EA030332B1 - Гликозилированные полипептиды сывороточного амилоида р, способы их получения, их применения и их фармацевтические препараты - Google Patents

Abstract

Изобретение относится к неожиданному открытию, что модификация структуры гликана на полипептиде SAP человека может увеличивать биологическую активность этого полипептида SAP относительно соответствующей пробы SAP дикого типа, выделенного из сыворотки человека. Это открытие обеспечивает гликозилированные полипептиды SAP человека, содержащие N-связанную олигосахаридную цепь, в которой все сиалилированные ветви олигосахаридной цепи заканчиваются α2,3-связанной частью сиаловой кислоты, причем олигосахаридная цепь свободна от α2,6-связанных частей сиаловой кислоты, а также имеющие ICдля ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты in vitro, которая меньше соответствующей пробы SAP дикого типа, выделенного из сыворотки человека. Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, содержащим такие полипептиды SAP, способам получения таких полипептидов SAP, клеткам CHO, содержащим такие полипептиды, и к применению таких полипептидов SAP.

Description

Изобретение относится к неожиданному открытию, что модификация структуры гликана на полипептиде δΑΓ человека может увеличивать биологическую активность этого полипептида δΑΓ относительно соответствующей пробы δΑР дикого типа, выделенного из сыворотки человека. Это открытие обеспечивает гликозилированные полипептиды δΑΕ человека, содержащие Νсвязанную олигосахаридную цепь, в которой все сиалилированные ветви олигосахаридной цепи заканчиваются а2,3-связанной частью сиаловой кислоты, причем олигосахаридная цепь свободна от а2,6-связанных частей сиаловой кислоты, а также имеющие Ю50 для ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты ш νίίτο, которая меньше соответствующей пробы δΑΚ дикого типа, выделенного из сыворотки человека. Изобретение также относится к фармацевтическим препаратам, содержащим такие полипептиды δΑί¹, способам получения таких полипептидов δΑΙ⁵, клеткам СИО, содержащим такие полипептиды, и к применению таких полипептидов δΑΕ

030332

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Эта ссылка заявляет преимущество предварительной заявки США с порядковым номером заявки 61/217931, поданной 4 июня 2009 г. Все идеи вышеуказанной заявки включены в данное описание посредством ссылки.

Уровень техники

Сывороточный амилоид Р (ЗАР) является членом семейства белков пентраксинов. ЗАР секретируется печенью и циркулирует в крови в виде стабильного пентамера. Предыдущее исследование демонстрирует, что ЗАР играет важную роль в фазах как инициации, так и разрешения иммунной реакции. ЗАР может связываться с остатками сахара на поверхности бактерий и посредством этого стимулировать их опсонизацию и поглощение антигенпрезентирующими клетками. ЗАР связывается также со свободной ДНК и хроматином, генерируемыми апоптотическими клетками при разрешении иммунной реакции, предотвращая посредством этого вторичную воспалительную реакцию против этих антигенов. Молекулы, связанные ЗАР, удаляются из внеклеточных зон вследствие способности ЗАР связываться со всеми тремя классическими рецепторами Рсу, рецепторами (РсуК), имеющими конкретную аффинность в отношении РсуК11 (СЭ32) и РсуКШ (СЭ16). После связывания рецептора ЗАР и любой прикрепленный комплекс обычно интернализуются и процессируются этой клеткой.

Недавно было выдвинуто предположение, что ЗАР может быть использован в качестве терапевтического агента для лечения различных нарушений, в том числе связанных с фиброзом нарушений, аллергических нарушений, аутоиммунных нарушений, воспаления слизистой оболочки и воспалительных нарушений, таких как нарушения, вызываемые микробной инфекцией. См., например, заявки на патенты США с порядковыми номерами 11/707333, 12/217617, 12/720845 и 12/720847. Белковые терапевтические вещества для лечения заболеваний человека революционизировали медицинскую промышленность. Однако имеются многочисленные трудности в получении белкового терапевтического средства, имеющего необходимую эффективность, и/или получении его в достаточном количестве для использования в качестве терапевтического агента. Многие потенциальные терапевтические агенты модифицированы для увеличения их биологической активности, такой как период полувыведения из плазмы, относительно природно получаемого белка. Для получения полипептида в достаточном количестве обычно выполняется технология рекомбинантной экспрессии. К сожалению, многие рекомбинантные системы продуцируют полипептиды, имеющие другие биологические свойства, чем природные формы, которые могут действовать на фармакокинетику, безопасность и эффективность терапевтического продукта.

Таким образом, остается потребность в развитии полипептидов ЗАР и способов их приготовления, пригодных для терапевтического лечения людей.

Сущность изобретения

Частично это описание изобретения обеспечивает вариантные полипептиды сывороточного амилоида Р (ЗАР) и способы их получения. Данное изобретение включает в себя способы и композиции для ίη νίΐτο и ίη νΐνο добавления, делеции или модификации сахарных остатков для получения вариантных полипептидов, имеющих желаемый характер гликозилирования.

В некоторых аспектах это описание изобретения обеспечивает полипептид ЗАР человека, содержащий Ν-связанную или О-связанную олигосахаридную цепь, которая имеет по меньшей мере одну ветвь, заканчивающуюся а2,3-связанной частью сиаловой кислоты.

В некоторых аспектах это описание изобретения обеспечивает гликозилированный полипептид ЗАР человека, содержащий Ν-связанную или О-связанную цепь олигосахаридную цепь, которая имеет по меньшей мере на 50% меньше а2,6-связанных частей сиаловой кислоты, чем ЗАР дикого типа, выделенный из сыворотки человека.

В некоторых аспектах это описание обеспечивает способы получения гликозилированного полипептида ЗАР человека, предусматривающие экспрессию полипептида ЗАР в клетке и выделение этого полипептида ЗАР из этой клетки. В одном предпочтительном варианте осуществления этой клеткой является клетка СНО. В некоторых аспектах этой клеткой является клетка СНО-З.

В некоторых аспектах это описание обеспечивает способы получения полипептида ЗАР человека, предусматривающие экспрессию полипептида ЗАР человека в клетке СНО и выделение этого полипептида ЗАР человека из этой клетки.

В некоторых аспектах это описание обеспечивает способы получения полипептида ЗАР человека, предусматривающие обеспечение гликозилированного полипептида ЗАР человека, содержащего Ν-связанную или О-связанную олигосахаридную цепь, и ферментативное или химическое изменение Ν-связанной или О-связанной олигосахаридной цепи полипептида ЗАР для получения модифицированного гликозилированного полипептида ЗАР.

В некоторых аспектах это описание изобретения обеспечивает способы получения полипептида ЗАР человека, предусматривающие обеспечение полипептида ЗАР человека и ферментативное или химическое изменение этого полипептида ЗАР для получения гликозилированного полипептида ЗАР, содержащего Ν-связанный или О-связанный олигосахарид.

- 1 030332

В некоторых аспектах это описание обеспечивает полипептид 8ЛР человека, полученный способом, предусматривающим экспрессию полипептида 8ЛР способом, предусматривающим экспрессию полипептида 8ЛР в клетке СНО и выделение этого полипептида 8ЛР из этой клетки.

В некоторых аспектах это описание обеспечивает клетку СНО, которая содержит полипептид 8ЛР человека с Ν-связанной олигосахаридной цепью, имеющей по меньшей мере одну ветвь этой олигосахаридной цепи, заканчивающуюся а2,3-связанной частью сиаловой кислоты.

В некоторых аспектах это описание обеспечивает клетку СНО, содержащую полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид 8ЛР человека.

В некоторых аспектах это описание обеспечивает полипептид 8ЛР человека, имеющий 1С₅₀ для ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты ίη νίΐτο, которая меньше половины, меньше 1/3, меньше 1/4, меньше 1/10 или меньше 1/100 части 1С₅₀ соответствующей пробы 8ЛР дикого типа, выделенного из сыворотки человека.

В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды 8ЛР человека этого изобретения имеют Ν-связанную олигосахаридную цепь. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна ветвь Ν-связанной олигосахаридной цепи заканчивается а2,3-связанной частью сиаловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эта Ν-связанная олигосахаридная цепь имеет по меньшей мере на 50% меньше а2,6-связанных частей сиаловой кислоты, чем 8ЛР дикого типа, выделенный из сыворотки человека. В некоторых вариантах осуществления все ветви этой Ν-связанной олигосахаридной цепи заканчиваются а2,3-связанными частями сиаловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эта Ν-связанная олигосахаридная цепь, по существу, не содержит а2,6-связанных частей сиаловой кислоты. Гликовариантные полипептиды 8ЛР этого изобретения могут содержать одну или несколько ветвей, например Ν-связанная олигосахаридная цепь может характеризоваться как имеющая би-антеннарную, триантеннарную, тетра-антеннарную или пента-антеннарную структуру. В некоторых вариантах осуществления эта Ν-связанная олигосахаридная цепь содержит пентасахаридную сердцевину Μαη[(α1,6-)-(Μαη(α1,3)]-Μαη(β1,4)-01οΝΑο(β1,4)-01οΝΑο(β1,Ν)-Αδη. В некоторых вариантах осуществления эта Ν-связанная олигосахаридная цепь содержит по меньшей мере одну ветвь, имеющую структуру ΝοιιΝΑο2(/.30;·ι1β401οΝΑοβ2Μ;·ιη(/.6. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна ветвь Ν-связанной олигосахаридной цепи не содержит галактозы и Ν-ацетилглюкозамина. В некоторых вариантах осуществления все ветви Ν-связанной олигосахаридной цепи, по существу, не содержат галактозы и Ν-ацетилглюкозамина. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна ветвь Ν-связанной олигосахаридной цепи содержит один или несколько маннозных остатков. В некоторых вариантах осуществления эта Ν-связанная олигосахаридная цепь содержит по меньшей мере один фукозный остаток. Любой из гликовариантных полипептидов ЗЛР этого изобретения может содержать по меньшей мере один модифицированный гликозильный остаток. Модифицированный гликозильный остаток может быть конъюгирован с одним или несколькими модифицирующими группами, выбранными из водорастворимых и нерастворимых полимеров, терапевтических частей молекул, диагностических агентов и биомолекул.

В некоторых аспектах полипептид ЗЛР этого изобретения может быть рекомбинантным полипептидом. Полипептид ЗЛР этого изобретения может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную ЗЕО ΙΌ ΝΟ: 1, 2, 3 или 4. Предпочтительно полипептид ЗЛР является белком ЗЛР человека. Полипептид ЗЛР человека этого изобретения может содержать аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичную ЗЕО ГО ΝΟ: 1.

В некоторых аспектах полипептид ЗЛР человека этого изобретения является слитым белком, содержащим домен ЗΑР человека и один или несколько гетерологичных доменов. Этот гетерологичный домен может усиливать одно или несколько из таких свойств, как стабильность ίη νίνο, период полувыведения ίη νίνο, поглощение/введение, локализацию или распределение в ткани, образование белковых комплексов и/или очистка.

В некоторых аспектах полипептид ЗЛР человека этого изобретения содержит один или несколько модифицированных аминокислотных остатков, например пэгилированную аминокислоту, гликозилированную (например, О-связанным гликозилированием) аминокислоту, пренилированную аминокислоту, ацетилированную аминокислоту, биотинилированную аминокислоту и/или аминокислоту, конъюгированную с органическим дериватизирующим агентом. Эти модифицированные аминокислотные остатки могут усиливать одно или несколько из таких свойств, как стабильность ίη νίνο, период полувыведения ίη νίνο, поглощение/введение, локализацию или распределение в ткани, образование белковых комплексов и/или очистка.

В предпочтительных вариантах осуществления полипептиды ЗЛР человека этого изобретения имеют увеличенную биологическую активность относительно соответствующей пробы ЗЛР дикого типа, выделенного из сыворотки человека. В некоторых аспектах полипептиды ЗЛР этого изобретения имеют 1С₅₀ для ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты ίη νίΐτο, которая меньше половины, меньше 1/3, меньше 1/4, меньше 1/10 или меньше 1/100 части 1С₅₀ соответствующей пробы ЗЛР дикого

- 2 030332

типа, выделенного из сыворотки человека.

В некоторых аспектах способы получения любого из полипептидов ЗАР человека этого изобретения предусматривают дополнительную стадию ферментативного или химического изменения полипептида ЗАР для присоединения Ν-связанной или О-связанной олигосахаридной цепи к полипептиду ЗАР или для модификации существующей Ν-связанной или О-связанной олигосахаридной цепи полипептида ЗАР. В некоторых вариантах осуществления ферментативное или химическое изменение полипептида ЗАР предусматривает обработку полипептида ЗАР одним или несколькими ферментативными белками, выбранными из гликозилтрансфераз, гликозидаз и фосфатаз. В некоторых вариантах осуществления способ ферментативного или химического изменения полипептида ЗАР осуществляется в присутствии одного или нескольких предшественников сахаров. Подходящие предшественники сахаров включают в себя, но не ограничиваются ими, УДФ-Ы-ацетилглюкозамин, УДФ-Ы-ацетилгалактозамин ЦМФ-Νгликолилнейраминовую кислоту, ЦМФ-Ы-ацетилнейраминовую кислоту, УДФ-галактозу и ГДФ-фукозу. В некоторых вариантах осуществления способ ферментативного или химического изменения полипептида ЗАР удаляет одну или несколько концевых а2,6-связанных частей сиаловой кислоты из Ν-связанной или О-связанной олигосахаридной цепи. В некоторых вариантах осуществления способ ферментативного или химического изменения выделенного полипептида ЗАР заменяет одну или несколько концевых а2,6-связанных частей сиаловой кислоты на этой олигосахаридной цепи одной или несколькими а2,3-связанными частями сиаловой кислоты.

Это описание дополнительно обеспечивает фармацевтические препараты полипептидов ЗАР человека этого изобретения для применения млекопитающим. Фармацевтические препараты этого изобретения включают в себя по меньшей мере один из описанных здесь полипептидов ЗАР и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления этот фармацевтический препарат дополнительно содержит дополнительный активный агент. В некоторых вариантах осуществления этот фармацевтический препарат готовят в виде композиции пролонгированного высвобождения. В некоторых вариантах осуществления фармацевтические препараты этого описания пригодны для введения пациенту местно, инъекцией, внутривенной инъекцией, ингаляцией, с использованием непрерывного депопрепарата пролонгированного действия или посредством насоса.

Это описание изобретения обеспечивает способы лечения или предупреждения чувствительных к ЗАР нарушений или состояний введением пациенту, нуждающемуся в этом, терапевтически эффективного количества одного или нескольких полипептидов ЗАР этого изобретения. Чувствительные к ЗАР нарушения или состояния включают в себя, но не ограничиваются ими, фиброзные или фибропролиферативные нарушения или состояния, аллергические нарушения или состояния, аутоиммунные нарушения или состояния, воспалительные заболевания или состояния и воспаление слизистой оболочки. Полипептид ЗАР этого изобретения может вводиться пациенту местно, инъекцией, внутривенной инъекцией, ингаляцией, с использованием непрерывного депо-препарата пролонгированного действия или посредством насоса или комбинацией этих способов. В некоторых вариантах осуществления полипептид ЗАР этого изобретения вводят с одним или несколькими дополнительными активными агентами.

Краткое описание фигур

Фиг. 1. Анализ дифференцировки фиброцитов.

Анализ на основе ЕЫЗА использовали для измерения продуцирования МЭС после инкубирования моноцитов с полипептидами ЗАР. Υ-ось показывает среднюю эффективность (т.е. среднее из семи независимых экспериментов) полученного из сыворотки ЗАР человека (ЬЗАР) в сравнении с рекомбинантным ЗАР человека (тЬЗАР), выделенным из клеток СНО-δ. Относительная активность ЬЗАР установлена при 1,0.

Фиг. 2. Структурный анализ гликана вариантных полипептидов ЗАР.

Анализ (А) масс-спектрометрией, сопряженной с жидкостной хроматографией (ЬСМЗ), и анализ (В) анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографией (АЕХ-НРЬС) использовали для определения связей сиаловой кислоты на гликоремоделированном ЗАР человека, выделенном из клеток СНО-З. Анализ (С) масс-спектрометрией, сопряженной с жидкостной хроматографией (ЬСМЗ), и анализ (О) анионообменной высокоэффективной хроматографией (АЕХ-НРЬС) использовали для определения связей сиаловой кислоты на гликоремоделированном ЬЗАР (полученном из сыворотки человека ЗАР). Анализ (Е) масс-спектрометрией, сопряженной с жидкостной хроматографией (ЬСМЗ), и анализ (Р) анионообменной высокоэффективной хроматографией (АЕХ-НРЬС) использовали для определения связей сиаловой кислоты на тЬЗАР, который обрабатывали а2,3-сиалилтрансферазой для увеличения количества концевых 2,3-связанных сиаловых кислот на гликанах ЗАР.

Для фигур ЬСМЗ: Х-ось представляет массу в дальтонах, а Υ-ось представляет относительную интенсивность. Для кривых НРЬС: Х-ось является временем в минутах, а Υ-ось является единицами абсорбции (шАИ).

Фиг. 3. Анализ дифференцировки фиброцитов.

Анализ на основе ЕЫЗА использовали для измерения продуцирования МЭС после инкубирования моноцитов с вариантными полипептидами ЗАР. Υ-ось показывает среднюю относительную активность

- 3 030332

каждого варианта 8ЛР в сравнении со ссылочным стандартом й§АР. для которого эта активность установлена при 1.0 (см. самый левый столбец).

Фиг. 4. Анализ дифференцировки фиброцитов.

Моноциты обрабатывали ЙМС8Р и затем впоследствии определяли количественно в отношении дифференцировки фиброцитов. Х-ось представляет концентрацию ЙМС8Е. инкубированного с донорными моноцитами. Υ-ось показывает величину пролиферации фиброцитов в день 5. измеренную подсчетом фиброцитов на 5.0х10⁴ клеток.

Фиг. 5. Анализ дифференцировки фиброцитов.

Моноциты обрабатывали й§АР и затем впоследствии определяли количественно в отношении дифференцировки фиброцитов. Х-ось представляет концентрацию Й8АР. инкубированного с донорными моноцитами. Υ-ось показывает количество пролиферации фиброцитов в день 5. измеренное подсчетом фиброцитов на 5.0х10⁴ клеток.

Подробное описание изобретения

Обзор.

Наиболее часто встречающиеся в природе пептиды имеют углеводные части (т.е. гликаны). присоединенные к этому пептиду через специфические связи с определенными аминокислотами вдоль длины первичной пептидной цепи. с образованием таким образом "гликопептидов". Характер гликозилирования на любом конкретном пептиде может оказывать огромные воздействия на функцию этого пептида. Например. структура этих Ν-связанных гликанов на пептиде может влиять на различные характеристики этого пептида. включающие в себя чувствительность к протеазам. внутриклеточную направленную миграцию. секрецию. тканевое нацеливание. биологический период полувыведения и антигенность. Изменение одной или нескольких из этих характеристик в значительной степени влияет на эффективность пептида в его природном окружении.

Структуры гликанов. обнаруженных в встречающихся в природе гликопептидах. обычно подразделяются на два класса: Ν-связанные и О-связанные гликаны. Пептиды. экспрессируемые в эукариотических клетках. являются обычно Ν-гликозилированными на остатках аспарагина в сайтах в первичной структуре пептида. содержащих последовательность аспарагин-Х-серин/треонин. где X может быть любой аминокислотой. за исключением пролина и аспарагиновой кислоты. Углеводная часть таких пептидов известна как Ν-связанный гликан или Ν-связанный олигосахарид. Эти ранние события Ν-гликозилирования встречаются в эндоплазматическом ретикулуме (ЕК) и являются консервативными у млекопитающих. растений. насекомых и других высших эукариотов. Сначала олигосахаридная цепь. содержащая 14 сахарных остатков. конструируется на молекуле липидного носителя. Когда возникающий пептид транслируется и транслоцируется в ЕК. вся эта олигосахаридная цепь переносится к амидной группе остатка аспарагина в реакции. катализируемой мембраносвязанным ферментом гликозилтрансферазой. Этот Ν-связанный гликан дополнительно процессируется как в ЕК. так и в аппарате Гольджи. Этот дополнительный процессинг обычно влечет за собой удаление некоторых из сахарных остатков и добавление других сахарных остатков в реакциях. катализируемых гликозилазами и гликотрансферазами. специфическими в отношении удаляемых и добавляемых сахарных остатков.

