KR20210008174A

KR20210008174A - 세포 내 송달 비히클

Info

Publication number: KR20210008174A
Application number: KR1020217001218A
Authority: KR
Inventors: 도시카즈 츠지; 구미코 이카도; 사유리 야마다; 세이이치 우치야마; 교코 가와모토; 히데토시 도쿠야마; 겐타로 오카노
Original assignee: 기린 홀딩스 가부시키가이샤; 도호쿠 다이가쿠; 도꾜 다이가꾸
Priority date: 2015-09-07
Filing date: 2016-09-06
Publication date: 2021-01-20
Also published as: EP3348648A1; EP3760193B9; CN108350479A; KR20180040714A; US11452697B2; EP3348648B1; US20200309782A1; CN108350479B; EP3760193B1; JP2017051113A; CN113214422B; EP3760193A1; US20190137503A1; EP3348648A4; SG10202108915VA; US10712346B2; KR102403515B1; KR102205918B1; WO2017043484A1; JP6666673B2

Abstract

표면이 양성 하전으로 덮인 세포 내 송달 비히클, 목적 성분 또는 화합물이 그 세포 내 송달 비히클에 충전되어 이루어지는 세포 내 송달 복합체, 그 세포 내 송달 복합체를 포함하여 이루어지는 온도 감수성 프로브, 및 그 온도 감수성 프로브에 의해 세포 내의 온도를 측정하는 방법이 개시된다. 그 세포 내 송달 비히클은 세포 증식을 방해하지 않고 세포 내에 원하는 성분 또는 화합물을 용이하게 송달할 수 있는 점에서 유용하다.

Description

세포 내 송달 비히클 {INTRACELLULAR DELIVERY VEHICLE}

관련 출원의 참조

본 특허 출원은, 먼저 출원된 일본에서의 특허 출원인 일본 특허 출원 제2015-176106호(출원일: 2015년 9월 7일)에 기초하는 우선권의 주장을 수반하는 것이다. 이 앞의 특허 출원에서의 전체 개시 내용은, 인용함으로써 본 명세서의 일부로 된다.

기술분야

본 발명은, 세포 증식을 방해하지 않고 원하는 성분 또는 화합물을 세포 내에 용이하게 송달할 수 있는 세포 내 송달 비히클, 그의 제조 방법 또는 사용 방법에 관한 것이다.

단백질 등을 세포 내에 도입하는데 있어서, 단백질을 양이온화함으로써, 효율적으로 도입할 수 있음이 알려져 있다(특허문헌 1). 또한, 인슐린 등의 펩티드성 의약품을 키토산 등의 양이온성 고분자 등과 함께 사용하면, 점막 상피 세포에 장애를 부여할 일 없이 점막 흡수 촉진이 도모되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 1). 또한, 폴리양이온을 사용한 나노 입자에 의한 siRNA의 세포로의 도입에 의한 RNAi 치료의 부작용의 문제점과 그의 해결 수단에 대하여 검토되어 있다(비특허문헌 2). 또한, 최근에는, 온도 감수성 형광 프로브로서 세포 내에 도입하기 위한 양이온성 중합체가 보고되어 있다(특허문헌 2). 그러나, 양이온이 상술한 현상을 야기하는 메커니즘, 세포에 미치는 영향, 나아가 그의 응용 범위에 대해서는, 반드시 해명되어 있는 것은 아니다.

이들 이외에도, 양이온에 착안한 기능 개발은 수많이 이루어져 있다. 예를 들어, 양이온계 바이오 중합체인 키토산과 γ 글루탐산에 의한 나노 캡슐에 대해서, 주위의 pH에 연동하여 팽윤/수축하는 성질을 알아내고, 그의 응용이 검토되어 있다(비특허문헌 3). 또한, 신형 양이온 활성제의 헤어 컨디셔너에의 활용의 가능성(비특허문헌 4)이나, 대전량을 유지하면서 저흡습성이 우수한 양이온성 중합체의 응용(특허문헌 3) 등이 보고되어 있다.

그러나, 이들 기술에 의해 여러 가지 양이온성의 중합체가 주어진다고 하더라도, 세포 증식을 방해하지 않고 세포 내에 용이하게 도입할 수 있고, 특히 도입한 세포의 세포 분열을 저해하지 않는 중합체를 골라 내는 것은 곤란하였다.

일본 특허 공개 제2004-49214호 공보 국제 공개 제2013/094748호 일본 특허 공개 제2011-157503호 공보

세키토시노부 약학잡지, vol.130(9), pp.1115-1121, 2010 Borja Ballarin-Gonzalez et.al., Advanced Drug Delivery Reviews vol., 64 p.1717-1729, 2012 Takayuki Imoto et.al., Macromol. Biosci. vol.10, pp.271-277, 2010 미타무라 조지 등 J. Soc. Cosmet. Chem. Jpn. vol.30(1), pp.84-93, 1996

본 발명의 목적은, 세포 증식을 방해하지 않고 세포 내에 원하는 성분 또는 화합물을 용이하게 송달할 수 있는 비히클, 그의 제조 방법 및 사용 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은, 온도 감수성 형광 프로브를 세포 내에 도입하는 기술을 개발하는 과정에서, 세포 내에 용이하게 도입할 수 있음과 함께, 도입한 세포의 세포 분열을 저해하지 않는 신규 비히클의 제조 방법을 알아냈다. 본 발명은 이 지견에 기초하는 것이다.

즉, 본 발명은 이하의 발명을 포함한다.

(1) 표면이 양성 하전으로 덮인, 세포 내 송달 비히클.

(2) 세포 내에 송달되는 목적 성분 또는 화합물이, 상기 (1)에 기재된 상기 세포 내 송달 비히클에 충전되어 이루어지는, 세포 내 송달 복합체.

(3) 세포 내에 송달되는 목적 성분 또는 화합물이 상기 세포 내 송달 비히클에 공유 결합하고 있는, 상기 (2)에 기재된 세포 내 송달 복합체.

(4) 상기 화합물이, 온도에 따라서 그 특성이 변화하는 감열성 유닛, 및 그 감열성 유닛의 특성 변화에 따라서 형광 강도 또는 형광 수명이 변화하는 형광성 유닛인, 상기 (2) 또는 (3)에 기재된 세포 내 송달 복합체.

(5) 상기 (4)에 기재된 세포 내 송달 복합체를 포함하여 이루어지는, 온도 감수성 프로브.

(6) 세포 내의 온도를 측정하는 방법이며,

(a) 상기 (5)에 기재된 온도 감수성 프로브를 세포 내에 도입하는 공정, 및

(b) 여기광 조사 하, 형광 강도 또는 형광 수명을 측정하는 공정

을 포함하여 이루어지는, 방법.

본 발명은 마이크로인젝션 등의 복잡한 조작을 필요로 하지 않고, 원하는 성분 또는 화합물을 용이하게 세포에 도입할 수 있다는 점에서 유리하다. 또한, 도입된 비히클이 세포의 세포 증식을 방해하지 않는다는 점에서 유리하다. 또한, 본 발명의 비히클을 이용하면, 원하는 성분 또는 화합물을, 세포 증식을 방해하지 않고, 용이하게 세포 내에 송달할 수 있다는 점에서 유리하다. 또한, 본 명세서의 실시예에서는, 세포에 도입된 본 발명의 비히클이 세포의 분화를 방해하지 않는다고 하는 이점을 갖는 것도 확인되어 있다.

도 1은 화합물 2b의 TEM에 의한 관찰 결과를 나타낸 일례이다.
도 2는 화합물 3d의 TEM에 의한 관찰 결과를 나타낸 일례이다.
도 3은 화합물 EF043의 TEM에 의한 관찰 결과를 나타낸 일례이다.
도 4는 화합물 Lin40과 Lin41(흑원: Lin40, 백원: Lin41)의 150mM 염화칼륨 수용액 중에서의 형광 강도(Lin40: 569㎚, Lin41: 571㎚)의 감열 응답성 시험 결과(0.005w/v％, 여기 파장 450㎚)의 일례이다(n=3).
도 5는 EF043, NN-AP4, Lin40, Lin41, k40을 각각 5％ 글루코오스 용액 중에서 인간 자궁경부암 유래 HeLa 세포와 혼합(37℃, 10분)하고, 현미경으로 관찰(여기광: 473㎚, 형광: 500㎚ 내지 600㎚)을 행한 사진의 일례이다.
도 6은 EF043, NN-AP4, Lin40을 도입한 HeLa 세포를 사용하여, 24 시간 후의 프로브가 들어간 세포수를 카운트하고, 증식률을 평가한 일례이다(n=3).
도 7은 갈색 지방 세포로 분화 유도 직후에 양이온성 겔형 온도 프로브 EF043을 도입하고, 그 후, 이어서 배양을 3일간 계속하고, 성숙한 상태가 된 갈색 지방 세포를 현미경 하에서 관찰한 결과의 일례이다.
도 8은 EF043을 5％ 글루코오스 용액 중에서 MOLT-4(인간 급성 림프 아구성 백혈병 T세포)와 혼합(37℃, 10분)하고, 현미경으로 관찰(여기광: 473㎚, 형광: 500㎚ 내지 600㎚)을 행한 사진의 일례(좌측)와 MOLT-4 세포 중의 EF043의 형광 강도의 감열 응답성 시험의 결과의 일례(우측)(n=3)이다.
도 9는 MOLT-4(인간 급성 림프 아구성 백혈병 T세포) 세포 중의 EF043의 형광 수명(Ex: 405㎚, Em: 565㎚)의 감열 응답성 시험의 결과(n=3)의 일례이다.
도 10은 도 9의 그래프로부터 산출한 온도 분해능의 결과의 일례이다.
도 11은 플루오레세인 및 로다민 B를 포함한 PEG형의 양이온성 겔의 HEK293T(인간 유래 태아 신장 세포) 세포로의 도입 효율을 형광 분자 단독의 경우와 비교한 결과(n=3)의 일례이다.

1. 정의

본 발명에 있어서 「비히클」(vehicle)이란, 원하는 성분 또는 화합물을 세포 내에 송달시키는 매체 또는 담체를 의미한다.

본 발명에 있어서의 「세포」란, 일반적인 분류인 원핵 세포와 진핵 세포 둘다를 포함하며, 특별히 그 생물의 종은 상관없다. 예를 들어, 원핵 세포는 진정세균과 고세균으로 나뉘는데, 진정세균은 그 중에서도 방선균문과 같은 그람양성균과 프로테오박테리아문과 같은 그람음성균으로 크게 나뉘고, 펩티드 글리칸층의 두께 등에 따라, 본 발명의 세포 내 송달 비히클을 적용할 수 있는 범위는 제한되지 않는다. 또한, 진핵 세포에는, 주로 진핵생물(원생 생물, 진균, 식물, 동물)에 속하는 세포가 해당된다. 예를 들어, 일반적으로 분자생물학 등의 연구에서 이용되며, 또한 공업적으로도 이용되는 효모는 진균에 속한다. 또한, 본 발명의 세포 내 송달 비히클은, 부유 세포 및 접착 세포 둘다에서 바람직하게 사용된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-3 알킬」이란, 탄소수 1 내지 3의 직쇄상, 분지쇄상, 또는 환상의 알킬기를 의미하고, 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, 시클로프로필이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알킬」이란, 탄소수 1 내지 6의 직쇄상, 분지쇄상, 환상 또는 부분적으로 환상의 알킬기를 의미하고, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, n-부틸, s-부틸, i-부틸, t-부틸, n-펜틸, 3-메틸부틸, 2-메틸부틸, 1-메틸부틸, 1-에틸프로필, n-헥실, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸, 1-메틸펜틸, 3-에틸부틸, 및 2-에틸부틸, 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸, 시클로헥실, 및 시클로프로필메틸 등이 포함되고, 예를 들어 C_1-4 알킬 및 C_1-3 알킬 등도 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-10 알킬」이란, 탄소수 1 내지 10의 직쇄상, 분지쇄상, 환상 또는 부분적으로 환상의 알킬기를 의미하고, 예를 들어 이미 정의한 C_1-6 알킬 및 C_1-3 알킬 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-20 알킬」이란, 탄소수 1 내지 20의 직쇄상, 분지쇄상, 환상 또는 부분적으로 환상의 알킬기를 의미하고, 예를 들어 이미 정의한 C_1-10 알킬, C_1-6 알킬 및 C_1-3 알킬 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알콕시」란, 알킬 부분으로서 이미 정의한 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 갖는 알킬옥시기를 의미하고, 예를 들어 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, i-프로폭시, n-부톡시, s-부톡시, i-부톡시, t-부톡시, n-펜톡시, 3-메틸부톡시, 2-메틸부톡시, 1-메틸부톡시, 1-에틸프로폭시, n-헥실옥시, 4-메틸펜톡시, 3-메틸펜톡시, 2-메틸펜톡시, 1-메틸펜톡시, 3-에틸부톡시, 시클로펜틸옥시, 시클로헥실옥시, 시클로프로필메틸옥시 등이 포함되고, 예를 들어 C_1-4 알콕시 및 C_1-3 알콕시 등도 포함된다.

본 명세서에 있어서 「아릴」이란, 6 내지 10원 방향족 탄소환기를 의미하고, 예를 들어 페닐, 1-나프틸, 2-나프틸 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_7-14 아르알킬」이란 아릴기를 포함하는 탄소수가 7 내지 14인 아릴알킬기를 의미하고, 예를 들어 벤질, 1-페네틸, 2-페네틸, 1-나프틸메틸, 2-나프틸메틸 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 할로겐 원자로서는, 예를 들어 불소 원자, 염소 원자, 브롬 원자 및 요오드 원자 등을 들 수 있다.

본 명세서에 있어서 「C_1-20 알킬렌」이란, 탄소수 1 내지 20의 직쇄상, 분지쇄상, 환상 또는 부분적으로 환상의 알킬렌기를 의미하고, 예를 들어 메틸렌, 에틸렌, 프로필렌, 부틸렌 등, 나아가 C_1-10 알킬렌 및 C_1-6 알킬렌 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_3-20 알케닐렌」이란, 탄소수 3 내지 20의 직쇄상, 분지쇄상, 환상 또는 부분적으로 환상의 알케닐렌기를 의미하고, 예를 들어 프로페닐렌, 부테닐렌 등, 나아가 C_3-10 알케닐렌 및 C_3-6 알케닐렌 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_3-20 알키닐렌」이란, 탄소수 3 내지 20의 직쇄상, 분지쇄상, 환상 또는 부분적으로 환상의 알키닐렌기를 의미하고, 예를 들어 프로피닐렌, 부티닐렌 등, 나아가 C_3-10 알키닐렌 및 C_3-6 알키닐렌 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알킬티오」란, 알킬 부분으로서 이미 정의한 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 갖는 알킬티오기를 의미하고, 예를 들어 메틸티오, 에틸티오, n-프로필티오, i-프로필티오, n-부틸티오, s-부틸티오, i-부틸티오, t-부틸티오 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알킬술피닐」이란, 알킬 부분으로서 이미 정의한 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 갖는 알킬술피닐기를 의미하고, 예를 들어 메틸술피닐, 에틸술피닐, n-프로필술피닐, i-프로필술피닐, n-부틸술피닐, s-부틸술피닐, i-부틸술피닐, t-부틸술피닐 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알킬술포닐」이란, 알킬 부분으로서 이미 정의한 탄소수 1 내지 6의 알킬기를 갖는 알킬술포닐기를 의미하고, 예를 들어 메틸술포닐, 에틸술포닐, n-프로필술포닐, i-프로필술포닐, n-부틸술포닐, s-부틸술포닐, i-부틸술포닐, t-부틸술포닐 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「6 내지 18원 방향족 탄소환기」란, 예를 들어 페닐, 나프틸, 안트라세닐, 피레닐, 인다닐, 테트랄리닐 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「5 내지 18원 방향족 헤테로환기」란, 산소, 질소 및 황으로부터 선택되는 1 이상의 헤테로 원자를 갖는 방향족 헤테로환이며, 예를 들어 피롤릴, 피라졸릴, 이미다졸릴, 피리딜, 인돌릴, 퀴놀릴, 퀴녹살리닐, 퀴나졸리닐, 벤조푸라닐, 벤조티에닐, 벤조피라닐, 벤조크로메닐 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_2-6 알케닐술포닐」이란, 알케닐 부분으로서 이미 정의한 C_2-6 알케닐기를 갖는 알케닐술포닐기를 의미하고, 예를 들어 비닐술포닐, 알릴술포닐 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_2-6 알케닐카르보닐」이란, 알케닐 부분으로서 이미 정의한 C_2-6 알케닐기를 갖는 알케닐카르보닐기를 의미하고, 예를 들어 아크릴로일, 메타크릴로일 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_2-6 알키닐카르보닐」이란, 알키닐 부분으로서 이미 정의한 C_2-6 알키닐기를 갖는 알키닐카르보닐기를 의미하고, 예를 들어 에티닐카르보닐 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알킬카르보닐」이란, 기 -CO(C_1-6 알킬)를 나타내고, 여기서 당해 C_1-6 알킬은 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알콕시카르보닐」이란, 기 -CO(C_1-6 알콕시)를 나타내고, 여기서 당해 C_1-6 알콕시는 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 알킬카르보닐아미노」란, 기 -NHCO(C_1-6 알킬)를 나타내고, 여기서 당해 C_1-6 알킬은 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서 「C_1-6 아릴카르보닐아미노」란, 기 -NHCO(아릴)를 나타내고, 여기서 당해 아릴은 이미 정의한 바와 같다.

