JP2008514227A - ミオスタチンアイソフォーム - Google Patents
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Abstract
Description
X1 I F L E X2 X3 X4 Q X5 C S I L X6 X7 X8 X9 X10
(式中、X1はIまたはLであり、X2はVまたはLであり、X3はY、C、GまたはSであり、X4はIまたはFであり、X5はFまたはLであり、X6はGまたはEであり、X7はEまたはVであり、X8はAまたはTであり、X9はAまたはVであり、およびX10は存在しないか、FまたはLである)
を有するアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを提供する。
(a)配列番号48〜95のいずれか1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド、
(b)(a)のポリペプチドのフラグメントまたは変種を含むポリペプチド、および
(c)(a)のポリペプチドと95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリペプチド
から選択することもできる。
(a)配列番号1から47、または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(b)(a)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
(c)(a)のポリヌクレオチドと95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
(d)(a)から(c)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、および
(e)(a)から(c)のいずれか1つの逆相補鎖
から選択することができる。
(a)プロモーター配列、
(b)本発明によるポリヌクレオチド、および
(c)遺伝子終止配列
を含むことができる。
(a)請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド、
(b)請求項4から6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド、
(c)請求項7から11のいずれか一項に記載のベクター、
(d)(a)の変種のフラグメント、
(e)(b)のいずれか1つの相補鎖、
(f)(b)の逆相補鎖、および
(g)(b)、(e)または(f)のいずれか1つのアンチセンスポリヌクレオチド
のいずれか1つの化合物を含む、筋肉の成長を制御する組成物も提供する。
(a)本発明によるポリペプチド、
(b)本発明によるポリペプチドまたはその相補的配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(c)(i)配列番号1から47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)(i)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
(iii)(i)のポリヌクレオチドに95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
(iv)(i)から(iii)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されたポリヌクレオチド、
(d)(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター、
(e)発現ベクターである、(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター、
(f)作動可能に結合した、プロモーター、(b)または(c)のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター、および
(g)(b)または(c)によるポリペプチド産生物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉の成長を制御する方法も提供する。
(a)本発明によるポリペプチド、
(b)本発明によるポリペプチドまたはその相補的配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(c)(i)配列番号1から47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)(i)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
(iii)(i)のポリヌクレオチドに95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
(iv)(i)から(iii)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されたポリヌクレオチド、
(d)(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター、
(e)発現ベクターである、(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター、
(f)作動可能に結合した、プロモーター、(b)または(c)のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター、および
(g)(b)または(c)によるポリペプチド産生物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉組織に関連する疾患を治療する方法も提供する。
(a)請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列、
(b)(i)配列番号1から47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、
(ii)(i)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド、
(iii)(i)のポリヌクレオチドに95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド、および
(iv)(i)から(iii)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群からなる群から選択されたポリヌクレオチド、
(c)(a)または(b)によるポリペプチド産生物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド、および
(d)干渉RNA分子
からなる群から選択されたポリヌクレオチドに特異的に結合することができる組成物を含む、MSV遺伝子発現の調節因子も提供する。
i)動物から試料を得る工程、
