JP7044267B2 - 非シアル化抗炎症ペプチド - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１１年１２月１９日に出願された米国仮出願第６１／５７７，３６１号
の優先権を主張する。前記出願の内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

政府の権利
本明細書に開示された発明は、少なくとも一部は、国立衛生研究所からの助成金番号Ｎ
ＩＨ ＡＩ０３５８７５の下で政府の支援を受けて完成された。従って、米国政府は本発
明において一定の権利を有する。

発明の分野
本発明は、抗炎症剤、組成物、および炎症性疾患を治療するための方法に関する。

背景
自己免疫疾患を含む炎症性疾患は、白血球の異常な活性化およびその後の身体の患部へ
の移動を伴う疾患である。これらの症状は、世界中の何百万人もの人々の生活に影響を与
える広範囲の病気を包含する。様々な治療法が現在利用可能であるが、多くはかなりの副
作用を持っているか、または全ての症状を緩和するほど十分に有効ではない。したがって
、炎症性疾患を治療するための抗炎症剤に対する要求、およびそのような薬剤を同定し評
価する方法に対する要求が存在する。

免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）は、そのＦｃ断片によって媒介される相互作用を介して炎
症促進および抗炎症活性（ｐｒｏ－ ａｎｄ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ａ
ｃｔｉｖｉｔｉｅｓ）の両方を媒介すると、長い期間認識されている。Ｆｃ－ＦｃｙＲ相
互作用は免疫複合体および細胞毒性抗体の炎症促進性特性の原因であるが、静脈内ガンマ
グロブリン（ＩＶＩＧ）およびそのＦｃ断片は抗炎症性であり、炎症性疾患を抑制するた
めに広く使用される。ＩｇＧのグリコシル化がＩｇＧの細胞毒性および炎症性能力の調節
に重要であることが提案されている。例えば、ＩＶＩＧの抗炎症活性は、Ｆｃ断片および
その結合グリカンの特性であり、端末α．２，６シアル酸結合を必要とし、免疫抑制のた
めには特定のポリペプチド骨格とグリカン構造とが複合的に要求されることを示している
（アンソニーら，２００８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２０：３７３－３７６、およびＷＯ２０
０７／１１７５０５）。

しかしながら、ＩＶＩＧ中のＩｇＧの小規模な集団のみが、α２，６シアル酸で終端し
たグリカン（ｓＦｃ）および抗炎症活性を有する。その結果、様々な臨床状況において自
己抗体によって引き起こされる炎症の抑制のためには、シアル化ＩｇＧを強化するために
高用量（ｌ～２ｇ／ｋｇ）でＩＶＩＧを投与するか、そうでなかったらＩｇＧのシアル化
を高めなければならない（米国出願第２００８０２０６２４６、および２００９０００４
１７９、ならびにニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ）ら Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ ２６，５１３－５３３（２００８））。

本発明はシアル化されていない抗炎症ペプチドを同定することにより、上記の要求に取
り組み、応える。

概要
本発明は、炎症性疾患、例えば、自己免疫疾患を治療するためのポリペプチドおよび抗
体のような薬剤、および方法に関する。

従って、本発明の一態様は、ＩｇＧ Ｆｃ領域と少なくとも７５％（例えば、７０％、
８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を包括した、例えば、７５％
および１００％間の任意の数字）相同な改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）配列を含む単離された
ポリペプチドを特徴とする。改変配列はシアル化されておらず、ポリペプチドは元（ｐａ
ｒｅｎｔ）ポリペプチドのものよりも高い抗炎症活性を有する。親ポリペプチドは、以下
に示す配列番号：１の配列のようなＩｇＧ Ｆｃ領域を含み得る。いくつかの実施形態で
は、ポリペプチドは、ＤＣ－ＳＩＧＮと結合する能力を有し、およびｈＦｃγＲＩＩＡま
たはＲＩＩＢに結合する能力を有する。一実施形態では、単離されたポリペプチドは、２
×１０^－５Ｍ以下のＫ_Ｄ（すなわち、５．０×１０^４Ｍ^－１以上のＫ_Ａ）でｈＦｃγＲＩ
ＩＡまたはＲＩＩＢに結合する能力を有する。好ましくは、改変配列は、ＦＡ２４１変異
を有する。改変配列は、配列番号：２と少なくとも７５％（例えば、７０％、８０％、８
５％、９０％、９５％、９９％、および１００％を包括した、例えば、７５％および１０
０％間の任意の数字）相同であり得る。いくつかの例において、改変配列は配列番号：２
を含む、または本質的に配列番号：２からなる。

別の態様において、本発明は、抗炎症活性を有するポリペプチドを作製する方法を提供
する。この方法は、とりわけ、ＩｇＧ Ｆｃ領域の配列を有する親ポリペプチド、または
親ポリペプチドをコードする第１の核酸配列を提供する工程；および改変ポリペプチドを
得るために、改変ポリペプチドがシアル化されておらず且つＩｇＧ Ｆｃ領域のシアル化
形態の構造を模倣する（ｍｉｍｉｃｓ）ように、親ポリペプチドを改変する工程を含む。
改変する工程は、改変ポリペプチドをコードする第２の核酸を得るために、第１の核酸配
列を改変することによって行われ得る。本発明はまた、直前に記載した方法により作製さ
れたポリペプチドを提供する。

第三の態様において、本発明は、上記ポリペプチドをコードする配列を含む、単離され
た核酸；当該核酸を含む発現ベクター；および当該核酸を含む宿主細胞を特徴とする。本
発明はまた、ポリペプチドを製造する方法を特徴とする。当該方法は、核酸によってコー
ドされるポリペプチドの発現を可能にする条件下で培地中で宿主細胞を培養すること、お
よび培養した細胞または細胞の培地からポリペプチドを精製することを含む。

第四の態様において、本発明は、（ｉ）上記のポリペプチドまたは核酸、および（ｉｉ
）薬学的に許容される担体、を含む医薬製剤を特徴とする。

第五の態様において、本発明は、炎症性疾患を治療する方法を提供する。当該方法は、
上記のポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸の治療上の有効量を、それを必
要とする被験体に投与することを含む。また、炎症性疾患を治療するための医薬の製造に
おける、ポリペプチドまたは核酸の使用が提供される。本発明はまた、本明細書に実質的
に示されおよび記載される、単離されたポリペプチド、核酸、発現ベクター、宿主細胞、
組成物、または炎症性疾患を治療するための方法を特徴とする。

本発明の一つ以上の実施形態の詳細は、以下の説明に記載されている。他の特徴、物（
ｏｂｊｅｃｔ）、および本発明の利点は、明細書および特許請求の範囲から明らかであろ
う。

図１ａ－ｃは、α２，６－結合シアル酸が、ＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃに与えたことを示す、図および写真である。 図１ａ－ｃは、α２，６－結合シアル酸が、ＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃに与えたことを示す、図および写真である。 図１ａ－ｃは、α２，６－結合シアル酸が、ＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃに与えたことを示す、図および写真である。 図２ａ－ｂは、Ｆｃ－グリカン相互作用を妨害することで、ＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃに与えたことを示す、図および写真である。 図２ａ－ｂは、Ｆｃ－グリカン相互作用を妨害することで、ＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃに与えたことを示す、図および写真である。 図２ａ－ｂは、Ｆｃ－グリカン相互作用を妨害することで、ＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を組換えヒトＩｇＧ１ Ｆｃに与えたことを示す、図および写真である。 図３は、ｈＩｇＧ１ ＦｃでのＦＡ２４１変異が、α２，６ ｓＦｃの抗炎症活性を再現することを示す、セットとしての図である。 図４ａ－ｄは、ＦＡ２４１抗炎症活性のための特徴的要件を示す図である。 図５は、ＦＡ２４１変異がＦｃγ受容体結合を増加させたことを示す図のセットである。 図５は、ＦＡ２４１変異がＦｃγ受容体結合を増加させたことを示す図のセットである。 図５は、ＦＡ２４１変異がＦｃγ受容体結合を増加させたことを示す図のセットである。 図６ａ－ｂは、骨髄由来マクロファージにおけるＦＡ２４１によるＩＬ－３３ ｍＲＮＡ誘導を示す写真である。

詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的には、非シアル化ＩｇＧ Ｆｃ変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ
）が抗炎症活性を付与し、抗炎症性メディエーターとして２，６シアル化Ｆｃの効果を模
倣するという予想外の発見に基づく。

