JP2002538181A

JP2002538181A - 生体材料の患者への導入

Info

Publication number: JP2002538181A
Application number: JP2000602761A
Authority: JP
Inventors: オロンヤコビ−ゼーヴィ，
Original assignee: インサイトストラテジーアンドマーケティングリミテッド
Priority date: 1999-03-02
Filing date: 2000-02-10
Publication date: 2002-11-12
Also published as: NO20014218L; US20030031660A1; WO2000052149A1; CA2364463A1; AU2988100A; NO20014218D0; AU761592B2; US20010006630A1; EP1159409A1; IL144932A0; US20040175371A1; EP1159409A4

Abstract

(57)【要約】生体製剤が提供され、その生体製剤は、生体材料と、その生体材料の外側に付着されている精製された天然のまたは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素とを含有している。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】発明の属する技術分野本発明は、生体材料を患者に導入する方法、製剤および医薬組成物に関する。
詳しくは、本発明は、細胞、組織および薬物送達システムを患者に、有効に導入
する方法、製剤および医薬組成物に関する。

【０００２】従来の技術と発明が解決しようとする課題プロテオグリカン類（ＰＧ）：プロテオグリカン類（以前はムコ多糖と呼ばれ
ていた）は、身体のあらゆる組織に見られる著しく複雑な分子である。ＰＧは互
いに会合し、かつ細胞や組織の他の主要な構造成分、例えばコラーゲンやエラス
チンとも会合している。いくつかのＰＧは特定の接着性タンパク質、例えばフィ
ブロネクチンおよびラミニンと相互に作用している。グリコサミノグリカン類（
ＧＡＧ）は、その多糖連鎖が長く伸びていてかつゲル化することができるので、
小分子を比較的自由に拡散させるが、大きな巨大分子が通過するのを阻止する。
ＧＡＧが伸張した構造を有しかつ巨大なマクロ分子凝集体を形成することが多い
ので、ＰＧはタンパク質に比べて細胞外マトリックスのうちの大きな容積を占め
ている（Murry RKとKeeley FW；Biochemistry，57章667〜685頁）。

【０００３】ヘパラン硫酸プロテオグリカン類（ＨＳＰＧ）は、細胞膜と細胞外マトリック
スと会合している酸性多糖タンパク質の複合体である。ヘパラン硫酸プロテオグ
リカン類は、細胞外マトリックス成分、成長因子類、成長因子結合タンパク質類
、サイトカイン類、細胞接着分子類、脂質代謝のタンパク質、分解酵素類および
プロテアーゼ阻害物質を含む各種の生体エフェクター分子に強く結合している。
これらの相互作用によって、ヘパラン硫酸プロテオグリカン類は、生物学的に、
機能的な役割を演じ、事実、これらプロテオグリカン類の大部分の機能は、その
ヘパラン硫酸の連鎖によるものであり、多数の系における細胞−細胞の相互作用
および細胞の増殖と分化に寄与している。ヘパラン硫酸は、組織の完全性と内皮
細胞の機能を維持する。ヘパラン硫酸は、接着分子として働き、接着を誘発する
サイトカイン類（特にケモカイン類）を提供し、白血球の局在化と活性化を容易
にする。ヘパラン硫酸は炎症細胞が分泌する酵素類の活性化と作用を調節する。
ヘパラン硫酸の機能が免疫応答の過程で変化するのは、ヘパラン硫酸の代謝の変
化、およびヘパラン硫酸結合分子類の特異な発現とこれら分子間の競合が原因で
ある（Selvan RSら、Ann. NY Acad. Sci．797巻127〜139頁1996年）。

【０００４】また、ＨＳＰＧ類は血管の支配的な成分である（Wight TNら、Arteriosclerosi
s., 9巻1〜20頁1989年）。ＨＳＰＧ類は、大血管においては、大部分、血管の内
膜と中膜に集中しており、一方、毛細血管においては、主として内皮下基底膜内
に見られ、その膜内で増殖し遊走する内皮細胞を支持し、毛細血管壁の構造を安
定化する。ＨＳＰＧが、コラーゲン、ラミニンとフィブロネクチンなどの細胞外
マトリックス（ＥＣＭ）巨大分子および形質膜上の異なる付着部位と相互に作用
する性能は、このプロテオグリカンが、ＥＣＭ成分の自己集合と不溶性および細
胞の付着と移動に重要な役割を果たしていることを示唆している。

【０００５】ヘパラナーゼ−ＧＡＧ分解酵素：ＧＡＧの分解は、一連のリソソーム加水分解
酵素で実施される。特定のＧＡＧの異化作用に関与している一つの重要な酵素は
ヘパラナーゼである。ヘパラン硫酸を特定のインターチェーン（interchain)部
位で切断するのはエンド−β−グルクロニダーゼである。Ｔリンパ球、Ｂリンパ
球、血小板、顆粒球、マクロファージ、およびマスト細胞と、内皮下細胞外マト
リックス（ＥＣＭ）との相互作用は、ヘパラナーゼの活性によるヘパラン硫酸の
分解と関連がある。結合組織活性化ペプチドIII（ＣＴＡＰ）すなわちα−ケモ
カインはヘパラナーゼとして作用することができ、そしていくつかのヘパラナー
ゼ類は、非常に小さい微環境のｐＨによって、接着分子または分解酵素として作
用する。この酵素は、各種の活性化シグナル（例えばトロンビン、カルシウムイ
オノホア、免疫複合体類、抗原類およびマイトジェン類）に応答して細胞内コン
パートメント類（例えばリソソーム類、特定の顆粒類）から放出されるが、この
ことはこの酵素が炎症と細胞性免疫に規制された関与をしていることを示唆して
いる（Vlodavsky Iら、Invasion Metas．12(2)巻112〜127頁1992年）。対照的に
、各種の腫瘍細胞は、それらの転移性と関連して、構成的方式（constitutive m
anner）で、ヘパラナーゼを発現し分泌するようである（Nakajima Mら、J. Cell
Biochem．36(2)巻157〜167頁1988年2月）。

【０００６】白血球による組織浸潤のプロセス中の重要なプロセスとしては、血管内皮のル
ミナール表面への白血球の付着、白血球の血管内皮細胞層の通過およびこれに続
く一群の分泌されるおよび／または細胞表面のプロテアーゼとグリコシダーゼの
活性による、下側の基底膜と細胞外マトリックスの分解がある。したがって、ヘ
パラン硫酸のヘパラナーゼによる切断が、内皮下ＥＣＭの分解を起こして、血液
が運ぶ正常な細胞および悪性の細胞の血管外滲出に決定的な役割を演じる（Vlod
avsky Iら、Inv. Metast., 12巻112〜127頁1992年；Vlodavsky Iら、Inv. Metas
t., 14巻290〜302頁1995年）。

【０００７】ヘパラナーゼが細胞の移動と浸潤の際に機能するのみならず、間接的な血管新
生応答を誘発することはすでに立証されている（Vlodavsky Iら、Trends Bioche
m. Sci., 16巻268〜271頁1991年）。ＥＣＭＨＳＰＧは、塩基性線維芽細胞増
殖因子（ｂＦＧＦ）に対する天然の貯蔵場所を提供する。したがって、活性ｂＦ
ＧＦをＥＣＭ内のその貯蔵場所から、ヘパラナーゼが仲介して放出する機構は、
正常なまたは病的な状態の血管新生を誘発する新規な機構である（Vlodavsky I
ら、Cell. Molec. Aspects. 327〜343頁1993年、Acad. Press. Inc. ；Thunberg
Lら、FEBS Lett. 117巻203〜206頁1980年）。ヘパラン硫酸が、ヘパラナーゼに
よって分解されると、他のヘパリン結合成長因子、ならびに基底膜内にヘパラン
硫酸によって封鎖されている酵素と形質タンパク質、細胞外マトリックスおよび
細胞表面が放出される（Selvan RSら、Ann. NY Acad. Sci., 797巻127〜139頁19
96年）。

【０００８】骨髄間質細胞の細胞治療と遺伝子治療への使用：骨髄間質細胞（ＭＳＣ）は、
各種の間葉細胞に分化する潜在性を有している。過去数年間にわたって、ＭＳＣ
は細胞治療と遺伝子治療の両者に使用する伝達体として研究されている。これら
の細胞は、局所麻酔下で得ることができる骨髄の少量吸引液から比較的容易に単
離することができ、また、培養で拡張し、そして外因性遺伝子をトランスフェク
トすることも比較的容易である。ＭＳＣ類を治療に用いるいくつもの異なる方法
が下記のように追求されている。（ｉ）変形性関節症の患者の骨髄からＭＳＣを単離し、そのＭＳＣを培養で拡
張し、次にその拡張された細胞を使用し、関節に直接注射することによって関節
面を再建する。あるいは、ＭＳＣを十分に治癒していない骨に移植してその修復
プロセスを高めることができる。（ii）分泌される治療タンパク質をコードする遺伝子をＭＳＣ中に導入し次に
その細胞を全身的に注入し、その結果、その細胞が骨髄または他の組織に戻って
治療タンパク質を分泌する。ＭＳＣは、その細胞が骨髄を再増殖させるだけでな
く、他の組織、例えば骨、肺および恐らくは軟骨と脳などの再増殖のための子孫
も提供する条件下で全身的に注入する。最近の実験は以下のことを示した。すな
わち、変異したコラーゲン遺伝子を発現するため衰弱している若いマウスに、正
常マウス由来のドナーＭＳＣを注入すると、その正常なドナー細胞は、受容マウ
スの骨、軟骨および脳の細胞の３０％まで整復する。これらの結果は、Ｉ型コラ
ーゲンの遺伝子が変異していることによって起こる重篤なＯＳインパーフェクタ
（osimperfecta）の小児に見られる骨の欠陥を治療するため、現在進行中の臨床
試験の基礎になった（Prockop DJ;Science，276巻71〜74頁1997年）。従来致命
的であると考えられていたリソソームとペルオキシゾームの疾患の治療と治癒す
る可能性が、過去１０年間で現実のものになった。骨髄移植が、疾患を起こす酵
素欠損症の修復法を提供した。ドナー骨髄由来の細胞は、酵素を無期限に提供し
続ける。異染性白質ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、ハーラー症候群
（ＭＰＳＩ）、マロトー・ラミー症候群（ＭＰＳ VI）、ゴーシェ病、および
フコース蓄積症といった多様な疾患の多数の患者が長期間の移植によって治療さ
れ成功している。中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の動物モデルにおいて、その疾患の
症状発現は正常ドナーからの移植によって予防または改善される。ミクログリア
細胞系は、骨髄移植による酵素活性の最も適当な伝達体とみなされている。成熟
した動物またはヒトのミクログリアは、新しく移植された骨髄から誘導される（
Krivit Wら、Cell Trans. 4(4)巻385〜392頁1995年）。動物モデルで、ＭＳＣは
レトロウィルスを使用してトランスフェクトすることができ、高レベルの遺伝子
発現を、生体外と生体内で達成できる（Lazarus HMら、Bone Marrow Transpl.,
16巻557〜564頁1995年）。 (iii) 治療タンパク質を分泌するＭＳＣは、タンパク質を拡散させるが細胞自
体を拡散させないある種の不活性材料で被包することができる。IX因子の遺伝子
をトランスフェクトされたヒトＭＳＣは、ＳＣＩＤマウスに全身注入を行った後
、少なくとも８週間、前記タンパク質を分泌することが報告されている（Procko
p DJ;Science，276巻71〜74頁1997年）。

【０００９】骨髄間質線維芽細胞（ＭＳＦ）が多分化能性であることは十分に立証されてい
る。しかし、この細胞の初期増殖と続く成熟を刺激する因子は十分に確定されて
いない。ｂＦＧＦだけが、増殖をわずかに刺激することが発見された（Gehron R
obey Pら、6^ｔｈinternational conference on the molecular biology and pat
hology of matrix, session IV）。他の研究者は、間質細胞を骨髄に移植するこ
とが著しく困難であり、免疫不全マウスに移植された間質細胞は脾臓、肝臓また
は肺臓に生存するが骨髄には生存しないことを立証している（Lazarus HMら、Bo
ne Marrow Transpl. 16巻557〜564頁1995年）。細胞治療および遺伝子治療に対する一次皮膚線維芽細胞と角化細胞の使用：皮
膚は、身体の内部環境の完全性を保護する非常に重要な役割を演じている。身体
のこの最大の器官の相当な部分が損失すると、生命を維持することができない。
再建手術または熱傷管理を行う場合、皮膚の置換が必要なことが多い。伝統的な
方法、例えば分層皮膚移植もしくは全層皮膚移植、組織皮膚弁および遊離組織の
移植などの方法に加えて、生体外または生体内での皮膚生体工学が、過去数十年
間にわたって開発されている（Pomahac Bら、Crit Rev Oral Biol Med，9(3)巻3
33〜344頁1998年）。