ii)配列番号1から47または96のいずれか1つの配列を有するポリヌクレオチド、配列番号1から47もしくは96に95%、90%、80%もしくは70%の相同性を有するポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種からの遺伝子発現レベルを定量する工程、
iii)遺伝子発現レベルを平均と比較する工程、および
iv)前記動物の筋肉質量を予測する工程
を含む、動物における筋肉質量を予測する方法も提供する。
i)動物から試料を得る工程、
ii)配列番号48から95のいずれか1つの配列を有するポリペプチド、配列番号48から95のいずれか1つに95%、90%、80%もしくは70%の相同性を有するポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種の量を定量する工程、
iii)ポリペプチドの量を平均と比較する工程、および
iv)前記動物の筋肉質量を予測する工程
を含む、動物における筋肉質量を予測する方法も提供する。
i)上記の方法により筋肉質量が増加していると予測される1頭または複数の動物を選択する工程、および
ii)増加した筋肉質量を有するように選択した1頭または複数の動物を繁殖させて、増加した筋肉質量を有する1頭または複数の子孫を作製する工程
を含む、動物の1頭または複数の子孫の筋肉質量を増加させる方法も提供する。
(a)配列番号48から95のいずれか1つの配列、または
(b)配列番号48から95のいずれか1つに95%、90%、80%もしくは70%の配列同一性を有する配列
を有するポリペプチドに優先的に結合する、タンパク質も提供する。
相補鎖:3’GCATAA−5’
逆相補鎖:3’AATACG−5’
ヒツジMSVの新規なC末端配列の生物学的機能を探索するために、65アミノ酸ペプチド(配列番号49)をイー・コリ中で組換えタンパク質として発現させ(組換えヒツジミオスタチンスプライス変種65(roMSV65)と称する)、その機能を筋細胞培養系で試験した。
選択的スプライシングの間に正常ミオスタチンmRNAから切り出されたフラグメントは、Arg266における正常な触媒的切断部位を含む。しかしながら、フューリンエンドペプチダーゼを含むプロペプチド変換酵素(PC1〜7)による強力な(KERK/RXXR)切断部位が271位から274位に存在することが決定されている(Steiner、1998年)。フューリンタンパク質前駆体変換酵素(PC)には(K/R)−(X)n−(K/R)↓共通モチーフがなければならない(ここで、n=0、2、4、または6、およびXはアミノ酸であるが、通常Cysではない)(Seidah、1999年、Seidah、1997年)。TGF−βファミリーにもっと共通的なのはR−X−K/R−Rモチーフであり、その場合、KおよびRは互換性であるが、R−X−K/R−R配列が最適である(Dubois、2001年)。274位における切断は、ヒツジおよびウシ配列から47アミノ酸C末端成熟MSVフラグメント(ヒツジ:oMSV47、配列番号50およびウシ:bMSV47、配列番号54)を遊離させるであろう。ブタの配列の切断は50アミノ酸のフラグメント(pMSV50、配列番号72)の遊離という結果を生じ、ヒト、チンパンジーおよびネコに対しては20アミノ酸フラグメント(h1〜2MSV20、配列番号75おおよび78;chMSV20、配列番号81;およびcaMSV20、配列番号93)、およびイヌの配列からは18アミノ酸ペプチド(d1〜3MSV18、配列番号84、87、および90)が遊離される。成熟C末端ペプチドの存在は、MSV47ペプチドに対する抗体を使用して確認された(図8C)。
種々の配列の比較を、示した種々のフラグメントと共に図15に示す。コンピュータシミュレーションによる分析(GCGソフトウェア)を使用する配列の分析は、成熟ペプチド中に、6アミノ酸残基リンカーにより分離された2つのαヘリックスの存在を予測した。興味あることに、ヒト、チンパンジー、ネコおよびイヌはすべて第1αヘリックスのみを含み、一方ウシ、ヒツジおよびブタはすべて両方のαヘリックスを含む。ヒト、チンパンジー、ネコおよびイヌはすべて第1αヘリックスのみを含むので、これは、第1αヘリックスがMSVペプチドの成長促進活性の原因である可能性があることを意味する。これを支持するのは、比較において、推定αヘリックス中に残基のより大なる保存があるという事実である(第1ヘリックス中に58%および第2ヘリックス中に89%)。MSVの生物活性ドメインを同定するための努力において、多数の組換えおよび合成ペプチドが作製された。組換えαヘリックス1(MSVα1、配列番号51)および組換えαヘリックス2(MSVα2、配列番号98)を作製した。第3リンカーペプチド(MSVL18、配列番号100)も第1αヘリックスのC末端6残基、リンカー6残基、および第2αヘリックスのN末端6残基を含んで構築した。
IIFLEVXIQFCSILGETAL
が決定されることを可能にする。
X1 I F L E X2 X3 X4 Q X5 C S I L X6 X7 X8 X9 X10
式中、X1はIまたはLであり;X2はVまたはLであり;X3はY、C、GまたはSであり;X4はIまたはFであり;X5はFまたはLであり;X6はGまたはEであり;X7はEまたはVであり;X8はAまたはTであり;X9はAまたはVであり;およびX10は存在しないか、FまたはLである。
H H H H A H P H P H P P H H P A P/H H H
(式中、H=疎水性、P=極性、A=酸性、B=塩基性)。
MSVは、in vitroで、ミオスタチンのその作用に拮抗すること、および筋肉成長を促進することにおいて有効であることが示されている。それ故、MSVは、筋肉消耗状態のための治療または予防のための良い候補であると思われる。これを試験する目的で、癌悪液質のラットモデルにおける筋肉消耗に対するroMSV47の効果を試験した。
ミオスタチンにおける欠失が、ウシのベルジャンブルー種で観察される、通常ダブルマッスルと称せられる筋肥大の原因であることが見出されている。ベルジャンブルー牛は、成熟ミオスタチンのコード領域中に、フレームシフトおよびエクソン3中の早発の終止コドンの原因になる11bp欠失を有することが示されていて、その結果ミオスタチン活性が消滅する。ベルジャン牛のMSV(bMSVbb)も単離され、キャラクタライズされている(配列番号96および95)。bMSVbb遺伝子(配列番号96)は、bMSV(配列番号5)のヌクレオチド749〜770の間に21ヌクレオチド欠失を含む。bMSVbbタンパク質(配列番号95)はアミノ酸長314で、bMSV(配列番号52)より7アミノ酸短い。しかしながら、7アミノ酸欠失は独自の65アミノ酸C末端ペプチド内では起こらず、それ故、bMSV65(配列番号53)およびbMSV47(配列番号54)は、正常ウシとベルジャンブルー種の間で同一である。独自の65アミノ酸C末端ペプチドの保存は、MSVタンパク質の機能的重要性を示す。
1)成熟MSVタンパク質は血液に分泌されて他のペプチドホルモンと同様に循環することができる、および
2)成熟MSVのホモダイマーは血液中に存在することができる
ことを示す。
ヒツジMSV:
