JP7252211B2 - リソソーム蓄積症を治療するための薬剤、デバイス、および血液循環システム、ならびにリソソーム蓄積症を治療するための方法 - Google Patents
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Description
本願は配列表を含有し、これはASCIIフォーマットで電子提出されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。2018年8月27日に作成された前記ASCIIコピーは116227-0109_SL.txtと名付けられており、サイズは65,245バイトである。
エンド型酵素が糖分解酵素として用いられる。好ましい実施形態によれば、ムコ多糖症(例えば、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病(A、B、C、もしくはD)、モルキオ病(AもしくはB)、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症IX型、またはムコ多糖症プラス症候群)の患者に対して、グリコサミノグリカン分解酵素が糖分解酵素として用いられる。
ある。モルキオ病AおよびB型はそれぞれGALNSおよびβ-ガラクトシダーゼの欠損によって引き起こされることが公知である。モルキオ病の患者に蓄積するケラタン硫酸(ガラクトシルβ-(1→4)-N-アセチルグルコサミン二糖単位のβ-(1→3)反復から形成される)は、健康な者では次の(1)および(2)の反復反応によって非還元末端から分解される。
(1)N-アセチルガラクトサミン-6-スルファターゼ(本願において下ではGALNSともまた言われる)またはN-アセチルグルコサミン-6-スルファターゼによる、非還元末端糖残基からの6-O-硫酸基の脱硫酸化
(2)β-ガラクトシダーゼ(GLB1)またはβ-ヘキソサミニダーゼ(HexA)による、非還元末端糖残基を除去するための加水分解反応
Keiichi, and Tokuyasu Kiyochika, Biochemistry, 60, 935 (1988))およびバシラス サーキュランス(Bacillus circulans)のKsT202に由来するエンド-β-N-アセ
チルグルコサミニダーゼ(Clinical Biochemistry 48 (2015) 796-802)を包含するバシ
ラス属の微生物に由来するケラタナーゼ;エシュキリア フレンディ(Escherichia freundii)に由来するエンド-β-ガラクトシダーゼ(H.Nakagawa, T.Yamada, J-L.Chien, A.Gardas, M.Kitamikado, S-C.Li, Y-T.Li, J. Biol. Chem., 255, 5955 (1980))を包含
するエシェリキア属の微生物に由来するケラタナーゼ;ならびにシュードモナスsp.IFO-13309株に由来するエンド-β-ガラクトシダーゼ(K.Nakazawa, N.Suzuki, S.Suzuki, J. Biol. Chem., 250, 905 (1975)、K.Nakazawa, S.Suzuki, J. Biol. Chem.,
250, 912 (1975))およびシュードモナス レプチリボラ(Pseudomonas reptilivora)
によって生産されるエンド-β-ガラクトシダーゼ(特公昭57-041236号)を包含するシュードモナス属の微生物に由来するケラタナーゼを包含するが、これらに限定されない。
はヘパリナーゼIII(Glycobiology., 21, 1454-1531 (2011))を包含するが、これら
に限定されない。
and Tokuyasu Kiyochika, Biochemistry, 61, 1023 (1989))を包含するが、これらに限定されない。
びストレプトコッカス ピオゲネス(Streptococcus pyogenes)などのストレプトコッカス属の微生物に由来するヒアルロニダーゼを包含するが、これらに限定されない。
するが、これらに限定されない。
びに前記部分的なポリペプチドのドメインC(Phe81からThr192)およびドメインD(Ala227からAla294)の少なくとも1つが配列番号2のアミノ酸配列からさらに欠失したポリペプチド鎖(Glycoconjugate Journal (2017), Volume 34, Issue 5, 643-649;DOI10.1007/s10719-017-9786-3)、例えば配列番号3、4、または5のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。本発明の1つの実施形態によれば、80%以上、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらにはより好ましくは95%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を配列番号1から5のいずれか1つのアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列を有し、患者のリソソーム内の蓄積する糖部分の分解活性を有するタンパク質が、糖分解酵素として用いられる。
うに遺伝子操作された微生物から得られた酵素であり得る。
