JP2009536030A - 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬 - Google Patents
真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2009536030A JP2009536030A JP2009509534A JP2009509534A JP2009536030A JP 2009536030 A JP2009536030 A JP 2009536030A JP 2009509534 A JP2009509534 A JP 2009509534A JP 2009509534 A JP2009509534 A JP 2009509534A JP 2009536030 A JP2009536030 A JP 2009536030A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- peptide
- protein
- bis
- transfection
- fusion
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/10—Dispersions; Emulsions
- A61K9/127—Liposomes
- A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
- A61K9/1272—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers with substantial amounts of non-phosphatidyl, i.e. non-acylglycerophosphate, surfactants as bilayer-forming substances, e.g. cationic lipids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/88—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microencapsulation, e.g. using amphiphile liposome vesicle
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2720/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsRNA viruses
- C12N2720/00011—Details
- C12N2720/12011—Reoviridae
- C12N2720/12022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses
- C12N2810/6063—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses ds RNA viruses
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Description
リポソームのような脂質集合体は、生細胞中への例えばDNA、RNA、およびタンパク質などの高分子の導入を容易にする。カチオン性脂質成分を含んでなる集合体は、ある種の細胞中への核酸などの大きなアニオン性分子の効率的な輸送を行うために用いられる。Felgner et al.Nature 337:387-388(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:7413(1987)参照。
ミド四トリフルオロ酢酸塩、スペルミン‐5‐カルボキシグリシン(N′‐ステアリル‐N′‐エライジル)アミド四トリフルオロ酢酸塩、アグマチニルカルボキシコレステロール酢酸塩、スペルミン‐5‐カルボキシ‐β‐アラニンコレステリルエステル四トリフルオロ酢酸塩、2,6‐ジアミノヘキサノイル‐β‐アラニンコレステリルエステル二トリフルオロ酢酸塩、2,4‐ジアミノブチロイル‐β‐アラニンコレステリルエステル二トリフルオロ酢酸塩、N,N‐ビス(3‐アミノプロピル)‐3‐アミノプロピオニルβ‐アラニンコレステリルエステル三トリフルオロ酢酸塩、〔N,N‐ビス(2‐ヒドロキシエチル)‐2‐アミノエチル〕アミノカルボキシコレステリルエステル、ステアリルカルニチンエステル、パルミチルカルニチンエステル、ミリスチルカルニチンエステル、ステアリルステアロイルカルニチンエステルクロリド塩、L‐ステアリルステアロイルカルニチンエステル、ステアリルオレオイルカルニチンエステルクロリド、パルミチルパルミトイルカルニチンエステルクロリド、ミリスチルミリストイルカルニチンエステルクロリド、L‐ミリスチルミリストイルカルニチンエステルクロリド、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)パルミチルアミノ)プロピル〕ピペラジン、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(ドデシルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(オレイルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(パルミチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(ミリスチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐ドデシルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐オレイルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐パルミチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐ミリスチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミドを含有しうる。中性脂質としては、例えばDOPE、DPhPEまたはコレステロールであってもよい。
MLRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MPRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MSGDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
MSSDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
MGQRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、および
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
からなる群より選択される配列の10〜30連続アミノ酸を含んでなるペプチドでもよい。
RMPPGSCNGATAVFGNVH、
GDCAGLVSVFGSVH、
SDCAKIVSVFGSVH、
QRHSIVQPPAPPPNAFVEIVS、
およびSGPSNFVNHAPGEAIVT
からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸を含有してもよい。
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=パルミチル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ミリスチル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ラウリル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ステアリル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=オレオイル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=パルミチル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ミリスチル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ラウリル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ステアリル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=オレオイル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=パルミチル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ミリスチル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ラウリル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ステアリル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=オレオイル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=パルミチル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ミリスチル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ラウリル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン、
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1、Z2=ステアリル、W1、W2=OH、q、p、m=1、およびY=ピペラジン。
一つの態様において、ここで提供されるトランスフェクション複合体は、細胞へ輸送される高分子、融合誘導ペプチドおよびトランスフェクション剤を含有する。前記複合体が形成され、次いでトランスフェクトされる細胞へ加えられる。他の態様において、高分子が核酸である場合、融合誘導ペプチドは核酸結合部分へ機能的に連結される。例えば、融合誘導ペプチドは、以下で更に詳細に記載されているように、核酸と結合するペプチド配列または他のポリカチオン性核酸結合部分へ連結される。機能的な連結は共有結合でも、または非共有でもよい。前記ペプチドと核酸結合部分との非共有結合の例は、前記ペプチドが結合対の第一メンバーを含有し、核酸結合部分が結合対の第二メンバーを含有し、結合対の第一および第二メンバーの会合が融合誘導ペプチドと核酸結合部分との機能的な連結をもたらす場合である。適切な結合対には、抗体および抗原、ストレプトアビジン/ビオチンなどがある。ある例示態様では、ここで開示されているような融合誘導ペプチドとトランスフェクション試薬を含有する複合体を用いて、トランスフェクション複合体が形成される。融合誘導ペプチドおよびトランスフェクション試薬を含有するこれらの複合体が本発明の他の態様を形成する。
非エンベロープウイルスから誘導されるアミノ酸配列が、通常のトランスフェクション剤では難しい細胞、例えば初代細胞のような細胞中への高分子のトランスフェクションを促進する上で高度の効率的であることを、本発明者らは意外にも見出したのである。有利には、前記ペプチドは、非エンベロープ融合誘導レオウイルスによりコードされる融合関連小貫膜(FAST)タンパク質のN末端領域から誘導される配列を有する。
1 MSSDCAKIVS VFGSVHCQSS KNSAGGDLQA TSVFTTYWPH FAIGGGIIVV
51 ILLLGLFYCC YLKWKTSQVK HTYRRELIAL TRSHVHSTPS GISYV
MLRMPPGSCN GATAI/VFGNVH CQAAQNTAGG DLQATSSIIA YWPYLAAGGG FLLIVIIFAI LYCCKAKVKA DAARSVFHRE LVALSSGKHN AMAPPYNV
MLRMPPGSCNGATAIFGNVHCQAAQNTAGG DLQATSSIIAYWPYLAAGGGFLLIVIIFAI LYCCKAKVKA DAARSVFHRE LVALSSGKHN AMAPPYNV
1 MSSDCAKIVS VFGSVHCQSS KNSAGGDLQA TSVFTTYWPH FAIGGGIIVV 51 ILLLGLFYCC YLKWKTSQVK HTYRRELIAL TRSHVHSTPS GISYV
このセクションの具体例は本発明のプロトタイプトリレオウイルス融合誘導ペプチドを提供する。
MLRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MLRMPPGSCNGATAIFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MPRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MSGDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
MSSDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
MGQRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI。
RMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
RMPPGSCNGATAIFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
GDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
SDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
SGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI、
QRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、
SGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI。
RMPPGSCNGATAVFGNVH、
RMPPGSCNGATAIFGNVH、
GDCAGLVSVFGSVHCQSS、
SDCAKIVSVFGSVHCQSS、
QRHSIVQPPAPPPNAFVE、
SGPSNFVNHAPGEAIVTG。
MLRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MPRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MSGDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
MSSDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
MGQRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI。
RMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
RMPPGSCNGATAIFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
GDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
SDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
SGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI、
QRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、
SGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI。
RMPPGSCNGATAVFGNVHKKKKKKKKKKKKKKKK、
RMPPGSCNGATAIFGNVHKKKKKKKKKKKKKKKK、
GDCAGLVSVFGSVHCQSSKKKKKKKKKKKKKKKK、
SDCAKIVSVFGSVHCQSSKKKKKKKKKKKKKKKK、
QRHSIVQPPAPPPNAFVEKKKKKKKKKKKKKKKK、