【００１０】皮膚弁のプレファブリケーション(prefabrication)は、移植された動静脈ペデ
ィクル(arteriovenous pedicle)と被移植者の組織との間に起こる血管新生の応
答によって決まる。この血管新生応答の血管新生成長因子による増大は、皮膚弁
の生存を最大限にし、そしてペディクル移植と皮膚弁の回転の間の間隔を最小限
にする。内因性成長因子の生物活性を最大にすると、皮膚弁の生存に対し同様に
決定的に影響する。外因性成長因子を人工的に添加することに依存せずに、内因
性成長因子の生物活性を最大にするように設計された基質を使用する方法が皮膚
弁の生存を改善する方法を研究する際の新しい方法になっている(Duffy FJ Jrら
、Microsurg., 17(4)巻176〜179頁1996年）。肥厚性瘢痕を減らすための臨床戦略には、皮膚の移植または培養された上皮自
己移植を適用することによって創傷を早く閉鎖する試みが含まれていなければな
らない（Garner WL，Plast Reconstr Surg 102(1)巻135〜139頁1998年）。

【００１１】表皮細胞と真皮細胞は、各種の技法を使って、生体外で増殖させることができ
る。深い熱傷の傷を被覆するための自己表皮置換物は３週間以内に調製できる。
皮膚細胞の三次元培養の栄養を最適化する新しい技法が要求されており、この技
法によって皮膚再建の分野がさらに進歩するに違いない(Benathan Mら、Rev Med
Suisse Romande, 118(2)巻149〜153頁1998年）。

【００１２】培養された内皮の自己移植は、広範囲の皮膚の創傷を被覆する興味深い方法を
提供する。この方法の主な問題点は、移植後、最初の数週間、機械的に不安定な
ことである。培養された角化細胞の自己移植の上記欠点は、成熟した機能性の真
皮−表皮の結合を欠いていることが原因であるという証拠がある(Raghunath Mら
、Pediatr Surg Int, 12(7)巻478〜483頁1997年）。

【００１３】角化細胞の移植は、急性外傷および慢性の治癒していない創傷を治療するのに
利用できる。活性化された角化細胞は多種の成長因子を分泌するので、角化細胞
のシートは特に脆弱でありかつ臨床上の生着を評価することが困難であり、この
ことは生着はさておいて創傷の治癒に影響する。培養された角化細胞の自己移植
の代わりに真皮の自己移植が必要であるという圧倒的な証拠がある（Myers Sら
、Am J Surg, 170(1)巻75〜83頁1995年）。

【００１４】一次皮膚線維芽細胞の遺伝的修飾は、欠損している伝達物質特異的な酵素また
は栄養物質を、損傷を受けたＣＮＳまたは疾病にかかったＣＮＳに集中的に送達
する新しい方法を提供する。線維芽細胞は、欠陥がある神経の連結度を解剖学的
に修正できないが、生体内で、酵素や成長因子に対し生物学的ポンプとして働く
。遺伝的に加工された細胞が、ＣＮＳ障害の動物モデルの疾患表現型を改善でき
ることによって、結局、機能が回復する。現時点で、一次皮膚線維芽細胞は、パ
ーキンソン病の動物モデルに対し遺伝子導入と脳内移植を適用するのに便利な細
胞集団のようである（Kawaja MDら、Genet Eng(NY), 13巻205〜220頁1991年）。

【００１５】遺伝子送達のための酵素の使用：細胞治療または遺伝子治療にＥＣＭ分解酵素
を使うことは非常に限定されている。エラスターゼとともにプレインキュベート
すると、複製欠損アデノウィルスベクターをウサギ腸骨動脈に、検出可能な動脈
の損傷なしで、カテーテルに基づいて遺伝子送達を行うときのトランスダクショ
ンの効率が増大したことを一つの報告が示した。経皮アデノウィルスが仲介する
動脈中膜への遺伝子送達に対する主な障害は内弾性層板のようである（Maillard
Lら、Gene therapy, 5巻1023〜1030頁1998年）。組織再生時のＥＣＭとｂＦＧＦの役割：ＥＣＭＨＳＰＧは、塩基性線維芽細
胞成長因子（ｂＦＧＦ）の天然の貯蔵場所を提供する。したがって、ＥＣＭ内の
ｂＦＧＦ貯蔵場所から活性ｂＦＧＦをヘパラナーゼが仲介して放出することは、
正常な状態または病的状態で血管新生を誘発する新規な機構を提供する（Vlodav
sky Iら、Cell. Molec. Aspects. Acad. Press. Inc. 327〜343頁1993年；Thunb
erg Lら、FEBS Lett., 117巻203〜206頁1980年）。ｂＦＧＦは骨マトリックス内
に見られる内因性因子の一つである。ｂＦＧＦは、骨芽細胞および軟骨細胞を含
む多種の細胞型のマイトジェンである。ｂＦＧＦの投与量が低いと骨のカルシウ
ム含量が増大するが、投与量が高いと骨のカルシウム含量が低下する。したがっ
て、外因性ｂＦＧＦは、骨形成誘導の早期相中の増殖を刺激することができる。
ｂＦＧＦは、骨移植対における骨形成を、投与量と投与方法に応じて刺激する。
ヒアルロリネートのゲルがｂＦＧＦの徐放担体として有効であることが報告され
ている(Wang JS, Acta Orthop. Scand. Suppl., 269巻1〜33頁1996年）。ｂＦＧ
Ｆの注入は、早期と後期の両者で注入されると、骨移植体での骨の内部成長を増
大するが、その効果は、数週間後にのみ判定できる(Wang JSら、Acta Orthop Sc
and, 67(3)巻229〜236頁1996年）。

【００１６】ｂＦＧＦは、ラットの骨折モデルでカルス(callus)の容積を増大すると報告さ
れている。しかし、分節骨欠陥を、ｂＦＧＦ溶液を塗布することによって修復す
るのに成功したという報告はない。大きな骨欠陥の治癒に成功するには、ｂＦＧ
Ｆの適切な投与量と適当な送達システムが必要である。これらの知見は、ｂＦＧ
Ｆのミニペレットが、臨床のプラクティスで、有力な価値があることを示唆して
いる(Inui Kら、Calcif Tissue Int, 63(6)巻490〜495頁1998年）。

【００１７】生物分解性ヒドロゲル類と複合体を形成したｂＦＧＦによる骨の再生が、臨床
上ほとんど不可能であるとみなされていた頭蓋骨の欠陥の修復に利用された(Tab
ata Yら、Biomaterials., 19(7〜9)巻807〜815頁1998年）。

【００１８】げっ歯動物に脱塩骨マトリックスを移植すると、移植体の内側に移植体に隣接
して新しい骨を形成するに至る一連の細胞現象が誘発される。このプロセスは、
骨マトリックス内に存在する誘導タンパク質(inductive protein)によって開始
されると考えられた。このプロセスが一旦開始されると、局所成長因子がそのプ
ロセスをさらに調節することが示唆されている。骨の形成は、すべての移植体に
よって、３週間後に誘発された。ｂＦＧＦで処置された移植体の鉱質化(mineral
ized)された組織の量は、未処理の対照移植体より２５％多かった(Aspenberg P
ら、Acta Orthop Acand,60(4)巻473〜476頁1989年）。

【００１９】カルボキシメチルセルロースゲル中の組換えヒトｂＦＧＦを、脱塩骨マトリッ
クス移植体に局所適用すると、ラットに移植してから３週間後のカルシウム含量
で測定した骨の収量が増加する。この増大は３〜４週間の時点で見られたがそれ
より早くまたはそれより後には見られなかった。さらに、その刺激作用は、３〜
７５ｎｇ／移植体の投与量で見られた。０．６ｎｇまたは３８０ｎｇの投与量は
骨の収量を増大しなかったが、１９００ｎｇは著しい抑制作用があった(Aspenbe
rg Pら、Acta Orthop Acand, 62(5)巻481〜484頁1991年）。

【００２０】大網の移植すなわち大網の一部を取り出して消化器官に移植することによって
、胃または十二指腸の穿孔性潰瘍を修復する外科的処置は、潰瘍の治癒を加速し
かつ潰瘍の再発を阻止する。大網を移植した群には、より大きな抗炎症活性と血
管新生活性および加速されたコラーゲン合成が見られた。ｂＦＧＦ仲介の血管新
生が、この群に、大網内または大網のまわりのＴＧＦ−β１活性とともに認めら
れた(Matoba Yら、J. Gastroenterol., 31(6)巻777〜784頁1996年）。

【００２１】ｂＦＧＦを適用することによって、ステロイド、化学療法およびＸ線照射で治
療した治癒修復ラットモデルに形成が復活した。ｂＦＧＦを繰り返し適用すると
、糖尿病マウスの全厚みを切りとられた創傷の閉鎖を加速するが、投与量が高い
とむしろ応答が低下した。対照的に、創傷組織を形態学的に肉眼評価を行ったと
ころ、投与量依存方式で血管新生と肉芽組織の形成が高まったことが明らかにな
った。これらの知見は、過剰量のｂＦＧＦを局所に適用すると、血管新生と肉芽
組織の形成の両者の応答が引きのばされるため、創傷閉鎖を促進するｂＦＧＦの
性能を低下させるということを示唆している（Okumura Mら、Arzneimittelforsc
hung, 46(10)巻1021〜1026頁1996年）

【００２２】対照および虚血の後肢における内因性ｂＦＧＦのレベルと、外因性の組換えｂ
ＦＧＦとヘパリンの投与に対する応答が報告された。動脈閉塞によって、すべて
の虚血筋肉群の内因性ｂＧＦＧのレベルが１０倍に増大した。動脈を結紮したと
きに、ｂＦＧＦ含有ヘパリン−セファロースペレットを筋肉内に移植すると、未
処置の虚血肢と比べて３週間にわたって血流が著しく増大した。ｂＦＧＦの追加
投与量を結紮してから４週間後に投与したとき、血流がさらに増大した（Chlebo
un JOとMartins RN, Aust. NZJ Surg., 64(3)巻202〜207頁1994年）。

【００２３】胚盤胞を着床する際のＥＣＭとｂＦＧＦの関与：着床の際、栄養外胚葉が子宮
の先端管腔内皮細胞面（apical uterine luminal epithelial cell surface）に
付着する。ヒトとマウスの分子解剖学の研究結果と実験モデルのデータによって
、このプロセスに関与できるいくつかの接着分子すなわちαｖファミリーのイン
テグリン類、トロフィニン（trophinin）、ＣＤ４４、ｃａｄ−１１、Ｈタイプ
ＩとＬｅｗｉｓｙのオリゴ糖類およびヘパラン硫酸が確認された。付着の後、
介在栄養膜の浸潤が起こって、母体ＥＣＭならびに間質細胞と血管細胞の集団に
よる接着相互作用の新しいレパートリーが必要になる。ヒトの固定部位は、栄養
膜細胞層のカラムを含有し、そのカラムにおいて、自己付着が徐々にＥＣＭに対
する接着に変わり次いで間質移行（interstitial migration）に変わる（Aplin
JD, Rev Reprod, 2(2)巻84〜93頁1997年； Lessey BAら、J. Reprod Immuol, 39
(1〜2)巻105〜116頁1998年）。

【００２４】ヒトでの着床過程中、胎児の栄養膜細胞は、母胎の脱落膜中に浸潤し移行する
。この移行中、栄養膜細胞は、母胎のらせん動脈の壁を破壊して、らせん動脈を
筋肉管（muscular vessel）から、弛緩洞様のう（flaccid sinusoidal sac）に
変換する。この血管変形は、胎児胎盤系への適当な血液供給を保証するのに重要
である。細胞−細胞および細胞−マトリックスの相互作用の両者が、脱落間質と
脱落らせん動脈の栄養膜浸潤に対して重要である。細胞−マトリックスの接着は
、特定の受容体（大部分がインテグリン類のファミリーに属している）によって
仲介される。インテグリン類を通じてマトリックスから細胞に伝達されるシグナ
ルは、マトリックスの分解や組織の再造形をしやすくするメタロプロテイナーゼ
類のように、細胞の挙動と遺伝子の発現の制御に極めて重要な役割を演じている
（Burrows TDら、Hum Reprod Updat, 2(4)巻307〜321頁1996年）。したがって、
胚盤胞および胎盤の栄養膜細胞は浸潤性表現型を発現する。これらの細胞は、細
胞外マトリックスを消化できるメタロプロテイナーゼ類を生成し分泌して細胞外
マトリックスに浸潤する。栄養膜の浸潤を制御する多種類の子宮内膜因子の中で
、ラミニンやフィブロネクチンなどのＥＣＭの成分は重要な役割を演じる。した
がって、子宮内膜細胞外マトリックスは、栄養膜浸潤の強力なレギュレーターで
ある（Bischof Pら、Contracept Fertil Sex, 22(1)巻48〜52頁1994年）。絨毛
外栄養膜細胞の母体子宮内膜中への浸潤は、ヒトの胎盤形成の重要な事象のうち
の一つである。これらの細胞が、子宮壁に浸潤して胎盤を子宮壁に固定する性能
、および子宮−胎盤血管に浸潤し調節して妊娠させる性能はとりわけ、これら細
胞の、細胞外マトリックスを分解する酵素を分泌する性能によって決まる（Hupp
ertz Bら、Cell Tissue Res., 291(1)巻133〜148頁1998年）。