Обычно конечные структуры Ν-связанных гликанов зависят от организма. в котором продуцируется этот пептид. Например. пептиды. продуцируемые в бактериях. обычно являются негликозилированными. Пептиды. экспрессируемые в клетках насекомых. обычно содержат высокое количество маннозных или малое количество маннозных Ν-связанных олигосахаридных цепей. Пептиды. продуцируемые в культуре клеток млекопитающих. обычно являются дифференциально гликозилированными в зависимости от вида и условий культуры клеток. Даже в одном и том же виде и при одних и тех же условиях иногда встречается некоторое количество гетерогенности в гликозильной цепи. Обычно пептиды. продуцируемые в клетках растений. содержат структуры гликанов. которые значимо отличаются от структур. продуцируемых в клетках животных.

В этой области были предложены множество способов для получения конкретного характера гликозилирования пептида. в том числе способы. описанные в опубликованных международных заявках с номерами \УО 99/22764. \νϋ 98/58964 и \νϋ 99/54342. а также в патенте США № 5047335. По существу. были клонированы и секвенированы многие из ферментов. требуемых для гликозилирования ίη νίΐΓΟ пептидов. В некоторых случаях эти ферменты использовали ίη νΐίτο для добавления конкретных сахаров к гликану на пептиде. В других случаях клетки конструировали генетически для экспрессии комбинации ферментов и желаемых белков таким образом. что добавление желаемой сахарной части к экспрессируемому пептиду происходит в этой клетке.

В синтезе углеводов используют два основных класса ферментов: гликозилтрансферазы и гликозидазы.

Гликозилтрансферазы добавляют или модифицируют существующие олигосахаридные структуры на пептиде. Гликозилтрансферазы являются эффективными для получения специфических продуктов с хорошим стереохимическим и региохимическим контролем.

- 4 030332

Гликозилтрансферазы использовали для получения олигосахаридов и для модификации концевых Ν- и О-связанных углеводных структур, в частности, на пептидах, продуцируемых в клетках млекопитающих. Например, эти концевые олигосахариды гликопептидов могут быть полностью сиалилированы и/или фукозилированы для обеспечения более стойких сахарных структур с использованием гликозилтрансфераз, которые могут улучшать фармакодинамику гликопептидов и множество других биологических свойств.

Гликозидазы дополнительно классифицируются как экзогликозидазы (например, β-маннозидаза, β-глюкозидаза) и эндогликозидазы (например, Епйо-А, Епйо-М). Гликозидазы в норме катализируют гидролиз гликозидной связи. Однако при соответствующих условиях они могут быть использованы для образования этой связи. Большинство гликозидаз, используемых для синтеза углеводов, являются экзогликозидазами; перенос гликозила происходит при невосстанавливающем конце этого субстрата. Гликозидаза связывает донор гликозила в промежуточном продукте гликозил-фермент, который перехватывается либо водой с образованием продукта гидролиза, либо акцептором для генерирования нового гликозида или олигосахарида. Одним примерным путем, использующим экзогликозидазу, является синтез сердцевинного трисахарида всех Ν-связанных гликопептидов, в том числе β-маннозидной связи, которая образуется действием β-маннозидазы (ЗтдЬ е! а1., СЬет. Соттип. 993-994 (1996)). Хотя их применение является менее обычным, чем применение экзогликозидаз, эндогликозидазы, также могут использоваться для образования углеводов. Эндогликозидазы могут быть использованы для переноса всей олигосахаридной цепи, а не моносахарида, на полипептид. Фрагменты олигосахаридов добавляли к субстратам с использованием эндо^-ТОацетилглюкозаминов, таких как эндо-Е и эндо-М (Шапд е! а1., Те!гаЬейгоп Ье!!. 37: 1975-1978 и Напейа е! а1., СагЪоЬуйг. Кез. 292: 61-70 (1996). Каждый из этих классов ферментов успешно использовали для получения гликозилированных пептидов. В отношении общего обзора, см. Сгои! е! а1., Сигг. Ορίη. СЬет. Βίο1. 2: 98-111 (1998).

Сывороточный амилоид Р (ЗАР) является встречающимся в природе сывороточным белком в млекопитающих, состоящим из пяти идентичных субъединиц, или "стимуляторов", которые нековалентно ассоциированы в подобном диску комплексе. 8АР принадлежит к суперсемейству белков пентраксинов, которые характеризуются этой циклической пентамерной структурой. Классические короткие пентраксины включают в себя ЗАР, а также С-реактивный белок (Озтапй, А.Р., е! а1., Ргос. ΝοΙ. Асай. δει., 74: 739-743, 1997). ЗАР обычно синтезируется в печени и имеет физиологический период полувыведения 24 ч. Ниже описана последовательность субъединицы ЗАР человека, которая соответствует аминокислотам 20-223 Оспе Ьапк Ассеззюп ΝΟ. NР 001630 (сигнальная последовательность не изображена).

НТОЬЗСКУГУГРКЕЗУТОНУЫЫТРЬЕКРЪаЫГТЬСГКАУЗОЪЗНАУЗЪГЗУЫТОСНЪЫЕЪЬУ ΥΚΕΡν0ΕΥ5ΕΥΙ0ΡΗΚνΤ8ΚνΐΕΚΕΡΑΡνΗΙ0ν5ΐΛ/Ε5550ΙΑΕΕΜΙΝ0ΤΡΕνΚΚ0ΕΡ<20ΥΕνΕ Α<2ΡΚΐνΕΟ<2Ε<2ϋ5ΥΟ<3ΚΕΌΚ5<25ΕνθΕΙΟϋΕΥΜΚϋ5νΕΡΡΕΝΙΕ5ΑΥ(2!3ΤΡΕΡΑΝΙΕΡΚ(2ΑΕΝ ΥΕΙΚσΥνΤΙΚΡΙΛΑίν (5Εζ) ТО N0:1)

Ниже описана последовательность субъединицы ЗАР Оа11из §а11из.

ОЕБЪУККУЕУЕКЕОРЗОАУУЪЕОУОЪЕКРЪЫТОТУСЕКЗУТОЪТКРНЗЕЕЗУАТКАООЖТОЕ ΕΚΡΚΡΟΕΥΚΕΥνθΟΚΥνΤΕΚνΡΕΝΚΟΕΝΕΗνθΑ5ΝΕ5Ο5<3ΙΑΕΕΝΕΝΟΚΡΚΡΚΚ(3Ε0ΚΟΥΕνθ ЕЕАУУМЪСОЕООАУСССЕОУУЖЕТСЕМАОУНЪТОАСЪЗРОКМКЗАУЪАЪКЪРРАРЪАИСКЪК УЕАКСОАЛТОКРКЪНЕАЬСА (5Е<2 ТО N0:2)

Ниже описана последовательность субъединицы ЗАР Воз !аигиз.

0ΤΟΕΚΟΚνΕνΕΡΚΕ55ΤΟΗνΤΕΙΤΚΕιΕΚΡΕΚΝΕιΤΕι(2ΕιΡΑΥ5ΌΕ5ΚΟΥ5ΕΕ5ΥΝΙΗ5ΚΌΝΕΕιΕν ЕКЫС1СЕУЗЬУ1СКТКУТУКАТЕКЕРЗРУН1СТ31л/ЕЗЗТС1АЕЕИ1МСКРЬУККСЬК0С¥АУС ΑΗΡΚΐνΕΟ<2Ε<2ϋ5ΥΟΟΟΕϋΚΝ<25ΕΜΟΕΙ СРЬУМТОЗУЬЗРЕЕ1ЬЪУУ <2055515 РТ1]ТОИ<2АЬ КУЕ1КСУУ1УКРМУИС (5Е<2 ТО N0:3).

Ниже описана последовательность субъединицы ЗАР Спсе!и1из т1§га!опиз.

ОТОЪТСКУЕУЕРКЕЗЕЗОУУКЪТОКЪЕКРГ^ЕТЪСЕКТУТОЪЗКРНЗЪЕЗУЖКШШЯЕЪЫ

ΥΚΕΚΜ0ΕΥ0ΕΥΙΕΝν0ΑΐνΚ0νΕΕΕΑ5ΡνΗΕ0Τ5ΝΕ5550ΙΑ0ΕΝνΝ0ΙΡΝνΚΚ0ΕΚΚ0ΥΤνΚ

Τ0Ρ5ΙΙΕΟ0Ε0ΟΝΥΟΟΟΕΟΚ505ΕνθΕΜΟΟΕΝΜΝΟ5νΕΤΡΕΕΙΚ5νΥΕΟ5ΝΕΕΡΝΙΕΟΝΗΑΕΝ ΥΕΜ5ΟΥΑνΐΡΡΡνΝΗ (5Е<2 ТО N0:4).

Один аспект данного изобретения относится к неожиданному открытию, что модификация структуры гликана на полипептиде ЗАР человека может увеличивать биологическую активность полипептида ЗАР относительно соответствующей пробы ЗАР дикого типа, выделенного из сыворотки человека. Как показано примерами этого описания изобретения, выделенный ЗАР из сыворотки человека содержит только а2,6-связанные остатки сиаловой кислоты. В отличие от этого, рекомбинантный ЗАР человека,

- 5 030332

продуцируемый в клетках СНО, содержит только а2,3-связанные остатки сиаловой кислоты. С использованием биоанализов на основе клеток ίη νίΐτο было продемонстрировано, что полипептиды §АР с а2,3-связанной сиаловой кислотой имеют постоянно более высокую активность, чем §АР дикого типа (т.е. 8АР, содержащий а2,6-связанные части сиаловой кислоты), выделенный из сыворотки человека. Эти вариантные полипептиды §АР данного изобретения могли бы быть более эффективными в качестве терапевтических агентов, вследствие их увеличенной биологической эффективности. Например, более эффективные варианты §АР могут требовать меньшей дозы и/или менее частого введения доз относительно 8АР дикого типа, выделенного из сыворотки человека. Данное описание изобретения обеспечивает как вариантные полипептиды §АР человека, так и способы их получения. В частности, это описание включает в себя способы и композиции для ίη νίΐτο и ίη νίνο добавления, делеции или модификации сахарных остатков для получения полипептида 8АР человека, имеющего желаемый характер гликозилирования.

Определения.

Если нет иного определения, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же самое значение, что и значение, обычно понимаемое средним специалистом в данной области. В общем, номенклатура, используемая в данном описании и в лабораторных процедурах в культуре клеток, молекулярной генетике, органической химии и химии и гибридизации нуклеиновых кислот, хорошо известна и обычно используется в данной области. Для синтеза нуклеиновых кислот и пептидов используются стандартные способы. Эти способы и процедуры обычно выполняют в соответствии с общепринятыми способами в данной области и многочисленными общими ссылками (например, 8атЬгоок с1 а1., 1989, Мо1еси1аг С1отпд: А ЕаЬогаЮгу Мапиа1, 2"^й ей. Со1й 8ргшд НагЬог ЕаЬогаЮгу Рге88, Со1й 8ргшд НагЬог, N. Υ.), которые приводятся по всему этому документу.

Существительные в единственном числе используются здесь для ссылки на один или несколько (т.е. по меньшей мере один) из грамматических объектов. Например, "элемент" обозначает один элемент или больше чем один элемент.

Как используется в данном описании, термины "лечение" и "обработка" относятся к получению желаемого фармакологического и/или физиологического эффекта. Этот эффект может быть профилактическим в том смысле, что он полностью или частично предотвращает нарушение или его симптом, или может быть терапевтическим в том смысле, что он частично или полностью излечивает нарушение и/или вредное воздействие, приписываемое этому нарушению. "Лечение" в данном контексте охватывает любое лечение заболевания у млекопитающего, в частности у человека, и включает в себя (а) увеличение времени выживания; (Ь) уменьшение риска смерти вследствие этого заболевания; (с) ингибирование этого заболевания, т.е. остановку его развития или уменьшение скорости прогрессирования заболевания; и (й) ослабление этого заболевания, т.е. вызывание регрессии этого заболевания.

В данном контексте терапевтическое средство, которое "ингибирует" или "предотвращает" нарушение или состояние, является соединением, которое в статистической пробе уменьшает появление этого нарушения или состояния в обработанной пробе относительно необработанной контрольной пробы или задерживает появление или уменьшает тяжесть одного или нескольких симптомов этого нарушения или состояния относительно необработанной контрольной пробы.

В этом контексте термины "субъект" и "пациент" относятся к животным, в том числе млекопитающим, таким как люди. Термин "млекопитающее" включает в себя приматов, домашних животных, включающих в себя собак, кошек, овец, крупный рогатый скот, лошадей, коз, свиней, мышей, крыс, кроликов, морских свинок, находящихся в неволе животных, таких как животные зоопарка, и диких животных.

В этом контексте термин "ткань" относится к органу или группе специализированных клеток, таких как кожная ткань, легочная ткань, ткань почки и другие типы клеток.

Термин "терапевтическое действие" является общепризнанным и относится к локальному или системному действию в животных, в частности млекопитающих, и более конкретно в людях, вызываемому фармакологически активным веществом. Фраза "терапевтически эффективное количество" обозначает количество такого вещества, которое производит некоторое желаемое локальное или системное действие при разумном соотношении пользы/риска, применимое к любой обработке. Терапевтически эффективное количество такого вещества будет варьироваться в зависимости от субъекта и патологического состояния, подвергаемого лечению, массы и возраста этого субъекта, тяжести этого патологического состояния, способа введения, которые могут быть легко определены средним специалистом в данной области. Например, некоторые описанные здесь композиции могут вводиться в достаточном количестве для получения желаемого действия в разумном соотношении пользы/риска, применимом к такому лечению.

В этом контексте термин "нуклеиновая кислота" относится к полинуклеотиду, такому как дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) и, в случае необходимости, рибонуклеиновая кислота (РНК). Должно быть понятно, что этот термин включает в себя также в качестве эквивалентов аналоги РНК или ДНК, полученные из аналогов нуклеотидов, и применительно к описываемому варианту одноцепочечный (например, смысловой или антисмысловой) и двухцепочечный полинуклеотид.

- 6 030332

Термины "пептиды", "белки" и "полипептиды" используются здесь взаимозаменяемо. Термин "очищенный белок" относится к препарату белка или белков, которые выделены или другим образом по существу освобождены от других белков, обычно ассоциированных с этим белком (с этими белками) в клетке или клеточном лизате. Термин "по существу свободные от других клеточных белков" или "по существу свободные от других загрязняющих белков" определяется как термин, включающий в себя отдельные препараты каждого из этих белков, содержащие менее 20% (в расчете на сухую массу) загрязняющего белка и предпочтительно менее 5% загрязняющего белка. Функциональные формы каждого из этих белков могут быть получены в виде очищенных препаратов с использованием клонированного гена, как также известно в данной области.

Под термином "очищенная" имеется в виду, что указанная молекула присутствует, по существу, в отсутствие других биологических макромолекул, таких как другие белки (в частности, другие белки, которые могут существенно маскировать, уменьшать, создавать путаницу или изменять характеристики этих белков-компонентов либо в очищенных белках, либо в их функции в рассматриваемой воссозданной смеси). Термин "очищенные" в данном контексте означает предпочтительно по меньшей мере 80% в расчете на сухую массу, более предпочтительно в диапазоне 85% в расчете на массу, более предпочтительно 95-99% в расчете на массу и наиболее предпочтительно по меньшей мере 99,8% в расчете на массу присутствующих биологических макромолекул того же самого типа (но могут присутствовать вода, буферы и другие малые молекулы, особенно молекулы, имеющие молекулярную массу менее 5000). Термин "чистые" в данном контексте имеет те же самые числовые границы, что и "очищенные", приведенные непосредственно выше.

"Ν-связанные" олигосахариды являются олигосахаридами, которые связаны с пептидным скелетом через аспарагин посредством связи аспарагин-Л-ацетилглюкозамин. Ν-связанные олигосахариды называют также "Ν-гликанами." Встречающиеся в природе Ν-связанные олигосахариды имеют общую пентасахаридную сердцевину Μαη[(α1,6-)-(Μαη(α1,3)]-Μαη(β1,4)-Ο1εΝΑε(β1,4)-Ο1εΝΑε(β1,Ν). Они отличаются присутствием и количеством ветвей (также называемых антеннами) периферических сахаров, таких как Ν-ацетилглюкозамин, галактоза, Ν-ацетилгалактозамин, фукоза и сиаловая кислота. Необязательно, эта структура может также содержать молекулу фукозы и/или молекулу ксилозы в качестве сердцевины (кора).

Термин "сиаловая кислота" относится к любому члену семейства 9-углеродных карбоксилированных сахаров. Наиболее обычным членом семейства сиаловых кислот является Ν-ацетилнейраминовая кислота (часто сокращаемая как №и5Ас, №иАе или ΝΑΝΑ). Вторым членом этого семейства является Ν-гликолилнейраминовая кислота (№и50с или №иОс), в которой Ν-ацетильная группа NеиΑс является гидроксилированной. Третьим членом семейства сиаловых кислот является 2-кето-3дезоксинонулозоновая кислота (ΚΌΝ) (Ναάαηο с( а1. (1986) 1. Βίο1. СЬет. 261: 11550-11557; Капатоп с( а1., I. Βίο1. СЬет. 265: 21811-21819 (1990)). Включены также 9-замещенные сиаловые кислоты, такие как 9-О-С1С₆-ацил-№и5Ас, такие как 9-Ο-лактил-Nеи5Αс или 9-О-ацетил-№и5Ас, 9-дезокси-9-фтор-№и5Ас и 9-азидо-9-дезокси-№и5Ас. В отношении обзора семейства сиаловых кислот см., например, Уагкк О1усоЫо1оду 2: 25-40 (1992); §1аЬс ΑΟάδ: сЬет181гу, МекаЬоЬзт апй Рипсйоп, К. ЗсЬаиег, Ей. (8ргтдег-Уег1ад, №ν Уогк (1992)).

"Генетически сконструированная" или "рекомбинантная клетка" является клеткой, имеющей одну или несколько модификаций в отношении генетического материала этой клетки. Такие модификации включают в себя, но не ограничиваются ими, инсерции генетического материала, делеции генетического материала и инсерцию генетического материала, который является внехромосомным, независимо от того, является или не является такой материал стабильно сохраняющимся.

В данном контексте термин "модифицированный сахар" относится к встречающемуся в природе или не встречающемуся в природе углеводу, который ферментативно добавлен на аминокислотный или гликозильный остаток пептида в способе этого изобретения. Этот модифицированный сахар выбран из ряда субстратов ферментов, в том числе, но не только, сахарных нуклеотидов (моно-, ди- и трифосфатов), активированных сахаров (например, гликозилгалогенидов, гликозилмезилатов) и сахаров, которые не являются активированными и не являются нуклеотидами. "Модифицированный сахар" может быть ковалентно функционализован "модифицирующей группой". Применимые модифицирующие группы включают в себя, но не ограничиваются ими, водорастворимые и нерастворимые в воде полимеры, терапевтические части молекул, диагностические части молекул, биомолекулы. Локус функционализации модифицирующей группой выбирают таким образом, что он не препятствует ферментативному добавлению этого "модифицированного сахара" к пептиду или гликозильному остатку этого пептида.

Вариантные полипептиды 8ΑΡ.