본 명세서에 있어서의 「5 내지 7원 질소 함유 헤테로환」에는, 예를 들어 피롤환, 피롤리딘환, 피페리딘환, 호모피페리딘환, 피페라진환, 호모피페라진환, 모르폴린환, 티오모르폴린환 등 포화 헤테로환이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「4 내지 8원 질소 함유 헤테로환」에는, 예를 들어 피롤환, 아제티딘환, 피롤리딘환, 피페리딘환, 호모피페리딘환, 피페라진환, 호모피페라진환, 모르폴린환, 티오모르폴린환 등, 및 5 내지 7원 질소 함유 헤테로환이 포함된다.

본 명세서에 있어서의 「2개의 질소 원자를 포함하는 5 내지 7원 헤테로환」에는, 예를 들어 이미다졸리딘, 테트라히드로피리미딘 등이 포함된다.

본 명세서에 있어서, 알킬렌이 1 이상의 개소에서 O가 삽입되어 있는 경우, 당해 알킬렌쇄는 주쇄 중에 에테르 결합을 포함하게 되고, 당해 삽입은 안정한 구조로 되기 때문에, -O-O-및 -O-CH₂-O-의 구조로 되지 않도록 행하여지는 것은 당업자라면 용이하게 이해할 것이다. 이상은 알킬렌으로의 S의 삽입에 있어서도 해당한다.

본 명세서에 있어서, 공중합체란, 각 유닛에 맞는 단량체를 섞고, 중합 반응을 하여 생성된 고분자쇄의 집합체이다. 중합체란, 단량체 유닛이 결합하여 이어진 고분자쇄를 나타낸다.

본 명세서에 있어서 「카운터 음이온」이란, 유기화학의 기술분야에서 유기 화합물의 카운터 음이온으로서 통상 사용되는 음이온이기만 하면 특별히 제한되지 않고, 예를 들어 할로겐화물 음이온(염화물 이온, 브롬화물 이온, 불화물 이온, 요오드화물 이온), 유기산의 공액 염기(예를 들어 아세트산 이온, 트리플루오로아세트산 이온), 질산 이온, 황산 이온, 탄산 이온 등이 포함된다. 본 발명에 있어서 바람직한 카운터 음이온으로서는, 예를 들어 트리플루오로메탄술폰산 이온, 염화물 이온, 질산 이온 등을 들 수 있다.

또한, 카운터 음이온이 2가 이상인 경우, 거기에 대응하는 개수의 이온성 관능기와 이온 결합을 형성하는 것은 당업자에 의해 용이하게 이해되는 바와 같다.

2. 세포 내 송달 비히클

본 발명의 세포 내 송달 비히클이란, 표면이 양성 하전으로 덮인 임의의 형상의 겔 입자:

이다. 본 발명의 세포 내 송달 비히클의 형상은, 바람직하게는 대략 타원구 형상이며, 더욱 바람직하게는 대략 구 형상이다.

이 세포 내 송달 비히클은 원하는 성분 또는 화합물을 충전하여 세포 내 송달 복합체를 형성할 수 있다. 또한, 이 세포 내 송달 비히클에 원하는 성분 또는 화합물을 공유 결합하여 세포 내 송달 복합체를 형성할 수 있다. 세포 내 송달 비히클 및 이들 세포 내 송달 복합체는 용이하게 세포 내에 도입할 수 있고, 게다가 도입한 세포의 생존 및 증식을 방해하지 않는다. 또한, 본 명세서의 실시예에서는, 세포에 도입된 본 발명의 비히클이 세포의 분화를 방해하지 않는다고 하는 이점을 갖는 것도 확인되어 있다.

하나의 바람직한 실시 양태에 의하면, 본 발명의 세포 내 송달 비히클은,

의 구조를 갖는다.

3. 세포 내 송달 비히클의 제조 방법

본 발명의 세포 내 송달 비히클은, 예를 들어 2개의 말단 중 적어도 한쪽 말단의 유닛 또는 그 부근의 유닛이 양성 하전을 갖는 중합체를 제작하고, 이것을 분자 간에 가교시킴으로써 제조할 수 있다. 하나의 바람직한 실시 양태에 의하면, 본 발명의 세포 내 송달 비히클은, 양이온성 중합 개시제와, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하여 이루어지는 단량체와, 가교제를 사용하는 라디칼 중합 반응을 행함으로써 제조된다.

(1) 양이온성 중합 개시제

본 발명에 사용되는 양이온성 중합 개시제는, (a) 상온에서 안정되고, (b) 수용성이며, (c) 라디칼 중합 반응을 야기시키는 라디칼 산생능이 있고, (d) 라디칼 중합 반응 후의 중합체 말단에서도 폭넓은 pH의 범위에서, 적어도 중성 부근에서, 양전하를 갖는 것이다.

여기서, 양이온성 중합 개시제는, 세포 내에 있어서 양전하를 유지하는 것인 것이 바람직하다. 많은 세포 내의 pH는 2 내지 9, 또한 일반적인 동물, 식물 및 미생물의 세포라면 4 내지 8 정도이다. 따라서, 양이온성 중합 개시제는, 이 pH의 범위 내에서 양전하를 유지하는 것인 것이 바람직하다.

본 발명의 양이온성 중합 개시제는, 예를 들어 일반식 (I):

[식 중,

Y는, 단결합 또는 CR⁸⁵를 나타내고,

Z는, 단결합 또는 CR⁸⁶을 나타내고,

R⁷², R⁷³, R⁷⁵, R⁷⁶, R⁷⁷, R⁷⁸, R⁸⁵ 및 R⁸⁶은, 각각 독립적으로 수소 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬카르보닐, 페닐 및 히드록시로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬카르보닐 및 페닐은, 추가로 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬카르보닐, 페닐 및 히드록시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환기로 치환되어 있어도 되고,

R⁷² 및 R⁷³은, 또한 각각 독립적으로 아다만틸, 또는 Si(OCH₃)₂(CH₃)로 치환된 C_1-6 알킬을 나타내도 되거나, 또는 R⁷⁵ 및 R⁷⁶, 또는 R⁷⁷ 및 R⁷⁸은, 일체로 되어 -(CH₂)_3-5-을 형성해도 되고,

R⁸¹, R⁸², R⁸³, 및 R⁸⁴는, C_1-4 알킬, C_1-4 알킬카르보닐, 및 C_1-3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기이며, 여기서 상기 C_1-4 알킬은 1개의 C_1-3 알콕시기로 치환되어 있어도 되고,

R⁷¹ 및 R⁷⁴는, 각각 독립적으로 C_1-3 알킬기이고, X_f ^-은 카운터 음이온임]

의 화학 구조를 갖는다.

본 발명의 한 실시 양태에서는, 식 (I)의 Y 및 Z는 단결합을 나타낸다.

다른 실시 양태에서는, 식 (I)의 R⁸¹, R⁸², R⁸³ 및 R⁸⁴는, 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 메틸 카르보닐, 이소부틸, 및 2-메틸-2-메톡시-프로필로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 실시 양태에서는, 식 (I)의 R⁷¹ 및 R⁷⁴는 메틸기이다.

다른 실시 양태에서는, 식 (I)의 R⁷², R⁷³, R⁷⁵, R⁷⁶, R⁷⁷, R⁷⁸, R⁸⁵, 및 R⁸⁶은, 각각 독립적으로 수소 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬카르보닐, 페닐 및 히드록시로 이루어지는 군으로부터 선택된다.

다른 실시 양태에서는, 식 (I)의 R⁷⁵ 및 R⁷⁶, 또는 R⁷⁷ 및 R⁷⁸은, 일체로 되어 -(CH₂)₄-를 형성한다.

본 발명의 바람직한 실시 양태에 의하면, 식 (I)의 R⁷² 및 R⁷³, R⁷⁵ 및 R⁷⁷, R⁷⁶ 및 R⁷⁸, R⁸¹ 및 R⁸⁴, R⁸² 및 R⁸³, 및 R⁷¹ 및 R⁷⁴는, 각각 동일한 치환기를 나타내고, 또한 Y 및 Z는, 동일한 치환기, 또는 모두 단결합을 나타낸다.

본 발명의 양이온성 중합 개시제의 더욱 바람직한 실시 양태에 의하면, 식 (I)의 R⁷¹, R⁷², R⁷³, R⁷⁴, R⁸¹, R⁸², R⁸³, 및 R⁸⁴가 메틸기이고, R⁷⁵, R⁷⁶, R⁷⁷, 및 R⁷⁸이 수소 원자이고, Y 및 Z가 단결합이다.

식 (I)의 화합물의 합성법은, 특별히 한정되지 않지만 예를 들어 다음과 같이 하여 합성할 수 있다.

먼저, α,α'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN) 유도체:

를 적당한 용매에 용해하고, 과잉량의 메탄올 존재 하, 실온에서 염화수소 가스를 통과시킴으로써, 활성인 이미노에스테르 유도체:

를 얻을 수 있다. 또한, 본 명세서에 있어서 구조식 중의 Me는 메틸기를 의미한다. 이어서, 당해 이미노에스테르 유도체에, 에틸렌디아민 등의 알킬렌디아민 유도체:

를 과잉량 첨가하여, 교반함으로써 환상 구조로 된 화합물:

을 얻을 수 있다. 이어서, 디클로로메탄에 생성물을 용해하고, 실온, 탈산소 조건 하에서, 2.1당량의 트리플루오로에탄술폰산에스테르 R⁷¹OTf 또는 R⁷⁴OTf를 반응시킴으로써, N알킬화 반응이 일어나서, 식 (I)로 표시되는 목적 화합물을 얻을 수 있다.

상기 식 (I)의 화합물은 신규 화합물이며, 본 발명의 한 양태를 이룬다.

(2) 단량체

라디칼 중합 반응의 원료가 되는 단량체로서는, 탄소-탄소 이중 결합을 갖는 화합물이기만 하면, 어느 것이든 사용할 수 있다. 또한, 그 중에서, 원하는 성분, 화합물을 충전하거나, 또는 화학 결합하는데 있어서 적당한 것을, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다. 또한, 그 중에서, 생체 적합성이나 분해 용이성 등의 관점으로부터 적당한 것을, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다. 또한, 그 중에서, 라디칼 중합 반응의 효율, 경제성, 안전성 등의 관점으로부터 적당한 것을, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다.

본 발명의 한 실시 양태에서는, 예를 들어 충전하는 성분 또는 화합물의 분자량이 1000 이하인 저분자일 경우에는, 가교제 농도를 높게 하여 포어 사이즈를 작게 한 비히클을 선택할 수 있다. 게다가, 저분자는 그 비히클의 그물눈으로부터 확산으로 밖으로 누출되어버리기 쉽기 때문에, 이하의 기재와 같이 저분자의 소수성이나 전하 등을 이용하여, 비히클과의 상호 작용을 촉진하거나, 또는 공유 결합에 의해, 비히클과 직접 결합할 수 있는 단량체를 선택하는 것이 바람직하다. 한편, 분자량이 비교적 큰 고분자의 경우에는, 가교제의 농도를 적절하게 선택함으로써 그물눈을 제어하는 것을 들 수 있다.

다른 실시 양태에서는, 생체 적합성을 중시하는 경우에는, PEG 등의 단량체를 사용하는 것을 들 수 있다.

다른 실시 양태에서는, 충전하는 성분 또는 화합물이 전하를 갖고 있는 경우에는, 그 전하의 카운터가 되는 이온성기를 가진 단량체를 선택할 수 있다. 예를 들어, 충전하는 성분 또는 화합물이 음전하를 갖고 있으면, 아민 등의 양전하를 갖는 측쇄를 갖는 단량체 등을 들 수 있고, 충전하는 성분 또는 화합물이 양전하를 갖고 있으면, 카르복실산당 등의 음전하를 갖는 측쇄를 갖는 단량체 등을 들 수 있다.

다른 실시 양태에서는, 충전하는 성분 또는 화합물의 소수성·친수성에 따라서도, 단량체의 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 충전하는 성분 또는 화합물이 소수성이 높은 분자라면, 측쇄에 수산기나 아민기 및 이온성기를 포함하지 않으며, 또한 탄소수가 큰 단량체를 들 수 있고, 또한 그 중에서도, 충전하는 성분 또는 화합물이 벤젠환을 포함하는 구조라면, 페닐기를 측쇄에 갖는 단량체를 선택함으로써, 상호 작용에 의해, 비히클 내에서의 충전 성분의 안정성을 유지할 수 있다. 한편, 충전하는 성분 또는 화합물이 물에 녹기 쉬운 친수성이 높은 분자라면, 측쇄에 수산기나 아민기 및 이온성기를 포함하는 단량체를 들 수 있다.

다른 실시 양태에서는, 성분 또는 화합물을 세포 내 송달 비히클에 공유 결합하는 경우에는, 아크릴아미드계의 단량체 등에 목적 저분자 또는 고분자를 공유 결합시킨 화합물을 합성함으로써, 그 화합물을 비히클의 단량체로서 이용할 수 있다.

다른 실시 양태에서는, pH에 응답하여, 충전하는 성분 또는 화합물을 비히클 밖으로 방출하는 것을 생각하는 경우에는, pH에 응답하여 화학 구조가 바뀌는 단량체를 선택함으로써, 비히클의 포어 사이즈나 충전하는 성분 또는 화합물과의 상호 작용의 강약을 컨트롤할 수 있다. 그러한 단량체로서, 카르복실산이나 아민을 측쇄에 포함하는 단량체를 들 수 있다.

다른 실시 양태에서는, 온도에 응답하여, 충전하는 성분 또는 화합물을 비히클 밖으로 방출하는 것을 생각하는 경우에는, 온도에 응답하여 중합체 구조가 바뀌는 단량체를 선택함으로써, 비히클의 포어 사이즈나 충전하는 성분 또는 화합물과의 상호 작용의 강약을 컨트롤할 수 있다. 그러한 단량체로서, 아크릴아미드계의 단량체를 들 수 있다.

다른 실시 양태에서는, 자외선 등의 광에 응답하여, 충전하는 성분 또는 화합물을 비히클 밖으로 방출하는 것을 생각하는 경우에는, UV에 응답하여 단량체의 일부분의 구조가 개열하는 단량체를 선택함으로써, 비히클의 구조를 크게 바꿔서, 충전하는 성분 또는 화합물을 비히클 밖으로 방출할 수 있다. 그러한 단량체로서, PEG-photo-MA(Murayama, Shuhei, et al. "NanoPARCEL: a method for controlling cellular behavior with external light." Chemical Communications 48.67 (2012): 8380-8382.)와 같은 광 개열성 단량체를 들 수 있다.

(3) 가교제

라디칼 중합 반응의 원료가 되는 가교제로서는, 분자 중에 2 이상의 비닐기를 포함하는 단량체이며, 가교제로서 통상 사용되고 있는 것이라면 특별히 한정되지 않는다. 당해 가교제의 구체적인 예로서는, N,N'-메틸렌비스아크릴아미드, N,N'-에틸렌비스아크릴아미드, N,N'-메틸렌비스메타크릴아미드, N,N'-에틸렌비스메타크릴아미드, 에틸렌글리콜디아크릴레이트, 에틸렌글리콜디메타크릴레이트 등을 들 수 있다.

사용하는 가교제 단량체의 양은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 후술하는 식 (a), (b) 및 (c)의 단량체에 대하여 0.1 내지 20몰％의 양을 사용할 수 있다.

(4) 반응 조건

본 발명의 세포 내 송달 비히클은, 고분자 합성의 기술분야에서의 통상의 지식에 기초하여 합성할 수 있고, 예를 들어 라디칼 중합 등에 의한 중합체로서 얻을 수 있다.

일반적인 세포 내 송달 비히클의 제조 방법은 이하와 같다.

중합 개시제의 사용량은, 사용하는 단량체에 대하여 0.01몰％ 이상의 양이면 되고, 라디칼 합성이 진행하는 농도의 범위 내에서 적량을 선택할 수 있다. 예를 들어, 0.1몰％ 이상, 바람직하게는 1몰％ 이상의 중합 개시제를 사용할 수 있다.

중합 반응에 사용하는 반응 용매는, 특별히 한정되지 않지만, 예로서, 물, 디옥산, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드 등을 들 수 있다. 라디칼 중합은, 특별히 제한은 되지 않지만, 예를 들어 0 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃의 반응 온도, 및 예를 들어 1 내지 48시간, 바람직하게는 2 내지 16시간의 반응 시간에 행할 수 있다.

가교제 단량체를 사용하는 경우의 공중합 반응은, 당해 기술분야에서 관용의 방법에 의해 행할 수 있다.

당해 공중합 반응에 사용하는 반응 용매로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 계면 활성제(예를 들어, 도데실황산나트륨, 도데실벤젠황산나트륨, 펜타데칸황산나트륨, N-도데실-N,N,N-트리메틸암모늄브로마이드, N-세틸-N,N,N-트리메틸암모늄브로마이드, 트라이톤 X-100 등)를 포함하는 물을 사용할 수 있다.

가교제 단량체를 사용하여 얻어지는 공중합체의 나노 겔(나노 사이즈의 겔 미립자)의 사이즈는, 공중합 반응에 있어서의 교반 효율, 반응 온도, 계면 활성제의 사용량, 반응 개시제의 사용량, 가교제 단량체의 사용량에 의해 조절할 수 있다. 예를 들어, 계면 활성제 및/또는 반응 개시제의 사용량을 증가시킴으로써, 사이즈가 작은 나노 겔을 얻을 수 있다. 얻어지는 나노 겔의 사이즈는, 본 발명이 속하는 당업자라면 적절히 조절할 수 있고, 본 발명의 공중합체 나노 겔의 사이즈는, 예를 들어 5 내지 100㎚이다.

