EA044897B1 - Несиалированный выделенный полипептид, способ получения указанного полипептида и фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания - Google Patents
Несиалированный выделенный полипептид, способ получения указанного полипептида и фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания Download PDFInfo
- Publication number
- EA044897B1 EA044897B1 EA201892339 EA044897B1 EA 044897 B1 EA044897 B1 EA 044897B1 EA 201892339 EA201892339 EA 201892339 EA 044897 B1 EA044897 B1 EA 044897B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- polypeptide
- nucleic acid
- seq
- sign
- expression
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 79
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 76
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 76
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 title claims description 16
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 9
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 9
- 108010037897 DC-specific ICAM-3 grabbing nonintegrin Proteins 0.000 claims description 48
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 43
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 16
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 12
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 6
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 4
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 3
- NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 1-methylethyl 11-methoxy-3,7,11-trimethyl-2,4-dodecadienoate Chemical compound COC(C)(C)CCCC(C)CC=CC(C)=CC(=O)OC(C)C NFGXHKASABOEEW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 claims description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 44
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 25
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 22
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 17
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 17
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 17
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 16
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 15
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 14
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 14
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 12
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 10
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 10
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 238000002198 surface plasmon resonance spectroscopy Methods 0.000 description 8
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 8
- 238000011740 C57BL/6 mouse Methods 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102100021992 CD209 antigen Human genes 0.000 description 6
- 101000897416 Homo sapiens CD209 antigen Proteins 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 6
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 6
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 6
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 6
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 6
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 6
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 5
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 5
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 4
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 3
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 3
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 208000029523 Interstitial Lung disease Diseases 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 3
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 3
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- -1 polyoxyethylene Polymers 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 3
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N (+/-)-1,3-Butanediol Chemical compound CC(O)CCO PUPZLCDOIYMWBV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 2
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N D-mannomethylose Natural products CC1OC(O)C(O)C(O)C1O SHZGCJCMOBCMKK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 2
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N Fucose Natural products C[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)C=O PNNNRSAQSRJVSB-SLPGGIOYSA-N 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 2
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N L-fucopyranose Chemical compound C[C@@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O SHZGCJCMOBCMKK-DHVFOXMCSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 2
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 2
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 2
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 2
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 2
- 230000003286 arthritogenic effect Effects 0.000 description 2
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 2
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 2
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 108091008042 inhibitory receptors Proteins 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- 208000018937 joint inflammation Diseases 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 2
- 150000002482 oligosaccharides Polymers 0.000 description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000000770 proinflammatory effect Effects 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- 238000011816 wild-type C57Bl6 mouse Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000002874 Acne Vulgaris Diseases 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010058284 Allergy to arthropod sting Diseases 0.000 description 1
- 206010002198 Anaphylactic reaction Diseases 0.000 description 1
- 206010002556 Ankylosing Spondylitis Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010063836 Atrioventricular septal defect Diseases 0.000 description 1
- 208000008439 Biliary Liver Cirrhosis Diseases 0.000 description 1
- 208000033222 Biliary cirrhosis primary Diseases 0.000 description 1
- TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N CMP-N-acetyl neuraminic acid Natural products O1C(C(O)C(O)CO)C(NC(=O)C)C(O)CC1(C(O)=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N CMP-N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound O1[C@@H]([C@H](O)[C@H](O)CO)[C@H](NC(=O)C)[C@@H](O)C[C@]1(C(O)=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(N=C(N)C=C2)=O)O1 TXCIAUNLDRJGJZ-BILDWYJOSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- 241000938605 Crocodylia Species 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- 206010011686 Cutaneous vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000192700 Cyanobacteria Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- 206010013700 Drug hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016228 Fasciitis Diseases 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108700023372 Glycosyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 208000030836 Hashimoto thyroiditis Diseases 0.000 description 1
- 241000282418 Hominidae Species 0.000 description 1
- 201000009794 Idiopathic Pulmonary Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000034624 Leukocytoclastic Cutaneous Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 208000032514 Leukocytoclastic vasculitis Diseases 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 208000001940 Massive Hepatic Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 108010046068 N-Acetyllactosamine Synthase Proteins 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N N-acelyl-D-glucosamine Natural products CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O OVRNDRQMDRJTHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N N-acetyl-beta-D-glucosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-FMDGEEDCSA-N 0.000 description 1
- MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N N-acetylglucosamine Natural products CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO MBLBDJOUHNCFQT-LXGUWJNJSA-N 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 208000012654 Primary biliary cholangitis Diseases 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000001263 Psoriatic Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036824 Psoriatic arthropathy Diseases 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 240000003152 Rhus chinensis Species 0.000 description 1
- 235000014220 Rhus chinensis Nutrition 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003838 Sialyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000141 Sialyltransferases Proteins 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N UDP-alpha-D-galactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-ABVWGUQPSA-N 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 1
- 206010047112 Vasculitides Diseases 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 206010047124 Vasculitis necrotising Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 206010000496 acne Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000002029 allergic contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002917 arthritic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001106 artificial yeast chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 1
- 201000009564 autosomal recessive limb-girdle muscular dystrophy type 2A Diseases 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000008119 colloidal silica Substances 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000022811 deglycosylation Effects 0.000 description 1
- 201000001981 dermatomyositis Diseases 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001211 electron capture detection Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 201000009580 eosinophilic pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 201000001155 extrinsic allergic alveolitis Diseases 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000019634 flavors Nutrition 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 108010074605 gamma-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- 102000045442 glycosyltransferase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700014210 glycosyltransferase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000022098 hypersensitivity pneumonitis Diseases 0.000 description 1
- 201000006362 hypersensitivity vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 208000036971 interstitial lung disease 2 Diseases 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007919 intrasynovial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 206010028417 myasthenia gravis Diseases 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229950006780 n-acetylglucosamine Drugs 0.000 description 1
- 230000031990 negative regulation of inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 208000005987 polymyositis Diseases 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 201000009732 pulmonary eosinophilia Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000004700 rosacea Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 238000012868 site-directed mutagenesis technique Methods 0.000 description 1
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002311 subsequent effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Description
Перекрестная ссылка на связанные заявки
Это заявка заявляет приоритет предварительной заявки США № 61/577361 от 19 декабря 2011 г.
Содержание заявки включено в данный документ ссылкой в полном объеме.
Государственные капиталовложения
Изобретение, раскрытое в данном документе, было проведено, по меньшей мере, частично при поддержке государственного гранта № NIH AI035875 Национального института здравоохранения. Соответственно США обладают определенными правами на данное изобретение.
Область техники
Изобретение относится к противовоспалительным агентам, композициям и способам лечения воспалительных расстройств.
Уровень техники
Воспалительные расстройства, включающие аутоиммунные заболевания, представляют собой расстройства, включающие аномальную активацию и последующую миграцию лейкоцитов в пораженные области организма. Эти условия охватывают широкий спектр болезней, которые влияют на жизни миллионов людей по всему миру. Хотя в настоящее время доступны различные методы лечения, многие из них обладают значительными побочными эффектами или не очень эффективны в ослаблении симптомов. Таким образом, существует необходимость получения противовоспалительных агентов для лечения воспалительных расстройств, и существует необходимость в разработке методов идентификации и оценки таких агентов.
Давно известно, что иммуноглобулин G (IgG) опосредует как про-, так и противовоспалительные активности посредством взаимодействий, опосредованных его Fc-фрагментом. В то время как взаимодействия Fc-FcyR отвечают за провоспалительные свойства иммунных комплексов и цитотоксических антител, внутривенный гамма-глобулин (IVIG) и его Fc-фрагменты являются противовоспалительными и широко используются для подавления воспалительных заболеваний. Предполагалось, что гликозилирование IgG является критическим для регуляции цитотоксичности и воспалительного потенциала IgG. Например, предполагали, что противовоспалительная активность IVIG является свойством Fc-фрагмента и его связанного гликана, требующего концевых связей а-2,6-сиаловой кислоты, выявляющих совместное требование для специфичного полипептидного остова и структуры гликана, необходимое для иммуносупрессии. (Anthony, et al., 2008, Science 320: 373-376 и WO 2007/117505).