ミオスタチンcDNA(ミオスタチンメッセンジャーRNAの相補的DNA配列)のオープンリーディングフレーム(ORF)周辺の側方PCRプライマーを使用して、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)により、ヒツジミオスタチンスプライス変種を最初に同定した。順方向プライマー(5’−TCAGACTGGGCAGGCATTAACG−3’、配列番号101)は5’非翻訳領域(UTR)に、逆方法プライマー(5’−GCATATGGAGTTTTAAGACCA−3’、配列番号102)は離れた3’UTRに位置した。PCR反応は、2μlのヒツジ筋肉cDNA(Texel種ヒツジの半腱様筋のmRNAから逆転写した)をテンプレートとして、増幅前変性のために94℃の温度で2分間、それから45サイクルの、94℃で30秒間、55℃で1分間、および72℃で2分間で実施した。PCR産物は、Perfect Prepキット(Eppendorf、ドイツ所在)を使用してゲルで精製し、pGEM−T Easyイー・コリプラスミドベクターに、メーカーの使用説明(Promega、米国所在)に従って、クローニングした。プラスミドクローンはpFJ106/3と命名して、挿入物をWaikato DNA Sequencing Facility(Hamilton、ニュージーランド所在)において、T7およびSp6プライマーから双方向塩基配列決定により分析した。pFJ106/3の完全な挿入物はGSG/SeqLabソフトウェア(Accelrys Inc.米国所在、配列番号1)で再構築した。
ウシミオスタチンスプライス変種(bMSV)を、RT−PCR、およびそれに続く全長ORFのクローニングおよび塩基配列決定により同定した。順方向プライマー(5’−ACCATGGAAAAACTCCAAATCTTT−3’、配列番号103)は、ウシミオスタチンの翻訳開始部位に、逆方向プライマー(5’−GTCATCGTCATCTTTCATCCTAAAAGCTGCAGT−3’、配列番号104)はbMSVの予測された翻訳終止部位に位置した。PCR反応は、2μlのウシ筋肉cDNA(ヘレフォード/フリージアン交配種またはダブルマッスルベルジャンブルー牛の胎児半腱様筋mRNAから逆転写した)をテンプレートとして、増幅前変性のために94℃の温度で2分間、それから45サイクルの、94℃で30秒間、55℃で30秒間、および68℃で1分間で実施した。PCR産物は、Perfect Prepキット(Eppendorf、ドイツ所在)を使用してゲルで精製し、pMT/V5−His−TOPOプラスミドベクターに、メーカーの使用説明(Invitrogen、カリフォルニア州所在)に従って、クローニングした。挿入物をWaikato DNA Sequencing Facility(Hamilton、ニュージーランド所在)において、MTF1およびBGHプライマーから双方向塩基配列決定により分析した。完全な挿入物の配列はGSG/SeqLabソフトウェアで構築した(配列番号4)。
ヒツジMSVのサイズおよび存在比を確認するために、mRNAノーザンブロット分析を使用した。6頭の成体雄Romneyヒツジの凍結半腱様筋をTrizol試薬(Invitrogen、カリフォルニア州所在)中氷上で、UltraTurraxホモジナイザー(Janke & Kunkel GmbH、ドイツ所在)を使用して13,500rpmで30秒間ホモジナイズした。残屑を10,000gで10分間の遠心分離により除去して、全RNAをメーカー(Invitrogen、カリフォルニア州所在)の実施要領に従って単離した。RNAをジエチルピロカーボネート処理した水に再懸濁して、全RNA濃度を260nmで吸光度を測定することにより定量した。約600マイクログラムの全RNAをプールして、ポリ(A)+RNAをmRNA精製キット(Amersham Bioscience、英国所在)を使用し、メーカーの使用説明に従って精製した。全体の10マイクログラムおよびポリ(A)+RNAの5マイクログラムを1.2%ホルムアルデヒド−アガロースゲルで分離し、次に非荷電ナイロン膜(Hybond−N、Amersham Biosciences、英国)に、毛管作用により移した。膜は紫外線照射を使用して架橋し、メチレンブルーで染色してRNAの完全性および移行の均一性を検証した。
MSVタンパク質の組換え発現および精製
MSVタンパク質の生物学的効果を試験するために、次の組換えペプチドを作製した:ヒツジMSV65(aa257〜321)、ウシMSV47(aa275〜321)、ヒツジMSVα1ヘリックス(aa275〜293)、ヒツジMSV連結配列(aa287〜305)、ヒツジMSVα2ヘリックス(aa300〜321)、ヒトMSV38(aa257〜298)。各々に対する適当なDNA挿入物をイー・コリでクローニングし、組換えタンパク質として発現させて精製した。ヒトまたはヒツジ(Romney)骨格筋のプールしたcDNAを、テンプレートとして使用して、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりMSV DNAを増幅した。PCR産物は、次の順方向および逆方向のプライマーをそれぞれ使用して得た:
ヒツジMSV65(aa257〜321)5’−CACCGTGCATTTTTACACTCCTCCCT−3’(配列番号122)、5’−TTATTTCATCCTAAAAGCTGCAG−3’(配列番号123);ヒツジMSV47(aa275〜321)5’−CACCATCATTTTTCTAGAGGTCTAC−3’(配列番号124)、5’−TTATTTCATCCTAAAAGCTGCAG−3’(配列番号125);ヒツジMSVα1ヘリックス(aa275〜297)5’−CACCATCATTTTTCTAGAGGTCTAC−3’(配列番号106)、5’−TTATGACTGCCTTTTAAACACAGC−3’(配列番号107);ヒツジMSV連結配列(aa287〜306)5’−CACCATACTTGGAGAAGCTGTGTTT−3’(配列番号126)、5’−TTAGAAATTTTGACAAAAATGAAT−3’(配列番号127);ヒツジMSVα2ヘリックス(aa298〜321)5’−CACCAAAAGTATTCATTTTTGTCAA−3’(配列番号128)、5’−TTATTTCATCCTAAAAGCTGCAG−3’(配列番号129);ヒトMSV38(aa257〜298)5’−CACCGTGCATTTTCCTACACCTCCA−3’(配列番号130)、5’−TTAAGATAATGCAGTTTCTCCAAG−3’(配列番号131)。
PCRは、2μlのヒツジ筋肉cDNAを使用して、増幅前変性として94℃で2分間、次に35〜45サイクルの、94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で30秒間で実施した。