ＩｇＧおよびＦｃシアル化
ＩｇＧは、主要な血清免疫グロブリンである。２つの同一の重鎖および２つの軽鎖から
なる糖タンパク質であり、可変および定常ドメインで順番に構成される。ＩｇＧは、その
２つの重鎖のそれぞれの上のＣＨ２ドメイン内のＡｓｎ^２９７において単一のＮ－結合グ
リカンを含む。共有結合した複合糖質は、Ｎ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）お
よびマンノース（ｍａｎ）を含むコア、二分岐ペンタ－多糖で構成されている。フコース
、分岐したＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース（ｇａｌ）および可変的に見出される末端シアル
酸（ｓａ）部分の存在により、コア糖質構造のさらなる改変が血清抗体で観察される。４
０を超える異なる糖型が、このように、この単一のグリコシル化部位に共有結合されてい
ることが検出されている（フジイら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６５，６００９，１
９９０）。ＩｇＧのグリコシル化は、２つの重鎖の開いたコンフォメーションを維持する
ことによって、すべてのＦｃｙＲへの結合に必須であることが示されている。ジェフリー
ズ（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ）とルンド（Ｌｕｎｄ），Ｉｍｍｕｎｅ．１ Ｌｅｔｔ． ８２，
５７（２００２）、 ソンダーマン（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ）ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
． ３０９，７３７（２００１）。ＦｃｙＲ結合のためのこのＩｇＧグリコシル化は、脱
グリコシル化ＩｇＧ抗体が、ＡＤＣＣ、食作用（ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）および炎症
性メディエーターの放出などのインビボにおいて誘発される炎症反応を媒介することがで
きないことについての主要因であると考えられている。ニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊ
ａｈｎ）とラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）， Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２４，１９（２００６
）。ＩｇＧの個々の糖型は炎症反応を調節することに寄与し得るというさらなる所見が、
フコースを含むまたは欠くＩｇＧ抗体について報告された個々のＦｃｙＲに対する変化し
た親和性、および細胞毒性に対するそれらの結果的な影響によって、示唆されている。シ
ールズ（Ｓｈｉｅｌｄｓ）ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７，２６７３３（２００
２）、 ニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ）とラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ），
Ｓｃｉｅｎｃｅ ３１０，１５１０（２００５）。自己免疫状態とＩｇＧ抗体の特定のグ
リコシル化パターンとの間の関連性が、ＩｇＧ抗体の減少したガラクトシル化およびシア
ル化が報告されている関節リウマチおよびいくつかの自己免疫血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔ
ｉｅｓ）を有する患者において、観察されている。パレク（Ｐａｒｅｋｈ）ら，Ｎａｔｕ
ｒｅ ３１６，４５２（１９８５）、 ラーデマッヘル（Ｒａｄｅｍａｃｈｅｒ）ら，Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１，６１２３（１９９４）、 マツモ
トら，１２８，６２１（２０００）、 ホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，Ｂｉｏｃｈｉｍ
．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１２月２７日。ＩｇＧ糖型の多様性はまた、加齢および免
疫化の際に関連することが報告されているが、これらの変化のインビボでの重要性は究明
されていない。シカタら，Ｇｌｙｃｏｃｏｎｊ．Ｊ．１５，６８３（１９９８）、 ラス
トラ（Ｌａｓｔｒａ）ら，Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ ２８，２５（１９９８）。

本明細書に開示されるように、特定の非シアル化ＩｇＧ Ｆｃ変異体も、驚くべきこと
に抗炎症活性を与える。ＦＡ２４１変異体を含むこのような変異体は、シアル化Ｆｃの構
造的および生物学的特性を模倣することにより、シアル化を必要とせずに、抗炎症治療薬
として開発され得る分子のより大きな属（ｇｅｎｕｓ）内の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）を表す
。

ポリペプチドおよび核酸
ポリペプチド
本明細書に開示されるように、本発明は、上記のＡｓｎ^２９７でのα２，６結合を介し
てガラクトース部分に接続された末端シアル酸を有する多糖鎖を欠く、ヒトＩｇＧ Ｆｃ
の変異体の配列を有する単離されたポリペプチドを提供する。このような非シアル化Ｉｇ
Ｇ Ｆｃ変異体は、天然に存在する抗体に由来するか、または細胞株において発現されて
もよい。

一実施形態において、Ｆｃ領域はｈＩｇＧ１アミノ酸配列の１つ以上の置換を含む。こ
れに限定されるものではないが、典型的なＩｇＧ１ Ｆｃ領域は以下のように提供される
：

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書においてはポ
リマー中のアミノ酸残基の配置（ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を説明するために交換可能に
使用される。ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は、天然に存在する標準的な２
０個のアミノ酸に加えて、希少アミノ酸および合成アミノ酸類似体から構成され得る。そ
れらは長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミ
ノ酸の任意の鎖であり得る。「本発明の」ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質は
、ＤＣ－ＳＩＧＮ、ＦｃγＲＩＩＡおよびＦｃγＲＩＩＢに結合する特定のドメインまた
は部分を有する、組換え的にまたは合成的に産生された型（ｖｅｒｓｉｏｎｓ）を含む。
この用語はまた、追加されたアミノ末端メチオニン（原核細胞における発現に有用）を有
するポリペプチドを包含する。

「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、それが天然において結合されている
他のタンパク質、脂質、および核酸から分離されているポリペプチドまたはタンパク質を
指す。ポリペプチド／タンパク質は、精製された調製物の乾燥重量で少なくとも１０％（
すなわち、１０％～１００％の間の任意のパーセンテージ、例えば２０％、３０％、４０
％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％）を構成
することができる。純度は任意の適切な標準的方法により、例えば、カラムクロマトグラ
フィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ分析によって、測定され得る。
本発明に記載の単離されたポリペプチド／タンパク質は、天然源から精製され、組換えＤ
ＮＡ技術または化学的方法によって生産され得る。ＩｇＧ Ｆｃの機能的等価物は、Ｉｇ
Ｇ Ｆｃポリペプチド誘導体を意味し、例えば、１つ以上の点変異、挿入、欠失（ｄｅｌ
ｅｔｉｏｎｓ）、切断（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）、融合タンパク質、またはそれらの組
み合わせを有するタンパク質である。これは、ＩｇＧ Ｆｃの活性、すなわち、それぞれ
の受容体に結合しそれぞれの細胞応答を誘発する能力を、実質的に保持する。単離された
ポリペプチドは、配列番号：２を含み得る。一般的に、機能的等価物は、配列番号：２と
少なくとも７５％（例えば、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、および９９％を
包括した、例えば、７５％および１００％間の任意の数字）相同である。

２つのアミノ酸配列のまたは２つの核酸の「相同性パーセント」は、カーリン（Ｋａｒ
ｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３において修正された、カーリン（Ｋａｒ
ｌｉｎ）およびアルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０のアルゴリズムを用いて決定される。こ
のようなアルゴリズムは、アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ
． ２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バ
ージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索は、本発明の核酸分
子に相同なヌクレオチド配列を得るためには、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００
、ワード長－１２によって行われ得る。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、本発明のタンパク
質分子に相同なアミノ酸配列を得るためには、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、
ワード長＝３によって行われ得る。２つの配列間にギャップが存在する場合は、アルトシ
ュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：
３３８９－３４０２，１９９７に記載されるようにＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴが利用され
得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれ
のプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメーターが使
用され得る。

本明細書に記載のポリペプチドのアミノ酸組成は、それぞれの受容体に結合しそれぞれ
の細胞応答を誘発するポリペプチドの能力を破壊することなく、変化してもよい。例えば
、１つ以上の保存的アミノ酸置換を含むことができる。「保存的アミノ酸置換」は、アミ
ノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されたものである。類似の側鎖を有す
るアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において明らかにされている。これらのファ
ミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、
酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシ
ン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性
側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニ
ン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ－分岐側鎖（例えば、トレオニン、バリン、
イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファ
ン、ヒスチジン）を含む。従って、例えば配列番号：２において予測される非必須アミノ
酸残基は、好ましくは、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。ある
いは、変異は、飽和突然変異誘発などによって配列の全てまたは一部に沿ってランダムに
導入されることができ、結果として生じる変異体は、実施例において後述するような活性
を保持する変異体を同定するために、それぞれの受容体に結合しそれぞれの細胞応答を誘
発する能力についてスクリーニングされることができる。

本発明に記載されるようなポリペプチドは、組換えポリペプチドとして得られ得る。組
換えポリペプチドを調製するため、それ（例えば、ＦＡ２４１、配列番号：２）をコード
する核酸は、例えば、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、６×Ｈｉｓエ
ピトープタグまたはＭ１３遺伝子３タンパク質のような融合パートナーをコードする別の
核酸に連結され得る。結果として得られる融合核酸は、当技術分野で公知の方法により単
離され得る融合タンパク質を、適切な宿主細胞中で発現する。単離された融合タンパク質
は、融合パートナーを除去し本発明の組換えポリペプチドを得るために、例えば酵素消化
により、さらに処置され得る。

