JP6254045B2 - 細胞内の温度を測定するためのレシオ型蛍光性プローブ - Google Patents
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Description
相互に異なる最大蛍光波長を有する第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットを含んでなり、
感熱性ユニットが、以下の式(a):
R4およびR5は、独立に、水素原子およびC1−20アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、C1−6アルコキシ、およびアリールから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、またはR4およびR5はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、C1−10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい]
で表される1種または2種以上のモノマーに由来する1種または2種以上の繰り返し構造であり、
カチオン性ユニットが、以下の式(b):
Wは、芳香環または−X1−C(=O)−(ここで、Q1に直接結合するのはX1である)であり;
X1は、O、S、またはN−R11であり;
R11は、水素原子、C1−6アルキル、または−Q1−Yであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、およびC1−6アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
Q1は、独立に、C1−20アルキレン、C3−20アルケニレン、またはC3−20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、S、−O−P(=O)(−OH)−O−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Yは、独立に、1以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−N+R21R22R23Xe −、−C(=NR41)−NR42R43、および下式:
Xe −およびXf −はカウンターアニオンであり;
R21、R22、およびR23は、独立に、C1−10アルキル、およびC7−14アラルキルから選択され、またはR21およびR22は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよく;
R24は、C1−10アルキル、またはC7−14アラルキルであり;
R41、R42およびR43は、独立に、水素原子およびC1−10アルキルから選択され、またはR41およびR42は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、2つの窒素原子を含む5〜7員ヘテロ環を形成してもよく、またはR42およびR43は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよい]
で表される1種または2種以上のモノマーに由来する1種または2種以上の繰り返し構造である、温度感受性プローブが提供される。
X2は、O、S、またはN−R12であり;
X3は、直接結合、O、S、SO、SO2、N(−R13)、CON(−R16)、N(−R16)CO、N(−R17)CON(−R18)、SO2N(−R19)またはN(−R19)SO2であり;
Q2は、C1−20アルキレン、C3−20アルケニレン、またはC3−20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、Sまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Arは、6〜18員芳香族炭素環基、または5〜18員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の1以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−CH2−は−C(O)−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、C1−6アルキルカルボニル、C1−6アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−NR6R7、および−SO2NR14R15から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく(ここで前記C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、C1−6アルキルスルホニル、C1−6アルキルカルボニルおよびC1−6アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、C1−6アルキルアミノ、ジ(C1−6アルキル)アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい);
R6およびR7は、独立に、水素原子、C1−10アルキル、アリール、C1−10アルキルカルボニル、アリールカルボニル、C1−10アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、N−(C1−10アルキル)カルバモイル、およびN,N−ジ(C1−10アルキル)カルバモイルから選択され、ここで前記C1−10アルキル、C1−10アルキルカルボニル、C1−10アルキルスルホニル、N−(C1−10アルキル)カルバモイル、およびN,N−ジ(C1−10アルキル)カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、C1−6アルキルアミノ、ジ(C1−6アルキル)アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;または
R6およびR7はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、C1−10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R12は、水素原子、C1−6アルキル、または−Q2−X3−Arであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、およびC1−6アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R13は、水素原子、またはC1−6アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、およびC1−6アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R14およびR15は、独立に、水素原子、およびC1−6アルキルから選択され;またはR14およびR15はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し;