MSVが筋細胞の増殖を促進することを示すために、C2C12マウスおよび始原ヒツジ筋芽細胞を使用した。96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)で、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Invitrogen)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた200μlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen、カリフォルニア州所在)中に、筋芽細胞を、ウェル当たり1000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、0、0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3、1、3または10μg/mlのoMSV65を含むDMEM10%FBS試験培地で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で72時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを各ウェルに添加して、室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計を使用して655nmで吸光度を測定した(図3aおよび3b)。吸光度対細胞数のプロットは、知りたい範囲で直線的であることが見出された(1cm2当たり4000から30000細胞、Oliverら、1989年)。
roMSV65が筋細胞の細胞周期を制御していることをさらに示すために、2つの分子マーカー、すなわちp21およびPCNAを使用した。p21は周期依存性のキナーゼ阻害剤であり、それはG1終止を誘起することにより細胞周期の進行を制御して、Cdksを不活性化することにより、または増殖性細胞核抗原(PCNA)の活性を阻害することによりS期への移行を遮断する。したがって、p21タンパク質発現の減少は、細胞増殖速度の増大を示すことができる。PCNAは細胞増殖の正のマーカーである。それは、細胞周期におけるDNA複製中のDNAポリメラーゼδのサブユニットである。PCNAタンパク質発現のレベルの高まりは、細胞周期のDNA複製期へ移行する細胞数の高まりに随伴している。
roMSV65が筋芽細胞分化または筋管肥大を制御するかどうかを調べるために、C2C12筋管培養を使用した。ミオゲニンおよびdMHCのような十分確立された初期および晩期のミオゲニン分化の分子マーカーのレベルを、roMHC65タンパク質の存在下または不存在下に測定した。
roMSV65と標準的ミオスタチンとの競合は、C2C12マウス筋芽細胞で実施した。筋芽細胞は、96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Invitrogen)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた200μlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen、カリフォルニア州所在)中で、ウェル当たり1000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、添加したタンパク質を含まない;1.5または2.5μg/mlの組換えミオスタチンを単独で含む、およびそれにroMSV65を1、2、4、10、20のモル比で組み合わせて含む;ならびにミオスタチンなしで前記と同量のroMSV65含むDMEM10%FBS試験培地で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で72時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを、各ウェルに添加して室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計(VersaMax、Molecular Devices、カリフォルニア州所在)を使用して655nmで吸光度を測定した。
MSVタンパク質を特異的に検出および定量的に測定するために、2つのポリクローナル抗MSV抗体をウサギで生成させた。
ヒツジMSV47のクローニング、発現および精製:
oMSV47の筋芽細胞増殖に対する生物学的影響を試験するために、oMSV47をクローニングし、イー・コリで組換えタンパク質として発現させて精製した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によりoMSV47を増幅させるためのテンプレートとして、プールしたヒツジ(Romney)骨格筋cDNAを使用した。次の順方向および逆方向プライマーでPCR産物を得た:
5’−CACCATCATTTTTCTAGAGGTCTAC−3’(配列番号106)および
5’−TTATTTCATCCTAAAAGCTGCAG−3(配列番号107)。PCRは、2μlのヒツジ筋肉cDNAで、Pfx Platinum Taq DNAポリメラーゼ(Invitrogen、カリフォルニア州所在)を使用して、増幅前変性のために94℃の温度で2分間、それから40サイクルの、94℃で15秒間、55℃で30秒間、および68℃で30秒間で実施した。
roMSV47が筋細胞の増殖を促進することを示すために、C2C12マウスおよび始原ヒツジ筋芽細胞を使用した。筋芽細胞は、96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Invitrogen、カリフォルニア州所在)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた200μlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中で、ウェル当たり1000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、0、0.01、0.1、1または10μg/mlのoMSV47を含むDMEM10%FBS試験培地で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で60時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを各ウェルに添加して、室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計を使用して655nmで吸光度を測定した(図9)。吸光度対細胞数のプロットは、知りたい範囲で直線的であることが見出された(1cm2当たり4000から30000細胞、Oliverら、1989年)。