核酸
本発明の別の態様は、上述のポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列を含む単
離された核酸を特徴とする。核酸は、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ
）、ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）、またはＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体（ａｎａｌ
ｏｇ）を指す。ＤＮＡまたはＲＮＡ類似体は、ヌクレオチド類似体から合成され得る。核
酸分子は一本鎖または二本鎖であり得るが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離され
た核酸」は、天然に存在する核酸のいずれのものまたは天然に存在するゲノム核酸のいず
れの断片とも相同ではない構造の、核酸を意味する。従って、この用語は、例えば、（ａ
）ＤＮＡは、天然に存在するゲノムＤＮＡ分子の一部の配列を有するが、天然に存在する
生物のゲノム中の分子のその部分に隣接する（ｆｌａｎｋ）コード配列の両方によって、
隣接されていない；（ｂ）結果として得られる分子がいずれの天然に存在するベクターま
たはゲノムＤＮＡとも相同でないような方法で、ベクター中または原核生物もしくは真核
生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた核酸；（ｃ）ｃＤＮＡ、ゲノム断片、ポリメラーゼ連
鎖反応（ＰＣＲ）によって生成された断片または制限断片などの、分離された（ｓｅｐａ
ｒａｔｅ）分子；および（ｄ）ハイブリッド遺伝子、すなわち融合タンパク質をコードす
る遺伝子、の一部である組換えヌクレオチド配列である。上記の核酸は、本発明の融合タ
ンパク質を発現するために使用され得る。この目的のためには、発現ベクターを作り出す
ため、適切な調節配列に作動的に核酸を連結することができる。

ベクターは、それに連結された別の核酸を輸送できる核酸分子を指す。ベクターは、自
己複製が可能であるか、または宿主ＤＮＡへ統合（ｉｎｔｅｇｒａｔｅ）できる。ベクタ
ーとしては、プラスミド、コスミド、またはウイルスベクターが挙げられる。ベクターは
、宿主細胞において核酸の発現に適した形態で核酸を含む。好ましくは、ベクターは、発
現されるべき核酸配列に作動的に連結された、１以上の調節配列を含む。

「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現調節因子（例えば、ポ
リアデニル化シグナル）を含む。調節配列は、ヌクレオチド配列の恒常的発現を導くもの
、ならびに組織特異的調節および／または誘導性配列を含むものである。発現ベクターの
設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質またはＲＮＡの発現レベルな
どのような因子に依存し得る。発現ベクターは、本発明のポリペプチドを産生する宿主細
胞に導入され得る。プロモーターは、ＤＮＡに結合してＲＮＡ合成を開始するようにＲＮ
Ａポリメラーゼを導くＤＮＡ配列として定義される。強力なプロモーターは、ｍＲＮＡを
高頻度で開始させるものである。

上記の任意のポリヌクレオチド、または同じ意図の目的のために当業者に利用可能な生
物学的に等価なポリヌクレオチドは、適切な発現ベクターに挿入され、この受容体を発現
する「組換えＤＮＡ分子」を形成するように他のＤＮＡ分子と連結されてもよい。これら
のベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成されてもよく；ほとんどのクローニング目的
のＤＮＡベクターは好ましい。典型的なベクターは、プラスミド、改変ウイルス、バクテ
リオファージおよびコスミド、酵母人工染色体、ならびにエピソーム性のまたは統合ＤＮ
Ａの他の形態を含む。これは、特定使用のための適切なベクターを決定するための、当業
者にとっての知識の範囲内である。

様々な哺乳類発現ベクターが、哺乳類細胞中で上記のＩｇＧ Ｆｃを発現するために使
用されてもよい。上述したように、発現ベクターは、適切な宿主中において、クローニン
グされたＤＮＡの転写およびそれらのｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列であり得る。そ
のようなベクターは、細菌、藍藻類、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞のような様々な
宿主において真核生物ＤＮＡを発現するために使用され得る。特別に設計されたベクター
は、細菌－酵母または細菌－動物細胞のような宿主間のＤＮＡの往復を可能にする。適切
に構築された発現ベクターは：宿主細胞中での自己複製のための複製起点、選択マーカー
、有用な制限酵素部位の限られた数、高コピー数の能力、および活性プロモーターを含む
はずである。発現ベクターは、特に限定されないが、クローニングベクター、改変クロー
ニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを含んでも良い。好適であ
り得る市販の哺乳類発現ベクターは、限定されないが、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ（インビト
ロジェン社）、ｐｃＤＮＡ３．１（インビトロジェン）、ｐＣＩ－ｎｅｏ（プロメガ）、
ｐＬＩＴＭＵＳ２８、ｐＬＩＴＭＵＳ２９、ｐＬＩＴＭＵＳ３８およびｐＬＩＴＭＵＳ３
９（ニューイングランドバイオラボ）、ｐｃＤＮＡＩ、ｐｃＤＮＡＩａｍｐ（インビトロ
ジェン）、ｐｃＤＮＡ３（インビトロジェン）、ｐＭＣ１ｎｅｏ（ストラタジーン）、ｐ
ＸＴ１（ストラタジーン）、ｐＳＧ５（ストラタジーン）、ＥＢＯ－ｐＳＶ２－ｎｅｏ（
ＡＴＣＣ ３７５９３） ｐＢＰＶ－１（８－２）（ＡＴＣＣ ３７１１０）、ｐｄＢＰ
Ｖ－ＭＭＴｎｅｏ（３４２－１２）（ＡＴＣＣ ３７２２４）、ｐＲＳＶｇｐｔ（ＡＴＣ
Ｃ ３７１９９）、ｐＲＳＶｎｅｏ（ＡＴＣＣ ３７１９８）、ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ（Ａ
ＴＣＣ ３７１４６）、ｐＵＣＴａｇ（ＡＴＣＣ ３７４６０）、ならびにＩＺＤ３５（
ＡＴＣＣ ３７５６５）が挙げられる。

上記の核酸を含有する宿主細胞もまた、本発明の範囲内である。例としては、Ｅ．ｃｏ
ｌｉ細胞、昆虫細胞（例えば、バキュロウイルス発現ベクターを用いる）、酵母細胞、ま
たは哺乳類細胞が挙げられる。例えば、ゲッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ），（１９９０）Ｇｅ
ｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ １８５， アカデミック・プレス，サンディエゴ，カリフォルニア州を
参照。本発明のポリペプチドを製造するため、本発明の核酸によってコードされるポリペ
プチドの発現を可能にする条件下で培地中で宿主細胞を培養し、培養した細胞または細胞
の培地からポリペプチドを精製することができる。あるいは、本発明の核酸は、例えば、
Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを用いて、インビトロで転写および翻
訳され得る。

天然に存在するＩｇＧ Ｆｃ、遺伝子操作されたＩｇＧ Ｆｃ、および化学的に合成さ
れたＩｇＧ Ｆｃは全て、本明細書に開示された発明を実施するために使用され得る。組
換えＤＮＡ技術によって得られたＩｇＧ Ｆｃは、［ＦＡ２４１］配列番号：２）と同じ
アミノ酸配列またはその機能的等価物を有していてもよい。用語「ＩｇＧ Ｆｃ」はまた
、化学的に改変された型を含む。化学的に改変されたＩｇＧ Ｆｃの例としては、コンフ
ォメーション変化を受けたＩｇＧ Ｆｃ、糖鎖の付加または欠失、およびポリエチレング
リコールなどの化合物が結合されているＩｇＧ Ｆｃが挙げられる。

このようにして作られたポリペプチド／タンパク質の有効性を、以下に説明するように
、トランスジェニックマウスなどの動物モデルを用いて、検証することができる。インビ
ボでのＩＬ－３３好塩基球の発現やエフェクターマクロファージ上のＦｃγＲＩＩＢ受容
体の発現における任意の統計的に有意な増加は、ポリペプチド／タンパク質が後述する疾
患を治療するための候補であることを示す。一実施形態では、上述のアッセイは、ＤＣ－
ＳＩＧＮタンパク質またはＤＣ－ＳＩＧＮ^（＋）細胞への結合の測定に基づいてもよい。
本技術は、ＤＣ－ＳＩＧＮまたはＤＣ－ＳＩＧＮ^（＋）細胞への化合物の能力、および例
えばＩＬ－３３などのＤＣ－ＳＩＮＧパスウェイによって調節される遺伝子の発現におけ
る関連した変化を測定することに適した、当業者が利用可能な様々な技術に富んでいる。
当業者は、過度の実験なしにこれらの様々な研究ツールを組み合わせ、適合させることが
できるであろう。精製され、標準的方法または下記実施例に記載のアッセイおよび方法に
従って試験された後、非シアル化ＩｇＧ Ｆｃ変異体は、炎症性疾患を治療するための医
薬組成物に含有させられることもできる。

本明細書で使用される「抗体」は、最も広い意味で用いられ、具体的には、モノクロー
ナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例
えば、二重特異性抗体）および抗体断片を、それらが所望の生物学的活性を示す限り含む
。

本明細書で使用される「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含んでもよく、一般
的には、インタクトな抗体の抗原結合もしくは可変領域またはＦｃＲ結合能力を保持する
抗体のＦｃ領域を含む。抗体断片の例としては、線状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体
断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体断片は、好ましくは、少なくとも
ヒンジの部分、および任意にＩｇＧ重鎖のＣＨ１領域を保有する。より好ましくは、抗体
断片は、ＩｇＧ重鎖の定常領域全体を保有し、およびＩｇＧ軽鎖を含む。

本明細書で使用される用語「Ｆｃ断片」または「Ｆｃ領域」は、免疫グロブリン重鎖の
Ｃ末端領域を定義するために使用される。「Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域または変異
型Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化してもよいが、
ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ
２３０から、そのカルボキシル末端に伸長すると定義される。

