ES2367257T3 - Tratamiento de deficit de alfa-galactosidasa a. - Google Patents

Tratamiento de deficit de alfa-galactosidasa a. Download PDF

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Abstract

Un procedimiento para analizar una preparación de α-Gal A, comprendiendo el procedimiento: y obtener o proporcionar una primera preparación de α-Gal A de ensayo; y determinar si la primera preparación de α-Gal A de ensayo tiene cuatro o más de las características (1)-(7): (1) tiene al menos aproximadamente un 75% de glicanos neutros, mono- y disialilados combinados; (2) tiene menos de aproximadamente un 35% de glicanos tri- y tetrasialilados combinados; (3) tiene más de un 50% de glicanos complejos; (4) tiene menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados; (5) tiene más de aproximadamente un 45% de glicanos sialilados; (6) tiene una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1; (7) tiene una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor de 1, analizándose de esta manera una preparación de α-Gal A.

Description

Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas
La presente solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos con Número de Serie 60/375.584, presentada el 25 de abril de 2002.
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a composiciones de -galactosidasa A mejoradas para el tratamiento de déficits de -galactosidasa A, incluyendo la enfermedad de Fabry.
Antecedentes de la Invención
La enfermedad de Fabry es una enfermedad de almacenamiento lisosomal hereditaria asociada al cromosoma X caracterizada por insuficiencia renal grave, angioqueratomas y/o anomalías cardiovasculares, incluyendo aumento de los ventrículos e insuficiencia de la válvula mitral. La enfermedad de Fabry también afecta al sistema nervioso periférico, produciendo episodios de dolor urente muy agudo en las extremidades.
La enfermedad de Fabry se produce por una deficiencia en la enzima -galactosidasa A (-Gal A). La patofisiología de la enfermedad de Fabry está bien establecida: debido a una carencia de la enzima lisosomal -galactosidasa A (-Gal A), hay una acumulación de globotriaosilceramida (Gb3) en todo el cuerpo.
Debido al patrón hereditario asociado al cromosoma X de la enfermedad, la mayoría de los pacientes con enfermedad de Fabry son del sexo masculino. Con frecuencia se observan mujeres heterocigotas afectadas gravemente, aunque en las mujeres heterocigotas los síntomas pueden aparecer en una etapa posterior de la vida. Una variante de la enfermedad de Fabry se correlaciona con hipertrofia del ventrículo izquierdo y enfermedad cardiaca. Nakano y col., New Engl. J Med. 333: 288-293 (1995). Se han aislado y secuenciado el ADN y el gen que codifican la -Gal A humana. La -Gal A humana se expresa como un polipéptido de 429 aminoácidos, de los que los 31 aminoácidos N-terminales son el péptido señal. La enzima humana se ha expresado en células de Ovario de Hámster Chino (CHO) (Desnick y col., Patente de Estados Unidos 5.356.804; Ioannou y col., J Cell Biol. 119: 1137 (1992)); células de insecto (Calhoun y col., documento WO 90/11353); y células humanas (Selden y col., Patentes de Estados Unidos 6.083.725 y 6.458.574B1). La terapia de reemplazo enzimático es un procedimiento usado actualmente de tratamiento para la enfermedad de Fabry.
Sumario de la Invención
Mediante la comprensión de la farmacocinética y el perfil de modificación (por ejemplo, modificación de carbohidratos, fosfato o de la sialilación) de la -Gal A humana, los presentes inventores han desarrollado nuevas composiciones farmacéuticas de -Gal A, kits para el tratamiento del déficit de -Gal A, procedimientos de selección y una dosis apropiada de -Gal A para un paciente, y procedimientos para tratar déficits de -Gal A usando dichas composiciones. También se proporcionan procedimientos para evaluar preparaciones de -Gal A, muestras y lotes y similares, por ejemplo, procedimientos de control de calidad y determinación de bioequivalencia, por ejemplo, haciendo referencia a las composiciones de -Gal A descritas en la presente memoria.
Las estrategias de administración y dosificación de -Gal A descritas en la presente memoria reducen la cantidad y coste de -Gal A necesarios para la terapia de reemplazo de -Gal A y también reducen el número necesario de administraciones de dosis.
Por consiguiente, en un aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que incluye una preparación de -galactosidasa A (-Gal A) humana. A dosis inferiores a los niveles de saturación de aclaramiento sérico o plasmático, el aclaramiento sérico de la preparación de -Gal A de la circulación es preferentemente menor de 4 ml/min/kg en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis, más preferentemente menor de aproximadamente 3,5, 3 o 2,5 ml/min/kg, en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis. La preparación de -Gal A puede tener un exponente “b” para la ecuación de escalamiento alométrico para el aclaramiento de la circulación (suero o plasma) en mamíferos, Y=a (PC)b, de al menos 0,85, en la que Y es la velocidad de aclaramiento de -Gal A (ml/min), “a” es una constante no específica y PC es el peso corporal. El exponente “b” preferentemente es al menos 0,88, más preferentemente al menos 0,90 y aún más preferentemente al menos 0,92 o al menos 0,94.
En una realización, la -Gal A se produce a partir de células humanas, por ejemplo, células humanas primarias, por ejemplo, fibroblastos humanos primarios o una línea de células humanas continua. Las células y/o la preparación de -Gal A aislada a partir de las células puede modificarse para proporcionar una preparación de -Gal A con características de glicosilación, fosforilación o sialilación deseables.
En otra realización, la -Gal A se produce a partir de células no humanas, por ejemplo, células CHO. Las células y/o la preparación de -Gal A aislada a partir de las células puede modificarse para proporcionar una preparación de -Gal A con características de glicosilación, fosforilación o sialilación deseables.
En otro aspecto, los presentes inventores describen un kit para el tratamiento de un déficit de -Gal A. El kit incluye
(a) una preparación de glicoproteína -Gal A humana, en la que a dosis inferiores a los niveles de saturación de aclaramiento sérico o plasmático, el aclaramiento sérico de la preparación de -Gal A de la circulación es preferentemente menor de 4 ml/mm/kg en la parte lineal de la curva de área bajo la curva (ABC) frente a la dosis, más preferentemente menor de aproximadamente 3,5, 3 o 2,5 ml/min/kg, en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis, y (b) instrucciones para administrar la preparación a un sujeto que lo necesita.
El kit también pueden incluir instrucciones para administrar una dosis unitaria de la preparación de -Gal A comprendida entre aproximadamente 0,05 mg y 2,0 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto (mg/kg). En algunas realizaciones, el kit incluye instrucciones para administrar una dosis unitaria de la preparación de -Gal A comprendida entre 0,05 y 2,0 mg/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,05 y 1,0 mg/kg, más preferentemente entre aproximadamente 0,05 y 0,5 mg/kg, por ejemplo, y entre 0,05 y menos de 0,3 mg/kg. En una realización, la dosis unitaria es menor de 0,3 mg/kg. Por ejemplo, el kit puede incluir instrucciones para administrar una dosis unitaria de la preparación de -Gal A de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0-8, 0,9 o 1,0 mg por kilogramo de peso corporal.
En otras realizaciones, el kit incluye instrucciones para administrar una dosis unitaria de la preparación de -Gal A comprendida entre aproximadamente 0,1 x 106 U/kg y 10 x 106 U/kg. En algunas realizaciones, el kit incluye instrucciones para administrar una dosis unitaria de la preparación de -Gal A comprendida entre 0,1 x 106 U/kg y 5 x 106 U/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,1 x 106 U/kg y 3 x 106 U/kg. Por ejemplo, el kit puede incluir instrucciones para administrar una dosis unitaria de la preparación de -Gal A de aproximadamente 0,1, 0,2, 0,3, 0,5, 1, 2, 3, 5 o hasta 10 x 106 U/kg.
En algunas realizaciones, el kit también incluye instrucciones para administrar la dosis unitaria no más de una vez cada 7 días. Por ejemplo, las instrucciones pueden incluir instrucciones para administrar la dosis unitaria no más de una vez cada 7 días, 10 días, 14 días, 21 días, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas o 10 semanas.
En otro aspecto, los presentes inventores describen un kit para el tratamiento del déficit de -Gal A. El kit incluye una preparación de glicoproteína -Gal A humana y una o más de las siguientes instrucciones: (a) instrucciones para administrar la preparación a un sujeto que lo necesita a una dosis comprendida entre 0,05 y 2,0 mg/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,05 y 1,0 mg/kg, más preferentemente entre aproximadamente 0,05 y 0,5 mg/kg, por ejemplo, entre 0,05 y menos de 0,3 mg/kg; (b) instrucciones para administrar una dosis unitaria de la preparación de -Gal A comprendida entre 0,1 x 106 U/kg y 10 x 106 U/kg, por ejemplo, entre 0,1 x 106 U/kg y 5 x 106 U/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,1 x 106 U/kg y 3 x 106 U/kg; o (c) instrucciones para administrar la preparación no más de aproximadamente una vez cada 8 semanas, 6 semanas, 4 semanas, 21 días, 14 días, 10 días o 7 días.
Los reactivos de un kit descrito en la presente memoria pueden envasarse en recipientes en cantidades predeterminadas. En la Figura 16 se ilustra un kit que incorpora elementos de la presente invención, designado en general por el número 2. El kit 2 comprende los siguientes elementos principales: un envase 4, una preparación de -Gal A 6 descrita en la presente memoria e instrucciones 8. Opcionalmente, el kit puede incluir un agente adicional
10. El agente adicional puede ser, por ejemplo, un tampón o soluciones farmacéuticas, por ejemplo, para disolver o diluir la preparación de -Gal A 6. Las instrucciones 8 pueden ser, por ejemplo, material impreso sobre cómo administrar la preparación 6 y pueden incluir información sobre una dosificación adecuada. Las instrucciones preferidas comprenden instrucciones para administrar la preparación de -Gal A 6 en una dosis unitaria descrita en la presenta memoria. El envase 4 es una estructura de tipo caja para contener un vial (o un número de viales) que contiene una preparación de -Gal A de la invención 6, instrucciones 8 y, opcionalmente, un vial (o número de viales) que contiene un agente 10. Un experto individual en la materia puede modificar fácilmente el envase 4 para adaptarse a las necesidades individuales.
Los presentes inventores también describen un procedimiento para seleccionar un intervalo de dosis unitarias de -Gal A para el tratamiento de un sujeto que tiene un déficit de -Gal A. El procedimiento incluye: proporcionar el peso corporal de un sujeto, por ejemplo, pesando al sujeto u obteniendo el peso corporal del sujeto a partir del sujeto, a partir de un profesional sanitario que trata al sujeto o a partir de una base de datos; y determinar el valor del intervalo entre 0,05 mg y 2 mg (por ejemplo, entre 0,05 y 0,5 mg o entre 0,05 y menos de 0,3 mg) de la -Gal A por kilogramo de peso corporal del sujeto. El intervalo de dosis unitarias seleccionado puede usarse para seleccionar un régimen de terapia de reemplazo de -Gal A para el sujeto. El procedimiento también puede incluir evaluar en el sujeto uno o más de los niveles basales de -Gal A, por ejemplo, la concentración en suero de -Gal A; la función cardiovascular; la función renal; la función hepática, la edad, y el sexo.
En una realización preferida, la dosis unitaria satura la captación hepática de la -Gal A al tener un valor de Cmáx (concentración máxima en suero después de la infusión del fármaco) mayor de 2 x 10-9 M.
En otro aspecto, los presentes inventores describen un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene o con riesgo de tener un déficit de -Gal A. El procedimiento incluye administrar a un sujeto que lo necesita una preparación de glicoproteína -Gal A humana, en el que a dosis inferiores a los niveles de saturación de aclaramiento sérico o plasmático, el aclaramiento sérico de la preparación de -Gal A después de la infusión intravenosa desde la circulación es preferentemente menor de 4 ml/min/kg en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis, más preferentemente menor de aproximadamente 3,5, 3 o 2,5 ml/min/kg en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis, por ejemplo, una preparación de glicoproteína -Gal A humana descrita anteriormente en la presente memoria. Como se describe en otras partes de la presente memoria, la dosis unitaria administrada preferentemente satura la captación hepática de la -Gal A.
En una realización preferida, la preparación se administra por vía intravenosa, aunque puede formularse para la administración oral, subcutánea, o intratecal, como se describe en otras partes de la presente memoria.
En otro aspecto, los presentes inventores describen un procedimiento para tratar a un sujeto que tiene o con riesgo de déficit de -Gal A. El procedimiento incluye uno o más de (a)-(c): (a) administrar a un sujeto que lo necesita una preparación de glicoproteína -Gal A humana a una dosis unitaria comprendida entre aproximadamente 0,05 y 2,0 mg por kilogramo de peso corporal, preferentemente entre 0,05 y 1,0 mg/kg o entre 0,05 y 0,5 mg/kg, por ejemplo, entre 0,05 y menos de 0,3 mg/kg, por ejemplo, aproximadamente 0,25, 0,20, 0,15 o 0,1 mg por kilogramo de peso corporal del sujeto; (b) administrar a un sujeto que lo necesita una preparación de glicoproteína -Gal A humana a una dosis unitaria de la preparación de -Gal A comprendida entre 0,1 x 106 U/kg y 10 x 106 U/kg, por ejemplo, entre 0,1 x 106 U/kg y 5 x 106 U/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,1 x 106 U/kg y 3 x 106 U/kg; (c) administrar a un sujeto que lo necesita una preparación de glicoproteína -Gal A humana no más de una vez cada 7 días, por ejemplo, no más de una vez cada 10 días,14 días, 21 días, 4 semanas, 6 semanas u 8 semanas. En algunas realizaciones, hay al menos 7, 10, 14, 21, 30 o 60 días entre cada administración. En algunas realizaciones, la preparación se administra durante un periodo de al menos 8, 16, 24, 36 o 48 semanas o incluso mayor, por ejemplo, durante al menos 1, 2 o 3 años.
En una realización, la preparación de glicoproteína -Gal A humana se administra al menos dos veces, preferentemente 3, 4, 5 o 6 veces o más, pero no más de una vez cada 7 días, preferentemente 10 días, más preferentemente 14 días o más, por ejemplo 21 días, 4 semanas, 6 semanas, 7 semanas, 8 semanas o más.
En una realización preferida, la dosis unitaria satura la captación hepática de la -Gal A, para permitir que la -Gal A administrada evite el hígado y esté disponible para otros tejidos en el cuerpo.
En una realización preferida, la preparación se administra por vía intravenosa.
En otro aspecto, los presentes inventores describen una dosis unitaria de -Gal A humana descrita en la presente memoria envasada en un recipiente, por ejemplo, un recipiente de vidrio o plástico o un dispositivo de liberación, por ejemplo una jeringa. La dosis unitaria es equivalente a entre 0,05 y 2 mg/kg, por ejemplo entre 0,05 y 1,0 mg/kg, preferentemente entre 0,05 y 0,5 mg/kg, más preferentemente entre 0,05 y menos de 0,3 mg/kg de peso corporal del sujeto para el que está destinada. La actividad de la preparación de -Gal A generalmente está comprendida entre aproximadamente 2,0 y 4,5 x 106 U/mg. Por ejemplo, el recipiente o dispositivo de liberación puede incluir entre 2,0 y 32,0 mg de -Gal A humana descrita en la presente memoria para una dosis unitaria de adulto, por ejemplo, el recipiente o dispositivo de liberación puede incluir aproximadamente 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25 o 30 mg de -Gal A para una dosis de adulto.
Aunque sin ligarse a ninguna teoría, se cree que las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria pueden eliminarse predominantemente de la sangre a través de receptores de manosa-6-fosfato (M6P). En realizaciones preferidas, menos del 25%, 20%, 16%, 14% (medido entre 40 horas y 50 horas, por ejemplo, aproximadamente 44 horas después de la dosificación) o menos de la preparación de -Gal A, por ejemplo, una preparación descrita en la presente memoria, entra en el hígado tras la administración a un sujeto. A dosis inferiores a los niveles de saturación de aclaramiento sérico o plasmático, el aclaramiento sérico de la preparación de -Gal A de la circulación preferentemente es menor de 4 ml/min/kg en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis, más preferentemente menor de aproximadamente 3,5, 3 o 2,5 ml/min/kg, en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis. Una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria presenta una curva de saturación hepática como se indica a continuación:
Mg -Gal A/hígado = 2,1 mg (1-e-Dosis/4,7),
en la que la dosis es la dosis total (en mg) administrada a un paciente típico de 75 kg. El coeficiente de variación
(CV) puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,40. (Las dosis y cantidades se ajustarían de acuerdo con esto para pacientes de mayores o menores dimensiones).