SGPSNFVNHAPGEAIVTGKKKKKKKKKKKKKKKK。
本発明で用いられる複合体の追加成分はトランスフェクション剤である。本発明の関係で適切なトランスフェクション剤には、カチオン性およびポリカチオン性ポリマー、および/またはカチオン性およびポリカチオン性脂質がある。本発明で使用に適したカチオン性およびポリカチオン性ポリマーは当業界において知られ、例えば密集星型デンドリマー、PAMAMデンドリマー、NH3コアデンドリマー、エチレンジアミンコアデンドリマー、第5世代以上のデンドリマー、置換基を有するデンドリマー、1以上のアミノ酸を有するデンドリマー、グラフト化デンドリマー、活性化デンドリマー、ポリエチレンイミン、ポリエチレンイミン接合体(conjugate)、およびポリアルキレンイミンがある。本発明はこれらのポリカチオン性ポリマートランスフェクション剤の使用に限定されない、と当業者であればわかるであろう。
式(I)の脂質は、以下において一般的に記載され、かつ実施例において更に詳細に記載されているように合成される。これら方法の変法または当業界において周知である他の方法を用いてこれらクラスの脂質の他のメンバーも合成されうる、と当業者であればわかるであろう。
融合誘導ペプチド、オプションの核酸結合ドメイン、核酸、およびトランスフェクション剤の間で形成される複合体は、核または他の細胞内局在において機能し、輸送または移送で機能し、レセプターリガンドであり、細胞接着シグナル、細胞標的化シグナル、細胞インターナリゼーションシグナル、またはエンドサイトーシスシグナルを含んでなるタンパク質またはペプチド、並びにエンベロープウイルスのウイルス融合誘導タンパク質、ウイルス核局在シグナル、レセプターリガンド、細胞接着シグナル、細胞標的化シグナルまたはインターナリゼーションもしくはエンドサイトーシス誘発シグナルのペプチドまたはその機能性部分のような部分の含有により更に高められてもよい。
本発明の方法においては、少なくとも前記のような融合誘導ペプチド、トランスフェクション剤、および核酸を含んでなるトランスフェクション複合体と何らかの細胞、好ましくは真核細胞を接触させる。前記複合体は、一種以上の追加ペプチドまたはタンパク質、例えば融合誘導、膜透過性、輸送、もしくは移送細胞内局在、またはレセプター‐リガンドペプチドもしくはタンパク質も場合により含有してよい。これらの追加ペプチドもしくはタンパク質は場合により核酸結合基へ接合され、または場合によりトランスフェクション剤(脂質またはポリカチオン性ポリマー)へ接合され、そこで前記ペプチドまたはタンパク質あるいは修飾ペプチドまたはタンパク質が核酸と非共有会合される。いかなる理論にも拘束されることなく、本出願人らは本発明の複合体がリポソーム構造を典型的に含有する脂質集合体であると考えているが、これら構造の正確な性質は現在未知である。したがって、ある実例において、本発明の複合体はリポソーム複合体である。複合体全体または複合体の一部、例えば脂質部分、例えば式Iの脂質は、例えば当業界における周知のリバースエバポレーションの方法を用いて、リポソームへ処方される。一方、複合体の脂質部分または複合体全体は、超音波処理またはミクロ流動化のようなリポソーム形成のための他の周知方法により処方してもよい。これらのリポソーム処方体はDNAを培養細胞中へトランスフェクトするために有効である。
本発明の複合体および方法、特にここで提供される複合体を含有するトランスフェクション組成物に関するものは、細胞、特に真核細胞のインビトロおよびインビボトランスフェクション、更に具体的には動物細胞を含めた高等真核細胞のトランスフェクションに用いられる。本発明の方法は、有用な遺伝子産物を発現するトランスフェクト細胞を作製するために用いられる。本発明の方法は、トランスジェニック動物の作製においても一工程として用いられる。本発明の方法は、遺伝子療法およびウイルス阻害の方法を含めた細胞中への核酸の導入を要する治療法に、および細胞中へのアンチセンスまたはアンチジーン核酸、リボザイム、RNA調節配列、siRNA、RNAi、StealthRNAi(Invitrogen Corporation,Carlsbad,CA)または関連阻害もしくは調節核酸の導入のために、一工程として有用である。特に、これらの方法は癌治療、インビボおよび半ビボ遺伝子療法、並びに診断法において有用である。
式(I)の脂質は、インビトロまたはインビボで細胞中へ高分子の輸送のために、単独で用いられる。これらの脂質は少なくとも活性であり、細胞中へ高分子の輸送のために現在市販されているカチオン性脂質よりほとんどの場合に活性である。本発明の脂質、例えば1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)オレオイルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジンのHCl塩が、補助脂質なしに、または中性脂質DOPEまたはコレステロール(実施例11の129A‐Eおよび129H)と一緒に処方された。図6〜9において示されているように、本発明の脂質はCHO、NIH3T3、HEK293、および293GT細胞をトランスフェクトするために用いられ、比較脂質より2〜4倍良いトランスフェクション効率を呈することが示された。
ある実例において、式Iの脂質は、高分子を輸送するために、他の脂質および/または追加のトランスフェクション促進剤を含有する組成物でも用いられる。このような組成物は、式(I)の脂質と、中性、正荷電(例えばカチオン性脂質)、または負荷電の補助脂質を含有する。このような中性脂質としては、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシド類、およびジアシルグリセロール類があるが、それらに限定されない。カチオン性脂質としては、N,N‐ジオレイル‐N,N‐ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC)、N‐〔1‐(2,3‐ジオレイルオキシ)プロピル〕‐N,N,N‐トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA)、N,N‐ジステアリル‐N,N‐ジメチルアンモニウムブロミド(DDAB)、N‐〔1‐(2,3‐ジオレオイルオキシ)プロピル〕‐N,N,N‐トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP)、3‐〔N‐(N′,N′‐ジメチルアミノエタン)カルバモイル〕コレステロール(DC‐Chol)、N‐(1,2‐ジミリスチルオキシプロピ‐3‐イル)‐N,N‐ジメチル‐N‐ヒドロキシエチルアンモニウムブロミド(DMRIE)、1,2‐ジリノレイルオキシ‐N,N‐ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)、1,2‐ジリノレニルオキシ‐N,N‐ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、DODAP、DODMAおよびDMDMAがあるが、それらに限定されない。カチオン性脂質としては、LipofectAmine2000、LipofectAmine、Lipofectin、DMRIE‐C、Fugene、Fugene HD、Transfectam、Transfectin、SilentFect、およびEffecteneもあるが、それらに限定されない。アニオン性脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N‐ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン類、N‐スクシニルホスファチジルエタノールアミン類、N‐グルタリルホスファチジルエタノールアミン類、リシルホスファチジルグリセロール類、パルミトイルオレオイルホスファチジルグリセロール(POPG)、および中性脂質へ結合される他のアニオン性修飾基があるが、それらに限定されない。
本発明のトランスフェクション剤およびトランスフェクション促進剤は、治療用に様々な医薬組成物および剤形で提供される。例えば、これらの複合体を含有した注射用処方剤、鼻内処方剤、および静脈内および/または病変内投与用の処方剤が療法に用いられる。
本発明のトランスフェクション組成物の成分は試薬キットで提供しうる。前記キットは、トランスフェクション剤と、非エンベロープウイルスの融合誘導タンパク質からのアミノ酸配列とを含有してよい。このキットは、トランスフェクション促進剤、例えばトランスフェクション促進ペプチド、タンパク質、もしくはその断片、またはトランスフェクション促進化合物も含有しうる。トランスフェクション剤、アミノ酸配列、典型的には融合誘導ペプチド、および存在する場合、トランスフェクション促進剤は、各々が混合物として(即ち、単一容器、典型的にはチューブおよび/またはバイアルで)含有されるか、または別々の部分として(即ち、別々の容器、例えば別々のバイアルおよび/またはチューブで)含有される。本発明のキットは、理解されるように、典型的には、例えば段ボール箱へ一緒に詰み込まれる、バイアルおよび/またはチューブのような容器を含む。前記キットは供給者から顧客へ輸送しうる。例えば、一つの例において、ここで提供されるのは、トランスフェクション剤およびトランスフェクション促進ペプチドを含有するリポソーム処方体を含有したバイアルを含むキットである。前記キットは、例えば、トランスフェクション促進剤、例えばトランスフェクション促進ペプチド、例えばPlus Reagent(Invitrogen Corp.,Carlsbad,CA)を含む別々な容器も含有しうる。前記キットは、別々な容器に、細胞、細胞培地、およびリポーター核酸配列、例えばリポーター遺伝子を発現するプラスミドも含有しうる。ある例において、培地は低血清培地および/またはタンパク質発現培地である。
ここで提供される融合誘導ペプチド、脂質、複合体、および/またはトランスフェクション組成物および/またはキットを識別する識別名を顧客へ提示し、識別名を用いてここで提供される融合誘導ペプチド、脂質、トランスフェクション複合体、トランスフェクション組成物および/またはキットを購入するための購入機能へ顧客をアクセスさせることを含んでなる、ここで提供される融合誘導ペプチド、脂質、トランスフェクション複合体、トランスフェクション組成物および/またはキットを販売するための方法も提供される。識別名は、典型的には、オーダーシステムの一部として顧客へ提示される。オーダーシステムには、望ましい製品を識別するためのインプット機能と、識別された望ましい製品を購入するための購入機能を含む。オーダーシステムは、典型的には供給業者の直接または間接コントロール下にある。ここで用いられている顧客とは、生物研究用製品およびサービスを得ようとしている個人、機関、企業、大学、または組織に関する。ここで用いられている供給業者とは、生物研究用製品およびサービスを提供しようとしている個人、機関、企業、大学、または組織に関する。
β‐ガラクトシダーゼリポータープラスミドpCMV・SPORT‐β‐galでCHO‐K1、NIH3T3、A549、Cos‐7、およびBE(2)Cのトランスフェクションを次のように行った:
望ましい密集度(70%〜95%)へ達するように、トランスフェクション前日に10%牛胎児血清含有培地100μL入り96ウェルプレートへ細胞を入れた。翌日、DNA/脂質複合体を形成するために、脂質DMTS(ジミリスチル‐テトラヒドロキシ‐スペルミン)およびDOPE(2:1DMTS:DOPE)のリポソーム組成物を含有するトランスフェクション剤と、DNAとをOpti-MEM中で混合した。様々な量の脂質(0.1〜0.35μL)を100μLのOpti-MEMへ加えることにより複合体を形成した。DNA(100ng)を100μL Opti-MEMへ加えた。DNA脂質複合体を形成するために、DNAおよび脂質溶液を次いで混合した。複合体を少なくとも15分間インキュベートし、その後でDNA脂質複合体へ、次のような、ここで提供されるプロトタイプトリレオウイルス融合誘導ペプチドの配列:
Arg-Met-Pro-Pro-Gly-Ser-Cys-Asn-Gly-Ala-Thr-Ala-Val-Phe-Gly-Asn-Val-His-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
を有する様々な量のペプチド20μLを加え、DNA/脂質/ペプチド複合体を形成するために15分間インキュベートした。30分間のインキュベート後、20μLのDNA/脂質/ペプチド複合体を10%血清中の細胞へ直接加えた。プラスミドの発現を行わせるために、細胞を更に24時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を100〜200μLの溶解用緩衝液中で溶解させた。酵素基質ONPGを用いて、溶解物(20μL)をβ‐gal活性について検証した。Bio-Rad Benchmark Microplate Spectrophotometerを用いて405でODを読むことにより、総活性を調べた。
β‐ガラクトシダーゼリポータープラスミドpCMV・SPORT‐β‐galでCHO‐K1、NIH3T3、A549、Cos‐7、およびBE(2)Cのトランスフェクションを次のように行った:
望ましい密集度(70%〜95%)へ達するように、トランスフェクション前日に10%牛胎児血清含有培地100μL入り96ウェルプレートへ細胞を入れた。翌日、DNA/脂質/ペプチド複合体を形成するために、脂質DMTS(ジミリスチル‐テトラヒドロキシ‐スペルミン)およびDOPE(2:1DMTS:DOPE)のリポソーム組成物を含有するトランスフェクション剤とDNA/ペプチドをOpti-MEM中で混合した。ペプチドおよびDNAを15分間混合し、更に15分間脂質と混合した。様々な量の脂質(0.1〜0.35μL)を100μLのOpti-MEMへ加えることにより複合体を形成した。DNA(100ng)を100μL Opti-MEMへ加え、次いで次のような、ここで提供されるプロトタイプトリレオウイルス融合誘導ペプチドの配列:
Arg-Met-Pro-Pro-Gly-Ser-Cys-Asn-Gly-Ala-Thr-Ala-Val-Phe-Gly-Asn-Val-His-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys
を有する様々な量のペプチドをDNA混合物へ加え、15分間インキュベートした。DNA脂質複合体を形成するために、DNA/ペプチドおよび脂質溶液を次いで混合した。複合体を更に15分間インキュベートした。インキュベート後、20μLの複合体を10%血清中の細胞へ直接加えた。プラスミドの発現を行わせるために、細胞を更に24時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を100〜200μLの溶解用緩衝液中で溶解させた。酵素基質ONPGを用いて、溶解物(20μL)をβ‐gal活性について検証した。Bio-Rad Benchmark Microplate Spectrophotometerを用いて405でODを読むことにより、総活性を調べた。
β‐ガラクトシダーゼリポータープラスミドpCMV・SPORT‐β‐galで懸濁中CHO‐SおよびHEK293のトランスフェクションを下記のように行う:
トランスフェクション前に、細胞をオービタルシェーカー上で含湿37℃および8%CO2中懸濁状態で培養した。抗生物質は細胞死を招くため、これは培地へ加えない。加えて凝集はトランスフェクション効率を低下させることから、凝集を避けるために規則的間隔で細胞を十分に撹拌し、抗凝集剤は培養時およびトランスフェクション前に加えない。しかしながら、抗凝集剤は場合によりトランスフェクション後に用いられる。
A)HEK293細胞のルーチン培養の場合、135〜155rpmで振盪して細胞密度を0.1〜2×106細胞/mL培養物に保つ。2×106細胞/mLを超える細胞密度はトランスフェクション効率の低下を招く。
B)CHO‐S細胞のルーチン培養の場合、120〜135rpmで振盪して細胞密度を0.05〜1.5×106細胞/mL培養物に保つ。1.5×106細胞/mLを超える細胞密度はトランスフェクション効率の低下を招く。培地はL‐グルタミンで最終濃度8mMに補充される。
タンパク質発現を最適化するために、トランスフェクション後1〜7日間にわたり時間経過させ、タンパク質産生のピークを得て、細胞生存を測定する。GFT型蛍光タンパク質の発現でトランスフェクション効率を評価するために、培養物をトランスフェクション後24時間経てから測定する。分泌されるIgGタンパク質産生の場合、ピーク産出はトランスフェクション後5〜7日目である。
異なる培養容量について、下記パラメーターを用いる:
24ウェルフォーマットで哺乳類細胞中へDNA(β‐ガラクトシダーゼリポータープラスミドpCMV・SPORT‐β‐gal)をトランスフェクトするために下記プロトコールを用いる。用いられる量はパーウェルベースである。
