WO2013094748A1 - 細胞内に導入するための温度感受性蛍光プローブ - Google Patents

細胞内に導入するための温度感受性蛍光プローブ Download PDF

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WO2013094748A1
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俊一 辻
聖一 内山
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Definitions

  • the present invention relates to a novel fluorescent polymer and a simple method for measuring intracellular temperature using the polymer.
  • Non-patent Document 3 Photochem. Photobiol. 1995, Vol. 62, pp. 416-425.
  • Non-Patent Document 4 J. Phys.D: Appl.Phys.2004, 37, 2938-2943;
  • Non-patent Document 5 Anal.Chem.
  • Non-Patent Document 6 Appl.Phys.Lett.2005, 87, 20112;
  • Non-patent Document 7 Biophys.J.1998, 74, 82-89
  • a highly functional molecular temperature sensor with a single molecule has been developed, and its application to cells has begun to be studied.
  • Non-Patent Document 8 Anal. Chem. 2003, Vol. 75, pages 5926-5935.
  • This fluorescent temperature sensor has the property that the fluorescence intensity increases with increasing temperature in an aqueous solution due to the heat-induced phase transition of polyacrylamide, which is the main chain. Therefore, by measuring the fluorescence intensity, Changes in temperature can be observed.
  • Non-Patent Document 9 J. Mater). Chem. 2005, 15, 2796-2800; Non-Patent Document 10: J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 2766-2767). Furthermore, it has been reported that by incorporating an ionic functional group into a polymer, aggregation can be prevented and a measurement temperature range can be widened (Patent Document 1: International Publication No. 2008/029770 pamphlet). ).
  • Non-Patent Document 11 Anal. Chem. 2004, Vol. 76, pp. 1793 to 1798
  • microorganisms and plant cells that cannot use the microinjection method have a very big problem that these polymers cannot be used.
  • the temperature range can be changed by changing the acrylamide molecule in the solution, but it is possible that the sensor interacts with various molecules such as proteins, nucleic acids and lipids in the cell. I don't know if the temperature range can be changed freely by changing the molecule, and if you use multiple acrylamide molecules in a single sensor, it is totally unpredictable how the sensor will respond in the cell. However, there is a problem that it is not known whether a sensor in the temperature region that actually measures the inside of a cell can be made freely.
  • the present inventors have conducted extensive research to solve the above problems, and can be applied to many cells such as microorganisms such as yeast, animal cells, and plant cells by introducing cationic units into the polymer.
  • the present inventors have found that it can be used as a highly practical intracellular fluorescent temperature sensor that does not require advanced techniques such as microinjection.
  • it has been found that by calculating the temperature from the ratio of the fluorescence intensities at a plurality of wavelengths obtained using the introduced polymer, the temperature in the cell or in the micro space can be measured more generally and accurately.
  • the temperature in the cell or in the minute space can be measured well by using the fluorescence lifetime as an index.
  • the present invention is based on these findings.
  • a method for introducing a temperature-sensitive probe comprising a copolymer containing a thermosensitive unit and a fluorescent unit into a cell the method comprising a cationic unit. And using the copolymer further as a temperature sensitive probe and mixing the copolymer with cells in a solvent.
  • a method for measuring a temperature in a cell comprising (a) introducing a temperature sensitive probe into the cell according to the method according to the first aspect of the present invention, and (B) including a step of measuring fluorescence intensity or fluorescence lifetime under excitation light irradiation.
  • a method for measuring an intracellular temperature comprising (a) a temperature sensitive probe comprising a copolymer comprising a thermosensitive unit and a fluorescent unit. The step of introducing into a cell, and (b) the step of measuring fluorescence intensity or fluorescence lifetime under excitation light irradiation, wherein the copolymer comprises two or more types of thermosensitive units.
  • a method for measuring temperature using a temperature sensitive probe comprising a copolymer comprising a thermosensitive unit and a fluorescent unit, the method comprising (a) said Dissolving a temperature sensitive probe, (b) measuring fluorescence intensity under excitation light irradiation, and (c) calculating a ratio of fluorescence intensity in two wavelength regions.
  • kits for measuring temperature using the method according to the first to third aspects of the present invention comprising a temperature sensitive probe used in the method. Comprising.
  • the copolymer used in the present invention has a cationic group, the copolymer enters the cell without using a special method. Therefore, the copolymer is preferably used as a fluorescence temperature sensor for measuring the temperature in the cell. be able to.
  • the present invention can be applied to a wide variety of cells such as microorganisms such as yeast, animal cells, and plant cells. Further, by calculating the fluorescence emitted from the copolymer as the ratio of the fluorescence intensity in a certain two regions, or by using the fluorescence lifetime as a measurement parameter, the measured value becomes a value specific to the temperature. It is possible to provide a more accurate temperature measurement method that does not depend on the concentration of. Furthermore, according to the present invention, it is possible to freely set a temperature region suitable for measurement by combining a plurality of thermosensitive units.
  • FIG. 2 is an example of a photograph of compounds 1 to 7 and yeast Saccharomyces cerevisiae SYT001 mixed and observed with a confocal laser microscope (excitation wavelength: 473 nm, fluorescence wavelength: 500-600 nm).
  • FIG. 6 is a histogram when compounds 2 to 6 are mixed with yeast Saccharomyces cerevisiae SYT001 and the fluorescence of the yeast cells is counted with a flow cytometer (excitation light: 488 nm, fluorescence: 515 nm to 545 nm).
  • FIG. 3 is a diagram in which compounds 1 to 7 are subjected to agarose gel electrophoresis and ionic strength of each compound is qualitatively evaluated.
  • FIG. 6 is a histogram when the fluorescence of yeast cells was counted with a flow cytometer (excitation light: 488 nm, fluorescence: 515 nm to 545 nm).
  • Compound 2 was mixed with yeast Saccharomyces cerevisiae SYT001 in water and allowed to stand for 5, 10, 20, 30 or 60 minutes, and then the fluorescence of the yeast cells was counted with a flow cytometer (excitation light: 488 nm, fluorescence: 515 nm ⁇ 545 nm).
  • FIG. 3 is an example of a photograph of compound 3 introduced into cells of yeast Saccharomyces cerevisiae SYT001 and observed with a confocal laser microscope (excitation wavelength 473 nm, fluorescence wavelength 520 to 560 nm).
  • Compound 3 was introduced into cells of yeast Saccharomyces cerevisiae SYT001, and observed with a confocal laser microscope (excitation wavelength: 473 nm).
  • the fluorescence intensity ratio (520 to 560 nm / 570 to 610 nm) is calculated from the fluorescence spectrum at each temperature when compound 3 is introduced into yeast, and the fluorescence intensity ratio with respect to each temperature is plotted. An example of the obtained temperature response curve is shown.
  • Compound 3 was introduced into cells of yeast Saccharomyces cerevisiae SYT001 using a fluorescence microscope, observed with a confocal laser microscope (excitation wavelength: 473 nm), and fluorescence intensity and fluorescence from a fluorescence image (P1) with a fluorescence wavelength of 520-560 nm
  • An example of a temperature response curve obtained by calculating a fluorescence intensity ratio (P1 / P2) from a fluorescence image (P2) having a wavelength of 570 to 610 nm and plotting the fluorescence intensity ratio with respect to each temperature is shown.
  • Compound 2-7 at a concentration of 0.005%, 0.025%, 0.05% or 0.25% is mixed and suspended with yeast Saccharomyces SYT001 strain, the polymer is introduced into the cell, and the polymer is introduced.
  • the yeast was washed twice with water, suspended again with water, spotted on a YPD plate to become 10 4 , 10 3 , 10 2, or 10 cells, and cultured for 2 days at 25 ° C. It is a photograph of a plate. Fluorescence image (excitation wavelength: 473 nm, fluorescence wavelength: 500-600 nm) obtained by mixing human-derived fetal kidney cells HEK293T with compound 1, 4 or 7 having a final concentration of 0.05% and observing with a confocal laser microscope Show.
  • Fluorescence image (excitation wavelength: 473 nm, fluorescence wavelength: 500-600 nm) obtained by mixing mouse-derived macrophage-like progenitor cells RAW264 with compound 1, 4 or 7 having a final concentration of 0.05% and observing with a confocal laser microscope Indicates. It is an example of a photograph when compound 4 and E. coli DH5 ⁇ are mixed and observed with a confocal laser microscope under the temperature condition of 25 ° C. or 41 ° C. (excitation wavelength: 473 nm, fluorescence wavelength: 500-600 nm).
  • thermosensitive response test of the fluorescence lifetime of the compound 2, 9 and 10 in a yeast cell (white circle: Compound 2, black circle: Compound 9, white triangle: Compound 10). It is an example of a photograph when compound 2 and MOLT-4 cells which are floating cells are mixed and observed with a confocal laser microscope (excitation wavelength: 473 nm, fluorescence wavelength: 500-600 nm). It is an example of the result of the thermosensitive response test of the fluorescence intensity of compound 2, 9 and 10 in a cultured cell (MOLT4 which is a floating cell) (white circle: compound 2, black circle: compound 9, white triangle: compound 10).
  • thermosensitive response test of the fluorescence lifetime of the compounds 2, 9, and 10 in a cultured cell (MOLT4 which is a floating cell) (white circle: Compound 2, black circle: Compound 9, white triangle: Compound 10). It is an example of a photograph when Compound 2, 9 or 10 and HEK293T cells are mixed and observed with a confocal laser microscope (excitation wavelength: 473 nm, fluorescence wavelength: 500-600 nm).
  • Compound 9 is introduced into HEK293T cells and observed with a confocal laser microscope (excitation wavelength: 473 nm), and the ratio of the fluorescence image (CH1) with a fluorescence wavelength of 500-550 nm to the fluorescence image (CH2) with a fluorescence wavelength of 600-650 nm is obtained. It is an example of the fluorescence image (Ratio: CH1 / CH2) obtained by this.
  • the copolymer used as the temperature-sensitive probe in the first embodiment of the present invention includes a cationic unit in addition to the heat-sensitive unit and the fluorescent unit. This makes it possible to introduce the copolymer into cells by mixing the copolymer with cells in a solvent. Such a copolymer can be introduced into cells by a method such as microinjection, but it is not necessary to use such advanced technology, and it can be introduced into cells by simply mixing with the cells. Is done. Another advantage of the copolymer is that it can be easily introduced into a wide variety of cells such as microorganisms and plant cells that cannot utilize the microinjection method.
  • the cationic unit incorporated in the copolymer used in the present invention is not particularly limited as long as it is a repeating structure derived from a monomer containing an ionic functional group having one or more positive charges.
  • a monomer represented by the following formula (b) is preferably used: [Wherein R 2 is selected from a hydrogen atom and C 1-3 alkyl; W is an aromatic ring or —X 1 —C ( ⁇ O) — (where X 1 is directly attached to Q 1 ); X 1 is O, S, or N—R 11 ; R 11 is a hydrogen atom, C 1-6 alkyl, or —Q 1 -Y, where the alkyl is hydroxy, halogen atom, C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkylthio, C 1-6 alkyl Optionally substituted by one or more substituents selected from sulfinyl, and C 1-6 alkylsulfonyl; Q 1 is independently selected from C 1-20 alkyl
  • Y is independently an ionic functional group that may have one or more positive charges, and is —N + R 21 R 22 R 23 X e ⁇ , —C ( ⁇ NR 41 ) —NR 42 R 43 , and The following formula: Selected from the group represented by X e - and X f - are counter anions; R 21 , R 22 , and R 23 are independently selected from C 1-10 alkyl, and C 7-14 aralkyl, or R 21 and R 22 together with the nitrogen atom to which A 7-membered nitrogen-containing heterocycle may be formed; R 24 is C 1-10 alkyl, or C 7-14 aralkyl; R 41 , R 42 and R 43 are independently selected from a hydrogen atom and C 1-10 alkyl, or R 41 and R 42 together with the nitrogen and carbon atoms to which each is attached, A 5- to 7-membered heterocycle containing a nitrogen atom
  • thermosensitive unit contained in the copolymer used in the present invention is not particularly limited as long as it has a repeating structure whose shape changes according to temperature, but is preferably a repeating derived from a monomer having acrylamide as a basic skeleton. Structured.
  • Examples of such a monomer having acrylamide as a basic skeleton include monomers represented by the following formula (a): Wherein R 1 is selected from a hydrogen atom and C 1-3 alkyl; R 4 and R 5 are independently selected from a hydrogen atom and C 1-20 alkyl, wherein the alkyl is substituted with one or more substituents selected from hydroxy, C 1-6 alkoxy, and aryl Or R 4 and R 5 together with the nitrogen atom to which they are attached form a 4- to 8-membered nitrogen-containing heterocycle, where the heterocycle is C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, nitro, halogen atom, optionally substituted by one or more substituents selected from C 1-10 alkylcarbonylamino and arylcarbonylamino].
  • R 1 is selected from a hydrogen atom and C 1-3 alkyl
  • R 4 and R 5 are independently selected from a hydrogen atom and C 1-20 alkyl, wherein the alkyl is substituted with one or
  • the fluorescent unit contained in the copolymer used in the present invention is not particularly limited as long as it has a repeating structure in which the fluorescence intensity changes according to the change in the shape of the thermosensitive unit.
  • a repeating structure include those derived from a monomer represented by the following formula (c): [Wherein R 3 is selected from a hydrogen atom and C 1-3 alkyl; X 2 is O, S, or N—R 12 ; X 3 is a direct bond, O, S, SO, SO 2 , N (—R 13 ), CON (—R 16 ), N (—R 16 ) CO, N (—R 17 ) CON (—R 18 ) , SO 2 N (—R 19 ) or N (—R 19 ) SO 2 ; Q 2 is selected from C 1-20 alkylene, C 3-20 alkenylene, or C 3-20 alkynylene, wherein the alkylene has O, S or phenylene independently inserted at one or more points.
  • Ar is selected from a 6 to 18-membered aromatic carbocyclic group or a 5 to 18-membered aromatic heterocyclic group, wherein the aromatic carbocyclic group and the aromatic heterocyclic group include one or more of the included rings.
  • a condensed ring which is an aromatic ring may be included, and —CH 2 — existing as a ring atom in the aromatic carbocyclic group and aromatic heterocyclic group may be substituted with —C (O) —.
  • aromatic carbocyclic group and aromatic heterocyclic group include a halogen atom, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkylthio, C 1-6 alkylsulfinyl, C 1-6 alkylsulfonyl.
  • nitro, cyano, C 1-6 alkylcarbonyl, C 1-6 alkoxycarbonyl, carboxy, formyl, -NR 6 R 7, and by one or more substituents selected from -SO 2 NR 14 R 15 May be conversion (the C 1-6 alkyl, where, C 1-6 alkoxy, C 1-6 alkylthio, C 1-6 alkylsulfinyl, C 1-6 alkylsulfonyl, C 1-6 alkylcarbonyl and C
  • the alkyl contained in 1-6 alkoxycarbonyl is 1 selected from a halogen atom, C 1-6 alkoxy, hydroxy, amino, C 1-6 alkylamino, di (C 1-6 alkyl) amino, aryl, and carboxy.
  • R 6 and R 7 independently represent a hydrogen atom, C 1-10 alkyl, aryl, C 1-10 alkylcarbonyl, arylcarbonyl, C 1-10 alkylsulfonyl, arylsulfonyl, carbamoyl, N— (C 1-10 Alkyl) carbamoyl, and N, N-di (C 1-10 alkyl) carbamoyl, wherein said C 1-10 alkyl, C 1-10 alkylcarbonyl, C 1-10 alkylsulfonyl, N— (C 1 -10 alkyl) carbamoyl and alkyl contained in N, N-di (C 1-10 alkyl) carbamoyl are a halogen atom, C 1-6 alkoxy, hydroxy, amino, C 1-6 alkylamino, di (C 1 -6 alkyl) location amino, aryl, and optionally one or more substituents selected from carboxy May be
  • the copolymer used in the present invention comprises a monomer represented by the formula (a), a monomer represented by the formula (b), and a monomer represented by the formula (c). It is set as the copolymer containing the repeating structure derived from each of these.
  • the copolymers used in the present invention have the formulas (I), (II) and (III): [Wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , Y, W, X 2 , X 3 , Q 1 , Q 2 and Ar are as defined above] It is set as the copolymer containing the repeating unit represented by these.
  • the copolymer used in the present invention has the formula (IV): [Wherein R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , Y, W, X 2 , X 3 , Q 1 , Q 2 and Ar are as defined above, a, b and c Is a number greater than 0 representing the ratio of each repeating unit in the formula] It is set as the copolymer represented by these.
  • the sum of a and b is 100, b is preferably 2 to 10, and c is preferably 0.05 to 2.
  • this copolymer forms one aspect of the present invention as a substance itself.
  • the copolymer includes two or more heat-sensitive units.
  • thermosensitive units There are various types of thermosensitive units, and the temperature range showing the highest temperature reactivity varies depending on the type. In this embodiment, it can adjust so that the temperature reactivity of a copolymer may become high in a desired temperature range by combining 2 or more types of thermosensitive units.
  • the copolymer includes two or more heat-sensitive units represented by the formula (a). In one embodiment, two types of heat sensitive units are used.
  • NPAM Nn-propylacrylamide
  • NIPAM N-isopropylacrylamide
  • NTBAM N-tert-butylacrylamide
  • a in the formula (IV) represents the total sum of the thermosensitive units, and when two or more thermosensitive units are used, it means the sum of the ratios of the number of repeating units of all the thermosensitive units. .
  • Ar is represented by the following formula: An aromatic carbocyclic group or an aromatic heterocyclic group selected from the group represented by the formula: wherein these groups are halogen atoms, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, C 1-6 on the ring.
  • Ar is represented by the following formula: An aromatic carbocyclic group or an aromatic heterocyclic group selected from the group represented by the formula: wherein these groups are halogen atoms, C 1-6 alkyl, C 1-6 alkoxy, C 1-6 on the ring. alkylthio, C 1-6 alkylsulfinyl, C 1-6 alkylsulfonyl, nitro, C 1-6 alkylcarbonylamino, arylcarbonylamino, cyano, formyl, C 1-6 alkylcarbonyl, C 1-6 alkoxycarbonyl, carboxy and It may be substituted with one or more substituents selected from —SO 2 NR 14 R 15 .
  • C 1-3 alkyl means a linear, branched, or cyclic alkyl group having 1 to 3 carbon atoms, and is methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, cyclohexane. Contains propyl.
  • C 1-6 alkyl means a linear, branched, cyclic or partially cyclic alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, such as methyl, ethyl, n-propyl. I-propyl, n-butyl, s-butyl, i-butyl, t-butyl, n-pentyl, 3-methylbutyl, 2-methylbutyl, 1-methylbutyl, 1-ethylpropyl, n-hexyl, 4-methylpentyl , 3-methylpentyl, 2-methylpentyl, 1-methylpentyl, 3-ethylbutyl, and 2-ethylbutyl, cyclopropyl, cyclobutyl, cyclopentyl, cyclohexyl, cyclopropylmethyl, and the like, for example, C 1-4 alkyl And C 1-3 alkyl and the like are also included.
  • C 1-10 alkyl means a linear, branched, cyclic or partially cyclic alkyl group having 1 to 10 carbon atoms.
  • C 1-6 Alkyl and C 1-3 alkyl and the like are included.
  • C 1-20 alkyl means a linear, branched, cyclic or partially cyclic alkyl group having 1 to 20 carbon atoms.
  • C 1-10 Alkyl, C 1-6 alkyl, C 1-3 alkyl and the like are included.
  • C 1-6 alkoxy means an alkyloxy group having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms already defined as an alkyl moiety, and includes, for example, methoxy, ethoxy, n-propoxy, i-propoxy N-butoxy, s-butoxy, i-butoxy, t-butoxy, n-pentoxy, 3-methylbutoxy, 2-methylbutoxy, 1-methylbutoxy, 1-ethylpropoxy, n-hexyloxy, 4-methylpen Toxic, 3-methylpentoxy, 2-methylpentoxy, 1-methylpentoxy, 3-ethylbutoxy, cyclopentyloxy, cyclohexyloxy, cyclopropylmethyloxy, etc. are included, for example, C 1-4 alkoxy and C 1 Also included are -3 alkoxy and the like.
  • aryl means a 6- to 10-membered aromatic carbocyclic group, and includes, for example, phenyl, 1-naphthyl, 2-naphthyl and the like.
  • C 7-14 aralkyl means an arylalkyl group having 7 to 14 carbon atoms including an aryl group, such as benzyl, 1-phenethyl, 2-phenethyl, 1-naphthylmethyl, 2- Naphthylmethyl and the like are included.
  • examples of the halogen atom include a fluorine atom, a chlorine atom, a bromine atom, and an iodine atom.
  • C 1-20 alkylene means a linear, branched, cyclic or partially cyclic alkylene group having 1 to 20 carbon atoms, such as methylene, ethylene, propylene, butylene. And further include C 1-10 alkylene and C 1-6 alkylene.
  • C 3-20 alkenylene means a linear, branched, cyclic or partially cyclic alkenylene group having 3 to 20 carbon atoms, such as propenylene, butenylene, and the like. 3-10 alkenylene and C 3-6 alkenylene are included.
  • C 3-20 alkynylene means a linear, branched, cyclic or partially cyclic alkynylene group having 3 to 20 carbon atoms, such as propynylene, butynylene, and the like. 3-10 alkynylene and C 3-6 alkynylene are included.
  • C 1-6 alkylthio means an alkylthio group having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms already defined as the alkyl moiety, and examples thereof include methylthio, ethylthio, n-propylthio, i-propylthio, n-butylthio, s-butylthio, i-butylthio, t-butylthio and the like are included.
  • C 1-6 alkylsulfinyl means an alkylsulfinyl group having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms already defined as an alkyl moiety, such as methylsulfinyl, ethylsulfinyl, n-propylsulfinyl. I-propylsulfinyl, n-butylsulfinyl, s-butylsulfinyl, i-butylsulfinyl, t-butylsulfinyl and the like.