Частично данное описание изобретения обеспечивает вариантные полипептиды сывороточного амилоида Р (8ΑΡ). В частности, варианты 8ΑΡ этого изобретения включают в себя гликозилированные полипептиды 8ΑΡ человека, которые содержат одну или несколько Ν-связанных или О-связанных олигосахаридных цепей, каждая из которых имеет одну, две, три, четыре или пять или более ветвей, заканчивающихся а2,3-связанной частью сиаловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления все ветви

- 7 030332

этих Ν-связанных или О-связанных олигосахаридных цепей заканчиваются в а2,3-связанных частях. Другие варианты ЗАР этого изобретения включают в себя гликозилированные полипептиды ЗАР человека, которые содержат Ν-связанные или О-связанные олигосахаридные цепи, имеющие по меньшей мере на 20, 25, 30, 35 40, 45, 50, 55, 60, 65 75, 80, 85 или даже по меньшей мере на 95% меньше а2,6-связанных частей сиаловой кислоты, чем полипептид ЗАР дикого типа, полученный из сыворотки человека. В некоторых вариантах осуществления Ν-связанные или О-связанные олигосахаридные цепи по существу не содержат а2,6-связанных частей сиаловой кислоты, например имея менее 80, 85, 90, 95, 97, 98 или даже менее 99% а2,6-связанных частей сиаловой кислоты относительно полипептида ЗАР дикого типа, полученного из сыворотки человека).

Гликовариантные полипептиды ЗАР этого изобретения могут содержать Ν-связанную олигосахаридную или О-связанную цепь, имеющую одну или несколько ветвей (например, имеющую биантеннарную, три-антеннарную, тетра-антеннарную, пента-антеннарную и т.д. структуру). В некоторых вариантах осуществления полипептиды ЗАР этого изобретения содержат Ν-связанную или О-связанную олигосахаридную цепь, в которой одна, две, три, четыре или пять ветвей этой олигосахаридной цепи по существу свободны от галактозы и Ν-ацетилглюкозамина (например, имея менее 80, 85, 90, 95, 97, 98 или даже менее 99% Ν-ацетилглюкозамина относительно полипептида ЗАР дикого типа, полученного из сыворотки человека). Некоторые полипептиды ЗАР этого изобретения имеют Ν-связанные или Освязанные олигосахаридные цепи, которые по существу свободны от галактозы и Ν-ацетилглюкозамина (например имея менее 80, 85, 90, 95, 97, 98 или даже менее 99% галактозы и/или Ν-ацетилглюкозамина относительно полипептида ЗАР дикого вида, полученного из сыворотки человека). В некоторых вариантах осуществления полипептиды ЗАР этого изобретения содержат Ν-связанную или О-связанную олигосахаридную цепь, в которой одна, две, три, четыре или пять ветвей этой олигосахаридной цепи содержат один или несколько маннозных остатков. В некоторых вариантах осуществления полипептид ЗАР этого изобретения содержит Ν-связанный олигосахарид, имеющий пентасахаридную сердцевину Маи[(а1,6-)(Маи(α1,3)]-Маи(β1,4)-О1сNАс(β1,4)-О1сNАс(β1,N)-А8и. Эта пентасахаридная сердцевина может также содержать один или несколько фукозных или ксилозных остатков. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ЗАР этого изобретения содержат Ν-связанную олигосахаридную цепь, в которой одна, две, три, четыре или пять ветвей этой олигосахаридной цепи имеют структуру №иNАс2α3Оа1β4О1сNАсβ2Маиα6. Полипептиды ЗАР этого изобретения могут также содержать Ν-связанную олигосахаридную цепь, в которой все ветви имеют структуру №иNАс2α3Оа1β4О1сNАсβ2Маиα6.

Вариантные полипептиды ЗАР этого изобретения могут содержать один или несколько "модифицированных" сахарных остатков. Модифицированные сахара замещены в любом положении, которое позволяет присоединение этой модифицирующей части или группы. В предпочтительных аспектах модифицированный сахар замещен в положении, которое все еще позволяет сахару функционировать в качестве субстрата для фермента, используемого для связывания этого модифицированного сахара с пептидом ЗАР. Модифицирующая группа может быть присоединена к сахарной части ферментативным способом, химическим способом или их комбинацией с образованием посредством этого модифицированного сахара, например модифицированной галактозы, фукозы или сиаловой кислоты. Модифицирующие группы, подходящие для использования в данном изобретении, а также способы конъюгации этих модифицирующих групп с сахарными остатками описаны в следующем разделе.

В предпочтительных аспектах вариантные полипептиды ЗАР этого изобретения имеют 1С₅₀ для ингибирования дифференцировки моноцитов в фибропласты ίη νίίΓΟ, которая меньше половины 1С₅₀ соответствующей пробы ЗАР дикого типа, выделенного из сыворотки человека. В некоторых вариантах осуществления вариантные полипептиды ЗАР этого изобретения имеют 1С₅₀ для ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты ίη νίίΓΟ, которая меньше 1/3, меньше 1/4, меньше 1/10 или меньше 1/100 1С₅₀ соответствующей пробы ЗАР дикого типа, выделенного из сыворотки человека.

Вариантные полипептиды ЗАР этого изобретения могут быть по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 96%, по меньшей мере на 97%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99 или 100% идентичны аминокислотной последовательности ЗЕО ГО ΝΟ: 1, как определено с использованием компьютерной программы РАЗТЭВ на основе алгоритма ВгиЙад с1 а1. (Сотр. Арр. Вю5сг. 6:237-245 (1990)). В одном конкретном варианте осуществления параметры, используемые для расчета процентной идентичности и сходства сопоставления аминокислот, включает в себя: Ма1п\=РАМ 150, к-1ир1е=2, МЪшаЮН РспаНу (штраф за ошибочное спаривание)=1, ίοίηίηβ РспаНу (объединенный штраф)=20, Ρ;·ιηύοιηίζ;·ιΙίοη Огоир ЬеидП! (длина группы рандомизации)=0, СиЮГГ Зсоге (балльная оценка отсечения)=1, Оар РеиаЙу (штраф гэпа)=5 и Оар З^ζс РеиаЙу (штраф размера гэпа)=0,05.

Термин "полипептид ЗАР" включает в себя функциональные фрагменты и слитые белки, содержащие любые из предыдущих. Обычно полипептид ЗАР конструируют таким образом, что он является растворимым в водных растворах при биологически релевантных температурах, уровнях рН и осмолярности. Протомеры ЗАР, которые нековалентно ассоциируются вместе с образованием пентамерного ком- 8 030332

плекса 8ΑΡ, могут иметь идентичные аминокислотные последовательности и/или посттрансляционные модификации или, альтернативно, отдельные протомеры 8ΑΡ в едином комплексе могут иметь разные последовательности и/или модификации. Термин "полипептид 8ΑΡ" включает в себя полипептиды, содержащие любой встречающийся в природе полипептид 8ΑΡ, а также его любой вариант (в том числе мутанты, фрагменты и слияния). Полипептид 8ΑΡ этого изобретения может быть рекомбинантным полипептидом. В предпочтительных вариантах осуществления полипептид 8ΑΡ этого изобретения является полипептидом 8ΑΡ человека.

В некоторых вариантах осуществления обеспечены фармацевтические композиции, содержащие вариантный полипептид 8ΑΡ этого изобретения, или его функциональный фрагмент. В некоторых аспектах аминокислотная последовательность варианта 8ΑΡ может отличаться от 8ЕС ГО N0: 1 одной или несколькими консервативными или неконсервативными заменами. В данном контексте "консервативными заменами" являются остатки, которые являются физически или функционально сходными с соответствующими референсными остатками, т.е. консервативная замена и ее референсный остаток имеют сходные размер, форму, электрический заряд и/или химические свойства (например, способность образования ковалентных или водородных связей).

Предпочтительными консервативными заменами являются замены, удовлетворяющие критериям, определяемым в отношении акцептированной точечной мутации в ЭауНоГГ с1 а1., А11аз оГ ΡΐΌΐοίη 8ес|иепсе апб 81гие1игс 5: 345-352 (1978 & 8ирр.). Примерами консервативных замен являются замены в следующих группах: (а) валин, глицин; (Ь) глицин, аланин; (с) валин, изолейцин, лейцин; (б) аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота; (е) аспарагин, глутамин; (Г) серин, треонин; (д) лизин, аргинин, метионин и (Ь) фенилаланин, тирозин. Дополнительное руководство, касающееся того, какие аминокислотные изменения имеют вероятность быть фенотипически молчащими, могут быть найдены в Во\\зе с1 а1., 8с1епсе, 247:1306-1310 (1990).

Вариантные полипептиды 8ΑΡ и их фрагменты, которые сохраняют биологическую функцию, применимы в фармацевтических композициях и способах, описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вариантные полипептид 8ΑΡ или его фрагмент связывает РсуК1, РсуКПА и/или РсуКШВ. В некоторых вариантах осуществления вариантный полипептид 8ΑΡ или его фрагмент ингибирует дифференцировку одного или нескольких из группы, состоящей из фиброцита, предшественника фиброцита, предшественника миофибробласта и/или предшественника гемопоэтического моноцита. Варианты 8ΑΡ могут быть генерированы модификацией структуры полипептида 8ΑΡ для таких целей, как усиление терапевтической эффективности или стабильности (например, время хранения ех νίνο и устойчивость к протеолитической деградации ίη νίνο).

В некоторых аспектах вариантные полипептиды 8ΑΡ этого описания могут дополнительно содержать посттрансляционные модификации, наряду с любыми модификациями, которые природно присутствуют в полипептиде 8ΑΡ. Такие модификации включают в себя, но не ограничиваются ими, ацетилирование, карбоксилирование, гликозилирование (например, О-связанные олигосахариды, Ν-связанные олигосахариды и т.д.), фосфорилирование и липидирование. В результате этот модифицированный полипептид 8ΑΡ может содержать не являющиеся аминокислотами элементы, такие как полиэтиленгликоли, липиды, поли- или моносахариды и фосфаты.

В некоторых аспектах одна или несколько модификаций в отношении полипептида 8ΑΡ, описанные здесь, могут усиливать стабильность полипептида 8ΑΡ. Например, такие модификации могут увеличивать ίη νίνο период полувыведения полипептида 8ΑΡ или уменьшать протеолитическую деградацию полипептида 8ΑΡ.

В некоторых аспектах вариантные полипептиды 8ΑΡ этого изобретения включают в себя слитые белки, имеющие по меньшей мере часть полипептида 8ΑΡ человека и один или несколько слитых доменов или гетерологичных частей. Хорошо известные примеры таких слитых доменов включают в себя, но не ограничиваются ими, полигистидин, С1и-С1и, глутатион-8-трансферазу (С8Т), тиоредоксин, белок А, белок С и константную область тяжелой цепи иммуноглобулина (Рс), мальтозосвязывающий белок (МВР) или сывороточный альбумин человека. Слитый домен может быть выбран таким образом, чтобы он придавал желаемое свойство. Например, такие слитые домены особенно применимы для выделения слитых белков аффинной хроматографией. Для цели аффинной очистки используют релевантные матриксы для аффинной хроматографии, такие как глутатион-, амилаза- и никель- или кобальтконъюгированные смолы. В качестве другого примера слитый домен может быть выбран таким образом, чтобы облегчать детектирование полипептидов 8ΑΡ. Примеры таких доменов детектирования включают в себя различные флуоресцентные белки (например, СРΡ), а также "эпитопные метки", которые являются обычно короткими пептидными последовательностями, для которых доступно специфическое антитело. Хорошо известные эпитопные метки, для которых легко доступны специфические моноклональные антитела, включают в себя ΡΕΑΠ гемагглютинин вируса гриппа (НА) и с-тус-метки. В некоторых случаях эти слитые домены имеют сайт расщепления протеазой, который позволяет релевантной протеазе частично расщеплять эти слитые белки и посредством этого высвобождать из них рекомбинантный белок. Затем высвобожденные белки могут быть выделены из слитого домена последующим хроматографиче- 9 030332

ским разделением. В некоторых случаях полипептид ЗАР может быть слит с гетерологичным доменом, который стабилизирует полипептид ЗАР ίη νίνο. Под стабилизацией имеется в виду все, что увеличивает период полувыведения из сыворотки, независимо от того, является ли это уменьшением деструкции, уменьшением клиренса почкой или другим фармакокинетическим действием. Известно, что слияния с Ре-частью иммуноглобулина и сывороточным альбумином придают увеличенную стабильность.

Понятно, что различные элементы этих слитых белков могут быть расположены любым образом, согласующимся с желаемой функциональностью. Например, полипептид ЗАР может быть помещен С-терминально относительно гетерологичного домена или, альтернативно, гетерологичный домен может быть помещен С-терминально относительно полипептида ЗАР. Полипептид ЗАР и гетерологичный домен не должны быть обязательно рядом в слитом белке, и дополнительные домены или аминокислотные последовательности (например, линкерные последовательности) могут быть включены С- или Ν-терминально относительно любого домена или между доменами.

Способы получения измененных Ν-гликозилированных молекул.

Здесь описаны способы получения вариантных полипептидов ЗАР человека. Эти способы обычно включают в себя стадию приведения в контакт полипептида ЗАР с одним или несколькими химическими или ферментативными агентами для получения или модификации структуры гликозилирования на этом полипептиде ЗАР. Эти способы могут быть основаны на клетках или не быть основаны на клетках.

Ферменты, применимые для получения или модификации структуры гликанов, хорошо известны в данной области. Большинство ферментов/белков, применимых в способах этого описания, могут быть классифицированы в один из двух функциональных классов: гликозилтрансферазы и гликозидазы. Гликозилтрансферазами (например, Ν-ацетилглюкозаминилтрансферазами, галактозилтрансферазами, фукозилтрансферазами, сиалилтрансферазами, глюкозилтрансферазами, маннозилтрансферазами и т.д.) в этом контексте называют любой фермент/белок, который способен переносить донорный сахар на акцепторную часть молекулы. Гликозидазами (например, глюкозидазами, маннозидазами, Ν-ацетилглюкозаминидазами, сиалидазами, фукозидазами и т.д.) в данном контексте называют любой фермент/белок, который способен катализировать гидролиз гликозидной связи между сахарными молекулами.

Способы на основе клеток для получения измененных гликоформ полипептида ЗАР используют либо клетки дикого типа (например, клетки СНО), либо генетически сконструированные клетки, которые имеют по меньшей мере одну активность гликозилирования в отношении клетки человека. Клетки, подходящие для способов этого изобретения, включают в себя, например, клетки грибов, прокариотические клетки (т.е. бактерии, архебактерии), клетки растений или клетки животных (например, нематоды, насекомого, растения, птицы, пресмыкающегося или млекопитающего (например, мыши, крысы, кролика, хомячка, песчанки, собаки, кошки, козы, свиньи, коровы, лошади, кита, обезьяны или человека)). Эти клетки могут быть первичными клетками, иммортализованными клетками или трансформированными клетками. Такие клетки могут быть получены из различных коммерческих источников и ресурсов массового обслуживания исследований, например, Американской Коллекции Типовых Культур (Кос^Ше, Мб.). В некоторых аспектах клеткой, используемой для получения вариантного полипептида ЗАР. является клетка СНО.

Термин "активность гликозилирования" относится к любой активности, которая (ί) способна добавлять Ν-связанные или О-связанные гликаны к молекуле-мишени (т.е. олигосахарилтрансферазной активности); (ίί) удалять Ν-связанные или О-связанные гликаны из молекулы-мишени; (ίίί) модифицировать один или несколько Ν-связанных или О-связанных гликанов на молекуле-мишени; (ίν) модифицировать долихолсвязанные олигосахариды; (ν) способна содействовать активности одной или нескольких активностей пунктов ί-ίν. Таким образом, активность гликозилирования включает в себя, например, гликозидазную активность, гликозилтрансферазную активность, синтез, модификацию или транспортерную активность нуклеотидных производных сахаров. Модификация одного или нескольких Ν-связанных или О-связанных гликанов на молекуле-мишени включает в себя действие маннозилфосфорилтрансферазной активности, киназной активности или фосфатазной активности, наприме, маннозилфосфорилтрансферазной, киназной или фосфатазной активности, которая изменяет состояние фосфорилирования гликанов на молекулах-мишенях.

Сконструированные клетки, используемые в способах этого описания изобретения, могут иметь одну или несколько генетических модификаций, включающих в себя, но не ограничивающихся ими: (ί) делецию эндогенного гена, кодирующего белок, имеющий активность гликозилирования; (ίί) введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей мутантную форму белка (например, эндогенного или экзогенного белка), имеющего активность гликозилирования; (ίίί) введение или экспрессию молекулы РНК, которая интерферирует с функциональной экспрессией белка, имеющего активность гликозилирования; (ίν) введение рекомбинантной нуклеиновой кислоты, кодирующей белок дикого типа (например, эндогенный или экзогенный), имеющий активность гликозилирования; или (ν) изменение элементов промоторов или энхансеров одного или нескольких эндогенных генов, кодирующих белки, имеющие активность гликозилирования, для изменения посредством этого экспрессии кодируемых белков. Молекулы РНК, описанные выше, включают в себя, например, малую интерферирующую РНК (δίΚΝΑ), ко- 10 030332

роткую шпилечную РНК (ΠιΡΝΑ). антисмысловую РНК или микро-РНК (ιηίΡΝΛ). Понятно, что пункт (ίί) включает в себя. например. замену эндогенного гена (например. гомологичной рекомбинацией) геном. кодирующим белок. имеющий более высокую активность гликозилирования относительно замененного таким образом эндогенного гена.

Описанные здесь генетически сконструированные клетки имеют одну или несколько измененных активностей гликозилирования. таких как (ί) увеличение в одной или нескольких активностях гликозилирования в генетически модифицированной клетке. (ίί) уменьшение в одной или нескольких активностях гликозилирования в генетически модифицированной клетке. (ίίί) изменение в локализации или внутриклеточном распределении одной или нескольких активностей гликозилирования или (ίν) изменение в отношении одной или нескольких активностей гликозилирования в генетически модифицированной клетке относительно немодифицированной клетки того же происхождения. Понятно. что увеличение в величине активности гликозилирования может быть обусловлено сверхэкспрессией одного или нескольких белков. имеющих активность гликозилирования. увеличением копийности эндогенного гена (например. дупликацией гена) или изменением в промоторе. энхансере или супрессоре эндогенного гена. который стимулирует увеличение в экспрессии белка. кодируемого этим геном. Уменьшение в одной или нескольких активностях может быть обусловлено сверхэкспрессией мутантной формы (например. доминантно-негативной формы) одного или нескольких белков. имеющих измененные гликозилированнием активности. введением одного или нескольких белков. имеющих измененные гликозилированием активности. введением или экспрессией одной или нескольких интерферирующих РНК-молекул. которые уменьшают экспрессию одного или нескольких белков. имеющих активность гликозилирования. или делецией одного или нескольких генов. которые кодируют белок. имеющий активность гликозилирования.

Генетически сконструированные клетки. используемые способами этого описания. могут экспрессировать (например. сверхэкспрессировать) гены дикого типа или мутантные гены. кодирующие белки. имеющие активность гликозилирования. Такие гены включают в себя. но не ограничиваются ими. АЬС7. АЬС13. АЬС14. АЬС1. АЬС2. АЬС11. РГТ1. АЬС3. АЬС9. АЬС12. АЬСб. АЬС8. ΑΝΠ. АЬС10. АЬС5. О8Т3. О8Т4. О8Тб. 8ТТ3. О8Т1. О8Т5. АВР1. 8АР1. О8Т2. ΌΡΜΙ. 8ЕС59. ОСН1. ΜΝΝ9. УАМ. ΜΝΝ8. ΜΝΝ10. ΜΝΝ11. НОС1. ΜΝΝ2. ΜΝΝ5. ΜΝΝ6. КТР1. ΥυΡΙ. ΜΝΝ4. КРЕ2. КТР2. КТР3. ΜΝΝ1. ΜΝ81. ΜΝΝ4. ΡNО1. ΜΝΝ9. глюкозидазы I. глюкозидазы II или эндоманнозидазы. Гены. кодирующие белки. имеющие активность гликозилирования. могут быть генами любого вида (например. низших эукариот (например. гриба (в том числе дрожжей) или трипаносом). прокариот (т. е. бактерий или архебактерий). растения или животного (например. насекомого. растения. птицы). пресмыкающегося или млекопитающего (например. мыши или крысы. собаки. кошки. лошади. козы. коровы. свиньи. примата не человека или человека). Понятно. что генетически сконструированные клетки. используемые для способов этого описания. могут экспрессировать любое количество генов (например. генов. кодирующие белки. имеющие активность гликозилирования) и/или любую комбинацию одного или нескольких (например. 2. 3. 4. 5. б. 7. 8. 9 10. 11. 12. 15 или 20 или более) любых из вышеупомянутых здесь генов. Кроме того. любые генетически сконструированные клетки. используемые способами этого описания. могут содержать любое количество мутаций. которые изменяют или аннулируют одну или несколько активностей гликозилирования.

