I, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL D355K, N356E, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI E359D e I361T, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY truncamento TFGETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIK antes de L36 no EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC N-terminal e IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG truncamento após KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD D461 no C- TDAVDVCIAD terminal

Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 14 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de L342W, S343E, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI I344N, M345T, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV S347T, M348K, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA K349E, L352Q, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L353A, L354I, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM32 85 D355K, N356E, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI E359D e I361T, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY truncamento TFGETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIK antes de L36 no EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC N-terminal e IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG truncamento após KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD C458 no C- TDAVDVC terminal

Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 14 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de L342W, S343E, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI HM33 86 I344N, M345T, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV S347T, M348K, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA K349E, L352Q, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L353A, L354I, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL

D355K, N356E, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI E359D e I361T, PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY truncamento TFGETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIK antes de L36 no EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC N-terminal e IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG truncamento após KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD V455 no C- TDAV terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 15 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de T341S, L342W, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF S343E, I344N, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK M345T, S347T, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK M348K, K349E, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L352Q, L353A, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP L354I, D355K, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD HP34 87 N356E, E359D e AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF I361T, GETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEY

MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR truncamento KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP antes de F38 no TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD N-terminal e

AVDVCIADGVCIDAFLK truncamento após K470 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK HM35 88 K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF truncamento GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY antes de F38 no MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR

N-terminal e KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP truncamento após TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD P472 no C- AVDVCIADGVCIDAFLKPP terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM36 89 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF truncamento GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY antes de F38 no MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR N-terminal e KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP truncamento após TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD M473 no C- AVDVCIADGVCIDAFLKPPM terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM37 90 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPME E474 no C- terminal

Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM38 91 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMET T475 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM39 92 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETE E476 no C- terminal Substituição de NFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPL HM40 93 11 aminoácidos DMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYP de M345T, S347T, YIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDIT M348K, K349E, FYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVY

L352Q, L353A, KNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAG L354I, D355K, KDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHH N356E, E359D e YKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALY I361T e PSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIP

DAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYT truncamento FGETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKE antes de N37 no YMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCI N-terminal

RKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGK PTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDT DAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNA SPSTLS RAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDM

SLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYI Substituição de DSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFY 11 aminoácidos MPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKN de M345T, S347T, RSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKD M348K, K349E, FLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYK L352Q, L353A, KPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPS HM41 94 L354I, D355K, IYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDA N356E, E359D e KSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFG I361T e ETVALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKEYM truncamento DTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRK antes de R39 no NWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPT N-terminal LEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDA

VDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASP

STLS Substituição de PPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLDMSL 11 aminoácidos FSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPYIDS de M345T, S347T, ITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITFYMP M348K, K349E, VDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYKNRS HM42 95 L352Q, L353A, IELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGKDFL L354I, D355K, VETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHYKKP N356E, E359D e GYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYPSIY I361T e LNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPDAKS

PLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTFGET truncamento antes de P41 no VALGASGIVIWGTLSITRTKESCQAIKEYMDT N-terminal TLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIRKNW

NSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKPTLE DLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTDAVD VCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNASPST

LS Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM43 96 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCI I465 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY HM44 97 L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após

D466 no C- AVDVCIADGVCID terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM45 98 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e

TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDA A467 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 15 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de T341S, L342W, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF S343E, I344N, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK M345T, S347T, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK M348K, K349E, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L352Q, L353A, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP L354I, D355K, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD HP46 99 N356E, E359D e AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF I361T, GETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEY

MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR truncamento

KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP antes de F38 no TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD N-terminal e AVDVCIADGVCIDAF truncamento após F468 no C- terminal

Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM47 100 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEP P478 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM48 101 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQI I480 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD HM49 102 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK

S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no

KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFY Y482 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM50 103 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento

MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNA A484 no C- terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF HM51 104 I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD

E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNAS P486 no C- P terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 14 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de L342W, S343E, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF I344N, M345T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S347T, M348K, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK K349E, L352Q, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L353A, L354I, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HM52 105 D355K, N356E, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD E359D e I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

GETVALGASGIVIWGTWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYNAS T488 no C-

PST terminal Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 15 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de T341G, L342W, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI S343E, I344N, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV M345T, S347T, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA HM53 106 M348K, K349E, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL L354I, D355K, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI N356E, E359D e PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T, TFGETVALGASGIVIWGGWENTRTKESCQAIK truncamento EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC antes de L36490 IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG em N-terminal, e KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD depois de S490 TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN em C-terminal ASPSTLS

Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 15 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de T341A, L342W, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI S343E, I344N, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV M345T, S347T, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA M348K, K349E, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM54 107 L354I, D355K, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI N356E, E359D e PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T, TFGETVALGASGIVIWGAWENTRTKESCQAIK truncamento EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC antes de L36490 IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG em N-terminal, e KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD depois de S490 TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN em C-terminal ASPSTLS

Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 15 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de T341C, L342W, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI S343E, I344N, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV M345T, S347T, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA M348K, K349E, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM55 108 L354I, D355K, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI N356E, E359D e PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T, TFGETVALGASGIVIWGCWENTRTKESCQAIK truncamento EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC antes de L36490 IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG em N-terminal, e KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD depois de S490 TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQ109I em C-terminal FYNASPSTLS

Substituição de LNFRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEP 15 aminoácidos LDMSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYY de T341D, L342W, PYIDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDI S343E, I344N, TFYMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDV M345T, S347T, YKNRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKA M348K, K349E, GKDFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNH L352Q, L353A, HYKKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTAL HM56 109 L354I, D355K, YPSIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKI N356E, E359D e PDAKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVY I361T, TFGETVALGASGIVIWGDWENTRTKESCQAIK truncamento EYMDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVC antes de L36490 IRKNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRG em N-terminal, e KPTLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKD depois de S490 TDAVDVCIADGVCIDAFLKPPMETEEPQIFYN em C-terminal ASPSTLS Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 12 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de I344N, M345T, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF S347T, M348K, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK K349E, L352Q, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK L353A, L354I, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY D355K, N356E, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP HP57 110 E359D e I361T, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD

AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF truncamento GETVALGASGIVIWGTLSNTRTKESCQAIKEY antes de F38 no MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR N-terminal e KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP truncamento após TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD F468 no C- AVDVCIADGVCIDAF terminal Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 13 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY HP58 111 de S343E, I344N, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF M345T, S347T, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK M348K, K349E, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK

L352Q, L353A, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L354I, D355K, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP N356E, E359D e SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD I361T, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF truncamento GETVALGASGIVIWGTLENTRTKESCQAIKEY antes de F38 no MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR N-terminal e KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP truncamento após TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD F468 no C- AVDVCIADGVCIDAF terminal

Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 15 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de T341A, L342W, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF S343E, I344N, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK M345T, S347T, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK M348K, K349E, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L352Q, L353A, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP L354I, D355K, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD HP59 112 N356E, E359D e AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF I361T, GETVALGASGIVIWGAWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F384 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAF F468 em C- terminal

Substituição de FRAPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 15 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de T341G, L342W, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF S343E, I344N, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK HP60 113 M345T, S347T, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK M348K, K349E, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY L352Q, L353A, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP L354I, D355K, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD N356E, E359D e AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF

I361T, GETVALGASGIVIWGGWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F384 no KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP N-terminal TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAF F468 em C- terminal

Substituição de FRGPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD 16 aminoácidos MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY de A40G, T341S, IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF L342W, S343E, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK I344N, M345T, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK S347T, M348K, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY K349E, L352Q, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP L353A, L354I, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD HP61 114 D355K, N356E, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF E359D e I361T, GETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEY truncamento MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR antes de F38 em KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP C-terminal e TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD truncamento após AVDVCIADGVCIDAF F468 em C- terminal

Remoção de P42, FRGPPVIPNVPFLWAWNAPSEFCLGKFDEPLD substituição de MSLFSFIGSPRINATGQGVTIFYVDRLGYYPY 15 aminoácidos IDSITGVTVNGGIPQKISLQDHLDKAKKDITF de T341S, L342W, YMPVDNLGMAVIDWEEWRPTWARNWKPKDVYK S343E, I344N, NRSIELVQQQNVQLSLTEATEKAKQEFEKAGK HP62 115 M345T, S347T, DFLVETIKLGKLLRPNHLWGYYLFPDCYNHHY M348K, K349E, KKPGYNGSCFNVEIKRNDDLSWLWNESTALYP L352Q, L353A, SIYLNTQQSPVAATLYVRNRVREAIRVSKIPD L354I, D355K, AKSPLPVFAYTRIVFTDQVLKFLSQDELVYTF N356E, E359D e GETVALGASGIVIWGSWENTRTKESCQAIKEY I361T, MDTTLNPYIINVTLAAKMCSQVLCQEQGVCIR truncamento KNWNSSDYLHLNPDNFAIQLEKGGKFTVRGKP antes de F38 em TLEDLEQFSEKFYCSCYSTLSCKEKADVKDTD N-terminal, e AVDVCIADGVCIDAF truncamento depois de F38 em C-terminal Exemplo 2. Construção de variantes PH20 HM1 e HM6

[0168] Como mostrado na Fig. 1B, os resíduos de aminoácidos M345 a N363 de PH20 correspondem à região alfa-hélice 8 e a região ligante entre alfa-hélice 7 e alfa-hélice 8 no modelo de estrutura terciária da proteína. Entre os aminoácidos da alfa- hélice 8, C351 forma uma ligação dissulfeto com C60 da alfa- hélice 1; Y357 forma interação hidrofóbica com F315 da alfa- hélice 7; e N363 forma uma ligação de hidrogênio com D69 da alfa-hélice 1, estabilizando assim as estruturas secundárias adjacentes à alfa-hélice 8 (FIG. 1C).

[0169] A fim de construir variantes com maior atividade enzimática e estabilidade térmica do que WT, substituindo os aminoácidos localizados na região da alfa-hélice 8 de PH20 e a região ligante entre a alfa-hélice 7 e a alfa-hélice 8, as seguintes variantes foram construídas: a variante HM1 na qual 12 aminoácidos na região M345 a N363 foram substituídos; a variante HM2 na qual 7 aminoácidos na região Y365 a V379 foram substituídos; e a variante HM3 na qual 19 aminoácidos na região M345 a V379 foram substituídos. Entre os aminoácidos localizados na alfa-hélice 8 de PH20, C351, que está envolvido na ligação dissulfeto, e Y357, que está envolvido na interação hidrofóbica, não foram substituídos. As sequências de aminoácidos substituídas nas variantes HM1, HM2 e HM3 são mostradas na Tabela 11 acima. Quando as células ExpiCHO foram transfectadas com o plasmídeo pcDNA3.4-TOPO compreendendo o gene da variante HM1, HM2 ou HM3, a variante HM1 foi expressa nas células ExpiCHO (FIG. 3A), e as variantes HM2 e HM3 não foram expressas nas células. Se a proteína a seria expressa foi confirmado não apenas pela medição da atividade enzimática, mas também por análise de Western blot usando um anticorpo (Abcam, ab193009) contra PH20 humano. O epítopo do anticorpo é a região Q173 a P222. Estes resultados experimentais sugerem que a substituição de aminoácidos da região Y365 por V379 da sequência de aminoácidos da alfa-hélice 8, usada na construção das variantes HM2 e HM3, causa um sério efeito na estrutura da proteína; assim, as proteínas das variantes HM2 e HM3 não foram expressas. O nível de expressão da variante HM1 foi 3,4 vezes maior do que o de WT de tipo selvagem (FIG. 2). A variante HM1 é aquela em que a ligação de hidrogênio entre N363 da alfa-hélice 8 e D69 da alfa-hélice 1 foi removida substituindo N363 por glicina (FIG. 1C). Para restaurar a ligação de hidrogênio entre N363 e D69, G363 em HM1 foi substituído por asparagina, construindo assim a variante HM6. Os aminoácidos substituídos na variante HM6 são mostrados na Tabela 11 acima.