subtilis)からなる群から選択されるホスト細胞とそれらの細胞に対応する種々のベク
ターとの組み合わせを包含するが、これに限定されない。生産性および生産コストの観点からは、微生物(例えば大腸菌)が好ましい実施形態に従ってホスト細胞として用いられる。
がホスト細胞として用いられるときには、培養培地は、LB培地などを主成分として用いることによって調製され得る。さらに、COS-7細胞がホスト細胞として用いられるときには、細胞は、約2%(v/v)のウシ胎児血清を含有するDMEMを用いることによって37℃で培養され得る。
有効量を決定する能力があるであろう。
び膜(フィルター形態、中空糸形態、および平膜形態)を包含するが、これに限定されない。いくつかの実施形態によれば、治療デバイスは、糖分解酵素、例えば微粒子酵素が固定化されたカラムからなる。カラムの材料の例はポリカーボネート、ポリスチレン、ABS樹脂、およびガラスを包含するが、これに限定されない。
本願において下では、本発明の好ましい実施形態が例示されるが、本発明はこれに限定されない;
(1)有効成分として糖分解酵素を包含するリソソーム蓄積症のための治療剤であって、
糖分解酵素は、対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なり、患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する。
(2)(1)に従う治療剤であって、糖分解酵素はマンノース-6-リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
(3)(1)または(2)に従う治療剤であって、糖分解酵素は、患者のリソソームに蓄積する糖の切断部位の点で、リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる。
(4)有効成分として糖分解酵素を包含するリソソーム蓄積症のための治療剤であって、糖分解酵素はマンノース-6-リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
(5)(1)から(4)のいずれか1つに従う治療剤であって、糖分解酵素はエンド型酵素である。
(6)(1)から(5)のいずれか1つに従う治療剤であって、リソソーム蓄積症は、
ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病II型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される。
(7)(1)から(6)のいずれか1つに従う治療剤であって、リソソーム蓄積症は、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病A、サンフィリポ病B、サンフィリポ病C、サンフィリポ病D、モルキオ病A、モルキオ病B、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症IX型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される。
(8)(1)から(7)のいずれか1つに従う治療剤であって、糖分解酵素は、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド:N-グリカナーゼからなる群から選択される。
(9)(1)から(8)のいずれか1つに従う治療剤であって、糖分解酵素は、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、PNGaseF、およびエンドグリコシダーゼHからなる群から選択される少なくとも1つである。
(10)(1)から(9)のいずれか1つに従う治療剤であって、糖分解酵素は微生物に由来する。
(11)(10)に従う治療剤であって、微生物はバシラス属に属する微生物である。
(12)(1)から(11)のいずれか1つに従う治療剤であって、患者はヒトである。
(13)(1)から(12)のいずれか1つに従う治療剤であって、糖分解酵素を生産するホスト細胞は微生物である。
(14)(1)から(13)のいずれか1つに従う治療剤であって、治療剤は注射用製剤に製剤化されている。
(15)有効成分として糖分解酵素を含有するリソソーム蓄積症のための治療剤を製造するための方法であって、方法は:
糖分解酵素を生産する微生物の培養物を得るステップと;
培養物から糖分解酵素を回収するステップと;
任意に、回収された糖分解酵素を薬学的に許容される添加剤と混合することによって組成物を製剤化するステップと、
を包含する。
(16)(15)に従う方法であって、微生物は、バシラスおよびエシェリキア属に属する微生物からなる群から選択される。
(17)(15)または(16)に従う方法であって、方法は、エンドトキシンが実質的に含有されない程度まで、回収された糖分解酵素中のエンドトキシンレベルを低下させるステップを包含する。
(18)(15)から(17)のいずれか1つに従う方法であって、治療剤は(1)から(14)のいずれか1つから選択される。
(19)リソソーム蓄積症のための治療デバイスであって:
担体と担体に固定化された糖分解酵素とを包含し、