  • C 1-6 alkylsulfonyl means an alkylsulfonyl group having an alkyl group having 1 to 6 carbon atoms already defined as the alkyl moiety, such as methylsulfonyl, ethylsulfonyl, n-propylsulfonyl. I-propylsulfonyl, n-butylsulfonyl, s-butylsulfonyl, i-butylsulfonyl, t-butylsulfonyl and the like.
  • 6- to 18-membered aromatic carbocyclic group includes, for example, phenyl, naphthyl, anthracenyl, pyrenyl, indanyl, tetralinyl and the like.
  • the “5- to 18-membered aromatic heterocyclic group” is an aromatic heterocyclic ring having one or more heteroatoms selected from oxygen, nitrogen and sulfur, such as pyrrolyl, pyrazolyl, imidazolyl, pyridyl. , Indolyl, quinolyl, quinoxalinyl, quinazolinyl, benzofuranyl, benzothienyl, benzopyranyl, benzochromenyl and the like.
  • C 2-6 alkenylsulfonyl means an alkenylsulfonyl group having a C 2-6 alkenyl group which has already been defined as an alkenyl moiety, and includes, for example, vinylsulfonyl, allylsulfonyl and the like.
  • C 2-6 alkenylcarbonyl means an alkenylcarbonyl group having a C 2-6 alkenyl group already defined as an alkenyl moiety, and includes, for example, acryloyl, methacryloyl, and the like.
  • C 2-6 alkynylcarbonyl means an alkynylcarbonyl group having a C 2-6 alkynyl group which has already been defined as an alkynyl moiety, and includes, for example, ethynylcarbonyl and the like.
  • C 1-6 alkylcarbonyl refers to a group —CO (C 1-6 alkyl), wherein the C 1-6 alkyl is as previously defined.
  • C 1-6 alkoxycarbonyl refers to a group —CO (C 1-6 alkoxy), wherein the C 1-6 alkoxy is as defined above.
  • C 1-6 alkylcarbonylamino refers to the group —NHCO (C 1-6 alkyl), where C 1-6 alkyl is as previously defined.
  • C 1-6 arylcarbonylamino refers to the group —NHCO (aryl), where aryl is as previously defined.
  • the “5- to 7-membered nitrogen-containing heterocycle” in the present specification includes, for example, a saturated heterocycle such as a pyrrole ring, a pyrrolidine ring, a piperidine ring, a homopiperidine ring, a piperazine ring, a homopiperazine ring, a morpholine ring, and a thiomorpholine ring. included.
  • examples of the “4- to 8-membered nitrogen-containing heterocycle” include a pyrrole ring, an azetidine ring, a pyrrolidine ring, a piperidine ring, a homopiperidine ring, a piperazine ring, a homopiperazine ring, a morpholine ring, and a thiomorpholine ring. And 5- to 7-membered nitrogen-containing heterocycles.
  • the “5- to 7-membered heterocycle containing two nitrogen atoms” includes, for example, imidazolidine, tetrahydropyrimidine and the like.
  • the alkylene chain when alkylene is inserted at one or more sites, the alkylene chain contains an ether bond in the main chain, and the insertion has a stable structure.
  • the process is performed so as not to form the O— and —O—CH 2 —O— structures. The above also applies to the insertion of S into alkylene.
  • the “counter anion” is not particularly limited as long as it is an anion usually used as a counter anion of an organic compound in the technical field of organic chemistry.
  • a halide anion chloride ion, bromide ion, fluoride
  • Ions iodide ions
  • organic acid conjugate bases eg, acetate ions, trifluoroacetate ions
  • nitrate ions e.g, acetate ions, trifluoroacetate ions
  • sulfate ions e.g., arate ions, sulfate ions, carbonate ions, and the like.
  • Preferred counter anions in the present invention include, for example, chloride ions and nitrate ions.
  • R 1 , R 2 , and R 3 are preferably selected from a hydrogen atom and methyl.
  • —NR 4 R 5 is not particularly limited.
  • R 4 may be a hydrogen atom
  • R 5 may be C 2-10 alkyl.
  • R 4 and R 5 together with the nitrogen atom to which they are bonded form a 4- to 8-membered nitrogen-containing heterocycle, for example, pyrrolidine ring, piperidine ring, homopiperidine ring, piperazine ring, homopiperazine A ring, a morpholine ring, a thiomorpholine ring, or the like may be formed.
  • W in formula (b), formula (II) and (IV) is either an aromatic ring or —X 1 —C ( ⁇ O) — (wherein X 1 is directly bonded to Q 1 ).
  • the aromatic ring represented by W is preferably a C 6-18 aromatic ring, more preferably a benzene ring.
  • W is preferably —X 1 —C ( ⁇ O) — (where X 1 is directly bonded to Q 1 ).
  • X 1 is preferably O, NH or N (C 1-6 alkyl).
  • —Q 1 — is preferably C 2-10 alkylene.
  • formula (III) and (IV) is preferably X 2 is O, NH or N (C 1-6 alkyl), and Q 2 is C 2 -10 alkylene.
  • R 31 is selected from a hydrogen atom, a halogen atom, nitro, cyano, and —SO 2 NR 14 R 15 ;
  • R 32 is C 1-6 alkyl;
  • X 11 is N—R 33 , O Or R;
  • R 33 is a hydrogen atom or C 1-6 alkyl;
  • X 10 , R 14 and R 15 are as defined above. Is a group selected from
  • Preferred X 3 for formula (V) includes, for example, a direct bond, CON (—R 16 ), N (—R 16 ) CO, SO 2 N (—R 19 ) or N (—R 19 ) SO 2. It is done.
  • Preferred X 3 for formula (VI) includes, for example, N—R 13 (wherein preferred R 13 includes C 1-3 alkyl such as methyl), or S.
  • Preferred X 3 for formula (VII) includes, for example, a direct bond, CON (—R 16 ), N (—R 16 ) CO, SO 2 N (—R 19 ) or N (—R 19 ) SO 2. It is done.
  • Preferred X 3 for formula (VIII) includes, for example, a direct bond, CON (—R 16 ), N (—R 16 ) CO, SO 2 N (—R 19 ) or N (—R 19 ) SO 2. It is done.
  • Preferred X 3 for formula (IX) includes, for example, a direct bond.
  • Preferred X 3 for formula (X) includes, for example, a direct bond.
  • Preferred X 3 for the formula (XI) includes, for example, CO, SO 2 , SO 2 N (—R 19 ) or CON (—R 16 ) (wherein the SO 2 N (—R 19 ) and CON (—R) 16 ) includes a sulfur atom and a carbon atom bonded to Ar, respectively.
  • Preferred X 3 for the formula (XII) is, for example, CO, SO 2 , SO 2 N (—R 19 ) or CON (—R 16 ) (wherein the SO 2 N (—R 19 ) and CON (—R) 16 ) includes a sulfur atom and a carbon atom bonded to Ar, respectively.
  • the group —X 3 —Ar functions as an environmentally responsive fluorophore.
  • a fluorophore of the formula (V) or (VII) when used, the temperature at which the fluorescence intensity decreases with increasing temperature.
  • the sensor uses a fluorophore of formula (VI) or (VIII) to (XII), a temperature sensor is obtained in which the fluorescence intensity increases as the temperature increases.
  • the amount of the monomer of the formula (b) to be used can be, for example, 1 to 15 mol% with respect to the total amount of the monomers of the formulas (a) and (b).
  • the copolymer according to the present invention can be synthesized based on ordinary knowledge in the technical field of polymer synthesis, and can be obtained, for example, as a random copolymer by radical polymerization.
  • the radical initiator that can be used in this case is not particularly limited, but persulfates such as ammonium persulfate, sodium persulfate, and potassium persulfate; 2,2′-azobis (2-methylpropionamidine) Examples thereof include azo compounds such as hydrochloride, 2,2′-azobis [2- (2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride, and 4,4′-azobis (4-cyanovaleric acid).
  • the amount of the reaction initiator used may be 0.01 mol% or more based on the monomer used, and an appropriate amount can be selected as long as the radical synthesis proceeds.
  • a reaction initiator of 0.1 mol% or more, preferably 1 mol% or more can be used.
  • the reaction solvent used for polymerization is not particularly limited, and examples include acetonitrile, dioxane, dimethylformamide, methanol and the like.
  • the radical polymerization is not particularly limited, but can be performed, for example, at a reaction temperature of 0 to 100 ° C., preferably 50 to 70 ° C., and a reaction time of 1 to 48 hours, preferably 2 to 16 hours, for example.
  • the cationic functional group contained in the copolymer maintains ionicity in a wide range of pH. Is preferable.
  • the intracellular pH is 2 to 9, and in the normal state, general animal, plant, and microbial cells, the pH is about 4 to 8. Any functional group that is kept cationic at this pH may be used. From such a viewpoint, Y is preferably —N + R 21 R 22 R 23 X e — .
  • a copolymer comprising a repeating structure derived from each of the monomers represented by the formulas (a), (b) and (c).
  • the amount of the monomer represented by the formula (b) used for obtaining the copolymer is, for example, with respect to the total amount of the monomers represented by the formulas (a) and (b). 1 to 15 mol%, preferably 2 to 7.5 mol%, more preferably 2.5 to 5 mol%.
  • the amount of the monomer represented by the formula (c) used is, for example, 0.01 to 20 mol% with respect to the total amount of the monomers represented by the formulas (a) and (b). Specifically, it is 0.01 to 10 mol%, preferably 0.05 to 2 mol%, more preferably 0.5 to 1.5 mol%.
  • a, b and c in the formula (IV) are numbers greater than 0 representing the ratio of each repeating unit in the formula, and are not particularly limited.
  • a + b 100
  • c is the total amount of a and b ( That is, it is a ratio to 100), and c is 0.01 to 20, specifically 0.01 to 10, preferably 0.05 to 2, and more preferably 0.5 to 1. 5.
  • a + b 100
  • b is, for example, 1 or more, preferably 2 or more, more preferably 2.5 or more, more preferably 3 or more, for example, 15 or less, preferably 10 or less, more preferably 7 .5 or less, more preferably 6 or less, more preferably 5 or less.
  • b is, for example, 1 to 15, preferably 2 to 10, more preferably 2 to 7.5, more preferably 2.5 to 6, It is preferably 3 to 6, more preferably 3 to 5.
  • a is the sum of the thermosensitive units.
  • the ratio of the thermosensitive units is p: ap, using a certain number p.
  • A is 97.5, and the ratio of Nn-propylacrylamide to N-isopropylacrylamide is represented by p: 97.5-p.
  • the weight average molecular weight of the polymer of the present invention is not particularly limited, but is, for example, 5,000 to 1,000,000, preferably 10,000 to 200,000.
  • the change in the fluorescence intensity due to the thermal sensitivity of the copolymer used in the present invention can be measured by a usual fluorescence intensity measurement method.
  • the excitation wavelength in measurement and the fluorescence wavelength to be measured are not particularly limited.
  • the maximum excitation wavelength when measuring the excitation spectrum of the measurement sample or a wavelength in the vicinity thereof can be used.
  • the fluorescence wavelength to be measured is not particularly limited, and for example, the maximum fluorescence wavelength or a wavelength in the vicinity thereof when the fluorescence spectrum of the measurement sample is measured at a temperature at which the fluorescence intensity increases can be used.
  • the fluorescence lifetime can be used as an index as a change due to the thermal sensitivity of the copolymer used in the present invention. This change can be measured by a usual fluorescence lifetime measurement method.
  • the excitation wavelength in the measurement is not particularly limited. For example, a maximum excitation wavelength or a wavelength in the vicinity thereof when the excitation spectrum of the measurement sample is measured can be used.
  • a fluorescence lifetime value can be obtained from a fluorescence decay curve obtained by an experiment by using a general analysis method such as one-component approximation or two-component approximation according to the state of the sample to be measured.
  • the change in fluorescence lifetime due to the thermal sensitivity of the copolymer used in the present invention is determined by a general fluorescence lifetime measurement method such as a single photon counting method, a phase modulation method, a pulse sampling method, or an excitation probe method.
  • a general fluorescence lifetime measurement method such as a single photon counting method, a phase modulation method, a pulse sampling method, or an excitation probe method.
  • the single photon counting method is a method for measuring the fluorescence lifetime by utilizing the fact that the emission intensity distribution on the time axis and the emission probability of one photon are in correlation, and the fluorophore is about 1 ns.
  • the fluorescence lifetime measurement by the single photon counting method can be performed by using a commercially available time-correlated single photon counting fluorescence lifetime measuring apparatus and a measurement / analysis program attached thereto.
  • the “cell” in the present invention is composed of prokaryotic cells and eukaryotic cells, which are general classifications, and does not depend on the species of the organism.
  • prokaryotic cells are divided into eubacteria and archaea, but eubacteria are broadly divided into gram-positive bacteria such as actinomycetes and gram-negative bacteria such as proteobacteria, depending on the thickness of the peptidoglycan layer.
  • the range in which the copolymer can be applied is not limited.
  • cells belonging to eukaryotes protists, fungi, plants, animals
  • yeast that is generally used in research such as molecular biology and industrially belongs to fungi.
  • a solution having low ionic strength.
  • a solvent include water (preferably pure water), a sorbitol aqueous solution, a glucose solution, and the like.
  • the concentration of the copolymer when the copolymer is introduced into the cells according to the present invention is, for example, a final copolymer concentration of 0.001 to 1% (w / v), preferably 0.01 to 0.1. % (W / v) can be adjusted and mixed with bacterial cells. This applies not only to microbial cells but also to adherent cells.
  • the fluorescence intensity at two independent fluorescence wavelengths is measured and the ratio of these is taken. It is desirable to take the method of converting to. By this method, it is possible to eliminate the possibility that the fluorescence intensity emitted from the copolymer is caused by the concentration of the copolymer in the minute space, and to correspond the temperature to the fluorescence intensity ratio obtained in the experiment on a one-to-one basis. Is possible. This makes it possible to compare not only the temperature in the same cell but also the intracellular temperature of another cell placed under the same condition. For example, it is possible to grasp the physiological state of each yeast cell by measuring the difference in individual cell temperatures in the yeast population.
  • the method for calculating the fluorescence intensity ratio is not particularly limited, and the ratio can be calculated from the fluorescence intensities of two regions including different wavelengths.
  • one region may be 550 nm to 570 nm and the integrated value of the fluorescence intensity may be S1
  • the other region may be 570 nm to 590 nm
  • the integrated value of the fluorescence intensity may be S2
  • S1 / S2 may be the fluorescence intensity ratio.
  • the S1 and S2 regions may have the same width or different widths.
  • S1 may include a 20 nm wide wavelength region, while S2 may be a 1 nm wide single wavelength.
  • the wavelength selection criteria are not particularly limited, but considering the fluorescence intensity to be obtained, the normal temperature (for example, the fluorescent monomer represented by the formula (c)) that gives the fluorescent unit contained in the temperature-sensitive probe ( Two wavelengths (ie, wavelengths for S1 and S2) from the range of 200 nm, preferably 150 nm, and more preferably 100 nm before and after the wavelength showing the maximum fluorescence intensity when measuring an excitation spectrum in water at about 25 ° C. It is desirable to select (Area).
  • the normal temperature for example, the fluorescent monomer represented by the formula (c)
  • Two wavelengths ie, wavelengths for S1 and S2 from the range of 200 nm, preferably 150 nm, and more preferably 100 nm before and after the wavelength showing the maximum fluorescence intensity when measuring an excitation spectrum in water at about 25 ° C. It is desirable to select (Area).
  • a wavelength that becomes a baseline when a fluorescence spectrum in water at room temperature (about 25 ° C.) of a monomer for example, a fluorescent monomer represented by the formula (c)
  • a monomer for example, a fluorescent monomer represented by the formula (c)
  • the calibration curve measured under which conditions is not limited, but, for example, a curve plotting the change in fluorescence intensity due to the thermosensitive response of the copolymer in a potassium chloride solution that mimics the inside of a cell.
  • the cell population into which the copolymer has been introduced is subjected to a fluorometer, and the curve plotting the change in fluorescence intensity due to the heat-responsiveness, or the cell population into which the copolymer has been introduced is subjected to a fluorescence microscope to produce heat sensitivity in a plurality of cells.
  • a curve or the like in which an average value of changes in fluorescence intensity due to responsiveness is plotted can be used. More specifically, using a cell population into which the copolymer has been introduced, a thermosensitive response test is performed, and when plotting changes in fluorescence intensity, the cells do not actively undergo metabolic activity, For example, cells are suspended in water or in a buffer containing a compound that cannot be assimilated, held at a specific temperature for a certain period of time, and the external temperature and the internal temperature of the cell have reached equilibrium. The method of measuring a fluorescence intensity etc. is mentioned under the situation where it is possible. When measuring these fluorescence intensities, the fluorescence intensities may be measured, but by creating a calibration curve using the fluorescence intensity ratio in any two-wavelength region as described above, it is more accurate. It is possible to create a calibration curve.
  • the above-described temperature measurement method using the fluorescence intensity ratio can be widely applied to temperature measurement using a thermosensitive unit and a copolymer containing the fluorescent unit. Moreover, this temperature measurement method can be widely applied not only to temperature measurement in cells but also to temperature measurement in a minute space.
  • Fluorescence lifetime can also be used as an index in order to accurately measure the temperature in a limited microspace represented by cells. Since the measurement based on the fluorescence lifetime is not affected by the wavelength and the concentration of the fluorescent substance, the same advantageous effect as the measurement based on the fluorescence intensity ratio by the two wavelengths is obtained.
  • the temperature measurement method based on the fluorescence lifetime can be widely applied to temperature measurement using a thermosensitive unit and a copolymer containing the fluorescent unit. Moreover, this temperature measurement method can be widely applied not only to temperature measurement in cells but also to temperature measurement in a minute space.
  • the above-described embodiment using two or more types of heat-sensitive units is not limited to the case where the copolymer used in the present invention is used as a temperature-sensitive probe, but the temperature at which a copolymer containing a heat-sensitive unit and a fluorescent unit is used. Can be widely applied to measurement.
  • kits for measuring temperature using the methods described above are provided, the kits comprising temperature sensitive probes used in these methods.
  • This reagent kit for temperature measurement can be suitably used for temperature measurement in a minute space, particularly for cell temperature measurement.
  • the reagent kit can be used in research fields such as medicine, biology, and biotechnology, and in medical fields such as diagnosis and treatment.
  • the kit comprises a temperature sensitive probe comprising a copolymer comprising a thermosensitive unit, a fluorescent unit and a cationic unit.
  • the kit comprises a temperature sensitive probe comprising a copolymer comprising a thermosensitive unit and a fluorescent unit, the copolymer comprising two or more thermosensitive compounds. Includes units.
  • the method and temperature measurement kit of the present invention can be applied to various fields of research and development.
  • the field of biotechnology in the fermentative production of useful substances using microorganisms, it is expected to improve the efficiency of examination of culture conditions by adding the intracellular temperature, which has been difficult to measure accurately, to analysis parameters.
  • the intracellular temperature which has been difficult to measure accurately, to analysis parameters.
  • the method and temperature measurement kit of the present invention can be applied to various medical uses. For example, by using the temperature-sensitive probe according to the present invention for a part of a patient's tissue, it is possible to discriminate between cancer cells that are said to have high heat production and normal cells that do not. is there. In addition, it can be used to develop more effective thermotherapy. Alternatively, a material that activates brown adipocytes is screened by introducing a temperature-sensitive probe according to the present invention into brown adipocytes that produce a large amount of heat and measuring the temperature changes caused by adding various materials to the cells. It is also possible to do.
  • the method and temperature measurement kit of the present invention can be applied to elucidation of various physiological phenomena.
  • the activity of TRP channels in a different approach by sensing the temperature outside the body and investigating how the TRP channel, which is a receptor that causes a biological response, is related to the intracellular temperature.
  • by examining the relationship between the intracellular temperature distribution and the biological reaction that occurs inside and outside the cell it is possible to investigate the effect of the local temperature distribution on the biological reaction. Cells by local heating using an infrared laser, etc. It is also possible to perform control.
  • the temperature measurement method and the cell introduction method of the temperature-sensitive probe according to the present invention can be performed both in vitro and in vivo. In one embodiment, these methods are performed in vitro.
  • N, N-dimethyl-7- [methyl ⁇ 2- (methylamino) ethyl ⁇ amino] -2,1,3-benzooxadiazole-4-sulfonamide (113 mg) was dissolved in acetonitrile (10 ml) to obtain triethylamine. (50.2 ⁇ L, 1 eq) and acrylic acid chloride (38.0 ⁇ L, 1.3 eq) were added at 0 ° C., followed by stirring at 0 ° C. for 1 hour.
  • Example 2 Synthesis of Nn-propylacrylamide Nn-propylamine (8.2 mL) and triethylamine (16.7 mL, 1.2 eq) were added to benzene (125 mL), and a stirrer was placed in an ice bath. After use and well stirring, 3 mL of acrylic acid chloride (9.7 mL, 1.2 eq) was added every 10 minutes and allowed to warm to room temperature. The reaction solution was filtered and separated with 0.1N hydrochloric acid, and the upper benzene fraction was extracted.
  • NPAM Nn-propylacrylamide (269 mg, 2.375 mmol, hereinafter also referred to as “NNPAM”), 3-sulfopropyl acrylate potassium salt (29.0 mg, 125 ⁇ mol, hereinafter also referred to as “SPA potassium salt”), DBD-AA (9 .13 mg, 25 ⁇ mol) and AIBN (4.13 mg, 25 ⁇ mol) were dissolved in DMF (5 ml), and dissolved oxygen was removed by passing argon nitrogen gas through for 30 minutes. Then, it was made to react at 60 degreeC for 16.5 hours, DMF was partially distilled off from the reaction solution under pressure reduction, Then, it poured into diethyl ether (200 ml).