【００２５】マウス胚盤胞の外部栄養外胚葉細胞表面上でのヘパラン硫酸プロテオグリカン
すなわちパールカンの発現は、付着受容能（attachment competence）を獲得中
に増大する（Smith SEら、Dev, Biol., 184(1)巻38〜47頁1997年）。ラジオオー
トグラフィーのデータは、マウスの脱落膜細胞が、コラーゲンと硫酸化プロテオ
グリカン類を産生して分泌することを示している（Abrahamsohn PAら、J. Exp.
Zool., 266(6)巻603〜628頁1993年）。

【００２６】ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、胎盤および脱落膜のＥＣＭの
不可欠な成分である。このプロテオグリカンは、特に、ＥＣＭ内で各種の巨大分
子と相互に作用するから、それが分解するとマトリックスが分解する。したがっ
て、胎盤の場合、このことによって、正常な胎盤形成と栄養膜の浸潤が容易にな
る。栄養膜細胞層を、ＥＣＭと接触させてインキュベートすると、ＥＣＭに結合
したｂＦＧＦが放出される。したがって、栄養膜細胞層のヘパラナーゼが、栄養
膜細胞層の溢出および限局性血管新生によって胎盤形成を容易にするということ
が提言されている（Goshen Rら、Mol. Hum. Reprod., 2(9)巻679〜684頁1996年
）。

【００２７】哺乳類の胚の着床には、母体細胞と胚細胞との間の一連の複雑な相互作用が伴
う。子宮ポリペプチド成長因子がこれら細胞の相互作用において重要な役割を演
じる。ｂＦＧＦは成長因子のファミリーのメンバーである。この成長因子は胚の
着床のプロセスにとって潜在的に重要である。というのは、（ｉ）この成長因子
はＥＣＭ内に貯蔵されるので胚が浸潤中に容易に利用することができ、（ii）こ
の成長因子は細胞の増殖と分化の強力なモジュレーターでありそして（iii）こ
の成長因子は血管新生を刺激するからである（Chai Nら、Dev. Biol., 198(1)巻
105〜115頁1998年）。比較的高濃度のｂＦＧＦが、胚盤胞の付着と栄養膜の拡延
の比率を有意に高め、着床中の胚の表面積の拡張を促進する。子宮内膜細胞由来
の角化細胞成長因子（ＫＧＦ）とｂＦＧＦは、それらのコグネイト受容体を通じ
て栄養膜の増殖を刺激することによって、着床のプロセスに対してパラクリン効
果を発揮する（Taniguchi Fら、Mol. Reprod. Dev., 50(1)巻54〜62頁1998年; Y
oshida S, 日本産科婦人科学会雑誌、48(3)巻170〜176頁1996年）。

【００２８】ｂＦＧＦをコードするｍＲＮＡは、ひつじの着床前の胚のあらゆる段階で検出
されたが、この転写産物の相対的存在量は、単細胞の段階から胚盤胞の段階へ向
かうにつれて減少し、このことは、前記ｍＲＮＡがひつじの早期胚の母体転写産
物を示すことを示唆している。成長因子の転写産物が、哺乳動物発育の非常に早
い段階で発現されるということは、これらの分子が、着床前の期間を通じて早期
胚が発達するのを支持するのに必要な単一もしくは複数の役割をはたしていると
予想される（Watson AJら、Biol Reprod., 50(4)巻725〜733頁1994年）。

【００２９】ｂＦＧＦの細胞分布を、妊娠初期（２〜６日）のラット子宮について免疫組織
化学的に検査した。ｂＦＧＦは、間質細胞と上皮細胞の細胞内におよびＥＣＭ内
に妊娠２日目と３日目に局在していた。ｂＦＧＦは妊娠４日目と５日目に上皮細
胞の頂面に明らかに局在していた。ｂＦＧＦはこのように頂面に局在すると同時
に、子宮内腔流体中に存在していたが、このことは、この成長因子が上皮細胞か
ら放出されていることを示唆している。胚の着床は、内腔の上皮細胞および脱落
細胞の細胞内ｂＦＧＦ含量を増大させることによって達成した。しかし、着床部
位の外側のおよび人工的に脱落させた子宮内の類似の細胞は、類似レベルのｂＦ
ＧＦを発現しなかった。これは、胚からの独特のシグナルがｂＦＧＦの発現をト
リガーすることを示している。ｂＦＧＦの細胞特異的分布が変化していることは
、子宮細胞の増殖、分化および胚の着床におけるこの成長因子の多機能の役割を
示唆している。その上に、ｂＦＧＦが上皮細胞から先端放出されること（apical
release）は、妊娠初期におけるｂＦＧＦの放出（export）に新規な分泌経路を
利用していることを示している（Carlone DL, Rider V. Biol. Rerod., 49(4)巻
653〜665頁1993年）。マウスの場合、ＦＧＦのシグナリングは、着床前の胚細胞
とエキストラ胚細胞の、第五細胞分裂で始まる細胞分裂を誘発する（Chai Nら、
Dev Biol, 198(1)巻105〜115頁1998年）。ｂＦＧＦは、妊娠６〜９日目は着床チ
ャンバー（implantation chamber）内に存在し、そして脱落膜細胞の応答、栄養
膜の浸潤および血管新生に関与しているかもしれない（Wordinger RJら、Growth
factors, 11(3)巻175〜186頁1994年）。

【００３０】かなり長い間、卵管と子宮の分泌物が、着床前の哺乳類の胚の細胞増殖の刺激
および着床を成功させる早期分化の事象の促進に関与しているという仮説がたて
られている。子宮分泌物内に存在している制御因子のうち少なくともいくつかは
、胚細胞上の特異的受容体に結合することによって、パラクリン経路にそって作
用できる成長因子である。したがって、恐らく、成長因子が単独でそれらの特異
的受容体に作用する機能に加えて、成長因子類の組み合わせが特異的な生長応答
を誘発するのに重要である。また、成長因子類を組み合わせた結果、干渉のプロ
セスをもたらし、胚細胞を一つの成長因子に暴露すると、胚細胞が他の生長因子
に結合し応答する性能を弱めることもありうる（Schulz GA, Heyner S, Oxf. Re
v. Reprod. Biol., 15巻43〜81頁1993年）。

【００３１】ヘパラナーゼをコードするＤＮＡ（ｈｐａ）の動物細胞における発現：１９９
８年５月１日付で出願された米国特許願第０９／０７１６１８号に示されている
ように、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞が、ｈｐａ遺伝子産物を、構成的で
かつ安定な方式で発現した。なお上記特許願は本願に援用するものである。いく
つものＣＨＯ細胞は、タンパク質ブロット分析法および活性検定法によって確認
した結果、ｈｐａタンパク質を発現することについて特に生産的であった。その
ｈｐａＤＮＡは、５４３個のアミノ酸からなる大きなタンパク質（予想分子量
は約６０ｋＤａ）をコードしているが、試験結果は、二つのタンパク質、すなわ
ち一方は約６０ｋＤａ（ｐ６０）で他方は約４５〜５０ｋＤａ（ｐ４５）のタン
パク質、が存在していることを明確に立証している。ヘパラーゼ活性を有する４
５〜５０ｋＤａのタンパク質が胎盤から（Goshen, R.ら、Mol. Muman Reprod.,
2巻679〜684頁1996年）および血小板から（FreemanおよびParish, Biochem. J.,
339巻1341〜1350頁1998年）単離されたということはすでに報告されている。し
たがって、上記６０ｋＤａのタンパク質は、宿主細胞内で自然に処理されて４５
〜５０ｋＤａのタンパク質を生成するプロ酵素のようである。前記ｐ４５は、活
性が前記ｐ６０タンパク質の少なくとも１０倍であることが見出されたが、これ
はｐ４５が活性酵素であることを示唆している。さらに、ハイファイブ昆虫細胞
を、ｈｐａ遺伝子を含有する組換えバキュロウィルスを使用してトランスフェク
トした。これらの細胞は、６０ｋＤａ型のパラナーゼだけを産生した。

【００３２】本発明を実施したところ、以下のことが発見された。（ｉ）へパラナーゼが細
胞の細胞外マトリックスに付着する；（ii）へパラナーゼが外側に付着している
細胞が、そのヘパラナーゼを処理して活性型にする；（iii）活性型のヘパラナ
ーゼが外側に付着している細胞が、その付着したヘパラナーゼを、まわりを囲む
媒体から保護する；（iv）活性型のヘパラナーゼが外側に付着されている細胞、
すなわちヘパラナーゼを発現し分泌するように遺伝的に修飾された細胞または精
製されたヘパラナーゼが外側に付加された細胞は、外側に付着されたヘパラナー
ゼを欠いた細胞に比べて、体内にはるかに容易にトランスロケイト（translocat
e）させることができる。したがって、ヘパラナーゼおよび他の細胞外マトリッ
クス分解酵素を使用して、生体材料例えば細胞、組織および薬物送達システムな
どの患者への導入を助けることができる。

【００３３】発明の概要したがって、本発明の一側面によって、生体材料、およびその生体材料の外側
に付着されている、精製された天然のもしくは組換え体の細胞外マトリックス分
解酵素を含有する生体製剤を提供するものである。上記生体材料は、複数の細胞
、例えば骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞（marrow hematopoietic or stro
mal stem cell）、角化細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞、線維芽細胞お
よび治療遺伝子で遺伝的に修飾された細胞である。あるいは上記生体材料は、組
織またはその一部分であり、例えば、胚、皮膚弁および骨スクラップ（bone scr
ap）である。さらに代わりに、上記生体材料は、薬物送達システムでもよい。

【００３４】本発明の他の側面によって、組換え細胞外マトリックス分解酵素を発現し分泌
する遺伝的に修飾された細胞であって、その外側に前記細胞外マトリックス分解
酵素が付着されている細胞が提供される。

【００３５】本発明のさらに他の側面によって、上記生体製剤または細胞を、医薬として許
容できる担体と組み合わせて含有する医薬組成物が提供される。

【００３６】本発明のさらに別の側面によって、組織、例えば骨、筋肉、皮膚または神経組
織などを生体内で修復する方法であって、（ａ）生体内で増殖し分化して組織ま
たはその一部を形成することができかつその外側に細胞外マトリックス分解酵素
が付着されている細胞を提供し、次いで（ｂ）その細胞を生体内に投与するステ
ップを含んでなる方法が提供される。上記酵素は細胞の外側に付加されるか、あ
るいは代わりに細胞が遺伝的に修飾されて、上記酵素を発現して、細胞外に提供
するかまたは上記酵素を分泌する。

【００３７】本発明のさらに他の側面によって、組織、例えば胚、皮膚弁もしくは骨スクラ
ップまたはその一部を生体内に移植する方法であって、（ａ）前記組織またはそ
の一部の外側に、精製された天然のもしくは組換え体の細胞外マトリックス分解
酵素を付着させ、次いで（ｂ）その組織またはその一部を生体内に移植するステ
ップを含んでなる方法が提供される。

【００３８】本発明の追加の側面によって、細胞を生体内に移植する方法であって、（ａ）
移植可能な細胞、例えば骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角化細胞、胚盤
胞、神経芽細胞、星状膠細胞または線維芽細胞であって、その外側に細胞外マト
リックス分解酵素を付着された細胞を提供し、次いで（ｂ）それら細胞を生体内
に投与するステップを含んでなる方法が提供される。上記酵素が、前記細胞の外
側に付加されるか、または代わりに、上記細胞が遺伝的に修飾されて、上記酵素
を発現し細胞外に提供するかまたは上記酵素を分泌する。

【００３９】本発明のさらに追加の側面によって、ムコ多糖症、のう胞性線維症、パーキン
ソン病、ゴーシェ症候群または骨形成不全などの遺伝病の症状を軽減することが
できる治療タンパク質を発現する遺伝的に修飾された細胞を生体内に導入する体
細胞遺伝子治療法であって、（ａ）骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角化
細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞または線維芽細胞などの、治療タンパク
質を発現する遺伝的に修飾された細胞であって、外側に細胞外マトリックス分解
酵素を付着された細胞を提供し、次いで（ｂ）その細胞を生体内に投与するステ
ップを含んでなる方法が提供される。その酵素は、前記細胞の外側に付加される
か、または代わりに前記細胞が遺伝的に修飾されて、前記酵素を発現し、細胞外
に提供するかまたは分泌する。

