MX2014007292A - Polipeptidos antiinflamatorios no sialilados. - Google Patents

Polipeptidos antiinflamatorios no sialilados.

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Abstract

La presente invención se refiere a agentes antiinflamatorios, composiciones y métodos para tratar trastornos inflamatorios.

Description

POLIPEPTIDOS ANTIINFLAMATORIOS NO SIALILADOS Referencia Cruzada a Solicitudes de Patentes Relacionadas La presente invención reivindica prioridad de la Solicitud de Patente Estadounidense N° 61/577.361, presentada el 19 de diciembre de 2011. El contenido de la solicitud de patente se incorpora en la presente como referencia en su totalidad.
Derechos del Gobierno La invención revelada en la presente se hizo por lo menos parcialmente, con el respaldo del Gobierno Estadounidense con el Subsidio N° NIH AI035875 de los Institutos Nacionales de Salud. Por consiguiente, el Gobierno Estadounidense tiene determinados derechos sobre la presente invención.
Campo de la Invención La presente invención se relaciona con agentes antiinflamatorios, y con métodos para tratar trastornos inflamatorios.
Antecedentes de la invención Los trastornos inflamatorios, que incluyen enfermedades autoinmunes, son trastornos que consisten en la activación anormal y la posterior migración de glóbulos blancos a áreas del cuerpo afectadas. Estas condiciones comprenden una amplia gama de enfermedades que afectan las vidas de millones de personas en todo el mundo. Si bien actualmente hay diversos tratamientos disponibles, muchos poseen efectos colaterales importantes o no son demasiado efectivos en el alivio de los síntomas. Por lo tanto, existen necesidades de agentes antiinflamatorios para tratar trastornos inflamatorios y necesidades de métodos para identificar y evaluar tales agentes.
Se ha apreciado que la inmunoglobulina G (IgG) media las actividades proinflamatorias y antiinflamatorias a través de las instrucciones mediadas por su fragmento Fe. Si bien las interacciones de Fc-FcyR son responsables de las propiedades proinflamatorias de los complejos inmunes y los anticuerpos citotóxicos, la gammaglobulina intravenosa (IVIG) y sus fragmentos Fe son antiinflamatorios y se usan ampliamente para suprimir las enfermedades inflamatorias. Se ha propuesto que la glicosilación de IgG es crucial para la regulación de la citotoxicidad y el potencial inflamatorio de IgG. Por ejemplo, se ha sugerido que la actividad antiinflamatoria de IVIG es una propiedad del fragmento Fe y su glicano unido, que necesita ligaduras de ácido 2,6 siálico, que indica un requisito combinado para la cadena principal de polipéptido específico y la estructura de glicano para la inmunosupresión . (Anthony, et al., 2008, Ciencia 320: 373-376 and WO 2007/117505).
Sin embargo, solamente una población minoritaria de IgG en IVIG tiene glicanos que terminan en ácidos a2,ß siálico (sFc) y la actividad antiinflamatoria. Como resultado, en la supresión de la inflamación disparada por anticuerpos en una variedad de entornos clínicos, se debe administrar IVIG a dosis altas (l-2g/kg), enriquecer las IgG sialiladas, o aumentar de otro modo la sialilación de IgG. (Solicitudes de Patentes Estadounidenses N° 20080206246, y 20090004179, y Nimmerjahn et al. Annu Rev Immunol 26, 513-533 (2008) ) .
La presente invención enfrenta y satisface las necesidades mencionadas anteriormente, identificando polipéptidos antiinflamatorios sin sialilación.
Extracto de la invención La presente invención se relaciona con agentes, tales como polipéptidos y anticuerpos, y con métodos para tratar trastornos inflamatorios, por ejemplo, enfermedades autoinmunes .
Por consiguiente, un aspecto de la presente invención presenta un polipéptido aislado que comprende una secuencia modificada que es menos del 75% (por ejemplo, cualquier número entre el 75% y el 100%, inclusive, por ejemplo, el 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%) idéntica a una región de Fe de IgG. La secuencia modificada no tiene sialilación y el polipéptido tiene una actividad inflamatoria que es más alta que aquella de un polipéptido parental. El polipéptido parental puede comprender la región de Fe de IgG, tal como la secuencia de SEQ ID NO 1 enumerada a continuación. En algunas realizaciones, el polipéptido tiene la capacidad de unirse a DC-SIGN, y para unirse a hFcyRIIA o RIIB. En una realización, el polipéptido aislado tiene una capacidad para unirse a hFcyRIIA o RIIB a un KD de 2xl0~5 M o menor (es decir, KA de 5,0 x 104 M"1 o más) . Preferentemente, la secuencia modificada tiene una mutación de FA241. La secuencia modificada puede ser por lo menos 75% (por ejemplo, cualquier número entre 75% y 100%, inclusive, por ejemplo, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, y 100%) idéntica a SEQ ID NO: 2. En algunos ejemplos, la secuencia modificada comprende o consiste esencialmente en SEQ ID NO: 2.
En otro aspecto, la invención proporciona un método para fabricar un polipéptido que tiene una actividad antiinflamatoria. El método incluye, entre otros, los pasos de proporcionar polipéptidos párenteles que tienen la secuencia de una región de Fe de IgG o una primera secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido parental y modificar el polipéptido parental para obtener un polipéptido modificado de manera tal que el polipéptido modificado no tenga sialilación e imite la estructura de una forma sialilada de la región de Fe de IgG. El paso de modificación se puede realizar modificando la primera secuencia de ácido nucleico para obtener un segundo ácido nucleico que codifica el polipéptido modificado. La invención también proporciona un polipéptido hecho mediante el método descrito inmediatamente antes.
En un tercer aspecto, la invención ofrece un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el polipéptido descrito anteriormente; un vector de expresión que comprende el ácido nucleico y una célula huésped que comprende el ácido nucleico. La invención también ofrece un método para producir un polipéptido. El método incluye cultivar la célula huésped en un medio en condiciones que permiten la expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico y purificar el polipéptido de la célula cultivada o el medio de la célula.
En un cuarto aspecto, la invención ofrece una formulación farmacéutica que comprende (i) el polipéptido o el ácido nucleico descritos anteriormente, y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable .
En un quinto aspecto, la invención proporciona un método para tratar una enfermedad inflamatoria. El método incluye administrar a un sujeto que lo necesita, una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido descrito anteriormente o el ácido nucleico que codifica el polipéptido. También se proporciona el uso de un polipéptido o ácido nucleico en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria. La invención también ofrece un polipéptido aislado, un ácido nucleico, un vector de expresión una célula huésped, una composición, o un método para tratar una enfermedad inflamatoria sustancialmente como se muestra y se describe en la presente.
Los detalles de una o más realizaciones de la invención se pueden exponer en la descripción siguiente. Otras características, objetos y ventajas de la invención se harán evidentes a partir de la descripción y de las reivindicaciones.
Descripción de los dibujos Las Figuras la-c son diagramas y fotografías que muestran que el ácido siálico unido a a2,ß confirió una actividad de unión a DC-SIGN al Fe de IgGl humano recombinante .
Las Figuras 2a-b son diagramas y fotografías que muestran que la ruptura de interacciones de Fe y glicano confirieron la actividad de unión a DC-SIGN a Fe de IgGl humano recombinante.
La Figura 3 es un grupo de diagramas que muestran que la mutación de FA241 en Fe hlgGl recapitula la actividad antiinflamatoria de sFc de a2,6.
Las Figuras 4a-d son diagramas que muestran los requisitos característicos para la actividad antiinflamatoria de FA241.
La Figura 5 es un grupo de diagramas que muestran que la mutación FA241 aumentó la unión al receptor de de Fcy.
Las Figuras 6 a-b son fotografías que muestran la inducción de mARN de IL-33 en macrófagos derivados de la médula ósea por FA241.
Descripción Detallada La presente invención está basada, por lo menos parcialmente, en un descubrimiento inesperado de que las variantes de Fe de IgG no sialilado confieren actividad antiinflamatoria e imitan el efecto de Fe 2,6 sialilado como los mediadores antiinflamatorios.