당해 공중합 반응은, 특별히 제한은 되지 않지만, 예를 들어 0 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 70℃의 반응 온도, 및 예를 들어 1 내지 48시간, 바람직하게는 2 내지 16시간을 들 수 있다.

4. 세포 내 송달 복합체

상기 세포 내 송달 비히클에 원하는 성분 또는 화합물을 충전하거나, 또는 그 성분 또는 화합물을 결합시킴으로써, 세포 내 송달 복합체를 제조할 수 있다.

(1) 원하는 성분 또는 화합물이 상기 세포 내 송달 비히클에 충전된 세포 내 송달 복합체의 제조 방법

원하는 성분 또는 화합물을 세포 내 송달 비히클에 충전한 세포 내 송달 복합체의 제조는, 통상의 방법에 따라서, 이하와 같이 행할 수 있다.

(i) 중합 반응 환경 하에 충전시키는 화합물·분자를 그대로 존재시켜서, 라디칼 중합 반응을 일으키게 하는 경우, 예를 들어 유화 중합 등에 의해 화합물·분자를 용해할 수 있는 상태로 하여, 화합물·분자의 안정성이 손상되기 어려운 온도나 용매 조건에서 중합을 행하면 된다. 그 후, 원심, 투석 및 여과 등의 조작에 의해, 충전시키는 화합물·분자와 비히클을 분리함으로써 목적 비히클은 제조할 수 있다.

(ii) 세포 내 송달 비히클을 충전시킬 화합물 등을 포함한 용액에 침지하여 흡착시키는 경우, 충전되는 성분 또는 화합물의 전하나 극성에 따라, 상호 작용이 강한 단량체를 선택함으로써, 흡착을 촉진할 수 있다. 교반 처리나 온도의 제어에 의해 흡착량을 높이는 것도 가능하다. 또한 단량체로서, 비오틴과 같은 측쇄를 갖는 것을 사용하면, 또는 충전되는 화합물이 스트렙트아비딘과의 융합 단백질 등으로 되어 있다면, 매우 강한 힘으로 비히클에 결합되어, 충전시킬 화합물이 누출되기 어려운 안정적인 비히클을 합성할 수 있다.

(iii) 세포 내 송달 비히클을 충전시킬 화합물 등을 포함한 용액에 침지하여 침투시키는 경우, 예를 들어 pH나 온도 등에 의해, 비히클의 구조 변화가 일어나는 단량체를 선택함으로써, 침지 시에는 그물눈 구조(구멍 사이즈)를 크게 하고, 침지 침투 후에 그물눈 구조를 작게 함으로써, 비히클 내에 화합물(주로 고분자)을 가둘 수 있다. 그 후, 원심, 투석 및 여과 등의 조작에 의해, 충전시키는 화합물·분자와 비히클을 분리함으로써 목적 비히클은 제조할 수 있다.

(2) 원하는 성분 또는 화합물이 상기 세포 내 송달 비히클에 공유 결합한 세포 내 송달 복합체의 제조 방법

원하는 성분 또는 화합물을 세포 내 송달 비히클과 공유 결합한 세포 내 송달 복합체의 제조는, 당업자에게 알려진 통상의 방법에 따라서, 이하와 같이 행할 수 있다.

(i) 중합 전의 단량체에 원하는 성분 또는 화합물이 결합한 것을 제조하고, 이것을 라디칼 중합 반응에 부칠 경우, 중합이 촉진되는 온도 조건에서, 비교적 용이하게 중합체인 비히클을 얻을 수 있다. 그 후, 재침전이나 여과, 원심, 염석 등에 의해 비히클을 정제할 수 있다.

(ii) 먼저 세포 내 송달 비히클을 제조하고, 그 후 원하는 성분 또는 화합물을 결합시키는 경우, 중합 전의 단량체에 특정한 활성기를 부여하고, 중합 후에, 그 활성기에 특이적으로 반응하는 구조를 가진 원하는 성분 또는 화합물과 비히클을 반응시킴으로써, 비히클에 공유 결합으로 화합물을 결합시킬 수 있다. 예를 들어, N-히드록시숙신이미드 활성 에스테르-아미노기의 반응이나, 말레이미드기-티올기의 특이적인 결합 반응을 이용할 수 있다.

(3) 세포 내 송달 비히클에 충전하는 성분 또는 화합물의 예

본 발명의 세포 내 송달 비히클에 충전하는 원하는 성분 또는 화합물의 바람직한 예로서, 이하의 것을 들 수 있다.

·인슐린을 충전하여 경피 흡수의 촉진을 도모한다.

·미백 성분, 화장 성분을 충전하여 피부 외피 세포 내로의 이행 촉진을 도모한다.

·헤어컬링제로서의 염료를 충전하여, 모발에 대한 침투력을 높인다.

·모발에 좋은 성분을 충전한 샴푸, 컨디셔너를 제조하여, 모발로의 침투력을 높인다.

·유전 물질을 충전하여, 세포 분열을 저해하지 않는 특성을 살려서 당해 유전 물질의 세포 내로의 효율 도입을 도모한다.

·약물을 충전하여, 암 세포 등의 표적 세포 내로의 효율적인 약물 송달을 도모한다.

·잉크를 충전하여 잉크 성분의 분산 안정화를 도모한다.

(4) 세포 내 송달 복합체의 세포 내 이행 방법

본 발명의 세포 내 송달 비히클을 세포에 도입하는 때에는, 이온 강도가 낮은 용액(용매)으로 치환하는 것이 바람직하다. 이러한 용매로서는, 예를 들어 물(바람직하게는 순수) 및 소르비톨 수용액, 글루코오스 용액 등을 들 수 있다. 세포의 종류에 따라, 이들 글루코오스 용액 등에 0.45mM의 염화칼슘을 첨가한 용액 등도 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 따라서 세포 내 송달 비히클을 세포에 도입할 때의 세포 내 송달 비히클 중합체의 농도는, 예를 들어 공중합체의 최종 농도를 0.001 내지 1％(w/v), 바람직하게는 0.01 내지 0.5％(w/v)로 되도록 조정하여, 균체와 섞을 수 있다. 이것은 미생물 균체와 같은 것에 한하지 않고, 접착 세포 등의 다른 세포에도 해당된다.

본 발명의 세포 내 송달 복합체도, 위와 동일한 방법으로 세포 내에 도입할 수 있다.

5. 양이온성 겔형 온도 감수성 프로브

본 발명의 세포 내 송달 복합체는, 온도 감수성 프로브에도 응용할 수 있다. 그 경우에는, 감열성 유닛, 형광성 유닛, 양이온성 중합 개시제 및 가교제를 사용한 공중합 반응에 의해 제조할 수 있고, 본 발명의 온도 감수성 프로브로서 사용되는 공중합체로서 얻을 수 있다.

감열성 유닛과 형광성 유닛의 조합은, 주위의 온도에 따라서 어떠한 특성이 변화하는 감열성 유닛과, 그 특성 변화에 따라서 형광 강도 또는 형광 수명이 변화하는 형광성 유닛과의 조합이라면, 어떠한 것이든 사용할 수 있다. 당업자라면 세포의 종류나 측정하고 싶은 온도 영역에 따라 적절한 조합을 선택할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시 양태에 의하면, 감열성 유닛은, 중합체로 된 경우에 온도에 따라서 그 형상이나 소수성이 변화하는 것, 예를 들어 하한 임계 용액 온도나 상한 임계 용액 온도(LCST나 UCST)를 갖는 분자로 된다. 예를 들어 LCST 거동을 나타내는 경우에는, 어떤 온도를 경계로 그것보다 높은 온도에서는 그 분자 내, 또는 분자 간의 소수 결합이 강해져 중합체쇄가 응집하고, 반대로, 낮은 온도에서는 중합체쇄가 물분자를 결합하여 수화하는 상전이 거동을 일으킨다. 형광성 유닛은, 감열성 유닛의 형상 변화에 따라서 형광 강도 또는 형광 수명이 변화하는 것으로 된다. 감열성 유닛에는, 온도에 따른 형상 변화에 따라 물에 대한 용해성이 변화하는 것도 알려져 있고, 그 경우에는, 형광성 유닛으로서 용매의 극성에 따라 형광 강도 또는 형광 파장 또는 형광 수명이 변화하는 솔바토크로믹의 성질을 갖는 형광성 유닛을 사용할 수 있다.

(1) 감열성 유닛의 바람직한 예

본 발명의 온도 감수성 프로브로서 사용되는 공중합체에 포함되는 감열성 유닛의 바람직한 예는, 이하의 식 (a)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 단량체에서 유래하는 1종 또는 2종 이상의 반복 구조이다:

[식 중, R¹은, 수소 원자 및 C_1-3 알킬로부터 선택되고;

R⁴ 및 R⁵는, 독립적으로 수소 원자 및 C_1-20 알킬로부터 선택되며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, C_1-6 알콕시, 및 아릴로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되거나, 또는 R⁴ 및 R⁵는 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 4 내지 8원 질소 함유 헤테로환을 형성하며, 여기서 당해 헤테로환은, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 니트로, 할로겐 원자, C_1-10 알킬카르보닐아미노 및 아릴카르보닐아미노로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨].

(2) 형광성 유닛의 바람직한 예

본 발명의 온도 감수성 프로브로서 사용되는 공중합체에 포함되는 형광성 유닛의 바람직한 예는, 이하의 식 (b)로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 단량체에서 유래하는 1종 또는 2종 이상의 반복 구조이다:

[식 중, R³은, 수소 원자 및 C_1-3 알킬로부터 선택되고;

X²는, O, S, 또는 N-R¹²이고;

X³은, 직접 결합, O, S, SO, SO₂, N(-R¹³), CON(-R¹⁶), N(-R¹⁶)CO, N(-R¹⁷)CON(-R¹⁸), SO₂N(-R¹⁹) 또는 N(-R¹⁹)SO₂이고;

Q²는, C_1-20 알킬렌, C_3-20 알케닐렌, 또는 C_3-20 알키닐렌으로부터 선택되며, 여기서 상기 알킬렌은, 1 이상의 개소에서, O, S 또는 페닐렌이 독립적으로 삽입되어 있어도 되고;

Ar은, 6 내지 18원 방향족 탄소환기, 또는 5 내지 18원 방향족 헤테로환기로부터 선택되며, 여기서 당해 방향족 탄소환기 및 방향족 헤테로환기는, 포함되는 환의 1 이상이 방향족환인 축합환을 포함하고 있어도 되고, 당해 방향족 탄소환기 및 방향족 헤테로환기에 환 원자로서 존재하는 -CH₂-은 -C(O)-로 치환되어 있어도 되고, 또한 당해 방향족 탄소환기 및 방향족 헤테로환기는, 할로겐 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, 니트로, 시아노, C_1-6 알킬카르보닐, C_1-6 알콕시카르보닐, 카르복시, 포르밀, -NR⁶R⁷, 및 -SO₂NR¹⁴R¹⁵로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고(여기에서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, C_1-6 알킬카르보닐 및 C_1-6 알콕시카르보닐에 포함되는 알킬은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 디(C_1-6 알킬)아미노, 아릴, 및 카르복시로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨);

R⁶ 및 R⁷은, 독립적으로 수소 원자, C_1-10 알킬, 아릴, C_1-10 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, C_1-10 알킬술포닐, 아릴술포닐, 카르바모일, N-(C_1-10 알킬)카르바모일, 및 N,N-디(C_1-10 알킬)카르바모일로부터 선택되며, 여기서 상기 C_1-10 알킬, C_1-10 알킬카르보닐, C_1-10 알킬술포닐, N-(C_1-10 알킬)카르바모일, 및 N,N-디(C_1-10 알킬)카르바모일에 포함되는 알킬은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 디(C_1-6 알킬)아미노, 아릴, 및 카르복시로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고, 또한 상기 아릴, 아릴카르보닐, 및 아릴술포닐에 포함되는 아릴은, 할로겐 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 및 카르복시로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되거나; 또는

R⁶ 및 R⁷은 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 4 내지 8원 질소 함유 헤테로환을 형성하며, 여기서 당해 헤테로환은, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 니트로, 할로겐 원자, C_1-10 알킬카르보닐아미노 및 아릴카르보닐아미노로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고;

R¹²는, 수소 원자, C_1-6 알킬, 또는 -Q²-X³-Ar이며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, 및 C_1-6 알킬술포닐로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고;

R¹³은, 수소 원자, 또는 C_1-6 알킬이며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, 및 C_1-6 알킬술포닐로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고;

R¹⁴ 및 R¹⁵는, 독립적으로 수소 원자, 및 C_1-6 알킬로부터 선택되거나; 또는 R¹⁴ 및 R¹⁵는 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 4 내지 8원 질소 함유 헤테로환을 형성하고;

R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸ 및 R¹⁹는, 독립적으로 수소 원자, 및 C_1-6 알킬로부터 선택되며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, 및 C_1-6 알킬술포닐로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨]

로 표시되는 단량체에서 유래하는 반복 구조이다.

본 발명의 온도 감수성 프로브에 있어서는, 경우에 따라 제2 형광성 유닛을 병용할 수 있다. 제2 형광성 유닛을 병용하는 경우, 지금까지 설명한 형광성 유닛을 「제1 형광성 유닛」이라고 한다.

제2 형광성 유닛은, 제1 형광성 유닛과는 다른 최대 형광 파장을 갖는 것으로 된다. 제2 형광성 유닛을 사용하는 실시 양태에서는, 본 발명의 온도 감수성 프로브를 사용한 온도 측정에서, 제1 형광성 유닛에서 유래하는 형광의 강도와, 제2 형광성 유닛에서 유래하는 형광의 강도의 비를 산출하고, 이것과 실제의 온도를 대응시킴으로써, 높은 정밀도로, 간편하게 또한 단시간에 온도를 측정하는 것이 가능하게 된다.

제1 형광성 유닛 및 제2 형광성 유닛은, 동일 파장의 여기광 조사에 의해 서로 다른 최대 형광 파장의 형광을 발생하는 것인 것이 바람직하다. 또한, 제1 형광성 유닛의 최대 형광 파장과, 제2 형광성 유닛의 최대 형광 파장의 차는, 2개의 파장에서의 형광 강도를 동시에 측정하는 데 있어서, 측정기에 의해 충분히 식별될 정도로 떨어져 있으면 되며, 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 50㎚ 이상이 된다.

본 발명의 바람직한 실시 양태에 의하면, 제1 형광성 유닛 및 제2 형광성 유닛 중 어느 한쪽은, 온도의 상승에 따라서 형광 강도가 상승하는 것이며, 다른쪽은 온도의 상승에 따라서 형광 강도가 불변 또는 하강하는 것이며, 바람직하게는 하강하는 것이 된다.

식 (c)로 표시되는 제1 형광성 유닛과 조합할 수 있는 제2 형광성 유닛의 바람직한 예는, 이하의 식 (c):

[식 중, R⁵⁵는, 수소 원자 및 C_1-3 알킬로부터 선택되고;

R⁵¹, R⁵², R⁵³ 및 R⁵⁴는, 독립적으로 수소 원자 및 C_1-6 알킬로부터 선택되고;

X⁴는, 직접 결합, 페닐렌, -Q⁴-O-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임), -Q⁴-N(-R⁶¹)-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임)이고;

R⁶¹은, 수소 원자 및 C_1-6 알킬로부터 선택되고;

Q⁴는, C_1-20 알킬렌, 페닐렌, 및 나프틸렌으로부터 선택되며, 그 페닐렌 및 나프틸렌은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, 및 카르복시로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨]

로 표시되는 단량체에서 유래하는 반복 구조가 된다.

(3) 본 발명의 온도 감수성 프로브로서 사용되는 공중합체

본 발명의 바람직한 실시 양태에 의하면, 본 발명에 사용되는 공중합체는, 주쇄의 적어도 한쪽 말단에 식 (I)로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와, 이것에 이어지는, 식 (a)로 표시되는 단량체 및 식 (b)로 표시되는 단량체 각각에서 유래하는 반복 구조를 포함하고, 또한 가교제에 의한 가교 구조를 포함하는 공중합체가 된다.

본 발명의 더욱 바람직한 실시 양태에 의하면, 본 발명에 사용되는 공중합체는, 식 (I'), 식 (A), 및 식 (B):

[식 중, R⁷¹, R⁷², R⁷⁵, R⁷⁶, R⁸¹, R⁸² 및 Y, R¹, R⁴ 및 R⁵, 및 R³, X², X³, Q² 및 Ar은, 이미 정의한 바와 같고, a, 및 b는, 각 반복 단위의 비를 나타내는 0보다 큰 수임]

로 표시되는 반복 단위를 포함하고, 또한 가교제 M_K에 의한 가교 구조를 포함하는 공중합체가 된다. 이 공중합체에서는, a는 100이고, b는, 바람직하게는 0.05 내지 2가 된다. 또한, 이 공중합체에서는, 식 (I')의 구조가 말단에 존재하는 것을 조건으로 하여, 다른 반복 구조, 즉 식 (A) 및 식 (B)의 반복 단위 및 가교제 M_K에 의한 가교 구조는, 어떤 순서로 배열되어 있어도 된다. 또한, 이 공중합체는, 각각의 반복 단위에 대해서, 각 식으로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 반복 단위를 포함하고 있어도 된다. 이 공중합체는, 물질 바로 그 자체로서 본 발명의 한 양태를 이룬다.