接着細胞
トランスフェクションの1日前、細胞がトランスフェクション時に50〜80%密集度となるように、500μLの増殖培地へ細胞を入れる。
複合体の製造直前に、200,000〜500,000細胞を500μLの増殖培地へ入れる。
各トランスフェクションサンプルについて、複合体を次のように製造する。
500ngのプラスミドDNAを無血清の100μL Opti-MEM I Reduced Serum Mediumで希釈し、穏やかに混合する。(Plus試薬(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)でオプショナルトランスフェクションの場合は、Plus試薬を穏やかに混合し、0.5μLを希釈DNAへ直接加え、室温において5分間インキュベートする。)次いで、融合誘導ペプチド、カチオン性脂質およびヘルパー脂質を含有したここで提供されるトランスフェクション組成物1.25μLを(Plus試薬と共にまたはそれなしで)希釈DNA溶液へ加え、混合液を穏やかに混ぜ、室温において30分間インキュベートして、複合体を形成させる。次いで約100μLの複合体を細胞含有のウェルへ直接加え、プレートを穏やかに前後に揺する。プラスミドの発現を行わせるために、細胞をCO2インキュベーター中37℃において更に24時間インキュベートする。培地を場合により4〜6時間後に変える。
トランスフェクション後1日で細胞を新鮮培地へ1:10(またはそれ以上の希釈倍率)で移す。選択培地を場合により翌日加える。
異なる培養容量について、下記パラメーターを用いる:
細胞をトランスフェクションミックスへ直接入れることにより急速96ウェルトランスフェクションを得る。複合体をプレートで調製し、100μL容量で上記の2倍の細胞密度で細胞を直接加える。更に脂質を最適トランスフェクションのために用いる。
注意:血液寒天プレート、サブローデキストロース寒天プレート、および液状チオグリコレート培地を用い、リポータープラスミドでのトランスフェクションにより機能的に、微生物汚染の非存在についてトランスフェクション組成物を試験する。
高スループットでまたは少量のトランスフェクション組成物を用いて哺乳類細胞中へDNA(β‐ガラクトシダーゼリポータープラスミドpCMV・SPORT‐β‐gal)をトランスフェクトするために、下記プロトコールを用いる。この操作では、試薬を最初に前希釈し、次いで大きな容量を希釈DNAへ加える。用いられる量は、96ウェルフォーマットの場合にパーウェルベースである。
トランスフェクションの1日前、細胞がトランスフェクション時に50〜80%密集度となるように、100μLの増殖培地へ細胞を入れる。
複合体の製造直前に、40,000〜100,000細胞を100μLの増殖培地へ入れる。
各トランスフェクションサンプルについて、複合体を次のように製造する。
100ngのプラスミドDNAを無血清の10μL Opti-MEM I Reduced Serum Mediumで希釈し、穏やかに混合する。(Plus試薬(Invitrogen Inc.,Carlsbad,CA)でオプショナルトランスフェクションの場合は、Plus試薬を穏やかに混合し、無血清のOpti-MEM I Reduced Serum Medium(0.1μL/ウェル)で10倍希釈し、1μLの希釈Plus試薬を希釈DNAへ直接加え、穏やかに混合し、室温において5分間インキュベートする。)次いで、融合誘導ペプチド、カチオン性脂質、および中性脂質を含有したここで提供されるトランスフェクション組成物0.25μL/ウェルを無血清のOpti-MEM I Reduced Serum Medium中1mg/mL〜2mg/mLの混合総濃度で希釈して、10μL/ウェルとすることにより、トランスフェクション組成物のストック溶液を調製する。次いで融合誘導ペプチド、中性脂質、およびカチオン性脂質を含有したここで提供される希釈トランスフェクション組成物10μLを(Plus試薬と共にまたはそれなしで)希釈DNA溶液へ加え、混合液を穏やかに混ぜ、室温において30分間インキュベートして、複合体を形成させる。次いで約20μLの複合体を細胞含有の各ウェルへ直接加え、プレートを穏やかに前後に揺する。試験froトランスジーン発現前に、細胞をCO2インキュベーター中37℃において更に18〜48時間インキュベートする。培地を場合により4〜6時間後に変化させた。
ピペラジン(2.0g)、N‐(2,3‐エポキシプロピル)フタルイミド(12.0g)および過塩素酸リチウム(6.4g)を300mL無水エタノール中で混合し、還流下において2日間加熱した。得られた混合液を冷却し、濾過により得られる沈殿物をエタノールですすぎ、オフホワイト固体物として1,4‐ビス(2‐ヒドロキシ‐3‐フタルイミドプロピル)ピペリジン(化合物1)を得た(8.5g,75%収率)。
化合物3、オクタデカ‐9‐エニル‐〔2‐ヒドロキシ‐3‐〔4‐(3‐オクタデカ‐9‐エニルアミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)ピペラジン‐1‐イル〕プロピル〕アミン(3.2g)をエタノール(110mL)に溶解し、N‐(2,3‐エポキシプロピル)フタルイミド(2.3g)および過塩素酸リチウム(1.1g)を反応混合液へ加え、次いで還流下において加熱した。反応混合液を冷却し、クロロホルム(300mL)で希釈し、水(2×300mL)で抽出した。有機相を濃縮し、溶離液としてクロロホルム/メタノール(1〜3%)を用いてフラッシュクロマトグラフィーに付し、望ましいフタルアミド(3.05g)を得た。
R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CHOH‐CH2、R3、R6=N、W1、W2=OH、q、p、m=1、Y=ピペラジン、並びにZ1およびZ2は双方ともパルミチル、ミリスチル、ラウリル、またはステアリルである。
THF(200mL)中、1,4‐ビス(3‐アミノプロピル)ピペラジン(10.0g)の氷冷溶液へ38gのテクニカル塩化オレオイル(85%)を加えた。反応混合液を室温において一晩攪拌した。反応混合液をクロロホルム(500mL)で希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液(3×200mL)で抽出した。有機溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、溶離液としてクロロホルムおよび5〜20%メタノール/クロロホルムを用いてシリカゲルの短カラムクロマトグラフィーに残渣を付した。望ましい化合物オクタデカ‐9‐エン酸〔3‐〔4‐(3‐オクタデカ‐9‐エノイルアミノプロピル)ピペリジン‐1‐イル〕プロピル〕アミドを含有する画分を合わせ、濃縮して、オフホワイト固体物を得た(18.28g,50%収率)。生成物をマススペクトロメトリーにより特徴づけた。
アミン、オクタデカ‐9‐エニル‐〔3‐〔4‐(3‐オクタデカ‐9‐エニルアミノ‐プロピル)ピペラジン‐1‐イル〕プロピル〕アミン(5g,7.1mmol)をDMF(50mL)中N‐(3‐ブロモプロピル)フタルイミド(6.78g,25mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(3.7mL,21mmol)で処理した。反応混合液を120℃に1時間、次いで95℃において一晩加熱した。溶媒をロータリー蒸発で除去し、溶離液としてクロロホルムおよびメタノール/クロロホルムを用いてシリカフラッシュクロマトグラフィーにより望ましいフタルアミドを単離した。フタルイミドを前記のようにヒドラジン水和物で処理し、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)オレオイルアミノ)プロピル〕ピペラジン(R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、Z1,Z2=オレオイル、W1、W2=H、q、p、m=1、およびY=ピペラジン)を得た。化合物をTLCおよびマススペクトロメトリーにより特徴づけた。こうして、アルキル基の長さがC12‐C18で変わる化合物を合成した。例として次の化合物がある:R1、R2=H、X1、X2=CH2、R4、R5=CH2‐CH2‐CH2、R3、R6=N、W1、W2=H、q、p、m=1、Y=ピペラジン、並びにZ1およびZ2は双方ともパルミチル、ミリスチル、ラウリル、またはステアリルである。
オレイルアミン(2.67g,10mmol)をDMF(50mL)中、過剰N‐(2,3‐エポキシプロピル)フタルイミド(10.72,40mmol)およびジイソプロピルエチルアミン(6.7mL)で処理した。反応混合液を95℃において一晩加熱した。溶媒をロータリー蒸発で除去し、得られたゴム状物をクロロホルム(200mL)に溶解し、水(200mL)で2回抽出した。クロロホルムを蒸発により除去し、得られた物質を溶離液としてクロロホルムを用いてシリカで短カラムクロマトグラフィーに付した。こうして得られた望ましい物質を前記のようにヒドラジン水和物で処理し、1‐アミノ‐3‐〔(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)オクタデカ‐9‐エニルアミノ〕プロパン‐2‐オール(化合物6)を得た。
一般的に、所要量のカチオン性脂質および補助脂質を秤量し、丸底フラスコへ移す。脂質を溶解するために十分な量のクロロホルム、次いで望ましい総脂質濃度/容量(例えば2mg/mL)を得るために十分な分子生物学グレード水を加える。クロロホルムを真空下ロータリーエバポレーターにより除去する。クロロホルムが除去されたら、リポソームが水性媒体中で形成される。溶液は乳白色になり、処方されるカチオン性脂質および補助脂質に応じてその濁度が様々である。
β‐ガラクトシダーゼリポータープラスミドpCMV・SPORT‐β‐galでCHO‐K1およびHEK293のトランスフェクションを次のように行った:
望ましい密集度(70%〜95%)へ達するように、トランスフェクション前日に10%牛胎児血清含有培地100μL入り96ウェルプレートへ細胞を入れた。翌日、DNA/脂質複合体を形成するために、脂質およびDNAをOpti-MEM培地中で混合した。様々な量の脂質(0.1〜0.35μL)を100μLのOpti-MEMへ加えることにより複合体を形成させた。DNA(100ng)を100μL Opti-MEMへ加えた。DNA‐脂質複合体を形成するために、DNAおよび脂質溶液を次いで混合した。複合体を少なくとも20〜30分間インキュベートし、20μLの複合体を10%血清中の細胞へ直接加えた。プラスミドの発現を行わせるために、細胞を更に24時間インキュベートした。培地を除去し、細胞を100〜200μLの溶解用緩衝液中で溶解させた。酵素基質ONPGを用いて、溶解物(20μL)をβ‐gal活性について検証した。Bio-Rad Benchmark Microplate Spectrophotometerを用いて405nmでODを読むことにより、総活性を調べた。
siRNAトランスフェクションの場合、細胞が50〜60%密集度となるように、トランスフェクション前日に血清含有培地中適切な数の細胞で24ウェルプレートを接種し、細胞を3〜5%CO2インキュベーター中37℃において一晩インキュベートする。トランスフェクトされる各ウェルにおいて、0.1〜0.4μLの脂質を含有する無血清培地25μLおよびsiRNAを含有する無血清培地25μLを調製する。siRNAの最終濃度は10nMである。脂質およびsiRNA溶液を混合し、室温において20分間インキュベートする。脂質/siRNA複合体(50μL)を血清含有培地中の細胞へ加え、細胞をCO2インキュベーター中、37℃においてインキュベートする。遺伝子サイレンシングがトランスフェクション後24〜72時間で測定されうる。
Claims (162)
- トランスフェクション剤および融合剤を含んでなる複合体であって、前記融合剤が非エンベロープウイルスの融合タンパク質から誘導される融合促進アミノ酸配列を含んでなるものである、複合体。
- 前記非エンベロープウイルスがレオウイルスである、請求項1に記載の複合体。
- 前記レオウイルスが、トリレオウイルス、Nelson Bayレオウイルス、Pulauレオウイルス、およびヒヒレオウイルスからなる群より選択されるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記融合剤が、前記融合促進アミノ酸配列へ機能的に連結された核酸結合部分を更に含んでなる、請求項1に記載の複合体。
- 前記核酸結合部分が、ポリカチオン性ペプチド配列、ポリアミン、ペプチド核酸、スペルミン、スペリジン、およびカルボキシスペルミジンからなる群より選択されるものである、請求項4に記載の複合体。
- 前記核酸結合部分が前記融合促進アミノ酸配列へ共有結合されるものである、請求項5に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション剤が、カチオン性脂質、ポリアミン、ポリカチオン性ペプチド配列、およびカチオン性デンドリマーからなる群より選択される試薬を含んでなるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体がトランスフェクション促進剤を更に含んでなるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション促進剤が核局在タンパク質またはペプチドを含んでなるものである、請求項8に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション促進剤が融合誘導ペプチドまたはタンパク質を含んでなるものである、請求項8に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション促進剤がレセプター‐リガンドペプチドまたはタンパク質を含んでなるものである、請求項8に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション促進剤が輸送ペプチドまたはタンパク質を含んでなるものである、請求項8に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション促進剤が、レオウイルス以外のウイルスから誘導される、細胞侵入を容易にするウイルスペプチドまたはタンパク質を含んでなるものである、請求項8に記載の複合体。
- 前記ウイルスペプチドが、インフルエンザウイルス、水疱性口内炎ウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、セムリキ森林ウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、HIVウイルス、およびシミアンウイルスからなる群より選択されるウイルスから誘導されるものである、請求項13に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション促進剤が、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、細胞標的化抗体、ラクトフェリン、フィブロネクチン、アデノウイルスペントンベース、Knob、ヘキソンタンパク質、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質、セムリキ森林ウイルスコアタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素、肝炎Bコアタンパク質、HIV Tatタンパク質、単純ヘルペスウイルスVP22タンパク質、ヒストンタンパク質、アルギニンリッチ細胞透過性タンパク質、高移動性群タンパク質、インベーシンタンパク質、インターナリンタンパク質、内毒素、ジフテリア毒素、赤痢菌毒素、メリチン、マガイニン、グラミシジン、セクロピン、デフェンシン、プロテグリン、タキプレシン、チオニン、インドリシジン、バクテネシン、ドロソマイシン、アピダエシン、カテリシジン、殺菌性透過性促進タンパク質、ナイシン、ブホリン、またはそれらの断片からなる群より選択される、請求項8に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション剤が少なくとも一種のカチオン性脂質を含んでなるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション剤が一種以上の中性脂質を更に含んでなるものである、請求項16に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション剤が少なくとも一種のポリアミントランスフェクション剤を含んでなるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記カチオン性脂質が少なくとも一種の一価カチオン性脂質を含んでなるものである、請求項16に記載の複合体。