Однако только минорная популяция IgG в IVIG содержит гликаны, терминированные α-2,6сиаловыми кислотами (sFc), и имеет противовоспалительную активность. В результате, для супрессии воспаления, вызванного аутоантителами, во множестве клинических случаев специалисту следует вводить IVIG в высоких дозах (1-2 г/кг) для обогащения сиалированных IgG, или другим способом повышая сиалирование IgG (заявки США № 20080206246 и 20090004179, и Nimmerjahn et al. Annu Rev Immunol 26, 513-533 (2008)).
Настоящее изобретение направлено на решение вышеупомянутых проблем путем идентификации противовоспалительных полипептидов, свободных от сиалирования.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к агентам, таким как полипептиды и антитела, и к способам лечения воспалительных расстройств, например, аутоиммунных заболеваний.
Соответственно один аспект данного изобретения характеризует выделенный полипептид, включающий модифицированную последовательность, которая, по меньшей мере, на 75% (например, любое число между 75 и 100%, включая, например, 70, 80, 85, 90, 95, 99 и 100%) идентична последовательности Fc-участка IgG. Модифицированная последовательность свободна от сиалирования, и полипептид обладает противовоспалительной активностью, которая выше, чем противовоспалительная активность исходного полипептида. Исходный полипептид может включать Fc-участок IgG, такой как последовательность SEQ ID NO: 1, приведенная ниже. В некоторых воплощениях полипептид обладает способностью связываться с DC-SIGN, и связываться с hFcyRIIA или RIIB. В одном воплощении выделенный полипептид обладает способностью связываться с hFcyRIIA или RIIB при KD 2x10’5 М или ниже (то есть KA 5х104 М-1 или выше). Предпочтительно модифицированная последовательность содержит замену на аланин или консервативную аминокислоту в положении, соответствующем F241. Модифицированная последовательность может быть, по меньшей мере, на 75% (например, любое число между 75 и 100%, включая, например, 70, 80, 85, 90, 95, 99 и 100%) идентична SEQ ID NO: 2. В некоторых примерах модифицированная последовательность включает или по существу состоит из SEQ ID NO: 2.
В другом аспекте изобретение предоставляет способ получения полипептида, обладающего противовоспалительной активностью. Среди прочего способ включает стадии предоставления исходного полипептида, который на 75% идентичен Fc-участку hIgG1 с последовательностью SEQ ID NO: 1, или первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный полипептид; и модификации исходного полипептида с получением модифицированного полипептида, последовательность которого свободна от сиалирования и имеет замену на аланин или консервативную аминокислоту в положении, соответствующем F241 последовательности SEQ ID NO: 1 согласно системе нумерации Kabat. Стадия
- 1 044897 модификации может проводиться путем модификации первой последовательности нуклеотидов с получением второй последовательности нуклеотидов, кодирующей модифицированный полипептид. Изобретение также предоставляет полипептид, полученный только что описанным способом.
В третьем аспекте изобретение характеризует выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, кодирующую полипептид, описанный выше, экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту, и клетку-хозяина, включающую нуклеиновую кислоту. Изобретение также характеризует способ получения полипептида. Способ включает культивирование клетки-хозяина в среде при условиях, дающих возможность экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, и очистку полипептида из культивируемой клетки или из культуральной среды.
В четвертом аспекте в изобретении характеризуется фармацевтическая композиция, включающая (i) полипептид или нуклеиновую кислоту, описанные выше, и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
В пятом аспекте в изобретении предлагается способ лечения воспалительного заболевания. Способ включает введение нуждающемуся в этом объекту терапевтически эффективного количества вышеописанного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Также предлагается применение полипептида или нуклеиновой кислоты в производстве лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания. Изобретение также характеризует выделенный полипептид, нуклеиновую кислоту, экспрессирующий вектор, клетку-хозяина, композицию или способ лечения воспалительного заболевания, по существу как представлено и описано ниже.
Подробности одного или нескольких воплощений изобретения изложены в представленном ниже описании. Другие признаки, субъекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания и из формулы изобретения.
Описание чертежей
Фиг. 1a-с представляют собой диаграммы и фотографии, демонстрирующие, что а-2,6-связанная сиаловая кислота придает DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc.
Фиг. 2a-b представляют собой диаграммы фотографии, демонстрирующие, что нарушение взаимодействий Fc-гликана придает DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc.
Фиг. 3 представляет собой набор диаграмм, демонстрирующих, что мутация FA241 в hIgG1 Fc суммирует противовоспалительную активность α-2,6 sFc.
Фиг. 4a-d представляют собой диаграммы, демонстрирующие отличительные черты противовоспалительной активности FA241.
Фиг. 5 представляет собой набор диаграмм, демонстрирующих, что мутация FA241 повышает связывание Fcy с рецептором.
Фиг. 6а-b представляют собой фотографии, демонстрирующие индуцирование IL-33 мРНК с помощью FA241 в макрофагах, выделенных из костного мозга.
Подробное описание
Данное изобретение основано, по меньшей мере, частично на неожиданном обнаружении того, что несиалированные варианты IgG Fc придают противовоспалительную активность и имитируют эффект 2,6-сиалированных Fc в качестве противовоспалительных медиаторов.
Сиалирование IgG и Fc.
IgG представляет собой основной сывороточный иммуноглобулин. Он представляет собой гликопротеин, состоящий из двух идентичных тяжелых цепей и двух легких цепей, которые в свою очередь состоят из вариабельного и константного домена. IgG содержит единственный N-связанный гликан в Asn297 в СН2-домене на каждой из его двух тяжелых цепей. Ковалентно связанный комплексный углевод состоит из сердцевины, биантеннального пентаполисахарида, содержащего N-ацетилглюкозамин (GIcNAc) и маннозу (man). Дополнительная модификация сердцевинной углеводной структуры наблюдается в сывороточных антителах в присутствии фукозы, разветвленной GIcNAc, галактозы (gal) и концевых компонентов сиаловой кислоты (sa), которые не всегда имеют место. Таким образом, детектировали около 40 различных гликоформ, которые ковалентно присоединены по данному единственному сайту гликозилирования (Fujii et al., J. Biol. Chem. 265, 6009, 1990). Было продемонстрировано, что гликозилирование IgG является существенным для связывания со всеми FcyRs путем поддержания открытой конформации двух тяжелых цепей. Jefferis and Lund, Immune. Lett. 82, 57 (2002), Sondermann et al., J. Mol. Biol. 309, 737 (2001). Считается, что данное гликозилирование IgG для связывания FcyR отвечает за невозможность дегликозилированных IgG-антител опосредовать вызванные in vivo воспалительные реакции, такие как ADCC, фагоцитоз и высвобождение медиаторов воспаления. Nimmerjahn and Ravetch, Immunity 24, 19 (2006). Дополнительные наблюдения того, что индивидуальные гликоформы IgG могут способствовать модулированию воспалительного ответа, подтвердили с помощью различных аффинностей для индивидуальных FcyRs, известных для IgG-антител, содержащих или лишенных фукозы, и с помощью их последующего влияния на цитотоксичность. Shields et al., J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn and Ravetch, Science 310, 1510 (2005). Связь между аутоиммунными состояниями и специфичными профилями гликозилирования IgG-антител наблюдали у пациентов с ревматоидным артритом
- 2 044897 и несколькими аутоиммунными васкулитами, при которых, как сообщалось, имело место пониженное галактозилирование и сиалирование IgG-антител. Parekh et al., Nature 316, 452 (1985), Rademacher et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6123 (1994), Matsumoto et al., 128, 621 (2000), Holland et al., Biochim. Biophys. Acta December 27. Также сообщалось, что вариации IgG-гликоформ ассоциированы с возрастом и с иммунитетом, хотя in vivo значимость этих изменений не определена. Shikata et al., Glycoconj. J. 15, 683 (1998), Lastra, et al., Autoimmunity 28, 25 (1998).
Как обсуждалось в данном документе, неожиданно оказалось, что некоторые несиалированные Fcварианты IgG также придавали противовоспалительную активность. Такие варианты, включающие вариант FA241, характеризуют виды внутри более крупного семейства молекул, которые имитируют структурные и биологические свойства сиалированных Fc, но не требуют сиалирования, и могут быть разработаны в качестве противовоспалительных терапевтических средств.
Полипептиды и нуклеиновые кислоты.
Полипептиды.