  • the obtained crystals are collected by filtration, dried under reduced pressure, dissolved in 10 ml of pure water, dialyzed sufficiently using a Visking tube (dialysis cellulose tube) with a diameter of 28.6 mm, and the dialysis external solution as 1000 ml. Purification was performed. The purified product was lyophilized to give the title copolymer as a pale yellow powder (161 mg, 52%).
  • the ratio of NNPAM units to SPA units in the copolymer is based on the integral value in 1 H-NMR measurement, and the ratio of DBD-AA units is the absorbance in methanol of 4-N, N- (dimethylamino) -7-N. It was calculated by comparing with, N-dimethylaminosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole.
  • NNPAM 275 mg, 2.44 mmol
  • (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium chloride (17.5 mg, 62.5 ⁇ mol, hereinafter also referred to as “APTMA chloride”)
  • DBD-AA 9.13 mg, 25 ⁇ mol
  • AIBN 4 .05 mg, 25 ⁇ mol
  • the obtained crystals are collected by filtration, dried under reduced pressure, dissolved in 10 ml of pure water, and a 28.6 mm diameter Visking tube (dialysis cellulose tube) is used. Performed and purified. The purified product was lyophilized to give the title copolymer as a pale yellow powder (200 mg, 66%).
  • the ratio of NNPAM unit and APTMA unit in the copolymer is based on the integral value in 1 H-NMR measurement, and the ratio of DBD-AA unit is the absorbance in methanol of 4-N, N- (dimethylamino) -7-N. It was calculated by comparing with, N-dimethylaminosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole.
  • Example 5 Nn-propylacrylamide / (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium / N- ⁇ 2-[(7-N, N-dimethylaminosulfonyl) -2,1,3-benzooxadiazole-4 Preparation of —yl] (methyl) amino ⁇ ethyl-N-methylacrylamide copolymer Synthesis was carried out in the same manner as in Example 4. Using NNPAM (270 mg, 2.38 mmol), APTMA (34.4 mg, 125 ⁇ mol), DBD-AA (9.18 mg, 25 ⁇ mol), AIBN (4.09 mg, 25 ⁇ mol), the title copolymer was pale yellow powder (229 mg, 74%).
  • the calculation method is as in Example 4.
  • Example 6 Nn-propylacrylamide / (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium / N- ⁇ 2-[(7-N, N-dimethylaminosulfonyl) -2,1,3-benzooxadiazole-4 Preparation of —yl] (methyl) amino ⁇ ethyl-N-methylacrylamide copolymer Synthesis was carried out in the same manner as in Example 4. Using NNPAM (262 mg, 2.31 mmol), APTMA (51.9 mg, 188 ⁇ mol), DBD-AA (9.22 mg, 25 ⁇ mol), AIBN (4.15 mg, 25 ⁇ mol), the title copolymer was pale yellow powder (238 mg, 76%).
  • the number average molecular weight 6579 and the weight average molecular weight 11603, the composition ratio of each unit in the copolymer: NNPAM: APTMA: DBD-AA 90.9: 9.1: 0.896.
  • the calculation method is as in Example 4.
  • Example 7 Nn-propylacrylamide / (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium / N- ⁇ 2-[(7-N, N-dimethylaminosulfonyl) -2,1,3-benzooxadiazole-4 Preparation of —yl] (methyl) amino ⁇ ethyl-N-methylacrylamide copolymer Synthesis was carried out in the same manner as in Example 4. Using NNPAM (212 mg, 1.88 mmol), APTMA (173.6 mg, 625 ⁇ mol), DBD-AA (9.18 mg, 25 ⁇ mol), AIBN (4.18 mg, 25 ⁇ mol), the title copolymer was pale yellow powder (251 mg, 70%).
  • the ratio of NNPAM unit and APTMA unit in the copolymer is based on the integral value in 1 H-NMR measurement, and the ratio of DBD-AA unit is the absorbance in methanol of 4-N, N- (dimethylamino) -7-N. It was calculated by comparing with, N-dimethylaminosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole.
  • Example 8 Dimethylacrylamide / (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium / N- ⁇ 2-[(7-N, N-dimethylaminosulfonyl) -2,1,3-benzooxadiazol-4-yl] ( Preparation of methyl) amino ⁇ ethyl-N-methylacrylamide copolymer
  • DMMA Dimethylacrylamide / (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium / N- ⁇ 2-[(7-N, N-dimethylaminosulfonyl) -2,1,3-benzooxadiazol-4-y
  • the ratio of the DMAM unit and the APTMA unit in the copolymer is based on the integrated value in 1 H-NMR measurement, and the ratio of the DBD-AA unit is the absorbance in methanol of 4-N, N- (dimethylamino) -7-N. It was calculated by comparing with, N-dimethylaminosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole.
  • NNPAM (142 mg, 1.25 mmol), AIBN (2.02 mg, 12.5 ⁇ mol), DBD-AA (4.62 mg, 12.5 ⁇ mol) are dissolved in dioxane (5 ml) and dissolved by passing nitrogen gas for 30 minutes. Oxygen was removed. Then, it was made to react at 60 degreeC for 8 hours, and the reaction solution was poured into 200 ml of diethyl ether. The obtained crystals were collected by filtration and purified by reprecipitation (acetone 2.5 ml-diethyl ether 200 ml) to give the title copolymer as a pale yellow powder (87 mg, 58%).
  • the number average molecular weight 36033, the weight average molecular weight 92042, the composition ratio of each unit in the copolymer: NNPAM: DBD-AA 100: 1.031.
  • the ratio of DBD-AA units is determined by comparing the absorbance in methanol with 4-N, N- (dimethylamino) -7-N, N-dimethylaminosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole. Calculated.
  • NNPAM (268.7 mg, 2.375 mmol), vinylbenzyltrimethylammonium chloride (23.2 mg, 125 ⁇ mol, hereinafter also referred to as “VBTMA chloride”), DBD-AA (1.84 mg, 5 ⁇ mol), AIBN (4.05 mg, 25 ⁇ mol) )
  • DMF 5 ml
  • AIBN 4.05 mg, 25 ⁇ mol
  • the mixture was reacted at 60 ° C. for 14 hours and poured into diethyl ether (200 ml).
  • the obtained crystals are collected by filtration, dried under reduced pressure, dissolved in 10 ml of pure water, and a 28.6 mm diameter Visking tube (dialysis cellulose tube) is used. Performed and purified.
  • the purified product was lyophilized to give the title copolymer as a pale yellow powder (41 mg, 14%).
  • the ratio of the NNPAM unit to the VBTMA unit in the copolymer was calculated from the integrated value in 1 H-NMR measurement.
  • Example 11 Nn-propylacrylamide / N-isopropylacrylamide / (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium / N- ⁇ 2-[(7-N, N-dimethylaminosulfonyl) -2,1,3-benzo Preparation of Oxadiazol-4-yl] (methyl) amino ⁇ ethyl-N-methylacrylamide copolymer The same procedure as in Example 4 was carried out.
  • NNPAM 137.5 mg, 1.22 mmol
  • NIPAM N-isopropylacrylamide
  • APIBN 3-acrylamidopropyl trimethylammonium chloride
  • DBD-AA 9.13 mg, 25 ⁇ mol
  • AIBN 4.05 mg, 25 ⁇ mol
  • the ratio of NNPAM unit, NIPAM unit and APTMA unit in the copolymer is based on the integrated value in 1 H-NMR measurement, and the ratio of DBD-AA unit is the absorbance in methanol of 4-N, N- (dimethylamino)- Calculations were made by comparison with 7-N, N-dimethylaminosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole.
  • Example 12 N-isopropylacrylamide / (3-acrylamidopropyl) trimethylammonium / N- ⁇ 2-[(7-N, N-dimethylaminosulfonyl) -2,1,3-benzooxadiazol-4-yl
  • NIPAM 275 mg, 2.44 mmol
  • 3-acrylamidopropyl) trimethylammonium chloride (17.5 mg, 62.5 ⁇ mol, hereinafter referred to as “APTMA chloride”
  • DBD-AA (9.13 mg, 25 ⁇ mol
  • AIBN (4.05 mg, 25 ⁇ mol
  • DMF 5 ml
  • dissolved oxygen was removed by passing argon gas for 30 minutes.
  • the number average molecular weight 23312 and the weight average molecular weight 11737, the composition ratio of each unit in the copolymer NIPAM: APTMA: DBD-AA 96.4: 3.6: 0.814.
  • the ratio of the NIPAM unit and the APTMA unit in the copolymer is based on the integral value in 1 H-NMR measurement, and the ratio of the DBD-AA unit is the absorbance in methanol of 4-N, N- (dimethylamino) -7-N. It was calculated by comparing with, N-dimethylaminosulfonyl-2,1,3-benzooxadiazole.
  • copolymers prepared in Examples 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 and 12 are respectively referred to as compounds 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 below. And 10.
  • the table below summarizes the characteristics of the compounds 1 to 10.
  • Example 13 Test of polymer introduction into cells Yeast Saccharomyces SYT001 strain (Appl. Environ. Microbiol. 2008, 74, 2787-2796), YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2 %) The medium was inoculated into 3 mL of medium and cultured at 25 ° C. for 1 day under aerobic shaking. After measuring the absorbance (OD600) at 600 nm as the cell concentration of the culture solution, the culture solution is centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), washed twice with water and sufficiently washed, and then OD600 becomes 1. So that pure water was added and suspended.
  • OD600 absorbance
  • the observation was performed using a laser microscope (FV1000, Olympus) and a 100 ⁇ oil immersion objective lens (UplanSApo NA.1.40, Olympus).
  • a 473 nm laser Multi Ar laser was applied to the cells, and fluorescence images for fluorescence wavelengths from 500 nm to 600 nm were observed.
  • FIG. 1 shows a fluorescence image when each compound is introduced.
  • APTMA is contained in the unit, a region with high fluorescence intensity was observed inside the cell so as to overlap with the differential interference image, but when APTAM was not contained (compound 7), and an anionic unit In the case of containing SPA (compound 1), no fluorescence image was observed.
  • Example 14 Evaluation of polymer introduction efficiency into cells As in Example 13, 0.05% concentration of compounds 2 to 6 was mixed with yeast Saccharomyces SYT001 strain and introduced. Yeast into which the compound was introduced was subjected to flow cytometer (FACSCalibur, BD) analysis. The measurement conditions are as follows. The number of measured cells was 10,000 cells, the FSC voltage was E-1, the SSC voltage was 201, the FL1 voltage was 566V, and the FSC threshold was 52. After irradiating the cells with excitation light of an argon laser of 488 nm, fluorescence derived from each compound was detected with a fluorescence detector (FL1) of 515 nm to 545 nm.
  • FL1 fluorescence detector
  • a region peculiar to yeast is selected with SSC and FSC, and the horizontal axis is the signal fluorescence intensity of FL1, which is fluorescence emitted from the polymer, and the vertical axis is a histogram showing the number of cells with that fluorescence intensity. Analysis was performed.
  • Example 15 Qualitative evaluation of ionic strength in solution of each compound Compounds 1 to 7 were dissolved in pure water at a concentration of 5% and subjected to electrophoresis (Genius, SKbio) on a 1% agarose TAE gel. The amount applied is 5 ⁇ l. The electrophoresis was performed at 50V for 1.5 hours. The gel after electrophoresis was subjected to excitation with Blue Epi light (460 nm, GE Healthcare) using ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare), and excitation light and scattered light were cut with Y515 filter (GE Healthcare) to detect fluorescence from each probe.
  • Blue Epi light 460 nm, GE Healthcare
  • ImageQuant LAS 4000 GE Healthcare
  • FIG. 3 shows the result of the gel migrated. It was found that in the probe in which APTMA, which is a cationic group, was not introduced, the main chain of acrylamide itself was negatively charged and moved slightly to the positive charge side from the applied point. In addition, it was confirmed that the probe introduced with SPA, which is an anionic unit, moved greatly to the positive electrode side and the entire polymer was negatively charged. On the other hand, the polymer into which the cationic unit was introduced moved greatly to the negative electrode side in accordance with the introduction rate of APTMA, and it was confirmed that the introduction amount of APTMA and the cationicity were correlated. Furthermore, in the probe in which 9.1% of APTMA was introduced, the mobility was not changed by NNPAM and DMAM, which were thermosensitive units, and it was also confirmed that there was no cationic change by the thermosensitive unit.
  • APTMA which is a cationic group
  • Example 16 Thermal Sensitivity Test A thermal responsiveness test of compounds 2,3,4,5,6 in 150 mM KCl was performed according to the following procedure. Using a JASCO FP-6500 spectrofluorometer, KCl purchased from Wako Pure Chemicals was dissolved to a concentration of 150 mM using ultrapure water obtained from Millipore's Milli-Q reagent system as a solvent. Things were used. The initial concentration of the compound in this experiment was 0.01 w / v%, and the excitation wavelength was 456 nm. A JASCO ETC-273T water-cooled Peltier thermostatic cell holder was used for temperature control of the solution, and the temperature was measured with an attached thermocouple. The solution temperature was increased in increments of 2 ° C., and the fluorescence intensity at each temperature was measured.
  • thermosensitive unit When DMAM is used for the thermosensitive unit, it does not react to changes in temperature and the change in fluorescence intensity cannot be confirmed. However, when NNPAM is used as the thermosensitive unit, the molar ratio of APTMA in the copolymer is 9 Up to 1%, a change in fluorescence intensity that was sensitive to changes in temperature was confirmed. However, when the molar ratio of APTMA in the copolymer is 25.6%, the ratio of heat-sensitive units is lowered, and the ratio of ionic groups is too high, so that polymer stretching is inhibited by electrostatic action. Therefore, a change in fluorescence intensity in response to temperature could not be confirmed.
  • the ratio of APTMA is input with respect to the sum of NNPAM and APTMA in order to easily and easily measure the temperature in the cell without using a special method. It was found that 2.5% to 7.5% in terms of the molar amount of the monomer, and 3.3% to 9.1% in terms of the molar ratio contained in the actual copolymer are preferable.
  • Example 17 Evaluation of potassium chloride concentration dependency in thermal response test
  • the KCl concentration dependency of the thermal response of Compound 2 was tested and investigated by the following procedure.
  • the experimental procedure was the same as in Example 13, and the solvent was prepared so that the KCl concentration was 0 mM (pure water), 150 mM, 200 mM, and 250 mM.
  • the intracellular potassium concentration is estimated to be 150 mM to 250 mM, and it is known that the change in intracellular potassium concentration is small unless there is a special environmental change. Although a slight change in temperature responsiveness to changes in the concentration of the potassium chloride solution within this range is observed, the change in intracellular potassium concentration is at a much lower level. It was suggested that there was almost no influence on
  • Example 18 Evaluation of pH responsiveness The pH dependence of the thermal responsiveness of Compound 2 was tested and investigated by the following procedure.
  • a solvent ultrapure water obtained from Milli-Q reagent system of Millipore was used, and the pH was adjusted to 4 with hydrochloric acid. Ultrapure water was used as it was as a pH 7 solvent.
  • the experimental method is the same as in Example 13.
  • Example 19 Evaluation of suspension at the time of probe introduction into cells As in Example 13, 0.05% concentration of compounds 2 and 3 were mixed and suspended with yeast Saccharomyces SYT001 strain, and the probe was transferred to yeast. Introduced. As a solution / medium for suspending cells when mixing compounds and cells, there are 6 types of water, 1M Sorbitol, PBS, YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%), 50 mM KCl, 100 mM KCl. A solution / medium was used. Yeast into which compounds 2 and 3 were introduced respectively was subjected to flow cytometer (FACSCalibur, BD) analysis. The measurement conditions and analysis method are the same as in Example 14.
  • a solution / medium for suspending cells when mixing compounds and cells there are 6 types of water, 1M Sorbitol, PBS, YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%), 50 mM KCl, 100 mM KCl. A solution /
  • Example 20 Evaluation of mixing time at probe introduction into cells Yeast Saccharomyces SYT001 strain was inoculated in a YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) medium and aerobic at 25 ° C. for 1 day Cultured with shaking. After measuring the absorbance (OD600) at 600 nm as the cell concentration of the culture solution, the culture solution is centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), washed twice with water and sufficiently washed, and then OD600 becomes 1. So that pure water was added and suspended. Compound 2 dissolved in pure water at a concentration of 5% is added to the cell suspension so that the final concentration is 0.05%, and then 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60 minutes. And left at 25 ° C.
  • YPD yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 26%
  • Example 14 The measurement conditions and analysis method are the same as in Example 14.
  • the analysis results are shown in FIG.
  • the yeast before introduction hardly emitted fluorescence, but immediately after mixing with the polymer, the fluorescence intensity increased immediately after 5 minutes.
  • the contact time between the polymer and yeast was increased thereafter, almost no change was observed in the ratio of introduced yeast. That is, it was shown that the probe of the present invention is rapidly introduced into the cell upon contact with the cell, and thus can be easily taken into the cell without requiring a long incubation period.
  • a JASCO ETC-273T water-cooled Peltier thermostatic cell holder was used for temperature control of the solution, and the temperature was measured with an attached thermocouple.
  • the solution temperature was increased in increments of 5 ° C., and the temperature was increased for 10 minutes after the temperature increase so as to keep the temperature inside the cell and the temperature outside, and the fluorescence intensity at each temperature was measured.
  • the fluorescence intensity at 5 ° C. was set to 1, and the vertical axis was expressed as relative fluorescence intensity.
  • the fluorescence wavelength the fluorescence wavelength when the maximum fluorescence intensity of each compound is recorded is used.
  • the polymer developed in the present invention also reflects the intracellular temperature in the cell, and the intracellular fluorescence intensity increased as the temperature increased. .
  • Example 22 Accurate measurement of intracellular temperature by determining fluorescence intensity ratio
  • 0.05% concentration of Compound 3 was mixed and suspended with yeast Saccharomyces SYT001 strain, and the polymer was treated with cells. Introduced. The polymer-introduced yeast is suspended again in water, and the yeast cell suspension is poured into a glass bottom dish (35 mm Glass Base Dish, IWAKI) and placed in a water jacket stage incubator (CRYO-WJMSI, Okolab) to control the temperature.
  • observation was performed using a confocal laser microscope (FV1000, Olympus) and a 100 ⁇ oil immersion objective lens (UplanSApo NA.1.40, Olympus).
  • a 473 nm laser (Multi Ar laser) was applied to the cells, and a fluorescence image (P1) for a fluorescence wavelength from 520 nm to 560 nm and a fluorescence image (P2) for a fluorescence wavelength from 570 nm to 610 nm were observed. Further, an image was created by taking a ratio (P1 / P2) by the processing operation in the FV10-ASW analysis software (Olympus) (P3). The temperature was increased from 15 ° C. to 40 ° C. in increments of 5 ° C., and when the temperature reached a certain level, observation was performed after 10 minutes.
  • FIG. 11 shows an image P3 obtained by taking the ratio of P1 and P2 at 15 ° C. and 35 ° C.
  • FIG. 11 shows an image P3 obtained by taking the ratio of P1 and P2 at 15 ° C. and 35 ° C.
  • FIG. 11 shows the fluorescence intensity ratio in pseudo colors so that the ratio is 0.5 (black) to 1.0 (white).
  • the fluorescence intensity ratio (520 to 560 nm / 570 to 610 nm) was calculated from the fluorescence spectrum at each temperature when compound 3 measured in Example 20 was introduced into yeast. A response curve is shown.
  • the fluorescence intensity ratio (P1 / P2) and the temperature were plotted as shown in FIG. FIG. 12 and FIG. 13 are kept close to each other, and from this, it became clear that the intracellular temperature can be calculated from the fluorescence intensity ratio of the microscope (FIG. 11) using the calibration curve of FIG. .
  • Example 23 Evaluation of probe toxicity
  • the compounds 2 to 7 at concentrations of 0.005%, 0.025%, 0.05% and 0.25% were added to yeast Saccharomyces SYT001 strain. After mixing and suspending, the polymer was introduced into the cells. The yeast introduced with the polymer was washed twice with water, suspended again with water, then spotted on the YPD plate to become 10 4 , 10 3 , 10 2 , 10 cells and cultured at 25 ° C. for 2 days. After that, the plate was photographed and the cytotoxicity was evaluated qualitatively.
  • Example 24 Application of the probe of the present invention to cultured cells Human-derived fetal kidney cells HEK293T and mouse-derived macrophage-like precursor cells RAW264 were cultured in DMEM medium (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin), 35 mm glass bottom dish. (Seeding 1 ⁇ 10 6 cells / ml). One day later, compounds 1, 4 and 7 were added to a final concentration of 0.05%, cultured for 2 hours at 37 ° C., washed with PBS at the time of microscopic observation, and replaced with phenolred-free medium. went.
  • DMEM medium % FBS, 1% penicillin-streptomycin
  • FIG. 15 shows the result of HEK293T
  • FIG. 16 shows the result of RAW264.
  • no signal in the fluorescence image can be observed with Compound 7 having no ionic group, but Compound 4 having the cationic group APTMA introduced has an increased signal intensity inside the cell, whereas anionic Even in the compound 1 into which the group was introduced, a signal into the cell was somewhat observed, but the number and strength were very weak, indicating that the cationic group is important for introducing the probe into the cell. It was also shown that the probe of the present invention can be applied to animal cells.
  • Example 25 Application of the probe of the present invention to Escherichia coli E. coli DH5 ⁇ was inoculated into LB medium (tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 5 g), cultured at 37 ° C. for 16 hours, and then the cell concentration of the culture solution After measuring the absorbance at 600 nm (OD600), the culture solution is centrifuged (12000 rpm, 1 minute), washed twice with water, washed thoroughly, and then purified water so that OD600 is 0.1. Was added and suspended. Compound 4 dissolved in pure water at a concentration of 5% was added to the cell suspension so that the final concentration was 0.05%, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 0.5 hours.
  • LB medium tryptone 10 g, yeast extract 5 g, sodium chloride 5 g
  • the washed Escherichia coli was suspended again in water, poured into a glass bottom dish (35 mm Glass Base Dish, IWAKI), placed on a water jacket stage incubator (CRYO-WJMSI, okolab), and confocal laser microscope (FV1000) while controlling the temperature. Olympus), and a 100 ⁇ oil immersion objective lens (UplanSApo NA 1.40, Olympus).