В некоторых вариантах осуществления термин "экспрессия генов" или "экспрессия" относится к клеточным процессам. при помощи которых биологически активный полипептид продуцируется из ДНК-последовательности и проявляет биологическую активность в клетке. Такая экспрессия генов включает в себя процессы транскрипции и трансляции. но также включает в себя посттранскрипционные и посттрансляционные процессы. которые могут влиять на биологическую активность гена или продукта гена. Эти процессы включают в себя. но не ограничиваются ими. синтезы. процессинг и транспорт РНК. а также синтез. транспорт и посттрансляционную модификацию полипептидов.

Например. это описание обеспечивает способы получения полипептида 8АР этого изобретения экспрессией гена 8АР в клетке. В некоторых вариантах осуществления клетка может содержать эндогенный ген 8АР или его фрагмент. В других вариантах осуществления полинуклеотид. кодирующий экзогенный полипептид 8АР или его фрагмент. может быть введен (например. трансформирован. трансфицирован и т.д.) в клетку. Подходящие полинуклеотиды 8АР. которые могут быть введены в клетку. включают в себя фрагменты нуклеиновых кислот. а также конструкции нуклеиновых кислот или экспрессирующие векторы. В предпочтительных вариантах осуществления этот эндогенный или экзогенный ген кодирует полипептид 8АР человека.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент нуклеиновой кислоты. например. кодирующий полипептид 8АР человека. используемый для трансформации клетки-хозяина. может включать в себя сайт Шайна-Дальгарно (например. сайт связывания рибосом) и стартовый сайт (например. кодон АТС) для инициации трансляции транскибируемой мессенджер-РНК с получением этого фермента. Он может также включать в себя последовательность терминации последовательности для окончания трансляции. Последовательность терминации обычно является кодоном. для которого не существует соответствующая аминоацетил-тРНК. заканчивающим посредством этого синтез полипептида. В некоторых вариантах

- 11 030332

осуществления конструкция нуклеиновой кислоты, кодирующая полипептид §АР, может доставляться, например, в виде экспрессионной плазмиды, которая при транскрипции в клетке продуцирует полипептид §АР.

В некоторых вариантах осуществления подходящий экспрессирующий вектор содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид §АР этого изобретения, функционально связанную по меньшей мере с одной регуляторной последовательностью. Регуляторные последовательности являются видоузнаваемыми и выбираются для управления экспрессией любого из полипептидов этого описания. Таким образом, термин регуляторная последовательность включает в себя промоторы, энхансеры и другие регулирующие экспрессию элементы.

Примерные регуляторные последовательности описаны в Соеббек Оепе Ехргеккюп ТесЬпо1о§у: МеЛобк ίη Еп/ушо1о8у. Асабеннс Рге88, 8ап О1едо, СА (1990). Например, любая регуляторная последовательность экспрессии, которая регулирует экспрессию ДНК-последовательности, когда она функционально связана с ней, может быть использована в этих векторах для экспрессии любых из полипептидов этого описания. Такие применимые регуляторные последовательности экспрессии включают в себя, например, ранний и поздний промоторы §У40, промотор 1е1, немедленно ранний промотор аденовируса или цитомегаловируса, систему 1ас, систему !гр, систему ТАС или ТКС, промотор Т7, экспрессия которого управляется РНК-полимеразой Т7, основные районы оператора и промотора фага лямбда, регуляторные районы оболочки белка £б, промотор для 3-фосфоглицераткиназы или других гликолитических ферментов, промоторы кислой фосфатазы, например, РЬо5, промоторы факторов α-спаривания дрожжей, полиэдроновый промотор бакуловирусной системы и другие последовательности, о которых известно, что они регулируют экспрессию генов прокариотических или эукариотических клеток или их вирусов, и различные их комбинации. Должно быть понятно, что конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор клетки-хозяина для трансформации и/или тип белка, который желательно экспрессировать. Кроме того, должны рассматриваться также копийность вектора, способность регулировать эту копийность и экспрессировать любой другой белок, кодируемый этим вектором, например антибиотические маркеры.

В некоторых вариантах осуществления фрагмент нуклеиновой кислоты или система экспрессии, используемые для трансформации клетки-хозяина, могут необязательно включать в себя одну или несколько маркерных последовательностей. Говоря в общем, подходящие маркерные последовательности обычно кодируют продукт гена, обычно фермент, который инактивирует или иным образом детектирует соединение или детектируется соединением в среде роста. Например, включение маркерной последовательности может делать трансформируемую клетку устойчивой к антибиотику или оно может придавать соединение-специфический метаболизм трансформируемой клетке. Примеры подходящих маркерных последовательностей, которые придают устойчивость, включают в себя канамицин, ампициллин, хлорамфеникол и тетрациклин. Альтернативно, может быть использовано не давление отбора, а маркерный ген, что позволяет детектировать конкретные колонии, содержащие этот ген, например, β-галактозидазы, где используется субстрат, который обеспечивает окрашенный продукт.

Многие способы являются подходящими для трансформации клетки данного изобретения фрагментом нуклеиновой кислоты или экспрессирующим вектором. Обычные способы трансформации включают в себя электропорацию, опосредованную липосомами трансформацию, кальций-опосредованную трансформацию и опосредованную вирусом трансфекцию.

В некоторых аспектах, когда клетка-хозяин трансформирована фрагментом нуклеиновой кислоты или системой экспрессии данного изобретения, ген (например, 8АР человека) в указанной системе может быть интегрирован в хромосомную ДНК клеток-хозяев так называемой гомологичной рекомбинацией, и эта система экспрессии будет стабильно находиться в этом хозяине.

Для интегрирования этой системы экспрессии в векторе в хромосомную ДНК клеток-хозяев может быть использован подходящий маркерный ген отбора, причем указанный маркерный ген имеет последовательность, гомологичную гену на хромосомной ДНК конкретной клетки-хозяина. Маркеры отбора для такой цели могут быть легко отобраны квалифицированным специалистом. В качестве примера предпочтительный маркер является геном, который существует на хромосоме и связан с метаболизмом этой клетки-хозяина. А именно, предпочтительным является использование хозяина, который был модифицирован таким образом, что вышеуказанный ген на этой хромосоме будет инактивирован подходящими средствами, такими как мутация. Затем этого хозяина подвергают гомологичной рекомбинации с экспрессирующим вектором, содержащим интактный ген, после чего могут расти и быть отобраны только трансформанты, которые содержат нормальный ген метаболизма. Таким образом, если такой маркерный ген был введен в этот экспрессирующий вектор, будет иметь место гомологичная рекомбинация между этим маркерным геном в указанном экспрессирующем векторе и соответствующей частью хромосомной ДНК, посредством чего эта экспрессионная кассета гетерологичного гена будет одновременно интегрироваться в эту хромосомную ДНК.

- 12 030332

В некоторых вариантах осуществления термин "экспрессия" белка в клетке включает в себя также введение самого белка в эти клетки. Таким образом, в некоторых аспектах это описание изобретения обеспечивает способы получения полипептида 8АР этого изобретения введением полипептида 8АР в клетку. Способы введения полипептидов непосредственно в клетку известны в данной области и обычно включают в себя процесс проникновения через мембрану клетки. Такие способы включают в себя, но не ограничиваются ими, микроинъекцию полипептидов 8ЛР; инкапсулирование полипептида 8ЛР в мембранных пузырьках (например, липосомах, капсульных телах, "тенях" эритроцитов, протопластах и т.д.) и контактирование их с мембраной клетки для вызывания, тем самым, внутриклеточного введения полипептида 8АР слиянием; использование физических способов (например, механических, химических, электрических и т.д.), которые основаны на проникновении макромолекул в клетки диффузией через отверстия, транзиторно вводимые в их плазматические мембраны (например, нагрузка с использованием соскоба, нагрузка с использованием гранул и т.д.); и посредством поглощения через природный эндоцитоз вследствие клеточного фагоцитоза. Способ внутриклеточного введения может использовать рецептор-опосредованный путь, в котором один из различных рецепторов, экспрессируемых на поверхности клетки, устанавливается в качестве мишени, и полипептид 8АР присоединяется (ковалентно или нековалентно) к родственному лиганду, который действует в качестве части-носителя. Были описаны несколько способов для введения белков в живые клетки с использованием электростатической адсорбции, в которых этот белок сначала катионизировали и затем контактировали с отрицательно заряженной поверхностью клетки (см. публикацию патента Японии № 2004/049214).

В некоторых вариантах осуществления это описание обеспечивает клетки СНО, которые экспрессируют полипептид 8АР. В некоторых вариантах осуществления эта клетка СНО экспрессирует экзогенный полипептид 8АР. В предпочтительных вариантах осуществления эта клетка СНО экспрессирует полипептид 8АР человека. В некоторых вариантах осуществления это описание обеспечивает клетки СНО, содержащие полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептид 8АР.

В предпочтительных вариантах осуществления эта полинуклеотидная последовательность кодирует полипептид 8АР человека. Любой их вышеупомянутых способов может быть использован для "экспрессии" полипептида 8АР этого изобретения в клетке СНО или любой другой описанной здесь подходящей клетке.

Когда любая из описанных активностей гликозилирования клетки дикого типа или генетически сконструированной клетки являются индуцируемыми или обусловленными присутствием индуцирующего сигнала (например, химического или физического сигнала), эта клетка дикого типа или генетически сконструированная клетка может, необязательно, культивироваться в присутствии индуцирующего агента до, во время или после введения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид 8АР, или полипептида 8АР. Например, после введения полипептида 8АР в клетку она может быть подвергнута действию химического индуцирующего агента, который способен усиливать экспрессию одного или нескольких белков, имеющих активность Ν-гликозилирования дикого типа или измененную активность Ν-гликозилирования. Когда множественные индуцирующие сигналы индуцируют обусловленную ими экспрессию одного или нескольких белков, имеющих активность Ν-гликозилирования дикого типа или измененную активность Ν-гликозилирования, клетка может быть контактирована с множественными индуцирующими агентами. В некоторых вариантах осуществления культуральная среда может быть модифицирована для получения желаемой структуры гликана на полипептиде 8АР. Например, концентрация сыворотки, глюкозы и/или липида (например, долихола) этой среды могут быть модифицированы для оптимального получения желаемого гликоварианта 8АР. В некоторых вариантах осуществления температура, рН и/или осмолярность культуральной среды могут быть изменены для оптимального получения желаемого гликоварианта 8АР.

Вариантный полипептид 8АР этого изобретения может быть дополнительно процессирован ίη νίνο или может быть процессирован ίη νίΐτο до или после выделения из клетки или среды клеток. Этот дополнительный процессинг может включать в себя модификацию одного или нескольких остатков гликана полипептида 8АР или модификацию в отношении полипептида 8АР, другую, чем модификация структуры (структур) гликанов. В некоторых вариантах осуществления этот дополнительный процессинг полипептида 8АР может включать в себя добавление (ковалентное или нековалентное присоединение) одной или нескольких гетерологичных частей молекулы. В некоторых вариантах осуществления этот дополнительный процессинг включает в себя ферментативную или химическую обработку полипептида 8АР. Ферментативная обработка может включать в себя приведение в контакт полипептида 8АР с одной или несколькими из гликозидазы, фосфодиэстеразы, фосфолипазы, гликозилтрансферазы или протеазы в течение времени, достаточного для индукции модификации, добавления или делеции гликановых остатков (например, галактозы, маннозы, фукозы, сиаловой кислоты, ксилозы, Ν-ацетилглюкозамина и т.д.) на полипептиде 8АР. Изготовление по заказу Ν-связанной олигосахаридной цепи может осуществляться последовательной модификацией, добавлением или делецией желаемых сахарных частей с использованием способов, хорошо известных в данной области. Ферментативное расщепление углеводных частей на пептидных вариантах может достигаться с использованием различных эндо- и экзогликозидаз, как описано Тйо1акига с1 а1., 1987, МсОт Εηζνιηοΐ. 138: 350. Примерные способы добавления сахарных частей

- 13 030332

описаны в патентах США № 5876980, 6030815, 5728554 и 5922577.

В некоторых вариантах осуществления модификация гликановой структуры §АР требует присутствия одного или нескольких нуклеотидных производных сахаров (сахаронуклеотидов). Примерные сахаронуклеотиды, которые используются в данном изобретении, включают в себя моно-, ди- или трифосфаты или их аналоги. В предпочтительном варианте осуществления этот модифицированный сахаронуклеотид выбран из УДФ-гликозида, ЦМФ-гликозида или ГДФ-гликозида. Даже более предпочтительно этот сахаронуклеотид выбран из УДФ-галактозы, УДФ-галактозамина, УДФ-глюкозы, УДФ-глюкозамина, ГДФ-маннозы, ГДФ-фукозы, ЦМФ-сиаловой кислоты, ЦМФ-Ы-гликолилнейраминовой кислоты или ЦМФ-ЫеиАс. В некоторых вариантах осуществления модифицированный сахаронуклеотид используют для добавления модифицированного сахарного остатка к полипептиду δ АР. Ν-Ацетиламинпроизводные этих сахаронуклеотидов также применимы в этом способе изобретения.

Химическое добавление или удаление гликозильных частей молекул может проводиться любым подходящим способом. Например, химическое дегликозилирование может включать в себя воздействие трифторметансульфоновой кислоты или другой сильной кислоты на полипептид δΑΡ. Эта обработка приводит к отщеплению большинства или всех сахаров, за исключением связывающего сахара (Ν-ацетилглюкозамина или Ν-ацетилгалактозамина), с оставлением интактного пептида. Способы химического дегликозилирования описаны На1йтиййш е1 а1., 1987, Агсй. Вюейет. Вюрйук. 259: 52 и Ейде е1 а1., 1981, Апа1. Вюейет. 118: 131. Химическая обработка может, например, включать в себя приведение в контакт измененного полипептида δΑΡ с кислотой, такой как фтористо-водородная кислота, в течение времени, достаточного для индукции модификации полипептида δΑΡ. Обработка фтористо-водородной кислотой, при определенных условиях, специфически удаляет маннозные остатки, которые связаны фосфодиэфирной связью с гликанами, оставляя фосфат на этом гликане. Измененный полипептид δΑΡ может быть дополнительно процессирован добавлением или удалением фосфатной группы из одного или нескольких Ν-гликанов. Например, измененный полипептид δΑΡ может быть приведен в контакт с маннозилкиназой или маннозилфосфатазой.

В некоторых аспектах желательно модифицировать только концевые сахарные части на структуре гликана полипептида δΑΡ (Ν-связанного или О-связанного олигосахарида). В некоторых вариантах осуществления одну или несколько ветвей структуры гликана δΑΡ модифицируют добавлением, удалением, заменой или модификацией по меньшей мере одного концевого остатка сиаловой кислоты. Подходящие способы модификации гликанов, описанные здесь, могут быть использованы для изменения только концевой сахарной части на структуре гликана δΑΡ. В некоторых вариантах осуществления концевой остаток сиаловой кислоты, имеющий а2,6-связь, а2,8-связь или а2,9-связь, заменяют одним или несколькими концевыми а2,3-связанными остатками сиаловой кислоты. В одном конкретном аспекте δΑΡ человека, содержащий концевые а2,6-связанные остатки сиаловой кислоты, модифицируют в соответствии с одним из способов данного описания для замены одного или нескольких концевых а2,6-связанных остатков сиаловой кислоты одним или несколькими а2,3-связанными остатками сиаловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления концевой а2,3-связанный остаток сиаловой кислоты модифицирован для добавления одного или нескольких а2,6-связанных, а2,8-связанных и/или а2,9 связанных остатков сиаловой кислоты.

В некоторых аспектах способ получения полипептида δΑΡ этого изобретения включает в себя первую стадию дегликозилирования полипептида δΑΡ. Полипептид δΑΡ может быть частично или полностью дегликозилирован. В некоторых вариантах осуществления эта первая стадия дегликозилирования включает в себя удаление только концевых сахарных частей по меньшей мере из одной ветви структуры гликана на полипептиде δΑΡ. В некоторых вариантах осуществления эта первая стадия дегликозилирования удаляет по меньшей мере один а2,6-связанный остаток сиаловой кислоты. В некоторых вариантах осуществления эта первая стадия дегликозилирования удаляет по меньшей мере один О-связанный гликан. В некоторых вариантах осуществления эта первая стадия дегликозилирования удаляет по меньшей мере один Ν-связанный гликан. В некоторых вариантах осуществления эта первая стадия дегликозилирования удаляет все О-связанные и Ν-связанные гликаны. В некоторых вариантах осуществления дегликозилированный (частично или полностью) полипептид δΑΡ дополнительно процессируется в соответствии со способами этого описания, которые включают в себя, но не ограничиваются ими, ферментативную или химическую модификацию частично или полностью дегликозилированного полипептида δΑΡ, введение этого частично или полностью дегликозилированного полипептида δΑΡ в клетку или их комбинацию, где этот способ (эти способы) производит вариантный полипептид δΑΡ этого изобретения. В некоторых вариантах осуществления после введения частично или полностью дегликозилированного полипептида δΑΡ в клетку он может быть дополнительно модифицирован ίη νίνο или ίη νίίτο в соответствии со способами этого описания для получения вариантного полипептида δΑΡ этого изобретения. Подобным образом, частично или полностью дегликозилированный полипептид δΑΡ, который модифицирован ίη νίίτο, с использованием ферментативных или химических способов, описанных здесь, может быть введен в клетку для продуцирования вариантного полипептида δΑΡ этого изобретения.

- 14 030332

Должно быть понятно, что полипептид ЗАР этого изобретения может быть процессирован, но необязательно, в клетке. Например, это описание обеспечивает также бесклеточные способы получения вариантного полипептида ЗАР этого изобретения. В некоторых аспектах эти бесклеточные способы включают в себя стадию приведения в контакт полипептида ЗАР в условиях гликозилирования с клеточным лизатом, приготовленным из клетки дикого типа (например, клетки грибов, клетки растения или клетки животного) или генетически сконструированной клетки, имеющей по меньшей мере одну модифицированную активность гликозилирования, в которой контактирование полипептида ЗАР с клеточным лизатом присоединяет Ν-связанный или О-связанный олигосахарид к полипептиду ЗАР или модифицирует существующий Ν-связанный или О-связанный олигосахарид на полипептиде ЗАР. Под "условиями Ν-гликозилирования" имеется в виду, что смесь (например, полипептида ЗАР и клеточного лизата) инкубируют при условиях, которые делают возможным желаемое измененное Ν-гликозилирование.