Как раскрыто в данном документе, в данном изобретении предлагаются выделенные полипептиды, содержащие последовательности Fc-вариантов IgG, которые лишены полисахаридной цепи, содержащей концевую сиаловую кислоту, связанную с галактозным компонентом посредством а-2,6-связи по вышеупомянутому Asn297. Такие несиалированные Fc-варианты IgG могут быть либо выделенными из природного антитела, либо могут экспрессироваться в клеточной линии.
В одном варианте осуществления изобретения Fc-участок включает одну или более замен в аминокислотной последовательности hIgG1. В частности, типичные Fc-участки IgG1 представлены ниже:
Fc hlgGl (начиная с аминокислоты 210 в системе Rabat):
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEV KFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSD GSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1;
F241 и F243 подчеркнуты)
Fc hlgGl FA241:
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVALFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 2)
Fc hlgGl FA243:
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLAPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSH EDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPI EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
Термины пептид, полипептид и белок используются взаимозаменяемо для описания расположения аминокислотных остатков в полимере. Пептид, полипептид или белок могут состоять из 20 стандартных природных аминокислот дополнительно к редким аминокислотам и к их синтетическим аналогам. Они могут представлять собой любую цепь аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования). Пептид, полипептид или белок по настоящему изобретению включает рекомбинантно или синтетически полученные варианты, содержащие конкретные домены или участки, которые связываются с DC-SIGN, FcyRIIA и FcyRIIB. Термин также охватывает полипептиды, которые содержат добавленный N-концевой метионин (применяемый для экспрессии в прокариотических клетках).
Выделенный полипептид или белок относится к полипептиду или белку, которые отделены от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми они ассоциированы в естественной среде. Полипептид/белок может составлять, по меньшей мере, 10% (то есть любое процентное содержание между 10 и 100%, например, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 и 99%) сухого веса очищенного препарата. Чистота может измеряться с помощью подходящих стандартных методов, например с помощью колоночной хроматографии, электрофореза на полиакриламидном геле или ВЭЖХ. Выделенный полипептид/белок, описанный в изобретении, может быть очищен из природного источника, может быть получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК или с помощью химических методов. Функциональный эквивалент IgG Fc относится к полипептидному производному IgG Fc, например, к участку, содержащему одну или более мутаций, вставок, делеций, укорачиваний, сшитый белок или их комбинации. Он по существу сохраняет активность IgG Fc, то есть способность связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ. Выделенный полипептид может содержать SEQ ID NO: 2. Вообще, функциональный эквивалент, по меньшей мере, на 75% (например, любое число между 75 и 100%, включая, например, 70, 80, 85, 90, 95 и 99%) идентичен SEQ ID NO: 2.
- 3 044897
Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот определяется с использованием алгоритма Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, с модификацией как в Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (версии 2.0) Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Нуклеотидные поиски BLAST могут быть осуществлены с помощью программы NBLAST (сумма баллов =100, размера слова =12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Белковый поиск Blast может быть осуществлен с помощью программы XBLAST (сумма баллов =50, размер слова =3) для получения аминокислотных последовательностей гомологичных белковым молекулам по изобретению. В случае существования пропусков между двумя последовательностями может применяться Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).
Аминокислотный состав полипептида, описанного в данном документе, может варьироваться без нарушения способности полипептида связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ. Например, он может содержать одну или несколько консервативных аминокислотных замен. Консервативная аминокислотная замена представляет собой такую замену, в которой аминокислотный остаток замещается остатком, имеющим похожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), с бета-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный несущественный аминокислотный остаток, например в SEQ ID NO: 2, предпочтительно заменяется на другой аминокислотный остаток из аминокислоты того же семейства боковых цепей. Альтернативно мутации могут вводиться случайным образом по всей последовательности или в ее части, как, например, с помощью насыщенного мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут скринироваться на способность связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ для идентификации мутантов, которые сохраняют активность, как описано ниже в примерах. Полипептид, описанный в данном изобретении, может быть получен в виде рекомбинантного полипептида. Для получения рекомбинантного полипептида нуклеиновая кислота, кодирующая его (например, FA241, SEQ ID NO: 2), может быть связана с другой нуклеиновой кислотой, кодирующей сшитый партнер по взаимодействию, например, глутатион-s-трансферазу (GST), метку 6х-His эпитопа или белок гена 3 М13. Полученная в результате сшитая нуклеиновая кислота экспрессирует в подходящих клеткаххозяевах сшитый белок, который может быть выделен с помощью методов, известных в данной области. Выделенный сшитый белок может быть дополнительно обработан, например, с помощью ферментативного гидролиза для удаления сшитого партнера и с получением рекомбинантного полипептида по настоящему изобретению.
Нуклеиновые кислоты.
Другой аспект изобретения характеризует выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, которая кодирует полипептид или белок, описанный выше. Нуклеиновая кислота относится к молекуле ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекуле РНК (например, мРНК) или к аналогу ДНК или РНК. Аналог ДНК или РНК может быть синтезирован из нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Выделенная нуклеиновая кислота относится к нуклеиновой кислоте, структура которой не идентична структуре любой природной нуклеиновой кислоты или структуре любого фрагмента природной геномной нуклеиновой кислоты. Таким образом, термин охватывает, например, (а) ДНК, которая имеет последовательность части природной геномной молекулы ДНК, но не фланкированной обеими из кодирующих последовательностей, которые фланкируют эту часть молекулы в геноме организма, в котором она присутствует в естественной среде; (b) нуклеиновую кислоту, включенную в вектор или в геномную ДНК прокариотов или эукариотов таким образом, что полученная в результате молекула не идентична любому природному вектору или геномной ДНК; (с) отдельная молекула, такая как кДНК, геномный фрагмент, фрагмент, полученный полимеразной цепной реакцией (ПЦР), или фрагмент рестрикции; и (d) рекомбинантная нуклеотидная последовательность, которая является частью гибридного гена, т.е. гена, кодирующего сшитый белок. Нуклеиновая кислота, описанная выше, может использоваться для экспрессии сшитого белка по настоящему изобретению. Для этой цели специалист может функционально связать нуклеиновую кислоту с подходящими регуляторными последовательностями для генерации экспрессирующего вектора.
Вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую
- 4 044897 кислоту, с которой он связан. Вектор может быть способен к автономной репликации или к интеграции в
ДНК хозяина. Примеры векторов включают плазмиду, космиду или вирусный вектор. Вектор включает нуклеиновую кислоту в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине.
Предпочтительно вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, функционально связанных с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты.
Регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Регуляторные последовательности включают те, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности, а также тканеспецифичные регуляторные и/или индуцируемые последовательности.
Конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии целевого белка или РНК и тому подобное. Экспрессирующий вектор может вводиться в клетки-хозяева с получением полипептида по настоящему изобретению. Промотор определяется как ДНК-последовательность, которая направляет РНК-полимеразу для связывания с ДНК и инициации синтеза РНК. Сильный промотор представляет собой такой промотор, который вызывает инциацию мРНК с высокой степенью частоты.
Любой полипептид, как упомянуто выше, или биологически эквивалентный полинуклеотид, доступный специалисту для таких же специальных целей, может вводиться в соответствующий экспрессирующий вектор и связываться с другими молекулами ДНК с образованием рекомбинантных молекул ДНК, экспрессирующих данный рецептор. Эти векторы могут состоять из ДНК или РНК; для большинства целей клонирования ДНК-векторы являются предпочтительными. Типичные векторы включают плазмиды, модифицированные вирусы, бактериофаг и космиды, дрожжевые искусственные хромосомы и другие формы эписомной или интегрированной ДНК. Специалисту в данной области хорошо известно, как определить подходящий вектор для конкретного применения.
Множество векторов, экспрессирующих в клетках млекопитающих, может использоваться для экспрессии вышеупомянутых IgG Fc в клетках млекопитающих. Как отмечено выше, экспрессирующие векторы могут представлять собой ДНК-последовательности, которые требуются для транскрипции клонированной ДНК и трансляции их мРНК в соответствующем хозяине. Такие векторы могут использоваться для экспрессии эукариотической ДНК во множестве хозяев, таких как бактерии, сине-зеленые водоросли, растительные клетки, клетки насекомых и животные клетки. Специфически сконструированные векторы дают возможность переноса ДНК между хозяевами, такими как бактериальные-дрожжевые клетки или бактериальные-животные клетки. Соответствующим образом сконструированный экспрессирующий вектор должен содержать: последовательность начала репликации для автономной репликации в клетках-хозяевах, селектируемые маркеры, ограниченное количество применяемых сайтов ферментов рестрикции, потенциал для высокого количества копий и активные промоторы. Экспрессирующие векторы могут включать в частности клонирующие векторы, модифицированные клонирующие векторы, специально сконструированные плазмиды и вирусы. Коммерчески доступные векторы, экспрессирующие в клетках млекопитающего, которые могут быть подходящими, включают в частности pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 and pLITMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и IZD35 (ATCC 37565).