roMSV47と標準的ミオスタチンとの競合は、C2C12マウス筋芽細胞で実施した。筋芽細胞は、96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Invitrogen、カリフォルニア州所在)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた200μlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中で、ウェル当たり1000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、添加したタンパク質を含まない、1.5μg/mlの組換えウシミオスタチンを単独でならびにroMSV47を1、5および10のモル比で組み合わせて含む、ならびにミオスタチンなしで同量のroMSV47を含むDMEM10%FBS試験培地で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で60時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)緩衝液で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを各ウェルに添加して室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計(VersaMax、Molecular Devices、カリフォルニア州所在)を使用して655nmで吸光度を測定した。
MSVペプチドそれぞれが筋細胞の増殖を促進することを示すために、C2C12マウス筋芽細胞を使用した。筋芽細胞は、96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Invitrogen、カリフォルニア州所在)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた200μlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中で、ウェル当たり1000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、0、0.01、0.1、1、5または10μg/mlのそれぞれのペプチドを含むDMEM2.5%FBS試験培地で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で80時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを各ウェルに添加して、室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計(VersaMax、Molecular Devices、カリフォルニア州所在)を使用して655nmで吸光度を測定した。
rhMSV38およびroMSV47がヒト骨格筋細胞を刺激して複製することができることを示すために、それらを増殖アッセイで試験した。ヒト骨格筋細胞(Cambrex、オーストラリア所在)は、96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Cambrex、オーストラリア所在)で補充した200μlの骨格筋基礎培地(Cambrex、オーストラリア所在)中で、ウェル当たり2000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。5%胎児ウシ血清(FBS、Invitrogen、カリフォルニア州所在)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させ、各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、0、0.1、1、5または10μg/mlのrhMSV38またはroMSV47タンパク質を添加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen、カリフォルニア州所在)で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で96時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを各ウェルに添加して、室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計(VersaMax、Molecular Devices、カリフォルニア州所在)を使用して655nmで吸光度を測定した。
筋芽細胞は、96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Invitrogen、カリフォルニア州所在)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた200μlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中で、ウェル当たり1000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、添加したタンパク質を含まない、1.5μg/mlの組換えミオスタチンを単独でならびにroMSV47を1、5および10のモル比で組み合わせて含む、ならびにミオスタチンなしで同量のroMSV47を含むDMEM10%FBS試験培地で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で69時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)緩衝液で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを各ウェルに添加して室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計(VersaMax、Molecular Devices、カリフォルニア州所在)を使用して655nmで吸光度を測定した。
ヒト骨格筋筋芽細胞(Cambrex、オーストラリア所在)を、96ウェルの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Cambrex、オーストラリア所在)で補充した200μlの骨格筋基本培地(Cambrex、オーストラリア所在)中で、ウェル当たり2000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。5%胎児ウシ血清(FBS、Invitrogen、カリフォルニア州所在)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた、添加したタンパク質を含まない、1.5または3.0μg/mlの組換えウシ成熟ミオスタチンを単独でおよびrhMSV38をミオスタチンに対して0.3、1、3、10のモル比で組み合わせて含む、ならびにミオスタチンなしで同量のrhMSV38含むダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen)で、各試験培地について8複製の(n=8)セミランダム配置で、培地を置換した。プレートを37℃、5%CO2で48時間インキュベートしてから、培地を除去した。ウェルを200μlのリン酸緩衝食塩水(PBS、Oxoid、英国所在)緩衝液で洗浄し、100μlの10%ホルムアルデヒド、0.9%NaCl溶液で少なくとも1時間固定した。次に固定液を除去して、0.01Mホウ酸緩衝液(pH8.5)中1%のメチレンブルー染色液100μlを各ウェルに添加して、室温で30分間インキュベートした。過剰の染色液は、ホウ酸緩衝液で4回続けて洗浄することにより除去した。メチレンブルーを、100μlの1:1(v/v)エタノール/0.1HClの添加により細胞から溶出させた。プレートを穏やかに振盪して、マイクロプレート光度計(VersaMax、Molecular Devices、カリフォルニア州所在)を使用して655nmで吸光度を測定した。