Подходящие способы для получения клеточных лизатов, которые сохраняют активность или целостность одной или нескольких активностей гликозилирования в этом лизате, могут включать в себя применение подходящих буферов и/или ингибиторов, включающих в себя ингибиторы нуклеазы, протеазы и фосфатазы, которые сохраняют или минимизируют изменения в активностях Ν-гликозилирования в этом клеточном лизате. Такие ингибиторы включают в себя, например, комплексообразователи, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТК), этиленгликоль-бис-(Р-аминоэтиловый эфир)-\Щ,Ш,Штетрауксусная кислота (ЭГТА), ингибиторы протеаз, такие как фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ), апротинин, лейпептин, антипаин, и ингибиторы фосфатаз, такие как фосфат, фторид натрия и ванадат. Ингибиторы могут быть выбраны таким образом, что они не препятствуют представляющим интерес активности или активностям Ν-гликозилирования или только минимально влияют на представляющие интерес активность или активности Ν-гликозилирования. Подходящие буферы и условия для получения лизатов, содержащих ферментативные активности, описаны, например, в Ли8иЪе1 с1 а1. СиггеШ РгоЮсоР ίη Мо1еси1аг Вю1оду (Зирр1етеп1 47), ίοΐιη XVПсу & Зоп8, №\у Уогк (1999); Наг1о\у апб Ьапе, Лηι^Ьοб^С5: А ЬаЪогаФгу Магша1 Со1б Зргшд НагЬог ЬаЪогаФгу Рге88 (1988); Наг1о\у анб Ране, И8шд Лηι^Ьοб^е5: А ЬаЪогаФгу Маииа1, Со1б Зргшд НагЬог Рге88 (1999); Ие1/ Тех!Ъоок οί С1Писа1 Скет18ку, 3^гб еб. ВигЙ8 авб А8к№ооб, еб8. ν.Β. Зг-шабе^, РкПабе1р1иа (1999).

Клеточный лизат может быть дополнительно процессирован для элиминирования или минимизации присутствия интерферирующих веществ в случае необходимости. Если желательно, клеточный лизат может быть фракционирован любым из множества способов, хорошо известных квалифицированным в данной области специалистам, включающих в себя субклеточное фракционирование и хроматографические способы, такие как ионообменная, гидрофобная хроматография и хроматография с обращенной фазой, эксклюзивная хроматография по размеру (гель-фильтрация), аффинная хроматография и гидрофобная хроматография с индукцией заряда (см., например, Зсоре8, Рго1еш Ри^^ί^саί^οη: Ргшар1е8 авб Ргасбсе, 1Ыгб с6111оп, Зргтдег-Уег1ад, Νον Уогк (1993); Вцг1оп авб Нагбтд, ί. СкготаЮдг. А 814:71-81 (1998)) или любые другие подходящие способы очистки.

Может быть получен клеточный лизат, в котором все клеточные органеллы остаются интактными и/или функциональными.

Например, лизат может содержать один или несколько из интактного зернистого эндоплазматического ретикулума, интактного гладкого эндоплазматического ретикулума или интактного аппарата Гольджи. Подходящие способы приготовления лизатов, содержащих интактные клеточные органеллы, и испытание на функциональность этих органелл описаны, например, в Могеаи е1 а1. (1991), ί. Βίο1. Скет. 266(7): 4329-4333; Могеаи е1 а1. (1991), ί. Вю1. Скет. 266(7): 4322-4328; Кехаск е! а1. (1991), ί. Се11 Вю1. 114(2): 219-229 и Раикк е! а1. (1999), Агск. Вюскет. Вюрку8. 367(2): 265-273; описания каждого из которых включены в данное описание посредством ссылки в полном объеме.

Полипептид ЗАР может быть контактирован всего лишь с одним очищенным белком, имеющим активность гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления полипептид ЗАР может быть контактирован более чем с одним очищенным белком, имеющим активность гликозилирования. Один или несколько белков, имеющих активность гликозилирования, могут быть очищены с использованием стандартных способов выделения белков. Полипептид ЗАР может быть контактирован с одним или несколькими белками в подходящем буфере в течение времени, достаточного для индукции модификации полипептидов ЗАР, как описано выше. Полипептид ЗАР может быть контактирован более чем с одним белком одновременно или последовательно. Если полипептид ЗАР контактируют последовательно с более чем одним белком, имеющим активность гликозилирования, полипептид ЗАР может быть (необязательно) очищен после одной или нескольких стадий. То есть, полипептид ЗАР может быть контактирован с активностью "А" белка и затем очищен перед контактированием этой молекулы с активностью "В" белка. Способы модификации пептидов как таковых известны в данной области, например Ьее авб Рагк (2002), 30(6): 716-720 и Ри)ка ип6 Такеда\уа (2001), Вюскет. Вюрку8. Ке8. Соттию 282(3): 678-682, описания которых включены в данный документ посредством ссылки в полном объеме.

В некоторых аспектах способы этого описания включают в себя стадию выделения полипептида ЗАР, например, из клеток или из компонентов клеточного лизата. Многие стандартные способы выделения белка известны в данной области. Например, способы выделения полипептидов включают в себя, но

- 15 030332

не ограничиваются ими. вытеснительную хроматографию (гель-фильтрацию). хроматографию с обращенной фазой. жидкостную хроматографию (например. НРЬС). аффинную хроматографию (например. хроматографию с использованием хелатирования металлов или иммуноаффинную хроматографию). ионообменную хроматографию. гидрофобную хроматографию. осаждение. дифференциальную солюбилизацию. иммунопреципитацию. центрифугирование (например. ультрацентрифугирование. центрифугирование с сахарозным градиентом и т.д.) или их любые комбинации. В некоторых вариантах осуществления полипептид ЗАР может быть конъюгирован с аффинной меткой для облегчения очистки этого полипептида. Подходящие аффинные метки для очистки §АР включают в себя. но не ограничиваются ими. хитинсвязывающий белок (СВР). мальтозосвязывающий белок (МВР). глутатион-§-трансферазу (О8Т). стрептавидин. биотин и поли(Н18)-метки. Аффинные метки могут быть получены в виде части рекомбинантного белка (т. е. в виде слитого белка. содержащего гетерологичный домен аффинной метки и домен полипептида ЗАР) или присоединены (ковалентно или нековалентно) ίη νίνο или ίη νΐίτο к полипептиду ЗАР. В некоторых вариантах осуществления могут быть использованы множественные стадии очистки для выделения полипептида ЗАР. Например. полипептид ЗАР. содержащий метку для очистки. может быть аффинно очищен из клеточного лизата или многокомпонентной смеси с использованием аффинной очистки. Затем этот аффинно очищенный полипептид ЗАР может быть дополнительно очищен для удаления минорных нежелательных загрязнителей дополнительной стадией очистки. например. вытеснительной хроматографией или ОФ-ВЖХ. Если полипептид этого изобретения продуцируется в клетке. этот полипептид ЗАР может быть выделен из самой клетки или из среды. в которой культивируются эти клетки. В некоторых вариантах осуществления полипептиды ЗАР этого изобретения продуцируются и секретируются из клетки в культуральную среду. В этих вариантах осуществления выделение может включать в себя отделение клеточной фракции от растворимой. ЗАР-содержащей фракции (например. центрифугированием).

В некоторых аспектах может быть выгодным связывание полипептида ЗАР с твердофазным носителем перед контактированием молекулы-мишени с одной или несколькими активностями Ν-гликозилирования. Такое связывание может сделать возможным более легкую очистку после модификаций Ν-гликозилированием. Подходящие твердофазные носители включают в себя. но не ограничиваются ими. многолуночные планшеты для анализов. частицы (например. магнитные или кодируемые частицы). хроматографическую колонку или мембрану.

В некоторых вариантах осуществления любой из измененных полипептидов ЗАР. описанных здесь. может быть присоединен к гетерологичной части при помощи ферментативных или химических способов. "Гетерологичной частью" называют любой компонент. который присоединен (например. ковалентно или нековалентно) к измененной молекуле-мишени. причем этот компонент отличается от компонента. исходно присутствующего на этом полипептиде ЗАР. Гетерологичные части включают в себя. например. водорастворимые и нерастворимые в воде полимеры. нацеливающие части. терапевтические части. диагностические части и биомолекулы.

Полипептиды ЗАР этого изобретения могут содержать один или несколько "модифицированных" сахарных остатков. Модифицирующая группа может быть присоединена к сахарной части ферментативными способами. химическими способами или их комбинацией с получением посредством этого модифицированного сахара. например модифицированной галактозы. фукозы или сиаловой кислоты. При использовании модифицированной сиаловой кислоты в этих способах может быть использована либо сиалилтрансфераза. либо транс-сиалидаза. Эти сахара могут быть замещены в любом положении. которое позволяет присоединение модифицирующей части. хотя все еще позволяет сахару функционировать в качестве субстрата для фермента. используемого для сопряжения этого модифицированного сахара с этим пептидом.

Обычно сахарная часть и модифицирующая группа связаны вместе посредством использования реактивных групп. которые обычно преобразуются процессом связывания в новую органическую функциональную группу или в нереактивные частицы. Эта реактивная в отношении сахара функциональная группа (реактивные в отношении сахара функциональные группы) может быть локализована в любом положении на сахарной части. Реактивные группы и классы реакций. используемые в применении на практике данного изобретения. обычно являются группами и классами реакций. которые хорошо известны в области химии биоконъюгатов. Существующие предпочтительные классы реакций. доступные с реактивными в отношении сахара частями. являются классами реакций. которые протекают при относительно мягких условиях. Они включают в себя. но не ограничиваются ими. нуклеофильные замены (например. реакции аминов и спиртов с ацилгалогенидами. активными сложными эфирами). электрофильные замены (например. реакции с енаминами) и добавления множественных связей углерод-углерод и углерод-гетероатом (например. реакция Михаэля. реакция Дильса-Альдера). Эти и другие применимые реакции обсуждаются. например. в διηίΐΐι авб МагсЬ. Абνаηсеб Огдатс СНстШгу. 5'¹' Еб.. ίοΐιη \νί1ον & 3οηδ. Νο\ν ΥοτΚ. 2001; Нспшнъоп. ВюсоцщдаЮ ТссНшсщс/,. Асабетю Ргекк. Зав Ωίοβο. 1996 и Росасу с1 а1.. Μο6ίΓχ;·ιΙίοη οί РгоЮиъ; Абνаηсеδ ίη СНеткЦу Зепек. νοί. 198. Атепсаи СЬетюа1 ЗоаеА. ναδΗίη^ίοη. О.С.. 1982.

- 16 030332

Применимые реактивные функциональные группы, свешивающиеся из сахарного ядра или модифицирующей группы, включают в себя, но не ограничиваются ими, (а) карбоксильные группы и их различные производные (например, сложные эфиры Ν-гидроксисукцинимида, сложные эфиры Ν-гидроксибензотриазола, галогенангидриды кислот, ацилимидазолы, сложные тиоэфиры, сложные п-нитрофениловые эфиры, сложные алкиловые, алкениловые, алкиниловые и ароматические эфиры); (Ь) гидроксильные группы, которые могут быть превращены, например, в сложные эфиры, простые эфиры, альдегиды и т.д.; (с) галогеналкильные группы, в которых галоген может быть позднее вытеснен нуклеофильной группой, такой как, например, амин, карбоксилатный анион, карбанион или алкоксидный ион, с получением посредством этого ковалентного присоединения новой группы в функциональной группе атома галогена; (й) диенофильные группы, которые способны участвовать в реакциях ДильсаАльдера, такие как, например, малеимидогруппы; (е) альдегидные или кетоновые группы, так что последующая дериватизация возможна через образование карбонильных производных, таких как, например, имины, гидразоны, семикарбазоны или оксимы, или через такие механизмы, как реакция (присоединение) Гриньяра или присоединение алкиллития; (ί) сульфонилгалогенидные группы для последующей реакции с аминами, например, для образования сульфонамидов; (е) тиоловые группы, которые могут быть, например, превращены в дисульфиды или реагировать с алкил- и ацилгалогенидами; (И) аминные или сульфгидрильные группы, которые могут быть, например, ацилированы, алкилированы или окислены; (ί) алкены, которые могут подвергаться, например, циклоприсоединениям, ацилированию, реакции присоединения Михаэля, метатезису (реакции обмена), реакции Хека и т.д.; (]) эпоксиды, которые могут реагировать, например, с аминами и гидроксильными соединениями.

Эти реакционноспособные функциональные группы могут быть выбраны таким образом, что они не участвуют в реакциях, необходимых для сборки реакционноспособных сахарного ядра или модифицирующей группы, или не препятствуют этим реакциям. Альтернативно, реакционноспособная функциональная группа может быть защищена от участия в этой реакции присутствием защитной группы. Квалифицированным в данной области специалистам понятно, как защитить конкретную функциональную группу таким образом, что она не препятствует выбранному набору условий реакции. В отношении примеров применимых защитных групп см., например, Огеепе еΐ а1., Рго1ес1|уе Огоирк ίη Огдапю 8упФе515, ФИп АПеу & 8оп8, №\у Υο^к, 1991.

В некоторых вариантах осуществления модифицированный сахар является активированным сахаром. Активированные модифицированные сахара, используемые в данном изобретении, обычно являются гликозидами, которые были синтетически изменены для включения активированной удаляемой группы. В данном контексте термин "активированная удаляемая группа" относится к частям молекул, которые легко вытесняются в регулируемых ферментом нуклеофильных реакция замещения. Многие активированные сахара известны в данной области. См., например, Уосай1о еΐ а1., Ιη СагЬоИуйгаЮ СЬеш181гу апй Вю1о§у, Уо1. 2, Ετηδΐ еΐ а1. Ей., АПеу-УСН Уег1ад: АешИет, Оегтапу, 2000; Койата еΐ а1., ТеЦаИейгоп ЬеИ. 34: 6419 (1993); ЕоидИеей, еΐ а1., ί. Вю1. СИет. 274: 37717 (1999)). Примеры таких удаляемых групп включают в себя фтор, хлор, бром, тозилат, мезилат, трифлат и т.п. Предпочтительные активированные удаляемые группы для применения в данном изобретении являются группами, которые не затрудняют значимо стерически ферментативный перенос гликозида к акцептору. Таким образом, предпочтительные варианты осуществления активированных гликозидных производных включают в себя гликозилфториды и гликозилмезилаты, причем гликозилфториды являются особенно предпочтительными. Среди гликозилфторидов, наиболее предпочтигельными являются а-галактозилфторид, а-маннозилфторид, а-глюкозилфторид, а-фукозилфторид, а-ксилозилфторид, а-сиалилфторид, α-Ν-ацетилглюкозаминилфторид, α-Ν-ацетилглюкозаминилфторид, β-галактозилфторид, β-маннозилфторид, β-глюкозилфторид, β-фукозилфторид, β-ксилозилфторид, β-сиалилфторид, β-Ν-ацетилглюкозаминилфторид и β-Ν-ацетилгалактозаминилфторид.

В некоторых аспектах модифицированный сахарный остаток конъюгирован с одним или несколькими водорастворимыми полимерами. Многие водорастворимые полимеры известны квалифицированным в данной области специалистам и применимы в практике данного изобретения. Термин "водорастворимый полимер" включает в себя такие молекулярные частицы, как сахариды (например, декстран, амилозу, гиалуроновую кислоту, поли(сиаловую кислоту), гепараны, гепарины и т.д.); поли(аминокислоты); нуклеиновые кислоты; синтетические полимеры (например, поли(акриловую кислоту), простые поли(эфиры), например поли(этиленгликоль)); пептиды, белки и т.п. Данное изобретение может осуществляться с любым водорастворимым полимером с единственным ограничением, что этот полимер должен включать в себя точку, в которой может быть присоединена остальная часть этого конъюгата.

Способы и химия для активации водорастворимых полимеров и сахаридов, а также способы конъюгирования сахаридов и полимеров с различными молекулярными частицами описаны в литературе. Обычно используемые способы активации полимеров включают в себя активацию функциональных групп цианогенбромидом, периодатом, глутаральдегидом, биэпоксидами, эпихлоргидрином, дивинилсульфоном, карбодиимидом, сульфонилгалогенидами, трихлортриазином и т.д. (см., К.Р. Тау1ог (1991),

- 17 030332

Рго1еш Ιιηιηοόίΐίζαΐίοη. РипЪашейак апЪ АррБсаЬопз, Магсе1 Эскксг. Ν. Υ.; З.З. ХУопд, (1992), СЬеш181гу оГ Рго1еш СоищдаЬоп апЪ СгоззБпктд, СКС Ргезз, Воса КаЮп; О.Т. Негшапзоп е1 а1. (1993), ПпшоЫЩеЪ АГЛпНу ПдапЪ ТесЬтциез, АсаЪешк Ргезз, Ν.Υ.; Эипп, К.Ь., е1 а1., ЕЪз. Ро1ушегю Эгидз апЪ Эгид ОеПуегу Зуз1ешз, АСЗ Зушрозшш Зепез Уо1. 469, Атепсап СЬешюа1 Зоае1у, ^азЫпдЮп, Э.С 1991).

В некоторых аспектах модифицированный сахарный остаток конъюгируют с одним или несколькими водонерастворимыми полимерами. В некоторых вариантах осуществления конъюгация водонерастворимого полимера может быть использована для доставки терапевтического пептида регулируемым образом. Полимерные системы доставки лекарственных средств известны в данной области. См., например, Эипп е1 а1., ЕЪз. Ро1ушегю Ъгидз апЪ Эгид Оекуегу Зуз1ешз, АСЗ Зушрозшш Зепез Уо1. 469, Ашепсап СЬешка1 Зос1е1у, ^азЫпд£оп, Э.С., 1991. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что, по существу, любая известная система доставки лекарственных средств применима к конъюгатам данного изобретения.

Репрезентативные водонерастворимые полимеры включают в себя, но не ограничиваются ими, полифосфазены, поли(виниловые спирты), полиамиды, поликарбонаты, полиалкилены, полиакриламиды, полиалкиленгликоли, полиалкиленоксиды, полиалкилентерефталаты, простые поливиниловые эфиры, сложные поливиниловые эфиры, поливинилгалогениды, поливинилпирролидон, полигликолиды, полисилоксаны, полиуретаны, поли(метилметакрилат), поли(этилметакрилат), поли(бутилметакрилат), поли(изобутилметакрилат), поли(гексилметакрилат), поли(изодецилметакрилат), поли(лаурилметакрилат), поли(фенилметакрилат), поли(метилакрилат), поли(изопропилакрилат), поли(изобутилакрилат), поли(октадецилакрилат), полиэтилен, полипропилен, поли(этиленгликоль), поли(этиленоксид), поли(этилентерефталат), поли(винилацетат), поливинилхлорид, полистирол, поливинилпирролидон, плюроники и поливинилфенол и их сополимеры.

Эти и другие полимеры, обсуждаемые в данном описании, могут быть легко получены из коммерческих источников, таких как З1дша СЬешюа1 Со. (З1. Ьошз, Мо.), Ро1узс1епсез (^аггеШоп, Ра.), ЛИпск (МЪ^аикее, ^1з.), Р1ика (Копкопкоша, Ν. Υ.) и ВюКаЪ (КюЬшопЪ, СаПГ), или синтезированы из мономеров, получаемых от этих поставщиков, с использованием стандартных способов. Репрезентативные биодеградируемые полимеры, используемые в конъюгатах этого изобретения, включают в себя, но не ограничиваются ими, полиактиды, полигликолиды и их сополимеры, поли(этилентерефталат), поли(масляную кислоту), поли(валериановую кислоту), поли(сополимер лактида и капролактона), поли(сополимер лактида и гликолида), полиангидриды, полиортоэфиры, их смеси и сополимеры. Особенно применимы композиции, которые образуют гели, такие как композиции, включающие в себя коллаген, и плюроники.

В одном предпочтительном варианте осуществления один или несколько модифицированных сахарных остатков конъюгируют с одной или несколькими молекулами ПЭГ.

В некоторых аспектах этот модифицированный сахар конъюгируют с биомолекулой. Биомолекулы этого изобретения могут включать в себя, но не ограничиваются ими, функциональные белки, ферменты, антигены, антитела, пептиды, нуклеиновые кислоты (например, отдельные нуклеотиды или нуклеозиды, олигонуклеотиды, полинуклеотиды и одноцепочечные нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты с большим количеством цепей), лектины, рецепторы или их комбинацию. Некоторые предпочтительные биомолекулы являются, по существу, нефлуоресцентными или испускают такое минимальное количество флуоресценции, что они не пригодны для использования в качестве флуоресцентного маркера в анализе. Другие биомолекулы могут быть флуоресцентными.