Sialilación de IgG y Fe IgG es la principal inmunoglobulina del suero. Es una glicoproteína compuesta por dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas livianas, que a su vez están compuestas por dominios variables y constantes. IgG contiene un solo glicano unido a N en Asn297 en el dominio de CH2 sobre cada una de sus cadenas pesadas. El carbohidrato del complejo unido en forma covalente está compuesto por un núcleo, penta-polisacárido biantenario que contiene N-acetilglucosamina (GIcNAc) y mañosa (man) . Se observa otra modificación de la estructura de carbohidrato en los anticuerpos del suero con la presencia de grupos fucosa, GIcNAc de ramificación, galactosa (gal) y ácido siálico (sa) del extremo que se hallan en forma variable. Se ha detectado entonces que más de 40 glicoformas diferentes están unidas en forma covalente a este único sitio de glicosilación (Fujii et al., J. Biol. Chem. 265, 6009, 1990) . Se ha mostrado que la glicosilación de IgG es esencial para unirse a todos los FcyR manteniendo una conformación abierta de las dos cadenas pesadas. Jefferis y Lund, Immune. 1 Lett . 82, 57 (2002), Sondermann et al., J. Mol. Biol. 309, 737 (2001) . Se cree que esta glicosilación de IgG para esta unión a FcyR explica la incapacidad de los anticuerpos de IgG desglicosilados median las respuestas inflamatorias disparadas in vivo, tales como ADCC, fagocitosis y la liberación de mediadores inflamatorios. Nimmerjahn y Ravetch, Inmunidad 24, 19 (2006). Otras observaciones que cada glicoforma de IgG puede contribuir a modular respuestas inflamatorias han sido sugeridas por las afinidades alteradas para cada FcyR informadas para anticuerpos de IgG que contienen o carecen de fucosa y sus efectos sobre la citotoxicidad. Shields et al., J. Biol. Chem. 277, 26733 (2002), Nimmerjahn y Ravetch, Science 310, 1510 (2005) . Se ha observado un vinculo entre los estados autoinmunes y patrones de glicosilación específicos de los anticuerpos de IgG en pacientes con artritis reumatoide y varias vasculitis autoinmunes en las cuales se ha informado galactosilación y sialilación reducidas de anticuerpos de IgG. Parekh et al., Naturaleza 316, 452 (1985), Rademacher et al., Proc. Nati. Acad. Sci . USA 91, 6123 (1994), Matsumoto et al., 128, 621 (2000), Holland et al., Biochim. Biophys. Acta 27 de diciembre. Se ha informado que las variantes de glicoformas de IgG están asociadas al envejecimiento y la inmunización, aunque no se ha determinado la importancia in vivo de estas alteraciones. Shikata et al., Glycoconj . J. 15, 683 (1998), Lastra, et al., Autoinmunidad 28, 25 (1998).
Como se discutió anteriormente, determinadas variantes de Fe de IgG no sialilada sorpresivamente también confieren actividad antiinflamatoria. Tales variantes, que incluyen la variante FA241, representan especies dentro de un género más grande de moléculas que, en virtud de la imitación de las propiedades estructurales y biológicas de Fe sialilado, pero que no necesitan sialilación, se pueden desarrollar en terapias antiinflamatorias.
Polipéptidos y Ácidos Nucleicos Polipéptidos Como se revela en la presente, esta invención proporciona polipéptidos aislados que tienen secuencias de variantes de Fe de IgG humano que carece de una cadena de polisacárido que tiene un ácido siálico del extremo conectado a un grupo galactosa a través de la unión a o¡2,6 en la Asn297 mencionada. Tales variantes de Fe de IgG no sialiladas puede derivar de un anticuerpo natural o expresarse en una linea de células.
En una realización, la región de Fe incluye una o más sustituciones de la secuencia de aminoácido de hlgGl. Si bien no se limitan a ellas, se proporcionan los siguientes ejemplos de regiones de Fe de IgGl: Fe de hlgGl (que comienza desde el aminoácido 210 en el sistema de Kabat) : KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSR QQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:l; F241 y F243 están subrayadas) Fe de FA241 de hlgGl: KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVALFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSV HEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 2) Fe de FA241 de hlgGl: KVDKRVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLAPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVK FNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA KGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 3) Los términos "péptido", "polipéptido" y "proteína" se usan en la presente en forma intercambiable para describir la disposición de residuos de aminoácidos en un polímero. Un péptido, polipéptido, o proteína puede estar compuesto por 20 aminoácidos naturales estándar, además de aminoácidos raros y análogos de aminoácidos sintéticos. Puede ser cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o de la modificación postraduccional (por ejemplo, glicosilación o fosforilación) . El péptido, polipéptido, o proteína "de la presente invención" incluyen versiones producidas en forma recombinante o sintética que tienen los dominios o proteínas particulares que se unen a DC-SIGN, FcyRIIA y FcyRIIB. El término también comprende polipéptidos que tienen una metionina de extremo de amino agregada (útil para la expresión en células procariotas) .
Un polipéptido o proteína "aislada" se refiere a un polipéptido o una proteína que se ha separado de otras proteínas, lípidos y ácidos nucleicos con los cuales está asociado naturalmente. El polipéptido/proteína puede constituir por lo menos el 10% (es decir, cualquier porcentaje entre el 10% y el 100%, por ejemplo el, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, y 99%) en peso seco de la preparación purificada. La pureza se puede purificar mediante cualquier método estándar apropiado, por ejemplo, por cromatografía de columna, electroforesis de gel de poliacrilamida, o análisis de HPLC. Un polipéptido/proteína aislada descrito en la invención se puede purificar desde una fuente natural, producir mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante métodos químicos. Un equivalente funcional de Fe de IgG se refiere a un derivado de polipéptido de Fe de IgG, por ejemplo, una proteína que tiene una o más mutaciones de la punta, inserciones, eliminaciones, truncamientos, una proteína de fusión, o una combinación de ellos. Mantiene sustancialmente la actividad del Fe de IgG, es decir, la capacidad de unirse al receptor respetivo y disparar la respuesta celular respectiva. El polipéptido aislado puede contener SEQ ID NO 2. En general, el equivalente funcional es por lo menos el 75% (por ejemplo, cualquier número entre el 75% y el 100%, inclusive, por ejemplo, el 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, y 99%) idéntico a SEQ ID NO: 2.
El "porcentaje de identidad" de dos secuencias de aminoácidos o de dos ácidos nucleicos se determina usando el algoritmo de Karlin y Altschul Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990, modificado como en Karlin y Altschul Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993. Tal algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990. Las búsquedas de nucleótidos de BLAST se pueden realizar con el programa NBLAST, calificación=100 , longitud de palabra-12 para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácidos nucleicos de la invención. Las búsquedas de proteínas de BLAST se pueden realizar con el programa XBLAST, calificación=50, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteínas de la invención. Cuando existen espacios entre dos secuencias, se puede utilizar Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17) : 3389-3402, 1997. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST) .
La composición de aminoácidos del polipéptido descrito en la presente puede variar sin perturbar la capacidad del polipéptido de unirse al receptor respectivo y disparar la respuesta celular respectiva. Por ejemplo, puede contener una o más sustituciones de aminoácidos conservadoras. Una "sustitución de aminoácido conservadora" es aquella en la cual el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral definida. Las- familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en el arte. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina) , cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico) , cadenas laterales polares sin cambios (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteina) , cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano) , cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina) . Por lo tanto, un residuo de aminoácido no esencial predicho en, por ejemplo, SEQ ID NO: 2 , preferentemente se reemplaza con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Alternativamente, se pueden introducir mutaciones en forma aleatoria a lo larqo de la totalidad o de una parte de las secuencias, tal como mediante mutagénesis de saturación y los mutantes resultantes se pueden tamizar por la capacidad de unirse al receptor respectivo y de disparar la respuesta celular respectiva para identificar mutantes que mantienen la actividad como se describe a continuación en los ejemplos.