En algunas realizaciones, la preparación de -Gal A de las composiciones, procedimientos y kits descritos en la presente memoria se aísla a partir de células humanas modificadas por ingeniería genética para producir -Gal A. En otras realizaciones, la preparación de -Gal A puede aislarse a partir de células no humanas (por ejemplo, células CHO), en las que la célula se ha modificado por ingeniería genética para producir -Gal A. En algunas realizaciones, una o más de: la construcción de expresión de -Gal A, las células humanas o no humanas o la -Gal A aislada a partir de las células humanas o no humanas puede modificarse para proporcionar una preparación de -Gal A con glicosilación alterada, por ejemplo, estructuras alteradas de glicano, sialilación o fosfato. Por ejemplo, una célula no humana modificada por ingeniería genética para producir -Gal A humana (o la -Gal A purificada) puede modificarse para imitar las características de glicosilación de la -Gal A producida en células humanas. En una realización, las células pueden modificarse, por ejemplo, por ingeniería genética para expresar una o más enzimas modificadoras de -Gal A exógenas, por ejemplo, una glicosidasa, glucosil transferasa, fosforil transferasa o sialil transferasa. En una realización, la secuencia codificante de -Gal A puede modificarse para tener más o menos (preferentemente más) sitios de glicosilación. En otra realización, las células pueden exponerse a uno o más inhibidores u otros moduladores de enzimas de glicosilación, por ejemplo, kifunensina o swainsonina. En otra realización, la -Gal A, una vez aislada a partir de las células, puede modificarse, por ejemplo, escindirse o modificarse químicamente (por ejemplo, cambiando el número de moles de ácido siálico y/o manosa-6-fosfato por mol de -Gal A), por ejemplo, con un inhibidor de fosfatasa, quinasa, glicosidasa, glucosil transferasa, fosforil transferasa o sialil transferasa.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria se enriquece en estructuras de glicano neutras, monosialiladas y disialiladas (combinadas) con respecto a estructuras con un mayor grado de sialilación tales como estructuras trisialiladas y tetrasialiladas. Por ejemplo, una preparación de -Gal A preferida tiene uno o más de: (a) al menos aproximadamente un 22% de glicanos neutros, por ejemplo, al menos aproximadamente un 25% o 30% de glicanos neutros; (b) al menos aproximadamente un 15%, 20% o 25% de glicanos monosialilados; (c) al menos aproximadamente un 35%, preferentemente al menos aproximadamente un 40%, 45% o 50% de glicanos neutros y monosialilados combinados; (d) al menos aproximadamente un 75%, 76%, 78% o más glicanos neutros, mono- y disialilados combinados; y (e) menos de aproximadamente un 35%, preferentemente menos de aproximadamente un 25%, 20%, 18% o aproximadamente un 15% de estructuras de glicano tri- y tetrasialiladas combinadas.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene, en promedio, más de un glicano complejo por monómero, preferentemente al menos un 50% de glicanos complejos por monómero, por ejemplo, una media de 1,5 glicanos complejos o más por monómero.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene al menos un 5%, preferentemente al menos un 7%, 10% o 15% de glicanos neutros.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene menos de un 45% de glicanos fosforilados.
Por ejemplo, la preparación tiene menos de aproximadamente un 35%, 30%, 25%, o 20% de glicanos fosforilados.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene una proporción total de glicanos sialilados mayor de aproximadamente un 45%, por ejemplo, mayor de un 50% o 55%.
En una realización preferida, la relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en la preparación de -Gal (en una base de mol por mol) es mayor que 1,5 a 1, preferentemente mayor que 2 a 1, más preferentemente mayor que 3 a 1; y aún más preferentemente mayor que 3,5 a 1 o superior.
En una realización, la relación en porcentaje entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados es mayor que 1, preferentemente mayor que 1,5, y más preferentemente mayor que 2, por ejemplo, mayor que aproximadamente 2,5
o 3.
Las composiciones de -Gal A y procedimientos descritos en la presente memoria son útiles para el tratamiento de individuos con un déficit de -Gal A. Las composiciones de -Gal A y procedimientos descritos en la presente memoria proporcionan tratamientos que son eficaces en cuando al coste y minimizan la dosificación y frecuencia requerida de administraciones de -Gal A.
En otro aspecto, la invención se refiere a diversos procedimientos para evaluar, por ejemplo, analizar, seleccionar o clasificar una preparación, muestra, lote u otra composición de -Gal A. Los procedimientos pueden usarse para determinar los parámetros estructurales y/o biológicos (por ejemplo, la composición de carbohidratos, el perfil de fosfatos, el perfil de sialilación, la distribución tisular o las características de aclaramiento sérico) de la preparación o muestra. A modo de ejemplo, los procedimientos se usan para determinar si la preparación o muestra tiene una o más propiedades físicas o funcionales de una -Gal A descrita en la presente memoria. Por ejemplo, se puede comparar una composición de -Gal A de una muestra con una composición de -Gal A de referencia, por ejemplo, una composición de -Gal A humana descrita en la presente memoria, por ejemplo, una -Gal A humana que tiene propiedades farmacocinéticas o biológicas deseables, tal como una -Gal A humana preparada a partir de células humanas, por ejemplo, fibroblastos humanos. Los procedimientos son útiles, entre otras cosas, para estudios de control de calidad y/o bioequivalencia de preparaciones de -Gal A.
En un aspecto, el procedimiento incluye obtener o proporcionar una preparación de -Gal A de ensayo y determinar si la preparación tiene al menos una (preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres o más, por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis o siete) de las siguientes características estructurales: (1) está enriquecida en estructuras de glicano neutras, monosialiladas y disialiladas (combinadas) en relación con estructuras con un mayor grado de sialilación, por ejemplo, tiene (i) al menos aproximadamente un 22% de glicanos neutros, por ejemplo, al menos aproximadamente un 25% o 30% de glicanos neutros, (ii) al menos aproximadamente un 15%, 20% o 25% de glicanos monosialilados, (iii) al menos aproximadamente un 35%, preferentemente al menos aproximadamente un 40%, 45% o 50% de glicanos neutros y monosialilados combinados, y/o (iv) al menos aproximadamente un 75%, 76%, 78% o más glicanos neutros, mono- y disialilados combinados; (2) tiene menos de aproximadamente un 35%, preferentemente menos de aproximadamente un 25%, 20%, 18% o aproximadamente un 15% de estructuras de glicano tri- y tetrasialiladas combinadas; (3) tiene al menos un 50%, preferentemente al menos un 67% de glicanos complejos; (4) tiene menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados, preferentemente menos de aproximadamente un 35%, más preferentemente menos de aproximadamente un 30%, 25% o 20% de glicanos fosforilados; (5) tiene más de aproximadamente un 45%, preferentemente más de aproximadamente un 50 o 55% de glicanos sialilados; (6) tiene una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1, preferentemente mayor que aproximadamente 2 a 1, más preferentemente mayor que aproximadamente 3 a 1 o 3,5 a 1; y (7) tiene una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor que 1, preferentemente mayor que 1,5, más preferentemente mayor que aproximadamente 2, 2,5 o 3; y/o tiene una o más de las siguientes características biológicas o farmacocinéticas: (a) el aclaramiento sérico desde la circulación humana es menor de 4 ml/min/kg en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis, más preferentemente menor de aproximadamente 3,5, 3 o 2,5 ml/min/kg, en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis; (b) la preparación preferentemente se dirige a células del endotelio capilar/vascular, células epiteliales de los glomérulos renales (podocitos) y células mesangiales glomerulares, células endoteliales renales, miocitos cardiacos, células del endotelio hepático, células sinusoidales hepáticas, células pulmonares y/o células neurales; y (c) no se capta por los hepatocitos del hígado.
Una preparación de ensayo que tenga una o más de las características mencionadas anteriormente puede seleccionarse, clasificarse, formularse, envasarse o pasarse a otro procesamiento aguas abajo. Por ejemplo, dicha preparación puede seleccionarse para un uso farmacéutico particular. La posesión por la preparación de ensayo de una o más (preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres o más, por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis o siete) de los parámetros estructurales mencionados anteriormente (1)-(7) se correlaciona positivamente con (y, por lo tanto, puede usarse para predecir) parámetros farmacocinéticos o una actividad biológica deseable, por ejemplo, una o más de las características biológicas o farmacocinéticas (a)-(c). La correlación o información predictiva puede usarse, por ejemplo, para diseñar una preparación terapéutica de -Gal A para un paciente específico o una variante específica de la enfermedad de Fabry (por ejemplo, variante renal de la enfermedad de Fabry o variante cardiaca de la enfermedad de Fabry). La correlación o información de predicción puede registrarse (por ejemplo, en un medio impreso o un medio legible por ordenador).
En algunas realizaciones, una actividad biológica o parámetro farmacocinético de la muestra o preparación de -Gal A de ensayo se predice a partir de su firma de carbohidratos. En otras realizaciones, una actividad biológica o parámetro farmacocinético de la preparación o muestra se determina experimentalmente.
El resultado de la determinación (que puede ser, por ejemplo, un valor para cualquiera de: la cantidad de glicanos neutros, mono-, di-, tri- o tetrasialilados o combinaciones de los mismos; la cantidad de glicanos complejos; la cantidad de glicanos fosforilados; la cantidad de glicanos sialilados; la relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol, o la relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados) preferentemente se introduce en un registro, por ejemplo, un registro impreso o legible por ordenador, tal como un registro o conjunto de datos de laboratorio. El registro puede incluir otra información tal como un identificador de muestra específico para la preparación, una fecha, un operario del procedimiento, o información sobre la actividad enzimática, fuente, procedimiento de purificación o actividad biológica de la preparación. El registro puede usarse para almacenar o proporcionar información sobre la preparación de ensayo. Por ejemplo, el registro puede usarse para proporcionar información (por ejemplo, al gobierno, a un profesional sanitario, a una compañía de seguros o paciente) relacionada con la preparación de -Gal A o su uso, por ejemplo en forma de material de información, de comercialización o de instrucciones, por ejemplo, material impreso o material legible por ordenador (por ejemplo, una etiqueta). El registro
o información derivada del registro puede usarse, por ejemplo, para identificar la preparación de ensayo como adecuada o no adecuada para el uso farmacéutico o terapéutico. Por ejemplo, una preparación de ensayo de -Gal A que, según se ha determinado, tiene uno o más de los parámetros estructurales (1)-(7) mencionados anteriormente puede identificarse como una preparación que tiene parámetros farmacocinéticos o una actividad biológica deseable (por ejemplo, los parámetros (a)-(c) mencionados anteriormente).
Los procedimientos descritos en la presente memoria también pueden usarse para comparar la variación de un lote a otro de una preparación de -Gal A. En este caso, puede evaluarse cualquiera de los parámetros estructurales o farmacocinéticos descritos anteriormente en la presente memoria con respecto a una pluralidad de lotes de -Gal A, por ejemplo, diferentes lotes fabricados a partir del mismo protocolo de purificación. En una realización preferida, el procedimiento incluye seleccionar un lote con menos de un intervalo de variación preseleccionado (por ejemplo, menos de un 10%, preferentemente menos de un 5%, más preferentemente menos de un 2,5% o menos variación) de uno o más de los parámetros biológicos o estructurales mencionados anteriormente (1)-(7) o (a)-(c). Cuando se analizan múltiples preparaciones (por ejemplo, diferentes lotes de una preparación de -Gal A), la introducción de los resultados de las determinaciones en un registro puede incluir la generación de un conjunto de datos de las determinaciones, por ejemplo, un conjunto de datos impreso o legible por ordenador. El conjunto de datos puede incluir una correlación de una característica estructural determinada con un parámetro farmacocinético o actividad biológica evaluada experimentalmente o predicha.
La muestra de -Gal A a ensayar se puede obtener a partir de cualquier célula, pero preferentemente procede de una célula de mamífero, por ejemplo, una célula humana o no humana, tal como una célula CHO. En algunas realizaciones, la firma de carbohidratos de la muestra se ha modificado, por ejemplo, por procedimientos reconocidos en la técnica, antes de realizar la etapa de determinación, por ejemplo, por glicoingeniería, por ejemplo, como se describe en la presente memoria, por tratamiento con una enzima de glicosidación tal como una glucosil transferasa o glicosidasa, o tratamiento de la célula o preparación con una fosforil transferasa, sialil transferasa, inhibidor de fosfatasa, quinasa o inhibidor de la glicosilación, o por co-expresión en la célula (por ejemplo, mediante co-transfección) de un ADN que codifica cualquiera de las enzimas anteriores u otras enzimas modificadoras de carbohidratos.
La firma de carbohidratos de la muestra puede obtenerse por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAE), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o espectroscopía de masas. La evaluación de la firma de carbohidratos puede incluir la evaluación de la composición, carga, fosforilación y/o sialilación de los glicanos de la preparación.
En otro aspecto, la solicitud se refiere a un procedimiento para producir una preparación de -Gal A humana (por ejemplo, una preparación de -Gal A mejorada). El procedimiento incluye proporcionar una preparación de -Gal A humana recogida a partir de una célula; y modificar la estructura de glicanos de la preparación de -Gal A para ajustarse a uno o más (preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres o más, por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis o siete) de los siguientes parámetros: (1) enriquecimiento en estructuras de glicano neutras, monosialiladas y disialiladas (combinadas) con respecto a estructuras con un grado de sialilación mayor, por ejemplo, tiene (i) al menos aproximadamente un 22% de glicanos neutros, por ejemplo, al menos aproximadamente un 25% o 30% de glicanos neutros, (ii) al menos aproximadamente un 15%, 20% o 25% de glicanos monosialilados, (iii) al menos aproximadamente un 35%, preferentemente al menos aproximadamente un 40%, 45% o 50% de glicanos neutros y monosialilados combinados, y/o (iv) al menos aproximadamente un 75%, 76%, 78% o más glicanos neutros, mono- y disialilados combinados; (2) menos de aproximadamente un 35%, preferentemente menos de aproximadamente un 25%, 20%, 18% o aproximadamente un 15% de estructuras de glicano tri- y tetrasialiladas combinadas; (3) al menos un 50%, preferentemente al menos un 67% de glicanos complejos; (4) menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados, preferentemente menos de aproximadamente un 35%, más preferentemente menos de aproximadamente un 30%, 25% o 20% de glicanos fosforilados; (5) más de aproximadamente un 45%, preferentemente más de aproximadamente un 50 o 55% de glicanos sialilados; (6) una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1, preferentemente mayor que aproximadamente 2 a 1, más preferentemente mayor que aproximadamente 3 a 1 o 3,5 a 1; y (7) una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor que 1, preferentemente mayor que 1,5, más preferentemente mayor que aproximadamente 2, 2,5 o 3. La estructura de glicano puede modificarse por procedimientos conocidos en la técnica, por ejemplo, por glicoingeniería (por ejemplo, por modificación de la célula por ingeniería genética para producir una -Gal A humana que tiene un sitio de glicosilación no natural; y/o modificación de la célula por ingeniería genética para producir una glucosidasa, glucosil transferasa, fosforil transferasa, fosfatasa o sialil transferasa); por aislamiento selectivo de glicoformas durante el procedimiento de purificación de -Gal A; por tratamiento de la célula o preparación con una enzima modificadora de carbohidratos; o tratamiento de la célula o preparación con un inhibidor de la glicosilación, por ejemplo, kifunensina y/o por coexpresión en la célula (por ejemplo, mediante co-transfección) de un ADN que codifica cualquiera de las enzimas anteriores u otras enzimas modificadoras de carbohidratos.
En una realización preferida, el procedimiento incluye la etapa de analizar (por ejemplo, ensayar) uno o más parámetros de la firma de carbohidratos, actividad biológica o parámetro farmacocinético de la preparación de -Gal A después de la modificación.
La invención también se refiere al uso en el tratamiento de un sujeto, por ejemplo, un ser humano. El procedimiento incluye: proporcionar u obtener un panel de dos o más preparaciones de -Gal A que tienen diferentes características de glicano; y seleccionar una preparación de -Gal A que tiene una firma de carbohidratos que se ajusta a uno o más (preferentemente al menos dos, más preferentemente al menos tres o más, por ejemplo, al menos cuatro, cinco, seis o siete) de los parámetros (1)-(7) y/o (a)-(c) mencionados anteriormente para tratar al sujeto.
El procedimiento también puede incluir administrar una o más dosis de una cantidad terapéuticamente eficaz de la preparación de -Gal A seleccionada al sujeto. El sujeto puede evaluarse antes, durante y/o después de la administración. Por ejemplo, en el sujeto puede evaluarse la distribución tisular o aclaramiento sérico de la preparación de -Gal A, por ejemplo, puede evaluarse de forma repetida a lo largo del tiempo. La dosis de la preparación después puede ajustarse de acuerdo con el resultado de la evaluación. El sujeto también puede evaluarse o supervisarse con respecto al estado, por ejemplo, el estado clínico, en respuesta a la administración de la preparación de -Gal A.
Diferentes firmas de carbohidratos, por ejemplo, cada parámetro (1) a (7) o diferentes combinaciones de parámetros (1)-(7) pueden correlacionarse con tener propiedades farmacocinéticas u otras propiedades biológicas deseables para diferentes poblaciones, por ejemplo, poblaciones que difieren por estadio o tipo de enfermedad (por ejemplo, enfermedad de Fabry cardiaca frente a tipo renal), edad, sexo, origen étnico o genotipo.
Por “déficit de -Gal A” se entiende cualquier déficit en la cantidad o actividad de esta enzima en un paciente, que produce acumulaciones anormales de glicolípidos neutros (por ejemplo, globotriaosilceramida) principalmente en células del endotelio capilar, células epiteliales de los glomérulos renales (podocitos) y células mesangiales glomerulares, y/o miocitos cardiacos. Los depósitos de este material pueden producir dolor neuropático severo (por ejemplo, acroparestesia y dolor lacerante), enfermedad renal y cardiovascular grave y/o ictus. La acumulación de glicolípidos puede inducir síntomas severos como los observados típicamente en hombres que padecen la enfermedad de Fabry. Como alternativa, la acumulación puede inducir síntomas relativamente leves, como los que pueden verse algunas veces en algunas mujeres heterocigotas portadoras del gen defectuoso. Los individuos afectados tienen una esperanza de vida muy acortada; la muerte normalmente se produce por complicaciones renales, cardiacas y/o cerebrovasculares aproximadamente en la cuarta y quinta décadas de la vida.