糖分解酵素は、対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なり、患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する。
(20)リソソーム蓄積症のための治療デバイスであって:
担体と担体に固定化された糖分解酵素とを包含し、
糖分解酵素はマンノース-6-リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
(21)リソソーム蓄積症を治療するための血液循環システムであって:
(19)または(20)に従う治療デバイスと;
リソソーム蓄積症患者から採取された血液を治療デバイスに輸送するための脱血側回路と;
治療デバイスに含有される糖分解酵素と接触させられた血液をリソソーム蓄積症患者に輸送するための返血側回路と;
脱血側回路および返血側回路の内部の血液を圧送するための血液ポンプと、
を包含する。
(22)リソソーム蓄積症を治療するための方法であって、(1)から(14)のいずれか1つに従う治療剤を、これを必要とする患者に投与することを包含する。
(23)リソソーム蓄積症を治療するための方法であって:
リソソーム蓄積症患者から採取された血液を糖分解酵素と接触させるステップと;
糖分解酵素と接触させられた血液を患者に輸送するステップと、を包含し、
糖分解酵素は、患者の欠損タンパク質とは異なり、患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する。
(24)(23)に従う方法であって、糖分解酵素はマンノース-6-リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
(25)(23)または(24)に従う方法であって、糖分解酵素は、患者のリソソームに蓄積する糖の切断部位の点で、リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる。
(26)(23)から(25)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素はエンド型である。
(27)(23)から(26)のいずれか1つに従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病II型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される。
(28)(23)から(27)のいずれか1つに従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病A、サンフィリポ病B、サンフィリポ病C、サンフィリポ病D、モルキオ病A、モルキオ病B、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症IX型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される。
(29)(23)から(28)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素は、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド:N-グリカナーゼからなる群から選択される。
(30)(23)から(29)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素は、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、PNGaseF、およびエンドグリコシダーゼHからなる群から選択される少なくとも1つである。
(31)(23)から(30)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素は微生物に由来する。
(32)(31)に従う方法であって、微生物はバシラス属に属する微生物である。
(33)(23)から(32)のいずれか1つに従う方法であって、患者はヒトである。
(34)(23)から(33)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素を生産するホスト細胞は微生物である。
(35)(23)から(34)のいずれか1つに従う方法であって、治療剤は注射用製剤に製剤化されている。
(36)リソソーム蓄積症を治療するための方法であって:
リソソーム蓄積症患者から採取された血液を糖分解酵素と接触させるステップと;
糖分解酵素と接触させられた血液を患者に輸送するステップと、を包含し、
糖分解酵素はマンノース-6-リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
(37)(36)に従う方法であって、糖分解酵素はエンド型である。
(38)(36)または(37)に従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病II型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される。
