KR102621518B1 - 중성 pH에서 활성을 나타내는 히알루로니다제 Hyal1변이체 - Google Patents
중성 pH에서 활성을 나타내는 히알루로니다제 Hyal1변이체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 촉매 아미노산으로 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하는 야생형 인간 히알루로니다제 Hyal1 기준으로, 촉매 아미노산과 인접한 아미노산 중 하나 이상이 산성 또는 극성 아미노산으로 치환된 Hyal1 변이체, Hyal1 변이체를 제조하는 방법, Hyal1 변이체 제조에 적용할 수 있는 핵산, 발현벡터 및 숙주세포와 Hyal1 변이체의 제제 내지 용도를 제공한다.
본 발명의 히알루로니다제 Hyal1 변이체는 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있어 활용성이 높다는 효과를 갖는다.
본 발명의 히알루로니다제 Hyal1 변이체는 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있어 활용성이 높다는 효과를 갖는다.
Description
본 발명은 인간 히알루로니다제의 작용 pH를 변경시키는 기술로 구체적으로는 산성~중성의 pH 범위에서 촉매 작용을 하는 인간 히알루로니다제 Hyal1의 변이체에 관한 것이다.
히알루로니다제(hyaluronidase)는 히알루론산을 가수분해하는 효소로, 인간에게 존재하는 히알루로니다제에는 Hyal1, Hyal2, Hyal3, Hyal4 및 PH20이 포함된다.
히알루로니다제 PH20은 세포외기질의 히알루론산을 가수분해하는 특성으로 인해 임상에서 항체치료제의 피하주사 제형에 사용되어, 피하로의 약물전달을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 현재 히알루론산의 가수분해는 PH20 한 종류의 효소에 의존하고 있다. 즉, PH20 이외의 인간 히알루로니다제 중 Hyal1은 pH 3~4의 산성조건에서 주로 촉매작용을 하므로, 활용에 제한이 있다. 예를 들어, pH 7.0 내지 7.5의 중성을 나타내는 피하부위에 Hyal1 적용시, 히알루론산 분해 효과를 기대하기 어렵기 때문이다. 그 외 야생의 Hyal2, Hyal3, Hyal4 등도 중성 영역에서 활성이 약하기 때문에 실제 사용되지 못하고 있다.
따라서 본 발명자는 이와 같은 야생형 인간 Hyal1의 활용성을 개선하기 위해 연구한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
Pace CN, Grimsley GR, Scholtz JM. Protein ionizable groups: pK values and their contribution to protein stability and solubility. J Biol Chem. 2009;284(20):13285-13289.
Reitinger S, Mullegger J, Greiderer B, Nielsen JE, Lepperdinger G. Designed human serum hyaluronidase 1 variant, HYAL1DeltaL, exhibits activity up to pH 5.9. J Biol Chem. 2009;284(29):19173-19177.
본 발명이 해결하고자 하는 과제는 중성 pH에서 히알루론산을 효과적으로 가수분해할 수 있는 인간 Hyal1의 변이체를 제공하는 것이다.
본 발명의 인간 히알루로니다제 Hyal1 변이체는 촉매 아미노산으로 Asp129와 Glu131을 가진다. 본 발명은 Hyal1이 중성 pH에서도 촉매 작용을 할 수 있도록 Hyal1의 1차구조 또는 3차구조에서 상기 촉매 아미노산과 인접한 아미노산을 산성 또는 극성 아미노산으로 치환한다.
또한 Hyal1의 3차구조에서 상기 촉매 아미노산과 인접한 아미노산 중 어느 하나가 염기성 아미노산으로 치환된다. 이때 치환된 상기 염기성 아미노산은 촉매 아미노산에 인접한 산성 또는 극성 아미노산과 이온결합을 할 수 있다.
Hyal1의 촉매 아미노산과 1차구조 또는 3차구조에서 인접한 아미노산은 Ala132 또는 Ser76~Leu98의 아미노산으로 구성된 루프에 위치한 아미노산이거나 또는 Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산의 활성에 영향을 줄 수 있는 산성 또는 극성 아미노산과 이웃한 아미노산이다.
Ala132는 산성 또는 극성 아미노산으로 치환될 수 있다. 이때, 산성 아미노산은 Asp 또는 Glu이고, 극성 아미노산은 Ser, Thr, Asn, Gln, 또는 Tyr이다. Ser76~Leu98의 아미노산으로 구성된 루프에서 촉매 아미노산과 3차구조에서 인접한 아미노산은 Ser, Thr, 또는 Pro이며, 이들 아미노산을 Asp 또는 Glu로 치환한다.
한편, Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산의 활성에 영향을 줄 수 있는 또다른 인접한 아미노산은 산성 아미노산 Asp206과 극성 아미노산 Tyr210이다. Asp206 또는 Tyr210과 이웃한 아미노산을 염기성 아미노산 Arg, Lys 또는 His으로 치환한다.
예를 들면 Tyr210에 이웃한 Phe139를 염기성 아미노산 Arg로 치환하면 Arg139와 Tyr210 사이에 이온결합이 형성된다. 마찬가지로 Asp206에 이웃한 Tyr210을 염기성 아미노산 His로 치환하면 Asp206과 His210 사이에 이온결합이 형성된다. 그 결과로 촉매 아미노산이 중성 pH에서도 히알루론산을 가수분해할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 Hyal1 변이체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 히알루론산 분해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 약물전달제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 정맥 주사용 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 피하 투여용 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 안과용 제제를 제공한다.
본 발명의 히알루로니다제 Hyal1 변이체는 산성 pH 뿐만 아니라 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있어, 활용성이 높다는 효과를 갖는다. 즉, 본 발명의 히알루로니다제로 중성 pH에서도 히알루론산 분해 및 그를 이용한 약물전달이 가능하며, 피하 투여용 제제, 정맥주사용 제제, 안과용 제제와 같은 다양한 제제 내지 용도로도 활용될 수 있다. 또한, 본 발명의 핵산, 발현벡터, 숙주세포, 및 방법에 의해, 본 발명의 히알루로니다제를 효과적으로 제조할 수 있다.
도 1(A)는 pH에 따라 Hyal1 야생형과 Ala132 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 조사한 실험결과이다.