  • a 473 nm laser Multi Ar laser was applied to the cells, and fluorescence images for fluorescence wavelengths from 500 nm to 600 nm were observed. The temperature at the time of observation was measured at two points of 25 ° C and 41 ° C.
  • results are shown in FIG. As shown in FIG. 17, in E. coli also, the cationic temperature probe of the present invention was introduced into cells, and it became clear that cells with high fluorescence intensity increased according to the temperature. That is, it was shown that this polymer can be applied to microorganisms such as E. coli, and can be applied to various cell types.
  • Example 26 Test of polymer introduction into cells Yeast Saccharomyces SYT001 strain was inoculated into 3 mL of YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) medium, and cultured at 25 ° C. with aerobic shaking for 1 day. After measuring the absorbance (OD600) at 600 nm as the cell concentration of the culture solution, the culture solution is centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), washed twice with water and sufficiently washed, and then OD600 becomes 1. So that pure water was added and suspended. Compound 8 dissolved in pure water at a concentration of 5% was added to the cell suspension so that the final concentration was 0.05%, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. for 0.5 hours.
  • YPD yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) medium
  • the mixture was centrifuged (10000 rpm, 1 minute), the supernatant was quickly removed, and washing with cold water was performed once again.
  • the washed yeast is suspended again in water, and the yeast cell suspension is placed on a slide glass (Super Frost: MATUNAMI) and sealed with a cover glass (MATUNAMI), then the slide glass is placed on a stage (Olympus) and confocal.
  • the observation was performed using a laser microscope (FV1000, Olympus) and a 100 ⁇ oil immersion objective lens (UplanSApo NA.1.40, Olympus).
  • a 473 nm laser Multi Ar laser was applied to the cells, and fluorescence images for fluorescence wavelengths from 500 nm to 600 nm were observed.
  • FIG. 18 shows a fluorescence image when compound 8 is introduced. Even when not only APTMA but also VBTMA, which is a cationic unit, is contained in the unit, a region with high fluorescence intensity was observed inside the cell so as to overlap the differential interference image. From this, it was found that substances other than APTMA can be used for the cell-introduced cationic unit.
  • Example 27 Thermal sensitivity test The thermal sensitivity test of Compound 8 in 150 mM KCl was performed according to the following procedure. Using a JASCO FP-6500 spectrofluorometer, KCl purchased from Wako Pure Chemicals was dissolved to a concentration of 150 mM using ultrapure water obtained from Millipore's Milli-Q reagent system as a solvent. A thing was used. The initial concentration of the compound in this experiment was 0.01 w / v%, and the excitation wavelength was 456 nm. A JASCO ETC-273T water-cooled Peltier thermostatic cell holder was used for temperature control of the solution, and the temperature was measured with an attached thermocouple. The solution temperature was increased in increments of 2 ° C., and the fluorescence intensity at each temperature was measured.
  • a JASCO ETC-273T water-cooled Peltier thermostatic cell holder was used for temperature control of the solution, and the temperature was measured with an attached thermocouple.
  • the solution temperature was increased in increments of 5 ° C., and the temperature was increased for 10 minutes after the temperature increase so as to keep the temperature inside the cell and the temperature outside, and the fluorescence intensity at each temperature was measured.
  • the fluorescence intensity at 5 ° C. was set to 1, and the vertical axis was expressed as relative fluorescence intensity.
  • the fluorescence wavelength the fluorescence wavelength when the maximum fluorescence intensity of each compound is recorded is used.
  • the polymer developed in the present invention also reflects the intracellular temperature in the cell, and the intracellular fluorescence intensity increased as the temperature increased. . According to the results of Examples 26 to 28, even with a probe using a cationic unit other than APTMA, the probe can be easily introduced into the cell and has a function of increasing the fluorescence intensity in response to a temperature rise in the cell. It became clear.
  • Example 29 Polymer introduction test of compounds 9 and 10 into yeast cells
  • the yeast Saccharomyces SYT001 strain was inoculated into 3 mL of YPD (yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 2%) medium, and the mixture was preferably cultured at 25 ° C for 1 day. Cultured with shaking. After measuring the absorbance (OD600) at 600 nm as the bacterial cell concentration of the culture solution, the culture solution was centrifuged (3000 rpm, 5 minutes), washed twice with 1.2 M sorbitol, and thoroughly washed. 1.2 M sorbitol was added so that it became 1, and it suspended.
  • YPD yeast extract 1%, peptone 2%, glucose 26%
  • the observation was performed using a confocal laser microscope (FV1000, Olympus) and a 100 ⁇ oil immersion objective lens (UplanSApo NA.1.40, Olympus).
  • a 473 nm laser Multi Ar laser was applied to the cells, and fluorescence images for fluorescence wavelengths from 500 nm to 600 nm were observed.
  • FIG. 21 shows a fluorescence image when the compounds 9 and 10 are introduced. It was confirmed that the probe could be introduced into the cells even if a thermosensitive unit other than NNPAM was used. It was also confirmed that the probe could be introduced into the cells when two thermosensitive response units, NIPAM and NNPAM, were used.
  • Example 30 Thermal sensitivity test The thermal sensitivity test of compounds 2, 9 and 10 in 150 mM KCl was carried out as in Example 16. The solution temperature was increased in increments of 2 ° C., and the fluorescence intensity at each temperature was measured.
  • the test results are shown in FIG. It was confirmed that the temperature response region can be changed by changing the thermosensitive response site from NNPAM to NIPAM.
  • NNPAM / NIPAM in which both monomers were mixed at a ratio of 1: 1, it was found that the NNPAM / NIPAM was located in the middle of the temperature response region of NNPAM and NIPAM. It was confirmed that a fluorescent temperature sensor responding to an arbitrary temperature range around -50 ° C. can be produced.
  • a JASCO ETC-273T water-cooled Peltier type thermostatic cell holder was used for temperature control of the solution, and the temperature in the cell holder was measured with an attached thermometer.
  • the solution temperature was raised in increments of 5 ° C., and the temperature was raised for 5 minutes after the temperature was raised so that the temperature inside the cell and the temperature outside were kept constant, and the fluorescence intensity at each temperature was measured.
  • the fluorescence intensity at 10 ° C. was 1, and the vertical axis was represented by relative fluorescence intensity.
  • the fluorescence wavelength the fluorescence wavelength when the maximum fluorescence intensity of each compound is recorded is used.
  • the thermosensitive response site is NNPAM
  • the thermosensitive response site can be freely changed according to the intracellular temperature region to be measured without greatly changing the response region in the cell. I was able to prove that
  • Example 32 Thermal response test of change in fluorescence lifetime Using the yeast suspension containing compounds 2, 9 and 10 prepared in Example 31, a thermal response test of change in fluorescence lifetime was conducted.
  • the excitation wavelength was set to 456 nm using a FluoroCube 3000U (Horiba Jobin Yvon) time-correlated single photon counting fluorescence lifetime measurement apparatus.
  • measurement was performed using an LED (NanoLED-456, Horiba) at a pulse repetition rate of 1 MHz.
  • a JASCO ETC-273T water-cooled Peltier type thermostatic cell holder was used for temperature control of the solution, and the temperature in the cell holder was measured with an attached thermometer.
  • the fluorescence lifetime at each temperature was measured at a fluorescence wavelength of 560 nm.
  • the obtained fluorescence decay curve was approximated by the following formula to obtain a two-component fluorescence lifetime.
  • the average fluorescence lifetime at each temperature was calculated from the obtained fluorescence lifetime using the following formula.
  • Example 33 Introduction of probe into cultured cells (floating cells) MOLT-4 (human acute lymphoblastic leukemia (T-cell)) was cultured in RPMI 1640 medium (10% FBS) in a 100 mm dish (seeding 1 ⁇ 10 6 cells / ml). One day later, 3 ml of the culture solution is centrifuged (1000 rpm, 1 minute), the medium is removed, washed with 5% glucose, suspended in 1 ml of 5% glucose again, and compound 2 is added to a final concentration of 0.05%. did.
  • RPMI 1640 medium 10% FBS
  • Example 34 Fluorescence intensity response of compounds 9 and 10 in cultured cells (floating cells) Compounds 2, 9 and 10 were introduced into MOLT-4 and suspended in PBS as in Example 33. In addition, a spherical stirring bar having a diameter of 2 mm was placed in the cuvette. The cuvette was set on a JASCO FP-6500 spectrofluorometer and rotated at a speed of about 800 rpm to measure the fluorescence spectrum while preventing the cells from sinking. The excitation wavelength was 456 nm. A JASCO ETC-273T water-cooled Peltier type thermostatic cell holder was used for temperature control of the solution, and the temperature in the cell holder was measured with an attached thermometer. The solution temperature was raised in increments of 5 ° C., and the temperature was raised for 5 minutes after the temperature was raised so that the temperature inside the cell and the temperature outside were kept constant, and the fluorescence intensity at each temperature was measured.
  • Results are shown in FIG. From the low temperature region side, it was revealed that the cells responded in the order of NNPAM, NNPAM / NIPAM, and NIPAM. This is the same as the experimental result of the yeast of Example 31, and it was shown that a thermosensitive response unit corresponding to the target measurement temperature can be selected and measured also in cultured cells.
  • Example 35 Fluorescence lifetime response of compounds 9 and 10 in cultured cells (floating cells) Fluorescence lifetime was measured using MOLT-4 into which compound 2, 9 or 10 prepared as in Example 33 was introduced. . The measurement was performed in a state suspended in PBS, and the measurement method was exactly the same as in Example 32.
  • thermosensitive response unit corresponding to the target measurement temperature can be selected and measured in cultured cells.
  • Example 36 Effect of Compounds 9 and 10 on Microscopic Observation HEK293T was cultured in DMEM medium (10% FBS, 1% penicillin-streptomycin) in a 35 mm glass bottom dish (seeding 1 ⁇ 10 6 cells / ml). After 1 day, the medium was replaced with 5% glucose, Compound 2, 9 or 10 was added to a final concentration of 0.05%, washed at 15 ° C. for 10 minutes, washed with PBS, and then replaced with phenolred-free medium. Then, microscopic observation was performed.
  • DMEM medium 10% FBS, 1% penicillin-streptomycin
  • thermosensitive unit When NNPAM is used for the thermosensitive unit, the fluorescence intensity does not increase much around 37 ° C, which is the optimum cell growth temperature, whereas strong fluorescence around 37 ° C is obtained by using NNPAM / NIPAM. It was clear from microscopic observation that a response was seen. Further, it was expected that higher temperature regions could be measured by using NIPAM. From this result, it was shown that the thermosensitive unit can be properly used in the microscopic observation.
  • Example 37 Effect of Compound 9 in Microscopic Observation (Fluorescence Intensity Ratio Measurement) Using the sample in which Compound 9 was introduced into HEK293T as in Example 36, the fluorescence intensity ratio was measured, and the temperature was independent of the fluorescence intensity. It was investigated whether measurement was possible. Microscopic observation was performed using a confocal laser microscope (FV1000, Olympus) and a 60 ⁇ oil immersion objective lens (UplanSApo NA 1.40, Olympus).
  • a 473 nm laser (Multi Ar laser) is applied to the cells, the fluorescence image (CH1) for the fluorescence wavelength from 500 nm to 550 nm, the fluorescence image (CH2) for the fluorescence wavelength from 600 nm to 650 nm, and the fluorescence intensity of CH1 to the fluorescence of CH2.
  • CH1 fluorescence image
  • CH2 fluorescence image
  • CH2 fluorescence intensity

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Abstract

　感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する方法が提供され、該方法は、カチオン性ユニットをさらに含む前記共重合体を温度感受性プローブとして用い、かつ、該共重合体を溶媒中で細胞と混合する工程を含む。前記共重合体は、カチオン性基を有することにより、特殊な方法を使わずとも細胞内に共重合体が入り込むため、細胞内の温度を測定する蛍光温度センサーとして好適に使用することができる。

Description

細胞内に導入するための温度感受性蛍光プローブ 関連出願の参照
　本特許出願は、先に出願された日本国における特許出願である特願２０１１－２８０２０２号（出願日：２０１１年１２月２１日）に基づく優先権の主張を伴うものである。この先の特許出願における全開示内容は、引用することにより本明細書の一部とされる。
　本発明は、新規な蛍光性ポリマーおよび当該ポリマーを用いた細胞内温度の簡便な測定方法に関する。
　細胞が栄養源を取り込み、代謝によってエネルギーを取り出す過程で生じる多くの化学反応は、温度に大きく依存している。つまり、細胞の数々の機能や反応は、細胞内外の温度によって制御されている、と言える。例えば、温度という物性を利用した研究は、医療研究に多く見られ、がん細胞での異常な熱発生などが報告されている（非特許文献１：Ｓｃａｎｄ． J．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８６年，第３６巻，第３５３～３５７頁）。代謝活性の高いガン細胞と、そうでない正常細胞の識別に、熱発生を用いることが可能である。これを利用して、熱発生をターゲットにした治療法や創薬等の開発も検討されている。
　医療研究のみならず、温度制御による細胞の代謝活性制御技術は、発酵などの微生物を利用した食品業界でも重要である。例えば、酒類醸造においては、酵母から発生する熱量とエタノールの産生量に相関があることが研究されている（非特許文献２：Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． １９８９年，第３４巻，第８６～１０１頁）。
　一方で、温度が生物学的な重要な指標になっていることに加え、細胞内の重要な反応の多くは細胞内で行われているにも関わらず、細胞内の温度を測定しようという試みは非常に少ない。それは細胞レベルでの微小領域の温度測定法が確立されていないことが1つの要因であった。しかしながら、近年の研究で、温度の変化に伴って物性が変化する分子の温度センサーとしての使用が検討され始め（非特許文献３：Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９５年，第６２巻，第４１６～４２５頁；非特許文献４：Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２００４年，第３７巻，第２９３８～２９４３頁；非特許文献５：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年，第７８巻，第５０９４～５１０１頁；非特許文献６：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００５年，第８７巻，第２０１１０２頁；非特許文献７：Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８年，第７４巻，第８２～８９頁）、特に最小機能単位を１分子とする高機能な分子温度センサーが開発され、細胞への応用が検討され始めた。
　分子温度センサーの一例として、感熱性ポリマーであるポリアクリルアミドに環境応答性の蛍光団である２，１，３－ベンゾオキサジアゾリル基を組み込むという原理に基づいた蛍光性温度センサーが既に報告されている（非特許文献８：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年，第７５巻，第５９２６～５９３５頁）。この蛍光性温度センサーは、主鎖であるポリアクリルアミドの熱による相転移により、水性溶液中で温度上昇に伴って蛍光強度が増加するという特性を有するため、蛍光強度を測定することにより系中の温度の変化を観測することができる。
　また、ポリマーの製造時に架橋剤を添加して得られる、蛍光団が組み込まれたポリアクリルアミドのマイクロゲルの、蛍光性温度センサーとしての使用についても報告されている（非特許文献９：Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１５巻，第２７９６～２８００頁；非特許文献１０：Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年，第１３１巻，第２７６６～２７６７頁）。さらに、イオン性官能基をポリマー内部に入れ込むことによって、凝集を防ぎ、かつ測定温度範囲を広くすることが可能となることが報告されている（特許文献１：国際公開第２００８／０２９７７０号パンフレット）。
　感熱性応答部位として用いる主鎖のアクリルアミドの側鎖の構造を変えることにより、水溶液中でセンサーが応答する温度領域を自由に変化できることは既に報告されており（非特許文献１１：Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年，第７６巻，第１７９３～１７９８頁）、測定対象の温度領域に応じて、感熱性応答部位に複数のアクリルアミド分子を使用することも可能であった。