Una “firma de carbohidratos” de una preparación de -Gal A es una o más características de identificación de la estructura de glicano de una preparación o muestra dada de -Gal A. La firma de carbohidratos puede ser cualitativa
o cuantitativa. Por ejemplo, una firma de carbohidratos de una preparación de -Gal A puede incluir una o más de las siguientes características de identificación: (a) el nivel relativo, el intervalo en porcentaje o valor específico de glicanos complejos frente a glicanos de alto contenido de manosa o híbridos; (b) el nivel relativo, intervalo en porcentaje o valor específico de estructuras de glicano neutras y sialiladas, por ejemplo, monosialiladas, disialidadas, trisialiladas y tetrasialiladas; (c) el nivel relativo, intervalo en porcentaje o valor específico de glicanos fosforilados o no fosforilados; (d) el nivel relativo, intervalo en porcentaje o valor específico de glicanos sialilados; (e) el perfil relativo o carga específica de los glicanos de la preparación; (f) la relación relativa o específica de un tipo de monosacárido cargado con respecto a otro, por ejemplo, la relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato; o la relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados.
Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una representación de la secuencia de ADNc de -Gal A, incluyendo la secuencia que codifica el péptido señal (SEC ID Nº: 1).
La FIG. 2 es una representación de la secuencia de aminoácidos de -Gal A humana (SEC ID Nº: 2).
La FIG. 3A es un mapa esquemático de pGA213C. La FIG. 3B es una representación esquemática de la construcción de dirección, pGA213C, y recombinación homóloga con el locus de -Gal A endógeno. pGA213C se representa como secuencias de dirección alineadas encima de secuencias correspondientes en el locus de -Gal A del cromosoma X. Las posiciones relativas al codón de iniciación de metionina, ATG, se indican por los números encima de los mapas lineales. La unidad de activación que contiene dhfr murina, neo bacteriano y promotor de CMV/secuencias intrón de aldolasa se muestra encima de la posición (-221), en la que se insertaron por clonación de ADN. Las secuencias codificantes de -Gal A se indican por los recuadros sombreados. Las secuencias genómicas no codificantes de -Gal A se indican por recuadros ligeramente sombreados. Las cabezas de flecha grandes indican la dirección de transcripción para la expresión de dhfr y neo.
La FIG. 4 es una cromatografía que muestra glicanos liberados a partir de -Gal A obtenida en células humanas (Replagal™) frente a -Gal A obtenida en células CHO (Fabrazyme™). Las dos preparaciones se analizaron usando HPAE-PAD en un Dionex BioLC Carbohydrate System. Los perfiles de glicano indican que hay diferencias significativas en las cadenas de glicano de Replagal™ (superior) y Fabrazyme™ (inferior). Fabrazyme™ está enriquecido en estructuras fosforiladas (picos que eluyen a 65-69 minutos) y estructuras con un mayor grado de sialilación (estructuras tetrasialiladas que eluyen a los 56-60 minutos y estructuras trisialiladas que eluyen a los 51-55 minutos) en comparación con Replagal™. Replagal™ está enriquecido en estructuras neutras (picos a 33-36 minutos), monosialiladas (picos a 39-44 minutos) y disialiladas (picos a 45-49 minutos).
La FIG. 5 es un gráfico que muestra la internalización de -Gal A obtenida en células humanas (Replagal™) y -Gal A obtenida en células CHO (Fabrazyme™) en las células. Se incubaron fibroblastos humanos normales en placas de cultivo de múltiples pocillos durante 6 horas en ausencia (control, no mostrado) o presencia de Replagal™ o Fabrazyme™. Esta internalización se puede inhibir por manosa-6-fosfato, indicando que la internalización predominantemente es a través de receptores de manosa-6-fosfato. Los resultados indican que Replagal™ y Fabrazyme™ no se internalizan de forma comparable por los fibroblastos. Fabrazyme™ se elimina más rápidamente que Replagal™ por internalización mediada por el receptor de manosa-6 fosfato.
La FIG. 6 muestra las masas moleculares de -Gal A obtenida en células humanas (Replagal™) (superior) y -Gal A obtenida en células CHO (Fabrazyme™) (inferior) determinadas por espectroscopía de masas MALDITOF. El máximo del pico ancho principal está a 50.775 y 50.705 Da, respectivamente, coherentes con el peso molecular esperado del monómero glicosilado. Está presente un saliente principal a aproximadamente 48.071 Da y 47.667 Da, que representa las glicoformas de menor peso molecular para Replagal™ y Fabrazyme™, respectivamente. El saliente principal, que corresponde a las glicoformas de menor peso molecular, es mucho más evidente en el especto de Fabrazyme™.
La FIG. 7 es un perfil de carga de los glicanos liberados a partir de -Gal A obtenida en células humanas (Replagal™) (inferior) y -Gal A obtenida en células CHO (Fabrazyme™) (superior). Se obtuvieron glicanos con una sonda fluorescente y se compararon por cromatografía de intercambio iónico en una columna GlycoSep™
C. Los resultados muestran que Replagal™ tiene una mayor proporción de glicanos neutros y mono-cargados y Fabrazyme™ tiene una mayor proporción de glicanos tri-cargados.
La FIG. 8 es un cromatograma de Fabrazyme™ (superior) y Replagal™ (inferior) analizado por HPLC de fase inversa usando una columna de fase inversa C4 (Vydac). Se muestran cromatogramas obtenidos a 214 nm. El saliente principal, que corresponde a las glicoformas de menor peso molecular, es mucho más pronunciado en Fabrazyme™.
La FIG. 9 es un gráfico que muestra la concentración en suero (U/ml) de -Gal A (Replagal™) obtenida en células humanas procedentes de mono Cynomolgus dosificado IV a 1 mg/kg.
La FIG. 10 es un gráfico que muestra la proporcionalidad de la dosis de Cmáx en modelos animales de -Gal A (Replagal™) obtenida en células humanas.
La FIG. 11 es un gráfico que muestra la concentración en plasma de Replagal™ (U/ml) después de la infusión de 0,2 mg/kg en un sujeto humano.
La FIG. 12 es un gráfico que muestra la proporcionalidad de la dosis de Cmáx en seres humanos frente a mono de -Gal A (Replagal™) obtenida en células humanas.
La FIG. 13 es un gráfico que muestra la proporcionalidad de la dosis del área bajo la curva (ABC) en animales y seres humanos para -Gal A (Replagal™) obtenida en células humanas.
La FIG. 14 es un gráfico que muestra la distribución hepática frente a la dosis en seres humanos de una preparación de -Gal A (Replagal™) obtenida en células humanas.
La FIG. 15 es un gráfico que muestra la concentración plasmática de Replagal™ (U/ml) después de la infusión a 0,2 mg/kg en un sujeto humano del sexo masculino y del sexo femenino.
La FIG. 16 es un dibujo esquemático de un kit que contiene una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria envasada en un vial e instrucciones para administrar la preparación.
Descripción detallada de la invención
Introducción
Se ha descubierto que la -Gal A humana puede fabricarse con modificaciones (por ejemplo, en la estructura de carbohidratos, por ejemplo, glicano; modificaciones de fosfato o sialilación) que dan como resultado una preparación de -Gal A humana que tiene propiedades farmacocinéticas que son deseables para una terapia de reemplazo enzimático para el déficit de -Gal A. Por ejemplo, una preparación de -Gal A humana producida a partir de células humanas modificadas por ingeniería genética para producir -Gal A tiene un exponente “b” para la ecuación de escalamiento alométrico para el aclaramiento desde la circulación en seres humanos, Y = a(PC)b, de al menos 0,85 (preferentemente hasta 0,92), en la que Y es la velocidad de aclaramiento de -Gal A (ml/min), “a” es una constante no específica y PC es el peso corporal. Dicha preparación de -Gal A, como se describe en la presente memoria, puede captarse predominantemente por receptores de M6P y tiene un aclaramiento sérico menos rápido que el de la -Gal A humana producida en células no humanas, por ejemplo células CHO. Por consiguiente, las composiciones farmacéuticas y kits para el tratamiento del déficit de -Gal A descritos en la presente memoria incluyen preparaciones de -Gal A tales que se administran en una dosis unitaria sustancialmente menor que la que se usa actualmente en la técnica. Por ejemplo, en algunas realizaciones, las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria se administran en una dosis unitaria comprendida entre 0,05 mg y 2,0 mg por kilogramo de peso corporal (mg/kg), preferentemente entre 0,05 y 5 mg/kg, más preferentemente entre 0,05 y 0,3 mg/kg (por ejemplo, a aproximadamente 0,1, 0,2, 0,25, 0,3, 0,4 o 0,5 mg/kg). La dosis unitaria puede estar, por ejemplo, comprendida entre 0,1 x 106 U/kg y 10 x 106 U/kg. En algunas realizaciones, la dosis unitaria de la preparación de -Gal A está comprendida entre 0,1 x 106 U/kg y 5 x 106 U/kg, preferentemente entre aproximadamente 0,1 x 106 U/kg y 3 x 106 U/kg. En otras realizaciones, las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria se administran no más de una vez cada 7 días, por ejemplo, una vez cada 10 días, 14 días o 21 días, o una vez cada 4, 5, 6, 7 u 8 semanas. Para algunos pacientes, es posible una dosificación incluso menos frecuente, por ejemplo, una vez cada 9, 10, 11 o 12 semanas o más.
Se cree que la farmacocinética deseable se debe al menos en parte a los patrones de glicosilación de la preparación de -Gal A. Los patrones de glicosilación requeridos para la farmacocinética deseable de la -Gal A humana (por ejemplo, al menos un 50% de glicanos complejos por monómero de -Gal A, en promedio; una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato (en una base de mol por mol) mayor de 1,5 a 1, preferentemente mayor de 2 a 1, más preferentemente mayor de 3 a 1, y aún más preferentemente mayor de 3,5 a 1 o superior) pueden conseguirse mediante varios procedimientos conocidos en la técnica. Ciertas realizaciones representativas se resumen y describen con más detalle más adelante.
Las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria pueden producirse en cualquier célula (una célula de producción de -Gal A) para el tratamiento de la enfermedad de Fabry. En algunas realizaciones, las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria usan -Gal A humana producida usando técnicas de ingeniería genética convencionales (basadas en la introducción del gen de -Gal A clonado o ADNc en una célula huésped) o activación de genes, descrita con más detalle más adelante. La -Gal A humana puede producirse en células humanas, que proporcionan las modificaciones de carbohidratos que son importantes para la actividad farmacocinética de la enzima.
Sin embargo, también puede producirse -Gal A humana en células no humanas, por ejemplo células CHO. Si la -Gal A se produce en células no humanas, pueden modificarse uno o más de: la construcción de expresión de -Gal A, las células no humanas o la -Gal A aislada a partir de las células no humanas, por ejemplo, como se describe en la presente memoria más adelante, para proporcionar preparaciones de -Gal A que tengan un perfil de glicosilación que dé como resultado propiedades farmacocinéticas deseables.
Células adecuadas para la producción de -Gal A humana
Puede obtenerse -Gal A humana purificada a partir de células cultivadas, preferentemente células modificadas genéticamente, por ejemplo, células humanas modificadas genéticamente u otras células de mamífero, por ejemplo, células CHO. También pueden usarse células de insecto.
Cuando las células se van a modificar genéticamente para los fines de tratamiento de la enfermedad de Fabry, las células pueden modificarse por procedimientos convencionales de ingeniería genética o por activación de genes.
De acuerdo con procedimientos convencionales, una molécula de ADN que contiene una secuencia de ADN genómico o ADNc de -Gal A puede estar contenida dentro de una construcción de expresión e introducirse por transfección en células primarias, secundarias o inmortalizadas por procedimientos convencionales que incluyen, pero sin limitación, transfección mediada por liposomas, polibreno o DEAE dextrano, electroporación, precipitación con fosfato cálcico, microinyección o microproyectiles dirigidos por velocidad (véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.048.729).
Como alternativa, se puede usar un sistema que suministra la información genética mediante un vector viral. Los virus que se sabe que son útiles para la transferencia de genes incluyen adenovirus, virus adenoasociados, virus del herpes, virus de las paperas, poliovirus, retrovirus, virus Sindbis y vaccinia virus tales como virus de la viruela de los canarios.
Como alternativa, las células pueden modificarse usando un enfoque de activación génica (“AG”), por ejemplo como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 5.641.670; Patente de Estados Unidos Nº 5.733.761; Patente de Estados Unidos Nº 5.968.502; Patente de Estados Unidos Nº 6.200.778; Patente de Estados Unidos Nº 6.214.622; Patente de Estados Unidos Nº 6.063.630; Patente de Estados Unidos Nº 6.187.305; Patente de Estados Unidos Nº 6.270.989; y Patente de Estados Unidos Nº 6.242.218. La -Gal A obtenida por activación génica se denomina en la presente memoria GA-GAL (Selden y col., Patentes de Estados Unidos Nº 6.083.725 y 6.458.574B1).
Por consiguiente, se entiende que la expresión “modificado genéticamente”, como se usa en la presente memoria haciendo referencia a células, incluye células que expresan un producto génico particular después de la introducción de una molécula de ADN que codifica el producto génico y/o que incluye elementos reguladores que controlan la expresión de una secuencia codificante del producto génico. La molécula de ADN puede introducirse por dirección a genes o recombinación homóloga, es decir, introducción de la molécula de ADN en un sitio genómico particular. La recombinación homóloga puede usarse para reemplazar el propio gen defectuoso (el gen de -Gal A defectuoso o una parte del mismo podría reemplazarse en las propias células de un paciente con enfermedad de Fabry con el gen entero o una parte del mismo).
Como se usa en la presente memoria, la expresión “célula primaria” incluye células presentes en una suspensión de células aisladas a partir de una fuente de tejido de un vertebrado (antes de cultivarse en placas, es decir, de unirse a un sustrato de cultivo de tejidos tal como una placa o matraz), células presentes en un explante derivado de un tejido, los dos tipos previos de células cultivadas por primera vez y suspensiones celulares derivadas de esas células cultivadas.
“Células secundarias” se refiere a células en todas las etapas posteriores de cultivo. Es decir, la primera vez que una célula primaria cultivada se retira del sustrato de cultivo y se vuelve a cultivar (se somete a pases), se denomina célula secundaria, así como todas las células en los pases posteriores.
Un “cepa celular” consiste en células secundarias que se han sometido a pases una o más veces; presentan un número finito de duplicaciones de población medias en cultivo; presentan las propiedades de crecimiento dependiente de anclaje inhibido por contacto (con la excepción de las células propagadas en cultivo de suspensión); y no están inmortalizadas.
Por “célula inmortalizada” o “línea celular continua” se entiende una célula de una línea celular establecida que presenta una duración aparentemente ilimitada en cultivo.
Los ejemplos de células primarias o secundarias incluyen fibroblastos, células epiteliales que incluyen células epiteliales intestinales y mamarias, células endoteliales, elementos formados de la sangre incluyendo linfocitos y células de médula ósea, células gliales, hepatocitos, queratinocitos, células musculares, células neurales o los precursores de estos tipos celulares. Los ejemplos de líneas celulares humanas inmortalizadas útiles en los presentes procedimientos incluyen, pero sin limitación, células de Melanoma de Bowes (Nº de Acceso de la ATCC CRL 9607), células de Daudi (Nº de Acceso de la ATCC CCL 213), células HeLa y derivados de células HeLa (Nº de Acceso de la ATCC CCL 2, CCL 2.1 y CCL 2.2), células HL-60 (Nº de Acceso de la ATCC CCL 240), células HT1080 (Nº de Acceso de la ATCC CCL 121), células Jurkat (Nº de Acceso de la ATCC TIB 152), células de carcinoma KB (Nº de Acceso de la ATCC CCL 17), células de leucemia K-562 (Nº de Acceso de la ATCC CCL 243), células de cáncer de mama MCF-7 (Nº de Acceso de la ATCC BTH 22), células MOLT-4 (Nº de Acceso de la ATCC 1582), células Namalwa (Nº de Acceso de la ATCC CRL 1432), células Raji (Nº de Acceso de la ATCC CCL 86), células RPMI 8226 (Nº de Acceso de la ATCC CCL 155), células U-937 (Nº de Acceso de la ATCC CRL 15 93), células WI-3 8VAI3 de la sublínea 2R4 (Nº de Acceso de la ATCC CLL 75.1), células CCRF-CEM (Nº de Acceso de la ATCC CCL 119) y células de carcinoma de ovario 2780AD (Van der Blick y col., Cancer Res. 48: 5927-5932, 1988), así como células de heterohibridomas producidas por fusión de células humanas y células de otras especies.
Después de la modificación genética de células humanas para producir una células que secreta -Gal A, puede generarse una cepa de células clonales consistente esencialmente en una pluralidad de células humanas primarias cultivadas genéticamente idénticas o, cuando las células están inmortalizadas, una línea celular clonal consistente esencialmente en una pluralidad de células humanas inmortalizadas genéticamente idénticas. En una realización, las células de la cepa de células clonales o la línea de células clonales son fibroblastos. En una realización preferida, las células son fibroblastos humanos secundarios, por ejemplo, células BRS-11. El Ejemplo 1 proporciona una pauta adicional sobre la producción de células modificadas por ingeniería genética para producir -Gal A.
Después de la modificación genética, las células se cultivan en condiciones que permiten la producción y secreción de -Gal A. La proteína se aísla a partir de las células cultivadas recogiendo el medio en el que crecen las células, y/o lisando las células para liberar sus contenidos, y después aplicando técnicas de purificación de proteínas.
Aumento de la semivida circulatoria, la captación celular y/o la dirección de -Gal A a tejidos apropiados
Los datos descritos en la presente memoria muestran que puede obtenerse -Gal A humana con modificaciones (por ejemplo, modificaciones en carbohidratos, fosfato o sialilación) que dan como resultado propiedades farmacocinéticas de la enzima que son deseables para uso en la terapia de reemplazo enzimático para un déficit de -Gal A. Un procedimiento para fabricar dichas preparaciones de -Gal A humana es producir -Gal A a partir de células humanas.