(39)(36)から(38)のいずれか1つに従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病A、サンフィリポ病B、サンフィリポ病C、サンフィリポ病D、モルキオ病A、モルキオ病B、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症IX型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される
。
(40)(36)から(39)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素は、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド:N-グリカナーゼからなる群から選択される。
(41)(36)から(40)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素は、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、PNGaseF、およびエンドグリコシダーゼHからなる群から選択される少なくとも1つである。
(42)(36)から(41)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素は微生物に由来する。
(43)(42)に従う方法であって、微生物はバシラス属に属する微生物である。
(44)(36)から(43)のいずれか1つに従う方法であって、患者はヒトである。
(45)(36)から(44)のいずれか1つに従う方法であって、糖分解酵素を生産するホスト細胞は微生物である。
(46)(36)から(45)のいずれか1つに従う方法であって、治療剤は注射用製剤に製剤化されている。
(酵素活性を測定するための方法)
酵素活性は、ケラタン硫酸の加水分解に従って生ずる末端還元糖の増大に基づいてパーク・ジョンソン法[J. Biol. Chem., 181, 149 (1949)]を用いることによって測定した
。すなわち、ウシ角膜に由来するケラタン硫酸の50μl(2.4mg/ml)水溶液に、50μlの酵素溶液および100μlの0.2M酢酸緩衝液(pH6.0)を追加し、反応が37℃で15分間に渡って起こることを許した。200μlの炭酸-シアン化物溶液(5.3gの炭酸ナトリウムおよび0.65gのシアン化カリウムを1000mlの水に溶解した)を反応溶液に追加することによって、反応を終了させた。それから、反応溶液に、200μlのフェリシアン化物溶液(1000mlの水に溶解した0.5gのフェリシアン化カリウム)を追加し、沸騰浴によって15分間に渡って加熱した。水浴によって反応溶液を冷却した後に、1mlの硫酸第二鉄溶液(1000mlの0.05N硫酸に溶解した1.5gの硫酸鉄(III)アンモニウム十二水和物および1gのドデシル硫酸ナトリウム)を追加し、次に混合した。反応が37℃で15分間に渡って起こることを許すことによって、測定溶液を得た。690nmにおける吸光度を、分光光度計を用いて測定し、得られた吸光度をAとしてとった。50μlの熱不活性化した酵素溶液を上記の酵素溶液の代わりに用いたこと以外は、上と同じ処理を実施することによって得られた吸光度をA0としてとった。さらにその上、10nmol/200μlのN-アセチルグルコサミン溶液を反応溶液の代わりに処理したこと以外は、上と同じ処理を実施することによって得られた吸光度をAstとしてとった。上記の条件において1分間に1μmolのガラクトースまたはN-アセチルグルコサミンに対応する還元糖を生産する酵素の量を、1単位として定義した(本願において下では、これは「単位」または「U」と略称され得る)。1mlあたりの酵素単位数は次の等式に基づいて計算した。
Bacillus circulansのKsT202株を、サメ軟骨に由来する0.2(w/v)%ケラタン硫酸を追加したブレインハートインフュージョン斜面培地(20(w/v)%ウシ脳加水分解物、25(w/v)%ウシ心臓加水分解物、1(w/v)%ペプトン消化生成物、0.5(w/v)%NaCl、0.25(w/v)%リン酸二ナトリウム、および1.5(w/v)%寒天、pH7.2)によって継代培養した。
7.5)を用いることによって行った。活性画分をUK-10膜(アドバンテック東洋株式会社製造)による限外濾過によって濃縮し、およそ100倍の量の緩衝液Aに対して透析した。透析の内側の液体を、緩衝液Aによって前もって平衡化したDEAE-トヨパール(TM)(東ソー株式会社製造)カラム(2.2cm×15cm)にかけた。爾後に、カラムを、0.1MのNaClを含有する150mlの緩衝液Aによって洗浄した。それから、カラムを0.1Mから0.2MのNaCl直線勾配によって溶出して、精製された酵素を得た。酵素画分を限外濾過によって濃縮し、Sephacryl(TM)S-300(GEヘルスケア製造)カラム(2.2cm×101cm)に載せて、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。4MのNaCl溶液を有するように、NaClを酵素画分に追加した。それから、溶液を、4MのNaClを含有する10mMトリス酢酸(pH7.5)によって前もって平衡化したフェニルセファロース(TM)(GEヘルスケア製造)カラム(1.6cm×15cm)にかけた。爾後に、カラムを4Mから0MのNaCl直線勾配によって溶出して、精製された酵素を得た。29単位の酵素が得られ、比活性は2.09U/mgであった。タンパク質濃度は参照標準としてウシ血清アルブミンを用いるローリーアッセイによって測定した。