Также в рамках изобретения клетка-хозяин, которая содержит вышеописанную нуклеиновую кислоту. Примеры включают клетки Е.coli, клетки насекомых (например, с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевых клеток или клеток млекопитающих. См., например, Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Для получения полипептида по настоящему изобретению специалист может культивировать клетку-хозяин в среде при условиях, дающих возможность экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению, и очистки полипептида из культивируемых клеток или из культуральной среды. Альтернативно нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может транскрибироваться и транслироваться in vitro, например, с использованием промоторных регуляторных последовательностей Т7 и Т7полимеразы.
Все из природных IgG Fc, генетически сконструированных IgG Fc и химически синтезированных IgG Fc могут использоваться для практического осуществления изобретения, раскрытого в данном документе. IgG Fc, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, могут содержать такую же аминокислотную последовательность, как [FA241] SEQ ID NO: 2) или ее функциональный эквивалент. Термин IgG Fc также охватывает химически модифицированные варианты. Примеры химически модифицированных IgG Fc включают IgG Fc, подвергнутые конформационному изменению, вставке или делеции сахарной цепи, и IgG Fc, с которым связано соединение, такое как полиэтиленгликоль.
Специалист может проверить эффективность полученного таким образом полипептида/белка с использованием животной модели, такой как трансгенная мышь, как описано ниже. Любое статистически значимое увеличение в in vivo экспрессии IL-33 базофилами или экспрессии FcyRIIB рецептора на эф- 5 044897 фекторных макрофагах выявляет полипептид/белок, который является кандидатом для лечения расстройства, упомянутого ниже. В одном варианте осуществления изобретения вышеописанные анализы могут быть основаны на измерении связывания с белком DC-SIGN или с клетками DC-SIGN(+). В данной области известно множество методов, доступных специалисту, которые подходят для измерения способности соединения связываться с DC-SIGN или с DC-SIGN(+) клетками и связанных с этим изменений в экспрессии гена, регулирующегося белками сигнального пути DC-SING, такого как IL-33. Специалист способен смешивать и комбинировать эти разнообразные исследовательские инструменты без излишнего экспериментирования. После очистки и тестирования с помощью стандартных методов или согласно анализам и методам, описанным в примерах ниже, несиалированные варианты IgG Fc могут быть включены в фармацевтическую композицию для лечения воспалительных расстройств.
При использовании в данном документе термин антитело используется в широком смысле и специфически охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и антительные фрагменты при условии, что они демонстрируют целевую биологическую активность.
При использовании в данном документе термин антительные фрагменты может включать часть интактного антитела, как правило, включающую антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела или Fc-участок антитела, который сохраняет FcR-связывающую активность. Примеры антительных фрагментов включают линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифичные антитела, образованные из антительных фрагментов. Антительные фрагменты предпочтительно сохраняют, по меньшей мере, часть шарнира и необязательно CHI-участок тяжелой цепи IgG. Более предпочтительно антительные фрагменты сохраняют цельный константный участок тяжелой цепи IgG и включает легкую цепь IgG.
При использовании в данном документе термин Fc-фрагмент или Fc-участок используется для определения С-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc-участок может представлять собой нативную последовательность Fc-участка или вариант Fc-участка. Хотя связи Fc-участка тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-участок тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяется как фрагмент от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230, до его карбоксильного конца.
Нативная последовательность Fc-участка включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-участка, обнаруженного в естественной среде. Специалисту в данной области понятно, что вариант Fc-участка включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-участка посредством, по меньшей мере, одной аминокислотной модификации. Предпочтительно вариант Fc-участка содержит, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc-участка или с Fcучастком исходного полипептида, например, примерно от одной примерно до десяти аминокислотных замен, и предпочтительно примерно от одной примерно до пяти аминокислотных замен в нативной последовательности Fc-участка или в Fc-участке исходного полипептида. В данном документе вариант Fcучастка предпочтительно будет иметь, по меньшей мере, примерно 75 или 80% гомологии с нативной последовательностью Fc-участка и/или с Fc-участком исходного полипептида и более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 90% гомологии с ним, более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 95% гомологии, еще более предпочтительно, по меньшей мере, примерно 99% гомологии.
Термины Fc-рецептор или FcR используются для описания рецептора, который связывается с Fc-участком антитела. В одном воплощении изобретения FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. В другом воплощении FcR, включающий человеческий FcR, связывается с IgG-антителом (гамма-рецептор) и включает рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включающие аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. FcyRII-рецепторы включают FcyRIIA (активирующий рецептор) и FcyRIIB (ингибирующий рецептор), которые имеют похожие аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcyRIIA содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене (см., обзор Daron, Annu Rev Immunol, 15, 203-234 (1997); FcR рассмотрены в Ravetch and Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4, 25-34 (1994); и de Haas et al., J Lab Clin Med, 126, 330-41 (1995), Nimmerjahn and Ravetch 2006, Ravetch Fc Receptors in Fundemental Immunology, ed William Paul 5th Ed., каждый из которых включен в данный документ ссылкой).
Термин нативный или исходный относится к немодифицированному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность Fc. Исходный полипептид может включать нативную последовательность Fc-участка или Fc-участок с уже существующими аминокислотными модификациями (такими как вставки, делеции и/или замены).
Композиции.
В рамках настоящего изобретения композиция, которая содержит подходящий носитель и один или
- 6 044897 более агентов, описанных выше, таких как несиалированные Fc-варианты IgG. Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель, или косметическую композицию, которая содержит косметически приемлемый носитель.
Термин фармацевтическая композиция относится к комбинации активного агента с носителем, инертным или активным, делающим композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vivo или ex vivo. Фармацевтически приемлемый носитель после введения объекту не вызывает нежелательных физиологических эффектов. Носитель в фармацевтической композиции должен быть приемлемым также в том смысле, что он совместим с активным ингредиентом и может быть способен его стабилизировать. Один или более стабилизирующих агентов могут применяться в качестве фармацевтических носителей для доставки активного соединения. Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают в частности биосовместимые носители, адъюванты, добавки и разбавители для доставки композиции, применяемой в качестве лекарственной формы. Примеры других носителей включают коллоидный оксид кремния, стеарат магния, целлюлозу и лаурил сульфат натрия.
Вышеописанная композиция, во многих формах описанная выше, может использоваться для лечения расстройств, характеризующихся воспалением. Эффективное количество относится к количеству активного соединения/агента, которое требуется для придания терапевтического эффекта объекту, подвергающемуся лечению. Специалисту в данной области понятно, что эффективные дозы будут варьироваться в зависимости от типов заболеваний, подвергаемых лечению, пути введения, применения эксципиента и возможности совместного использования с другим терапевтическим лечением.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться парентерально, перорально, назально, ректально, местно или буккально. При использовании в данном документе термин парентеральный относится к подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, внутрисиновиальной, надчревной, внутриоболочечной (внутрь пораженных тканей) или внутричерепной инъекции, а также к любому подходящему методу инфузии.
Стерильная композиция для инъекций может представлять собой раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. Такие растворы включают в частности 1,3-бутандиол, маннит, воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, фиксированные масла подходящим образом применяются в качестве растворителя или суспендирующей среды (например, синтетические моно- или диглицериды). Жирная кислота, такая как в частности олеиновая кислота и ее глицеридные производные, применимы в препарате для инъекций, поскольку являются природными фармацевтически приемлемыми маслами, такими как в частности оливковое масло или касторовое масло, их полиоксиэтилированные варианты. Эти масляные растворы или суспензии также могут содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергирующий агент, такой как в частности карбоксиметилцеллюлоза или похожие диспергирующие агенты. Другие широко используемые поверхностно-активные вещества, такие как в частности TWEENS или SPANS или другие похожие эмульгирующие агенты или усилители биодоступности, которые широко используются в производстве фармацевтически приемлемой твердой, жидкой или другой лекарственной формы, также могут использоваться для целей составления композиции.