본 발명의 다른 바람직한 실시 양태에 의하면, 본 발명에 사용되는 공중합체는, 주쇄의 적어도 한쪽 말단에 식 (I)로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와, 이것에 이어지는, 식 (a)로 표시되는 단량체, 식 (b)로 표시되는 단량체 및 식 (c)로 표시되는 단량체 각각에서 유래하는 반복 구조를 포함하고, 또한 가교제에 의한 가교 구조를 포함하는 공중합체가 된다.

본 발명의 더욱 바람직한 실시 양태에 의하면, 본 발명에 사용되는 공중합체는, 식 (I'), 식 (A), 식 (B) 및 식 (C):

[식 중, R⁷¹, R⁷², R⁷⁵, R⁷⁶, R⁸¹, R⁸² 및 Y, R¹, R⁴ 및 R⁵, 및 R³, X², X³, Q² 및 Ar, 및 R⁵⁵, X⁴, R⁵¹, R⁵², R⁵³ 및 R⁵⁴는, 이미 정의한 바와 같고, a, b, 및 c는, 각 반복 단위의 비를 나타내는 0보다 큰 수임]

로 표시되는 반복 단위를 포함하고, 또한 가교제 M_K에 의한 가교 구조를 포함하는 공중합체가 된다. 이 공중합체에서는, a는 100이고, b는 바람직하게는 0.05 내지 2가 되고, c는, 바람직하게는 0.005 내지 1이 된다. 또한, 이 공중합체에서는, 식 (I')의 구조가 말단에 존재하는 것을 조건으로 하여, 다른 반복 구조, 즉 식 (A), 식 (B) 및 식 (C)의 반복 단위 및 가교제 M_K에 의한 가교 구조는, 어떤 순서로 배열되어 있어도 된다. 또한, 이 공중합체는, 각각의 반복 단위에 대해서, 각 식으로 표시되는 1종 또는 2종 이상의 반복 단위를 포함하고 있어도 된다. 이 공중합체는, 물질 바로 그 자체로서 본 발명의 한 양태를 이룬다.

본 발명의 바람직한 실시 양태에 의하면, 상기 공중합체는 2종 이상의 감열성 유닛을 포함하는 것이 된다. 감열성 유닛에는 여러 종류의 것이 있고, 그 종류에 따라, 가장 높은 온도 반응성을 나타내는 온도 영역이 상이하다. 이 실시 양태에서는, 2종 이상의 감열성 유닛을 조합함으로써, 원하는 온도 영역에서 공중합체의 온도 반응성이 높아지도록 조정할 수 있다. 본 발명의 보다 바람직한 실시 양태에 의하면, 상기 공중합체는, 상기 식 (a)로 표시되는 2종 이상의 감열성 유닛을 포함하는 것이 된다. 또한, 하나의 실시 양태에서는, 2종류의 감열성 유닛이 사용된다. 예를 들어, 동물 세포의 일반적인 배양 온도인 35℃ 부근의 측정에서는, N-n-프로필아크릴아미드(NNPAM)와 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)의 조합을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 효모 등의 미생물의 발효를 모니터하는 등의 목적으로 25℃ 이하의 온도 영역의 측정이 필요하게 되는 경우에는, N-tert-부틸아크릴아미드(NTBAM)와 NNPAM의 조합을 사용하는 것이 바람직하다.

식 (A)에 있어서의 a는, 감열성 유닛 전체의 총합을 나타내는 것이며, 2종 이상의 감열성 유닛을 사용한 경우에는, 모든 감열성 유닛의 반복 단위수의 비율의 합을 의미한다.

본 발명의 바람직한 실시 양태에 의하면, 상술한 공중합체에 있어서, Ar은, 하기 식:

으로 표시되는 기로부터 선택되는 방향족 탄소환기 또는 방향족 헤테로환기이며, 이들 기는 당해 환 상을 할로겐 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, 니트로, 시아노, C_1-6 알킬카르보닐, C_1-6 알콕시카르보닐, 카르복시, 포르밀, -NR⁶R⁷, 및 -SO₂NR¹⁴R¹⁵로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고(여기에서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, C_1-6 알킬카르보닐 및 C_1-6 알콕시카르보닐에 포함되는 알킬은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 디(C_1-6 알킬)아미노, 아릴, 및 카르복시로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨);

X¹⁰은, O, S 또는 Se로부터 선택되고;

R⁸은, 수소 원자, C_1-10 알킬, 및 아릴로부터 선택되며, 당해 알킬은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 디(C_1-6 알킬)아미노, 아릴, 및 카르복시로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고, 또한 상기 아릴은, 할로겐 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 및 카르복시로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 된다.

본 발명의 더욱 바람직한 실시 양태에 의하면, Ar은, 하기 식:

으로 표시되는 기로부터 선택되는 방향족 탄소환기 또는 방향족 헤테로환기이며, 이들 기는 당해 환 상을 할로겐 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, 니트로, C_1-6 알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 시아노, 포르밀, C_1-6 알킬카르보닐, C_1-6 알콕시카르보닐, 카르복시 및 -SO₂NR¹⁴R¹⁵로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 된다.

본 발명에 있어서, R¹, R², R³ 및 R⁵⁵는, 바람직하게는, 수소 원자 및 메틸로부터 선택된다.

식 (a) 및 식 (A)에 있어서의 -NR⁴R⁵는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 R⁴가 수소 원자이고, R⁵는 C_2-10 알킬이어도 된다. 또한, R⁴ 및 R⁵는 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 4 내지 8원 질소 함유 헤테로환을 형성하는 경우, 예를 들어 피롤리딘환, 피페리딘환, 호모피페리딘환, 피페라진환, 호모피페라진환, 모르폴린환, 티오모르폴린환 등을 형성해도 된다.

식 (b) 및 식 (B)에 있어서의 -X²-Q²-은, 바람직하게는, X²는, O, NH 또는 N(C_1-6 알킬)이고, Q²는 C_2-10 알킬렌이다.

식 (b) 및 식 (B)에 있어서의 -Ar은, 바람직하게는, 하기 식 (V) 내지 (XII):

[식 중, R³¹은 수소 원자, 할로겐 원자, 니트로, 시아노, 및 -SO₂NR¹⁴R¹⁵로부터 선택되고; R³²는 C_1-6 알킬이고; X¹¹은, N-R³³, O 또는 S이고; R³³은 수소 원자 또는 C_1-6 알킬이고; X¹⁰, R¹⁴ 및 R¹⁵는, 이미 정의한 바와 같음]

로부터 선택되는 기이다.

식 (V)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 직접 결합, CON(-R¹⁶), N(-R¹⁶)CO, SO₂N(-R¹⁹) 또는 N(-R¹⁹)SO₂를 들 수 있다.

식 (VI)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 N-R¹³(여기서, 바람직한 R¹³으로서는 메틸 등의 C_1-3 알킬을 들 수 있음), 또는 S를 들 수 있다.

식 (VII)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 직접 결합, CON(-R¹⁶), N(-R¹⁶)CO, SO₂N(-R¹⁹) 또는 N(-R¹⁹)SO₂를 들 수 있다.

식 (VIII)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 직접 결합, CON(-R¹⁶), N(-R¹⁶)CO, SO₂N(-R¹⁹) 또는 N(-R¹⁹)SO₂를 들 수 있다.

식 (IX)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 직접 결합을 들 수 있다.

식 (X)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 직접 결합을 들 수 있다.

식 (XI)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 CO, SO₂, SO₂N(-R¹⁹) 또는 CON(-R¹⁶)(여기에서 상기 SO₂N(-R¹⁹) 및 CON(-R¹⁶)은 각각 황 원자 및 탄소 원자가 Ar에 결합함)을 들 수 있다.

식 (XII)에 대하여 바람직한 X³으로서는, 예를 들어 CO, SO₂, SO₂N(-R¹⁹) 또는 CON(-R¹⁶)(여기에서 상기 SO₂N(-R¹⁹) 및 CON(-R¹⁶)은 각각 황 원자 및 탄소 원자가 Ar에 결합함)을 들 수 있다.

본 발명에 있어서, 기 -X³-Ar은 환경 응답성의 형광단으로서 기능하고, 예를 들어 식 (V) 또는 (VII)의 형광단을 사용한 경우에는 온도의 상승에 따라 형광 강도가 저하되는 온도 센서가, 식 (VI) 또는 (VIII) 내지 (XII)의 형광단을 사용한 경우에는, 온도의 상승에 따라 형광 강도도 상승하는 온도 센서가 얻어진다.

식 (c) 및 식 (C)에 있어서의 R⁵¹, R⁵², R⁵³ 및 R⁵⁴는, 바람직하게는 수소 원자 및 메틸기로부터 독립적으로 선택된다.

식 (c) 및 식 (C)에 있어서의 바람직한 X⁴는, 예를 들어 직접 결합, 페닐렌, -Q⁴-O-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임), 또는 -Q⁴-NH-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임)이다.

식 (c) 및 식 (C)에 있어서의 Q⁴는, 바람직하게는 페닐렌이 된다.

본 발명의 특히 바람직한 실시 양태에 의하면, R¹은, 수소 원자, 메틸 및 에틸로부터 선택되고; R⁴는, n-프로필, 이소프로필 및 t-부틸로부터 선택되고, R⁵는 수소 원자이고; R³은, 수소 원자 및 C_1-3 알킬로부터 선택되고; X²는, O, 또는 N-R¹²이고; X³은, 직접 결합, O, N(-R¹³), CON(-R¹⁶), N(-R¹⁶)CO, 또는 N(-R¹⁷)CON(-R¹⁸)이고; Q²는, C_1-20 알킬렌, C_3-20 알케닐렌, 또는 C_3-20 알키닐렌으로부터 선택되며, 여기서 상기 알킬렌은, 1 이상의 개소에서, O, S 또는 페닐렌이 독립적으로 삽입되어 있어도 되고; Ar은, 하기 식:

으로 표시되는 기로부터 선택되는 방향족 탄소환기 또는 방향족 헤테로환기이며, 이들 기는 당해 환 상을 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 니트로, 시아노, -NR⁶R⁷, 및 -SO₂NR¹⁴R¹⁵로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있으며, 또한 C_1-6 알킬에 의해 치환되어 있어도 되고; X¹⁰은, O, S 또는 Se로부터 선택되고; R⁸은, 수소 원자, C_1-10 알킬, 및 아릴로부터 선택되고; R⁶ 및 R⁷은, 독립적으로 수소 원자, C_1-10 알킬, 아릴, C_1-10 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, C_1-10 알킬술포닐, 아릴술포닐, 및 카르바모일로부터 선택되거나; 또는 R⁶ 및 R⁷은 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 5 내지 7원 질소 함유 헤테로환을 형성하며, 여기서 당해 헤테로환은, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 니트로, 및 할로겐 원자로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고; R¹²는, 수소 원자, C_1-6 알킬, 또는 -Q²-X³-Ar이며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시 및 할로겐 원자로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고; R¹³은, 수소 원자, 또는 C_1-6 알킬이며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시 및 할로겐 원자로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고; R¹⁴ 및 R¹⁵는, 독립적으로 수소 원자, 및 C_1-6 알킬로부터 선택되거나; 또는 R¹⁴ 및 R¹⁵는 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 5 내지 7원 질소 함유 헤테로환을 형성하고; R¹⁶, R¹⁷ 및 R¹⁸은, 독립적으로 수소 원자, 및 C_1-6 알킬로부터 선택되며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시 및 할로겐 원자로부터 선택되는 1 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고; R⁵¹, R⁵², R⁵³, R⁵⁴ 및 R⁵⁵는, 수소 원자 및 메틸기로부터 독립적으로 선택되고; X⁴는, 직접 결합, 페닐렌, -Q⁴-O-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임), 또는 -Q⁴-NH-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임)가 되고, Q⁴는 페닐렌이 된다.

식 (A), 식 (B) 및 식 (C)에 있어서의 a, b, 및 c는 식 중의 각 반복 단위의 비를 나타내는 0보다 큰 수이며, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 a를 100으로 한 때에, b는 0.01 내지 10이며, 구체적으로는 0.02 내지 5이며, 바람직하게는 0.05 내지 2이며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 1.5이다. c는 0.001 내지 5이며, 구체적으로는 0.002 내지 2이며, 바람직하게는 0.005 내지 1이며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1이다. b와 c의 비를 나타내는 b/c는, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0.1 내지 30, 보다 바람직하게는 1 내지 20, 더욱 바람직하게는 3 내지 10이 된다. 상술한 바와 같이, a는 감열성 유닛의 총합이며, 예를 들어 2종류의 감열성 유닛을 사용하는 경우의 감열성 유닛의 비는, 어떤 수 p를 사용하여, p: a-p가 된다. 또한, 본 발명의 공중합체 크기는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1 내지 100000㎚, 바람직하게는 1 내지 10000㎚, 보다 바람직하게는, 1 내지 1000㎚이다.

본 발명의 공중합체는 주위의 온도 변화에 대하여 매우 빠르게 응답하고, 그 구조 변화는 몇밀리초 정도이다. 즉, 본 발명의 온도 감수성 형광 프로브는, 세포 내의 온도 변화에 민첩하게 응답하여 형광 강도를 변화시키기 때문에, 현미경 등을 사용하여, 세포 내의 온도 분포를 가시화한 경우에는, 그 형광 강도비로부터 세포 내의 각 미소 공간에서의 세포 내의 온도를 정량할 수 있다.

본 발명의 공중합체를 포함하는 용액 중의 pH나 염 농도에 영향을 받지 않고 온도 측정을 행하기 위해서, 당해 공중합체에 포함되는 양이온성 관능기는, 광범위한 pH에서 이온성을 유지하는 편이 바람직하다. 그러나, 세포 내 온도를 측정하는 용도에 한하여 말하자면, 세포 내의 pH는 2 내지 9, 또한 통상의 상태, 일반적인 동물, 식물, 미생물 세포라면 pH4 내지 8 정도이다.

(4) 측정 방법

본 발명에 사용되는 공중합체의 감열 응답성에 의한 형광 강도의 변화는, 통상의 형광 강도 측정 방법에 의해 측정할 수 있다. 측정에서의 여기 파장 및 측정하는 형광 파장은, 특별히 제한은 되지 않지만, 예를 들어 측정 시료의 여기 스펙트럼을 측정했을 때의 최대 여기 파장 또는 그 부근의 파장을 사용할 수 있다. 또한, 측정하는 형광 파장도 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 어떤 온도에서 측정 시료의 형광 스펙트럼을 측정했을 때의 최대 형광 파장 또는 그 부근의 파장을 사용할 수 있다.

본 발명에서는, 어떤 독립된 2개의 형광 파장에서의 형광 강도를 측정하여 이들의 비를 취하고, 그 형광 강도비로부터 온도로 환산하는 방법을 취할 수도 있다. 이 방법에 의해, 공중합체로부터 발해지는 형광 강도가, 미소 공간 내의 공중합체의 농도나 여기하는 레이저 강도에 기인하는 가능성을 배제하고, 온도와 실험에서 얻어지는 형광 강도비를 일대일로 대응시키는 것이 가능하다. 이에 의해 동일 세포에서의 온도 비교뿐만 아니라, 동일 조건 하에 놓인 별도의 세포의 세포 내 온도의 비교도 가능하게 된다. 예를 들어, 효모 집단 중에서의 개개의 세포 온도의 차이를 측정함으로써, 각 효모 세포의 생리 상태를 파악하는 것이 가능하게 된다.

형광 강도비의 산출법은, 특별히 한정되는 것은 아니며, 서로 다른 파장을 포함한 2개의 영역의 형광 강도로부터 그 비를 산출할 수 있다. 예를 들어, 한쪽 영역은 제1 형광성 유닛으로부터 발생하는 형광의 최대 강도를 나타내는 파장을 포함하는 20㎚ 정도의 파장 영역으로서 형광 강도의 적분값을 S1로 하고, 다른 쪽 영역은 제2 형광성 유닛으로부터 발생하는 형광의 최대 강도를 나타내는 파장을 포함하는 20㎚ 정도의 파장 영역으로서 형광 강도의 적분값을 S2로 하고, S1/S2를 형광 강도비로 해도 된다. 또한, S1 및 S2의 영역은 동일한 폭이어도 되고, 서로 다른 폭이어도 된다.

예를 들어, 형광 강도가 노이즈를 무시할 수 있는 충분한 값을 나타내면, S1은 20㎚폭의 파장 영역을 포함하는 한편, S2는 1㎚폭의 단독 파장이어도 된다. 파장의 선택 기준도 특별히 한정되는 것은 아니며, 얻어지는 형광 강도를 고려하면, 온도 감수성 프로브에 포함되는 각각의 형광성 유닛을 부여하는 단량체(예를 들어, 식 (b) 또는 식 (c)로 나타나는 형광 단량체)의 상온(약 25℃)에서의 수중 및 수중에 가까운 극성 용매에서의 여기 스펙트럼을 측정했을 때의 최대 형광 강도를 나타내는 파장에 기초하여, 그 주변의 파장으로부터 선택하는 것이 바람직하다.