【００４０】本発明のさらに追加の側面によって、生体血液関門、例えば血液−脳関門、血
液−ミルク関門（blood-milk-barrier）または母体の血液−胎盤−胚関門を横切
って生体材料を送達する方法であって、（ａ）生体材料の外側に、精製された天
然のまたは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素を付着させ、次いで（ｂ）そ
の生体材料を生体内に投与するステップを含んでなる方法が提供される。その生
体材料は、複数の細胞、または薬物送達システムでもよい。

【００４１】本発明の別の側面によって、生体血液関門、例えば血液−脳−関門、血液−ミ
ルク−関門または母体の血液−胎盤−胚関門を横切って細胞を送達する方法であ
って、（ａ）細胞マトリックス分解酵素を発現して細胞外に提供しまたは分泌す
るように、細胞を遺伝的に修飾し、次いで（ｂ）その細胞を生体内に投与するス
テップを含んでなる方法が提供される。

【００４２】本発明のさらに別の側面によって、グリコサミノグリカン類を含有する粘液性
、粘膿性または膿性の物質が蓄積している患者を管理する方法であって、少なく
とも一種のグリコサミノグリカン類分解酵素を、前記物質の粘弾性、病原体の感
染力および炎症のうちの少なくとも一つを低下させるために治療上有効な量で患
者に投与するステップを含んでなり、そして前記少なくとも一種のグリコサミノ
グリカン類分解酵素が、不活性形態で投与され、次いで前記粘液性、粘膿性また
は膿性物質に固有のプロテアーゼ類によって処理されて活性型になる方法が提供
される。

【００４３】下記の本発明の好ましい実施態様のさらなる特徴によって、細胞外マトリック
ス分解酵素は、例えばコラゲナーゼ（すなわちメタロプロテイナーゼ）、グリコ
サミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼであってもよい。上記グリコサミ
ノグリカン類分解酵素は、例えばヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、へパ
リナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、スルファタ
ーゼおよびコンドロイチナーゼであってもよい。細胞外マトリックス分解酵素は
、内因性プロテアーゼによって処理されて活性になる不活性型でもよい。あるい
は、細胞外マトリックス分解酵素はその活性型でもよい。本発明は、細胞、組織および薬物送達システムを患者に有効に導入するための
新しい手段を提供することによって、現在知られている構成の欠点を成功裡に処
理する。

【００４４】図面の簡単な説明本発明は添付図面を参照して例示のためのみにここで記載される。図中、図１ａ〜１ｂはヘパラナーゼが周囲のｐＨや血清の存在によって不活性化され
ないように細胞が保護することを示す図である。骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）の非存
在下（図１ａ）または存在下（図１ｂ）でヘパラナーゼを培養培地に添加した後
の放射能標識化ＥＣＭの分解を試験した。図１ａ−ヘパラナーゼまたは緩衝液（
０．４ＭＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸塩の緩衝液ｐＨ−６．８）を、ＤＭＥＭ＋
１０％ＦＣＳ中の放射能標識化ＥＣＭプレートに添加し、その培地のｐＨを測定
して、ヘパラナーゼの活性を試験した（ｓｓ＝基質、Ｃｓ＝緩衝液、Ｅｓ＝ヘパ
ラナーゼ）。図１ｂ−ＢＭＳＣを放射能標識化ＥＣＭプレート上で増殖させて、
分解された放射能標識化ＥＣＭの産物の増殖培地内の存在を、緩衝液（１）また
はヘパラナーゼ（２）を添加する前と添加後に試験した。図２ａ〜２ｂはヘパラナーゼがＢＭＳＣに付着してその活性を保持することを
示す図である。ヘパラナーゼとともにインキュベートした細胞を洗浄し、収集し
、次いで（図２ａ）ＤＭＢへパラナーゼ活性検定法（１〜６は六つの異なる実験
を表す）および（図２ｂ）抗ヘパラナーゼ抗体を使用するウェスタンブロット分
析法（Ｔ＝トリプシン；１Ｅ＝１ｍＭのＥＤＴＡ；２Ｅ＝２ｍＭのＥＤＴＡ；Ｃ
ｂ＝対照、バキュロウィルス由来の精製ヘパラナーゼｐ６０；Ｃｃ＝対照、ＣＨ
Ｏ細胞由来の精製ヘパラナーゼｐ４５；ｋＤａ＝キロダルトン）に付した。図３はヘパラナーゼを細胞に付着させるのに、ＧＡＧの存在が必要であること
を示す図である。細胞をヘパラナーゼとともに２ｈｒインキュベートし、洗浄し
、収集し、次いでＤＭＢへパラナーゼ活性検定法に付した。図４ａ〜４ｃはヘパラナーゼがＢ１６−Ｆ１細胞に付着してその活性を保持す
ることを示す図である。ｈｐａｃＤＮＡをトランスフェクトされた（「トラン
スフェクトされた」）かまたはヘパラナーゼとともにインキュベートされたか（
「付着された」＋ｂ２２もしくは＋ｂ２７）またはヘパラナーゼで処理されなか
った（ＮＴもしくは−）細胞を洗浄し、収集し次いでＤＭＢへパラナーゼ活性検
定法（図４ａ）、ゲルシフト検定法（図４ｂ）および抗ヘパラナーゼ抗体を使用
するウェスタンブロット分析法（図４ｃ）に付した。精製バキュロウィルスヘパ
ラナーゼｐ６０（ｂ２２，ｂ２７）またはＣＨＯヘパラナーゼｐ４５を対照（Ｃ
）として使用した。図５ａ〜５ｂはヘパラナーゼがＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞系に結合してタンパク質
分解開裂作用を受けて高いヘパラナーゼ活性を示すことを立証する図である。ヘ
パラナーゼとともにインキュベートした細胞を、洗浄し、収集し、次いでＤＭＢ
活性検定法（図５ａ）および抗ヘパラナーゼ抗体を使用するウェスタンブロット
分析法（図５ｂ）に付した。図６ａ〜６ｃはヘパラナーゼのタンパク質分解活性化に対する痰プロテアーゼ
類の作用を立証する図である。（図６ａ）ヘパラナーゼの痰の粘度に対する作用
をマイクロ粘度計を使用して試験した。（図６ｂ）バキュロウィルス由来ヘパラ
ナーゼ−ｐ６０とともに（No.１と２）または食塩水とともに（No.３と４）また
はＣＨＯｐ４５ヘパラナーゼとともに（No.５と６）またはプロテアーゼ阻害剤
（ＰＩ）の存在下ｐ６０ヘパラナーゼあり（No.７）もしくはｐ６０ヘパラナー
ゼなし（No.８）で、３７℃にて２ｈｒインキュベートした痰試料の痰固形分の
容積の減少を、遠心分離を行った後に観察し、次いでその上澄み液を、２種の抗
ヘパラナーゼモノクローナル抗体すなわちｐ６０型だけを認識するNo.２３９（
図６ｃ左）とｐ６０型とｐ４５型の両者を認識するNo.１１７（図６ｃ右）とを
用いるウェスタンブロット分析法に付した（図６ｃ）。図７は腫瘍細胞の転移に対するヘパラナーゼの作用（生体内）を立証する図で
ある。ＨｐａｃＤＮＡをトランスフェクトされた（「トランスフェクト」）か
、またはフラグミン（Ｉ）なしもしくはありでｐ６０ヘパラナーゼ酵素でコート
された（付着）Ｂ１６−Ｆ１黒色腫細胞を、Ｃ５７ＢＬマウスに注射した。肺内
への転移の数を、注射してから３週間後に計数した。図８ａ〜８ｇは一次ＢＭＳＣ培養物からの骨様組織の生成に対するヘパラナー
ゼの作用を立証する図である。図８ａ〜８ｂ−ＢＭＳＣの増殖に対するヘパラナ
ーゼの作用を、ＭＴＴ増殖試験法を使用して、２頭の独立したラットについて測
定した。対照：ゼロ日の細胞を１００％として算出した。図８ｃ〜８ｄ−ＢＭＳ
Ｃの分化状態に対するヘパラナーゼの作用を、上記ラットそれぞれについて、ア
ルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性によって測定した。全タンパク質に対する
相対ＡＬＰ活性も算出した（図８ｅ）。図８ｆ〜８ｇ−ＢＭＳＣの鉱質化に対す
るヘパラナーゼの作用を上記ラットそれぞれについて測定して、そのウェルの相
対染色面積で表した。

【００４５】発明の実施の形態本発明は、生体材料、例えば細胞、組織および薬物送達システムの患者への導
入を助けるために使用できる方法、製剤および医薬組成物の発明である。具体的
に述べると、本発明を使用して、例えば体細胞遺伝子治療または細胞／組織の移
植の場合の、各種の細胞と組織の移植を行うプロセスを改善することができる。

【００４６】本発明の原理と操作は、添付図面と以下の説明によって十分に理解できる。

【００４７】本発明の少なくとも一つの実施態様を詳細に説明する前に、本願の発明が、以
下の説明に述べられているかまたは図面に例示されている構造の詳細と構成要素
の配置に限定されないと解すべきである。本発明は、他の実施態様が可能であり
、すなわち各種の方法で実施することができる。また、本願で使用される語句は
、説明を目的とするものであり、限定するとみなすべきでないと解すべきである
。

【００４８】以下の実施例の項で例示されるように、ヘパラナーゼを外部から添加すると、
細胞に付着することが、本発明を実施する間に発見されたのである。ヘパラナー
ゼが外側に付着されている細胞がそのヘパラナーゼを処理して活性型にし、そし
て活性型のヘパラナーゼが外側に付着されている細胞は、その付着されているヘ
パラナーゼを周囲の媒体から保護し、その結果、その付着されたヘパラナーゼは
、さもないとその活性を阻害する条件下でヘパラナーゼの触媒活性を保持するこ
とがさらに発見された。活性型のヘパラナーゼが外側に付着されている細胞であ
って、ヘパラナーゼを発現して細胞外に提供するかまたは分泌するように遺伝的
に修飾された細胞または精製されたヘパラナーゼが細胞外に付加された細胞が、
外側に付着されたヘパラナーゼを欠いた細胞に比べて、実験動物モデルの体内に
、はるかに容易に移植できることがさらに発見された。本発明を実施する間に、
不活性のプロ−ヘパラナーゼが内因性プロテアーゼ類によって処理されてその活
性型になることができるという追加の発見がなされた。

【００４９】したがって、ヘパラナーゼおよびその外の細胞外マトリックス分解酵素を使用
して、生体材料、例えば細胞、組織および薬物送達システムを患者の体内の所望
の位置へ導入するのに役立てることができることが分かったのである。本願の明細書および特許請求の範囲の項で使用する場合、用語「ヘパラナーゼ
」は、β−脱離反応によって、ヘパリンまたは硫酸ヘパランを分解する細菌酵素
類（へパリナーゼＩ，IIおよびIII）の活性とは対照的に、ヘパリンまたはヘパ
ラン硫酸のプロテオグリカン基質に特異的な動物のエンドグリコシダーゼ加水分
解酵素を意味する。上記ヘパラナーゼは、国際特許願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０９
２５６に記載されているように、天然のまたは組換え体のそして任意に修飾され
た前駆体または活性化された形態でもよい。なお上記国際特許願は、本願に援用
するものである。

【００５０】本願の明細書および特許請求の範囲の項で使用される場合、語句「薬物送達シ
ステム」にはリポソーム類、顆粒類などが含まれ、これらは薬物を入れる内部容
積を有し、薬物は後にそのシステムから放出される。このようなリポソーム類や
顆粒類は当該技術分野でよく知られている。例えば、細胞外マトリックス分解酵
素が付着できる人工の細胞外マトリックスをつくるため、中に糖脂質および／ま
たは糖タンパク質を埋めこんだリポソームを製造することができる。

【００５１】本発明の一側面によって、生体材料と、その生体材料の外側に付着されている
精製された天然のもしくは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素を含有する生
体製剤が提供される。本発明のこの側面による生体材料は、複数の細胞、例えば
限定されないが、骨髄の造血幹細胞もしくは間質乾細胞、角化細胞、胚盤胞、神
経芽細胞、星状膠細胞、線維芽細胞および治療タンパク質を産生する治療遺伝子
で遺伝的に修飾された細胞である。あるいは、上記生体材料は組織またはその一
部であり、例えば、限定されないが、胚、皮膚弁または骨スクラップである。さ
らに、代わりに、生体材料は薬物送達システムでもよい。

【００５２】本願の明細書と特許請求の範囲の項で使用する場合、用語「細胞外に付着され
た」は、例えば「提供された」と関連した意味をもっている。細胞（または組織
）に用いられる場合、この用語は細胞外マトリックスと関連した意味をもってい
る。いくつかの細胞／組織は、単一もしくは複数の固有の細胞外マトリックス分
解酵素が付着されていることが分かるであろう。しかし、本発明は、ヒトが介入
することによって、細胞／組織に追加の付着酵素を付加することを目的とするも
のである。