Ｓｃａｎｄ． J．Ｈａｅｍａｔｏｌ．１９８６年，第３６巻，第３５３～３５７頁 Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ． １９８９年，第３４巻，第８６～１０１頁 Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ．Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．１９９５年，第６２巻，第４１６～４２５頁 Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｄ：Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．２００４年，第３７巻，第２９３８～２９４３頁 Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００６年，第７８巻，第５０９４～５１０１頁 Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓ．Ｌｅｔｔ．２００５年，第８７巻，第２０１１０２頁 Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．１９９８年，第７４巻，第８２～８９頁 Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００３年，第７５巻，第５９２６～５９３５頁 Ｊ．Ｍａｔｅｒ．Ｃｈｅｍ．２００５年，第１５巻，第２７９６～２８００頁 Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９年，第１３１巻，第２７６６～２７６７頁 Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．２００４年，第７６巻，第１７９３～１７９８頁
国際公開第２００８／０２９７７０号パンフレット
　蛍光団が組み込まれた直鎖型または架橋型のポリアクリルアミドを利用する蛍光性温度センサーに関して、既に報告されているポリマーは、細胞内での温度測定を可能にするという利点はあったが、ポリマーの細胞内への導入法には、高い技術を有するマイクロインジェクション法を利用しなければならないという問題を有していた。
　さらに、細胞内への物質導入法として、マイクロインジェクション法を利用することのできない微生物や植物細胞では、これらポリマーを利用できないという非常に大きな問題を有していた。
　加えて、細胞内に代表されるような限られた微小空間内の温度を測定する際には、温度に応答するポリマーから発せられる蛍光強度が、ポリマーの置かれている温度に起因するものか、あるいはその微小空間内に存在しているポリマーの濃度に起因するものかわからないという問題を有していた。
　そして、溶液中ではアクリルアミド分子を変えることによって、温度領域を変化できることはわかっていたが、細胞内ではタンパク質、核酸および脂質など様々な分子とセンサーが相互作用してしまうことも考えられるため、アクリルアミド分子を変える事によって温度領域を自由に変えられるかどうかはわからず、ましてや１つのセンサー内に複数のアクリルアミド分子を用いた場合に、細胞内でセンサーがどのような応答をするのかは全く予想がつかず、実際に細胞内を測定対象とする温度領域のセンサーを自由に作れるかはわからないという問題を有していた。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を進めたところ、ポリマーにカチオン性のユニットを導入することにより、酵母などの微生物、動物細胞、植物細胞などの多くの細胞に適応可能で、かつ、マイクロインジェクションなどの高度な技術を必要としない実用性の高い細胞内蛍光性温度センサーとして利用できることを見出した。さらに、導入したポリマーを用いて得られた複数の波長における蛍光強度の比率から温度を算出することにより、より汎用的かつ正確に細胞内または微小空間内の温度を測定できることを見出した。さらに、蛍光寿命を指標とすることによっても、細胞内または微小空間内の温度を良好に測定できることも確認した。さらに、複数種の感熱性ユニットを１つの分子内に含む共重合体を温度感受性プローブとして用いることにより、細胞内において温度応答領域を細かく設定することが可能であることを見出した。本発明はこれら知見に基づくものである。
　すなわち、本発明の第一の態様によれば、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する方法が提供され、該方法は、カチオン性ユニットをさらに含む前記共重合体を温度感受性プローブとして用い、かつ、該共重合体を溶媒中で細胞と混合する工程を含む。
　さらに、本発明によれば、細胞内の温度を測定する方法が提供され、該方法は、（ａ）本発明の第一の態様による方法に従って、温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程を含む。
　本発明の第二の態様によれば、細胞内の温度を測定する方法が提供され、該方法は、（ａ）感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および（ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程を含んでなり、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。
　本発明の第三の態様によれば、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを用いて温度を測定する方法が提供され、該方法は、（ａ）前記温度感受性プローブを溶解する工程、（ｂ）励起光照射下、蛍光強度を測定する工程、および（ｃ）２つの波長領域における蛍光強度の比を算出する工程を含む。
　本発明の第四の態様によれば、本発明の第一から第三までの態様による方法を用いて温度を測定するためのキットが提供され、該キットは、前記方法に用いられる温度感受性プローブを含んでなる。
　本発明に用いられる共重合体は、カチオン性基を有することにより、特殊な方法を使わずとも細胞内に共重合体が入り込むため、細胞内の温度を測定する蛍光温度センサーとして好適に使用することができる。本発明は、酵母等の微生物、動物細胞、植物細胞など、多種多様な細胞に応用できる。また、共重合体から発せられる蛍光を、ある２領域での蛍光強度の比として算出すること、もしくは蛍光寿命を測定パラメータとすることにより、測定値が温度に特有の値になり、共重合体の濃度に依存しない、より正確な温度測定法を提供することが可能である。さらに、本発明によれば、複数の感熱性ユニットを組み合わせることにより、測定に適した温度領域を自在に設定することが可能である。
化合物１～７と酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）ときの写真の一例である。 化合物２～６を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１と混合し、フローサイトメーターで酵母細胞の蛍光をカウントした（励起光：４８８ｎｍ、蛍光：５１５ｎｍ～５４５ｎｍ）場合のヒストグラムである。 化合物１～７をアガロースゲル電気泳動し、各化合物のイオン強度を定性的に評価した図である。 化合物２～６（黒菱形：化合物２、白四角：化合物３、黒丸：化合物４、黒三角：化合物５、白菱形：化合物６）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ）の一例である。 ０、１５０、２００および２５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中における化合物２（いずれも０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ、蛍光波長５６６ｎｍ）の感熱応答性試験の結果（黒菱形：水中、白丸：１５０ｍＭ　ＫＣｌ中、白三角：２００ｍＭ　ＫＣｌ中、黒四角：２５０ｍＭ　ＫＣｌ中を示す）の一例である。 ｐＨ４および７の水中における化合物２（いずれも０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ、蛍光波長５６６ｎｍ）の感熱応答性試験（白丸：ｐＨ４、黒四角：ｐＨ７）の一例である。 化合物２および３を、水、１Ｍソルビトール、ＰＢＳ、ＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）、５０ｍＭ ＫＣｌ、１００ｍＭ ＫＣｌの６種類の溶液・培地中で酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１と混合し、フローサイトメーターで酵母細胞の蛍光をカウントした（励起光：４８８ｎｍ、蛍光：５１５ｎｍ～５４５ｎｍ）場合のヒストグラムである。 化合物２を、水中で酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１と混合し、５、１０、２０、３０または６０分間静置した後に、フローサイトメーターで酵母細胞の蛍光をカウントした（励起光：４８８ｎｍ、蛍光：５１５ｎｍ～５４５ｎｍ）場合のヒストグラムである。 酵母細胞中における化合物２、３、４および６の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（黒菱形：化合物２、黒四角：化合物３、白三角：化合物４、Ｘ：化合物６）。 化合物３を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１の細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５２０－５６０ｎｍ）ときの写真の一例である。 化合物３を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１の細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長５２０－５６０ｎｍの蛍光像（Ｐ１）と蛍光波長５７０－６１０ｎｍの蛍光像（Ｐ２）の比をとることにより得られた蛍光像（Ｐ３）の一例である。 蛍光分光光度計を用いて、化合物３を酵母に導入した際の各温度における蛍光スペクトルから蛍光強度比（５２０～５６０ｎｍ／５７０～６１０ｎｍ）を算出し、各温度に対する蛍光強度比をプロットして得られた温度応答曲線の一例を示す。 蛍光顕微鏡を用いて、化合物３を酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１の細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長５２０－５６０ｎｍの蛍光像（Ｐ１）からの蛍光強度と蛍光波長５７０－６１０ｎｍの蛍光像（Ｐ２）からの蛍光強度の比（Ｐ１／Ｐ２）を算出し、各温度に対する蛍光強度比をプロットして得られた温度応答曲線の一例を示す。 ０．００５％、０．０２５％、０．０５％または０．２５％の濃度の化合物２～７を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入し、ポリマーが導入された酵母を２回水で洗浄し、再度水で懸濁した後、ＹＰＤプレートに１０４、１０３、１０２または１０細胞となるようにスポットして、２日間２５℃で培養した後に撮影したプレートの写真である。 ヒト由来胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔを、終濃度０．０５％の化合物１、４または７と混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察して得られた蛍光像（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）を示す。 マウス由来マクロファージ様前駆細胞ＲＡＷ２６４を、終濃度０．０５％の化合物１、４または７と混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察して得られた蛍光像（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）を示す。 化合物４と大腸菌ＤＨ５αとを混合し、２５℃または４１℃の温度条件下において共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）ときの写真の一例である。 化合物８と酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）ときの写真の一例である。 化合物８（黒菱形）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ）の一例である。 酵母細胞中における化合物８の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（黒菱形）。 化合物９または１０と酵母サッカロマイセスセレビシエＳＹＴ００１とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）ときの写真の一例である。 化合物２、９および１０（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）の１５０ｍＭ塩化カリウム水溶液中での蛍光強度の感熱応答性試験結果（０．０１ｗ／ｖ％、励起波長４５６ｎｍ）の一例である。 酵母細胞中における化合物２、９および１０の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。 酵母細胞中における化合物２、９および１０の蛍光寿命の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。 化合物２と浮遊細胞であるＭＯＬＴ－４細胞とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）ときの写真の一例である。 培養細胞（浮遊細胞であるＭＯＬＴ４）中における化合物２、９および１０の蛍光強度の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。 培養細胞（浮遊細胞であるＭＯＬＴ４）中における化合物２、９および１０の蛍光寿命の感熱応答性試験の結果の一例である（白丸：化合物２、黒丸：化合物９、白三角：化合物１０）。 化合物２、９または１０とＨＥＫ２９３Ｔ細胞とを混合し、共焦点レーザー顕微鏡で観察した（励起波長４７３ｎｍ、蛍光波長５００－６００ｎｍ）ときの写真の一例である。 化合物９をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内に導入し、共焦点レーザー顕微鏡で観察し（励起波長４７３ｎｍ）、蛍光波長５００－５５０ｎｍの蛍光像（ＣＨ１）と蛍光波長６００－６５０ｎｍの蛍光像（ＣＨ２）の比をとることにより得られた蛍光像（Ｒａｔｉｏ：ＣＨ１／ＣＨ２）の一例である。
発明の具体的説明
　本発明の第一の態様において温度感受性プローブとして用いられる共重合体は、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットに加えて、カチオン性ユニットを含む。これにより、該共重合体を溶媒中で細胞と混合することにより、該共重合体を細胞内に導入することが可能となる。このような共重合体は、マイクロインジェクション法等の方法によって細胞内に導入することも可能であるが、そのような高度な技術を利用するまでもなく、細胞と共に混合するだけで細胞内に導入される。また、マイクロインジェクション法を利用することのできない微生物や植物細胞などの多種多様な細胞に簡便に導入できる点も、上記の共重合体の利点である。
　本発明に用いられる共重合体に組み込まれるカチオン性ユニットは、１以上の正電荷を有するイオン性官能基を含むモノマーに由来する繰り返し構造であればよく、特に限定されない。このようなモノマーとしては、好ましくは以下の式（ｂ）で表されるモノマーが用いられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｒ２は、水素原子およびＣ１－３アルキルから選択され；
　Ｗは、芳香環または－Ｘ１－Ｃ（＝Ｏ）－（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；
　Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ－Ｒ１１であり；
　Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１－６アルキル、または－Ｑ１－Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
　Ｑ１は、独立に、Ｃ１－２０アルキレン、Ｃ３－２０アルケニレン、またはＣ３－２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－Ｏ－またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
　Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、－Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ －、－Ｃ（＝ＮＲ４１）－ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 により表される基から選択され；
　Ｘｅ －およびＸｆ －はカウンターアニオンであり；
　Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１－１０アルキル、およびＣ７－１４アラルキルから選択され、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５～７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
　Ｒ２４は、Ｃ１－１０アルキル、またはＣ７－１４アラルキルであり；
　Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１－１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５～７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５～７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］。
　本発明に用いられる共重合体に含まれる感熱性ユニットは、温度に応じてその形状が変化する繰り返し構造であればよく、特に限定されないが、好ましくはアクリルアミドを基本骨格として有するモノマーに由来する繰り返し構造とされる。このようなアクリルアミドを基本骨格として有するモノマーとしては、例えば、以下の式（ａ）で表されるモノマーが挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 ［式中、Ｒ１は、水素原子およびＣ１－３アルキルから選択され；
　Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１－２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４～８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１－１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］。
　本発明に用いられる共重合体に含まれる蛍光性ユニットは、感熱性ユニットの形状の変化に応じて蛍光強度が変化する繰り返し構造であればよく、特に限定されない。このような繰り返し構造としては、例えば、以下の式（ｃ）で表されるモノマーに由来するものが挙げられる：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、Ｒ３は、水素原子およびＣ１－３アルキルから選択され；
　Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮ－Ｒ１２であり；
　Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（－Ｒ１３）、ＣＯＮ（－Ｒ１６）、Ｎ（－Ｒ１６）ＣＯ、Ｎ（－Ｒ１７）ＣＯＮ（－Ｒ１８）、ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）またはＮ（－Ｒ１９）ＳＯ２であり；
　Ｑ２は、Ｃ１－２０アルキレン、Ｃ３－２０アルケニレン、またはＣ３－２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
　Ａｒは、６～１８員芳香族炭素環基、または５～１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する－ＣＨ２－は－Ｃ（Ｏ）－に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１－６アルキルカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、－ＮＲ６Ｒ７、および－ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、Ｃ１－６アルキルカルボニルおよびＣ１－６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１－６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
　Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１－１０アルキル、アリール、Ｃ１－１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１－１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ－（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ－ジ（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ１－１０アルキル、Ｃ１－１０アルキルカルボニル、Ｃ１－１０アルキルスルホニル、Ｎ－（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ－ジ（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１－６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
　Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４～８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１－１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
　Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル、または－Ｑ２－Ｘ３－Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
　Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１－６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
　Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１－６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４～８員含窒素ヘテロ環を形成し；
　Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素原子、およびＣ１－６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］。
　本発明の好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（ａ）で表されるモノマー、式（ｂ）で表されるモノマー、および式（ｃ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体とされる。
　本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（Ｉ）、（ＩＩ）および（ＩＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙ、Ｗ、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ１、Ｑ２およびＡｒは、既に定義したとおりである］
で表される繰り返し単位を含む共重合体とされる。
　本発明のさらに好ましい実施態様によれば、本発明に用いられる共重合体は、式（ＩＶ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 ［式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｙ、Ｗ、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ１、Ｑ２およびＡｒは、既に定義したとおりであり、ａ、ｂおよびｃは、式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
で表される共重合体とされる。この共重合体では、ａおよびｂの和は１００であり、ｂは、好ましくは２～１０とされ、ｃは、好ましくは０．０５～２とされる。また、この共重合体は、物質そのものとして本発明の一つの態様をなす。
　本発明の好ましい実施態様によれば、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。感熱性ユニットには様々な種類のものがあり、その種類に応じて、最も高い温度反応性を示す温度域が異なる。この実施態様では、２種以上の感熱性ユニットを組み合わせることにより、所望の温度域において共重合体の温度反応性が高くなるように調整することができる。本発明のより好ましい実施態様によれば、前記共重合体は、前記式（ａ）で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。また、一つの実施態様では、２種類の感熱性ユニットが用いられる。例えば、動物細胞の一般的な培養温度である３５℃付近の測定では、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（ＮＮＰＡＭ）とＮ－イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）との組み合わせを用いることが好ましい。また、酵母等の微生物の発酵をモニターする等の目的で２５℃以下の温度領域の測定が必要になる場合には、Ｎ―ｔｅｒｔ-ブチルアクリルアミド（ＮＴＢＡＭ）とＮＮＰＡＭとの組み合わせを用いることが好ましい。
　式（ＩＶ）におけるaは、感熱性ユニット全体の総和を表すものであり、２種以上の感熱性ユニットを用いた場合には、全ての感熱性ユニットの繰り返し単位数の比率の和を意味する。
　本発明の好ましい実施態様によれば、上述の共重合体において、Ａｒは、下式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
 により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１－６アルキルカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、－ＮＲ６Ｒ７、および－ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、Ｃ１－６アルキルカルボニルおよびＣ１－６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１－６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
　Ｘ１０は、Ｏ、ＳまたはＳｅから選択され；
　Ｒ８は、水素原子、Ｃ１－１０アルキル、およびアリールから選択され、当該アルキルは、
ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１－６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリールは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
　本発明のさらに好ましい実施態様によれば、Ａｒは、下式：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
 により表される基から選択される芳香族炭素環基または芳香族ヘテロ環基であり、これらの基は当該環上をハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、ニトロ、Ｃ１－６アルキルカルボニルアミノ、アリールカルボニルアミノ、シアノ、ホルミル、Ｃ１－６アルキルカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、カルボキシおよび－ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよい。
　本明細書において「Ｃ１－３アルキル」とは、炭素数１～３の直鎖状、分岐鎖状、または環状のアルキル基を意味し、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、シクロプロピルが含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－６アルキル」とは、炭素数１～６の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｉ－プロピル、ｎ－ブチル、ｓ－ブチル、ｉ－ブチル、ｔ－ブチル、ｎ－ペンチル、３－メチルブチル、２－メチルブチル、１－メチルブチル、１－エチルプロピル、ｎ－ヘキシル、４－メチルペンチル、３－メチルペンチル、２－メチルペンチル、１－メチルペンチル、３－エチルブチル、および２－エチルブチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロプロピルメチルなどが含まれ、例えば、Ｃ１－４アルキルおよびＣ１－３アルキルなども含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－１０アルキル」とは、炭素数１～１０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１－６アルキルおよびＣ１－３アルキルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－２０アルキル」とは、炭素数１～２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキル基を意味し、例えば、既に定義したＣ１－１０アルキル、Ｃ１－６アルキルおよびＣ１－３アルキルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－６アルコキシ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１～６のアルキル基を有するアルキルオキシ基を意味し、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ、ｉ－プロポキシ、ｎ－ブトキシ、ｓ－ブトキシ、ｉ－ブトキシ、ｔ－ブトキシ、ｎ－ペントキシ、３－メチルブトキシ、２－メチルブトキシ、１－メチルブトキシ、１－エチルプロポキシ、ｎ－ヘキシルオキシ、４－メチルペントキシ、３－メチルペントキシ、２－メチルペントキシ、１－メチルペントキシ、３－エチルブトキシ、シクロペンチルオキシ、シクロヘキシルオキシ、シクロプロピルメチルオキシなどが含まれ、例えば、Ｃ１－４アルコキシおよびＣ１－３アルコキシなども含まれる。
　本明細書において「アリール」とは、６～１０員芳香族炭素環基を意味し、例えば、フェニル、１－ナフチル、２－ナフチルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ７－１４アラルキル」とはアリール基を含む炭素数が７～１４のアリールアルキル基を意味し、例えば、ベンジル、１－フェネチル、２－フェネチル、１－ナフチルメチル、２－ナフチルメチルなどが含まれる。
　本明細書においてハロゲン原子としては、例えばフッ素原子、塩素原子、臭素原子およびヨウ素原子などが挙げられる。
　本明細書において「Ｃ１－２０アルキレン」とは、炭素数１～２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキレン基を意味し、例えば、メチレン、エチレン、プロピレン、ブチレンなど、さらにＣ１－１０アルキレンおよびＣ１－６アルキレンなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ３－２０アルケニレン」とは、炭素数３～２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルケニレン基を意味し、例えば、プロペニレン、ブテニレンなど、さらにＣ３－１０アルケニレンおよびＣ３－６アルケニレンなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ３－２０アルキニレン」とは、炭素数３～２０の直鎖状、分岐鎖状、環状または部分的に環状のアルキニレン基を意味し、例えば、プロピニレン、ブチニレンなど、さらにＣ３－１０アルキニレンおよびＣ３－６アルキニレンなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－６アルキルチオ」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１～６のアルキル基を有するアルキルチオ基を意味し、例えば、メチルチオ、エチルチオ、ｎ－プロピルチオ、ｉ－プロピルチオ、ｎ－ブチルチオ、ｓ－ブチルチオ、ｉ－ブチルチオ、ｔ－ブチルチオなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－６アルキルスルフィニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１～６のアルキル基を有するアルキルスルフィニル基を意味し、例えば、メチルスルフィニル、エチルスルフィニル、ｎ－プロピルスルフィニル、ｉ－プロピルスルフィニル、ｎ－ブチルスルフィニル、ｓ－ブチルスルフィニル、ｉ－ブチルスルフィニル、ｔ－ブチルスルフィニルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－６アルキルスルホニル」とは、アルキル部分として既に定義した炭素数１～６のアルキル基を有するアルキルスルホニル基を意味し、例えば、メチルスルホニル、エチルスルホニル、ｎ－プロピルスルホニル、ｉ－プロピルスルホニル、ｎ－ブチルスルホニル、ｓ－ブチルスルホニル、ｉ－ブチルスルホニル、ｔ－ブチルスルホニルなどが含まれる。