- 前記一価カチオン性脂質が、DOTMA、DOTAP、DMRIE、DC‐Chol、およびDDABからなる群より選択されるものである、請求項19に記載の複合体。
- 前記カチオン性脂質が少なくとも一種の多価カチオン性脂質を含んでなるものである、請求項16に記載の複合体。
- 前記多価カチオン性脂質が、DOSPA、DOSPER、DOGS、TMTPS、TMTOS、TMTLS、TMTMS、TMDOS、N‐1‐ジメチル‐N‐1‐(2,3‐ジアオレオイルオキシプロピル)‐2‐ヒドロキシプロパン‐1,3‐ジアミン、N‐1‐ジメチル‐N‐1‐(2,3‐ジアミリスチルオキシプロピル)‐2‐ヒドロキシプロパン‐1,3‐ジアミン、N‐1‐ジメチル‐N‐1‐(2,3‐ジアパルミチルオキシプロピル)‐2‐ヒドロキシプロパン‐1,3‐ジアミン、N‐1‐ジメチル‐N‐1‐(2,3‐ジアオレオイルオキシプロピル)‐2‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピルオキシ)プロパン‐1,3‐ジアミン、N‐1‐ジメチル‐N‐1‐(2,3‐ジアミリスチルオキシプロピル)‐2‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピルオキシ)プロパン‐1,3‐ジアミン、N‐1‐ジメチル‐N‐1‐(2,3‐ジアパルミチルオキシプロピル)‐2‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピルオキシ)プロパン‐1,3‐ジアミン、L‐スペルミン‐5‐カルボキシル‐3‐(DL‐1,2‐ジパルミトイル‐ジメチルアミノプロピル‐β‐ヒドロキシエチルアミン)、3,5‐(N,N‐ジ‐リシル)ジアミノベンゾイル‐グリシル‐3‐(DL‐1,2‐ジパルミトイル‐ジメチルアミノプロピル‐β‐ヒドロキシエチルアミン)、L‐リシン‐ビス(O,O′‐オレオイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、L‐リシン‐ビス(O,O′‐パルミトイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)アルキルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、L‐リシン‐ビス(O,O′‐ミリストイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、L‐オルニチン‐ビス(O,O′‐ミリストイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、L‐オルニチン‐ビス(O,O′‐オレオイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)オレイルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、L‐オルニチン‐ビス(O,O′‐パルミトイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、1,4‐ビス〔(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)オレイルアミノ〕ブタン‐2,3‐ジオール、1,4‐ビス〔(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)パルミチルアミノ〕ブタン‐2,3‐ジオール、1,4‐ビス〔(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)ミリスチルアミノ〕ブタン‐2,3‐ジオール、1,4‐ビス〔(3‐オレイルアミノ)プロピル〕ピペラジン、L‐アルギニン‐ビス(O,O′‐オレオイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)ミリスチルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、L‐アルギニン‐ビス(O,O′‐パルミトイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、L‐セリン‐ビス(O,O′‐オレオイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)パルミチルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、グリシン‐ビス(O,O′‐パルミトイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、サルコシン‐ビス(O,O′‐パルミトイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、L‐ヒスチジン‐ビス(O,O′‐パルミトイル‐β‐ヒドロキシエチル)アミド二塩酸塩、コレステリル‐3β‐カルボキシル‐アミドエチレントリメチルアンモニウムヨージド、1,4‐ビス〔(3‐ミリスチルアミノ)プロピル〕ピペラジン、1‐ジメチルアミノ‐3‐トリメチルアンモニオ‐DL‐2‐プロピル‐コレステリルカルボキシレートヨージド、コレステリル‐3β‐カルボキシアミドエチレンアミン、コレステリル‐3β‐オキシスクシンアミドエチレントリメチルアンモニウムヨージド、1‐ジメチルアミノ‐3‐トリメチルアンモニオ‐DL‐2‐プロピル‐コレステリル‐3β‐オキシスクシネートヨージド、2‐〔(2‐トリメチルアンモニオ)エチルメチルアミノ〕エチル‐コレステリル‐3β‐オキシスクシネートヨージド、3β‐〔N‐(N′,N′‐ジメチルアミノエタン)カルバモイル〕コレステロール、3β‐〔N‐(ポリエチレンイミン)カルバモイル〕コレステロール、1,4‐ビス〔(3‐パルミチルアミノ)プロピル〕ピペラジン、L‐オルニチルグリシル‐N‐(1‐ヘプタデシルオクタデシル)グリシンアミド、N2,N5‐ビス(3‐アミノプロピル)‐L‐オルニチルグリシル‐N‐(1‐ヘプタデシルオクタデシル)グリシンアミド、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)アルキルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、N2‐〔N2,N5‐ビス(3‐アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジオクタデシル‐L‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジオクタデシル‐L‐α‐グルタミン、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)オレイルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジオクタデシル‐L‐α‐アスパラギン、N‐〔N2‐〔N2,N5‐ビス〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕‐N2,N5‐ビス〔3‐〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕アミノプロピル〕‐L‐オルニチル‐N,N‐ジオクタデシル‐L‐グルタミニル〕‐L‐グルタミン酸、N2‐〔N2,N5‐ビス(3‐アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジオレイル‐L‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジオレイル‐L‐α‐グルタミン、4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)ミリスチルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジオレイル‐L‐α‐アスパラギン、N‐〔N2‐〔N2,N5‐ビス〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕‐N2,N5‐ビス〔3‐〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕アミノプロピル〕‐L‐オルニチル‐N,N‐ジオレイル‐L‐グルタミニル〕‐L‐グルタミン酸、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)オレイルアミノ)プロピル〕ピペラジン、N2‐〔N2,N5‐ビス(3‐アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジパルミチル‐L‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジパルミチル‐L‐α‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジパルミチル‐L‐α‐アスパラギン、N‐〔N2‐〔N2,N5‐ビス〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕‐N2,N5‐ビス〔3‐〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕アミノプロピル〕‐L‐オルニチル‐N,N‐ジパルミチル‐L‐グルタミニル〕‐L‐グルタミン酸、N2‐〔N2,N5‐ビス(3‐アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジミリスチル‐L‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジミリスチル‐L‐α‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジミリスチル‐L‐α‐アスパラギン、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)パルミチルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、N‐〔N2‐〔N2,N5‐ビス〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕‐N2,N5‐ビス〔3‐〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕アミノプロピル〕‐L‐オルニチル‐N,N‐ジミリスチル‐L‐グルタミニル〕‐L‐グルタミン酸、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)ミリスチルアミノ)プロピル〕ピペラジン、N2‐〔N2,N5‐ビス(3‐アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジラウレイル‐L‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジラウレイル‐L‐α‐グルタミン、N2‐〔N2,N5‐ビス(アミノプロピル)‐L‐オルニチル〕‐N,N‐ジラウレイル‐L‐α‐アスパラギン、N‐〔N2‐〔N2,N5‐ビス〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕‐N2,N5‐ビス〔3‐〔(1,1‐ジメチルエトキシ)カルボニル〕アミノプロピル〕‐L‐オルニチル‐N,N‐ジラウレイル‐L‐グルタミニル〕‐L‐グルタミン酸、3‐〔N′,N″‐ビス(2-tert-ブチルオキシカルボニルアミノエチル)グアニジノ〕‐N,N‐ジオクタデカ‐9‐エニルプロピオンアミド、3‐〔N′,N″‐ビス(2-tert-ブチルオキシカルボニルアミノエチル)グアニジノ〕‐N,N‐ジパルミチルプロピオンアミド、3‐〔N′,N″‐ビス(2-tert-ブチルオキシカルボニルアミノエチル)グアニジノ〕‐N,N‐ジミリスチルプロピオンアミド、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)パルミチルアミノ)プロピル〕ピペラジン、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)オレイルアミノ)プロピル〕ピペラジン、N,N‐(2‐ヒドロキシ‐3‐アミノプロピル)‐N‐2‐ヒドロキシプロピル‐3‐N,N‐ジオレイルアミノプロパン、N,N‐(2‐ヒドロキシ‐3‐アミノプロピル)‐N‐2‐ヒドロキシプロピル‐3‐N,N‐ジパルミチルアミノプロパン、N,N‐(2‐ヒドロキシ‐3‐アミノプロピル)‐N‐2‐ヒドロキシプロピル‐3‐N,N‐ジミリスチルアミノプロパン、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)ミリスチルアミノ)プロピル〕ピペラジン、〔(3‐アミノプロピル)‐ビス(2‐テトラデシルオキシエチル)〕メチルアンモニウムブロミド、〔(3‐アミノプロピル)‐ビス(2‐オレイルオキシエチル)〕メチルアンモニウムブロミド、〔(3‐アミノプロピル)‐ビス(2‐パルミチルオキシエチル)〕メチルアンモニウムブロミド、オレオイル‐2‐ヒドロキシ‐3‐N,N‐ジメチルアミノプロパン、2‐ジデカノイル‐1‐N,N‐ジメチルアミノプロパン、パルミトイル‐2‐ヒドロキシ‐3‐N,N‐ジメチルアミノプロパン、1,2‐ジパルミトイル‐1‐N,N‐ジメチルアミノプロパン、ミリストイル‐2‐ヒドロキシ‐3‐N,N‐ジメチルアミノプロパン、1,2‐ジミリストイル‐1‐N,N‐ジメチルアミノプロパン、(3‐アミノプロピル)‐4‐(3‐アミノプロピルアミノ)‐4‐テトラデシルカルバモイル‐ブチルカルバミン酸コレステリルエステル、(3‐アミノプロピル)‐4‐(3‐アミノプロピルアミノ)‐4‐カルバモイルブチルカルバミン酸コレステリルエステル、(3‐アミノプロピル)‐4‐(3‐アミノプロピルアミノ)‐4‐(2‐ジメチルアミノエチルカルバモイル)ブチルカルバミン酸コレステリルエステル、スペルミン‐5‐カルボキシグリシン(N′‐ステアリル‐N′‐オレイル)アミド四トリフルオロ酢酸塩、スペルミン‐5‐カルボキシグリシン(N′‐ステアリル‐N′‐エライジル)アミド四トリフルオロ酢酸塩、アグマチニルカルボキシコレステロール酢酸塩、スペルミン
‐5‐カルボキシ‐β‐アラニンコレステリルエステル四トリフルオロ酢酸塩、2,6‐ジアミノヘキサノイル‐β‐アラニンコレステリルエステル二トリフルオロ酢酸塩、2,4‐ジアミノブチロイル‐β‐アラニンコレステリルエステル二トリフルオロ酢酸塩、N,N‐ビス(3‐アミノプロピル)‐3‐アミノプロピオニルβ‐アラニンコレステリルエステル三トリフルオロ酢酸塩、〔N,N‐ビス(2‐ヒドロキシエチル)‐2‐アミノエチル〕アミノカルボキシコレステリルエステル、ステアリルカルニチンエステル、パルミチルカルニチンエステル、ミリスチルカルニチンエステル、ステアリルステアロイルカルニチンエステルクロリド塩、L‐ステアリルステアロイルカルニチンエステル、ステアリルオレオイルカルニチンエステルクロリド、パルミチルパルミトイルカルニチンエステルクロリド、ミリスチルミリストイルカルニチンエステルクロリド、L‐ミリスチルミリストイルカルニチンエステルクロリド、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノ‐2‐ヒドロキシプロピル)パルミチルアミノ)プロピル〕ピペラジン、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(ドデシルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(オレイルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(パルミチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N,N′‐ビス(ミリスチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐ドデシルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐オレイルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐パルミチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、N‐(3‐アミノプロピル)‐N′‐メチル‐N,N′‐(ビス‐2‐ミリスチルオキシエチル)ピペラジニウムブロミド、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)オレイルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)ミリスチルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジン、および1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)パルミチルアミノ)‐2‐ヒドロキシプロピル〕ピペラジンからなる群より選択されるものである、請求項21に記載の複合体。 - 前記中性脂質が、DOPE、DPhPE、およびコレステロールからなる群より選択されるものである、請求項17に記載の複合体。