В некоторых вариантах осуществления биомолекула является нацеливающей частью молекулы. Термин "нацеливающая часть" и "нацеливающий агент" в данном контексте относится к молекулярным частицам, которые селективно локализуются в конкретной ткани или области тела. В некоторых вариантах осуществления биомолекула выбрана для направления полипептида ЗАР этого изобретения к конкретному внутриклеточному компартменту, для усиления посредством этого доставки этого пептида к этому внутриклеточному компартменту относительно количества недериватизованного пептида, который доставляется к этой ткани. Эта локализация опосредована специфическим узнаванием молекулярных детерминант, молекулярным размером нацеливающего агента или конъюгата, ионными взаимодействиями, гидрофобными взаимодействиями и т.п. Другие механизмы нацеливания агента на конкретные ткань или район известны квалифицированным в данной области специалистам.

В некоторых вариантах осуществления этот модифицированный сахар включает в себя терапевтическую часть. Квалифицированным в данной области специалистам будет понятно, что имеется перекрывание между категорией терапевтических частей и категорией биомолекул, т.е. многие биомолекулы имеют терапевтические свойства или терапевтический потенциал.

Классы применимых терапевтических частей молекул включают в себя, например, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства; стероидные противовоспалительные лекарственные средства; адъюванты; антигистаминные лекарственные средства; противокашлевые лекарственные средства; противозудные лекарственные средства; антихолинергические лекарственные средства; противорвотные лекарственные средства и лекарственные средства против тошноты; лекарственные средства против анорексии; стимулирующие средства центрального действия; лекарственные средства против

- 18 030332

аритмии; лекарственные средства против β-адренергического блокатора; кардиотонические лекарственные средства; антигипертензивные лекарственные средства; диуретические лекарственные средства; сосудорасширяющие лекарственные средства; сосудосужающие лекарственные средства; противоязвенные лекарственные средства; анестезирующие лекарственные средства; антидепрессантные лекарственные средства; транквилизирующие и седативные лекарственные средства; антипсихотические лекарственные средства и антимикробные лекарственные средства.

Другие лекарственные части, применимые в осуществлении данного изобретения, включают в себя противоопухолевые лекарственные средства, разрушающие клетки агенты, антиэстрогены и антиметаболиты. В этом классе включены также агенты на основе радиоизотопов как для диагностики (например, визуализации), так и для терапии и конъюгированные токсины.

Терапевтическая часть может быть также гормоном, миорелаксантом, противосудорожным средством, активирующим кости агентом, эндокринным модулирующим агентом, модулятором диабета, андрогеном, антидиуретическими средствами или кальцитониновым лекарственным средством.

Другие применимые модифицирующие группы включают в себя иммуномодулирующие лекарственные средства, иммуносупрессоры и т.д. Используются также группы с противовоспалительной активностью, такие как сулиндак, этодолак, кетопрофен и кеторолак. Другие лекарственные средства для применения вместе с данным изобретением, будут очевидными квалифицированным в данной области специалистам.

Полипептиды 3ΑΓ с измененным Ν-гликозилированием, получаемые способами этого описания, могут быть гомогенными (т.е. проба полипептида 3ΑΓ является однородной в специфической структуре Ν-гликана) или, по существу, гомогенными. Под термином "по существу, гомогенные" имеется в виду, что по меньшей мере около 25% (например, по меньшей мере около 27%, по меньшей мере около 30%, по меньшей мере около 35%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 45%, по меньшей мере около 50%, по меньшей мере около 55%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 65%, по меньшей мере около 70%, по меньшей мере около 75%, по меньшей мере около 80%, по меньшей мере около 85%, по меньшей мере около 90% или по меньшей мере около 95% или по меньшей мере около 99%) полипептидов 3ΑΓ содержат одну и ту же специфическую структуру Ν-гликана.

В некоторых вариантах осуществления вариантные полипептиды 3ΑΓ этого изобретения имеют 1С₅₀ для ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты ίη νίΐτο, которая равна менее 1/2, менее 1/3, менее 1/4, менее 1/10 или менее 1/100 1С₅₀ соответствующей пробы 3ΑΓ дикого типа, выделенного из сыворотки человека. Существуют многие хорошо охарактеризованные способы определения чувствительности мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) или клеток-моноцитов к 3ΑΓ для дифференцировки фиброцитов. Эти способы могут быть использованы для определения относительной эффективности любого из вариантных полипептидов 3ΑΓ этого изобретения в сравнении с пробой полученного из сыворотки человека 3ΑΓ, любым другим вариантным полипептидом 3ΑΓ или другим супрессором или активирующим агентом фиброцитов. РВМС или моноциты, подходящие для применения в этих способах, могут быть получены из различных линий культуры ткани. Альтернативно, подходящие клетки для анализов дифференцировки фиброцитов могут быть получены из биологической пробы, которая содержит РВМС или клетки-моноциты. Биологическая проба может быть получена из сыворотки, плазмы, здоровой ткани или фиброзной ткани. Обычно, анализы дифференцировки фиброцитов проводят инкубированием РВМС или клеток-моноцитов в средах с различными концентрациями полипептида ЗЛР для определения степени дифференцировки фиброцитов. Концентрация ЗΑР может составлять от 0,0001 мкг/мл до 1 мг/мл и в некоторых вариантах осуществления равна 0,001, 1,0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 300 или 500 мкг/мл. В некоторых анализах эти среды могут быть дополнены 1100 нг/мл ЬМСЗР; причем предпочтительная концентрация ЬМСЗР равна 25 нг/мл. Указание на то, что РВМС и моноциты дифференцировались в фиброциты, может быть определено квалифицированным в данной области специалистом. Обычно фиброциты морфологически определяются в виде прикрепленных клеток с формой удлиненного веретена и с присутствием овального ядра. В некоторых анализах клетки фиксируют и окрашивают Нета 3 перед подсчетом фиброцитов прямым счетом, например, с использованием инвертированного микроскопа. Величина дифференцировки фиброцитов интерпретируется квалифицированным в данной области специалистом в виде показателя чувствительности клетки к 3ΑΕ. Как показано примерами этого описания, более высокая супрессия дифференцировки фиброцитов указывает на более высокую степень чувствительности к 3ΑΕ. Альтернативный способ измерения дифференцировки фиброцитов включает в себя определение экспрессии фиброцит-специфических маркеров клеточной поверхности или секретируемых факторов, например цитокинов (например, 1Ь-1та, ΕΝΑ-78^ΧΡΡ-5, ΌΑΙ-1). фибронектина, коллагена-1. Способы детектирования и/или количественного определения маркеров клеточной поверхности или секретируемых факторов хорошо известны в данной области, и они включают в себя, но не ограничиваются ими, различные способы на основе Ε03Α и ΡЛСЗ, использующие иммунореактивные антитела против одного или нескольких фиброцитспецифических маркеров. Как описано в примерах этого описания, измерение экспрессии полученного из макрофагов хемокина (МЭС) является одним из эффективных способов определения дифференцировки фиброцитов.

- 19 030332

Способы детектирования и/или характеристики Ν-гликозилирования (например, измененного Ν-гликозилирования) полипептида ЗАР включают в себя электрофорез углеводов с использованием ДНК-секвенатора (ИЗА), с использованием флуорофора (РАСЕ) или времяпролетной массспектрометрии с лазерной десорбцией и ионизацией (3ΕΕΌΙ-ΤΟΡ МЗ). Например, анализ может использовать ОЗА-РАСЕ, в котором, например, гликопротеины денатурируются после иммобилизации, например, на мембране. Затем эти гликопротеины могут быть восстановлены подходящим восстанавливающим агентом, таким как дитиотреитол (ЭЛТА) или β-меркаптоэтанол. Сульфгидрильные группы белков могут быть карбоксилированы с использованием кислоты, такой как йодуксусная кислота. Затем Ν-гликаны могут быть высвобождены из этого белка с использованием фермента, такого как Ν-гликозидаза Р. Ν-Гликаны могут быть, необязательно, воссозданы и дериватизованы восстановительным аминированием. Затем эти дериватизованные Ν-гликаны могут быть сконцентрированы. Оборудование, подходящее для анализа Ν-гликана, включает в себя, например, ДНК-секвенатор АВ1 РК1ЗМ® 377 (АррЬеб ВюхуЧепъ). Анализ данных может выполняться с использованием, например, программы ΟΕNΕЗСЛN®. 3.1 (АррЬеб ВюхуЧепъ). Необязательно выделенные маннопротеины могут быть дополнительно обработаны одним или несколькими ферментами для подтверждения их Ν-гликанового статуса. Примерные ферменты включают в себя, например, α-маннозидазу или а-1,2-маннозидазу. Дополнительные способы анализа Ν-гликанов включают в себя, например, масс-спектрометрию (например, МАРП1-ТОР-МЗ), жидкостную хроматографию высокого давления (НРЬС) на нормальной фазе, обращенной фазе и ионообменную хроматографию (например, с импульсным амперометрическим детектированием, когда гликаны не являются мечеными, и с УФ-поглощением или флуоресценцией, если гликаны являются соответствующим образом мечеными). См., также статьи С.'а11е\уаег1 е1 а1. (2001), О1усоЪю1о§у 11(4): 275-281 и Ргеие е! а1. (2006), Вюсопщд. СЬет. 17(2): 559-564, описания каждой из которых включены в данный документ посредством ссылки в их полном объеме.

Фармацевтические препараты и композиции.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы включают в себя введение по меньшей мере одного вариантного полипептида ЗАР этого изобретения субъекту в качестве терапевтического агента. Терапевтические агенты этого изобретения могут быть приготовлены общепринятым образом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей или эксципиентов. Например, терапевтические агенты и их физиологически приемлемые соли и сольваты могут быть приготовлены для введения, например, инъекцией (например, ЗиЪр, 1М, 1Р), ингаляцией или инсуффляцией (либо через рот, либо через нос) или пероральным, буккальным, подъязычным, чрескожным, назальным, парентеральным или ректальным введением. В некоторых вариантах осуществления терапевтические агенты могут вводиться локально, в место, в котором присутствуют клетки-мишени, т.е. в конкретных ткани, органе или жидкости (например, крови, цереброспинальной жидкости, опухолевой массе и т.д.).

Данное изобретение обеспечивает дополнительно применение любого вариантного полипептида ЗАР этого изобретения для приготовления лекарственного средства для лечения или предупреждения нарушения или состояния, описанного здесь, у пациента, например применение вариантного полипептида ЗАР для приготовления лекарственного средства для лечения нарушения или состояния, описанного здесь. В некоторых аспектах любой вариантный полипептид ЗАКЗ этого изобретения может быть использован для приготовления фармацевтического препарата для применения при лечении или предупреждении заболевания или состояния, описанного здесь.

Терапевтические агенты могут быть приготовлены для различных способов введения, в том числе системного и местного или локализованного введения. Способы и композиции обычно могут быть найдены в КепипдЮп'х РЬагтасеиЬса1 Зтепсек, Меабе РиЪЬкЫпд Со., ЕаЛоп, РА. Для парентерального введения предпочтительной является инъекция, включающая в себя внутримышечную, внутривенную, внутрибрюшинную и подкожную инъекцию. Для инъекции эти соединения могут быть приготовлены в жидких растворах, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хенка или раствор Рингера. Кроме того, эти соединения могут быть приготовлены в твердой форме и растворены или суспендированы перед использованием. В изобретение включены также лиофилизированные формы. В некоторых вариантах осуществления эти терапевтические агенты могут вводиться в клетки различными способами, известными квалифицированным в данной области специалистам, включающими в себя, но не ограничивающимися ими, инкапсулирование в липосомах, ионтофорез, или включением в другие носители, такие как гидрогели, циклодекстрины, биодеградируемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы.

Для перорального введения эти фармацевтические композиции могут иметь форму, например, таблеток, пастилок или капсул, приготовленных общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми эксципиентами, такими как связывающие агенты (например, предварительно желатинированный кукурузный крахмал, поливинилпирролидон или гидроксилметилцеллюлоза); наполнители (например, лактоза, микрокристаллическая целлюлоза или гидрофосфат кальция); смазывающие вещества (например, стеарат магния, тальк или диоксид кремния); дезинтегрирующие агенты (например, картофельный

- 20 030332

крахмал или гликолат натрий-крахмала); или увлажняющие агенты (например, лаурилсульфат натрия). На таблетки могут быть нанесены покрытия способами, хорошо известными в данной области. Жидкие препараты для перорального введения могут иметь форму, например, растворов, сиропов или суспензий или они могут быть представлены в виде сухого продукта для воссоздания с водой или другим носителем перед использованием. Такие жидкие препараты могут быть приготовлены общепринятыми способами с фармацевтически приемлемыми добавками, такими как суспендирующие агенты (например, сироп сорбита, производные целлюлозы или гидрогенизированные годные в пищу жиры); эмульгирующие агенты (например, лецитин и аравийская камедь); неводные носители (например, миндальное масло, масляные эфиры, этиловый спирт или фракционированные растительные масла) и консерванты (например, метил- или пропил-п-гидроксибензоаты или сорбиновая кислота). Препараты могут также содержать буферные соли, вкусовые, красящие и подслащивающие агенты в случае необходимости. Препараты для перорального введения могут быть также приготовлены для регулируемого высвобождения активного соединения.

Для введения ингаляцией (например, при легочной доставке) терапевтические агенты могут доставляться общепринятым образом в виде аэрозольного раствора из находящихся под давлением упаковок или распылителя с использованием подходящего пропеллента, например дихлордифторбутана, трихлорфторметана, дихлортетрафторэтана, диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае находящегося под давлением аэрозоля единица дозы может быть определена за счет клапана для доставки отмеренного количества. Могут быть приготовлены капсулы и картриджи, например, из желатина для использования в ингаляторе или инсуффляторе, содержащем порошкообразную смесь соединения и подходящую порошковую основу, такую как лактоза или крахмал.

В способах этого изобретения эти фармацевтические соединения могут также вводиться интраназальным или интрабронхиальным способом, включающим в себя инсуффляцию, порошки и аэрозольные композиции (например, стероидных ингаляционных препаратов, см. Ροϊιαίαβί (1995), ί. СП η. Ркагтасо1оду. 35:1187-1193; Труа (1995), Άηη. Л11егду ЛкШта Iттиηο1. 75:107-111). Например, аэрозольные препараты могут быть помещены в находящиеся под давлением приемлемые пропелленты, такие как дихлордифторметан, пропан, азот и т.п. Они могут быть также приготовлены в виде фармацевтических веществ для не находящихся под давлением препаратов, например, находящихся в распылителе или аэрозольном ингаляторе. Обычно такое введение выполняется в водном фармакологически приемлемом буфере.

Фармацевтические композиции, подходящие для респираторной доставки (например, интраназальной, ингаляционной и т.д.) вариантных полипептидов 8АР, могут быть приготовлены либо в твердой, либо в жидкой форме.

Полипептиды 8АР этого изобретения могут быть приготовлены для парентерального введения инъекцией, например болюсной инъекцией, или непрерывной инфузией. Препараты для инъекции могут быть представлены в форме единичной дозы, например в ампулах или многодозовых контейнерах, с добавленным консервантом. Эти композиции могут быть в таких формах, как суспензии, растворы или эмульсии в масляных или водных носителях, и могут содержать способствующие приготовлению агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, эти активные ингредиенты могут находиться в форме порошка для объединения с подходящим носителем, например стерильной апирогенной водой перед использованием.

Кроме того, полипептиды 8АР этого изобретения могут быть также приготовлены в виде препарата пролонгированного действия (депонированного препарата). Такие длительно действующие формы могут вводиться имплантацией (например, подкожно или внутримышечно) или внутримышечной инъекцией. Таким образом, терапевтические агенты могут быть приготовлены, например, с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или с ионообменными смолами или в виде умеренно растворимых производных, например в виде умеренно растворимой соли. Состав пролонгированного высвобождения включает в себя также пластыри.

В некоторых вариантах осуществления описанные здесь соединения могут быть приготовлены для доставки в центральную нервную систему (ЦНС) (обзор в Вед1еу, РЬа^тасο1ο§у & Ткегареикск, 104: 2945 (2004)). Общепринятые подходы для доставки лекарственных средств в ЦНС включают в себя нейрохирургические стратегии (например, интрацеребральную инъекцию или интрацеребровентрикулярную инфузию); молекулярную манипуляцию агента (например, образование химерного слитого белка, который содержит транспортный пептид, который имеет аффинность в отношении молекулы поверхности эндотелиальных клеток, в комбинации с агентом, который сам неспособен пересекать гематоэнцефалический барьер, в попытке использования одного из эндогенных транспортных путей гематоэнцефалического барьера); фармакологические стратегии, предназначенные для увеличения растворения в липидах агента (например, конъюгирование водорастворимых агентов с липидными или холестериновыми носителями); и транзиторное нарушение целостности ВВВ гиперосмотическим разрушением (происходящим вследствие инфузии раствора маннита в сонную артерию или использования биологически активного агента, такого как пептид ангиотезина).

- 21 030332

В некоторых вариантах осуществления полипептиды §АР этого изобретения включают в композицию для местного введения, содержащую носитель для локального введения, который обычно пригоден для местного введения лекарственного средства, и содержащую любой подобный материал, известный в данной области. Этот носитель для местного введения может быть выбран таким образом, чтобы обеспечивать эту композицию в желаемой форме, например в виде мази, лосьона, крема, микроэмульсии, геля, масла, раствора или т.п., и может состоять либо из встречающегося в природе материала, либо из материала синтетического происхождения. Предпочтительно выбранный носитель не влияет вредным образом на активный агент или другие компоненты композиции для местного применения. Примеры подходящих носителей для местного применения для применения в данном описании включают в себя воду, спирты и другие нетоксичные органические растворители, глицерин, минеральное масло, силикон, вазелин, ланолин, жирные кислоты, растительные масла, парабены, воски и т.п.

Фармацевтические композиции (в том числе косметические препараты) могут содержать от приблизительно 0,00001 до 100 мас.%, например от 0,001 до 10 мас.% или от 0,1до 5 мас.% одного или нескольких описанных здесь вариантных полипептидов §АР. В некоторых композициях для местного введения активный агент присутствует в количестве приблизительно 0,25-75 мас.% композиции, предпочтительно приблизительно 0,25-30 мас.% композиции, более предпочтительно приблизительно 0,5-15 мас.% композиции и наиболее предпочтительно приблизительно 1-10 мас.% композиции.

Состояния, относящиеся к глазам, могут лечиться или предупреждаться, например, системно, местно, внутриглазной инъекцией терапевтических агентов или введением устройства пролонгированного высвобождения, которое высвобождает терапевтические агенты. Полипептиды §АР этого изобретения могут доставляться в фармацевтически приемлемом офтальмическом носителе, так что это соединение поддерживается в контакте с глазной поверхностью в течение достаточного периода времени для проникновения этого соединения в роговичные и внутренние районы глаза, например переднюю камеру, конъюнктиву, заднюю камеру, стекловидное тело, внутриглазную жидкость, жидкую часть стекловидного тела, роговицу, радужную оболочку/реснитчатую часть, хрусталик, хороидальную оболочку/сетчатку и склеру. Фармацевтически приемлемый офтальмический носитель может быть, например, мазью, растительным маслом или инкапсулирующим материалом. Альтернативно, эти соединения могут быть инъецированы непосредственно в жидкость стекловидного тела и внутриглазную жидкость. В другой альтернативе, эти соединения могут быть введены системно, например внутривенной инфузией или инъекцией, для лечения глаза.

Описанные здесь терапевтические агенты могут храниться в бескислородной среде в соответствии со способами, известными в данной области.