Композиция для перорального введения может представлять собой любую перорально приемлемую лекарственную форму, включающую капсулы, таблетки, эмульсии и водные суспензии, дисперсии и растворы. В случае таблеток широко используемые носители включают в частности лактозу и кукурузный крахмал. Также, как правило, добавляют смазывающие агенты, такие как в частности стеарат магния. Для перорального введения в капсульной форме применяемые разбавители включают в частности лактозу и сухой кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный ингредиент может суспендироваться или растворяться в масляной фазе, объединяясь вместе с эмульгирующими или суспендирующими агентами. Если целесообразно, могут быть добавлены некоторые подсластители, ароматизаторы или красители.
Фармацевтические композиции для местного введения согласно описанному изобретению могут быть составлены в виде растворов, мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Альтернативно местные составы могут быть представлены в форме пластырей или повязок, пропитанных активным(и) ингредиентом(ами), которые необязательно могут включать один или несколько эксципиентов или разбавителей. В некоторых предпочтительных воплощениях местные составы включают материал, который будет усиливать абсорбцию или проникновение активного агента(ов) через кожу или другие подверженные воздействию области. Местная композиция применяется для лечения воспалительных расстройств на коже, включающих в частности экзему, акне, розацеа, псориаз, контактный дерматит и реакции на сумах ядоносный.
Местная композиция содержит безопасное и эффективное количество дерматологически приемлемого носителя, подходящего для применения на коже. Косметически приемлемая или дерматологически приемлемая композиция или компонент относятся к композиции или компоненту, которые подходят для применения в контакте с человеческой кожей без нежелательной токсичности, несовместимости, нестабильности, аллергической реакции и так далее. Носитель дает возможность доставки активного агента и необязательного компонента на кожу в соответствующей концентрации. Таким образом, носи- 7 044897 тель может действовать в качестве разбавителя, диспергирующего агента, растворителя или подобного для гарантии того, что активные материалы будут применимы и распределены по выбранной мишени в соответствующей концентрации. Носитель может быть твердым, полутвердым или жидким. Носитель может быть представлен в форме лосьона, крема или геля, конкретно в такой форме, которая имеет достаточную консистенцию и предел текучести для предотвращения седиментации активного материала. Носитель может быть инертным или обладает дерматологически полезными свойствами. Также он должен быть физически и химически совместимым с активными компонентами, описанными в данном документе, и не должен чрезмерно ослаблять стабильность, эффективность или другие полезные свойства, ассоциированные с композицией. Местная композиция может представлять собой косметический или дерматологический продукт в форме, известной в данной области для местного или трансдермального применения, включающей растворы, аэрозоли, кремы, гели, пластыри, мазь, лосьон или пенку.
Способы обработки (лечения).
В описанном изобретении предлагаются способы лечения у объекта воспалительного расстройства. Термин воспалительное расстройство относится к расстройству, которое характеризуется аномальным или нежелательным воспалением, такому как аутоиммунное заболевание. Аутоиммунные заболевания и расстройства характеризуются хронической активацией иммунных клеток при неактивирующих условиях. Примеры включают псориаз, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), ревматоидный артрит, псориатический артрит, рассеянный склероз, волчанка, диабет I типа, билиарный первичный цирроз печени и трансплантация.
Другие примеры воспалительных расстройств, которые могут подвергаться лечению с помощью способов по настоящему изобретению, включают астму, инфаркт миокарда, инсульт, воспалительные дерматозы (например, дерматит, экзему, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, крапивницу, некротический васкулит, кожный васкулит, гиперчувствительный васкулит, эозинофильный миозит, полимиозит, дерматомиозит и атонический фасциит), синдром острой дыхательной недостаточности, молниеносный гепатит, заболевания гиперчувствительности легких (например, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильная пневмония, гиперчувствительность замедленного типа, интерстициальное заболевание легких (ILD), идиопатический фиброз легких и ILD, ассоциированное с ревматоидным артритом) и аллергический ринит. Дополнительные примеры также включают миастению гравис, юношеский диабет, гломерулонефрит, аутоиммунный тиреоидит, анкилозирующий спондилоартрит, склеродермию, острые и хронические воспалительные заболевания (например, системная анафилаксия или гиперчувствительные реакции, аллергии на лекарственные средства, аллергии на укусы насекомых, отторжение аллотрансплантата и реакция трансплантат против хозяина) и синдром Шегрена.
Объект относится к человеку и к животному, отличному от человека. Примеры животных, отличных от человека, включают позвоночных, например млекопитающих, таких как млекопитающие, отличные от человека, приматы, отличные от человека (конкретно высшие приматы), собака, грызун (например, мышь или крыса), морская свинка, кошка и кролик, и не млекопитающие, такие как птицы, амфибии, рептилии и т.д. В одном варианте осуществления изобретения объектом является человек. В другом варианте осуществления изобретения объектом является экспериментальное животное, отличное от человека, или животное, подходящее в качестве модели заболевания.
Объект, подвергаемый лечению воспалительного расстройства, может быть идентифицирован с помощью стандартных методов диагностики расстройства. Необязательно объект может исследоваться на предмет уровня или процентное содержание одного или нескольких цитокинов или клеток тестируемого образца, полученных из объекта с помощью методов, известных в данной области. Если уровень или процентное содержание на уровне порогового значения или ниже (которое может быть получено для здорового объекта), то объект является кандидатом для лечения, описанного в данном документе. Для подтверждения ингибирования или лечения специалист может оценить и/или подтвердить уровень или процентное содержание одного или нескольких вышеупомянутых цитокинов или клеток у объекта после лечения.
Лечение (treating) или лечение (обработка)(treatment) относится к введению соединения или агента объекту, у которого есть расстройство с целью лечения, облегчения, ослабления, уменьшения, устранения, задержки приступа, предотвращения или улучшения состояния при расстройстве, предотвращения или улучшения симптома расстройства, болезненного состояния, вторичного по отношению к расстройству, или предрасположенности по отношению к расстройству.
Эффективное количество или терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения или агента, которое способно производить целевой с медицинской точки зрения результат у объекта, подвергаемого лечению. Способ лечения может осуществляться in vivo или ex vivo, индивидуально или совместно с другими лекарственными средствами или терапией. Терапевтически эффективное количество может вводиться за одно или несколько введений, применений или дозировок и не предназначено для ограничения конкретного состава или пути введения.
Агент может вводиться in vivo или ex vivo, индивидуально или совместно с другими лекарственными средствами или терапиями, то есть терапия коктейля. При использовании в данном документе термин совместное введение или совместно вводимые относится к введению объекту, по меньшей мере, двух
- 8 044897 агентов или терапий. В некоторых вариантах осуществления изобретений совместное введение двух или более агентов/терапий осуществляется одновременно. В других вариантах осуществления изобретений первый агент/терапия вводится перед вторым агентом/терапией. Специалистам в данной области понятно, что составы и/или пути введения различных используемых агентов/терапий могут варьировать.
В in vivo способе объекту вводят соединение или агент. Как правило, соединение или агент суспендируют в фармацевтически приемлемом носителе (таком как, например, в частности физиологический солевой раствор) и вводят перорально или с помощью внутривенной инфузии или инъецируют или имплантируют подкожно, внутримышечно, внутриоболочечно, внутрибрюшинно, внутриректально, внутривагинально, внутриназально, внутрижелудочно, внутритрахейно или внутрилегочно.
Требуемая дозировка зависит от выбора пути введения; природы состава; природы болезни пациента; габаритов объекта, веса, площади поверхности, возраста и пола; введения других лекарственных средств и предписаний врача. Подходящие дозировки находятся в интервале 0,01-100 мг/кг. Вариации необходимых дозировок ожидаемы с точки зрения разнообразия доступных соединений/агентов и различных эффективностей различных путей введения. Например, ожидается, что для перорального введения будут требоваться более высокие дозировки, чем для внутривенной инъекции. Вариации в данных дозировках могут регулироваться с использованием стандартных эмпирических путей оптимизации, хорошо известных в данной области. Инкапсулирование соединения в подходящем носителе для доставки (например, в полимерных микрочастицах или в имплантируемых устройствах) может повышать эффективность доставки, особенно для пероральной доставки.
Пример 1. Методы и материалы.
Данный пример описывает методы и материалы, используемые в примерах 2-7.
Мыши.