C2C12筋芽細胞は、直径10cmの組織培養プレート(Nunc、Roskilde、デンマーク所在)に、胎児ウシ血清(FBS、10%v/v、Invitrogen、カリフォルニア州所在)、ペニシリン(1×105IU/l、Sigma、St Louis、ミズーリ州、米国所在)およびストレプトマイシン(100mg/l、Sigma)で補充し、pH指示薬としてフェノールレッド(7.22nmol/l)を含むNaHCO3で緩衝させた10mlのダルベッコ変法イーグル培地(DMEM、Invitrogen)中で、1cm2当たり3000細胞の細胞密度で播種し、5%CO2、37℃で一晩インキュベートした。8プレートの1セット(慢性処置、「A」と命名した)に対して、培地を試験培地、すなわち0または10μg/mlのoMSV47で補充し、2.5%FBSを含むDMEMで置換した(n=4)。次にプレート「A」を37℃、5%CO2で48時間インキュベートした。他の8プレートの1セット(急性処置、「B」と命名した)については、プレート培地を2.5%FBSを含むDMEMで置換して、37℃、5%CO2で48時間インキュベートし、続いて新鮮な試験培地、すなわち0または10μg/mlのoMSV47で補充し、2.5%FBSを含むDMEMで置換した(n=4)。次に、プレート「B」を37℃、5%CO2で6時間インキュベートした。処理をした後、プレートを10mlのPBS緩衝液中で洗浄し、細胞を2mlのトリゾール試薬で補集した。メーカー(Invitrogen、カリフォルニア州所在)の手順書に従って、全RNAをトリゾール試薬で単離した。RNAをジエチルピロカーボネートで処理した水に再懸濁して、全RNA濃度を260nmの吸光度を測定することにより(Nanodrop Spectrophotometer、デラウェア州、米国所在)定量した。5μgの全RNAを、Superscript III Pre−Amplificationキット(Invitrogen、カリフォルニア州所在)を使用して、メーカーの手順書に従って逆転写した。マウスミオスタチン(nt715〜796)のエクソン2/3境界にまたがる範囲を含むオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。順方向プライマー:5’−GCTGTAACCTTCCCAGGACC−3’(配列番号132)および逆方向プライマー:5’−GGGACCTCTTGGGTGTGTCT−3’(配列番号133)。PCRは、各LightCycler反応に対して次のマスター混合物と2.5μlの逆転写酵素反応液で実施した:4.5μlの水、0.5μlの10μMプライマーおよび2.0μlのLightCycler FastStart DNA Master plus SYBR Green I試薬(Roche Diagnostics)。マウス筋肉の逆転写酵素反応液の一連の希釈液を標準として使用した。次の実験実施手順を使用した:変性(95℃で5分間)、増幅(95℃で5秒間、62℃で10秒間、72℃で20秒間、単回蛍光測定、50サイクル)、LightCycler 2.0 PCR機(Roche Diagnostics)での溶融曲線(連続的に蛍光測定しながら毎秒0.1℃の加熱速度で60〜95℃)。標準曲線(Roche Diagnostics)を使用して、Lightcyclerソフトウェアにより、任意単位の濃度を計算した。
腹水肝癌130(AH130)はVicki Baracos博士(アルバータ大学、Edmonton、アルバータ州、カナダ所在)からのギフトとして入手し、50%DMSOおよび10%BSAの溶液で液体窒素中クライオバイアルに入れて保存した。一定分量を取り出して解凍し、3匹のドナーラットの各々に1mlを腹腔中に注射して、7日間増殖させた。ラットはCO2窒息とそれに続く頸椎脱臼により殺した。腹水を回収して、100μlを14匹のレシピエント雄ラット(280±6g)の各々の腹腔内に注射した。等量の食塩水を7匹の対照ラットの腹腔内に注射した。AH130腫瘍を接種した14匹のラットのうち7匹に毎日2回、roMSV47を、1μg/g体質量の用量で無菌食塩水により希釈して1mlの容量にして皮下注射した。腫瘍を接種した残りの7匹のラットおよび7匹の対照ラットには、各々毎日2回、1mlの無菌食塩水を皮下注射した。腫瘍の成長は6日間進行させるに任せて、その時点ですべてのラットを上記のようにして殺した。死亡時に各ラットから血液試料を心臓穿刺により採取して、抗凝血剤としてEDTAを含むチューブに入れた。血清を回収して、一定分量をクレアチンキナーゼ(CK)アッセイのために−20℃で凍結保存した。腹腔内の腹水は注射器で取り出し、容量を記録した。右後肢の6カ所の筋肉(大腿二頭筋、腓腹筋、ヒラメ筋、足底筋、前脛骨筋および大腿四頭筋)を切り出して、それらの質量を記録した。
CK−NACは市販キット(Randox laboratories Ltd、英国所在)でアッセイした。反応容量は、アッセイを96ウェルのマイクロタイタープレートで実施できるように比例的に規模を縮小して、試料は3重にアッセイして(CK−NAC)、メーカーの取扱い説明に従って1分当たりのU/L変化として読み取った。
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Claims (59)
- 式:
X1 I F L E X2 X3 X4 Q X5 C S I L X6 X7 X8
X9 X10
[式中、X1はIまたはLであり;X2はVまたはLであり;X3はY、C、GまたはSであり;X4はIまたはFであり;X5はFまたはLであり;X6はGまたはEであり;X7はEまたはVであり;X8はAまたはTであり;X9はAまたはVであり;およびX10は存在しないか、FまたはLである]
で示されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。 - (a)配列番号48−95のいずれか1つのアミノ酸配列を含むポリペプチド;
(b)(a)のポリペプチドのフラグメントまたは変種を含むポリペプチド;および
(c)(a)のポリペプチドと95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリペプチド
から選択される、単離されたポリペプチド。 - 配列番号48−95のいずれか1つのアミノ酸配列または少なくとも80%の配列同一性を有するポリペプチドであって、筋芽細胞増殖促進能を有するところの、単離されたポリペプチド。
- 請求項1ないし3のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- (a)配列番号1ないし47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(b)(a)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド;