Un polipéptido como se describe en la presente invención se puede obtener como un polipéptido recombinante . Para preparar un polipéptido recombinante, un ácido nucleico que lo codifica (por ejemplo, FA241, SEQ ID NO 2) se puede unir a otro ácido nucleico que codifica un compañero de fusión, por ejemplo, glutationa-transferasa (GST) , marcador de epitope de 6x-His, o proteina del Gene 3 de M13. El ácido nucleico de fusión resultante expresa en las células huésped adecuadas una proteina de fusión que se puede aislar mediante métodos conocidos en el arte. La proteina de fusión aislada se puede tratar, por ejemplo, mediante digestión enzimática, para eliminar el compañero de fusión y obtener el polipéptido recombinante de la presente invención. Ácido nucleico Otro aspecto de la invención ofrece un ácido nucleico que comprende una secuencia que codifica el polipéptido o la proteina descritos anteriormente. Un ácido nucleico se refiere a una molécula de ADN (por ejemplo, un cADN o ADN genómico, una molécula de ARN (por ejemplo, mARN) , o un ADN, un análogo de ARN. Un ADN o análogo de ARN se puede sintetizar a partir de análogos de nucleótidos. La molécula ácido nucleico se tener una sola cadena o cadena doble. Un "ácido nucleico aislado" se refiere a un ácido nucleico cuya estructura no es idéntica a aquella de ningún ácido nucleico natural o a aquella de ningún fragmento de un ácido nucleico genómico natural. El término en consecuencia abarca, por ejemplo, (a) un ADN que tiene la secuencia de parte de una molécula de ácido nucleico natural pero no está flanqueada por ambas de las secuencias que flanquean aquella parte de la molécula del genoma del organismo en el cual se presenta naturalmente; (b) un ácido nucleico incorporado en un vector o en el ADN genómico de un procariota o eucariota de manera tal que la molécula resultante no sea idéntica a ningún vector natural o ADN genómico; (c) una molécula por separado tal como un cADN, un fragmento genómico, un fragmento producido mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o un fragmento de restricción; y (d) una secuencia de molécula recombinante que forma parte de un gene híbrido, es decir, un gene que codifica una proteína de fusión. El ácido nucleico descrito anteriormente se puede usar para expresar la proteina de fusión de la presente invención. Con este propósito, puede estar unido operativamente al ácido nucleico a secuencias reguladoras adecuadas para generar un vector de expresión.
Un vector se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual se ha unido. El vector puede ser capaz de replicacion autónoma o de integrarse en un ADN del huésped. Ejemplos del vector incluyen un plásmido, un cósmido, o un vector viral. El vector incluye un ácido nucleico en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped. Preferentemente el vector incluye una o más secuencias reguladoras unidas operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se debe expresar.
Una "secuencia reguladora" incluye promotores, mejoradores y otros elementos de control (por ejemplo, poliadenilación en señales). Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que se dirigen a la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos, asi como secuencias reguladoras y/o inducibles especificas del tejido. El diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped que se debe transformar, el nivel de expresión de la proteina o el ARN deseado, y similares. El vector de expresión se puede introducir en las células huésped para producir un polipéptido de la presente invención. Un promotor se define como una secuencia de ADN que se dirige a la polimerasa del ARN para unirse al ADN e iniciar la síntesis del ARN. Un promotor resistente es aquel que hace que los mARN se inicien a una alta frecuencia.
Todos los polinucleótidos mencionados anteriormente o un polinucleótido biológicamente equivalente disponibles para el experto en el arte con el mismo propósito se pueden insertar en un vector de expresión apropiado y unirse a otras moléculas de ADN para formar "moléculas de ADN recombinantes" que expresan este receptor. Estos vectores pueden comprender un ADN o ARN; con la mayor parte de los propósitos de clonación se prefieren los vectores del ADN. Los vectores típicos incluyen plásmidos, virus modificados, bacteriófagos y cósmidos, cromosomas artificiales de levadura y otras formas del ADN episomal o integrado. Está dentro de la competencia del experto en el arte determinar un vector apropiado para un uso particular.
Se puede usar una variedad de vectores de expresión de mamíferos para expresar los Fe de IgG mencionados anteriormente en células de mamíferos. Como se indicó anteriormente, los vectores de expresión pueden ser secuencias de ADN que son necesarios para la transcripción del ADN clonado y la traducción de sus mARN en un huésped apropiado. Dichos vectores se pueden usar para expresar el ADN .eucariota en una variedad de huéspedes tales como bacterias, algas verde-azules, células vegetales, células de insectos y células animales. Los vectores diseñados específicamente permiten el transporte del ADN entre los huéspedes tales como levadura de bacterias o células animales de bacterias. Un vector de expresión construido apropiadamente debe contener: un origen de replicación para la replicación autónoma en células huésped, marcadores seleccionables, un número limitado de sitios de enzimas de restricción útiles, un potencial para el número alto de copias, y promotores activos. Los vectores de expresión pueden incluir, en forma no taxativa, vectores de clonación, vectores de clonación modificados, plásmidos o virus diseñados específicamente. Los vectores de expresión de mamíferos comercialmente disponibles que pueden ser adecuados incluyen en forma no taxativa, pcDNA3.neo ( Invitrogen) , pcDNA3.1 (Invitrogen), pCI-neo (Promega) , pLITMUS28, pLITMUS29, pLITMUS38 y pLITMUS39 (New England Bioloabs) , pcDNAI, pcDNAIamp (Invitrogen), pcDNA3 (Invitrogen), pMClneo (Stratagene) , pXTl (Stratagene) , pSG5 (Stratagene), EBO-pSV2-neo (ATCC 37593) pBPV- 1(8-2) (ATCC 37110), pdBPV-MMTneo (342-12 ) (ATCC 37224), pRSVgpt (ATCC 37199), pRSVneo (ATCC 37198), pSV2-dhfr (ATCC 37146), pUCTag (ATCC 37460), y IZD35 (ATCC 37565).
También está dentro del alcance de la presente invención una célula huésped que contiene el ácido nucleico mencionado anteriormente. Ejemplos incluyen células de E. coli, células de insectos (por ejemplo, que usan vectores de expresión de baculovirus ) , células de levadura, o células de mamíferos. Véase, por ejemplo, g., Goeddel, (1990) Tecnología de Expresión de Genes: Métodos en Enzimologia 185, Academic Press, San Diego, California. Para producir un polipéptido de la presente invención, se puede cultivar una célula huésped en un medio en condiciones que permiten la expresión del polipéptido codificado por un ácido nucleico de la presente invención, y purificar el polipéptido a partir de la célula cultivada o el medio de la célula. Alternativamente, el ácido nucleico de la invención se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo, usando secuencias reguladoras de promotores de T7 y T7 polimerasa.
La totalidad de los Fe de IgG naturales, Fe de IgG creados genéticos y los Fe de IgG sintetizados químicamente se pueden usar para practicar la invención revelada en la presente. Fe de IgG obtenido mediante la tecnología de ADN recombinante puede tener la misma secuencia de aminoácidos que [FA241] SEQ ID NO: 2) o un equivalente funcional de él. El término "Fe de IgG" también abarca versiones modificadas químicamente. Ejemplos de Fe de IgG modificado, químicamente incluyen Fe de IgG sometidos a un cambio de conformación, agregado o eliminación una cadena de azúcar, y Fe de IgG al cual se ha unido un compuesto tal como polietielenglicol .
Se puede verificar la eficacia de un polipéptido/proteína así elaborado usando un modelo animal, tal como un ratón transgénico, como se describe a continuación. Cualquier aumento estadísticamente importante en la expresión in vivo de basófilos de IL-33 o la expresión del receptor de FcyRIIB sobre los macrófagos efectores indica que el polipéptido/proteina es un candidato para tratar los trastornos mencionados a continuación. En una realización, los ensayos descritos anteriormente pueden estar basados en la medición de una unión a la proteina DC-SIGN o las células de DC-SIGN(+) . El arte está repleto de diversas técnicas disponibles para el experto en el arte que son adecuadas para medir la capacidad de un compuesto a un DC-SIGN o a células DC-SIGN(+) y cambios relacionados en la expresión de un gene regulado por la via de DC-SIGN, tal como IL-33. El experto en el arte podrá elaborar e igualar estas diversas herramientas de investigación sin experimentación indebida. Una vez que se purifican y se ensayan mediante métodos estándar o de acuerdo con los ensayos y métodos descritos en los ejemplos siguientes, las variantes de Fe de IgG no sialiladas se pueden incluir en una composición farmacéutica para tratar trastornos inflamatorios.
Como se usa en la presente, "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y específicamente comprende anticuerpos monoclonales (que incluyen anticuerpos monoclonales de longitud completa) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos ) , y fragmentos de anticuerpos siempre que presenten la actividad biológica deseada.
Como se usa en la presente, los "fragmentos de anticuerpos" pueden comprender una parte de un anticuerpo intacto, que generalmente incluye la unión al antigeno o la región variable del anticuerpo estándar o la región de Fe de un anticuerpo gue conserva la capacidad de unión a FcR. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen anticuerpos lineales, moléculas de anticuerpos de una sola cadena y anticuerpos multiespecificos formados a partir de fragmentos de anticuerpos. Los fragmentos de anticuerpos preferentemente conservan por lo menos una parte de la bisagra y opcionalmente la región de CHl de una cadena pesada de IgG. Más preferentemente, los fragmentos de anticuerpos conservan la región constante completa de una cadena pesada de IgG e incluyen una cadena liviana de IgG.
