JP2004049214A - 蛋白質またはペプチドの細胞内導入方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞内に蛋白質を導入することができる複合体、及び、該複合体を用いて、時間的・量的に制御でき、なおかつ効率的に蛋白質を細胞内へ導入する方法を提供することを目的とする。
【解決手段】蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
【選択図】 なし
【解決手段】蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
【選択図】 なし
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な蛋白質複合体、及び該複合体を用いて蛋白質を細胞内に効率的に導入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、様々な細胞の増殖・分化・発生に関わる蛋白質の発現・修飾のタイムシグナルが明らかにされつつあり、これらの知見に基づいて、例えば再生医学・組織工学といった工学面へと応用する際に、細胞内で機能させたい蛋白質を任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させることができれば、様々な可能性が広がることが期待される。
【０００３】
細胞内で任意の蛋白質を機能させる技術は、現在のところ遺伝子導入法がほぼ唯一の手法となっている。恒常的に細胞内で任意の蛋白質を機能させたい場合は遺伝子導入法が有利な手法ではあるが、任意の蛋白質を一過的に細胞内で機能させたい場合は蛋白質そのものを細胞内に導入することが好ましい。
【０００４】
従来、蛋白質そのものを細胞内へ導入する方法としては、細胞膜を透過させる必要があることから、マイクロインジェクション等の特殊な手法や、リポソーム等のカプセル状のものに蛋白質を封入し、それを細胞膜に融合させることにより内容物（蛋白質等）を細胞内に導入する手法が用いられている。また、細胞の種類は限定されるものの、細胞表面に発現する各種のレセプターを標的とし、そのリガンドをキャリアーとしたレセプター依存経路による細胞内導入法も実用化されている。
【０００５】
我々は最近、これらの経路以外にカチオン性の高い蛋白質や化学修飾によりカチオン化された蛋白質が、負に帯電している細胞表面に静電的に吸着し、高効率に細胞内に取り込まれることを確認した（Ｆｕｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４０， ７５１８−７５２４， ２００１）。同じく最近、ＨＩＶ由来の塩基性に富むＴＡＴペプチド（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５， １５６９−１５７２， １９９９）やＰｏｌｙ−Ａｒｇ等のカチオン性ペプチド（Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５８３６−５８４０， ２００１）を付加した蛋白質が細胞膜を効率的に透過することが報告された。何れも詳細なメカニズムは不明ではあるが、カチオン性蛋白質と細胞表面との静電相互作用に起因する経路による細胞膜透過経路が考えられる。
しかしながら、従来の蛋白質のカチオン化による手法では、蛋白質分子内の多部位のアミノ酸側鎖の修飾が必要であったため、機能低下の問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】
二見ら（Ｆｕｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．）， バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）， ４０， ７５１８−７５２４， ２００１
【非特許文献２】
シュワルツら（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．）， サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）， ２８５， １５６９−１５７２， １９９９
【非特許文献３】
二木ら（Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．）， ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）， ２７６， ５８３６−５８４０， ２００１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞内に蛋白質を導入することができる複合体、及び、該複合体を用いて、時間的・量的に制御でき、なおかつ効率的に蛋白質を細胞内へ導入する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、ポリエチレンイミン等のカチオン価を有する重合体を蛋白質に結合して、蛋白質をカチオン化することにより当該課題を解決できることを見いだし本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
（２）前記重合体が、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はその塩である前記（１）記載の方法。
（３）前記重合体の数平均分子量が１００〜１００万である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とが共有結合を介して結合した複合体である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とがアミド結合、ジスルフィド結合、又はチオエーテル結合を介して結合した複合体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）蛋白質又はペプチドとポリアルキレンポリアミン骨格を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
（７）前記重合体が、ポリアルキレンイミンである前記（６）記載の方法。
（８）前記重合体が、ポリエチレンイミンである前記（６）又は（７）記載の方法。
（９）前記重合体の数平均分子量が１００〜１００万である前記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記重合体の数平均分子量が１００〜１０万である前記（６）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とが共有結合を介して結合した複合体である前記（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とがアミド結合、ジスルフィド結合、又はチオエーテル結合を介して結合した複合体である前記（６）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有し、かつ数平均分子量が１００〜１００万である重合体とが結合した複合体。
（１４）前記重合体が、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はその塩である前記（１３）記載の複合体。
（１５）蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有し、かつ数平均分子量が１００〜１００万である重合体とが結合した複合体を含有する医薬。
【００１０】
さらに、本発明は以下の発明を包含する。
（１）蛋白質とポリアルキレンイミンとが結合した複合体。
（２）ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである前記（１）記載の複合体。
（３）ポリアルキレンイミンの数平均分子量が１００〜１００，０００の範囲である前記（１）又は（２）記載の複合体。
（４）蛋白質とポリアルキレンイミンとが、アミド結合、ジスルフィド結合、又はチオエーテル結合を介して結合した前記（１）〜（３）のいずれかに記載の複合体。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の複合体を用いて蛋白質を細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質の細胞内導入方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書でいう「蛋白質又はペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して生じる化合物を意味する。本発明で用いることのできる蛋白質又はペプチドとしては特に限定されず、ペプチド、酵素、抗体、その他機能性（薬理作用等の生理活性）を有し、医薬・薬物として有用な蛋白質又はペプチド等の任意の蛋白質又はペプチドを用いることができ、その分子量としては１００〜１００万が好ましい。なお、本明細書でいう「蛋白質」とは、その蛋白質に、糖鎖、脂質、及び／又はリン酸基が結合した複合蛋白質をも含む意味である。また、その蛋白質の構造は天然状態であっても変性状態であってもよい。
【００１２】
本発明で用いることのできるカチオン性の基を有する重合体としては、例えば、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体が挙げられる。本明細書でいう「カチオン価」とは、前記重合体のアミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）と前記重合体の数平均分子量との積を１０００で割った値のことである。本発明で用いられる前記重合体のカチオン価は一般に２を超えて３万以下であるが、２を超えて２万以下が好ましく、２を超えて２５００以下がより好ましく、２を超えて２５０以下が特に好ましく、４以上７０以下が最も好ましい。なお、「アミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）」とは試料化合物中に含まれるアミンの総量の指標であり、試料化合物１ｇに含まれるアミンのｍｍｏｌ数で表される。試料化合物のアミン価は一般的なアミノ基の定量方法に従って測定できる。一般的なアミノ基の定量方法としては、「新実験化学講座 第１３巻 有機化学構造Ｉ」（丸善株式会社発行、日本化学会編、昭和５３年１１月２０日発行）の第８８頁〜第９９頁に記載の方法やコロイド滴定法を挙げることができる。コロイド滴定法は、「コロイド滴定法」（株式会社南江堂発行、千手諒一著、第１版１９６９年１１月２０日発行）に記載されている。アミン価の分析は試料化合物の形態、溶解性、含有不純物等を考慮して、精度よく分析できる方法を適宜選択する必要がある。本発明で用いられる重合体のアミン価は特に限定されるものではないが、１〜３０が好ましく、５〜２５がさらに好ましい。
【００１３】
また、本発明で用いられる重合体の数平均分子量としては、一般に１００〜１００万であるが、１００〜１０万が好ましく、１００〜１万が更に好ましく、２００〜３０００が特に好ましい。なお、重合体の数平均分子量の測定にあたっては、重合体の数平均分子量が１万以下の場合は沸点上昇法により測定し、１万を超える場合はＧＰＣにより測定すると分子量を精度よく測定できる。
【００１４】
本発明で用いることのできる重合体としては、例えば、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はこれらの共重合体を挙げることができる。また、それらの重合体の塩、例えば、第一級、第二級、第三級、及び第四級アンモニウム塩等も同様に用いることができる。更にこれらの重合体を化学的に修飾、変成した重合体も同様に用いることができる。
【００１５】
そのような重合体の具体例としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン等のポリアルキレンイミン等のポリアルキレンポリアミン、ポリアリルアミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド等のポリアリルアミン、ポリアクリルアミドのホフマン分解物、ポリビニルアセトアミド加水分解物、ポリビニルフタルイミドの加水分解物、Ｎ−ビニルホルムアミドポリマーの加水分解物等のポリビニルアミン、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド（共）重合体等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド（共）重合体、ポリメタアクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート（共）重合体、ポリアミジン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、ジシアンジアミド系縮合物、エピクロロヒドリン・ジメチルアミン縮合物等のエピクロロヒドリン・ジアルキルアミン縮合物、ジメチルアミン・エチレンジクロライド縮合物等のジアルキルアミン・アルキルジハライド縮合物、ポリビニルイミダゾリン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、カルボキシメチルセルロース第四級アンモニウム（第四級アンモニウムＣＭＣ）、グリコールキトサン、カチオン化デンプン等が挙げられる。