　本明細書において「６～１８員芳香族炭素環基」とは、例えば、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピレニル、インダニル、テトラリニルなどが含まれる。
　本明細書において「５～１８員芳香族ヘテロ環基」とは、酸素、窒素および硫黄から選択される１以上のヘテロ原子を有する芳香族ヘテロ環であり、例えば、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、ピリジル、インドリル、キノリル、キノキサリニル、キナゾリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチエニル、ベンゾピラニル、ベンゾクロメニルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ２－６アルケニルスルホニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２－６アルケニル基を有するアルケニルスルホニル基を意味し、例えばビニルスルホニル、アリルスルホニルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ２－６アルケニルカルボニル」とは、アルケニル部分として既に定義したＣ２－６アルケニル基を有するアルケニルカルボニル基を意味し、例えばアクリロイル、メタクリロイルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ２－６アルキニルカルボニル」とは、アルキニル部分として既に定義したＣ２－６アルキニル基を有するアルキニルカルボニル基を意味し、例えばエチニルカルボニルなどが含まれる。
　本明細書において「Ｃ１－６アルキルカルボニル」とは、基－ＣＯ（Ｃ１－６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１－６アルキルは既に定義したとおりである。
　本明細書において「Ｃ１－６アルコキシカルボニル」とは、基－ＣＯ（Ｃ１－６アルコキシ）を表し、ここで当該Ｃ１－６アルコキシは既に定義したとおりである。
　本明細書において「Ｃ１－６アルキルカルボニルアミノ」とは、基－ＮＨＣＯ（Ｃ１－６アルキル）を表し、ここで当該Ｃ１－６アルキルは既に定義したとおりである。
　本明細書において「Ｃ１－６アリールカルボニルアミノ」とは、基－ＮＨＣＯ（アリール）を表し、ここで当該アリールは既に定義したとおりである。
　本明細書における「５～７員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など飽和ヘテロ環が含まれる。
　本明細書における「４～８員含窒素ヘテロ環」には、例えば、ピロール環、アゼチジン環、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環など、および５～７員含窒素ヘテロ環が含まれる。
　本明細書における「２つの窒素原子を含む５～７員ヘテロ環」には、例えば、イミダゾリジン、テトラヒドロピリミジンなどが含まれる。
　本明細書において、アルキレンが１以上の個所においてＯが挿入されている場合、当該アルキレン鎖は主鎖中にエーテル結合を含むことになり、当該挿入は安定な構造となるために、－Ｏ－Ｏ－および－Ｏ－ＣＨ２－Ｏ－の構造とならないように行われることは当業者であれば容易に理解するはずである。以上のことはアルキレンへのＳの挿入においても当てはまる。
　本明細書において「カウンターアニオン」とは、有機化学の技術分野で有機化合物のカウンターアニオンとして通常用いられるアニオンであれば特に制限されず、例えば、ハロゲン化物アニオン（塩化物イオン、臭化物イオン、フッ化物イオン、ヨウ化物イオン）、有機酸の共役塩基（例えば酢酸イオン、トリフルオロ酢酸イオン）、硝酸イオン、硫酸イオン、炭酸イオンなどが含まれる。本発明のおいて好ましいカウンターアニオンとしては、例えば、塩化物イオン、硝酸イオンなどが挙げられる。
　なお、カウンターアニオンが２価以上である場合、それに対応する個数のイオン性官能基とイオン結合を形成することは当業者により容易に理解されるとおりである。
　本発明において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、好ましくは、水素原子およびメチルから選択される。
　式（ａ）、式（Ｉ）および（ＩＶ）における－ＮＲ４Ｒ５は、特には限定されないが、例えば、Ｒ４が水素原子であり、Ｒ５はＣ２－１０アルキルであってもよい。また、Ｒ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４～８員含窒素ヘテロ環を形成する場合、例えば、ピロリジン環、ピペリジン環、ホモピペリジン環、ピペラジン環、ホモピペラジン環、モルホリン環、チオモルホリン環などを形成してもよい。
　式（ｂ）、式（ＩＩ）および（ＩＶ）におけるＷは、芳香環および－Ｘ１－Ｃ（＝Ｏ）－（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）のいずれであってもよい。Ｗにより表される芳香環は、好ましくはＣ６－１８芳香環、より好ましくはベンゼン環とされる。Ｗは、好ましくは－Ｘ１－Ｃ（＝Ｏ）－（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）とされる。Ｘ1は、好ましくはＯ、ＮＨまたはＮ（Ｃ１－６アルキル）とされる。
　式（ｂ）、式（ＩＩ）および（ＩＶ）における－Ｑ1－は、好ましくはＣ２－１０アルキレンとされる。
　式（ｃ）、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）における－Ｘ２－Ｑ２－は、好ましくは、Ｘ２は、Ｏ、ＮＨまたはＮ（Ｃ１－６アルキル）であり、Ｑ２はＣ２－１０アルキレンである。
　式（ｃ）、式（ＩＩＩ）および（ＩＶ）における－Ａｒは、好ましくは、下式（Ｖ）～（ＸＩＩ）：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
 ［式中、Ｒ３１は水素原子、ハロゲン原子、ニトロ、シアノ、および－ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択され；Ｒ３２はＣ１－６アルキルであり；Ｘ１１は、Ｎ－Ｒ３３、ＯまたはＳであり；Ｒ３３は水素原子またはＣ１－６アルキルであり；Ｘ１０、Ｒ１４およびＲ１５は、既に定義したとおりである］
から選択される基である。
　式（Ｖ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（－Ｒ１６）、Ｎ（－Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）またはＮ（－Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
　式（ＶＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、Ｎ－Ｒ１３（ここで、好ましいＲ１３としてはメチルなどのＣ１－３アルキルが挙げられる）、またはＳが挙げられる。
　式（ＶＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（－Ｒ１６）、Ｎ（－Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）またはＮ（－Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
　式（ＶＩＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合、ＣＯＮ（－Ｒ１６）、Ｎ（－Ｒ１６）ＣＯ、ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）またはＮ（－Ｒ１９）ＳＯ２が挙げられる。
　式（ＩＸ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
　式（Ｘ）について好ましいＸ３としては、例えば、直接結合が挙げられる。
　式（ＸＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）またはＣＯＮ（－Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）およびＣＯＮ（－Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
　式（ＸＩＩ）について好ましいＸ３としては、例えば、ＣＯ、ＳＯ２、ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）またはＣＯＮ（－Ｒ１６）（ここで前記ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）およびＣＯＮ（－Ｒ１６）は、それぞれ硫黄原子および炭素原子がＡｒに結合する）が挙げられる。
　本発明において、基－Ｘ３－Ａｒは環境応答性の蛍光団として機能し、例えば、式（Ｖ）または（ＶＩＩ）の蛍光団を使用した場合は温度の上昇に伴い蛍光強度が低下する温度センサーが、式（ＶＩ）または（ＶＩＩＩ）～（ＸＩＩ）の蛍光団を使用した場合は、温度の上昇に伴い蛍光強度も上昇する温度センサーが得られる。
　使用する式（ｂ）のモノマーの量は、例えば、式（ａ）、（ｂ）のモノマーの使用総量に対して、１～１５モル％の量を使用することができる。
　本発明に係る共重合体は、高分子合成の技術分野における通常の知識に基づいて合成することができ、例えば、ラジカル重合によるランダム共重合体として得ることができる。その場合に使用することができるラジカル開始剤としては、特に限定はされないが、過硫酸アンモニウム、過硫酸ナトリウム、過硫酸カリウムなどの過硫酸塩；２，２'－アゾビス（２－メチルプロピオンアミジン）二塩酸塩、２，２'－アゾビス［２－（２－イミダゾリン－２－イル）プロパン］二塩酸塩、４，４'－アゾビス（４－シアノ吉草酸）などのアゾ化合物が挙げられる。
　反応開始剤の使用量は、使用するモノマーに対して０．０１モル％以上の量であればよく、ラジカル合成が進行する濃度であれば、適量を選択することができる。例えば、０．１モル％以上、好ましくは１モル％以上の反応開始剤を使用することができる。
　重合に使用する反応溶媒は、特に限定されないが、例として、アセトニトリル、ジオキサン、ジメチルホルムアミド、メタノールなどが挙げられる。ラジカル重合は、特に限定はされないが、例えば０～１００℃、好ましくは５０～７０℃の反応温度、および例えば１～４８時間、好ましくは２～１６時間の反応時間で行うことができる。
　本発明の共重合体を含む溶液中のｐＨや塩濃度に影響を受けずに温度測定を行うために、当該共重合体に含まれるカチオン性官能基は、広範囲のｐＨにおいてイオン性を維持するという方が望ましい。しかしながら、細胞内温度を測定するという用途に限って言えば、細胞内のｐＨは２～９、さらに通常の状態、一般的な動物、植物、微生物細胞であればｐＨ４～８程度である。このｐＨでカチオン性が保たれている官能基であればよい。このような観点から、Ｙは－Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ －が好ましい。
　本発明の別の態様において、前記式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）で表されるモノマーのそれぞれに由来する繰り返し構造を含む共重合体が提供される。ここで、当該共重合体を得るために使用される式（ｂ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）および（ｂ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、１～１５モル％であり、好ましくは２～７．５モル％であり、より好ましくは２．５～５モル％である。また、使用される式（ｃ）で表されるモノマーの量は、前記式（ａ）および（ｂ）で表されるモノマーの合計使用量に対して、例えば、０．０１～２０モル％であり、具体的には０．０１～１０モル％であり、好ましくは０．０５～２モル％であり、より好ましくは０．５～１．５モル％である。
　また、式（ＩＶ）中のａ，ｂおよびｃは式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数であり、特に限定されないが、例えば、ａ＋ｂ＝１００、ｃはａとｂの総量（つまり１００）に対する割合であって、ｃは０．０１～２０であり、具体的には０．０１～１０であり、好ましくは０．０５～２であり、より好ましくは０．５～１．５である。また、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂは、例えば１以上、好ましくは２以上、より好ましくは２．５以上、より好ましくは３以上とされ、例えば１５以下、好ましくは１０以下、より好ましくは７．５以下、より好ましくは６以下、より好ましくは５以下とされる。さらに、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂは、例えば１～１５であり、好ましくは２～１０であり、より好ましくは２～７．５であり、より好ましくは２．５～６であり、より好ましくは３～６、より好ましくは３～５とされる。上述のように、aは感熱性ユニットの総和であり、例えば、２種類の感熱性ユニットを使う場合の感熱性ユニットの比は、ある数ｐを用いて、ｐ：a－ｐとなる。例えば、ａ＋ｂ＝１００とした場合のｂが２．５となるように共重合体を作製し、かつ、２種類の感熱性ユニット（例えば、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミドとＮ－イソプロピルアクリルアミド）を組み合わせて用いる場合には、aは９７．５であり、Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミドとＮ－イソプロピルアクリルアミドの比はp：９７．５－ｐで表される。また、本発明のポリマーの重量平均分子量は、特には限定されないが、例えば５０００～１００００００、好ましくは１００００～２０００００である。
　本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化は、通常の蛍光強度測定方法により測定することができる。測定での励起波長および測定する蛍光波長は、特に限定はされないが、例えば、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。また、測定する蛍光波長も特には限定されないが、例えば、蛍光強度が増加する温度で測定試料の蛍光スペクトルを測定した際の最大蛍光波長またはその付近の波長を使用することができる。
　また、本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による変化として、蛍光寿命を指標にすることもできる。この変化は通常の蛍光寿命測定法により測定することができる。測定での励起波長は特に限定されないが、例えば、測定試料の励起スペクトルを測定した際の最大励起波長またはその付近の波長を使用することができる。実験によって得られた蛍光減衰曲線から、測定する試料の状態に応じて、１成分近似、２成分近似などの一般的な解析手法を用いることにより、蛍光寿命値を得ることができる。
　本発明に用いられる共重合体の感熱応答性による蛍光寿命の変化は、一般的な蛍光寿命測定方法、例えば、単一光子計数法、位相変調法、パルスサンプリング法、励起プローブ法などの手法により測定することができる。このうち、単一光子計数法は、時間軸上の発光強度分布と光子１個の発光確率とが相関関係にあることを利用して蛍光寿命を測定する方法であり、蛍光団を１ｎｓ程度の非常に短い（パルス）光で励起した後、検出される光の発生時刻を測定し、励起を多数回繰り返して得られるヒストグラムを蛍光減衰曲線として指数関数の和で近似して蛍光寿命を決定する。単一光子計数法による蛍光寿命の測定は、市販されている時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置およびそれに付随している測定・解析プログラムを使用して行うことができる。
　本発明における「細胞」とは、一般的な分類である原核細胞と真核細胞から成り、特にその生物の種に依らない。例えば、原核細胞は真正細菌と古細菌に分けられるが、真正細菌はその中でも放線菌門のようなグラム陽性菌とプロテオバクテリア門のようなグラム陰性菌に大きく分けられ、ペプチドグリカン層の厚みなどによって、共重合体が適用できる範囲は制限されない。また真核細胞には、主に真核生物（原生生物、真菌、植物、動物）に属する細胞が当てはまる。例えば、一般的に分子生物学などの研究で利用され、かつ工業的にも利用される酵母は真菌に属する。
　本発明の共重合体を細胞に導入する際には、イオン強度の低い溶液（溶媒）に置換することが望ましい。このような溶媒としては、例えば、水（好ましくは純水）およびソルビトール水溶液、グルコース溶液などが挙げられる。
　本発明に従って共重合体を細胞に導入するときの共重合体の濃度は、例えば、共重合体の終濃度を０．００１～１％（ｗ／ｖ）、好ましくは０．０１～０．１％（ｗ／ｖ）になるように調整し、菌体と混ぜることができる。これは微生物菌体のようなものに限らず、接着細胞などの場合にもあてはまる。
　細胞内に代表されるような限られた微小空間内の温度を正確に測定するために、ある独立した２つの蛍光波長における蛍光強度を測定してこれらの比をとり、その蛍光強度比から温度に換算するという方法をとることが望ましい。この手法により、共重合体から発せられる蛍光強度が、微小空間内の共重合体の濃度に起因する可能性を排除し、温度と実験で得られる蛍光強度比を１対１に対応させることが可能である。これにより同一細胞での温度比較だけでなく、同一条件下に置かれた別の細胞の細胞内温度の比較も可能となる。例えば、酵母集団中における個々の細胞温度の違いを測定することにより、各酵母細胞の生理状態を把握することが可能となる。
　蛍光強度比の算出法は、特に限定されるものではなく、異なる波長を含んだ２つの領域の蛍光強度からその比を算出することができる。例えば、一方の領域は５５０ｎｍ～５７０ｎｍとしてその蛍光強度の積分値をＳ１とし、他方の領域は５７０ｎｍ～５９０ｎｍとしてその蛍光強度の積分値をＳ２とし、Ｓ１／Ｓ２を蛍光強度比としてよい。さらに、Ｓ１およびＳ２の領域は同じ幅でも異なる幅でもよい。例えば、Ｓ１は２０ｎｍ幅の波長領域を含む一方で、Ｓ２は１ｎｍ幅の単独波長でもよい。波長の選択基準も特に限定されるものではないが、得られる蛍光強度を考慮すると、温度感受性プローブに含まれる蛍光性ユニットを与えるモノマー（例えば、式（ｃ）で示される蛍光モノマー）の常温（約２５℃）における水中での励起スペクトルを測定した際の最大蛍光強度を示す波長の前後２００ｎｍ、好ましくは１５０ｎｍ、さらに好ましくは１００ｎｍの範囲から、２つの波長領域（つまりＳ１およびＳ２のための波長領域）を選択するのが望ましい。また、温度感受性プローブに含まれる蛍光性ユニットを与えるモノマー（例えば、式（ｃ）で示される蛍光モノマー）の常温（約２５℃）における水中での蛍光スペクトルを測定した際にベースラインとなる波長領域、つまり蛍光強度が測定機器のノイズの範囲内となる波長領域は、上述の２つの波長領域を選択するときには避けることが望ましい。
　実験で得られた蛍光強度比から温度を求める際には、自らが設定した検量線を使用することが可能である。具体的に、どの条件で測定した検量線を使用するかは限定されないが、例えば、細胞内を模倣した塩化カリウム溶液中での、共重合体の感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、共重合体を導入した細胞集団を蛍光光度計に供し、感熱応答性による蛍光強度の変化をプロットした曲線、あるいは共重合体を導入した細胞集団を蛍光顕微鏡に供し、複数の細胞での感熱応答性による蛍光強度の変化の平均値をプロットした曲線などを用いることができる。さらに具体的には、共重合体を導入した細胞集団を用いて、感熱応答性試験を行い、蛍光強度の変化をプロットする際には、細胞は代謝活動を積極的に行わないような状態、例えば、水中や資化することのできない化合物が含まれた緩衝液中に細胞を懸濁した状態で、特定の温度に一定期間保持し、外部温度と細胞内部温度が平衡状態に達したと考えられる状況下で、蛍光強度を測定する方法などが挙げられる。これら蛍光強度を測定する際には、蛍光強度を測定してもよいが、上述されているような任意の２波長領域の蛍光強度比を用いて検量線を作成することで、より精度の高い検量線を作成することが可能である。
　蛍光強度比を用いる上述の温度測定法は、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を用いる温度測定に広く適用することができる。また、この温度測定法は、細胞内の温度測定だけでなく、微小空間内の温度測定に広く適用することができる。
　細胞内に代表されるような限られた微小空間内の温度を正確に測定するために、蛍光寿命を指標として用いることもできる。蛍光寿命による測定は、波長や蛍光物質の濃度の影響を受けないため、二波長による蛍光強度比による測定と同様の有利な効果を奏する。蛍光寿命による温度測定法は、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を用いる温度測定に広く適用することができる。また、この温度測定法は、細胞内の温度測定だけでなく、微小空間内の温度測定に広く適用することができる。
　さらに、２種以上の感熱性ユニットを用いる上記の実施態様は、本発明に用いる共重合体を温度感受性プローブとして用いる場合のみならず、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を用いる温度測定に広く適用することができる。
　以上に説明した方法を実施するために、必要な試薬等をまとめてキットとすることができる。従って、本発明の第四の態様によれば、上述の方法を用いて温度を測定するためのキットが提供され、該キットは、これら方法に用いられる温度感受性プローブを含んでなる。この温度測定用試薬キットは、微小空間内の温度測定、特に細胞内の温度測定に好適に使用することができる。当該試薬キットは、医学・生物学・生物工学等の研究分野、診断・治療等の医療分野において使用することができる。
　本発明の一つの実施態様によれば、前記キットは、感熱性ユニット、蛍光性ユニットおよびカチオン性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを含む。
　本発明の他の実施態様によれば、前記キットは、感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを含んでなり、前記共重合体は２種以上の感熱性ユニットを含むものとされる。
　本発明の方法および温度測定用キットは、様々な研究開発の分野に応用することができる。例えば、生物工学の分野では、微生物を用いた有用物質の発酵生産において、これまで正確な測定が困難であった細胞内温度を解析パラメータに加えることにより、培養条件の検討の効率化が期待される。
　本発明の方法および温度測定用キットは、様々な医療用途に応用することができる。例えば、本発明による温度感受性プローブを患者の組織の一部に対して使用することにより、熱産生量が多いとされているがん細胞と、そうでない正常細胞との識別を行うことも可能である。さらにそれを応用する事でより効果的な温熱治療法の開発などにも使える。あるいは、熱産生量が多い褐色脂肪細胞に本発明による温度感受性プローブを導入し、その細胞に様々な素材を添加することによる温度変化を測定することにより、褐色脂肪細胞を活性化する素材をスクリーニングすることも可能である。
　本発明の方法および温度測定用キットは、様々な生理現象の解明にも応用可能である。例えば、生体外の温度を感知し、生体反応を引き起こす受容体であるＴＲＰチャネルが細胞内の温度とどのように関連しているのかを調べることで今までとは異なるアプローチでのＴＲＰチャネルの活性化が考えられる。また細胞内温度分布と細胞内外で起こる生体反応との関わりを調べる事により、局所的な温度分布が生体反応に及ぼす影響を調べる事が可能で、赤外線レーザーなどを用いた局所的な加熱による細胞のコントロールを行う事なども可能である。
　本発明による温度測定法および温度感受性プローブの細胞導入法は、in vitroおよびin vivoのいずれにおいても行うことができる。一つの実施態様では、これらの方法はin vitroにおいて行われる。
　以下に実施例を示すことにより本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
試薬及びデータ測定
　α，α'－アゾビスイソブチロニトリルはメタノールを用いた再結晶により精製して用いた。その他の試薬は購入したものをさらに精製することなく使用した。
　１Ｈ－ＮＭＲはＢＲＵＫＥＲ　ＡＶＡＮＣＥ４００スペクトロメーター（４００ＭＨｚ）を使用して測定し、ケミカルシフトはｐｐｍで表示した。数平均分子量、重量平均分子量はＪＡＳＣＯ　ＧＰＣ　ｓｙｓｔｅｍ（ＪＡＳＣＯ　ＰＵ－２０８０ポンプ、ＪＡＳＣＯ　ＲＩ－２０３１示差屈折計、ＪＡＳＣＯ　ＣＯ－２０６０カラムオーブン、Ｓｈｏｄｅｘ　ＧＰＣ　ＫＤ－８０６Ｍカラム）を使用し、ポリスチレン標準試料により得られる較正曲線を用いて算出した。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには、関東化学ｓｉｌｉｃａ　ｇｅｌ　６０Ｎ（４０－５０μＭ）を使用した。吸光度の測定には、ＪＡＳＣＯ
　Ｖ－５５０紫外可視光分光光度計を使用した。
実施例１：Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミドの合成
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－７－フルオロ－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール（９４ｍｇ）をアセトニトリル（５ｍｌ）に溶解し、この溶液をＮ，Ｎ'－ジメチルエチレンジアミン（１．２９ｍｌ）に加えて１５分間室温にて撹拌した。反応終了後、反応溶液を減圧乾固させた後、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン：メタノール＝１０：１→５：１を使用）にて精製を行い、Ｎ，Ｎ－ジメチル－７－［メチル｛２－（メチルアミノ）エチル｝アミノ］－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－スルホンアミドを橙色液体（１１３ｍｇ、９４％）として得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．８７（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），４．１５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．６Ｈｚ），３．３５（３Ｈ，ｓ），２．９４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ）２．８７（６Ｈ，ｓ），２．４８（３Ｈ，ｓ）。
　Ｎ，Ｎ－ジメチル－７－［メチル｛２－（メチルアミノ）エチル｝アミノ］－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－スルホンアミド（１１３ｍｇ）をアセトニトリル（１０ｍｌ）に溶解し、トリエチルアミン（５０．２μＬ、１ｅｑ）、アクリル酸クロリド（３８．０μＬ、１．３ｅｑ）を０℃にて加えた後、１時間０℃にて撹拌した。反応溶液にＮａ２ＣＯ３（１ｇ）を加えろ過した後、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒として酢酸エチル－ｎ－ヘキサン＝３：１→４：１を使用）にて精製を行い、表題の化合物を橙色結晶（１０６．１ｍｇ、８０％）として得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ７．８８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），６．４８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１０．４Ｈｚ），６．２８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ），６．１４（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．４Ｈｚ），５．６８（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ）４．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．００Ｈｚ），３．７４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ），３．２９，３．１２（３Ｈ，ｓ），２．８８（６Ｈ，ｓ）。
実施例２：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミドの合成
　ベンゼン（１２５ｍL）にＮ－ｎ－プロピルアミン（８．２ｍL）とトリエチルアミン（１６．７ｍL、１．２ｅｑ）を加え、氷浴中で、攪拌子を用いてよく攪拌した後に、アクリル酸クロリド（９．７ｍＬ、１．２ｅｑ）を１０分おきに３ｍＬずつ添加し、室温に戻した。反応液を濾過し、０．１Ｎの塩酸で分液を行い、上層のベンゼン画分を抽出、無水硫酸ナトリウムを添加した後に、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒としてジクロロメタン－メタノール＝５０：１を使用）にて1回目の精製を行った。目的化合物を含んだ画分を再度集め、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー（展開溶媒として酢酸エチル－ヘキサン＝１：２を使用）にて２回目の精製を行い、表題の化合物を無色透明液体（３．７４ｇ、３３％）として得た。
　１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）δ６．２８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ、１．６Ｈｚ），６．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１６．８Ｈｚ，１０．４Ｈｚ），５．６４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１０．４Ｈｚ、１．６Ｈｚ），５．５５（１Ｈ，ｂｒ），３．３０（２Ｈ，ｍ）１．５８（２Ｈ，ｍ），０．９５（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．６Ｈｚ）。
実施例３：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／３－スルホプロピルアクリレート／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド（２６９ｍｇ、２．３７５ｍｍｏｌ、以下「ＮＮＰＡＭ」とも称する）、３－スルホプロピルアクリレートカリウム塩（２９．０ｍｇ、１２５μｍｏｌ、以下「ＳＰＡカリウム塩」とも称する）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間窒アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１６．５時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥した後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１６１ｍｇ、５２％）として得た。
　数平均分子量１７６０６、重量平均分子量３９１８４で、共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＮＰＡＭ：ＳＰＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝９５．０：５．０：１．０１１。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＳＰＡユニットの割合は１Ｈ－ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ－ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４－Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
実施例４：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　ＮＮＰＡＭ（２７５ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）、（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（１７．５ｍｇ、６２．５μｍｏｌ、以下「ＡＰＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１９時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（２００ｍｇ、６６％）として得た。