(c)(a)のポリヌクレオチドと95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド;
(d)(a)ないし(c)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;および
(e)(a)ないし(c)のいずれか1つの逆相補鎖
から選択される、単離されたポリヌクレオチド。 - 配列番号1ないし47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列あるいは筋芽細胞増殖促進能を有するペプチドをコードする80%の配列同一性を有するその変種を含む、単離されたポリヌクレオチド。
- 請求項4ないし6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
- 発現ベクターである、請求項7記載のベクター。
- 作動可能な結合にて、
(a)プロモーター配列;
(b)請求項4ないし6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド;および
(c)遺伝子終止配列
を含む、請求項7または請求項8記載のベクター。 - ポリヌクレオチドがセンス方向にある、請求項9記載のベクター。
- ポリヌクレオチドがアンチセンス方向にある、請求項9記載のベクター。
- 請求項7ないし11のいずれか一項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
- 請求項7ないし11のいずれか一項に記載のベクターを含有する、1つまたは複数の細胞を含む、宿主動物。
- (a)請求項1ないし3のいずれか一項に記載のポリペプチド;
(b)請求項4ないし6のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド;
(c)請求項7ないし11のいずれか一項に記載のベクター;
(d)(a)のフラグメントまたは変種;
(e)(b)のいずれか1つの相補鎖;
(f)(b)の逆相補鎖;および
(g)(b)、(e)または(f)のいずれか1つのアンチセンスポリヌクレオチド
のいずれか1つの化合物を含む、筋肉の成長を制御する組成物。 - 化合物がアンチセンスポリヌクレオチドである、請求項14記載の組成物。
- 化合物が干渉RNA分子である、請求項14または請求項15記載の組成物。
- 化合物がRNAiまたはsiRNAである、請求項16記載の組成物。
- (a)請求項1ないし3のいずれか1つに記載のポリペプチド;
(b)請求項1ないし3のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含むポリヌクレオチド;
(c)(i)配列番号1ないし47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(ii)(i)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド;
(iii)(i)のポリヌクレオチドに対して95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド;および
(iv)(i)ないし(iii)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド;
(d)(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(e)発現ベクターであるところの、(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(f)作動可能に結合した、プロモーター、(b)または(c)のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター;および
(g)(b)または(c)によるポリペプチド産物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉の成長を制御する方法。 - (a)請求項1ないし3のいずれか1つに記載のポリペプチド;
(b)請求項1ないし3のいずれか1つに記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列またはそれに相補的な配列を含むポリヌクレオチド;
(c)(i)配列番号1ないし47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(ii)(i)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド;
(iii)(i)のポリヌクレオチドに対して95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド;および
(iv)(i)ないし(iii)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチド;
(d)(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(e)発現ベクターであるところの、(b)または(c)のポリヌクレオチドを含むベクター;
(f)作動可能に結合した、プロモーター、(b)または(c)のポリヌクレオチドおよび遺伝子終止配列を含むベクター;および
(g)(b)または(c)によるポリペプチド産物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド
からなる群から選択された組成物を投与することを含む、筋肉組織に関連する疾患の治療方法。 - 筋肉組織に関連する疾患が筋萎縮に付随する症状を含むところの、請求項19記載の方法。
- 筋萎縮に付随する症状が筋ジストロフィー、筋悪液質、筋萎縮症、筋肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択されるところの、請求項20記載の方法。
- 疾患関連筋萎縮症が癌またはHIV/AIDSに関連する筋肉消耗を含むところの、請求項21記載の方法。
- 筋肉組織に関連する疾患が心筋に関連する疾患を含むところの、請求項19記載の方法。
- 心筋に関連する疾患が梗塞を含むところの、請求項23記載の方法。
- (a)請求項1ないし3のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、またはそれに相補的な配列;
(b)(i)配列番号1ないし47または96のいずれか1つのヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド;
(ii)(i)のポリヌクレオチドのフラグメントまたは変種を含むポリヌクレオチド;
(iii)(i)のポリヌクレオチドに対して95%、90%、80%または70%の配列同一性を有するポリヌクレオチド;および
(iv)(i)ないし(iii)のいずれか1つの相補鎖であるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド
からなる群からなる群から選択されるポリヌクレオチド;