【００１６】
上記重合体のうち代表的な化合物のアミン価の理論値は以下の表のとおりである。本表に記載のアミン価の理論値とは、重合体を形成する単量体の分子量の逆数に１０００をかけた値である。一般的に、上記の方法により測定されるアミン価の実測値はその理論値と測定誤差の範囲内でほぼ一致する。上述の方法により測定されるアミン価に基づいて重合体のカチオン価を算出することができる。アミン価は重合体の合成方法を変更したり、他成分との共重合、重合体の化学的修飾により任意に変化させることが可能である。
【００１７】
【００１８】
以下に、本発明の複合体の製造方法について述べる。重合体として、例えばポリアルキレンイミンを用いる場合、以下のようにして本発明の複合体を製造することができる。
本発明で用いられるポリアルキレンイミンとしては、例えば下記一般式（Ｉ）：
【００１９】
【化１】
（式中、Ｒ１、Ｒ２、及びＲ３はアルキレン基を表し、Ｘ及びＹはそれぞれ０以上の整数であり、ＸとＹの和は１以上である。）
で表され、直鎖状のもの、又は、枝分かれ状のものどちらであってもよい。
【００２０】
前記ポリアルキレンイミンは、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３が互いに同一でも異なっていてもよい炭素原子数２〜４のアルキレン基であるポリアルキレンイミンが好ましく、さらには式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３が炭素原子数２のエチレン基であるポリエチレンイミンがより好ましい。
【００２１】
以下に、ポリエチレンイミンを用いる場合について説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、これ以外のその他の２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体についても以下と同様にして実施することができる。
本発明で好ましく用いられるポリエチレンイミン（以下、「ＰＥＩ」という）は下記式で表される。
【００２２】
【化２】
（式中、Ｘ及びＹはそれぞれ１以上の整数である。）
【００２３】
ＰＥＩは、大きな正の電荷密度を有する水溶性ポリマーである。なお、ＰＥＩはかまぼこの沈殿剤等の食品添加物としても利用されており、生体に対する安全性が確認されている。
本発明では、直鎖状のＰＥＩでも分岐鎖を多数有する枝分かれ構造のＰＥＩでも用いることができるが、下記式：
【００２４】
【化３】
【００２５】
で例示されるような枝分かれ構造を有するＰＥＩが、より正電荷密度が高いことから好ましい。また、分子量は細胞導入効率、取扱い性等を考慮すると、数平均分子量が１００〜１００，０００の範囲のＰＥＩが好ましく、１００〜１０，０００のＰＥＩがより好ましく、２００〜３，０００の低分子量のＰＥＩが特に好ましい。
【００２６】
本発明の複合体は、前記蛋白質と前記ＰＥＩとが結合したものである。ここでいう「結合」とは、化学結合であれば特に限定されないが、好ましくは共有結合のことをいう。蛋白質とＰＥＩとはそれらの間に何も介さずに直接的に結合していてもよいし、又は、公知の２価性架橋試薬等を用いて、間にスペーサー等を介して結合していてもよい。一分子の蛋白質に対して結合するＰＥＩの分子数は特に限定されないが、１〜１０個が好ましく、１〜３個が特に好ましい。また、個々のＰＥＩにおける蛋白質との結合部位数は１点であることが好ましい。本発明では、１個の蛋白質に対して１個のＰＥＩが１点だけで結合した複合体が特に好ましい。
【００２７】
蛋白質とＰＥＩとの間の結合は、蛋白質とＰＥＩとを共有結合で結合させることができるものであれば特に限定されるものではなく、化学分野で公知の合成手法を利用することにより様々な結合方法で結合させることができる。以下に、蛋白質とＰＥＩとの結合方法について例示するが、本発明で用いられる結合方法はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
蛋白質とＰＥＩとをアミド結合を介して結合する場合には、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド）等の活性化剤を用いて、蛋白質分子中のアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、又は炭素末端のカルボキシル基とＰＥＩのアミノ基との間にアミド結合を形成させることができる。ＥＤＣを用いた場合の例を下記に模式的に示す。
【００２９】
【化４】
【００３０】
蛋白質とＰＥＩとをジスルフィド結合を介して結合する場合には、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）等の試薬を用いて、蛋白質分子中のシステイン残基のチオール基とＰＥＩのアミノ基との間にジスルフィド結合を含む共有結合を形成させることができる。ＳＰＤＰを用いた場合の例を下記に模式的に示す。
【００３１】
【化５】
【００３２】
ジスルフィド結合は可逆的な結合であり、細胞質内の還元条件下で解離する。このため、ジスルフィド結合により結合された複合体は、細胞内に導入されるとＰＥＩと蛋白質とに分離し、蛋白質がより有利にその機能を細胞内で発揮することが期待される。
【００３３】
この他に、蛋白質とＰＥＩとを結合させる例としては、２−イミノチオラン等を用いて、蛋白質分子中のリジン残基又はＮ末端のアミノ基とＰＥＩのアミノ基とを結合させる方法や、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド ）等を用いて、蛋白質分子中のシステイン残基のチオール基とＰＥＩのアミノ基との間にチオエーテル結合を含む共有結合を形成させる方法等が挙げられる。
【００３４】
ここで挙げた結合方法以外にも、エーテル結合、エステル結合、イミド結合、炭素−炭素結合、アミジン結合等が挙げられ、文献（例えば、株式会社 東京化学同人「蛋白質ＩＶ 構造機能相関」社団法人 日本生化学会 編、第１版１９９１年３月２０日 発行）等を参照することにより、様々な結合方法を採用することができる。
【００３５】
上述の製造方法及び当技術分野で公知の合成手段を参照することにより、ポリアルキレンイミン以外の重合体を用いた場合についても同様に本発明の複合体を製造することができる。
【００３６】
また、本発明で用いられる複合体を、必要に応じて標識してもよい。標識方法としては、一般的な公知の方法であれば特に限定されないが、蛍光標識、オートラジオグラフィ、高電子密度物質、色素不溶化酵素であることが好ましい。特に好ましい形態は、蛍光標識化合物を共有結合により複合体を標識することである。
【００３７】
蛍光標識に用いる蛍光物質としては、特に限定されないが、例えばピレン、アントラニロイル基、ダンシル基、フルオレセイン、ローダミン、ニトロベンゾキサジアゾール基等の蛍光団を有する化合物が挙げられる。上記の蛍光団を有する化合物は公知であり（例えば、平塚寿章、「蛋白質 核酸 酵素」、Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．７（１９９７）等参照）、常法により蛋白質分子又はペプチド等に導入することができる。
次に、本発明の複合体を用いて細胞内に蛋白質を導入する方法について説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
蛋白質を導入しようとする細胞を含む培地中に、本発明の複合体又は該複合体を含む溶液を添加する。その後、細胞を適切な培養温度、培養時間等の培養条件で培養することにより、本発明の複合体は細胞内に取り込まれ、時間の経過とともに複合体の細胞への取り込み量は増加する。本発明の方法では、蛋白質の細胞内への導入量を、添加する複合体の絶対量、濃度、添加時間等を変化させることにより容易に制御できる。なお、本発明の複合体は、該複合体が有する正電荷と細胞表面の負電荷との静電相互作用に起因する機構により細胞内へ取り込まれるものと推測され、このため、培地中で細胞に複合体を取り込ませる場合には、ヘパリン、核酸等のアニオン性ポリマーが共存しない条件下で行うことが好ましい。また、本発明の複合体を含む溶液を、例えば経口投与、静脈内投与、患部への注射、皮膚への塗布等の方法により直接生体に接種して、生体内の細胞に複合体を取り込ませることもできる。
【００３９】
このことから、本発明に記載のある蛋白質又はペプチドと、２を越えて３万以下のカチオン価を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法、及びその複合体は、生細胞における蛋白質又はペプチドの機能解析への応用、更には医療品、医薬品、試薬、創薬支援、再生医療に適用することも本発明の好ましい実施形態の一つである。例えば、薬物として薬理作用等の生理活性を有する蛋白質又はペプチド（例えば、酵素、抗体、ホルモン等）とカチオン化重合体とを結合させて複合体としたものを医薬として用いることができる。このような医薬は、カチオン化重合体がキャリアーとして作用し、薬物である蛋白質又ペプチドが効率良く細胞内に送達されるため非常に有用である。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明の実施形態について具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例では、数平均分子量は沸点上昇法により測定し、アミン価は酸中和滴定法により測定した。得られた数平均分子量及びアミン価を用いてカチオン価を算出した。
また、以下の実施例では、数平均分子量２５０、６００、１０００、１２００、及び１８００のＰＥＩ（日本触媒製：商品名「エポミン」）を用い、それぞれＰＥＩ２５０、ＰＥＩ６００、ＰＥＩ１０００、ＰＥＩ１２００、及びＰＥＩ１８００として表記した。
【００４１】
（実施例１）
ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ 複合体の合成
蛋白質として、細胞内へ導入されることで蛋白質合成阻害に伴う細胞増殖阻害を誘起する酵素であるＲＮａｓｅＡを用いた。
６０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＥＩ水溶液 １．５ｍｌ（塩酸でｐＨ５に調整）にＲＮａｓｅＡ １５ｍｇを溶解した。ＥＤＣ ２．５ｍｇを添加して室温で１６時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を水に対して透析し、最後に陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−トヨパール ６５０Ｍ）で精製してＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体（ＲＮａｓｅＡ１分子あたりＰＥＩが１〜２個結合）を得た。得られたＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の１．５μｇ相当を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果を図１に示す。
【００４２】
ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ 複合体の蛋白質の機能評価
また、Ｙｅａｓｔ ＲＮＡを基質としてＹｅａｓｔ ＲＮＡの分解速度を測定し、酵素活性をネイティブ（ｎａｔｉｖｅ） ＲＮａｓｅＡと比較した。ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡに対するＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の相対活性を表１に示す。また、それぞれのＰＥＩのアミン価及びカチオン価も併せて表１に示す。なお、ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ１２００−１及びＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ１２００−２は、それぞれＲＮａｓｅＡ一分子あたりＰＥＩ１２００が約１個及び約２個結合した複合体であることを表す。表１の結果より、本発明の複合体は、従来法によるＲＮａｓｅＡ−エチレンジアミンと比較すると極めて高い酵素活性を示し、ＲＮａｓｅＡが本来有している機能の低下が小さいことがわかる。
【００４３】
【表１】
【００４４】
ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ 複合体の細胞への導入