「天然配列Ｆｃ領域」は、自然界に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と相同なアミノ
酸配列を含む。当業者によって理解されるように、「変異型Ｆｃ領域」は、少なくとも１
つの「アミノ酸改変」によって天然配列Ｆｃ領域のものとは異なるアミノ酸配列を含む。
好ましくは、変異型Ｆｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域と比
較して少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１個～約１０個のアミノ酸置換、好まし
くは天然配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドのＦｃ領域において約１個～約５個のアミノ
酸置換を有する。本明細書における変異型Ｆｃ領域は、好ましくは、天然配列Ｆｃ領域お
よび／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約７５または８０％の相同性を有し
、より好ましくはそれらと少なくとも約９０％の相同性を有し、より好ましくはそれらと
少なくとも約９５％の相同性を有し、さらにより好ましくはそれらと少なくとも約９９％
の相同性を有する。

用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に対して結合する受容体を記
述するために使用される。本発明の一実施形態では、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである
。別の実施形態において、ヒトＦｃＲを含むＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合し（ガンマ受容
体）、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスを含み、これらの受
容体の対立遺伝子変異体および選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、
その細胞質ドメインが主に異なる類似のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化
（ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制性（ｉｎｈｉｂｉｔ
ｉｎｇ）受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫
受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。抑制性受容体ＦｃγＲＩＩＢ
は、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシンベース抑制性モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む
。（ダロン（Ｄａｒｏｎ），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５，２０３－２３４
（１９９７）の総論を参照；ＦｃＲは、ラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ）とキネット（Ｋｉ
ｎｅｔ），Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，９，４５７－９２（１９９１）；カペル
（Ｃａｐｅｌ）ら，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４，２５－３４（１９９４）、および
デハース（ｄｅ Ｈａａｓ）ら，Ｊ Ｌａｂ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ，１２６，３３０－４１
（１９９５）、ニマージャーン（Ｎｉｍｍｅｒｊａｈｎ）とラヴェッチ（Ｒａｖｅｔｃｈ
）２００６，Ｒａｖｅｔｃｈ Ｆｃ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ ｉｎ Ｆｕｎｄｅｍｅｎｔａ
ｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，ウィリアムポール編集第５版、にまとめられており、これら
各々は参照により本明細書に組み込まれる）。

用語「天然（ｎａｔｉｖｅ）」または「親（ｐａｒｅｎｔ）」は、Ｆｃアミノ酸配列を
含む非改変ポリペプチドを指す。親ポリペプチドは、天然配列Ｆｃ領域または既存のアミ
ノ酸配列改変（例えば、付加、欠失および／または置換のような）がされたＦｃ領域を含
んでもよい。

組成物
適切な担体および非シアル化ＩｇＧ Ｆｃ変異体のような上記の薬剤の１つ以上を含有
する組成物は、本発明の範囲内である。組成物は、薬学的に許容される担体を含有する医
薬組成物、または化粧品として許容される担体を含有する化粧品組成物であり得る。

用語「医薬組成物」は、活性薬剤と不活性または活性な担体との組み合わせを指し、組
成物をインビボまたはエキソビボでの診断または治療用途に特に適したものにする。「薬
学的に許容される担体」は、被験体へまたは被験体上へ投与された後、望ましくない生理
学的効果を生じさせない。医薬組成物中の担体は、活性成分と適合性であり、それを安定
化することが可能であり得るという意味においても「許容され」なければならない。１つ
以上の可溶化剤が、活性化合物のデリバリーのための薬学的担体として利用され得る。薬
学的に許容される担体の例としては、剤形として使用可能な組成物を得るための、生体適
合性のビヒクル、アジュバント、添加剤、および希釈剤が挙げられるが、これらに限定さ
れない。他の担体の例としては、コロイド状酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、セ
ルロース、およびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。

上記の組成物は、上述の形態のいずれかにおいても、炎症により特徴付けられる疾患を
治療するために使用され得る。有効量は、治療される被験体に治療効果を与えるのに必要
とされる活性化合物／薬剤の量を指す。当業者によって認識されるように、有効用量は、
治療される疾患の種類、投与の経路、賦形剤の使用、および他の治療処置との併用の可能
性に依存して、異なるであろう。

本発明の医薬組成物は、非経口、経口、経鼻、経直腸、局所または口腔で投与され得る
。本明細書で使用する用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内
、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内または頭蓋内注射、ならびに任意の適切な注入技術
を指す。

無菌の注射可能な組成物は、非毒性の非経口的に許容される希釈剤または溶媒中の溶液
または懸濁液であり得る。このような溶液としては、これらに限定されないが、１，３－
ブタンジオール、マンニトール、水、リンガー溶液、および等張性塩化ナトリウム溶液が
挙げられる。さらに、固定油は、溶媒または懸濁媒体として従来用いられている（例えば
、合成モノ－またはジ－グリセリド）。脂肪酸、これらに限定されないが、オレイン酸お
よびそのグリセリド誘導体などは、これらに限定されないが、オリーブ油もしくはヒマシ
油のような天然の薬学的に許容される油、それらのポリオキシエチル化型として、注射剤
の調製に有用である。これらの油溶液または懸濁液はまた、長鎖アルコール希釈剤、もし
くは、限定されないがカルボキシメチルセルロースのような分散剤、または類似の分散薬
剤を含み得る。これらに限定されないが、ＴＷＥＥＮＳもしくはＳＰＡＮＳのようなその
他の一般的に使用される界面活性剤、または薬学的に許容される固体、液体もしくは他の
剤形の製造に一般的に使用される他の同様の乳化剤もしくはバイオアベイラビリティ増強
剤もまた、製剤化の目的のために使用され得る。

経口投与のための組成物は、カプセル、錠剤、乳化物および水性懸濁液、分散液ならび
に溶液を含む任意の経口的に許容される剤形であり得る。錠剤の場合、通常使用される担
体としては、ラクトースおよびコーンスターチが挙げられるが、これらに限定されない。
限定されないが、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤もまた典型的に添加される。
カプセル形態での経口投与の場合、有用な希釈剤としては、ラクトースおよび乾燥コーン
スターチが挙げられるが、これらに限定されない。水性懸濁液または乳化物が経口投与さ
れる場合、活性成分は、乳化剤または懸濁化剤と組み合わされて、油相に懸濁されるかま
たは溶解され得る。所望であれば、ある種の甘味料、香味料、または着色剤が添加され得
る。

記載された発明に係る局所投与のための医薬組成物は、溶液、軟膏、クリーム、懸濁液
、ローション、粉末、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾルまたは油として製剤化され
得る。代替的には、局所製剤は、活性成分（複数可）を含浸させたパッチまたは包帯の形
態であり得、１つ以上の賦形剤または希釈剤を任意に含み得る。いくつかの好ましい実施
形態では、局所製剤は、皮膚または他の患部を通って活性薬剤（複数可）の吸収または浸
透を高めるであろう物質を含む。局所用組成物は、これらに限定されないが、湿疹、にき
び、酒さ、乾癬、接触性皮膚炎およびツタウルシに対する反応を含む、皮膚の炎症性疾患
を治療するのに有用である。

局所用組成物は、皮膚への塗布に適した皮膚科学的に許容される担体の安全かつ有効量
を含む。「化粧品として許容される」または「皮膚科学的に許容される」組成物または成
分は、過度の毒性、不適合性、不安定性、アレルギー反応などを伴わずにヒトの皮膚と接
触して使用するのに好適である組成物または成分を意味する。担体は、活性薬剤および任
意成分が、適切な濃度（複数可）で皮膚にデリバリーされることを可能する。担体はそれ
ゆえ、選択された標的上に適切な濃度で活性物質が塗布され、均一に広げられていること
を確保するための、希釈剤、分散剤、溶媒などとして作用することができる。担体は、固
体、半固体、または液体であり得る。担体は、ローション、クリームまたはゲルの形態、
特に、活性物質が沈降することを防止するのに十分な厚さまたは降伏点を有するものであ
り得る。担体は不活性であるか、または皮膚科学的利点を有することがある。また、本明
細書に記載された活性成分と物理的および化学的に適合可能であるべきであり、安定性、
有効性または組成物に関連する他の使用利点を、過度に損なうべきではない。局所用組成
物は、溶液、エアロゾル、クリーム、ゲル、パッチ、軟膏、ローションまたは泡状を含む
、局所または経皮塗布のために当技術分野で公知の形態の化粧品または皮膚用製品であっ
てもよい。

治療方法
記載された発明は、被験体における炎症性疾患を治療するための方法を提供する。用語
「炎症性疾患」は、自己免疫疾患などの異常なまたは望ましくない炎症により特徴づけら
れる疾患を指す。自己免疫疾患は、非活性化条件下での免疫細胞の慢性的活性化によって
特徴付けられる疾患である。例としては、乾癬、炎症性腸疾患（例えば、クローン病およ
び潰瘍性大腸炎）、関節リウマチ、乾癬性関節炎、多発性硬化症、狼瘡、Ｉ型糖尿病、原
発性胆汁性肝硬変、および移植が挙げられる。