Мышей C57BL/6 дикого типа приобретали в Jackson Laboratories. Мыши SIGNR1’/’ были предоставлены A. McKenzie. Трансгенные CDllc-DC-SIGN+ мыши были предоставлены Т. Sparwasser. Трансгенных мышей hDC-SIGN ВАС генерировали на основе SIGNR1’/’ в лаборатории авторов изобретения, как описано ранее. Мышей KRN TCR C57BL/6 (подарок D. Mathis и С. Benoist) скрещивали с мышами NOD с получением мышей K/BxN. Кровь у мышей K/BxN (в возрасте 6-12 недель) отбирали и собирали вместе сыворотку, содержащую артритогенные антитела. Пассивный перенос 200 мкл K/BxN сыворотки с помощью внутривенной инъекции наивным мышам (в возрасте 8-12 недель) индуцировал артрит. Воспаление оценивали в баллах 0-3 для каждой лапы и суммировали для общей клинической бальной оценки индивидуальной мыши.
Получение рекомбинантного Fc.
IDEC-114, рекомбинантный источник полноразмерного человеческого моноклонального антитела IgG1, гидролизовали папаином в течение ночи при 37°C для отщепления фрагментов Fab и Fc. После гидролиза реакцию останавливали путем добавки 2,5 мг/мл йодацетамида. Для отделения отщепленных фрагментов от негидролизованного антитела образцы пассировали через колонку HiPrep 26/60 S-200HR эксклюзионной хроматографии (GEHEALTHCARE). Затем Fc-фрагмент очищали с помощью агарозных гранул с белком G. Чистоту образца подтверждали путем окрашивания кумасси синим SDSполиакриламидных гелей.
Альтернативно рекомбинантные Fc получали путем транзиторной трансфекции плазмид, экспрессирующих человеческий IgG1 Fc, в клетки 293Т с последующим осаждением сульфатом аммония надосадочных фракций и очистки с белком G. Генетическую последовательность, кодирующую Fc-участок человеческого IgG1, амплифицировали из 4-4-20 IgG1 с помощью стандартных протоколов ПЦР и лигировали в pSecTag2 (INVITROGEN). Точечные мутации вводили в последовательность, кодирующую Fc, с помощью стандартных методов сайтнаправленного мутагенеза и подтверждали с помощью анализа ДНК-секвенирования. ПЦР-праймеры для замены Phe на Ala в положении 241 (FA241):
5'-ggggaccgtcagtcgccctcttccccccaa-3' (SEQ ID NO: 4) и
5'- ttggggggaagagggcgactgacggtcccc-3' (SEQ ID NO: 5).
Экспрессию белка и чистоту подтверждали с помощью иммуноблоттинга с антителами к человеческому Fc и/или с помощью окрашивания кумасси синим SDS-полиакриламидных гелей.
Двухстадийная in vitro реакция сиалирования.
После очистки 10-50 мг/мл Fc-фрагментам меняли буфер на буфер для реакции галактозилирования (50 мМ MOPS, pH 7,2; 20 мМ MnCl2) и инкубировали в течение ночи при 37°C вместе с 50 мг UDPгалактозы и 0,75 U в-1,4-галактозилтрансферазы.
Галактозилирование подтверждали с помощью лектиновых блотов с использованием ECL для распознавания конечных галактозных остатков. Затем галактозилированным Fc меняли буфер на реакционный буфер для сиалирования (100 мМ MOPS, 0,2 мг/мл BSA, 0,5% Triton X-100, рН 7,4) и инкубировали в течение ночи при 37°C вместе с 50 мг СМР-сиаловой кислоты и 0,75 Ед а2,6-сиалилтрансферазы. Сиалирование подтверждали с помощью лектиновых блотов с использованием SNA для распознавания конечных остатков сиаловой кислоты со связью α-2-6.
Адоптивный перенос макрофагов, выделенных из костного мозга.
- 9 044897
Костномозговые клетки вымывали струей из большой берцовой кости и из бедренной мышей DCSIGNtg или SIGNRr- и высевали в 10см-планшеты, обработанные для нетканевых культур, в ростовой среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 1% Пен/Стреп, IL-3 (5 нг/мл, PEPROTECH) и M-CSF (5 нг/мл, PEPROTECH). После ночной инкубации при 37°C неприкрепленные клетки извлекали и переносили в 10см-планшеты, обработанные для нетканевых культур, содержащие ростовую среду RPMI с добавкой IL-3/M-CSF, и культивировали в течение 5-7 дней при 37°C. Зрелые макрофаги трипсинизировали и высевали в б-луночные планшеты с плотностью 2x106 клеток/на лунку и давали им возможность прикрепиться в течение ночи. На следующий день макрофаги стимулировали с использованием указанного препарата рекомбинантного Fc в течение 30 мин при 37°C. Клетки извлекали, промывали холодным PBS и внутривенно вводили 1x106 клеток мышам C57BL/6 дикого типа. Через один час после инъекции реципиентных мышей заражали сывороткой K/BxN. Экспрессия и очистка растворимого человеческого DCSIGN Плазмида, содержащая кДНК-последовательность внеклеточного домена (ECD) человеческого DCSIGN, была предоставлена K. Drickamer. Кодирующую последовательность DC-SIGN ECD модифицировали для введения N-концевой стреп-метки с помощью стандартных методов ПЦР и лигировали с pET28b(+). pET28b-strepDCSIGN трансформировали в Е.coli штамм BL21/DE3 и растили в 3 л ростовой среды ТВ при 37°C до момента достижения бактериальной культурой OD600 0,7-0,8. Экспрессию белка индуцировали путем добавления 100 мг/л IPTG и культуры инкубировали при 37°C в течение 3,5 ч. Бактерии осаждали путем центрифугирования при 4000xg в течение 10 мин при 4°C. Осадки бактерий ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl, рН 7,8, и лизировали обработкой ультразвуком. Тельца включения осаждали путем центрифугирования при 10000xg в течение 15 мин при 4°C и солюбилизировали в 100 мл 6 М гуанидин-HQ; 100 мМ Трис-HCl, рН 7,8; 0,2% TRITON X-100. Твердые примеси удаляли путем центрифугирования при 20000xg в течение 30 мин при 4°C, и надосадочную фракцию диализовали против 250 мМ NaCl; 25 мМ Трис-HCl, рН 7,8; 25 мМ CaCl2. После диализа нерастворимые осадки удаляли путем центрифугирования при 20000хд в течение 30 мин при 4°C, и надосадочную фракцию применяли к смоле strep-tactin (NOVAGEN) для сбора strep-меченных DC-SIGN ECD. Связанный белок элюировали из смолы с использованием элюирующего буфера, предоставленного производителем (NOVAGEN). Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, и положительные фракции объединяли и загружали на манноза-агарозную колонку для селекции активных рецепторов. DC-SIGN ECD элюировали с помощью 250 мМ NaCl; 25 мМ Трис-HCl, рН 7,8; 5 мМ EDTA. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE.
Поверхностный плазмонный резонанс.
Для определения взаимодействия между различными препаратами рекомбинантного Fc с растворимым hDC-SIGN или hFcyRs, записывали измерения равновесной аффинности на сенсор Biacore T100. Рецепторы, разведенные до 20-50 мкг/мл в NaOAc pH 5, иммобилизовали на чипах СМ5 с высокой плотностью (2000 RU) с помощью стандартной конденсации аминогрупп. Для взаимодействий hDC-SIGN инъекции осуществляли при скорости потока 20 мкл/мин с коммерчески доступным буфером HBS-P+, доведенным до рН 9, и с добавлением 2 мМ CaCl2 и 500 мМ NaCl. Для взаимодействий hFcyRs инъекции осуществляли со скоростью потока 20 мкл/мин с коммерчески доступным буфером HBS-EP+. Поверхности регенерировали с использованием короткой обработки 50 мМ NaOH. Значения Kd рассчитывали после вычитания фонового связывания с контрольной проточной ячейкой с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation.
ОТ-ПЦР.