- 前記ポリアミントランスフェクション剤が、密集星型デンドリマー、PAMAMデンドリマー、NH3コアデンドリマー、エチレンジアミンコアデンドリマー、第5世代以上のデンドリマー、置換基を有するデンドリマー、1以上のアミノ酸を有するデンドリマー、グラフト化デンドリマー、活性化デンドリマー、ポリエチレンイミン、およびポリエチレンイミン接合体からなる群より選択されるものである、請求項18に記載の複合体。
- 前記トランスフェクション剤が前記融合促進アミノ酸配列へ共有結合されるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記カチオン性脂質の少なくとも一種が前記融合促進アミノ酸配列の一種以上へ共有結合されるものである、請求項16に記載の複合体。
- 前記中性脂質の少なくとも一種が前記融合促進アミノ酸配列の一種以上へ共有結合されるものである、請求項17に記載の複合体。
- 前記ポリアミンの少なくとも一種が前記融合促進アミノ酸配列の一種以上へ共有結合されるものである、請求項18に記載の複合体。
- 前記融合促進アミノ酸配列が少なくとも一種の核酸結合基へ接合されるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記核酸結合基が少なくとも一種のポリアミンまたはペプチド核酸を含んでなるものである、請求項29に記載の複合体。
- 前記核酸結合基が、少なくとも一つのスペルミン部分を含んでなるポリアミンである、請求項30に記載の複合体。
- クロロキン、リソソーム指向性化合物、またはそれらの組合せを更に含んでなる、請求項8に記載の複合体。
- 核酸、タンパク質またはペプチド、トランスフェクション剤、および融合剤を含んでなる複合体と、細胞とを接触させ(ここで、前記融合剤は非エンベロープウイルスの融合タンパク質から誘導される融合促進アミノ酸配列を含んでなる)、それにより核酸、タンパク質、またはペプチドを細胞中へ導入することを含んでなる、核酸、タンパク質、またはペプチドを細胞中へ導入するための方法。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞が動物細胞である、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞が線維芽細胞である、請求項33に記載の方法。
- 前記細胞が初代細胞である、請求項33に記載の方法。
- 前記トランスフェクション剤が同一もしくは異なるペプチドまたはタンパク質のマルチマーを含んでなるものである、請求項1に記載の複合体。
- 融合誘導剤、核局在配列、輸送ペプチド、レセプター‐リガンド、および細胞接着ペプチドからなる群より選択される二種のトランスフェクション剤を含んでなる、請求項1に記載の複合体。
- 請求項1に記載の複合体と、製剤担体とを含んでなる、医薬組成物。
- 核酸、タンパク質、またはペプチド、および融合剤を含んでなる第一混合物を、トランスフェクション剤を含んでなる第二混合物と接触させることにより、複合体を形成することを更に含んでなる、請求項33に記載の方法。
- 融合剤およびトランスフェクション剤を含んでなる混合物へ核酸、タンパク質、またはペプチドを加えることにより、複合体を形成することを更に含んでなる、請求項33に記載の方法。
- 請求項2〜39のいずれか一項に記載の複合体および核酸、タンパク質、またはペプチドと、細胞とを接触させることを含んでなる、細胞を核酸、タンパク質、またはペプチドによりトランスフェクトする方法。
- 前記アミノ酸配列がレオウイルスから誘導されるものである、請求項33に記載の方法。
- 前記レオウイルスが、トリレオウイルス、Nelson Bayレオウイルス、またはPulauレオウイルスからなる群より選択されるものである、請求項44に記載の方法。
- 核酸結合部分と、レオウイルスの融合促進アミノ酸配列から誘導されるペプチドもしくはタンパク質または修飾ペプチドもしくは修飾タンパク質とを含んでなる、キット。
- カチオン性脂質トランスフェクション剤を更に含んでなる、請求項46に記載のキット。
- カチオン性脂質トランスフェクション剤が、“LIPOFECTAMINE”、“LIPOFECTIN”、“LIPOFECTACE”、“CELLFECTIN”、“MULTIFECTOR”、“TRANSFECTIN”、Tfx‐10、Tfx‐20、Tfx‐50、SilentFect、GenePorter、Transfectam、DharmaFect 1、DharmaFect 2、DharmaFect 3、DharmaFect 4、Oligofectamine、Effectene、およびLIPOFECTAMINE2000からなる群より選択されるものである、請求項47に記載のキット。
- ポリカチオン性ポリマートランスフェクション剤を更に含んでなる、請求項48に記載のキット。
- 前記キットが、診断用核酸を更に含んでなる診断キットである、請求項49に記載のキット。
- 前記キットが、トランスフェクション剤と、ペプチド、タンパク質、修飾ペプチド、または修飾タンパク質との混合物を含む容器を含んでなるものである、請求項91に記載のキット。
- トランスフェクション剤と、ペプチド、タンパク質、修飾ペプチド、または修飾タンパク質とが別々の容器に存在する、請求項91に記載のキット。
- 非エンベロープウイルスから誘導される融合誘導ペプチドを含んでなる、長さ20〜50アミノ酸のペプチド。
- 前記核酸結合部分がポリカチオン性ペプチドである、請求項53に記載のペプチド。
- 前記核酸結合部分がリンカーを介して融合ペプチドへ連結されるものである、請求項54に記載のペプチド。
- 前記リンカーがペプチド配列である、請求項55に記載のペプチド。
- 前記ポリカチオン性ペプチドが融合誘導ペプチドへ直接連結されるものである、請求項54に記載のペプチド。
- 前記核酸結合部分がポリアミン、ペプチド核酸、またはスペルミンである、請求項53に記載のペプチド。
- 前記ペプチドが:
MLRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MPRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MSGDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
MSSDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
MGQRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、および
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
からなる群より選択される配列の5〜30連続アミノ酸を含んでなる、請求項53〜58のいずれか一項に記載の融合誘導ペプチド。 - 前記ペプチドが、8〜30リシン残基へ共有結合された:
RMPPGSCNGATAVFGNVH、
RMPPGSCNGATAIFGNVH、
GDCAGLVSVFGSVH、
SDCAKIVSVFGSVH、
SGPSNFVNHAPGEAIVT、
QRHSIVQPPAPPPNAFVEIVS、および
SGPSNFVNHAPGEAIVT
からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸を含んでなる、請求項59に記載のペプチド。 - 請求項40に記載の医薬組成物を対象者へ投与することを含んでなる、対象者における疾患を治療する方法。
- 前記ペプチドもしくはタンパク質または修飾ペプチドもしくは修飾タンパク質がレオウイルスからの融合誘導ペプチドである、請求項46に記載のキット。
- 前記ペプチドもしくはタンパク質または修飾ペプチドもしくは修飾タンパク質が、トリレオウイルス、Nelson Bayレオウイルス、またはPulauレオウイルスからの融合誘導ペプチドである、請求項46に記載のキット。
- 前記キットがトランスフェクション促進剤を更に含んでなるものである、請求項46に記載のキット。
- 前記トランスフェクション促進剤がトランスフェクション促進ペプチドである、請求項64に記載のキット。
- 前記キットが、核局在配列を含むペプチドを更に含んでなるものである、請求項64に記載のキット。
- 前記核局在配列が、ペプチドまたはタンパク質あるいは修飾ペプチドまたは修飾タンパク質においてみられるものである、請求項66に記載のキット。
- 前記キットが、核局在配列を含むトランスフェクション促進剤を更に含んでなるものである、請求項66に記載のキット。
- 前記融合促進アミノ酸配列が脂肪酸へ結合されていないものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記複合体が核酸分子を更に含んでなるものである、請求項1に記載の複合体。
- 前記融合促進アミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸が、レオウイルスFASTタンパク質の疎水性領域の少なくとも10アミノ酸と少なくとも80%同一である、請求項2に記載の複合体。
- 前記融合促進アミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸が、レオウイルスFASTタンパク質の疎水性領域の少なくとも10アミノ酸と少なくとも90%同一である、請求項2に記載の複合体。
- 前記融合促進アミノ酸配列の少なくとも10アミノ酸の連続ストレッチが、レオウイルスFASTタンパク質の疎水性領域の少なくとも10アミノ酸と同一である、請求項2に記載の複合体。
- 前記核酸結合部分がポリカチオン性アミノ酸配列を含んでなるものである、請求項4に記載の複合体。
- 前記細胞が初代細胞培養物、継代細胞培養物、または細胞系からのものである、請求項33に記載の方法。
- 核酸が細胞中へ導入される、請求項33に記載の方法。
- 細胞中へ導入される核酸がベクターである、請求項76に記載の方法。
- 細胞中へ導入されるベクターが発現ベクターである、請求項77に記載の方法。
- 発現ベクターによりコードされるタンパク質を発現することを更に含んでなる、請求項78に記載の方法。
- 発現されるタンパク質が抗体である、請求項79に記載の方法。
- 接触される細胞が懸濁細胞である、請求項79に記載の方法。
- タンパク質がリポータータンパク質である、請求項79に記載の方法。
- 核酸、タンパク質、またはペプチドと、トランスフェクション剤とを含んでなる第一混合物を、融合剤を含んでなる第二混合物と接触させることにより、複合体を形成することを更に含んでなる、請求項33に記載の方法。
- 前記トランスフェクション剤がカチオン性脂質を含んでなる、請求項33に記載の方法。
- 前記トランスフェクション剤が中性脂質を更に含んでなる、請求項83に記載の方法。
- 細胞を接触させる前に、トランスフェクション剤を脂質集合体へ形成することを更に含んでなる、請求項84に記載の方法。
- 前記融合促進アミノ酸配列が、長さ20〜50アミノ酸である融合誘導ペプチドである、請求項33に記載の方法。
- 前記融合促進アミノ酸配列が、トリレオウイルス、Nelson Bayレオウイルス、またはPulauレオウイルスのFASTタンパク質の疎水性領域の少なくとも10連続アミノ酸と少なくとも80%同一である、少なくとも10アミノ酸の連続ストレッチを含んでなる、請求項87に記載の方法。
- 前記融合促進アミノ酸配列が、トリレオウイルスFASTタンパク質の疎水性領域の少なくとも10連続アミノ酸と少なくとも80%同一であり、少なくとも10アミノ酸の連続ストレッチを含んでなる、請求項87に記載の方法。
- 核酸、タンパク質、またはペプチドを細胞中へ導入するために、前記細胞が少なくとも15分間にわたり複合体と接触される、請求項33に記載の方法。
- トランスフェクション剤を更に含んでなる、請求項46に記載のキット。
- 細胞を含む容器を更に含んでなる、請求項46に記載のキット。
- 前記細胞が懸濁細胞である、請求項92に記載のキット。
- ベクターを更に含んでなる、請求項46に記載のキット。
- 前記ベクターが、プロモーターを含んでなる発現ベクターである、請求項94に記載のキット。
- 前記発現ベクターが、プロモーターへ機能的に連結された、リポータータンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項95に記載のキット。
- 細胞培地を含む容器を更に含んでなる、請求項46に記載のキット。
- トランスフェクション促進剤を更に含んでなる、請求項91に記載のキット。
- 前記トランスフェクション促進剤が、核酸結合剤を含んでなる剤である、請求項98に記載のキット。
- 前記トランスフェクション促進剤が、核局在配列を含むペプチドを含んでなる、請求項98に記載のキット。
- 前記ペプチドもしくはタンパク質または修飾ペプチドもしくはタンパク質が、長さ20〜50アミノ酸である融合誘導ペプチドである、請求項46に記載のキット。
- 前記融合誘導ペプチドが、トリレオウイルス、Nelson Bayレオウイルス、またはPulauレオウイルスのFASTタンパク質の疎水性領域の少なくとも10連続アミノ酸と少なくとも80%同一であり、少なくとも10アミノ酸の連続ストレッチを含んでなるものである、請求項101に記載のキット。
- 前記融合誘導ペプチドが、トリレオウイルスFASTタンパク質の疎水性領域の少なくとも10連続アミノ酸と少なくとも80%同一であり、少なくとも10アミノ酸の連続ストレッチを含んでなるものである、請求項101に記載のキット。
- 前記核酸結合部分が融合誘導ペプチドへ機能的に連結されるものである、請求項101に記載のキット。
- 前記核酸結合部分が融合誘導ペプチドへ共有結合されるものである、請求項101に記載のキット。
- 前記核酸結合部分が、塩基性アミノ酸を含んでなるペプチドである、請求項105に記載のキット。
- 前記核酸結合部分が8〜30リシン残基を含んでなるものである、請求項105に記載のキット。
- 前記ペプチドが:
MLRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MPRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MSGDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
MSSDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
MGQRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、および
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
からなる群より選択される配列の5〜30連続アミノ酸を含んでなるものである、請求項103に記載のキット。 - 前記ペプチドが、8〜30リシン残基へ共有結合された:
RMPPGSCNGATAVFGNVH、
RMPPGSCNGATAIFGNVH、
GDCAGLVSVFGSVH、
SDCAKIVSVFGSVH、
SGPSNFVNHAPGEAIVT、
QRHSIVQPPAPPPNAFVEIVS、
、および
SGPSNFVNHAPGEAIVT
からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸を含んでなるものである、請求項103に記載のキット。 - 前記ペプチドが核酸結合部分へ共有結合されたものである、請求項53に記載のペプチド。
- 前記核酸結合部分が8〜30リシン残基を含んでなるものである、請求項53に記載のペプチド。
- 前記カチオン性脂質が下記式を有する:
X5およびX6は、独立して、(CH2)1‐6であり、
W1およびW2は、独立して、水素、‐OH、‐O‐(C1‐C18)アルキル、‐O‐(C1‐C18)アルケニル、‐O‐(C1‐C18)アルキニル、‐NH2、‐NH(CH2)sCH3、‐N((CH2)sCH3)、‐SH、および‐NH‐NH2からなる群より選択され、
R3および(R6)qは、独立して、N、NH、CH、N(CH2)sCH3、(CH)n、(COH)n、CON‐からなる群より選択され、q=0〜1であり、
R4およびR5は、独立して、(CH2)n、(CH2‐CHOH‐CH2)n、(CHOH)n、HNCO、CONH、CO、‐O‐、‐S‐、‐S‐S‐、ポリアミド、およびエステル結合鎖からなる群より選択され、