本発明の方法によって治療することができる炎症性疾患の他の例としては、喘息、心筋
梗塞、脳卒中、炎症性皮膚疾患（例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー
性接触皮膚炎、蕁麻疹、壊死性血管炎、皮膚血管炎、過敏性血管炎、好酸球性筋炎、多発
性筋炎、皮膚筋炎および好酸球性筋膜炎）、急性呼吸窮迫症候群、劇症肝炎、過敏性肺疾
患（例えば、過敏性肺炎、好酸球性肺炎、遅延型過敏症、間質性肺疾患（ＩＬＤ）、特発
性肺線維症、および関節リウマチに関連したＩＬＤ）、ならびにアレルギー性鼻炎が挙げ
られる。追加の例としてはまた、重症筋無力、若年発症糖尿病、糸球体腎炎、自己免疫性
甲状腺炎、強直性脊椎炎、全身性硬化症、急性および慢性炎症性疾患（例えば、全身性ア
ナフィラキシーまたは過敏性反応、薬物アレルギー、虫刺されアレルギー、同種移植片拒
絶、および移植片対宿主病）、ならびにシェーグレン症候群が挙げられる。

「被験体」は、ヒトおよび非ヒト動物を指す。非ヒト動物としては、すべての脊椎動物
、例えば、非ヒト哺乳動物、非ヒト霊長類（特に高等霊長類）、イヌ、げっ歯類（例えば
、マウスまたはラット）、モルモット、ネコおよびウサギのような哺乳動物、ならびに鳥
類、両生類、爬虫類などのような非哺乳類が挙げられる。一実施形態では、被験体はヒト
である。別の実施形態においては、被験体は、実験的な、非ヒト動物または疾患モデルと
して適した動物である。

炎症性疾患のために治療されるべき被験体は、疾患を診断するための標準的な技術によ
って同定され得る。任意に、被験体は、１つ以上のサイトカインまたは細胞のレベルまた
はパーセンテージについて、被験体から得た試験試料が本分野で公知の方法によって調べ
られてもよい。レベルまたはパーセンテージが閾値（正常被験体から得られる）以下であ
る場合、被験体は、本明細書に記載の治療のための候補である。阻害または治療を確認す
るために、治療後の被験体における１つ以上の上記サイトカインまたは細胞のレベルまた
はパーセンテージを評価および／または確認することができる。

「治療すること」または「治療」は、疾患、疾患に続発する病状、または疾患にかかり
やすい素因を治癒し、緩和し、軽減し、取り除き、その発症を遅延させ、予防し、または
改善する目的での、疾患を有する被験体への化合物または薬剤の投与を意味する。

「有効量」または「治療上の有効量」とは、治療される被験体において医学的に望まし
い結果を生じることができる化合物または薬剤の量を指す。治療方法は、インビボまたは
エキソビボにおいて、単独でまたは他の薬剤もしくは治療法と組み合わせて行われ得る。
治療上の有効量は、１回以上の投与、塗布または投薬で投与されることができ、特定の製
剤または投与経路に限定されることを意図してはいない。

薬剤は、インビボまたはエキソビボにおいて、単独で、または、他の薬剤または治療法
と組み合わせた同時投与、すなわちカクテル療法で投与され得る。本明細書で使用される
場合、用語「同時投与（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」または「同時投与され
た（ｃｏ－ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」は、少なくとも２つの薬剤または治療法の被験
体への投与を指す。いくつかの実施形態では、２つ以上の薬剤／治療法の同時投与は同時
である。他の実施形態では、第二の薬剤／治療法の前に、第一の薬剤／治療法が投与され
る。当業者は、使用される様々な薬剤／治療法の、製剤および／または投与経路が異なっ
てもよいことを理解する。

インビボでのアプローチにおいて、化合物または薬剤は、被験体に投与される。一般に
、化合物または薬剤は、薬学的に許容される担体（例えば、制限されるものではないが、
生理的食塩水など）中に懸濁され、経口でもしくは静脈内点滴によって投与され、または
皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内もしくは肺内に注
射されもしくは移植される。

必要な用量は、投与経路の選択；製剤の性質；患者の病気の性質；被験体の大きさ、体
重、表面積、年齢、および性別；他の薬剤が投与されていること；ならびに担当医の判断
に依存する。適切な投与量は０．０１～１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。必要とされる用
量の変動は、利用可能な化合物／薬剤および投与の様々な経路の異なる効率の種々の観点
から予想される。例えば、経口投与は、静脈内注射による投与よりも、高い用量を必要と
すると予想される。当技術分野でよく理解されているように、これらの用量レベルの変動
は、最適化のための標準的経験的ルーチンを用いて調整され得る。適切なデリバリービヒ
クル中への化合物のカプセル化（例えば、ポリマー微粒子または埋め込み型装置）は、特
に経口デリバリーのためには、デリバリーの効率を高めることができる。

実施例１：方法および材料
この実施例では、実施例２～７に用いられる一般的な方法および材料について説明する
。

マウス
野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ジャクソン研究所（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｉｅｓ）から購入された。ＳＩＧＮＲ１^－／－マウスは、Ａ．マッケンジー（ＭｃＫ
ｅｎｚｉｅ）によって提供された。ＣＤ１１ｃ－ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋トランスジェニックマ
ウスは、Ｔ．スパーワッセル（Ｓｐａｒｗａｓｓｅｒ）によって提供された。ＳＩＧＮＲ
１^－／－バックグラウンドでのｈＤＣ－ＳＩＧＮ ＢＡＣトランスジェニックマウスは、
以前に説明したように発明者らの研究室で作り出された。ＫＲＮ ＴＣＲ Ｃ５７ＢＬ／
６マウス（Ｄ．マティス（Ｍａｔｈｉｓ）およびＣ．ベノア（Ｂｅｎｏｉｓｔ）からの贈
り物）は、Ｋ／ＢｘＮマウスを作り出すために、ＮＯＤマウスと交配させられた。Ｋ／Ｂ
ｘＮマウス（６～１２週齢）からの血液が採取され、関節炎抗体を含む血清は一緒にプー
ルされた。ナイーブマウス（８～１２週齢）への静脈内注射による２００μＬ Ｋ／Ｂｘ
Ｎ血清の受動輸送は、関節炎を誘導した。炎症は、各脚について０～３でスコア化され、
マウス個体あたりの総臨床スコアために一緒に加算された。

組換えＦｃの調製
ＩＤＥＣ－１１４、全長ヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体の組換え源は、Ｆａｂおよび
Ｆｃ断片を切断するため、３７℃で一晩パパインにより消化された。消化後、反応は、２
．５ｍｇ／ｍＬヨードアセトアミド添加によって停止させられた。未消化の抗体から切断
された断片を分離するため、試料は、ＨｉＰｒｅｐ２６／６０ Ｓ－２００ＨＲサイズ排
除カラム（ＧＥヘルスケア）を通過させられた。Ｆｃ断片は、その後、プロテインＧアガ
ロースビーズで精製された。試料純度は、ＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルのクーマシー
ブリリアントブルー染色により確認された。あるいは、組換えＦｃは、２９３Ｔ細胞への
ヒトＩｇＧ１ Ｆｃ発現プラスミドの一過性発現によって産出され、続けて上清画分の硫
酸アンモニウム沈殿およびプロテインＧ精製が行われた。ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域をコー
ドする遺伝子配列は、標準ＰＣＲプロトコルによって４－４－２０ＩｇＧ１から増幅され
、ｐＳｅｃＴａｇ２（インビトロジェン）にライゲーションされた。点突然変異が標準的
な部位特異的突然変異誘発技術によってＦｃコード配列に導入され、ＤＮＡシーケンシン
グにより確認された。２４１位におけるＰｈｅからＡｌａへの置換（ＦＡ２４１）のため
のＰＣＲプライマーは

および

であった。

タンパク質発現および純度は、抗ヒトＦｃ抗体による免疫ブロッティングおよび／また
はＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルのクーマシーブリリアントブルー染色により確認され
た。

二段階インビトロシアル化反応
精製後、１０～５０ｍｇ／ｍＬ Ｆｃ断片は、ガラクトシル化反応緩衝液（５０ｍＭ
ＭＯＰＳ、ｐＨ７．２；２０ｍＭ ＭｎＣｌ_２）にバッファー交換され、５０ｍｇ ＵＤ
Ｐ－ガラクトースおよび０．７５Ｕ β１，４－ガラクトース転移酵素と共に３７℃で一
晩インキュベートされた。ガラクトシル化は、末端ガラクトース残基を認識するため、Ｅ
ＣＬを用いたレクチンブロットによって確認された。ガラクトシル化Ｆｃは次に、シアル
化反応緩衝液（１００ｍＭ ＭＯＰＳ、０．２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、０．５％ＴＲＩＴＯ
Ｎ Ｘ－１００、ｐＨ７．４）にバッファー交換され、５０ｍｇ ＣＭＰ－シアル酸およ
び０．７５Ｕ α２，６－シアル酸転移酵素と共に３７℃で一晩インキュベートされた。
シアル化は、α２－６結合を有する末端シアル酸残基を認識するＳＮＡを用いたレクチン
ブロットによって確認された。