[0170] A variante HM6 foi expressa em células ExpiCHO, e o nível de expressão das mesmas foi semelhante ao da variante HM1 (o nível de expressão foi 3,4 vezes maior do que o de WT) (FIG. 2). Quando a atividade enzimática foi medida por ensaio turbidimétrico, foi mostrado que a atividade enzimática da variante HM6 foi 1,3 vez maior do que a de WT (FIG. 3B). No ensaio de substrato-gel, geralmente, o SDS é removido com 2,5% Triton X-100 (p/v) após SDS-PAGE, e a reação enzimática é realizada a 37ºC por 1 a 4 h, durante as quais a extensão em que a hialuronidase hidrolisa o ácido hialurônico é medida usando o corante azul Alcian. Sabe-se que quando o SDS é removido do gel de substrato, o enovelamento da proteína ocorre imediatamente e o substrato não afeta o enovelamento da proteína. Quando as atividades enzimáticas de WT e as variantes HM1 e HM6 foram medidas pelo ensaio de substrato-gel a 37ºC por 1 a 4 h, HM6 exibiu maior atividade enzimática do que aqueles de WT e a variante HM1 (FIG. 3C). Este resultado sugere que o dobramento de proteínas das variantes HM1 e HM6 e a renaturação resultante foram mais rápidas do que as de WT e que as variantes construídas exibem maior atividade enzimática do que WT. Quando o peptídeo sinal do próprio PH20 foi usado, o nível de expressão da proteína em células ExpiCHO foi baixo, e para resolver este problema, a sequência do peptídeo sinal de albumina sérica humana ou Hyal1 humano foi usada. Como mostrado na Fig. 3C, quando cada um dos peptídeos de sinal de albumina sérica humana e Hyal1 humano foi usado como o peptídeo de sinal da variante HM1, a expressão da proteína aumentou e não houve diferença significativa entre os dois peptídeos de sinal. Quando a atividade enzimática foi medida pelo ensaio de substrato-gel, WT tendo o peptídeo sinal de albumina sérica humana e a variante HM1 tendo o peptídeo sinal de albumina sérica humana ou Hyal1 apresentaram atividade enzimática em pH variando de 5 a 8 (FIG. 3D). Na presente invenção, o peptídeo sinal de albumina sérica humana foi usado como o peptídeo sinal da variante construída após HM1.

[0171] Quando as estabilidades térmicas de WT e as variantes HM1 e HM6 foram comparadas com base nas temperaturas de agregação, as temperaturas de agregação foram 46,5º C, 53,0ºC e 50,5ºC,

respectivamente, indicando que as temperaturas de agregação das variantes HM1 e HM6 foram de 6,5ºC e 4,0º C mais altas do que a de WT, respectivamente (FIG. 10). Os resultados da medição das temperaturas de agregação foram consistentes com os resultados de redobramento da proteína mostrados no ensaio de substrato- gel. Esses resultados sugerem pela primeira vez que a ligação de hidrogênio formada pelo resíduo N363 da alfa-hélice 8 desempenha um papel importante na estabilidade térmica e atividade enzimática do PH20.

[0172] Além disso, quando as naturezas hidrofílica/hidrofóbica de WT e as variantes HM1 e HM6 foram comparadas usando uma cromatografia em coluna de fenil, HM1 e HM6 foram todos eluídos antes de WT. Isso sugere que as variantes HM1 e HM6 têm uma natureza mais hidrofílica do que WT devido à substituição dos aminoácidos. No entanto, as variantes HM1 e HM6 eluídas da coluna fenil apresentaram dois picos, ao contrário de WT, e exibiram o mesmo peso molecular quando tratadas com PNGase F. Esta parece ser uma diferença causada pela N-glicosilação (Fig. 3E).

Exemplo 3. Construção de variantes PH20 HM4, HM7, HM8, HM9, HM10, HM11 e HM12

[0173] Acredita-se que a substituição de aminoácidos das regiões M345 por N363 e M345 por I361 pela construção das variantes HM1 e HM6 no Exemplo 2 resultou em um aumento na atividade enzimática e estabilidade térmica de PH20, fez grandes avanços em termos de engenharia de proteínas. Assim, com base nas variantes HM1 e HM6, outros aminoácidos nas direções N-terminal e C-terminal foram adicionalmente substituídos.

[0174] Em primeiro lugar, as variantes HM4 e HM7 foram construídas, que compreendem os aminoácidos substituídos nas variantes HM1 e HM6 e nas quais os aminoácidos entre G340 e I344 foram adicionalmente substituídos com G340V, T341S, L342W, S343E e I344N.

As sequências das sequências de aminoácidos substituídas nas variantes HM4 e HM7 são mostradas na Tabela 11 acima.

As variantes HM4 e HM7 foram expressas em células ExpiCHO.

Os resultados da purificação de proteínas para HM7 são mostrados na FIG. 5A.

HM4 e HM7 mostraram um aumento na expressão da proteína de 6,3 vezes em comparação com WT, e mostraram aumentos na temperatura de agregação de 10ºC e 11,5º C, respectivamente, em comparação com WT.

No entanto, as atividades enzimáticas de HM4 e HM7, medidas por ensaio turbidimétrico, foram cerca de 15% daquela de WT (FIG. 5B). A atividade enzimática e a estabilidade térmica geralmente têm uma relação de troca, mas na presente invenção, parece que a substituição introduzida nas variantes HM1 e HM6 aumentou a estabilidade térmica das variantes, mantendo a atividade enzimática e as atividades enzimáticas do as variantes HM4 e HM7 diminuíram devido a um aumento excessivo na estabilidade térmica.

Um aumento na temperatura de agregação de 11,5º C, que apareceu nas variantes HM4 e HM7, é um resultado muito significativo em termos de engenharia de proteínas.

Quando as flexibilidades estruturais das proteínas foram analisadas por um gráfico de Stern-Volmer, foi mostrado que as flexibilidades estruturais de HM1, HM6, HM4 e HM7, obtidas pela substituição da alfa-hélice 8 e sua região ligante, eram todas maiores do que a de WT (FIG. 11A). Esse resultado sugere que o aumento da estabilidade térmica local resultou em um aumento na flexibilidade de toda a estrutura da proteína.