실험에서 얻어진 형광 강도비로부터 온도를 구하는 때에는, 자체적으로 작성한 검량선을 사용하는 것이 가능하다. 구체적으로, 어떤 조건에서 측정한 검량선을 사용할지는 한정되지 않지만, 예를 들어 세포 내를 모방한 염화칼륨 용액 중에서의, 공중합체의 감열 응답성에 의한 형광 강도의 변화를 플롯한 곡선, 공중합체를 도입한 세포 집단을 형광 광도계에 제공하여, 감열 응답성에 의한 형광 강도의 변화를 플롯한 곡선, 또는 공중합체를 도입한 세포 집단을 형광 현미경에 제공하여, 복수의 세포에서의 감열 응답성에 의한 형광 강도의 변화 평균값을 플롯한 곡선 등을 사용할 수 있다. 더욱 구체적으로는, 공중합체를 도입한 세포 집단을 사용하여 감열 응답성 시험을 행하여, 형광 강도의 변화를 플롯하는 때에는, 세포는 대사 활동을 적극적으로 실시하지 않는 상태, 예를 들어 수중이나 자화할 수 없는 화합물이 포함된 완충액 내에 세포를 현탁한 상태에서, 특정한 온도에 일정 기간 유지하고, 외부 온도와 세포 내부 온도가 평형 상태에 달했다고 생각되는 상황 하에서, 형광 강도를 측정하는 방법 등을 들 수 있다.

또한, 본 발명에 사용되는 공중합체의 감열 응답성에 따른 변화로서, 형광 수명을 지표로 할 수도 있다. 이 변화는 통상의 형광 수명 측정법에 의해 측정할 수 있다. 측정에서의 여기 파장은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 측정 시료의 여기 스펙트럼을 측정했을 때의 최대 여기 파장 또는 그 부근의 파장을 사용할 수 있다. 실험에 의해 얻어진 형광 감쇠 곡선으로부터, 측정하는 시료의 상태에 따라, 1성분 근사, 2성분 근사 등의 일반적인 해석 방법을 사용함으로써, 형광 수명값을 얻을 수 있다.

본 발명에 사용되는 공중합체의 감열 응답성에 의한 형광 수명의 변화는, 일반적인 형광 수명 측정 방법, 예를 들어 단일 광자 계수법, 위상 변조법, 펄스 샘플링법, 여기 프로브법 등의 방법에 의해 측정할 수 있다. 이 중, 단일 광자 계수법은, 시간축 상의 출발 광강도 분포와 광자 1개의 발광 확률이 상관 관계에 있는 것을 이용하여 형광 수명을 측정하는 방법이며, 형광단을 50ps 내지 1ns 정도의 매우 짧은 (펄스)광으로 여기한 후, 검출되는 광의 발생 시각을 측정하고, 여기를 다수회 반복하여 얻어지는 히스토그램을 형광 감쇠 곡선으로 하여 지수 함수의 합으로 근사하여 형광 수명을 결정한다. 단일 광자 계수법에 의한 형광 수명의 측정은, 시판되고 있는 시간 상관 단일 광자 계수법 형광 수명 측정 장치 및 그것에 부수되어 있는 측정·해석 프로그램을 사용하여 행할 수 있다.

(5) 키트

이상에서 설명한 방법을 실시하기 위해서, 필요한 시약 등을 통합하여 키트로 할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 양태에 의하면, 상술한 방법을 사용하여 온도를 측정하기 위한 키트가 제공되고, 그 키트는, 본 발명의 온도 감수성 프로브 또는 본 발명의 공중합체를 포함하여 이루어진다. 이 온도 측정용 시약 키트는, 미소 공간 내의 온도 측정, 특히 세포 내의 온도 측정에 바람직하게 사용할 수 있다. 당해 시약 키트는, 의학·생물학·생물공학 등의 연구 분야, 진단·치료 등의 의료 분야에서 사용할 수 있다.

(6) 본 발명의 방법 및 키트의 용도

본 발명의 방법 및 온도 측정용 키트는, 여러 가지 연구 개발의 분야에 응용할 수 있다. 예를 들어, 생물공학의 분야에서는, 미생물을 사용한 유용 물질의 발효 생산에 있어서, 지금까지 정확한 측정이 곤란했던 세포 내 온도를 해석 파라미터에 가함으로써, 배양 조건의 검토 효율화가 기대된다.

본 발명의 방법 및 온도 측정용 키트는, 여러 가지 의료 용도에 응용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의한 온도 감수성 프로브를 환자의 조직 일부에 대하여 사용함으로써, 열 산생량이 많다고 되어 있는 암 세포와, 그렇지 않은 정상 세포의 식별을 행하는 것도 가능하다. 또한 그것을 응용함으로써 효과적인 온열 치료법의 개발 등에도 사용할 수 있다. 또는, 열 산생량이 많은 갈색 지방 세포에 본 발명에 의한 온도 감수성 프로브를 도입하여, 그 세포에 여러 가지 소재를 첨가하는 것에 의한 온도 변화를 측정함으로써, 갈색 지방 세포를 활성화하는 소재를 스크리닝하는 것도 가능하다.

본 발명의 방법 및 온도 측정용 키트는, 여러 가지 생리 현상의 해명에도 응용 가능하다.

예를 들어, 생체 밖의 온도를 감지하고, 생체 반응을 야기하는 수용체인 TRP채널이 세포 내의 온도와 어떻게 관련하고 있는지를 조사함으로써 지금까지와는 상이한 어프로치에 의한 TRP 채널의 활성화가 생각된다. 또한 세포 내 온도 분포와 세포 내외에서 일어나는 생체 반응의 관계를 조사함으로써, 국소적인 온도 분포가 생체 반응에 미치는 영향을 조사하는 것이 가능해서, 적외선 레이저 등을 사용한 국소적인 가열에 의한 세포의 컨트롤을 행하는 것 등도 가능하다.

본 발명에 의한 온도 측정법 및 온도 감수성 프로브의 세포 도입법은, 시험관 내(in vitro) 및 생체 내(in vivo) 중 어느 경우에서도 행할 수 있다. 하나의 실시 양태에서는, 이들 방법은 in vitro에서 행하여진다.

6. 정리

이상과 같이, 본 발명에 따르면, 이하의 발명이 제공된다.

(1) 표면이 양성 하전으로 덮인, 세포 내 송달 비히클.

(2) 이하의 화학 구조:

를 갖는 상기 (1)에 기재된 세포 내 송달 비히클.

(3) 양이온성 중합 개시제와, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하여 이루어지는 단량체와, 가교제에 의한 라디칼 중합 반응을 행하는 것을 특징으로 하는, 표면이 양성 하전으로 덮인 세포 내 송달 비히클의 제조 방법.

(4) 일반식 (I):

[식 중,

Y는, 단결합 또는 CR⁸⁵를 나타내고,

Z는, 단결합 또는 CR⁸⁶을 나타내고,

R⁷² 및 R⁷³은, 또한 각각 독립적으로 아다만틸, 또는 Si(OCH₃)₂(CH₃)로 치환된 C_1-6 알킬을 나타내도 되거나, 또는 R⁷⁵ 및 R⁷⁶, 또는 R⁷⁷ 및 R⁷⁸은, 일체로 되어 -(CH₂)_3-5-를 형성해도 되고,

의 화학 구조를 갖는 화합물.

(5) 상기 Y 및 Z가 단결합을 나타내는, (4)에 기재된 화합물.

(6) 상기 R⁸¹, R⁸², R⁸³, 및 R⁸⁴가, 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 메틸 카르보닐, 이소부틸, 및 2-메틸-2-메톡시-프로필로 이루어지는 군으로부터 선택되는, (4) 또는 (5)에 기재된 화합물.

(7) 상기 R⁷¹ 및 R⁷⁴가 메틸기인, (4) 내지 (6) 중 어느 하나에 기재된 화합물.

(8) 상기 R⁷² 및 R⁷³, 상기 R⁷⁵ 및 R⁷⁷, 상기 R⁷⁶ 및 R⁷⁸, 상기 R⁸¹ 및 R⁸⁴, 상기 R⁸² 및 R⁸³, 및 상기 R⁷¹ 및 R⁷⁴가, 각각 동일한 치환기를 나타내고, 또한 상기 Y 및 Z가, 동일한 치환기 또는 함께 단결합을 나타내는, (4) 내지 (7) 중 어느 하나에 기재된 화합물.

(9) R⁷¹, R⁷², R⁷³, R⁷⁴, R⁸¹, R⁸², R⁸³ 및 R⁸⁴가 메틸기이고, R⁷⁵, R⁷⁶, R⁷⁷ 및 R⁷⁸이 수소 원자이고, Y 및 Z가 단결합인, (4)에 기재된 화합물.

(10) 상기 (4) 내지 (9) 중 어느 하나에 기재된 화합물을 포함하는 양이온성 중합 개시제.

(11) 상기 (10)에 기재된 양이온성 중합 개시제와, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하여 이루어지는 단량체와, 가교제에 의한 라디칼 중합 반응을 행하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 내 송달 비히클의 제조 방법.

(12) 상기 (11)의 제조 방법에 의해 얻어지는 세포 내 송달 비히클.

(13) 세포 내에 송달되는 목적 성분 또는 화합물이, 상기 (1)에 기재된 세포 내 송달 비히클에 충전되어 이루어지는, 세포 내 송달 복합체.

(14) 상기 (1)에 기재된 세포 내 송달 비히클에, 세포 내에 송달되는 목적 성분 또는 화합물을 충전하는 것을 포함하여 이루어지는, 세포 내 송달 복합체의 제조 방법.

(15) 세포 내에 송달되는 목적 성분 또는 화합물이 상기 세포 내 송달 비히클에 공유 결합하고 있는, 상기 (13)에 기재된 세포 내 송달 복합체.

(16) 상기 화합물이, 온도에 따라서 그 특성이 변화하는 감열성 유닛, 및 그 감열성 유닛의 특성 변화에 따라서 형광 강도 또는 형광 수명이 변화하는 형광성 유닛인, 상기 (13) 또는 (15)에 기재된 세포 내 송달 복합체.

(17) 주쇄의 적어도 한쪽 말단에 식 (I')로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와, 이것에 이어지는, 식 (a)로 표시되는 단량체 및 식 (b)로 표시되는 단량체 각각에서 유래하는 반복 구조를 포함하고, 또한 가교제에 의한 가교 구조를 포함하는, 공중합체.

(18) 식 (I'), 식 (A), 및 식 (B)로 표시되는 반복 단위를 포함하고, 또한 가교제에 의한 가교 구조를 포함하는, 공중합체.

(19) 주쇄의 적어도 한쪽 말단에 식 (I')로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와, 이것에 이어지는, 식 (a)로 표시되는 단량체, 식 (b)로 표시되는 단량체 및 식 (c)로 표시되는 단량체 각각에서 유래하는 반복 구조를 포함하고, 또한 가교제에 의한 가교 구조를 포함하는, 공중합체.

(20) 식 (I'), 식 (A), 식 (B) 및 식 (C)로 표시되는 반복 단위를 포함하고, 또한 가교제에 의한 가교 구조를 포함하는, 공중합체.

(21) 상기 (16)에 기재된 세포 내 송달 복합체, 또는 상기 (17) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 공중합체를 포함하여 이루어지는, 온도 감수성 프로브.

(22) 세포 내의 온도를 측정하는 방법이며,

(a) 상기 (21)에 기재된 온도 감수성 프로브를 세포 내에 도입하는 공정, 및

을 포함하여 이루어지는, 방법.

(23) 세포 내의 온도를 측정하기 위한 키트이며, 상기 (16)에 기재된 세포 내 송달 복합체, 상기 (17) 내지 (20) 중 어느 하나에 기재된 공중합체, 또는 상기 (21)에 기재된 온도 감수성 프로브를 포함하여 이루어지는, 키트.

(24) 상기 (10)에 기재된 양이온성 중합 개시제와, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하여 이루어지는 단량체에 의한 라디칼 중합 반응을 행하는 것을 포함하여 이루어지는, 적어도 한쪽 말단이 양성 하전을 띤 끈상 중합체의 제조 방법.

(25) 주쇄의 적어도 한쪽 말단에 식 (I')로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와, 이것에 이어지는, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하여 이루어지는 단량체에서 유래하는 반복 구조를 포함하는 공중합체를 포함하는, 적어도 한쪽 말단이 양성 하전을 띤 끈상 중합체.

(26) 상기 (24)의 제조 방법에 의해 얻어지는, 적어도 한쪽 말단이 양성 하전을 띤 끈상 중합체.

(27) 적어도 한쪽 말단이 양성 하전을 띤 끈상 중합체와 음성 하전을 띤 잉크 입자를 포함하는 복합체.

실시예

이하에 실시예를 나타내는 것에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

시약 및 데이터 측정

양이온성 중합 개시제의 합성 위한 원료가 되는 α,α'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN)은 메탄올을 사용한 재결정, 감열성 유닛인 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)는 n-헥산을 사용한 재결정에 의해 정제하여 사용하였다. 기타의 시약은 구입한 것을 추가로 정제하지 않고 사용하였다.

¹H-NMR은 BRUKER AVANCE400 스펙트로미터(400MHz)를 사용하여 측정하고, 케미컬쉬프트는 ppm으로 표시하였다. 수 평균 분자량 및 중량 평균 분자량은 JASCO GPC system(JASCO PU-2080 펌프, JASCO RI-2031 시차 굴절계, JASCO CO-2060 칼럼 오븐, Shodex GPC KD-806M 칼럼)을 사용하고, 폴리스티렌 표준 시료에 의해 얻어지는 교정 곡선을 사용하여 산출하였다. 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에는, 간또 가가꾸 silica gel 60N(40-50㎛)을 사용하였다. 흡광도의 측정에는, JASCO V-650 자외가시광 분광 광도계를 사용하였다. IR의 측정에는, SHIMADZU FTIR-8300을 사용하였다. 질량 분석은, JMS-700 또는 Brucker micrOTOF II(ESI)를 사용하였다. 겔 입자 직경은, 동적 광산란법(DLS)에 기초하여, Zetasizer Nano ZS(Malvern)를 사용하여 측정하였다.

실시예 A-1: 양이온성 중합 개시제의 합성

α,α'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN)(20.1g, 0.12mol)을 메탄올(MeOH) 20mL와 톨루엔(Tol) 200mL에 현탁하였다. 이 용액에, 염화나트륨(NaCl)(200g)에 농황산(260mL)을 적하하고, 발생하는 염화수소(HCl) 가스를 불어 넣고, 실온에서 5시간 교반하였다. 석출된 고체를 여과하고, 톨루엔(Tol)으로 씻고, 진공 건조함으로써 백색 고체의 화합물 1a를 얻었다(28.3g, 수율 77％).

화합물 1a의 ¹H NMR(400MHz, MeOD-d₄)은 이하와 같다.

δ3.35(s.6H), 1.57(s, 12H)

화합물 1a의 질량 분석의 결과는 이하와 같다.

HRMS(EI⁺): [C₅H₁₀NO]⁺에 대한 계산값, 100.0757; 실측값, 100.0761

또한, 화합물 1a의 원소 분석의 결과는 이하와 같다.

C₁₀H₂₂Cl₂N₄O₂에 대한 분석 계산값: C, 39.87; H, 7.36; N, 18.60. 실측값: C, 39.16; H, 7.41; N.18.25

N-메틸에틸렌디아민(12.6mL, 0.14mol)을 메탄올(MeOH) 60mL에 첨가하고, 감압 하에서 톨루엔(Tol) 100mL/메탄올(MeOH) 6mL에 현탁한 화합물 1a(15.0g, 49.7㎜ol)를 40분에 걸쳐 적하하였다. 감압 하(250Torr), 실온에서 3시간 교반한 후, 여과하였다. 여과액량이 1/2량 정도로 될 때까지 용매를 감압 증류 제거하고, 데칸테이션에 의해 상청을 분리하였다. 그 상청을 감압 증류 제거하고, 진공 건조함으로써 황색 고체인 화합물 1b를 얻었다(13.2g, 수율 95％).

화합물 1b의 ¹H NMR(400MHz, MeOD-d₄)은 이하와 같다.

δ3.66(t, 4H, J=10.0Hz), 3.42(t, 4H, J=10.0Hz), 2.75(s, 6H), 1.47(s, 12H).

화합물 1b의 ¹³C NMR(100MHz, MeOH-d₄)은 이하와 같다.

δ171.0, 72.7, 55.1, 52.3, 36.0, 25.0

화합물 1b의 질량 분석의 결과는 이하와 같다.

HRMS(EI⁺): [C₇H₁₃N₂]⁺에 대한 계산값, 125.1073; 실측값, 125.1092

또한, 화합물 1b의 원소 분석 결과는 이하와 같다.

C₁₄H₂₆N₆에 대한 분석 계산값: C, 60.40; H, 9.41; N, 30.19. 실측값: C, 59.79; H, 9.45; N, 29.68.

아르곤 환경 하에서, 화합물 1b(2.7g, 9.7㎜ol)를 디클로로메탄(CH₂Cl₂) 30mL에 용해하고, 트리플루오로메탄술폰산메틸(MeOTf)(2.3mL, 20.3㎜ol)을 적하하였다. 실온에서 3.5시간 교반한 후, 용매를 감압 증류 제거함으로써 목적물인 양이온성 중합 개시제 화합물 1c를 얻었다(5.6g, 수율 95％).

화합물 1c의 ¹H NMR(400MHz, MeOD-d₄)은 이하와 같다.

δ4.00(s.8H), 3.24(s, 12H) 1.73(s, 12H)

화합물 1c의 ¹³C NMR(100MHz, MeOH-d₄)은 이하와 같다.

δ169.0, 74.5, 53.3, 38.4, 24.7

화합물 1c의 질량 분석의 결과는 이하와 같다.

HRMS(EI⁺): [C₇H₁₃N₂]⁺에 대한 계산값, 125.1073; 실측값, 125.1073

또한, 화합물 1c의 원소 분석의 결과는 이하와 같다.

