BRPI1012924B1

BRPI1012924B1 - polipeptídeo de amilóide p de soro humano glicosilado, preparação farmacêutica que compreende o dito polipeptídeo, métodos para preparar e uso terapêuticos dos mesmos

Info

Publication number: BRPI1012924B1
Application number: BRPI1012924-3A
Authority: BR
Inventors: W. Scott Willett; Richard J. Caimi
Original assignee: Promedior, Inc.
Priority date: 2009-06-04
Filing date: 2010-06-04
Publication date: 2020-12-22
Also published as: DK3042915T3; HRP20181803T1; US20230058309A1; CO6480917A2; EA201171490A1; SI2438083T1; CA2764461C; EP3042915B1; SI3042915T1; ES2692815T3; TR201815592T4; EA030332B1; CN102574902A; ZA201108857B; HRP20160221T1; ES2563748T3; AU2010256426A1; US20100317596A1; US20180044387A1; UA110323C2

Abstract

DERIVADOS DE AMILÓIDE P DE SORO E SUA PREPARAÇÃO E USO Um aspecto da presente invenção refere- se à descoberta surpreendente que a modificação de uma estrutura do glicano sobre um polipeptídeo de SAP humano pode aumentar a atividade biológica do polipeptídeo de SAP em relação a uma amostra correspondente do SAP do tipo selvagem, isolado do soro humano. A divulgação proporciona tanto os polipeptídeos de SAP humanos variantes quanto os métodos para preparar os mesmos. Em particular, a presente invenção proporciona métodos e composições para a adição, a remoção, ou a modificação in vitro e in vivo dos resíduos de açúcares, para produzir polipeptídeos de SAP, tais como um polipeptídeo de SAP humano, tendo um padrão de glicosilação desejado.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório U.S. No de Série 61/217.931, depositado em 4 de junho de 2009. Todos os ensinamentos do pedido acima mencionado são incorporados neste documento por referência.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[002] O Amilóide P de Soro (SAP) é um membro da família de proteínas pentraxina. O SAP é secretado pelo fígado e circula no sangue como um pentâmero estável. A pesquisa anterior demonstra que o SAP tem uma função importante em ambas as fases de iniciação e resolução da resposta imune. O SAP pode ligar-se aos resíduos de açúcar sobre a superfície das bactérias e, com isso, promover a sua opsonização e ingestão pelas células apresentadoras de antígenos. O SAP também se liga ao DNA livre e à cromatina gerados por células apoptóticas na resolução de uma resposta imune, assim impedindo uma resposta inflamatória secundária contra estes antígenos. As moléculas ligadas pelo SAP são removidas das áreas extracelulares devido à capacidade do SAP de ligar-se a todos os três receptores de Fcy (FcyR) clássicos, tendo uma afinidade particular pelo FcyRII (CD32) e pelo FcyRIII (CD16). Após a ligação aos receptores, o SAP e qualquer complexo unido são geralmente internalizados e processados pela célula.

[003] Recentemente, foi sugerido que o SAP pode ser usado como um agente terapêutico para tratar diversos distúrbios, incluindo os distúrbios relacionados à fibrose, os distúrbios de hipersensibilidade, os distúrbios autoimunes, a mucosite, e os distúrbios inflamatórios, tais como aqueles causados por infecção microbiana. Ver, por exemplo, os Pedidos de Patentes U.S. Nos de Série 11/707.333, 12/217.617, 12/720.845, e 12/720.847. As substâncias terapêuticas protéicas para tratar a doença humana têm revolucionado a indústria de cuidados da saúde. Entretanto, existem muitas dificuldades na produção de uma substância terapêutica protéica tendo a potência necessária e/ou em quantidade suficiente para ser útil como um agente terapêutico. Muitos agentes terapêuticos potenciais são modificados para aumentar a sua atividade biológica, tal como a meia vida plasmática, em relação à proteína naturalmente derivada. A tecnologia de expressão recombinante é normalmente efetuada para produzir polipeptídeos em quantidade suficiente. Infelizmente, muitos sistemas recombinantes produzem polipeptídeos tendo propriedades biológicas diferentes do que as formas derivadas naturalmente, o que pode afetar a farmacocinética, a segurança, e a eficácia de um produto terapêutico.

[004] Portanto, permanece uma necessidade por desenvolver polipeptídeos de SAP, e métodos de fabricá-los, adequados para o tratamento terapêutico de seres humanos.

RESUMO DA INVENÇÃO

[005] Em parte, a divulgação proporciona polipeptídeos de Amilóide P de Soro (SAP) e métodos para produzi-los. A presente invenção inclui métodos e composições para a adição, a remoção, ou a modificação in vitro e in vivo de resíduos de açúcar, para produzir polipeptídeos de SAP variantes tendo um padrão de glicosilação desejado.

[006] Em certos aspectos, a divulgação proporciona um polipeptídeo de SAP humano glicosilado, compreendendo uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O que tem pelo menos uma ramificação terminando com uma porção de ácido siálico ligada em a.2,3.

[007] Em certos aspectos, a divulgação proporciona um polipeptídeo de SAP humano glicosilado, compreendendo uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O que tem pelo menos 50% menos porções de ácido siálico ligadas em α2,6 do que o SAP do tipo selvagem isolado do soro humano.

[008] Em certos aspectos, a divulgação proporciona métodos de preparar um polipeptídeo de SAP humano glicosilado, compreendendo expressar um polipeptídeo de SAP em uma célula e isolar o polipeptídeo de SAP da célula. Em uma modalidade preferida, a célula é uma célula CHO. Em certos aspectos, a célula é uma célula CHO-S.

[009] Em certos aspectos, a divulgação proporciona métodos de preparar um polipeptídeo de SAP humano, compreendendo expressar o polipeptídeo de SAP humano em uma célula CHO e isolar o polipeptídeo de SAP humano da célula.

[0010] Em certos aspectos, a divulgação proporciona métodos de preparar um polipeptídeo de SAP humano, compreendendo proporcionar um polipeptídeo de SAP humano glicosilado contendo uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O e alterar enzimática ou quimicamente a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O do polipeptídeo de SAP, para produzir um polipeptídeo de SAP glicosilado modificado.

[0011] Em certos aspectos, a divulgação proporciona métodos de preparar um polipeptídeo de SAP humano, compreendendo proporcionar um polipeptídeo de SAP humano e alterar enzimática ou quimicamente o polipeptídeo de SAP para produzir um polipeptídeo de SAP glicosilado compreendendo um oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O.

[0012] Em certos aspectos, a divulgação proporciona um polipeptídeo de SAP humano preparado por um processo que compreende expressar um polipeptídeo de SAP em uma célula CHO e isolar o polipeptídeo de SAP da célula.

[0013] Em certos aspectos, a divulgação proporciona uma célula CHO que contém um polipeptídeo de SAP humano com uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N tendo pelo menos uma ramificação da cadeia de oligossacarídeo terminando com uma porção de ácido siálico ligada em a.2,3.

[0014] Em certos aspectos, a divulgação proporciona uma célula CHO contendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo de SAP humano.

[0015] Em certos aspectos, a divulgação proporciona um polipeptídeo de SAP humano tendo uma IC50 para inibir a diferenciação de monócitos em fibrócitos in vitro que é menos do que a metade, menos do que um terço, menos do que um quarto, menos do que um décimo, ou menos do que um centésimo que aquela de uma amostra correspondente de SAP do tipo selvagem isolado do soro humano.

[0016] Nas modalidades preferidas, os polipeptídeos de SAP humanos da invenção têm uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N. Em algumas modalidades, pelo menos uma ramificação da cadeia de oligossacarídeo ligado ao N termina com uma porção de ácido siálico ligada em a2,3. Em algumas modalidades, a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N tem pelo menos 50% menos porções de ácido siálico ligadas em a2,6 do que um SAP do tipo selvagem isolado do soro humano. Em algumas modalidades, todas as ramificações da cadeia de oligossacarídeo ligado ao N terminam com as porções de ácido siálico ligadas em a.2,3. Em algumas modalidades, a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N está substancialmente livre de porções de ácido siálico ligadas em a2,6. Os polipeptídeos de SAP glicovariantes da invenção podem compreender uma ou mais ramificações, p.ex., a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N pode ser caracterizada como tendo uma estrutura biantenária, triantenária, tetra-antenária, ou uma estrutura penta-antenária. Em algumas modalidades, a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N compreende um núcleo de pentassacarídeo de Man[(α1,6-)-(Man(α1,3)]-Man(β1,4)-GlcNAc(β1,4)- GlcNAc(β1,N)-Asn. Em algumas modalidades, a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N compreende pelo menos uma ramificação tendo a estrutura NeuNAc2α3Galβ4GlcNAcβ2Manα6. Em algumas modalidades, pelo menos uma ramificação da cadeia de oligossacarídeo ligado ao N está substancialmente livre de galactose e N-acetilglucosamina. Em algumas modalidades, todas as ramificações da cadeia de oligossacarídeo ligado ao N estão substancialmente livres de galactose e N-acetilglucosamina. Em algumas modalidades, pelo menos uma ramificação da cadeia de oligossacarídeo ligado ao N compreende um ou mais resíduos de manose. Em algumas modalidades, a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N compreende pelo menos um resíduo de fucose. Quaisquer dos polipeptídeos de SAP glicovariantes da invenção podem compreender pelo menos um resíduo de glicosila modificado. Um resíduo de glicosila modificado pode ser conjugado a um ou mais grupos modificadores selecionados a partir de polímeros solúveis e insolúveis em água, porções terapêuticas, agentes diagnósticos, e biomoléculas.

[0017] Em certos aspectos, o polipeptídeo de SAP da invenção pode ser um polipeptídeo recombinante. O polipeptídeo de SAP da invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica às SEQ ID Nos. 1, 2, 3, ou 4. De preferência, o polipeptídeo de SAP é uma proteína de SAP humana. Um polipeptídeo de SAP humano da invenção pode compreender uma sequência de aminoácidos pelo menos 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntica à SEQ ID NO: 1.

[0018] Em certos aspectos, o polipeptídeo de SAP humano da invenção é uma proteína de fusão compreendendo um domínio de SAP e um ou mais domínios heterólogos. O domínio heterólogo pode aumentar uma ou mais de estabilidade in vivo, meia vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição no tecido, formação de complexos protéicos, e/ou purificação.

[0019] Em certos aspectos, o polipeptídeo de SAP humano da invenção compreende um ou mais resíduos de aminoácidos modificados, p.ex., um aminoácido PEGuilado, um aminoácido glicosilado (p.ex., glicosilação ligada ao O), um aminoácido prenilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, e/ou um aminoácido conjugado a um agente de derivação orgânico. Os resíduos de aminoácidos modificados podem aumentar uma ou mais de estabilidade in vivo, meia vida in vivo, absorção/administração, localização ou distribuição no tecido, formação de complexos protéicos, e/ou purificação.

[0020] Nas modalidades preferidas, os polipeptídeos de SAP humanos da invenção têm atividade biológica aumentada em relação a uma amostra correspondente de SAP do tipo selvagem isolado do soro humano. Em certos aspectos, os polipeptídeos de SAP da invenção têm uma IC50 para inibir a diferenciação de monócitos em fibrócitos in vitro que é menos do que a metade, menos do que um terço, menos do que um quarto, menos do que um décimo, ou menos do que um centésimo daquela de uma amostra correspondente de SAP do tipo selvagem isolado do soro humano.

[0021] Em certos aspectos, os métodos de preparar quaisquer dos polipeptídeos de SAP humanos da invenção compreendem uma etapa adicional de alterar enzimática ou quimicamente o polipeptídeo de SAP, para unir uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O ao polipeptídeo de SAP ou para modificar a cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O existente do polipeptídeo de SAP. Em algumas modalidades, alterar enzimática ou quimicamente o polipeptídeo de SAP compreende tratar o polipeptídeo de SAP com uma ou mais proteínas enzimáticas, selecionadas a partir de glicosiltransferases, glicosidases, e fosfatases. Em algumas modalidades, o processo de alterar enzimática ou quimicamente o polipeptídeo de SAP é efetuado na presença de um ou mais precursores de açúcar. Os precursores de açúcar adequados incluem, porém não estão limitados à UDP-N-acetilglucosamina, CMP-ácido N-glicolilneuramínico UDP- N-acetilgalactosamina, CMP-ácido N-acetilneuramínico, UDP-galactose, e GDP- fucose. Em algumas modalidades, o processo de alterar enzimática ou quimicamente o polipeptídeo de SAP remove uma ou mais porções de ácido siálico ligadas em α.2,6 terminais da cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O. Em algumas modalidades, o processo de alterar enzimática ou quimicamente o polipeptídeo de SAP isolado substitui uma ou mais porções de ácido siálico ligadas em α2,6 terminais sobre a cadeia de oligossacarídeo por uma ou mais porções de ácido siálico ligadas em a.2,3.

[0022] A divulgação adicionalmente proporciona preparações farmacêuticas de polipeptídeos de SAP humanos da invenção, adequadas para uso em um mamífero. As preparações farmacêuticas da invenção incluem pelo menos um dos polipeptídeos de SAP divulgados neste documento e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica adicionalmente compreende um agente ativo adicional. Em algumas modalidades, a preparação farmacêutica é preparada como uma formulação de liberação constante. Em algumas modalidades, as preparações farmacêuticas da divulgação são adequadas para a administração a um paciente topicamente, por injeção, por injeção intravenosa, por inalação, por formulação de efeito prolongado, ou por bomba.

[0023] A divulgação adicionalmente proporciona métodos para tratar ou prevenir os distúrbios ou as condições sensíveis ao SAP, por administração a um paciente que necessita deles de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um ou mais dos polipeptídeos de SAP da invenção. Os distúrbios ou as condições sensíveis ao SAP incluem, porém não estão limitadas aos distúrbios ou condições fibróticas ou fibroproliferativas, distúrbios ou condições de hipersensibilidade, distúrbios ou condições autoimunes, doenças ou condições inflamatórias, e mucosite. O polipeptídeo de SAP da invenção pode ser administrado a um paciente topicamente, por injeção, por injeção intravenosa, por inalação, por formulação de efeito prolongado ou bomba, ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de SAP da invenção é administrado com um ou mais agentes ativos adicionais.

BREVES DESCRIÇÕES DOS DESENHOS

[0024] Figura 1. Ensaio de diferenciação em fibrócitos. Um ensaio baseado em ELISA foi usado para medir a produção de MDC após incubação dos monócitos com os polipeptídeos de SAP. O eixo Y indica a potência média (i.e., a média de 7 experimentos independentes) do SAP derivado de soro humano (hSAP) comparado ao SAP humano recombinante (rhSAP) isolado das células CHO-S. A atividade relativa do hSAP é fixada em 1,0.

[0025] Figura 2. Análise estrutural de glicanos dos polipeptídeos de SAP variantes. A análise por Cromatografia Líquida Espectrometria de Massa (LCMS) (A) e a análise por Cromatografia Líquida de Alta Performance com Troca Aniônica (AEX-HPLC) (B) foram usadas para determinar as ligações de ácido siálico sobre o SAP humano recombinante glicorremodelado, isolado das células CHO-S. A análise por Cromatografia Líquida Espectrometria de Massa (LCMS) (C) e a análise por Cromatografia Líquida de Alta Performance com Troca Aniônica (AEX-HPLC) (D) foram usadas para determinar as ligações de ácido siálico sobre o hSAP glicorremodelado (SAP derivado de soro humano). A análise por Cromatografia Líquida Espectrometria de Massa (LCMS) (E) e a análise por Cromatografia Líquida de Alta Performance com Troca Aniônica (AEX-HPLC) (F) foram usadas para determinar as ligações de ácido siálico sobre o hrSAP que foi tratado com uma a.2,3- sialiltransferase para aumentar o número de ácidos siálicos ligados em 2,3 terminais sobre os glicanos do SAP. Para as figuras de LCMS, o eixo X representa a massa em Daltons, e o eixo Y representa a intensidade relativa. Para os traços de HPLC, o eixo X é o tempo em minutos, e o eixo Y são unidades de absorbância (mAU).

[0026] Figura 3. Ensaio de diferenciação em fibrócitos. Um ensaio baseado em ELISA foi usado para medir a produção de MDC após incubação dos monócitos com os polipeptídeos de variantes de SAP. O eixo Y indica a atividade relativa média de cada variante de SAP comparada a um padrão de referência de hSAP, para o qual a atividade é fixada em 1,0 (ver a barra mais à esquerda).

[0027] Figura 4. Ensaio de diferenciação em fibrócitos. Os monócitos foram tratados com hMCSF e então subsequentemente quantificados quanto à diferenciação em fibrócitos. O eixo X representa a concentração de hMCSF incubado com os monócitos doadores. O eixo Y indica a quantidade de proliferação dos fibrócitos no dia cinco, como medida pela enumeração dos fibrócitos por 5,0 x 104 células.

[0028] Figura 5. Ensaio de diferenciação em fibrócitos. Os monócitos foram tratados com hSAP e então subsequentemente quantificados quanto à diferenciação em fibrócitos. O eixo X indica a concentração de hSAP incubado com os monócitos doadores. O eixo Y indica a quantidade de proliferação dos fibrócitos no dia cinco, como medida pela enumeração dos fibrócitos por 5,0 x 104 células.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Visão Geral

[0029] A maior parte dos peptídeos de ocorrência natural tem porções de carboidratos (i.e., glicanos) unidas ao peptídeo por meio de ligações específicas a certos aminoácidos ao longo do comprimento da cadeia peptídica primária, desse modo formando "glicopeptídeos". O padrão de glicosilação sobre qualquer peptídeo dado pode ter grandes implicações para a função daquele peptídeo. Por exemplo, a estrutura dos glicanos ligados ao N sobre um peptídeo pode ter impacto sobre diversas características do peptídeo, incluindo a suscetibilidade à protease, o tráfego intracelular, a secreção, o alvejamento do tecido, a meia vida biológica, e a antigenicidade. A alteração de uma ou mais destas características afeta bastante a eficácia de um peptídeo em seu ambiente natural.