R16、R17、R18およびR19は、独立に、水素原子、およびC1−6アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、およびC1−6アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい]
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造であり、
第二の蛍光性ユニットは、以下の式(d):
R51、R52、R53およびR54は、独立に、水素原子およびC1−6アルキルから選択され;
X4は、直接結合、フェニレン、−Q4−O−C(=O)−(ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはQ4である)、−Q4−N(−R61)−C(=O)−(ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはQ4である)であり;
R61は、水素原子およびC1−6アルキルから選択され;
Q4は、C1−20アルキレン、フェニレン、およびナフチレンから選択され、該フェニレンおよびナフチレンは、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい]
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造とされる。
R4およびR5は、独立に、水素原子およびC1−20アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、C1−6アルコキシ、およびアリールから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、またはR4およびR5はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、C1−10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい]。
[式中、R2は、水素原子およびC1−3アルキルから選択され;
Wは、芳香環または−X1−C(=O)−(ここで、Q1に直接結合するのはX1である)であり;
X1は、O、S、またはN−R11であり;
R11は、水素原子、C1−6アルキル、または−Q1−Yであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、およびC1−6アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
Q1は、独立に、C1−20アルキレン、C3−20アルケニレン、またはC3−20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、S、−O−P(=O)(−OH)−O−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Yは、独立に、1以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−N+R21R22R23Xe −、−C(=NR41)−NR42R43、および下式:
Xe −およびXf −はカウンターアニオンであり;
R21、R22、およびR23は、独立に、C1−10アルキル、およびC7−14アラルキルから選択され、またはR21およびR22は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよく;
R24は、C1−10アルキル、またはC7−14アラルキルであり;
R41、R42およびR43は、独立に、水素原子およびC1−10アルキルから選択され、またはR41およびR42は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、2つの窒素原子を含む5〜7員ヘテロ環を形成してもよく、またはR42およびR43は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよい]。
で表される繰り返し単位を含む共重合体とされる。この共重合体では、aおよびbの和は100であり、bは、好ましくは2〜10とされ、cは、好ましくは0.3〜2とされ、dは、好ましくは0.03〜1とされる。また、この共重合体は、物質そのものとして本発明の一つの側面をなす。
X10は、O、SまたはSeから選択され;
R8は、水素原子、C1−10アルキル、およびアリールから選択され、当該アルキルは、
ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、C1−6アルキルアミノ、ジ(C1−6アルキル)アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリールは、ハロゲン原子、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい。
から選択される基である。
α,α'−アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)はメタノールを用いた再結晶、N−イソプロピルアクリルアミド(NIPAM)はn―ヘキサンを用いた再結晶により精製して用いた。その他の試薬は購入したものをさらに精製することなく使用した。
δ7.61 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.29 (br, 1H), 7.24 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 5.89 (s, 2H), 2.34 (s, 6H), 2.21 (s, 3H), 1.34 (s, 6H)
δ7.05−7.03 (m, 2H), 6.75−6.73 (m, 2H), 5.89 (s, 2H), 3.76 (br, 2H), 2.34 (s, 6H), 1.42 (s, 6H)
δ7.02−7.00 (m, 2H), 6.79−6.77 (m, 2H), 5.97 ( 2H), 3.83 (br, 2H), 2.55 (s, 6H), 1.50 (s, 6H).
δ155.0, 147.0, 143.2, 142.6, 132.0, 129.0, 124.7, 120.9, 115.4, 14.6, 14.5.
δ7.88−7.86 (m, 2H), 7.31−7.29 (m, 2H), 6.51−6.37 (m, 2H), 6.07 (s, 2H), 5.81 (dd, 1H, J = 2.4, 9.6 Hz), 2.49 (s, 6H), 1.48 (s, 6H).
δ7.69 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 7.31 (br, 1H), 7.22 (d, 2H, 8.2 Hz), 5.98 (s, 2H), 2.55 (s, 6H), 1.43 (s, 6H), 1.29 (d, 6H, J = 6.8 Hz), 1.25 (br, 1H).
δ175.3, 155.5, 143.1, 141.3, 138.9, 131.6, 130.5, 128.8, 121.2, 119.9, 36.9, 19.6, 14.64, 14.56.