上記の各複合体について、３Ｔ３／ＳＶ４０細胞に対する細胞増殖阻害活性について評価した。細胞増殖阻害活性試験は、９６ウェルプレートを用い、１５００個／ウェルの３Ｔ３／ＳＶ４０細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で１２時間培養し、その培養上清にｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡ、及びＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体を各種の濃度で添加し、３日後の細胞の増殖度をＭＴＴ法で評価した。その結果を図２に示す。ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡは細胞内に取り込まれず、有意の細胞増殖阻害活性を示さなかったが、本発明の複合体は効率的に細胞内に導入され、導入されたＰＥＩの正電荷量に比例した細胞増殖阻害活性を示すことが確認された。
【００４５】
（実施例２）
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体の合成
蛋白質として、細胞内への取り込みが蛍光により容易に確認できるＥｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ｅＧＦＰ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。ｅＧＦＰは、アミノ末端側にＨｉｓタグを含み、大腸菌リコンビナント蛋白質として発現・精製したものである。
６０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＥＩ水溶液 ４．５ｍｌ（塩酸でｐＨ５に調整）にｅＧＦＰ ３ｍｇを溶解した。ＥＤＣ １０ｍｇを添加してボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、室温で１６時間インキュベートした。反応溶液を水に対して透析し、最後にＨｉＴｒａｐ（Ｎｉ＋）キレートカラムで精製してｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を得た。得られたｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果を図３に示す。
【００４６】
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体の蛋白質の機能評価
ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体、及び比較としてｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体の蛍光強度について比較した。その結果を図４に示す。図４からわかるとおり、従来法によるエチレンジアミンで多修飾した場合と比較して、約１個のＰＥＩで修飾したｅＧＦＰは ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰと同等の高い蛍光強度を保持しており、ＰＥＩ修飾によるｅＧＦＰの機能への影響は小さいことが示された。
【００４７】
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体の細胞への導入
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３ Ａ３１Ｋ 細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清に１００ｎＭ（３μｇ／ｍｌ）のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を添加し、８時間後のｅＧＦＰの取り込みを蛍光により観察した。比較として、ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、及びｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体についても同様に試験した。その観察結果を図５に示す。図５の観察結果からわかるとおり、ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、及びｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体はほとんど細胞内に取り込まれていないのに対して、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることが分かる。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行なっていない。
【００４８】
（実施例３）
Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ＰＥＩ１２００ 複合体の合成
Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．は分子量が１００ｋＤａで、分子表面に２個のシステイン残基が露出している。大腸菌を用いてリコンビナントＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．を発現させた。得られたＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．を精製し、４．６２ｍｇ／ｍｌ（４６．８μＭ）の水溶液とした。０．１０７ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ１２００の水溶液（塩酸でｐＨ８に調整）と１．４ｍｇ／０．１ｍｌのＳＰＤＰのエタノール溶液とを混合（ＰＥＩ１２００とＳＰＤＰとのモル比は２：１）した。この混合溶液とＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．の水溶液とを、ＳＰＤＰとＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．とのモル比が１０：１となるように混合し、室温で１６時間撹拌した。反応終了後、ゲル濾過により精製して１分子のＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．あたり２分子のＰＥＩ１２００が結合したＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００複合体を得た。
【００４９】
細胞への Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００ の導入によるレポーター遺伝子 （ｅＧＦＰ） の発現
Ｔ７プロモーターの下流にｅＧＦＰ遺伝子を接続したプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に導入して、Ｔ７−ｅＧＦＰ／ＣＯＳ−７細胞を作製した。Ｔ７−ｅＧＦＰ／ＣＯＳ−７細胞の培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地）に１μＭのＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００を添加し、室温で１日培養した。培養終了後、蛍光を観察することによりｅＧＦＰの発現を確認した。その観察図を図６に示す。これに対して、Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００を添加しなかった場合はｅＧＦＰが発現しないことが確認された。
【００５０】
（実施例４）
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００ 複合体と ＴＡＴ−ｅＧＦＰ 融合蛋白質との細胞導入効率の比較
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を含む１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ培地に、実施例２に従って合成したｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体を１００ｎＭ添加し、３７℃で６時間培養した。培養終了後にｅＧＦＰの細胞への取り込みを蛍光で観察した。また、比較としてＴＡＴペプチドをｅＧＦＰのアミノ末端側に付加した融合蛋白質を大腸菌リコンビナント蛋白質として発現・精製し、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質を１０００ｎＭ添加し、３７℃で６時間培養した。培養終了後にｅＧＦＰの細胞への取り込みを蛍光で観察した。ＴＡＴペプチドはＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧのアミノ酸配列を有するペプチドであり、蛋白質と複合体化させることにより、蛋白質が細胞へ取り込まれ易くなることが報告されている。結果を図７に示す。図７の結果から、ＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質を用いた場合は、細胞内にほとんど取り込まれないが、本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体を用いた場合は、ＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質の１０分の１の濃度でも極めて効率的に細胞内に取り込まれることが示された。
【００５１】
（実施例５）
２− イミノチオランを用いる ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ６００ 複合体の合成
ＲＮａｓｅＡ １０ｍｇ（０．７３μｍｏｌ）を５００μｌの０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解した。２−イミノチオラン ０．５ｍｇ（３．６μｍｏｌ）を添加し、室温で１５分間撹拌した。次いで、ＢｒＣＨ２ＣＯＮＨＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ １０ｍｇ（３６μｍｏｌ）を添加し、超音波をかけて分散させた後に室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を遠心分離機にかけた。上澄みを、１０％ＰＥＩ溶液（ｐＨ８に調整） ０．５ｍｌ（８３μｍｏｌ）と混合し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を水に対して透析してＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ６００複合体を得た。
【００５２】
得られた複合体について、実施例１と同様にして３Ｔ３／ＳＶ４０細胞に対する細胞増殖阻害活性について試験したところ、２−イミノチオランを用いて得られたＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ６００複合体も、ＥＤＣを用いて得られたＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体と同様に、効率的に細胞に取り込まれて細胞増殖阻害活性を示すことが確認された。
【００５３】
（実施例６）ＩｇＧ−ＰＥＩ−ＦＩＴＣの細胞導入
ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００ 複合体の合成
０．１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９．３）０．５ｍｌにＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製， ヤギ由来）１０ｍｇを溶解した。１ｍｌのＤＭＦに３．０ｍｇのＦＩＴＣ（Ｉ型，同仁化学研究所社製）を溶解した液を３０μｌとり、ＩｇＧ溶液に添加した。室温で２時間反応させた後、ゲルろ過にて精製してＦＩＴＣで修飾されたＩｇＧを得た。６０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＥＩ６００水溶液１ｍｌ（塩酸ｐＨ５に調整）にＦＩＴＣで修飾されたＩｇＧを３ｍｇを溶解した。次いで、ＥＤＣ３．０ｍｇを添加して室温で４時間反応後、水及びＰＢＳ溶液で透析することにより、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体を得た。
【００５４】
ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００ の細胞への導入
３Ｔ３／ＳＶ４０細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清にＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体を添加し、１２時間後の複合体取り込みを蛍光により観察した。比較として、ＰＥＩ６００を結合していないＦＩＴＣ−ＩｇＧ複合体についても同様に試験した。その観察結果を図８に示す。図８の観察結果からわかる通り、５０μＭ添加したにもかかわらずＦＩＴＣ−ＩｇＧ複合体は殆ど細胞内に取り込まれていない（図８（ａ））のに対して、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることがわかる（図８（ｂ））。また、細胞を０．５μｍ間隔で切断してその切断面を観察したところ、切断面に蛍光が観察されたことから、本発明の複合体は細胞表面ではなく細胞内部に取り込まれていることが確認された。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行っていない。