Como se usa en la presente, el término "fragmento de Fe" o "región de Fe" se usa para definir una región de extremo de C de una cadena pesada de inmunoglobulina . La "región de Fe" puede ser una región de Fe de secuencia nativa o una variante de región de Fe. Si bien los limites de la región de Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina podrían variar, la región de Fe de cadena pesada de IgG habitualmente se define que abarca desde un residuo de aminoácido en la posición Cys226, o desde Pro230, hasta el extremo de carboxilo de él.
Una "región de Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región de Fe hallada en la naturaleza. Una "variante de región de Fe" apreciada por un experto en el arte comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de aquella de una región de Fe de secuencia nativa en virtud de por lo menos una "modificación de aminoácido". Preferentemente la variante de región de Fe tiene por lo menos una sustitución de aminoácido comparada con una región de Fe de secuencia nativa o la región de Fe de un polipéptido parental, por ejemplo, de una a diez sustituciones de aminoácidos y preferentemente de una a cinco sustituciones de aminoácidos en una región de Fe de secuencia nativa o en la región de Fe del polipéptido parental. La variante de región de Fe de la presente preferentemente posee por lo menos un 75% u 80% de homología con una región de Fe de secuencia nativa y/o con una región de Fe de un polipéptido parental y más preferentemente por lo menos un 90% de homología con ella, más preferentemente por lo menos un 95% de homología con ella, aún más preferentemente por lo menos un 99% de homología con ella.
Los términos "receptor de Fe" o "FcR" se usan para describir un receptor que se une a la región de Fe de un anticuerpo. En una realización de la invención FcR es un FcR humano de secuencia nativa. En otra realización, FcR que incluye FcR, se une a un anticuerpo de IgG (un receptor de gamma) e incluye receptores de las subclases de FcyRI, FcyRII, y FcyRIII, que incluyen variantes alélicas y alternativamente formas empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor de activación") y FcyRIIB (un receptor inhibidor") que tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos . La activación del receptor FcyCRIIA contiene un motivo de activación del inmunorreceptor basado tirosina (ITAM) en el dominio citoplasmático . La inhibición del receptor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición de inmunorrector basado en tirosina (ITI ) en su dominio citoplasmático (véase la revisión en Daron, Annu Rev Immunol, 15, 203-234 (1997); los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu Rev Immunol, 9, 457-92 (1991); Capel et al., Inmunométodos, 4, 25-34 (1994); y de Haas et al., J Lab Clin Med, 126, 330-41 (1995), Nimmerjahn y Ravetch 2006, Receptores de Fe de Ravetch en Inmunología Fundamental, ed William Paul 5th Ed. cada una de las cuales se incorpora en la presente como referencia.
El término "nativo" o "parental" se refiere a un polipéptido no modificado que comprende una secuencia de aminoácidos de Fe. El polipéptido parental puede comprender una región de Fe de secuencia, nativa o una región de Fe con modificaciones de secuencias de aminoácidos preexistentes (tales como agregados, eliminaciones y/o sustituciones) .
Composiciones Dentro del alcance de la presente invención está una composición que contiene un portador adecuado y uno o más de los agentes descritos anteriormente, tales como las variantes de Fe de IgG no sialiladas. La composición puede ser una composición farmacéutica que contiene un portador farmacéuticamente aceptable o una composición cosmética que contiene un portador cosméticamente aceptable .
El término "composición farmacéutica" se refiere a la combinación de un agente activo con un portador, inerte o activo, que hace a la composición especialmente adecuada para el diagnóstico o el uso terapéutico in vivo o ex vivo. Un "portador farmacéuticamente aceptable" después de ser administrado a un sujeto, no produce efectos fisiológicos indeseables. El portador en la composición farmacéutica debe ser "aceptable" también en el sentido de que sea compatible con el ingrediente activo y pueda ser capaz de estabilizarlo. Uno o más agentes solubilizantes se pueden utilizar como portadores farmacéuticos para el suministro de un compuesto activo. Ejemplos de un portador farmacéuticamente aceptable incluyen, en forma no taxativa, excipientes biocompatibles , coadyuvantes, aditivos y diluyentes para obtener una composición utilizable como una forma de dosificación. Ejemplos de otros portadores incluyen óxido de silicio coloidal, estearato de magnesio, celulosa, y sulfato de laurilo de sodio.
La composición descrita anteriormente, en cualquiera de las formas descritas anteriormente, se puede usar para tratar trastornos caracterizados por la inflamación. Una cantidad efectiva se refiere a la cantidad de un agente compuesto activo que se necesita para conferir un efecto terapéutico sobre un sujeto tratado. Las dosis efectivas varían, como los reconocen los expertos en el arte, según los tipos de enfermedades tratadas, la vía de administración, el uso de excipientes y la posibilidad de un uso conjunto con otro tratamiento terapéutico.
Una composición farmacéutica de la presente invención se puede administrar por vía parental, oral, nasal, rectal, tópica, o bucal. El término "parental" como se usa en la presente se refiere a la inyección subcutánea, intracutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intraarterial, intrasinovial, intraesternal , intratecal, intralesional, o intracraneal, así como cualquier técnica de infusión adecuada.
Una composición inyectable estéril puede ser una solución o suspensión en un diluyente o solvente aceptable parenteral no tóxica. Tales soluciones incluyen, en forma no taxativa, 1,3-butanodiol, manitol, agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos como un solvente o medio de suspensión (por ejemplo, monoglicéridos o diglicéridos sintéticos). Los ácidos grasos, tales como, en forma no taxativa, el ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de inyectables, así como lo son los aceites farmacéuticamente aceptables, tales como, en forma no taxativa, aceite de oliva o aceite de castor, sus versiones polioxietiladas . Estas soluciones o suspensiones de aceites también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga tales como, en forma no taxativa, carboximetil celulosa, o agentes dispersantes similares. Otros surfactantes usados comúnmente, tales como, en forma no taxativa, TWEENS o SPANS u otros agentes emulsionantes o mejoradores de la biodisponibilidad similares, que se usan comúnmente en la fabricación de formas de dosificación sólidas, liquidas, u otras formas farmacéuticamente aceptables, se pueden usar con los propósitos de la formulación.
Una composición para la administración oral puede ser cualquier forma de dosificación oralmente aceptable que incluye cápsulas, tabletas, emulsiones y suspensiones, dispersiones y -soluciones acuosas. En el caso de las tabletas, los portadores usados comúnmente incluyen, en forma no taxativa, lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes, tales como, en forma no taxativa, estearato de magnesio, también se agregan normalmente. Para la administración oral en una forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen, en forma no taxativa, lactosa y almidón de maíz seco. Cuando las suspensiones o emulsiones acuosas se administran por via oral, los ingredientes activos se pueden suspender o disolver en una fase de aceite combinada con agentes emulsionantes o de suspensión. Si se desea, se pueden agregar determinados agentes edulcorantes, saborizantes o colorantes.
Las composiciones farmacéuticas para la administración tópica de acuerdo con la invención descrita se pueden formular como soluciones, ungüentos, cremas, suspensiones, lociones, polvos, pastas, geles, aspersiones, aerosoles, o aceites. Alternativamente, las formulaciones tópicas pueden estar en la forma de parches o vendajes impregnados con el ingrediente ( s ) activo, que opcionalmente pueden comprender uno o más excipientes o diluyentes. En algunas realizaciones preferidas, las formulaciones tópicas incluyen un material que mejorarla la absorción o penetración del agente (s) activo a través de la piel u otras superficies afectadas. La composición tópica es útil para tratar trastornos inflamatorios en la piel, que incluyen, en forma no taxativa, eczema, acné, rosácea, soriasis, dermatitis de contacto, y reacciones a la hiedra venenosa.