実施例1−2で合成したBODIPY−IAをそれぞれアセトニトリル、メタノール、ヘキサン、酢酸エチルおよび水75v/v%ジオキサン25v/v%に10μMになるように溶かし、積分球ユニットILF835を付設した蛍光光度計FP8500(日本分光)を用いて、絶対蛍光量子収率を算出した。励起波長は470nmを選択した。試料がない状態での入射光面積S0と試料散乱光面積S1、蛍光波長のピーク面積S2を算出し、
量子収率=S2/(S0−S1)×100
の式を用いて算出を行った結果を表1に示す。
ベンゼンにN−n−プロピルアミンとトリエチルアミン(1.2eq)を加え、氷浴中で、攪拌子を用いてよく攪拌した後に、アクリル酸クロリド(1.2eq)を10分おきに3回に分けて添加し、室温に戻した。反応液を濾過し、0.1Nの塩酸で分液を行い、上層のベンゼン画分を抽出、無水硫酸ナトリウムを添加した後に、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒としてジクロロメタン−メタノール=50:1を使用)にて1回目の精製を行った。目的化合物を含んだ画分を再度集め、減圧乾固し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(展開溶媒として酢酸エチル−ヘキサン=1:2を使用)にて2回目の精製を行い、表題の化合物を無色透明液体として得た。
合成は、文献A(Chemistry A European Journal 2012年, 第18巻,第9552 − 9563頁)に記載の方法に従って行った。3−クロロ−1,2−フェニレンジアミンをトルエンに溶解し、N−チオニルアニリンを加えた。130℃で3時間加熱環流したのち、減圧乾固し、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製をして、4−クロロ−2,1,3−ベンゾチアジアゾールを得た。これを0℃にて濃硫酸に溶解し、0℃で1時間半攪拌した後、150℃に加熱し2時間半攪拌した。反応終了後、反応溶液を氷水に注ぎ、ジクロロメタンを用いて抽出した。有機層をNa2SO4により乾燥した後、減圧乾固し、シリカゲルクロマトグラフィーによる精製をして、7−クロロ−2,1,3−ベンゾチアジアゾール4−スルホニルクロリドを得た。
NNPAM(543mg、4.8mmol)、(3−アクリルアミドプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド(55.1mg、0.2mmol、以下「APTMAクロリド」とも称する)、DBThD−AA(9.59mg、25μmol)、BODIPY−AA(1.97mg、5μmol)、AIBN(8.21mg、50μmol)をDMF(10ml)に溶解し、30分間アルゴンガスを通じることにより溶存酸素を除去した。その後、60℃にて4時間反応させ、室温に冷やした。この溶液を、ジエチルエーテル(300ml)に攪拌しながら注いだ。得られた結晶を濾取し、減圧乾燥させた後、さらにMeOH(1mL)に溶かして再沈殿を行った後、純水に溶かし、直径28.6mmのヴィスキングチューブ(透析用セルロースチューブ)を使用し、透析外液を1000mlとして、充分に透析を行い、精製を行った。精製品を凍結乾燥し、表題の共重合体を淡黄色粉末(254.4mg、42%)として得た。
実施例4で用いた感温性ユニットであるNNPAMよりも各々高い温度、低い温度で構造変化を起こすNIPAM、N−tert―ブチルアクリルアミド(NTBAM)を用いて共重合体の合成を行った。合成した化合物のリストを表2に示す。合成は、実施例4と同様の手法で行い、淡黄色粉末を得た。
実施例4で用いたカチオン性ユニットであるAPTMAをより多い比率で用いた共重合体を製造した。また4級アンモニウム塩であるカチオン性ユニットとしてAPTMAの代わりにVBTMAを用いた共重合体を合成した。合成した化合物のリストを表3に示す。合成は、実施例4と同様の手法で行い、淡黄色粉末を得た。
実施例4で合成した共重合体の2つの蛍光性ユニット比を変化させた共重合体を合成した。合成した化合物のリストを表4に示す。合成は、実施例4と同様の手法で行い、淡黄色粉末を得た。
化合物1〜8の150mM KCl中での感熱応答性試験を以下の手順で行った。JASCO FP−6500分光蛍光光度計を使用し、溶媒として、Millipore社のMilli−Q reagent systemから得た超純水を用いて、和光純薬より購入したKClを150mMの濃度になるように溶かしたものを用いた。当実験における化合物の初期濃度は0.01w/v%とし、励起波長は458nmとした。溶液の温度制御にはJASCO ETC−273T水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を1℃あるいは2℃刻みで上昇させ、各温度における450〜850nmの蛍光スペクトルを測定した。
化合物1の感熱応答性におけるKCl濃度依存性を以下の手順で試験し、調査した。実験手法は実施例8と同様であり、当実験における化合物1の初期濃度は0.005w/v%とし、KCl濃度は125mM、150mM、175mMとなるように溶媒を調製した。
化合物1の感熱応答性におけるpH依存性を以下の手順で試験し、調査した。溶媒として150mM KClを用いて、塩酸でpHを6に、水酸化カリウムでpHを9に調整した。実験手法は実施例8と同様である。当実験における化合物1の初期濃度は0.005w/v%とした。
MOLT−4 (ヒト急性リンパ芽球性白血病(T−細胞))をRPMI1640培地(10%FBS)、100mmディッシュにて培養した(播種1×104cells/ml)。2日後、培養液3mlを遠心(300g、2分)し、培地を取り除き、5%グルコースで洗浄後、再度5%グルコース1mlで懸濁し、化合物1−9をそれぞれ終濃度0.05%となるように添加した。25℃、10分後、遠心(300g、2分)し、上清を取り除き、PBSで洗浄後、PBSに懸濁し、プローブが導入されているかの確認を顕微鏡観察にて行った。共焦点レーザー顕微鏡(FV1000、Olympus)、40倍対物レンズ(UplanSApo,Olympus)を用いて観察し、細胞に473nmのレーザー(Multi Arレーザー)を当て、500nmから600nmまでの蛍光波長に対する蛍光像を観察した。