[0030] As estruturas dos glicanos encontradas nas glicoproteínas de ocorrência natural são tipicamente divididas em duas classes, glicanos ligados ao N e ligados ao O. Os peptídeos expressos em células eucarióticas são tipicamente N- glicosilados sobre resíduos de asparagina em locais na estrutura primária do peptídeo contendo a sequência asparagina-X-serina/treonina, onde X pode ser qualquer aminoácido, exceto a prolina e o ácido aspártico. A porção de carboidrato de tais peptídeos é conhecida como um glicano ligado ao N ou oligossacarídeo ligado ao N. Os eventos iniciais de N-glicosilação ocorrem no retículo endoplásmico (ER) e são conservados em mamíferos, plantas, insetos e outros eucariotos superiores. Primeiro, uma cadeia de oligossacarídeo compreendendo quatorze resíduos de açúcar é construída sobre uma molécula de veículo lipídica. À medida que o peptídeo nascente for traduzido e translocado para o ER, a cadeia inteira de oligossacarídeo é transferida para o grupo amida do resíduo de asparagina, em uma reação catalisada por uma enzima de glicosiltransferase ligada à membrana. O glicano ligado ao N é adicionalmente processado tanto no ER quanto no aparelho de Golgi. O processamento adicional geralmente envolve a remoção de alguns dos resíduos de açúcar e a adição de outros resíduos de açúcar em reações catalisadas por glicosilases e glicosiltransferases específicas para os resíduos de açúcar removidos e adicionados.

[0031] Tipicamente, as estruturas finais dos glicanos ligados ao N são dependentes do organismo no qual o peptídeo é produzido. Por exemplo, os peptídeos produzidos em bactérias são geralmente não glicosilados. Os peptídeos expressos em células de insetos tipicamente contêm cadeias de oligossacarídeos ligados ao N com alto teor de manose ou pouca manose. Os peptídeos produzidos na cultura de células mamíferas são normalmente glicosilados diferencialmente, dependendo da espécie e das condições de cultura das células. Mesmo nas mesmas espécies e sob as mesmas condições, algumas vezes é verificada certa quantidade de heterogeneidade na cadeia de glicosila. Em geral, os peptídeos produzidos nas células de plantas compreendem estruturas de glicano que diferem significativamente daquelas produzidas nas células de animais.

[0032] Uma variedade de métodos tem sido proposta na técnica para personalizar o padrão de glicosilação de um peptídeo, incluindo os métodos descritos nos Pedidos Internacionais Publicados Nos WO 99/22764, WO 98/58964, e WO 99/54342, bem como na Pat. U.S. No 5.047.335. Essencialmente, muitas das enzimas requeridas para a glicosilação in vitro dos peptídeos têm sido clonadas e seqüenciadas. Em algumas situações, estas enzimas têm sido usadas in vitro para adicionar açúcares específicos a um glicano sobre um peptídeo. Em outras situações, as células têm sido geneticamente engenheiradas para expressar uma combinação de enzimas e peptídeos desejados, de modo tal que a adição de uma porção de açúcar desejada a um peptídeo expresso ocorra dentro da célula.

[0033] Duas classes principais de enzimas são usadas na síntese de carboidratos: as glicosiltransferases e as glicosidases. As glicosiltransferases adicionam ou modificam as estruturas dos oligossacarídeos existentes sobre um peptídeo. As glicosiltransferases são efetivas para produzir produtos específicos com bom controle estereoquímico e regioquímico. As glicosiltransferases têm sido usadas para preparar oligossacarídeos e para modificar as estruturas dos carboidratos ligados ao N e ao O terminais, particularmente sobre peptídeos produzidos em células mamíferas. Por exemplo, os oligossacarídeos terminais de glicopeptídeos podem ser completamente sialilados e/ou fucosilados, para proporcionar estruturas de açúcares mais consistentes, usando as glicosiltransferases, as quais podem melhorar a farmacodinâmica do glicopeptídeo e uma variedade de outras propriedades biológicas.

[0034] As glicosidases são adicionalmente classificadas como exoglicosidases (p.ex., β-manosidase, β-glucosidase), e endoglicosidases (p.ex., Endo-A, Endo-M). As glicosidases normalmente catalisam a hidrólise de uma ligação glicosídica. Entretanto, sob condições apropriadas, elas podem ser usadas para formar esta ligação. A maior parte das glicosidases usadas para a síntese de carboidratos são exoglicosidases; a transferência de glicosila ocorre na extremidade não redutora do substrato. A glicosidase liga um doador de glicosila em um intermediário de glicosil-enzima que é interceptado pela água para produzir o produto da hidrólise, ou por um receptor, para gerar um novo glicosídeo ou oligossacarídeo. Uma via ilustrativa usando uma exoglicosidase é a síntese do trissacarídeo de núcleo de todos os glicopeptídeos ligados ao N, incluindo a ligação de β-manosideo, que é formada pela ação da β-manosidase (Singh e col., Chem. Commun. 993-994 (1996)). Embora seu uso seja menos comum do que aquele das exoglicosidases, as endoglicosidases são também utilizadas para preparar carboidratos. As endoglicosidases podem ser usadas para transferir uma cadeia de oligossacarídeo inteira, em vez de um monossacarídeo, para um polipeptídeo. Os fragmentos de oligossacarídeos têm sido adicionados aos substratos usando as endo-β-N-acetilglucosaminas, tais como a endo-F e a endo-M (Wang e col., Tetrahedron Lett. 37: 1975-1978; e Haneda e col., Carbohydr. Res. 292: 61-70 (1996). Cada uma destas classes de enzimas tem sido usada com êxito para produzir peptídeos glicosilados. Quanto a uma revisão geral, ver Crout e col., Curr. Opin. Chem. Biol. 2: 98-111 (1998).

[0035] O amilóide P de soro (SAP) é uma proteína do soro de ocorrência natural em mamíferos, composta de cinco subunidades idênticas, ou "promotores", que estão associadas não covalentemente em um complexo similar a um disco. O SAP pertence à superfamília de proteínas pentraxina, que são caracterizadas por esta estrutura pentamérica cíclica. As pentraxinas curtas clássicas incluem o SAP, bem como a proteína C reativa (Osmand, A.P., e col., Proc. Nat. Acad. Sci., 74: 739- 743, 1997). O SAP é normalmente sintetizado no fígado e tem uma meia vida fisiológica de vinte e quatro horas. A sequência da subunidade de SAP humano é divulgada abaixo, que corresponde aos aminoácidos 2-233 do Banco de genes No de Acesso NP_001630 (sequência sinal não representada). HTDLSGKVFVFPRESVTDHVNLITPLEKPLQNFTLCFRAYSDLSRAYSLFSY NTQGRDNELLVYKERVGEYSLYIGRHKVTSKVIEKFPAPVHICVSWESSSGIAEFWI NGTPLVKKGLRQGYFVEAQPKIVLGQEQDSYGGKFDRSQSFVGEIGDLYMWDSVL PPENILSAYQGTPLPANILDWQALNYEIRGYVIIKPLVWV (SEQ ID NO: 1)

[0036] A sequência da subunidade de SAP de Gallus gallus é divulgada abaixo. QEDLYRKVFVFREDPSDAYVLLQVQLERPLLNFTVCLRSYTDLTRPHSLFS YATKAQDNEILLFKPKPGEYRFYVGGKYVTFRVPENRGEWEHVCASWESGSGIAEF WLNGRPWPRKGLQKGYEVGNEAVVMLGQEQDAYGGGFDVYNSFTGEMADVHLW DAGLSPDKMRSAYLALRLPPAPLAWGRLRYEAKGDVVVKPRLREALGA (SEQ ID NO: 2)

[0037] A sequência da subunidade de SAP de Bos taurus é divulgada abaixo. QTDLRGKVFVFPRESSTDHVTLITKLEKPLKNLTLCLRAYSDLSRGYSLFSY NIHSKDNELLVFKNGIGEYSLYIGKTKVTVRATEKFPSPVHICTSWESSTGIAEFWIN GKPLVKRGLKQGYAVGAHPKIVLGQEQDSYGGGFDKNQSFMGEIGDLYMWDSVLS PEEILLVYQGSSSISPTILDWQALKYEIKGYVIVKPMVWG (SEQ ID NO: 3)

[0038] A sequência da subunidade de SAP de Cricetulus migratorius é divulgada abaixo. QTDLTGKVFVFPRESESDYVKLIPRLEKPLENFTLCFRTYTDLSRPHSLFSY NTKNKDNELLIYKERMGEYGLYIENVGAIVRGVEEFASPVHFCTSWESSSGIADFWV NGIPWVKKGLKKGYTVKTQPSIILGQEQDNYGGGFDKSQSFVGEMGDLNMWDSVL TPEEIKSVYEGSWLEPNILDWRALNYEMSGYAVIRPRVWH (SEQ ID NO: 4)

[0039] Um aspecto da presente invenção refere-se à descoberta surpreendente que a modificação de uma estrutura do glicano sobre um polipeptídeo de SAP humano pode aumentar a atividade biológica do polipeptídeo de SAP em relação a uma amostra correspondente do SAP do tipo selvagem, isolado do soro humano. Conforme demonstrado pelos exemplos da divulgação, o SAP isolado do soro humano contém somente resíduos de ácido siálico ligado em a.2,6. Em contraste, o SAP humano recombinante, produzido nas células CHO, contém somente resíduos de ácido siálico ligado em a2,3. Usando os bioensaios à base de células in vitro, demonstrou-se que os polipeptídeos de SAP tendo ácido siálico ligado em a.2,3 têm uma atividade consistentemente maior do que o SAP do tipo selvagem (i.e., o SAP compreendendo porções de ácido siálico ligado em a2,6) isolado do soro humano. Os polipeptídeos de SAP variantes da invenção seriam mais efetivos como agentes terapêuticos devido à sua potência biológica aumentada. Por exemplo, as variantes de SAP mais potentes podem requerer menor dosagem e/ou dosagem menos frequente em relação ao SAP do tipo selvagem, isolado do soro humano. A presente divulgação proporciona tanto os polipeptídeos de SAP humanos variantes quanto os métodos para preparar os mesmos. Em particular, a divulgação inclui os métodos e as composições para a adição, a remoção, ou a modificação in vitro e in vivo dos resíduos de açúcares, para produzir um polipeptídeo de SAP humano tendo um padrão de glicosilação desejado.

Definições

[0040] Salvo definição em contrário, todos os termos técnicos e científicos usados neste documento geralmente têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica. Geralmente, a nomenclatura usada neste documento e os procedimentos de laboratório na cultura de células, genética molecular, química orgânica, e química e hibridização de ácido nucléico são aqueles bastante conhecidos e comumente empregados na técnica. As práticas padrões são usadas para a síntese de ácidos nucléicos e peptídeos. As práticas e os procedimentos são geralmente efetuados de acordo com os métodos convencionais na técnica e as diversas referências gerais (p.ex., Sambrook e col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.), que são proporcionadas por todo este documento.

[0041] Os artigos "um" e "uma" são usados neste documento para referirem- se a um ou a mais do que um (i.e., a pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, "um elemento" significa um elemento ou mais do que um elemento.

[0042] Conforme usados neste documento, os termos "tratamento" e "tratar" referem-se a obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de prevenir completa ou parcialmente um distúrbio ou sintoma dele e/ou pode ser terapêutico em termos de uma cura parcial ou completa para um distúrbio e/ou efeito adverso atribuível ao distúrbio. O "tratamento", conforme usado neste documento, cobre qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, particularmente em um ser humano, e inclui: (a) aumentar o tempo de sobrevivência; (b) diminuir o risco de morte devida à doença; (c) inibir a doença, i.e., parar o seu desenvolvimento ou reduzir a taxa de progressão da doença; e (d) abrandar a doença, i.e., causar a regressão da doença.

[0043] Conforme usada neste documento, uma substância terapêutica que "inibe" ou "previne" um distúrbio ou condição é um composto que, em uma amostra estatística, reduz a ocorrência do distúrbio ou da condição na amostra tratada em relação a uma amostra de controle não tratada, ou retarda o início ou reduz a gravidade de um ou mais sintomas do distúrbio ou da condição em relação à amostra de controle não tratada.

[0044] Conforme usados neste documento, os termos "cobaia" e "paciente" referem-se aos animais, incluindo os mamíferos, tais como os seres humanos. O termo "mamífero" inclui os primatas, os animais domesticados, incluindo os cães, gatos, ovelhas, o gado, os cavalos, as cabras, os porcos, os camundongos, os ratos, os coelhos, os porquinhos da índia, os animais cativos, tais como os animais do zoológico, e os animais selvagens.

[0045] Conforme usado neste documento, o termo "tecido" refere-se a um órgão ou grupo de células especializadas, tal como o tecido da pele, o tecido do pulmão, o tecido do rim, e outros tipos de células.

[0046] O termo "efeito terapêutico" é reconhecido na técnica e refere-se a um efeito local ou sistêmico nos animais, particularmente nos mamíferos, e mais particularmente nos seres humanos, causado por uma substância farmacologicamente ativa. A expressão "quantidade terapeuticamente efetiva" significa aquela quantidade de tal substância que produz algum efeito local ou sistêmico desejado em uma razão de benefício/risco razoável, aplicável a qualquer tratamento. A quantidade terapeuticamente efetiva de tal substância variará dependendo do paciente e da condição da doença que está sendo tratada, do peso e idade do paciente, da gravidade da condição da doença, do modo de administração, a qual pode prontamente ser determinada por alguém de habilidade na técnica. Por exemplo, certas composições descritas neste documento podem ser administradas em uma quantidade suficiente para produzir um efeito desejado, em uma razão de benefício/risco razoável aplicável a tal tratamento.

[0047] Conforme usado neste documento, o termo "ácido nucléico" refere-se a um polinucleotídeo, tal como o ácido desoxirribonucléico (DNA), e, onde apropriado, o ácido ribonucléico (RNA). O termo também será entendido incluir, como equivalentes, os análogos de RNA ou DNA preparados a partir dos análogos de nucleotídeos e, conforme aplicável à modalidade que está sendo descrita, o polinucleotídeo de fita simples (tal como com sentido ou sem sentido) e de fita dupla.

[0048] Os termos "peptídeos", "proteínas" e "polipeptídeos" são usados de modo intercambiável neste documento. O termo "proteína purificada" refere-se a uma preparação de uma proteína ou proteínas que são preferivelmente isoladas de, ou de outro modo estão substancialmente livres de, outras proteínas normalmente associadas com a(s) proteína(s) em uma célula ou lisado de células. O termo "substancialmente livres de outras proteínas celulares" ou "substancialmente livres de outras proteínas contaminantes" é definido como incluindo as preparações individuais de cada uma das proteínas compreendendo menos do que 20% (por peso seco) de proteína contaminante, e preferivelmente compreende menos do que 5% de proteína contaminante. As formas funcionais de cada uma das proteínas podem ser preparadas como preparações purificadas por utilização de um gene clonado, conforme é bastante conhecido na técnica. Por "purificada" pretende-se que a molécula indicada esteja presente na ausência substancial de outras macromoléculas biológicas, tais como outras proteínas (particularmente outras proteínas que possam substancialmente mascarar, diminuir, confundir ou alterar as características das proteínas componentes, como preparações purificadas ou na sua função na mistura reconstituída exposta). O termo "purificada", conforme usado neste documento, preferivelmente significa pelo menos 80% por peso seco, mais preferivelmente na faixa de 85% por peso, mais preferivelmente 95-99% em peso, e mais preferivelmente pelo menos 99,8% em peso, de macromoléculas biológicas do mesmo tipo presentes (porém a água, os tampões, e outras moléculas pequenas, especialmente as moléculas tendo um peso molecular de menos do que 5000, podem estar presentes). O termo "pura", conforme usado neste documento, preferivelmente tem os mesmos limites numéricos como a "purificada" imediatamente acima.

[0049] Os oligossacarídeos "ligados ao N" são aqueles oligossacarídeos que estão ligados a uma cadeia principal peptídica através da asparagina, por meio de uma ligação de asparagina-N-acetilglucosamina. Os oligossacarídeos ligados ao N são também chamados "N-glicanos". Os oligossacarídeos ligados ao N de ocorrência natural têm um núcleo comum de pentassacarídeo de Man[(α1,6-)- (Man(α1,3)]-Man(β1,4)-GlcNAc(β1,4)-GlcNAc(β1,N). Eles diferem na presença de, e no número de ramificações (também chamadas antenas) de açúcares periféricos, tais como a N-acetilglucosamina, a galactose, a N-acetilgalactosamina, a fucose, e o ácido siálico. Opcionalmente, esta estrutura pode também conter uma molécula de núcleo de fucose e/ou uma molécula de xilose.

[0050] O termo "ácido siálico" refere-se a qualquer membro de uma família de açúcares carboxilados de nove carbonos. O membro mais comum da família do ácido siálico é o ácido N-acetil-neuramínico (frequentemente abreviado como Neu5Ac, NeuAc, ou NANA). Um segundo membro da família é o ácido N-glicolil- neuramínico (Neu5Gc ou NeuGc), no qual o grupo N-acetila do NeuAc está hidroxilado. Um terceiro membro da família do ácido siálico é o ácido 2-ceto-3- desóxi-nonulosônico (KDN) (Nadano e col. (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori e col., J. Biol. Chem. 265: 21811-21819 (1990)). Também estão incluídos os ácidos siálicos substituídos em 9, tais como um 9-O-C1C6-acil-Neu5Ac, como o 9- O-lactil-Neu5Ac ou o 9-O-acetil-Neu5Ac, o 9-desóxi-9-flúor-Neu5Ac e o 9-azido-9- desóxi-Neu5Ac. Quanto a uma revisão da família do ácido siálico, ver, p.ex., Varki, Glycobiology 2: 25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, Nova York (1992)).