(単回投与試験)
GALNSホモノックアウトマウスを試験に用いた。8週齢GALNSホモノックアウトマウスに、尾静脈からケラタナーゼを0.5U/ml、4μl/g体重の用量で単回投与した(処置群)。対照として、PBSを同様に投与した(無処置群)。
血清中のケラタン硫酸およびヘパリン硫酸の定量は文献に記載されている方法に基づい
て実施した(Metabolites 2014, 4, 655-679)。簡略には、血清中のケラタン硫酸およびヘパリン硫酸をグリコサミノグリカン分解酵素の混合物によって消化し、生ずる二糖の量を定量した。ケラタンモノ硫酸化型二糖標準のガラクトースβ1→4N-アセチルグルコサミン-6-硫酸はCarbosynthから購入した(製品コードOA09703)。非硫酸化型の不飽和ヘパラン二糖(デルタdiHS-0S)標準は生化学工業から得た。より詳細な測定方法は本願において以下に記載されている。
図2Aはケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルを示している。ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルは、微生物に由来する糖分解酵素の単回静脈内投与によって2週間を超えて有意に減少した。
(反復投与試験)
GALNSホモおよびヘテロノックアウトマウスを試験に用いた。生後1日または2日に、ホモノックアウトマウスに、80mU/ml、25μl/g体重のケラタナーゼを浅側頭静脈から投与し、4および8週齢に0.5U/ml、4μl/g体重のケラタナーゼを尾静脈から投与した(処置群)。ケラタナーゼの代わりに、PBSを同じ様式でGALNSホモおよびヘテロノックアウトマウスに投与した(それぞれ無処置群およびコントロール群)。
膝関節のパラフィン包埋組織標本を下に記載されているように作製した。すなわち、採取された組織を10%(v/v)中性緩衝ホルマリン溶液によって固定した。次に、骨が軟化するまで、組織を脱灰液(ギ酸:10%(v/v)中性緩衝ホルマリン:蒸留水=1:1:18(v:v:v))によって脱灰した。脱灰完了後に、組織を硫酸ナトリウムの5%(w/v)水溶液によって一晩中和し、その後、流水中で10時間ほど洗浄した。次に、組織を次の手順のようにパラフィン包埋および切片化した;組織を順に70%(v/v)、80%(v/v)、および99%(v/v)のエタノール系列によって脱水した。次に、エタノールをキシレンに置換し、キシレンをさらにパラフィンワックスに置換した。次に、パラフィンワックス浸透組織をワックスブロックに包埋した。ミクロトームを用いて3μm厚切片を作製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン(H&E)によって染色した。
ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルの結果が図3Aに示されている。処置群のケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルは12週齢において無処置群の30%未満であった。逆に、図3Bに示されているように、デルタdiHS-0Sの血清中レベルは有意に影響されなかった。
群のマウスでは、軟骨細胞の肥大化および空胞化は無処置群のマウスと比較して抑制されていた(図5C)。
(酵素固定化カラムの調製)
1.5gのCNBr活性化セファロース(TM)4B(GEヘルスケア製造)が2.5mM塩酸中において膨潤することを許す。ガラスフィルター上において、セファロース(TM)4B樹脂を200mlの2.5mM塩酸によって数回洗浄し、最後に、0.1MのNaHCO3および0.5MのNaClを含有する100mlの緩衝液B(pH8.3)によって洗浄する。2.4mlの膨潤した樹脂に対して、上で得られたケラタナーゼの4mgを追加し、4mlの溶液Bによって懸濁する。懸濁液を低温(4℃)で24時間に渡ってゆっくり攪拌する。ガラスフィルターによって通過分を取り除いた後に、樹脂を樹脂体積の10倍の0.2Mトリス塩酸(pH8.0)中に再懸濁する。懸濁液を低温(4℃)で24時間に渡ってゆっくり攪拌する。それから、樹脂をカラムにパッキングし、3CVの0.1M酢酸ナトリウムおよび0.5MのNaCl(pH4.0)によってコンディショニングする。爾後に、カラムを0.5MのNaClを有する3CVの0.1Mトリス塩酸(pH8.0)によって洗浄する。最後に、カラムを25mlのPBSによって洗浄し、糖分解酵素固定化カラムを得る。
(C末端短縮型ケラタナーゼの調製)