実施例11のようにして、MOLT−4へ化合物1の導入を行い、PBSに懸濁した状態でキュベットに入れ、さらにキュベット内に2mm直径の球状の攪拌子を入れた。キュベットをJASCO FP−6500分光蛍光光度計にセットし、約800rpmの速度で回転させ、細胞が沈むのを防ぎながら、蛍光スペクトルを測定した。励起波長は458nmとした。溶液の温度制御にはJASCO ETC−273T水冷ペルチェ式恒温セルホルダを使用し、付属の熱電対により温度を測定した。溶液温度を2℃刻みで上昇させ、細胞内部の温度と外部の温度を一定にするよう温度上昇後2分静置し、各温度における蛍光強度を測定した。
実施例8の結果のように、温度(T)を横軸に蛍光強度比(R)を縦軸に取った場合を想定する。∂を微小量、δを誤差とした場合、次のような関係が成り立つ。
既知の公報(国際公開第2013/094748号)に記載の化合物9(以下「前化合物9」という)は、細胞内で感度よく応答する温度領域が35℃付近を中心として±5℃の範囲であり、感度良く細胞内温度計測ができることがわかっていた。培養したMOLT−4 を5%グルコースで洗浄後、再度5%グルコース1mlで懸濁し、前化合物9を終濃度0.05%となるように添加した。25℃、10分後、遠心(300g、2分)し、上清を取り除き、PBSで洗浄後、PBSに懸濁して、実施例12のようにして、各温度(25〜40℃、1℃刻み)における蛍光スペクトルを測定した。
ヒト由来胎児腎細胞HEK293TをDMEM培地(5%FBS,1%penicillin−streptomycin)、35mmガラスボトムディッシュにて培養した(播種1×103cells/cm2)。1日後、培地を5%グルコースに置換し、化合物1を終濃度0.05%となるように添加し、25℃で10分静置した。その後、プローブを取り除き、PBSで洗浄後、phenolred−freeのDMEM培地に置換し、37℃に保った状態で顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡(FV1000、Olympus)、60倍油浸対物レンズ(UplanSApo N.A.1.40,Olympus)を用いて観察した。細胞に473nmのレーザー(Multi Arレーザー)に照射し、490〜530nmの蛍光画像(P1)と560〜610nmの蛍光画像(P2)を取得した。なおP1、P2はバックグラウンドとして細胞のないある領域の蛍光強度を差し引く画像処理を行った。
実施例14のようにして、HEK293T細胞に化合物1を導入し、DMEM培地に置換し、27℃、32℃、37℃に保った状態でそれぞれの温度で顕微鏡観察を行った。顕微鏡観察は、共焦点レーザー顕微鏡(FV1000、Olympus)、60倍油浸対物レンズ(UplanSApo N.A.1.40,Olympus)を用いて観察した。励起は473nmのレーザー(Multi Arレーザー)で行い、80/20リフレクターを介して、510〜520nmの蛍光画像(P1)と580〜590nmの蛍光画像(P2)を取得した。
実施例11のようにして、MOLT−4細胞に化合物1を導入し、RPMI培地に懸濁した。また、実施例14のようにして、HEK293T細胞に化合物1を導入し、DMEM培地に置換した。その後、両細胞に対して、非膜透過性の蛍光試薬であるヨウ化プロピジウム(PI)を終濃度0.67μg/mlとなるように培地中に添加し、37℃で30分間処理した後、顕微鏡で観察を行った。化合物1は473nmのレーザーで励起し、PIは559nmのレーザーで励起し、それぞれ490〜550nm、655〜755nmの蛍光波長で観察を行った。なお、観察時のカメラの光増倍管感度やレーザー強度は、95℃、1分間熱処理した細胞を死滅した細胞のコントロールとして用いて調整を行った。
C2C12(マウス筋芽細胞由来、ECACC)を増殖培地(DMEM、10%FBS、100 U/mlpenicillin, 100 μg/mlstreptomycin)で培養後、3x103/cm2となるようにプラスチックボトムディッシュ(ibidi社)に播種、3日後に分化培地(DMEM,2%ウマ血清,100 U/mlpenicillin, 100 μg/mlstreptomycin)に置換し、さらに7日間培養した。
Claims (13)
- 感熱性ユニット、カチオン性ユニットおよび蛍光性ユニットを含む共重合体を含んでなる温度感受性プローブであって、
相互に異なる最大蛍光波長を有する第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットを含んでなり、
感熱性ユニットが、以下の式(a):
R4およびR5は、独立に、水素原子およびC1−20アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、C1−6アルコキシ、およびアリールから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、またはR4およびR5はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C1−6アルキル、C1−6アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、C1−10アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい]
で表される1種または2種以上のモノマーに由来する1種または2種以上の繰り返し構造であり、
カチオン性ユニットが、以下の式(b):
Wは、芳香環または−X1−C(=O)−(ここで、Q1に直接結合するのはX1である)であり;
X1は、O、S、またはN−R11であり;
R11は、水素原子、C1−6アルキル、または−Q1−Yであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C1−6アルコキシ、C1−6アルキルチオ、C1−6アルキルスルフィニル、およびC1−6アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