Hay diferencias en las características de glicosilación de células humanas y no humanas (por ejemplo, células CHO) de tal forma que la producción de -Gal A (o, de hecho, de cualquier glicoproteína) a partir de células humanas necesariamente da como resultado una proteína estructuralmente diferente que la producida en células CHO. Aunque sin ligarse a ninguna teoría, se cree que estas diferencias son importantes para la farmacocinética deseable de las preparaciones de -Gal A humana en las composiciones y procedimientos descritos en la presente memoria. Sin embargo, también pueden producirse preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria a partir de células no humanas, en las que se modifican las células, la secuencia codificante de -Gal A y/o la -Gal A purificada. Por ejemplo, pueden modificarse por ingeniería genética células no humanas cuya maquinaria de glicosilación difiere de la humana (por ejemplo, células CHO) para expresar una enzima del metabolismo de carbohidratos (por ejemplo, -2,6-sialiltransferasa, que está presente en células humanas pero no en células CHO.
En otro ejemplo, las células pueden modificarse por ingeniería genética para expresar una proteína -Gal A que tiene uno o más sitios de glicosilación modificados, por ejemplo, una célula humana o no humana puede modificarse por ingeniería genética para expresar una secuencia codificante de -Gal A en la que se han añadido o delecionado uno o más sitios de N-glicosilación adicionales. Los sitios de glicosilación adicionales pueden glicosilarse por la maquinaria celular en la célula, por ejemplo, la célula CHO, en la que se expresa la secuencia codificante de -Gal A modificada, proporcionando de esta manera una preparación de -Gal A que tiene una mayor semivida circulatoria, captación celular y/o mejor dirección a tejidos de corazón, riñón u otros tejidos apropiados en comparación con la -Gal A no modificada, por ejemplo, cuando se expresa en células no humanas.
La -Gal A también puede modificarse (por ejemplo, después del aislamiento a partir de una célula no humana modificada por ingeniería genética) para asemejarse a la -Gal A producida en células humanas. Por ejemplo, una preparación de -Gal A aislada a partir de una célula no humana puede modificarse, por ejemplo, fosforilarse o escindirse (por ejemplo, con neuraminidasa o fosfatasa) antes de la administración a un sujeto.
La semivida circulante, captación celular y/o dirección a tejidos también puede modificarse, entre otras cosas, (i) modulando la fosforilación de -Gal A; (ii) modulando el contenido de ácido siálico de -Gal A; y/o (iii) eliminando secuencialmente el ácido siálico y los restos de galactosa terminales, o eliminado los restos de galactosa terminales, en las cadenas de oligosacáridos de -Gal A. La sialilación alterada de las preparaciones -Gal A puede aumentar la semivida circulatoria, la captación celular y/o la dirección a tejidos de -Gal A exógena. Un cambio en la relación de moles de manosa-6-fosfato por mol de ácido siálico por molécula de -Gal A también puede dar como resultado una mejor captación celular, con respecto a la de los hepatocitos, en células que no son hepatocitos tales como células endoteliales hepáticas, células sinusoidales hepáticas, células del endotelio capilar/vascular, células del epitelio de los glomérulos renales (podocitos) y células mesangiales glomerulares, células endoteliales renales, células pulmonares, células renales, células neurales y/o miocitos cardiacos. Por ejemplo, una relación preferida entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en la preparación de -Gal A (en una base de mol por mol) es mayor que 1,5 a 1, preferentemente mayor que 2 a 1, más preferentemente mayor que 3 a 1, y aún más preferentemente mayor que 3,5 a 1 o superior.
Remodelación de glicanos
La modificación de glicoproteínas (por ejemplo, cuando -Gal A se produce en células no humanas) puede aumentar la captación de la enzima en tejidos específicos distintos del hígado y macrófagos, por ejemplo, puede aumentar la captación en células del endotelio capilar/vascular, células epiteliales de los glomérulos renales (podocitos) y células mesangiales glomerulares, células endoteliales renales, células pulmonares, células renales, células neurales y/o miocitos cardiacos. Usando procedimientos de modificación de glicoproteínas, pueden obtenerse preparaciones de -Gal A glicosilada humana, en las que entre un 35% y un 85% de los oligosacáridos, preferentemente al menos un 50%, están cargados.
La N-glicosilación de proteínas funciona modificando restos de asparagina apropiados de proteínas con estructuras de oligosacáridos, influyendo de esta manera en sus propiedades y bioactividades (Kukuruzinska & Lennon, Crit. Rev. Oral. Biol. Med. 9: 415-48 (1998)). Una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria puede tener un alto porcentaje de los oligosacáridos que están cargados negativamente, principalmente por la adición de uno a cuatro restos de ácido siálico sobre glicanos complejos, o de uno a dos restos fosfato sobre glicanos de alto contenido de manosa, o de un solo fosfato y un solo ácido siálico sobre glicanos híbridos. También pueden estar presentes cantidades más pequeñas de glicanos complejos sulfatados. Una alta proporción de estructuras cargadas tiene dos funciones principales. En primer lugar, la protección del penúltimo resto de galactosa por ácido siálico unido por enlaces 2,3 o 2,6 previene la retirada prematura de la circulación por el receptor de asialoglicoproteína presente en los hepatocitos. Este receptor reconoce glicoproteínas con restos de galactosa terminales.
La modificación del patrón de glicosilación de la -Gal A producida en células no humanas, por ejemplo, para imitar el patrón producido en células humanas, proporciona a órganos diana importantes tales como el corazón y riñón la oportunidad de captar por endocitosis mayores cantidades de enzima del plasma después de la infusión de la enzima. En segundo lugar, la presencia de Man-6-fosfato en glicanos híbridos o de alto contenido de manosa proporciona la oportunidad de captación mediada por receptores por el receptor de Man-6-fosfato independiente de cationes (CI-MPR). Esta captación mediada por receptores se produce en la superficie de muchas células, incluyendo células del endotelio vascular, que son un sitio de almacenamiento importante de Gb3 en pacientes de Fabry. Las moléculas de enzima con dos restos de Man-6-fosfato tienen una afinidad mucho mayor por CI-MPR que las que tienen un solo Man-6-fosfato.
La complejidad de la N-glicosilación se aumenta por el hecho de que diferentes restos de asparagina dentro del mismo polipéptido pueden modificarse con diferentes estructuras de oligosacáridos, y diversas proteínas se distinguen entre sí por las características de sus restos de carbohidrato.
En la presente memoria se proporcionan varios enfoques para la remodelación de carbohidratos en una proteína que contiene cadenas de N-glicano. En primer lugar, se puede modificar por ingeniería genética una célula, por ejemplo, una célula no humana, para producir una -Gal A humana que tiene un sitio de glicosilación no natural, por ejemplo, se puede modificar por ingeniería genética una secuencia codificante de -Gal A humana para producir una proteína -Gal A que tenga uno o más sitios de glicosilación adicionales. Los sitios de glicosilación adicionales pueden glicosilarse (por ejemplo, con glicanos complejos) por la maquinaria celular en la célula, por ejemplo, la célula CHO, en la que se expresa la secuencia codificante de -Gal A modificada, proporcionando de esta manera una preparación de -Gal A que tiene una mejor semivida circulatoria, captación celular y/o dirección a tejidos en comparación con la -Gal A no modificada, por ejemplo, cuando se expresa en células no humanas.
En segundo lugar, la proporción de -Gal A cargada puede aumentarse por aislamiento selectivo de glicoformas durante el proceso de purificación. La presente solicitud proporciona un aumento en la proporción de glicoformas de 5 -Gal A de alta carga y mayor peso molecular por fraccionamiento de especies de -Gal A en resinas de columnas de cromatografía durante y/o después del procedimiento de purificación. Las especies de glicoformas con mayor índice de carga de -Gal A contienen más ácido siálico y/o más fosfato, y las glicoformas de mayor peso molecular también contendrían las especies completamente glicosiladas, más ramificadas y con un alto índice de carga. La selección de las especies cargadas, o la eliminación de las especies no glicosiladas, poco glicosiladas o poco
10 sialiladas y/o fosforiladas de -Gal A daría como resultado una población de glicoformas de -Gal A con más ácido siálico y/o una mayor relación deseable entre ácido siálico y fosfato en la preparación, proporcionando de esta manera una preparación de -Gal A con mejor semivida, captación celular y/o dirección a tejidos, que tiene de esta manera una mejor eficacia terapéutica.
Este procedimiento de fraccionamiento puede realizarse, pero sin limitación, en resinas de columnas
15 cromatográficas adecuadas utilizadas para purificar o aislar -Gal A. Por ejemplo, el fraccionamiento puede realizarse, pero sin limitación, en resinas de intercambio catiónico (tales como SP-SepharoseG), resinas de intercambio aniónico (Q-SepharoseG), resinas de afinidad (Heparin Sepharose-b, columnas de lectina), columnas de exclusión molecular (Superdex 200) y columnas de interacción hidrófoba (Butyl Sepharose) y otras resinas de columnas cromatográficas conocidas en la técnica.
20 Como la -Gal A se produce en células como una mezcla heterogénea de glicoformas que difieren en peso molecular y carga, la -Gal A tiende a eluir en picos relativamente anchos desde las resinas de cromatografía. Dentro de estas eluciones, las glicoformas se distribuyen de una manera particular dependiendo de la naturaleza de la resina que se está utilizando. Por ejemplo, en la cromatografía de exclusión molecular, las glicoformas de mayor tamaño tenderán a eluir antes en el perfil de elución que las glicoformas más pequeñas. En la cromatografía de
25 intercambio iónico, las glicoformas cargadas más negativamente tenderán a unirse a una resina cargada positivamente (tal como Q-Sepharose) con mayor afinidad que las glicoformas cargadas menos negativamente, y por lo tanto tenderán a eluir más tarde en el perfil de elución. Por el contrario, estas glicoformas de alta carga negativa pueden unirse menos fuertemente a una resina cargada negativamente, tal como SP Sepharose8, que las especies cargadas menos negativamente, o pueden incluso no unirse en absoluto.
30 El fraccionamiento y selección de glicoformas de alta carga y/o mayor peso molecular de -Gal A puede realizarse en cualquier preparación de -Gal A, tal como la derivada de células modificadas genéticamente tales como células, por ejemplo, células humanas o no humanas, modificadas por procedimientos convencionales de ingeniería genética
o por activación génica (GA). Puede realizarse en líneas celulares cultivadas en sistemas optimizados para proporcionar una sialilación y fosforilación alterada como se describe en la presente memoria, por ejemplo, para
35 proporcionar una preparación con una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato (en una base de mol por mol) mayor que1,5 a 1, preferentemente mayor que 2 a 1, más preferentemente mayor que 3 a 1, y aún más preferentemente mayor que 3,5 a 1 o superior.
Un tercer enfoque para la remodelación de carbohidratos puede implicar la modificación de ciertas glicoformas en la -Gal A purificada por unión de un resto de azúcar terminal adicional usando una glucosil transferasa purificada y el 40 donante de azúcar de nucleótido apropiado. Este tratamiento afecta sólo a las glicoformas que tienen un resto de azúcar terminal libre apropiado para actuar como aceptor para la glucosil transferasa que se está usando. Por ejemplo, una  2,6-sialiltransferasa añade ácido siálico en un enlace  2,6 a un aceptor Gal1,4GlcNAc-R terminal, usando CMP-ácido siálico como donante de azúcar de nucleótido. Las enzimas disponibles en el mercado y su especie de origen incluyen: fucosa  1,3-transferasas III, V y VI (humanas); galactosa  1,3 transferasa (porcina); 45 galactosa 1,4 transferasa (bovina); manosa  1,2 transferasa (levadura); ácido siálico  2,3 transferasa (rata); y ácido siálico  2,6 transferasa (rata). Después de completarse la reacción, la glucosil transferasa puede retirarse de la mezcla de reacción por una columna de afinidad específica de glucosil transferasa consistente en el nucleótido apropiado unido a un gel a través de un espaciador de 6 carbonos por un enlace pirofosfato (GDP, UDP) o fosfato (CMP) o por otros procedimientos cromatográficos conocidos en la técnica. De las glucosil transferasas indicadas
50 anteriormente, las sialil transferasas son particularmente útiles para la modificación de enzimas, tales como -Gal A, para la terapia de reemplazo enzimático en pacientes humanos. El uso de cualquier sialil transferasa con ácido CMP-5-fluoresceinil-neuramínico como donante de azúcar de nucleótido produce una glicoproteína marcada por fluorescencia cuya captación y localización tisular puede supervisarse fácilmente.
Un cuarto enfoque para la remodelación de carbohidratos implica la glicoingeniería, por ejemplo, es un enfoque
55 preferido la introducción de genes que afectan a los mecanismos de glicosilación de la célula de producción de -Gal A para modificar el procesamiento postraduccional en el aparato de Golgi.
Un quinto enfoque para la remodelación de carbohidratos implica tratar la -Gal A con glicosidasas apropiadas para reducir el número de glicoformas diferentes presentes. Por ejemplo, el tratamiento secuencial de cadenas de glicano complejas con neuraminidasa, -galactosidasa y -hexosaminidasa escinde el oligosacárido en el núcleo de trimanosa.
Un sexto enfoque para la remodelación de glicanos implica el uso de inhibidores de la glicosilación, por ejemplo, kifunensina (un inhibidor de manosidasa I), swainsonina o similares. Dichos inhibidores pueden añadirse a las células cultivadas que expresan una -Gal A humana. Los inhibidores se captan en las células e inhiben las enzimas de glicosilación, tales como glicosil transferasas y glicosidasas, proporcionando moléculas de -Gal A con estructuras de azúcar alteradas. Como alternativa, una célula modificada por ingeniería genética para producir -Gal A humana puede transfectarse con enzimas de glicosilación tales como glucosil transferasas y glicosidasas.
Un séptimo enfoque implica el uso de enzimas de glicosilación (por ejemplo, glucosil transferasas o glicosidasas) para remodelar las estructuras de carbohidrato in vitro, por ejemplo, en una -Gal A que se ha aislado a partir de una célula modificada por ingeniería genética, como se describe en la presente memoria.
En la técnica se conocen otros enfoques para la remodelación de glicanos.
Alteración de la semivida y/o captación celular de -Gal A alterando la sialilación
La sialilación afecta a la semivida circulatoria y la biodistribución de proteínas. Las proteínas con un contenido mínimo o nulo de ácido siálico se internalizan fácilmente por el receptor de asialoglicoproteína (receptor de Ashwell) en los hepatocitos por restos de galactosa expuestos en la proteína. La semivida circulante de la -Gal A terminada en galactosa puede alterarse mediante (1) la eliminación secuencial de ácido siálico por contacto de -Gal A con neuraminidasa (sialidasa), dejando de esta manera los restos de galactosa terminales expuestos, y (2) la eliminación de los restos de galactósido terminales poniendo en contacto la -Gal A desialilada con -galactosidasa. La preparación de -Gal A resultante tiene un número reducido de ácido siálico terminal y/o restos de galactósido terminales en las cadenas de oligosacárido en comparación con las preparaciones de -Gal A que no se han puesto en contacto secuencialmente con neuraminidasa y -galactosidasa. Como alternativa, la semivida circulante de la -Gal A terminada en galactosa puede aumentarse retirando únicamente los restos de galactósido terminales poniendo en contacto la -Gal A desialilada con -galactosidasa. La preparación de -Gal A resultante tiene un número reducido de restos de galactósido terminales en las cadenas de oligosacárido en comparación con las preparaciones de -Gal A que no se han puesto en contacto con -galactosidasa. En una realización preferida, después del contacto secuencial con neuraminidasa y -galactosidasa, las preparaciones de -Gal A resultantes posteriormente se ponen en contacto con -hexosaminidasa, escindiendo de esta manera el oligosacárido del núcleo de trimanosa.
El contenido de ácido siálico en las preparaciones de -Gal A puede aumentarse por (i) aislamiento de las glicoformas de -Gal A de alta carga y/o mayor peso molecular durante o después del proceso de purificación; (ii) adición de restos de ácido siálico usando células modificadas genéticamente (por procedimientos de ingeniería genética convencionales o activación génica) para expresar un gen de sialil transferasa o ADNc; o (iii) fermentación
o crecimiento de células que expresan la enzima en un entorno de bajo contenido de amonio.
Alteración de la semivida y/o captación celular alterando la fosforilación
La alteración de la fosforilación de una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria puede alterar la semivida circulatoria y la captación celular de la preparación en tejidos deseados. En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A tiene menos de un 45% de glicanos fosforilados. Por ejemplo, la preparación tiene menos de aproximadamente un 35%, 30%, 25% o 20% de glicanos fosforilados. Una relación deseable de ácido siálico: manosa-6-fosfato en la preparación de -Gal A (en una base de mol por mol) es una relación mayor que 1,5 a 1, preferentemente mayor que 2 a 1, más preferentemente mayor que 3 a 1, y aún más preferentemente mayor que 3,5 a 1 o superior.
La fosforilación de preparaciones de -Gal A puede modificarse, por ejemplo aumentarse o reducirse, (i) añadiendo
o retirando restos de fosfato usando células modificadas genéticamente (por procedimientos de ingeniería genética convencionales o activación génica) para expresar un gen de fosforil transferasa o fosfatasa o ADNc; (ii) añadiendo fosfatasas, quinasas o sus inhibidores a las células cultivadas; o (iii) añadiendo fosfatasas, quinasas o sus inhibidores a una preparación de -Gal A purificada producida a partir de una célula modificada por ingeniería genética como se describe en la presente memoria.