C末端短縮型ケラタナーゼ遺伝子(配列番号2)をGenScriptによって合成し、6×Hisタグ配列が発現構築物のC末端に追加され得るようにしてpET26bベクターのBamHIおよびHindIII部位にサブクローニングした。発現構築物を大腸菌BL21Star(DE3)(サーモフィッシャーサイエンティフィック)に形質転換した。0.5から0.7のOD600まで、形質転換体を30μg/mlカナマイシンを有するLB培地によって37℃で培養した。0.4から1.0mMの終濃度を与えるように、イソプロピルβ-D-チオガラクトピラノシドを培養物に追加し、培養物を振盪インキュベーター内において3hに渡って37℃に保った。大腸菌細胞を遠心によって収穫し、10mMトリス塩酸、0.5MのNaCl、および1mMフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する液体中に再懸濁した。超音波処理および4℃における15minの50,000×gでの遠心によって調製した大腸菌ライセートをNi-セファロースカラムにかけ、酵素画分を直線勾配の0から300mMイミダゾールによって溶出した。酵素画分中のエンドトキシンを低下させるために、5%(v/v)のTritonX-114を混合し、混合物を氷上で5minに渡って冷やした。それから、混合物を5minに渡って37℃水浴中に保ち、次に5minの2,300×gによって上相を回収した。エンドトキシンを低下させるためのこのステップを5回反復した。酵素溶液を限外濾過デバイス(アミコンウルトラ15-100K、メルクミリポア)によって濃縮し、PBSによって平衡化したHiprep(TM)16/60sephacrylカラム(GEヘルスケア)に載せた。もたらされた溶液を0.22μm濾過によって滅菌した。11.3U/mlの酵素活性および1.5U/mgの比活性および0.003エンドトキシン単位/mgタンパク質のエンドトキシンレベルを有する5mlの液体が最後に得られた。タンパク質濃度は参照標準としてウシ血清アルブミンを用いるマイクロBCAアッセイによって測定した。
1gのCNBr活性化セファロース4B(GEヘルスケア製造)が2.5mM塩酸中において膨潤することを許した。ガラスフィルター上において、セファロース4B樹脂を200mlの2.5mM塩酸によって数回洗浄し、最後に、0.1MのNaHCO3および0.5MのNaClを含有する10mlの緩衝液B(pH8.3)によって洗浄した。上で得られた1.0mlの緩衝液B中のおよそ4.5mgのケラタナーゼを1.0mlの膨
潤した樹脂に懸濁した。代替的には、1.0mlの膨潤した樹脂を1mlの緩衝液B単独(コントロール)に、または10mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)を含有する1mlの緩衝液Bに懸濁した。懸濁液を常温で2時間に渡ってゆっくり攪拌した。使い捨て空カラム(ポリプレップ(TM)クロマトグラフィーカラム、バイオ・ラッド)を通過する画分を取り除いた後に、樹脂を10mlの0.2Mトリス塩酸(pH8.0)中に再懸濁した。懸濁液を4℃で一晩ゆっくり攪拌した。それから、未固定化(コントロール)、BSA固定化、またはケラタナーゼ固定化樹脂の各1mlをそれぞれポリプレップ(TM)カラムにパッキングした(ベッド高2cm)。残存する自由なCNBr基がブロッキングされ得るようにして、パッキングしたカラムを3CVの緩衝液Bおよび0.2Mトリス塩酸(pH8.0)によって3回洗浄し、次に5CVのPBSによって洗浄した。このやり方で、コントロールカラム、BSA固定化カラム、およびケラタナーゼ固定化カラムを得た。
各カラムからの溶離液中のケラタン硫酸含量を定量した。簡略には、カラム溶離液の残留液をケラタナーゼIIによって消化し、生ずる二糖の量を次のように定量した。
(マウス組織中のケラタン硫酸レベルの測定)
GALNSホモノックアウトマウスを試験に用いた。4週齢GALNSホモノックアウトマウスに尾静脈から0.5U/ml、4μl/g体重の用量でケラタナーゼを単回投与した(処置群)。ケラタナーゼの代わりに、PBSを同じ様式で投与した(無処置群)。マウスを投与後24時間に屠殺した。血清および組織サンプルを採取し、使用時まで冷凍保存した。凍結した組織をSKミル(凍結破砕器具、株式会社トッケン)によって破砕し、12Uのテルモリシン(シグマ、T7902)によって、5mMのCaCl2を有する200mM酢酸アンモニウムpH8.1中において70℃で16hに渡って消化した。可溶化したサンプルを20,000×gで15minに渡って遠心し、上清を9体積の冷エタノールと混合し、それから-20℃に16h保った。ケラタン硫酸を15minの20,000×gにおける遠心によって沈殿させた。沈殿を300μlの蒸留水によって戻し、ケラタン硫酸レベルの測定に用いた。血清および組織サンプル中のケラタン硫酸の量を、例1に記載されている同じ様式でLC-MS/MSシステムによって測定した。
ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルの結果が図6に示されている。処置群のケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルは無処置群よりも有意に低かった。
2 血液回路
2a 脱血側回路
2b 返血側回路
3 血液ポンプ
100 治療血液循環システム
[配列表]
>AAO88279.1 エンド-ベータ-N-アセチルグルコサミニダーゼ[Bacillus
circulans](配列番号1)