[0051] Uma célula "geneticamente engenheirada" ou "recombinante" é uma célula tendo uma ou mais modificações no material genético da célula. Tais modificações incluem, porém não estão limitadas às inserções de material genético, remoções de material genético e inserção de material genético que seja extracromossômico, quer tal material esteja estavelmente mantido, quer não esteja.

[0052] Conforme usado neste documento, o termo "açúcar modificado" refere-se a um carboidrato de ocorrência natural ou não natural que é adicionado enzimaticamente a um aminoácido ou um resíduo de glicosila de um peptídeo, em um processo da invenção. O açúcar modificado é selecionado a partir de diversos substratos de enzimas, incluindo, porém não limitados aos nucleotídeos de açúcares (mono-, di-, e trifosfatos), açúcares ativados (p.ex., halogenetos de glicosila, mesilatos de glicosila) e açúcares que não estão nem ativados nem são nucleotídeos. Um "açúcar modificado" pode ser covalentemente funcionalizado com um "grupo modificador". Os grupos modificadores úteis incluem, porém não estão limitados aos polímeros solúveis e insolúveis em água, porções terapêuticas, porções diagnósticas, biomoléculas. O local de funcionalização com o grupo modificador é selecionado de modo tal que ele não impeça o "açúcar modificado" de ser adicionado enzimaticamente a um peptídeo ou resíduo de glicosila do peptídeo.

Polipeptídeos de SAP Variantes

[0053] Em parte, a divulgação proporciona polipeptídeos de Amilóide P de Soro (SAP) variantes. Em particular, as variantes de SAP da invenção incluem os polipeptídeos de SAP humanos glicosilados que compreendem uma ou mais cadeias de oligossacarídeos ligados ao N ou ligados ao O, cada uma independentemente tendo uma, duas, três, quatro, cinco ou mais ramificações terminando com uma porção de ácido siálico ligada em α.2,3. Em algumas modalidades, todas as ramificações das cadeias de oligossacarídeos ligados ao N ou ligados ao O terminam nas porções ligadas em α2,3. As outras variantes de SAP da invenção incluem os polipeptídeos de SAP humanos glicosilados que contêm uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O tendo pelo menos 20%, 25%, 30%, 35% 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 75%, 80%, 85%, ou mesmo pelo menos 95% menos porções de ácido siálico ligadas em α2,6 do que um polipeptídeo de SAP do tipo selvagem, derivado do soro humano. Em algumas modalidades, as cadeias de oligossacarídeos ligados ao N ou ligados ao O estão substancialmente livres de porções de ácido siálico ligadas em a2,6, p.ex., tendo menos do que 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou mesmo menos do que 99% de porções de ácido siálico ligadas em a2,6 em relação a um polipeptídeo de SAP do tipo selvagem, derivado do soro humano. Os polipeptídeos de SAP glicovariantes da invenção podem compreender um oligossacarídeo ligado ao N ou cadeia ligada ao O tendo uma ou mais ramificações (p.ex., tendo uma estrutura biantenária, triantenária, tetra- antenária, penta-antenária, etc.). Em certas modalidades, os polipeptídeos de SAP da invenção compreendem uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O onde uma, duas, três, quatro, ou cinco ramificações da cadeia de oligossacarídeo estão substancialmente livres de galactose e N-acetilglucosamina (p.ex., tendo menos do que 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou mesmo menos do que 99% de N-acetilglucosamina em relação a um polipeptídeo de SAP do tipo selvagem, derivado do soro humano). Certos polipeptídeos de SAP da invenção têm cadeias de oligossacarídeos ligados ao N ou ligados ao O que estão substancialmente livres de galactose e N-acetilglucosamina (p.ex., tendo menos do que 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% ou mesmo menos do que 99% de galactose e/ou N- acetilglucosamina em relação ao polipeptídeo de SAP do tipo selvagem, derivado do soro humano). Em algumas modalidades, os polipeptídeos de SAP da invenção compreendem uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O onde uma, duas, três, quatro, ou cinco ramificações da cadeia de oligossacarídeo contêm um ou mais resíduos de manose. Em certas modalidades, o polipeptídeo de SAP da invenção compreende um oligossacarídeo ligado ao N tendo um núcleo de pentassacarídeo de Man[(α1,6-)-(Man(α1,3)]-Man(β1,4)-GlcNAc(β1,4)- GlcNAc(β1,N)-Asn. Este núcleo de pentassacarídeo também pode compreender um ou mais resíduos de fucose ou xilose. Em certas modalidades, os polipeptídeos de SAP da invenção compreendem uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N onde uma, duas, três, quatro, ou cinco ramificações da cadeia de oligossacarídeo têm a estrutura NeuNAc2α3Galβ4GlcNAcβ2Manα6. Os polipeptídeos de SAP da invenção também podem compreender uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N onde todas as ramificações têm a estrutura NeuNAc2α3Galβ4GlcNAcβ2Manα6.

[0054] Os polipeptídeos de SAP variantes da invenção podem compreender um ou mais resíduos de açúcares "modificados". Os açúcares modificados são substituídos em qualquer posição que permita a união da porção ou do grupo modificador. Nos aspectos preferidos, o açúcar modificado é substituído em uma posição que ainda permite que o açúcar funcione como um substrato para uma enzima usada para acoplar o açúcar modificado ao peptídeo de SAP. Um grupo modificador pode ser unido a uma porção de açúcar por meios enzimáticos, meios químicos ou uma combinação destes, com isso produzindo um açúcar modificado, p.ex., galactose, fucose, ou ácido siálico modificado. Os grupos modificadores adequados para uso na presente invenção, bem como os métodos para conjugar estes grupos modificadores aos resíduos de açúcar, são descritos na seção a seguir.

[0055] Nos aspectos preferidos, os polipeptídeos de SAP variantes da invenção têm uma IC50 para inibir a diferenciação dos monócitos em fibrócitos in vitro que é menos do que a metade daquela de uma amostra correspondente de SAP do tipo selvagem, isolado do soro humano. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de SAP variantes da invenção têm uma IC50 para inibir a diferenciação dos monócitos em fibrócitos in vitro que é menos do que 1/3, menos do que 1/4, menos do que 1/10, ou menos do que 1/100 daquela de uma amostra correspondente de SAP do tipo selvagem, isolado do soro humano.

[0056] Os polipeptídeos de SAP variantes da invenção podem ser pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% idênticos à sequência de aminoácidos de SE ID NO: 1, como determinado usando o programa de computador FASTDB baseado no algoritmo de Brutlag e col. (Comp. App. Biosci., 6:237-245 (1990)). Em uma modalidade específica, os parâmetros empregados para calcular a porcentagem de identidade e similaridade de um alinhamento de aminoácidos compreendem: Matriz=PAM 150, Tupla de k=2, Penalidade de Mal Emparelhamento =1, Penalidade da União =20, Comprimento do Grupo de Randomização =0, Pontuação de Corte =1, Penalidade da Abertura =5 e Penalidade do Tamanho da Abertura =0,05.

[0057] O termo "polipeptídeo de SAP" inclui os fragmentos funcionais e as proteínas de fusão compreendendo quaisquer dos precedentes. Geralmente, um polipeptídeo de SAP será projetado para ser solúvel em soluções aquosas nas temperaturas, níveis de pH e osmolaridade biologicamente relevantes. Os promotores de SAP, que se associam conjuntamente de modo não covalente para formarem um complexo de SAP pentamérico, podem ter sequências de aminoácidos e/ou modificações pós-traducionais idênticas ou, alternativamente, os promotores de SAP individuais dentro de um único complexo podem ter diferentes sequências e/ou modificações. O termo polipeptídeo de SAP inclui os polipeptídeos compreendendo qualquer polipeptídeo de SAP de ocorrência natural, bem como qualquer variante dele (incluindo os mutantes, os fragmentos, e as fusões). Um polipeptídeo de SAP da invenção pode ser um polipeptídeo recombinante. Nas modalidades preferidas, o polipeptídeo de SAP da invenção é um polipeptídeo de SAP humano.

[0058] Em algumas modalidades, proporcionam-se composições farmacêuticas compreendendo um polipeptídeo de SAP variante da invenção, ou um seu fragmento funcional. Em alguns aspectos, a sequência de aminoácidos de uma variante de SAP pode diferir da SEQ ID NO: 1 por uma ou mais substituições conservativas ou não conservativas. Conforme usadas neste documento, as "substituições conservativas" são resíduos que são física ou funcionalmente similares aos resíduos de referência correspondentes, i.e., uma substituição conservativa e o seu resíduo de referência têm tamanho, formato, carga elétrica, e/ou propriedades químicas similares (p.ex., a capacidade de formar ligações covalentes ou de hidrogênio). As substituições conservativas preferidas são aquelas que satisfazem os critérios definidos para uma mutação pontual aceita em Dayhoff e col., Atlas of Protein Sequence and Structure 5:345-352 (1978 e Supp.). Os exemplos de substituições conservativas são as substituições dentro dos seguintes grupos: (a) valina, glicina; (b) glicina, alanina; (c) valina, isoleucina, leucina; (d) ácido aspártico, ácido glutâmico; (e) asparagina, glutamina; (f) serina, treonina; (g) lisina, arginina, metionina; e (h) fenilalanina, tirosina. Uma orientação adicional em relação a quais mudanças de aminoácidos são prováveis de serem fenotipicamente silenciosas pode ser encontrada em Bowie e col., Science 247:1306-1310 (1990).

[0059] Os polipeptídeos de SAP variantes e os fragmentos deles que conservam a função biológica são úteis nas composições farmacêuticas e nos métodos descritos neste documento. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de SAP variante ou o fragmento dele liga o FcyRI, o FcyRIIA, e/ou o FcyRIIIB. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de SAP variante ou o fragmento dele inibe uma ou mais de fibrócito, precursor de fibrócito, precursor de miofibroblasto, e/ou diferenciação do precursor de monócito hematopoiético. As variantes de SAP podem ser geradas por modificação da estrutura de um polipeptídeo de SAP para tais propósitos como aumentar a eficácia terapêutica ou a estabilidade (p.ex., a vida útil ex vivo e a resistência à degradação proteolítica in vivo).

[0060] Em certos aspectos, os polipeptídeos de SAP variantes da divulgação podem adicionalmente compreender modificações pós-traducionais, além das quaisquer que estão naturalmente presentes no polipeptídeo de SAP. Tais modificações incluem, porém não estão limitadas à acetilação, carboxilação, glicosilação (p.ex., oligossacarídeos ligados ao O, oligossacarídeos ligados ao N, etc.), fosforilação, e lipidação. Como resultado, o polipeptídeo de SAP modificado pode conter elementos que não são aminoácidos, tais como polietileno glicóis, lipídios, poli- ou monossacarídeos, e fosfatos.

[0061] Em certos aspectos, uma ou mais modificações no polipeptídeo de SAP descrito neste documento podem aumentar a estabilidade do polipeptídeo de SAP. Por exemplo, tais modificações podem aumentar a meia vida in vivo do polipeptídeo de SAP ou reduzir a degradação proteolítica do polipeptídeo de SAP.

[0062] Em certos aspectos, os polipeptídeos de SAP variantes da invenção incluem as proteínas de fusão tendo pelo menos uma porção do polipeptídeo de SAP humano e um ou mais domínios de fusão ou porções heterólogas. Os exemplos bastante conhecidos de tais domínios de fusão incluem, porém não estão limitados à poli-histidina, Glu-Glu, glutationa S transferase (GST), tiorredoxina, proteína A, proteína G, e região constante da cadeia pesada da imunoglobulina (Fc), proteína de ligação à maltose (MBP), ou soro albumina humana. Um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a conferir uma propriedade desejada. Por exemplo, alguns domínios de fusão são particularmente úteis para o isolamento das proteínas de fusão através de cromatografia por afinidade. Para o propósito de purificação por afinidade, utilizam-se matrizes relevantes para a cromatografia por afinidade, tais como as resinas conjugadas à glutationa, amilase, e níquel, ou cobalto. Como um outro exemplo, um domínio de fusão pode ser selecionado de modo a facilitar a detecção dos polipeptídeos de SAP. Os exemplos de tais domínios de detecção incluem as diversas proteínas fluorescentes (p.ex., a GFP), bem como os "marcadores de epítopos", que são sequências de peptídeos normalmente curtas para as quais está disponível um anticorpo específico. Os marcadores de epítopos bastante conhecidos para os quais estão prontamente disponíveis anticorpos monoclonais específicos incluem os marcadores de FLAG, hemaglutinina (HA) do vírus influenza e c-myc. Em alguns casos, os domínios de fusão têm um sítio de clivagem de protease que permite que a protease relevante digira parcialmente as proteínas de fusão e, com isso, libere a proteína recombinante delas. As proteínas liberadas podem então ser isoladas do domínio de fusão por separação cromatográfica subsequente. Em alguns casos, o polipeptídeo de SAP pode ser fundido a um domínio heterólogo que estabiliza o polipeptídeo de SAP in vivo. Por "estabilizar" pretende-se qualquer coisa que aumente a meia vida no soro, independente de se isto é por causa da destruição diminuída, da depuração diminuída pelo rim, ou de outro efeito farmacocinético. As fusões com a porção de Fc de uma imunoglobulina e soro albumina são sabidas conferirem estabilidade aumentada.

[0063] Entende-se que os diferentes elementos das proteínas de fusão podem ser dispostos em qualquer modo que seja consistente com a funcionalidade desejada. Por exemplo, um polipeptídeo de SAP pode ser colocado C terminal a um domínio heterólogo ou, alternativamente, um domínio heterólogo pode ser colocado C terminal a um polipeptídeo de SAP. O polipeptídeo de SAP e o domínio heterólogo não necessitam estar adjacentes em uma proteína de fusão, e domínios adicionais ou sequências de aminoácidos (p.ex., as sequências ligadoras) podem ser incluídas C ou N terminais a cada domínio ou entre os domínios.

Métodos de Produzir Moléculas de N-Glicosilação Alterada

[0064] São descritos neste documento métodos de produzir polipeptídeos de SAP humanos variantes. Os métodos geralmente envolvem uma etapa de contatar um polipeptídeo de SAP com um ou mais agentes químicos ou enzimáticos, para produzir ou modificar uma estrutura de glicosilação sobre o polipeptídeo de SAP. Os métodos podem ser baseados em células ou não baseados em células.

[0065] As enzimas úteis para produzir ou modificar as estruturas dos glicanos são bastante conhecidas na técnica. A maior parte das enzimas/proteínas úteis nos métodos da divulgação pode ser categorizada em uma de duas classes funcionais: glicosiltransferases e glicosidases. As glicosiltransferases (p.ex., as N- acetilglucosaminil-transferases, as galactosil-transferases, as fucosil-transferases, as sialil-transferases, as glucosil-transferases, as manosil-transferases, etc.), como usadas neste documento, referem-se a qualquer enzima/proteína que tenha a capacidade de transferir um açúcar doador para uma porção receptora. As glicosidases (p.ex., as glucosidases, as manosidases, as N-acetilglucosaminidases, as sialidases, as fucosidases, etc.), como usadas neste documento, referem-se a qualquer enzima/proteína que tenha a capacidade de catalisar a hidrólise da ligação glicosídica entre as porções de açúcar.

[0066] Os métodos baseados em células para produzir as formas glico alteradas de um polipeptídeo de SAP utilizam as células do tipo selvagem (p.ex., as células CHO) ou geneticamente engenheiradas que tenham pelo menos uma atividade de glicosilação modificada em relação a uma célula humana. As células adequadas para os métodos da divulgação incluem, por exemplo, as células fúngicas, a célula procariótica (i.e., bactérias, Archaea), as células de plantas, ou as células de animais (p.ex., nematóide, inseto, planta, ave, réptil, ou mamífero (p.ex., um camundongo, rato, coelho, hamster, gerbo, cão, gato, cabra, porco, vaca, cavalo, baleia, macaco, ou ser humano)). As células podem ser células primárias, células imortalizadas, ou células transformadas. Tais células podem ser obtidas de uma variedade de fontes comerciais e instalações de recursos de pesquisa, p.ex., a American Type Culture Collection (Rockville, Md.). Em certos aspectos, a célula usada para produzir um polipeptídeo de SAP variante é uma célula CHO.

[0067] O termo "atividade de glicosilação" refere-se a qualquer atividade que seja (i) capaz de adicionar glicanos ligados ao N ou ligados ao O a uma molécula alvo (i.e., uma atividade da oligossacaril-transferase); (ii) remover os glicanos ligados ao N ou ligados ao O de uma molécula alvo; (iii) modificar um ou mais glicanos ligados ao N ou ligados ao O sobre uma molécula alvo; (iv) modificar os oligossacarídeos ligados ao dolicol; (v) capaz de auxiliar a atividade de uma ou mais das atividades sob i-iv. Desse modo, a atividade de glicosilação inclui, por exemplo, a atividade da glicosidase, a atividade da glicosiltransferase, a síntese de nucleotídeo de açúcar, a modificação, ou a atividade do transportador. A modificação de um ou mais glicanos ligados ao N ou ligados ao O sobre uma molécula alvo inclui a ação de uma atividade da manosilfosforil-transferase, uma atividade da cinase, ou uma atividade da fosfatase, p.ex., uma manosilfosforil- transferase, uma cinase, ou uma atividade da fosfatase que altera o estado de fosforilação dos glicanos sobre as moléculas alvo.