Las acciones concertadas de dos enzimas de Golgi unidas a la membrana se necesitan para generar un marcador de reconocimiento de Man-6-fosfato en una proenzima lisosomal. La primera, UDP-Nacetilglucosamina:glicoproteína N-acetilglucosamina-1-fosfotransferasa (GlcNAc fosfotransferasa) requiere un determinante de reconocimiento de proteína en enzimas lisosomales que consiste en dos restos de lisina separadospor 34 Å y en la relación espacial correcta con respecto a una cadena de alto contenido de manosa. La segunda, Nacetilglucosamina-1-fosfodiéster -N-acetilglucosaminidasa (fosfodiéster -GlcNAcasa), hidroliza el enlace GlcNAc-fosfato exponiendo el sitio de reconocimiento de Man-6-fosfato. Estas enzimas pueden inducirse o inhibirse por procedimientos conocidos en la técnica para proporcionar una preparación de -Gal A con características de fosforilación deseables (por ejemplo, con una relación deseable entre glicanos sialilados y fosforilados).
En una realización, se obtiene una preparación de -Gal A con la fosforilación alterada introduciendo primero en una célula de producción de -Gal A un polinucleótido que codifica la fosforil transferasa, o introduciendo una secuencia reguladora por recombinación homóloga que regula la expresión de un gen de fosforil transferasa endógeno. La célula de producción de -Gal A después se cultiva en condiciones de cultivo que dan como resultado la expresión de -Gal A y fosforil transferasa. Después se aísla la preparación de -Gal A con mayor fosforilación en comparación con la -Gal A producida en una célula sin el polinucleótido.
En otra realización adicional, se obtiene una preparación de -Gal A glicosilada con la fosforilación alterada añadiendo un inhibidor de fosfatasa, por ejemplo, bromotetramisol, o un inhibidor de quinasa, a células cultivadas.
Usando los procedimientos descritos en la presente memoria, se obtienen preparaciones de -Gal A en las que a dosis inferiores a los niveles de saturación de aclaramiento sérico o plasmático, el aclaramiento sérico de la preparación de -Gal A de la circulación preferentemente es menor de 4 ml/min/kg en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis, más preferentemente menor de aproximadamente 3,5, 3 o 2,5 ml/min/kg, en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis. La preparación de -Gal A tiene un exponente “b” para la ecuación de escalamiento alométrico para el aclaramiento desde la circulación en mamíferos, Y = (PC)b, de al menos 0,85, en la que Y es el aclaramiento de -Gal A desde la circulación (ml/min), “a” es una constante no especifica y PC es el peso corporal. El exponente “b” preferentemente es al menos 0,88, más preferentemente al menos 0,90 y aún más preferentemente al menos 0,92, 0,94 o superior.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria está enriquecida en estructuras de glicano neutras, monosialiladas y disialiladas (combinadas) en relación con estructuras de un mayor grado de sialilación tales como estructuras trisialiladas y tetrasialiladas. Por ejemplo, una preparación de -Gal A preferida tiene uno o más de: (a) al menos aproximadamente un 22% de glicanos neutros, por ejemplo, al menos aproximadamente un 25% o 30% de glicanos neutros; (b) al menos aproximadamente un 15%, 20% o 25% de glicanos monosialilados; (c) al menos aproximadamente un 35%, preferentemente al menos aproximadamente un 40%, 45% o 50% de glicanos neutros y monosialilados combinados; (d) al menos aproximadamente un 75%, 76%, 78% o más glicanos neutros, mono- y disialilados combinados; y (e) menos de aproximadamente un 35%, preferentemente menos de aproximadamente un 25%, 20%, 18% o aproximadamente un 15% de estructuras de glicano tri- y tetrasialiladas combinadas.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene, en promedio, más de un glicano complejo por monómero, preferentemente al menos un 50% de glicanos complejos por monómero, por ejemplo, 2 glicanos complejos o más por monómero.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene al menos un 5%, preferentemente al menos un 7%, 10% o 15% de glicanos neutros.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene menos de un 45% de glicanos fosforilados. Por ejemplo, la preparación tiene menos de aproximadamente un 35%, 30%, 25%, o 20% de glicanos fosforilados.
En realizaciones preferidas, una preparación de -Gal A descrita en la presente memoria tiene una proporción total de glicanos sialilados mayor de aproximadamente un 45%, por ejemplo, mayor de un 50% o 55%.
En una realización preferida, la relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en la preparación de -Gal (en una base de mol por mol) es mayor que 1,5 a 1, preferentemente mayor que 2 a 1, más preferentemente mayor que 3 a 1, y aún más preferentemente mayor que 3,5 a 1 o superior.
En una realización, la relación en porcentaje entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados es mayor que 1, preferentemente mayor que 1,5, y más preferentemente mayor que 2, por ejemplo, mayor que aproximadamente 2,5
o 3.
PEGilación
En otras realizaciones, la semivida circulatoria de una preparación de -Gal A humana se aumenta complejando -Gal A con polietilenglicol (PEG). En una realización preferida, la preparación de -Gal A se compleja usando tresil monometoxi PEG (TMPEG) para formar una -Gal A PEGilada. La -Gal A PEGilada después se purifica para proporcionar una preparación de -Gal A PEGilada aislada. La PEGilación de -Gal A aumenta la semivida circulante, la captación celular y/o la distribución tisular de la proteína.
Purificación de -Gal A a partir del medio acondicionado de células transfectadas de forma estable
La -Gal A puede purificarse casi hasta la homogeneidad a partir de las cepas de células cultivadas y/o el medio acondicionado de las cepas de células cultivadas que se han transfectado de forma estable para producir la enzima. La -Gal A puede aislarse a partir de medio que contiene -Gal A usando etapas cromatográficas. Por ejemplo, pueden usarse 1 o más, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o más etapas cromatográficas. Las diferentes etapas de cromatografía utilizan diversos principios de separación que aprovechan las diferentes propiedades físicas de la enzima para separar la -Gal A del material contaminante. Por ejemplo, las etapas pueden incluir: cromatografía de interacción hidrófoba en butyl Sepharose, interacción iónica en hidroxiapatita, cromatografía de intercambio aniónico en Q Sepharose y cromatografía de exclusión molecular en Superdex 200. La cromatografía de exclusión molecular puede servir como medio eficaz para cambiar la proteína purificada en un tampón compatible con la formulación.
Un procedimiento de purificación incluye el uso de cromatografía de butyl sepharose como primera etapa en la purificación. También pueden usarse otras resinas de interacción hidrófobas, tales como Source Iso (Pharmacia), Macro-Prep Methyl Support (Bio-Rad), TSK Butyl (Tosohaas) o Phenyl Sepharose (Pharmacia). La columna puede equilibrarse en una concentración relativamente alta de una sal, por ejemplo, sulfato amónico 1 M o cloruro sódico 2 M, por ejemplo, en un tampón de pH 5,6. La muestra a purificar puede prepararse ajustando el pH y la concentración de sal a los del tampón de equilibrio. La muestra se aplica a la columna y la columna se lava con tampón de equilibrio para retirar el material no unido. La -Gal A se eluye de la columna con un tampón de menor fuerza iónica, agua o un disolvente orgánico en agua, por ejemplo, etanol al 20% o propilenglicol al 50%. Como alternativa, la -Gal A puede hacerse fluir a través de la columna usando una menor concentración de sal en el tampón de equilibrio y en la muestra o usando un diferente pH. Otras proteínas pueden unirse a la columna, dando como resultado la purificación de la muestra que contiene -Gal A que no se une a la columna.
Una etapa de purificación alternativa puede usar una resina de intercambio catiónico, por ejemplo, SP Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia), Source 30S (Pharmacia), CM Sepharose Fast Flow (Pharmacia), Macro-Prep CM Support (Bio-Rad) o Macro-Prep High S Support (Bio-Rad), para purificar -Gal A. La “primera etapa de cromatografía” es la primera aplicación de una muestra a una columna de cromatografía (se excluyen todas las etapas asociadas con la preparación de la muestra). La -Gal A puede unirse a la columna a pH 4,4. Para equilibrar la columna puede usarse un tampón, tal como acetato sódico 10 mM, pH 4,4, citrato sódico 10 mM, pH 4,4 u otro tampón con capacidad tamponante adecuada a aproximadamente pH 4,4. La muestra a purificar se ajusta al pH y fuerza iónica del tampón de equilibrio. La muestra se aplica a la columna y la columna se lava después de la carga para retirar el material no unido. Puede usarse una sal, tal como cloruro sódico o cloruro potásico, para eluir la -Gal A de la columna. Como alternativa, la -Gal A puede eluirse de la columna con un tampón de mayor pH o una combinación de mayor concentración de sal y mayor pH. La -Gal A también puede hacerse fluir a través de la columna durante la carga aumentando la concentración de sal en el tampón de equilibrio y en la carga de muestra, haciendo funcionar la columna a un mayor pH, o por una combinación de tanto una mayor concentración de sal como un mayor pH.
Otra etapa de purificación puede usar una Q Sepharose 6 Fast Flow para la purificación de -Gal A. Q Sepharose 6 Fast Flow es una resina de intercambio aniónico relativamente fuerte. También puede usarse una resina de intercambio aniónico más débil tal como DEAE Sepharose Fast Flow (Pharmacia) o Macro-Prep DEAB (Bio-Rad) para purificar -Gal A. La columna se equilibra en un tampón, por ejemplo, fosfato sódico 10 mM, pH 6. El pH de la muestra se ajusta a pH 6 y se obtiene una baja fuerza iónica por dilución o diafiltración de la muestra. La muestra se aplica a la columna en condiciones que unen -Gal A. La columna se lava con tampón de equilibrio para retirar el material no unido. La -Gal A se eluye con la aplicación de sal, por ejemplo, cloruro sódico o cloruro potásico, o aplicación de un tampón de menor pH, o una combinación de una mayor concentración de sal y un menor pH. La -Gal A también puede hacerse fluir a través de la columna durante la carga aumentando la concentración de sal en la carga o haciendo funcionar la columna a un menor pH, o por una combinación de tanto una mayor concentración de sal como un menor pH.
Otra etapa de purificación puede usar una cromatografía de exclusión molecular Superdex 200 (Pharmacia) para la purificación de -Gal A. También pueden usarse otras resinas de cromatografía de exclusión molecular tales como Sephacryl S-200 HR o Bio-Gel A-1,5 m para purificar -Gal A. El tampón preferido para la cromatografía de exclusión molecular es fosfato sódico 25 mm, pH 6,0, que contiene cloruro sódico 0,15 M. También pueden usarse otros tampones compatibles con la formulación, por ejemplo, citrato sódico o potásico 10 mM. El pH del tampón puede estar comprendido entre pH 5 y pH 7 y debe contener una sal, por ejemplo, cloruro sódico o una mezcla de cloruro sódico y cloruro potásico.
Otra etapa de purificación puede usar una resina de cromatoenfoque tal como Polybuffer Exchanger PBE 94 (Pharmacia) para purificar -Gal A. La columna se equilibra a un pH relativamente elevado (por ejemplo, pH 7 o superior), el pH de la muestra a purificar se ajusta al mismo pH, y la muestra se aplica a la columna. Las proteínas se eluyen con un gradiente de pH decreciente a un pH tal como un pH 4, usando un sistema tampón, por ejemplo, Polybuffer 74 (Pharmacia), que se había ajustado a pH 4.
Como alternativa, puede usarse una cromatografía de inmunoafinidad para purificar -Gal A. Puede inmovilizarse un anticuerpo policlonal o monoclonal apropiado contra -Gal A (generado por inmunización con -Gal A o con un péptido derivado de la secuencia de -Gal A usando técnicas convencionales) en una resina de acoplamiento activada, por ejemplo, Sepharose 4 Fast Flow activada con NHS (Pharmacia) o Sepharose 4 Fast Flow activada con CNBr (Pharmacia). La muestra a purificar puede aplicarse a la columna con el anticuerpo inmovilizado a aproximadamente pH 6 o pH 7. La columna se lava para retirar el material no unido. La -Gal A se eluye de la columna con reactivos típicos utilizados para la elución de columnas de afinidad tales como bajo pH, por ejemplo, pH 3, desnaturalizante, por ejemplo, guanidina HCl o tiocianato, o un disolvente orgánico, por ejemplo, propilenglicol al 50% en un tampón de pH 6. El procedimiento de purificación también puede usar una resina de afinidad de quelato metálico, por ejemplo, Chelating Sepharose Fast Flow (Pharmacia), para purificar -Gal A. la columna se precarga con iones metálicos, por ejemplo, Cu+2, Zn+2, Ca+2, Mg+2 o Cd+2. La muestra a purificar se aplica a la columna a un pH apropiado, por ejemplo, pH 6 a 7,5, y la columna se lava para retirar las proteínas no unidas. Las proteínas unidas se eluyen por elución competitiva con imidazol o histidina o reduciendo el pH usando citrato sódico o acetato sódico a un pH menor de 6, o introduciendo agentes quelantes, tales como EDTA o EGTA.
Dosificaciones para Administración de Preparación de -Gal A
Las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria presentan una semivida circulatoria y distribución tisular deseables, por ejemplo, en células del endotelio capilar, células epiteliales de los glomérulos renales (podocitos) y células mesangiales glomerulares y/o miocitos cardiacos. Dichas preparaciones pueden administrase en dosificaciones relativamente bajas. Por ejemplo, la dosis unitaria de administración puede estar comprendida entre 0,05 y 2,0 mg por kilogramo de peso corporal (mg/kg). Por ejemplo, la dosis unitaria puede estar comprendida entre 0,05 y 1,0 mg, entre 0,5 y 0,5 mg/kg o entre 0,5 y 0,3 mg/kg. Se prefieren dosis unitarias comprendidas entre 0,05 y 0,29 mg/kg, por ejemplo, una dosis unitaria de aproximadamente 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, 0,25 mg/kg. Asumiendo una actividad específica de la preparación de -Gal A comprendida entre 2 y 4,5 x 106 U/mg, estos valores corresponden a aproximadamente 0,1 x 106 a 1,3 x 106 U/kg. Una dosis unitaria preferida satura la captación hepática de la -Gal A.
Las dosis repetidas regularmente de la proteína necesariamente se administran a lo largo de un periodo de tiempo, por ejemplo, durante un periodo de varios meses o 1, 2 o 3 años o más, incluso durante la vida del paciente. Sin embargo, la distribución tisular y la semivida circulatoria deseable de las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria permiten la administración de la dosis unitaria a un paciente a intervalos relativamente largos. Por ejemplo, una dosis unitaria puede administrarse durante no más de una vez cada 7 días, 10 días, 14 días, 21 días, 4 semanas, 6 semanas, 8 semanas, 10 semanas o 12 semanas. Una frecuencia de dosificación preferida es bisemanal, mensual o bimensual.
Durante el tiempo de la terapia, un paciente puede supervisarse clínicamente para evaluar el estado de su enfermedad. La mejoría clínica medida, por ejemplo, por una mejoría en la función renal o cardiaca o el bienestar global del paciente (por ejemplo, dolor) y las mejorías de laboratorio medidas, por ejemplo, por reducciones en los niveles de Gb3 en orina, plasma o tejidos, pueden usarse para evaluar el estado de salud del paciente. En caso de que se observe una mejoría clínica después de un periodo de tratamiento y supervisión, puede reducirse la frecuencia de administración de -Gal A. Por ejemplo, un paciente que recibe inyecciones semanales de preparación de -Gal A puede cambiar a una administración bisemanal; un paciente que recibe inyecciones bisemanales de una preparación de -Gal A puede cambiar a la administración mensual; un paciente que recibe inyecciones mensuales de una preparación de -Gal A puede cambiar a inyecciones bimensuales. Después de dicho cambio en la frecuencia de dosificación, debe supervisarse al paciente durante otro periodo de tiempo, por ejemplo varios años, por ejemplo un periodo de 3 años, para evaluar las medidas clínicas y de laboratorio relacionadas con la enfermedad de Fabry. En una realización preferida, la dosis administrada no cambia si se realiza un cambio en la frecuencia de dosificación. Esto asegura que ciertos parámetros farmacocinéticos (por ejemplo, concentración máxima en plasma [Cmáx], tiempo transcurrido hasta la concentración máxima en plasma [tmáx], semivida en plasma [t1/2], y exposición medida por área bajo la curva [ABC]) siguen siendo relativamente constantes después de cada dosis administrada. El mantenimiento de estos parámetros farmacocinéticos dará como resultado niveles relativamente constantes de captación mediada por receptores de -Gal A en tejidos cuando cambie la frecuencia de las dosis.
En algunas realizaciones, un paciente se evalúa clínicamente entre dosis y puede realizarse una determinación tras la evaluación en cuanto al momento de administración de la próxima dosis.
Pueden usarse inyecciones subcutáneas para mantener una exposición al fármaco a mayor plazo. Las dosificaciones de las preparaciones de -Gal A que se administran por inyecciones intramusculares pueden ser iguales o diferentes a las inyectadas por vía subcutánea. En una realización preferida, las dosificaciones intramusculares son más pequeñas si se administran con menos frecuencia. La preparación de -Gal A preferentemente se administra por vía intravenosa, por ejemplo, en una inyección en embolada intravenosa, en una inyección intravenosa en pulsos lentos o por una inyección intravenosa continua. La infusión IV continua (por ejemplo, durante 2-6 horas) permite el mantenimiento de niveles específicos en la sangre.