【００５３】本願の明細書および特許請求の範囲の項で使用する場合、用語「精製された」
は強化されたという意味も含む。細胞外マトリックス分解酵素の精製／強化方法
は当該技術分野で周知である。その例は、Goshenらの１９９８年５月１日付けで
出願された米国特許願第０９／０７１６１８号（Goshe Rら、Mol. Human Reprod
. 2巻679〜684頁1996年）および国際特許願公開第ＷＯ９１／０２９７７号に提
供されている。なおこれらの文献は本願に援用するものである。

【００５４】本願の明細書と特許請求の範囲の項で使用する場合、用語「天然の」は、天然
起源の酵素を意味する。

【００５５】本願の明細書と特許請求の範囲の項で使用する場合、用語「組換え体の」は、
発現系中に導入された遺伝子がコードする酵素を意味する。

【００５６】本願の明細書と特許請求の範囲の項で使用する場合、用語「酵素」は、その不
活性のプロ酵素型とその処理された活性型の両方を意味する。

【００５７】本発明の他の側面によって、組換え体の細胞外マトリックス分解酵素を発現し
て細胞外に提供するかまたは分泌する遺伝的に修飾された細胞が提供され、その
細胞外マトリックス分解酵素は細胞の外側に提供されるかまたは細胞に付着され
る。

【００５８】本願の明細書と特許請求の範囲の項で使用する場合、語句「遺伝的に修飾され
た」は、組換え体核酸の配列を取りこんでいる細胞を意味する。

【００５９】本発明のさらに他の側面によって、上記生体製剤または細胞を、医薬として許
容できる担体、例えば粘稠化剤、緩衝剤、賦形剤、界面活性剤、保存剤などすべ
て当該技術分野で周知のものと組み合わせて含有する医薬組成物が提供される。
また本発明の医薬組成物は、一種以上の有効成分、例えば限定されないが、抗炎
症薬、抗菌薬、麻酔薬などを含有していてもよい。

【００６０】本発明の医薬組成物は、局所治療または全身治療を選ぶかどうかおよび治療す
べき領域によって決まる一種以上の方式で投与することができる。投与は、局所
（眼、膣、直腸、鼻腔内）、経口、吸入、または非経口例えば点滴注入または腹
腔内、皮下、筋肉内もしくは組織特異的な注射例えば限定されないが子宮内、気
管内、乳腺内、脳内または骨内の注射で行われる。

【００６１】局所投与用の配合物としては、限定されないが、ローション剤、軟膏剤、ゲル
剤、クリーム剤、坐剤、滴剤、液剤、スプレー剤および散剤がある。通常の医薬
担体、水性、粉末または油状の基剤、粘稠化剤などが必要かまたは望ましい。経
口投与用組成物としては、散剤もしくは顆粒剤、水もしくは非水性の媒体による
懸濁剤もしくは溶液剤、サシェ剤（sachets）、カプセル剤または錠剤がある。
粘稠化剤、賦形剤、調味料、分散助剤、乳化剤または結合剤が望ましい。非経口
投与用の配合物としては、限定されないが、緩衝剤、賦形剤および他の適切な添
加剤を含有していてもよい滅菌水溶液がある。

【００６２】投与回数は、治療すべき症状の重症度と反応性によって決まるが、一般に、数
日〜数ヶ月続く治療の過程で、または全治するかもしくは病状が軽減するまで一
回以上の投与回数である。当業技術者は、最適の投与量、投与法および繰返し率
（repetition rate）を容易に決定することができる。

【００６３】本発明の製剤、細胞および医薬組成物を使用して、例えば以下の項でさらに詳
細に説明するようないくつもの治療プロトコルを実施することができる。

【００６４】かくして、本発明のさらに他の側面によって、組織またはその一部、例えば限
定されないが、損傷した骨、筋肉、皮膚または神経組織を生体内で修復する方法
を提供するものである。本発明のこの側面による上記方法は、生体内で増殖し分
化し、組織またはその一部を生成して修復できる細胞であって、外側に細胞外マ
トリックス分解酵素を付着された細胞を提供し、次いでその細胞を生体内に投与
することによって行われる。その酵素は、細胞の外側に付加されるか、あるいは
細胞が遺伝的に修飾されて、酵素を発現して細胞外に提供するかまたは分泌する
。後記実施例の項に例示されているように、上記のような細胞は、受容組織には
るかに容易に到達して受容組織内に定着する。

【００６５】本発明のさらに別の側面で、組織、例えば限定されないが、胚、皮膚弁または
骨スクラップを、生体内に移植する方法が提供される。本発明のこの側面の方法
は、組織またはその一部の外側に、精製された天然のまたは組換え体の細胞外マ
トリックス分解酵素を付着させ、次いでその組織またはその一部を生体内に移植
することによって行われる。

【００６６】本発明の追加の側面で、細胞を生体内に移植する方法が提供される。本発明の
この側面の方法は、移植可能な細胞、例えば骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細
胞、角化細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞、線維芽細胞であって、外側に
細胞外マトリックス分解酵素を付着された細胞を提供し、次いでその細胞を生体
内に投与することによって行われる。本発明のこの側面の酵素が細胞の外側に付
加されるか、または、代わりに、細胞が遺伝的に修飾されて、前記酵素を発現し
て細胞外に提供するかまたは分泌する。この方法は、例えば、健康なドナーの細
胞を、例えば、ある種のタンパク質が欠如していることを特徴とする遺伝病にか
かっているＭＨＣ適合患者に移植するのに使用できる。

【００６７】本発明のさらに追加の側面によって、遺伝病、例えば限定されないがムコ多糖
症、のう胞性線維症、パーキンソン症、ゴーシェ症候群または骨形成不全などの
症状を軽減することができる治療タンパク質を発現する遺伝的に修飾された細胞
を生体内に導入する体細胞遺伝子治療法が提供される。本発明のこの側面の方法
は、遺伝的に修飾されて治療タンパク質を発現する細胞（例えば骨髄の造血幹細
胞または間質幹細胞、角化細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞および線維芽
細胞）であって、その外側に細胞外マトリックス分解酵素を付着された細胞を提
供し、次いでその細胞を生体内に投与することによって行われる。先に述べたよ
うに、上記酵素は、前記細胞の外側に付加されるか、代わりに、細胞が前記酵素
を発現し次いで細胞外に提供するかまたは分泌するように遺伝的に修飾される。

【００６８】本発明のさらに追加の側面によって、生体材料を、生体血液関門、例えば限定
されないが、血液−脳−関門、血液−ミルク−関門または母体の血液−胎盤−胚
関門を横切って送達する方法が提供される。本発明のこの側面の方法は、生体材
料の外側に、精製された天然のまたは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素を
付着させ、次いでその生体材料を生体内に投与することによって行われる。その
生体材料は、複数の細胞または薬物送達システムでもよい。

【００６９】本発明の別の側面によって、細胞を、生体の血液関門を横切って送達する方法
が提供される。本発明のこの側面の方法は、細胞外マトリックス分解酵素を発現
して細胞外に提供するかまたは分泌するように前記細胞を遺伝的に修飾すること
によって行われる。

【００７０】本発明のさらに別の側面によって、グリコサミノグリカン類を含有する粘液性
、粘膿性または膿性の物質が蓄積している患者を管理する方法が提供される。本
発明のこの側面の方法は、少なくとも一種のグリコサミノグリカン類分解酵素を
、前記物質の粘弾性、病原体の感染力および炎症のうちの少なくとも一つを低下
させるために治療上有効な量で患者に投与し、そして前記少なくとも一種のグリ
コサミノグリカン類分解酵素は不活性形態で投与され、次いで前記粘液性、粘膿
性または膿性の物質に固有のプロテアーゼ類によって処理されて活性型になる方
法で行われる。

【００７１】本発明の上記治療法を実施するために使用できる細胞マトリックス分解酵素は
、例えばコラゲナーゼ（すなわちメタロプロテイナーゼ）、グリコサミノグリカ
ン類分解酵素およびエラスターゼでもよい。グリコサミノグリカン類分解酵素は
、例えばヘパラナーゼ、結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダ
ーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチ
ナーゼでもよい。前記細胞外マトリックス分解酵素は、内因性プロテアーゼ類に
よって処理されて活性になる不活性型でもよい。あるいは、細胞外マトリックス
分解酵素はその活性型でもよい。これらの酵素および他の酵素は、各種の起源か
ら、強化型で入手することができる。これらの酵素をコードする遺伝子はクロー
ン化されているので、組換え酵素が入手できるかまたは容易に入手可能になる。

【００７２】本発明の追加の目的、利点および新規な特徴は、当業技術者が、本発明を限定
しない以下の実施例を試験すると明らかになるであろう。さらに、先に詳述され
かつ本願の特許請求の範囲の項で請求されている本発明の各種実施態様と側面は
各々、以下の実施例によって実験で裏付けられている。本発明を添付図面を参照して実施例で説明する。

【００７３】実施例以下の諸実施例を参照し、上記説明を組み合わせて、本発明を説明するが、本
発明を限定するものではない。

【００７４】本願で使用される用語、および以下に述べる組換えＤＮＡ技法の実験室の手順
は周知であり、かつ当該技術分野で通常利用されている。クローン化、ＤＮＡと
ＲＮＡの単離、増幅および精製の標準の方法が使用される。一般に、ＤＮＡリガ
ーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、制限エンドヌクレアーゼなどが関与する酵素反応が
製造業者の仕様書にしたがって実施される。これらの技法と各種の他の技法は一
般に、Sambrookら、Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring H
arbor Laboratory, 米国ニューヨーク州コールドスプリングハーバー１９８９年
にしたがって実施される。このマニュアルは、以後「Sambrook」と呼称する。こ
の文書は、他の一般的な文献を提供している。この文書に記載された方法は当該
技術分野では周知の方法であると考えられ、読者にとっては便利である。この文
書に含まれている情報はすべて本願に援用するものである。

【００７５】材料と実験方法細胞：骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）：２頭の雄の４５日齢のSprague-Dawleyラット由来
の大腿骨をイスラエルのHarlan Biotechから入手した。これらの大腿骨は滅菌方
式で、３０℃（ラット番号１）および４℃（ラット番号２）の食塩水に入れて輸
送された。骨髄細胞を、フラッシュアウト（flush out）し、プールし（一方の
ラットの２個の大腿骨から）、１５％の熱不活性化ＦＣＳ、１ｍｌ当り１００ｕ
／１００μｇのペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭのグルタミン、０．２
５ｍｇ／ｍｌのFungizone（これらはすべてイスラエルのBeit Haemekから購入し
た）、１０ｍＭのβ−グリセロールホスフェート、５０μｇ／ｍｌのアスコルビ
ン酸（Sigma）および１０^−７Ｍのデキサメタゾン（Vitamed）を含有するＭＥＭ
α内で培養した。培養物は、８％ＣＯ_２で３７℃の加湿インキュベーター内に保
持した。３日間インキュベートした後、非付着細胞を洗い出し、そして付着細胞
を完全ＭＥＭα培地内で再培養した。培地は以後、１週間にわたって２日毎に変
えた。次にその細胞をトリプシンで処理し計数した。細胞を、１１個の９６ウェ
ルプレート中で継代培養を行った。一つのプレートをＭＴＴ増殖試験に付し（以
下参照）、残りのプレートは、８％ＣＯ_２で３７℃の加湿インキュベーター内の
、１０^−８Ｍデキサメタゾン含有完全ＭＥＭα培地中に保持した。１２日目と１
５日目に、プレートを、以下の試験：ＭＴＴ、アルカリホスファターゼおよびア
リザリンレッド染色の各試験に付した。ＭＴＴ試験は６日目にも行った。

【００７６】ＣＨＯ細胞：ＣＨＯ細胞と、ＣＨＯサブラインNo.８０３（ごく少量のヘパラ
ン硫酸を発現する）およびＣＨＯサブラインNo.７４５（ごく少量のグリコサミ
ノグリカン類を発現する）（Esko JDら、Science, 241巻1092〜1096頁1988年）
を、１０％の熱不活性化ＦＣＳ（Beit-Haemek）を含有するＤＭＥＭまたはＦ１
２中で培養した。

【００７７】Ｂ１６−Ｆ１細胞：Ｂ１６−Ｆ１細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中で培養し
た。

【００７８】ＭＴＴ細胞増殖試験：細胞は、ＲＰＭＩ（Beit Haemek）で３回洗浄した。ＭＴＴ（チアゾリルブル
ー、カタログNo.Ｍ５６５５、Sigma）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度でＲＰＭＩに溶解
して０．２μｍのフィルターで濾過した。その濾液１００μｌずつを各ウェルに
添加した。３７℃で３ｈｒインキュベートした後、１０μｌのストップソリュー
ション（５０％ＤＭＦ、１０％ＳＤＳ、２％酢酸および０．０２５ＮＨＣｌ、
すべてSigmaより入手）を各ウェルに添加し、単一もしくは複数のプレートを一
夜、室温でインキュベートした。カラー生成を、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して
５８０ｎｍで測定した。