[0068] As células engenheiradas, úteis nos métodos da divulgação, podem ter uma ou mais modificações genéticas, incluindo, porém não limitadas à: (i) remoção de um gene endógeno codificando uma proteína tendo atividade de glicosilação; (ii) introdução de um ácido nucléico recombinante codificando uma forma mutante de uma proteína (p.ex., proteína endógena ou exógena) tendo uma atividade de glicosilação; (iii) introdução ou expressão de uma molécula de RNA que interfere com a expressão funcional de uma proteína tendo a atividade de glicosilação; (iv) introdução de um ácido nucléico recombinante codificando uma proteína do tipo selvagem (p.ex., endógena ou exógena) tendo atividade de glicosilação; ou (v) alteração dos elementos promotores ou reforçadores de um ou mais genes endógenos codificando proteínas tendo atividade de glicosilação para, desse modo, alterar a expressão das proteínas codificadas. As moléculas de RNA descritas acima incluem, por exemplo, o RNA interferente pequeno (siRNA) o RNA hairpin curto (shRNA), o RNA sem sentido, ou o micro RNA (miRNA). Entende-se que o item (ii) inclui, por exemplo, a substituição de um gene endógeno (p.ex., por recombinação homóloga) por um gene codificando uma proteína tendo maior atividade de glicosilação em relação ao gene endógeno assim substituído.

[0069] As células geneticamente engenheiradas descritas neste documento têm uma ou mais atividades de glicosilação alterada, tais como: (i) um aumento em uma ou mais atividades de glicosilação na célula geneticamente modificada, (ii) uma diminuição em uma ou mais atividades de glicosilação na célula geneticamente modificada, (iii) uma mudança na localização ou na distribuição intracelular de uma ou mais atividades de glicosilação na célula geneticamente modificada, ou (iv) uma mudança na razão de uma ou mais atividades de glicosilação na célula geneticamente modificada em relação a uma célula não modificada da mesma origem. Entende-se que um aumento na quantidade de atividade de glicosilação possa ser devido à superexpressão de uma ou mais proteínas tendo atividade de glicosilação, a um aumento no número de cópias de um gene endógeno (p.ex., duplicação do gene), ou a uma alteração no promotor, reforçador, ou supressor de um gene endógeno que estimula um aumento na expressão da proteína codificada pelo gene. Uma diminuição em uma ou mais atividades de glicosilação pode ser devida à superexpressão de uma forma mutante (p.ex., uma forma negativa dominante) de uma ou mais proteínas tendo atividades que alteram a glicosilação, à introdução ou à expressão de uma ou mais moléculas de RNA interferente que reduzem a expressão de uma ou mais proteínas tendo uma atividade de glicosilação, ou à remoção de um ou mais genes endógenos que codificam uma proteína tendo atividade de glicosilação.

[0070] As células geneticamente engenheiradas, usadas pelos métodos da divulgação, podem expressar (p.ex., superexpressar) os genes do tipo selvagem ou mutantes que codificam proteínas tendo atividade de glicosilação. Tais genes incluem, porém não estão limitados ao ALG7, ALG13, ALG14, ALG1, ALG2, ALG11, RFT1, ALG3, ALG9, ALG12, ALG6, ALG8, ANL1, ALG10, ALG5, OST3, OST4, OST6, STT3, OST1, OST5, WBP1, SWP1, OST2, DPM1, SEC59, OCH1, MNN9, VAN1, MNN8, MNN10, MNN11, HOC1, MNN2, MNN5, MNN6, KTR1, YUR1, MNN4, KRE2, KTR2, KTR3, MNN1, MNS1, MNN4, PNO1, MNN9, glucosidase I, glucosidase II, ou endomanosidase. Os genes codificando as proteínas tendo atividade de glicosilação podem ser a partir de quaisquer espécies (p.ex., eucariotos inferiores (p.ex., fungo (incluindo as leveduras) ou tripanossomos), procariotos (i.e., bactérias ou Archaea), planta, ou animal (p.ex., inseto, ave, réptil, ou mamífero, tal como camundongo ou rato, cão, gato, cavalo, cabra, vaca, porco, primata não humano, ou ser humano). Entende-se que as células geneticamente engenheiradas, usadas para os métodos da divulgação, podem expressar qualquer número de genes (p.ex., genes codificando proteínas tendo atividade de glicosilação) e/ou qualquer combinação de um ou mais (p.ex., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10, 11, 12, 15, ou 20 ou mais) de quaisquer dos genes descritos neste documento. Além disso, quaisquer células geneticamente engenheiradas, usadas pelos métodos da divulgação, podem compreender qualquer número de mutações que alterem ou anule uma ou mais atividades de glicosilação.

[0071] Em algumas modalidades, o termo "expressão gênica" ou "expressão" refere-se aos processos celulares pelos quais se produz um polipeptídeo biologicamente ativo a partir de uma sequência de DNA e exibe uma atividade biológica em uma célula. Como tal, a expressão gênica envolve os processos de transcrição e tradução, porém também envolve os processos pós- transcricionais e pós-traducionais que podem influenciar uma atividade biológica de um gene ou produto de gene. Estes processos incluem, porém não estão limitados às sínteses de RNA, processamento, e transporte, bem como síntese de polipeptídeos, transporte, e modificação pós-traducional dos polipeptídeos.

[0072] Por exemplo, a divulgação proporciona métodos para preparar um polipeptídeo de SAP da invenção por expressão de um gene de SAP em uma célula. Em algumas modalidades, a célula pode conter um gene de SAP endógeno ou o seu fragmento. Em outras modalidades, um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo de SAP exógeno ou o seu fragmento pode ser introduzido (p.ex., transformado, transfectado, etc.) em uma célula. Os polinucleotídeos de SAP adequados que podem ser introduzidos em uma célula incluem os fragmentos de ácidos nucléicos, bem como as construções de ácidos nucléicos ou os vetores de expressão. Nas modalidades preferidas, o gene endógeno ou exógeno codifica um polipeptídeo de SAP humano.

[0073] Em algumas modalidades, o fragmento de ácido nucléico, p.ex., que codifica um polipeptídeo de SAP humano, usado para transformar a célula hospedeira, pode incluir um sítio de Shine-Dalgarno (p.ex., um sítio de ligação de ribossomo) e um sítio de iniciação (p.ex., o códon ATG) para iniciar a tradução da mensagem transcrita para produzir a enzima. Ele pode também incluir uma sequência de terminação para finalizar a tradução. Uma sequência de terminação é tipicamente um códon para o qual não existe nenhum aminoacetil-tRNA correspondente, assim terminando a síntese do polipeptídeo. Em algumas modalidades, uma construção de ácido nucléico codificando um polipeptídeo de SAP pode ser liberada, por exemplo, como um plasmídio de expressão que, quando transcrito na célula, produz um polipeptídeo de SAP.

[0074] Em algumas modalidades, um vetor de expressão adequado compreende uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo de SAP da invenção operavelmente ligado a pelo menos uma sequência reguladora. As sequências reguladoras são reconhecidas na técnica e são selecionadas para guiar a expressão de quaisquer dos polipeptídeos da divulgação. Desse modo, o termo sequência reguladora inclui os promotores, os reforçadores e os outros elementos de controle da expressão.

[0075] As sequências reguladoras ilustrativas são descritas em Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego, CA (1990). Por exemplo, qualquer sequência de controle da expressão que regule a expressão de uma sequência de DNA quando operativamente ligada a ela pode ser usada nestes vetores para expressar quaisquer dos polipeptídeos da divulgação. Tais sequências de controle da expressão úteis incluem, por exemplo, os promotores iniciais e tardios de SV40, o promotor tet, o promotor inicial imediato de adenovírus ou citomegalovírus, o sistema lac, o sistema trp, o sistema TAC ou TRC, o promotor T7 cuja expressão é dirigida pela T7 RNA polimerase, as regiões operadoras e promotoras principais do fago lambda, as regiões de controle para a proteína de cobertura fd, o promotor para a 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, os promotores da ácido fosfatase, p.ex., o Pho5, os promotores do fator de acasalamento α da levedura, o promotor de poliedro do sistema de baculovírus e outras sequências sabidas controlarem a expressão de genes de células procarióticas ou eucarióticas ou seus vírus, e suas diversas combinações. Deve ser entendido que o projeto do vetor de expressão pode depender de tais fatores como a escolha da célula hospedeira a ser transformada e/ou o tipo de proteína desejada ser expressa. Além disso, o número de cópias do vetor, a capacidade de controlar este número de cópias e a expressão de qualquer outra proteína codificada pelo vetor, tal como os marcadores antibióticos, devem também ser considerados.

[0076] Em algumas modalidades, o fragmento de ácido nucléico ou o sistema de expressão usado para transformar a célula hospedeira opcionalmente pode incluir uma ou mais sequências marcadoras. Falando de um modo geral, as sequências marcadoras adequadas tipicamente codificam um produto de gene, normalmente uma enzima que inativa ou, de outro modo, detecta ou é detectada por um composto no meio de crescimento. Por exemplo, a inclusão de uma sequência marcadora pode tornar a célula transformada resistente a um antibiótico, ou ela pode conferir um metabolismo específico para o composto sobre a célula transformada. Os exemplos das sequências marcadoras adequadas que conferem resistência incluem a canamicina, a ampicilina, o cloranfenicol e a tetraciclina. Alternativamente, em vez da pressão seletiva, um gene marcador pode ser usado que permita a detecção de colônias particulares contendo o gene, tal como a β-galactosidase, onde um substrato é empregado que proporciona um produto colorido.

[0077] Uma variedade de métodos é adequada para transformar uma célula da presente invenção com um fragmento de ácido nucléico ou vetor de expressão. Os métodos de transformação comuns incluem a eletroporação, a transformação mediada por lipossomo, a transformação mediada por cálcio, e a transfecção mediada por vírus.

[0078] Em certos aspectos, quando uma célula hospedeira for transformada com um fragmento de ácido nucléico ou sistema de expressão da presente invenção, o gene (p.ex., o SAP humano) no dito sistema pode ser integrado no DNA cromossômico das células hospedeiras por uma assim chamada recombinação homóloga e o sistema de expressão será carregado estavelmente no hospedeiro.

[0079] Para integrar o sistema de expressão no vetor no DNA cromossômico das células hospedeiras, pode ser usado um gene marcador de seleção apropriado, onde o dito gene marcador tem uma sequência homóloga ao gene sobre o DNA cromossômico da célula hospedeira específica. Os marcadores de seleção para tal propósito podem ser facilmente selecionados por uma pessoa versada. Como um exemplo, um marcador preferido é um gene que existe sobre um cromossomo e refere-se ao metabolismo das células hospedeiras. A saber, é preferido usar um hospedeiro que tenha sido modificado em um modo tal que o gene acima mencionado sobre o cromossomo seja inativado por um meio apropriado, tal como uma mutação. O hospedeiro pode então ser submetido a uma recombinação homóloga com um vetor de expressão contendo o gene intacto correspondente, em consequência do que somente transformantes que contenham o gene do metabolismo normal possam desenvolver para serem selecionados. Portanto, se tal gene marcador tiver sido introduzido no vetor de expressão, uma recombinação homóloga ocorrerá entre o gene marcador no dito vetor de expressão e a porção correspondente do DNA cromossômico, pelo que o cassete de expressão do gene heterólogo simultaneamente será integrado no DNA cromossômico.

[0080] Em algumas modalidades, o termo "expressar" uma proteína em uma célula também inclui os métodos de introduzir uma proteína propriamente dita nas células. Portanto, em certos aspectos, a divulgação proporciona métodos para preparar um polipeptídeo de SAP da invenção por introdução de um polipeptídeo de SAP em uma célula. As práticas para introduzir os polipeptídeos diretamente em uma célula são conhecidas na técnica e geralmente envolvem um processo de permeação da membrana celular. Tais práticas incluem, porém não estão limitadas à microinjeção dos polipeptídeos de SAP; encapsulação de um polipeptídeo de SAP dentro das vesículas da membrana (p.ex., lipossomos, corpos capsulares, traços de eritrócitos, protoplastos, etc.) e contato delas com uma membrana celular para, desse modo, causar a introdução intracelular do polipeptídeo de SAP por fusão; utilização de métodos físicos (p.ex., mecânicos, químicos, elétricos, etc.) que se valem das macromoléculas que entram nas células por difusão através de orifícios transientemente introduzidos em suas membranas plasmáticas (p.ex., carga por abrasão, carga de glóbulos, etc.); e por absorção através de endocitose natural devida à fagocitose celular. Um método de introdução celular pode utilizar uma via mediada por receptor, onde um de diversos receptores expressos sobre a superfície celular é definido como um alvo e um polipeptídeo de SAP é unido (de modo covalente ou não covalente) ao ligante cognato que atua como uma porção de veículo. Foram descritos diversos métodos para introduzir as proteínas nas células vivas usando adsorção eletrostática, onde a proteína é primeiramente cationizada e então contatada com a superfície negativamente carregada de uma célula (Ver a Publicação de Patente Japonesa No 2004/049214).

[0081] Em certos aspectos, a divulgação proporciona células CHO que expressam um polipeptídeo de SAP. Em algumas modalidades, a célula CHO expressa um polipeptídeo de SAP exógeno. Nas modalidades preferidas, a célula CHO expressa um polipeptídeo de SAP humano. Em algumas modalidades, a divulgação proporciona células CHO compreendendo uma sequência de polinucleotídeos codificando um polipeptídeo de SAP. Nas modalidades preferidas, a sequência de polinucleotídeos codifica um polipeptídeo de SAP humano. Quaisquer das técnicas antes mencionadas podem ser usadas para "expressar" um polipeptídeo de SAP da invenção em uma célula CHO ou qualquer outra célula adequada, divulgada neste documento.

[0082] Onde quaisquer das atividades de glicosilação da célula do tipo selvagem ou geneticamente engenheirada forem capazes de indução ou condicionais na presença de um sinal indutor (p.ex., um sinal químico ou físico), a célula do tipo selvagem ou geneticamente engenheirada pode, opcionalmente, ser cultivada na presença de um agente indutor antes, durante, ou subsequente à introdução do ácido nucléico codificando um polipeptídeo de SAP ou um polipeptídeo de SAP. Por exemplo, após a introdução do polipeptídeo de SAP, a célula pode ser exposta a um agente indutor químico que seja capaz de promover a expressão de uma ou mais proteínas tendo uma atividade de N-glicosilação do tipo selvagem ou alterada. Onde múltiplos sinais indutores induzirem a expressão condicional de uma ou mais proteínas tendo atividade de N-glicosilação do tipo selvagem e/ou alterada, uma célula pode ser contatada com múltiplos agentes indutores. Em algumas modalidades, o meio de cultura pode ser modificado para produzir a estrutura do glicano desejada sobre o polipeptídeo de SAP. Por exemplo, a concentração de soro, glicose, e/ou lipídio (p.ex., dolicol) do meio pode ser modificada para a produção ótima do glicovariante de SAP desejado. Em algumas modalidades, a temperatura, o pH, e/ou a osmolaridade do meio de cultura podem ser alterados para a produção ótima do glicovariante de SAP desejado.

[0083] Um polipeptídeo de SAP variante da invenção pode ser adicionalmente processado in vivo ou pode ser processado in vitro antes ou depois do isolamento da célula ou do meio de células. O processamento adicional pode incluir a modificação de um ou mais resíduos de glicano do polipeptídeo de SAP ou a modificação no polipeptídeo de SAP que não em sua(s) estrutura(s) de glicano. Em algumas modalidades, o processamento adicional do polipeptídeo de SAP pode incluir a adição (união covalente ou não covalente) de uma ou mais porções heterólogas. Em algumas modalidades, o processamento adicional envolve o tratamento enzimático ou químico do polipeptídeo de SAP. O tratamento enzimático pode envolver o contato do polipeptídeo de SAP com uma ou mais glicosidase, fosfodiesterase, fosfolipase, glicosiltransferase, ou protease, por um tempo suficiente para induzir a modificação, a adição, ou a remoção dos resíduos de glicano (p.ex., galactose, manose, fucose, ácido siálico, xilose, N-acetilglucosamina, etc.) sobre o polipeptídeo de SAP. A personalização de uma cadeia de oligossacarídeo ligado ao N pode ser efetuada pela modificação, adição, ou remoção sequencial das porções de açúcar desejadas, usando práticas bastante conhecidas na técnica. A clivagem enzimática das porções de carboidrato sobre as variantes de peptídeos pode ser obtida pelo uso de uma variedade de endo- e exo-glicosidases, conforme descrito por Thotakura e col., 1987, Meth. Enzymol. 138: 350. Os métodos ilustrativos de adicionar porções de açúcar são divulgados nas Pats. U.S. Nos 5.876.980, 6.030.815, 5.728.554, e 5.922.577.

[0084] Em certas modalidades, a modificação da estrutura de glicano do SAP requer a presença de um ou mais nucleotídeos de açúcar. Os nucleotídeos de açúcar ilustrativos que são usados na presente invenção incluem os mono-, di- ou trifosfatos de nucleotídeos ou os seus análogos. Em uma modalidade preferida, o nucleotídeo de açúcar modificado é selecionado a partir de um UDP-glicosídeo, CMP-glicosídeo, ou um GDP-glicosídeo. Ainda mais preferivelmente, o nucleotídeo de açúcar é selecionado a partir de uma UDP-galactose, UDP-galactosamina, UDP- glicose, UDP-glucosamina, GDP-manose, GDP-fucose, CMP-ácido siálico, CMP- ácido N-glicolilneuramínico ou CMP-NeuAc. Em certas modalidades, um nucleotídeo de açúcar modificado é utilizado para adicionar um resíduo de açúcar modificado ao polipeptídeo de SAP. Os derivados de N-acetilamina dos nucleotídeos de açúcar são também de uso no método da invenção.

