JP2006506056A - 多量体タンパク質操作 - Google Patents

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Abstract

本明細書中に記載される発明は、（１）人工プレタンパク質、および該人工プレタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド、（２）これらの生体分子を製造するための方法、および（３）それらの使用方法を包含する。本発明の人工プレプロタンパク質は、単一のタンパク質に由来する多量体タンパク質を製造することができるタンパク質アセンブリーを含む。図４には、人工プレプロタンパク質をコードするポリヌクレオチドが細胞に導入され、目的とする生体分子が製造される方法が一般的に例示される。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）に基づき、米国仮特許出願第６０／４１５，９４０号（２００３年１０月３日出願）の利益を主張する。この出願の内容は本明細書により参考として本開示に援用される。
（技術分野）
本発明は、真核生物（すなわち、植物）における人工的な多量体タンパク質（すなわち、抗体および抗体フラグメント）の発現および組立てに関する。
（背景）
ポリペプチドが広範囲の様々な細胞宿主において発現され得ることが知られている。広範囲の様々な遺伝子が哺乳動物およびウイルスから単離され、異種の供給源に由来する転写および翻訳の開始調節シグナルおよび終結調節シグナルに結合され、これらの調節シグナルが機能的である宿主に導入されている。
植物は、多くの組換えタンパク質（特に、治療目的のために意図された組換えタンパク質）を発現させるための重要な系である。異種のタンパク質が、確実には、２つの一般的な方法の１つで、すなわち、染色体ＤＮＡの核形質転換によるか、または、宿主にウイルスベクターを感染させることによるかのいずれかによって作製されている。様々な遺伝子組換え植物が、植物ゲノムへの外来ＤＮＡの安定的な組み込みによって創出されており、遺伝子組換え植物の交配によるその後の遺伝的組換えは、新しい遺伝子を植物に導入し、多重遺伝子を植物に蓄積させるための簡便な方法である。あるいは、異種の遺伝子を運搬するために操作されたウイルスベクターを使用して、遺伝子がエピソーム様式で運搬され、これにより宿主の翻訳装置に寄生して目的とするタンパク質を発現するように、宿主をトランスフェクションすることができる。外来遺伝子の送達がどのように達成されるかにかかわらず、植物は、タンパク質を極めて競争力のあるコストでの農業的規模で製造することができる可能性のために、注目される宿主であり、しかし、他の利点もまた多く存在する。植物における組換えタンパク質のプロセシングおよび組立てもまた、哺乳動物細胞におけるプロセシングおよび組立てを相補することができ、このことは、より一般的に使用されている微生物発現システムを上回る利点であり得る。
組換え発現システムを抗体製造のために使用することのより有用な局面の１つは、抗体を分子工学によって要求に合わせて調節することができる容易さであり得る。このことは、全長型抗体の操作だけでなく、抗体フラグメントの製造を可能にする。例えば、付随的な様々な機能的な組換え抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂなど）を作製することができる。また、全長型抗体を産生する植物細胞の能力を、Ｆｃ媒介による特性が変化した抗体分子の製造のために利用することができる。これは、個々のドメインを遺伝子レベルで「切断し、つなぎ合わせる」ことを可能にする免疫グロブリン鎖のドメイン構造によって容易になる。例えば、機能的な抗体の正しい組立てを植物において維持しながら、ＩｇＭのＦｃ領域をＩｇＧのＦｃ領域で置換することができる。これらの変化は、抗原の結合または特異性に対する影響を有さず、しかし、Ｆｃ領域を介して媒介される抗体の保護的機能を変化させることがある。