[0175] A diferença entre as variantes HM6 e HM7 são os aminoácidos entre G340 e I344. A fim de identificar os aminoácidos que estão envolvidos no aumento da estabilidade térmica da variante HM7, as seguintes variantes foram construídas com base na variante HM6: HM8 em que I344N foi substituído; HM9 em que S343 e I344N foram substituídos; HM10 em que L342W, S343E e I344N foram substituídos; e HM21 em que T341S, L342W, S343E e I344N foram substituídos. As sequências dos aminoácidos substituídos nas variantes HM8, HM9, HM10 e HM21 são mostradas na Tabela 11 acima. As variantes HM8, HM9, HM10 e HM21 foram expressas em células ExpiCHO (FIG. 5A). Como I344N, S343E e L342W foram introduzidos no loop de direção N-terminal da alfa-hélice 8 com base na variante HM6, as temperaturas de agregação das variantes HM8, HM9 e HM10 aumentaram para 52,5ºC, 53º C e 55,5º C, respectivamente (FIG. 10). No entanto, as variantes HM8, HM9 e HM10 mantiveram atividades enzimáticas semelhantes às de WT (FIG. 5B). Este resultado sugere que a substituição de aminoácidos introduzida nas variantes HM8, HM9 e HM10 teve um efeito local nas estabilidades térmicas das enzimas, mas não teve efeito significativo nas atividades enzimáticas. No entanto, HM21 mostrou estabilidade térmica reduzida em comparação com HM10, mas apresentou atividade enzimática aproximadamente 2 vezes maior em comparação com WT em pH 7,0. Quando WT e cada variante foram deixados reagir com o substrato por 1 h no ensaio de substrato-gel, a atividade enzimática foi reduzida na ordem de HM21> HM10> HM9> HM8> HM6> WT (FIG. 5C).

[0176] Quando as propriedades físicas das variantes HM7, HM8, HM9, HM10 e HM21 foram examinadas usando uma cromatografia em coluna de fenil, essas variantes PH20 foram eluídas antes de WT, sugerindo que todas essas variantes têm uma natureza hidrofílica. No entanto, o padrão do pico principal na posição de substituição de aminoácidos apareceu de forma diferente (FIG. 5D).

[0177] A variante HM7 também apresentou dois picos na cromatografia em coluna fenil, como as variantes HM1 e HM6, sugerindo que dois tipos diferentes estavam presentes.

[0178] A fim de examinar os padrões de migração de WT e as variantes dependendo de seus pontos isoelétricos, a análise de focagem isoelétrica (doravante referida como IEF) foi realizada (FIG. 5E). No gel de IEF, WT e a variante HM6 e HM8 mostraram padrões de migração semelhantes, e as variantes HM9, HM10, HM21 e HM7 compreendendo a mutação S343E migraram para uma região mais ácida. Este resultado sugere que ocorre uma alteração no ponto isoelétrico da proteína devido à introdução do ácido glutâmico pela substituição S343E do aminoácido entre G340 e I344.

[0179] Além disso, com base na variante HM6, outros aminoácidos nas regiões C-terminais da alfa-hélice 8 foram substituídos, construindo assim as variantes HM11 e HM12. As sequências dos aminoácidos substituídos nas variantes HM11 e HM12 são mostradas na Tabela 11 acima. A variante HM11 foi expressa em células ExpiCHO, mas o seu nível de expressão foi inferior ao de WT (FIG. 2), e a variante HM12 não foi expressa em células ExpiCHO.

A variante HM11 exibiu uma atividade correspondente a 32% daquela de WT (FIG. 6B).

Exemplo 4. Construção de variantes de PH20 truncadas com aminoácido N-terminal com base em HM6

[0180] A região C-terminal de PH20 já é bem conhecida por desempenhar um papel importante na expressão e atividade enzimática de PH20, mas o papel da região N-terminal de PH20 não é bem conhecido. A fim de examinar o efeito da clivagem do aminoácido na região N-terminal de PH20 sobre a atividade enzimática, variantes HM40, HM13, HM41, HM24, HM42 e HM25 tendo o N-terminal clivado em N37, F38, R39, A40, P41 ou P42 foram construídos com base na variante HM6 (Tabela 11). Além disso, HP61 e HP62 com modificações nos aminoácidos N-terminais foram adicionalmente construídos.

[0181] As variantes HM40, HM13, HM41, HM24, HM42, HP61 e HP62 foram expressas em células ExpiCHO, mas HM25 não foi expresso (FIGS. 7A e 7B). As variantes de PH20 truncadas N-terminal mostraram uma diferença na atividade enzimática dependendo da posição onde o N-terminal começou. As variantes HM40, HM13 e HM41, nas quais um a três aminoácidos foram clivados, apresentaram atividade enzimática semelhante à do modelo HM6, mas HM24 e HM42, em que quatro a cinco aminoácidos foram clivados, apresentaram atividade ligeiramente inferior à de HM6 (FIG. 7C). No entanto, o HM25 no qual seis aminoácidos foram clivados foi pouco expresso nas células ExpiCHO, e a atividade enzimática também foi significativamente baixa (3,5 U/µg). Parece que as mudanças nas atividades enzimáticas de HP61 e HP62 com modificações nos aminoácidos N-terminais não são significativas.

[0182] Em relação às atividades enzimáticas das variantes de PH20 clivadas no N-terminal, medidas pelo ensaio de substrato-gel (1 h de reação), as atividades enzimáticas de HM40, HM13 e HM41 foram semelhantes às da variante HM6, mas a as atividades enzimáticas de HM24 e HM42 foram menores do que a de HM6 (FIG. 7D). O HM25 em que seis aminoácidos foram clivados não pode ser analisado, pois a quantidade de proteína produzida era pequena.

[0183] Quando as propriedades físicas das variantes HM40, HM13, HM41, HM24 e HM42 foram analisadas usando uma cromatografia em coluna de fenil, essas variantes foram eluídas da coluna antes de WT, sugerindo que essas variantes têm uma natureza hidrofílica (FIG. 7E). Este resultado sugere que as variantes HM40, HM13, HM41, HM24 e HM42 construídas com base na variante HM6 mantiveram a natureza hidrofílica do HM6 ao considerar as características dos resíduos L36 a A40.