[0085] A adição ou a remoção química de porções de glicosila pode ser realizada por qualquer método adequado. Por exemplo, a desglicosilação química pode envolver a exposição do polipeptídeo de SAP ao ácido trifluormetanossulfônico, ou um outro ácido forte. Este tratamento resulta na clivagem da maior parte ou de todos os açúcares, exceto o açúcar de ligação (N- acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), ao mesmo tempo deixando o peptídeo intacto. Os métodos de desglicosilação química são descritos por Haldmuddin e col., 1987, Arch. Biochem. Biophys. 259: 52 e por Edge e col., 1981, Anal. Biochem. 118: 131. O tratamento químico pode, por exemplo, envolver o contato do polipeptídeo de SAP alterado com um ácido, tal como o ácido fluorídrico, por um tempo suficiente para induzir a modificação do polipeptídeo de SAP. O tratamento com ácido fluorídrico, sob certas condições, remove especificamente os resíduos de manose que são ligados pelo fosfodiéster aos glicanos, ao mesmo tempo deixando o fosfato sobre o glicano. Um polipeptídeo de SAP alterado pode ser adicionalmente processado por adição ou remoção de um grupo fosfato a partir de um ou mais N- glicanos. Por exemplo, um polipeptídeo de SAP alterado pode ser contatado com uma manosil cinase ou uma manosil fosfatase.

[0086] Em certos aspectos, é desejável modificar somente as porções de açúcar terminais sobre a estrutura do glicano do polipeptídeo de SAP (oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O). Em algumas modalidades, uma ou mais ramificações da estrutura do glicano do SAP são modificadas pela adição, remoção, substituição ou modificação de pelo menos um resíduo de ácido siálico terminal. Os métodos adequados para modificar os glicanos descritos neste documento podem ser usados para alterar somente a porção de açúcar terminal sobre a estrutura do glicano do SAP. Em algumas modalidades, um resíduo de ácido siálico terminal tendo uma ligação de a.2,6, uma ligação de a.2,8, ou uma ligação de a.2,9 é substituído por um ou mais resíduos de ácido siálico ligados em a2,3 terminais. Em um aspecto particular, o SAP humano compreendendo os resíduos siálicos ligados em a2,6 terminais é modificado de acordo com um dos métodos da divulgação, para substituir um ou mais dos resíduos siálicos ligados em a.2,6 terminais por um ou mais resíduos de ácido siálico ligados em a2,3. Em algumas modalidades, um resíduo de ácido siálico ligado em a2,3 terminal é modificado para adicionar um ou mais resíduos de ácido siálico ligados em a2,6, ligados em a2,8, e/ou ligados em a2,9.

[0087] Em certos aspectos, o processo de preparar um polipeptídeo de SAP da invenção envolve uma primeira etapa de desglicosilação do polipeptídeo de SAP. O polipeptídeo de SAP pode ser parcial ou totalmente desglicosilado. Em algumas modalidades, a primeira etapa da desglicosilação envolve remover somente as porções de açúcar terminais de pelo menos uma ramificação da estrutura de glicano sobre o polipeptídeo de SAP. Em algumas modalidades, a primeira etapa da desglicosilação remove pelo menos um resíduo de ácido siálico ligado em a2,6. Em algumas modalidades, a primeira etapa de desglicosilação remove pelo menos um glicano ligado em O. Em algumas modalidades, a primeira etapa de desglicosilação remove pelo menos um glicano ligado em N. Em algumas modalidades, a primeira etapa de desglicosilação remove todos os glicanos ligados em O e ligados em N. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de SAP desglicosilado (parcial ou totalmente) é adicionalmente processado de acordo com os métodos da divulgação, que incluem, porém não estão limitados a modificar enzimática ou quimicamente o polipeptídeo de SAP parcial ou totalmente desglicosilado, introduzir o polipeptídeo de SAP parcial ou totalmente desglicosilado em uma célula, ou sua combinação, onde o(s) método(s) produz(em) um polipeptídeo de SAP variante da invenção. Em algumas modalidades, após um polipeptídeo de SAP parcial ou totalmente desglicosilado ter sido introduzido em uma célula, ele pode ser adicionalmente modificado, in vivo ou in vitro, de acordo com os métodos da divulgação, para produzir um polipeptídeo de SAP variante da invenção. Similarmente, um polipeptídeo de SAP parcial ou totalmente desglicosilado que é modificado in vitro, usando os métodos enzimáticos ou químicos descritos neste documento, pode ser introduzido em uma célula para produzir um polipeptídeo de SAP variante da invenção.

[0088] Entende-se que um polipeptídeo de SAP da invenção possa ser, porém não necessita ser, processado em uma célula. Por exemplo, a divulgação também proporciona métodos sem células de produzir um polipeptídeo de SAP variante da invenção. Em alguns aspectos, os métodos sem células incluem a etapa de contatar um polipeptídeo de SAP, sob condições de glicosilação, com um lisado de células preparado a partir de uma célula do tipo selvagem (p.ex., uma célula fúngica, uma célula de planta, ou uma célula de animal) ou célula geneticamente engenheirada tendo pelo menos uma atividade de glicosilação modificada, onde o contato do polipeptídeo de SAP com o lisado de células une um oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O ao polipeptídeo de SAP ou modifica um oligossacarídeo ligado ao N ou ligado ao O existente sobre o polipeptídeo de SAP. Por "condições de N-glicosilação" pretende-se que uma mistura (p.ex., de polipeptídeo de SAP e lisado de células) seja incubada sob condições que permitam a N-glicosilação alterada desejada.

[0089] Os métodos adequados para obter os lisados de células que conservam a atividade ou a integridade de uma ou mais atividades de glicosilação no lisado podem incluir o uso de tampões e/ou inibidores apropriados, incluindo os inibidores da nuclease, protease e fosfatase que conservam ou minimizam as alterações nas atividades de N-glicosilação no lisado de células. Tais inibidores incluem, por exemplo, os agentes quelantes, tais como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), o ácido etileno glicol bis(éter P-aminoetílico) N,N,N1,N1-tetracético (EGTA), os inibidores das proteases, tais como o fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF), a aproptinina, a leupeptina, a antipaína, e os inibidores das fosfatases, tais como o fosfato, o fluoreto de sódio, e o vanadato. Os inibidores podem ser escolhidos de modo tal que eles não interfiram com, ou somente minimamente afetem de modo adverso, a atividade, ou as atividades, de N- glicosilação de interesse. Os tampões e as condições apropriadas para obter os lisados contendo atividades enzimáticas são descritos, p.ex., em Ausubel e col. Current Protocols in Molecular Biology (Supplement 47), John Wiley & Sons, Nova York (1999); Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Harlow e Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1999); Tietz Textbook of Clinical Chemistry, 3a ed. Burtis e Ashwood, eds. W.B. Saunders, Filadélfia, (1999).

[0090] Um lisado de células pode ser adicionalmente processado para eliminar ou minimizar a presença de substâncias interferentes, conforme apropriado. Se desejado, um lisado de células pode ser fracionado por qualquer de uma variedade de métodos bastante conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo o fracionamento subcelular, e as técnicas cromatográficas, tais como a cromatografia de troca iônica, hidrofóbica e de fase reversa, por exclusão de tamanho, por afinidade, e por indução de carga hidrofóbica (ver, p.ex., Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, terceira edição, Springer-Verlag, Nova York (1993); Burton e Harding, J. Chromatogr. A 814:71-81 (1998)), ou qualquer outra técnica de purificação adequada.

[0091] Um lisado de células pode ser preparado, no qual as organelas celulares inteiras permaneçam intactas e/ou funcionais. Por exemplo, um lisado pode conter um ou mais de retículo endoplásmico áspero intacto, retículo endoplásmico liso intacto, ou aparelho de Golgi intacto. Os métodos adequados para preparar os lisados contendo organelas celulares intactas e testar a funcionalidade das organelas são descritos, p.ex., em Moreau e col. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4329-4333; Moreau e col. (1991) J. Biol. Chem. 266(7):4322-4328; Rexach e col. (1991) J. Cell Biol. 114(2):219-229; e Paulik e col. (1999) Arch. Biochem. Biophys. 367(2):265-273; cujas divulgações de cada são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[0092] O polipeptídeo de SAP pode ser contatado com somente uma proteína purificada tendo atividade de glicosilação. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de SAP pode ser contatado com mais do que uma proteína purificada tendo atividade de glicosilação. Uma ou mais proteínas tendo atividade de glicosilação podem ser purificadas usando técnicas padrões de isolamento da proteína. Um polipeptídeo de SAP pode ser contatado com uma ou mais proteínas, em um tampão adequado, por um tempo suficiente para induzir a modificação dos polipeptídeos de SAP, conforme descrito acima. O polipeptídeo de SAP pode ser contatado com mais do que uma proteína ao mesmo tempo ou sequencialmente. Onde o polipeptídeo de SAP for contatado sequencialmente com mais do que uma proteína tendo atividade de glicosilação, o polipeptídeo de SAP pode, porém não necessita, ser purificado após uma ou mais etapas. Ou seja, um polipeptídeo de SAP pode ser contatado com a atividade da proteína "A" e então purificado antes do contato da molécula com a atividade da proteína "B". Os métodos de modificar os peptídeos como tais são conhecidos na técnica, p.ex., Lee e Park (2002) 30(6):716- 720 e Fujita e Takegawa (2001) Biochem. Biophys. Res. Commun. 282(3):678-682, cujas divulgações são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

[0093] Em certos aspectos, os métodos da divulgação compreendem uma etapa de isolar um polipeptídeo de SAP, p.ex., de uma célula ou de componentes de um lisado de células. Muitas práticas padrões para o isolamento da proteína são conhecidas na técnica. Por exemplo, os métodos de isolar os polipeptídeos incluem, porém não estão limitados à cromatografia por exclusão de tamanho, cromatografia de fase reversa, cromatografia líquida (p.ex., HPLC), cromatografia por afinidade (p.ex., cromatografia por quelação de metal ou imunoafinidade), cromatografia de troca iônica, cromatografia por interação hidrofóbica, precipitação, solubilização diferencial, imunoprecipitação, centrifugação (p.ex., ultracentrifugação, centrifugação com gradiente de sacarose, etc.) ou qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de SAP pode ser conjugado a um marcador de afinidade para facilitar a purificação do polipeptídeo. Os marcadores de afinidade adequados para a purificação do SAP incluem, porém não estão limitados aos marcadores de proteína de ligação de quitina (CBP), proteína de ligação de maltose (MBP), glutationa-S-transferase (GST), estreptavidina, biotina, e poli(His). Os marcadores de afinidade podem ser produzidos como parte da proteína recombinante (i.e., como uma proteína de fusão compreendendo um domínio de marcador de afinidade heterólogo e um domínio de polipeptídeo de SAP) ou unidos (covalente ou não covalentemente) in vivo ou in vitro ao polipeptídeo de SAP. Em algumas modalidades, podem ser usadas múltiplas etapas de purificação para isolar um polipeptídeo de SAP. Por exemplo, um polipeptídeo de SAP compreendendo um marcador de purificação pode ser purificado por afinidade a partir de um lisado de células ou mistura de múltiplos componentes usando a purificação por afinidade. Então, o polipeptídeo de SAP purificado por afinidade pode ser adicionalmente purificado para remover quaisquer contaminantes indesejados secundários por uma etapa de purificação adicional, p.ex., cromatografia por exclusão de tamanho ou RP- HPLC. Onde um polipeptídeo da invenção for produzido em uma célula, o polipeptídeo de SAP pode ser isolado da célula propriamente dita ou dos meios no quais a célula foi cultivada. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de SAP da invenção são produzidos e secretados de uma célula para os meios de cultura. Nestas modalidades, o isolamento pode compreender a separação da fração celular da fração contendo SAP, solúvel (p.ex., por centrifugação).

[0094] Em alguns aspectos, pode ser vantajoso ligar o polipeptídeo de SAP a um suporte de fase sólida antes de contatar a molécula alvo com uma ou mais atividades de N-glicosilação. Tal ligação pode permitir a purificação mais fácil após as modificações de N-glicosilação. Os suportes de fase sólida adequados incluem, porém não estão limitados às placas de ensaio de múltiplas cavidades, partículas (p.ex., partículas magnéticas ou codificadas), uma coluna de cromatografia, ou uma membrana.

[0095] Em algumas modalidades, quaisquer dos polipeptídeos de SAP alterados descritos neste documento podem ser unidos a uma porção heteróloga usando meio enzimático ou químico. Uma "porção heteróloga" refere-se a qualquer constituinte que seja unido (p.ex., covalente ou não covalentemente) à molécula alvo alterada, constituinte este que é diferente de um constituinte originalmente presente sobre o polipeptídeo de SAP. As porções heterólogas incluem, por exemplo, os polímeros solúveis e insolúveis em água, as porções de alvejamento, as porções terapêuticas, as porções diagnósticas, e as biomoléculas.

[0096] Os polipeptídeos de SAP da invenção podem compreender um ou mais resíduos de açúcares "modificados". Um grupo modificador pode ser unido a uma porção de açúcar por meio enzimático, meio químico ou uma combinação destes, com isso produzindo um açúcar modificado, p.ex., galactose, fucose, ou ácido siálico modificado. Quando um ácido siálico modificado for usado, pode ser usada nestes métodos uma sialil-transferase ou uma trans-sialidase. Os açúcares podem ser substituídos em qualquer posição que permita a união da porção modificadora, porém que ainda permita que o açúcar funcione como um substrato para a enzima usada para acoplar o açúcar modificado ao peptídeo.

[0097] Em geral, a porção de açúcar e o grupo modificador são ligados conjuntamente através do uso de grupos reativos, os quais são tipicamente transformados, pelo processo de ligação, em um novo grupo funcional orgânico ou espécie não reativa. O(s) grupo(s) funcional(is) reativo(s) de açúcar pode(m) estar localizado(s) em qualquer posição sobre a porção de açúcar. Os grupos reativos e as classes de reações úteis na prática da presente invenção são geralmente aqueles que são bem conhecidos na técnica de química de bioconjugado. As classes de reações atualmente preferidas, disponíveis com as porções de açúcar reativas, são aquelas que ocorrem sob condições relativamente brandas. Estas incluem, porém não estão limitadas às substituições nucleofílicas (p.ex., reações de aminas e álcoois com halogenetos de acila, ésteres ativos), substituições eletrofílicas (p.ex., reações de enamina) e adições às múltiplas ligações de carbono-carbono e carbono- heteroátomo (p.ex., reação de Michael, adição de Diels-Alder). Estas e outras reações úteis são discutidas, por exemplo, em Smith and March, Advanced Organic Chemistry, 5a Ed., John Wiley & Sons, Nova York, 2001; Hermanson, Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego, 1996; e Feeney e col., Modification of Proteins; Advances in Chemistry Series, Vol. 198, American Chemical Society, Washington, D.C., 1982.

[0098] Os grupos funcionais reativos úteis, pendentes de um núcleo de açúcar ou grupo modificador, incluem, porém não estão limitados aos: (a) grupos carboxila e seus diversos derivados (p.ex., ésteres de N-hidroxisuccinimida, ésteres de N-hidroxibenzotriazol, halogenetos de ácido, acil imidazóis, tioésteres, ésteres p- nitrofenílicos, ésteres alquílicos, alquenílicos, alquinílicos e aromáticos); (b) grupos hidroxila, que podem ser convertidos em, p.ex., ésteres, éteres, aldeídos, etc.; (c) grupos haloalquila, onde o halogeneto pode ser posteriormente substituído com um grupo nucleofílico, tal como, por exemplo, uma amina, um ânion de carboxilato, ânion de tiol, carbânion, ou um íon de alcóxido, com isso resultando na união covalente de um novo grupo no grupo funcional do átomo de halogênio; (d) grupos de dienófilos, os quais são capazes de participar nas reações de Diels-Alder, tais como, por exemplo, os grupos maleimido (e) grupos aldeído ou cetona, tal que a derivação subsequente seja possível por meio da formação de derivados de carbonila, tais como, por exemplo, iminas, hidrazonas, semicarbazonas ou oximas, ou por meio de tais mecanismos como a adição de Grignard ou a adição de alquil lítio; (f) grupos halogeneto de sulfonila para a reação subsequente com aminas, por exemplo, para formar sulfonamidas; (g) grupos tiol, que podem ser, por exemplo, convertidos em dissulfetos ou reagidos com halogenetos de alquila e acila; (h) grupos amina ou sulfidrila, que podem ser, por exemplo, acilados, alquilados ou oxidados; (i) alquenos, que podem sofrer, por exemplo, cicloadições, acilação, adição de Michael, metátese, reação de Heck, etc.; (j) epóxidos, que podem reagir com, por exemplo, aminas e compostos de hidroxila.

[0099] Os grupos funcionais reativos podem ser escolhidos de modo tal que eles não participem nas, ou interfiram com as, reações necessárias para agregar o núcleo de açúcar reativo ou o grupo modificador. Alternativamente, um grupo funcional reativo pode ser protegido de participar na reação pela presença de um grupo protetor. Aqueles de habilidade na técnica entendem como proteger um grupo funcional particular de modo tal que ele não interfira com um grupo escolhido de condições de reação. Quanto aos exemplos dos grupos protetores úteis, ver, por exemplo, Greene e col., Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, Nova York, 1991.