Примерные композиции содержат полипептид §АР с одним или несколькими фармацевтически приемлемыми носителями и, необязательно, другими терапевтическими ингредиентами. Этот носитель (носители) должны быть "фармацевтически приемлемыми" в том смысле, что они являются совместимыми с другими ингредиентами этой композиции и не должны вызывать неприемлемого вредного действия в субъекте. Такие носители описаны здесь или являются хорошо известными квалифицированным в области фармакологии специалистам. В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции являются апирогенными и подходящими для введения пациенту-человеку. В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции не содержат раздражающих веществ и пригодны для введения пациенту-человеку. В некоторых вариантах осуществления эти фармацевтические композиции не содержат аллергенов и пригодны для введения пациенту-человеку. Эти композиции могут быть приготовлены любым из способов, хорошо известных в области фармации.

В некоторых вариантах осуществления полипептид §АР вводят в композиции задержанного высвобождения, например в композиции, которая включает в себя полимер медленного высвобождения. Полипептид §АР может быть приготовлен с носителями, которые будут защищать его против быстрого высвобождения. Примеры включают в себя носитель регулируемого высвобождения, такой как полимер, микроинкапсулированную систему доставки или биоадгезивный гель. Альтернативно, пролонгированная доставка полипептида 8АР может достигаться включением в эту композицию агентов, которые задерживают абсорбцию, например, гидрогелей моностеарата алюминия и желатина.

Способы доставки соединений нуклеиновых кислот известны в данной области (см., например, АкН1аг е( а1., 1992, Тгепбк Се11 Вю., 2, 139 и ЭеПуегу §1га1ед1е8 £ог Апбкепке ОНдопис1ео6бе ТЬегареибск, еб. АкЫаг, 1995; §иШуап е( а1., 1п1етабопа1 АррПсабоп Ыо. \УО 94/02595). Эти протоколы могут быть использованы для доставки фактически любого соединения нуклеиновой кислоты. Соединения нуклеиновых кислот могут вводиться в клетки различными способами, известными квалифицированным в данной области специалистам, в том числе, но не только, инкапсулированием в липосомах, ионтофорезом или включением в другие носители, такие как гидрогели, циклодекстрины, биодеградируемые нанокапсулы и биоадгезивные микросферы. Альтернативно, комбинацию нуклеиновая кислота/носитель локально доставляют прямой инъекцией или с использованием инфузионного насоса. Другие способы доставки включают в себя, но не ограничиваются ими, пероральную (в форме таблетки или пилюли) и/или внутриоболочечную доставку (Оо1б, 1997, Ыеигокаепсе, 76, 1153-1158). Другие подходы включают в себя применение различных транспортных систем и систем-носителей, например, посредством применения конъюга- 22 030332

тов и биодеградируемых полимеров. В отношении исчерпывающего обзора стратегий доставки лекарственных средств см. Но е! а1., 1999, Сигг. Ορΐη. Мо1. ТЬег., 1, 336-343 и Дат, Эгид ПеПуегу 8уз!етз: ТесЬпо1од1ез аηά Соттегс1а1 Оррог!итЕез, ^ес^з^οη Кезоигсез, 1998 и Сгоо!Ьшз е! а1., 1997, I. ΝαιΐΌ νΐτοί, 3, 387-400. Более подробные описания доставки и введения нуклеиновых кислот обеспечены в 8υ11ίνπη е! а1., зирга, Эгарег е! а1., ГСТ ^О 93/23569, Ве^де1таη е! а1., международной заявке ^О 99/05094 и КНтик е! а1., международной публикации Ж) 99/04819.

Следующие примеры служат для более полного описания способа применения вышеописанного изобретения, а также объяснения наилучших способов, рассматриваемых для осуществления различных аспектов этого изобретения. Понятно, что эти примеры никоим образом не должны ограничивать истинный объем этого изобретения и представлены скорее для иллюстративных целей.

Примеры

Пример 1. Рекомбинантный 8ΑΡ является более эффективным, чем 8ΑΡ, полученный из сыворотки человека.

Рекомбинантный 8ΑΡ человека, выделенный из клеток СНО-8 (γΗ8ΑΡ) и полученный из сыворотки человека 8ΑΡ (Η8ΑΡ), анализировали на биоактивность с использованием биоанализа ιη νΐ!ΐΌ. В этом анализе обогащенные моноцитами мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) инкубировали с варьирующимися концентрациями γΗ8ΑΡ или Η8ΑΡ в течение 96 ч. После этого инкубирования супернатанты полученных культур извлекали и анализировали при помощи ΙΉΙ8Α для определения количества производимого макрофагами хемокина (МЭС), которое было продуцировано. МЭС продуцируется фиброцитами и является, следовательно, показателем дифференцировки моноцитов в фиброциты. Сравнением ингибирующей концентрации, 50% (1С₅₀) этой пробы со ссылочным стандартом 1ι8ΑΡ, может быть определена относительная эффективность гликоварианта 8ΑΡ. Этот результат выражали в виде отношения 1С₅₀ этой пробы против ссылочного стандарта Η8ΑΡ.

Все пробы 8ΑΡ и стандарты разбавляли первоначально до концентрации 1,0 мг/мл в дополненной среде ЕЛгоБНе. Стандарты 8ΑΡ серийно разводили для получения рабочих концентраций стандартов 60, 30, 20, 13,4, 8,8, 6,0, 3,0, 1,5 и 0,75 мкг/мл (конечная концентрация стандарта 30, 15, 10, 6,7, 4,4, 3,0, 1,5, 0,75 и 0,375 мкг/мл); см. табл. 1.

Таблица 1

Рабочая концентрация гЬЗАР стандарта (мкг/мл)		Объем стандарта	Объем дополненной среды ПЪгоЪИе
60	60 1	(1 мг/мл)	940
30	600	(60 мкг/мл)	600
20	800	(30 мкг/мл станд.)	400
13,4	800	(20 мкг/мл станд.)	400
8,8	800	(13,4 мкг/мл станд.)	400
6, 0	800	(8,8 мкг/мл станд.)	400
3,0	600	(6,0 мкг/мл станд.)	600
1,5	600	(3,0 мкг/мл станд.)	600
0,75	600	(1,5 мкг/мл станд.)	600

Для приготовления для анализа ΕΕΙ8Α захватывающее антитело (т.е. антитело мыши против МЭС человека) разбавляли до рабочей концентрации в ЗФР без белка-носителя. Это разбавленное антитело использовали для покрытия 96-луночных планшетов и затем каждый планшет герметизировали и инкубировали в течение ночи при комнатной температуре. Перед использованием этих имеющих покрытие планшетов каждую лунку аспирировали и промывали промывочным буфером, повторяя этот процесс два раза, что давало в целом три промывки. Затем эти планшеты блокировали добавлением 300 мкл реагентаразбавителя к каждой лунке и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч. После инкубирования повторяли процедуру аспирации и промывания лунок.

Для анализа ΕΕΙ8Α 100 мкл проб каждого из супернатантов из культур моноцитов/фиброцитов или стандартов 8ΑΡ добавляли в каждую лунку. Затем этот планшет инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч перед аспирацией и промыванием этих лунок. Затем в каждую лунку добавляли 100 мкл рабочего разведения стрептавидин-ΗΚΡ. Планшет инкубировали в течение 20 мин при комнатной температуре перед добавлением в каждую лунку 50 мкл стоп-раствора. Немедленно измеряли оптическую плотность каждой лунки с использованием микропланшетного ридера, установленного на 450 нм. Если коррекция длины волны была доступна, микропланшетный ридер устанавливали на 540 или

- 23 030332

570 нм. Если коррекция длины волны не была доступна, то показания прибора при 540 или 570 нм вычитали из показаний прибора при 450 нм. Это вычитание корректирует оптические несовершенства в планшете.

Как ιΙιδΑΡ. так и ΙιδΑΡ анализировали на биоактивность с использованием этого анализа (фиг. 1). В среднем, ιΙιδΑΡ является в 3,4 раза более активным, чем ΙιδΑΡ (среднее из 7 независимых экспериментов).

Пример 2. Модификация структур гликанов δΑΡ.

С использованием способов гликоремоделирования гликановые части на пробе рекомбинантного δΑΡ человека (ΗιδΑΡ) модифицировали для замены концевых а2,3-связанных частей сиаловой кислоты а2,6-связанными частями сиаловой кислоты (фиг. 2А и 2В). Подобным образом, пробу полученного из сыворотки человека δΑΡ (ΙιδΑΡ) также модифицировали для замены концевых а2,6-связанных частей сиаловой кислоты а2,3-связанными частями сиаловой кислоты (фиг. 2С и 2Ό). Кроме того, поскольку ΛδΑΡ, выделенный из клеток СНО-δ, является только частично сиалилированным, пробу ιΙιδΑΡ обрабатывали для полного сиалилирования присоединенных гликановых структур а2,3-связанными частями сиаловой кислоты (фиг. 2Е и 2Р).

Как ΛδΑΡ, так и ΙιδΑΡ (Са1ЫосЬет Са!#970549) обрабатывали а2,3,6,8,9-сиалидазой (81дта Са!. # Ν8271) для полного десиалилирования этих полипептидов. После обработки сиалидазой в течение 17 ч десиалилированные (т.е. асиало) ιΙιδΑΡ и ΙιδΑΡ очищали с использованием фосфоэтаноламин-(РЕ)аффинной и вытеснительной (ЬерЬайех 200 ргер дгайе) хроматографии. Затем очищенные полипептиды асиало-δΑΡ ферментативно обрабатывали с использованием либо α2,3-, либо а2,6-сиалилтрансфераз (Са1ЫосЬет Са!. # 566223) в присутствии ЦМФ-сиаловой кислоты (Са1ЫосЬет Са!. # 233264) в течение 17 ч при 37°С. Следующие таблицы обеспечивают детали каждой реакционной смеси.

- 24 030332

Таблица 2

Реакции асиало гНЗАР (Кхпз)
Обработка α2,3-сиалилтрансферазой (ЗТЗСа13)
	параметр	единицы	величина
гйЗАР, ЗТЗСа13 исходные растворы реагентов	[асиало гйЗАР] збк	мг/мл	10,8
асиало гкЗАР ММ	г/мол	116293
[асиало гкЗАР ] зкк	мкМ	93
макс [галактоза]	мкМ	929
[ЗТЗСа13] збк	мг/мл	0,9
ЗТЗСа13 ММ	г/мол	84000
[ЗТЗСа13] зкк	мкМ	10,7
[СМР-ЗА] зкк	мг/мл	25
СМР-ЗА ММ	г/мол	658,4
[СМР-ЗА] зкк	мМ	38
объемы реакций	мкл асиало гЕЗАР 1 в реакции	мкл	260
мкл ЗТЗСа13 1 в реакции	мкл	50
мкл СМР-ЗА 1 в реакции	мкл	75
буфер (10 мМ НЕРЕЗ/150 мМ ЫаС1, рН 8)	мкл	615
общий объем реакции	мкл	1000
Концентрации в реакции	[асиало гНЗАР] реакции	мкМ	24,1
макс [галактоза]	мкМ	241
[ЗАР] реакции	мг/мл	2,8
[ЗТЗСа13] реакции	мкМ	0,5357
[ЗТЗСа13] реакции	мг/мл	0,045
[СМР-ЗА] реакции	мМ	2,85
асиало гНЗАР:ЗТЗ	Отношение масс	62
асиало гНЗАР:ЗТЗ	Молярное отношение	45
СМР-ЗА:ЗТЗ	Молярное отношение	5316
СМР-ЗА: асиало гНЗАР	Молярное отношение	118
СМР-ЗА: галактоза	Молярное отношение	11,8

- 25 030332

Обработка α2,6-сиалилтрансферазой (реакция ЗТ6)
	параметр	единицы	величина
гЪЗАР, 5Т6 исходные растворы реагентов	[асиало гЪЗАР] збк	мг/мл	10,8
асиало гЪЗАР ММ	г/мол	116293
[асиало гЪЗАР] зкк	мкМ	93
макс [галактоза]	мкМ	929
[ЗТ6] збк	мг/мл	0,205
ЗТ6 ММ	г/мол	42000
[ЗТ6] зкк	мкМ	4,9
[СМР-ЗА] зкк	мг/мл	25
СМР-ЗА ММ	г/мол	658,4
[СМР-ЗА] зкк	мМ	38
объемы реакций	мкл асиало гпЗАР 1 в реакции	мкл	260
мкл ЗТ6 в реакции	мкл	30
мкл СМР-ЗА в реакции	мкл	75
буфер (10 мМ НЕРЕЗ/150 мМ ЫаС1, рН 8)	мкл	635
общий объем реакции	мкл	1000
Концентрации в реакции	[асиало гЪЗАР] реакции	мкМ	24,1
макс [галактоза]	мкМ	241
[асиало гЪЗАР] реакции	мг/мл	2,8
[ЗТ6] реакции	мкМ	0,146
[ЗТ6] реакции	мг/мл	0,006
[СМР-ЗА] реакции	мМ	2,85
асиало гЪЗАР:ЗТ6	Отношение масс	457
асиало гЪЗАР:ЗТ6	Молярное отношение	165
СМР-ЗА:ЗТ6	Молярное отношение	19448
СМР-ЗА: асиало гЪЗАР	Молярное отношение	118
СМР-ЗА: галактоза	Молярное отношение	11,8

	Реакции асиало НЗАР (Кхпз)
Обработка α2,3-сиалилтрансферазой	(ЗТЗСа13)
	параметр	единицы	величина

- 26 030332

ЬЗАР, ЗТЗСа13 исходные растворы реагентов	[асиало ЬЗАР] збк	мг/мл	5,6
ЗАР ММ	г/мол	116293
[асиало ЬЗАР] зкк	мкМ	48
макс [галактоза]	мкМ	482
[ЗТЗСа13] збк	мг/мл	0,9
ЗТЗСа13 ММ	г/мол	84000
[ЗТЗСа13] зкк	мкМ	10,7
[СМР-ЗА] зкк	мг/мл	25
СМР-ЗА ММ	г/мол	658,4
[СМР-ЗА] зкк	мМ	38
объемы реакций	мкл асиало ЬЗАР в реакции	МКЛ	500
мкл ЗТЗСа13 в реакции	мкл	50
мкл СМР-ЗА в реакции	мкл	75
буфер (10 мМ НЕРЕЗ/150 мМ ЫаС1, рН 8)	мкл	375
общий объем реакции	мкл	1000
Концентрации в реакции	[асиало ЬЗАР] реакции	мкМ	24,1
макс [галактоза]	мкМ	241
[асиало ЬЗАР] реакции	мг/мл	2,8
[ЗТЗСа13] реакции	мкМ	0,54
[ЗТЗСа13] реакции	мг/мл	0,045
[СМР-ЗА] реакции	мМ	2,85
асиало ЬЗАР:ЗТЗ	Отношение масс	62
асиало ЬЗАР:ЗТЗ	Молярное отношение	45
СМР-ЗА:ЗТЗ	Молярное отношение	5316
СМР-ЗА: асиало ЬЗАР	Молярное отношение	118
СМР-ЗА: галактоза	Молярное отношение	11,8
Обработка α2,6-сиалилтрансферазой (реакция ЗТ6)
	параметр	единицы	величина
ЬЗАР, ЗТ6 исходные растворы реагентов	[асиало ЬЗАР] збк	мг/мл	5,6
асиало ЬЗАР ММ	г/мол	116293
[асиало ЬЗАР] зкк	мкМ	48
макс [галактоза]	мкМ	482
[ЗТ6] збк	мг/мл	0,205

- 27 030332

	ЗТб ММ	г/мол	42000
[ЗТб] збк	мкМ	4,9
[СМР-ЗА] зкк	мг/мл	25
СМР-ЗА ММ	г/мол	658,4
[СМР-ЗА] зкк	мМ	38
объемы реакций	мкл асиало АЗАР в реакции	МКЛ	500
мкл ЗТб в реакции	мкл	30
мкл СМР-ЗА в реакции	мкл	75
буфер (10 мМ НЕРЕЗ/150 мМ ЫаС1, рН 8)	мкл	395
общий объем реакции	мкл	1000
Концентрации в реакции	[асиало АЗАР] реакции	мкМ	24,1
макс [галактоза]	мкМ	241
[асиало АЗАР] реакции	мг/мл	2,8
[ЗТб] реакции	мкМ	0,146
[ЗТб] реакции	мг/мл	0,006
[СМР-ЗА] реакции	мМ	2,85
асиало АЗАР:ЗТб	Отношение масс	455
асиало АЗАР:ЗТб	Молярное отношение	164
СМР-ЗА:ЗТб	Молярное отношение	19448
СМР-ЗА: асиало АЗАР	Молярное отношение	118
СМР-ЗА: галактоза	Молярное отношение	11,8

В отдельной реакции выполняли полное сиалилирование гНЗ.·^ с использованием а2,3сиалилтрансферазы без первого десиалилирования этой молекулы при 37°С в течение 17 ч в соответствии со следующей таблицей.

- 28 030332

Таблица 3

Обработка <χ2,3-сиалилтрансферазой (5ТЗСа13)
	параметр	единицы	величина
гАЗАР	[гАЗАР] зЕк	мг/мл	19,0
ЗТЗСа13	гАЗАР ММ	г/моль	116293
исходные	[гАЗАР] зЕк	мкМ	163
растворы	макс [галактоза]	мкМ	1634
реагентов	[ЗТ30а13] зЕк	мг/мл	0,9

	ЗТ36а13 ММ	г/мол	84000
[ЗТЗСа13] зЕк	мкМ	10,7
[СМР-ЗА] зЕк	мг/мл	25
СМР-ЗА ММ	г/моль	658,4
[СМР-ЗА] зЕк	мМ	38
объемы реакций	мкл гАЗАР в реакции	МКЛ	500
мкл ЗТ36а13 в реакции	мкл	50
мкл СМР-ЗА в реакции	мкл	100
буфер (10 мМ НЕРЕЗ/150 мМ ЫаС1, рН 8)	мкл	350
общий объем реакции	мкл	1000
Концентрации в реакции	[гАЗАР] реакции	мкМ	81,7
мсакс [галаКтиЗсп	мкМ	О 1 П О ± /
[гАЗАР] реакции	мг/мл	9,5
[ЗТЗСа13] реакции	мкМ	0,54
[ЗТЗСа13] реакции	мг/мл	0,045
[СМР-ЗА] реакции	мМ	3,80
ВТА-02-17:ЗТЗ	Отношение масс	211
ВТА-02-17:ЗТЗ	Молярное отношение	152
СМР-ЗА:ЗТЗ	Молярное отношение	7088
СМР-ЗА:ВТА-02-17	Молярное отношение	46
СМР-ЗА: галактоза	Молярное отношение	4,6

После обработки сиалилированием, варианты как сиалилированного гЬ8АР, так и Н8.АР очищали с использованием РЕ-аффинной хроматографии с последующим диализом в 10 мМ №РЕ5% сорбит рН 7,5 (Р58-буфер). Подтверждение желаемых связей сиаловой кислоты (т.е., а2,3-связанного Н8.АР и а2,6-связанного гЕ8АР) выполняли с использованием как жидкостной хроматографии с массспектрометрией (фиг. 2А, 2С и 2Е), так и анионообменной высокоэффективной жидкостной хроматографии (фиг. 2В, 21) и 2Е) после обработки гликовариантных полипептидов 8АР а2,3-сиалидазой (Са1ЪюсЕет Са1. # 480706) при 37°С в течение 24 ч.

Пример 3. Ιη νΐίΓο биоанализ для определения эффективности гликоварианта 8АР в отношении ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты.

Гликоремоделированные гЕ8АР и Н8.АР анализировали на биоактивность с использованием того же самого ΐη νΐίΓο биоанализа, описанного в примере 1. Коротко, обогащенные моноцитами мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) инкубировали с варьирующимися концентрациями полипептида 8АР в течение 96 ч. После этого инкубирования полученные культуральные супернатанты извлекали и анализировали при помощи ЕЫ8А для количественного определения производимого макрофагами хемокина (ЛЮС), которое было продуцировано. Эти результаты выражали в виде отношения 1С₅₀ пробы против ссылочного стандарта Н8.АР и строили в виде графика относительной активности (относительная активность Н8.АР = 1). Все содержащие связь а2,3-сиаловой кислоты тестируемые материалы являются >

- 29 030332

чем в 2,4-раза более активными, чем ЬЗАР (фиг. 3). Равные смеси производных а2,3- и а2,6-связанной сиаловой кислоты ЗАР обнаруживают уровни промежуточной активности между 100% а2,6-связанным ЗАР и 100% а2, 3-связанным ЗАР, как и ожидалось (два самых крайних столбца на фиг. 3).