MSSRLKRKCSMLLTFTMIFQLLGLFLFKGEIVSASIRQDPTTGNYYKNVPLVGADFDDASNSNIVAKGTWDDNTAPLNTFFVDKGTATDGGFTTARITTVTDQVYEGGSLQFGDGSTYPINLNYKVDGLEVGATYRLSAYMKLFPGYPAKGGQFGVKNHDTANYTTGGETKSVNFSTVTADWKEYSVTFTPTYPHAKIFFWGSNNLPKVLVDKLRLEKVLEHPGPAAPAVTADDVNNIVVGIDETMEYNINGAGWVAYKEYAKPDLKGDLIVQIRVKETLNTLAGEVTTLTFTAQNDPAPGQPEQLLLKDGDFEAGAASVTTDTNVQNQFFSKNNQYEIVTGDTASGQYALKLRSPETIGYHKTDLKPSTKYQISFMAKVGSASQKLSFRISGYKNDNPYDLDNVMNYIEHTQMKNTGWSRFYYDLETGPSATSAFIDFSTAAGSTAWIDDVKLVEQGPADPPVTEPTLSRGSRLFLEKGLQIQSWVPTDVAYATRKWMKPPTAEEIVDLGLTTVQYNDAPNYSKTLHEEYKKLQQTNPSLPDLKWGVAFGPNANHLSSSYFDSETIAKHDPNKTGAPTEEQKARGFLTPDQLANVQNLNNIGFGDEEDYSDTLTQTLKEWFEVSKKHYPNVLVHHNEVGNTPPPTMSLISTFNENMLRKYMRTAKPDFITYDMYYFRENRQSSEVGGTVIPFYDDLNRYRKVASEGYDGSGLSPIPFGTYLQGWRTGPGAATYEKRGDGWYEITESQAYLSAFANWTFGAKWLSMFRWIEDTPGYLFSDYRPDEDGNWPKYHIYGQYKEMFRQSKNLGEHLIRINNKDVVIVPGQHMKDGQITKNNRPKDNPEWTKSGDRAFIDSLEISNLGKTNHSLKGDVFIGYFDPLPGIDTTQFFTSTAPKYFMLLNGLTSGQGLPAEEQTGSSYETRQEIKVTFDLSGGQARADQLRKVSRLTGELVAAPLKDLGNGKYEMTVVLGGGMADLYFWELGSLNTGNSKPVVADTPHDVRLTGDPKYAKNREIRDLTGKTVTVGWIKDTYSPVPQPLIHYNFSFTKDQNGKLQPMKNPDILSYFTRYYENTLWNKRVERIQKESNVKLEFVADIAWTKQELMDNIRKVKEGQTVDGMPDILIVPDEWTWSGLIQNEMILPASSFSEFDFTERKWNKSYKAMTTWKDQIYGMYAGPTMNSTGLFVNKALQASIGVTDDLMALQQNNAWDWNKLREVASAFQASANREGKYLLAGTDELFKQMVYANGAARGSVGGAMNQEFDLTSSSFREAAELYSELHAAGLIAAKPEGATDDWYVEQFSKNNILFLALPYQQTVDKLKFSYTNQDAVIEMKEGSFLGQPALIPTIVDAYETAYPDGIYKMAQGDWVFLMFPKGPSATGYAAMIDNPAYPVLLSSSANPADAAYVWNILSHEFEGVAYDRFLKLYLNQREVDKTTLKRIGLKEGVWDSYSGTGAWEQVIKPGVLPMLQAGVIDEAKLAELSVEAASYVTNNMTKPAQPGEEPGEEPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGAGNGSENQGGNEDQGGNGSQGGNGPKPEKIIVKPGELIAVEGKVTIVVPAGATEIVLPPQAAELPQQHKVELKTDRVTLEVPSGLLKKLASRIADKDVSISLKAAPLTAAQAKDAISKNKSVSPSAITLAGGVYDFKLSAAGANGSYAELSEFDQPITISLKIESGVNPEQVGIYYISGNGKLDYIGGEYRDGELAAEVTHFSQYAVLKVVKVFDDVPAGHWAEGVISKLTSRLMVDGTSETTFEPERVVTRAEFTALLARALKLTAGGTPTFADVKAGDWYADAVTAAVEAGIAEGKSAGQFEPQARITREEMVVMTMRAYNKAKDKGPSTGVEASFTDENQISAWAVEQVKAAAALQLIQGRAQGKFEPQGTATRAEAVQVIFNMLLK
//
>C末端短縮型ケラタナーゼ[人工配列](配列番号2)
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//
>ドメインC欠失ケラタナーゼ[人工配列](配列番号3)
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//
>ドメインD欠失ケラタナーゼ[人工配列](配列番号4)
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//
>ドメインC,D欠失ケラタナーゼ[人工配列](配列番号5)
SIRQDPTTGNYYKNVPLVGADFDDASNSNIVAKGTWDDNTAPLNTFQNDPAPGQPEQLLLKDGDFEAGAASVTTDTNVQNQFFSKNNQYEIVTGDTASGQYALKLRSPETIGYHKTDLKPSTKYQISFMAKVGSASQKLSFRISGYKNDNPYDLDNVMNYIEHTQMKNTGWSRFYYDLETGPSATSAFIDFSTAAGSTAWIDDVKLVEQGPADPPVTEPTLSRGSRLFLEKGLQIQSWVPTDVAYATRKWMKPPTAEEIVDLGLTTVQYNDAPNYSKTLHEEYKKLQQTNPSLPDLKWGVAFGPNANHLSSSYFDSETIA