【００５５】
（実施例７）
ＩｇＧ−ＰＥＩ６００ 複合体の合成
ヒトＳ１００Ｃ蛋白質（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐ３１９４９）は細胞内のアクチンフィラメントと結合能を有する蛋白質である（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４９， １１９３−１２０６ （２０００））。組換え蛋白質として調製したヒトＳ１００Ｃを抗原蛋白質として感作させ、このウサギ血清より抗ヒトＳ１００Ｃ抗体を含むＩｇＧ（Ａ）を調製した。対照として、抗原感作をさせていないウサギ血清より抗体混合物（Ｓ１００Ｃに特異的な結合能を有さない抗体；ＩｇＧ（Ｂ））も調製した。ＩｇＧ（Ａ）及びＩｇＧ（Ｂ）とＰＥＩ６００との複合体合成は、実施例１と同様にして行なった。得られたＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００複合体及びＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００複合体をＦＩＴＣにより蛍光標識してＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体及びＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体を得た。
【００５６】
ＩｇＧ−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ 複合体の細胞への導入及び機能評価
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で培養したヒト正常線維芽細胞：ＫＭＳ−６細胞の培養上清に１５μｇ／ｍｌとなるようにＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体又はＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体を添加した。３７℃で３時間培養した後、培地を除去し、サンプルを含まないＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に置換し、更に２４時間培養した。各ＩｇＧ−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体の細胞への取り込みを蛍光顕微鏡により観察した。その観察結果を図９に示す。抗体混合物であるＩｇＧ（Ｂ）を含む複合体を用いた場合、細胞全体に蛍光が観察されるのに対し（図９（ａ））、ＩｇＧ（Ａ）を含む複合体を用いた場合は、局在を示している様子が確認された（図９（ｂ））。更にＩｇＧ（Ａ）複合体を導入した細胞を固定化後、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８結合ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 社製）を用いてアクチンフィラメントを染色した結果を図９（ｃ）に示す。その結果、ＩｇＧ（Ａ）を含む複合体の局在と染色場所が一致することから、ＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体は、ＩｇＧ（Ａ）のＳ１００Ｃへの特異的な抗体能を損なうことなく、細胞内でＳ１００Ｃを認識して特異的に結合することが示された。
【００５７】
（実施例８）
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体のマウス腹腔内投与による臓器への取り込み評価
実施例２に基づいて作成された３００μｇのｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００、及び３００μｇのＮａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）に溶解し、それぞれをＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）に注射器を用いて腹腔内に投与した。８時間後に解剖し、肝臓、腎臓を摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＭＡ）中で急速に凍結させた。クリオスタットを用いて１０μｍの凍結組織切片を調製し蛍光顕微鏡にて臓器への取り込みを確認した（肝臓；図１０（ａ）、腎臓；図１０（ｂ））その結果、主に臓器の表面に強くｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００が取り込まれた様子が観察されたばかりではなく、腎臓においてはその内部にまで取り込まれた様子が観察された。一方、Ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを投与した場合には臓器に取り込まれる様子は観察されなかった。
【００５８】
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体のラット門脈投与による肝臓組織内への取り込み評価
実施例２に基づいて作成された１００μｇ のｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００ならびに１００μｇ のＮａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）に溶解し、それぞれ麻酔をかけたＷｉｓｔｅｒ Ｒａｔ （８週齢）の門脈に注射器を用いて投与した。１時間後に肝臓を摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＭＡ）中で急速に凍結させた。クリオスタットを用いて１０μｍの凍結組織切片を調製し蛍光顕微鏡にて肝臓への取り込みを確認した（図１０（ｃ））。その結果、肝臓の門静脈周辺に特異的に取り込まれる様子が確認され、中心静脈に向かってｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００が移行して行くグラジエントも確認された。一方、Ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを投与した場合にはこの様な様子は観察されなかった。
【００５９】
（実施例９）
種々のカチオン価を有する重合体と ＲＮａｓｅＡ 複合体の合成
【００６０】
【表２】
【００６１】
表２に示す種々のカチオン価を有する重合体とＲＮａｓｅＡ複合体を用いて種々のカチオン性重合体−ＲＮａｓｅＡ複合体を合成した。４０ｍｇ／ｍｌ濃度のカチオン価を有する重合体水溶液１．０ｍｌ（塩酸でｐＨ５に調整）にＲＮａｓｅＡ１０ｍｇを溶解し、次いでＥＤＣ３．０ｍｇを添加して室温で４時間反応した。反応後、反応溶液を水に対して透析し、カチオン価を有する重合体−ＲＮａｓｅＡ複合体を得た。
【００６２】
ＲＮａｓｅＡ− カチオン価を有する重合体複合体の細胞への導入
上記の各複合体について、３Ｔ３／ＳＶ４０細胞に対する細胞増殖阻害活性について評価した。細胞阻害活性試験は実施例１に記載と同様の方法で実施した。その結果を図１１に示す。Ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡは細胞内に取り込まれず、有意の細胞増殖阻害活性を示さなかったが、本発明の複合体を用いた場合は細胞増殖阻害活性を示し、本発明の複合体が効率的に細胞内に導入されることが確認された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、蛋白質の機能を損なうことなく、極めて高い効率で、且つ時間的・量的に制御可能な、蛋白質の細胞内導入方法が提供される。
即ち、従来は任意の蛋白質を細胞内で機能させる手法は遺伝子導入法が主流で、人為的に機能させる蛋白質を恒常的に細胞内で発現させるのに適しているのに対し、本法による蛋白質細胞内導入法は一過的に発現させるのに適した技術である。この様な新規技術は機能が未知な蛋白質の機能解析といった手段となる他、遺伝子導入法が抱える数々の問題点を解決する手段となり得る。
【００６４】
また、本発明の方法は、蛋白質分子内に多数の側鎖が修飾されるエチレンジアミンによるカチオン化という従来法に比較して、１〜数個以内の小数の側鎖の修飾で多数のカチオンが導入されるため、蛋白質の構造と機能に対する影響が軽微である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡ、及び、本発明のＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の電気泳動観察図である。
【図２】本発明のＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込み、及び細胞増殖阻害活性を示す図である。
【図３】ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体、及び本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体の電気泳動観察図である。
【図４】ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体、及び本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体の蛍光強度を比較した図である。
【図５】ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体、及び本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体のＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３ Ａ３１Ｋ 細胞への取り込みを蛍光により観察した図である。
【図６】Ｔ７−ｅＧＦＰ／ＣＯＳ−７細胞中でのレポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）の発現を蛍光により観察した図である。
【図７】Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞に対する、ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体、及びＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質の導入効率を比較した図である。
【図８】（ａ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込みを蛍光及び透過光により観察した図である（左：蛍光写真、右：透過光写真）。
（ｂ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込みを蛍光及び透過光により観察した図である（左：蛍光写真、右：透過光写真）。３Ｔ３／ＳＶ４０細胞を０．５μｍ間隔で切断し、その各切断面を観察した。
【図９】（ａ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００複合体のＫＭＳ−６細胞への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｂ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００複合体のＫＭＳ−６細胞への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｃ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００複合体を導入したＫＭＳ−６細胞をアクチンフィラメントで染色したときの観察図である。
【図１０】（ａ）はｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体のマウスの肝臓への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｂ）はｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体のマウスの腎臓への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｃ）はｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体のラットの肝臓への取り込みを蛍光により観察した図である。