[0184] As temperaturas de agregação das variantes de PH20 clivadas do N-terminal, medidas por DLS, eram diferentes entre as variantes, dependendo da posição onde o aminoácido começou (FIG. 7F). Embora os resíduos de aminoácidos N-terminais das variantes HM40, HM13, HM41 e HM42 tenham sido clivados, eles mostraram uma temperatura de agregação de 50ºC ou superior, indicando que as características do modelo HM6 permaneceram intactas. Dentre essas variantes, as variantes HM40 e HM42 exibiram uma temperatura de agregação 3 a 4ºC superior à do HM6, indicando que a estabilidade térmica dessas variantes aumentou. Além disso, a fim de examinar o efeito da substituição dos aminoácidos N-terminais de PH20 na expressão de proteínas e atividade enzimática, as seguintes variantes foram construídas: a variante HM17 em que os resíduos de aminoácidos N-terminais 36 a 47 (LNFRAPPVIPNV) de PH20 foram substituídos por FRGPLLPNR; e a variante HM18 na qual os resíduos de aminoácidos N-terminais 36 a 52 (LNFRAPPVIPNVPFLWA) de PH20 foram substituídos por FRGPLLPNRPFTTV. As sequências dos aminoácidos substituídos nas variantes HM17 e HM18 são mostradas na Tabela 11 acima. As variantes HM17 e HM18 não foram expressas em células ExpiCHO. Isso sugere que, mesmo quando até cinco aminoácidos localizados no N-terminal foram clivados, as variantes mostraram expressão de proteína e atividade enzimática; no entanto, a substituição de mais resíduos de aminoácidos, como 36 a 47 resíduos ou 36 a 52 resíduos, teve um efeito no dobramento de proteínas.

Exemplo 5. Construção das variantes à base de HM6 truncadas em aminoácidos C-terminal HM14, HM15 e HM16 de PH20

[0185] A região C-terminal de PH20 é conhecida por desempenhar um papel importante na expressão de proteínas e atividade enzimática. Na presente invenção, as variantes HM14, HM15 e HM16, nas quais os aminoácidos C-terminais foram clivados em I465, F468 e K471, respectivamente, foram construídas com base na variante HM6. As sequências dos aminoácidos substituídos nestas variantes HM14, HM15 e HM16 são mostradas na Tabela 11 acima. Estas variantes HM14, HM15 e HM16 foram expressas em células ExpiCHO (FIG. 8A), e os níveis de expressão da proteína foram da ordem de HM16> HM15> HM14, indicando que os níveis de expressão da proteína diminuíram conforme o número de aminoácidos do C-terminal clivado aumentou (FIG. 8A). No entanto, as atividades enzimáticas das variantes HM14, HM15 e HM16 foram da ordem de HM16> HM14 (≈WT) > HM15 (FIG. 8B). De acordo com Frost et al., a região C-terminal 477-483 de PH20 é necessária para a expressão solúvel, e quando o C-terminal é clivado em 467, a atividade enzimática da variante é apenas 10% de uma variante de PH20 cujo C-terminal foi clivado nos resíduos 477 a 483, e quando o C-terminal é clivado antes do resíduo 467, a variante não tem atividade enzimática. No entanto, as variantes clivadas do C-terminal HM14, HM15 e HM16 construídas com base na variante HM6 na presente invenção mostraram dobramento de proteína aumentado devido à substituição de aminoácidos da região M345 para I361 e, assim, a estabilidade térmica das mesmas aumentou. Por esta razão, mesmo quando o C- terminal foi clivado após I465, F468 ou P471, a variante apresentou atividade enzimática semelhante à de WT, e a atividade enzimática da mesma não diminuiu significativamente.

[0186] As flexibilidades estruturais de WT e as variantes HM14, HM15 e HM16 foram examinadas por extinção de fluorescência usando acrilamida (FIG. 11B). As variantes HM14, HM15 e HM16 eram todas estruturalmente mais flexíveis do que WT. Este resultado sugere que as variantes clivadas do C-terminal construídas usando a variante HM6 também mantiveram sua flexibilidade estrutural.

[0187] As atividades enzimáticas das variantes HM14, HM15 e HM16, medidas por ensaio turbidimétrico, também foram confirmadas no ensaio de substrato-gel (FIG. 8C).

[0188] Quando as propriedades físicas das variantes clivadas do C-terminal foram analisadas usando uma cromatografia em coluna de fenil, as variantes HM14, HM15 e HM16 foram todas eluídas antes de WT, indicando que tinham uma natureza hidrofílica. Além disso, as hidrofobicidades dessas variantes eram da ordem de HM16> HM14> HM15 (FIG. 8D).

Exemplo 6. Este resultado sugere que as variantes clivadas do terminal C construídas usando a variante HM6 também mantiveram sua flexibilidade estrutural.

[0189] As variantes de PH20 construídas na presente invenção foram baseadas em HM6 e HM8, HM9 e HM10, em que os resíduos de aminoácidos G340 a I344 foram adicionalmente substituídos, exibiram melhor desempenho do que WT em termos de níveis de expressão de proteínas, atividades enzimáticas e estabilidades térmicas. As variantes HM19 e HM20 foram construídas que tinham um N-terminal clivado em F38 e um C-terminal clivado em F468 com base em HM10 com alta atividade enzimática e estabilidade térmica entre as variantes HM8, HM9 e HM10. HM19 e HM20 foram todos expressos em células ExpiCHO e purificados usando uma cromatografia em coluna HisTrap (FIG. 9A). Quando as atividades enzimáticas dessas variantes foram medidas por ensaio turbidimétrico, HM19 e HM20 exibiram uma atividade enzimática que foi 10% maior do que a de WT (FIG. 9B). No ensaio de substrato-gel, HM19 e HM20 também exibiram maior atividade enzimática do que WT (FIG. 9C).

Exemplo 7. Caracterização de variantes PH20 baseadas em HM10

[0190] Os níveis de expressão de variantes truncadas do C- terminal com base em HM10 em células ExpiCHO mostraram uma tendência a diminuir conforme o comprimento da região do C-

terminal tornou-se mais curto, e essas variantes não foram expressas quando o C-terminal foi truncado em C464 ou mais curto (FIG. 12). C464 é necessário porque forma uma ligação dissulfeto com C437 e é importante para manter a estrutura da proteína.

[0191] A fim de examinar se a variante não é expressa em células ExpiCHO quando o C-terminal é clivado no resíduo 464 ou mais curto, a análise de Western blot foi realizada. Como mostrado na Fig. 13, as variantes HM30, HM31, HM32 e HM33 não foram detectadas em Western blots.

[0192] As atividades enzimáticas das variantes truncadas C- terminal baseadas em HM10, medidas por ensaio turbidimétrico, são mostradas nas FIGS. 14A e 14B. As variantes de PH20 truncadas no C-terminal exibiram uma atividade enzimática de ± 20% em comparação com WT. Quando o C-terminal foi clivado após 1480, a atividade da enzima aumentou em geral. Além disso, as variantes HP19 e HP20, obtidas pela remoção do tag 6xHis de HM19 e HM20, apresentaram decréscimos na atividade enzimática de 23% e 9,6%, respectivamente, em comparação com quando o tag 6xHis estava presente. Isso sugere que o tag 6xHis tem um efeito na atividade enzimática.