Q1は、独立に、C1−20アルキレン、C3−20アルケニレン、またはC3−20アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、S、−O−P(=O)(−OH)−O−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Yは、独立に、1以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−N+R21R22R23Xe −、−C(=NR41)−NR42R43、および下式:
Xe −およびXf −はカウンターアニオンであり;
R21、R22、およびR23は、独立に、C1−10アルキル、およびC7−14アラルキルから選択され、またはR21およびR22は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよく;
R24は、C1−10アルキル、またはC7−14アラルキルであり;
R41、R42およびR43は、独立に、水素原子およびC1−10アルキルから選択され、またはR41およびR42は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、2つの窒素原子を含む5〜7員ヘテロ環を形成してもよく、またはR42およびR43は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよい]
で表される1種または2種以上のモノマーに由来する1種または2種以上の繰り返し構造であり、
第一の蛍光性ユニットが、以下の式(c):
X 2 は、O、S、またはN−R 12 であり;
X 3 は、直接結合、O、S、SO、SO 2 、N(−R 13 )、CON(−R 16 )、N(−R 16 )CO、N(−R 17 )CON(−R 18 )、SO 2 N(−R 19 )またはN(−R 19 )SO 2 であり;
Q 2 は、C 1−20 アルキレン、C 3−20 アルケニレン、またはC 3−20 アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、Sまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Arは、6〜18員芳香族炭素環基、または5〜18員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の1以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−CH 2 −は−C(O)−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、C 1−6 アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、C 1−6 アルキルカルボニル、C 1−6 アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−NR 6 R 7 、および−SO 2 NR 14 R 15 から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく(ここで前記C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、C 1−6 アルキルスルホニル、C 1−6 アルキルカルボニルおよびC 1−6 アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、C 1−6 アルキルアミノ、ジ(C 1−6 アルキル)アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい);
R 6 およびR 7 は、独立に、水素原子、C 1−10 アルキル、アリール、C 1−10 アルキルカルボニル、アリールカルボニル、C 1−10 アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、N−(C 1−10 アルキル)カルバモイル、およびN,N−ジ(C 1−10 アルキル)カルバモイルから選択され、ここで前記C 1−10 アルキル、C 1−10 アルキルカルボニル、C 1−10 アルキルスルホニル、N−(C 1−10 アルキル)カルバモイル、およびN,N−ジ(C 1−10 アルキル)カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、C 1−6 アルキルアミノ、ジ(C 1−6 アルキル)アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;または
R 6 およびR 7 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、C 1−10 アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 12 は、水素原子、C 1−6 アルキル、または−Q 2 −X 3 −Arであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、およびC 1−6 アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 13 は、水素原子、またはC 1−6 アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、およびC 1−6 アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 14 およびR 15 は、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され;またはR 14 およびR 15 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し;