(c)(a)または(b)によるポリペプチド産物の発現を阻害または実質的に損なうことができるアンチセンスポリヌクレオチド;および
(d)干渉RNA分子
からなる群から選択されるポリヌクレオチドに特異的に結合することのできる組成物を含む、MSV遺伝子発現の調節因子。 - アンチセンスポリヌクレオチドを含む、請求項25記載のMSV遺伝子発現の調節因子。
- 化合物がRNAiまたはsiRNA分子であるところの、請求項25記載のMSV遺伝子発現の調節因子。
- 請求項25ないし27のいずれか一項に記載の調節因子を患者に投与することを含む、該患者における筋肉組織に関連する疾患の治療方法。
- 筋肉組織に関連する疾患が筋萎縮に付随する疾患であるところの、請求項29記載の方法。
- 筋萎縮に付随する疾患が筋ジストロフィー、筋悪液質、筋萎縮症、筋肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症(ALS)からなる群から選択されるところの、請求項29記載の方法。
- 疾患関連筋萎縮症が癌またはHIV/AIDSに関連する筋肉消耗を含むところの、請求項30記載の方法。
- 筋肉組織に関連する疾患が心筋に関連する疾患を含むところの、請求項28記載の方法。
- 心筋に関連する疾患が梗塞を含むところの、請求項32記載の方法。
- プロペプチド変換酵素がMSVプロペプチドの活性MSVペプチドへの蛋白分解性プロセッシングを改変させるのに十分な条件下で十分な時間、MSVプロペプチドをプロペプチド変換酵素と接触させ、それによりMSV活性を調節することを含む、MSV活性の調節方法。
- 接触工程が、MSVプロペプチドを変換酵素のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることを含む、請求項34記載の方法。
- プロペプチド変換酵素がフューリンエンドプロテアーゼを含むところの、請求項34または請求項35記載の方法。
- 筋肉組織関連の疾患を有し、MSVプロペプチドを含む対象に、プロペプチド変換酵素がMSVプロペプチドの活性MSVペプチドへの蛋白分解性プロセッシングを改変させるのに十分な条件下で十分な時間、該変換酵素を該対象に投与することを含む、筋肉組織に関連する疾患の治療方法。
- 投与工程が、MSVプロペプチドを変換酵素のアゴニストまたはアンタゴニストと接触させることをさらに含むところの、請求項37記載の方法。
- プロペプチド変換酵素がフューリンエンドプロテアーゼであるところの、請求項37または請求項38記載の方法。
- 筋肉組織に関連する疾患が筋萎縮に付随する疾患であるところの、請求項37ないし39のいずれか一項に記載の方法。
- 筋萎縮に付随する疾患が筋ジストロフィー、筋悪液質、萎縮症、肥大、疾患関連筋萎縮症および筋萎縮性側索硬化症(ALS)のいずれから選択されるところの、請求項40記載の方法。
- 疾患関連筋萎縮症が癌またはHIV/AIDSと関連する筋肉消耗を含むところの、請求項41記載の方法。
- 筋肉組織に関連する疾患が心筋に関連する疾患であるところの、請求項37ないし39のいずれか一項に記載の方法。
- 心筋に関連する疾患が梗塞を含むところの、請求項43記載の方法。
- 請求項14ないし17のいずれか一項に記載の組成物;請求項25ないし27のいずれか一項に記載のMSV遺伝子発現の調節因子;プロペプチド変換酵素あるいはプロペプチド変換酵素のアゴニストもしくはアンタゴニストのいずれか1つを、動物に投与することを含む、該動物の筋肉成長を制御する方法。
- プロペプチド変換酵素がフューリンエンドプロテアーゼであるところの、請求項45記載の方法。
- 動物が筋肉増量しているところの、請求項45または請求項46記載の方法。
- i)動物から試料を得る工程、
ii)配列番号1ないし47または96のいずれか1つの配列を有するポリヌクレオチド、配列番号1ないし47もしくは96に対して95%、90%、80%もしくは70%の同一性を有するポリヌクレオチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種からの遺伝子発現レベルを測定する工程、
iii)遺伝子発現レベルを平均と比較する工程、および
iv)該動物の筋肉量を予測する工程
を含む、動物における筋肉量を予測する方法。 - 遺伝子発現のレベルが、ポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で、核酸をハイブリダイズすることを含む方法により測定されるところの、請求項48記載の方法。
- 遺伝子発現のレベルがRT−PCRまたはノーザンブロット分析を用いて測定されるところの、請求項48または請求項49記載の方法。
- i)動物から試料を得る工程、
ii)配列番号48ないし95のいずれか1つの配列を有するポリペプチド、配列番号48ないし95のいずれか1つと95%、90%、80%もしくは70%の同一性を有するポリペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変種の量を測定する工程、
iii)ポリペプチドの量を平均量と比較する工程、および
iv)該動物の筋肉量を予測する工程
を含む、動物における筋肉量の予測方法。 - ポリペプチドの量が該ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて該ポリペプチドを検出することを含む方法により測定されるところの、請求項51記載の方法。
- ポリペプチドの量がELISAまたはウェスタンブロット分析を用いて測定されるところの、請求項51または請求項52記載の方法。
- i)請求項48ないし53のいずれか1つの方法により筋肉量が増加している予測される1または複数の動物を選択する工程、および
ii)筋肉量の増加した1または複数の動物を選択して繁殖させて、筋肉量の増加した1または複数の子孫を生成する工程
を含む、動物の1または複数の子孫の筋肉量を増加させる方法。 - 動物が、ヒツジ、ウシ、シカ、家禽、シチメンチョウ、ブタ、ウマ、マウス、ラットまたはヒトから選択されるところの、請求項54記載の方法。
- (a)配列番号48ないし95のいずれか1つの配列、または
(b)配列番号48ないし95のいずれか1つと95%、90%、80%もしくは70%の配列同一性を有する配列
を有するポリペプチドに優先的に結合する、タンパク質。 - タンパク質が、抗体;非哺乳類の抗体;細菌免疫タンパク質;または当該分野において知られている任意の他のクラスの結合性タンパク質、配列番号47ないし95のいずれか1つの配列を有するポリペプチド、もしくは配列番号47ないし95のいずれか1つに95%、90%もしくは70%の配列同一性を有するポリペプチドに結合することができるようなタンパク質から誘導されるフラグメントもしくは誘導体のいずれか1つから選択されるところの、請求項56記載のタンパク質。
- 非哺乳類の抗体がサメから由来のIgNARクラスの抗体であるところの、請求項57記載のタンパク質。
- 細菌免疫タンパク質がイー・コリから由来のIMM7免疫タンパク質であるところの、請求項57記載のタンパク質。
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