【００７９】アルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）：細胞をダルベッコのＰＢＳ×１（Be
it Haemek）で３回洗浄し、続いて、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２と０．１％のトリト
ンを含有する１０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．６）０．５ｍｌを添加し
た。次に、細胞の凍結と解凍を３回行い、−２０℃で貯蔵した。アルカリホスフ
ァターゼ活性のキットをSigmaから購入した。分析する準備が整ったとき、各ウ
ェル由来の細胞溶解物５μｌを、供給した基質２００ｍｌとともにインキュベー
トした。４０５ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで１分間毎に測定した。ＡＬ
Ｐ活性を、前記キットの販売業者（Sigma）が記載しているようにして算出した
。

【００８０】全タンパク質の測定（ＴＰ）：上記溶解物からの５μｌを、２００μｌのBrad
ford試薬（BioRad）に添加し、５８０ｎｍの吸光度をＥＬＩＳＡリーダーで測定
した。アリザリンレッドＳ染色試験：細胞を、ダルベッコのＰＢＳ×１（Beit Haeme
k）で３回洗浄し、次いで、メタノール：ホルムアルデヒド：Ｈ_２Ｏ（１：１：
１．５の比率）内で一夜固定した。次に、それらのウェルを洗浄し、次に、アリ
ザリンレッドＳ（Sigma）の飽和溶液（ｐＨ４．０）で５分間染色した。次にそ
のウェルを洗浄し、風乾した。

【００８１】ヘパラナーゼの細胞への付着：使用した酵素製剤は、昆虫細胞内に発現された
約６０ｋＤａの精製組換え体ヘパラナーゼであった（１９９８年５月１日に出願
された米国特許願第０９／０７１６１８号参照）。ヘパラナーゼの細胞への付着
は以下のようにして実施した。すなわち、細胞を、１０％のＦＣＳを補充した、
抗生物質なしのＤＭＥＭもしくはＦ１２の培地を有する３５ｍｍまたは９０ｍｍ
のプレートで培養した。抗生物質なしの培地内で少なくとも２４ｈｒインキュベ
ートした後、バキュロウィルス由来の組換え体ヘパラナーゼを、細胞培養物に、
１０μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で２ｈｒの間インキュベートした。次にこれらプ
レートをＰＢＳで２回洗浄し、ごく短時間トリプシン処理をして収穫し、ＰＢＳ
で洗浄し、次いでそのペレットを、活性検定法もしくはウェスタンブロット分析
法に付すかまたは再懸濁させてマウスに注射した。

【００８２】ウェスタンブロット分析：タンパク質類を、４〜２０％ポリアクリルアミド調
合勾配ゲル（Novex）で分離した。電気泳動を行った後、タンパク質類を、Hybon
dナイロン膜（Amersham, ３５０ｍＡ／１００Ｖで９０分間）に電気転写させた
。膜を、０．０２％のツィーン２０と５％の脱脂乳を含有するＴＢＳ内で１〜１
６ｈｒブロックし、次に、ブロッキング溶液で希釈した抗血清または精製抗体と
ともにインキュベートした。次にブロットをＴＢＳ−ツィーンで洗浄し、適当な
ＨＲＰ−複合抗マウス／抗ウサギＩｇＧとともにインキュベートし、次いで製造
業者の指示にしたがってＥＣＬ試薬（Amersham）を使ってデベロップさせた。

【００８３】ヘパラナーゼ活性の検定：酵素製剤を、２０ｍＭリン酸塩クエン酸塩緩衝液ｐ
Ｈ５．４、１ｍＭＣａＣｌ_２および１ｍＭＮａＣｌを、最終容積２００μｌ
に含有する反応混合物中、ヘッド−オーバー−テールシェーカー（head-over-ta
il shaker）上の０．５ｍｌエッペンドルフ試験管内で５０％ヘパリンセファロ
ースビーズ懸濁液（Pharmacia）１００μｌとともにインキュベートした（３７
℃、１７ｈｒ）。使用した酵素製剤は、昆虫細胞中に発現された組換え体ヘパラ
ナーゼを精製したものであった（１９９８年５月１日付けで出願された米国特許
願第０９／０７１６１８号参照）。インキュベーション時間が終わった後、試料
を１０００ｒｐｍで２分間、遠心分離し、ヘパラナーゼの活性によって上澄み液
に放出された生成物を、１９９８年７月１０日付けで出願された米国特許願第０
９／１１３１６８号に記載のジメチルメチレンブルー比色検定法を使用して分析
した。なおこの特許願は本願に援用するものである。

【００８４】ジメチルメチレンブルー検定（ＤＭＢ）：上澄み液（１００μｌ）をプラスチ
ック製キュベットに移した。これら試料を、ＰＢＳ＋１％ＢＳＡで０．５ｍｌま
で希釈した。１，９−ジメチルメチレン（Aldrich）を調製し（３２ｍｇをエタ
ノール５ｍｌに溶解し次いでギ酸塩緩衝液で１ｌまで希釈した）、０．５ｍｌず
つ各試料に添加した。これら試料の吸光度を、５３０ｎｍで、分光光度計（Cray
100, Varian）を使用して測定した。各試料に対して、インキュベーション期間
終了後に酵素を添加した対照を含めた。

【００８５】ゲルシフト検定：バキュロウィルス由来のヘパラナーゼまたは細胞溶解物を、
ヘパリン５μｇを含有する２０ｍＭクエン酸塩リン酸塩緩衝液ｐＨ５．４ととも
に、３７℃にて１７ｈｒインキュベートした。次に、これらの試料を、市販の４
〜２０％ポリアクリルアミド勾配ゲル（Novex）に装填した。そのゲルを、メチ
レンブルーの５０％エタノール溶液で１０分間染色し、次に水で脱染色した。

【００８６】放射能で標識したＥＣＭコートプレートでのヘパラナーゼ活性検定：ＥＣＭでコートされたディッシュの調製：ウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥＣ、第二
〜第五継代）を４ウェルプレート中に、初期濃度２×１０^５細胞／ｍｌでプレー
とし、次いで５％デキストランＴ−４０を補充したサルフェートなしのFisher培
地内で１２日間インキュベートした。Ｎａ_２ ^３５ＳＯ_４（μＣｉ／ｍｌ）を、接
種後、１日目と５日目に添加して、培養物を、培地を変えることなしに前記標識
とともにインキュベートした。細胞層を、０．５％トリトンＸ−１００と２０ｍ
ＭのＮＨ_４ＯＨを含有するＰＢＳで溶解する（室温で５分間）ことによって、前
記内皮下のＥＣＭを露出させ次いでＰＢＳで４回洗浄した。前記ＥＣＭは無傷の
ままで、細胞の砕片を含有せず、組織培養ディッシュの全面積にしっかりと付着
していた。

【００８７】ヘパラナーゼの活性：細胞（１×１０^６／３５ｍｍディッシュ）、細胞溶解物
またはならし培地を、^３５Ｓで標識したＥＣＭの頂部で、２０ｍＭリン酸塩緩衝
液（ｐＨ６．２）の存在下、インキュベートした（１８ｈｒ、３７℃）。細胞溶
解物とならし培地も、サルフェートで標識したピークＩ材料（peak I material
）（１０〜２０μｌ）とともにインキュベートした。前記インキュベーション培
地を収集し、遠心分離し（１８０００×ｇ、４℃、３分間）、次いでサルフェー
ト標識化材料を、セファロースＣＬ−６Ｂカラム（０．９×３０ｃｍ）によるゲ
ル濾過法で分析した。画分（０．２ｍｌずつ）を、ＰＢＳを用い、流量５ｍｌ／
ｈｒで溶離し、Bio-fluroシンチレーション流体を使用して放射能をカウントし
た。排除体積（Ｖ_ｏ）をブルーデキストランでマークし、そして全混在体積（to
tal included volume）（Ｖ_ｔ）をフェノールレッドでマークした。後者は、遊
離サルフェートと同時に移行することを示した。ヘパラン硫酸の側鎖の分解フラ
グメントがセファロース６Ｂから、０．５＜Ｋａｖ＜０．８（ピークII）で溶離
された。ＥＣＭから、トリプシンによっておよび低い程度にＰＢＳのみとインキ
ュベートする間に放出されたほぼ無傷のＨＳＰＧが、Ｖ_ｏの次に溶離された（Ｋ
ａｖ＜０．２、ピークＩ）。これらのカラムに加えられた標識化材料の回収率は
、異なる実験で８５〜９５％の範囲内であった。各実験は少なくとも３回ずつ行
ったが、溶離位置（Ｋａｖ値）の変動は±１５％を超えなかった。

【００８８】生体内での肺への転移の誘発：この実験には、６頭のマウスからなる５試験群
（１群は７頭のマウスを含む）および２頭のマウスからなる１対照群（注射しな
い）が含まれている。これらのマウス群に下記の細胞を注射した。第一群マウス
にはＢ１６−Ｆ１細胞（メラノーマ細胞系）を注射した；第二群マウスには、ヒ
トヘパラナーゼをトランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１細胞を注射した；第三群
マウスには、ヒトヘパラナーゼをトランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１細胞にフ
ラグミンを添加したものを注射した；第四群マウスにはヘパラナーゼを付着させ
たＢ１６−Ｆ１細胞を注射した；第五群マウスにはヘパラナーゼとフラグミンの
両者を付加したＢ１６−Ｆ１細胞を注射した；第六群マウスには注射されない対
照マウスが含まれている。

【００８９】上記の注射された細胞は以下のようにして調製した。第一群：Ｂ１６−Ｆ１細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ（Beit Haemek）内で増
殖させた。細胞をトリプシンで処理し、収穫し次いで遠心分離した。得られたペ
レットをＰＢＳで洗浄し次いでＰＢＳ中、２．５×１０^５細胞／ｍｌの濃度で再
懸濁した（１０頭のマウス当り合計４ｍｌ中１０^６の細胞）。１．５ｍｌ×２個
および１ｍｌ×１個のアリコートを、２ｍｌねじ蓋付き試験管に入れてつくった
。

【００９０】第二群：Ｂ１６−Ｆ１細胞にヘパラナーゼｃＤＮＡをトランスフェクトした（
Fugene, Boehringer-Mannheim）（１９９８年５月１日付け出願の米国特許願第
０９／０７１７３９号参照。なおこの文献はあたかも本願に完全に記載されてい
るように本願に援用するものである）。次に、その細胞を収集し、第一群マウス
について記載したように分割した。

【００９１】第三群：第二群と同様にしてトランスフェクトされたＢ１６−Ｆ１を調製した
。次に、その細胞を収集し、フラグミン（Pharmacia）を、１ｍｇ／ｍｌの濃度
で添加し、次いでその細胞を、第一群について記載したのと同様にアリコートに
分割した。

【００９２】第四群：ヘパラナーゼをＢ１６−Ｆ１細胞に付着させた。３×１０^６の細胞を
、１０％ＦＣＳを補充した抗生物質なしのＤＭＥＭ８ｍｌにプレートした。２４
ｈｒインキュベートした後、バキュロウィルス由来の組換え体ヘパラナーゼ８０
μｇ（最終濃度：１０μｇ／ｍｌ）を細胞培養物に添加して、３７℃で２ｈｒイ
ンキュベートした。次に、上記プレートをＰＢＳで２回洗浄し、ごく短い時間ト
リプシン処理をして収穫し、ＰＢＳで洗浄し、次いでＰＢＳ中２．５×１０^５細
胞／ｍｌの濃度で再懸濁した（１０頭のマウス当り合計４ｍｌ中１０^６の細胞）
。１．５ｍｌ×２個、１ｍｌ×１個のアリコートを、２ｍｌねじ蓋付き試験管に
入れてつくった。

【００９３】第五群：第四群について記載したのと同様にして、ヘパラナーゼを付着させた
。次に、その細胞を収集し、フラグミンを１ｍｇ／ｍｌの濃度で添加して、細胞
を、第一群について記載したのと同様にしてアリコートに分割した。肺への転移の定量的評価：試験開始の時点で体重が１７．１〜２６．９の範囲内の３３頭の雄の成熟Ｃ５
７ＢＬマウスをイスラエル所在のHarlan Laboratoriesから入手した。動物は、
受け取ってから８日間、新しい環境に順化させ、その間、毎日、これら動物の状
態および健康障害の徴候を観察した。動物は、目標温度２０±２℃、目標湿度３
０〜７０％および１２ｈｒ明／１２ｈｒ暗のサイクルに設定された環境条件のア
クセスが制限されたげっ歯動物施設内に保管した。温度と相対湿度は制御コンピ
ュータによって毎日、監視した。前記目標値からの偏差は全く観察されなかった
。