　数平均分子量１００６１、重量平均分子量２１６３７で、共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝９６．７：３．３：０．９３３。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ－ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ－ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４－Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
実施例５：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
　実施例４と同様にして合成を行った。ＮＮＰＡＭ（２７０ｍｇ、２．３８ｍｍｏｌ）、ＡＰＴＭＡ（３４．４ｍｇ、１２５μｍｏｌ）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０９ｍｇ、２５μｍｏｌ）を用いて、表題の共重合体を淡黄色粉末（２２９ｍｇ、７４％）として得た。
　数平均分子量８１６６、重量平均分子量１５２１３で、共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝９４．３：５．７：０．８８８。算出方法は実施例４の通りである。
実施例６：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
　実施例４と同様にして合成を行った。ＮＮＰＡＭ（２６２ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ）、ＡＰＴＭＡ（５１．９ｍｇ、１８８μｍｏｌ）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．２２ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．１５ｍｇ、２５μｍｏｌ）を用いて、表題の共重合体を淡黄色粉末（２３８ｍｇ、７６％）として得た。
　数平均分子量６５７９、重量平均分子量１１６０３で、共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝９０．９：９．１：０．８９６。算出方法は実施例４の通りである。
実施例７：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
　実施例４と同様にして合成を行った。ＮＮＰＡＭ（２１２ｍｇ、１．８８ｍｍｏｌ）、ＡＰＴＭＡ（１７３．６ｍｇ、６２５μｍｏｌ）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）を用いて、表題の共重合体を淡黄色粉末（２５１ｍｇ、７０％）として得た。
　数平均分子量４０４３、重量平均分子量５４５９で、共重合体中の各ユニットの組成比
　ＮＮＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝７４．４：２５．６：０．９０２。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ－ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ－ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４－Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
実施例８：ジメチルアクリルアミド／（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
　ジメチルアクリルアミド（２２９ｍｇ、２．３１ｍｍｏｌ、以下「ＤＭＡＭ」とも称する）、ＡＰＴＭＡ（５２．０ｍｇ、１８８μｍｏｌ）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．１８ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０７ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１６時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１８５ｍｇ、６６％）として得た。
　数平均分子量５６３３、重量平均分子量８４６８で、共重合体中の各ユニットの組成比
　ＤＭＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝７９．６：２０．４：０．８３１。なお、共重合体におけるＤＭＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ－ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ－ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４－Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
実施例９：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　ＮＮＰＡＭ（１４２ｍｇ、１．２５ｍｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（２．０２ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）、ＤＢＤ－ＡＡ（４．６２ｍｇ、１２．５μｍｏｌ）をジオキサン（５ｍｌ）に溶解し、３０分間窒素ガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて８時間反応させ、反応溶液をジエチルエーテル２００ｍｌに注いだ。得られた結晶を濾取し、再沈操作（アセトン２．５ｍｌ―ジエチルエーテル２００ｍｌ）によって精製を行い、表題の共重合体を淡黄色粉末（８７ｍｇ、５８％）として得た。
　数平均分子量３６０３３、重量平均分子量９２０４２で、共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＮＰＡＭ：ＤＢＤ－ＡＡ＝１００：１．０３１。なお、ＤＢＤ－ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４－Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
実施例１０：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／ビニルベンジルトリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　ＮＮＰＡＭ（２６８．７ｍｇ、２．３７５ｍｍｏｌ）、ビニルベンジルトリメチルアンモニウムクロリド（２３．２ｍｇ、１２５μｍｏｌ、以下「ＶＢＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ－ＡＡ（１．８４ｍｇ、５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１４時間反応させ、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（４１ｍｇ、１４％）として得た。
　共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＮＰＡＭ：ＶＢＴＭＡ＝９０．６：９．４。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニットとＶＢＴＭＡユニットの割合は１Ｈ－ＮＭＲ測定における積分値より算出した。
実施例１１：Ｎ－ｎ－プロピルアクリルアミド／Ｎ－イソプロピルアクリルアミド／（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
　実施例４と同様にして行った。具体的には、ＮＮＰＡＭ（１３７．５ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）、Ｎ－イソプロピルアクリルアミド（１３７．５ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ、以下「ＮＩＰＡＭ」とも称する）（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（１７．５ｍｇ、６２．５μｍｏｌ、以下「ＡＰＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１９時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１５４ｍｇ、５０％）として得た。
　数平均分子量１９７３０、重量平均分子量１０３８６で、共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＮＰＡＭ：ＮＩＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝４９．８：４６．９：３．３：０．８０５。なお、共重合体におけるＮＮＰＡＭユニット，ＮＩＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ－ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ－ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４－Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
実施例１２：Ｎ－イソプロピルアクリルアミド／（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム／Ｎ－｛２－［（７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル）－２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－４－イル］（メチル）アミノ｝エチル－Ｎ－メチルアクリルアミド共重合体の製造
　ＮＩＰＡＭ（２７５ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）、（３－アクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウムクロリド（１７．５ｍｇ、６２．５μｍｏｌ、以下「ＡＰＴＭＡクロリド」とも称する）、ＤＢＤ－ＡＡ（９．１３ｍｇ、２５μｍｏｌ）、ＡＩＢＮ（４．０５ｍｇ、２５μｍｏｌ）をＤＭＦ（５ｍｌ）に溶解し、３０分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、６０℃にて１９時間反応させ、反応溶液から減圧下ＤＭＦを一部留去したのち、ジエチルエーテル（２００ｍｌ）に注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、純水１０ｍｌに溶かし、直径２８．６ｍｍのヴィスキングチューブ（透析用セルローズチューブ）を使用し、透析外液を１０００ｍｌとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末（１３９ｍｇ、４５％）として得た。
　数平均分子量２３３１２、重量平均分子量１１７３７で、共重合体中の各ユニットの組成比　ＮＩＰＡＭ：ＡＰＴＭＡ：ＤＢＤ－ＡＡ＝９６．４：３．６：０．８１４。なお、共重合体におけるＮＩＰＡＭユニットとＡＰＴＭＡユニットの割合は１Ｈ－ＮＭＲ測定における積分値より、ＤＢＤ－ＡＡユニットの割合はメタノール中の吸光度を４－Ｎ，Ｎ－（ジメチルアミノ）－７－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノスルホニル－２，１，３－ベンゾオキサジアゾールと比較することにより算出した。
　実施例３、４、５，６，７，８、９、１０、１１および１２で製造した共重合体を、それぞれ以下、化合物１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０と称する。以下表に化合物１～１０の物質の特徴をまとめた。
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実施例１３：細胞へのポリマー導入試験
　酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００８年，第７４巻，第２７８７～２７９６頁）、をＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地３ｍＬに植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物１～７を終濃度が０．０５％となるように添加し、０．５時間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度水に懸濁し、酵母細胞懸濁液をスライドガラス（スーパーフロスト：ＭＡＴＵＮＡＭＩ）に載せ、カバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）で封をした後、スライドガラスをステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に載せ、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
　各化合物を導入した際の蛍光像を図１に示す。ユニット内にＡＰＴＭＡが入っている場合は、微分干渉像と重なるようにして、細胞内部に蛍光強度の高い領域が観察されたが、ＡＰＴＡＭが入っていない場合（化合物７）、そしてアニオン性のユニットであるＳＰＡが含まれている場合（化合物１）には全く蛍光像は観察されなかった。
実施例１４：細胞へのポリマー導入効率の評価
　実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物２～６を酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合し、導入した。化合物を導入した酵母をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ）解析に供した。測定時の条件は以下の通りである。計測細胞数を１００００細胞とし、ＦＳＣ電圧をＥ－１、ＳＳＣ電圧を２０１とし、ＦＬ１電圧を５６６Ｖとし、ＦＳＣ閾値を５２とした。細胞に４８８ｎｍのアルゴンレーザーの励起光を照射した後、各化合物由来の蛍光を５１５ｎｍ～５４５ｎｍの蛍光検出器（ＦＬ１）で検出した。ＳＳＣ、ＦＳＣで酵母に特有の領域を選択し、横軸に重合体から発せられる蛍光であるＦＬ１のシグナル蛍光強度をとり、縦軸にその蛍光強度を持つ細胞の数をとったヒストグラムを作成し、解析を行った。
　評価結果を図２に示す。ヒストグラムの山が右に行けば行く程、ポリマーの細胞への導入量が多いことを示しているが、ＡＰＴＭＡの比率が多くなるにつれ（化合物２～５）、細胞内蛍光強度が高い細胞が増えていることがわかる。実施例１３で観察できた結果と同様、ＡＰＴＭＡの導入量が多いほど、細胞内にプローブが入りやすくなることが明らかとなった。また、化合物４と化合物６との結果の比較により、それは感熱性ユニットによらないものであることが示された。
実施例１５：各化合物の溶液中のイオン強度の定性的評価
　化合物１～７を純水に５％の濃度で溶解し、１％アガロースＴＡＥゲルで電気泳動（Ｇｅｎｉｕｓ，ＳＫｂｉｏ）を行った。アプライ量は５μｌである。泳動は５０Ｖで１．５時間行った。泳動後のゲルはＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、Ｂｌｕｅ Ｅｐｉ ｌｉｇｈｔ (４６０ｎｍ，ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ)で励起、Ｙ５１５ｆｉｌｔｅｒ(ＧＥＨｅｌｔｈｃａｒｅ)で励起光、散乱光をカットし、各プローブからの蛍光を検出した。
　泳動したゲルの結果を図３に示す。カチオン性基であるＡＰＴＭＡを導入していないプローブでは、アクリルアミドの主鎖自体が負に帯電していることもあり、アプライした地点よりもやや正電荷側に移動していくことがわかった。また、アニオン性ユニットであるＳＰＡを導入したプローブは、正電極側に大きく移動し、ポリマー全体が負に帯電していることが確認できた。一方、カチオン性ユニットを導入したポリマーは、ＡＰＴＭＡの導入率に応じて、負電極側へ大きく移動しており、ＡＰＴＭＡの導入量とカチオン性が相関していることを確認できた。さらにＡＰＴＭＡが９．１％導入されたプローブにおいて、感熱性ユニットであるＮＮＰＡＭ、ＤＭＡＭによる移動度の変化がなかったことから、感熱性ユニットによるカチオン性の変化がないことも確認できた。
実施例１６：感熱応答性試験
　化合物２，３，４，５，６の１５０ｍＭ　ＫＣｌ中での感熱応答性試験を以下の手順で行った。ＪＡＳＣＯ　ＦＰ－６５００分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ－Ｑ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、和光純薬より購入したＫＣｌを１５０ｍＭの濃度になるように溶かしたものを用いた。当実験における化合物の初期濃度は０．０１ｗ／ｖ％とし、励起波長は４５６ｎｍとした。
溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ　ＥＴＣ－２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を２℃刻みで上昇させ、各温度における蛍光強度を測定した。
　試験結果を図４に示す。感熱性ユニットにＤＭＡＭを用いた場合は、温度の変化に反応せず、蛍光強度の変化は確認できないが、感熱性ユニットとしてＮＮＰＡＭを用いた場合には、共重合体におけるＡＰＴＭＡのモル比率が９．１％の場合までは温度の変化に鋭敏に反応した蛍光強度の変化が確認された。しかしながら、共重合体におけるＡＰＴＭＡのモル比率が２５．６％になると感熱性ユニットの比率が低くなることに加え、イオン性基の比率が高くなりすぎることで、ポリマー伸縮が静電的作用により阻害されることから、温度に応答した蛍光強度の変化は確認できなかった。実施例１３～１６の結果をあわせれば、特殊な方法を使用せず、細胞内の温度を感度よく、かつ簡便に測定するためには、ＡＰＴＭＡの比率はＮＮＰＡＭとＡＰＴＭＡの和に対して、投入量のモノマーのモル量換算で２．５％～７．５％、実際の共重合体に含まれているモル比率で３．３％～９．１％が好ましいことが明らかとなった。
実施例１７：感熱応答試験における塩化カリウム濃度依存性評価
　化合物２の感熱応答性におけるＫＣｌ濃度依存性を以下の手順で試験し、調査した。実験手法は実施例１３と同様であり、ＫＣｌ濃度は０ｍＭ（純水）、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭとなるように溶媒を調製した。
　試験結果を図５に示す。一般的に細胞内のカリウム濃度は１５０ｍＭ～２５０ｍＭと推定されており、特殊な環境変化がない限り、細胞内のカリウム濃度の変化は小さいことがわかっている。この範囲内の塩化カリウム溶液の濃度変化に対する温度応答性の変化はわずかに観測されるものの、細胞内のカリウム濃度変化はこれよりも到底低いレベルにあるために、細胞内の温度を測定する上での影響はほとんどないことが示唆された。
実施例１８：ｐＨ応答性の評価
　化合物２の感熱応答性におけるｐＨ依存性を以下の手順で試験し、調査した。溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ－Ｑ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、塩酸でｐＨを４に調整した。ｐＨ７の溶媒として、超純水をそのまま用いた。実験手法は実施例１３と同様である。
　試験結果を図６に示す。一般的な細胞の温度範囲（２０℃～４０℃）においては、ｐＨ変化による蛍光強度の変化はほとんど観測されなかった。つまり、ｐＨ変化によって温度応答性はほぼ影響を受けないことが明らかとなり、より高感度に蛍光強度がｐＨを反映することがわかった。
実施例１９：細胞へのプローブ導入時の懸濁液の評価
　実施例１３のようにして０．０５％濃度の化合物２、３を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、酵母へプローブを導入した。化合物と細胞を混合する際の細胞を懸濁する溶液・培地として、水、１Ｍ　Ｓｏｒｂｉｔｏｌ、ＰＢＳ、ＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）、５０ｍＭ　ＫＣｌ、１００ｍＭ　ＫＣｌの６種類の溶液・培地を用いた。化合物２，３をそれぞれ導入した酵母をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ）解析に供した。測定時の条件および解析方法は実施例１４と同様である。
　解析結果を図７に示す。水、１Ｍ　Ｓｏｒｂｉｔｏｌ溶液中では酵母の中に化合物２，３が入ったことによる蛍光強度の高い細胞群が観察されたが、ＹＰＤ培地、およびＰＢＳ緩衝液、ＫＣｌ溶液中では、蛍光強度の高い細胞群は観察されなかった。したがって、本発明のポリマーを細胞に導入する際には、イオン強度の低い溶液に一度置換してから、ポリマーと細胞を混合する必要があることが明らかとなった。
実施例２０：細胞へのプローブ導入時の混合時間の評価
　酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株を、ＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地に植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物２を終濃度が０．０５％となるように添加し、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０分間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度水に懸濁し、酵母をフローサイトメーター（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，ＢＤ）解析に供した。測定時の条件、および解析方法は実施例１４と同様である。
　解析結果を図８に示す。導入前の酵母はほとんど蛍光を発しないが、ポリマーと混合して５分後、すぐに蛍光強度の増加が見られた。また、その後、ポリマーと酵母の接触時間を長くしても、導入した酵母の割合に変化がほぼ見られなかった。つまり、本発明のプローブは細胞と接触して速やかに細胞内に導入されるため、長時間のインキュベートなどは必要とせず、簡便に細胞内に取り込ませることが可能であることが示された。
実施例２１：酵母細胞内温度の測定
　実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物２、３、４、６を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された細胞を水にＯＤ６００＝１の濃度で懸濁し、キュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ　ＦＰ－６５００分光蛍光光度計にセットし、約６００ｒｐｍの速度で回転させ、酵母が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ　ＥＴＣ－２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後１０分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。
　測定結果を図９に示す。なお、結果は５℃における蛍光強度を１とし、縦軸を相対蛍光強度で表した。蛍光波長は各化合物の最大蛍光強度を記録したときの蛍光波長を用いている。実施例１６における１５０ｍＭ　ＫＣｌ中でのポリマーの感熱応答性の結果と同様に、細胞内でも本発明で開発したポリマーは細胞内温度を反映し、温度上昇に伴って、細胞内蛍光強度が上昇した。非感熱応答性であるＤＭＡＭを用いた場合は、上記実施例の結果より、細胞内にプローブは導入されていることは明らかとなっていたが、温度に応答して、蛍光強度が上がらず、予想していた通り、温度を測定するプローブとして使用することができないことは確認できた。
実施例２２：蛍光強度比を求めることによる細胞内温度の正確な測定
　実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物３を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーを導入した酵母を再度水に懸濁し、酵母細胞懸濁液をガラスボトムディッシュ（３５ｍｍ　Ｇｌａｓｓ　Ｂａｓｅ　Ｄｉｓｈ，ＩＷＡＫＩ）に注ぎ、ウォータージャケットステージインキュベータ（ＣＲＹＯ－ＷＪＭＳＩ，ｏｋｏｌａｂ）に載せ、温度を制御しながら、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５２０ｎｍから５６０ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像（Ｐ１）、および５７０ｎｍから６１０ｎｍまで蛍光波長に対する蛍光像（Ｐ２）を観察した。また得られた像をＦＶ１０－ＡＳＷ解析ソフト（Ｏｌｙｍｐｕｓ）内の処理操作により、比をとる（Ｐ１／Ｐ２）ことによって、像を作成した（Ｐ３）。温度を１５℃から４０℃まで５℃刻みで上昇させ、一定の温度になったところで、１０分待った後、観察を行った。
　３５℃におけるＰ１の結果を図１０に示す。この結果から明らかなように、単純な蛍光強度からは、蛍光強度と温度が対応しないため、その温度は正確に見積もることができない。具体的には、蛍光強度の高い細胞の温度が高いかというとそうではなく、単純にプローブの導入量が多いだけである可能性もある。これを解消するためには、細胞内のプローブ導入量の定量と同じ測定条件下での本プローブの感熱応答性を評価する必要があるが、特に前者は蛍光強度が温度に依存するため、正確な算出をすることが難しい。そこで１５℃、３５℃におけるＰ１とＰ２の比を取った像Ｐ３を図１１に示す。図１１は比を０．５（黒）～１．０（白）となるように擬似色で蛍光強度比を示している。また、検量線となる曲線例として実施例２０で測定した化合物３を酵母に導入した際の各温度における蛍光スペクトルから蛍光強度比（５２０～５６０ｎｍ／５７０～６１０ｎｍ）を算出し、図１２に温度応答曲線を示した。さらに、各温度における顕微鏡写真より、撮影視野全体を囲み、蛍光強度比（Ｐ１／Ｐ２）と温度をプロットしたところ図１３のようになった。図１２と図１３は近い値を保っており、これより顕微鏡の蛍光強度比（図１１）から、図１２の検量線を用いて、細胞内の温度を算出することができることが明らかとなった。
　この結果により、同一細胞での温度比較だけでなく、同一条件下に置かれた別の細胞の細胞内温度の比較も可能となることがわかった。具体的には、例えば酵母集団中における個々の細胞温度の違いにより、細胞の生理状態の把握などに利用することが出来る。
実施例２３：プローブの毒性評価
　実施例１３のようにして、０．００５％、０．０２５％、０．０５％、０．２５％の濃度の化合物２～７を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された酵母を２回水で洗浄し、再度水で懸濁した後、ＹＰＤプレートに１０４、１０３、１０２、１０細胞となるようにスポットして、２日間２５℃で培養した後、プレートを撮影し、細胞毒性を定性的に評価した。
　結果を図１４に示す。共重合体におけるＡＰＴＭＡのモル比率が９．１％を超えたところから添加量に応じて、徐々に毒性が高まることがわかった。特に共重合体におけるＡＰＴＡＭのモル比率が２５．６％になると、導入量によらずかなりの毒性があることがわかる。しかしながら、細胞内導入型の温度測定プローブとして有用な共重合体におけるＡＰＴＡＭのモル比率が３．３％ないしは５．７％の化合物２，３は導入量が０．０５％となった場合でも、毒性はあまり見られず、一方で、実施例１４、図２の結果から、ほぼ全ての細胞にプローブの導入が行われていることが考えられるため、細胞内にプローブが導入しても、細胞毒性は少ないことが示された。
実施例２４：培養細胞への本発明のプローブの応用
　ヒト由来胎児腎細胞ＨＥＫ２９３Ｔおよびマウス由来マクロファージ様前駆細胞ＲＡＷ２６４をＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、３５ｍｍガラスボトムディッシュにて培養した（播種１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。１日後、化合物１、４，７を終濃度０．０５％となるように添加し、３７℃で培養２時間後、顕微鏡観察時にＰＢＳで洗浄後、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ－ｆｒｅｅ培地に置換し、顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
　ＨＥＫ２９３Ｔの結果を図１５に、ＲＡＷ２６４の結果を図１６に示す。図１５、１６ともに、イオン性基のない化合物７では蛍光像でのシグナルは全く観察できないが、カチオン性基ＡＰＴＭＡを導入した化合物４では細胞内部へのシグナル強度の増加がみられ、一方アニオン性基を導入した化合物１でも細胞内へのシグナルはやや見られるが、その数、強度ともに非常に弱く、細胞内へのプローブの導入にはカチオン性基が重要であることが示された。また、本発明のプローブが動物細胞でも応用可能であることが示された。
実施例２５：大腸菌への本発明のプローブの応用
　大腸菌ＤＨ５αをＬＢ培地（トリプトン１０ｇ，イーストエキス５ｇ，塩化ナトリウム５ｇ）に植菌し、３７℃で１６時間培養した後、培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が０．１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物４を終濃度が０．０５％となるように添加し、０．５時間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した大腸菌を再度水に懸濁し、ガラスボトムディッシュ（３５ｍｍ　Ｇｌａｓｓ　Ｂａｓｅ　Ｄｉｓｈ，ＩＷＡＫＩ）に注ぎ、ウォータージャケットステージインキュベータ（ＣＲＹＯ－ＷＪＭＳＩ，ｏｋｏｌａｂ）に載せ、温度を制御しながら、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。観察時の温度は２５℃と４１℃の２点で測定を行った。
　結果を図１７に示す。図１７で示されるように大腸菌においても本発明のカチオン性温度プローブは細胞に導入され、温度に応じて蛍光強度が高い細胞が増えていくことが明らかとなった。つまり、大腸菌のような微生物にも本ポリマーは応用可能で、様々な細胞種に適用できることが示された。
実施例２６：細胞へのポリマー導入試験
　酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株をＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地３ｍＬに植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、水で洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように純水を添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物８を終濃度が０．０５％となるように添加し、０．５時間、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１００００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度冷水で洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度水に懸濁し、酵母細胞懸濁液をスライドガラス（スーパーフロスト：ＭＡＴＵＮＡＭＩ）に載せ、カバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）で封をした後、スライドガラスをステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に載せ、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
　化合物８を導入した際の蛍光像を図１８に示す。ユニット内にＡＰＴＭＡだけではなく、おなじくカチオン性ユニットであるＶＢＴＭＡが入っている場合でも、微分干渉像と重なるようにして、細胞内部に蛍光強度の高い領域が観察された。このことから、細胞導入型のカチオン性ユニットに関しては、ＡＰＴＭＡ以外の物質も利用できることがわかった。
実施例２７：感熱応答性試験
　化合物８の１５０ｍＭ　ＫＣｌ中での感熱応答性試験を以下の手順で行った。ＪＡＳＣＯ　ＦＰ－６５００分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のＭｉｌｌｉ－Ｑ　ｒｅａｇｅｎｔ　ｓｙｓｔｅｍから得た超純水を用いて、和光純薬より購入したＫＣｌを１５０ｍＭの濃度になるように溶かしたものを用いた。当実験における化合物の初期濃度は０．０１ｗ／ｖ％とし、励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ　ＥＴＣ－２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を２℃刻みで上昇させ、各温度における蛍光強度を測定した。
　試験結果を図１９に示す。カチオン性ユニットとして、ＶＢＴＭＡを用いた場合でも、１５０ｍＭ塩化カリウム溶液中の温度上昇に応答して、蛍光強度の変化が確認できた。温度応答性に関しては全てのユニットにアクリルアミド、メタクリルアミドあるいはアクリル酸が含まれていることが望ましいが、本実施例のように共重合体におけるモル比率が１０％程度であればスチレン基など、一般的なビニル型モノマーがユニット内に含まれていても、温度に十分に応答するプローブとして機能することが明らかとなった。