[00100] Em algumas modalidades, o açúcar modificado é um açúcar ativado. Os açúcares modificados ativados, úteis na presente invenção, são tipicamente glicosídeos que tenham sido sinteticamente alterados para incluir um grupo abandonador ativado. Conforme usado neste documento, o termo "grupo abandonador ativado" refere-se àquelas porções que são facilmente substituídas nas reações de substituição nucleofílica reguladas por enzimas. Muitos açúcares ativados são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Vocadlo e col., Em Carbohydrate Chemistry and Biology, Vol. 2, Ernst e col. Ed., Wiley-VCH Verlag: Weinheim, Alemanha, 2000; Kodama e col., Tetrahedron Lett. 34: 6419 (1993); Lougheed, e col., J. Biol. Chem. 274: 37717 (1999)). Os exemplos de tais grupos abandonadores incluem o flúor, o cloro, o bromo, o tosilato, o mesilato, o triflato e similares. Os grupos abandonadores ativados preferidos, para uso na presente invenção, são aqueles que não obstruem significativa e estericamente a transferência enzimática do glicosídeo para o receptor. Desse modo, as modalidades preferidas dos derivados de glicosídeos ativados incluem os fluoretos de glicosila e os mesilatos de glicosila, com os fluoretos de glicosila sendo particularmente preferidos. Entre os fluoretos de glicosila, são mais preferidos o fluoreto de α-galactosila, o fluoreto de α-manosila, o fluoreto de α-glucosila, o fluoreto de α-fucosila, o fluoreto de α-xilosila, o fluoreto de α-sialila, o fluoreto de α- N-acetilglucosaminila, o fluoreto de α-N-acetilglucosaminila, o fluoreto de β- galatosila, o fluoreto de β-manosila, o fluoreto de .beta.-glucosila, o fluoreto de β- fucosila, o fluoreto de β-xilosila, o fluoreto de β-sialila, o fluoreto de β-N- acetilglucosaminila e o fluoreto de β-N-acetilgalactosaminila.

[00101] Em certos aspectos, um resíduo de açúcar modificado é conjugado a um ou mais polímeros solúveis em água. Muitos polímeros solúveis em água são conhecidos para aqueles de habilidade na técnica e são úteis na prática da presente invenção. O termo polímero solúvel em água inclui as espécies tais como os sacarídeos (p.ex., dextrana, amilose, ácido hialurônico, poli(ácido siálico), heparanas, heparinas, etc.); os poli(aminoácidos); os ácidos nucléicos; os polímeros sintéticos (p.ex., poli(ácido acrílico), poli(éteres), p.ex., poli(etileno glicol)); os peptídeos, as proteínas, e similares. A presente invenção pode ser praticada com qualquer polímero solúvel em água, com a única limitação que o polímero deva incluir um ponto no qual o restante do conjugado possa ser unido.

[00102] Os métodos e a química para a ativação dos polímeros solúveis em água e os sacarídeos, bem como os métodos para conjugar os sacarídeos e os polímeros a várias espécies são descritos na literatura. Os métodos comumente usados para a ativação dos polímeros incluem a ativação dos grupos funcionais com brometo de cianogênio, periodato, glutaraldeído, biepóxidos, epicloroidrina, divinil sulfona, carbodiimida, halogenetos de sulfonila, triclorotriazina, etc. (ver, R. F. Taylor, (1991), Protein Immobilization, Fundamentals and Applications, Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking, CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson e col., (1993), Immobilized Affinity Ligand Techniques, Academic Press, N.Y.; Dunn, R. L., e col., Eds. Polymeric Drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991).

[00103] Em certos aspectos, um resíduo de açúcar modificado é conjugado a um ou mais polímeros insolúveis em água. Em algumas modalidades, a conjugação a um polímero insolúvel em água pode ser usada para liberar um peptídeo terapêutico em um modo controlado. Os sistemas de liberação de fármacos poliméricos são conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Dunn e col., Eds. Polymeric drugs and Drug Delivery Systems, ACS Symposium Series Vol. 469, American Chemical Society, Washington, D.C. 1991. Aqueles de habilidade na técnica apreciarão que substancialmente qualquer sistema de liberação de fármaco conhecido é aplicável aos conjugados da presente invenção.

[00104] Os polímeros insolúveis em água representativos incluem, porém não estão limitados aos polifosfazenos, poli(álcoois vinílicos), poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, poliacrilamidas, polialquileno glicóis, poli(óxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(éteres vinílicos), poli(ésteres vinílicos), poli(halogenetos de vinila), polivinilpirrolidona, poliglicolídeos, polissiloxanos, poliuretanos, poli(metacrilato de metila), poli(metacrilato de etila), poli(metacrilato de butila), poli(metacrilato de isobutila), poli(metacrilato de hexila), poli(metacrilato de isodecila), poli(metacrilato de laurila), poli(metacrilato de fenila), poli(acrilato de metila), poli(acrilato de isopropila), poli(acrilato de isobutila), poli(acrilato de octadecila) polietileno, polipropileno, poli(etileno glicol), poli(óxido de etileno), poli (tereftalato de etileno), poli(acetato de vinila), poli(cloreto de vinila), poliestireno, polivinil pirrolidona, pluronics, e polivinilfenol, e seus copolímeros.

[00105] Estes e os outros polímeros discutidos neste documento podem ser prontamente obtidos a partir de fontes comerciais, tais como Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.), Polysciences (Warrenton, Pa.), Aldrich (Milwaukee, Wis.), Fluka (Ronkonkoma, N.Y.), e BioRad (Richmond, Calif.), ou então sintetizados a partir de monômeros obtidos destes fornecedores usando técnicas padrões. Os polímeros biodegradáveis representativos, úteis nos conjugados da invenção, incluem, porém não estão limitados aos polilactídeos, poliglicolídeos e seus copolímeros poli(tereftalato de etileno), poli(ácido butírico), poli(ácido valérico), poli(lactídeo-co- caprolactona), poli(lactídeo-co-glicolídeo), polianidridos, poliortoésteres, misturas e seus copolímeros. São de uso particular as composições que formam géis, tais como aquelas que incluem o colágeno, e os pluronics.

[00106] Em uma modalidade preferida, um ou mais resíduos de açúcares modificados são conjugados a uma ou mais moléculas de PEG.

[00107] Em certos aspectos, o açúcar modificado é conjugado a uma biomolécula. A biomolécula da invenção pode incluir, porém não está limitada às proteínas funcionais, enzimas, antígenos, anticorpos, peptídeos, ácidos nucléicos (p.ex., nucleotídeos ou nucleosídeos individuais, oligonucleotídeos, polinucleotídeos e ácidos nucléicos de uma única fita única ou uma quantidade maior de fitas), lectinas, receptores ou uma combinação destes. Algumas biomoléculas preferidas são essencialmente não fluorescentes, ou emitem tal quantidade mínima de fluorescência que elas são inadequadas para uso como um marcador fluorescente em um ensaio. As outras biomoléculas podem ser fluorescentes.

[00108] Em algumas modalidades, a biomolécula é uma porção de alvejamento. Uma "porção de alvejamento" e um "agente de alvejamento", como usados neste documento, referem-se às espécies que localizarão seletivamente em um tecido ou região particular do corpo. Em algumas modalidades, uma biomolécula é selecionada para guiar o polipeptídeo de SAP da invenção para um compartimento intracelular específico, com isso aumentando a liberação do peptídeo para aquele compartimento intracelular em relação à quantidade de peptídeo não derivado que é liberado para o tecido. A localização é mediada por reconhecimento específico de determinantes moleculares, tamanho molecular do agente de alvejamento ou conjugado, interações iônicas, interações hidrofóbicas e similares. Os outros mecanismos de alvejamento de um agente para um tecido ou região particular são conhecidos para aqueles de habilidade na técnica.

[00109] Em algumas modalidades, o açúcar modificado inclui uma porção terapêutica. Aqueles de habilidade na técnica apreciarão que há uma sobreposição entre a categoria de porções terapêuticas e biomoléculas, i.e., muitas biomoléculas têm propriedades ou potenciais terapêuticos.

[00110] As classes de porções terapêuticas úteis incluem, por exemplo, os fármacos anti-inflamatórios não esteroidais; os fármacos anti-inflamatórios esteroidais; os adjuvantes; os fármacos anti-histamínicos; os fármacos antitussivos; os fármacos antipruríticos; os fármacos anticolinérgicos; os fármacos antieméticos e antinauseantes; os fármacos anoréxicos; os fármacos estimulantes centrais; os fármacos antiarrítmicos; os fármacos bloqueadores p-adrenérgicos; os fármacos cardiotônicos; os fármacos anti-hipertensivos; os fármacos diuréticos; os fármacos vasodilatadores; os fármacos vasoconstritores; os fármacos antiúlcera; os fármacos anestésicos; os fármacos antidepressivos; os fármacos tranqüilizantes e sedativos; os fármacos antipsicóticos; e os fármacos antimicrobianos.

[00111] As outras porções de fármacos úteis na prática da presente invenção incluem os fármacos antineoplásticos, os agentes citocidas, os antiestrogênios, e os antimetabólitos. Também estão incluídos dentro desta classe os agentes à base de radioisótopos tanto para a diagnose (p.ex., imageamento) quanto para a terapia, e as toxinas conjugadas.

[00112] A porção terapêutica pode também ser um hormônio, um relaxante muscular, um antiespasmódico, agente ativador ósseo, agente modulador endócrino, modulador de diabete, androgênio, antidiuréticos, ou fármaco de calcitonina.

[00113] Os outros grupos modificadores úteis incluem os fármacos imunomoduladores, os imunossupressores, etc. Os grupos com atividade anti- inflamatória, tais como sulindac, etodolac, cetoprofeno e cetorolac, também são de uso. Os outros fármacos de uso em conjunção com a presente invenção serão aparentes para aqueles de habilidade na técnica.

[00114] Os polipeptídeos de SAP de N-glicosilação alterada, produzidos pelos métodos da divulgação, podem ser homogêneos (i.e., a amostra de polipeptídeo de SAP é uniforme na estrutura do N-glicano específica) ou substancialmente homogêneos. Por "substancialmente homogêneos" pretende-se que pelo menos cerca de 25% (p.ex., pelo menos cerca de 27%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99%) dos polipeptídeos de SAP contenham a mesma estrutura do N-glicano específica.

[00115] Em algumas modalidades, os polipeptídeos de SAP variantes da invenção têm uma IC50 para inibir a diferenciação dos monócitos em fibrócitos in vitro que é menos do que 1/2, menos do que 1/3, menos do que 1/4, menos do que 1/10, ou menos do que 1/100 daquela de uma amostra correspondente de SAP do tipo selvagem, isolado do soro humano. Existem muitos métodos bem caracterizados para determinar a sensibilidade das Células Mononucleares Sanguíneas Periféricas (PBMCs) ou das células de monócitos ao SAP para a diferenciação em fibrócitos. Estes métodos podem ser usados para determinar a potência relativa de quaisquer dos polipeptídeos variantes de SAP da invenção em comparação com uma amostra de SAP derivado de soro humano, qualquer outro polipeptídeo variante de SAP, ou outro agente supressor ou ativador de fibrócitos. As PBMCs ou os monócitos, adequados para uso nestes métodos, podem ser obtidos a partir de diversas linhagens de culturas de tecido. Alternativamente, as células adequadas para os ensaios de diferenciação em fibrócitos podem ser obtidas a partir de qualquer amostra biológica que contenha as células PBMC ou de monócitos. A amostra biológica pode ser obtida de soro, plasma, tecido saudável, ou tecido fibrótico. Em geral, os ensaios de diferenciação em fibrócitos são conduzidos incubando as células PBMC ou de monócitos em meios com concentrações variadas de um polipeptídeo de SAP, para determinar o grau de diferenciação em fibrócitos. A concentração de SAP pode variar de 0,0001 μg/mL a 1 mg/ml e, em algumas modalidades, é 0,001 μg/mL, 1,0 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL, 20 μg/mL, 25 μg/mL, 30 μg/mL, 35 μg/mL, 40 μg/mL, 45 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL, 300 μg/mL, ou 500 μg/mL. Em alguns ensaios, os meios podem ser suplementados com entre 1-100 ng/ml de hMCSF; a concentração preferida de hMCSF sendo 25 ng/mL. A indicação que a PBMC e os monócitos diferenciaram-se em fibrócitos pode ser determinada por alguém versado na técnica. Em geral, os fibrócitos são definidos morfologicamente como células aderentes com um formato de eixo alongado e a presença de um núcleo oval. Em alguns ensaios, as células são fixadas e tingidas com Hema 3 antes de enumerar os fibrócitos por contagem direta, p.ex., usando um microscópio invertido. A quantidade de diferenciação em fibrócitos é interpretada por alguém versado na técnica como uma indicação da sensibilidade de uma célula ao SAP. Conforme indicado pelos exemplos da divulgação, uma maior supressão da diferenciação em fibrócitos indica um maior grau de sensibilidade ao SAP. Um método alternativo de medir a diferenciação em fibrócitos envolve determinar a expressão dos marcadores da superfície celular específicos para fibrócitos ou dos fatores secretados, p.ex., as citocinas (p.ex., IL-1ra, ENA- 78/CXCL-5, PAI-1), a fibronectina, o colágeno-1. Os métodos de detectar e/ou quantificar os marcadores da superfície celular ou os fatores secretados são bastante conhecidos na técnica, incluindo, porém não limitados às diversas técnicas baseadas em ELISA e FACS que utilizam anticorpos imunorreativos contra um ou mais marcadores específicos para os fibrócitos. Conforme descrito nos exemplos da divulgação, a medição da expressão da Quimiocina Derivada de Macrófago (MDC) é um método efetivo de determinar a diferenciação em fibrócitos.

[00116] Os métodos para detectar e/ou caracterizar a N-glicosilação (p.ex., a N-glicosilação alterada) de um polipeptídeo de SAP incluem a eletroforese de carboidrato auxiliada por fluoróforo (FACE), auxiliada por seqüenciador de DNA (DSA), ou a espectrometria de massas por tempo de voo com dessorção/ionização a laser realçada por superfície (SELDI-TOF MS). Por exemplo, uma análise pode utilizar a DSA-FACE, na qual, por exemplo, as glicoproteínas são desnaturadas, seguidas por imobilização sobre, p.ex., uma membrana. As glicoproteínas podem então ser reduzidas com um agente redutor adequado, tal como o ditiotreitol (DATA) ou o β-mercaptoetanol. Os grupos sulfidrila das proteínas podem ser carboxilados usando um ácido, tal como o ácido iodoacético. A seguir, os N-glicanos podem ser liberados da proteína usando uma enzima, tal como a N-glicosidase F. Os N- glicanos, opcionalmente, podem ser reconstituídos e derivados por aminação redutiva. Os N-glicanos derivados podem então ser concentrados. A instrumentação adequada para a análise do N-glicano inclui, por exemplo, o seqüenciador de DNA ABI PRISM® 377 (Applied Biosystems). A análise dos dados pode ser efetuada usando, por exemplo, o software GENESCAN®. 3.1 (Applied Biosystems). Opcionalmente, as manoproteínas isoladas podem ser adicionalmente tratadas com uma ou mais enzimas para confirmar a sua situação de N-glicanos. As enzimas ilustrativas incluem, por exemplo, a a-manosidase ou a a-1,2- manosidase. Os métodos adicionais de análise do N-glicano incluem, por exemplo, a espectrometria de massa (p.ex., MALDI-TOF-MS), a cromatografia líquida em alta pressão (HPLC) sobre fase normal, a cromatografia sobre fase invertida e de troca iônica (p.ex., com detecção amperométrica pulsada, quando os glicanos não forem marcados, e com absorbância de UV ou fluorescência, se os glicanos forem apropriadamente marcados). Ver também Callewaert e col. (2001) Glycobiology 11(4):275-281 e Freire e col. (2006) Bioconjug. Chem. 17(2):559-564, cujas divulgações de cada são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.

Métodos de tratamento

[00117] Em um aspecto, a divulgação proporciona métodos para tratar um distúrbio sensível ao SAP em um paciente, por administração de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um polipeptídeo de SAP variante da invenção a um paciente que necessita deles. A dosagem e a frequência de tratamento podem ser determinadas por alguém versado na técnica e variarão dependendo dos sintomas, da idade e do peso do corpo do paciente, e da natureza e gravidade do distúrbio a ser tratado ou prevenido. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de SAP variante é administrado a um paciente uma vez ou duas vezes ao dia, uma vez ou duas vezes por semana, uma vez ou duas vezes por mês, ou exatamente antes do, ou no, início dos sintomas.

[00118] As dosagens podem ser prontamente determinadas pelas práticas conhecidas para aqueles de habilidade na técnica ou conforme ensinado neste documento. A toxicidade e a eficácia terapêutica do SAP podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos padrões em animais experimentais, por exemplo, determinando a LD50 e a ED50. A ED50 (Dose Efetiva 50) é a quantidade de fármaco requerido para produzir um efeito especificado em 50% de uma população de animais. A LD50 (Dose Letal 50) é a dose de fármaco que mata 50% de uma população de amostra.

[00119] Em algumas modalidades, o distúrbio sensível ao SAP é a fibrose. O uso de SAP como um tratamento terapêutico para a fibrose é descrito no Pedido de Patente U.S. No 2007/0243163, que é, pelo presente, incorporado por referência. Os distúrbios relacionados à fibrose, que podem ser receptivos ao tratamento com o método exposto, incluem, porém não estão limitados à doença de colágeno, doença de pulmão intersticial, doença de pulmão fibrótico humano (p.ex., bronquiolite obliterativa, fibrose pulmonar idiopática, fibrose pulmonar de uma etiologia desconhecida, estroma de tumor na doença do pulmão, esclerose sistêmica afetando os pulmões, síndrome de Hermansky-Pudlak, pneumoconiose do trabalhador de carvão, asbestose, silicose, hipertensão pulmonar crônica, hipertensão pulmonar associada à AIDS, sarcoidose, asma moderada a grave e similar), doença vascular fibrótica, esclerose arterial, aterosclerose, veias varicosas, infartos coronários, infartos cerebrais, fibrose miocárdica, fibrose musculosquelética, adesões pós-cirúrgicas, doença do rim humano (p.ex., síndrome nefrítica, síndrome de Alport, nefropatia associada ao HIV, doença do rim policístico, doença de Fabry, nefropatia diabética, glomerulonefrite crônica, nefrite associada com lupo sistêmico, e similar), esclerose sistêmica progressiva (PSS), colangite esclerosante primária (PSC), fibrose do fígado, cirrose do fígado, fibrose renal, fibrose pulmonar, fibrose cística, doença do enxerto versus hospedeiro crônica, esclerodermia (local e sistêmica), oftalmopatia de Grave, retinopatia diabética, glaucoma, doença de Peyronie, fibrose do pênis, uretrostenose após cistoscópio, acreção interna após cirurgia, cicatrização, mielofibrose, fibrose retroperitoneal idiopática, fibrose peritoneal de uma etiologia desconhecida, ergotismo induzido por fármaco, fibrose relacionada ao câncer benigno ou maligno, fibrose relacionada à infecção microbiana (p.ex., viral, bacteriana, parasítica, fúngica, etc.), doença de Alzheimer, fibrose relacionada à doença inflamatória do intestino (incluindo a formação de estenose na doença de Crohn e a colite microscópica), tumores de células estromais, mucosite, fibrose induzida por dano químico ou ambiental (p.ex., quimioterapia do câncer, pesticidas, ou radiação (p.ex., radioterapia do câncer)).