Un paciente con una variante atípica de la enfermedad de Fabry, por ejemplo, que presenta predominantemente anomalías cardiovasculares o implicación renal, puede tratarse con los mismos regímenes de dosificación que se han descrito en la presente memoria. La dosis se ajusta cuando sea necesario. Por ejemplo, un paciente con el fenotipo de variante cardiaca que se trata con terapia de reemplazo de enzima -Gal A tendrá un cambio en la composición de su corazón y mejor función cardiaca después de la terapia. Este cambio puede medirse con una ecocardiografía convencional que puede detectar un aumento del espesor de la pared del ventrículo izquierdo en pacientes con la enfermedad de Fabry (Goldman y col., JAm Coll Cardiol 7: 1157 - 1161 (1986)). Las medidas ecocardiográficas en serie del espesor de la pared del ventrículo izquierdo pueden realizarse durante la terapia, y una reducción del tamaño de la pared ventricular es indicativa de una respuesta terapéutica. Los pacientes sometidos a terapia de reemplazo de enzima -Gal A también pueden seguirse con imágenes de resonancia magnética (IRM) cardiaca. La IRM tiene la capacidad de evaluar la composición relativa de un tejido dado. Por ejemplo, la IRM cardiaca en pacientes con enfermedad de Fabry revela lípidos depositados dentro del miocardio en comparación con pacientes de control (Matsui y col., Ani Heart J 117: 472 – 474. (1989)). Las evaluaciones de IRM cardiaca en serie en un paciente sometido a una terapia de reemplazo enzimático puede revelar un cambio en la deposición de lípidos dentro del corazón del paciente. Los pacientes con el fenotipo variante renal también pueden beneficiarse de la terapia de reemplazo de enzima -Gal A.
El efecto de la terapia puede medirse por ensayos convencionales de la función renal, tales como el nivel de proteínas en orina de 24 horas, aclaramiento de creatinina y velocidad de filtración glomerular.
Composiciones Farmacéuticas
Las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria carecen sustancialmente de proteínas que no son -Gal A, tales como albúmina, proteínas que no son -Gal A producidas por la célula huésped o proteínas aisladas a partir de tejidos o fluidos del animal. La preparación preferentemente comprende parte de una suspensión o solución fluida compatible fisiológicamente o acuosa. El excipiente o vehículo es fisiológicamente compatible de forma que, además de suministrar la preparación deseada al paciente, no afecta de forma adversa al equilibrio de electrólitos y/o volumen del paciente. Pueden prepararse soluciones útiles para administración parenteral por cualquiera de los procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica (véase, por ejemplo, REMINGTON’S PHARMACEUTICAL SCIENCES Gennaro, A., ed., Mack Pub., 1990).
También pueden usarse formulaciones no parenterales, tales como supositorios y formulaciones orales. Preferentemente, la formulación contiene un excipiente. Son excipientes farmacéuticamente aceptables para -Gal A que pueden incluirse en la formulación tampones tales como tampón citrato, tampón fosfato, tampón acetato y tampón bicarbonato, aminoácidos, urea, alcoholes, ácido ascórbico; fosfolípidos; proteínas tales como albúmina de suero, colágeno y gelatina; sales tales como EDTA o EGTA y cloruro sódico; liposomas; polivinilpirrolidona; azúcares tales como dextrano, manitol, sorbitol y glicerol; propilenglicol y polietilenglicol (PEG); glicerol, glicina u otros aminoácidos; y lípidos. Los excipientes preferidos incluyen manitol, sorbitol, glicerol, aminoácidos lípidos, EDTA, EGTA, cloruro sódico, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, dextrano, o combinaciones de cualquiera de estos excipientes.
En otra realización, la formulación comprende además un detergente no iónico. Los detergentes no iónicos preferidos incluyen Polisorbato 20, Polisorbato 80, Triton X-100, Triton X-114, Nonidet P-40, Octil -glucósido, Octil -glucósido, Brij 35, Pluronic, Poloxamer 188 (a.k.a. Poloxalkol) y Tween 20M. En una realización preferida, el detergente no iónico comprende Polisorbato 20 o Polisorbato 80.
Una formulación preferida comprende además solución salina tamponada con fosfato, por ejemplo, a pH 6. Los sistemas tampón para usar con preparaciones de -Gal A incluyen tampones citrato; acetato; bicarbonato; y fosfato (todos disponibles en Sigma). Una realización preferida es el tampón fosfato. Un intervalo de pH preferido para preparaciones de -Gal A es pH 4,5-7,4.
Para la liofilización de preparaciones de -Gal A, la concentración de proteína puede ser 0,1-10 mg/ml. Pueden añadirse agentes para proporcionar volumen tales como glicina, manitol, albúmina y dextrano a la mezcla de liofilización. Además, pueden añadirse posibles crioprotectores tales como disacáridos, aminoácidos y PEG a la mezcla de liofilización. También puede añadirse cualquiera de los tampones excipientes y detergentes indicados anteriormente.
Las formulaciones para administración pueden incluir glicerol y otras composiciones de alta viscosidad para ayudar a mantener al agente en el sitio deseado. Los polímeros biocompatibles, preferentemente polímeros biocompatibles, bio-reabsorbibles (incluyendo, por ejemplo, ácido hialurónico, colágeno, polibutirato, polímeros de lactida y glicolida y copolímeros de lactida/glicolida) pueden ser excipientes útiles para controlar la liberación del agente in vivo. Las formulaciones para administración parenteral pueden incluir glicocolato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal o ácido cútnico para administración vaginal. Los supositorios para la administración rectal pueden prepararse mezclando una preparación de -Gal A de la solicitud con un excipiente no limitante tal como manteca de cacao u otras composiciones que son sólidas a temperatura ambiente y líquidas a la temperatura corporal.
Las formulaciones para la administración por inhalación pueden contener lactosa u otros excipientes, o pueden ser soluciones acosas que pueden contener polioxietileno-9-lauril éter, glicocolato o desoxicolato. Un aerosol de inhalación preferido se caracteriza por tener partículas de menor densidad de masa y mayor tamaño. Las partículas con densidades menores de 0,4 g por centímetro cúbico y diámetros medios superiores a 5 m liberan eficazmente agentes terapéuticos inhalados en la circulación sistémica. Dichas partículas se inspiran profundamente en los pulmones y escapan al mecanismo de eliminación natural de los pulmones hasta que las partículas inhaladas liberan su carga terapéutica. (Edwards y col., Science 276: 1868-1872 (1997)). Las preparaciones de -Gal A de la presente solicitud pueden administrarse en forma aerosolizada, por ejemplo, usando procedimientos de preparación y formulaciones como las descritas en las Patentes de Estados Unidos 5.654.007, 5.780.014 y 5.814.607.
La formulación para administración intranasal puede incluir soluciones oleosas para administración en forma de gotas nasales, o como un gel para aplicarse por vía intranasal.
Las formulaciones para administración tópica en la superficie de la piel pueden prepararse dispersando la preparación de -Gal A con un vehículo dermatológico aceptable tal como una loción, crema, pomada o jabón. Son particularmente útiles vehículos capaces de formar una película o capa sobre la piel para localizar la aplicación e inhibir la eliminación. Para la administración tópica en superficies de tejidos internos, la preparación de -Gal A puede dispersarse en un adhesivo de tejido líquido u otra sustancia que se sabe que aumenta la adsorción en una superficie de tejido. Por ejemplo, se han descrito varios adhesivos de la mucosa y comprimidos bucales para la administración de fármacos a través de la mucosa, tal como en las Patentes de Estados Unidos 4.740.365,
4.764.378 y 5.780.045.
También pueden incorporarse soluciones de hidroxipropilcelulosa o fibrinógeno/trombina. Como alternativa, también pueden usarse soluciones de revestimiento de tejidos tales como formulaciones que contienen pectina.
Las preparaciones de la solicitud pueden proporcionarse en recipientes adecuados para mantener la esterilidad, proteger la actividad de los ingredientes activos durante la distribución y almacenamiento apropiados y proporcionar una accesibilidad conveniente y eficaz de la preparación para la administración a un paciente. Una formulación inyectable de una preparación de -Gal A podría suministrarse en un vial tapado adecuado para extraer el contenido usando una aguja y una jeringa. El vial estaría destinado para un solo uso o múltiples usos. La preparación también puede suministrarse como una jeringa precargada. En algunos casos, el contenido se suministraría en una formulación líquida, mientras que en otros se suministraría en un estado seco o liofilizado, que en algunos casos requeriría la reconstitución con un patrón o un diluyente suministrado hasta un estado líquido. Cuando la preparación se suministra como un líquido para administración intravenosa, se puede proporcionar en una bolsa o recipiente estéril adecuado para la conexión con una línea o catéter de administración intravenosa. En realizaciones preferidas, las preparaciones de la solicitud se suministran en formulaciones líquidas o en polvo en dispositivos que administran convenientemente una dosis predeterminada de la preparación; los ejemplos de dichos dispositivos incluyen un inyector sin aguja para inyección subcutánea o intramuscular, y un dispositivo dosificador de aerosol. En otros casos, la preparación puede suministrarse en una forma adecuada para la liberación sostenida, tal como en un parche o venda que se aplicará a la piel para la administración transdérmica, o a través de dispositivos erosionables para la administración a través de la mucosa. En casos en los que la preparación se administra por vía oral en forma de comprimidos o píldoras, la preparación podría suministrarse en un frasco con una tapa de quita y pon. Los recipientes pueden etiquetarse con información tal como el tipo de preparación, el nombre del fabricante o distribuidor, la indicación, la dosificación sugerida, instrucciones para el almacenamiento apropiado o instrucciones para la administración.
Procedimientos de Administración de Preparación de -Gal A
Las preparaciones de -Gal A descritas en la presente memoria pueden administrarse por cualquier vía que sea compatible con la preparación de -Gal A. La preparación de -Gal A purificada puede administrarse a individuos que producen una cantidad insuficiente de proteína -Gal A o proteína -Gal A defectuosa o que pueden beneficiarse de la terapia con -Gal A. Las preparaciones terapéuticas de la presente solicitud pueden proporcionarse a un individuo por cualquier medio adecuado, directamente (por ejemplo, localmente, tal como por inyección, implantación o administración tópica en un punto de un tejido) o sistémicamente (por ejemplo, por vía oral
o parenteral).
La vía de administración preferida es intravenosa. Otras vías de administración pueden ser orales o parenterales, incluyendo subcutánea, intraarterial, intraperitoneal, oftálmica, intramuscular, bucal, rectal, vaginal, intraorbital, intracerebral, intradérmica, intracraneal, intraespinal, intraventricular, intratecal, intracisternal, intracapsular, intrapulmonar, intranasal, transmucosa, transdérmica o a través de inhalación. Se describen procedimientos, aparatos y preparaciones de fármacos de liberación intrapulmonar, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.785.049, 5.780.019 y 5.775.320. Un procedimiento preferido de administración intradérmica es por la liberación iontoforética a través de parches; se enseña un ejemplo de dicha liberación en la Patentes de Estados Unidos
5.843.015.
Una vía de administración particularmente útil es por inyección subcutánea. Una preparación de -Gal A de la presente solicitud se formula de tal forma que la dosis requerida total pueda administrarse en una sola inyección de uno o dos mililitros. Para permitir un volumen de inyección de uno o dos mililitros, una preparación de -Gal A de la presente solicitud puede formularse a una concentración en la que la dosis preferida se libera en un volumen de uno a dos mililitros, o la preparación de -Gal A puede formularse en una forma liofilizada, que se reconstituye en agua o un tampón fisiológicamente compatible apropiado antes de la administración. Las inyecciones subcutáneas de preparaciones de -Gal A tienen la ventaja de ser convenientes para el paciente, en particular al permitir la autoadministración, mientras que también dan como resultado una semivida en plasma prolongada en comparación con, por ejemplo, la administración intravenosa. Una prolongación de la semivida en plasma da como resultado el mantenimiento de niveles eficaces de -Gal A en plasma durante periodos de tiempo más largos, cuyo efecto beneficioso es aumentar la exposición de los tejidos afectados clínicamente a la -Gal A inyectada y, como resultado, puede aumentar la captación de -Gal A en dichos tejidos. Esto permite un efecto más beneficioso para el paciente y/o una reducción en la frecuencia de administración. Además, también puede usarse una diversidad de dispositivos diseñados para la comodidad del paciente, tales como plumas de inyección recargables y dispositivos de inyección sin aguja con las preparaciones de -Gal A de la presente solicitud como se analiza en la presente memoria.
La administración puede ser por inyecciones periódicas de un bolo de la preparación, o puede administrarse por administración intravenosa o intraperitoneal desde un depósito que es externo (por ejemplo, una bolsa IV) o interno (por ejemplo, un implante bioerosionable, un órgano bioartificial, o una población de células de producción de -Gal A implantadas). Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos 4.407.957 y 5.798.113. Se describen procedimientos y aparatos de liberación intrapulmonar, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos 5.654.007,
5.780.014 y 5.814.607. Otros sistemas de liberación parenterales útiles incluyen partículas de copolímero de etilenoacetato de vinilo, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, liberación desde bombas, liberación desde células encapsuladas, liberación desde liposomas, inyección suministrada con aguja, inyección sin aguja, nebulizador, aerosolizador, electroporación y parches transdérmicos. En las Patentes de Estados Unidos 5.879.327; 5.520.639; 5.846.233 y 5.704.911 se describen dispositivos de inyección sin agujas. En estos procedimientos puede administrarse cualquiera de las preparaciones de -Gal A descritas anteriormente.
La vía de administración y la cantidad de proteína liberada pueden determinarse por factores que están bien dentro de la capacidad de evaluación por los expertos en la materia. Además, los expertos en la materia son conscientes de que la vía de administración y dosificación de una proteína terapéutica puede variarse para un paciente dado hasta que se obtenga un nivel de dosificación terapéutico.
Ejemplos
Ejemplo 1: Preparación y Uso de Construcciones Diseñadas para Administrar y Expresar -Gal A
1.1: Preparación de -Gal A Activada por Gen (GA-GAL)
La producción de -Gal A activada por gen (GA-GAL) se produjo por inserción de secuencias de ADN reguladoras y estructurales aguas arriba de la secuencia codificante de -Gal A humana, usando la tecnología GA sustancialmente como se describe en la Patente de Estados Unidos 5.733.761. La inserción precisa de la secuencia de activación del gen se produce como resultado de recombinación homóloga entre el ADN presente en un fragmento de ADN transfectado y secuencias de ADN genómico aguas arriba del locus de -Gal A en una célula humana. La propia secuencia activadora del gen contiene la secuencia codificante de -Gal A hasta, pero sin incluir, el sitio de escisión del péptido señal. Se aislaron células que contenían un locus de -Gal A activado y se sometieron a selección con fármaco para aislar las células con una mayor producción de GA-GAL.
Un fragmento de ADN de dirección que contenía una secuencia de activación del gen apropiada se introdujo en líneas celulares huésped humanas por electroporación. Una de estas líneas celulares es HT-1080, una línea celular certificada disponible en ATCC (Manassas, VA). El plásmido de activación del gen (construcción de dirección) pGA213C que contenía dicho fragmento de ADN se muestra en la FIG. 3A. Este plásmido contiene secuencias diseñadas para activar una parte del locus de -Gal A endógeno en la línea de células huésped, y contiene secuencias que codifican el péptido señal, pero no la -Gal A humana. La construcción de dirección también contiene casetes de expresión para los genes neo bacteriano y dhfr de ratón. Esto permite la selección de fragmentos de dirección integrados de forma estable (a través del gen neo) y la selección posterior del gen dhfr usando selección con metotrexato (MTX) por etapas.
Además, pGA213C contiene secuencias diseñadas para dirigirse a secuencias cromosómicas aguas arriba del locus de -Gal A endógeno por recombinación homóloga. En la FIG. 3B se muestra la recombinación homóloga entre el locus de -Gal A endógeno y el fragmento de ADN de 9,6 kb de pGA213 C.
pGA213C se construyó para delecionar 962 pb de secuencias genómicas que se extienden desde las posiciones 1183 a -222 con respecto al codón de iniciación metionina de -Gal A, tras la recombinación homóloga del fragmento de pGA213C con el locus de -Gal A del cromosoma X. La activación de la transcripción del locus de -Gal A se produce a través de la dirección precisa de las secuencias reguladoras exógenas aguas arriba de la región codificante de -Gal A. El locus de GA-GAL resultante hace que la transcripción se inicie a partir del promotor de CMV y proceda a través del exón 1 de CMV, el intrón de aldolasa y los siete exones y seis intrones de la secuencia codificante de -Gal A. El corte y empalme del ARNm precursor grande une el exón de CMV exógeno (insertado por dirección) con el primer exón endógeno entero del transcrito de -Gal A. La traducción del ARNm de GA-GAL da como resultado pre GA-GAL con un péptido señal de treinta y un aminoácidos. Después de la secreción desde la célula huésped, se retira el péptido señal. Las líneas celulares dirigidas correctamente primero se identifican por exploración con reacción en cadena de la polimerasa con respecto a la presencia del ARNm de GA-GAL. También se han descubierto clones que producen el ARNm de GA-GAL que secretan -Gal A enzimáticamente activa en el medio de cultivo. La posterior confirmación de los acontecimientos de dirección se realiza por digestión con enzimas de restricción y análisis de hibridación de transferencia de Southern del ADN genómico.
5 Las células se expusieron a una selección con metotrexato (“MTX”) por etapas. Después de la selección en MTX 0,05 M, se aisló un clon de células y se sometió a selección con MTX 0,1 µM. A partir de este proceso se aisló un grupo de células resistentes a MTX 0,1 M (línea celular RAG001) y se expandieron en cultivo.
1.2: Preparación de Otras Construcciones para Expresar -Gal A
Se construyeron otros dos plásmidos de expresión, pXAG-16 y pXAG-28. Estos plásmidos contienen ADNc de -Gal
10 A humano que codifica los 398 aminoácidos de la enzima -Gal A (sin el péptido señal de -Gal A); la secuencia de ADN genómico del péptido señal de hormona de crecimiento humana (hGH), que está interrumpida por el primer intrón del gen de hGH; y la secuencia no traducida (UTS) del gen de hGH, que contiene una señal de poliadenilación. El plásmido pXAG-16 tiene el promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano (CMV IE) y un primer intrón (flanqueado por secuencias de exones no codificantes), mientras que pXAG-28 se dirige por el
15 promotor de colágeno I2 y el exón 1, y también contiene la 5’UTS del gen de la -actina que contiene el primer intrón del gen de -actina.