Una composición tópica contiene una cantidad segura y efectiva de un portador dermatológicamente aceptable adecuado para la aplicación a la piel. Una composición o componente "cosméticamente aceptable" o "dermatológicamente aceptable" se refiere a una composición o componente se refiere a una composición o componente que es adecuado para su uso en contacto con la piel humana sin toxicidad, incompatibilidad, inestabilidad, reacción alérgica indebida, y similares. El portador permite que un agente activo y un componente opcional se suministren a la piel a una concentración (es) apropiada. El portador entonces puede actuar como un diluyente, dispersante, solvente, o similar para asegurar que los materiales activos se apliquen y se distribuyan en forma uniforme sobre el blanco seleccionado a una concentración apropiada. El portador puede ser sólido, semisólido o liquido. El portador puede estar en la forma de una loción, o un gel, específicamente aquel que tiene una densidad o un punto de fluencia suficiente para impedir que materiales activos sedimenten. El portador puede ser inerte o poseer beneficios dermatológicos. También debe ser física y químicamente compatible con los componentes activos descritos en la presente y además no debe deteriorar indebidamente la estabilidad, eficacia u otros beneficios del uso asociados a la composición. La composición tópica puede ser un producto cosmético o dermatológico en la forma conocida en el arte para aplicaciones tópicas o transdérmicas, que incluyen soluciones, aerosoles, cremas, geles, parches, ungüento, loción o espuma.
Métodos de tratamiento La invención descrita provee métodos para tratar un trastorno inflamatorio en un sujeto. El término "trastorno inflamatorio" se refiere a un trastorno que se caracteriza por una inflamación anormal o no querida, tal como una enfermedad autoinmune. Las enfermedades autoinmunes son trastornos caracterizados por la activación crónica de células inmunes en condiciones no activadoras. Ejemplos incluyen soriasis, enfermedades intestinales inflamatorias (por ejemplo, enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa) , artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus, diabetes tipo I, cirrosis biliar primaria y trasplante.
Otros ejemplos de trastornos inflamatorios que se pueden tratar mediante los métodos de la presente invención incluyen asma, infarto de miocardio, ataque, dermatosis inflamatoria (por ejemplo, dermatitis, eczema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, urticaria, vasculitis necrotizante, vasculitis cutánea, vasculitis de hipersensibilidad, miositis eosinofilica, poliomielitis, dermatomiositis y fascitis eosinofilica) , síndrome de insuficiencia respiratoria aguda, hepatitis fulminante, enfermedades pulmonares de hipersensibilidad (por ejemplo, neumonitis de hipersensibilidad, neumonía eosinofilica, hipersensibilidad de tipo retardado, enfermedad pulmonar intersticial (ILD), fibrosis pulmonar idiopática e ILD asociada a la artritis reumatoide) y rinitis alérgica. Ejemplos adicionales también incluyen miastenia gravis, diabetes de inicio juvenil, glomerulonefritis , tiroiditis autoinmune, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, enfermedades inflamatorias agudas y crónicas (por ejemplo, anafilaxia sistémica o reacciones de hipersensibilidad, alergias a medicamentos, alergias a picaduras de insectos, rechazo de aloinjerto y enfermedad de injerto contra huésped) y síndrome de Sjogren.
Un "sujeto" se refiere a un humano y un animal no humano, Ejemplos de un animal no humano incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos, tales como mamíferos no humanos, primates no humanos (particularmente, primates superiores) , perros, roedores (por ejemplo, ratones o ratas), conejillos de Indias, gatos y conejos y no mamíferos, tales como aves, anfibios, reptiles, etc. En una realización, el sujeto es un humano. En otra realización, el sujeto es un humano. En otra realización, el sujeto es un animal no humano, experimental o un animal adecuado como un modelo de enfermedad.
Se puede identificar a un sujeto al que se debe tratar para un trastorno inflamatorio mediante técnicas de diagnóstico estándar para el trastorno. Opcionalmente, se puede examinar al sujeto por el nivel o porcentaje de una o más citoquinas o células de una muestra de ensayo obtenida del sujeto mediante métodos conocidos en el arte. Si el nivel o porcentaje está a un valor umbral o por debajo de él (que se puede obtener de un sujeto normal) , el sujeto es un candidato para el tratamiento descrito en la presente. Para confirmar la inhibición o el tratamiento, se puede evaluar y/o verificar el nivel o porcentaje de una o más de las citoquinas o células mencionadas anteriormente en el sujeto después del tratamiento.
"Tratar" o "tratamiento" se refiere a la administración de un compuesto o agente a un sujeto que tiene un trastorno con el propósito de curar, aliviar, remediar, retardar el inicio, prevenir o mejorar el trastorno, el síntoma del trastorno, el estado de enfermedad secundario al trastorno o la predisposición al trastorno.
Una "cantidad efectiva" o una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refieren a una cantidad del compuesto o agente que es capaz de producir un resultado médicamente deseable en un sujeto tratado. El método de tratamiento se puede practicar in vivo o ex vivo, solo o en conjunto con otros fármacos o terapias. Una cantidad terapéuticamente efectiva se puede administrar en una o más administraciones, aplicaciones o dosificaciones y no se desea que se limite a una formulación o via de administración particular .
El agente se puede administrar in vivo o ex vivo, solo o administrado en forma conjunta con otros fármacos o terapias, es decir, una terapia de cóctel. Como se usa en la presente, el término "administración conjunta" o "administrado conjuntamente" se refiere a la administración de por lo menos dos agentes o terapias a un sujeto. En algunas realizaciones, la administración conjunta de dos o más agentes/terapias es simultánea. En otras realizaciones, un primer agente/terapia se administra antes que un segundo agente/terapia. Los expertos en el arte entienden que las formulaciones y/o vías de administración de diversos agentes/terapias usadas pueden variar.
En un enfoque in vivo, un compuesto o agente se administra a un sujeto. Generalmente, el compuesto o agente se suspende en un portador farmacéuticamente aceptable (tal como, por ejemplo, en forma no taxativa, solución salina fisiológica) y se administra or via oral o por infusión intravenosa, o se inyecta o se implanta por via subcutánea, intramuscular, intratecal, intraperitoneal, intrarrectal, intravaginal, intranasal, intragástrica, intratraqueal, o intrapulmonar.
La dosificación necesaria depende de la elección de la via de administración, de la naturaleza de la formulación, de la naturaleza de la enfermedad del paciente, del tamaño, peso, superficie, edad, y sexo del sujeto; otros fármacos administrados; y el juicio del médico tratante. Las dosificaciones adecuadas están en la gama de 0,01-100 mg/kg. Se deben esperar variaciones en la dosificación necesaria en vista de la variedad de compuestos/agentes disponibles y de las diferentes eficiencias de diversas vías de administración. Por ejemplo, se esperaría que la administración oral necesite dosificaciones más altas que la administración por inyección intravenosa. La variaciones en estos niveles de dosificación se pueden ajusfar usando rutinas empíricas para la optimización como se entiende bien en el arte. La encapsulacion del compuesto en un excipiente de suministro adecuado (por ejemplo, micropartículas poliméricas o dispositivos implantables ) puede aumentar la eficiencia de la administración, particularmente para la administración oral.
Ejemplo 1: Métodos y Materiales Este ejemplo describe métodos y materiales generales usados en los Ejemplos 2-7.
Ratones Se compraron ratones C57BL/6 de tipo silvestre a Jackson Laboratories. A. McKenzie proveyó ratones SIGNRI~ _. T. Sparwasser proveyó ratones transgénicos CDllc-DC-SIGN+. Los ratones transgénicos hDC-SIGN BAC en un fondo de SIGNRI"/_ se generaron en el laboratorio de los inventores como se describió previamente. Los ratones KRN TCR C57BL/6 (donaciones de D. Mathis y C. Benoist) se criaron con ratones NOD para generar ratones K/BxN. Se extrajo sangre de los ratones K/BxN (de 6-12 semanas) y el suero que contiene anticuerpos artritogénicos se mezcló junto. La transferencia pasiva de 200 µL de suero de K/BxN por inyección intravenosa a ratones naive (de 8-12 semanas) indujo la artritis. La inflamación se calificó 0-3 para cada pata y se sumaron juntos para una calificación clínica total por cada ratón.