【図１１】本発明のＲＮａｓｅＡ−カチオン化重合体複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込み、及び細胞増殖阻害活性を示す図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、新規な蛋白質複合体、及び該複合体を用いて蛋白質を細胞内に効率的に導入する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
現在、様々な細胞の増殖・分化・発生に関わる蛋白質の発現・修飾のタイムシグナルが明らかにされつつあり、これらの知見に基づいて、例えば再生医学・組織工学といった工学面へと応用する際に、細胞内で機能させたい蛋白質を任意の量かつ任意の期間細胞内に存在させることができれば、様々な可能性が広がることが期待される。
【０００３】
細胞内で任意の蛋白質を機能させる技術は、現在のところ遺伝子導入法がほぼ唯一の手法となっている。恒常的に細胞内で任意の蛋白質を機能させたい場合は遺伝子導入法が有利な手法ではあるが、任意の蛋白質を一過的に細胞内で機能させたい場合は蛋白質そのものを細胞内に導入することが好ましい。
【０００４】
従来、蛋白質そのものを細胞内へ導入する方法としては、細胞膜を透過させる必要があることから、マイクロインジェクション等の特殊な手法や、リポソーム等のカプセル状のものに蛋白質を封入し、それを細胞膜に融合させることにより内容物（蛋白質等）を細胞内に導入する手法が用いられている。また、細胞の種類は限定されるものの、細胞表面に発現する各種のレセプターを標的とし、そのリガンドをキャリアーとしたレセプター依存経路による細胞内導入法も実用化されている。
【０００５】
我々は最近、これらの経路以外にカチオン性の高い蛋白質や化学修飾によりカチオン化された蛋白質が、負に帯電している細胞表面に静電的に吸着し、高効率に細胞内に取り込まれることを確認した（Ｆｕｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ， ４０， ７５１８−７５２４， ２００１）。同じく最近、ＨＩＶ由来の塩基性に富むＴＡＴペプチド（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８５， １５６９−１５７２， １９９９）やＰｏｌｙ−Ａｒｇ等のカチオン性ペプチド（Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７６， ５８３６−５８４０， ２００１）を付加した蛋白質が細胞膜を効率的に透過することが報告された。何れも詳細なメカニズムは不明ではあるが、カチオン性蛋白質と細胞表面との静電相互作用に起因する経路による細胞膜透過経路が考えられる。
しかしながら、従来の蛋白質のカチオン化による手法では、蛋白質分子内の多部位のアミノ酸側鎖の修飾が必要であったため、機能低下の問題があった。
【０００６】
【非特許文献１】
二見ら（Ｆｕｔａｍｉ ｅｔ ａｌ．）， バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）， ４０， ７５１８−７５２４， ２００１
【非特許文献２】
シュワルツら（Ｓｃｈｗａｒｚｅ ｅｔ ａｌ．）， サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）， ２８５， １５６９−１５７２， １９９９
【非特許文献３】
二木ら（Ｆｕｔａｋｉ ｅｔ ａｌ．）， ジャーナル オブ バイオロジカル ケミストリー（Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．）， ２７６， ５８３６−５８４０， ２００１
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、細胞内に蛋白質を導入することができる複合体、及び、該複合体を用いて、時間的・量的に制御でき、なおかつ効率的に蛋白質を細胞内へ導入する方法を提供することを目的とする。
【０００８】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは上記課題を解決するべく検討を重ねた結果、ポリエチレンイミン等のカチオン価を有する重合体を蛋白質に結合して、蛋白質をカチオン化することにより当該課題を解決できることを見いだし本発明を完成させるに至った。
【０００９】
即ち、本発明は以下の発明を包含する。
（１）蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
（２）前記重合体が、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はその塩である前記（１）記載の方法。
（３）前記重合体の数平均分子量が１００〜１００万である前記（１）又は（２）記載の方法。
（４）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とが共有結合を介して結合した複合体である前記（１）〜（３）のいずれかに記載の方法。
（５）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とがアミド結合、ジスルフィド結合、又はチオエーテル結合を介して結合した複合体である前記（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）蛋白質又はペプチドとポリアルキレンポリアミン骨格を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
（７）前記重合体が、ポリアルキレンイミンである前記（６）記載の方法。
（８）前記重合体が、ポリエチレンイミンである前記（６）又は（７）記載の方法。
（９）前記重合体の数平均分子量が１００〜１００万である前記（６）〜（８）のいずれかに記載の方法。
（１０）前記重合体の数平均分子量が１００〜１０万である前記（６）〜（９）のいずれかに記載の方法。
（１１）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とが共有結合を介して結合した複合体である前記（６）〜（１０）のいずれかに記載の方法。
（１２）前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とがアミド結合、ジスルフィド結合、又はチオエーテル結合を介して結合した複合体である前記（６）〜（１１）のいずれかに記載の方法。
（１３）蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有し、かつ数平均分子量が１００〜１００万である重合体とが結合した複合体。
（１４）前記重合体が、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はその塩である前記（１３）記載の複合体。
（１５）蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有し、かつ数平均分子量が１００〜１００万である重合体とが結合した複合体を含有する医薬。
【００１０】
さらに、本発明は以下の発明を包含する。
（１）蛋白質とポリアルキレンイミンとが結合した複合体。
（２）ポリアルキレンイミンがポリエチレンイミンである前記（１）記載の複合体。
（３）ポリアルキレンイミンの数平均分子量が１００〜１００，０００の範囲である前記（１）又は（２）記載の複合体。
（４）蛋白質とポリアルキレンイミンとが、アミド結合、ジスルフィド結合、又はチオエーテル結合を介して結合した前記（１）〜（３）のいずれかに記載の複合体。
（５）前記（１）〜（４）のいずれかに記載の複合体を用いて蛋白質を細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質の細胞内導入方法。
【００１１】
【発明の実施の形態】
以下に本発明を詳細に説明する。
本明細書でいう「蛋白質又はペプチド」とは、２個以上のアミノ酸がペプチド結合により結合して生じる化合物を意味する。本発明で用いることのできる蛋白質又はペプチドとしては特に限定されず、ペプチド、酵素、抗体、その他機能性（薬理作用等の生理活性）を有し、医薬・薬物として有用な蛋白質又はペプチド等の任意の蛋白質又はペプチドを用いることができ、その分子量としては１００〜１００万が好ましい。なお、本明細書でいう「蛋白質」とは、その蛋白質に、糖鎖、脂質、及び／又はリン酸基が結合した複合蛋白質をも含む意味である。また、その蛋白質の構造は天然状態であっても変性状態であってもよい。
【００１２】
本発明で用いることのできるカチオン性の基を有する重合体としては、例えば、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体が挙げられる。本明細書でいう「カチオン価」とは、前記重合体のアミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）と前記重合体の数平均分子量との積を１０００で割った値のことである。本発明で用いられる前記重合体のカチオン価は一般に２を超えて３万以下であるが、２を超えて２万以下が好ましく、２を超えて２５００以下がより好ましく、２を超えて２５０以下が特に好ましく、４以上７０以下が最も好ましい。なお、「アミン価（ｍｍｏｌ／ｇ）」とは試料化合物中に含まれるアミンの総量の指標であり、試料化合物１ｇに含まれるアミンのｍｍｏｌ数で表される。試料化合物のアミン価は一般的なアミノ基の定量方法に従って測定できる。一般的なアミノ基の定量方法としては、「新実験化学講座 第１３巻 有機化学構造Ｉ」（丸善株式会社発行、日本化学会編、昭和５３年１１月２０日発行）の第８８頁〜第９９頁に記載の方法やコロイド滴定法を挙げることができる。コロイド滴定法は、「コロイド滴定法」（株式会社南江堂発行、千手諒一著、第１版１９６９年１１月２０日発行）に記載されている。アミン価の分析は試料化合物の形態、溶解性、含有不純物等を考慮して、精度よく分析できる方法を適宜選択する必要がある。本発明で用いられる重合体のアミン価は特に限定されるものではないが、１〜３０が好ましく、５〜２５がさらに好ましい。
【００１３】
また、本発明で用いられる重合体の数平均分子量としては、一般に１００〜１００万であるが、１００〜１０万が好ましく、１００〜１万が更に好ましく、２００〜３０００が特に好ましい。なお、重合体の数平均分子量の測定にあたっては、重合体の数平均分子量が１万以下の場合は沸点上昇法により測定し、１万を超える場合はＧＰＣにより測定すると分子量を精度よく測定できる。
【００１４】
本発明で用いることのできる重合体としては、例えば、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はこれらの共重合体を挙げることができる。また、それらの重合体の塩、例えば、第一級、第二級、第三級、及び第四級アンモニウム塩等も同様に用いることができる。更にこれらの重合体を化学的に修飾、変成した重合体も同様に用いることができる。
【００１５】
そのような重合体の具体例としては、例えば、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン等のポリアルキレンイミン等のポリアルキレンポリアミン、ポリアリルアミン、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロライド等のポリアリルアミン、ポリアクリルアミドのホフマン分解物、ポリビニルアセトアミド加水分解物、ポリビニルフタルイミドの加水分解物、Ｎ−ビニルホルムアミドポリマーの加水分解物等のポリビニルアミン、ジメチルアミノプロピル（メタ）アクリルアミド（共）重合体等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリルアミド（共）重合体、ポリメタアクリロイルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロライド等のジアルキルアミノアルキル（メタ）アクリレート（共）重合体、ポリアミジン、ポリビニルピリジン、ポリビニルイミダゾール、ジシアンジアミド系縮合物、エピクロロヒドリン・ジメチルアミン縮合物等のエピクロロヒドリン・ジアルキルアミン縮合物、ジメチルアミン・エチレンジクロライド縮合物等のジアルキルアミン・アルキルジハライド縮合物、ポリビニルイミダゾリン、ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロライド、カルボキシメチルセルロース第四級アンモニウム（第四級アンモニウムＣＭＣ）、グリコールキトサン、カチオン化デンプン等が挙げられる。
【００１６】
上記重合体のうち代表的な化合物のアミン価の理論値は以下の表のとおりである。本表に記載のアミン価の理論値とは、重合体を形成する単量体の分子量の逆数に１０００をかけた値である。一般的に、上記の方法により測定されるアミン価の実測値はその理論値と測定誤差の範囲内でほぼ一致する。上述の方法により測定されるアミン価に基づいて重合体のカチオン価を算出することができる。アミン価は重合体の合成方法を変更したり、他成分との共重合、重合体の化学的修飾により任意に変化させることが可能である。