Para expresar -Gal A en los fibroblastos, se cultivaron fibroblastos secundarios y se transfectaron de acuerdo con procedimientos publicados (Selden y col., documento WO 93/09222). Los plásmidos pXAG-13, pXAG-16 y pXAG-28 se transfectaron por electroporación en fibroblastos de prepucio humano para generar cepas de células clonales
20 transfectadas de forma estable, y se supervisaron los niveles de expresión de -Gal A resultantes. La secreción de -Gal A por fibroblastos de prepucio normales está en el intervalo de 2-10 unidades/106 células/24 horas. Por el contrario, los fibroblastos transfectados presentaron niveles medios de expresión como los mostrados en la tabla mostrada a continuación.
Niveles medios de expresión de -Gal A ( desviación típica)
pXAG-13: 420  344 U/106 células/día N = 26 cepas clonales (intervalo 3-1133 U/106 células/día)
pXAG-16: 2.051  1253 U/106 células/día N = 24 cepas clonales (intervalo 422-5200 U/106 células/día)
pXAG-28: 141  131 U/106 células/día
N = 38 cepas clonales
(intervalo 20-616 U/106 células/día)
25
Estos datos muestran que las tres construcciones de expresión pueden aumentar la expresión de -Gal A muchas veces con respecto a los fibroblastos no transfectados. La expresión por fibroblastos transfectados de forma estable con pXAG-13, que codifica -Gal A unido al péptido señal de -Gal A, fue sustancialmente menor que la expresión por fibroblastos transfectados con pXAG-16, que difiere sólo en que el péptido señal es el péptido señal de hGH,
30 cuya secuencia codificante está interrumpida por el primer intrón del gen de hGH.
Las cepas celulares deseables para terapia génica o para su uso en la generación de material para la purificación de -Gal A deben presentar un crecimiento y expresión estables durante varios pases. Los datos de las cepas celulares que se transfectaron de forma estable con la construcción de expresión de -Gal A mostraron que la expresión de -Gal A se mantiene establemente durante el pase seriado.
35 Ejemplo 2: Comparación Estructural de -Gal A producida en células humanas frente a células CHO
Este ejemplo compara la estructura de Replagal, una preparación de -Gal A producida en células humanas, frente a Fabrazyme, una preparación de -Gal A producida en células CHO. Las preparaciones se compararon con respecto al punto isoeléctrico, peso molecular y perfil de carbohidratos, fosforilación y sialilación.
Punto Isoeléctrico Replagal y Fabrazyme se analizaron por enfoque isoeléctrico desnaturalizante (geles al 5%, intervalo de pH de 3 a 7, urea 6 M) seguido de transferencia de Western. Las preparaciones también se analizaron por enfoque isoeléctrico nativo (geles Novex al 5%, intervalo de pH de 3 a 7) seguido de tinción con azul de Coomassie. El intervalo de pI global de las 2 preparaciones fue similar, aunque las intensidades relativas de los patrones de bandas fueron diferentes. Esto indica que las glicoformas presentes en cada preparación difieren en la distribución de carga, conteniendo Fabrazyme una mayor proporción de glicoformas de menor pI (cargadas más negativamente) que Replagal .
Peso Molecular
Replagal y Fabrazyme se analizaron por SDS-PAGE (gel de poliacrilamida al 8-16%, muestras reducidas) seguido de tinción con azul de Coomassie. Los pesos moleculares de las preparaciones fueron similares. Sin embargo, la banda de la glicoforma menor (aproximadamente 45 kD) de Fabrazyme es más nítida que la de Replagal, mientras que Replagal presenta una distribución de tamaños más amplia.
En la FIG. 6 se determinaron las masas moleculares de Replagal (superior) y Fabrazyme (inferior) por espectroscopía de masas MALDI-TOF. El máximo del pico ancho principal está a 50.755 y 50.705 Da, respectivamente, lo cual es coherente con el peso molecular esperado del monómero glicosilado. Está presente un saliente principal aproximadamente a 48.071 Da y 47.667 Da, que representan las glicoformas de menor peso molecular para Replagal y Fabrazyme, respectivamente. El saliente principal, que corresponde a las glicoformas de menor peso molecular, es mucho más evidente en el espectro de Fabrazyme.
La FIG. 8 muestra Fabrazyme (superior) y Replagal (inferior) analizados por HPLC de fase inversa usando una columna de fase inversa C4 (Vydac). Se muestran los cromatogramas obtenidos a 214 nm. El saliente principal, que corresponde a las glicoformas de menor peso molecular, está mucho más pronunciado en Fabrazyme .
Internalización Celular
Se incubaron fibroblastos humanos normales en placas de cultivo multipocillo durante 6 horas en ausencia (control, no mostrado) o presencia de Replagal o Fabrazyme. Esta internalización se puede inhibir por manosa-6-fosfato, lo que indica que la internalización se realiza predominantemente a través de receptores de manosa-6-fosfato. Los resultados indican que Replagal y Fabrazyme no se internalizan de forma comparable por los fibroblastos. Fabrazyme se internaliza más rápidamente que Replagal por internalización mediada por el receptor de manosa6-fosfato (véase la FIG. 5).
Composición de Glicanos y Caracterización
La FIG. 7 muestra perfiles de carga de los glicanos liberados de Replagal (inferior) y Fabrazyme (superior). Se derivatizaron glicanos con una sonda fluorescente y se compararon por cromatografía de intercambio iónico en una columna GlycoSep C. Los resultados muestran que Replagal tiene una mayor proporción de glicanos neutros y monocargados, y Fabrazyme tiene una mayor proporción de glicanos tricargados.
La Tabla 1 muestra una comparación de áreas de picos de glicano. Los glicanos liberados de Replagal y Fabrazyme se analizaron usando HPAE-PAD como se muestra en la FIG. 4. La integración de los picos se realizó para cuantificar los porcentajes de los diversos grupos de picos. Los datos presentados en las tablas demuestran una mayor proporción de glicanos fosforilados en Fabrazyme y una mayor proporción de glicanos neutros y una mayor proporción total de glicanos sialilados en Replagal.
La Tabla 2 muestra los resultados del perfil de carga. Se obtuvieron perfiles de carga de glicanos liberados de Replagal y Fabrazyme y se separaron como se describe en la FIG. 7. CK-022 y CK-006 son 2 preparaciones de Replagal™ diferentes, mientras que CK-JL012502 es una preparación de Fabrazyme™. Los glicanos de cada producto se ensayaron por duplicado. Como se muestra en la tabla, las preparaciones de Replagal™ tienen mayores proporciones de glicanos que son neutros o llevan 1 carga, mientras que Fabrazyme™ contiene una mayor proporción de glicanos con 2 o 3 cargas.
La Tabla 3 muestra los resultados del perfil desialilado. Los perfiles de carga de glicanos liberados de Replagal™ y Fabrazyme™ se desialilaron, seguido de derivatización y separación como se describe en la FIG. 7. CK-022 y CK006 son 2 preparaciones de Replagal™ diferentes, mientras que CK-JL012502 es una preparación de Fabrazyme™. Los glicanos de cada producto se ensayaron por duplicado. Como se muestra en la tabla, las preparaciones de Replagal™ tienen menores proporciones de glicanos cargados residuales después de la desialilación, lo que indica que Fabrazyme™ tiene una mayor proporción de glicanos fosforilados (resistentes a sialidasa).
Ejemplo 3: Aumento a Escala entre Especies de la Farmacocinética de -Gal A (Replagal™) obtenida en células humanas
El objetivo de este ejemplo fue comparar parámetros farmacocinéticos derivados de modelos animales con resultados farmacocinéticos humanos.
Los animales (ratones, ratas, perros, conejos y monos) recibieron inyecciones intravenosas en embolada individuales de Replagal™. Se recogieron muestras de sangre durante un periodo de 24 horas, se procesaron para obtener suero y se analizaron con respecto a la actividad enzimática de -Gal A usando un ensayo de fluorescencia in vitro. Los perfiles de concentración en suero se analizaron usando un modelo de 2 compartimentos o un modelo no compartimental para estimar los parámetros farmacocinéticos.
Se recogieron muestras de sangre a partir de pacientes con Fabry del sexo masculino que recibieron su infusión inicial de 40 minutos de Replagal™. Las muestras de sangre se procesaron para obtener plasma o suero y se analizaron con respecto a la actividad enzimática de -Gal A. Los perfiles de concentración en suero se analizaron usando un modelo no compartimental para estimar los parámetros farmacocinéticos.
Se tomaron biopsias hepáticas 44 horas después de la dosificación a partir de pacientes con Fabry del sexo masculino en el ensayo de Fase I. Las muestras de tejido se procesaron y analizaron con respecto a la concentración de -Gal A administrada como se ha descrito previamente (Schiffman y Brady y col. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:365-370). La cantidad de dosis administrada recuperada en el hígado de cada paciente se calculó usando la concentración de -Gal A en cada biopsia de hígado y el peso hepático estimado de cada paciente.
Replagal™ tuvo un perfil de eliminación del suero bifásico después de una sola dosis IV en ratas, conejos y monos (la FIG. 9 ilustra el perfil en mono cynomolgus). La Cmáx fue proporcional a la dosis para estas tres especies de animales (FIG. 10). Replagal™ también tuvo un perfil de eliminación del suero bifásico en pacientes con Fabry después de una infusión de 40 minutos (FIG. 11). La Cmáx también fue proporcional a la dosis en seres humanos (FIG. 12). Replagal se eliminó 24 horas después de la dosificación en todas las especies. El ABC (área bajo la curva) aumentó linealmente con la dosis en animales y seres humanos en un intervalo de dosificación de 0,017 a 3,2 X 106 U/kg (FIG. 13). El intervalo de dosis en U/kg corresponde a un intervalo de 0,007 a 0,2 mg/kg en seres humanos y de 0,0625 a 1 mg/kg en animales.
Los parámetros fisiológicos en mamíferos siguen ecuaciones de escalamiento alométrico basadas en el peso corporal, Y = a (PC)b (Tabla 4). El exponente en la ecuación de escalamiento puede ser próximo a 1,0 (por ejemplo, volumen de sangre) pero varía entre 0,6 y 0,8 para el aclaramiento de fármacos o proteínas.
La ecuación de escalamiento alométrico de Replagal™ (ml/min) se basó en estudios farmacocinéticos en ratones, ratas, conejos, monos cynomolgus grandes y pequeños y pacientes con Fabry. El aclaramiento sérico siguió la ecuación de escalamiento alométrico con un exponente de 0,92. (Tabla 5). El mayor exponente para el aclaramiento sérico de Replagal™ en comparación con otros productos farmacéuticos o proteínas proporciona confirmación del aclaramiento de Replagal™ a través del receptor de M6P.
El porcentaje de Replagal administrado encontrado en el hígado de un paciente se reducía según aumentaba la dosis en una base de mg/kg (Tabla 6). A las dos dosis inferiores, 0,007 y 0,014 mg/kg, el porcentaje de Replagal™ recuperado en el hígado 44 horas después de la dosificación fue de aproximadamente un 25 a un 30%. Por el contrario, a 0,11 mg/kg, sólo el 14% del Replagal™ administrado se encontró en el hígado. La saturación de la captación hepática de Replagal™ se produjo cuando las concentraciones máximas de producto farmacéutico (Cmáx) excedían el valor de Kd para el receptor de M6P (2 x 10-9 M). Basándose en estos resultados, la cantidad estimada de la dosis comercial de Replagal™ (0,2 mg/kg) captada por el hígado es de aproximadamente 2 mg para un paciente de 75 mg (FIG. 14), el resto de la dosis (13 mg) entonces estaría disponible para la captación en tejidos distintos del hígado.
De esta manera, la farmacocinética de una sola dosis en modelos animales proporcionó una buena predicción de la farmacocinética de Replagal™ en pacientes con Fabry. El mecanismo de aclaramiento de Replagal™ de la sangre predominantemente es a través de receptores de M6P que se encuentran en tejidos de todo el cuerpo. El exponente para la ecuación de escalamiento alométrico para el aclaramiento sérico o plasmático de Replagal™, 0,92, es mayor que el observado para otros productos farmacéuticos o proteínas. El mayor exponente proporciona confirmación del aclaramiento de Replagal™ a través del receptor de M6P. Se observó la saturación de receptores hepáticos humanos cuando la Cmáx excedía la Kd del receptor de M6P (dosis de 0,056 mg/kg y superiores).
Ejemplo 4: Farmacocinética de Replagal™ en pacientes con Fabry del sexo masculino y femenino
El objetivo primario de esta evaluación fue comparar las propiedades farmacocinéticas de Replagal™ en pacientes con Fabry del sexo masculino y femenino. Un objetivo secundario fue comparar las propiedades farmacocinéticas entre pacientes tratados con Replagal™ y Fabrazyme™.
Se recogieron muestras de sangre de pacientes con Fabry del sexo masculino y femenino que recibían su infusión inicial de 40 minutos de Replagal de TKT006 (NIH), TKT007 (UK) y TKT014 (Alemania). Las muestras de sangre se procesaron para obtener suero (muestras TKT007 y TKT014) o plasma (muestras TKT006) y se analizaron con respecto a la actividad de la enzima -galactosidasa A a TKT usando un ensayo de fluorescencia in vitro. Los perfiles de concentración en suero/plasma se analizaron usando un modelo no compartimental para estimar los parámetros farmacocinéticos.
La actividad de la enzima antes de la dosis tuvo un valor medio de 1,2 U/ml en hombres y 6,5 U/ml en mujeres, lo que refleja el estado portador de los pacientes del sexo femenino (Tabla 7).
Replagal™ tuvo un perfil de eliminación en suero bifásico después de una sola infusión intravenosa en pacientes con Fabry tanto del sexo masculino como del sexo femenino y se eliminó de la mayoría de los pacientes 24 horas después de la dosificación (Figura 15). Como era de esperar, el valor de Cmáx coincidía con el final del periodo de infusión de 40 minutos.
Los parámetros farmacocinéticos medios fueron similares entre pacientes del sexo masculino y femenino (Tabla 8). El ABC (área bajo la curva) normalizada para la dosis fue ligeramente mayor en mujeres (relación de 0,51) pero no fue estadísticamente diferente de la relación en hombres (0,43). El aclaramiento sérico absoluto de Replagal™ fue menor en mujeres (140 en comparación con 177 ml/min.); pero cuando se normalizó para el peso corporal, el aclaramiento sérico no fue estadísticamente diferente (2,10 frente a 2,52 ml/min/kg). La diferencia estadísticamente significativa en la semivida de eliminación terminal (89 minutos en mujeres frente a 112 minutos en hombres) no se debía a una diferencia en la eliminación de Replagal™ de mujeres. En su lugar, la mayor actividad enzimática basal en mujeres hizo difícil detectar Replagal™ administrado después de 8 horas (Túltimo).
El aclaramiento de Replagal™ de la circulación de pacientes con Fabry fue más rápida que la que el IFG (índice de filtración glomerular) o el aclaramiento de creatinina en pacientes individuales, lo cual es coherente con su mecanismo de aclaramiento (Tabla 9). Replagal™ se elimina principalmente de la circulación por captación en tejidos a través de receptores de manosa-6-fosfato (M6P) y mínimamente por degradación de proteínas y eliminación renal.
Se realizó un análisis para confirmar que los cambios en la función renal no afectaran al aclaramiento de Replagal™ de la circulación (Tabla 10). La mayoría de los pacientes con Fabry sometidos al análisis farmacocinético de la primera dosis estaban en el intervalo normal (> 80 ml/min de aclaramiento de creatina) o tenían un deterioro renal “leve” (50-80 ml/min de aclaramiento de creatina) cuando recibieron su primera dosis de Replagal™. Aunque sólo 5 pacientes estaban en las categorías moderada o severa, el aclaramiento en suero de Replagal (ml/min/kg) para estos pacientes estaba dentro del intervalo establecido por las 2 categorías de la función renal superiores. Estos datos sugieren que Replagal™ no se excreta por el riñón. No hubo diferencias entre hombres y mujeres en este análisis.
El aclaramiento sérico de Fabrazyme™ de pacientes con Fabry fue significativamente más rápido que el observado con Replagal™ (Tabla 11). A dosis casi iguales, en pacientes del sexo masculino (0,2 y 0,3 mg/kg para Replagal y Fabrazyme respectivamente), el aclaramiento sérico de Fabrazyme™ fue de 4 ml/min/kg en comparación con 2,5 ml/min/kg para Replagal™. Esta diferencia en aclaramiento sérico a dosis casi equivalentes se debe al diferente patrón de glicosilación de Fabrazyme™ (fabricado en células CHO) en comparación con el patrón de glicosilación humano de Replagal™. A dosis superiores de Fabrazyme™ (1 y 3 mg/kg), el aclaramiento sérico se redujo significativamente hasta aproximadamente 2,7 y 1 ml/min/kg según se saturaban los mecanismos de aclaramiento para Fabrazyme™.
De esta manera, los parámetros farmacocinéticos eran similares en pacientes del sexo masculino y femenino que recibieron dosis de Replagal™. El aclaramiento sérico de Replagal™ superó significativamente la función renal (ml/min), lo cual es coherente con la captación mediada por M6P de Replagal™ en tejidos y células de todo el cuerpo. Como era de esperar, los análisis preliminares indicaron que el Replagal no se excreta por el riñón. A dosis inferiores a los niveles de saturación de aclaramiento, el aclaramiento sérico de Fabrazyme™ fue significativamente más rápida en comparación con Replagal™ y refleja diferencias en los patrones de glicosilación entre los dos productos farmacéuticos.