도 1(B)는 Hyal1 야생형과 Ala132 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 2(A)는 pH에 따라 Hyal1 야생형과 Ser77, Thr86 또는 Pro87 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 확인한 실험결과이다.
도 2(B)는 Hyal1 야생형과 Ser77, Thr86 또는 Pro87 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 3(A)는 pH에 따라 Ala132, Ser77 또는 Thr86 중에서 두 개 이상 함께 치환한 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 조사한 실험결과이다.
도 3(B)는 Ala132, Ser77 또는 Thr86 중에서 두 개 이상 함께 치환한 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 4는 인간 Hyal1과 인간 PH20의 효소 활성부위 구조를 비교한 것이다.
도 5(A)는 pH에 따라 Hyal1 야생형과 Phe139, Tyr210 또는 Phe139/Ile225 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 조사한 실험결과이다.
도 5(B)는 Hyal1 야생형과 Phe139, Tyr210 또는 Phe139/Ile225 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 5(C)는 Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산과 인접한 Phe139, Asp206, Tyr210 및 Ile225의 위치를 나타낸 것이다.
도 1(B)는 Hyal1 야생형과 Ala132 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 2(A)는 pH에 따라 Hyal1 야생형과 Ser77, Thr86 또는 Pro87 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 확인한 실험결과이다.
도 2(B)는 Hyal1 야생형과 Ser77, Thr86 또는 Pro87 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 3(A)는 pH에 따라 Ala132, Ser77 또는 Thr86 중에서 두 개 이상 함께 치환한 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 조사한 실험결과이다.
도 3(B)는 Ala132, Ser77 또는 Thr86 중에서 두 개 이상 함께 치환한 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 4는 인간 Hyal1과 인간 PH20의 효소 활성부위 구조를 비교한 것이다.
도 5(A)는 pH에 따라 Hyal1 야생형과 Phe139, Tyr210 또는 Phe139/Ile225 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 조사한 실험결과이다.
도 5(B)는 Hyal1 야생형과 Phe139, Tyr210 또는 Phe139/Ile225 변이체의 CHO-K1 세포에서 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다.
도 5(C)는 Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산과 인접한 Phe139, Asp206, Tyr210 및 Ile225의 위치를 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 "및/또는"은 언급된 구성요소의 각각 및 하나 이상의 모든 조합을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다. 명세서에서 사용되는 "포함한다(comprises)" 및/또는 "포함하는(comprising)"은 언급된 구성요소는 하나 이상의 다른 구성요소의 존재 또는 추가를 배제하지 않는다.
본 발명의 일 실시예인 히알루로니다제 Hyal1 변이체(이하 'Hyal1 변이체'라 함)는 촉매 아미노산으로 아스파르트산 (예를 들어 Asp129) 및 글루탐산 (예를 들어 Glu131)을 포함하는 야생형 인간 Hyal1 기준으로, 상기 촉매 아미노산과 1차구조 또는 3차구조에서 인접한 아미노산 중 하나 이상이 산성 또는 극성 아미노산으로 치환되는 것을 가리킨다.
본 발명의 또 다른 실시예인 Hyal1 변이체는 야생 Hyal1의 3차구조에서 상기 촉매 아미노산과 인접한 아미노산 중 어느 하나가 염기성 아미노산으로 치환된다. 이때 치환된 상기 염기성 아미노산은 촉매 아미노산에 인접한 산성 또는 극성 아미노산과 이온결합 할 수 있다.
즉, 본 발명의 일 실시예인 히알루로니다제 Hyal1 변이체는 야생형 인간 Hyal1의 변이체에 해당하며, 촉매 아미노산과 1차구조 또는 3차구조에서 인접한 아미노산을 특정한 산성 아미노산 또는 극성 아미노산으로 치환하거나, 상기 촉매 아미노산과 3차구조에서 인접한 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환함으로써, 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있어, 활용성을 높일 수 있다.
본 명세서에서 "Ala132" 또는 “A132”와 같이 3글자 또는 1글자의 아미노산 이름과 숫자가 함께 기재된 표현은 서열번호 1의 아미노산 서열 기준으로 각 위치의 아미노산을 의미한다. 예를 들어, "Ala132"와 “A132”는 서열번호 1의 아미노산 서열 기준으로, 132번째 위치하는 아미노산인 Ala을 나타낸다. 또한, 본 명세서에서 야생형 인간 히알루로니다제의 변이체는 특정 아미노산 위치에서, 아미노산이 보존적으로 치환된 변이체도 포함하는 의미이다. 이 때, "보존적 치환"이란 1개 이상의 아미노산을 해당 변이체의 생물학적 또는 생화학적 기능의 손실을 야기하지 않는 유사한 생물학적 또는 생화학적 특성을 갖는 아미노산으로 치환하는 것을 포함하는 변이체의 변형을 의미한다. 구체적으로, "보존적으로 치환된 변이체"는 서열번호 2 내지 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열로 이루어진 Hyal1 변이체와 예를 들어 80% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 더 바람직하게는 99% 이상의 서열 상동성을 가지며, 실질적으로 동일한 기능 및/또는 효과를 갖는 변이체일 수 있다.
본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 산성~중성의 넓은 pH 범위에서 히알루론산을 분해할 수 있는 히알루로니다제에 해당한다. 본 발명의 일 실시예인 히알루로니다제에 있어, 야생형 인간 히알루로니다제는 Hyal1이고, Hyal1은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지며, S77D, S77E, T86D, T86E, P87E, A132D, A132E, F139R, Y210H 및 F139R/I225D로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예인 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 야생형 Hyal1 기준으로, S77D, S77E, T86D, T86E, P87E, A132D, A132E, F139R, Y210H 및 F139R/I225D로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함할 수 있다.
여기에서 S77D의 의미는 서열번호 1의 77번째 세린이 아스파르트산으로 치환된 것임을 의미한다.
Hyal1 변이체는 야생형 인간 Hyal1의 서열에서 일부 아미노산의 변이, 구체적으로 아미노산이 치환된 것으로, S77D, S77E, T86D, T86E, P87E, A132D, A132E, F139R, Y210H 및 F139R/I225D로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는 것이다. 여기서 F139R/I225D의 치환의 의미는 F139R과 I225D의 아미노산 치환이 함께 이루어진 것을 의미한다.