Preparación del Fe recombinante IDEC-114, una fuente recombinante de anticuerpo monoclonal de IgGl humana de longitud completa, experimentó la digestión con papaína durante toda la noche a 37 °C para descomponer los fragmentos Fab y Fe. Después de la digestión, la reacción se detuvo agregando 2,5 mg/mL de yodoacetamida . Para separar los fragmentos descompuestos del anticuerpo no digerido, las muestras se pasaron sobre una columna de exclusión por tamaños de HiPrep 26/60 S-200HR (GE HEALTHCARE) . El fragmento Fe posteriormente se purificó con perlas de agarosa de proteina G. La pureza de la muestra se verificó mediante tinción de azul brillante Coomassie de geles de SDS-poliacrilamida. Alternativamente, se produjeron Fe recombinantes mediante la transfección transitoria de plásmidos que expresan Fe de IgGl humana en células 293T seguida por la precipitación de sulfato de amonio de fracciones de sobrenadante y purificación de proteina G. la secuencia genética que codifica la región de Fe de la IgGl humana se amplificó desde 4-4-20 IgGl mediante protocolos de PCR y se ligó en pSecTag2 ( INVITROGEN) . Se introdujeron mutaciones de punto en el Fe que codifica la secuencia mediante técnicas de mutagénesis dirigida al sitio estándar y se verificó mediante secuenciación de ADN. Los iniciadores de PCR para la sustitución de Phe a Ala en la posición 241 (FA241) fueron 5' -ggggaccgtcagtcgccctcttccccccaa-3' (SEQ ID NO: 4) y 5'- ttggggggaagagggcgactgacggtcccc-3' (SEQ ID NO: 5).
La expresión de la proteina y la pureza se confirmaron mediante inmunotransferencia con anticuerpos de Fe antihumano y/o tinción de azul brillante Coomassie de geles de SDS-poliacrilamida.
Reacción de sialilación de dos pasos Después de la purificación, 10-50 mg/mL de fragmentos Fe se intercambiaron con tampón en un tampón de reacción de galactosilación (50 mM MOPS, pH 7,2; 20 mM MnCl2) y se incubaron toda la noche a 37°C con 50 mg UDP-galactosa y 0,75 U de ß1,4-galatosiltransferasa . La galactosilación se confirma mediante blots de lectina usando ECL para reconocer los residuos de galactosa del extremo. Los Fe galactosilados luego se intercambiaron con tampón en un tampón de reacción de sialilación (100 mM MOPS, 0,2 mg/mL BSA, 0,5% de Tritón X-100, pH 7,4) y se incubaron toda la noche a 37 °C con 50 mg de CMP-ácido siálico y 0,75 U 0(2 , 6-sialiltransferasa . La sialilación se confirmó mediante blots de lectina usando SNA para reconocer los residuos de ácido siálico del extremo con una unión de a2-6.
Transferencia adoptiva de macrofagos derivados de la médula Las células de la médula ósea fluyeron desde tibias y fémures de ratones DC-SIGNg o SIGNRl_ ~ y se sembraron en placas de 10 cm tratadas con cultivo que no es de tejido en medios de cultivo de RPMI 1640 con suplemento de 10% de FBS, 1% de Pen/Strep, IL-3 (5 ng/mL, PEPROTECH) , y M-CSF (5 ng/mL, PEPROTECH) . Después de la incubación durante toda la noche a 37°C, las células no adherentes se recuperaron y se transfirieron a placas de 10 cm tratadas con, cultivo que no es de tejido con medios de cultivo de RPMI con suplemento de IL-3/M-CSF, y se cultivaron durante 5-7 días a 37°C. Los macrófagos maduros se tripsinizaron y se colocaron en placas de 6 receptáculos a una densidad de 2xl06 células/receptáculo y se dejó que se adhirieran toda la noche. Al día siguiente los macrófagos se impulsaron con la preparación de Fe recombinante indicada durante 30 minutos a 37°C. Las células se recuperaron, se lavaron con PBS frío, y se administraron lxlO6 células por vía intravenosa a ratones C57BL/6 de tipo silvestre. Una hora después de la administración se atacó a los ratones con sueros de K/BxN.
Expresión y purificación de DC-SIGN humano soluble K. Drickamer proveyó el plásmido que contiene la secuencia de ADN del dominio extracelular (ECD) de DC-SIGN humano. La secuencia de codificación para el ECD de DC-SIGN se modificó para introducir un marcador strep del extremo de N mediante técnicas de PCR estándar y se ligó a pET28b(+). pET28b-strepDCSIGN se transformó en BL21/DE3 de la cepa de E. coli y se cultivó en 3 L del medio de cultivo de TB a 37°C hasta que el cultivo de bacterias alcanzó un OD60o 0,7-0,8. La expresión de proteínas se indujo agregando 100 mg/L de IPTG y los cultivos se incubaron a 37°C durante 3,5 horas. Se hicieron pelotillas con bacterias mediante centrifugación a 4000xg durante 10 minutos a 4°C. Las pelotillas de bacterias se suspendieron en 10 mM de Tris-HCl, a pH 7 , 8 , y se sometieron a lisis sometiéndolas a ultrasonido. Los cuerpos de inclusión formaron pelotillas mediante centrifugación a lO.OOOxg durante 15 minutos a 4°C y se solubilizaron en 100 mL de 6 M guanidina-HCl; 100 mM Tris-HCl, a pH 7,8; 0,2% TRITON X-100. El material en partículas se retiró mediante centrifugación a 20.000xg durante 30 minutos a 4°C, y la fracción de sobrenadante se dializó contra 250 mM NaCl; 25 mM Tris-HCl, pH a 7,8; 25 mM CaCl2. Después de la diálisis, los precipitados insolubles se eliminaron mediante centrifugación a 20.000xg durante 30 minutos a 4°C, y la fracción de sobrenadante se aplicó a una resina de strep-tactin (NOVAGEN) tirar del ECD de DC-SIGN marcado con strep. Las proteínas unidas se eluyeron desde la resina con tampón de elución provisto por el fabricante (NOVAGEN) . Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE y las fracciones positivas se combinaron y se cargaron en una columna de manosa-agarosa para seleccionar los receptores activos. El ECD de DC-SIGN se eluyó con 250 mM NaCl; 25 mM Tris-HCl, pH 7,5; 5 mM EDTA. Las fracciones se analizaron mediante SDS-PAGE.
Resonancia de plasmones superficiales Para determinar la interacción entre diversas preparaciones de Fe recombinante con hDC-SIGN soluble o hFcyR, las mediciones de afinidad de estado estacionario se registraron en un sensor Biacore T100. Los receptores, diluidos a 20-50 µg/mL en NaOAc a pH 5,0, se inmovilizaron sobre chips de CM5 a alta densidad (2000 RU) mediante acoplamiento de aminas estándar. Para las interacciones de hDC-SIGN, se realizaron inyecciones a una velocidad de flujo de 20 L/min con tampón de HBS-P+ comercialmente disponible ajustado a pH 9,0 y se agregó suplemento de 2 mM CaCl2 y 500 mM NaCl. Para las interacciones de hFcyR, se realizaron inyecciones a una velocidad de flujo de 20 µ??/p??? con tampón de HBS-EP+ disponible comercialmente . Las superficies se regeneraron con un pulso corto de 50 mM NaOH. Se calcularon los' valores de Kd después de la sustracción de la unión de fondo a una célula de flujo control usando el software de evaluación Biacore.
RT-PCR El ARN total se extrajo de macrofagos obtenidos de la médula ósea usando el estuche RNeasy Mini (QIAGEN) . Se usó un microgramo del ARN total para analizar la expresión del mARN de IL-33 mediante RT-PCR usando el estuche de RT-PCR de Un Paso (QIAGEN) . La expresión de GAPDH sirvió como control de carga. Los iniciadores de PCR para mIL-33 fueron 5' -gaagatcccaacagaagacc-3' (SEQ ID NO: 6) y 5' -ttccggaggcgagacgtcac-3' (SEQ ID NO: 7); y para mGAPDH fueron 5' -gccgcctggagaaacctgc-3' (SEQ ID NO: 8) y 5'-tgaggtccaccaccctgttg-3' (SEQ ID NO: 9) . Las condiciones de la PCR fueron 94°C durante 30 segundos; 55°C durante 30 segundos; 72°C durante 60 segundos * 35 ciclos (IL-33) o 25 ciclos (GAPDH) .
Ejemplo 2: Ácido siálico unido a a2,6 confirió actividad de unión a DC-SIGN al Fe de IgGl humana recombinante Una población minoritaria de anticuerpos en preparaciones de IVIG suprime la inflamación inducida por anticuerpos. Estos anticuerpos, que contienen ácido siálico unido a a2,6 del extremo sobre el glicano de Fe, median una respuesta antiinflamatoria mediante la unión a SIGNRI sobre macrófagos de la zona marginal o su ortólogo humano, DC-SIGN, sobre células mieloides.
Para estudiar la interacción de sFc a DC-SIGN, una forma soluble del dominio extracelular de DC-SIGN (EDC de DC-SIGN) se purificó desde las bacterias y se inmovilizó sobre chips de CM5. sFc se preparó desde anticuerpos IDEC-114 de longitud completa y se sialiló in vitro (Figura Ib) y se unión específicamente a la superficie conjugada a DC-SIGN (figura la). Se realizaron mediciones de afinidad de estado estacionario y el valor de KD para esta interacción se calculó como 1,3?10"6 M (Figura le) . En cambio, una glicoforma asialilada de Fe de IDEC-114 no mosLró ninguna actividad de unión a DC-SIGN que sugiera que la sialilación induce un cambio de conformación en la cadena principal de Fe para revelar un sitio de unión a DC-SIGN.
Como se muestra en la Figura la, se halló que a2,6-sFc recombinante se unió a DC-SIGN soluble como se midió resonancia de plasmones superficiales (SPR) . Los Fe se prepararon mediante descomposición en papaina del anticuerpo de IgGl monoclonal humana de longitud completa (IDEC-114) seguida por las reacciones de galactosilación y sialilación in vitro. Los sensorgramas de SPR para la unión del anticuerpo a DC-SIGN inmovilizados se muestran para glicoformas sialiladas y galactosiladas de Fe de hlgGl como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Se hallo que las concentraciones de Fe fluyeron en una gama de ECD de DC-SIGN de 3-0,8 µ?. Como se muestra en la Figura Ib, el blot de lectina con SNA confirma la adhesión del ácido siálico con la ligadura de 2,6 sobre Fe (panel superior); los controles de carga con tinción de coomassie se muestran en el panel inferior. La medición de ,KD de estado estacionario de la unión de sFc a DC-SIGN (como se muestra en a.) se calculó mediante el software de Evaluación Biacore.
Ejemplo 3: Mutaciones que rompen interacciones de Fc-glicano confirieron actividad de unión de DC-SIGN al Fe de IgGl humana recombinante La cadena de oligosacáridos del núcleo adherida a Asn297 hace interacciones no covalentes amplias con la cadena principal de aminoácidos del Fe. Los cambios de conformación en el Fe inducidos por diferentes residuos de azúcar adheridos al glicano del núcleo están mediados por estas interacciones de proteina - carbohidrato. Las sustituciones de alanina que anulan los puntos de contacto fundamentales entre la cadena principal de Fe y los residuos de glicano parecen impartir actividad de unión a DC-SIGN.
Como se muestra en la Figura 2A, las mutaciones FA241 y FA243 presentan actividad de unión a DC-SIGN sin procesamiento enzimático in vitro. Los valores de KD aparentes están en la gama de 6xl0"7 M para FA241 a 3xl0~7 M para FA243. Los informes previos indican que estas mutaciones aumentan al sialilación de los anticuerpos, presumiblemente haciendo al glicano más accesible para las glicosiltransferasas, cuando se expresan en células de mamíferos. Para verificarlo, se realizó un blot de lectina para determinar si la unión de FA241 y FA243 a DC-SIGN se debe a la sialilación aumentada de proteínas expresadas transitoriamente. Como se muestra en la Figura 2B, los blots de SNA no detectaron residuos del ácido siálico del extremo en FA241 y FA243 purificados lo cual indica que la interacción de DC-SIGN fue independiente de la modificación del ácido siálico.
Más específicamente, los residuos F241, F243, D265, y R301 a lo largo de la cadena principal de aminoácidos de Fe de IgGl se reemplazaron con alanina para romper las interacciones no covalentes con residuos de oligosacáridos . Los Fe se expresaron y se purificaron desde células 293T y se analizaron por la actividad de unión de DC-SIGN con resonancia de plasmones superficiales como se describió anteriormente. Se hallo que los Fe que llevan mutaciones FA241 o FA243 presentaron una afinidad aumentada DC-SIGN en relación con las mediciones de afinidad para sFc (Figura la) . Los blots de lectina con ECL (Figura Ib, panel del medio) y SNA (panel superior) se llevaron a cabo para determinar grupos azúcar del extremo sobre Fes purificados desde células 293T. Como control positive para los sialilados, FA241 se sialiló in vitro como se describe en la Figura la. Los controles de carga con tinción de Coomassie se muestran en el panel inferior de la Figura Ib.
Ejemplo 3: Mutación de FA 241 en Fe de hlgGl recapituló la actividad antiinflamatoria de o¡2,6 sFc Si las mutaciones FA241 y FA243 imitan la actividad de unión de DC-SIGN de sFc, se realizaron ensayos para examinar si estas mutaciones podían replicar la actividad antiinflamatoria de sFc in vitro. Se atacó a ratones SIGNR1"7" y hDC-SIGN+/SIGNRl"/_ de la misma edad y del mismo sexo, con sueros de K/BxN artritogénico y se los trató con sFc, FA241, o FA243 a una dosis efectiva de 0,033 g/kg. Coincidentemente con los hallazgos previos, sFc suprimió la hinchazón de las almohadillas plantares en ratones DC-SIGN+ pero no en SIGNR1_ ". En forma similar, FA241 demostró una actividad antiinflamatoria comparable a aquella de sFc en ratones hDC-SIGN+/SIGNRl_/_ . Los ratones a los que se administró FA243 no mostraron ninguna reducción en la inflamación de las articulaciones. Estos hallazgos sugieren que los Fe recombinantes que llevan una mutación F24i (FA241) recapitulan la unión de DC- SIGN y la actividad antiinflamatoria de sFc sin modificación del ácido siálico.
Como se muestra en la Figura 3, a los ratones hDC-SIGN+/SIGNRl_/" (cuadrados blancos) y SIGNRl" _ (cuadrados negros) se les administró 0,7 mg/ratón de sFc, FA241, o FA243 por inyección intravenosa. Posteriormente se atacó a los ratones con sueros de K/BxN 1 hora después. La hinchazón de las almohadillas plantares se monitoreó y se calificó durante varios días. Como se informó previamente, la actividad antiinflamatoria de sFc es dependiente de DC-SIGN (panel izquierdo) . FA241 también suprimió la inflamación artrítica en ratones atacados con K/BxN en una forma dependiente de DC-SIGN. FA243 no redujo en forma importante la hinchazón de las almohadillas plantares el dia 6. Los promedios y SEM de las calificaciones clínicas de 4-5 ratones por cada grupo se graficaron el Día 6.
Ejemplo 5: Requisitos de caracterización para la actividad antiinflamatoria de FA241 Para identificar los determinantes para la actividad antiinflamatoria de FA241, macrofagos obtenidos de la médula ósea (???F) de ratones CDllc . DC-SIGN+ y SIGNR1_/" recibieron estimulación con FA241 u otras preparaciones de Fe y se transfirieron a ratones receptores WT C57BL/6 atacados con sueros de K/BxN.
En resumen, los macrofagos obtenidos de la médula ósea de ratones CDllc. DC-SIGN+ y SIGNRl"7" se cultivaron en IL-3 (5 ng/mL) y M-CSF (5 ng/mL) durante 5-7 días. Como se muestra en la Figura 4, DC-SIGN+ ???F fueron pulsados con 0,5 mg/mL de glicoformas asialiladas (barras negras) o sialiladas (barras blancas) de preparaciones de Fe indicadas. Los ???F tratados con Fe se transfirieron a ratones receptores WT C57BL/6 seguidos por el ataque con K/BxN. Como se muestra en la Figura 4b, SIGNRl-7" (barras negras) y DC-SIGN+ (barras blancas) ???F fueron pulsados con 0,5 mg/mL de la preparación de Fe indicada y se transfirieron a ratones receptores WT C57BL/6 seguido por el ataque con K/BxN.
En forma similar, los DC-SIGN+ ???F fueron pulsados con 0,5 mg/mL de FA241 o FA241 desglicosilada (Figura 4c, barras blancas) o PBS (Figura 4c, barra negra) y se transfirieron a ratones receptores WT C57BL/6 seguido por el ataque con K/BxN. FA241 se desglicosiló con PNGasa F y la eliminación de glicano se confirmó mediante txncion con lectma. DC-SIGN ?? F se pulsaron con la preparación de Fe asialilado o PBS (Figura 4d, circulo negro) y se transfirieron a ratones receptores WT C57BL/6 seguido por el ataque con K/BxN. En todos los casos, la hinchazón de las almohadillas plantares se monitoreó y se calificó durante varios dias. Los promedios y SEM de las calificaciones clínicas de 4-5 ratones por cada grupo se grafican. *P < 0,05, como se determina mediante el análisis del ensayo de la varianza (ANOVA) , seguido por una prueba post hoc de Tukey.