Суммарную РНК экстрагировали из костномозговых макрофагов с использованием набора реагентов RNeasy Mini kit (QIAGEN). Один микрограмм суммарной РНК использовали для анализа экспрессии IL-33 мРНК с помощью ОТ-ПЦР с использованием набора реагентов OneStep RT-PCR kit (QIAGEN). Экспрессия GAPDH служила в качестве контроля загрузки. ПЦР-праймеры для mIL-33: 5'gaagatcccaacagaagacc-3' (SEQ ID NO: 6) и 5'-ttccggaggcgagacgtcac-3' (SEQ ID nO: 7); и mGAPDH: 5'gccgcctggagaaacctgc-3' (SEQ ID NO: 8) и 5'-tgaggtccaccaccctgttg-3' (SEQ ID NO: 9). Условия ПЦР: 94°C в течение 30 с; 55°C в течение 30 с; 72°C в течение 60 сх35 циклов (IL-33) или 25 циклов (GAPDH).
Пример 2. а-2,6-связанная сиаловая кислота придавала DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc.
Минорная популяция антител в IVIG-препаратах подавляет воспаление, индуцированное аутоантителами. Эти антитела, содержащие концевую а-2,6-связанную сиаловую кислоту на Fc-гликане, опосредуют противовоспалительный ответ путем связывания с SIGNR1 на макрофагах периферической области или с его человеческим ортологом DC-SIGN, на миелоидных клетках.
Для изучения взаимодействия sFc с DC-SIGN растворимую форму внеклеточного домена DC-SIGN (DC-SIGN ECD) очищали из бактерий и иммобилизовали на СМ5-чипах. sFc получали из полноразмерных антител IDEC-114 и сиалировали in vitro (фиг. 1b) и специфично связывали с DC-SIGNконъюгированной поверхностью (фиг. 1а). Измерения равновесной аффинности проводили, и значение KD для данного взаимодействия рассчитывали как -1,3x10’6 М (фиг. 1с). Напротив, несиалированная гликоформа IDEC-114 Fc продемонстрировала отсутствие связывающей активности с DC-SIGN, предпо- 10 044897 лагающее, что сиалирование индуцирует конформационные изменения в остове Fc с обнаружением сайта связывания DC-SIGN.
Как представлено на фиг. 1а, было обнаружено, что рекомбинантный a-2,6-sFc связывался с растворимым DC-SIGN согласно измерениям поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fc получали с помощью папаинового расщепления полноразмерного человеческого моноклонального антитела IgG1 (IDEC-114) с последующими in vitro реакциями галактозилирования и сиалирования. Сенсограммы SPR для антитела, связывающегося с иммобилизованным DC-SIGN, представлены для сиалированных и галактозилированных гликоформ hIgG1 Fes, как описано выше в примере 1. Было обнаружено, что концентрация Fc, проходящая потоком через DC-SIGN ECD, колеблется в интервале 3-0,8 мкм. Как представлено на фиг. 1b, лектиновый блот с SNA подтвердил прикрепление сиаловой кислоты с 2,6-связью на Fc (верхняя панель); окрашенные кумасси контроли представлены на нижней панели. Измерение равновесной KD связывания sFc с DC-SIGN (как представлено в а) рассчитывали с помощью пакета программ Biacore Evaluation.
Пример 3. Мутация, разрушающая взаимодействия Fc-гликан, придавала DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc.
Сердцевинная олигосахаридная цепь, присоединенная к Asn297, делает экстенсивными нековалентные взаимодействия с аминокислотным остовом Fc. Конформационные изменения в Fc, индуцированные с помощью различных сахарных остатков, присоединенных к сердцевинному гликану, опосредуются с помощью этих белок-углеводных взаимодействий. Замены аланина, которые ликвидируют ключевые контактные точки между остовом Fc и остатками гликана, по-видимому, обеспечивают DC-SIGNсвязывающую активность.
Как представлено на фиг. 2А, мутации FA241 и FA243 демонстрируют DC-SIGN-связывающую активность без in vitro ферментативной обработки. Истинные значения KD колеблются от 6х10-7 М для FA241 до 3х10’7 М для FA243. Предыдущие сообщения выявляют, что эти мутации повышают сиалирование антител, в основном делая гликан более доступным гликозилтрансферазам при экспрессии в клетках млекопитающего. Для подтверждения этого осуществляли опыт с лектиновым блотом для определения того, что связывание FA241 и FA243 с DC-SIGN осуществляется благодаря повышенному сиалированию транзиторно экспрессированных белков. Как представлено на фигуре 2В, SNA-блоты не детектировали концевых остатков сиаловой кислоты в очищенных FA241 и FA243, указывая, что взаимодействие DC-SIGN было независимым от модификации сиаловой кислоты.
Более конкретно остатки F241, F243, D265 и R301 аминокислотного остова IgG1 Fc заменяли аланином для нарушения нековалентных взаимодействий с олигосахаридными остатками. Fc экспрессировали и очищали из клеток 293Т и анализировали на предмет DC-SIGN-связывающей активности с использованием поверхностного плазмонного резонанса, как описано выше. Было обнаружено, что Fc, несущие мутации FA241 или FA243, демонстрировали повышенную аффинность к DC-SIGN по отношению к измерениям аффинности для sFc (фиг. 1а). Проводили опыты с лектиновыми блотами с ECL (фиг. 1b, средняя панель) и SNA (верхняя панель) для определения концевых сахарных компонентов на Fc, очищенных из клеток 293Т. В качестве положительного контроля для сиалированных Fc FA241 сиалировали in vitro, как описано на фиг. 1а. Окрашенные кумасси контроли загрузки представлены на нижней панели фиг. 1b.
Пример 4. Мутация FA241 в hIgG1 Fc повторяла противовоспалительную активность α-2,6 sFc.
Если мутации FA241 и FA243 имитируют DC-SIGN-связывающую активность sFc, то проводили анализы для исследования того, могут ли эти мутации повторять противовоспалительную активность sFc in vivo. Подобранных по возрасту и полу мышей SIGNR1’/’ и hDC-SIGN+/SIGNRr/_ заражали с помощью артритогенной сыворотки K/BxN и обрабатывали с помощью sFc, FA241 или FA243 с эффективной дозой 0,033 г/кг. Согласуясь с предыдущими открытиями, sFc подавлял опухоль стопы у мышей DC-SIGN+, но не у мышей SIGNR1’/’. Аналогично мутация FA241 демонстрировала противовоспалительную активность, сравнимую с противовоспалительной активностью sFc у мышей hDC-SIGN+/SIGNRr/_. Мыши, которым вводили FA243, демонстрировали отсутствие уменьшения воспаления сустава. Эти открытия предполагают, что рекомбинантные Fc, несущие мутацию F241A (FA241), повторяли связывание DCSIGN и противовоспалительную активность sFc в отсутствие модификации сиаловой кислоты.
Как представлено на фигуре 3, мышам hDC-SIGN+/SIGNRΓ/(белые квадраты) и SIGNR1’/_ (черные квадраты) вводили с помощью 0,7 мг/на мышь sFc, FA241 или FA243 внутривенной инъекции. Затем мышей заражали с помощью K/BxN сыворотки через 1 ч. Опухание стоп отслеживали и оценивали в течение нескольких дней. Как сообщалось ранее, противовоспалительная активность sFc является DCSIGN-зависимой (левая панель). FA241 также подавляла артритное воспаление у зараженных мышей K/BxN DC-SIGN-зависимым образом, FA243 не уменьшала в значительной степени опухания стопы на 6й день. Средние значения и SEM клинических бальных оценок 4-5 мышей на группу наносили на график на 6-й день.
Пример 5. Отличительные требования для противовоспалительной активности FA241.
Для идентификации детерминант для противовоспалительной активности FA241 костномозговые
- 11 044897 макрофаги (ВММФ) из мышей CD11c.DC-SIGN+ и SIGNR1-- стимулировали с помощью FA241 или других Fc-препаратов и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6, зараженным сывороткой K/BxN.
Вкратце костномозговые макрофаги из мышей CD11c.DC-SIGN+ и SIGNR1-- культивировали в присутствии IL-3 (5 нг/мл) и M-CSF (5 нг/мл) в течение 5-7 дней. Как представлено на фигуре 4, DC-SIGN+ ВММф стимулировали с помощью 0,5 мг/мл несиалированных (черные полоски) или сиалированных (белые полоски) гликоформ указанных Fc-препаратов. Fc-обработанные ВММф переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Как представлено на фигуре 4b SIGNR1-(черные полоски) и DC-SIGN+ (белые полоски) ВММф стимулировали с помощью 0,5 мг/мл указанного Fc-препарата и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Аналогично, DC-SIGN+ ВММф стимулировали с помощью либо 0,5 мг/мл FA241 или дегликозилированного FA241 (фиг. 4с, белые полоски) либо с помощью PBS (фиг. 4с, черная полоска) и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. FA241 дегликозилировали с помощью PNG-азы F и удаление гликана подтверждали с помощью лектиновго блоттинга. DC-SIGN+ ВММф стимулировали с помощью указанного несиалированного Fc-препарата или с помощью PBS (фиг. 4d, черный круг) и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Во всех случаях опухоль стоп отслеживали и оценивали в течение нескольких дней. Средние значения и стандартные ошибки средних значений (SEM) клинических бальных оценок 4-5 мышей на группу наносили на график. *Р<0,05, как определено с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), с последующим апостериорным тестом Тьюки.