骨髄由来マクロファージの適合移植
骨髄細胞がＤＣ－ＳＩＧＮｔｇまたはＳＩＧＮＲ１^－／－マウスの脛骨および大腿骨か
ら流出され、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、ＩＬ－３（５ｎｇ／
ｍＬ、ペプロテック）およびＭ－ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ、ペプロテック）が補充されたＲ
ＰＭＩ１６４０増殖培地で、非組織培養処理された１０－ｃｍプレート中に播種された。
３７℃での一晩インキュベーション後、非接着細胞が回収され、ＩＬ－３／Ｍ－ＣＳＦ補
充ＲＰＭＩ増殖培地を入れた非組織培養処理された１０－ｃｍプレートに移され、３７℃
で５～７日間培養された。成熟したマクロファージはトリプシン処理され、６－ウェルプ
レートに２×１０^６細胞／ウェルの密度で播種され、一晩付着させられた。翌日、マクロ
ファージは、表示された（ｉｎｄｉｃａｔｅｄ）組換えＦｃ調製物と共に、３７℃で３０
分間パルスされた（ｐｕｌｓｅｄ）。細胞は回収され、冷ＰＢＳで洗浄され、１×１０^６
細胞が野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスへ静脈内投与された。注射一時間後、レシピエントマ
ウスは、Ｋ／ＢｘＮ血清を負荷された（ｃｈａｌｌｅｎｇｅｄ）。

可溶性ヒトＤＣ－ＳＩＧＮの発現および精製
ヒトＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のｃＤＮＡ配列を含むプラスミドは、
Ｋ．ドリッカマー（Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ）によって提供された。ＤＣ－ＳＩＧＮ ＥＣＤ
をコードする配列は、標準的なＰＣＲ技術によりＮ末端ｓｔｒｅｐタグを導入するために
改変され、ｐＥＴ２８ｂ（＋）にライゲーションされた。ｐＥＴ２８ｂ－ｓｔｒｅｐＤＣ
ＳＩＧＮは大腸菌株ＢＬ２１／ＤＥ３に形質転換され、細菌培養物がＯＤ_６００ ０．７
～０．８に達するまで、３７℃で３ＬのＴＢ増殖培地中で増殖させられた。タンパク質発
現が１００ｍｇ／ＬのＩＰＴＧの添加によって誘導され、培養物は３７℃で３．５時間イ
ンキュベートされた。細菌は、４℃で１０分間４０００ｘｇの遠心分離によってペレット
化された。細菌ペレットは、１０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．８の中に再懸濁され、超
音波処理により溶解させられた。封入体は、４℃で１５分間１０，０００ｘｇの遠心分離
によってペレット化され、１００ｍＬの６Ｍグアニジン－ＨＣｌ；１００ｍＭトリス－Ｈ
Ｃｌ、ｐＨ７．８；０．２％ＴＲＩＴＯＮ Ｘ－１００に溶解させられた。粒子状物質は
４℃で３０分間２０，０００ｘｇの遠心分離によって除去され、上清画分は２５０ｍＭ
ＮａＣｌ；２５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．８；２５ｍＭ ＣａＣｌ_２に対して透析さ
れた。透析後、不溶性の沈殿物が４℃で３０分間２０，０００ｘｇの遠心分離によって除
去され、上清画分は、ｓｔｒｅｐタグ化ＤＣ－ＳＩＧＮ ＥＣＤをプルダウンするために
ｓｔｒｅｐ－ｔａｃｔｉｎ樹脂（ノバジェン）に適用された。結合したタンパク質は、製
造業者（ノバジェン）によって供給される溶出緩衝液で樹脂から溶出させられた。画分は
ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析され、陽性画分は混合され、活性受容体を選択するために
マンノース－アガロースカラム上にロードされた。ＤＣ－ＳＩＧＮ ＥＣＤは、２５０ｍ
Ｍ ＮａＣｌ；２５ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．８；５ｍＭ ＥＤＴＡで溶出された。
画分は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析された。

表面プラズモン共鳴
可溶性ｈＤＣ－ＳＩＧＮまたはｈＦｃγＲへの種々の組換えＦｃ調製物の相互作用を測
定するため、定常状態親和性測定（ｓｔｅａｄｙ－ｓｔａｔｅ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｍｅ
ａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ）が、ビアコアＴ１００センサーで記録された。ＮａＯＡｃ ｐＨ
５．０中で２０～５０μｇ／ｍＬに希釈された受容体は、標準的なアミンカップリングに
より、高密度（２０００ＲＵ）でＣＭ５チップ上に固定化された。ｈＤＣ－ＳＩＧＮの相
互作用については、インジェクションは、ｐＨ９．０に調整され２ｍＭ ＣａＣｌ_２およ
び５００ｍＭ ＮａＣｌが補充された市販のＨＢＳ－Ｐ＋緩衝液により、２０μＬ／分の
流速で行われた。ｈＦｃγＲ相互作用については、インジェクションは、市販のＨＢＳ－
ＥＰ＋緩衝液により、２０μＬ／分の流速で行われた。表面は、５０ｍＭ ＮａＯＨの短
いパルスにより再生された。Ｋ_ｄ値は、ビアコア評価（Ｂｉａｃｏｒｅ Ｅｖａｌｕａｔ
ｉｏｎ）ソフトウェアを用いて対照フローセルへのバックグラウンド結合を差し引いた後
に算出された。

ＲＴ－ＰＣＲ
総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙミニキット（キアゲン）を用いて骨髄由来マクロファージか
ら抽出された。１μｇの総ＲＮＡが、ＯｎｅＳｔｅｐ ＲＴ－ＰＣＲキット（キアゲン）
を用いたＲＴ－ＰＣＲによりＩＬ－３３ ｍＲＮＡ発現を分析するために、用いられた。
ＧＡＰＤＨの発現が、ローディングコントロールとしての役割を果たした。ｍＩＬ－３３
についてのＰＣＲプライマーは、５’－ｇａａｇａｔｃｃｃａａｃａｇａａｇａｃｃ－３
’（配列番号：６）および５’－ｔｔｃｃｇｇａｇｇｃｇａｇａｃｇｔｃａｃ－３’（配
列番号：７）；であり、ならびに、ｍＧＡＰＤＨについてのＰＣＲプライマーは、５’－
ｇｃｃｇｃｃｔｇｇａｇａａａｃｃｔｇｃ－３’（配列番号：８）および５’－ｔｇａｇ
ｇｔｃｃａｃｃａｃｃｃｔｇｔｔｇ－３’（配列番号：９）であった。ＰＣＲ条件は、９
４℃、３０秒間；５５℃、３０秒間、；７２℃、６０秒間×３５サイクル（ＩＬ－３３）
または２５サイクル（ＧＡＰＤＨ）であった。

実施例２： α２，６－結合シアル酸は、組換えヒトＩｇＧ１ ＦｃにＤＣ－ＳＩＧＮ
結合活性を与えた
ＩＶＩＧ調製物中の抗体の少数集団（ｍｉｎｏｒ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）が、自己抗
体により誘導される炎症を抑制する。これらの抗体はＦｃグリカン上に末端α２，６－結
合シアル酸を含み、辺縁帯マクロファージ上のＳＩＧＮＲ１、またはそのヒト相同分子種
、骨髄細胞上のＤＣ－ＳＩＧＮに結合することによって、抗炎症反応を媒介する。

ＤＣ－ＳＩＧＮに対するｓＦｃの相互作用を研究するため、ＤＣ－ＳＩＧＮの細胞外ド
メイン（ＤＣ－ＳＩＧＮ ＥＣＤ）の可溶性形態が細菌から精製され、ＣＭ５チップ上に
固定化された。ｓＦｃは、全長ＩＤＥＣ－１１４抗体から調製され、インビトロでシアル
化され（図１ｂ）、ＤＣ－ＳＩＧＮが接合された（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）表面に特異的
に結合された（図１ａ）。定常状態親和性測定が実施され、この相互作用のＫ_Ｄ値は～１
．３×ｌ０^－６Ｍと計算された（図１ｃ）。対照的に、ＩＤＥＣ－１１４ Ｆｃの非シア
ル化（ａｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）糖型はＤＣ－ＳＩＧＮへの結合活性を示さず、ＤＣ－Ｓ
ＩＧＮ結合部位を露出するためのＦｃ骨格上のコンフォメーション変化を、このシアル化
が誘導することを、示唆している。