R 16 、R 17 、R 18 およびR 19 は、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、およびC 1−6 アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい]
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造であり、
第二の蛍光性ユニットが、以下の式(d):
R 51 、R 52 、R 53 およびR 54 は、独立に、水素原子およびC 1−6 アルキルから選択され;
X 4 は、直接結合、フェニレン、−Q 4 −O−C(=O)−(ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはQ 4 である)、または−Q 4 −N(−R 61 )−C(=O)−(ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはQ 4 である)であり;
R 61 は、水素原子およびC 1−6 アルキルから選択され;
Q 4 は、C 1−20 アルキレン、フェニレン、およびナフチレンから選択され、該フェニレンおよびナフチレンはハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい]
で表されるモノマーに由来する繰り返し構造である、温度感受性プローブ。 - 第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットが、同一波長の励起光の照射によって相互に異なる最大蛍光波長の蛍光を生じるものである、請求項1に記載の温度感受性プローブ。
- 第一の蛍光性ユニットの最大蛍光波長と、第二の蛍光性ユニットの最大蛍光波長との差が、50nm以上である、請求項1に記載の温度感受性プローブ。
- 第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットのいずれか一方が、温度の上昇に応じて蛍光強度が上昇するものであり、他方が、温度の上昇に応じて蛍光強度が不変あるいは下降するものであり、望ましくは下降するものである、請求項1に記載の温度感受性プローブ。
- 共重合体が、式(I)、式(II)、式(III)および式(XIII):
で表される繰り返し単位を含んでなり、aおよびbの和を100とする場合、bが2〜10である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の温度感受性プローブ。 - 前記共重合体が、前記式(a)で表される2種以上の感熱性ユニットを含むものである、請求項1〜5のいずれか一項に記載の温度感受性プローブ。
- R 3 が、水素原子およびC 1−3 アルキルから選択され;
X 2 が、O、S、またはN−R 12 であり;
X 3 が、直接結合、O、S、SO、SO 2 、N(−R 13 )、CON(−R 16 )、N(−R 16 )CO、N(−R 17 )CON(−R 18 )、SO 2 N(−R 19 )またはN(−R 19 )SO 2 であり;
Q 2 が、C 1−20 アルキレン、C 3−20 アルケニレン、またはC 3−20 アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、Sまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Arが、下式:
X 10 が、O、SまたはSeから選択され;
R 8 が、水素原子、C 1−10 アルキル、およびアリールから選択され;
R 6 およびR 7 が、独立に、水素原子、C 1−10 アルキル、アリール、C 1−10 アルキルカルボニル、アリールカルボニル、C 1−10 アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびカルバモイルから選択され;
あるいは、R 6 およびR 7 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、ニトロ、およびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 12 が、水素原子、C 1−6 アルキル、または−Q 2 −X 3 −Arであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 13 が、水素原子、またはC 1−6 アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 14 およびR 15 が、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され;
あるいは、R 14 およびR 15 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成し;
R 16 、R 17 およびR 18 が、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよい、請求項1〜6のいずれか一項に記載の温度感受性プローブ。 - 第一の蛍光性ユニットがDBThD−AAに由来する繰り返し構造であり、第二の蛍光性ユニットがBODIPY−AAに由来する繰り返し構造である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の温度感受性プローブ。
- 式(I)、式(II)、式(III)および式(XIII):
R 4 およびR 5 は、独立に、水素原子およびC 1−20 アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、C 1−6 アルコキシ、およびアリールから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、またはR 4 およびR 5 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、C 1−10 アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、