C₁₈H₃₂N₆O₆N₆S₂에 대한 분석 계산값: C, 35.64; H, 5.32; N, 13.85. 실측값: C, 35.37; H, 5.02; 13.59.

실시예 A-2: 양이온성 중합 개시제 1c를 사용한 폴리스티렌 공중합체의 제조

스티렌, 가교제로서 N,N'-메틸렌비스아크릴아미드(이하 , MBAM)와 계면 활성제로서 헥사데실트리메틸암모늄클로라이드(이하 , CTAC)를 표 1에 나타내는 양으로 물 25mL에 용해하고, 30분간 아르곤 가스를 통과시킴으로써 용존 산소를 제거하였다. 그 후, 표 1의 양 양이온성 중합 개시제 화합물 1c를 첨가하고, 메커니컬 교반기를 사용하여, 70℃에서 1시간, 유화 중합을 행하였다. 실온으로 식힌 후, 반응액에 염화나트륨을 첨가하여 염석을 하고, 투석에 의해 정제를 행하였다. 얻어진 중합체의 수율은 표 1에 나타내었다.

얻어진 중합체에 대해서, 제타 전위와 DLS에 의한 겔 입자 직경의 측정(중합체 농도 0.1％, 20℃)을 행하고, 투과형 전자 현미경(TEM)에 의한 겔 입자 직경의 측정(중합체 농도 0.01％로 풍건 후 측정)을 행하여, 표 2의 결과를 얻어, 양이온성의 겔이 얻어진 것이 확인되었다. 또한 투과형 전자 현미경(TEM)으로 화합물 2b를 관찰한 결과를 도 1에 도시한다. 이에 의해, 금회 새롭게 합성한 양이온성 중합 개시제 화합물 1c가 중합 개시제로서 기능하며, 또한 양이온성의 입자의 합성에 기여하는 것이 명확해졌다. 또한 중합 개시제의 양을 증가시킨 화합물 2a쪽이, 2b와 비교하여 제타 전위가 플러스로 되어 있어, 중합 개시제의 양에 따라, 입자 표면의 양이온 전하량을 제어할 수 있음도 알았다.

실시예 A-3: 양이온성 중합 개시제 1c를 사용한 PEG 공중합체의 제조

화합물 3a를 사용하여 공중합체 3c를, 화합물 3b를 사용하여 공중합체 3d를 얻었다. 합성법은 이하와 같다. 화합물 3a(20mg/ml) 또는 화합물 3b(33mg/ml)를 물(150μL)에 녹이고, 테트라에틸메틸렌디아민(17mM)과 화합물 1c(50mM)를 추가하여, 20분간 교반하였다. 15분간 실온에서 정치하고, 반응물에 물 또는 인산 완충 생리 식염수(PBS)를 350μL 첨가하고, 물 또는 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 투석을 행하고, 정제하여, 공중합체 3c 및 3d를 얻었다.

화합물 3e(4.2mM), p-디비닐벤젠(2.8mM), 계면 활성제 CTAC(1.82mM)를 물 45mL에 용해하고, 30분간 아르곤 가스를 통과시킴으로써 용존 산소를 제거하였다. 거기에, 양이온성 중합 개시제 화합물 1c(최종 농도 9.0mM)가 용해한 물 5mL을 첨가하고, 메커니컬 교반기를 사용하여, 70℃에서 유화 중합을 1.5시간 행하였다. 실온으로 식힌 후, 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 투석을 행하고, 정제하여, 공중합체 화합물 3f를 얻었다(수율 4.2％).

화합물 3b(33mg/ml)와 플루오레세인(33㎍/mL) 및 로다민 B(33㎍/mL)를 물(150μL)에 녹이고, 테트라에틸메틸렌디아민(17mM)과 화합물 1c(50mM)를 추가하여, 20분간 교반하였다. 15분간 실온에서 정치하고, 반응물에 물 또는 인산 완충 생리 식염수(PBS)를 350μL 첨가하고, 물 또는 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 투석을 행하고, 정제하여, 공중합체 3G(플루오레세인 포함) 및 3h(로다민 B 포함)를 얻었다.

얻어진 중합체에 대해서, 제타 전위와 DLS에 의한 겔 입자 직경을 측정(20℃)하고, 투과형 전자 현미경(이하 TEM)에 의한 겔 입자 직경의 측정(풍건 후 촬영)을 행하였다. 예로서 화합물 3d의 투과형 전자 현미경(TEM) 상을 도 2에 도시한다. 이하 표 3과 같은 결과를 얻고, PEG계의 단량체를 사용한 경우에도 양이온성의 겔이 얻어진 것이 확인되었다.

실시예 A-4: 양이온성 중합 개시제 1c를 사용한 온도 감수성 공중합체의 제조

공중합체의 합성에 필요한 단량체(형광성 유닛)의 하나인 N-(2-{[7-(N,N-디메틸아미노술포닐)-2,1,3-벤조티아디아졸-4-일]-(메틸)아미노}에틸)-N-메틸아크릴아미드(DBThD-AA)는 문헌 A(Chemistry A European Journal 2012년, 제18권, 제9552 -9563 페이지)에 기재된 방법에 따라 행하였다.

감열성 유닛인 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM)(100mM), 가교제 MBAM(1mM), 계면 활성제 CTAC(1.9mM), 형광성 유닛인 N-(2-{[7-(N,N-디메틸아미노술포닐)-2,1,3-벤조티아디아졸-4-일]-(메틸)아미노}에틸)-N-메틸아크릴아미드(DBThD-AA)(1mM), 및 N,N,N',N'-테트라메틸렌디아민(2.9mM)을 물(19ml)에 용해하고, 30분간 아르곤 가스를 통과시킴으로써 용존 산소를 제거하였다. 그 후, 물(1ml)에 용해한 화합물 1c(28mM)를 첨가하고, 70℃에서 메커니컬 교반기를 사용하여 1시간 유화 중합시켰다. 실온으로 식힌 후, 반응액에 염화나트륨을 첨가하여 염석을 하고, 물로 투석을 행하고, 정제하여, 공중합체 화합물 EF043, 75.3g를 얻었다(수율 31％). 얻어진 겔을 투과형 전자 현미경(TEM)으로 관찰한 결과를 도 3에 도시한다. 관찰 결과로부터 명백한 바와 같이, 구상의 입자가 합성된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 B-1: 신규 양이온성 중합 개시제와 동일한 양이온 구조를 가진 아크릴아미드계 양이온성 유닛의 합성

염화티오닐(SOCl₂)(2.65mL, 36.5㎜ol)과 트리클로로메탄(CHCl₃)(15.0mL)의 교반 혼합물에, 0℃에서, 아미노알코올 화합물 6(2.27mL, 29.7㎜ol)을 첨가하였다. 화합물 6이 완전히 소실할 때까지, 3시간의 가열 환류를 행하였다. 현탁액을 실온까지 식히고, 여과하고, 트리클로로메탄(CHCl₃)으로 잘 세정하여, 갈색 고체를 얻었다. 또한 거기에 아지드화나트륨(NaN₃)(2.91g, 44.7㎜ol)과 물(40mL)을 첨가하고, 80℃에서 24시간, 갈색 고체가 완전히 반응할 때까지 가열하였다. 2M 수산화나트륨(NaOH)을 첨가하여 반응을 멈추고, 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 3회 추출하였다. 추출액을 브라인으로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축함으로써, 아지드 화합물 7을 얻었다.

디클로로메탄(CH₂Cl₂)(132mL)에 아지드 화합물 7과 트리에틸아민(Et₃N)(6.85mL, 49.3㎜ol)을 녹이고, 또한 아크릴클로라이드(2.69mL, 32.9㎜ol)를 0℃에서 첨가하였다. 혼합물을 실온으로 데우고, 아지드 화합물 7이 없어질 때까지 45분 교반하였다. 물을 첨가하여 반응을 멈추고, 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 3회 추출하였다. 추출액을 브라인으로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 조생성물을 얻었다. 그 후, 실리카겔 크로마토그래피(헥산/아세트산 에틸=1/1)로 정제하여, 황색 결정 아미드 화합물 8을 얻었다(2.87g, 18.6㎜ol, 수율 63％).

화합물 8의 IR 데이터는 이하와 같다.

IR(순, cm^-1): 3277, 2932, 2097, 1657, 1626, 1550, 1408, 1245, 985, 957, 772

화합물 8의 ¹H NMR(400MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ6.29(dd, 1H, J=17.2, 1.2Hz), 6.09(dd, 1H, J=17.2, 10.0Hz), 5.73(brs, 1H), 5.66(dd, 1H, J=10.0, 1.6Hz), 3.48-3.35(m, 4H), 1.85(tt, 2H, J=6.8, 6.8Hz)

화합물 8의 ¹³C NMR(100MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ165.7, 130.7, 126.6, 49.4, 37.2, 28.7

화합물 8의 질량 분석의 결과는 이하와 같다.

HRMS(FAB⁺) C₈H₁₃NO₂(M+H⁺)에 대한 계산값, 155.0933; 실측값, 155.0936.

파르(parr) 압력 반응기에, 에틸렌디아민(화합물 9)(5.42mL, 81.1㎜ol), 아세토니트릴(8.47mL, 162㎜ol), 메탄올(4.39mL), 및 염화암모늄(270mg, 4.06㎜ol)을 넣고, 봉하였다. 200℃에서 4시간 가열 후, 반응물을 여과하고, 감압 하에서 농축하여, 이미다졸린 화합물 10을 얻었다.

무수 테트라히드로푸란(THF)(243mL)에 이미다졸린 화합물 10을 녹이고, n-부틸리튬(n-BuLi)(n-헥산 36.7mL 중, 2.65M, 97.3㎜ol)을 0℃에서 적하하고, 실온에서 1시간, 교반하였다. 그 후, 요오드화메틸(6.56mL, 105㎜ol)을 0℃에서 적하하고, 화합물 10이 완전히 없어질 때까지, 1시간 교반하였다. 물을 첨가하고, 반응을 멈추고, 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 3회 추출하였다. 추출액을 브라인으로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축하여 조생성물을 얻었다. 정제 때문에 증류(54℃/27hPa)를 하여, 무색 유상의 디메틸이미다졸린 화합물 11을 얻었다(4.22g, 43.0㎜ol, 수율 53％).

화합물 11의 분석 데이터는, Ye, G; Henry, W.P; Chen, C; Zhou, A.; PittmanJr., C.U. Tetrahedron Lett. 2009, 50, 2135-2139.에 나타내는 바와 같으며, 이하에 TLC로부터 구한 R_f값을 나타낸다.

R_f=0.42(헥산/n-프로필아민=10/3)

건조한 테트라히드로푸란(THF)(30.0mL)에 4-펜틴-1-올(4-pentyn-1-ol)(화합물 12)(1.53mL, 16.5㎜ol)을 녹이고, n-부틸리튬(n-BuLi)(n-헥산 13.6mL 중, 2.66M, 36.2㎜ol)을 -78℃에서 적하하고, 2시간 교반하였다. 그 후, 클로로트리 메틸실란(TMSCl)(4.80mL, 37.9㎜ol)을 -78℃에서 적하하고, 실온으로 데우고, 화합물 12가 완전히 없어질 때까지 10시간 교반하고, 반응을 진행시켰다. 1M 염산(5mL)을 첨가하여 반응을 멈추고, 디클로로메탄(CH₂Cl₂)으로 3회 추출하였다. 추출액을 브라인으로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축함으로써, 조생성물 알코올 화합물 13을 얻었다.

건조 디에틸에테르(32.1mL)와 아세토니트릴(22.5mL)에 화합물 13, 트리페닐포스핀(PPh₃)(7.58g, 28.9㎜ol), 이미다졸(2.08g, 30.5㎜ol)을 첨가하고, 교반하였다. 혼합물에 0℃에서 요오드(8.15g, 32.1㎜ol)를 첨가하고, 화합물 13이 완전히 반응할 때까지, 2시간 교반을 행하였다. 포화 피로황산나트륨 용액을 첨가하여 반응을 멈추고, 디에틸에테르로 3회 추출하였다. 추출액을 브라인으로 세정하고, 무수 황산나트륨으로 건조하고, 여과하고, 감압 하에서 농축함으로써, 조생성물을 얻었다. 조생성물을 실리카겔 크로마토그래피(펜탄)로 정제하여, 무색 유상의 요오드알킬 화합물 14를 얻었다(3.12g, 11.6㎜ol, 수율 71％).

화합물 14의 분석 데이터는, Braese, S.; Wertal, H.; Frank, D.; Vidovic, D.; de Meijere, A. Eur.J.Org.Chem. 2005, 4167-4178.에 나타내는 바와 같으며, 이하에 TLC로부터 구한 R_f값을 나타낸다.

R_f=0.24(펜탄)

화합물 14의 IR 데이터는 이하와 같다.

IR(순, cm^-1): 2958, 2898, 2176, 1426, 1250, 1221, 901, 842, 760, 698, 638

화합물 14의 ¹H NMR(400MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ3.29(t, 2H, J=6.8Hz), 2.36(t, 2H, J=6.8Hz), 2.00(tt, 2H, J=6.8, 6.8Hz), 0.15(s, 9H)

화합물 14의 ¹³C NMR(100MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ104.7, 85.7, 32.0, 20.8, 4.9, 0.1

화합물 14의 질량 분석의 결과는 이하와 같다.

HRMS(FAB⁺) C₈H₁₆SiI(M+H⁺)에 대한 계산값, 267.0066; 실측값, 267.0087.

건조한 테트라히드로푸란(THF)(1.8mL)과 디에틸에테르(2.7mL)에 이미다졸린 화합물 11(300mg, 3.06㎜ol)을 녹이고, n-부틸리튬(n-BuLi)(n-헥산, 2.76mL 중, 1.55M, 4.28㎜ol)을 -23℃에서 적하하고, 실온으로 데우고, 1시간 교반하였다. 그 후, 건조한 테트라히드로푸란(THF)(3mL)에 녹인 요오드알킬 화합물 14(901mg, 3.38㎜ol)를 캐뉼라를 통하여 교반한 혼합물에 0℃에서 첨가하였다. 실온으로 데우고, 화합물 11이 완전히 없어질 때까지 1시간 교반하고, 반응을 진행시켰다. 물을 첨가하여 반응을 멈추고, 트리클로로메탄(CHCl₃)으로 3회 추출하였다. 용매를 감압 하에서 제거하고, 실리카겔 크로마토그래피(헥산/n-프로필아민=5/1)로 정제하여, 황색 유상의 화합물 15를 얻었다(370mg, 1.57㎜ol, 수율 51％).

화합물 15의 IR 데이터는 이하와 같다.

IR(순, cm^-1): 2955, 2862, 2172, 1616, 1453, 1404, 1249, 843, 760, 640

화합물 15의 ¹H NMR(400MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ3.63(t, 2H, J=9.2Hz), 3.24(t, 2H, J=9.2Hz), 2.78(s, 3H), 2.26(t, 2H, J=7.2Hz), 2.21(t, 2H, J=7.6Hz), 1.79-1.67(m, 2H), 1.60(tt, 2H, J=7.2, 7.2Hz), 0.14(s, 9H)

화합물 15의 ¹³C NMR(100MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ167.9, 107.1, 84.6, 53.3, 51.9, 33.9, 28.4, 27.1, 25.4, 19.5, 0.1

화합물 15의 질량 분석의 결과는 이하와 같다.

HRMS(ESI⁺) C₁₂H₂₅N₂Si(M+H⁺)에 대한 계산값, 237.1782; 실측값, 237.1789.

디클로로메탄(3.19mL)에 이미다졸린 화합물 15(151mg, 639㎛ol)를 녹이고, 실온에서 트리플루오로메탄술폰산메틸(MeOTf)(145μL, 1.28㎜ol)을 첨가하고, 3시간 교반하였다. 감압 하에서 용매를 제거하여, 이미다졸륨염을 얻었다. 디메틸포름아미드(DMF)(3.0mL)에 그 염을 녹이고, 아미드 화합물 8(120mg, 776㎛ol), 황산구리·5수화물(CuSO₄·5H₂O)(31.9mg, 127㎛ol), 아스코르브산(45.0mg, 256㎛ol)을 첨가하여, 65℃에서 24시간 가열하였다. 감압 하에서 용매를 제거하여, 목적 화합물 16을 얻었다. 잔사를 ODS 실리카겔 크로마토그래피(메탄올/물=1/5→1/2)로 정제하고, 목적 분획에 물을 첨가하고, 디클로로메탄으로 3회 세정하였다. 수층 부분을 회수하고, 감압 하에서 농축하여, 아크릴아미드계 목적 화합물인 갈색 고체 화합물 16(143mg, 296㎛ol, 수율 46％)을 얻었다.

화합물 16의 IR 데이터는 이하와 같다.

IR(순, cm^-1): 3352, 2936, 1660, 1624, 1553, 1467, 1281, 1157, 1031, 638

화합물 16의 ¹H NMR(400MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ7.93(s, 1H), 7.43(brs, 1H), 6.32(d, 1H, J=9.2Hz), 6.30(d, 1H, J=2.8Hz), 5.60(dd, 1H, J=9.2, 2.8Hz), 4.44(t, 2H, J=6.4Hz), 3.95(s, 4H), 3.24(dt, 2H, J=6.4, 6.4Hz), 3.12(s, 6H), 2.83(t, 2H, J=6.4Hz), 2.55(t, 2H, J=8.0Hz), 2.20(tt, 2H, J=6.4, 6.4Hz), 1.85(tt, 2H, J=6.8, 6.8Hz)

화합물 16의 ¹³C NMR(100MHz, CDCl₃) 데이터는 이하와 같다.