L1およびL2は、独立して、‐NH‐、‐O‐、‐NHCO‐、‐CONH‐、‐OCO‐、‐COO‐、‐CO‐、‐S‐、‐S‐S‐、‐NHC(O)O‐、‐OC(O)NH‐、‐NHCONH‐、‐NHC(=NH)NH‐、‐NH‐NH‐、‐S(O)‐、および‐SO2‐からなる群より選択され、
Yは、少なくとも一つのアミンまたはアミド部分を含有するヘテロ環式部分であり、Yの結合点は炭素および/またはへテロ原子であり、
R1およびR2は、独立して、水素、一級アルキルアミン、二級アルキルアミン、三級アルキルアミン、四級アルキルアミン、アルケニルアミン、二級アルケニルアミン、三級アルケニルアミン、四級アルケニルアミン、アルキニルアミン、二級アルキニルアミン、三級アルキニルアミン、四級アルキニルアミン、アミノアルコール、アルキルポリアミン、アルケニルポリアミン、アルキニルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、アミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質からなる群より選択され、
Z1およびZ2は、独立して、直鎖アルキル、分岐アルキル、シクロアルキル、直鎖アルケニル、分岐アルケニル、シクロアルケニル、直鎖アルキニル、および分岐アルキニルからなる群より選択され、
m、n、p、およびsは、独立して、0〜6であるが、但しm、n、およびpがすべて0である場合、Yは削除され、R3がX2へ直接結合される、請求項16に記載の複合体。 - 前記カチオン性脂質が下記式を有する:
X5およびX6は、独立して、(CH2)1‐6であり、
W1およびW2は、独立して、水素、‐OH、‐O‐(C1‐C18)アルキル、‐O‐(C1‐C18)アルケニル、‐O‐(C1‐C18)アルキニル、‐NH2、‐NH(CH2)sCH3、‐N((CH2)sCH3)、‐SH、および‐NH‐NH2からなる群より選択され、
R3および(R6)qは、独立して、N、NH、CH、N(CH2)sCH3、(CH)n、(COH)n、CON‐からなる群より選択され、q=0〜1であり、
R4およびR5は、独立して、(CH2)n、(CH2‐CHOH‐CH2)n、(CHOH)n、HNCO、CONH、CO、‐O‐、‐S‐、‐S‐S‐、ポリアミド、およびエステル結合鎖からなる群より選択され、
L1およびL2は、独立して、‐NH‐、‐O‐、‐NHCO‐、‐CONH‐、‐OCO‐、‐COO‐、‐CO‐、‐S‐、‐S‐S‐、‐NHC(O)O‐、‐OC(O)NH‐、‐NHCONH‐、‐NHC(=NH)NH‐、‐NH‐NH‐、‐S(O)‐、および‐SO2‐からなる群より選択され、
Yは、少なくとも一つのアミンまたはアミド部分を含有するヘテロ環式部分であり、Yの結合点は炭素および/またはへテロ原子であり、
R1およびR2は、独立して、水素、一級アルキルアミン、二級アルキルアミン、三級アルキルアミン、四級アルキルアミン、アルケニルアミン、二級アルケニルアミン、三級アルケニルアミン、四級アルケニルアミン、アルキニルアミン、二級アルキニルアミン、三級アルキニルアミン、四級アルキニルアミン、アミノアルコール、アルキルポリアミン、アルケニルポリアミン、アルキニルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、アミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質からなる群より選択され、
Z1およびZ2は、独立して、直鎖アルキル、分岐アルキル、シクロアルキル、直鎖アルケニル、分岐アルケニル、シクロアルケニル、直鎖アルキニル、および分岐アルキニルからなる群より選択され、
m、n、p、およびsは、独立して、0〜6であるが、但しm、n、およびpがすべて0である場合、Yは削除され、R3がX2へ直接結合される、請求項46に記載のキット。 - 前記カチオン性脂質が下記式を有する:
X5およびX6は、独立して、(CH2)1‐6であり、
W1およびW2は、独立して、水素、‐OH、‐O‐(C1‐C18)アルキル、‐O‐(C1‐C18)アルケニル、‐O‐(C1‐C18)アルキニル、‐NH2、‐NH(CH2)sCH3、‐N((CH2)sCH3)、‐SH、および‐NH‐NH2からなる群より選択され、
R3および(R6)qは、独立して、N、NH、CH、N(CH2)sCH3、(CH)n、(COH)n、CON‐からなる群より選択され、q=0〜1であり、
R4およびR5は、独立して、(CH2)n、(CH2‐CHOH‐CH2)n、(CHOH)n、HNCO、CONH、CO、‐O‐、‐S‐、‐S‐S‐、ポリアミド、およびエステル結合鎖からなる群より選択され、
L1およびL2は、独立して、‐NH‐、‐O‐、‐NHCO‐、‐CONH‐、‐OCO‐、‐COO‐、‐CO‐、‐S‐、‐S‐S‐、‐NHC(O)O‐、‐OC(O)NH‐、‐NHCONH‐、‐NHC(=NH)NH‐、‐NH‐NH‐、‐S(O)‐、および‐SO2‐からなる群より選択され、
Yは、少なくとも一つのアミンまたはアミド部分を含有するヘテロ環式部分であり、Yの結合点は炭素および/またはへテロ原子であり、
R1およびR2は、独立して、水素、一級アルキルアミン、二級アルキルアミン、三級アルキルアミン、四級アルキルアミン、アルケニルアミン、二級アルケニルアミン、三級アルケニルアミン、四級アルケニルアミン、アルキニルアミン、二級アルキニルアミン、三級アルキニルアミン、四級アルキニルアミン、アミノアルコール、アルキルポリアミン、アルケニルポリアミン、アルキニルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、アミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質からなる群より選択され、
Z1およびZ2は、独立して、直鎖アルキル、分岐アルキル、シクロアルキル、直鎖アルケニル、分岐アルケニル、シクロアルケニル、直鎖アルキニル、および分岐アルキニルからなる群より選択され、
m、n、p、およびsは、独立して、0〜6であるが、但しm、n、およびpがすべて0である場合、Yは削除され、R3がX2へ直接結合される、請求項84に記載の方法。 - 下記式を有する脂質:
X5およびX6は独立して(CH2)1‐6であり、
W1およびW2は、独立して、水素、‐OH、‐O‐(C1‐C18)アルキル、‐O‐(C1‐C18)アルケニル、‐O‐(C1‐C18)アルキニル、‐NH2、‐NH(CH2)sCH3、‐N((CH2)sCH3)、‐SH、および‐NH‐NH2からなる群より選択され、
R3および(R6)qは、独立して、N、NH、CH、N(CH2)sCH3、(CH)n、(COH)n、CON‐からなる群より選択され、q=0〜1であり、
R4およびR5は、独立して、(CH2)n、(CH2‐CHOH‐CH2)n、(CHOH)n、HNCO、CONH、CO、‐O‐、‐S‐、‐S‐S‐、ポリアミド、およびエステル結合鎖からなる群より選択され、
L1およびL2は、独立して、‐NH‐、‐O‐、‐NHCO‐、‐CONH‐、‐OCO‐、‐COO‐、‐CO‐、‐S‐、‐S‐S‐、‐NHC(O)O‐、‐OC(O)NH‐、‐NHCONH‐、‐NHC(=NH)NH‐、‐NH‐NH‐、‐S(O)‐、および‐SO2‐からなる群より選択され、
Yは、少なくとも一つのアミンまたはアミド部分を含有するヘテロ環式部分であり、Yの結合点は炭素および/またはへテロ原子であり、
R1およびR2は、独立して、水素、一級アルキルアミン、二級アルキルアミン、三級アルキルアミン、四級アルキルアミン、アルケニルアミン、二級アルケニルアミン、三級アルケニルアミン、四級アルケニルアミン、アルキニルアミン、二級アルキニルアミン、三級アルキニルアミン、四級アルキニルアミン、アミノアルコール、アルキルポリアミン、アルケニルポリアミン、アルキニルポリアミン、スペルミジン、スペルミン、カルボキシスペルミン、グアニジニウム、ピリジニウム、ピロリジニウム、ピペリジニウム、ピペラジニウム、アミノアシル、ペプチジル、およびタンパク質からなる群より選択され、
Z1およびZ2は、独立して、直鎖アルキル、分岐アルキル、シクロアルキル、直鎖アルケニル、分岐アルケニル、シクロアルケニル、直鎖アルキニル、および分岐アルキニルからなる群より選択され、
m、n、p、およびsは、独立して、0〜6であるが、但しm、n、およびpがすべて0である場合、Yは削除され、R3がX2へ直接結合される。 - L1およびL2が、独立して、‐NH‐、‐O‐、‐NHCO‐、‐CONH‐、‐NHC(O)O‐、‐OC(O)NH‐、‐NHCONH‐、‐NHC(=NH)NH‐、‐S(O)‐、および‐SO2‐からなる群より選択されるものである、請求項115に記載の脂質。
- L1およびL2が、独立して、‐NH‐、‐NHCO‐、‐CONH‐、‐NHC(O)O‐、および‐OC(O)NH‐からなる群より選択されるものである、請求項116に記載の脂質。
- X3およびX4がNであり、n1およびn2が独立して1〜10である、請求項115〜119のいずれか一項に記載の脂質。
- n1およびn2が各々2である、請求項120に記載の脂質。
- 請求項115〜121のいずれか一項に記載の脂質と、中性、正荷電、または負荷電である補助脂質とを含んでなる、組成物。
- 前記補助脂質がDOPEまたはコレステロールである、請求項122に記載の組成物。
- 高分子を更に含んでなる、請求項122または123に記載の組成物。
- 前記高分子が核酸である、請求項124に記載の組成物。
- 前記核酸がDNA分子を含んでなる、請求項125に記載の組成物。
- 前記DNA分子が二本鎖DNA分子である、請求項126に記載の組成物。
- 前記DNA分子がプラスミドである、請求項127に記載の組成物。
- 前記プラスミドが、自己相補性でありかつ二本鎖RNAの領域を形成する、RNA分子をコードするものである、請求項128に記載の組成物。
- 前記核酸がRNA分子を含んでなるものである、請求項125に記載の組成物。
- 前記RNA分子が二本鎖RNA分子である、請求項130に記載の組成物。
- 前記RNA分子がsiRNAである、請求項131に記載の組成物。
- 真核細胞を更に含んでなる、請求項122〜132のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記細胞が哺乳類細胞である、請求項133に記載の組成物。
- 真核細胞を請求項124〜133のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含んでなる、高分子を細胞中へ導入する方法。
- 請求項115〜134のいずれか一項に記載の脂質または組成物と、ペプチドまたはタンパク質とを含んでなる、組成物。
- 前記ペプチドもしくはタンパク質が、核もしくは他の細胞内局在、輸送もしくは移送により機能するトランスフェクション促進ペプチドまたはタンパク質であり、細胞接着シグナル、細胞標的化シグナル、細胞インターナリゼーションシグナル、またはエンドサイトーシスシグナルおよびそれらの組合せを含んでなるレセプターリガンドである、請求項136に記載の組成物。
- 前記ペプチドまたはタンパク質が、エンベロープおよび非エンベロープウイルス、細菌、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、線維芽細胞成長因子、細胞標的化抗体、ラクトフェリン、フィブロネクチン、アデノウイルスペントンベース、Knob、ヘキソンタンパク質、水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質、セムリキ森林ウイルスコアタンパク質、インフルエンザ赤血球凝集素、肝炎Bコアタンパク質、HIV Tatタンパク質、単純ヘルペスウイルスVP22タンパク質、レオウイルス融合タンパク質、ヒストンタンパク質、アルギニンリッチ細胞透過性タンパク質、高移動性群タンパク質、インベーシンタンパク質、インターナリンタンパク質、内毒素、ジフテリア毒素、赤痢菌毒素、メリチン、マガイニン、グラミシジン、セクロピン、デフェンシン、プロテグリン、タキプレシン、チオニン、インドリシジン、バクテネシン、ドロソマイシン、アピダエシン、カテリシジン、アダプチンタンパク質、殺菌性透過性促進タンパク質、ナイシン、ブホリン、またはそれらの断片から誘導されるペプチドおよびタンパク質からなる群より選択されるものである、請求項136に記載の組成物。
- 請求項136〜138のいずれか一項に記載の組成物および高分子。
- 前記高分子が核酸である、請求項139に記載の組成物。
- 前記核酸がDNA分子を含んでなるものである、請求項140に記載の組成物。
- 前記DNA分子が二本鎖DNA分子である、請求項141に記載の組成物。
- 前記DNA分子がプラスミドである、請求項142に記載の組成物。
- 前記プラスミドが、自己相補性でありかつ二本鎖RNAの領域を形成する、RNA分子をコードするものである、請求項143に記載の組成物。
- 前記核酸がRNA分子を含んでなるものである、請求項140に記載の組成物。
- 前記RNA分子が二本鎖RNA分子である、請求項145に記載の組成物。
- 前記RNA分子がsiRNAである、請求項146に記載の組成物。
- 真核細胞を請求項139〜146のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含んでなる、高分子を細胞中へ導入する方法。
- 真核細胞を請求項136に記載の組成物と接触させることを含んでなる、ペプチドまたはタンパク質を細胞中へ導入する方法。
- 前記望ましい分子および脂質を含んでなる組成物または請求項115〜123または請求項136〜138のいずれか一項に記載の組成物と、前記組織とを接触させることを含んでなる、望ましい分子を組織中へ導入する方法。
- 前記望ましい分子が核酸、ペプチド、またはタンパク質である、請求項150に記載の方法。
- 前記補助脂質がカチオン性脂質である、請求項122に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が、LipofectAmine 2000、LipofectAmine、Lipofectin、DMRIE‐C、Fugene、Fugene HD、Transfectam、TRANSFECTIN、SilentFect、Effectene、およびDC‐cholからなる群より選択されるものである、請求項152に記載の組成物。
- 前記ペプチドまたはタンパク質が、核または他の細胞内局在、輸送または移送で機能するトランスフェクション促進ペプチドまたはタンパク質であり、スペルミン、スペルミジン、またはポリリシンで共有結合修飾された細胞接着シグナル、細胞標的化シグナル、細胞インターナリゼーションシグナル、またはエンドサイトーシスシグナルおよびそれらの組合せを含んでなるレセプターリガンドである、請求項136に記載の組成物。
- 前記カチオン性脂質が1,4‐ビス〔(3‐(3‐アミノプロピル)アルキルアミノ)プロピル〕ピペラジン脂質である、請求項155に記載の複合体。
- 前記融合促進アミノ酸配列が:
MLRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MPRMPPGSCNGATAVFGNVHCQAAQNTAGGDLQATSSIIA、
MSGDCAGLVSVFGSVHCQSSKNKAGGDLQATSILTTYWPH、
MSSDCAKIVSVFGSVHCQSSKNSAGGDLQATSVFTTYWPH、
MGQRHSIVQPPAPPPNAFVEIVSSSTGIIIAVGIFAFIFS、および
MGSGPSNFVNHAPGEAIVTGLEKGADKVAGTISHTIWEVI
からなる群より選択される配列の10〜30連続アミノ酸を含んでなるペプチドである、請求項1に記載の複合体。 - 前記ペプチドが、8〜30リシン残基へ共有結合された:
RMPPGSCNGATAVFGNVH、
GDCAGLVSVFGSVH、
SDCAKIVSVFGSVH、
QRHSIVQPPAPPPNAFVEIVS、および
SGPSNFVNHAPGEAIVT
からなる群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも10連続アミノ酸を含んでなる、請求項157に記載の複合体。 - 前記核酸結合部分と、レオウイルスの融合促進アミノ酸配列から誘導されるペプチドもしくはタンパク質または修飾ペプチドもしくは修飾タンパク質とが、同一容器中に存在する、請求項46に記載のキット。
- 前記核酸結合部分、カチオン性脂質トランスフェクション剤、およびレオウイルスの融合促進アミノ酸配列から誘導されるペプチドもしくはタンパク質または修飾ペプチドもしくは修飾タンパク質が、同一容器中に存在するものである、請求項47に記載のキット。
- トランスフェクション促進試薬を更に含んでなる、請求項160に記載のキット。