R 2 は、水素原子およびC 1−3 アルキルから選択され;
Wは、芳香環または−X 1 −C(=O)−(ここで、Q 1 に直接結合するのはX 1 である)であり;
X 1 は、O、S、またはN−R 11 であり;
R 11 は、水素原子、C 1−6 アルキル、または−Q 1 −Yであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、およびC 1−6 アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
Q 1 は、独立に、C 1−20 アルキレン、C 3−20 アルケニレン、またはC 3−20 アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、S、−O−P(=O)(−OH)−O−またはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Yは、独立に、1以上の正電荷を有しうるイオン性官能基であって、−N + R 21 R 22 R 23 X e − 、−C(=NR 41 )−NR 42 R 43 、および下式:
X e − およびX f − はカウンターアニオンであり;
R 21 、R 22 、およびR 23 は、独立に、C 1−10 アルキル、およびC 7−14 アラルキルから選択され、またはR 21 およびR 22 は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよく;
R 24 は、C 1−10 アルキル、またはC 7−14 アラルキルであり;
R 41 、R 42 およびR 43 は、独立に、水素原子およびC 1−10 アルキルから選択され、またはR 41 およびR 42 は、それぞれが結合する窒素原子および炭素原子と一緒になって、2つの窒素原子を含む5〜7員ヘテロ環を形成してもよく、またはR 42 およびR 43 は、結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成してもよく、
R 3 は、水素原子およびC 1−3 アルキルから選択され;
X 2 は、O、S、またはN−R 12 であり;
X 3 は、直接結合、O、S、SO、SO 2 、N(−R 13 )、CON(−R 16 )、N(−R 16 )CO、N(−R 17 )CON(−R 18 )、SO 2 N(−R 19 )またはN(−R 19 )SO 2 であり;
Q 2 は、C 1−20 アルキレン、C 3−20 アルケニレン、またはC 3−20 アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、Sまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Arは、6〜18員芳香族炭素環基、または5〜18員芳香族ヘテロ環基から選択され、ここで当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、含まれる環の1以上が芳香族環である縮合環を含んでいてもよく、当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基に環原子として存在する−CH 2 −は−C(O)−に置換されていてもよく、さらに当該芳香族炭素環基および芳香族ヘテロ環基は、ハロゲン原子、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、C 1−6 アルキルスルホニル、ニトロ、シアノ、C 1−6 アルキルカルボニル、C 1−6 アルコキシカルボニル、カルボキシ、ホルミル、−NR 6 R 7 、および−SO 2 NR 14 R 15 から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく(ここで前記C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、C 1−6 アルキルスルホニル、C 1−6 アルキルカルボニルおよびC 1−6 アルコキシカルボニルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、C 1−6 アルキルアミノ、ジ(C 1−6 アルキル)アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよい);
R 6 およびR 7 は、独立に、水素原子、C 1−10 アルキル、アリール、C 1−10 アルキルカルボニル、アリールカルボニル、C 1−10 アルキルスルホニル、アリールスルホニル、カルバモイル、N−(C 1−10 アルキル)カルバモイル、およびN,N−ジ(C 1−10 アルキル)カルバモイルから選択され、ここで前記C 1−10 アルキル、C 1−10 アルキルカルボニル、C 1−10 アルキルスルホニル、N−(C 1−10 アルキル)カルバモイル、およびN,N−ジ(C 1−10 アルキル)カルバモイルに含まれるアルキルは、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、C 1−6 アルキルアミノ、ジ(C 1−6 アルキル)アミノ、アリール、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、さらに前記アリール、アリールカルボニル、およびアリールスルホニルに含まれるアリールは、ハロゲン原子、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;または