【００９４】動物は順化中、飼育箱に入れ、そして試験期間中は、ポリプロピレン製のかご
に、一つのかごに６頭ずつ入れた。各かごには、その前に目視可能のかごカード
が設置され、試験番号、性別、系統などのすべての関連詳細事項が記載されてい
る。

【００９５】動物は、実験げっ歯動物用の市販常用飼料（Harlan Teklad TRM Rat/Mouse Di
et）およびステンレス鋼製ストロー管を備えたポリエチレン製ボトルによって各
かごに供給される飲料水に、自由にアクセスできるようになっている。

【００９６】動物は、下記のように、下記被検群と対照群に任意に割り当てた。

【表１】処理される動物には、上記細胞製剤（０．４ｍｌ／マウス）を尾静脈を通じて
注射することによって静脈投与を一回行った。

【００９７】動物は、投与の日の処理に対する健康障害または反応の徴候を観察し、その後
、試験が終了するまで毎日２回観察した。

【００９８】体重測定は、投与の直前、投与後９日目、１３日目、１８日目および試験終了
の時点（２１日目）に行った。

【００９９】肺への転移の数の測定は、安楽死させた後、肺を切り取って、すべての動物に
ついて行った。そのとき肺組織をＰＢＳですすぎ、個々の肺葉を分離し、続いて
、転移の数を双眼顕微鏡下で計数した。転移が追加の器官に観察された場合には
、同様に計数して記録した。

【０１００】痰の粘度および痰が含有するプロテアーゼ類によるヘパラナーゼのタンパク質
分解活性化：３７℃に保持した痰の試料２５０μｌを、エッペンドルフ試験管内
で、組換え体ヘパラナーゼ（ｐ６０）と混合するか、または食塩水と混合するか
、またはプロテアーゼ阻害剤の混合液と混合し続いてヘパラナーゼを添加して、
全容積を３５０μｌにした。これらの試料を直ちに０．５インシュリンシリンジ
に移し、マイクロ粘度計（Haake）を使用して粘度を検査した。シリンジ中のこ
れらの試料を次に３７℃でインキュベートして、１０分、５０分および１２０分
後に粘度を再び検査した。次に、これら試料を、１０分間、１３０００ｒｐｍで
遠心分離し、得られた上澄み液を、何種類もの抗ヘパラナーゼ抗体（１９９８年
５月１日付け出願の米国特許願第０９／０７１７３９号に記載のモノクローナル
抗体１１７号と２３９号）を使用して、ウェスタンブロット分析に付した。

【０１０１】実験結果一次ＢＭＳＣおよび各種細胞系に対するヘパラナーゼの付着：生体内臨床治験
の前提必要条件として、組織培養条件におけるヘパラナーゼの生体内利用率と活
性を試験するため、組換え体ヒトヘパラナーゼを、１０％ＦＣＳを含有するｐＨ
＞７．５のＤＭＥＭ内の放射能標識化ＥＣＭプレートに添加した。これらの条件
下では、ヘパラナーゼの分解生成物を表す放射能標識化ピークIIがないことによ
って示されているようにヘパラナーゼは活性でなかった（図１ａ）。対照的に、
培養された骨髄間質細胞（ＢＭＳＣ）の存在下、１０％ＦＣＳを含有するｐＨ＞
７．５のＤＭＥＭ内の放射能標識化ＥＣＭプレートにヘパラナーゼを添加した時
、ヘパラナーゼは、放射能標識化ピークIIの存在によって示されるように活性で
あった（図１ｂ）。したがって、細胞が前記酵素を周囲から保護して、酵素の活
性を可能にするという仮説がたてられた。

【０１０２】この仮説を試験するため、ヘパラナーゼ（バキュロウィルス由来、ｐ６０、プ
ロ酵素）を一次ＢＭＳＣ培養物とともにインキュベートした。２ｈｒインキュベ
ートした後、細胞を洗浄して、ヘパラナーゼ活性をＤＭＢ検定法で試験した。前
記細胞は非常に高いヘパラナーゼ活性を示したが、一方ＢＭＳＣはヘパラナーゼ
活性をもっていないことが発見された。このことは、前記酵素が細胞に付着して
その活性を保持したことを示唆している（図２ａ）。

【０１０３】次に、ヘパラナーゼに対するリガンドが何であるかを見つけることは興味深い
ことであった。以下の突然変異ＣＨＯ細胞クローンをヘパラナーゼとともにイン
キュベートした。すなわちＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−ｄｈｆｒ）、ごく少量のヘパラ
ン硫酸を発現するＣＨＯ細胞（ＨＳ，ＣＨＯ−８０３）およびほとんどＧＡＧを
発現しないＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−７４５，Esko JDら、Science, 241巻1092〜109
6頁1988年）である。ＧＡＧが少ない細胞へのヘパラナーゼの付着は有意に低下
することが見出された（図３）。

【０１０４】これらの観察結果は、ヘパラナーゼが、細胞に、ＨＳまたは他のＧＡＧを通じ
て付着することを示唆した。さらに、ヘパラナーゼは、ネズミ黒色腫細胞（Ｂ１６−Ｆ１）に極めて有効に
結合して高いヘパラナーゼ活性を示した（図４）。

【０１０５】これらの試験結果は、ヘパラナーゼが特定の受容体に結合せずに、より共通の
タイプ（more common type）の単一もしくは複数の分子に結合することを示して
いる。

【０１０６】サブ集密細胞単層（subconfluent cell monolayer）における細胞の数は細胞
の大きさに比例する。例えば、ＣＨＯサブ集密的細胞単層の１ｃｍ^２当りの細胞
の適当な数は、１０^５であり、マウスリンパ球のサブ集密的細胞単層の場合は４
×１０^５であるが、一方、ラットの骨髄間質のサブ集密的細胞単層の場合は１０ ^４である。ヘパラナーゼが付着した細胞のこの数は、ヘパラナーゼＤＭＢ活性検
定法（米国特許願第０９／１１３１６８号）において、Ｏ.Ｄ._５３０＞０．１を
与える。しかし、ヘパラナーゼが付着していないラットの骨髄間質細胞とマウス
のリンパ球中、測定可能なヘパラナーゼ活性は、同数の細胞を使用して、ＤＭＢ
活性検定法では全く測定できなかった。

【０１０７】タンパク質分解開裂と活性化がなされた付着ヘパラナーゼ：ヘパラナーゼが細
胞に実際に結合したことを示すため、その細胞のウェスタンブロット分析を行っ
た。ヘパラナーゼは細胞に結合していたのみならず、処理されてその不活性型ｐ
６０からその活性型ｐ４５になったことが見出された（図２ｂ，４ｃ，５ｂ）。
これらの試験結果は、該プロ酵素が生体内臨床治療用の優れた薬物であり、恐ら
く処理された該酵素より一層優れていることを示している。ｐ６０ヘパラナーゼ
がタンパク質分解開裂されて非常に活性になるという事実の別の証拠は、のう胞
性線維症の患者由来の痰試料に対するヘパラナーゼの液化作用に由来している（
図６ａ〜６ｂ）。ｐ６０ヘパラナーゼは、痰試料に添加すると、痰の粘度を、数
分間以内に有意に低下させることが見出された。対照的に、プロテアーゼ阻害剤
を、痰試料に、該酵素を加える前に添加すると、該酵素は痰試料の粘度を低下さ
せなかった。痰固有のプロテアーゼ類による該酵素のタンパク質分解開裂はウェ
スタンブロット分析法で確認された（図６ｃ）（この点については、１９９８年
３月２５日出願の米国特許願第０９／０４６４７５号参照。なおこの特許願は本
願に援用するものである）。

【０１０８】付着したヘパラナーゼは、生体内でのＢ１６−Ｆ１細胞の転移性能を増大する
：細胞の溢出性（extravazation）と浸潤性（invasiveness）に対する付着ｐ６
０ヘパラナーゼの作用を試験するため、該酵素を低転移性Ｂ１６−Ｆ１細胞に付
着させて、その細胞をＣ５７ＢＬマウスに注射した。３週間後に、その動物を安
楽死させ、肺を切り取り、転移の数を計数した。図７に示した試験結果は、処理
された細胞を注射された動物の肺内への転移数が、未処理細胞を注射された対照
動物に比べて２３倍であり、一方、ヘパラナーゼｃＤＮＡをトランスフェクトさ
れた細胞を注射された動物は、対照と比べて転移が３倍であったことを示してい
る。さらに、ヘパラナーゼを阻害することが知られているフラグミンを、処理さ
れた細胞と同時に注射したところ、肺内に見出された転移の数は、対照のレベル
まで著しく低下した。

【０１０９】以下の項では注射されたマウスの運命について述べる。異常な臨床徴候は、全試験期間中、どの動物にも全く検出されなかった。第四
群の一頭の動物（１９号）は、試験の４日目にかごの中で死んでいるのが見つか
った（３日間投与を行った）。

【０１１０】以下の表は、試験期間中のマウスの平均体重値（ｇ）と標準偏差（ＳＤ）を示
す。個々の値は付表に示す。

【表２】（^＊）−投与の日の体重；（^＊＊）−この群は２頭の動物だけなので、実際の値
を記載してあり、平均値とＳＤはない。以下の表は、試験終了の時点での転移の定量測定結果を示す。

【表３】これらの試験結果は、ヘパラナーゼが細胞および他の物質（例えば薬物送達シ
ステム）の、血管、血液−脳関門、血液−ミルク関門などを通じての溢出を触媒
して、受け取る組織中への浸潤を改善できることを示唆している。その結果、移
植の効力が加速されかつ細胞、微生物および恐らく他の物質も、生物学的血液関
門を横切ることができるようになる。

【０１１１】骨形成に対するヘパラナーゼの作用：組織再生に対するヘパラナーゼの作用を
試験するため、ヘパラナーゼの骨形成に対する作用を、β−グリセロールリン酸
とデキサメタゾンの存在下、１５日間培養した若い成熟ラットの大腿骨骨髄由来
の間質細胞を使用して試験した。１４日間の培養後、小結節が形成し、その小結
節の数と大きさが時間の経過とともに増大したことが実体顕微鏡によって示され
た。ＢＭＳＣの増殖に対するヘパラナーゼの作用を、ＭＴＴ増殖試験法を利用し
て試験した。処理された細胞の増殖率は、処理されなかった細胞より高かった（
図８ａ〜８ｂ）。ＢＭＳＣの分化に対するヘパラナーゼの作用を、アルカリホス
ファターゼ（ＡＬＰ）の活性を測定することによって試験した。１５日後のＡＬ
Ｐの活性は、処理された細胞が２〜４倍であった（図８ｃ〜８ｄ）。全タンパク
質に対する相対ＡＬＰ活性も算出したが（図８ｅ）、ヘパラナーゼで処理した細
胞の方が高かった。処理された培養物の石灰化小結節形成をアリザニンレッド染
色法によって測定した。１５日後の処理された細胞の染色された小結節の平均面
積は、対照細胞の培養物の２．５〜３倍であった（図８ｆ〜８ｇ）。

【０１１２】これらの知見は、ヘパラナーゼが、ラットの骨髄間質細胞培養物内で、細胞の
増殖を増大し、分化と骨様組織の形成を刺激することを示している。

【０１１３】本発明をその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの代替物、変形お
よび変化は当業技術者にとって明らかなことであることは明白である。したがっ
て、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲の中に入るかような代替
物、変形および変化をすべて含むものである。

【図面の簡単な説明】

【図１】ヘパラナーゼが周囲のｐＨや血清の存在によって不活性化されないように細胞
が保護することを示す図である。

【図２】ヘパラナーゼがＢＭＳＣに付着してその活性を保持することを示す図である。

【図３】ヘパラナーゼを細胞に付着させるのに、ＧＡＧの存在が必要であることを示す
図である。

【図４】ヘパラナーゼがＢ１６−Ｆ１細胞に付着してその活性を保持することを示す図
である。

【図５】ヘパラナーゼがＣＨＯ−ｄｈｆｒ細胞系に結合してタンパク質分解開裂作用を
受けて高いヘパラナーゼ活性を示すことを立証する図である。

【図６】ヘパラナーゼのタンパク質分解活性化に対する痰プロテアーゼ類の作用を立証
する図である。

【図７】腫瘍細胞の転移に対するヘパラナーゼの作用（生体内）を立証する図である。

【図８】図８は一次ＢＭＳＣ培養物からの骨様組織の生成に対するヘパラナーゼの作用
を立証する図である。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１３年５月１２日（２００１．５．１２）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項６】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、ヘ
パリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、スルファ
ターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選択される請求項４に記載の生
体製剤。