Как представлено на фиг. 4А, несиалированные и сиалированные FA241-препараты были эффективны в равной степени в подавлении воспаления сустава по сравнению с sFc. Однако WT Fc-препараты требовали а-2,6-связанной сиаловой кислоты, так как DC-SIGN+ ВММф, стимулированные асилированным WT Fc, не передавали защиту реципиентным мышам. Соответственно результатам, представленным на фиг. 3, обоим, sFc и FA241, требовалась экспрессия DC-SIGN на ВММф для передачи защиты (фиг. 4В). Хотя FA241 не требует сиаловой кислоты для передачи защиты, дегликозилирование с помощью PNGазы F отменяло противовоспалительные свойства FA241 (фиг. 4С), предполагая, что Fc гликан все равно необходим. Кроме того, для демонстрации того, что наблюдаемая противовоспалительная активность специфична для мутации F241A, DC-SIGN+ ВММф стимулировали с помощью Fc, несущих альтернативные мутации, которые не придают повышенного связывания DC-SIGN. Только РА241-стимулированные ВММф защищали зараженных реципиентных мышей K/BxN.
Пример 6. Мутация FA241 повышала связывание рецептора Fcy.
Если замена аланина в положении 241 индуцирует конформационное изменение в Fc, то возможно будет изменяться аффинность к человеческим рецепторам Fcy. Ранее сообщалось, что сиалирование уменьшает аффинность IgG к FcyR, ослабляя вследствие этого активность ADCC in vivo.
Связывание рекомбинантных IgG1 Fc с растворимыми FcyR измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fc готовили способом, описанным выше. Сенсограммы SPR для связывания антитела с иммобилизованным hFcyRIIA131R и hFcyRIIB представлены на фиг. 5 для несиалированных и сиалированных гликоформ WT hIgG1 Fc и для несиалированной формы FA241 Fc.
Как представлено на фиг. 5, несиалированные гликоформы WT Fc связывались с hFcyRIIA и RIIB с наблюдаемым значением KD ~2-3х10’5 М. Однако sFc, по-видимому, не связывались ни с hFcyRIIA, ни с RIIB. Неожиданно обнаружилось, что FA241, по-видимому, связываются с обоими, hFcyRIIA и RIIB, с аффинностью более высокого порядка (KD=~2x10’6 M).
Пример 7. Индуцирование IL-33 мРНК в костномозговых макрофагах с помощью FA241.
sFc индуцирует ТН2-зависимый противовоспалительный путь, который требует секреции IL-4 из популяции лейкоцитов FcεRI+, вероятно, базофилов, для положительной регуляции FcyRIIB на регуляторных макрофагах. Введение IL-33 in vivo или in vitro стимулирует базофилы для высвобождения запасов IL-4. Экспрессия IL-33 мРНК положительно регулируется в селезенке мышей WT C57BL/6, обработанных с помощью sFc или IVIG, но не у мышей SIGNR1’/’. Это предполагает, что sFc может индуцировать экспрессию IL-33 в клетках SIGNR1+ или DC-SIGN+. В данном примере анализы проводили и продемонстрировали, что стимулирование DC-SIGN+ ВММф с помощью FA241, по-видимому, положительно регулирует экспрессию IL-33.
Более конкретно, костномозговые макрофаги из мышей CD11c.DC-SIGN+ и SIGNR1-- культивировали способом, описанным выше. ВММф высевали на 12-луночные планшеты в бессывороточной среде RPMI и давали возможность прикрепиться в течение ночи при 37°C. На следующий день клетки стимулировали с помощью 0,5 мг/мл указанного Fc в бессывороточной среде RPMI в течение 1 ч (фиг. 6а) или 4 ч (фиг. 6b) при 37°C. мРНК собирали из клеток в конкретные моменты времени и 1 мкг суммарной РНК использовали для ОТ-ПЦР амплификации IL-33 мРНК (верхние панели). Амплификация GAPDH служила в качестве контроля загрузки (нижние панели). Плазмидой, совместно экспрессирующей DA265 Fc и человеческую сиалилтрансферазу (ST6Gal1), трансфецировали в клетки 293Т с получением высокосиалированного рекомбинантного Fc (ST6-DA265).
-
Claims (14)
- Как представлено на фигуре б, стимулирование DC-SIGN+ ВММф с помощью FA241, по-видимому, положительно регулирует экспрессию IL-33. Несмотря на высокий базальный уровень экспрессии IL-33 по сравнению с DC-SIGN+ ВММф, SIGNR1-- ВММф отрицательно регулировали экспрессию IL-33 мРНК в ответ на обработку FA241.Вышеописанный пример и описание предпочтительных вариантов осуществления следует понимать в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. Все публикации, процитированные в данном документе, включены в настоящий документ ссылкой в полном объеме. Понятно, что многочисленные вариации и комбинации признаков, представленных выше, могут применяться, не выходя при этом за рамки настоящего изобретения, представленного в формуле изобретения. Такие вариации не рассматриваются как выходящие за рамки изобретения, и подразумевается, что все такие вариации включены в рамки следующей формулы изобретения.ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Сиалированный полипептид, включающий модифицированную последовательность, которая, по меньшей мере, на 75% идентична Fc-участку IgG1, включающему SEQ ID NO: 2, где аминокислотный остаток 241 (пронумерованный согласно системе Kabat) полипептида, который соответствует аминокислотному остатку 32 SEQ ID NO: 2, представляет собой аланин (А).
- 2. Полипептид по п.1, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 80% идентична SEQ ID NO: 2.
- 3. Полипептид по п.1, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 90% идентична SEQ ID NO: 2.
- 4. Полипептид по п.1, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 95% идентична SEQ ID NO: 2.
- 5. Полипептид по п.1, где модифицированная последовательность, по меньшей мере, на 99% идентична SEQ ID NO: 2.
- 6. Полипептид по п.1, где модифицированная последовательность включает SEQ ID NO: 2.
- 7. Полипептид по п.1, где модифицированная последовательность по существу состоит из SEQ ID NO: 2.
- 8. Применение выделенной нуклеиновой кислоты, включающей последовательность, кодирующую полипептид по любому из пп.1-7, в способе получения указанного полипептида.
- 9. Экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в п.8.
- 10. Применение клетки-хозяина, включающей нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в п.8, в способе получения полипептида по любому из пп.1-7.
- 11. Способ получения полипептида, включающий культивирование клетки-хозяина по п.10 в среде при условиях, дающих возможность экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, охарактеризованной в п.8, и очистку полипептида из культивируемой клетки или из культуральной среды.
- 12. Фармацевтическая композиция, включающая: (i) полипептид по любому из пп.1-7 или нуклеиновую кислоту, охарактеризованную в п.8, и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
- 13. Способ лечения воспалительного заболевания у субъекта, нуждающегося в этом, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества полипептида по любому из пп.1-7 или нуклеиновой кислоты, охарактеризованной в п.8.
- 14. Применение полипептида по любому из пп.1-7 или нуклеиновой кислоты по п.8 в производстве лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания.-
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US61/577,361 | 2011-12-19 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
EA044897B1 true EA044897B1 (ru) | 2023-10-10 |
Family
ID=
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2012355710B2 (en) | Non-sialylated anti-inflammatory polypeptides | |
EP2908914B1 (en) | Immunomodulatory proteins | |
IL254284B2 (en) | Anti-inflammatory polypeptides | |
EA044897B1 (ru) | Несиалированный выделенный полипептид, способ получения указанного полипептида и фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания | |
US20230295306A1 (en) | Anti-Inflammatory Polypeptides | |
NZ627002B2 (en) | Non-sialylated anti-inflammatory polypeptides |