R 6 およびR 7 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、ニトロ、ハロゲン原子、C 1−10 アルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 12 は、水素原子、C 1−6 アルキル、または−Q 2 −X 3 −Arであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、およびC 1−6 アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 13 は、水素原子、またはC 1−6 アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、およびC 1−6 アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 14 およびR 15 は、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され;またはR 14 およびR 15 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、4〜8員含窒素ヘテロ環を形成し;
R 16 、R 17 、R 18 およびR 19 は、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシ、ハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、C 1−6 アルキルチオ、C 1−6 アルキルスルフィニル、およびC 1−6 アルキルスルホニルから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、
R 55 は、水素原子およびC 1−3 アルキルから選択され;
R 51 、R 52 、R 53 およびR 54 は、独立に、水素原子およびC 1−6 アルキルから選択され;
X 4 は、直接結合、フェニレン、−Q 4 −O−C(=O)−(ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはQ 4 である)、または−Q 4 −N(−R 61 )−C(=O)−(ここで、ボロンジピロメテン骨格に直接結合するのはQ 4 である)であり;
R 61 は、水素原子およびC 1−6 アルキルから選択され;
Q 4 は、C 1−20 アルキレン、フェニレン、およびナフチレンから選択され、該フェニレンおよびナフチレンはハロゲン原子、C 1−6 アルコキシ、ヒドロキシ、アミノ、およびカルボキシから選択される1以上の置換基により置換されていてもよく、
a、b、cおよびdは、各繰り返し単位の比を表す0より大きい数である]
で表される繰り返し単位を含んでなる共重合体であって、aおよびbの和を100とする場合、bが2〜10である、共重合体。 - R 3 が、水素原子およびC 1−3 アルキルから選択され;
X 2 が、O、S、またはN−R 12 であり;
X 3 が、直接結合、O、S、SO、SO 2 、N(−R 13 )、CON(−R 16 )、N(−R 16 )CO、N(−R 17 )CON(−R 18 )、SO 2 N(−R 19 )またはN(−R 19 )SO 2 であり;
Q 2 が、C 1−20 アルキレン、C 3−20 アルケニレン、またはC 3−20 アルキニレンから選択され、ここで前記アルキレンは、1以上の個所において、O、Sまたはフェニレンが独立に挿入されていてもよく;
Arが、下式:
X 10 が、O、SまたはSeから選択され;
R 8 が、水素原子、C 1−10 アルキル、およびアリールから選択され;
R 6 およびR 7 が、独立に、水素原子、C 1−10 アルキル、アリール、C 1−10 アルキルカルボニル、アリールカルボニル、C 1−10 アルキルスルホニル、アリールスルホニル、およびカルバモイルから選択され;
あるいは、R 6 およびR 7 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成し、ここで当該ヘテロ環は、C 1−6 アルキル、C 1−6 アルコキシ、ニトロ、およびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 12 が、水素原子、C 1−6 アルキル、または−Q 2 −X 3 −Arであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 13 が、水素原子、またはC 1−6 アルキルであり、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよく;
R 14 およびR 15 が、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され;
あるいは、R 14 およびR 15 はそれらが結合する窒素原子と一緒になって、5〜7員含窒素ヘテロ環を形成し;
R 16 、R 17 およびR 18 が、独立に、水素原子、およびC 1−6 アルキルから選択され、ここで当該アルキルは、ヒドロキシおよびハロゲン原子から選択される1以上の置換基により置換されていてもよい、請求項9に記載の共重合体。 - 式(III)で表される繰り返し単位がDBThD−AAに由来する繰り返し構造であり、式(XIII)で表される繰り返し単位がBODIPY−AAに由来する繰り返し構造である、請求項9または10に記載の共重合体。
- 細胞内の温度を測定する方法であって、
(a)請求項1〜8のいずれか一項に記載の温度感受性プローブを溶媒中で細胞と混合することにより、該温度感受性プローブを細胞内に導入する工程、
(b)励起光照射下、第一の蛍光性ユニットおよび第二の蛍光性ユニットのそれぞれに由来する蛍光の強度を測定する工程、および
(c)測定された2つの蛍光強度の比を算出する工程
を含んでなる、方法。 - 細胞内の温度を測定するためのキットであって、請求項1〜8のいずれか一項に記載の温度感受性プローブを含んでなる、キット。
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