[0193] Quando as atividades enzimáticas das variantes truncadas C-terminal baseadas em HM10 foram medidas por ensaio de substrato-gel, essas variantes exibiram atividade enzimática mais alta do que WT e mostraram atividade enzimática semelhante à do modelo HM10, indicando que a diferença na atividade enzimática dependendo do comprimento da região C- terminal não foi significativa (FIG. 14C).

Exemplo 8. Caracterização de variantes PH20 baseadas em HM21

[0194] A variante HP34 foi purificada por cromatografia em coluna de quatro etapas (FIG. 15A), e a variante HP46 foi purificada por cromatografia em coluna de três etapas (FIG. 15B). A variante HP34 foi purificada por cromatografia em coluna de quatro etapas (FIG. HP34 e HP46 são variantes 6xHis-tag-free e o processo de purificação dessas variantes difere do processo de purificação de variantes com 6xHis-tag e, portanto, é difícil comparar os níveis de expressão das proteínas.

[0195] No ensaio turbidimétrico, as atividades de HP34 e HP46 foram 45,6 U/µg e 47,2 U/µg, respectivamente, que foram cerca de 2 vezes maiores do que a de WT e foram cerca de 10% maiores do que a do modelo HM21 (FIG. 16A).

[0196] A cinética de cada variante foi medida pelo ensaio Morgan- Elson e os resultados da medição são mostrados na FIG. 16B. As eficiências catalíticas (kcat/Km) de HP34 e HP46 foram 1,7 a 2 vezes maiores do que a de HW2 de tipo selvagem. Este resultado é consistente com o resultado de que a atividade específica foi maior do que a do WT. A constante de Michaelis (Km) era inferior em que estas variantes em HW2, indicando as afinidades de substrato destas variantes aumentada. A partir desses resultados, pode-se concluir que as variantes HM21, HP34 e HP46 se ligam fortemente ao substrato e possuem a propriedade de converter o substrato em um produto com alta eficiência. Esta propriedade é atribuível ao efeito de substituição de T341 por serina. Quando a treonina localizada na posição 341 é substituída por um aminoácido, tal como alanina, glicina, ácido aspártico ou semelhantes, o efeito da substituição na atividade enzimática pode ser previsto.

[0197] As temperaturas de agregação de HP34 e HP46, medidas por DLS, foram 51,5ºC e 51,0ºC, respectivamente, que eram semelhantes às do modelo HM21 e eram cerca de 5ºC mais altas que as de HW2, indicando que estas as variantes eram termicamente estáveis (FIG. 17A). A atividade enzimática de HP20, medida por ensaio de substrato-gel, foi semelhante à de HP20, enquanto HP46 exibiu maior atividade enzimática do que HP20, indicando que o dobramento de proteína de HM21 como um modelo era melhor do que o de HM10 (FIG. 17B).

[0198] HW2 de tipo selvagem e a variante HP46 foram deixados em repouso durante a noite em pH 7,0 e pH 3,0 e, em seguida, as atividades enzimáticas dos mesmos foram comparadas por ensaio de substrato-gel. Como resultado, foi mostrado que HP46 exibiu alta atividade não apenas em pH 7,0, mas também em pH 3,0, indicando que tinha excelente estabilidade (FIG. 17C).

[0199] HM53, HM54, HM55, HM56, HP59 e HP60 são variantes com uma mutação no aminoácido na posição 341, entre as variantes baseadas em HM21. Foi confirmado que a mutação do aminoácido na posição 341 teve vários efeitos sobre o nível de expressão e atividade das variantes (FIGS. 17D e 17E).

Exemplo 9. Ensaio de imunogenicidade in vitro da variante de PH20

[0200] Biofármacos com pesos moleculares mais altos do que os de produtos químicos sintéticos de baixo peso molecular têm o risco de desencadear respostas imunológicas indesejadas quando entram no corpo humano. Uma superfície de contato externa, criada por dobramento ou interação com domínios adjacentes na estrutura secundária ou estrutura terciária de um biomaterial de grande peso molecular, pode promover a resposta imunológica ao biomaterial, fornecendo um epítopo ao sistema imunológico no corpo humano. Essa resposta imunológica pode produzir um anticorpo anti-droga (ADA), e essa resposta pode inibir a eficácia da droga, ou causar hipersensibilidade à droga, ou promover a eliminação da droga no corpo humano. A resposta imunológica à droga pode, portanto, afetar os resultados em ensaios clínicos e pode causar reações anormais graves com o uso a longo prazo. Essa resposta imunológica pode ser influenciada por vários fatores e desencadeada pela resposta específica à própria droga ou doença, ou por fatores que dependem do método de administração da droga ou de cada paciente. Os fatores causados pela própria droga incluem a semelhança ou dissimilaridade dos biofármacos com os peptídeos humanos, modificação pós-tradução, impurezas, formação de agregados e as características da formulação. Fatores que variam entre pacientes individuais incluem sexo, reatividade com outras drogas em uso e fatores genéticos, dependendo do tipo de antígeno leucocitário humano (HLA).

[0201] Essa resposta imunogênica é desencadeada por células T CD4+ ou células T CD8+ que reconhecem epítopos, independentemente da causa da resposta imunológica. Por causa da diversidade do gene HLA classe II em indivíduos, os epítopos das células T CD4+ são diferentes entre os indivíduos e, portanto, a capacidade de resposta aos biofármacos nas células T CD4+ em cada sangue fornecido pelo doador saudável pode ser um critério muito importante para avaliar as respostas imunológicas que podem surgir em processos clínicos.

As células T CD4+ são ativadas por células apresentadoras de antígenos (APCs) que reconhecem os antígenos apresentados por meio de seu MHC tipo II (complexo principal de histocompatibilidade). As células T CD4+ ativadas liberam citocinas que ativam macrófagos, células T citotóxicas e células B, resultando em altos níveis de produção de anticorpos.

Ao contrário, as células T CD8+ têm citotoxicidade direta e removem diretamente células infectadas com antígenos, células danificadas ou células que perderam sua função.