【００１７】
以下に、本発明の複合体の製造方法について述べる。重合体として、例えばポリアルキレンイミンを用いる場合、以下のようにして本発明の複合体を製造することができる。
本発明で用いられるポリアルキレンイミンとしては、例えば下記一般式（Ｉ）：
【００１９】
【化１】
で表され、直鎖状のもの、又は、枝分かれ状のものどちらであってもよい。
【００２０】
前記ポリアルキレンイミンは、式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３が互いに同一でも異なっていてもよい炭素原子数２〜４のアルキレン基であるポリアルキレンイミンが好ましく、さらには式（Ｉ）中のＲ１、Ｒ２、及びＲ３が炭素原子数２のエチレン基であるポリエチレンイミンがより好ましい。
【００２１】
以下に、ポリエチレンイミンを用いる場合について説明するが、本発明はこれに限定されるものではなく、これ以外のその他の２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体についても以下と同様にして実施することができる。
本発明で好ましく用いられるポリエチレンイミン（以下、「ＰＥＩ」という）は下記式で表される。
【００２２】
【化２】
【００２３】
ＰＥＩは、大きな正の電荷密度を有する水溶性ポリマーである。なお、ＰＥＩはかまぼこの沈殿剤等の食品添加物としても利用されており、生体に対する安全性が確認されている。
本発明では、直鎖状のＰＥＩでも分岐鎖を多数有する枝分かれ構造のＰＥＩでも用いることができるが、下記式：
【００２４】
【化３】
で例示されるような枝分かれ構造を有するＰＥＩが、より正電荷密度が高いことから好ましい。また、分子量は細胞導入効率、取扱い性等を考慮すると、数平均分子量が１００〜１００，０００の範囲のＰＥＩが好ましく、１００〜１０，０００のＰＥＩがより好ましく、２００〜３，０００の低分子量のＰＥＩが特に好ましい。
【００２６】
本発明の複合体は、前記蛋白質と前記ＰＥＩとが結合したものである。ここでいう「結合」とは、化学結合であれば特に限定されないが、好ましくは共有結合のことをいう。蛋白質とＰＥＩとはそれらの間に何も介さずに直接的に結合していてもよいし、又は、公知の２価性架橋試薬等を用いて、間にスペーサー等を介して結合していてもよい。一分子の蛋白質に対して結合するＰＥＩの分子数は特に限定されないが、１〜１０個が好ましく、１〜３個が特に好ましい。また、個々のＰＥＩにおける蛋白質との結合部位数は１点であることが好ましい。本発明では、１個の蛋白質に対して１個のＰＥＩが１点だけで結合した複合体が特に好ましい。
【００２７】
蛋白質とＰＥＩとの間の結合は、蛋白質とＰＥＩとを共有結合で結合させることができるものであれば特に限定されるものではなく、化学分野で公知の合成手法を利用することにより様々な結合方法で結合させることができる。以下に、蛋白質とＰＥＩとの結合方法について例示するが、本発明で用いられる結合方法はこれらに限定されるものではない。
【００２８】
蛋白質とＰＥＩとをアミド結合を介して結合する場合には、例えば、ＥＤＣ（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド）等の活性化剤を用いて、蛋白質分子中のアスパラギン酸残基、グルタミン酸残基、又は炭素末端のカルボキシル基とＰＥＩのアミノ基との間にアミド結合を形成させることができる。ＥＤＣを用いた場合の例を下記に模式的に示す。
【００２９】
【化４】
蛋白質とＰＥＩとをジスルフィド結合を介して結合する場合には、例えば、ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート）等の試薬を用いて、蛋白質分子中のシステイン残基のチオール基とＰＥＩのアミノ基との間にジスルフィド結合を含む共有結合を形成させることができる。ＳＰＤＰを用いた場合の例を下記に模式的に示す。
【００３１】
【化５】
ジスルフィド結合は可逆的な結合であり、細胞質内の還元条件下で解離する。このため、ジスルフィド結合により結合された複合体は、細胞内に導入されるとＰＥＩと蛋白質とに分離し、蛋白質がより有利にその機能を細胞内で発揮することが期待される。
【００３３】
この他に、蛋白質とＰＥＩとを結合させる例としては、２−イミノチオラン等を用いて、蛋白質分子中のリジン残基又はＮ末端のアミノ基とＰＥＩのアミノ基とを結合させる方法や、ＧＭＢＳ（Ｎ−（４−マレイミドブチリルオキシ）スクシンイミド ）等を用いて、蛋白質分子中のシステイン残基のチオール基とＰＥＩのアミノ基との間にチオエーテル結合を含む共有結合を形成させる方法等が挙げられる。
【００３４】
ここで挙げた結合方法以外にも、エーテル結合、エステル結合、イミド結合、炭素−炭素結合、アミジン結合等が挙げられ、文献（例えば、株式会社 東京化学同人「蛋白質ＩＶ 構造機能相関」社団法人 日本生化学会 編、第１版１９９１年３月２０日 発行）等を参照することにより、様々な結合方法を採用することができる。
【００３５】
上述の製造方法及び当技術分野で公知の合成手段を参照することにより、ポリアルキレンイミン以外の重合体を用いた場合についても同様に本発明の複合体を製造することができる。
【００３６】
また、本発明で用いられる複合体を、必要に応じて標識してもよい。標識方法としては、一般的な公知の方法であれば特に限定されないが、蛍光標識、オートラジオグラフィ、高電子密度物質、色素不溶化酵素であることが好ましい。特に好ましい形態は、蛍光標識化合物を共有結合により複合体を標識することである。
【００３７】
蛍光標識に用いる蛍光物質としては、特に限定されないが、例えばピレン、アントラニロイル基、ダンシル基、フルオレセイン、ローダミン、ニトロベンゾキサジアゾール基等の蛍光団を有する化合物が挙げられる。上記の蛍光団を有する化合物は公知であり（例えば、平塚寿章、「蛋白質 核酸 酵素」、Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．７（１９９７）等参照）、常法により蛋白質分子又はペプチド等に導入することができる。
次に、本発明の複合体を用いて細胞内に蛋白質を導入する方法について説明するが、本発明の方法はこれらに限定されるものではない。
【００３８】
蛋白質を導入しようとする細胞を含む培地中に、本発明の複合体又は該複合体を含む溶液を添加する。その後、細胞を適切な培養温度、培養時間等の培養条件で培養することにより、本発明の複合体は細胞内に取り込まれ、時間の経過とともに複合体の細胞への取り込み量は増加する。本発明の方法では、蛋白質の細胞内への導入量を、添加する複合体の絶対量、濃度、添加時間等を変化させることにより容易に制御できる。なお、本発明の複合体は、該複合体が有する正電荷と細胞表面の負電荷との静電相互作用に起因する機構により細胞内へ取り込まれるものと推測され、このため、培地中で細胞に複合体を取り込ませる場合には、ヘパリン、核酸等のアニオン性ポリマーが共存しない条件下で行うことが好ましい。また、本発明の複合体を含む溶液を、例えば経口投与、静脈内投与、患部への注射、皮膚への塗布等の方法により直接生体に接種して、生体内の細胞に複合体を取り込ませることもできる。
【００３９】
このことから、本発明に記載のある蛋白質又はペプチドと、２を越えて３万以下のカチオン価を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法、及びその複合体は、生細胞における蛋白質又はペプチドの機能解析への応用、更には医療品、医薬品、試薬、創薬支援、再生医療に適用することも本発明の好ましい実施形態の一つである。例えば、薬物として薬理作用等の生理活性を有する蛋白質又はペプチド（例えば、酵素、抗体、ホルモン等）とカチオン化重合体とを結合させて複合体としたものを医薬として用いることができる。このような医薬は、カチオン化重合体がキャリアーとして作用し、薬物である蛋白質又ペプチドが効率良く細胞内に送達されるため非常に有用である。
【００４０】
【実施例】
以下に、本発明の実施形態について具体的に説明するが、これらの実施例は本発明の範囲を限定するものではない。
以下の実施例では、数平均分子量は沸点上昇法により測定し、アミン価は酸中和滴定法により測定した。得られた数平均分子量及びアミン価を用いてカチオン価を算出した。
また、以下の実施例では、数平均分子量２５０、６００、１０００、１２００、及び１８００のＰＥＩ（日本触媒製：商品名「エポミン」）を用い、それぞれＰＥＩ２５０、ＰＥＩ６００、ＰＥＩ１０００、ＰＥＩ１２００、及びＰＥＩ１８００として表記した。
【００４１】
（実施例１）
ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ 複合体の合成
蛋白質として、細胞内へ導入されることで蛋白質合成阻害に伴う細胞増殖阻害を誘起する酵素であるＲＮａｓｅＡを用いた。
６０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＥＩ水溶液 １．５ｍｌ（塩酸でｐＨ５に調整）にＲＮａｓｅＡ １５ｍｇを溶解した。ＥＤＣ ２．５ｍｇを添加して室温で１６時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を水に対して透析し、最後に陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＭ−トヨパール ６５０Ｍ）で精製してＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体（ＲＮａｓｅＡ１分子あたりＰＥＩが１〜２個結合）を得た。得られたＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の１．５μｇ相当を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果を図１に示す。
【００４２】
ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ 複合体の蛋白質の機能評価
また、Ｙｅａｓｔ ＲＮＡを基質としてＹｅａｓｔ ＲＮＡの分解速度を測定し、酵素活性をネイティブ（ｎａｔｉｖｅ） ＲＮａｓｅＡと比較した。ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡに対するＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の相対活性を表１に示す。また、それぞれのＰＥＩのアミン価及びカチオン価も併せて表１に示す。なお、ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ１２００−１及びＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ１２００−２は、それぞれＲＮａｓｅＡ一分子あたりＰＥＩ１２００が約１個及び約２個結合した複合体であることを表す。表１の結果より、本発明の複合体は、従来法によるＲＮａｓｅＡ−エチレンジアミンと比較すると極めて高い酵素活性を示し、ＲＮａｓｅＡが本来有している機能の低下が小さいことがわかる。
【００４３】
【表１】
ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ 複合体の細胞への導入
上記の各複合体について、３Ｔ３／ＳＶ４０細胞に対する細胞増殖阻害活性について評価した。細胞増殖阻害活性試験は、９６ウェルプレートを用い、１５００個／ウェルの３Ｔ３／ＳＶ４０細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で１２時間培養し、その培養上清にｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡ、及びＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体を各種の濃度で添加し、３日後の細胞の増殖度をＭＴＴ法で評価した。その結果を図２に示す。ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡは細胞内に取り込まれず、有意の細胞増殖阻害活性を示さなかったが、本発明の複合体は効率的に細胞内に導入され、導入されたＰＥＩの正電荷量に比例した細胞増殖阻害活性を示すことが確認された。
【００４５】
（実施例２）
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体の合成
蛋白質として、細胞内への取り込みが蛍光により容易に確認できるＥｎｈａｎｃｅｄ Ｇｒｅｅｎ Ｆｌｕｏｒｅｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎ （ｅＧＦＰ：ＣＬＯＮＴＥＣＨ社製）を用いた。ｅＧＦＰは、アミノ末端側にＨｉｓタグを含み、大腸菌リコンビナント蛋白質として発現・精製したものである。