야생형 인간 Hyal1의 아미노산 서열은 아래 표 1에 나타낸 바와 같다. 표 1에 기재된 서열에서와 같이, Ala132는 촉매 아미노산인 Asp129와 Glu131에 인접하여 위치한다. 이와 같이 촉매 아미노산과 인접한 아미노산을 특정 아미노산으로 치환시킨 Hyal1 변이체는 히알루론산 가수분해 효소 활성은 유지한 상태로, 야생형과는 다른 특성을 나타내는 것으로 보인다. 즉, 실험예로부터 확인되는 바와 같이, Ala132를 Asp 또는 Glu로 치환하면 중성 pH에서도 히알루론산을 가수분해할 수 있다.
즉, 야생형 인간 Hyal1의 아미노산 서열 기준으로 132번째 아미노산인 Ala을 Asp 또는 Glu로 치환함으로써 중성 pH에서도 히알루론산을 가수분해할 수 있다. 그러나, Ala132를 다른 유사 아미노산으로 치환한 Hyal1 변이체는 그와 같은 효과를 나타내지는 못하였다. 따라서, 특히 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체에 의할 때, 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있음을 알 수 있다.
또한, Ser77은 Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산과 인접하여 위치하며, Ser77을 Asp 또는 Glu로 치환하면 중성 pH에서 히알루론산을 가수분해할 수 있다. 즉, 야생형 인간 Hyal1의 아미노산 서열 기준으로 77번째 아미노산인 Ser을 Asp 또는 Glu로 치환함으로써 중성 pH에서도 히알루론산을 가수분해할 수 있다.
또한, Thr86과 Pro87은 Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산과 인접하여 위치하며, Thr86을 Asp 또는 Glu로 치환하거나 Pro87을 Glu로 치환하면 역시 중성 pH에서 히알루론산을 가수분해할 수 있다. 즉, 야생형 인간 Hyal1의 아미노산 서열 기준으로 86, 87번째 아미노산인 Thr과 Pro을 Asp 또는 Glu로 치환함으로써 중성 pH에서도 히알루론산을 가수분해할 수 있다.
한편, Asp206과 Tyr210은 Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산과 인접하여 위치한다. 이때, Tyr210과 이웃한 Phe139가 염기성 아미노산으로 치환됨으로써 Tyr210과 이온결합을 할 수 있고, Asp206과 이웃한 Tyr210이 염기성 아미노산으로 치환되었을 때 Asp206과 이온결합을 할 수 있다.
구체적으로, Phe139를 Arg로 치환하면 Arg139와 Tyr210의 이온결합에 의해 Tyr210의 하이드록실기가 탈수소화된 상태로 존재하여 촉매 아미노산 Glu131의 pKa 값을 증가시킬 수 있다. 또한 Phe139와 Ile225를 각각 Arg와 Asp로 함께 치환하면(F139R/I225D), Arg139과 Asp225 사이의 이온결합에 의해 Arg139의 양전하가 안정화되고, Arg139는 다시 Tyr210과 이온결합을 하여 Tyr210의 하이드록실기를 탈수소화 시킬 수 있다.
한편, Tyr210을 His로 치환하면 Asp206과 His210 사이의 이온결합에 의해 Asp206의 pKa 값이 감소하고, 이 결과로 촉매 아미노산 Glu131의 pKa 값을 증가시킬 수 있다.
야생형 Hyal1의 아미노산 서열은 표 1에, Ala132 변이체는 표 2에, 루프 변이체의 아미노산 서열은 표 3에, Ala132 또는 루프 변이체 중에서 한 개 이상 함께 치환한 변이체의 아미노산 서열은 표 4에, 그리고 Phe139 및 Tyr210 변이체의 아미노산 서열은 표 5에 각각 기재하였다.
| 야생형 인간 Hyal1 | 서열 번호 |
아미노산 서열 |
| 1 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| 변이체 | 서열 번호 |
아미노산 서열 |
| A132E | 2 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE E WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| A132N | 3 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE N WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| A132D | 4 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE D WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| A132Y | 5 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE Y WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| A132S | 6 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE S WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| A132H | 7 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE H WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| 변이체 | 서열번호 | 아미노산 서열 |
| S77D | 8 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYS D QLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| S77E | 9 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYS E QLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| T86D | 10 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYY D PTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| T86E | 11 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYY E PTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| P87E | 12 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYT E TGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| 변이체 | 서열 번호 |
아미노산 서열 |
| S77D/A132E | 13 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYS D QLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE E WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| S77E/A132E | 14 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYS E QLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE E WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| S77D/T86D | 15 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYS D QLGTYPYY D PTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| S77D/T86E | 16 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYS D QLGTYPYY E PTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| S77D/T86D/ A132E |
17 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYS D QLGTYPYY D PTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWE E WRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| 변이체 | 서열 번호 |
아미노산 서열 |
| F139R | 18 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWA R NWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| Y210H | 19 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWAFNWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYN H DFLSPNYTGQCPSGIRAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
| F139R/I225D | 20 | MAAHLLPICALFLTLLDMAQGFRGPLLPNRPFTTVWNANTQWCLERHGVDVDVSVFDVVANPGQTFRGPDMTIFYSSQLGTYPYYTPTGEPVFGGLPQNASLIAHLARTFQDILAAIPAPDFSGLAVIDWEAWRPRWA R NWDTKDIYRQRSRALVQAQHPDWPAPQVEAVAQDQFQGAARAWMAGTLQLGRALRPRGLWGFYGFPDCYNYDFLSPNYTGQCPSG D RAQNDQLGWLWGQSRALYPSIYMPAVLEGTGKSQMYVQHRVAEAFRVAVAAGDPNLPVLPYVQIFYDTTNHFLPLDELEHSLGESAAQGAAGVVLWVSWENTRTKESCQAIKEYMDTTLGPFILNVTSGALLCSQALCSGHGRCVRRTSHPKALLLLNPASFSIQLTPGGGPLSLRGALSLEDQAQMAVEFKCRCYPGWQAPWCERKSMW |
이와 같은 Hyal1 변이체는 산성~중성의 넓은 pH 범위에서 히알루론산 분해가 가능하다. 또한, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 산성~중성의 pH 범위에서 히알루론산 분해가 가능하므로, 약물을 효과적으로 다양한 부위에 전달하는 것도 가능하다. 세포외기질의 히알루론산이 가수분해되면, 히알루론산의 점성이 감소되고 조직(피부)으로의 투과성이 증가되기 때문이다. 특히, 피부의 피하 부위는 pH가 대략 7.0 내지 7.5인 중성이므로, 중성 pH에서 히알루론산을 분해할 수 있는 본 발명의 일 실시예에 의해 투과성을 증가시킬 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예인 약물전달제는 본 발명의 일 실시예인 변이체를 포함하여, 다양한 부위에 약물을 효과적으로 전달할 수 있다.
이 때, 약물은 약물학적 활성을 나타내는 성분으로, 이로써 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 안구이완제, 마취제, 항체치료제, 항암제 등일 수 있다. 약물은 본 발명의 일 실시예인 변이체와 함께 조성물로 이루어질 수도 있다. 즉, 본 발명의 일 실시예인 변이체는 그 자체 또는 약물과 함께 약학조성물 형태일 수도 있다.
본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 다양한 부위에 적용될 수 있는 제제에 포함될 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 실시예인 피하 투여용 제제, 정맥주사용 제제, 또는 안과용 제제는 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 포함할 수 있다. 이 때, 안과용 제제는 점안제일 수 있으며, 점안제는 안과수술시 마취제의 확산 촉진을 위한 것일 수 있다. 또한, 피하 투여용 제제는 구체적으로 피하 투여용 주사제일 수 있다. 피하 투여용 주사제는 필러 시술 시 히알루론산 가수분해를 위한 것일 수 있다. 또한, 정맥주사용 제제는 항암제의 종양세포 접근성을 높이기 위한 것일 수 있다. 정맥주사용 제제는 혈액을 따라 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 이동시켜 종양세포 표면에 과발현된 히알루론산을 가수분해하여 항암제의 종양세포 접근성을 높일 수 있기 때문이다. 이와 같이, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 치료 목적 외에 미용 목적으로도 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예인 제제는 약제학적 제제 및/또는 화장품 제제일 수 있다.
본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체의 투여량은 피하주사 투여 시 1회당 10 ng/ml ~ 10 mg/ml이며, 바람직하게는 10 ng/ml ~ 100 μg/ml이다. 1일 1회 또는 수회로 나누어 투여도 가능하며, 이와 같은 투여량은 성인(체중 60 kg) 기준일 수 있으나, 체중, 신체 상태 등에 달라질 수 있음은 당연하다. 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 주로 비경구적인 방법으로, 예를 들면 피하주사 또는 정맥주사에 의한 투여, 또는 점안에 의한 투여로 투여한다.
본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 약학적으로 허용되는 첨가제와 함께 제제화하여 주사제, 점안제, 경피투여용 패치제 등의 형태로 제조할 수도 있다.
약학적으로 허용되는 첨가제는 당업자에게 잘 알려진 여러 가지 인자에 따라 적용될 수 있는데, 예를 들면 이용된 특정 생리활성물질, 이의 농도, 안정성 및 의도된 생체이용성; 치료하고자 하는 질환 및 질병 또는 상태; 치료받을 개체, 나이, 크기 및 일반적인 상태; 예를 들어 비강, 구강, 안구, 국소, 경피 및 근육 등의 요인을 고려해야 하나, 이에 제한되지는 않는다. 일반적으로 경구 투여 경로 이외의 생리활성물질 투여에 이용되는 약제학적으로 이용가능한 첨가제에는 D5W (물 중에서 5% 포도당), 덱스트로즈 및 생리학적 염을 용적의 5% 이내로 포함하는 수용액 등을 포함하며, 국소주사의 경우 효과를 증진시키고 지속시간을 증가시키기 위하여 여러 가지 주사가능한 하이드로겔(hydrogel)을 사용할 수 있다. 또한 약학적으로 이용가능한 첨가제는 보존제 및 항산화제와 같은 활성 성분들의 안정성을 보강시킬 수 있는 추가 성분들을 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예인 변이체는 해당분야의 적절한 방법으로 제제화할 수 있으며, 각 질환이나 상태에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 생리 식염수 용액으로 보관할 수 있고, 만니톨 또는 소르비톨의 첨가 후 앰플(ample)에 동결 건조시킬 수 있으며, 이것을 투여하기 위해 사용할 때는 생리 식염수 등에 용해시킬 수 있다. 이 때, 생리 식염수 용액에 완충제, 안정화제 및/또는 계면활성제가 포함될 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예인 히알루론산 분해 및/또는 약물전달법은 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 투여를 필요로 하는 인간을 포함한 포유류에게 투여하는 단계를 포함한다. 이 때, 투여되는 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 유효량의 변이체일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예인 용도는 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체의 히알루론산 분해제제 또는 약물전달제제 제조를 위한 용도이다.
본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 유전자 조작 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어 유전자 조작을 통하여 융합파트너와 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체 단백질로 된 융합 단백질을 코딩하는 융합 유전자를 제조하고 그것으로 숙주세포에 형질전환시킨 후 숙주세포에서 융합 단백질 형태로 발현시킨 후 단백질 분해효소 또는 화합물을 이용하여 융합 단백질로부터 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 절단, 분리하여 원하는 단백질 형태로 생산할 수 있다. 따라서, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 본 발명의 일 실시예인 핵산, 발현벡터, 숙주세포 및/또는 방법에 의해, 효과적으로 제조될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예인 핵산은 본 발명의 일 실시예인 변이체를 코딩한다. 핵산은 세포, 세포 용해물(lysate) 중에 존재하거나, 또는 부분적으로 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수도 있다. 핵산은 예를 들어 DNA 또는 RNA일 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예인 발현벡터는 본 발명의 일 실시예인 핵산을 포함한다. 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체의 발현을 위하여, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 코딩하는 DNA를 분자 생물학 기술(예, PCR 증폭, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 발현하는 하이브리도마를 이용한 cDNA 클로닝)로 얻을 수 있으며, 그와 같은 DNA를 전사 및 번역 제어 서열에 작동되도록 결합시켜 발현 벡터 내로 삽입하여, 본 발명의 일 실시예인 발현벡터를 제조할 수 있다. 이 때, "작동되도록 결합"은 벡터 내의 전사 및 번역 제어 서열이 본 발명의 일 실시예인Hyal1 변이체를 코딩하는 유전자의 전사 및 번역을 조절하는 의도된 기능을 하도록 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 코딩하는 유전자가 벡터 내로 라이게이션 된다는 것을 의미할 수 있다. 발현 벡터 및 발현 제어 서열은 사용되는 발현용 숙주세포와 적합하도록 선택된다. 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 코딩하는 유전자는 표준 방법(예, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 코딩하는 유전자 단편 및 벡터 상의 상보성 제한 효소 부위의 라이게이션, 또는 제한 효소 부위가 전혀 존재하지 않을 경우 블런트(blunt) 말단 라이게이션)으로 발현 벡터 내로 삽입된다. 재조합 발현 벡터는 숙주세포에서 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 코딩하는 유전자의 발현을 제어하는 조절서열을 지닌다. "조절서열"은 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 코딩하는 유전자의 전사 또는 번역을 제어하는 프로모터, 인핸서 및 기타 발현 제어 요소(예를 들어 폴리아데닐화 신호)를 포함할 수 있다. 이 때, 형질전환시킬 숙주세포의 선택, 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자에 따라 조절 서열을 달리 선택하여, 발현 벡터의 디자인이 달라질 수 있음은 물론이다.
또한, 본 발명의 일 실시예인 숙주세포는 본 발명의 일 실시예인 핵산 또는 본 발명의 일 실시예인 발현벡터를 포함할 수 있다. 숙주 세포는 이로써 한정되는 것은 아니나, 예를 들어, 동물세포, 식물세포, 효모, 대장균 및 곤충세포로 구성된 군에서 선택될 수 있다.
핵산 또는 발현벡터는 숙주세포에 형질주입 또는 트랜스펙션(transfection)된다. "형질주입" 또는 "트랜스펙션"시키기 위해 원핵 또는 진핵 숙주세포 내로 외인성 핵산(DNA 또는 RNA)을 도입하는 데에 통상 사용되는 여러 종류의 다양한 기술, 예를 들어 전기 영동법, 인산칼슘 침전법, DEAE-덱스트란 트랜스펙션 또는 리포펙션(lipofection) 등을 사용할 수 있다. 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 발현시키기 위해 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 진핵숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 대장균(Escherichia coli)에서 얻어지는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μm 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL941이다.
또한, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체의 제조방법은 본 발명의 일 실시예인 숙주세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체를 발현할 수 있는 재조합 발현 벡터가 포유류 숙주세포 내로 도입될 경우, 본 발명의 일 실시예인 변이체는 숙주세포에서 발현되기에 충분한 기간 동안, 보다 바람직하게는 숙주세포가 배양되는 배양 배지 내로 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체가 분비되게 하기에 충분한 기간 동안 숙주세포를 배양함으로써 제조될 수 있다.
필요시, 발현된 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체는 숙주세포로부터 분리하여 균일하도록 정제할 수 있다. 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체의 분리 또는 정제는 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제 방법, 예를 들어 크로마토그래피에 의해 수행될 수 있다. 크로마토그래피는 예를 들어, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피 또는 소수성 크로마토그래피에서 선택된 하나 이상의 조합일 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다. 크로마토그래피 이외에, 추가로 여과, 초여과, 염석, 투석 등을 조합하여 사용할 수도 있다.
별도의 언급이 없는 한, 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체, 히알루론산 분해제, 약물전달제, 조성물, 용도, 제제, 방법에서 언급된 사항은 서로 모순되지 않는 한 동일성 범위에서 서로 동일하게 적용된다.
이하, 실시예, 비교예, 및 제조예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하나, 하기 실시예 및 제조예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐으로 본 발명의 내용이 하기 실시예나 제조예에 의해 한정되는 것은 아니다.
이하, 실시예 등에서 사용한 시약은 시중에서 구할 수 있는 것으로, 최상품을 사용하였으며, 별도의 언급이 없는 한, Sigma-Aldrich사에서 구입한 것을 사용하였다.
<실시예 1> Hyal1 변이체 제조
인간 Hyal1 유전자(Clone ID: hMU005315)는 한국인간유전자은행에서 구입하였다. pCMV-SPORT6-인간 Hyal1 플라스미드를 이용하여 PCR 방법(바이오니아, AllInOneCycler PCR system)으로 인간 Hyal1 유전자를 증폭하였다. 증폭된 유전자는 pSGHV0 벡터에서 인간 성장호르몬(hGH)과 TEV 단백질분해효소 절단자리를 제거한 벡터(pSGHV1 벡터로 명명)에 제한효소 Xho I과 Not I을 이용하여 삽입하였다. 이 때, Ni2+-컬럼을 이용한 단백질 정제를 위해 Hyal1 cDNA의 3´-말단에 6개 His 잔기의 DNA 서열이 위치하도록 하였다. Hyal1 변이체 역시 PCR 반응기를 이용하여 제작하였고, 제작된 Hyal1 변이체의 DNA 서열은 DNA 시퀀싱 방법으로 확인하였다. PCR에 사용한 프라이머는 표 6에 기재된 바와 같다.
| Hyal1 | 서열 번호 | 프라이머 이름 | DNA 서열 (5'→3') |
| WT | 21 | Hyal1-F | CTCGAGGCCACCATGGCAGCCCACCTGCTTCC (XhoI site underlined) |
| 22 | Hyal1-R | GCGGCCGCTCAGTGGTGATGGTGATGATGCCACATGC (NotI site underlined) |
|
| S77D | 23 | S77D-F | CAATTTTCTATAGCGACCAGCT |
| 24 | S77D-R | AGCTGGTCGCTATAGAAAATTG | |
| S77E | 25 | S77E-F | CTATAGCGAGCAGCTGGG |
| 26 | S77E-R | CCCAGCTGCTCGCTAT | |
| T86D | 27 | T86D-F | CTACCCCTACTACGATCCCAC |
| 28 | T86D-R | CCCCAGTGGGATCGTAGTAG | |
| T86E | 29 | T86E-F | CTACCCCTACTACGAGCCCAC |
| 30 | T86E-R | CCCCAGTGGGCTCGTAGTAG | |
| P87E | 31 | P87E-F | CCCTACTACACGGAAACTGG |
| 32 | P87E-R | GCTCCCCAGTTTCCGTG | |
| A132E | 33 | A132E-F | TGGGAGGAATGGCGCCCAC |
| 34 | A132E-R | GTGGGCGCCATTCCTCCCA | |
| A132N | 35 | A132N-F | TGGGAGAACTGGCGCCCAC |
| 36 | A132N-R | GTGGGCGCCAGTTCTCCCA | |
| A132D | 37 | A132D-F | CATCGACTGGGAGGATTGGCG |
| 38 | A132D-R | CGCCAATCCTCCCAGTCGATG | |
| A132Y | 39 | A132Y-F | CATCGACTGGGAGTATTGGCGC |
| 40 | A132Y-R | GCGCCAATACTCCCAGTCGATG | |
| A132S | 41 | A132S-F | CATCGACTGGGAGAGTTGGCG |
| 42 | A132S-R | CGCCAACTCTCCCAGTCGATG | |
| A132H | 43 | A132H-F | CATCGACTGGGAGCATTGGCG |
| 44 | A132H-R | CGCCAATGCTCCCAGTCGATG | |
| F139R | 45 | F139R-F | CACGCTGGGCCAGAAACTGG |
| 46 | F139R-R | GGTGTCCCAGTTTCTGGCCCA | |
| Y210H | 47 | Y210H-F | CCTGACTGCTACAACCATGAC |
| 48 | Y210H-R | GCTTAGAAAGTCATGGTTGTAGC | |
| I225D | 49 | I225D-F | GCCCATCAGGCGACCGTGC |
| 50 | I225D-R | GTCATTTTGGGCACGGTCGCCTG |
<실시예 2> Hyal1 Ala132 변이체의 효소활성 및 발현 확인
실시예 1에서 제조된 Hyal1 야생형 또는 변이체의 유전자가 삽입된 플라스미드로 polyethylenimine (PEI, Sigma-Aldrich) 또는 Lipofectamine 3000 (Thermofisher) 시약을 이용하여 CHO-K1 세포(한국세포주은행에서 구입)를 형질전환하였다. CHO-K1 세포가 6-well plate에서 면적 대비 90~95% 자랐을 때 2 μg의 플라스미드 DNA가 포함된 150 μL의 DMEM 배지와 6 μg의 PEI가 포함된 150 μL의 DMEM 배지를 혼합한다. 30분 후, PEI-DNA 혼합물을 6-well plate로 조심스럽게 옮기고 5% CO2 배양기에서 배양한다.
형질전환 48시간 후, 세포배양액을 회수하고 10,000 Х g에서 원심분리하여 상층액을 얻었다. Hyal1 야생형과 변이체의 효소활성을 substrate-gel assay 방법으로 측정하였다. 구체적으로, 히알루론산(1.0 mg/mL)이 포함된 10% SDS gel을 이용하여 전기영동한 후, 4 ℃에서 2시간 동안 Triton X-100가 포함된 버퍼(3% Triton X-100, 50 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 7.5)을 이용하여 SDS를 제거하였다. 100 mM NaCl을 포함하고, disodium phosphate와 monosodium phosphate를 이용하여 pH를 4, 5, 6, 및 7로 조정한 인산 버퍼를 각각 제조하였다. 각 SDS gel을 pH 4~7의 인산 버퍼에 넣고 37 ℃에서 50 rpm으로 진탕하면서 4~17시간 동안 효소반응을 진행하였다. 효소반응 후, 1.0% Alcian blue 염색약으로 SDS gel의 히알루론산을 염색하였다. 본 발명은 중성 pH에서 Hya1 변이체의 효소활성을 조사하는 것이 목적이므로, pH 4를 대조군으로 하고 pH 6과 pH 7에서의 효소활성을 조사하였다.
도 1(A)는 pH에 따라 Hyal1 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 확인한 실험결과이다. Substrate-gel assay 방법으로 Hyal1 변이체에 의해 가수분해된 히알루론산은 Alcian blue에 의해 염색되지 않으므로 흰색의 밴드로 나타난다. 도 1(A)에서, Control은 벡터만 transfection한 대조군을 나타내고, WT는 야생형 Hyal1을 나타내며, A132E, A132N, A132D, A132Y, A132S, 및 A132H은 각각의 Hyal1 변이체를 나타낸다.
도 1(A)에 나타난 바와 같이 pH 4에서는 A132Y를 제외한 변이체들이 모두 히알루론산을 가수분해하여 효소활성을 나타내었지만, pH 6에서는 A132E, A132D 및 A132H 변이체가 효소활성을 나타내었고, pH 7에서는 A132E와 A132D만 효소활성을 나타내었다. 이들 Hyal1 변이체 중에서 A132E가 pH 7에서 가장 높은 효소활성을 나타내었다. 극성 아미노산으로 치환한 A132N과 A132S는 pH 4에서는 야생형보다 효소활성이 높았지만, pH 6에서 A132S만 일부 효소활성을 보였다. 염기성 아미노산 His는 pH 6에서 효소활성을 보였지만 pH 7에서는 효소활성을 나타내지 않았다.
또한, CHO-K1 세포에서의 단백질 발현을 알아보기 위해 도 1(A)의 실험과 같이 단백질 전기영동 후, Western blotting을 실시하였다. 구체적으로, 10% SDS gel을 nitrocellulose membrane으로 100 V에서 1시간 동안 트랜스퍼한 후, Hyal1 단일클론항체(1D10, Santa Cruze Biotechnology, Dallas, TX, US)와 anti-mouse IgG 이차항체(m-IgGk BP-HRP, Santa Cruze Biotechnology)를 이용하여 Hyal1 야생형과 Ala132 변이체의 발현을 조사하였다. 그 결과를 도 1(B)에 나타내었다. 도 1(B)는 Hyal1 변이체 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다. 도 1(B)에서, Control은 벡터만 transfection한 대조군을 나타내고, WT는 야생형 Hyal1을 나타내며, A132E, A132N, A132D, A132Y, A132S, 및 A132H는 각각의 변이체를 나타낸다. 도 1(B)에서와 같이, WT, A132E, A132N, A132D, A132S 및 A132H 변이체 단백질은 Hyal1 항체로 검출되었지만, A132Y 변이체는 검출되지 않았다. 이와 같은 결과로부터, 도 1(A)에 나타난 A132Y 변이체의 음성 결과는 단백질 미발현에 의한 것임이 추론된다.
본 발명의 Hyal1 변이체는 일반 산-염기 촉매작용(general acid-base catalysis)에 의해 히알루론산을 가수분해한다. 촉매 아미노산 Glu131의 카르복실기(-COOH)는 Hydroxyl leaving group에 대한 양성자 제공 역할을 하므로 Glu131의 양성자화(protonation)는 촉매반응에 중요하다. 도 1(A)의 결과는 촉매 아미노산 Glu131과 3차구조에서 인접한 아미노산을 산성 아미노산으로 치환하면 Glu131의 pKa 값이 증가하여 산성~중성 pH에서 Glu131이 양성자 제공 역할을 할 수 있음을 의미한다. 그러나 같은 산성 아미노산이라도 A132E가 A132D보다 pH 7에서 효소활성이 더 높았다. 따라서, 특히 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체 A132E에 의할 때, 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 3> Hyal1 루프(loop) 변이체의 효소활성 및 발현 확인
제작한 Hyal1 루프 변이체(S77D, S77E, T86D, T86E 및 P87E)의 pH 4~7 구간에서의 효소활성을 조사하기 위해 CHO-K1 세포를 Hyal1 루프 변이체의 유전자가 삽입된 플라스미드로 실시예 1에서 기술한 것과 같이 PEI 또는 Lipofectamaine 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환 48시간 후, 세포배양액을 회수하고 10,000 Х g에서 원심분리하여 상층액을 얻었다. Substrate-gel assay 방법으로 상층액에 포함된 Hyal1 WT과 루프 변이체의 효소활성을 37 ℃, pH 4~7 구간에서 인산버퍼를 이용하여 4~17시간 동안 효소반응을 시키고, 가수분해 된 히알루론산의 양을 1.0% Alcian blue 염색약을 이용하여 조사하였다. 그 결과를 도 2(A)에 나타내었다. 도 2(A)는 pH에 따라 Hyal1 WT과 루프 변이체가 효소활성을 나타내는지 여부를 확인한 실험결과이다. 도 2(A)에서, Control은 벡터만 transfection 된 대조군을 나타내고, WT는 야생형 Hyal1을 나타내며, S77D, S77E, T86D, T86E 및 P87E는 각각의 Hyal1 변이체를 나타낸다.
도 2(A)에 나타난 바와 같이, Hyal1 WT는 pH 4에서 히알루론산을 가수분해하여 효소활성을 나타내었으나, 루프 변이체(S77D, S77E, T86D, T86E 및 P87E)들은 모두 pH 4~7 전 구간에서 효소활성을 나타내었다. 이와 같은 결과로부터, 야생형 인간 Hyal1의 루프 부위의 Ser77, Thr86 및 Pro87을 Asp 또는 Glu로 치환한 Hyal1 변이체는 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있음을 알 수 있다. 특히 본 발명의 일 실시예인 Hyal1 변이체에 의할 때, S77D와 S77E, P87E가 T86D, T86E 변이체보다 pH7에서 효소활성이 높았다. 도 2(B)는 Hyal1 변이체 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다. 도 2(B)에서, Hyal1 WT와 변이체는 정상적으로 CHO-K1 세포에서 발현했음을 알 수 있다.
<실시예 4> Hyal1 Ala132 또는 루프(loop) 아미노산을 치환한 혼합 변이체의 효소활성 및 발현 확인
Ala132 변이체 중에서 가장 활성이 높은 A132E 변이체와 루프 변이체 중 하나 이상을 함께 돌연변이 시켜 pH 4~7 구간에서의 효소활성을 조사하였다. 제작한 Hyal1 변이체(S77D/A132E, S77E/A132E, S77D/T86D, S77D/T86E, 및 S77D/T86D/A132E)의 pH 4~7 구간에서의 효소활성을 조사하기 위해 CHO-K1 세포를 이들 Hyal1 변이체의 유전자가 삽입된 플라스미드로 실시예 1에서 기술한 것과 같이 PEI 또는 Lipofectamaine 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환 48시간 후, 세포배양액을 회수하고 10,000 Х g에서 원심분리하여 상층액을 얻었다. Substrate-gel assay 방법으로 상층액에 포함된 Hyal1 변이체의 효소활성을 37 ℃, pH 4~7 구간에서 인산버퍼를 이용하여 4~17 시간 동안 효소반응을 시키고, 가수분해 된 히알루론산의 양을 1.0% Alcian blue 염색약을 이용하여 조사하였다.
도 3(A)에 나타난 바와 같이, 이중 또는 삼중 변이체는 pH 4 뿐만 아니라 pH 7에서도 히알루론산을 가수분해하여 효소활성을 나타내었다. 특히 pH 7에서는 활성 정도의 차이가 나타났으며 S77D/A132E 변이체가 가장 좋은 활성을 보였다.
도 3(B)는 Hyal1 변이체 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다. 도 3(B)에서, Hyal1 변이체는 정상적으로 CHO-K1 세포에서 발현했음을 알 수 있다.
<실시예 5> 인간 Hyal1과 PH20의 단백질 3차구조 비교
본 발명에서 도입한 Hyal1의 돌연변이 아미노산들을 PH20의 아미노산과 위치를 비교하기 위해 인간 Hyal1과 PH20의 3차구조를 비교하였다. 인간 PH20의 3차구조 모델은 인간 Hyal1의 결정구조(PDB code 2PE4)를 바탕으로 Swiss-Model을 이용해서 제작하였다. PyMol 프로그램을 이용하여 인간 Hyal1과 PH20의 구조를 비교하고 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 도시된 바와 같이, 인간 Hyal1에서 Ser76 및 Ser77, Thr86과 Pro87은 촉매 아미노산 Glu131과 인접한 위치에 있음을 알 수 있다. 인간 PH20의 3차구조 모델에서 Asp94, Asp103, 및 Glu149는 촉매 아미노산 Glu148과 인접한 위치에 있음을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 Hyal1 변이체는 중성 pH에서 효소활성을 가지는 PH20처럼 인간 Hyal1의 3차구조에서 촉매 아미노산과 인접한 아미노산이 산성 아미노산으로 치환되어, 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해하는 효과를 나타낸 것으로 보인다.
<실시예 6> F139R 및 Y210H 변이체의 효소활성 및 발현 확인
Hyal1의 촉매 아미노산 Glu131의 pKa 값을 증가시키는 또다른 방법은 Glu131과 인접한 아미노산을 염기성 아미노산으로 치환하여 이 염기성 아미노산과 이온결합을 형성하는 산성 또는 극성 아미노산의 pKa 값을 감소시키는 것이다. Hyal1의 3차구조에서 Phe139, Asp206, Ile225 및 Tyr210은 촉매 아미노산과 인접하여 위치한다. 소수성 아미노산 Phe139를 Arg로 치환하면 Arg139와 Tyr210 사이의 이온결합에 의해 Tyr210의 pKa 값이 감소하고, 이로 인해 촉매 아미노산 Glu131의 pKa 값을 증가시킬 수 있다. 또한 소수성 아미노산 Phe139와 Ile225를 각각 Arg와 Asp로 치환하면, Arg139와 Asp225 사이의 이온결합에 의해 Arg139의 양전하가 강화되고, 이에 따라 Arg139와 Tyr210 사이의 이온결합에서 F139R 단독 변이체에서 보다 Tyr210의 하이드록실기 탈수소화가 촉진될 수 있다. 또한, 극성 아미노산 Tyr210을 염기성 아미노산 His로 치환하면 Asp206과 His210 사이의 이온결합에 의해 Asp206의 pKa 값이 감소하고, 이 결과로 촉매 아미노산 Glu131의 pKa 값을 증가시킬 수 있다.
제작한 Hyal1 변이체(F139R, F139R/I225D, 및 Y210H))의 pH 4~7 구간에서의 효소활성을 조사하기 위해 CHO-K1 세포를 이들 Hyal1 변이체의 유전자가 삽입된 플라스미드로 실시예 1에서 기술한 것과 같이 PEI 또는 Lipofectamaine 방법을 이용하여 형질전환하였다. 형질전환 48 시간 후, 세포배양액을 회수하고 10,000 Х g에서 원심분리하여 상층액을 얻었다. Substrate-gel assay 방법으로 상층액에 포함된 Hyal1 WT과 변이체의 효소활성을 37 ℃, pH 4~7 구간에서 인산버퍼를 이용하여 4~17 시간 동안 효소반응을 시키고, 가수분해 된 히알루론산의 양을 1.0% Alcian blue 염색약을 이용하여 조사하였다.
도 5(A)에서 Control은 벡터만 transfection 된 대조군을 나타내고, WT는 야생형 Hyal1을 나타내며, F139R, Y210H 및 F139R/I225D는 각각의 Hyal1 변이체를 나타낸다. WT는 pH 4에서만 효소활성을 나타내지만, F139R, Y210H 및 F139R/I225D 변이체는 pH 4와 pH 7에서 효소활성을 나타내었다. F139R/I225D 이중 변이체는 F139R 단독 변이체보다 pH 6에서 활성이 높았지만, pH 7에서는 단독 변이체와 이중 변이체의 효소활성이 유사하였다.
도 5(B)는 Hyal1 변이체의 발현을 확인하기 위한 실험결과를 나타낸다. 도 5(B)에서, Hyal1 변이체는 정상적으로 CHO-K1 세포에서 발현했음을 알 수 있다.
도 5(C)는 상기 아미노산들이 표시된 Hyal1의 3차구조이다. Asp206과 Tyr210은 촉매 아미노산 Glu 131과 인접하게 위치한다.
이상의 결과로부터, 본 발명의 Hyal1 변이체는 산성 pH 뿐만 아니라 중성 pH에서도 히알루론산을 효과적으로 분해할 수 있어, 활용성이 높음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 Hyal1 변이체로 중성 pH에서도 히알루론산 분해가 가능하므로, 그를 이용한 약물전달이 가능하며, 피하 투여용 제제, 정맥주사용 제제, 안과용 제제와 같은 다양한 제제 내지 용도로도 활용될 수 있다.
또한, 이상의 결과로부터, 본 발명의 핵산, 발현벡터, 숙주세포 및 방법에 의해, Hyal1 변이체를 효과적으로 제조할 수 있음을 알 수 있다.
<제조예 1> 액제 제조
실시예 2 내지 6에서 제조한 Hyal1 변이체 단백질 1 μg을 PBS에 용해시켜 용액 1 mL을 만든다. 만들어진 용액은 주사제용 앰플 또는 멸균용기에 충진하여 주사액제 또는 점안제를 제조한다. 이와 같이 제조된 제제는 히알루론산 분해제, 약물전달제 등으로 활용될 수 있다. 특히, 주사액제는 피하 투여용 제제, 또는 정맥주사용 제제로 활용되고, 점안제는 안과용 제제로 활용될 수 있다.
Claims (12)
- 서열번호 1에서 촉매 아미노산 아스파르트산 129 및 글루탐산 131을 포함한 아미노산 서열로 이루어진 야생형 인간 히알루로니다제 Hyal1 기준으로,
상기 촉매 아미노산 글루탐산 131과 1차구조 또는 3차구조에서 인접한 아미노산 중 하나 이상이 산성 아미노산으로 치환되는 것을 특징으로 하는
중성 pH에서 활성을 나타내는 히알루로니다제 Hyal1 변이체. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 히알루로니다제 Hyal1 변이체는 야생형 인간 히알루로니다제 Hyal1을 기준으로 S77D, S77E, T86D, T86E, P87E, A132D, A132E로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 치환을 포함하는
중성 pH에서 활성을 나타내는 히알루로니다제 Hyal1 변이체. - 제1항의 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 코딩하는 핵산.
- 제4항의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
- 제5항의 발현 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 제6항의 숙주세포를 배양하는 단계를 포함하는 히알루로니다제 Hyal1 변이체의 제조방법.
- 제1항의 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 히알루론산 분해제.
- 제1항의 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 약물전달제.
- 제1항의 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 피하 투여용 제제.
- 제1항의 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 정맥주사용 제제.
- 제1항의 히알루로니다제 Hyal1 변이체를 포함하는 안과용 제제.
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