- 前記核酸結合部分、前記トランスフェクション促進試薬、前記カチオン性脂質トランスフェクション剤、および前記レオウイルスの融合促進アミノ酸配列から誘導されるペプチドもしくはタンパク質または修飾ペプチドもしくは修飾タンパク質が、同一容器中に存在するものである、請求項161に記載のキット。
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US74660406P | 2006-05-05 | 2006-05-05 | |
US60/746,604 | 2006-05-05 | ||
US74685806P | 2006-05-09 | 2006-05-09 | |
US74685406P | 2006-05-09 | 2006-05-09 | |
US60/746,854 | 2006-05-09 | ||
US60/746,858 | 2006-05-09 | ||
PCT/US2006/019356 WO2007130073A2 (en) | 2006-05-05 | 2006-05-17 | Novel reagents for transfection of eukaryotic cells |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012122480A Division JP5683533B2 (ja) | 2006-05-05 | 2012-05-29 | 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009536030A true JP2009536030A (ja) | 2009-10-08 |
JP5364574B2 JP5364574B2 (ja) | 2013-12-11 |
Family
ID=38668190
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2009509534A Active JP5364574B2 (ja) | 2006-05-05 | 2006-05-17 | 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬 |
JP2012122480A Active JP5683533B2 (ja) | 2006-05-05 | 2012-05-29 | 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2012122480A Active JP5683533B2 (ja) | 2006-05-05 | 2012-05-29 | 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP2604255B1 (ja) |
JP (2) | JP5364574B2 (ja) |
AU (1) | AU2006343357A1 (ja) |
CA (2) | CA2651389C (ja) |
NZ (2) | NZ593080A (ja) |
WO (1) | WO2007130073A2 (ja) |
Cited By (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011136368A1 (ja) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
WO2011136369A1 (ja) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
JP2012217388A (ja) * | 2011-04-08 | 2012-11-12 | Bridgestone Corp | 遺伝子導入剤組成物 |
WO2013065825A1 (ja) * | 2011-11-02 | 2013-05-10 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
WO2013094748A1 (ja) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | キリンホールディングス株式会社 | 細胞内に導入するための温度感受性蛍光プローブ |
JP2013539469A (ja) * | 2010-08-26 | 2013-10-24 | ツイ,クンユァン | 巨大環状脂肪族化合物及びその応用 |
KR20160028754A (ko) * | 2014-09-04 | 2016-03-14 | 디오셀 주식회사 | 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도 |
Families Citing this family (46)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NZ711583A (en) * | 2009-05-05 | 2017-03-31 | Arbutus Biopharma Corp | Lipid compositions |
BR122022001262B1 (pt) | 2010-11-15 | 2022-09-27 | Life Technologies Corporation | Compostos de transfecção contendo amina e complexo de transfecção |
EP2643459B1 (en) | 2010-11-24 | 2017-09-27 | Takara Bio USA, Inc. | Inducible expression system transcription modulators comprising a distributed protein transduction domain and methods for using the same |
EP2668276A4 (en) * | 2011-01-26 | 2014-04-23 | Clontech Lab Inc | IMPROVED PROTEIN TRANSDUCTION |
AU2012242455A1 (en) | 2011-04-15 | 2013-11-28 | Molecular Transfer, Inc. | Agents for improved delivery of nucleic acids to eukaryotic cells |
EP2734621B1 (en) | 2011-07-22 | 2019-09-04 | President and Fellows of Harvard College | Evaluation and improvement of nuclease cleavage specificity |
AU2012312654B2 (en) | 2011-09-19 | 2017-04-13 | Gencia Corporation | Modified creatine compounds |
CN103987847B (zh) | 2011-10-18 | 2017-06-16 | 迪克纳制药公司 | 胺阳离子脂质及其用途 |
US9163284B2 (en) | 2013-08-09 | 2015-10-20 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for identifying a target site of a Cas9 nuclease |
US9359599B2 (en) | 2013-08-22 | 2016-06-07 | President And Fellows Of Harvard College | Engineered transcription activator-like effector (TALE) domains and uses thereof |
US9737604B2 (en) | 2013-09-06 | 2017-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Use of cationic lipids to deliver CAS9 |
US9340800B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-05-17 | President And Fellows Of Harvard College | Extended DNA-sensing GRNAS |
US9322037B2 (en) | 2013-09-06 | 2016-04-26 | President And Fellows Of Harvard College | Cas9-FokI fusion proteins and uses thereof |
WO2016070129A1 (en) * | 2014-10-30 | 2016-05-06 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of negatively charged proteins using cationic lipids |
WO2015051071A1 (en) | 2013-10-04 | 2015-04-09 | Academia Sinica | Molecular catalysts capable of catalyzing oxidation of hydrocarbons and method for oxidizing hydrocarbons |
SG10201811729PA (en) | 2013-12-12 | 2019-02-27 | Life Technologies Corp | Membrane-penetrating peptides to enhance transfection and compositions and methods for using same |
US20150165054A1 (en) | 2013-12-12 | 2015-06-18 | President And Fellows Of Harvard College | Methods for correcting caspase-9 point mutations |
US10077453B2 (en) | 2014-07-30 | 2018-09-18 | President And Fellows Of Harvard College | CAS9 proteins including ligand-dependent inteins |
US9816080B2 (en) | 2014-10-31 | 2017-11-14 | President And Fellows Of Harvard College | Delivery of CAS9 via ARRDC1-mediated microvesicles (ARMMs) |
PT3313449T (pt) | 2015-06-24 | 2020-10-30 | Nitto Denko Corp | Compostos ionizáveis e composições e suas utilizações |
EP3322813A1 (en) | 2015-07-13 | 2018-05-23 | Life Technologies Corporation | System and method for improved transient protein expression in cho cells |
CN108136050A (zh) | 2015-08-28 | 2018-06-08 | 分子传递有限公司 | 转染络合物和其使用方法 |
JP7067793B2 (ja) | 2015-10-23 | 2022-05-16 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | 核酸塩基編集因子およびその使用 |
EP3423438A4 (en) * | 2016-03-01 | 2020-05-06 | Molecular Transfer, Inc. | PLANT VIRUS MOTOR PROTEINS AND METHOD FOR USE THEREOF |
JP7231935B2 (ja) | 2016-08-03 | 2023-03-08 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | アデノシン核酸塩基編集因子およびそれらの使用 |
AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
EP3518981A4 (en) | 2016-10-03 | 2020-06-10 | President and Fellows of Harvard College | DELIVERING THERAPEUTIC RNAS VIA ARRDC1-MEDIATED MICROVESICLES |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
CN106811483B (zh) * | 2017-02-16 | 2020-04-07 | 甘肃农业大学 | 一种高效转染真核细胞的方法 |
US11898179B2 (en) | 2017-03-09 | 2024-02-13 | President And Fellows Of Harvard College | Suppression of pain by gene editing |
EP3592777A1 (en) | 2017-03-10 | 2020-01-15 | President and Fellows of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
KR20190130613A (ko) | 2017-03-23 | 2019-11-22 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵산 프로그램가능한 dna 결합 단백질을 포함하는 핵염기 편집제 |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
JP2020534795A (ja) | 2017-07-28 | 2020-12-03 | プレジデント アンド フェローズ オブ ハーバード カレッジ | ファージによって支援される連続的進化(pace)を用いて塩基編集因子を進化させるための方法および組成物 |
WO2019139645A2 (en) | 2017-08-30 | 2019-07-18 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising gam |
WO2019079347A1 (en) | 2017-10-16 | 2019-04-25 | The Broad Institute, Inc. | USES OF BASIC EDITORS ADENOSINE |
ES2964547T3 (es) * | 2018-06-08 | 2024-04-08 | Fujifilm Corp | Compuesto, sal del mismo y partículas lipídicas |
EP3942040A1 (en) | 2019-03-19 | 2022-01-26 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for editing nucleotide sequences |
WO2021226558A1 (en) | 2020-05-08 | 2021-11-11 | The Broad Institute, Inc. | Methods and compositions for simultaneous editing of both strands of a target double-stranded nucleotide sequence |
WO2021255262A1 (en) | 2020-06-19 | 2021-12-23 | Sylentis Sau | siRNA AND COMPOSITIONS FOR PROPHYLACTIC AND THERAPEUTIC TREATMENT OF VIRUS DISEASES |
CN112250884A (zh) * | 2020-08-21 | 2021-01-22 | 江苏省农业科学院 | 一种树枝状聚抗菌肽及其制备方法和应用 |
EP4015634A1 (en) | 2020-12-15 | 2022-06-22 | Sylentis, S.A.U. | Sirna and compositions for prophylactic and therapeutic treatment of virus diseases |
WO2023018990A2 (en) | 2021-08-12 | 2023-02-16 | Life Technologies Corporation | Lipids for nucleic acid delivery |