δ168.4, 166.4, 146.1, 131.3, 125.8, 123.0, 49.9, 47.5, 36.0, 34.0, 29.8, 28.4, 24.6, 24.0, 23.9

화합물 16의 질량 분석의 결과는 이하와 같다.

HRMS(ESI⁺) C₁₇H₂₉N₆O(M⁺)에 대한 계산값, 333.2397; 실측값, 333.2387.

실시예 B-2: 신규 양이온성 중합 개시제와 동일한 양이온 구조를 가진 끈상 중합체의 합성

감열성 유닛인 N-이소프로필아크릴아미드(NIPAM), 양이온 단량체 유닛 화합물 16, 형광성 유닛인 N-(2-{[7-(N,N-디메틸아미노술포닐)-2,1,3-벤조티아디아졸-4-일]-(메틸)아미노}에틸)-N-메틸아크릴아미드(DBThD-AA), α,α'-아조비스이소부티로니트릴(AIBN)을 표 4의 양으로 디메틸포름아미드(DMF)(5ml)에 용해하고, 30분간 아르곤 가스를 통과시킴으로써 용존 산소를 제거하였다. 그 후, 60℃에서 8시간 반응시키고, 실온으로 식혔다. 이 용액을, 디에틸에테르(100ml)에 교반하면서 주입하였다. 얻어진 결정을 여과 취출하고, 감압 건조시킨 후, 이어서 메탄올(MeOH)(1mL)에 녹여서 재침전을 행한 후, 순수에 녹이고, 직경 28.6㎜의 비스킹 튜브(투석용 셀룰로오스 튜브)를 사용하고, 투석 외액을 1000ml로 하여, 충분히 투석을 행하고, 정제를 행하였다. 정제품을 동결 건조하여, 표제의 공중합체 Lin40과 Lin41을 담황색 분말로서 얻었다. 수율은 표 4에 나타내었다.

Lin40과 Lin41에 대하여 공중합체의 특성을 평가한 결과를 표 5에 나타내었다. 또한 NMR에 의해 산출한 NIPAM:양이온 단량체 유닛(화합물 16):DBThD-AA의 비는, 이 순서로

Lin40 94.5:5.48:1.43

Lin41 93.0:7.03:1.43

이었다. 또한, 제타 전위 측정은 0.5w/v％ 수용액을 사용하여, 20℃에서 행하였다.

실시예 B-3: Lin40, Lin41의 온도 응답성 시험

Lin40, Lin41에 150mM 염화칼륨(KCl) 수용액 중에서의 온도 응답성 시험을 이하의 수순으로 행하였다. JASCO FP-6500분광 형광 광도계를 사용하고, 용매로서, Millipore사의 Milli-Q reagent system으로부터 얻은 초순수를 사용하여, 와코준야쿠로부터 구입한 염화칼륨(KCl)을 150mM의 농도가 되도록 녹인 것을 사용하였다. 당 실험에 있어서의 화합물의 초기 농도는 0.005w/v％로 하고, 여기 파장은 450㎚로 하였다. 용액의 온도 제어에는 JASCO ETC-273T 수냉 펠티에식 항온 셀 홀더를 사용하고, 부속의 열전대에 의해 온도를 측정하였다. 용액 온도를 1℃씩 상승시키고, 각 온도에서의 450 내지 850㎚의 형광 스펙트럼을 측정하였다.

Lin40 및 Lin41에 569㎚ 및 571㎚의 형광 강도 변화를 플롯한 예를 도 4에 도시한다. 이 결과로부터, 새롭게 합성한 양이온성 유닛(화합물 16)을 사용해도, 온도에 응답하는 프로브를 합성할 수 있음을 알았다. 또한, 양이온성 유닛 비율을 높이면, 온도 변화에 대한 형광 강도의 상승도는 작아짐을 알았다.

실시예 B-4: 각종 온도 감수성 프로브의 합성

NN-AP4(끈상의 아크릴아미드형 고분자)의 합성은, 문헌 A(PloS One 2015년, 제10(2)권) 중의 AP4-FPT에 기재된 방법에 따라 행하였다. 음이온 겔 k40의 합성은, 문헌 B(Chemistry A European Journal 2012년, 제18권, 제9552 -9563 페이지) 중의 DBThD nanogel에 기재된 방법에 따라 행하였다.

실시예 5: 동물 세포(접착 세포)로의 온도 프로브의 도입

인간 자궁경부암 유래 HeLa 세포를 DMEM 배지(10％ FBS, 1％ 페니실린(penicillin)-스트렙토마이신(streptomycin))가 들어간, 플라스틱 보텀 디쉬(ibidi사)에 파종하여, 배양하였다. 1일 후, 배지를 5％ 글루코오스 수용액으로 치환하고, EF043, NN-AP4, Lin40, Lin41, k40을 각각 최종 농도 0.05％가 되도록 첨가하여, 37℃에서 10분 정치하였다. 그 후, 프로브를 제거하고, 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 세정 후, 페놀레드 프리(phenolred-free)의 DMEM 배지로 치환하고, 현미경 관찰을 행하였다. 현미경 관찰은, 공초점 레이저 현미경(FV1000, Olympus), 40배 대물 렌즈(Uplan Apo40x NA0.85, Olympus)를 사용하여 관찰하였다.

세포에 473㎚의 레이저(Multi Ar 레이저)로 조사하고, 500 내지 600㎚의 형광 화상을 취득하였다.

세포를 촬영한 결과 예를 도 5에 도시한다. 또한, 얻어진 현미경 사진을 사용하여, 백그라운드로서 세포가 없는 어떤 영역의 형광 강도를 차감하는 화상 처리를 행하고, 미처리의 세포가 갖는 자가 형광 이상으로 형광 시그널이 관찰된 세포에 대하여 카운트함으로써 세포에 대한 프로브의 도입률을 산출하였다. 결과를 표 6에 나타내었다. 종래의 중합 개시제를 사용하여 만들어진 표면이 음전하를 띤 온도 프로브 k40에서는 도입이 거의 보이지 않았지만, 신규 양이온성 중합 개시제를 사용하여 합성한 겔형 온도 프로브 EF043을 비롯하여, 양이온성을 띤 프로브는 세포 내로의 도입을 확인할 수 있었다. 또한 Lin41은 세포막으로의 국재가 인정되며, 세포 내로의 도입량이 많지 않았다.

실시예 6: 프로브의 독성 평가

실시예 5와 같이 하여, HeLa 세포에 EF043, NN-AP4, Lin40, Lin41을 도입하고, 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 세정 후, 페놀레드 프리(phenolred-free)의 DMEM 배지로 치환하였다. 그 후, 비막투과성의 형광 시약인 요오드화프로피디움(PI)을 최종 농도 0.67㎍/ml가 되도록 배지 중에 첨가하고, 37℃에서 30분간 처리한 후, 현미경으로 관찰을 행하였다. 형광 프로브는 473㎚의 레이저로 여기하고, 요오드화프로피디움(PI)은 559㎚의 레이저로 여기하고, 각각 490 내지 550㎚, 655 내지 755㎚의 형광 파장에서 관찰을 행하였다. 또한, 관찰 시의 카메라의 광 증배관 감도나 레이저 강도는, 메탄올로 처리한 세포를 사멸한 세포의 컨트롤로서 사용하여 조정을 행하였다.

현미경 하에서 온도 프로브의 형광이 관찰된 세포를 약 100세포 선택하고, 요오드화프로피디움(PI)의 형광이 관찰된 세포를 사멸 세포로 하여 수를 카운트하고, 100분율을 산출하였다. 그 결과, 표 7과 같은 결과가 되었다. EF043, Lin40, NN-AP4에 대해서는, 요오드화프로피디움(PI)에 의한 세포독성은 거의 보이지 않았지만, Lin41에 대해서는 세포막 투과성이 향상되고, 세포독성이 있음을 알았다. 즉, 끈상 고분자인 온도 프로브를 사용한 경우에, 양이온성 유닛의 도입량을 많게 하면, 세포독성이 발생하는 것이 명확해졌다.

실시예 7: 온도 프로브의 구조에 의한 세포 분열에 미치는 영향의 조사

인간 자궁경부암 유래 HeLa 세포를 DMEM 배지(10％ FBS, 1％ penicillin-streptomycin), 그리드 구비 플라스틱 보텀 디쉬 μ-Dish 35㎜ grid-500(ibidi사)에 파종, 배양하였다. 1일 후, 실시예 5와 같이 EF043, NN-AP4, Lin40의 3개의 프로브를 도입하고, 페놀레드 프리(phenolred-free)의 DMEM 배지로 치환하고, 현미경 관찰을 행하였다. 현미경 관찰은, 공초점 레이저 현미경(FV1000, Olympus), 40배 대물 렌즈(Uplan Apo40x NA0.85, Olympus)를 사용하여 관찰하였다. 세포에 473㎚의 레이저(Multi Ar 레이저)로 조사하고, 500 내지 600㎚의 형광 화상을 취득했다

특정한 그리드 내에 포함되는 세포 중, 형광 프로브가 도입되어 있는 세포를 실시예 5의 방법에 따라서 카운트하고, 37℃, 5％ CO₂에서 배양 하, 24 시간 후의 형광 프로브가 도입되어 있는 세포를 다시 카운트함으로써, 24 시간 후의 세포 증식률을 산출하였다.

결과를 도 6에 나타내었다. 또한, 미처리의 대조(Ctrl)에서는, 프로브가 도입되어 있지 않은 세포를 모두 카운트하였다. 그 결과, 양이온성 겔인 EF043은 대조(Ctrl)와 비교하여, 세포 증식률이 거의 바뀌지 않고, 끈상의 온도 프로브인 NN-AP4나 Lin40은 세포 증식을 저해하고 있음을 알았다. 이 저해 효과는 포함되는 양이온성 유닛의 구조 차이(NN-AP4에서는 4급 암모늄 골격, Lin40에서는, 1,3-디메틸-4,5-디히드로-1H-이미다졸-3-이움 골격)에 의존하지 않는다. 또한, EF043과 Lin40은 양이온성 분자의 구조가 동일하기 때문에, 양이온성 구조에 의한 세포 증식 저해 효과보다도 고분자의 구조가 끈상일 경우(Lin40)에 세포 분열에 미치는 저해 효과가 크고, 겔상일 경우(EF043)에는 저해 효과가 거의 없는 것을 알았다. 또한 프로브가 도입되어 있는 세포가 배양에 의해 증가했기 때문에, 프로브가 분열에 따라 양 세포로 분배되어 있는 것이 명확해졌다.

실시예 8: 갈색 지방 세포에의 분화에 미치는 영향의 조사

안락사한 래트(Wistar, 숫컷, 3주령)로부터 갈색 지방 조직을 채취하여, 가위로 세밀하게 자르고, 콜라게나아제 용액에 부유시켜서 교반기로 진탕하면서 30분, 37℃에서 인큐베이트하였다. 100㎛ 셀 스트레이너로 미소화 조직편을 제거하여, 여과액을 원심 분리하고(400g, 실온, 5분), 얻어진 펠릿을 HBSS(-)에 현탁하고, 원심하여 세정하였다. 용혈 버퍼에 현탁하고, 실온에서 10분 둔 뒤, HBSS(-)를 첨가하여 원심 분리하고, 펠릿을 증식 배지(표 8)에 현탁하고, 40㎛ 셀 스트레이너에 통과시킨 것을 SVF 현탁액으로 하였다. SVF 현탁액을 콜라겐 코팅된 글래스 보텀 디쉬에 파종하여, 37℃에서 배양하였다. 18시간 후에 배지를 제거하여 HBSS(-)로 2회 세정하고, 미접착 세포를 제거하고, 다시 증식 배지를 첨가하여 4일간 배양(37℃, 5％ CO₂)하였다. 분화 배지(표 8)로 치환하여 48시간 배양(37℃, 5％ CO₂)한 후, 온도 감수성 프로브 EF043을 세포에 도입하였다. 도입은, 세포를 5％ 글루코오스로 세정하고, 5％ 글루코오스 중에서 최종 농도 0.05w/v％가 되도록 EF043을 세포에 첨가하여, 37℃, 15분 인큐베이트하였다. 그 후, HBSS로 2회 세정을 행하고, 현미경 관찰을 행하였다. 이어서 EF043을 도입한 세포를 지방적의 유도를 촉진시키는 유지 배지(표 8)로 치환하고, 3일간 배양한(37℃, 5％ CO₂) 후에, 현미경 관찰을 행하였다. 현미경 관찰은, 공초점 레이저 현미경(FV1000, Olympus)에 의해, 40배 대물 렌즈(Uplan Apo40x NA0.85, Olympus)를 사용하여 관찰하였다. 세포에 473㎚의 레이저(Multi Ar 레이저)를 조사하고, 500 내지 600㎚의 형광 화상을 취득하였다.

결과를 도 7에 나타내었다. 도 7 좌측에 나타낸 바와 같이, 분화 배지에서 배양 후의 세포 내에 온도 프로브의 형광이 보이고, 프로브가 자발적으로 세포 내에 도입됨을 알았다. 또한 그 세포를 유지 배지에서 배양하고, 지방적의 형성을 촉진하면, 도 7 우측과 같이, 프로브의 형광이 세포 내에 확인할 수 있으며, 또한 갈색 지방 세포에 특징적인 다포성의 지방적이 보였다. 이 결과로부터, 양이온성 겔형 온도 프로브 EF043은 세포의 분화를 저해하지 않고, 세포 내에 유지됨을 알았다.

실시예 9: 배양 세포(부유 세포)에 대한 EF043의 형광 강도 응답

MOLT-4(인간 급성 림프 아구성 백혈병(T-세포))를 RPMI1640 배지(10％ FBS)를 사용하여, 100㎜ 디쉬에서 배양했다(파종 1×10⁴세포/ml). 2일 후, 배양액 3ml을 원심 분리(300g, 2분)하여 배지를 제거하고, 5％ 글루코오스로 세정 후, 다시 5％ 글루코오스 1ml에 현탁하고, EF043, NN-AP4, Lin40을 각각 최종 농도 0.05％가 되도록 첨가하였다. 37℃, 10분 후, 원심 분리(300g, 2분)하여 상청을 제거하고, 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 세정 후, 인산 완충 생리 식염수(PBS)에 재 현탁하고, 비막투과성의 형광 시약인 요오드화프로피디움(PI)을 최종 농도 0.67㎍/ml가 되도록 인산 완충 생리 식염수(PBS) 중에 첨가하고, 37℃에서 30분간 처리한 후, 현미경으로 관찰을 행하였다. 형광 프로브는 473㎚의 레이저로 여기하고, 요오드화프로피디움(PI)은 559㎚의 레이저로 여기하고, 각각 490 내지 550㎚, 655 내지 755㎚의 형광 파장에서 관찰을 행하였다. 프로브가 도입되어 있는지의 확인을 현미경 관찰로 행하였다. 공초점 레이저 현미경(FV1000, Olympus), 40배 대물 렌즈(UplanSApo, Olympus)를 사용하여 관찰하고, 세포에 473㎚의 레이저(Multi Ar 레이저)를 쏘고, 500㎚부터 600㎚까지의 형광 파장에 대한 형광상을 관찰하였다.

또한, 프로브 EF043이 도입된 MOLT-4 세포(요오드화프로피디움(PI)으로 처리되어 있지 않음)를 인산 완충 생리 식염수(PBS)에 현탁한 상태에서 큐벳트에 넣고, 또한 큐벳트 내에 2㎜ 직경의 구상 교반자를 넣었다. 큐벳트를 JASCO FP-6500 분광 형광 광도계에 세트하고, 약 800rpm의 속도로 회전시켜, 세포가 가라앉는 것을 방지하면서, 형광 스펙트럼을 측정하였다. 여기 파장은 440㎚로 하였다. 용액의 온도 제어에는 JASCO ETC-273T 수냉 펠티에식 항온 셀 홀더를 사용하고, 부속의 열전대에 의해 온도를 측정하였다. 용액 온도를 2℃씩 상승시키고, 세포 내부의 온도와 외부의 온도를 일정하게 하도록 온도 상승 후 2분 정치하고, 각 온도에서의 형광 강도를 측정하였다.

세포로의 프로브의 도입률에 대해서는, 얻어진 현미경 사진을 사용하여, 백그라운드로서 세포가 없는 어떤 영역의 형광 강도를 차감하는 화상 처리를 행하고, 미처리의 세포가 갖는 자가 형광 이상으로 형광 시그널이 관찰된 세포에 대하여 카운트함으로써 산출하였다. 또한, 세포막의 투과성을 나타내는 요오드화프로피디움(PI) 독성에 대해서는, 현미경 하에서 온도 프로브의 형광이 관찰된 세포를 약 50-200세포 선택하고, 요오드화프로피디움(PI)의 형광이 관찰된 세포를 사멸 세포로 하여 수를 카운트하였다.

프로브 도입률, 및 요오드화프로피디움(PI) 독성의 결과를 표 9에, 온도 응답성의 결과를 도 8에 나타내었다. EF043은 MOLT-4 세포에서도 섞는 것만으로 세포 내로 이행하는 것이 현미경의 결과로부터 명확해졌다. 또한 요오드화프로피디움(PI) 독성에 대해서도, 사용한 프로브 간에 차이가 없고, 전체적으로 큰 독성은 보이지 않았다.