[00120] Em algumas modalidades, a doença relacionada à fibrose é selecionada a partir de esclerodermia sistêmica ou local, quelóides, cicatrizes hipertróficas, aterosclerose, reestenose, inflamação e fibrose pulmonares, fibrose pulmonar idiopática, cirrose do fígado, fibrose como resultado de infecção por hepatite B ou C crônica, doença do rim, doença do coração resultante de tecido de cicatrização, degeneração macular, e retinopatia retinal e vítrea. Em algumas modalidades, o distúrbio relacionado à fibrose resulta de fármacos quimioterápicos, fibrose induzida por radiação, e lesões e queimaduras. Em algumas modalidades, o distúrbio ou a condição relacionada à fibrose resulta de cicatrização pós-cirúrgica, p.ex., após trabeculectomia ou outra cirurgia de filtração do olho.

[00121] Em algumas modalidades, o distúrbio sensível ao SAP é um distúrbio de hipersensibilidade, tal como aqueles mediados por respostas de Th1 ou Th2. O uso de SAP como um tratamento terapêutico para os distúrbios de hipersensibilidade é também descrito no Pedido Provisório U.S. No 61/209.795, que é pelo presente incorporado por referência. Os distúrbios relacionados à hipersensibilidade que podem ser receptivos ao tratamento com o SAP incluem, porém não estão limitados à rinite alérgica, sinusite alérgica, conjuntivite alérgica, broncoconstrição alérgica, dispnéia alérgica, aumento alérgico na produção de muco nos pulmões, eczema atópico, dermatite, urticária, anafilaxia, pneumonite, e asma alérgica.

[00122] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de SAP variante da invenção pode ser usado para tratar respostas imunes de alérgenos específicos, tais como a anafilaxia, a diversos antígenos, incluindo, porém não limitados aos antimicrobianos (p.ex., cefalosporinas, sulfonamidas, penicilina e outras β-lactams), anticonvulsivos (p.ex., fenitoína, fenobarbital, carbamazepina, dapsona, alopurinol, e minociclina), quimioterápicos (p.ex., taxanos, compostos de platina, asparaginases, e epipodofilotoxinas), heparina, insulina, protamina, aspirina e outros fármacos anti- inflamatórios não esteroidais, relaxantes musculares (p.ex., succinilcolina, atracúrio, vecurônio, e pancurônio), agentes de indução (p.ex., barbituratos, etomidato, propofol), narcóticos (p.ex., fentanil, meperidina, morfina), colóides para expansão de volume intravascular, materiais de radiocontraste, produtos sanguíneos, látex, produtos de animais, descamação dos animais, ácaros do pó, insetos (p.ex., picadas, ferroadas ou veneno), cosméticos, metais (p.ex., níquel, cobalto, e cromato), plantas, esporos, pólen, alimento (p.ex., leite, ovos, trigo, soja, amendoins e nozes de árvores), vacinação, e antígenos fúngicos (p.ex., espécies Aspergillus, Curvularia, Exserohilum, e Alternaria).

[00123] Em algumas modalidades, o distúrbio sensível ao SAP é um distúrbio autoimune, tal como aqueles mediados por respostas de Th1 ou Th2. O uso de SAP como um tratamento terapêutico para distúrbios autoimunes é também descrito no Pedido Provisório U.S. No 61/209.845, que é, pelo presente, incorporado por referência. Os distúrbios autoimunes relacionados que podem ser receptivos ao tratamento com o SAP incluem, porém não estão limitados à diabete do tipo I, esclerose múltipla, artrite reumatóide, artrite psoriática, miocardite autoimune, pênfigo, miastenia grave, tiroidite de Hashimoto, doença de Graves, doença de Addison, hepatite autoimune, artrite de Lyme crônica, cardiomiopatia dilatada familiar, dermatomiosite juvenil, policondrite, síndrome de Sjogren, psoríase, artrite idiopática juvenil, doença inflamatória do intestino, lupo sistêmico eritematoso, doença pulmonar obstrutiva crônica, e doença do enxerto versus hospedeiro.

[00124] Em algumas modalidades, o distúrbio sensível ao SAP é uma mucosite. O uso de SAP como um tratamento terapêutico para mucosite é também descrito no Pedido U.S. No 12/217.614, que é, pelo presente, incorporado por referência. Os métodos da invenção podem ser úteis para tratar mucosite oral, esofágica, e gastrointestinal, bem como úlceras gástricas e duodenais, ou erosões do estômago e esôfago.

[00125] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de SAP variante da invenção pode ser usado para tratar uma doença ou condição inflamatória. Em algumas modalidades, a doença inflamatória pode ser uma infecção viral, bacteriana, fúngica, ou parasítica. O uso de SAP como um tratamento terapêutico para infecção viral também foi descrito na Patente U.S. 6.406.698 e no Pedido de Patente Internacional No WO1997/026906, os quais são ambos incorporados por referência neste documento.

Preparações e Formulações Farmacêuticas

[00126] Em certas modalidades, os métodos descritos neste documento envolvem a administração de pelo menos um polipeptídeo de SAP variante da invenção a um paciente, como um agente terapêutico. Os agentes terapêuticos da invenção podem ser formulados em um modo convencional, usando um ou mais veículos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Por exemplo, os agentes terapêuticos e os seus sais e solvatos fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para a administração através de, por exemplo, injeção (p.ex., SubQ, IM, IP), inalação ou insuflação (através da boca ou do nariz) ou administração oral, bucal, sublingual, transdérmica, nasal, parenteral ou retal. Em certas modalidades, os agentes terapêuticos podem ser administrados localmente, no local onde as células alvo estão presentes, i.e., em um tecido, órgão, ou fluido específico (p.ex., sangue, fluido cerebroespinhal, massa de tumor, etc.).

[00127] A presente invenção adicionalmente proporciona o uso de qualquer polipeptídeo de SAP variante da invenção na manufatura de um medicamento, para o tratamento ou a prevenção de um distúrbio ou uma condição, conforme descrita neste documento, em um paciente, por exemplo, o uso de um polipeptídeo de SAP variante na manufatura de um medicamento para o tratamento de um distúrbio ou uma condição descrita neste documento. Em alguns aspectos, qualquer polipeptídeo de SAP variante da invenção pode ser usado para preparar uma preparação farmacêutica para uso no tratamento ou na prevenção de uma doença ou condição descrita neste documento.

[00128] Os agentes terapêuticos podem ser formulados para uma variedade de modos de administração, incluindo a administração sistêmica e tópica ou localizada. As técnicas e as formulações em geral podem ser encontradas no Remington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Para a administração parenteral, a injeção é preferida, incluindo a intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, e subcutânea. Para a injeção, os compostos podem ser formulados em soluções líquidas, preferivelmente em tampões fisiologicamente compatíveis, tais como a solução de Hank ou a solução de Ringer. Além disso, os compostos podem ser formulados na forma sólida e dissolvidos ou suspensos imediatamente antes do uso. As formas liofilizadas estão também incluídas. Em algumas modalidades, os agentes terapêuticos podem ser administrados às células por uma variedade de métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo, porém não restritos à encapsulação em lipossomos, por iontoforese, ou por incorporação em outros veículos, tais como hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis, e microesferas bioadesivas.

[00129] Para a administração oral, as composições farmacêuticas podem tomar a forma de, por exemplo, comprimidos, pastilhas, ou cápsulas preparadas por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes aglutinantes (p.ex., amido de milho pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropil metilcelulose); cargas (p.ex., lactose, celulose microcristalina ou hidrogeno fosfato de cálcio); lubrificantes (p.ex., estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (p.ex., amido de batata ou amido glicolato de sódio); ou agentes molhantes (p.ex., lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bastante conhecidos na técnica. As preparações líquidas para a administração oral podem tomar a forma de, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou elas podem ser apresentadas como um pó seco para constituição com água ou outro veículo adequado, antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de suspensão (p.ex., xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras comestíveis hidrogenadas); agentes emulsificantes (p.ex., lecitina ou acácia); veículos não aquosos (p.ex., óleo de amêndoa, ésteres oleosos, álcool etílico ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (p.ex., p-hidroxibenzoatos de metila ou propila ou ácido sórbico). As preparações podem também conter sais de tampão, agentes aromatizantes, corantes e adoçantes, conforme apropriados. As preparações para a administração oral podem ser adequadamente formuladas para dar a liberação controlada do composto ativo.

[00130] Para a administração por inalação (p.ex., liberação pulmonar), os agentes terapêuticos podem ser convenientemente liberados na forma de uma apresentação de spray de aerossol a partir de pacotes pressurizados ou um nebulizador, com o uso de um propulsor adequado, p.ex., diclorodifluormetano, triclorofluormetano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gás adequado. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando-se uma válvula para liberar uma quantidade medida. As cápsulas e os cartuchos de, p.ex., gelatina, para uso em um inalador ou insuflador, podem ser formulados contendo uma mistura de pós do composto e uma base de pó adequada, tal como a lactose ou o amido.

[00131] Nos métodos da invenção, os compostos farmacêuticos podem também ser administrados por rotas intranasais ou intrabronquiais, incluindo a insuflação, os pós, e as formulações de aerossóis (quanto aos exemplos de inalantes de esteróides, ver Rohatagi (1995) J. Clin. Pharmacology. 35:1187-1193; Tjwa (1995) Ann. Allergy Asthma Immunol. 75:107-111). Por exemplo, as formulações de aerossóis podem ser colocadas em propulsores pressurizados aceitáveis, tais como o diclorodifluormetano, o propano, o nitrogênio, e similar. Eles podem também ser formulados como substâncias farmacêuticas para preparações não pressurizadas, tais como em um nebulizador ou um atomizador. Tipicamente, tal administração é em um tampão farmacologicamente aceitável, aquoso.

[00132] As composições farmacêuticas, adequadas para a liberação respiratória (p.ex., intranasal, inalação, etc.) dos polipeptídeos de SAP variantes, podem ser preparadas na forma sólida ou líquida.

[00133] Os polipeptídeos de SAP da invenção podem ser formulados para a administração parenteral por injeção, p.ex., por injeção de bolo ou infusão contínua. As formulações para injeção podem ser apresentadas na forma de dosagem de unidade, p.ex., em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado. As composições podem tomar tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilizadores e/ou dispersantes. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, p.ex., água sem pirogênio estéril, antes do uso.

[00134] Além disso, os polipeptídeos de SAP da invenção podem também ser formulados como uma preparação de efeito prolongado. Tais formulações de longa atuação podem ser administradas por implantação (por exemplo, de modo subcutâneo ou intramuscular) ou por injeção intramuscular. Desse modo, por exemplo, os agentes terapêuticos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel. A fórmula de liberação controlada também inclui os emplastros.

[00135] Em certas modalidades, os compostos descritos neste documento podem ser formulados para a liberação para o sistema nervoso central (SNC) (revisto em Begley, Pharmacology & Therapeutics 104: 29-45 (2004)). As abordagens convencionais para a liberação do fármaco para o SNC incluem: estratégias neurocirúrgicas (p.ex., injeção intracerebral ou infusão intracerebroventricular); manipulação molecular do agente (p.ex., produção de uma proteína de fusão quimérica que compreende um peptídeo de transporte que tem uma afinidade por uma molécula da superfície da célula endotelial em combinação com um agente que é, ele próprio, incapaz de cruzar a barreira hematoencefálica, em uma tentativa de utilizar uma das vias de transporte endógenas da barreira hematoencefálica); estratégias farmacológicas projetadas para aumentar a solubilidade em lipídio de um agente (p.ex., conjugação de agentes solúveis em água com veículos de lipídios ou colesterol); e o rompimento transitório da integridade da BBB por rompimento hiperosmótico (resultante da infusão de uma solução de manitol na artéria carótida ou do uso de um agente biologicamente ativo, tal como um peptídeo de angiotensina).

[00136] Em certas modalidades, os polipeptídeos de SAP da invenção são incorporados em uma formulação tópica contendo um veículo tópico que é geralmente adequado para a administração tópica dos fármacos e compreendendo qualquer tal material conhecido na técnica. O veículo tópico pode ser selecionado de modo a proporcionar a composição na forma desejada, p.ex., como um unguento, loção, creme, microemulsão, gel, óleo, solução, ou similar, e pode ser compreendido de um material de ocorrência natural ou origem sintética. É preferível que o veículo selecionado não afete adversamente o agente ativo ou os outros componentes da formulação tópica. Os exemplos de veículos tópicos adequados, para uso neste documento, incluem a água, os álcoois e os outros solventes orgânicos não tóxicos, a glicerina, o óleo mineral, o silicone, o petrolato, a lanolina, os ácidos graxos, os óleos vegetais, os parabenos, as ceras, e similares.

[00137] As composições farmacêuticas (incluindo as preparações cosméticas) podem compreender de cerca de 0,00001 a 100%, tal como de 0,001 a 10% ou de 0,1% a 5% em peso, de um ou mais dos polipeptídeos de SAP variantes descritos neste documento. Em certas formulações tópicas, o agente ativo está presente em uma quantidade na faixa de aproximadamente 0,25% em peso a 75% em peso da formulação, preferivelmente na faixa de aproximadamente 0,25% em peso a 30% em peso da formulação, mais preferivelmente na faixa de aproximadamente 0,5% em peso a 15% em peso da formulação, e mais preferivelmente ainda na faixa de aproximadamente 1,0% em peso a 10% em peso da formulação.

[00138] As condições do olho podem ser tratadas ou prevenidas, p.ex., por injeção sistêmica, tópica, intraocular de agentes terapêuticos, ou por inserção de um dispositivo de liberação continuada que libera os agentes terapêuticos. Os polipeptídeos de SAP da invenção podem ser liberados em um veículo oftálmico farmaceuticamente aceitável, de modo tal que o composto seja mantido em contato com a superfície ocular por um período de tempo suficiente para permitir que o composto penetre nas regiões corneais e internas do olho, como por exemplo, a câmara anterior, a conjuntiva, a câmara posterior, o corpo vítreo, o humor aquoso, o humor vítreo, a córnea, a íris/ciliar, o cristalino, a coróide/retina e a esclera. O veículo oftálmico farmaceuticamente aceitável pode, por exemplo, ser um unguento, óleo vegetal ou um material de encapsulação. Alternativamente, os compostos podem ser injetados diretamente no humor vítreo e aquoso. Em uma alternativa adicional, os compostos podem ser administrados sistemicamente, tal como infusão ou injeção intravenosa, para o tratamento do olho.

[00139] Os agentes terapêuticos descritos neste documento podem ser armazenados em ambiente sem oxigênio, de acordo com os métodos na técnica.

[00140] As composições ilustrativas compreendem um polipeptídeo de SAP com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e, opcionalmente, outros ingredientes terapêuticos. O(s) veículo(s) deve(m) ser "farmaceuticamente aceitável(is)" no sentido de ser(em) compatível(is) com os outros ingredientes da composição e não provocando um efeito deletério inaceitável no paciente. Tais veículos são descritos neste documento ou são de outro modo bastante conhecidos para aqueles versados na técnica de farmacologia. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são sem pirogênio e são adequadas para a administração a um paciente humano. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são sem irritantes e são adequadas para a administração a um paciente humano. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas são sem alérgenos e são adequadas para a administração a um paciente humano. As composições podem ser preparadas por quaisquer dos métodos bastante conhecidos na técnica de farmácia.

[00141] Em algumas modalidades, um polipeptídeo de SAP é administrado em uma formulação de liberação com o tempo, por exemplo, em uma composição que inclui um polímero de liberação lenta. Um polipeptídeo de SAP pode ser preparado com veículos que protegerão contra a liberação rápida. Os exemplos incluem um veículo de liberação controlada, tal como um polímero, sistema de liberação microencapsulado, ou gel bioadesivo. Alternativamente, a liberação prolongada de um polipeptídeo de SAP pode ser obtida incluindo agentes que retardem a absorção na composição, por exemplo, os hidrogéis de monoestearato de alumínio e a gelatina.

[00142] Os métodos para a liberação dos compostos de ácidos nucléicos são conhecidos na técnica (ver, p.ex., Akhtar e col., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; e Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995; Sullivan e col., Pedido Internacionanl No WO 94/02595). Estes protocolos podem ser utilizados para a liberação de virtualmente qualquer composto de ácido nucléico. Os compostos de ácidos nucléicos podem ser administrados às células por uma variedade de métodos conhecidos para aqueles versados na técnica, incluindo, porém não restritos à encapsulação em lipossomos, por iontoforese, ou por incorporação em outros veículos, tais como hidrogéis, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradáveis, e microesferas bioadesivas. Alternativamente, a combinação de ácido nucléico/veículo é liberada localmente por injeção direta ou por uso de uma bomba de infusão. As outras rotas de liberação incluem, porém não estão limitadas à liberação oral (forma de comprimidos ou pílulas) e/ou intratecal (Gold, 1997, Neuroscience, 76, 1153-1158). As outras abordagens incluem o uso de diversos sistemas de transportes e veículos, por exemplo, através do uso de conjugados e polímeros biodegradáveis. Quanto a uma revisão abrangente sobre as estratégias de liberação dos fármacos, ver Ho e col., 1999, Curr. Opin. Mol. Ther., 1, 336-343 e Jain, Drug Delivery Systems: Technologies and Commercial Opportunities, Decision Resources, 1998 e Groothuis e col., 1997, J. NeuroVirol., 3, 387-400. As descrições mais detalhadas da liberação e da administração de ácidos nucléicos são proporcionadas em Sullivan e col., supra, Draper e col., PCT WO93/23569, Beigelman e col., Pedido Internacional No WO99/05094, e Klimuk e col., Publicação Internacional No WO99/04819.