WO2024031051A1 (en) | 2022-08-05 | 2024-02-08 | Life Technologies Corporation | Lipids for nucleic acid delivery |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002512002A (ja) * | 1997-11-07 | 2002-04-23 | ダルハウジー、ユニバーシティー | 新規なレオウイルス由来タンパク質、このタンパク質をコードする核酸、およびその使用 |
JP2004520019A (ja) * | 2000-12-01 | 2004-07-08 | フソジェニックス、インコーポレーテッド | レオウイルス由来の膜融合タンパク質 |
Family Cites Families (12)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4897355A (en) | 1985-01-07 | 1990-01-30 | Syntex (U.S.A.) Inc. | N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor |
JPS63287752A (ja) * | 1987-05-18 | 1988-11-24 | Kao Corp | N−メチル化第3級アミンの製造方法 |
FR2645866B1 (fr) | 1989-04-17 | 1991-07-05 | Centre Nat Rech Scient | Nouvelles lipopolyamines, leur preparation et leur emploi |
US5264618A (en) | 1990-04-19 | 1993-11-23 | Vical, Inc. | Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules |
US5334761A (en) | 1992-08-28 | 1994-08-02 | Life Technologies, Inc. | Cationic lipids |
JPH06273907A (ja) * | 1993-03-18 | 1994-09-30 | Fuji Photo Film Co Ltd | カラー拡散転写感光材料 |
WO1995014651A1 (en) * | 1993-11-24 | 1995-06-01 | Megabios Corporation | Amphiphilic derivatives of piperazine |
US5527928A (en) | 1994-09-30 | 1996-06-18 | Nantz; Michael H. | Cationic transport reagents |
US5635487A (en) * | 1994-12-29 | 1997-06-03 | Wolff; Jon A. | Amphipathic, micellar delivery systems for biologically active polyions |
US5744335A (en) | 1995-09-19 | 1998-04-28 | Mirus Corporation | Process of transfecting a cell with a polynucleotide mixed with an amphipathic compound and a DNA-binding protein |
AU739998B2 (en) * | 1997-06-12 | 2001-10-25 | Transgene S.A. | Novel lipid complexes for transferring at least one therapeutically active substance, in particular a polynucleotide, into a target cell, and use in gene therapy |
ATE383331T1 (de) | 1998-11-12 | 2008-01-15 | Invitrogen Corp | Transportreagentien |
-
2006
- 2006-05-17 EP EP12008260.7A patent/EP2604255B1/en active Active
- 2006-05-17 NZ NZ593080A patent/NZ593080A/xx not_active IP Right Cessation
- 2006-05-17 EP EP06784437A patent/EP2015780B1/en active Active
- 2006-05-17 JP JP2009509534A patent/JP5364574B2/ja active Active
- 2006-05-17 CA CA2651389A patent/CA2651389C/en active Active
- 2006-05-17 CA CA2960570A patent/CA2960570C/en active Active
- 2006-05-17 WO PCT/US2006/019356 patent/WO2007130073A2/en active Application Filing
- 2006-05-17 NZ NZ572564A patent/NZ572564A/en unknown
- 2006-05-17 AU AU2006343357A patent/AU2006343357A1/en not_active Abandoned
-
2012
- 2012-05-29 JP JP2012122480A patent/JP5683533B2/ja active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002512002A (ja) * | 1997-11-07 | 2002-04-23 | ダルハウジー、ユニバーシティー | 新規なレオウイルス由来タンパク質、このタンパク質をコードする核酸、およびその使用 |
JP2004520019A (ja) * | 2000-12-01 | 2004-07-08 | フソジェニックス、インコーポレーテッド | レオウイルス由来の膜融合タンパク質 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
JPN6011062660; EMBO J. vol.24, no.17, 2005, pp.2980-2988 * |
JPN6011062661; J. Control. Release vol.112, no.2, 20060306, pp.271-279 * |
Cited By (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9408914B2 (en) | 2010-04-28 | 2016-08-09 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Cationic lipid |
WO2011136369A1 (ja) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
WO2011136368A1 (ja) * | 2010-04-28 | 2011-11-03 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
US9920028B2 (en) | 2010-04-28 | 2018-03-20 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Cationic lipid |
US9845306B2 (en) | 2010-04-28 | 2017-12-19 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Cationic lipid |
JP2013539469A (ja) * | 2010-08-26 | 2013-10-24 | ツイ,クンユァン | 巨大環状脂肪族化合物及びその応用 |
JP2012217388A (ja) * | 2011-04-08 | 2012-11-12 | Bridgestone Corp | 遺伝子導入剤組成物 |
WO2013065825A1 (ja) * | 2011-11-02 | 2013-05-10 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
JPWO2013065825A1 (ja) * | 2011-11-02 | 2015-04-02 | 協和発酵キリン株式会社 | カチオン性脂質 |
WO2013094748A1 (ja) * | 2011-12-21 | 2013-06-27 | キリンホールディングス株式会社 | 細胞内に導入するための温度感受性蛍光プローブ |
JP5514368B2 (ja) * | 2011-12-21 | 2014-06-04 | キリンホールディングス株式会社 | 細胞内に導入するための温度感受性蛍光プローブ |
US10191035B2 (en) | 2011-12-21 | 2019-01-29 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Temperature-sensitive fluorescent probe for introduction into cell |
US11199537B2 (en) | 2011-12-21 | 2021-12-14 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Temperature-sensitive fluorescent probe for introduction into cell |
US11649311B2 (en) | 2011-12-21 | 2023-05-16 | Kirin Holdings Kabushiki Kaisha | Temperature-sensitive fluorescent probe for introduction into cell |
KR101695792B1 (ko) | 2014-09-04 | 2017-01-12 | 디오셀 주식회사 | 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도 |
KR20160028754A (ko) * | 2014-09-04 | 2016-03-14 | 디오셀 주식회사 | 신규 세포막 투과 펩티드 및 생리활성 물질 전달체로서의 그의 용도 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CA2960570C (en) | 2018-05-08 |
NZ593080A (en) | 2012-12-21 |
EP2604255A1 (en) | 2013-06-19 |
WO2007130073A2 (en) | 2007-11-15 |
EP2015780B1 (en) | 2012-12-12 |
CA2651389A1 (en) | 2007-11-15 |
JP5364574B2 (ja) | 2013-12-11 |
AU2006343357A1 (en) | 2007-11-15 |
NZ572564A (en) | 2011-10-28 |
JP5683533B2 (ja) | 2015-03-11 |
EP2604255B1 (en) | 2017-10-25 |
EP2015780A4 (en) | 2010-03-10 |
JP2012196220A (ja) | 2012-10-18 |
EP2015780A2 (en) | 2009-01-21 |
WO2007130073A3 (en) | 2009-04-30 |
CA2651389C (en) | 2017-04-25 |
CA2960570A1 (en) | 2007-11-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5683533B2 (ja) | 真核細胞のトランスフェクションのための新規試薬 | |
US8759499B2 (en) | Lipids for transfection of Eukaryotic cells | |
US20200392537A1 (en) | Membrane-penetrating peptides to enhanced transfection and compositions and methods for using same | |
JP4265699B2 (ja) | ペプチドによって増強されるトランスフェクション | |
US8058068B2 (en) | Peptide-enhanced transfections | |
US20190352316A1 (en) | Polycationic methyl phospholipids for improved delivery of nucleic acids to eukaryotic cells | |
EP2696678A1 (en) | Agents for improved delivery of nucleic acids to eukaryotic cells | |
AU2012268867B2 (en) | Novel reagents for transfection of eukaryotic cells | |
US20110200624A1 (en) | Novel peptides for use in transfection |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20111129 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120228 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120306 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120329 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120405 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120501 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120510 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120529 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120921 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20121221 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130104 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130121 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130128 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130221 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130228 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130301 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20130621 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130719 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130809 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130909 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5364574 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |