EA031715B1 - ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ НЕСИАЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД МОДИФИЦИРОВАННОГО Fc-УЧАСТКА hIgG1, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ - Google Patents

ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ НЕСИАЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД МОДИФИЦИРОВАННОГО Fc-УЧАСТКА hIgG1, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ Download PDF

Info

Publication number
EA031715B1
EA031715B1 EA201491215A EA201491215A EA031715B1 EA 031715 B1 EA031715 B1 EA 031715B1 EA 201491215 A EA201491215 A EA 201491215A EA 201491215 A EA201491215 A EA 201491215A EA 031715 B1 EA031715 B1 EA 031715B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
polypeptide
seq
sequence
nucleic acid
inflammatory
Prior art date
Application number
EA201491215A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201491215A1 (ru
Inventor
Джеффри В. Равеч
Эндрю Пинсетик
Original Assignee
Дзе Рокфеллер Юниверсити
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Дзе Рокфеллер Юниверсити filed Critical Дзе Рокфеллер Юниверсити
Publication of EA201491215A1 publication Critical patent/EA201491215A1/ru
Publication of EA031715B1 publication Critical patent/EA031715B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2851—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the lectin superfamily, e.g. CD23, CD72
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/63—Arthropods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/16—Central respiratory analeptics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70535—Fc-receptors, e.g. CD16, CD32, CD64 (CD2314/705F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/40—Immunoglobulins specific features characterized by post-translational modification
    • C07K2317/41—Glycosylation, sialylation, or fucosylation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/54—F(ab')2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2318/00—Antibody mimetics or scaffolds

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)

Abstract

Настоящее изобретение относится к выделенному полипептиду, включающему модифицированную последовательность, которая свободна от сиалирования и по меньшей мере на 75% идентична последовательности Fc-участка hIgG1, представляющей собой SEQ ID NO: 1, и имеет замену на аланин или консервативную аминокислоту в положении, соответствующем F241 последовательности SEQ ID NO: 1 согласно системе нумерации Kabat, причем полипептид обладает противовоспалительной активностью, которая выше, чем противовоспалительная активность исходного полипептида, включающего SEQ ID NO: 1. Настоящее изобретение также относится к способу получения заявленного полипептида, противовоспалительной фармацевтической композиции, содержащей заявленный полипептид, способу лечения воспалительного заболевания, включающему введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества заявленного полипептида.

Description

Изобретение относится к противовоспалительным агентам, композициям и способам лечения воспалительных расстройств.
Уровень техники
Воспалительные расстройства, включающие аутоиммунные заболевания, представляют собой расстройства, включающие аномальную активацию и последующую миграцию лейкоцитов в пораженные области организма. Эти условия охватывают широкий спектр болезней, которые влияют на жизни миллионов людей по всему миру. Хотя в настоящее время доступны различные методы лечения, многие из них обладают значительными побочными эффектами или не очень эффективны в ослаблении симптомов. Таким образом, существует необходимость получения противовоспалительных агентов для лечения воспалительных расстройств, и существует необходимость в разработке методов идентификации и оценки таких агентов.
Давно известно, что иммуноглобулин G (IgG) опосредует как про-, так и противовоспалительные активности посредством взаимодействий, опосредованных его Fc-фрагментом. В то время как взаимодействия Fc-FcyR отвечают за провоспалительные свойства иммунных комплексов и цитотоксических антител, внутривенный γ-глобулин (IVIG) и его Fc-фрагменты являются противовоспалительными и широко используются для подавления воспалительных заболеваний. Предполагалось, что гликозилирование IgG является критическим для регуляции цитотоксичности и воспалительного потенциала IgG. Например, предполагали, что противовоспалительная активность IVIG является свойством Fc-фрагмента и его связанного гликана, требующего концевых связей ц-2,6-сиаловой кислоты, выявляющих совместное требование для специфичного полипептидного остова и структуры гликана, необходимое для иммуносупрессии (Anthony, et al., 2008, Science 320: 373-376 и WO 2007/117505).
Однако только минорная популяция IgG в IVIG содержит гликаны, терминированные α-2,6сиаловыми кислотами (sFc), и имеет противовоспалительную активность. В результате, для супрессии воспаления, вызванного аутоантителами, во множестве клинических случаев специалисту следует вводить IVIG в высоких дозах (1-2 г/кг) для обогащения сиалированных IgG, или другим способом повышая сиалирование IgG (заявки США № 20080206246 и 20090004179, и Nimmerjahn et al. Annu Rev Immunol 26, 513-533 (2008)).
Настоящее изобретение направлено на решение вышеупомянутых проблем путем идентификации противовоспалительных полипептидов, свободных от сиалирования.
Сущность изобретения
Данное изобретение относится к агентам, таким как полипептиды и антитела, и к способам лечения воспалительных расстройств, например аутоиммунных заболеваний.
Соответственно один аспект данного изобретения характеризует выделенный полипептид, включающий модифицированную последовательность, которая по меньшей мере на 75% (например, любое число между 75 и 100%, включая, например, 70, 80, 85, 90, 95, 99 и 100%) идентична последовательности Fc-участка IgG. Модифицированная последовательность свободна от сиалирования, и полипептид обладает противовоспалительной активностью, которая выше, чем противовоспалительная активность исходного полипептида. Исходный полипептид может включать Fc-участок IgG, такой как последовательность SEQ ID NO: 1, приведенная ниже. В некоторых воплощениях полипептид обладает способностью связываться с DC-SIGN и связываться с hFcyRIIA или RIIB. В одном воплощении выделенный полипептид обладает способностью связываться с hFcyRIIA или RIIB при KD 2+10-5 М или ниже (т.е. KA 5+104 М1 или выше). Предпочтительно модифицированная последовательность содержит замену на аланин или консервативную аминокислоту в положении, соответствующем F241. Модифицированная последовательность может быть по меньшей мере на 75% (например, любое число между 75 и 100%, включая, например, 70, 80, 85, 90, 95, 99 и 100%) идентична SEQ ID NO: 2. В некоторых примерах модифицированная последовательность включает или, по существу, состоит из SEQ ID NO: 2.
В другом аспекте изобретение предоставляет способ получения полипептида, обладающего противовоспалительной активностью. Среди прочего способ включает стадии предоставления исходного полипептида, который на 75% идентичен Fc-участку hIgG1 с последовательностью SEQ ID NO: 1, или первой последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей исходный полипептид; и модификации исходного полипептида с получением модифицированного полипептида, последовательность которого свободна от сиалирования и имеет замену на аланин или консервативную аминокислоту в положении, соответствующем F241 последовательности SEQ ID NO: 1 согласно системе нумерации Kabat. Стадия модификации может проводиться путем модификации первой последовательности нуклеотидов с полу
- 1 031715 чением второй последовательности нуклеотидов, кодирующей модифицированный полипептид. Изобретение также предоставляет полипептид, полученный только что описанным способом.
В третьем аспекте изобретение характеризует выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, кодирующую полипептид, описанный выше, экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту, и клетку-хозяин, включающую нуклеиновую кислоту. Изобретение также характеризует способ получения полипептида. Способ включает культивирование клетки-хозяина в среде при условиях, дающих возможность экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой, и очистку полипептида из культивируемой клетки или из культуральной среды.
В четвертом аспекте в изобретении характеризуется фармацевтическая композиция, включающая (i) полипептид или нуклеиновую кислоту, описанные выше, и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
В пятом аспекте в изобретении предлагается способ лечения воспалительного заболевания. Способ включает введение нуждающемуся в этом объекту терапевтически эффективного количества вышеописанного полипептида или нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептид. Также предлагается применение полипептида или нуклеиновой кислоты в производстве лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания. Изобретение также характеризует выделенный полипептид, нуклеиновую кислоту, экспрессирующий вектор, клетку-хозяин, композицию или способ лечения воспалительного заболевания, по существу, как представлено и описано ниже.
Подробности одного или нескольких воплощений изобретения изложены в представленном ниже описании. Другие признаки, субъекты и преимущества изобретения будут очевидны из описания и из формулы изобретения.
Описание чертежей
Фиг. 1А-С представляют собой диаграммы и фотографии, демонстрирующие, что а-2,6-связанная сиаловая кислота придает DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc;
фиг. 2A-B - диаграммы фотографии, демонстрирующие, что нарушение взаимодействий Fc-гликана придает DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc;
фиг. 3 - набор диаграмм, демонстрирующих, что мутация FA241 в hIgG1 Fc суммирует противовоспалительную активность α-2,6 sFc;
фиг. 4A-D - диаграммы, демонстрирующие отличительные черты противовоспалительной активности FA241;
фиг. 5 - набор диаграмм, демонстрирующих, что мутация FA241 повышает связывание Fcy с рецептором;
фиг. 6A-B - фотографии, демонстрирующие индуцирование IL-33 мРНК с помощью FA241 в макрофагах, выделенных из костного мозга.
Подробное описание
Данное изобретение основано, по меньшей мере частично, на неожиданном обнаружении того, что несиалированные варианты IgG Fc придают противовоспалительную активность и имитируют эффект 2,6-сиалированных Fc в качестве противовоспалительных медиаторов.
Сиалирование IgG и Fc.
IgG представляет собой основной сывороточный иммуноглобулин. Он представляет собой гликопротеин, состоящий из двух идентичных тяжелых цепей и двух легких цепей, которые, в свою очередь, состоят из вариабельного и константного домена. IgG содержит единственный N-связанный гликан в Asn297 в CH2-домене на каждой из его двух тяжелых цепей. Ковалентно-связанный комплексный углевод состоит из сердцевины, биантеннального пентаполисахарида, содержащего N-ацетилглюкозамин (GIcNAc) и маннозу (man). Дополнительная модификация сердцевинной углеводной структуры наблюдается в сывороточных антителах в присутствии фукозы, разветвленной GIcNAc, галактозы (gal) и концевых компонентов сиаловой кислоты (sa), которые не всегда имеют место. Таким образом, детектировали около 40 различных гликоформ, которые ковалентно присоединены по данному единственному сайту гликозилирования (Fujii et al., J. Biol. Chem. 265, 6009, 1990). Было продемонстрировано, что гликозилирование IgG является существенным для связывания со всеми FcyRs путем поддержания открытой конформации двух тяжелых цепей. Jefferis and Lund, Immune. Lett. 82, 57 (2002), Sondermann et al., J. Mol. Biol. 309, 737 (2001). Считается, что данное гликозилирование IgG для связывания FcyR отвечает за невозможность дегликозилированных IgG-антител опосредовать вызванные in vivo воспалительные реакции, такие как ADCC, фагоцитоз и высвобождение медиаторов воспаления. Nimmerjahn and Ravetch, Immunity 24, 19 (2006). Дополнительные наблюдения того, что индивидуальные гликоформы IgG могут способствовать модулированию воспалительного ответа, подтвердили с помощью различных аффинностей для индивидуальных FcyRs, известных для IgG-антител, содержащих или лишенных фукозы, и с помощью их последующего влияния на цитотоксичность. Shields et al., J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn and Ravetch, Science 310, 1510 (2005). Связь между аутоиммунными состояниями и специфичными профилями гликозилирования IgG-антител наблюдали у пациентов с ревматоидным артритом и несколькими аутоиммунными васкулитами, при которых, как сообщалось, имело место пониженное галактозилирование и сиалирование IgG-антител. Parekh et al., Nature 316, 452 (1985), Rademacher et al.,
- 2 031715
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 6123 (1994), Matsumoto et al., 128, 621 (2000), Holland et al., Biochim. Biophys. Acta December 27. Также сообщалось, что вариации IgG-гликоформ ассоциированы с возрастом и с иммунитетом, хотя in vivo значимость этих изменений не определена. Shikata et al., Glycoconj. J. 15, 683 (1998), Lastra, et al., Autoimmunity 28, 25 (1998).
Как обсуждалось в данном документе, неожиданно оказалось, что некоторые несиалированные Fcварианты IgG также придавали противовоспалительную активность. Такие варианты, включающие вариант FA241, характеризуют виды внутри более крупного семейства молекул, которые имитируют структурные и биологические свойства сиалированных Fc, но не требуют сиалирования, и могут быть разработаны в качестве противовоспалительных терапевтических средств.
Полипептиды и нуклеиновые кислоты.
Полипептиды.
Как раскрыто в данном документе, в данном изобретении предлагаются выделенные полипептиды, содержащие последовательности Fc-вариантов IgG, которые лишены полисахаридной цепи, содержащей концевую сиаловую кислоту, связанную с галактозным компонентом посредством ц-2,6-связи по вышеупомянутому Asn297. Такие несиалированные Fc-варианты IgG могут быть либо выделенными из природного антитела, либо могут экспрессироваться в клеточной линии.
В одном варианте осуществления изобретения Fc-участок включает одну или более замен в аминокислотной последовательности hIgG1. В частности, типичные Fc-участки IgG1 представлены ниже.
Fc hIgG1 (начиная с аминокислоты 210 в системе Kabat):
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE
VKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKT
ISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL
DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:
1; F241 и F243 подчеркнуты)
Fc hIgG1 FA241:
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVALFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 2)
Fc hIgG1 FA243:
KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLAPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVS
HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 3)
Термины пептид, полипептид и белок используются взаимозаменяемо для описания расположения аминокислотных остатков в полимере. Пептид, полипептид или белок могут состоять из 20 стандартных природных аминокислот дополнительно к редким аминокислотам и к их синтетическим аналогам. Они могут представлять собой любую цепь аминокислот, независимо от длины или посттрансляционной модификации (например, гликозилирования или фосфорилирования). Пептид, полипептид или белок по настоящему изобретению включает рекомбинантно или синтетически полученные варианты, содержащие конкретные домены или участки, которые связываются с DC-SIGN, FcyRIIA и FcyRIIB. Термин также охватывает полипептиды, которые содержат добавленный N-концевой метионин (применяемый для экспрессии в прокариотических клетках).
Выделенный полипептид или белок относится к полипептиду или белку, которые отделены от других белков, липидов и нуклеиновых кислот, с которыми они ассоциированы в естественной среде. Полипептид/белок может составлять по меньшей мере 10% (т.е. любое процентное содержание между 10 и 100%, например 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 85, 90, 95 и 99%) сухого веса очищенного препарата. Чистота может измеряться с помощью подходящих стандартных методов, например с помощью колоночной хроматографии, электрофореза на полиакриламидном геле или ВЭЖХ. Выделенный полипептид/белок, описанный в изобретении, может быть очищен из природного источника, может быть получен с помощью технологии рекомбинантных ДНК или с помощью химических методов. Функциональный эквивалент IgG Fc относится к полипептидному производному IgG Fc, например к участку, содержащему одну или более мутаций, вставок, делеций, укорачиваний, сшитый белок или их комбинации. Он, по существу, сохраняет активность IgG Fc, т.е. способность связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ. Выделенный полипептид может содержать SEQ ID NO: 2. Вообще,
- 3 031715 функциональный эквивалент по меньшей мере на 75% (например, любое число между 75 и 100%, включая, например, 70, 80, 85, 90, 95 и 99%) идентичен SEQ ID NO: 2.
Процент идентичности двух аминокислотных последовательностей или двух нуклеиновых кислот определяется с использованием алгоритма Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, с модификацией как в Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Такой алгоритм включен в программы NBLAST и XBLAST (версии 2.0) Altschul et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Нуклеотидные поиски BLAST могут быть осуществлены с помощью программы NBLAST (сумма баллов = 100, размер слова = 12) для получения нуклеотидных последовательностей, гомологичных молекулам нуклеиновых кислот по изобретению. Белковый поиск Blast может быть осуществлен с помощью программы XBLAST (сумма баллов = 50, размер слова = 3) для получения аминокислотных последовательностей гомологичных белковым молекулам по изобретению. В случае существования пропусков между двумя последовательностями может применяться Gapped BLAST, как описано в Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402, 1997. При использовании программ BLAST и Gapped BLAST могут использоваться параметры по умолчанию соответствующих программ (например, XBLAST и NBLAST).
Аминокислотный состав полипептида, описанного в данном документе, может варьироваться без нарушения способности полипептида связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ. Например, он может содержать одну или несколько консервативных аминокислотных замен. Консервативная аминокислотная замена представляет собой такую замену, в которой аминокислотный остаток замещается остатком, имеющим похожую боковую цепь. Семейства аминокислотных остатков, имеющих похожие боковые цепи, известны в данной области. Эти семейства включают аминокислоты с основными боковыми цепями (например, лизин, аргинин, гистидин), с кислыми боковыми цепями (например, аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота), с незаряженными полярными боковыми цепями (например, глицин, аспарагин, глутамин, серин, треонин, тирозин, цистеин), с неполярными боковыми цепями (например, аланин, валин, лейцин, изолейцин, пролин, фенилаланин, метионин, триптофан), с β-разветвленными боковыми цепями (например, треонин, валин, изолейцин) и с ароматическими боковыми цепями (например, тирозин, фенилаланин, триптофан, гистидин). Таким образом, предсказанный несущественный аминокислотный остаток, например в SEQ ID NO: 2, предпочтительно заменяется на другой аминокислотный остаток из аминокислоты того же семейства боковых цепей. Альтернативно, мутации могут вводиться случайным образом по всей последовательности или в ее части, как, например, с помощью насыщенного мутагенеза, и полученные в результате мутанты могут скринироваться на способность связываться с соответствующим рецептором и вызывать соответствующий клеточный ответ для идентификации мутантов, которые сохраняют активность, как описано ниже в примерах.
Полипептид, описанный в данном изобретении, может быть получен в виде рекомбинантного полипептида. Для получения рекомбинантного полипептида нуклеиновая кислота, кодирующая его (например, FA241, SEQ ID NO: 2), может быть связана с другой нуклеиновой кислотой, кодирующей сшитый партнер по взаимодействию, например глутатион^-трансферазу (GST), метку 6x-His эпитопа или белок гена 3 М13. Полученная в результате сшитая нуклеиновая кислота экспрессирует в подходящих клеткаххозяевах сшитый белок, который может быть выделен с помощью методов, известных в данной области. Выделенный сшитый белок может быть дополнительно обработан, например, с помощью ферментативного гидролиза для удаления сшитого партнера и с получением рекомбинантного полипептида по настоящему изобретению.
Нуклеиновые кислоты.
Другой аспект изобретения характеризует выделенную нуклеиновую кислоту, включающую последовательность, которая кодирует полипептид или белок, описанный выше. Нуклеиновая кислота относится к молекуле ДНК (например, кДНК или геномной ДНК), молекуле РНК (например, мРНК) или к аналогу ДНК или РНК. Аналог ДНК или РНК может быть синтезирован из нуклеотидных аналогов. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, но предпочтительно является двухцепочечной ДНК. Выделенная нуклеиновая кислота относится к нуклеиновой кислоте, структура которой не идентична структуре любой природной нуклеиновой кислоты или структуре любого фрагмента природной геномной нуклеиновой кислоты. Таким образом, термин охватывает, например, (a) ДНК, которая имеет последовательность части природной геномной молекулы ДНК, но не фланкированной обеими из кодирующих последовательностей, которые фланкируют эту часть молекулы в геноме организма, в котором она присутствует в естественной среде; (b) нуклеиновую кислоту, включенную в вектор или в геномную ДНК прокариотов или эукариотов таким образом, что полученная в результате молекула не идентична любому природному вектору или геномной ДНК; (c) отдельная молекула, такая как кДНК, геномный фрагмент, фрагмент, полученный полимеразной цепной реакцией (ПЦР), или фрагмент рестрикции; и (d) рекомбинантная нуклеотидная последовательность, которая является частью гибридного гена, т. е. гена, кодирующего сшитый белок. Нуклеиновая кислота, описанная выше, может использоваться для экспрессии сшитого белка по настоящему изобретению. Для этой цели специалист может функционально связать нуклеиновую кислоту с подходящими регуляторными последовательностями
- 4 031715 для генерации экспрессирующего вектора.
Вектор относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной переносить другую нуклеиновую кислоту, с которой он связан. Вектор может быть способен к автономной репликации или к интеграции в ДНК хозяина. Примеры векторов включают плазмиду, космиду или вирусный вектор. Вектор включает нуклеиновую кислоту в форме, подходящей для экспрессии нуклеиновой кислоты в клетке-хозяине. Предпочтительно вектор включает одну или несколько регуляторных последовательностей, функционально связанных с экспрессируемой последовательностью нуклеиновой кислоты.
Регуляторная последовательность включает промоторы, энхансеры и другие элементы контроля экспрессии (например, сигналы полиаденилирования). Регуляторные последовательности включают те, которые направляют конститутивную экспрессию нуклеотидной последовательности, а также тканеспецифичные регуляторные и/или индуцируемые последовательности.
Конструирование экспрессирующего вектора может зависеть от таких факторов, как выбор трансформируемой клетки-хозяина, уровень экспрессии целевого белка или РНК и тому подобное. Экспрессирующий вектор может вводиться в клетки-хозяева с получением полипептида по настоящему изобретению. Промотор определяется как ДНК-последовательность, которая направляет РНК-полимеразу для связывания с ДНК и инициации синтеза РНК. Сильный промотор представляет собой такой промотор, который вызывает инциацию мРНК с высокой степенью частоты.
Любой полипептид, как упомянуто выше, или биологически эквивалентный полинуклеотид, доступный специалисту для таких же специальных целей, может вводиться в соответствующий экспрессирующий вектор и связываться с другими молекулами ДНК с образованием рекомбинантных молекул ДНК, экспрессирующих данный рецептор. Эти векторы могут состоять из ДНК или РНК; для большинства целей клонирования ДНК-векторы являются предпочтительными. Типичные векторы включают плазмиды, модифицированные вирусы, бактериофаг и космиды, дрожжевые искусственные хромосомы и другие формы эписомной или интегрированной ДНК. Специалисту в данной области хорошо известно, как определить подходящий вектор для конкретного применения.
Множество векторов, экспрессирующих в клетках млекопитающих, может использоваться для экспрессии вышеупомянутых IgG Fc в клетках млекопитающих. Как отмечено выше, экспрессирующие векторы могут представлять собой ДНК-последовательности, которые требуются для транскрипции клонированной ДНК и трансляции их мРНК в соответствующем хозяине. Такие векторы могут использоваться для экспрессии эукариотической ДНК во множестве хозяев, таких как бактерии, сине-зеленые водоросли, растительные клетки, клетки насекомых и животные клетки. Специфически сконструированные векторы дают возможность переноса ДНК между хозяевами, такими как бактериальные-дрожжевые клетки или бактериальные-животные клетки. Соответствующим образом сконструированный экспрессирующий вектор должен содержать последовательность начала репликации для автономной репликации в клеткаххозяевах, селектируемые маркеры, ограниченное количество применяемых сайтов ферментов рестрикции, потенциал для высокого количества копий и активные промоторы. Экспрессирующие векторы могут включать, в частности, клонирующие векторы, модифицированные клонирующие векторы, специально сконструированные плазмиды и вирусы. Коммерчески доступные векторы, экспрессирующие в клетках млекопитающего, которые могут быть подходящими, включают, в частности, pcDNA3.neo (Invitrogen), pcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega), pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 и pLITMUS39 (New England Bioloabs), pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene), pXT1 (Stratagene), pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV-1(8-2) (ATCC 37110), pdBPVMMTneo(342-12) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460) и IZD35 (ATCC 37565).
Также в рамках изобретения клетка-хозяин, которая содержит вышеописанную нуклеиновую кислоту. Примеры включают клетки E. coli, клетки насекомых (например, с использованием бакуловирусных экспрессирующих векторов), дрожжевые клетки или клетки млекопитающих. См., например, Goeddel, (1990) Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif. Для получения полипептида по настоящему изобретению специалист может культивировать клетку-хозяин в среде при условиях, дающих возможность экспрессии полипептида, кодируемого нуклеиновой кислотой по изобретению, и очистки полипептида из культивируемых клеток или из культуральной среды. Альтернативно, нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может транскрибироваться и транслироваться in vitro, например, с использованием промоторных регуляторных последовательностей T7 и T7полимеразы.
Все из природных IgG Fc, генетически сконструированных IgG Fc и химически синтезированных IgG Fc, могут использоваться для практического осуществления изобретения, раскрытого в данном документе. IgG Fc, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК, могут содержать такую же аминокислотную последовательность, как [FA241] SEQ ID NO: 2) или ее функциональный эквивалент. Термин IgG Fc также охватывает химически модифицированные варианты. Примеры химически модифицированных IgG Fc включают IgG Fc, подвергнутые конформационному изменению, вставке или делеции сахарной цепи, и IgG Fc, с которым связано соединение, такое как полиэтиленгликоль.
Специалист может проверить эффективность полученного таким образом полипептида/белка с ис
- 5 031715 пользованием животной модели, такой как трансгенная мышь, как описано ниже. Любое статистически значимое увеличение в in vivo экспрессии IL-33 базофилами или экспрессии FcyRIIB рецептора на эффекторных макрофагах выявляет полипептид/белок, который является кандидатом для лечения расстройства, упомянутого ниже. В одном варианте осуществления изобретения вышеописанные анализы могут быть основаны на измерении связывания с белком DC-SIGN или с клетками DC-SIGN(+). В данной области известно множество методов, доступных специалисту, которые подходят для измерения способности соединения связываться с DC-SIGN или с DC-SIGN(+) клетками и связанных с этим изменений в экспрессии гена, регулирующегося белками сигнального пути DC-SING, такого как IL-33. Специалист способен смешивать и комбинировать эти разнообразные исследовательские инструменты без излишнего экспериментирования. После очистки и тестирования с помощью стандартных методов или согласно анализам и методам, описанным в примерах ниже, несиалированные варианты IgG Fc могут быть включены в фармацевтическую композицию для лечения воспалительных расстройств.
При использовании в данном документе термин антитело используется в широком смысле и специфически охватывает моноклональные антитела (включая полноразмерные моноклональные антитела), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела) и антительные фрагменты при условии, что они демонстрируют целевую биологическую активность.
При использовании в данном документе термин антительные фрагменты может включать часть интактного антитела, как правило, включающую антигенсвязывающий или вариабельный участок интактного антитела или Fc-участок антитела, который сохраняет FcR-связывающую активность. Примеры антительных фрагментов включают линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител и мультиспецифичные антитела, образованные из антительных фрагментов. Антительные фрагменты предпочтительно сохраняют по меньшей мере часть шарнира и необязательно CHI-участок тяжелой цепи IgG. Более предпочтительно антительные фрагменты сохраняют цельный константный участок тяжелой цепи IgG и включает легкую цепь IgG.
При использовании в данном документе термин Fc-фрагмент или Fc-участок используется для определения C-концевого участка тяжелой цепи иммуноглобулина. Fc-участок может представлять собой нативную последовательность Fc-участка или вариант Fc-участка. Хотя связи Fc-участка тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-участок тяжелой цепи человеческого IgG обычно определяется как фрагмент от аминокислотного остатка в положении Cys226, или от Pro230 до его карбоксильного конца.
Нативная последовательность Fc-участка включает аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности Fc-участка, обнаруженного в естественной среде. Специалисту в данной области понятно, что вариант Fc-участка включает аминокислотную последовательность, которая отличается от нативной последовательности Fc-участка посредством по меньшей мере одной аминокислотной модификации. Предпочтительно вариант Fc-участка содержит по меньшей мере одну аминокислотную замену по сравнению с нативной последовательностью Fc-участка или с Fcучастком исходного полипептида, например примерно от одной примерно до десяти аминокислотных замен и предпочтительно примерно от одной примерно до пяти аминокислотных замен в нативной последовательности Fc-участка или в Fc-участке исходного полипептида. В данном документе вариант Fcучастка предпочтительно будет иметь по меньшей мере примерно 75 или 80% гомологии с нативной последовательностью Fc-участка и/или с Fc-участком исходного полипептида и более предпочтительно по меньшей мере примерно 90% гомологии с ним, более предпочтительно по меньшей мере примерно 95% гомологии, еще более предпочтительно по меньшей мере примерно 99% гомологии. Термины Fcрецептор или FcR используются для описания рецептора, который связывается с Fc-участком антитела. В одном воплощении изобретения FcR представляет собой нативную последовательность человеческого FcR. В другом воплощении FcR, включающий человеческий FcR, связывается с IgG-антителом (γрецептор) и включает рецепторы подклассов FcyRI, FcyRII и FcyRIII, включающие аллельные варианты и формы альтернативного сплайсинга этих рецепторов. FcyRII-рецепторы включают FcyRIIA (активирующий рецептор2) и FcyRIIB (ингибирующий рецептор), которые имеют похожие аминокислотные последовательности, которые отличаются главным образом в их цитоплазматических доменах. Активирующий рецептор FcyRIIA содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене. Ингибирующий рецептор FcyRIIB содержит иммунорецепторный мотив активации на основе тирозина (ITAM) в своем цитоплазматическом домене (см., обзор Daron, Annu Rev Immunol, 15, 203-234 (1997); FcR рассмотрены в Ravetch and Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods, 4, 25-34 (1994); и de Haas et al., J. Lab. Clin Med, 126, 330-41 (1995), Nimmerjahn and Ravetch 2006, Ravetch Fc Receptors in Fundemental Immunology, ed William Paul 5th Ed., каждый из которых включен в данный документ ссылкой).
Термин нативный или исходный относится к немодифицированному полипептиду, включающему аминокислотную последовательность Fc. Исходный полипептид может включать нативную последовательность Fc-участка или Fc-участок с уже существующими аминокислотными модификациями (такими как вставки, делеции и/или замены).
Композиции.
- 6 031715
В рамках настоящего изобретения композиция, которая содержит подходящий носитель и один или более агентов, описанных выше, таких как несиалированные Fc-варианты IgG.
Композиция может представлять собой фармацевтическую композицию, которая содержит фармацевтически приемлемый носитель, или косметическую композицию, которая содержит косметически приемлемый носитель.
Термин фармацевтическая композиция относится к комбинации активного агента с носителем, инертным или активным, делающим композицию особенно подходящей для диагностического или терапевтического применения in vivo или ex vivo. Фармацевтически приемлемый носитель после введения объекту не вызывает нежелательных физиологических эффектов. Носитель в фармацевтической композиции должен быть приемлемым также в том смысле, что он совместим с активным ингредиентом и может быть способен его стабилизировать. Один или более стабилизирующих агентов могут применяться в качестве фармацевтических носителей для доставки активного соединения. Примеры фармацевтически приемлемого носителя включают, в частности, биосовместимые носители, адъюванты, добавки и разбавители для доставки композиции, применяемой в качестве лекарственной формы. Примеры других носителей включают коллоидный оксид кремния, стеарат магния, целлюлозу и лаурилсульфат натрия.
Вышеописанная композиция, во многих формах описанная выше, может использоваться для лечения расстройств, характеризующихся воспалением. Эффективное количество относится к количеству активного соединения/агента, которое требуется для придания терапевтического эффекта объекту, подвергающемуся лечению. Специалисту в данной области понятно, что эффективные дозы будут варьироваться в зависимости от типов заболеваний, подвергаемых лечению, пути введения, применения эксципиента и возможности совместного использования с другим терапевтическим лечением.
Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может вводиться парентерально, перорально, назально, ректально, местно или буккально. При использовании в данном документе термин парентеральный относится к подкожной, внутрикожной, внутривенной, внутримышечной, внутрисуставной, внутриартериальной, внутрисиновиальной, надчревной, внутриоболочечной (внутрь пораженных тканей) или внутричерепной инъекции, а также к любому подходящему методу инфузии.
Стерильная композиция для инъекций может представлять собой раствор или суспензию в нетоксичном парентерально приемлемом разбавителе или растворителе. Такие растворы включают в частности 1,3-бутандиол, маннит, воду, раствор Рингера и изотонический раствор хлорида натрия. Кроме того, фиксированные масла подходящим образом применяются в качестве растворителя или суспендирующей среды (например, синтетические моно- или диглицериды). Жирная кислота, такая как, в частности, олеиновая кислота и ее глицеридные производные, применимы в препарате для инъекций, поскольку являются природными фармацевтически приемлемыми маслами, такими как, в частности, оливковое масло или касторовое масло, их полиоксиэтилированные варианты. Эти масляные растворы или суспензии также могут содержать длинноцепочечный спиртовой разбавитель или диспергирующий агент, такой как, в частности, карбоксиметилцеллюлоза или похожие диспергирующие агенты. Другие широко используемые поверхностно-активные вещества, такие как, в частности, TWEENS или SPANS или другие похожие эмульгирующие агенты или усилители биодоступности, которые широко используются в производстве фармацевтически приемлемой твердой, жидкой или другой лекарственной формы, также могут использоваться для целей составления композиции.
Композиция для перорального введения может представлять собой любую перорально приемлемую лекарственную форму, включающую капсулы, таблетки, эмульсии и водные суспензии, дисперсии и растворы. В случае таблеток широко используемые носители включают, в частности, лактозу и кукурузный крахмал. Также, как правило, добавляют смазывающие агенты, такие как, в частности, стеарат магния. Для перорального введения в капсульной форме применяемые разбавители включают, в частности, лактозу и сухой кукурузный крахмал. При пероральном введении водных суспензий или эмульсий активный ингредиент может суспендироваться или растворяться в масляной фазе, объединяясь вместе с эмульгирующими или суспендирующими агентами. Если целесообразно, могут быть добавлены некоторые подсластители, ароматизаторы или красители.
Фармацевтические композиции для местного введения согласно описанному изобретению могут быть составлены в виде растворов, мазей, кремов, суспензий, лосьонов, порошков, паст, гелей, спреев, аэрозолей или масел. Альтернативно местные составы могут быть представлены в форме пластырей или повязок, пропитанных активным(и) ингредиентом(ами), которые необязательно могут включать один или несколько эксципиентов или разбавителей. В некоторых предпочтительных воплощениях местные составы включают материал, который будет усиливать абсорбцию или проникновение активного агента(ов) через кожу или другие подверженные воздействию области. Местная композиция применяется для лечения воспалительных расстройств на коже, включающих, в частности, экзему, акне, розацеа, псориаз, контактный дерматит и реакции на сумах ядоносный.
Местная композиция содержит безопасное и эффективное количество дерматологически приемлемого носителя, подходящего для применения на коже. Косметически приемлемая или дерматологически приемлемая композиция или компонент относятся к композиции или компоненту, которые подходят для применения в контакте с человеческой кожей без нежелательной токсичности, несовместимости,
- 7 031715 нестабильности, аллергической реакции и так далее. Носитель дает возможность доставки активного агента и необязательного компонента на кожу в соответствующей концентрации. Таким образом, носитель может действовать в качестве разбавителя, диспергирующего агента, растворителя или подобного для гарантии того, что активные материалы будут применимы и распределены по выбранной мишени в соответствующей концентрации. Носитель может быть твердым, полутвердым или жидким. Носитель может быть представлен в форме лосьона, крема или геля, конкретно в такой форме, которая имеет достаточную консистенцию и предел текучести для предотвращения седиментации активного материала. Носитель может быть инертным или обладает дерматологически полезными свойствами. Также он должен быть физически и химически совместимым с активными компонентами, описанными в данном документе, и не должен чрезмерно ослаблять стабильность, эффективность или другие полезные свойства, ассоциированные с композицией. Местная композиция может представлять собой косметический или дерматологический продукт в форме, известной в данной области для местного или трансдермального применения, включающей растворы, аэрозоли, кремы, гели, пластыри, мазь, лосьон или пенку.
Способы обработки (лечения).
В описанном изобретении предлагаются способы лечения у объекта воспалительного расстройства. Термин воспалительное расстройство относится к расстройству, которое характеризуется аномальным или нежелательным воспалением, такому как аутоиммунное заболевание. Аутоиммунные заболевания и расстройства характеризуются хронической активацией иммунных клеток при неактивирующих условиях. Примеры включают псориаз, воспалительные заболевания кишечника (например, болезнь Крона и неспецифический язвенный колит), ревматоидный артрит, псориатический артрит, рассеянный склероз, волчанка, диабет I типа, билиарный первичный цирроз печени и трансплантация.
Другие примеры воспалительных расстройств, которые могут подвергаться лечению с помощью способов по настоящему изобретению, включают астму, инфаркт миокарда, инсульт, воспалительные дерматозы (например, дерматит, экзему, атопический дерматит, аллергический контактный дерматит, крапивницу, некротический васкулит, кожный васкулит, гиперчувствительный васкулит, эозинофильный миозит, полимиозит, дерматомиозит и атонический фасциит), синдром острой дыхательной недостаточности, молниеносный гепатит, заболевания гиперчувствительности легких (например, гиперчувствительный пневмонит, эозинофильная пневмония, гиперчувствительность замедленного типа, интерстициальное заболевание легких (ILD), идиопатический фиброз легких и ILD, ассоциированное с ревматоидным артритом) и аллергический ринит. Дополнительные примеры также включают миастению гравис, юношеский диабет, гломерулонефрит, аутоиммунный тиреоидит, анкилозирующий спондилоартрит, склеродермию, острые и хронические воспалительные заболевания (например, системная анафилаксия или гиперчувствительные реакции, аллергии на лекарственные средства, аллергии на укусы насекомых, отторжение аллотрансплантата и реакция трансплантат против хозяина) и синдром Шегрена.
Объект относится к человеку и к животному, отличному от человека. Примеры животных, отличных от человека, включают позвоночных, например млекопитающих, таких как млекопитающие, отличные от человека, приматы, отличные от человека (конкретно высшие приматы), собака, грызун (например, мышь или крыса), морская свинка, кошка и кролик, и не млекопитающие, такие как птицы, амфибии, рептилии и т. д. В одном варианте осуществления изобретения объектом является человек. В другом варианте осуществления изобретения объектом является экспериментальное животное, отличное от человека, или животное, подходящее в качестве модели заболевания.
Объект, подвергаемый лечению воспалительного расстройства, может быть идентифицирован с помощью стандартных методов диагностики расстройства. Необязательно объект может исследоваться на предмет уровня или процентное содержание одного или нескольких цитокинов или клеток тестируемого образца, полученных из объекта с помощью методов, известных в данной области. Если уровень или процентное содержание на уровне порогового значения или ниже (которое может быть получено для здорового объекта), то объект является кандидатом для лечения, описанного в данном документе. Для подтверждения ингибирования или лечения специалист может оценить и/или подтвердить уровень или процентное содержание одного или нескольких вышеупомянутых цитокинов или клеток у объекта после лечения.
Лечение (treating) или лечение (обработка) (treatment) относится к введению соединения или агента объекту, у которого есть расстройство, с целью лечения, облегчения, ослабления, уменьшения, устранения, задержки приступа, предотвращения или улучшения состояния при расстройстве, предотвращения или улучшения симптома расстройства, болезненного состояния, вторичного по отношению к расстройству, или предрасположенности по отношению к расстройству.
Эффективное количество или терапевтически эффективное количество относится к количеству соединения или агента, которое способно производить целевой с медицинской точки зрения результат у объекта, подвергаемого лечению. Способ лечения может осуществляться in vivo или ex vivo, индивидуально или совместно с другими лекарственными средствами или терапией. Терапевтически эффективное количество может вводиться за одно или несколько введений, применений или дозировок и не предназначено для ограничения конкретного состава или пути введения.
Агент может вводиться in vivo или ex vivo, индивидуально или совместно с другими лекарственны
- 8 031715 ми средствами или терапиями, т.е. терапия коктейля. При использовании в данном документе термин совместное введение или совместно вводимые относится к введению объекту по меньшей мере двух агентов или терапий. В некоторых вариантах осуществления изобретений совместное введение двух или более агентов/терапий осуществляется одновременно. В других вариантах осуществления изобретений первый агент/терапия вводится перед вторым агентом/терапией. Специалистам в данной области понятно, что составы и/или пути введения различных используемых агентов/терапий могут варьировать.
В in vivo способе объекту вводят соединение или агент. Как правило, соединение или агент суспендируют в фармацевтически приемлемом носителе (таком как, например, в частности, физиологический солевой раствор) и вводят перорально или с помощью внутривенной инфузии или инъецируют или имплантируют подкожно, внутримышечно, внутриоболочечно, внутрибрюшинно, внутриректально, внутривагинально, внутриназально, внутрижелудочно, внутритрахейно или внутрилегочно.
Требуемая дозировка зависит от выбора пути введения; природы состава; природы болезни пациента; габаритов объекта, веса, площади поверхности, возраста и пола; введения других лекарственных средств и предписаний врача. Подходящие дозировки находятся в интервале 0,01-100 мг/кг. Вариации необходимых дозировок ожидаемы с точки зрения разнообразия доступных соединений/агентов и различных эффективностей различных путей введения. Например, ожидается, что для перорального введения будут требоваться более высокие дозировки, чем для внутривенной инъекции. Вариации в данных дозировках могут регулироваться с использованием стандартных эмпирических путей оптимизации, хорошо известных в данной области. Инкапсулирование соединения в подходящем носителе для доставки (например, в полимерных микрочастицах или в имплантируемых устройствах) может повышать эффективность доставки, особенно для пероральной доставки.
Пример 1. Методы и материалы.
Данный пример описывает методы и материалы, используемые в примерах 2-7.
Мыши.
Мышей C57BL/6 дикого типа приобретали в Jackson Laboratories. Мыши SIGNR1-/- были предоставлены A. McKenzie. Трансгенные CD11c-DC-SIGN+ мыши были предоставлены T. Sparwasser. Трансгенных мышей hDC-SIGN BAC генерировали на основе SIGNR1-/- в лаборатории авторов изобретения, как описано ранее. Мышей KRN TCR C57BL/6 (подарок D. Mathis и C. Benoist) скрещивали с мышами NOD с получением мышей K/BxN. Кровь у мышей K/BxN (в возрасте 6-12 недель) отбирали и собирали вместе сыворотку, содержащую артритогенные антитела. Пассивный перенос 200 мкл K/BxN сыворотки с помощью внутривенной инъекции наивным мышам (в возрасте 8-12 недель) индуцировал артрит. Воспаление оценивали в баллах 0-3 для каждой лапы и суммировали для общей клинической бальной оценки индивидуальной мыши.
Получение рекомбинантного Fc.
IDEC-114, рекомбинантный источник полноразмерного человеческого моноклонального антитела IgG1, гидролизовали папаином в течение ночи при 37°C для отщепления фрагментов Fab и Fc. После гидролиза реакцию останавливали путем добавки 2,5 мг/мл йодацетамида. Для отделения отщепленных фрагментов от негидролизованного антитела образцы пассировали через колонку HiPrep 26/60 S-200HR эксклюзионной хроматографии (GE HEALTHCARE). Затем Fc-фрагмент очищали с помощью агарозных гранул с белком G. Чистоту образца подтверждали путем окрашивания кумасси синим SDSполиакриламидных гелей. Альтернативно, рекомбинантные Fc получали путем транзиторной трансфекции плазмид, экспрессирующих человеческий IgG1 Fc, в клетки 293T с последующим осаждением сульфатом аммония надосадочных фракций и очистки с белком G. Генетическую последовательность, кодирующую Fc-участок человеческого IgG1, амплифицировали из 4-4-20 IgG1 с помощью стандартных протоколов ПЦР и лигировали в pSecTag2 (INVITROGEN). Точечные мутации вводили в последовательность, кодирующую Fc, с помощью стандартных методов сайтнаправленного мутагенеза и подтверждали с помощью анализа ДНК-секвенирования. ПЦР-праймеры для замены Phe на Ala в положении 241 (FA241):
5'-ggggaccgtcagtcgccctcttccccccaa-3' (SEQ ID NO: 4) и 5'-ttggggggaagagggcgactgacggtcccc-3' (SEQ ID NO: 5).
Экспрессию белка и чистоту подтверждали с помощью иммуноблоттинга с антителами к человеческому Fc и/или с помощью окрашивания кумасси синим SDS-полиакриламидных гелей.
Двухстадийная in vitro реакция сиалирования.
После очистки 10-50 мг/мл Fc-фрагментам меняли буфер на буфер для реакции галактозилирования (50 мМ MOPS, pH 7,2; 2 0 мМ MnCl2) и инкубировали в течение ночи при 37°C вместе с 50 мг UDPгалактозы и 0,75 U β-1,4-галактозилтрансферазы. Галактозилирование подтверждали с помощью лектиновых блотов с использованием ECL для распознавания конечных галактозных остатков. Затем галактозилированным Fc меняли буфер на реакционный буфер для сиалирования (100 мМ MOPS, 0,2 мг/мл BSA, 0,5% Triton X-100, pH 7,4) и инкубировали в течение ночи при 37°C вместе с 50 мг CMP-сиаловой кислоты и 0,75 Ед ц-2,6-сиалилтрансферазы. Сиалирование подтверждали с помощью лектиновых блотов с использованием SNA для распознавания конечных остатков сиаловой кислоты со связью α-2-6.
Адоптивный перенос макрофагов, выделенных из костного мозга.
- 9 031715
Костномозговые клетки вымывали струей из большой берцовой кости и из бедренной мышей DCSIGNtg или SIGNR1-/- и высевали в 10-см планшеты, обработанные для нетканевых культур, в ростовой среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS, 1% пен/стреп, IL-3 (5 нг/мл, PEPROTECH) и M-CSF (5 нг/мл, PEPROTECH). После ночной инкубации при 37°C неприкрепленные клетки извлекали и переносили в 10-см планшеты, обработанные для нетканевых культур, содержащие ростовую среду RPMI с добавкой IL-3/M-CSF, и культивировали в течение 5-7 дней при 37°C. Зрелые макрофаги трипсинизировали и высевали в 6-луночные планшеты с плотностью 2*106 клеток/на лунку и давали им возможность прикрепиться в течение ночи. На следующий день макрофаги стимулировали с использованием указанного препарата рекомбинантного Fc в течение 30 мин при 37°C. Клетки извлекали, промывали холодным PBS и внутривенно вводили 1*106 клеток мышам C57BL/6 дикого типа. Через 1 ч после инъекции реципиентных мышей заражали сывороткой K/BxN.
Экспрессия и очистка растворимого человеческого DC-SIGN.
Плазмида, содержащая кДНК-последовательность внеклеточного домена (ECD) человеческого DCSIGN, была предоставлена K. Drickamer. Кодирующую последовательность DC-SIGN ECD модифицировали для введения N-концевой стреп-метки с помощью стандартных методов ПЦР и лигировали с pET28b(+). pET28b-strepDCSIGN трансформировали в E. coli штамм BL21/DE3 и растили в 3 л ростовой среды TB при 37°C до момента достижения бактериальной культурой OD600 0,7-0,8. Экспрессию белка индуцировали путем добавления 100 мг/л IPTG и культуры инкубировали при 37°C в течение 3,5 ч. Бактерии осаждали путем центрифугирования при 4000*g в течение 10 мин при 4°C. Осадки бактерий ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl, pH 7,8, и лизировали обработкой ультразвуком. Тельца включения осаждали путем центрифугирования при 10000*g в течение 15 мин при 4°C и солюбилизировали в 100 мл 6М гуанидин-HCl; 100 мМ Трис-HCl, pH 7,8; 0,2% TRITON X-100. Твердые примеси удаляли путем центрифугирования при 20000*g в течение 30 мин при 4°C и надосадочную фракцию диализовали против 250 мМ NaCl; 25 мМ Трис-HCl, pH 7,8; 25 мМ CaCl2. После диализа нерастворимые осадки удаляли путем центрифугирования при 20000*g в течение 30 мин при 4°C и надосадочную фракцию применяли к смоле strep-tactin (NOVAGEN) для сбора strep-меченных DC-SIGN ECD. Связанный белок элюировали из смолы с использованием элюирующего буфера, предоставленного производителем (NOVAGEN). Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE, и положительные фракции объединяли и загружали на манноза-агарозную колонку для селекции активных рецепторов. DC-SIGN ECD элюировали с помощью 250 мМ NaCl; 25 мМ Трис-HCl, pH 7,8; 5 мМ EDTA. Фракции анализировали с помощью SDS-PAGE.
Поверхностный плазмонный резонанс.
Для определения взаимодействия между различными препаратами рекомбинантного Fc с растворимым hDC-SIGN или hFcyRs, записывали измерения равновесной аффинности на сенсор Biacore T100. Рецепторы, разведенные до 20-50 мкг/мл в NaOAc pH 5, иммобилизовали на чипах CM5 с высокой плотностью (2000 RU) с помощью стандартной конденсации аминогрупп. Для взаимодействий hDC-SIGN инъекции осуществляли при скорости потока 20 мкл/мин с коммерчески доступным буфером HBS-P+, доведенным до pH 9, и с добавлением 2 мМ CaCl2 и 500 мМ NaCl. Для взаимодействий hFcyRs инъекции осуществляли со скоростью потока 20 мкл/мин с коммерчески доступным буфером HBS-EP+. Поверхности регенерировали с использованием короткой обработки 50 мМ NaOH. Значения Kd рассчитывали после вычитания фонового связывания с контрольной проточной ячейкой с использованием программного обеспечения Biacore Evaluation.
ОТ-ПЦР.
Суммарную РНК экстрагировали из костномозговых макрофагов с использованием набора реагентов RNeasy Mini kit (QIAGEN). Один микрограмм суммарной РНК использовали для анализа экспрессии IL-33 мРНК с помощью ОТ-ПЦР с использованием набора реагентов OneStep RT-PCR kit (QIAGEN). Экспрессия GAPDH служила в качестве контроля загрузки. ПЦР-праймеры для mIL-33: 5'gaagatcccaacagaagacc-3' (SEQ ID NO: 6) и 5'-ttccggaggcgagacgtcac-3' (SEQ ID nO: 7); и mGAPDH: 5'gccgcctggagaaacctgc-3' (SEQ ID NO: 8) и 5'-tgaggtccaccaccctgttg-3' (SEQ ID NO: 9). Условия ПЦР: 94°C в течение 30 с; 55°C в течение 30 с; 72°C в течение 60 с * 35 циклов (IL-33) или 25 циклов (GAPDH).
Пример 2. а-2,6-связанная сиаловая кислота придавала DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc.
Минорная популяция антител в IVIG-препаратах подавляет воспаление, индуцированное аутоантителами. Эти антитела, содержащие концевую а-2,6-связанную сиаловую кислоту на Fc-гликане, опосредуют противовоспалительный ответ путем связывания с SIGNR1 на макрофагах периферической области или с его человеческим ортологом DC-SIGN на миелоидных клетках.
Для изучения взаимодействия sFc с DC-SIGN растворимую форму внеклеточного домена DC-SIGN (DC-SIGN ECD) очищали из бактерий и иммобилизовали на СМ5-чипах. sFc получали из полноразмерных антител IDEC-114 и сиалировали in vitro (фиг. 1B) и специфично связывали с DC-SIGNконъюгированной поверхностью (фиг. 1A). Измерения равновесной аффинности проводили и значение KD для данного взаимодействия рассчитывали как ~1,3 *10-6 М (фиг. 1C). Напротив, несиалированная гликоформа IDEC-114 Fc продемонстрировала отсутствие связывающей активности с DC-SIGN, предполагающее, что сиалирование индуцирует конформационные изменения в остове Fc с обнаружением сай
- 10 031715 та связывания DC-SIGN.
Как представлено на фиг. 1A, было обнаружено, что рекомбинантный a-2,6-sFc связывался с растворимым DC-SIGN согласно измерениям поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fc получали с помощью папаинового расщепления полноразмерного человеческого моноклонального антитела IgG1 (IDEC-114) с последующими in vitro реакциями галактозилирования и сиалирования. Сенсограммы SPR для антитела, связывающегося с иммобилизованным DC-SIGN, представлены для сиалированных и галактозилированных гликоформ hIgG1 Fcs, как описано выше в примере 1. Было обнаружено, что концентрация Fc, проходящая потоком через DC-SIGN ECD, колеблется в интервале 3-0,8 цМ. Как представлено на фиг. 1B, лектиновый блот с SNA подтвердил прикрепление сиаловой кислоты с 2,6-связью на Fc (верхняя панель); окрашенные кумасси контроли представлены на нижней панели. Измерение равновесной KD связывания sFc с DC-SIGN (как представлено в a) рассчитывали с помощью пакета программ Biacore Evaluation.
Пример 3. Мутация, разрушающая взаимодействия Fc-гликан, придавала DC-SIGN-связывающую активность рекомбинантному человеческому IgG1 Fc.
Сердцевинная олигосахаридная цепь, присоединенная к Asn297, делает экстенсивными нековалентные взаимодействия с аминокислотным остовом Fc. Конформационные изменения в Fc, индуцированные с помощью различных сахарных остатков, присоединенных к сердцевинному гликану, опосредуются с помощью этих белок-углеводных взаимодействий. Замены аланина, которые ликвидируют ключевые контактные точки между остовом Fc и остатками гликана, по-видимому, обеспечивают DC-SIGNсвязывающую активность.
Как представлено на фиг. 2A, мутации FA241 и FA243 демонстрируют DC-SIGN-связывающую активность без in vitro ферментативной обработки. Истинные значения KD колеблются от 6*10-7 М для FA241 до 3*10-7 М для FA243. Предыдущие сообщения выявляют, что эти мутации повышают сиалирование антител, в основном делая гликан более доступным гликозилтрансферазам при экспрессии в клетках млекопитающего. Для подтверждения этого осуществляли опыт с лектиновым блотом для определения того, что связывание FA241 и FA243 с DC-SIGN осуществляется благодаря повышенному сиалированию транзиторно экспрессированных белков. Как представлено на фиг. 2B, SNA-блоты не детектировали концевых остатков сиаловой кислоты в очищенных FA241 и FA243, указывая, что взаимодействие DC-SIGN было независимым от модификации сиаловой кислоты.
Более конкретно остатки F241, F243, D265 и R301 аминокислотного остова IgG1 Fc заменяли аланином для нарушения нековалентных взаимодействий с олигосахаридными остатками. Fc экспрессировали и очищали из клеток 293T и анализировали на предмет DC-SIGN-связывающей активности с использованием поверхностного плазмонного резонанса, как описано выше. Было обнаружено, что Fc, несущие мутации FA241 или FA243, демонстрировали повышенную аффинность к DC-SIGN по отношению к измерениям аффинности для sFc (фиг. 1A). Проводили опыты с лектиновыми блотами с ECL (фиг. 1B, средняя панель) и SNA (верхняя панель) для определения концевых сахарных компонентов на Fc, очищенных из клеток 293T. В качестве положительного контроля для сиалированных Fc FA241 сиалировали in vitro, как описано на фиг. 1A. Окрашенные кумасси контроли загрузки представлены на нижней панели фиг. 1B.
Пример 4. Мутация FA241 в hIgG1 Fc повторяла противовоспалительную активность α-2,6 sFc.
Если мутации FA241 и FA243 имитируют DC-SIGN-связывающую активность sFc, то проводили анализы для исследования того, могут ли эти мутации повторять противовоспалительную активность sFc in vivo. Подобранных по возрасту и полу мышей SIGNR1-/- и hDC-SIGN+/SIGNR1-/- заражали с помощью артритогенной сыворотки K/BxN и обрабатывали с помощью sFc, FA241 или FA243 с эффективной дозой 0,033 г/кг. Согласуясь с предыдущими открытиями, sFc подавлял опухоль стопы у мышей DC-SIGN+, но не у мышей SIGNR1-/-. Аналогично мутация FA241 демонстрировала противовоспалительную активность, сравнимую с противовоспалительной активностью sFc у мышей hDC-SIGN+/SIGNR1-/-. Мыши, которым вводили FA243, демонстрировали отсутствие уменьшения воспаления сустава. Эти открытия предполагают, что рекомбинантные Fc, несущие мутацию F241A (FA241), повторяли связывание DCSIGN и противовоспалительную активность sFc в отсутствие модификации сиаловой кислоты.
Как представлено на фиг. 3, мышам hDC-SIGN+/SIGNR1-/-(белые квадраты) и SIGNR1-/- (черные квадраты) вводили с помощью 0,7 мг/на мышь sFc, FA241 или FA243 внутривенной инъекции. Затем мышей заражали с помощью K/BxN сыворотки через 1 ч. Опухание стоп отслеживали и оценивали в течение нескольких дней. Как сообщалось ранее, противовоспалительная активность sFc является DCSIGN-зависимой (левая панель). FA241 также подавляла артритное воспаление у зараженных мышей K/BxN DC-SIGN- зависимым образом, FA243 не уменьшала в значительной степени опухания стопы на 6-й день. Средние значения и SEM клинических бальных оценок 4-5 мышей на группу наносили на график на 6-й день.
Пример 5. Отличительные требования для противовоспалительной активности FA241.
Для идентификации детерминант для противовоспалительной активности FA241 костномозговые макрофаги (ВММФ) из мышей CD11c.DC-SIGN+ и SIGNR1-/- стимулировали с помощью FA241 или других Fc-препаратов и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6, зараженным сывороткой K/BxN.
- 11 031715
Вкратце костномозговые макрофаги из мышей CD11c.DC-SIGN^ и SIGNR1 культивировали в присутствии IL-3 (5 нг/мл) и M-CSF (5 нг/мл) в течение 5-7 дней. Как представлено на фиг. 4, DC-SIGN+ ВММФ стимулировали с помощью 0,5 мг/мл несиалированных (черные полоски) или сиалированных (белые полоски) гликоформ указанных Fc-препаратов. Fc-обработанные ВММФ переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Как представлено на фиг. 4B SIGNR1-/(черные полоски) и DC-SIGN' (белые полоски) ВММФ стимулировали с помощью 0,5 мг/мл указанного Fc-препарата и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Аналогично, DC-SIGN^ ВММФ стимулировали с помощью либо 0,5 мг/мл FA241 или дегликозилированного FA241 (фиг. 4C, белые полоски) либо с помощью PBS (фиг. 4C, черная полоска) и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. FA241 дегликозилировали с помощью PNG-азы F и удаление гликана подтверждали с помощью лектиновго блоттинга. DC-SIGN^ ВММΦ стимулировали с помощью указанного несиалированного Fc-препарата или с помощью PBS (фиг. 4D, черный круг) и переносили реципиентным мышам WT C57BL/6 с последующим заражением K/BxN. Во всех случаях опухоль стоп отслеживали и оценивали в течение нескольких дней. Средние значения и стандартные ошибки средних значений (SEM) клинических бальных оценок 4-5 мышей на группу наносили на график. *P<0,05, как определено с помощью дисперсионного анализа (ANOVA), с последующим апостериорным тестом Тьюки.
Как представлено на фиг. 4A, несиалированные и сиалированные FA241-препараты были эффективны в равной степени в подавлении воспаления сустава по сравнению с sFc. Однако WT Fc-препараты требовали а-2,6-связанной сиаловой кислоты, так как DC-SIGN^ ВММΦ, стимулированные асилированным WT Fc, не передавали защиту реципиентным мышам. Соответственно результатам, представленным на фиг. 3, обоим, sFc и FA241, требовалась экспрессия DC-SIGN на ВММΦ для передачи защиты (фиг. 4B). Хотя FA241 не требует сиаловой кислоты для передачи защиты, дегликозилирование с помощью PNG-азы F отменяло противовоспалительные свойства FA241 (фиг. 4C), предполагая, что Fc гликан все равно необходим. Кроме того, для демонстрации того, что наблюдаемая противовоспалительная активность специфична для мутации F24iA, DC-SIGN+ ВММΦ стимулировали с помощью Fc, несущих альтернативные мутации, которые не придают повышенного связывания DC-SIGN. Только EA241стимулированные ВММΦ защищали зараженных реципиентных мышей K/BxN.
Пример 6. Мутация FA241 повышала связывание рецептора Fcy.
Если замена аланина в положении 241 индуцирует конформационное изменение в Fc, то возможно будет изменяться аффинность к человеческим рецепторам Fcy. Ранее сообщалось, что сиалирование уменьшает аффинность IgG к FcyR, ослабляя вследствие этого активность ADCC in vivo.
Связывание рекомбинантных IgG1 Fc с растворимыми FcyR измеряли с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Fc готовили способом, описанным выше. Сенсограммы SPR для связывания антитела с иммобилизованным hFcyRIIA131R и hFcyRIIB представлены на фиг. 5 для несиалированных и сиалированных гликоформ WT hIgG1 Fc и для несиалированной формы FA241 Fc.
Как представлено на фиг. 5, несиалированные гликоформы WT Fc связывались с hFcyRIIA и RIIB с наблюдаемым значением KD ~2-3*10-5 М. Однако sFc, по-видимому, не связывались ни с hFcyRIIA, ни с RIIB. Неожиданно обнаружилось, что FA241, по-видимому, связываются с обоими, hFcyRIIA и RIIB, с аффинностью более высокого порядка (Kd=~2x10-6 M).
Пример 7. Индуцирование IL-33 мРНК в костномозговых макрофагах с помощью FA241.
sFc индуцирует Тн2-зависимый противовоспалительный путь, который требует секреции IL-4 из популяции лейкоцитов FceRI'. вероятно, базофилов, для положительной регуляции FcyRIIB на регуляторных макрофагах. Введение IL-33 in vivo или in vitro стимулирует базофилы для высвобождения запасов IL-4. Экспрессия IL-33 мРНК положительно регулируется в селезенке мышей WT C57BL/6, обработанных с помощью sFc или IVIG, но не у мышей SIGNR1-/-. Это предполагает, что sFc может индуцировать экспрессию IL-33 в клетках SIGNR1+ или DC-SIGN® В данном примере анализы проводили и продемонстрировали, что стимулирование DC-SIGN^ ВММФ с помощью FA241, по-видимому, положительно регулирует экспрессию IL-33.
Более конкретно, костномозговые макрофаги из мышей CDUc.DC-SIGN^ и SIGNR1-/- культивировали способом, описанным выше. ВММФ высевали на 12-луночные планшеты в бессывороточной среде RPMI и давали возможность прикрепиться в течение ночи при 37°C. На следующий день клетки стимулировали с помощью 0,5 мг/мл указанного Fc в бессывороточной среде RPMI в течение 1 ч (фиг. 6A) или 4 ч (фиг. 6B) при 37°C. мРНК собирали из клеток в конкретные моменты времени и 1 цг суммарной РНК использовали для ОТ-ПЦР амплификации IL-33 мРНК (верхние панели). Амплификация GAPDH служила в качестве контроля загрузки (нижние панели). Плазмидой, совместно экспрессирующей DA265 Fc и человеческую сиалилтрансферазу (ST6Gal1), трансфецировали в клетки 293T с получением высокосиалированного рекомбинантного Fc (ST6-DA265).
Как представлено на фиг. 6, стимулирование DC-SIGN+ ВММФ с помощью FA241, по-видимому, положительно регулирует экспрессию IL-33. Несмотря на высокий базальный уровень экспрессии IL-33 по сравнению с DC-SIGN+ ВММФ, SIGNR1-/- ВММФ отрицательно регулировали экспрессию IL-33 мРНК в ответ на обработку FA241.
- 12 031715
Вышеописанный пример и описание предпочтительных вариантов осуществления следует понимать в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения настоящего изобретения, определенного формулой изобретения. Все публикации, процитированные в данном документе, включены в настоящий документ ссылкой в полном объеме. Понятно, что многочисленные вариации и комбинации признаков, представленных выше, могут применяться, не выходя при этом за рамки настоящего изобретения, представленного в формуле изобретения. Такие вариации не рассматриваются как выходящие за рамки изобретения, и подразумевается, что все такие вариации включены в рамки следующей формулы изобретения.
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> The Rockefeller University
Ravetch, Jeffrey V
Pincetic, Andrew <120> Противовоспалительный несиалированный полипептид модифицированного Fc-участка hIgG1, способ его получения и применение <130> RU1062/070413.20147 <140> PCT/US TBD <141> 2012-12-04 <150> US 61/577,361 <151> 2011-12-19 <160>9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211>238 <212> БЕЛОК <213> Homo sapiens <400>1
Lys 1 Val Asp Lys Arg 5 Val Glu Pro Lys Ser 10 Cys Asp Lys Thr His 15 Thr
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
20 25 30
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
35 40 45
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
50 55 60
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
65 70 75 80
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
85 90 95
- 13 031715
Leu Thr Val Leu 100 His Gln Asp Trp Leu 105 Asn Gly Lys Glu Tyr 110 Lys Cys
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
165 170 175
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
195 200 205
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
210 215 220
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 2 <211> 238 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> FA241 Мутант <400> 2
Lys 1 Val Asp Lys Arg 5 Val Glu Pro Lys Ser 10 Cys Asp Lys Thr His 15 Thr
Cys Pro Pro Cys 20 Pro Ala Pro Glu Leu 25 Leu Gly Gly Pro Ser 30 Val Ala
Leu Phe Pro 35 Pro Lys Pro Lys Asp 40 Thr Leu Met Ile Ser 45 Arg Thr Pro
Glu Val 50 Thr Cys Val Val Val 55 Asp Val Ser His Glu 60 Asp Pro Glu Val
- 14 031715
Lys 65 Phe Asn Trp Tyr Val 70 Asp Gly Val Glu Val 75 His Asn Ala Lys Thr 80
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
85 90 95
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
100 105 110
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
165 170 175
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
195 200 205
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
210 215 220
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 3 <211> 238 <212> БЕЛОК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> FA243 Мутант <400> 3
Lys 1 Val Asp Lys Arg 5 Val Glu Pro Lys Ser 10 Cys Asp Lys Thr His 15 Thr
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
20 25 30
Leu Ala Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
- 15 031715
Glu Val 50 Thr Cys Val Val Val 55 Asp Val Ser His Glu 60 Asp Pro Glu Val
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
65 70 75 80
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
85 90 95
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
100 105 110
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
115 120 125
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
130 135 140
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
145 150 155 160
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
165 170 175
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
180 185 190
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
195 200 205
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
210 215 220
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
225 230 235
<210> 4 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 4 ggggaccgtc agtcgccctc ttccccccaa
- 16 031715 <210> 5 <211> 30 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400>5 ttggggggaa gagggcgact gacggtcccc30
<210> 6
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 6
gaagatccca acagaagacc 20
<210> 7
<211> 20
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> PCT Primer
<400> 7
ttccggaggc gagacgtcac 20
<210> 8
<211> 19
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ПЦР-праймер
<400> 8
gccgcctgga gaaacctgc 19
<210>9 <211> 20 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>
<223> ПЦР-праймер <400> 9 tgaggtccac caccctgttg 20
- 17 031715

Claims (25)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Выделенный полипептид, включающий модифицированную последовательность, которая свободна от сиалирования и по меньшей мере на 75% идентична последовательности Fc-участка hIgGI, представляющей собой SEQ ID NO: 1, и имеет замену на аланин или консервативную аминокислоту в положении, соответствующем F241 последовательности SEQ ID NO: 1 согласно системе нумерации Kabat, причем полипептид обладает противовоспалительной активностью, которая выше, чем противовоспалительная активность исходного полипептида, включающего SEQ ID NO: 1.
  2. 2. Выделенный полипептид по п.1, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1.
  3. 3. Выделенный полипептид по п.1 или 2, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 90% идентична последовательности SEQ ID NO: 1.
  4. 4. Выделенный полипептид по любому из пп.1-3, обладающий способностью связываться с DCSIGN.
  5. 5. Выделенный полипептид по любому из пп.1-4, обладающий способностью связываться с hFcyRIIA или RIIB.
  6. 6. Выделенный полипептид по любому из пп.1-5, обладающий способностью связываться с hFcyRIIA или RIIB при KD 2*10-5 М или ниже (т.е. KA 5*104 М-1 или выше).
  7. 7. Выделенный полипептид по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что указанная замена представляет собой F241A.
  8. 8. Выделенный полипептид по любому из пп.1-7, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 75% идентична SEQ ID NO: 2.
  9. 9. Выделенный полипептид по п.8, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 80% идентична SEQ ID NO: 2.
  10. 10. Выделенный полипептид по п.9, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 90% идентична SEQ ID NO: 2.
  11. 11. Выделенный полипептид по п.10, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 95% идентична SEQ ID NO: 2.
  12. 12. Выделенный полипептид по п.11, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 99% идентична SEQ ID NO: 2.
  13. 13. Выделенный полипептид по п.12, отличающийся тем, что модифицированная последовательность включает SEQ ID NO: 2.
  14. 14. Выделенный полипептид по п.9, отличающийся тем, что модифицированная последовательность состоит из SEQ ID NO: 2.
  15. 15. Способ получения полипептида по любому из пп.1-14, включающий предоставление первой последовательности нуклеотидов, кодирующей исходный полипептид, который на 75% идентичен Fc-участку hIgG1 с последовательностью SEQ ID NO: 1; и модификацию первой последовательности нуклеотидов с получением второй последовательности нуклеотидов, кодирующей модифицированный полипептид, последовательность которого свободна от сиалирования и имеет замену на аланин или консервативную аминокислоту в положении, соответствующем F241 последовательности SEQ ID NO: 1 согласно системе нумерации Kabat.
  16. 16. Способ по п.15, отличающийся тем, что модифицированная последовательность по меньшей мере на 80% идентична последовательности SEQ ID NO: 1.
  17. 17. Полипептид, полученный способом по п.15 или 16, обладающий противовоспалительной активностью.
  18. 18. Выделенная нуклеиновая кислота, включающая последовательность нуклеотидов, кодирующую полипептид по любому из пп.1-14 и 17.
  19. 19. Экспрессирующий вектор, включающий нуклеиновую кислоту по п.18.
  20. 20. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п.18.
  21. 21. Способ получения полипептида по любому из пп.1-14, включающий культивирование клеткихозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, включающую последовательность нуклеотидов, кодирующую указанный полипептид, в среде при условиях, подходящих для экспрессии указанного полипептида, и его очистку из культивируемой клетки или из культуральной среды.
  22. 22. Фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания, включающая (i) полипептид по любому из пп.1-14 и 17 или нуклеиновую кислоту по п.18 и (ii) фармацевтически приемлемый носитель.
  23. 23. Способ лечения воспалительного заболевания, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества полипептида по любому из пп.1-14 и 17 или нуклеиновой кислоты по п.18.
  24. 24. Применение полипептида по любому из пп.1-14 и 17 в производстве лекарственного средства для лечения воспалительного заболевания.
  25. 25. Применение нуклеиновой кислоты по п.18 в производстве лекарственного средства для лечения
    - 18 031715 воспалительного заболевания,
EA201491215A 2011-12-19 2012-12-10 ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ НЕСИАЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД МОДИФИЦИРОВАННОГО Fc-УЧАСТКА hIgG1, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ EA031715B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201161577361P 2011-12-19 2011-12-19
PCT/US2012/068718 WO2013095966A1 (en) 2011-12-19 2012-12-10 Non-sialylated anti-inflammatory polypeptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201491215A1 EA201491215A1 (ru) 2015-02-27
EA031715B1 true EA031715B1 (ru) 2019-02-28

Family

ID=48669359

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201491215A EA031715B1 (ru) 2011-12-19 2012-12-10 ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ НЕСИАЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД МОДИФИЦИРОВАННОГО Fc-УЧАСТКА hIgG1, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
EA201892339A EA201892339A3 (ru) 2011-12-19 2012-12-10 Несиалированный выделенный полипептид, способ получения указанного полипептида и фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201892339A EA201892339A3 (ru) 2011-12-19 2012-12-10 Несиалированный выделенный полипептид, способ получения указанного полипептида и фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания

Country Status (17)

Country Link
US (5) US9587025B2 (ru)
EP (2) EP2793943B1 (ru)
JP (6) JP6322872B2 (ru)
CN (2) CN117964709A (ru)
AU (1) AU2012355710B2 (ru)
BR (1) BR112014014549A2 (ru)
CA (1) CA2859022A1 (ru)
EA (2) EA031715B1 (ru)
ES (1) ES2692539T3 (ru)
HK (1) HK1203374A1 (ru)
IL (2) IL233082B (ru)
IN (1) IN2014CN04765A (ru)
MX (1) MX357923B (ru)
PT (1) PT2793943T (ru)
SG (3) SG11201403311SA (ru)
WO (1) WO2013095966A1 (ru)
ZA (1) ZA201405185B (ru)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2702077A2 (en) 2011-04-27 2014-03-05 AbbVie Inc. Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
EA031715B1 (ru) * 2011-12-19 2019-02-28 Дзе Рокфеллер Юниверсити ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ НЕСИАЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД МОДИФИЦИРОВАННОГО Fc-УЧАСТКА hIgG1, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
WO2013158273A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Abbvie Inc. Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
CA2905010A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
US20160215061A1 (en) * 2013-10-08 2016-07-28 Merck Sharp & Dohme Corp. Fc CONTAINING POLYPEPTIDES HAVING INCREASED BINDING TO FcGammaRIIB
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
CA2968357A1 (en) 2014-11-21 2016-05-26 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies against cd73 and uses thereof
DK3221346T3 (da) 2014-11-21 2020-10-12 Bristol Myers Squibb Co Antistoffer omfattende modificerede konstante områder af tungkæden
MY187045A (en) 2014-12-23 2021-08-27 Bristol Myers Squibb Co Antibodies to tigit
EP3265124A4 (en) * 2015-03-04 2018-09-12 The Rockefeller University Anti-inflammatory polypeptides
US10300127B2 (en) 2015-03-20 2019-05-28 The Rockefeller University Immune complex
ES2936317T3 (es) 2015-05-29 2023-03-16 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos contra OX40 y usos de los mismos
BR112017028353A2 (pt) 2015-06-29 2018-09-04 The Rockfeller University anticorpos para cd40 com atividade agonista melhorada
FR3038517B1 (fr) * 2015-07-06 2020-02-28 Laboratoire Francais Du Fractionnement Et Des Biotechnologies Utilisation de fragments fc modifies en immunotherapie
WO2017152085A1 (en) 2016-03-04 2017-09-08 Bristol-Myers Squibb Company Combination therapy with anti-cd73 antibodies
EP3423489B1 (en) 2016-03-04 2024-08-07 The Rockefeller University Antibodies to cd40 with enhanced agonist activity
WO2018106885A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 East Carolina University Compositions and methods for in vitro cultivation and/or expansion of regulatory t cells
TWI788340B (zh) 2017-04-07 2023-01-01 美商必治妥美雅史谷比公司 抗icos促效劑抗體及其用途
EP3630833A1 (en) 2017-05-25 2020-04-08 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
KR20200035972A (ko) 2017-08-11 2020-04-06 리서치 디벨럽먼트 파운데이션 증강된 혈청 반감기를 위한 조작된 항체 fc 변이체
CN111741973A (zh) 2017-12-19 2020-10-02 洛克菲勒大学 具有改进的效应子功能的人IgG Fc结构域变体
WO2019133747A1 (en) 2017-12-27 2019-07-04 Bristol-Myers Squibb Company Anti-cd40 antibodies and uses thereof
WO2020089811A1 (en) 2018-10-31 2020-05-07 Novartis Ag Dc-sign antibody drug conjugates
PE20211284A1 (es) 2018-11-16 2021-07-19 Bristol Myers Squibb Co Anticuerpos anti-nkg2a y usos de los mismos
EP3887397A1 (en) 2018-11-28 2021-10-06 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies comprising modified heavy constant regions
US20230192867A1 (en) 2020-05-15 2023-06-22 Bristol-Myers Squibb Company Antibodies to garp

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008076487A2 (en) * 2006-12-20 2008-06-26 Verenium Corporation Antibodies and methods for making and using them
US20100286067A1 (en) * 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
WO2011059684A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-19 Centocor Ortho Biotech Inc. Antibody glycosylation variants

Family Cites Families (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7064191B2 (en) 2000-10-06 2006-06-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Process for purifying antibody
US20040002587A1 (en) * 2002-02-20 2004-01-01 Watkins Jeffry D. Fc region variants
US8188231B2 (en) 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
JP2006506056A (ja) 2002-10-03 2006-02-23 ラージ・スケール・バイオロジー・コーポレイション 多量体タンパク質操作
AU2006204791A1 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Xencor, Inc Antibodies and Fc fusion proteins with altered immunogenicity
CA2605781A1 (en) 2005-05-09 2007-04-12 Glycart Biotechnology Ag Antigen binding molecules having modified fc regions and altered binding to fc receptors
AU2006265676B2 (en) 2005-06-30 2013-01-24 Centocor, Inc. Methods and compositions with enhanced therapeutic activity
US8470318B2 (en) 2005-11-07 2013-06-25 The Rockefeller University Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
US20080206246A1 (en) 2006-04-05 2008-08-28 Ravetch Jeffrey V Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
CA2627981A1 (en) 2005-11-07 2007-05-18 The Rockefeller University Reagents, methods and systems for selecting a cytotoxic antibody or variant thereof
EP2815768A3 (en) 2006-04-05 2015-01-14 The Rockefeller University Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
NZ597651A (en) 2006-10-26 2012-07-27 Univ Rockefeller Polypeptides with enhanced anti-inflammatory and decreased cytotoxic properties and relating methods
MX2009007139A (es) * 2006-12-28 2009-10-08 Centocor Ortho Biotech Inc Metodos y vectores para generar inmunoglobulinas no sialiladas.
US20110020269A1 (en) 2007-05-08 2011-01-27 Beth Israel Deaconess Medical Center, Inc. Methods and compositions for modifying t cell immune responses and inflammation
US7867491B2 (en) * 2007-05-30 2011-01-11 Genexine Co., Ltd. Immunoglobulin fusion proteins
AU2009240637A1 (en) 2008-04-22 2009-10-29 The Rockefeller University Methods of identifying anti-inflammatory compounds
PL2647707T3 (pl) * 2010-11-30 2019-02-28 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Środek terapeutyczny wywołujący cytotoksyczność
AU2011349502B2 (en) * 2010-12-20 2016-12-22 The Rockefeller University Modulating agonistic TNFR antibodies
US20120258041A1 (en) * 2011-04-07 2012-10-11 Basi Guriqbal S Compositions and methods for treating diseases of protein aggregation involving ic3b deposition
US20130273089A1 (en) * 2011-11-03 2013-10-17 Tolera Therapeutics, Inc. Antibody and methods for selective inhibition of t-cell responses
EA031715B1 (ru) 2011-12-19 2019-02-28 Дзе Рокфеллер Юниверсити ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЙ НЕСИАЛИРОВАННЫЙ ПОЛИПЕПТИД МОДИФИЦИРОВАННОГО Fc-УЧАСТКА hIgG1, СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ И ПРИМЕНЕНИЕ

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008076487A2 (en) * 2006-12-20 2008-06-26 Verenium Corporation Antibodies and methods for making and using them
US20100286067A1 (en) * 2008-01-08 2010-11-11 Biogenerix Ag Glycoconjugation of polypeptides using oligosaccharyltransferases
WO2011059684A1 (en) * 2009-10-29 2011-05-19 Centocor Ortho Biotech Inc. Antibody glycosylation variants

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BURTON, DR. et al. Sugar Determines Antibody Activity. Science. August 4, 2006; Vol. 313, pages 627-628, DOI: 10.1126/science.1131712; page 627, column 2, paragraph 2 to page 627, column 3, paragraph 1; figure 1 *
RAMAKRISHNA, C. et al. Passively Administered Pooled Human Immunoglobulins Exert IL-10 Dependent Anti-Inflammatory Effects That Protect Against Fatal HSV Encephalitis. PLoS Pathog. June 2, 2011; Vol. 7, No. 6, pages 1-17: e1002071. doi:10.1371/journal.ppat,1002071; abstract; page 2, column 1, paragraph 1; page 14, column 1, paragraph 4; figures 1d, 6 *

Also Published As

Publication number Publication date
CA2859022A1 (en) 2013-06-27
US20140377280A1 (en) 2014-12-25
JP2015504883A (ja) 2015-02-16
EP2793943A4 (en) 2015-03-04
IN2014CN04765A (ru) 2015-09-18
JP6322872B2 (ja) 2018-05-16
JP7044267B2 (ja) 2022-03-30
US20180179284A1 (en) 2018-06-28
US20160319024A9 (en) 2016-11-03
JP2018093874A (ja) 2018-06-21
US11613579B2 (en) 2023-03-28
ZA201405185B (en) 2015-06-24
US11608379B2 (en) 2023-03-21
IL268787A (en) 2019-10-31
ES2692539T3 (es) 2018-12-04
US10894832B2 (en) 2021-01-19
IL268787B (en) 2021-09-30
SG10201805962PA (en) 2018-08-30
CN117964709A (zh) 2024-05-03
SG10202001596VA (en) 2020-04-29
US9587025B2 (en) 2017-03-07
EP3485909A1 (en) 2019-05-22
SG11201403311SA (en) 2014-07-30
HK1203374A1 (en) 2015-10-30
EP2793943B1 (en) 2018-09-26
AU2012355710B2 (en) 2017-11-02
JP2022091768A (ja) 2022-06-21
JP2020039357A (ja) 2020-03-19
EA201892339A3 (ru) 2019-06-28
WO2013095966A1 (en) 2013-06-27
JP2024125369A (ja) 2024-09-18
EP2793943A1 (en) 2014-10-29
EA201491215A1 (ru) 2015-02-27
AU2012355710A1 (en) 2014-08-07
PT2793943T (pt) 2018-11-13
NZ627002A (en) 2016-08-26
IL233082B (en) 2019-09-26
MX2014007292A (es) 2014-09-08
US20210101986A1 (en) 2021-04-08
US20150376280A1 (en) 2015-12-31
US20210130472A1 (en) 2021-05-06
US9845358B2 (en) 2017-12-19
IL233082A0 (en) 2014-07-31
EA201892339A2 (ru) 2019-03-29
CN104010659A (zh) 2014-08-27
MX357923B (es) 2018-07-30
JP2021063117A (ja) 2021-04-22
BR112014014549A2 (pt) 2020-09-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7044267B2 (ja) 非シアル化抗炎症ペプチド
EP2908914B1 (en) Immunomodulatory proteins
IL254284B2 (en) Anti-inflammatory polypeptides
CN114667298A (zh) Siglec-9 ecd融合分子及其使用方法
US20230295306A1 (en) Anti-Inflammatory Polypeptides
EA044897B1 (ru) Несиалированный выделенный полипептид, способ получения указанного полипептида и фармацевтическая композиция для лечения воспалительного заболевания
NZ627002B2 (en) Non-sialylated anti-inflammatory polypeptides