図１ａに示されるように、組換えα２，６－ｓＦｃが可溶性ＤＣ－ＳＩＧＮに結合する
ことが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されて見出された。Ｆｃは、全長ヒ
トモノクローナルＩｇＧ１抗体（ＩＤＥＣ－１１４）のパパイン切断により調製され、続
けてインビトロでガラクトシル化およびシアル化反応がされた。実施例１で説明されたよ
うに、固定化ＤＣ－ＳＩＧＮに結合する抗体についてのＳＰＲセンサーグラムが、ｈＩｇ
Ｇ１ Ｆｃのシアル化およびガラクトシル化糖型について示されている。ＤＣ－ＳＩＧＮ
ＥＣＤ上を流れるＦｃ濃度は、３～０．８μΜの範囲であることが見出された。図１ｂ
に示されるように、ＳＮＡによるレクチンブロットは、Ｆｃ上で２，６－結合を有するシ
アル酸の接続を確認した（上部パネル）；クーマシー染色されたローディングコントロー
ルは、下部パネルに示された。ＤＣ－ＳＩＧＮに対するｓＦｃの結合の定常状態Ｋ_Ｄ測定
は（ａに示されるように。）、ビアコア評価ソフトウェアによって算出された。

実施例３ Ｆｃ－グリカン相互作用を破壊する変異は、組換えヒトＩｇＧ１ ＦｃにＤ
Ｃ－ＳＩＧＮ結合活性を与えた
Ａｓｎ^２９７に接続するコアオリゴ糖は、Ｆｃのアミノ酸骨格と広範な非共有結合相互
作用を形成する。コアグリカンに接続した異なる糖残基によってもたらされるＦｃのコン
フォメーション変化は、これらのタンパク質－糖質相互作用によって媒介される。Ｆｃ骨
格とグリカン残基との重要な接触点を無効にするアラニン置換は、ＤＣ－ＳＩＧＮ結合活
性を授けるように見える。

図２Ａに示されるように、ＦＡ２４１およびＦＡ２４３変異は、インビトロ酵素処理せ
ずにＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を呈する。見かけのＫ_Ｄ値は、ＦＡ２４１についての６×１
０^－７Ｍから、ＦＡ２４３についての３×１０^－７Ｍの範囲である。以前の報告では、哺
乳類細胞で発現された場合、これらの変異は、おそらくグリカンが糖転移酵素にさらに接
近しやすくすることにより、抗体のシアル化を高めることを示している。これを検証する
ため、ＤＣ－ＳＩＧＮへのＦＡ２４１およびＦＡ２４３の結合が一過性に発現したタンパ
ク質の増加したシアル化によるものであるかどうかを測定するため、レクチンブロットが
実施された。図２Ｂに示されるように、ＳＮＡブロットは精製されたＦＡ２４１およびＦ
Ａ２４３中に末端シアル酸残基を検出せず、このことはＤＣ－ＳＩＧＮ相互作用がシアル
酸修飾とは無関係であったことを示す。

より具体的には、ＩｇＧ１ Ｆｃのアミノ酸骨格に沿ってＦ２４１、Ｆ２４３、Ｄ２６
５、およびＲ３０１残基は、オリゴ糖残基との非共有相互作用を破壊するためにアラニン
に置換された。Ｆｃが発現させられ、２９３Ｔ細胞から精製され、上述のように表面プラ
ズモン共鳴によってＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性について分析された。変異ＦＡ２４１または
ＦＡ２４３を備えるＦｃは、ｓＦｃについての親和性測定と比較して、ＤＣ－ＳＩＧＮに
対する増加した親和性を呈すことが見出された（図１ａ）。ＥＣＬ（図１ｂ、中央パネル
）およびＳＮＡ（上部パネル）を用いたレクチンブロットが、２９３Ｔ細胞から精製され
たＦｃ上の末端糖部分を測定するために実施された。シアル化Ｆｃの陽性対照として、図
１ａに説明されているようにＦＡ２４１がインビトロでシアル化された。クーマシー染色
されたローディングコントロールが、図１ｂの下部パネルに示されている。

実施例４ ｈＩｇＧ１ ＦｃにおけるＦＡ２４１変異は、α２，６ｓＦｃの抗炎症活性
を反復した（ｒｅｃａｐｉｔｕｌａｔｅｄ）
ＦＡ２４１およびＦＡ２４３変異がｓＦｃのＤＣ－ＳＩＧＮ結合活性を模倣するのであ
れば、これらの変異がインビボでのｓＦｃの抗炎症活性を再現できるのか調べるため、ア
ッセイが実施された。年齢および性別が一致させられたＳＩＧＮＲ１^－／－とｈＤＣ－Ｓ
ＩＧＮ^＋／ＳＩＧＮＲ１^－／－マウスは、関節炎Ｋ／ＢｘＮ血清で負荷され、０．０３３
ｇ／ｋｇの有効用量でｓＦｃ、ＦＡ２４１、またはＦＡ２４３で治療された。これまでの
知見と一致して、ｓＦｃはＤＣ－ＳＩＧＮ^＋マウスの足底が腫れることを抑制したが、Ｓ
ＩＧＮＲ１^－／－では抑制されなかった。同様に、ＦＡ２４１は、ｈＤＣ－ＳＩＧＮ^＋／
ＳＩＧＮＲ１^－／－マウスにおいてｓＦｃのそれに匹敵する抗炎症活性を示した。ＦＡ２
４３が投与されたマウスは、関節炎の低下を示さなかった。これらの知見は、Ｆ_２４１Ａ
変異（ＦＡ２４１）を有する組換えＦｃが、シアル酸修飾無しで、ｓＦｃのＤＣ－ＳＩＧ
Ｎ結合および抗炎症活性を再現することを示唆している。

図３に示しているように、ｈＤＣ－ＳＩＧＮ^＋／ＳＩＧＮＲ１^－／－（白四角）および
ＳＩＧＮＲ１^－／－マウス（黒四角）は、静脈内注射により０．７ｍｇ／マウスのｓＦｃ
、ＦＡ２４１またはＦＡ２４３が投与された。マウスは、続いて、１時間後にＫ／ＢｘＮ
血清で負荷された。足底の腫れは、数日間にわたって観察され、スコア化された。既報の
通り、ｓＦｃの抗炎症作用は、ＤＣ－ＳＩＧＮ－依存的（左パネル）である。ＦＡ２４１
もまた、Ｋ／ＢｘＮで負荷されたマウスにおいて、ＤＣ－ＳＩＧＮ－依存的に関節炎を抑
制した。ＦＡ２４３は、６日目において測定の腫れを有意に減少させなかった。群あたり
４－５匹のマウスの臨床スコアの平均およびＳＥＭは、６日目にプロットされた。

実施例５ ＦＡ２４１抗炎症活性についての必要条件の特徴づけ
ＦＡ２４１の抗炎症活性についての決定要因を特定するため、ＣＤ１１ｃ．ＤＣ－ＳＩ
ＧＮ^＋およびＳＩＧＮＲ１^－／－マウスからの骨髄由来マクロファージ（ΒΜΜΦ）はＦ
Ａ２４１または他のＦｃ調製物で刺激され、Ｋ／ＢｘＮ血清で負荷されたＷＴ Ｃ５７Ｂ
Ｌ／６レシピエントマウスに移植された。

つまり、ＣＤ１１ｃ．ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋およびＳＩＧＮＲ１^－／－マウスからの骨髄由
来マクロファージは、ＩＬ－３（５ｎｇ／ｍＬ）およびＭ－ＣＳＦ（５ｎｇ／ｍＬ）中で
５～７日間培養された。図４に示されるように、ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋ΒΜΜΦは、０．５ｍ
ｇ／ｍＬの表示されたＦｃ調製物の非シアル化（黒棒）またはシアル化（白棒）糖型と共
にパルスされた。Ｆｃ－処置ΒΜΜΦは、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスに移
植され、続けてＫ／ＢｘＮ負荷が行われた。図４ｂに示されるように、ＳＩＧＮＲ１^－／
－（黒棒）およびＤＣ－ＳＩＧＮ^＋（白棒）ΒΜΜΦは、０．５ｍｇ／ｍＬの表示された
Ｆｃ調製物と共にパルスされ、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスに移植され、続
けてＫ／ＢｘＮ負荷が行われた。同様に、ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋ΒΜΜΦは、０．５ｍｇ／ｍ
ＬのＦＡ２４１もしくは脱グリコシル化ＦＡ２４１（図４ｃ、白棒）またはＰＢＳ（図４
ｃ、黒棒）のいずれかと共にパルスされ、ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスに移
植され、続けてＫ／ＢｘＮ負荷が行われた。ＦＡ２４１はＰＮＧアーゼＦにより脱グリコ
シル化され、グリカン除去はレクチンブロッティングにより確認された。ＤＣ－ＳＩＧＮ
^＋ΒΜΜΦは、表示されたＦｃ調製物またはＰＢＳ（図４ｄ、黒丸）と共にパルスされ、
ＷＴ Ｃ５７ＢＬ／６レシピエントマウスに移植され、続けてＫ／ＢｘＮ負荷が行われた
。全ての場合において、足底の腫れは、数日間にわたって観察され、スコア化された。群
あたり４～５匹のマウスの臨床スコアの平均およびＳＥＭがプロットされる。^＊Ｐ＜０．
０５、分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定され、続けてテューキーポストホックテスト
が行われた。