Como se muestra en la Figura 4A, las preparaciones de FA241 asialilada o sialilada fueron igualmente efectivas en la supresión de la inflamación de las articulaciones comparado con sFc. Las preparaciones de Fe WT, sin embargo, necesitaron ácido siálico unido a a2,6 ya que DC-SIGN+ ???F pulsados con Fe de WT asialilado Fe no transfirieron la protección a los ratones receptores. En forma correspondiente con los resultados mostrados en la Figura 3, tanto sFc como FA241 necesitaron la expresión de DC-SIGN en ???F para transferir la protección (Figura 4B) . Si bien FA241 no necesita del ácido siálico para transferir protección, la desglicosilación con PNGasa F anuló las propiedades antiinflamatorias de FA241 (Figura 4C) lo cual sugiere que el glicano de Fe aún es necesario. Además, para demostrar que la actividad antiinflamatoria observada es especifica de la mutación F24iA, DC-SIGN+ ???F se pulsaron con Fe que llevan otras mutaciones que no confieren una unión mejorada a DC-SIGN. Solamente los ???F estimulados por FA241 protegieron a los ratones receptores atacados por K/BxN.
Ejemplo 6: La mutación FA241 aumentó la unión al receptor de Fcy Si una sustitución de alanina en la posición 241 induce un cambio de conformación en el Fe, entonces quizás se altera la afinidad hacia receptores Fcy humanos. Previamente se informó que la sialilación reduce la afinidad de las IgG a los FcyR, atenuando en consecuencia la actividad in vivo de ADCC.
La unión de Fe de IgGl recombinante hacia FcyR humanos se midió mediante resonancia de plasmones superficiales (SPR) . Los Fe se prepararon en la forma descrita anteriormente. Los sensorgramas de SPR para la unión de anticuerpos a hFcyRIIAi3iR y hFcyRIIB inmovilizados se muestran en la Figura 5 para glicoformas asialiladas y sialiladas de Fe de hlgGl T y para Fe de FA241 asialilado .
Como se muestra en la Figura 5, las glicoformas asialiladas de Fe WT unido a hFcyRIIA y RIIB con un valor de KD observado de 2-3x10" 5 M. sFc, sin embargo, no pareció unirse ni a hFcyRIIA ni a RIIB.
Sorpresivamente, FA241 parece unirse tanto a hFcyRIIA como a RIIB con un orden de magnitud de mayor afinidad (KD = 2xl0~6 M) .
Ejemplo 7: La inducción de mARN de IL-33 en macrofagos obtenidos de la médula ósea por FA241 sFe induce una via antiinflamatoria dependiente de TH2 que necesita la secreción de IL-4 desde la población de leucocitos de FceRI+, probablemente basófilos, para regular en forma ascendente FcyRIIB sobre macrofagos reguladores. La administración de IL-33 in vivo o in vitro estimula a los basófilos a liberar almacenamientos de IL-4. La expresión de mARN de IL-33 se regula en forma ascendente en bazos de ratones WT C57BL/6 tratados con sFc o IVIG, pero no en ratones SIGNRl~/_. Esto sugiere que sFc puede inducir la expresión de IL-33 en células SIGNR1+ o DC- SIGN+. En este ensayo, se realizaron ensayos y demuestran que ???F de DC-SIGN+ con FA241 parece regular en forma ascendente la expresión de IL-33.
Más específicamente, los macrófagos obtenidos de la médula ósea de ratones CDllc . DC-SIGN+ y SIGNRl"7" se cultivaron en la forma descrita anteriormente. Los ???F se sembraron en places de 12 receptáculos en medios de RPMI sin suero y se dejó que se adhirieran durante toda la noche a 37°C. Al día siguiente, las células se pulsaron con 0,5 mg/mL del Fe indicado en medios de RPMI sin suero durante 1 hora (Figura 6a.) o 4 horas (Figura 6b) a 37°C. El mARN se cosechó desde células en puntos de tiempo específicos y 1 µg de ARN total se usó para la amplificación de RT-PCR del mARN de IL-33 (paneles superiores). La amplificación de GAPDH sirvió como un control de carga (paneles inferiores) . El plásmido que expresa conjuntamente el Fe de DA265 y sialiltransferasa humana (ST6Gall) se transíectaron en células 293T que producen Fe recombinante altamente sialilado (ST6-DA265) .
Como se muestra en la Figura 6, la estimulación de ???F de DC-SIGN+ con FA241 parece regular en forma ascendente la expresión de IL-33. A pesar de los mayores niveles de basal de IL-33 comparado con ???F de DC-SIGN+, ???F de SIGNRl- " regularon en forma descendente la expresión del mARN de IL-33 en respuesta al tratamiento con FA241.
El ejemplo y la descripción precedentes de las realizaciones preferidas se deben tomar como ejemplos antes que como taxativos de la presente invención definida por las reivindicaciones. Todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan por la presente como referencia en su totalidad. Como se apreciará fácilmente, numerosas variantes y combinaciones de las características expuestas anteriormente se pueden utilizar sin apartarse de la presente invención que se expone en las reivindicaciones. No se considera que tales variantes se aparten del alcance de la invención y todas aquellas variantes están destinadas a estar incluidas dentro del alcance de las reivindicaciones siguientes.

Claims (26)

REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia modificada que es por lo menos un 75% idéntica a la región de Fe de IgG, en donde la secuencia modificada no tiene sialilación y el polipéptido tiene una actividad antiinflamatoria que es más alta que aquella de un polipéptido parental.
2. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el polipéptido parental comprende la región de Fe de IgG.
3. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la región de Fe de IgG comprende la secuencia de SEQ ID NO 1.
4. El polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el polipéptido aislado tiene la capacidad de unirse a DC-SIGN. i ?
5. El polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde el polipéptido aislado tiene una capacidad de unirse a hFcyRIIA o RIIB.
El polipéptido aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde el polipéptido aislado tiene la capacidad de unirse a hFcyRIIA o RIIB a un KD de 2xl0"5 M o menor (es decir, KA de 5,0 x 104 M"1 o mayor) .
El polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en donde la secuencia modificada tiene una mutación FA241.
El polipéptido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde la secuencia modificada es por lo menos un 75% idéntica a SEQ ID NO 2.
El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la secuencia modificada es por lo menos un 80% idéntica a SEQ ID NO 2.
El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la secuencia modificada es por lo menos un 90% idéntica a SEQ ID NO 2.
11. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 10, en donde la secuencia modificada es por lo menos un 95% idéntica a SEQ ID NO 2.
12. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 11, en donde la secuencia modificada es por lo menos un 99% idéntica a SEQ ID NO 2.
13. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 12, en donde la secuencia modificada comprende SEQ ID NO 2.
14. El polipéptido aislado de acuerdo con la reivindicación 9, en. dorrde .">lá secuencia modificada comprende esencialmente SEQ ID NO 2.
15. Un método para elaborar un polipéptido que tiene una actividad "añtiinflamatoria, el método comprende: proveer un polipéptido parental que tiene la secuencia de una región de Fe de IgG o una primera secuencia de ácido . nucleico que codifica el polipéptido parental; y modificar el polipéptido parental para obtener un polipéptido modificado de manera tal que el polipéptido modificado no tenga sialilación e imite la estructura de una : forma sialilada de la región de Fe de IgG.
16. El método de acuerdo con la reivindicación 15, en donde el paso de modificación se realiza modificando la primera secuencia de ácido nucleico para obtener un segundo ácido nucleico que codifica el polipéptido modificado.
17. Un polipéptido elaborado mediante el método de acuerdo con la reivindicación 15 o 16.
18. Un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia que codifica el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y 17.
19. Un vector de expresión que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18.
20. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18.
21. Un método para producir un polipéptido, que comprende cultivar la célula huésped de acuerdo con la reivindicación 20 en un medio en condiciones que permiten la expresión de un polipéptido codificado por el ácido nucleico y purificar el polipéptido desde la célula cultivada o el medio de la célula.
22. Una formulación farmacéutica que comprende (i) el polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y 17 o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18, y (ii) un portador farmacéuticamente aceptable.
23. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y 17, o un ácido nucleico que codifica el polipéptido.
24. Un polipéptido aislado, ácido nucleico, vector de expresión, Célula huésped, o una composición sustancialmente como se muestra y se describe en la presente.
25. Un método para tratar una enfermedad inflamatoria sustancialmente como se muestra y se describe en la presente.
26. El uso de un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-14 y 17 o un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 18 en la fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad inflamatoria.
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