TABLA 1
Replagal
Fabrazyme
Neutro
15,6% 4,6%
1 Ácido Siálico
29,5% 8,9%
Desconocido
4,6% 1,8%
2 Ácido Siálico
20,1% 11,3%
1 Fosfato
13,0% 27,1%
Desconocido
4,0% 4,6%
3 Ácido Siálico
1,9% 8,5%
4 Ácido Siálico
5,9% 15,1 %
2 Fosfato
5,4% 18,0%
TABLA 2
Muestra
% ID Neutro % 1 Carga % 2 Cargas % 3 Cargas % 4 Cargas
CK-022 vial 1
32,76 26,97 25,64 9,78 4,85
CK-022 vial 2
33,61 26,37 25,16 9,92 4,93
CK-006 vial 1
29,73 25,61 27,12 11,85 5,70
CK-006 vial 2
29,33 26,69 27,14 11,47 5,37
CK-JL012502 vial 1
21,88 12,59 38,44 21,94 5,15
CK-JL012502 vial 2
21,60 12,61 39,35 21,44 5,00
TABLA 3
Muestra ID
% Neutro % Neutro % 1 carga % 1 Carga % 2 Cargas % 2 Cargas
CK-022 iny 1
94,45 2,73 2,82
CK-022 iny 2
94,39 2,68 2,93
CK-006 iny 1
93,18 2,57 4,25
CK-006 iny 2
93,34 2,24 4,42
CK-JL012502 iny 1
88,52 4,37 7,11
CK-JL012502 iny 2
88,08 4,41 7,51
TABLA 4 TABLA 5
Escalamiento Alométrico de Parámetros Fisiológicos y Anatómicos (función de peso corporal, PC) Ecuación: Y = a (PC)b
Parámetro (Y)
Exponente (b)
Área de superficie corporal
0,67
Volumen de sangre (ml)
0,99
Peso de pulmón (g)
0,99
Producción de orina (ml/h)
0,82
Aclaramiento de insulina (ml/h)
0,77
Peso de riñón (g)
0,85
Aclaramiento de fármaco del plasma
0,6-0,8
Aclaramiento de de proteína del plasma
0,65-0,84
Aclaramiento por receptor de M6P
¿
Chappell y Mordenti (1991) Extrapolation of Toxicological and Pharmacological Data from Animals to Humans. En B. Testa (ed.) Advances in Drug Research, Vol. 20, págs. 1-116.
Escalamiento Alométrico de Parámetros Farmacocinéticos-Exponentes
Producto Farmacéutico
IC (ml/min)
Moléculas pequeñas*
0,6-0,8
Proteínas publicadas*
0,65-0,84
Rt-PA
0,84
Relaxina
0,80
CD4-IgG
0,74
rhGH
0,71
RCD4
0,65
Replagal
0,92
* Mordenti y col. (1991) Interspecies Scaling of Clearance and Volume Distribution Data for Five Therapeutic Proteins. Pharmaceutical Research 8: 1351-1359
TABLA 6
Dosis Administrada en Porcentaje de Replagal en Hígado Humano
Dosis (mg/kg)
Tiempo de Infusión Cmáx (x 109 M) Porcentaje de Dosis administrada en hígado
44 h (medido)
Tmáx (2 horas) calculado usando T1/2 de 3 Días
0,007
20 min 0,4 25,0% 38%
0,014
20 min 1,1 28,7% 43%
0,028
20 min 2,5 16,8% 25%
0,056
20 min 5,0 19,4% 29%
0,11
20 min 7,8 13,7% 21%
0,2
40 min 11,6 No determinado 8%-18% (estimado)
La Kd del receptor de M6P es 2 x 10-9 M (Kornfeld Ann Rev Biochem 61:307-330, 1992) semividas de α-Galactosidasa A: 4 días en fibroblastos de Fabry (Mayes y col., Am J Hum Genet 34:602-610, 1982) 2 días en hígado de ratón (Ioannou y col., Am J Hum Genet 68:14-25, 2001)
TABLA 7
Valores Basales de Actividad de Enzima  -Galactosidasa A
Estudio Nº
Nº de Pacientes Valor Medio Basal (U/ml)
TKT006 y TKT007 (NIH y UK)
39 hombres 1,2* (intervalo 0,4-9)
TKT014 (Alemania)
15 mujeres 6,5 (intervalo 2-12)
*excluye un paciente del sexo masculino con un valor basal de aproximadamente 15 U/ml 1 Unidad (U) se define como la hidrólisis de un nanomol de 4-metilumbeliferil--Dgalactopiranósido por hora a 37°C.
TABLA 8
Comparación farmacocinética entre pacientes de Fabry del sexo masculino y femenino después de la 1ª dosis de Replagal
Estudio Clínico
Nº Dosis media (U/kg x 106) Peso corp. (kg) ABC/ Dosis IC (ml/min) IC (ml/min/kg) T1/2(λz) (min) Mediana Túltimo Vss (% PC)
TKT006 TKT007
18 hombres 0,61 72,9 (16,1) 0,43 (0,12) 177 (43) 2,52 (0,74) 112 (25) 12 horas 16,0% (4,3%)
TKT014
15 mujeres 0,66 68,0 (13,8) 0,51 (0,13) 140 (38) 2,10 (0,62) 89 (28) 8 horas 16,5% (4,3%)
Ensayo t
0,057 0,015 0,10 0,02 NA NS
( ) desviación típica NA, no aplicable NS, no significativo Túltimo, tiempo de la última actividad enzimática de Replagal detectable El ABC normalizado tiene unidades de (min*U/ml)/(U/kg)
TABLA 9
Aclaramiento Sérico de Replagal de Pacientes del Sexo Masculino y Femenino
Estudio Nº
Evaluación Farmacocinética (N) IFG* Medio (ml/min) Eliminación de Replagal Media (ml/min)
TKT006 (NIH)
10 hombres 78 (24) 193 (47)
TKT005 (UK)
8 hombres 115 (63) 157 (29)
Combinado
18 hombres 95 (48) 177 (43)
TKT014 (Alemania)
15 mujeres 70 (20) † 140 (38)
( ) desviación típica N, número de pacientes evaluados con respecto a los parámetros farmacocinéticos después de la primera dosis de Replagal * IFG, índice de filtración glomerular, medido 2-3 semanas antes de la primera dosis de Replagal † aclaramiento de creatinina medido en mujeres
TABLA 10
Comparación de Función Renal y Aclaramiento Sérico de Replagal
Estudio Nº
Evaluación Farmacocinética (N) Categoría de Función Renal* Intervalo de Eliminación de Replagal (ml/min/kg)
TKT006 (NIH) y TKT007 (UK)
10 hombres Intervalo Normal (>80 ml/min) 1,7 - 3,4
6 hombres
Leve (50 - 80 ml/min) 2,0 - 4,4
1 hombres
Moderada (30-50 ml/min) 3,5
1 hombres
Severa < 30 ml/min) 1,6
TKT014 (Alemania)
5 mujeres Intervalo Normal (>80 ml/min) 2,2 - 3,0
7 mujeres
Leve (50 - 80 ml/min) 1,4 - 3,6
2 mujeres
Moderada (30 - 50 ml/min) 1,5 -1,6
1 mujeres
Severa (< 30 ml/min) 1,8
* categorías de la FDA basadas en la eliminación de creatinina estimada
TABLA 11
Aclaramiento Sérico en Pacientes con Fabry Dosificados con Replagal o Fabrazyme
Dosis (mg/kg)
Aclaramiento Sérico (ml/min/kg)
Hombres con Fabrazyme*
Replagal
Hombres
Mujeres
0,2
2,5 2,1
0,3
4
1,0
~ 2,7 †
3,0
~ 1 †
* Eng y col (2001) A Phase I/II Clinical Trial of Enzyme Replacement in Fabry Disease. Am J Hum Genet 68:711-722. † aclaramiento sérico saturado
Lo que se reivindica se presenta a continuación y va seguido de un listado de secuencias.

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento para analizar una preparación de -Gal A, comprendiendo el procedimiento:
    obtener o proporcionar una primera preparación de -Gal A de ensayo; y determinar si la primera preparación de -Gal A de ensayo tiene cuatro o más de las características (1)-(7):
    (1)
    tiene al menos aproximadamente un 75% de glicanos neutros, mono-y disialilados combinados;
    (2)
    tiene menos de aproximadamente un 35% de glicanos tri- y tetrasialilados combinados;
    (3)
    tiene más de un 50% de glicanos complejos;
    (4)
    tiene menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados;
    (5)
    tiene más de aproximadamente un 45% de glicanos sialilados;
    (6) tiene una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1; y
    (7) tiene una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor de 1, analizándose de esta manera una preparación de -Gal A.
  2. 2.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de seleccionar la preparación de -Gal A de ensayo si tiene cuatro o más de las características (1)-(7).
  3. 3.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene al menos aproximadamente un 75% de glicanos neutros, mono- y disialilados combinados.
  4. 4.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene menos de aproximadamente un 35% de glicanos tri- y tetrasialilados combinados.
  5. 5.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene más de un 50% de glicanos complejos.
  6. 6.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados.
  7. 7.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene más de aproximadamente un 45% de glicanos sialilados.
  8. 8.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1.
  9. 9.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la etapa de determinación comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor de 1.
  10. 10.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende determinar si la preparación de -Gal A de ensayo tiene cinco, seis o siete de las características (1)-(7).
  11. 11.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la determinación se realiza por uno o más procedimientos seleccionados del grupo que consiste en: cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de intercambio aniónico de alta resolución (HPAE), cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), espectroscopía de masas.
  12. 12.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra de -Gal A se recoge a partir de una célula de mamífero.
  13. 13.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la célula de mamífero es una célula humana.
  14. 14.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la célula de mamífero no es una célula humana.
  15. 15.
    El procedimiento de la reivindicación 12, en el que la célula de mamífero es una célula CHO.
  16. 16.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la firma de carbohidratos de la preparación de ensayo se ha modificado antes de realizar la etapa de determinación.
  17. 17.
    El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la firma de carbohidratos de la preparación de ensayo se ha modificado por tratamiento con una enzima.
  18. 18.
    El procedimiento de la reivindicación 17, en el que enzima es una glicosidasa, glucosil transferasa, fosforil transferasa, quinasa o sialil transferasa.
  19. 19.
    El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la firma de carbohidratos de la preparación de ensayo se ha modificado por tratamiento con un inhibidor de fosfatasa.
  20. 20.
    El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la firma de carbohidratos de las preparaciones de ensayo se ha modificado por glicoingeniería.
  21. 21.
    El procedimiento de la reivindicación 16, en el que la firma de carbohidratos de la preparación de ensayo se ha modificado por tratamiento con un inhibidor de la glicosilación.
  22. 22.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de comparar la preparación de -Gal A humana de ensayo con una preparación de -Gal A de referencia.
  23. 23.
    El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la preparación de -Gal A de referencia es una preparación de -Gal A humana obtenida en células humanas.
  24. 24.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:
    obtener o proporcionar una segunda preparación de -Gal A de ensayo; determinar si la segunda preparación tiene cuatro o más de las características (1)-(7); e introducir el resultado de cada determinación en un registro,
    en el que la primera y segunda preparaciones son un primer y segundo lotes de una preparación de -Gal A farmacéutica.
  25. 25.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además la etapa de:
    predecir un parámetro farmacocinético o actividad biológica de la preparación de -Gal A de ensayo, prediciéndose que el parámetro farmacocinético o la actividad biológica es deseable si la preparación de -Gal A de ensayo tiene cuatro o más de las características (1)-(7).
  26. 26.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además las etapas de:
    evaluar un parámetro farmacocinético o actividad biológica de la preparación de -Gal A de ensayo.
  27. 27.
    El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, en el que el parámetro farmacocinético o actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en: actividad enzimática, aclaramiento sérico y captación en tejidos.
  28. 28.
    El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, en el que el parámetro farmacocinético o actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en: captación hepática, captación renal y captación cardiovascular.
  29. 29.
    El procedimiento de la reivindicación 25 o 26, en el que el parámetro farmacocinético o actividad biológica es la dirección tisular a al menos a uno de: células del endotelio hepático, células sinusoidales hepáticas, células del endotelio capilar/vascular, células epiteliales de los glomérulos renales (podocitos), células mesangiales glomerulares, células endoteliales renales, células pulmonares, células renales, células neurales o miocitos cardiacos.
  30. 30.
    El procedimiento de la reivindicación 25, que comprende además la etapa de usar la predicción para diseñar una preparación terapéutica de -Gal A para un paciente específico o una variante específica de enfermedad de Fabry.
  31. 31.
    El procedimiento de la reivindicación 30, en el que la variante específica de la enfermedad de Fabry es la variante renal de la enfermedad de Fabry o la variante cardiaca de la enfermedad de Fabry.
  32. 32.
    El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el procedimiento comprende además la etapa de introducir el resultado de la determinación en un registro.
  33. 33.
    Un procedimiento para producir una preparación de -Gal A humana mejorada, comprendiendo el procedimiento las etapas de:
    a.
    proporcionar una preparación de -Gal A humana recogida a partir de una célula; y
    b.
    modificar la firma de carbohidratos de la preparación de -Gal A para que corresponda a cuatro o más de los siguientes parámetros:
    (1)
    tenga al menos aproximadamente un 75% de glicanos neutros, mono-y disialilados combinados;
    (2)
    tenga menos de aproximadamente un 35% de glicanos tri- y tetrasialilados combinados;
    (3)
    tenga más de un 50% de glicanos complejos;
    (4)
    tenga menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados;
    (5)
    tenga más de aproximadamente un 45% de glicanos sialilados;
    (6)
    tenga una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1; y
    (7)
    tenga una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor de 1,
    proporcionándose de esta manera una preparación de -Gal A mejorada.
  34. 34.
    El procedimiento de la reivindicación 33, en el que la firma de carbohidratos de la preparación de -Gal A se modifica por glicoingeniería.
  35. 35.
    El procedimiento de la reivindicación 34, en el que la firma de carbohidratos de la preparación de -Gal A se modifica por uno o los dos de: modificación por ingeniería genética de la célula para producir una -Gal A humana, que tenga un sitio de glicosilación no natural; y modificación por ingeniería genética de la célula para producir una glucosidasa, glucosil transferasa, fosforil transferasa, fosfatasa o sialil transferasa.
  36. 36.
    El procedimiento de la reivindicación 33, en el que la firma de carbohidratos de la preparación de -Gal A se modifica por uno o más de: aislamiento selectivo de glicoformas durante el proceso de purificación de -Gal A; tratamiento de la célula o preparación con una enzima modificadora de carbohidratos; y tratamiento de la célula o preparación con un inhibidor de la glicosilación.
  37. 37.
    El procedimiento de la reivindicación 33, que comprende además la etapa de analizar la firma de carbohidratos de la preparación de -Gal A después de la modificación.
  38. 38.
    Uso de una preparación de -Gal A en la preparación de un medicamento, en el que la preparación de -Gal A se selecciona:
    proporcionando u obteniendo un panel de dos o más preparaciones de -Gal A que tienen diferentes firmas de carbohidratos; determinando si una preparación de -Gal A tiene una firma de carbohidratos que corresponde a cuatro o más de los siguientes parámetros:
    (1)
    tiene al menos aproximadamente un 75% de glicanos neutros, mono-y disialilados combinados;
    (2)
    tiene menos de aproximadamente un 35% de glicanos tri- y tetrasialilados combinados;
    (3)
    tiene más de un 50% de glicanos complejos;
    (4)
    tiene menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados;
    (5)
    tiene más de aproximadamente un 45% de glicanos sialilados;
    (6)
    tiene una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1; y
    (7)
    tiene una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor de 1; y
    seleccionando la preparación de -Gal A si tiene una firma de carbohidratos que corresponde a cuatro o más de los parámetros (1)-(7).
  39. 39.
    El uso de la reivindicación 38, en el que el uso comprende además ajustar la dosis de la preparación de -Gal A después de la etapa de determinación.
  40. 40.
    Un procedimiento para seleccionar un lote de una preparación de -Gal A, comprendiendo el procedimiento:
    proporcionar una pluralidad de lotes de -Gal A, teniendo cada una de la pluralidad una variación de lote a lote en la firma de carbohidratos; y
    determinar si un lote tiene menos que un intervalo de variación preseleccionado de cuatro o más de los siguientes parámetros en la firma de carbohidratos:
    (1)
    tiene al menos aproximadamente un 75% de glicanos neutros, mono-y disialilados combinados;
    (2)
    tiene menos de aproximadamente un 35% de glicanos tri- y tetrasialilados combinados;
    (3)
    tiene más de un 50% de glicanos complejos;
    (4)
    tiene menos de aproximadamente un 45% de glicanos fosforilados;
    (5)
    tiene más de aproximadamente un 45% de glicanos sialilados;
    (6)
    tiene una relación entre ácido siálico y manosa-6-fosfato en una base de mol por mol mayor que 1,5 a 1; y
    (7)
    tiene una relación entre glicanos sialilados y glicanos fosforilados mayor de 1; y
    seleccionar el lote si tiene menos que el intervalo de variación preseleccionado de cuatro o más de los parámetros (1)-(7).
  41. 41.
    El procedimiento de la reivindicación 40, en el que la variación preseleccionada es menor del 5%.
  42. 42.
    El procedimiento de la reivindicación 40, en el que la variación preseleccionada es menor del 2,5%.
  43. 43.
    El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además:
    determinar uno o más de: (1) si el aclaramiento sérico de la circulación humana es menor de 4 ml/min/kg en la parte lineal de la curva de ABC frente a la dosis; (2) si la preparación preferentemente se dirige a células del endotelio capilar/vascular, células epiteliales de los glomérulos renales (podocitos), células mesangiales glomerulares, células endoteliales renales, células pulmonares, células renales, células neurales o miocitos cardiacos en un sujeto, y (3) si la preparación no se capta por los hepatocitos del hígado.
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