Один альтернативный способ количественного определения дифференцировки фибробластов включает в себя прямой подсчет количества фиброцитов, которые генерируются после инкубирования моноцитов с супрессором фиброцитов (например, ЗАР или его вариантом) или активирующим агентом (например, М-СЗР). В одном эксперименте моноциты очищали из полученных из крови РВМС с использованием отрицательного отбора с магнитными бусинами, стандартного в данной области (например, Са!. # 113-41Ό, ΙηνίίΓΟ^η, СагкЪаб, СА), и культивировали в 96-луночном планшете для культуры ткани, содержащем среды Р1ЪгоЬгГе, дополненные 25 или 50 нг/мл М-СЗР, в трех повторностях. Этот планшет инкубировали в течение 96 ч при 37°С в 5% СО₂-термостате. Затем эти клетки фиксировали параформальдегидом и окрашивали красителем Нета 3 (Са!. # 122-911, Нета 3 З!ат, РкЬег Заепбйс, Натр!оп, ΝΗ). Количество фиброцитов на лунку определяли суммированием измерений пяти различных полей на лунку с использованием инвертированного микроскопа. Фиброциты определяли морфологически в виде прикрепленных клеток с формой удлиненного веретена и с присутствием овального ядра. Эти данные показали, что 25 или 50 нг/мл М-СЗР были достаточными для увеличения количества фиброцитов, дифференцирующихся из моноцитов на ~50% в этом доноре (фиг. 4). Последующие эксперименты использовали среды Р1ЪгоЬгГе Меб1а, дополненные 25 нг/мл М-СЗР, как необходимо и определено ниже.

Среды НЬгоПГе: (Са!. # ЬМ-0001, ЫГеПпе Се11 ТесЬпо1о§у, ^а1кег^Ше, МО), дополненные 10 мМ НЕРЕЗ (Са!. # Н0887, З^дта-Л1б^^сЬ), 1х не являющимися незаменимыми аминокислотами (Са!. # М7145, З^дта-Л1б^^сЬ), 1 мМ пируватом натрия (Са!. # З8636, З^дта-Л1б^^сЬ), 2 мМ глутамином (Са!. # 25030149, 1^бгодеп), 100 Е/мл пенициллином и 100 мкг/мл стрептомицином (Са!. # Р0781, З1дта-А1бг1сЬ) и 1ТЗ-3 (Са!. # 12771, 500 мкг/мл бычьим сывороточным альбумином, 10 мкг/мл инсулином, 5 мкг/мл трансферрином, 5 нг/мл селенитом натрия, 5 мкг/мл линолевой кислоты и 5 мкг/мл олеиновой кислоты; З1дта-А1бг1сЬ).

В одном дополнительном эксперименте РВМС или моноциты очищали из цельной крови и культивировали в средах Р1ЪгоЬгГе, дополненных различными количествами ЗАР, в трех повторностях (как описано выше). Планшет инкубировали в течение 96 ч при 37°С в 5% СО₂-термостате. Затем эти клетки фиксировали параформальдегидом и окрашивали красителем Нета 3 (Са!. # 122-911, Нета 3 З!аш, РкЬег Заепбйс, Натр!оп, ΝΉ). Количество фиброцитов на лунку определяли суммированием измерений пяти различных полей на лунку с использованием инвертированного микроскопа. Было определено, что минимальная концентрация ЗАР, необходимая для обеспечения максимального ингибирования дифференцировки фиброцитов в этой системе, была равна 2 мкг/мл (фиг. 5). Количество фиброцитов уменьшается с увеличением концентрации ЗАР во всех донорах.

Включение посредством ссылки.

Все вышеупомянутые публикации и патенты включены в данное изобретение посредством ссылки в их полном виде, как если бы каждые публикация или патент были специально и по отдельности указаны как включенные посредством ссылки.

Хотя обсуждались конкретные варианты осуществления предмета изобретения, приведенное выше описание является иллюстративным и не ограничивающим это изобретение. Полный объем этого изобретения должен определяться ссылкой на формулу изобретения, вместе с ее полным объемом эквивалентов, и этим описанием, вместе с такими вариациями.

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ΡΗΟΜΕΌΙΟΗ, 1ЫС.

<120> Производные сывороточного амилоида Р и их получение и применение

<130> 104112-0020-ВД01

<140>

<141> 2010-06-04

<150> 61/217,931 <151> 2009-06-04

<160> 4

- 30 030332

<170> РаЬепЫп νθΓΞΪοη 3.5

<210> 1

<211> 204

<212> Белок

<213> Ното зарбепз

<400> 1

Нбз 1

ТЪг

Азр

Ьей

Бег 5

С1у

Ьуз

Уа1

РЪе

Уа1 10

РЪе

Рго

Агд

С1и

Бег 15

Уа1

ТЪг

Азр

Нбз

Уа1

Азп

Ьей

11е

ТЪг

Рго

Ьей

С1и

Ьуз

Рго

Ьей

С1п

Азп

20

25

30

РЪе

ТЪг

Беи

Суз

РЪе

Агд

А1а

Туг

Бег

Азр

Ьей

Бег

Агд

А1а

Туг

Бег

35

40

45

Беи

РЪе

Бег

Туг

Азп

ТЪг

С1п

С1у

Агд

Азр

Азп

С1и

Беи

Ьей

Уа1

Туг

50

55

60

Ьуз

С1и

Агд

Уа1

С1у

С1и

Туг

Бег

Ьей

Туг

11е

С1у

Агд

Нбз

Ьуз

Уа1

65

70

75

80

ТЪг

Бег

Ьуз

Уа1

11е

С1и

Ьуз

РЪе

Рго

А1а

Рго

Уа1

Нбз

11е

Суз

Уа1

85

90

95

Бег

Тгр

С1и

Бег

Бег

Бег

С1у

11е

А1а

С1и

РЪе

Тгр

11е

Азп

С1у

ТЪг

100

105

110

Рго

Ьей

Уа1

Ьуз

Буз

С1у

Беи

Агд

С1п

С1у

Туг

РЪе

Уа1

С1и

А1а

С1п

115

120

125

Рго

Ьуз

11е

Уа1

Ьей

С1у

С1п

С1и

С1п

Азр

Бег

Туг

С1у

С1у

Ьуз

РЪе

130

135

140

Азр

Агд

Бег

С1п

Бег

РЪе

Уа1

С1у

С1и

11е

С1у

Азр

Ьей

Туг

МеЬ

Тгр

145

150

155

160

Азр

Бег

Уа1

Беи

Рго

Рго

С1и

Азп

11е

Ьей

Бег

А1а

Туг

С1п

С1у

ТЪг

165

170

175

Рго

Беи

Рго

А1а

Азп

11е

Беи

Азр

Тгр

С1п

А1а

Беи

Азп

Туг

С1и

11е

180

185

190

Агд

С1у

Туг

Уа1

11е

11е

Ьуз

Рго

Ьей

Уа1

Тгр

Уа1

195

200

- 31

030332

<210> 2

<211> 208

<212> Белок <213> Са11из да11из

<400> 2

С1п 1

С1и

Азр

Ьеи Туг Агд 5

Ьуз

Уа1

РЬе

Уа1 10

РЬе

Агд

С1и

Азр

Рго 15

Бег

Азр

А1а

Туг

Уа1 Ьеи Ьеи

С1п

Уа1

С1п

Ьеи

С1и

Агд

Рго

Ьеи

Ьеи

Азп

20

25

30

РЬе

ТЬг

Уа1

Суз Ьеи Агд

Бег

Туг

ТЬг

Азр

Ьеи

ТЬг

Агд

Рго

Нчз

Бег

35

40

45

Ьеи

РЬе

Бег

Туг А1а ТЬг

Ьуз

А1а

С1п

Азр

Азп

С1и

11е

Ьеи

Ьеи

РЬе

50

55

60

Ьуз

Рго

Ьуз

Рго С1у С1и

Туг

Агд

РЬе

Туг

Уа1

С1у

С1у

Ьуз

Туг

Уа1

65

70

75

80

ТЬг

РЬе

Агд

Уа1 Рго С1и

Азп

Агд

С1у

С1и

Тгр

С1и

Нчз

Уа1

Суз

А1а

85

90

95

Бег

Тгр

С1и

Бег С1у Бег

С1у

11е

А1а

С1и

РЬе

Тгр

Ьеи

Азп

С1у

Агд

100

105

110

Рго

Тгр

Рго

Агд Ьуз С1у

Ьеи

С1п

Ьуз

С1у

Туг

С1и

Уа1

С1у

Азп

С1и

115

120

125

А1а

Уа1

Уа1

МеЬ Ьеи С1у

С1п

С1и

С1п

Азр

А1а

Туг

С1у

С1у

С1у

РЬе

130

135

140

Азр

Уа1

Туг

Азп Бег РЬе

ТЬг

С1у

С1и

МеЬ

А1а

Азр

Уа1

Нчз

Ьеи

Тгр

145

150

155

160

Азр

А1а

С1у

Ьеи Бег Рго

Азр

Ьуз

МеЬ

Агд

Бег

А1а

Туг

Ьеи

А1а

Ьеи

165

170

175

Агд

Ьеи

Рго

Рго А1а Рго

Ьеи

А1а

Тгр

С1у

Агд

Ьеи

Агд

Туг

С1и

А1а

180

185

190

Ьуз

С1у

Азр

Уа1 Уа1 Уа1

Ьуз

Рго

Агд

Ьеи

Агд

С1и

А1а

Ьеи

С1у

А1а

195

200

205

<210> 3 <211> 205

- 32 030332

<212> Белок <213> Воз Баигиз

<400> 3

С1у

Буз

Уа1

РЪе

Уа1 10

РЪе

Рго

Агд

С1и

Бег 15

Бег

С1п 1

ТЪг

Азр

Беи

Агд 5

ТЪг

Азр

Нтз

Уа1

ТЪг

Беи

11е

ТЪг

Буз

Беи

С1и

Буз

Рго

Беи

Буз

Азп

20

25

30

Беи

ТЪг

Беи

Суз

Беи

Агд

А1а

Туг

Бег

Азр

Беи

Бег

Агд

С1у

Туг

Бег

35

40

45

Беи

РЪе

Бег

Туг

Азп

11е

Нтз

Бег

Буз

Азр

Азп

С1и

Беи

Беи

Уа1

РЪе

50

55

60

Буз

Азп

С1у

11е

С1у

С1и

Туг

Бег

Беи

Туг

11е

С1у

Буз

ТЪг

Буз

Уа1

65

70

75

80

ТЪг

Уа1

Агд

А1а

ТЪг

С1и

Буз

РЪе

Рго

Бег

Рго

Уа1

Нтз

11е

Суз

ТЪг

85

90

95

Бег

Тгр

С1и

Бег

Бег

ТЪг

С1у

11е

А1а

С1и

РЪе

Тгр

11е

Азп

С1у

Буз

100

105

110

Рго

Беи

Уа1

Буз

Агд

С1у

Беи

Буз

С1п

С1у

Туг

А1а

Уа1

С1у

А1а

Нтз

115

120

125

Рго

Буз

11е

Уа1

Беи

С1у

С1п

С1и

С1п

Азр

Бег

Туг

С1у

С1у

С1у

РЪе

130

135

140

Азр

Буз

Азп

С1п

Бег

РЪе

МеБ

С1у

С1и

11е

С1у

Азр

Беи

Туг

МеБ

Тгр

145

150

155

160

Азр

Бег

Уа1

Беи

Бег

Рго

С1и

С1и

11е

Беи

Беи

Уа1

Туг

С1п

С1у

Бег

165

170

175

Бег

Бег

11е

Бег

Рго

ТЪг

11е

Беи

Азр

Тгр

С1п

А1а

Беи

Буз

Туг

С1и

180

185

190

11е

Буз

С1у

Туг

Уа1

11е

Уа1

Буз

Рго

МеБ

Уа1

Тгр

С1у

195

200

205

<210> 4

<211> 204

<212> Белок

<213> Сг1сеБи1из ттдгаБогтиз

- 33

030332

<400> 4

С1у

Ьуз

Уа1

РЬе

Уа1 10

РЬе

Рго

Агд

С1и

Зег 15

С1и

С1п 1

ТЬг

Азр

Ьеи

ТЬг 5

Зег

Азр

Туг

Уа1

Ьуз

Ьеи

11е

Рго

Агд

Ьеи

С1и

Ьуз

Рго

Ьеи

С1и

Азп

20

25

30

РЬе

ТЬг

Ьеи

Суз

РЬе

Агд

ТЬг

Туг

ТЬг

Азр

Ьеи

Зег

Агд

Рго

Нтз

Зег

35

40

45

Ьеи

РЬе

Зег

Туг

Азп

ТЬг

Ьуз

Азп

Ьуз

Азр

Азп

С1и

Ьеи

Ьеи

11е

Туг

50

55

60

Ьуз

С1и

Агд

МеЕ

С1у

С1и

Туг

С1у

Ьеи

Туг

11е

С1и

Азп

Уа1

С1у

А1а

65

70

75

80

11е

Уа1

Агд

С1у

Уа1

С1и

С1и

РЬе

А1а

Зег

Рго

Уа1

Нтз

РЬе

Суз

ТЬг

85

90

95

Зег

Тгр

С1и

Зег

Зег

Зег

С1у

11е

А1а

Азр

РЬе

Тгр

Уа1

Азп

С1у

11е

100

105

110

Рго

Тгр

Уа1

Ьуз

Ьуз

С1у

Ьеи

Ьуз

Ьуз

С1у

Туг

ТЬг

Уа1

Ьуз

ТЬг

С1п

115

120

125

Рго

Зег

11е

11е

Ьеи

С1у

С1п

С1и

С1п

Азр

Азп

Туг

С1у

С1у

С1у

РЬе

130

135

140

Азр

Ьуз

Зег

С1п

Зег

РЬе

Уа1

С1у

С1и

МеЕ

С1у

Азр

Ьеи

Азп

МеЕ

Тгр

145

150

155

160

Азр

Зег

Уа1

Ьеи

ТЬг

Рго

С1и

С1и

11е

Ьуз

Зег

Уа1

Туг

С1и

С1у

Зег

165

170

175

Тгр

Ьеи

С1и

Рго

Азп

11е

Ьеи

Азр

Тгр

Агд

А1а

Ьеи

Азп

Туг

С1и

МеЕ

180

185

190

Зег

С1у

Туг

А1а

Уа1

11е

Агд

Рго

Агд

Уа1

Тгр

Нтз

195

200

Claims (20)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Гликозилированный полипептид сывороточного амилоида Р (ЗАР) человека, содержащий Νсвязанную олигосахаридную цепь, где все сиалилированные ветви олигосахаридной цепи заканчиваются а2,3-связанной частью сиаловой кислоты, где олигосахаридная цепь свободна от а2,6-связанных частей сиаловой кислоты, и где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по мень- 34 030332

   шей мере на 85% идентична 8ЕС ГО N0: 1, и где полипептид §ЛР имеет 1С₅₀ для ингибирования дифференцировки моноцитов в фиброциты ίη νίΐτο, которая меньше 1С₅₀ соответствующей пробы §ЛР дикого типа, выделенного из сыворотки человека, благодаря чему полипептид §ЛР имеет повышенную биологическую активность по сравнению с 8ЛР дикого типа, выделенного из сыворотки человека.
2. 2. Гликозилированный полипептид §ЛР человека по п.1, где полипептид содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8ЕС ГО N0: 1.
3. 3. Гликозилированный полипептид §ЛР человека по п.2, где полипептид §ЛР содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 99% идентична 8ЕС ГО N0: 1.
4. 4. Гликозилированный полипептид §ЛР человека по п.3, где полипептид содержит аминокислотную последовательность 8Е0 ГО N0: 1.
5. 5. Гликозилированный полипептид §ЛР человека по любому из пп.1-4, где ^связанная олигосахаридная цепь содержит пентасахаридную сердцевину Μаη[(α1,6-)-(Μаη(α1,3)]-Μаη(β1,4)-Ο1сNΑс(β1,4)01сNΑс(β1,N)-Αδη.
6. 6. Гликозилированный полипептид §АР человека по любому из пп.1-5, где олигосахаридная цепь содержит по меньшей мере одну ветвь, имеющую структуру NеиNΑс2α3Са1β4С1сNΑсβ2Μаηα6.
7. 7. Гликозилированный полипептид §АР человека по любому из пп.1-6, где полипептид является слитым белком, содержащим домен §АР и один или несколько гетерологичных доменов.
8. 8. Гликозилированный полипептид §АР человека по п.7, где один или несколько гетерологичных доменов повышают стабильность ίη νίνο полипептида 8АР, и/или период полувыведения ίη νίνο полипептида 8АР, и/или поглощение/введение полипептида 8АР, и/или локализацию или распределение в ткани полипептида 8АР, и/или облегчение очистки полипептида 8ЛР.
9. 9. Гликозилированный полипептид §АР человека по любому из пп.1-8, где полипептид содержит один или несколько модифицированных аминокислотных остатков.
10. 10. Гликозилированный полипептид §АР человека по п.8, где один или несколько модифицированных аминокислотных остатков содержат пэгилированную аминокислоту, пренилированную аминокислоту, ацетилированную аминокислоту, биотинилированную аминокислоту и/или аминокислоту, конъюгированную с органическим дериватизирующим агентом.
11. 11. Гликозилированный полипептид §АР человека по п.10, где один или несколько модифицированных аминокислотных остатков повышают стабильность ίη νίνο полипептида 8АР, и/или период полувыведения ίη νίνο полипептида 8АР, и/или поглощение/введение полипептида 8АР, и/или локализацию или распределение полипептида 8АР в ткани, и/или облегчение очистки полипептида 8АР.
12. 12. Фармацевтический препарат для применения в снижении фиброза и/или лечения фиброзного или фибропролиферативного нарушения у млекопитающего, содержащий полипептид §АР человека по любому из пп.1-11 и фармацевтически приемлемый носитель.
13. 13. Способ получения гликозилированного полипептида 8АР человека по п.1 или 2, включающий:

    ί) обеспечение экспрессии с помощью технологии рекомбинантных белков и созревание гликозилированного полипептида 8АР человека в клетке СН0;

    ίί) выделение экспрессированного гликозилированного полипептида 8АР человека.
14. 14. Способ по п.13, где выделенный полипептид §АР человека содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% идентична 8ЕС ГО N0: 1.
15. 15. Способ по п.13 или 14, где выделенный полипептид §ЛР человека содержит аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 1.
16. 16. Способ получения гликозилированного полипептида 8АР человека по п.1, включающий: ί) обеспечение рекомбинантного полипептида 8АР;

    ίί) ферментативное или химическое изменение полипептида 8АР для получения гликозилированного полипептида 8АР, содержащего ^связанную олигосахаридную цепь, где все сиалилированные ветви олигосахаридной цепи заканчиваются а2,3-связанными частями сиаловой кислоты.
17. 17. Гликозилированный полипептид §АР человека по п.1 или 2, который получен способом по п.13.
18. 18. Гликозилированный полипептид §ЛР человека по п.17, где полипептид §АР содержит аминокислотную последовательность 8ЕС ГО N0: 1.
19. 19. Клетка СН0, которая содержит гликозилированный полипептид §АР человека по п.1.
20. 20. Применение полипептида 8АР по любому из пп.1-11, 17 и 18 для лечения или предотвращения состояния или нарушения, выбранного из воспалительного нарушения, фиброзного или фибропролиферативного нарушения, аллергического нарушения, аутоиммунного нарушения или воспаления слизистой оболочки.

    - 35 030332

    - 36 030332

    - 37 030332

    - 38 030332

    Средняя относительная активность