図４Ａに示されるように、非シアル化またはシアル化ＦＡ２４１調製物は、ｓＦｃと比
べて、関節炎を抑制することに同様に有効であった。しかしながら、非シアル化ＷＴ Ｆ
ｃでパルスされたＤＣ－ＳＩＧＮ^＋ΒΜΜΦが、レシピエントマウスへ保護（ｐｒｏｔｅ
ｃｔｉｏｎ）を移植（ｔｒａｎｓｆｅｒ）しなかったことから、ＷＴ Ｆｃ調製物はα２
，６－結合シアル酸を必要とした。図３に示された結果と一致し、ｓＦｃおよびＦＡ２４
１の両方ともに、保護を移植するためにはΒΜΜΦ上でのＤＣ－ＳＩＧＮ発現を必要とし
た（図４Ｂ）。ＦＡ２４１は保護を移植するためにシアル酸を必要としないが、ＰＮＧア
ーゼＦによる脱グリコシル化がＦＡ２４１の抗炎症性を無効化したことは（図４Ｃ）、Ｆ
ｃグリカンが依然として必要であることを示唆している。さらに、観察された抗炎症活性
がＦ_２４１Ａ変異に特異的であることを示すため、ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋ΒΜΜΦは、高めら
れたＤＣ－ＳＩＧＮ結合を付与しない代替的変異を有するＦｃと共に、パルスされた。Ｆ
Ａ２４１刺激されたΒΜΜΦのみが、Ｋ／ＢｘＮ負荷されたレシピエントマウスを保護し
た。

実施例６ ＦＡ２４１変異はＦｃγ受容体結合を増強した
２４１位でのアラニン置換がＦｃにおいてコンフォメーション変化を誘導するのであれ
ば、おそらくヒトＦｃγ受容体に対する親和性が変更される。シアル化がＦｃγＲに対す
るＩｇＧの親和性を減少させ、結果として、インビボでのＡＤＣＣ活性を減弱させること
が、以前に報告された。

組換えＩｇＧ１ Ｆｃの可溶性ＦｃγＲへの結合は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に
よって測定された。Ｆｃは、上述した方法で調製された。固定化ｈＦｃγＲＩＩＡ_{１３１
Ｒ}およびｈＦｃγＲＩＩＢに対して抗体が結合することについてのＳＰＲセンサーグラム
が、ＷＴ ｈＩｇＧ１ Ｆｃの非シアル化およびシアル化糖型について、ならびに非シア
ル化ＦＡ２４１ Ｆｃについて、図５に示されている。

図５に示されるように、ＷＴ Ｆｃの非シアル化糖型が、～２－３×１０^－５Ｍの観測
されたＫ_Ｄ値でｈＦｃγＲＩＩＡおよびＲＩＩＢに結合した。ｓＦｃはしかしながら、ｈ
ＦｃγＲＩＩＡまたはＲＩＩＢのいずれかにも結合しないようであった。驚くべきことに
、ＦＡ２４１は、一桁分強い親和性（Ｋ_Ｄ＝～２×１０^－６Ｍ）でｈＦｃγＲＩＩＡとＲ
ＩＩＢの両方に結合すると思われる。

実施例７ ＦＡ２４１による、骨髄由来マクロファージにおけるＩＬ－３３ ｍＲＮＡ
誘導
ｓＦｃは、制御性（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ）マクロファージ上のＦｃγＲＩＩＢをアッ
プレギュレートするために、ＦｃεＲＩ^＋白血球集団、おそらく好塩基球からのＩＬ－４
分泌を必要とするＴ_Ｈ２－依存性の抗炎症パスウェイを、誘導する。インビボまたはイン
ビトロにおいて、ＩＬ－３３の投与は、好塩基球を刺激してＩＬ－４の蓄えを放出させる
。ＩＬ－３３ ｍＲＮＡ発現は、ｓＦｃまたはＩＶＩＧによって処理されたＷＴ Ｃ５７
ＢＬ／６マウスの脾臓中でアップレギュレートされるが、ＳＩＧＮＲ１^－／－マウスでは
されない。これは、ｓＦｃがＳＩＧＮＲ１^＋またはＤＣ－ＳＩＧＮ^＋細胞においてＩＬ－
３３発現を誘導する可能性を示唆している。この実施例においては、アッセイが実施され
、ＦＡ２４１によってＤＣ－ＳＩＧＮ^＋ΒΜΜΦを刺激すると、ＩＬ－３３発現をアップ
レギュレートすると思われることを示す。

より具体的には、ＣＤ１１ｃ．ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋およびＳＩＧＮＲ１^－／－マウスから
の骨髄由来マクロファージは、上述の方法で培養された。ΒΜΜΦは、無血清ＲＰＭＩ培
地中で１２－ウェルプレートに播種され、３７℃で一晩接着させられた。翌日、細胞は、
３７℃で１時間（図６ａ）または４時間（図６ｂ）、無血清ＲＰＭＩ培地中の０．５ｍｇ
／ｍＬの表示されたＦｃと共にパルスされた。ｍＲＮＡが特定の時点で細胞から採取され
、１μｇ総ＲＮＡがＩＬ－３３ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲ増幅のために使用された（上部
パネル）。ＧＡＰＤＨ増幅が、ローディングコントロールとしての役割を果たした（下部
パネル）。ＤＡ２６５ Ｆｃおよびヒトシアル酸転移酵素（ＳＴ６Ｇａｌ１）を共発現す
るプラスミドは、高度にシアル化された組換えＦｃ（ＳＴ６－ＤＡ２６５）を生産する２
９３Ｔ細胞に形質転換された。

図６に示されるように、ＦＡ２４１によってＤＣ－ＳＩＧＮ^＋ΒΜΜΦを刺激すると、
ＩＬ－３３発現をアップレギュレートするように思われる。ＤＣ－ＳＩＧＮ^＋ΒΜΜΦと
比べてＩＬ－３３の基底発現レベルがより大きいにもかかわらず、ＳＩＧＮＲ１^－／－Β
ΜΜΦは、ＦＡ２４１処理に応答してＩＬ－３３ ｍＲＮＡ発現をダウンレギュレートし
た。

好ましい実施形態の上記実施例および説明は、特許請求の範囲によって定義される本発
明を限定するものというより、例示するものとして解釈されるべきである。本明細書で引
用された全ての刊行物は、その全体が本明細書中に参照によって組込まれる。容易に理解
されるように、上述した特徴の多数の変形および組み合わせは、特許請求の範囲に記載の
本発明から逸脱することなく利用されることができる。そのような変形は、本発明の範囲
からの逸脱とはみなされず、全てのそのような変形は、以下の特許請求の範囲内に含まれ
ることが意図される。

Claims (16)

1. 配列番号：１に対して少なくとも９０％の同一性を有する改変配列を含むＩｇＧ Ｆｃ領域を有する、単離された抗体、またはその抗原結合部分であって、配列番号１のＦ３２（ＫａｂａｔシステムにおけるＦｃ ｈＩｇＧ１のＦ２４１）に対応する位置で置換を有し、前記置換はＡであり、前記抗体、またはその抗原結合部分は配列番号：１の配列を含む非シアル化親抗体のものよりも高い抗炎症活性を有する、単離された抗体、またはその抗原結合部分。
2. 前記改変配列はシアル化されていない、請求項１に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
3. ＤＣ－ＳＩＧＮに結合する能力を有する、請求項１または２に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
4. ｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する、請求項１～３のいずれか１項に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
5. ２×１０^－５Ｍ以下のＫ_Ｄ（すなわち、５．０×１０^４Ｍ^－１以上のＫ_Ａ）でｈＦｃγＲＩＩＡまたはｈＦｃγＲＩＩＢに結合する能力を有する、請求項１～４のいずれか１項に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
6. 前記改変配列が配列番号：２と少なくとも９５％の同一性を有する、請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
7. 前記改変配列が配列番号：２と少なくとも９９％の同一性を有する、請求項６に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
8. 前記改変配列が配列番号：２を含む、請求項７に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
9. 前記改変配列が配列番号：２からなる、請求項８に記載の単離された抗体、またはその抗原結合部分。
10. 請求項１～９のいずれかに記載の前記抗体、またはその抗原結合部分をコードする配列を含む、単離された核酸。
11. 請求項１０に記載の核酸を含む発現ベクター。
12. 請求項１０に記載の核酸を含む宿主細胞。
13. 前記抗体、またはその抗原結合部分の発現を可能にする条件下で培地中で抗体、またはその抗原結合部分をコードする配列を含む核酸を含む宿主細胞を培養すること、および前記培養した細胞または前記細胞の前記培地から前記抗体、またはその抗原結合部分を精製することを含む、請求項１～９のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合部分を製造する方法。
14. （ｉ）請求項１～９のいずれかに記載の前記抗体、またはその抗原結合部分または請求項１０に記載の核酸、ならびに（ｉｉ）薬学的に許容される担体、を含む医薬製剤。
15. 請求項１～９のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合部分または請求項１０に記載の核酸の治療上の有効量を含む、炎症性疾患を治療する薬剤。
16. 炎症性疾患を治療するための医薬の製造における、請求項１～９のいずれかに記載の抗体、またはその抗原結合部分または請求項１０に記載の核酸の使用。

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