또한, 세포 내의 EF043은, 외부의 온도 변화에 예민하게 반응하고, 형광 강도(형광 파장 570㎚)를 상승시켰다(도 8). 일반적인 포유류 세포의 생육 온도인 25 내지 40℃의 폭넓은 온도 영역에서 세포 내 온도를 계측할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 10: 형광 수명 변화의 감열 응답 시험

실시예 9에서 제작한 프로브 EF043이 도입된 MOLT-4 세포 현탁액을 사용하여, 형광 수명 변화의 감열성 응답 시험을 행하였다. FluoroCube 3000U(Horiba Jobin Yvon) 시간 상관 단일 광자 계수법 형광 수명 측정 장치를 사용하고, 여기 파장은 405㎚로 하였다. 용액의 여기에는, LED(NanoLED-456, Horiba)를 사용하여, 펄스 반복수 1MHz로 측정을 행하였다. 용액의 온도 제어에는 JASCO ETC-273T 수냉 펠티에식 항온 셀 홀더를 사용하고, 부속의 온도계에 의해 셀 홀더 내의 온도를 측정하였다. 측정 전에 열전대에 의해 용액의 온도가 안정된 것을 확인한 후, 각 온도에서의 형광 수명을 형광 파장 580㎚±8㎚으로 하여 측정하였다. 얻어진 형광 감쇠 곡선을 이하에 나타내는 식에 의해 근사하고, 2성분의 형광 수명을 얻었다.

얻어진 형광 수명으로부터, 이하에 나타내는 식을 사용하여 각 온도에서의 평균 형광 수명을 산출하였다.

시험 결과를 도 9에 나타내었다. 고온이 됨에 따라서 평균 형광 수명이 연장되고, 온도의 변화에 예민하게 반응하여 평균 형광 수명이 변화하는 것이 확인되었다.

실시예 11: 온도 분해능의 평가

실시예 10의 결과, 온도(T)를 횡축에 형광 수명(τ)을 종축에 취한 경우를 상정한다. ∂을 미소량, δ을 오차로 한 경우, 다음과 같은 관계가 성립된다.

즉 몇℃의 온도차를 검출할 수 있을지를 나타내는 온도 분해능 δT는,

로 나타낸다. 여기서, ∂이 미소량을 나타내기 때문에,

는 온도(T)를 횡축에 형광 수명(τ)을 종축에 취한 그래프의 곡선의 접선 기울기를 나타내고 있다. δ는 오차를 나타내고 있으므로, δτ는 형광 수명의 오차이다. 여기에서는 표준 편차를 오차값으로서 사용하였다.

즉, (온도 분해능)=(온도(T)를 횡축에 형광 수명(τ)을 종축에 취한 그래프의 곡선의 접선 기울기의 역수)×(형광 수명의 오차)로서 산출할 수 있다.

실시예 10의 결과인 도 9에 대하여 온도 분해능을 평가한 결과, 도 10과 같이 되었다. EF043에 대해서는, 0.2℃ 정도의 온도 분해능이 있고, 매우 정량성이 높음을 알았다.

실시예 12: PEG계 겔을 사용한 세포에의 응용

인간 유래 태아 신장 세포 HEK293T를 DMEM 배지(10％ FBS, 1％ penicillin-streptomycin), 35㎜ 글래스 보텀 디쉬에서 배양했다(파종 1×10³세포/㎠). 1일 후, 배지를 5％ 글루코오스로 치환하고, 형광 색소의 최종 농도를 맞추도록 하고, 화합물 3G 및 플루오레세인(1㎍/ml), 또는 화합물 3G 및 로다민 B(0.5㎍/ml)를 첨가하여, 37℃에서 15분 정치하였다. 그 후, 프로브 및 형광 색소를 제거하고, 인산 완충 생리 식염수(PBS)로 세정 후, 페놀레드 프리(phenolred-free)의 DMEM 배지로 치환하여, 현미경 관찰을 행하였다. 현미경 관찰은, 공초점 레이저 현미경(FV1000, Olympus)을 사용하여 관찰하였다. 플루오레세인은 473㎚의 레이저(Multi Ar 레이저)로, 로다민 B는 559㎚의 레이저로 여기하고, 관찰을 행하였다. 취득한 상으로부터 20개 정도의 세포를 선택하고, 세포 내의 평균 시그널을 산출하여, 비교를 행하였다.

결과를 도 11에 도시한다. 형광 색소를 양이온성의 겔에 포매시킨 경우 쪽이, 형광 색소 단독의 경우보다도 세포에 도입되는 양이 많은 것을 알았다. 이 현상은 분자로서 마이너스 전하를 띠고 있는 플루오레세인과 분자로서 플러스 전하를 띠고 있는 로다민 B의 양쪽에서 보였기 때문에, 포매하는 분자의 성질에 별로 영향을 받지 않고 세포 내로의 도입을 촉진하고 있는 것이 시사되었다. 달리 말하자면, 금회의 양이온성 겔은, 저분자를 비롯한 분자의, 세포 내 딜리버리 기술로서도 이용할 수 있음을 알았다.

Claims

하기 일반식 (I)로 표시되는 화학 구조를 갖는 양이온성 중합 개시제와, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 단량체와, 가교제에 의한 라디칼 중합 반응을 행하는 것을 포함하는, 겔 입자의 제조 방법.

(I)
[식 중,
Y는, 단결합 또는 CR⁸⁵를 나타내고,
Z는, 단결합 또는 CR⁸⁶을 나타내고,
R⁷², R⁷³, R⁷⁵, R⁷⁶, R⁷⁷, R⁷⁸, R⁸⁵ 및 R⁸⁶은, 각각 독립적으로 수소 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬카르보닐, 페닐 및 히드록시로 이루어지는 군으로부터 선택되며, 여기서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬카르보닐 및 페닐은, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬카르보닐, 페닐 및 히드록시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 또는 2개의 치환기로 치환되어 있어도 되고,
R⁷² 및 R⁷³은, 각각 독립적으로 아다만틸, 또는 Si(OCH₃)₂(CH₃)로 치환된 C_1-6 알킬을 나타내도 되거나, 또는
R⁷⁵ 및 R⁷⁶, 또는 R⁷⁷ 및 R⁷⁸은, 일체로 되어 -(CH₂)_3-5-를 형성해도 되고,
R⁸¹, R⁸², R⁸³, 및 R⁸⁴는, C_1-4 알킬, C_1-4 알킬카르보닐, 및 C_1-3 알콕시로 이루어지는 군으로부터 선택되는 치환기이며, 여기서 상기 C_1-4 알킬은 1개의 C_1-3 알콕시기로 치환되어 있어도 되고,
R⁷¹ 및 R⁷⁴는, 각각 독립적으로 C_1-3 알킬이고,
X_f ^-은 카운터 음이온임]
제1항에 있어서, 상기 Y 및 Z가 단결합을 나타내는 방법.
제1항에 있어서, 상기 R⁸¹, R⁸², R⁸³, 및 R⁸⁴가, 각각 독립적으로 메틸, 에틸, 메틸 카르보닐, 이소부틸, 및 2-메틸-2-메톡시프로필로 이루어지는 군으로부터 선택되는 방법.
제1항에 있어서, 상기 R⁷¹ 및 R⁷⁴가 메틸인 방법.
제1항에 있어서, 상기 R⁷² 및 R⁷³, 상기 R⁷⁵ 및 R⁷⁷, 상기 R⁷⁶ 및 R⁷⁸, 상기 R⁸¹ 및 R⁸⁴, 상기 R⁸² 및 R⁸³, 및 상기 R⁷¹ 및 R⁷⁴가, 각각 동일한 치환기를 나타내고, 상기 Y 및 Z가, 동일한 치환기 또는 함께 단결합을 나타내는 방법.
제1항에 있어서, 상기 R⁷¹, R⁷², R⁷³, R⁷⁴, R⁸¹, R⁸², R⁸³, 및 R⁸⁴가 메틸이고, 상기 R⁷⁵, R⁷⁶, R⁷⁷, 및 R⁷⁸이 수소 원자이고, 상기 Y 및 Z가 단결합인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어지는 겔 입자.
하기 일반식 (I)로 표시되는 화학 구조를 갖는 양이온성 중합 개시제와, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 단량체를 사용하여 라디칼 중합 반응을 행하는 것을 포함하는, 적어도 한쪽 말단이 양성 하전을 띤 끈상 중합체의 제조 방법.

(I)
[식 중, Y, Z, R⁷², R⁷³, R⁷⁵, R⁷⁶, R⁷⁷, R⁷⁸, R⁸¹, R⁸², R⁸³, R⁸⁴, R⁷¹, R⁷⁴, 및 X_f ^-은 제1항에 정의한 바와 같음]
제8항의 방법에 의해 얻어지는, 적어도 한쪽 말단이 양성 하전을 띤 끈상 중합체.
주쇄의 적어도 한쪽 말단에 하기 식 (I')로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와, 이것에 이어지는, 탄소-탄소 이중 결합을 포함하는 단량체에서 유래하는 반복 구조를 포함하는, 적어도 한쪽 말단이 양성 하전을 띤 끈상 중합체.

(I')
[식 중, Y, R⁷², R⁷⁵, R⁷⁶, R⁸¹, R⁸², 및 R⁷¹은 제1항에 정의한 바와 같음]
주쇄의 적어도 한쪽 말단에 하기 식 (I')로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와,
이것에 이어지는, 하기 식 (a) 및 하기 식 (b)로 표시되는 단량체 각각에서 유래하는 반복 구조와,
가교제에서 유래하는 가교 구조
를 포함하는 공중합체.

(I')
[식 중, Y, R⁷², R⁷⁵, R⁷⁶, R⁸¹, R⁸², 및 R⁷¹은 제1항에 정의한 바와 같음]

[식 중,
R¹은, 수소 원자 및 C_1-3 알킬로부터 선택되고;
R⁴ 및 R⁵는, 독립적으로 수소 원자 및 C_1-20 알킬로부터 선택되며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, C_1-6 알콕시, 및 아릴로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되거나, 또는
R⁴ 및 R⁵는 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 4 내지 8원 질소 함유 헤테로환을 형성하며, 여기서 당해 헤테로환은, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 니트로, 할로겐 원자, C_1-10 알킬카르보닐아미노 및 아릴카르보닐아미노로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨]

[식 중,
R³은, 수소 원자 및 C_1-3 알킬로부터 선택되고;
X²는, O, S, 또는 N-R¹²이고;
X³은, 직접 결합, O, S, SO, SO₂, N(-R¹³), CON(-R¹⁶), N(-R¹⁶)CO, N(-R¹⁷)CON(-R¹⁸), SO₂N(-R¹⁹) 또는 N(-R¹⁹)SO₂이고;
Q²는, C_1-20 알킬렌, C_3-20 알케닐렌, 및 C_3-20 알키닐렌으로부터 선택되며, 여기서 상기 알킬렌은, 1 이상의 개소에서, O, S 또는 페닐렌이 독립적으로 삽입되어 있어도 되고;
Ar은, 6 내지 18원 방향족 탄소환기, 또는 5 내지 18원 방향족 헤테로환기로부터 선택되며, 여기서 당해 방향족 탄소환기 및 방향족 헤테로환기는, 포함되는 환의 하나 이상이 방향족환인 축합환을 포함하고 있어도 되고, 당해 방향족 탄소환기 및 방향족 헤테로환기에 환 원자로서 존재하는 -CH₂-은 -C(O)-로 치환되어 있어도 되고, 또한 당해 방향족 탄소환기 및 방향족 헤테로환기는, 할로겐 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, 니트로, 시아노, C_1-6 알킬카르보닐, C_1-6 알콕시카르보닐, 카르복시, 포르밀, -NR⁶R⁷, 및 -SO₂NR¹⁴R¹⁵로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고(여기서 상기 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, C_1-6 알킬술포닐, C_1-6 알킬카르보닐 및 C_1-6 알콕시카르보닐에 포함되는 알킬은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 디(C_1-6 알킬)아미노, 아릴, 및 카르복시로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨);
R⁶ 및 R⁷은, 독립적으로 수소 원자, C_1-10 알킬, 아릴, C_1-10 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, C_1-10 알킬술포닐, 아릴술포닐, 카르바모일, N-(C_1-10 알킬)카르바모일, 및 N,N-디(C_1-10 알킬)카르바모일로부터 선택되며, 여기서 상기 C_1-10 알킬, C_1-10 알킬카르보닐, C_1-10 알킬술포닐, N-(C_1-10 알킬)카르바모일, 및 N,N-디(C_1-10 알킬)카르바모일에 포함되는 알킬은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, C_1-6 알킬아미노, 디(C_1-6 알킬)아미노, 아릴, 및 카르복시로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고, 또한 상기 아릴, 아릴카르보닐, 및 아릴술포닐에 포함되는 아릴은, 할로겐 원자, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 및 카르복시로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되거나; 또는
R⁶ 및 R⁷은 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 4 내지 8원 질소 함유 헤테로환을 형성하며, 여기서 당해 헤테로환은, C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 니트로, 할로겐 원자, C_1-10 알킬카르보닐아미노 및 아릴카르보닐아미노로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고;
R¹²는, 수소 원자, C_1-6 알킬, 또는 -Q²-X³-Ar이며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, 및 C_1-6 알킬술포닐로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고;
R¹³은, 수소 원자, 또는 C_1-6 알킬이며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, 및 C_1-6 알킬술포닐로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 되고;
R¹⁴ 및 R¹⁵는, 독립적으로 수소 원자, 및 C_1-6 알킬로부터 선택되거나; 또는 R¹⁴ 및 R¹⁵는 그들이 결합하는 질소 원자와 일체로 되어, 4 내지 8원 질소 함유 헤테로환을 형성하고;
R¹⁶, R¹⁷, R¹⁸, 및 R¹⁹는, 독립적으로 수소 원자, 및 C_1-6 알킬로부터 선택되며, 여기서 당해 알킬은, 히드록시, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, C_1-6 알킬티오, C_1-6 알킬술피닐, 및 C_1-6 알킬술포닐로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨]
하기 식 (I'), 하기 식 (A) 및 하기 식 (B)로 표시되는 반복 단위와, 가교제에서 유래하는 가교 구조를 포함하는 공중합체.

(I')
[식 중, Y, R⁷², R⁷⁵, R⁷⁶, R⁸¹, R⁸², 및 R⁷¹은 제11항에 정의한 바와 같음]

(A)
[식 중, R¹, R⁴, 및 R⁵는 제11항에 정의한 바와 같음]

(B)
[식 중, R³, X², X³, Q², 및 Ar은 제11항에 정의한 바와 같음]
주쇄의 적어도 한쪽 말단에 하기 식 (I')로 표시되는 양이온성 중합 개시제에서 유래하는 구조와,
이것에 이어지는, 하기 식 (a)로 표시되는 단량체, 하기 식 (b)로 표시되는 단량체 및 하기 식 (c)로 표시되는 단량체 각각에서 유래하는 반복 구조와,
가교제에서 유래하는 가교 구조
를 포함하는 공중합체.

(I')
[식 중, Y, R⁷², R⁷⁵, R⁷⁶, R⁸¹, R⁸², 및 R⁷¹은 제11항에 정의한 바와 같음]

[식 중, R¹, R⁴, 및 R⁵는 제11항에 정의한 바와 같음]

[식 중, R³, X², X³, Q², 및 Ar은 제11항에 정의한 바와 같음]

[식 중,
R⁵⁵는, 수소 원자 및 C_1-3 알킬로부터 선택되고;
R⁵¹, R⁵², R⁵³, 및 R⁵⁴는, 독립적으로 수소 원자 및 C_1-6 알킬로부터 선택되고;
X⁴는, 직접 결합, 페닐렌, -Q⁴-O-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임), 또는 -Q⁴-N(-R⁶¹)-C(=O)-(여기서, 보론디피로메텐 골격에 직접 결합하는 것은 Q⁴임)이고;
R⁶¹은, 수소 원자 및 C_1-6 알킬로부터 선택되고;
Q⁴는, C_1-20 알킬렌, 페닐렌, 및 나프틸렌으로부터 선택되며, 여기서, 당해 페닐렌 및 나프틸렌은, 할로겐 원자, C_1-6 알콕시, 히드록시, 아미노, 및 카르복시로부터 선택되는 1개 이상의 치환기로 치환되어 있어도 됨]
하기 식 (I'), 하기 식 (A), 하기 식 (B) 및 하기 식 (C)로 표시되는 반복 단위와, 가교제에서 유래하는 가교 구조를 포함하는 공중합체.

(I')
[식 중, Y, R⁷², R⁷⁵, R⁷⁶, R⁸¹, R⁸², 및 R⁷¹은 제13항에 정의한 바와 같음]

(A)
[식 중, R¹, R⁴, 및 R⁵는 제13항에 정의한 바와 같음]

(B)
[식 중, R³, X², X³, Q², 및 Ar은 제13항에 정의한 바와 같음]

(C)
[식 중, R⁵⁵, R⁵¹, R⁵², R⁵³, R⁵⁴, 및 X⁴는 제13항에 정의한 바와 같음]
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 공중합체를 포함하는 온도 감수성 프로브.
(a) 제15항에 따른 온도 감수성 프로브를 세포 내에 도입하는 공정; 및
(b) 여기광 조사 하, 형광 강도 또는 형광 수명을 측정하는 공정
을 포함하는, 세포 내의 온도를 측정하는 방법.
제11항 내지 제14항 중 어느 한 항의 공중합체, 또는 상기 공중합체를 포함하는 온도 감수성 프로브를 포함하는, 세포 내의 온도를 측정하기 위한 키트.