[00143] Os exemplos a seguir servem para descrever mais completamente o modo de utilizar a invenção acima descrita, bem como para apresentar os melhores modos contemplados para realizar os diversos aspectos da invenção. Entende-se que estes exemplos de modo algum servem para limitar o escopo real desta invenção, porém, mais exatamente, são apresentados para propósitos ilustrativos.

EXEMPLIFICAÇÃO

[00144] Exemplo 1: O SAP recombinante é mais potente do que o SAP derivado de soro humano.

[00145] O SAP humano recombinante isolado das células CHO-S (rhSAP) e o SAP derivado do soro humano (hSAP) foram testados quanto à bioatividade usando um bioensaio in vitro. Neste ensaio, as Células Mononucleares Sanguíneas Periféricas (PBMCs) enriquecidas em monócitos foram incubadas com concentrações variadas de rhSAP ou hSAP, por 96 horas. Após esta incubação, os sobrenadantes da cultura resultantes foram removidos e testados por ELISA para quantificar a quantidade de Quimiocina Derivada de Macrófago (MDC) que foi produzida. A MDC é produzida pelos fibróticos e, portanto, um indicador da diferenciação dos monócitos em fibrócitos. Por comparação da concentração inibitória, 50% (IC50) da amostra com o padrão de referência de hSAP, pode ser determinada a potência relativa de um glicovariante de SAP. O resultado é expresso como uma razão de IC50 da amostra versus o padrão de referência de hSAP.

[00146] Todas as amostras e padrões de SAP foram inicialmente diluídos até uma concentração de 1,0 mg/mL em Meio FibroLife Suplementado. Os padrões de SAP foram diluídos em série para gerar concentrações de padrão de trabalho de 60, 30, 20, 13,4, 8,8, 6,0, 3,0, 1,5, e 0,75 μg/mL (concentração de padrão final de 30, 15, 10, 6,7, 4,4, 3,0, 1,5, 0,75, e 0,375 μg/mL). Ver a Tabela 1 a seguir.

[00147] Para preparar para o ensaio de ELISA, o anticorpo de captura (i.e., a MDC anti-humana de camundongo) foi diluído até a concentração de trabalho em PBS sem proteína veículo. O anticorpo de captura diluído foi usado para revestir placas de 96 cavidades, e então cada placa foi vedada e incubada durante a noite, na temperatura ambiente. Antes de usar as placas revestidas, cada cavidade foi aspirada e lavada com tampão de lavagem, repetindo o processo duas vezes para um total de três lavagens. As placas foram então bloqueadas por adição de 300 μL de diluente reagente a cada cavidade e incubação na temperatura ambiente por uma hora. Após incubação, repetiu-se o procedimento de aspiração e bastante lavagem.

[00148] Para o ensaio de ELISA, as amostras de 100 μL dos sobrenadantes das culturas de monócitos/fibrócitos ou dos padrões de SAP foram adicionadas a cada cavidade. A placa foi então incubada na temperatura ambiente, por 2 horas, antes de aspirar e lavar as cavidades. Então, 100 μL de uma diluição de trabalho de Estreptavidina-HRP foram adicionados a cada cavidade. A placa foi incubada por 20 minutos, na temperatura ambiente, antes de adicionar 50 μL de Solução de Interrupção a cada cavidade. Imediatamente, a densidade óptica de cada cavidade foi medida usando uma leitora de microplaca ajustada a 450 nm. Se a correção do comprimento de ondas estivesse disponível, a leitora de microplaca era ajustada para 540 nm ou 570 nm. Se a correção do comprimento de ondas não estivesse disponível, então as leituras a 540 nm ou 570 nm eram subtraídas das leituras a 450 nm. Esta subtração corrige as imperfeições ópticas na placa.

[00149] Tanto o RHSAP quanto o hSAP foram testados quanto à bioatividade usando este ensaio (Figura 1). Na média, o RHSAP é 3,4 vezes mais ativo do que o hSAP (média de 7 experimentos independentes). Exemplo 2: Modificação das estruturas do glicano do SAP

[00150] Usando as técnicas de glicorremodelagem in vitro, as porções de glicano sobre uma amostra de SAP humano recombinante (rhSAP) foram modificadas para substituir as porções de ácido siálico ligadas em a2,3 terminais por porções de ácido siálico ligadas em a.2,6 (Figura 2, A e B). Similarmente, uma amostra de SAP derivado do soro humano (hSAP) foi também modificada para substituir as porções de ácido siálico ligadas em a2,6 terminais por porções de ácido siálico ligadas em a2,3 (Figura 2, C e D). Além disso, como o rhSAP isolado de células CHO-S é somente parcialmente sialilado, uma amostra de rhSAP foi tratada para sialilar totalmente as estruturas de glicanos unidas com as porções de ácido siálico ligadas em a2,3 (Figura 2, E e F).

[00151] Tanto o rhSAP quanto o hSAP (Calbiochem, Cat. no 970549) foram tratados com uma a2,3,6,8,9-sialidase (Sigma, Cat. no N8271) para desialilar completamente os polipeptídeos. Após o tratamento com a sialidase por 17 horas, o rhSAP e o hSAP desialilados (i.e., asialo) foram purificados usando cromatografia por afinidade de fosfoetanolamina (PE) e exclusão de tamanho (Sephadex 200 grau prep). Os polipeptídeos de SAP asialo purificados foram então tratados enzimaticamente usando a a2,3- ou a a2,6-sialiltransferase (Calbiochem, Cat. no 566233), na presença de CMP-ácido siálico (Calbiochem, Cat. no 233264), por 17 horas, a 37°C. As tabelas a seguir proporcionam detalhes sobre cada mistura de reação.

[00152] Em uma reação separada, a sialilação completa do rhSAP usando a α2,3-sialiltransferase, sem primeiramente desialilar a molécula, foi efetuada a 37 °C, por 17 h, de acordo com a seguinte tabela.

[00153] Após o tratamento de sialilação, ambas as variantes rhSAP e hSAP sialiladas foram purificadas usando cromatografia por afinidade de PE, seguida por diálise em NaPi a 10 mM/5% de sorbitol pH 7,5 (tampão P5S). A confirmação das ligações de ácido siálico desejadas (i.e., hSAP ligado em a2,3 e RHSAP ligado em a.2,6) foi efetuada usando tanto a Cromatografia Líquida Espectrometria de Massa (Figura 2; A, C, e E) quanto a Cromatografia Líquida de Alta Performance com Troca Aniônica (Figura 2: B, D, e F) após o tratamento dos polipeptídeos de SAP glicovariantes com uma a 2,3 sialidase (Calbiochem, Cat. No 480706), a 37°C, por 24 horas.

[00154] Exemplo 3: Bioensaio in vitro para determinar a potência do glicovariante de SAP para inibir a diferenciação dos monócitos em fibrócitos.

[00155] O rhSAP e o hSAP glicorremodelados foram testados quanto à bioatividade usando o mesmo bioensaio in vitro descrito no Exemplo 1. Em resumo, as células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMCs) enriquecidas em monócitos foram incubadas com concentrações variadas de um polipeptídeo de SAP, por 96 horas. Após esta incubação, os sobrenadantes da cultura resultantes foram removidos e testados por ELISA para quantificar a quantidade de Quimiocina Derivada de Macrófago (MDC) que foi produzida. Os resultados foram expressos como uma razão de IC50 da amostra versus o padrão de referência de hSAP e representados graficamente como atividade relativa (atividade relativa do hSAP = 1). Todos os materiais de teste contendo a ligação de ácido a2,3-siálico são > 2,4 vezes mais ativos do que o hSAP (Figura 3). As misturas iguais de derivados do SAP com ácido siálico ligado em a.2,3 e a2,6 mostram níveis intermediários de atividade entre o SAP 100% ligado em a2,6 e o 100% ligado em a2,3, como esperado (duas barras mais à direita na Figura 3).

[00156] Um método alternativo de quantificar a diferenciação em fibrócitos envolve enumerar diretamente o número de fibrócitos que são gerados após os monócitos serem incubados com um supressor de fibrócitos (p.ex., o SAP ou a sua variante) ou agente ativador (p.ex., M-CSF). Em um experimento, os monócitos foram purificados da PBMC derivada do sangue usando a seleção por glóbulos magnéticos negativos, padrão na técnica (p.ex., CAT no 113-41 D, Invitrogen, Carlsbad, CA), e cultivados em uma placa de cultura de tecido de 96 cavidades contendo o Meio FibroLife suplementado com 25 ou 50 ng/ml de M-CSF em triplicata. A placa foi incubada por 96 horas, a 37°C, em incubadora com 5% de CO2. As células foram então fixadas com paraformaldeído e tingidas com corante de Hema 3 (Cat no 122-911, Corante de Hema 3, Fisher Scientific, Hampton, NH). O número de fibrócitos por cavidade foi determinado somando a contagem de cinco campos diferentes por cavidade usando um microscópio invertido. Os fibrócitos foram definidos morfologicamente como células aderentes com um formato de eixo alongado e presença de um núcleo oval. Os dados indicaram que 25 ou 50 ng/ml de M-CSF foram suficientes para aumentar o número de fibrócitos que se diferenciam dos monócitos em ~50% neste doador (Figura 4). Os experimentos subsequentes usaram o Meio FibroLife suplementado com 25 ng/ml de M-CSF, conforme necessário e definido abaixo.

[00157] Meio Fibrolife: (Cat no LM-0001, Lifeline Cell Technology, Walkersville, MD) suplementado com HEPES a 10 mM (Cat no H0887, Sigma- Aldrich), 1 x aminoácidos não essenciais (Cat no M7145, Sigma-Aldrich,), piruvato de sódio a 1 mM (Cat no S8636, Sigma-Aldrich), glutamina a 2 mM (Cat no 25030-149, Invitrogen), 100 U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina (Cat no# P0781, Sigma-Aldrich), e ITS-3 (Cat no I2771, 500 ug/ml de soro albumina bovina, 10 ug/ml de insulina, 5ug/ml de transferrina, 5 ng/ml de selenito de sódio, 5 ug/ml de ácido linoléico, e 5 ug/ml de ácido oléico; Sigma-Aldrich).

[00158] Em um experimento adicional, a PBMC ou os monócitos foram purificados do sangue integral e cultivados em Meio FibroLife suplementado com diversas quantidades de SAP em triplicata (como descrito acima). A placa foi incubada por 96 horas, a 37°C, em uma incubadora de 5% de CO2. As células foram então fixadas com paraformaldeído e coloridas com corante de Hema 3 (Cat no 122- 911, Corante de Hema 3, Fisher Scientific, Hampton, NH). O número de fibrócitos por cavidade foi determinado somando a contagem de cinco campos diferentes por cavidade, usando um microscópio invertido. A concentração mínima de SAP, necessária para proporcionar inibição máxima da diferenciação em fibrócitos neste sistema, foi determinada ser 2 ug/ml (Figura 5). O número de fibrócitos diminui com a concentração crescente de SAP em todos os doadores.

INCORPORAÇÃO POR REFERÊNCIA

[00159] Todas as publicações e patentes mencionadas neste documento são, pelo presente, incorporadas por referência em sua totalidade como se cada publicação ou patente individual fosse específica e individualmente indicada para ser incorporada por referência.

[00160] Embora tenham sido discutidas modalidades específicas da matéria, o relatório descritivo acima mencionado é ilustrativo e não restritivo. Muitas variações serão aparentes para aqueles versados na técnica na revisão deste relatório descritivo e das reivindicações abaixo listadas. O escopo completo da invenção deve ser determinado por referência às reivindicações, juntamente com o seu escopo completo de equivalentes, e ao relatório descritivo, juntamente com tais variações.

Claims

1. Polipeptídeo de Amilóide P de Soro (SAP) humano glicosilado, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende uma cadeia de oligossacarídeo N- ligada, em que pelo menos uma ramificação da cadeia de oligossacarídeo termina com uma porção de ácido siálico a2,3-ligada, em que a cadeia de oligossacarídeo é livre de porções de ácido siálico o2,6-ligadas, e em que o polipeptídeo compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. Polipeptídeo de SAP humano glicosilado, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que todas as ramificações sialiladas da cadeia de oligossacarídeo terminam com as porções de ácido siálico a2,3-ligadas.

3. Polipeptídeo de SAP humano glicosilado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia de oligossacarídeo N-ligada compreende um núcleo de pentassacarídeo de Man[(α1,6-)-(Man(α1,3)]-Man(β1,4)- GlcNAc(β1,4)-GlcNAc(β1,N)-Asn.

4. Polipeptídeo de SAP humano glicosilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, CARACTERIZADO pelo fato de que a cadeia de oligossacarídeo compreende pelo menos uma ramificação tendo a estrutura NeuNAc2α3Galβ4GlcNAcβ2Manα6.

5. Polipeptídeo de SAP humano glicosilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de SAP é um polipeptídeo recombinante.

6. Polipeptídeo de SAP humano glicosilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo compreende um ou mais resíduos de aminoácidos modificados selecionados dentre um aminoácido PEGuilado, um aminoácido prenilado, um aminoácido acetilado, um aminoácido biotinilado, e/ou um aminoácido conjugado a um agente de derivação orgânico.

7. Polipeptídeo de SAP humano glicosilado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, CARACTERIZADO pelo fato de que o polipeptídeo de SAP tem uma IC50 para inibir a diferenciação de monócitos em fibrócitos in vitro que é menos do que a metade daquela de uma amostra correspondente de SAP do tipo selvagem isolado do soro humano.

8. Preparação farmacêutica adequada para uso em um mamífero, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o polipeptídeo de SAP humano, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

9. Método para preparar um polipeptídeo de SAP humano, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: i) expressar um polipeptídeo de SAP humano em uma célula CHO; e ii) isolar o polipeptídeo de SAP humano da célula.

10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende ainda alterar enzimaticamente ou quimicamente o polipeptídeo de SAP isolado para produzir um polipeptídeo de SAP tendo uma cadeia de oligossacarídeo modificada, em que alterar enzimaticamente ou quimicamente o polipeptídeo de SAP isolado é efetuado na presença de um ou mais precursores de açúcar ou compreende tratar o polipeptídeo de SAP isolado com uma ou mais proteínas enzimáticas selecionadas dentre glicosiltransferases, glicosidases e fosfatases.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo de alterar enzimaticamente ou quimicamente o polipeptídeo de SAP isolado remove uma ou mais porções terminais de ácido siálico a2,6-ligadas da cadeia de oligossacarídeo.

12. Método, de acordo com a reivindicação 11, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo de alterar enzimaticamente ou quimicamente o polipeptídeo de SAP isolado substitui uma ou mais porções terminais de ácido siálico a2,6-ligadas na cadeia de oligossacarídeo por uma ou mais porções de ácido siálico a2,3-ligadas.

13. Método para preparar um polipeptídeo de SAP, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: i) fornecer um polipeptídeo de SAP glicosilado, em que o polipeptídeo de SAP glicosilado compreende uma cadeia de oligossacarídeo N-ligada; e ii) alterar enzimaticamente ou quimicamente a cadeia de oligossacarídeo N- ligada do polipeptídeo de SAP para produzir um polipeptídeo de SAP glicosilado modificado, em que alterar enzimaticamente ou quimicamente o polipeptídeo de SAP isolado é efetuado na presença de um ou mais precursores de açúcar ou compreende tratar o polipeptídeo de SAP isolado com uma ou mais proteínas enzimáticas selecionadas dentre glicosiltransferases, glicosidases e fosfatases.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo de alterar enzimaticamente ou quimicamente a cadeia de oligossacarídeo N-ligada do polipeptídeo de SAP remove uma ou mais porções terminais de ácido siálico a2,6-ligadas da cadeia de oligossacarídeo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que o processo de alterar enzimaticamente ou quimicamente a cadeia de oligossacarídeo N-ligada do polipeptídeo de SAP substitui uma ou mais porções terminais de ácido siálico o2,6-ligadas na cadeia de oligossacarídeo por uma ou mais porções de ácido siálico a2,3-ligadas.

16. Método para preparar um polipeptídeo de SAP, como definido na reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende: i) fornecer um polipeptídeo de SAP, e ii) alterar enzimaticamente ou quimicamente o polipeptídeo de SAP para produzir um polipeptídeo de SAP glicosilado compreendendo um oligossacarídeo N- ligado, em que alterar enzimaticamente ou quimicamente o polipeptídeo de SAP isolado é efetuado na presença de um ou mais precursores de açúcar ou compreende tratar o polipeptídeo de SAP isolado com uma ou mais proteínas enzimáticas selecionadas dentre glicosiltransferases, glicosidases e fosfatases.

17. Uso de um polipeptídeo de SAP, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, CARACTERIZADO pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir uma condição ou distúrbio selecionado dentre um distúrbio inflamatório, um disturbio fibrótico ou fibroproliferativo, um distúrbio de hipersensibilidade, um distúrbio autoimune, ou mucosite.

18. Uso de um polipeptídeo de SAP, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que é para tratar ou prevenir mielofibrose.

19. Uso de um polipeptídeo de SAP, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que é para tratar ou prevenir doença pulmonar fibrótica humana.

20. Uso de um polipeptídeo de SAP, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de que é para tratar ou prevenir fibrose pulmonar idiopática.