実施例２８：酵母細胞内温度の測定
　実施例１３のようにして、０．０５％濃度の化合物８を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された細胞を水にＯＤ６００＝１の濃度で懸濁し、キュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ　ＦＰ－６５００分光蛍光光度計にセットし、約６００ｒｐｍの速度で回転させ、酵母が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ　ＥＴＣ－２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後１０分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。
　測定結果を図２０に示す。なお、結果は５℃における蛍光強度を１とし、縦軸を相対蛍光強度で表した。蛍光波長は各化合物の最大蛍光強度を記録したときの蛍光波長を用いている。実施例１６における１５０ｍＭ　ＫＣｌ中でのポリマーの感熱応答性の結果と同様に、細胞内でも本発明で開発したポリマーは細胞内温度を反映し、温度上昇に伴って、細胞内蛍光強度が上昇した。実施例２６～２８の結果により、ＡＰＴＭＡ以外のカチオン性ユニットを用いたプローブでも、細胞内にプローブを簡便に導入でき、かつ細胞の中で温度上昇に応答して蛍光強度が上昇する機能を持つことが明らかとなった。
実施例２９：化合物９および１０の酵母細胞へのポリマー導入試験
　酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株をＹＰＤ（酵母エキス１％、ペプトン２％、グルコース２％）培地３ｍＬに植菌し、２５℃で１日間好気振とう培養した。培養液の菌体濃度として６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定した後、培養液を遠心分離（３０００ｒｐｍ、５分）し、１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌで洗浄を２回行い、充分に洗浄した後、ＯＤ６００が１となるように１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌを添加し、懸濁した。菌体懸濁液に、５％の濃度で純水に溶かした化合物９および１０を終濃度が０．０５％となるように添加し、２０分、２５℃で静置した。その後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１分）し、速やかに上清を除き、再度氷冷１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌ, ５０ｍＭ　ＫＣｌで洗浄を１回行った。洗浄した酵母を再度１．２Ｍ ｓｏｒｂｉｔｏｌに懸濁し、酵母細胞懸濁液をスライドガラス（スーパーフロスト：ＭＡＴＵＮＡＭＩ）に載せ、カバーガラス（ＭＡＴＳＵＮＡＭＩ）で封をした後、スライドガラスをステージ（Ｏｌｙｍｐｕｓ）に載せ、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、１００倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
　化合物９および１０を導入した際の蛍光像を図２１に示す。感熱性ユニットにＮＮＰＡＭ以外のものを用いても、プローブを細胞内に導入できることが確認できた。またＮＩＰＡＭとＮＮＰＡＭの２つの感熱性応答ユニットを用いた場合にもプローブを細胞内に導入できることが確かめられた。
実施例３０：感熱応答性試験
　化合物２、９および１０の１５０ｍＭ　ＫＣｌ中での感熱応答性試験を実施例１６のようにして行った。溶液温度は２℃刻みで上昇させ、各温度における蛍光強度を測定した。
　試験結果を図２２に示す。感熱性応答部位をＮＮＰＡＭからＮＩＰＡＭへと変化させることで、温度応答領域を変更できることが確認できた。またその両方のモノマーを１：１の割合で混ぜて共重合体を合成したＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭにおいてはＮＮＰＡＭとＮＩＰＡＭの温度応答領域の中間に位置することがわかり、これら比率を変えることによって、３０℃～５０℃付近の任意の温度領域に応答する蛍光温度センサーが作れることが確認できた。
実施例３１：感熱性応答ユニットの違いによる酵母細胞内温度の測定範囲の変化
　実施例２９のようにして、０．０５％濃度の化合物２、９および１０を、酵母サッカロマイセス属ＳＹＴ００１株と混合・懸濁し、ポリマーを細胞に導入した。ポリマーが導入された細胞をＰＢＳにＯＤ６００＝１の濃度で懸濁し、キュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ　ＦＰ－６５００分光蛍光光度計にセットし、約８００ｒｐｍの速度で回転させ、酵母が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ　ＥＴＣ－２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の温度計によりセルホルダー内の温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後５分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。
　測定結果を図２３に示す。なお、結果は１０℃における蛍光強度を１とし、縦軸を相対蛍光強度で表した。蛍光波長は各化合物の最大蛍光強度を記録したときの蛍光波長を用いている。感熱性応答部位をＮＮＰＡＭにした場合には２５℃～３５℃の範囲で蛍光強度が変化し、ＮＮＰＡＭ/ＮＩＰＡＭの場合には３０℃～４０℃、ＮＩＰＡＭ単独の場合には３５℃以上で蛍光強度が変化していることが明らかとなった。溶液中で温度応答領域を変化できることは図２２からも明らかであったが、細胞内においてもその応答領域を大きく変えることなく、測定したい細胞内温度領域に応じて自由に感熱性応答部位を変えることができることを証明できた。
実施例３２：蛍光寿命変化の感熱応答試験
　実施例３１で作製した化合物２、９および１０の入った酵母懸濁液を用いて、蛍光寿命変化の感熱性応答試験を行った。ＦｌｕｏｒｏＣｕｂｅ　３０００Ｕ（Ｈｏｒｉｂａ　Ｊｏｂｉｎ　Ｙｖｏｎ）時間相関単一光子計数法蛍光寿命測定装置を使用して、励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の励起には、ＬＥＤ（ＮａｎｏＬＥＤ－４５６，ＨＯｒｉｂａ）を用いて、パルス繰り返し数１ＭＨｚで測定を行った。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ　ＥＴＣ－２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の温度計によりセルホルダー内の温度を測定した。測定前に熱電対により溶液の温度が安定したことを確認した後、各温度における蛍光寿命を蛍光波長５６０ｎｍとして測定した。得られた蛍光減衰曲線を以下に示す式により近似し、２成分の蛍光寿命を得た。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000023
　得られた蛍光寿命から、以下に示す式を用いて各温度における平均蛍光寿命を算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000024
　試験結果を図２４に示す。実施例３１の結果と同様に、感熱性応答部位をＮＮＰＡＭにした場合には２５℃～３５℃の範囲で蛍光寿命が変化し、ＮＮＰＡＭ/ＮＩＰＡＭの場合には３０℃～４０℃、ＮＩＰＡＭ単独の場合には３５℃以上で蛍光寿命が変化していることが明らかとなった。高温になるにつれて平均蛍光寿命が延長し、温度の変化に鋭敏に反応して平均蛍光寿命が変化することが確認された。
実施例３３：培養細胞（浮遊細胞）へのプローブ導入
　ＭＯＬＴ－４（ヒト急性リンパ芽球性白血病(Ｔ－細胞)）をＲＰＭＩ１６４０培地（１０％ＦＢＳ）、１００ｍｍディッシュにて培養した（播種１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。１日後、培養液３ｍｌを遠心（１０００ｒｐｍ、１分）し、培地を取り除き、５％グルコースで洗浄後、再度５％グルコース１ｍｌで懸濁し、化合物２を終濃度０．０５％となるように添加した。１５℃、１０分後、遠心し、上清を取り除き、ＰＢＳで洗浄後、ＰＢＳに懸濁し、プローブが導入されているかの確認を顕微鏡観察にて行った。共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察し、細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
　結果を図２５に示す。浮遊細胞であるＭＯＬＴ４においてもプローブの導入が確認できた。
実施例３４：培養細胞（浮遊細胞）における化合物９および１０の蛍光強度応答
　実施例３３のようにして、ＭＯＬＴ－４へ化合物２、９および１０の導入を行い、ＰＢＳに懸濁した状態でキュベットに入れ、さらにキュベット内に２ｍｍ直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをＪＡＳＣＯ　ＦＰ－６５００分光蛍光光度計にセットし、約８００ｒｐｍの速度で回転させ、細胞が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は４５６ｎｍとした。溶液の温度制御にはＪＡＳＣＯ　ＥＴＣ－２７３Ｔ水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の温度計によりセルホルダー内の温度を測定した。溶液温度を５℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後５分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。
　結果を図２６に示す。低温領域側から、ＮＮＰＡＭ，ＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭ，ＮＩＰＡＭの順に細胞内でも応答することが明らかとなった。これは実施例３１の酵母の実験結果と同様であり、培養細胞においても目的の測定温度に対応する感熱性応答ユニットを選択し、測定できる事が示された。
実施例３５：培養細胞（浮遊細胞）における化合物９および１０の蛍光寿命応答
　実施例３３のようにして作製した化合物２、９または１０が導入されたＭＯＬＴ－４を用いて、蛍光寿命を測定した。ＰＢＳに懸濁した状態で測定し、測定方法は実施例３２と全く同様である。
　結果を図２７に示す。図２６と同様に、低温領域側から、ＮＮＰＡＭ，ＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭ，ＮＩＰＡＭの順に細胞内でも応答することが明らかとなった。実施例３４の結果とあわせて、培養細胞においても目的の測定温度に対応する感熱性応答ユニットを選択し、測定できる事が強く示された。
実施例３６：顕微鏡観察における化合物９および１０の効果
　ＨＥＫ２９３ＴをＤＭＥＭ培地（１０％ＦＢＳ，１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）、３５ｍｍガラスボトムディッシュにて培養した（播種１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）。１日後、培地を５％グルコースに置換し、化合物２、９または１０を終濃度０．０５％となるように添加し、１５℃、１０分後、ＰＢＳで洗浄後、ｐｈｅｎｏｌｒｅｄ－ｆｒｅｅ培地に置換し、顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから６００ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
　結果を図２８に示す。感熱性ユニットにＮＮＰＡＭを用いると、細胞の最適増殖温度である３７℃付近での蛍光強度の上昇はあまり見られないのに対して、ＮＮＰＡＭ／ＮＩＰＡＭを用いることで、３７℃付近での強い蛍光応答が見られることが顕微鏡観察からも明らかとなった。また、ＮＩＰＡＭを用いる事で、さらに高温領域も測定可能になることが予想された。この結果により、顕微鏡観察においても感熱性ユニットの使い分けができることが示された。
実施例３７：顕微鏡観察（蛍光強度比測定）における化合物９の効果
　実施例３６のようにしてＨＥＫ２９３Ｔに化合物９を導入したサンプルを用いて、蛍光強度比を測定し、蛍光強度に依らず、温度測定ができるかどうかを調べた。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡（ＦＶ１０００、Ｏｌｙｍｐｕｓ）、６０倍油浸対物レンズ（ＵｐｌａｎＳＡｐｏ　Ｎ．Ａ．１．４０，Ｏｌｙｍｐｕｓ）を用いて観察した。細胞に４７３ｎｍのレーザー（Ｍｕｌｔｉ　Ａｒレーザー）を当て、５００ｎｍから５５０ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像（ＣＨ１）と６００ｎｍから６５０ｎｍまでの蛍光波長に対する蛍光像（ＣＨ２）、そしてＣＨ１の蛍光強度をＣＨ２の蛍光強度で除したＲａｔｉｏ像を観察した。
　結果を図２９に示す。ＣＨ１とＣＨ２だけでは、単純に蛍光強度があがっていないような細胞でもＲａｔｉｏを取る事によりＲａｔｉｏ比が増大していることが明確になり、温度が上昇している事が明確に示された。

Claims (19)

  1. 　感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する方法であって、カチオン性ユニットをさらに含む前記共重合体を温度感受性プローブとして用い、かつ、該共重合体を溶媒中で細胞と混合する工程を含んでなる、方法。
  2. 　カチオン性ユニットが、１以上の正電荷を有するイオン性官能基を含むモノマーに由来する繰り返し構造である、請求項１に記載の方法。
  3. 　カチオン性ユニットが、以下の式（ｂ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ２は、水素原子およびＣ１－３アルキルから選択され；
    　Ｗは、芳香環または－Ｘ１－Ｃ（＝Ｏ）－（ここで、Ｑ１に直接結合するのはＸ１である）であり；
    　Ｘ１は、Ｏ、Ｓ、またはＮ－Ｒ１１であり；
    　Ｒ１１は、水素原子、Ｃ１－６アルキル、または－Ｑ１－Ｙであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    　Ｑ１は、独立に、Ｃ１－２０アルキレン、Ｃ３－２０アルケニレン、またはＣ３－２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓ、－Ｏ－Ｐ（＝Ｏ）（－ＯＨ）－Ｏ－またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
    　Ｙは、独立に、１以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、－Ｎ＋Ｒ２１Ｒ２２Ｒ２３Ｘｅ －、－Ｃ（＝ＮＲ４１）－ＮＲ４２Ｒ４３、および下式：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     により表される基から選択され；
    　Ｘｅ －およびＸｆ －はカウンターアニオンであり；
    　Ｒ２１、Ｒ２２、およびＲ２３は、独立に、Ｃ１－１０アルキル、およびＣ７－１４アラルキルから選択され、またはＲ２１およびＲ２２は、結合する窒素原子と一緒になって、５～７員含窒素ヘテロ環を形成してもよく；
    　Ｒ２４は、Ｃ１－１０アルキル、またはＣ７－１４アラルキルであり；
    　Ｒ４１、Ｒ４２およびＲ４３は、独立に、水素原子およびＣ１－１０アルキルから選択され、またはＲ４１およびＲ４２は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、２つの窒素原子を含む５～７員ヘテロ環を形成してもよく、またはＲ４２およびＲ４３は、結合する窒素原子と一緒になって、５～７員含窒素ヘテロ環を形成してもよい］
    で表されるモノマーに由来する繰り返し構造である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　感熱性ユニットが、アクリルアミドを基本骨格として有するモノマーに由来する繰り返し構造である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　感熱性ユニットが、以下の式（ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     ［式中、Ｒ１は、水素原子およびＣ１－３アルキルから選択され；
    　Ｒ４およびＲ５は、独立に、水素原子およびＣ１－２０アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、Ｃ１－６アルコキシ、およびアリールから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、またはＲ４およびＲ５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４～８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１－１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
    で表されるモノマーに由来する繰り返し構造である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　蛍光性ユニットが、以下の式（ｃ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｒ３は、水素原子およびＣ１－３アルキルから選択され；
    　Ｘ２は、Ｏ、Ｓ、またはＮ－Ｒ１２であり；
    　Ｘ３は、直接結合、Ｏ、Ｓ、ＳＯ、ＳＯ２、Ｎ（－Ｒ１３）、ＣＯＮ（－Ｒ１６）、Ｎ（－Ｒ１６）ＣＯ、Ｎ（－Ｒ１７）ＣＯＮ（－Ｒ１８）、ＳＯ２Ｎ（－Ｒ１９）またはＮ（－Ｒ１９）ＳＯ２であり；
    　Ｑ２は、Ｃ１－２０アルキレン、Ｃ３－２０アルケニレン、またはＣ３－２０アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、１以上の個所において、Ｏ、Ｓまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく；
    　Ａｒは、６～１８員芳香族炭素環基、または５～１８員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の１以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する－ＣＨ２－は－Ｃ（Ｏ）－に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、Ｃ１－６アルキルカルボニル、Ｃ１－６アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、－ＮＲ６Ｒ７、および－ＳＯ２ＮＲ１４Ｒ１５から選択される１以上の置換基により置換されていてもよく（ここで前記Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、Ｃ１－６アルキルスルホニル、Ｃ１－６アルキルカルボニルおよびＣ１－６アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１－６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい）；
    　Ｒ６およびＲ７は、独立に、水素原子、Ｃ１－１０アルキル、アリール、Ｃ１－１０アルキルカルボニル、アリールカルボニル、Ｃ１－１０アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、Ｎ－（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ－ジ（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイルから選択され、ここで前記Ｃ１－１０アルキル、Ｃ１－１０アルキルカルボニル、Ｃ１－１０アルキルスルホニル、Ｎ－（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイル、およびＮ，Ｎ－ジ（Ｃ１－１０アルキル）カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、Ｃ１－６アルキルアミノ、ジ（Ｃ１－６アルキル）アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、およびカルボキシから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；または
    　Ｒ６およびＲ７はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４～８員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、Ｃ１－６アルキル、Ｃ１－６アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、Ｃ１－１０アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    　Ｒ１２は、水素原子、Ｃ１－６アルキル、または－Ｑ２－Ｘ３－Ａｒであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    　Ｒ１３は、水素原子、またはＣ１－６アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよく；
    　Ｒ１４およびＲ１５は、独立に、水素原子、およびＣ１－６アルキルから選択され；またはＲ１４およびＲ１５はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、４～８員含窒素ヘテロ環を形成し；
    　Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８およびＲ１９は、独立に、水素原子、およびＣ１－６アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、Ｃ１－６アルコキシ、Ｃ１－６アルキルチオ、Ｃ１－６アルキルスルフィニル、およびＣ１－６アルキルスルホニルから選択される１以上の置換基により置換されていてもよい］
    で表されるモノマーに由来する繰り返し構造である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　共重合体が、式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、請求項５で定義したとおりであり、Ｒ２、Ｙ、ＷおよびＱ１は、請求項３で定義したとおりであり、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒは、請求項６で定義したとおりであり、ａ、ｂおよびｃは、式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
    で表され、ａおよびｂの和が１００であり、ｂが２～１０である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記共重合体が、２種以上の感熱性ユニットを含むものである、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　前記共重合体が、前記式（ａ）で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものである、請求項８に記載の方法。
  10. 　式（ＩＶ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
     ［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、請求項５で定義したとおりであり、Ｒ２、Ｙ、ＷおよびＱ１は、請求項３で定義したとおりであり、Ｒ３、Ｘ２、Ｘ３、Ｑ２およびＡｒは、請求項６で定義したとおりであり、ａ、ｂおよびｃは、式中の各繰り返し単位の比を表す０より大きい数である］
    で表される共重合体であって、ａおよびｂの和が１００であり、ｂが２～１０である、共重合体。
  11. 　細胞内の温度を測定する方法であって、
    （ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の方法に従って、温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
    （ｂ）励起光照射下、蛍光強度を測定する工程
    を含んでなる、方法。
  12. 　（ｃ）２つの波長領域における蛍光強度の比を算出する工程をさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
  13. 　２つの波長領域が、温度感受性プローブに含まれる蛍光性ユニットを与えるモノマーの常温における水中での励起スペクトルを測定した際の最大蛍光強度を示す波長の前後２００ｎｍの範囲から選択される、請求項１２に記載の方法。
  14. 　細胞内の温度を測定する方法であって、
    （ａ）請求項１～９のいずれか一項に記載の方法に従って、温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
    （ｂ）励起光照射下、蛍光寿命を測定する工程
    を含んでなる、方法。
  15. 　細胞内の温度を測定する方法であって、
    （ａ）感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、および
    （ｂ）励起光照射下、蛍光強度または蛍光寿命を測定する工程
    を含んでなり、前記共重合体が２種以上の感熱性ユニットを含むものである、方法。
  16. 　前記共重合体が、以下の式（ａ）：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
     ［式中、Ｒ１、Ｒ４およびＲ５は、請求項５で定義したとおりである］
    で表される２種以上の感熱性ユニットを含むものである、請求項１５に記載の方法。
  17. 　感熱性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブを用いて温度を測定する方法であって、
    （ａ）前記温度感受性プローブを溶解する工程、
    （ｂ）励起光照射下、蛍光強度を測定する工程、および
    （ｃ）２つの波長領域における蛍光強度の比を算出する工程
    を含んでなる、方法。
  18. 　２つの波長領域が、温度感受性プローブに含まれる蛍光性ユニットを与えるモノマーの常温における水中での励起スペクトルを測定した際の最大蛍光強度を示す波長の前後２００ｎｍの範囲から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 　請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法を用いて温度を測定するためのキットであって、前記方法に用いられる温度感受性プローブを含んでなる、キット。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015218304A (ja) * 2014-05-20 2015-12-07 キリン株式会社 細胞内の温度を測定するためのレシオ型蛍光性プローブ
JP2017051113A (ja) * 2015-09-07 2017-03-16 キリン株式会社 細胞内送達ベヒクル
JP2020097622A (ja) * 2020-02-21 2020-06-25 キリンホールディングス株式会社 細胞内送達ベヒクル
WO2022138854A1 (ja) * 2020-12-25 2022-06-30 株式会社ダイセル 温度感受性プローブ

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104845613B (zh) * 2015-04-29 2017-01-04 南方医科大学 五取代四氢嘧啶在制备温度敏感荧光材料中的应用
JP6681480B2 (ja) * 2016-12-22 2020-04-15 株式会社日立製作所 温度検知素子及びこれを備える温度検知装置
CN108976324B (zh) * 2018-07-02 2022-07-29 湖北大学 一种嵌段共聚物及包含嵌段共聚物的吸收剂
WO2021044264A1 (en) * 2019-09-03 2021-03-11 King Abdullah University Of Science And Technology Detecting temperature abuse
CN116903782B (zh) * 2023-07-09 2024-06-11 齐鲁工业大学(山东省科学院) 一种基于苯并噻二唑的聚丙烯酸酯类荧光探针、合成方法及在监测脂滴中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09285290A (ja) * 1995-07-25 1997-11-04 Stichting Voor De Technische Wetenschappen 高分子輸送ビヒクル
JP2007252304A (ja) * 2006-03-24 2007-10-04 Tokyo Medical & Dental Univ ナノゲルを用いたタンパク質の細胞内導入法
WO2008029770A1 (fr) * 2006-09-05 2008-03-13 The University Of Tokyo Thermomètre moléculaire fluorescent
JP2008537882A (ja) * 2005-04-01 2008-10-02 インヴィトロジェン コーポレーション 生体高分子を細胞に導入する方法および構成体
JP2009536030A (ja) * 2006-05-05 2009-10-08 モレキュラー、トランスファー、インコーポレイテッド 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004044068A1 (en) * 2002-11-13 2004-05-27 Kross Robert D Disinfecting dip compositions and related methods

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09285290A (ja) * 1995-07-25 1997-11-04 Stichting Voor De Technische Wetenschappen 高分子輸送ビヒクル
JP2008537882A (ja) * 2005-04-01 2008-10-02 インヴィトロジェン コーポレーション 生体高分子を細胞に導入する方法および構成体
JP2007252304A (ja) * 2006-03-24 2007-10-04 Tokyo Medical & Dental Univ ナノゲルを用いたタンパク質の細胞内導入法
JP2009536030A (ja) * 2006-05-05 2009-10-08 モレキュラー、トランスファー、インコーポレイテッド 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬
WO2008029770A1 (fr) * 2006-09-05 2008-03-13 The University Of Tokyo Thermomètre moléculaire fluorescent

Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2015218304A (ja) * 2014-05-20 2015-12-07 キリン株式会社 細胞内の温度を測定するためのレシオ型蛍光性プローブ
JP2017051113A (ja) * 2015-09-07 2017-03-16 キリン株式会社 細胞内送達ベヒクル
KR20180040714A (ko) 2015-09-07 2018-04-20 기린 가부시키가이샤 세포 내 송달 비히클
US10712346B2 (en) 2015-09-07 2020-07-14 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Intracellular delivery vehicle
EP3760193A1 (en) 2015-09-07 2021-01-06 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Intracellular delivery vehicle
KR20210008174A (ko) 2015-09-07 2021-01-20 기린 홀딩스 가부시키가이샤 세포 내 송달 비히클
US11452697B2 (en) 2015-09-07 2022-09-27 Kirin Holdings Kabushiki Kaisha Intracellular delivery vehicle
JP2020097622A (ja) * 2020-02-21 2020-06-25 キリンホールディングス株式会社 細胞内送達ベヒクル
JP7111312B2 (ja) 2020-02-21 2022-08-02 キリンホールディングス株式会社 細胞内送達ベヒクル
WO2022138854A1 (ja) * 2020-12-25 2022-06-30 株式会社ダイセル 温度感受性プローブ

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