KHDPNKTGAPTEEQKARGFLTPDQLANVQNLNNIGFGDEEDYSDTLTQTLKEWFEVSKKHYPNVLVHHNEVGNTPPPTMSLISTFNENMLRKYMRTAKPDFITYDMYYFRENRQSSEVGGTVIPFYDDLNRYRKVASEGYDGSGLSPIPFGTYLQGWRTGPGAATYEKRGDGWYEITESQAYLSAFANWTFGAKWLSMFRWIEDTPGYLFSDYRPDEDGNWPKYHIYGQYKEMFRQSKNLGEHLIRINNKDVVIVPGQHMKDGQITKNNRPKDNPEWTKSGDRAFIDSLEISNLGKTNHSLKGDVFIGYFDPLPGIDTTQFFTSTAPKYFMLLNGLTSGQGLPAEEQTGSSYETRQEIKVTFDLSGGQARADQLRKVSRLTGELVAAPLKDLGNGKYEMTVVLGGGMADLYFWELGSLNTGNSKPVVADTPHDVRLTGDPKYAKNREIRDLTGKTVTVGWIKDTYSPVPQPLIHYNFSFTKDQNGKLQPMKNPDILSYFTRYYENTLWNKRVERIQKESNVKLEFVADIAWTKQELMDNIRKVKEGQTVDGMPDILIVPDEWTWSGLIQNEMILPASSFSEFDFTERKWNKSYKAMTTWKDQIYGMYAGPTMNSTGLFVNKALQASIGVTDDLMALQQNNAWDWNKLREVASAFQASANREGKYLLAGTDELFKQMVYANGAARGSVGGAMNQEFDLTSSSFREAAELYSELHAAGLIAAKPEGATDDWYVEQFSKNNILFLALPYQQTVDKLKFSYTNQDAVIEMKEGSFLGQPALIPTIVDAYETAYPDGIYKMAQGDWVFLMFPKGPSATGYAAMIDNPAYPVLLSSSANPADAAYVWNILSHEFEGVAYDRFLKLYLNQREVDKTTLKRIGLKEGVWDSYSGTGAWEQVIKPGVLPMLQAGVIDEAKLAELSVEAASYVTNNMTKPAQPG
//
Claims (10)
- 有効成分として糖分解酵素を含むリソソーム蓄積症のための治療剤であって、
前記糖分解酵素が、対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なり、前記患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有し、
前記糖分解酵素が、(a)~(d)の少なくとも1つに該当し、
(a)マンノース-6-リン酸部分またはマンノース部分を有さない、
(b)前記患者のリソソームに蓄積する糖の切断部位の点で、前記リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる、
(c)エンド型である、
(d)微生物に由来する、
注射用製剤に製剤化されている、治療剤(ただし、治療タンパク質を発現する遺伝的に修飾された細胞を含む治療剤を除く)。 - 前記リソソーム蓄積症が、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病II型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される、請求項1に記載の治療剤。
- 前記リソソーム蓄積症が、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病A、サンフィリポ病B、サンフィリポ病C、サンフィリポ病D、モルキオ病A、モルキオ病B、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症IX型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される、請求項1に記載の治療剤。
- 前記糖分解酵素が、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド:N-グリカナーゼからなる群から選択される、請求項1に記載の治療剤。
- 前記糖分解酵素が、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、α-ガラクトシダーゼ、PNGaseF、およびエンドグリコシダーゼHからなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1に記載の治療剤。
- 前記患者がヒトである、請求項1に記載の治療剤。
- 前記糖分解酵素を生産するホスト細胞が微生物である、請求項1に記載の治療剤。
- 請求項1に記載の治療剤を製造するための方法であって:
糖分解酵素を生産する微生物の培養物を得るステップと;
前記培養物から糖分解酵素を回収するステップと;
任意に、回収された前記糖分解酵素を薬学的に許容される添加剤と混合することによって組成物を製剤化するステップと、を含む、方法。 - 前記微生物が、バシラスおよびエシェリキア属に属する微生物からなる群から選択される、請求項8に記載の方法。
- さらに、エンドトキシンが実質的に含有されない程度まで、前記回収された糖分解酵素中のエンドトキシンレベルを低下させるステップを含む、請求項8に記載の方法。
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