As células T CD8+ têm receptores de células T que podem reconhecer peptídeos de antígenos específicos ligados a moléculas MHC tipo I localizadas na superfície de cada célula.

As células T CD8+ também podem ser ativadas por meio do reconhecimento de antígenos apresentados pelas células apresentadoras de antígenos, e essa ativação pode ser posteriormente aumentada por citocinas de células T CD4+. As células T CD8 + também podem ser ativadas por meio do reconhecimento de antígenos apresentados pelas células apresentadoras de antígenos, e essa ativação pode ser posteriormente aumentada por citocinas de células T CD4+. Neste exemplo, a fim de prever a imunogenicidade da variante de PH20 em comparação com um controle, células T CD4+ e células T CD8+ foram isoladas de PBMCs e, em seguida, tratadas com 1,5 ng/mL e 15 ng/mL do controle PH20 e a variante de PH20 (HP46), e então as distribuições de células T CD4+ ativadas e células T CD8+ foram medidas.

O nível de ativação de cada tipo de células T foi medido usando o índice de estimulação e o índice de estimulação (SI) é definido como segue:

[0202] Índice de estimulação (SI) = (nível de ativação de células T após tratamento com amostra de teste)/(nível de ativação de células T após tratamento com veículo)

[0203] Se o valor SI das células for 2 ou mais, pode-se determinar que as células foram ativadas em um nível significativo.

[0204] As respostas imunogênicas podem variar dependendo do tipo de HLA. Portanto, os experimentos para medir as respostas em mais vários tipos de HLA foram realizados usando células T isoladas de PBMCs fornecidas a partir de 10 doadores saudáveis. Os tipos de HLA dos 10 PBMCs usados são mostrados na Tabela 12 abaixo.

Tabela 12 Tipos HLA de PBMCs testados No HLA A HLA B HLA C1 DRB1 DQB1 DPB1 .

020 330 350 580 030 080 140 150 030 060 020 030 1 6 3 1 1 2 1 5 1 3 2 1 1 020 020 460 510 010 150 080 110 030 060 020 020 2 1 7 1 1 2 2 3 1 1 1 1 2 020 310 150 350 030 040 080 090 030 060 020 050 3 6 1 1 1 4 1 3 1 3 1 1 1 010 310 150 151 030 070 130 150 060 060 040 050 4 1 1 1 7 3 1 2 1 2 4 1 1 5 020 310 510 670 070 140 040 040 030 030 020 040

[0205] Os resultados da medição dos níveis de ativação de células T CD4+ e CD8+ tratadas com cada um de PH20 e a variante de PH20 estão resumidos na Tabela 13 abaixo.

Ao observar os resultados da medição dos níveis de ativação das células T CD4+ e CD8+, parece que o PH20 e a variante de PH20 mostram níveis de ativação relativamente baixos.

No caso de PH20, o nível de ativação de células T CD4+ foi medido em 2 ou mais em dois experimentos, e no caso da variante de PH20, a ativação de células T CD4+ não foi detectada.

No caso de PH20, a ativação de células T CD8+ foi detectada em um experimento, e no caso da variante de PH20, a ativação de células T CD8+ também foi detectada em um experimento.

No entanto, no caso de PH20, o valor SI foi medido como 2 ou mais em 1,5 ng/mL e 15 ng/mL, mas no caso da variante de PH20, um valor SI de 2 ou menos em 1,5 ng/mL e um valor SI de 2 ou mais a 15 ng/mL foram medidos (ver FIGS. 18 e 19).

[0206] Portanto, na concentração mais baixa, o nível de ativação de células T CD8+ foi observado como baixo no caso da variante de PH20, e é determinado que o nível de ativação de células T CD8+ por PH20 é maior do que a ativação nível de células T CD8+ pela variante de PH20. As conclusões tiradas dos resultados acima são as seguintes:

[0207] 1) os níveis de ativação de células T CD4+ e células T CD8+ por PH20 e a variante de PH20 são relativamente baixos; e

[0208] 2) a possibilidade de ativação de células T CD4+ e células T CD8+ pela variante de PH20 é menor do que pelo PH20.

[0209] A partir desses resultados, espera-se que a variante de PH20 tenha menor possibilidade de desencadear uma resposta imunogênica em processos clínicos do que o PH20.

Tabela 13 Índice de estimulação (SI) medido a partir dos resultados do ensaio de imunogenicidade in vitro CD4 CD8 Variante Variante

PBMC PH20 (ng/mL) PH20 (ng / PH20 (ng/mL) PH20 (ng / No. mL) mL) 1,5 15 1,5 15 1,5 15 1,5 15 1 1,03 0,859 0,728 1,176 1,38 1,42 1,22 1,60

2 1,05 0,09 0,596 0,922 1,20 1,11 1,00 1,07 3 1,90 1,44 1,56 1,12 1,43 1,31 1,59 1,35 4 2,51 2,79 0,788 1,82 1,28 1,90 0,579 0,974 5 1,27 1,47 1,09 1,14 0,987 0,932 0,972 1,02 6 0,825 0,834 0,998 0,946 0,904 1,13 1,09 0,986 7 2,07 2,07 1,43 1,90 2,08 2,34 1,30 2,46 8 0,898 1,079 0,967 0,822 0,926 1,06 0,896 0,813 9 0,882 0,957 0,895 0,941 0,853 0,993 0,950 1,09 10 0,983 0,970 1,12 1,13 1,15 1,08 1,15 1,24 Efeitos Vantajosos

[0210] As variantes de PH20 ou fragmentos das mesmas, de acordo com a presente invenção, têm níveis aumentados de expressão de proteína e mostram um aumento na temperatura de agregação de proteína de 4-11,5º C ou mais, quando expresso em células CHO (ExpiCHO), de modo que possam ser produzidas de forma eficiente, embora tenham alta estabilidade térmica, em comparação com o PH20 de tipo selvagem maduro.

[0211] Além disso, como resultado do ensaio de substrato-gel, um dos testes para medir a atividade da hialuronidase, as variantes de PH20 ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção, melhoraram o redobramento da proteína, de modo que são renovados mais rapidamente do que o de o PH20 de tipo selvagem maduro e a atividade enzimática original são mantidas independentemente da posição de clivagem C-terminal.