６０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＥＩ水溶液 ４．５ｍｌ（塩酸でｐＨ５に調整）にｅＧＦＰ ３ｍｇを溶解した。ＥＤＣ １０ｍｇを添加してボルテックスミキサーで３０秒間撹拌後、室温で１６時間インキュベートした。反応溶液を水に対して透析し、最後にＨｉＴｒａｐ（Ｎｉ＋）キレートカラムで精製してｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を得た。得られたｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。その結果を図３に示す。
【００４６】
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体の蛋白質の機能評価
ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体、及び比較としてｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体の蛍光強度について比較した。その結果を図４に示す。図４からわかるとおり、従来法によるエチレンジアミンで多修飾した場合と比較して、約１個のＰＥＩで修飾したｅＧＦＰは ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰと同等の高い蛍光強度を保持しており、ＰＥＩ修飾によるｅＧＦＰの機能への影響は小さいことが示された。
【００４７】
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体の細胞への導入
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３ Ａ３１Ｋ 細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清に１００ｎＭ（３μｇ／ｍｌ）のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体を添加し、８時間後のｅＧＦＰの取り込みを蛍光により観察した。比較として、ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、及びｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体についても同様に試験した。その観察結果を図５に示す。図５の観察結果からわかるとおり、ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、及びｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体はほとんど細胞内に取り込まれていないのに対して、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることが分かる。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行なっていない。
【００４８】
（実施例３）
Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ＰＥＩ１２００ 複合体の合成
Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．は分子量が１００ｋＤａで、分子表面に２個のシステイン残基が露出している。大腸菌を用いてリコンビナントＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．を発現させた。得られたＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．を精製し、４．６２ｍｇ／ｍｌ（４６．８μＭ）の水溶液とした。０．１０７ｍｌの１００ｍｇ／ｍｌのＰＥＩ１２００の水溶液（塩酸でｐＨ８に調整）と１．４ｍｇ／０．１ｍｌのＳＰＤＰのエタノール溶液とを混合（ＰＥＩ１２００とＳＰＤＰとのモル比は２：１）した。この混合溶液とＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．の水溶液とを、ＳＰＤＰとＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．とのモル比が１０：１となるように混合し、室温で１６時間撹拌した。反応終了後、ゲル濾過により精製して１分子のＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．あたり２分子のＰＥＩ１２００が結合したＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００複合体を得た。
【００４９】
細胞への Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００ の導入によるレポーター遺伝子 （ｅＧＦＰ） の発現
Ｔ７プロモーターの下流にｅＧＦＰ遺伝子を接続したプラスミドＤＮＡをエレクトロポレーションによりＣＯＳ−７細胞に導入して、Ｔ７−ｅＧＦＰ／ＣＯＳ−７細胞を作製した。Ｔ７−ｅＧＦＰ／ＣＯＳ−７細胞の培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地）に１μＭのＴ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００を添加し、室温で１日培養した。培養終了後、蛍光を観察することによりｅＧＦＰの発現を確認した。その観察図を図６に示す。これに対して、Ｔ７ ＲＮＡ Ｐｏｌ．−ＰＥＩ１２００を添加しなかった場合はｅＧＦＰが発現しないことが確認された。
【００５０】
（実施例４）
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００ 複合体と ＴＡＴ−ｅＧＦＰ 融合蛋白質との細胞導入効率の比較
Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を含む１０％ＦＢＳ＋ＤＭＥＭ培地に、実施例２に従って合成したｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体を１００ｎＭ添加し、３７℃で６時間培養した。培養終了後にｅＧＦＰの細胞への取り込みを蛍光で観察した。また、比較としてＴＡＴペプチドをｅＧＦＰのアミノ末端側に付加した融合蛋白質を大腸菌リコンビナント蛋白質として発現・精製し、Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞を含むＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地にＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質を１０００ｎＭ添加し、３７℃で６時間培養した。培養終了後にｅＧＦＰの細胞への取り込みを蛍光で観察した。ＴＡＴペプチドはＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＧのアミノ酸配列を有するペプチドであり、蛋白質と複合体化させることにより、蛋白質が細胞へ取り込まれ易くなることが報告されている。結果を図７に示す。図７の結果から、ＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質を用いた場合は、細胞内にほとんど取り込まれないが、本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体を用いた場合は、ＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質の１０分の１の濃度でも極めて効率的に細胞内に取り込まれることが示された。
【００５１】
（実施例５）
２− イミノチオランを用いる ＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ６００ 複合体の合成
ＲＮａｓｅＡ １０ｍｇ（０．７３μｍｏｌ）を５００μｌの０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８）に溶解した。２−イミノチオラン ０．５ｍｇ（３．６μｍｏｌ）を添加し、室温で１５分間撹拌した。次いで、ＢｒＣＨ２ＣＯＮＨＮＨＣＯＣＨ２Ｂｒ １０ｍｇ（３６μｍｏｌ）を添加し、超音波をかけて分散させた後に室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を遠心分離機にかけた。上澄みを、１０％ＰＥＩ溶液（ｐＨ８に調整） ０．５ｍｌ（８３μｍｏｌ）と混合し、室温で１時間撹拌した。反応終了後、反応溶液を水に対して透析してＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ６００複合体を得た。
【００５２】
得られた複合体について、実施例１と同様にして３Ｔ３／ＳＶ４０細胞に対する細胞増殖阻害活性について試験したところ、２−イミノチオランを用いて得られたＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ６００複合体も、ＥＤＣを用いて得られたＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体と同様に、効率的に細胞に取り込まれて細胞増殖阻害活性を示すことが確認された。
【００５３】
（実施例６）ＩｇＧ−ＰＥＩ−ＦＩＴＣの細胞導入
ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００ 複合体の合成
０．１Ｍの炭酸ナトリウム水溶液（ｐＨ９．３）０．５ｍｌにＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ社製， ヤギ由来）１０ｍｇを溶解した。１ｍｌのＤＭＦに３．０ｍｇのＦＩＴＣ（Ｉ型，同仁化学研究所社製）を溶解した液を３０μｌとり、ＩｇＧ溶液に添加した。室温で２時間反応させた後、ゲルろ過にて精製してＦＩＴＣで修飾されたＩｇＧを得た。６０ｍｇ／ｍｌ濃度のＰＥＩ６００水溶液１ｍｌ（塩酸ｐＨ５に調整）にＦＩＴＣで修飾されたＩｇＧを３ｍｇを溶解した。次いで、ＥＤＣ３．０ｍｇを添加して室温で４時間反応後、水及びＰＢＳ溶液で透析することにより、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体を得た。
【００５４】
ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００ の細胞への導入
３Ｔ３／ＳＶ４０細胞をＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で培養し、その培養上清にＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体を添加し、１２時間後の複合体取り込みを蛍光により観察した。比較として、ＰＥＩ６００を結合していないＦＩＴＣ−ＩｇＧ複合体についても同様に試験した。その観察結果を図８に示す。図８の観察結果からわかる通り、５０μＭ添加したにもかかわらずＦＩＴＣ−ＩｇＧ複合体は殆ど細胞内に取り込まれていない（図８（ａ））のに対して、ＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体は効率的に細胞内に取り込まれていることがわかる（図８（ｂ））。また、細胞を０．５μｍ間隔で切断してその切断面を観察したところ、切断面に蛍光が観察されたことから、本発明の複合体は細胞表面ではなく細胞内部に取り込まれていることが確認された。なお、蛍光観察は生細胞のままで、固定等は行っていない。
【００５５】
（実施例７）
ＩｇＧ−ＰＥＩ６００ 複合体の合成
ヒトＳ１００Ｃ蛋白質（ＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｕｍｂｅｒ Ｐ３１９４９）は細胞内のアクチンフィラメントと結合能を有する蛋白質である（Ｓａｋａｇｕｃｈｉ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｊ． Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ． １４９， １１９３−１２０６ （２０００））。組換え蛋白質として調製したヒトＳ１００Ｃを抗原蛋白質として感作させ、このウサギ血清より抗ヒトＳ１００Ｃ抗体を含むＩｇＧ（Ａ）を調製した。対照として、抗原感作をさせていないウサギ血清より抗体混合物（Ｓ１００Ｃに特異的な結合能を有さない抗体；ＩｇＧ（Ｂ））も調製した。ＩｇＧ（Ａ）及びＩｇＧ（Ｂ）とＰＥＩ６００との複合体合成は、実施例１と同様にして行なった。得られたＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００複合体及びＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００複合体をＦＩＴＣにより蛍光標識してＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体及びＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体を得た。