【手続補正書】

【提出日】平成１３年９月４日（２００１．９．４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】００８１

【補正方法】変更

【補正の内容】

【００８１】ヘパラナーゼの細胞への付着：使用した酵素製剤は、昆虫細胞内に発現された
約６０ｋＤａの精製組換え体ヘパラナーゼ（１９９８年５月１日に出願された米
国特許願第０９／０７１６１８号参照）、またはＰＣＴ／ＵＳ９９／０９２５
６（この文献は参考文献としてここに組入れる）に記述のように発現されて精製
された４５ｋＤａの組換え体ヘパラナーゼであった。ヘパラナーゼの細胞への付
着は以下のようにして実施した。すなわち、細胞を、１０％のＦＣＳを補充した
、抗生物質なしのＤＭＥＭもしくはＦ１２の培地を有する３５ｍｍまたは９０ｍ
ｍのプレートで培養した。抗生物質なしの培地内で少なくとも２４ｈｒインキュ
ベートした後、バキュロウィルス由来の組換え体ヘパラナーゼを、細胞培養物に
、１０μｇ／ｍｌ添加し、３７℃で２ｈｒの間インキュベートした。次にこれら
プレートをＰＢＳで２回洗浄し、ごく短時間トリプシン処理をして収穫し、ＰＢ
Ｓで洗浄し、次いでそのペレットを、活性検定法もしくはウェスタンブロット分
析法に付すかまたは再懸濁させてマウスに注射した。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０１１２

【補正方法】変更

【補正の内容】

【０１１２】ヘパラナーゼの活性型（ｐ４５）は細胞の存在下においてのみ活性である：組
換え体活性型ヘパラナーゼ（組換え体ｐ４５：例えばＰＣＴ／ＵＳ９９／０９
２５６を参照されたい）が細胞（Ｅｂ、マウスＴリンパ腫細胞、またはラットの
骨髄間質細胞）に添加され、放射能標識されたＥＣＭプレート上でｐＨ＞７．５
で１０％ＦＣＳを含有する培地中で２０ｈｒの間培養された。放射能標識された
ピークII材料が上澄み中に見出された。これはヘパラナーゼ活性の指標である。
一方、未処理の細胞は放射能標識されたピークＩ材料のみを生産した。加えて、
ｐ４５が細胞の不在下で完全培地に添加された場合は、放射能標識されたピーク
IIは上澄み中には見出されず、ヘパラナーゼ活性がないことを示した。これらの
結果は活性型のヘパラナーゼ（ｐ４５）が細胞に結合すること、およびそれ故そ
れは１０％ＦＣＳおよびｐＨ＞７．５という好ましくない環境条件下ですら活性
であるということを示唆する。ヘパラナーゼは多くの細胞型に結合する：本発明を実施したところ、ヘパラナ
ーゼ（ｐ６０およびｐ４５）は多くの細胞型に結合すること、およびプロ酵素（
ｐ６０）は細胞によって処理されて活性型（ｐ４５）となり、高い細胞関連ヘパ
ラナーゼ活性を示すことが見出された。ヘパラナーゼはヒトリンパ球、角化細胞
、およびＨＴ−３細胞；ラット骨髄間質細胞およびＣＨＯ細胞に結合し、これら
の細胞によって処理される。ヘパラナーゼはマウスのリンパ球、Ｅｂ−Ｔリンパ
腫細胞、Ｆ１およびＦ１０−９細胞にも結合する。まとめると、ここで示された実験結果はヘパラナーゼが、ラットの骨髄間質細
胞培養物内で、細胞の増殖を増大し、分化と骨様組織の形成を刺激することを示
している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/48 Ａ６１Ｋ 48/00 38/48 Ａ６１Ｐ 19/08 48/00 25/16 Ａ６１Ｐ 19/08 43/00 １０５ 25/16 Ａ６１Ｋ 37/54 43/00 １０５Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＣ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/547 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 4B024 AA01 BA11 BA12 BA14 CA04 DA02 DA03 EA02 EA04 FA02 FA17 GA11 HA01 HA17 4B065 AA90X AA93Y AB01 BA02 CA31 CA33 CA44 4C076 AA95 BB32 CC26 EE41 FF63 4C084 AA02 AA17 BA44 CA53 CA56 DC02 MA02 NA13 NA14 ZA022 ZA962 4C087 AA01 AA02 BB44 BB45 BB48 BB57 BB64 BB65 CA03 CA04 MA02 NA13 NA14 ZA02 ZA96 ZB21 ZC02

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】生体材料と、その生体材料の外側に付着されている精製され
た天然のまたは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素とを含有する生体製剤。
【請求項２】前記生体材料が複数の細胞である請求項１に記載の生体製剤
。
【請求項３】前記複数の細胞が骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角
化細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞、線維芽細胞および遺伝的に修飾され
た細胞からなる群から選択される請求項２に記載の生体製剤。
【請求項４】前記生体材料が組織またはその一部である請求項１に記載の
生体製剤。
【請求項５】前記組織または前記その一部が胚、皮膚弁および骨スクラッ
プからなる群から選択される請求項４に記載の生体製剤。
【請求項６】前記生体材料が薬物送達システムである請求項１に記載の生
体製剤。
【請求項７】前記細胞外マトリックス分解酵素がコラゲナーゼ、グリコサ
ミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求項１
に記載の生体製剤。
【請求項８】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、結
合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、ヒ
アルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選択
される請求項７に記載の生体材料。
【請求項９】組換え体細胞外マトリックス分解酵素を発現して細胞外に提
供するかまたは分泌する遺伝的に修飾された細胞であって、前記細胞外マトリッ
クス分解酵素がその細胞外に提供されているかまたはその細胞に付着されている
遺伝的に修飾された細胞。
【請求項１０】前記細胞が、骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角化
細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞、線維芽細胞および治療遺伝子によって
遺伝的に修飾された細胞からなる群から選択される請求項９に記載の遺伝的に修
飾された細胞。
【請求項１１】前記細胞外マトリックス分解酵素が、コラゲナーゼ、グリ
コサミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求
項９に記載の遺伝的に修飾された細胞。
【請求項１２】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項１１に記載の遺伝的に修飾された細胞。
【請求項１３】請求項１に記載の生体製剤および医薬として許容できる担
体を含有する医薬組成物。
【請求項１４】請求項９に記載の遺伝的に修飾された細胞および医薬とし
て許容できる担体を含有する医薬組成物。
【請求項１５】組織を生体内で修復する方法であって、（ａ）生体内で増殖し分化して前記組織またはその一部を形成することができ
る細胞であって、その外側に細胞外マトリックス分解酵素を付着されている細胞
を提供し、次いで（ｂ）その細胞を生体内に投与する、ステップを含んでなる方法。
【請求項１６】前記細胞が、前記細胞外マトリックス分解酵素を発現して
、細胞外に提供するかまたは分泌するように遺伝的に修飾されている請求項１５
に記載の方法。
【請求項１７】前記細胞外マトリックス分解酵素が、前記細胞の外側に付
加された、精製された天然のまたは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素であ
る請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】前記細胞が、骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角化
細胞、線維芽細胞、胚盤胞、神経芽細胞および星状膠細胞からなる群から選択さ
れる請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】前記組織が、骨、筋肉、皮膚および神経からなる群から選
択される請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】前記細胞外マトリックス分解酵素が、コラゲナーゼ、グリ
コサミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求
項１５に記載の方法。
【請求項２１】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】組織またはその一部を生体内に移植する方法であって、（ａ）組織またはその一部の外側に、精製された天然のまたは組換え体の細胞
外マトリックス分解酵素を付着させ、（ｂ）その組織またはその組織の一部を生体内に移植する、ステップを含んでなる方法。
【請求項２３】前記組織またはその一部が、胚、皮膚弁および骨スクラッ
プからなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】前記細胞外マトリックス分解酵素が、コラゲナーゼ、グリ
コサミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求
項２２に記載の方法。
【請求項２５】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】細胞を生体内に移植する方法であって、（ａ）移植可能な細胞であってその外側に細胞外マトリックス分解酵素を付着
された細胞を提供し、次いで（ｂ）その細胞を生体内に投与する、ステップを含んでなる方法。
【請求項２７】前記細胞が、前記細胞外マトリックス分解酵素を発現して
、細胞外に提供するかまたは分泌するように遺伝的に修飾されている請求項２６
に記載の方法。
【請求項２８】前記細胞外マトリックス分解酵素が、前記細胞の外側に付
加された、精製された天然のまたは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素であ
る請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】前記細胞が、骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角化
細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞および線維芽細胞からなる群から選択さ
れる請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】前記細胞外マトリックス分解酵素が、コラゲナーゼ、グリ
コサミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求
項２６に記載の方法。
【請求項３１】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】治療タンパク質を発現する遺伝的に修飾された細胞を生体
内に導入する体細胞遺伝子治療方法であって、（ａ）細胞外マトリックス分解酵素を外側に付着された、治療タンパク質を発
現する遺伝的に修飾された細胞を提供し、次いで（ｂ）前記細胞を生体内に投与する、ステップを含んでなる方法。
【請求項３３】前記細胞が、前記細胞外マトリックス分解酵素を発現して
、細胞外に提供するかまたは分泌するようにさらに遺伝的に修飾されている請求
項３２に記載の方法。
【請求項３４】前記細胞外マトリックス分解酵素が、前記細胞の外側に付
加された、精製された天然のまたは組換え体の細胞外マトリックス分解酵素であ
る請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】前記細胞が、骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角化
細胞、胚盤胞、神経芽細胞、星状膠細胞および線維芽細胞からなる群から選択さ
れる請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】前記細胞外マトリックス分解酵素が、コラゲナーゼ、グリ
コサミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求
項３２に記載の方法。
【請求項３７】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】前記治療タンパク質が遺伝病の症状を軽減することができ
る請求項３２に記載の方法。
【請求項３９】前記遺伝病が、ムコ多糖症、のう胞性線維症、パーキンソ
ン症、ゴーシェ症候群および骨形成不全からなる群から選択される請求項３８に
記載の方法。
【請求項４０】生体材料を生体血液関門を横切って送達する方法であって
、（ａ）生体材料の外側に、精製された天然のまたは組換え体の細胞外マトリッ
クス分解酵素を付着させ、次いで（ｂ）その生体材料を生体内に投与する、ステップを含んでなる方法。
【請求項４１】前記生体材料が細胞を含んでいる請求項４０に記載の方法
。
【請求項４２】前記細胞が、骨髄の造血幹細胞もしくは間質幹細胞、角化
細胞、神経芽細胞、星状膠細胞、線維芽細胞および遺伝的に修飾された細胞から
なる群から選択される請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】前記生体材料が薬物送達システムである請求項４０に記載
の方法。
【請求項４４】前記細胞外マトリックス分解酵素が、コラゲナーゼ、グリ
コサミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求
項４０に記載の方法。
【請求項４５】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】前記生体血液関門が、血液−脳−関門、血液−ミルク−関
門および母胎の血液−胎盤−胚関門からなる群から選択される請求項４０に記載
の方法。
【請求項４７】細胞を、生体血液関門を横切って送達する方法であって、（ａ）細胞外マトリックス分解酵素を発現して細胞外に提供するかまたは分泌
するように、細胞を遺伝的に修飾し、次いで（ｂ）その細胞を生体内に投与する、ステップを含んでなる方法。
【請求項４８】前記細胞が、治療タンパク質を発現するようにさらに遺伝
的に修飾されている請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】前記細胞が、骨髄の造血幹細胞もしくは、間質幹細胞、角
化細胞、神経芽細胞、星状膠細胞、線維芽細胞および治療タンパク質を発現する
ように遺伝的に修飾された細胞からなる群から選択される請求項４７に記載の方
法。
【請求項５０】前記細胞外マトリックス分解酵素が、コラゲナーゼ、グリ
コサミノグリカン類分解酵素およびエラスターゼからなる群から選択される請求
項４７に記載の方法。
【請求項５１】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】グリコサミノグリカン類を含有する粘液性、粘膿性または
膿性の物質が蓄積している患者を管理する方法であって、少なくとも一種のグリ
コサミノグリカン類分解酵素を、前記物質の粘弾性、病原体の感染力および炎症
のうちの少なくとも一つを低下させるために治療上有効な量で患者に投与するこ
とを含んでなり、そして前記少なくとも一種のグリコサミノグリカン類分解酵素
が不活性形態で投与され、次いで前記粘液性、粘膿性または膿性の物質に固有の
プロテアーゼ類によって処理されて活性型になる方法。
【請求項５３】前記グリコサミノグリカン類分解酵素が、ヘパラナーゼ、
結合組織活性化ペプチド、ヘパリナーゼ、グルコロニダーゼ、ヘパリチナーゼ、
ヒアルロニダーゼ、スルファターゼおよびコンドロイチナーゼからなる群から選
択される請求項５２に記載の方法。