[0212] Além disso, as variantes de PH20 ou fragmentos dos mesmos, de acordo com a presente invenção, têm baixo imunogenicidade para que possam ser administrados repetidamente ao corpo humano.

Referências

[0213] Arming, S., Strobl, B., Wechselberger, C., and Kreil, G. (1997). In vitro mutagenesis of PH-20 hyaluronidase from human sperm. Eur J Biochem 247, 810-814.

[0214] Bookbinder, L.H., Hofer, A., Haller, M.F., Zepeda, M.L., Keller, G.A., Lim, J.E., Edgington, T.S., Shepard, H.M., Patton, J.S., and Frost, G.I. (2006). A recombinant human enzyme for enhanced interstitial transport of therapeutics. J Control Release 114, 230-241.

[0215] Chao, K.L., Muthukumar, L., and Herzberg, O. (2007). Structure of human hyaluronidase-1, a hyaluronan hydrolyzing enzyme involved in tumor growth and angiogenesis. Biochemistry 46, 6911-6920.

[0216] Frost, G.I. (2007). Recombinant human hyaluronidase (rHuPH20): an enabling platform for subcutaneous drug and fluid administration. Expert Opin Drug Deliv 4, 427-440.

Lista de Sequência (Texto livre)

[0217] O arquivo eletrônico anexado.

Claims (27)

REIVINDICAÇÕES EMENDADAS

1. Variante de PH20 ou fragmento do mesmo caracterizada por compreender uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionados do grupo que consiste em T341A, T341C, T341G, S343E, M345T, K349E, L353A, L354I, N356E e I361T em PH20 tipo selvagem tendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1.

2. Variante de PH20 ou fragmento do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T341A, T341C, L354I e N356E.

3. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos na região correspondente a uma região de alfa-hélice e/ou sua região ligante em PH20 de tipo selvagem tendo a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

4. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pela região de alfa-hélice ser uma região de alfa-hélice 8 (S347 a C381) e sua região ligante ser uma região ligante (A333 a R346) entre a alfa-hélice 7 e alfa- hélice 8.

5. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela região correspondente à região de alfa-hélice e sua região ligante ser T341 a N363, T341 a I361, L342 a I361, S343 a I361, I344 a I361, M345 a I361, ou M345 a N363.

6. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pela região de alfa-hélice 8 (S347 a C381) e/ou a região ligante (A333 a R346) entre alfa-

hélice 7 e alfa-hélice 8 serem substituídas por um ou mais resíduos de aminoácidos da região correspondente de Hyal1.

7. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender as substituições de resíduo de aminoácido de L354I e/ou N356E, e compreender ainda uma substituição de resíduo de aminoácido em uma ou mais posições selecionadas do grupo que consiste em T341, L342, S343, I344, M345, S347, M348, K349, L352, L353, D355, E359, I361 e N363.

8. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender substituições de resíduos de aminoácidos de L354I e/ou N356E, e compreender ainda uma ou mais substituições de resíduos de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em T341A, T341C, T341D, T341G, T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, D355K, E359D, I361T e N363G.

9. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T.

10. Variante PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por compreender M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T.

11. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por compreender qualquer substituição de resíduo de aminoácido selecionada a partir dos seguintes grupos de substituição de resíduo de aminoácido: (a) T341S, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (b) L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T;

(c) M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D, I361T e N363G; (d) T341G, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (e) T341A, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (f) T341C, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (g) T341D, L342W, S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; (h) I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T; e (i) S343E, I344N, M345T, S347T, M348K, K349E, L352Q, L353A, L354I, D355K, N356E, E359D e I361T.

12. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada por um ou mais dos resíduos de aminoácidos N-terminal ou C-terminal serem deletados.

13. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de a clivagem ocorrer antes de um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em M1 a P42 no N-terminal, de modo que um ou mais resíduos de aminoácido no N-terminal sejam deletados.

14. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 13, caracterizada pelo fato de que a clivagem ocorre antes de um resíduo de aminoácido L36, N37, F38, R39, A40, P41 ou P42 no N-terminal, de modo que um ou mais resíduos de aminoácido no N-terminal são deletados.

15. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de a clivagem ocorrer após um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em V455 a L509 no C-terminal, de modo que um ou mais resíduos de aminoácidos no C-terminal são deletados.

16. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de a clivagem ocorrer após um resíduo de aminoácido selecionado do grupo que consiste em V455 a S490 no C-terminal, de modo que um ou mais resíduos de aminoácidos no C-terminal são deletados.

17. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 16, caracterizada pelo fato de a clivagem ocorrer após um resíduo de aminoácido V455, C458, D461, C464, I465, D466, A467, F468, K470, P471, P472, M473, E474, T475, E476, P478, I480, Y482, A484, P486, T488 ou S490 no C-terminal, de modo que um ou mais resíduos de aminoácidos no C-terminal sejam deletados.

18. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizada pelo N- terminal compreender um peptídeo de sinal derivado do hormônio de crescimento humano tendo uma sequência de aminoácidos MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA de SEQ ID NO: 3, um peptídeo de sinal derivado de albumina sérica humana tendo uma sequência de aminoácidos MKWVTFISLLFLFSSAYS de SEQ ID NO: 4, ou um peptídeo de sinal derivado de Hyal1 humano tendo uma sequência de aminoácidos MAAHLLPICALFLTLLDMAQG de SEQ ID NO: 5.

19. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizada pela variante de PH20 ou fragmento da mesma ser selecionada a partir do grupo que consiste em sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 60 a 115.

20. Variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com a reivindicação 19, caracterizada por possuir uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 99.

21. Composição para tratamento de câncer caracterizada por compreender a variante de PH20 ou fragmento do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

22. Composição para tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pela composição ser usada para tratamento combinado com outras drogas anticancerígenas.

23. Composição para o tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 22, caracterizada pelas outras drogas anticancerígeno serem agentes imuno-oncológicos.

24. Composição para o tratamento de câncer, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelos agentes imuno-oncológicos serem inibidores de ponto de verificação imunológico.

25. Ácido nucleico caracterizado por codificar a variante de PH20 ou fragmento da mesma, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20.

26. Vetor de expressão recombinante caracterizado por compreender o ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 25.

27. Célula hospedeira caracterizada por ser transformada com o vetor de expressão recombinante, de acordo com a reivindicação

26.