【００５６】
ＩｇＧ−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ 複合体の細胞への導入及び機能評価
ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地で培養したヒト正常線維芽細胞：ＫＭＳ−６細胞の培養上清に１５μｇ／ｍｌとなるようにＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体又はＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体を添加した。３７℃で３時間培養した後、培地を除去し、サンプルを含まないＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ培地に置換し、更に２４時間培養した。各ＩｇＧ−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体の細胞への取り込みを蛍光顕微鏡により観察した。その観察結果を図９に示す。抗体混合物であるＩｇＧ（Ｂ）を含む複合体を用いた場合、細胞全体に蛍光が観察されるのに対し（図９（ａ））、ＩｇＧ（Ａ）を含む複合体を用いた場合は、局在を示している様子が確認された（図９（ｂ））。更にＩｇＧ（Ａ）複合体を導入した細胞を固定化後、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８結合ファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ 社製）を用いてアクチンフィラメントを染色した結果を図９（ｃ）に示す。その結果、ＩｇＧ（Ａ）を含む複合体の局在と染色場所が一致することから、ＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００−ＦＩＴＣ複合体は、ＩｇＧ（Ａ）のＳ１００Ｃへの特異的な抗体能を損なうことなく、細胞内でＳ１００Ｃを認識して特異的に結合することが示された。
【００５７】
（実施例８）
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体のマウス腹腔内投与による臓器への取り込み評価
実施例２に基づいて作成された３００μｇのｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００、及び３００μｇのＮａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）に溶解し、それぞれをＣ５７ＢＬ／６マウス（８週齢）に注射器を用いて腹腔内に投与した。８時間後に解剖し、肝臓、腎臓を摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＭＡ）中で急速に凍結させた。クリオスタットを用いて１０μｍの凍結組織切片を調製し蛍光顕微鏡にて臓器への取り込みを確認した（肝臓；図１０（ａ）、腎臓；図１０（ｂ））その結果、主に臓器の表面に強くｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００が取り込まれた様子が観察されたばかりではなく、腎臓においてはその内部にまで取り込まれた様子が観察された。一方、Ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを投与した場合には臓器に取り込まれる様子は観察されなかった。
【００５８】
ｅＧＦＰ−ＰＥＩ 複合体のラット門脈投与による肝臓組織内への取り込み評価
実施例２に基づいて作成された１００μｇ のｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００ならびに１００μｇ のＮａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを生理食塩水（０．９％ ＮａＣｌ）に溶解し、それぞれ麻酔をかけたＷｉｓｔｅｒ Ｒａｔ （８週齢）の門脈に注射器を用いて投与した。１時間後に肝臓を摘出し、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ（Ｍｉｌｅｓ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ， ＭＡ）中で急速に凍結させた。クリオスタットを用いて１０μｍの凍結組織切片を調製し蛍光顕微鏡にて肝臓への取り込みを確認した（図１０（ｃ））。その結果、肝臓の門静脈周辺に特異的に取り込まれる様子が確認され、中心静脈に向かってｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００が移行して行くグラジエントも確認された。一方、Ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰを投与した場合にはこの様な様子は観察されなかった。
【００５９】
（実施例９）
種々のカチオン価を有する重合体と ＲＮａｓｅＡ 複合体の合成
【００６０】
【表２】
表２に示す種々のカチオン価を有する重合体とＲＮａｓｅＡ複合体を用いて種々のカチオン性重合体−ＲＮａｓｅＡ複合体を合成した。４０ｍｇ／ｍｌ濃度のカチオン価を有する重合体水溶液１．０ｍｌ（塩酸でｐＨ５に調整）にＲＮａｓｅＡ１０ｍｇを溶解し、次いでＥＤＣ３．０ｍｇを添加して室温で４時間反応した。反応後、反応溶液を水に対して透析し、カチオン価を有する重合体−ＲＮａｓｅＡ複合体を得た。
【００６２】
ＲＮａｓｅＡ− カチオン価を有する重合体複合体の細胞への導入
上記の各複合体について、３Ｔ３／ＳＶ４０細胞に対する細胞増殖阻害活性について評価した。細胞阻害活性試験は実施例１に記載と同様の方法で実施した。その結果を図１１に示す。Ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡは細胞内に取り込まれず、有意の細胞増殖阻害活性を示さなかったが、本発明の複合体を用いた場合は細胞増殖阻害活性を示し、本発明の複合体が効率的に細胞内に導入されることが確認された。
【００６３】
【発明の効果】
本発明により、蛋白質の機能を損なうことなく、極めて高い効率で、且つ時間的・量的に制御可能な、蛋白質の細胞内導入方法が提供される。
即ち、従来は任意の蛋白質を細胞内で機能させる手法は遺伝子導入法が主流で、人為的に機能させる蛋白質を恒常的に細胞内で発現させるのに適しているのに対し、本法による蛋白質細胞内導入法は一過的に発現させるのに適した技術である。この様な新規技術は機能が未知な蛋白質の機能解析といった手段となる他、遺伝子導入法が抱える数々の問題点を解決する手段となり得る。
【００６４】
また、本発明の方法は、蛋白質分子内に多数の側鎖が修飾されるエチレンジアミンによるカチオン化という従来法に比較して、１〜数個以内の小数の側鎖の修飾で多数のカチオンが導入されるため、蛋白質の構造と機能に対する影響が軽微である。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｎａｔｉｖｅ ＲＮａｓｅＡ、及び、本発明のＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の電気泳動観察図である。
【図２】本発明のＲＮａｓｅＡ−ＰＥＩ複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込み、及び細胞増殖阻害活性を示す図である。
【図３】ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体、及び本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体の電気泳動観察図である。
【図４】ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体、及び本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体の蛍光強度を比較した図である。
【図５】ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−エチレンジアミン複合体、及び本発明のｅＧＦＰ−ＰＥＩ複合体のＢａｌｂ／ｃ３Ｔ３ Ａ３１Ｋ 細胞への取り込みを蛍光により観察した図である。
【図６】Ｔ７−ｅＧＦＰ／ＣＯＳ−７細胞中でのレポーター遺伝子（ｅＧＦＰ）の発現を蛍光により観察した図である。
【図７】Ｂａｌｂ／ｃ３Ｔ３細胞に対する、ｎａｔｉｖｅ ｅＧＦＰ、ｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体、及びＴＡＴ−ｅＧＦＰ融合蛋白質の導入効率を比較した図である。
【図８】（ａ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込みを蛍光及び透過光により観察した図である（左：蛍光写真、右：透過光写真）。
（ｂ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ−ＰＥＩ６００複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込みを蛍光及び透過光により観察した図である（左：蛍光写真、右：透過光写真）。３Ｔ３／ＳＶ４０細胞を０．５μｍ間隔で切断し、その各切断面を観察した。
【図９】（ａ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ（Ｂ）−ＰＥＩ６００複合体のＫＭＳ−６細胞への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｂ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００複合体のＫＭＳ−６細胞への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｃ）はＦＩＴＣ−ＩｇＧ（Ａ）−ＰＥＩ６００複合体を導入したＫＭＳ−６細胞をアクチンフィラメントで染色したときの観察図である。
【図１０】（ａ）はｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体のマウスの肝臓への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｂ）はｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体のマウスの腎臓への取り込みを蛍光により観察した図である。
（ｃ）はｅＧＦＰ−ＰＥＩ６００複合体のラットの肝臓への取り込みを蛍光により観察した図である。
【図１１】本発明のＲＮａｓｅＡ−カチオン化重合体複合体の３Ｔ３／ＳＶ４０細胞への取り込み、及び細胞増殖阻害活性を示す図である。
Claims (9)
- 蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
- 前記重合体が、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はその塩である請求項１記載の方法。
- 蛋白質又はペプチドとポリアルキレンポリアミン骨格を有する重合体とが結合した複合体を用いて蛋白質又はペプチドを細胞内に輸送することを特徴とする蛋白質又はペプチドの細胞内導入方法。
- 前記重合体が、ポリエチレンイミンである請求項３記載の方法。
- 前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とが共有結合を介して結合した複合体である請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記複合体が、前記蛋白質又はペプチドと前記重合体とがアミド結合、ジスルフィド結合、又はチオエーテル結合を介して結合した複合体である請求項項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
- 蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有し、かつ数平均分子量が１００〜１００万である重合体とが結合した複合体。
- 前記重合体が、ポリアルキレンポリアミン骨格、ポリアリルアミン骨格、ポリビニルアミン骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルエステル骨格、ポリ（メタ）アクリル酸ジアルキルアミノアルキルアミド骨格、ポリアミジン骨格、ポリビニルピリジン骨格、若しくはポリビニルイミダゾール骨格を有する重合体、又はその塩である請求項７記載の複合体。
- 薬物である蛋白質又はペプチドと、２を超えて３万以下のカチオン価を有し、かつ数平均分子量が１００〜１００万である重合体とが結合した複合体を用いる蛋白質又はペプチド薬物の送達方法。
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