免疫グロブリン分子は、２つの同一の重鎖および同一の軽鎖（Ｈ２Ｌ２）から構成されており、この場合、２つの鎖が等モル比で存在し、ジスルフィド結合によって連結されている。重鎖および軽鎖をコードする多重遺伝子、重鎖および軽鎖の再配置、ならびに、抗体を成熟化する厳密な転写制御および翻訳制御と組み合わせられた体細胞変異によって作り出される抗体の多様性は、Ｂ細胞の成熟化のための複雑化したプロセスをもたらす。Ｂ細胞が抗体提示細胞に成熟すると、発現した抗体の適正な組立てはその活性にとって非常に重要である。この問題を解決するために、細胞の分泌装置は、組立ての適正な折り畳みおよび折り畳み時期において不可欠な役割を果たしている。２つの重鎖は、天然に存在する抗体分子のいずれにおいても、２つの重鎖および２つの軽鎖が同一であるようにジスルフィド結合によって連結される。タンパク質分解酵素、例えば、パパインなどを使用して、Ｉｇ分子を３つのフラグメントに断片化することができる。２つのフラグメントは同一であり、抗原結合活性を含有しており、Ｆａｂフラグメント（または抗原結合フラグメント）と呼ばれ、これは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを有する対形成した軽鎖に対応する。第３のフラグメントは抗原結合性を含有しておらず、Ｆｃ（または結晶化可能なフラグメント）と呼ばれ、これは、対形成したジスルフィド連結のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを含有する。抗体のＦａｂ部分およびＦｃ部分を連結するヒンジ領域は柔軟なつなぎ鎖であり、つなぎ鎖が剛直であった場合には不可能な２つのＦａｂ領域の独立した運動を可能にしている。この多量体複合体の輸送は構成要素の正しい組立てに依存しており、部分的には、不完全に組み立てられたＩｇ重鎖が小胞体（ＥＲ）シャペロンＢｉＰと会合することによって制御される（Ｌｅｅ ＹＫ他、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．、１９９９（Ｊｕｌ）、１０（７）：２２０９〜１９）。他の重鎖定常ドメインは、軽鎖合成の非存在下では一時的にＢｉＰと相互作用するが、ＢｉＰは重鎖の最初の定常ドメイン（ＣＨ１）に安定に結合し、それにより重鎖をＥＲ内に保持させる。軽鎖の発現がない場合、ＣＨ１ドメインは折り畳まれず、また、そのドメイン間ジスルフィド結合が形成されず、従って、ＢｉＰに対する基質のままである。インビボでは、軽鎖が、ＣＨ１ドメインの折り畳みと、ＢｉＰの放出との両方を促進させるために要求される（Ｌｅｅ ＹＫ他、Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．、１９９９（Ｊｕｌ）、１０（７）：２２０９〜１９）。軽鎖は、本質的にはＣＨ１ドメインの折り畳みのために必須ではなく、しかし、ＢｉＰをＣＨ１ドメインから除き、それにより、ＣＨ１ドメインを折り畳み、Ｉｇの組立てを進行させる際には非常に重要な役割を果たしている。ＥＲにおける多量体タンパク質複合体の組立ては、厳密には、個々のサブユニットの適正な折り畳みに依存していない。むしろ、組立てはタンパク質サブユニットの完全な折り畳みを行わせることができる。ＢｉＰおよび軽鎖は、適正に組立られたＩｇ分子のみが、重鎖の最終的な折り畳みを制御することによってＥＲから輸送されることを確実にするために連係していることが明らかにされている。従って、両方の鎖が、同じ細胞において、同じ細胞内オルガネラに、同じ量で同時に存在しなければならないという要件は、成熟型抗体の最大限のスループットのためには非常に重要である。
多量体タンパク質の１つのタイプとしての抗体の標準的な組換え発現は、哺乳動物の抗体供給源により提供される方法と似ている。この場合、抗体のそれぞれの鎖が、それぞれの鎖をコードする個々の遺伝子から発現されるので、この方法は、２つのポリペプチドに対して２つの遺伝子という規則に従っている。それぞれの鎖の転写、翻訳、および細胞局在化または分泌は、その対応する鎖に依存することなく制御される。そのため、抗体多量体のポリペプチド鎖はそれぞれが別個のプロモーターおよび分泌リーダーによって制御される。染色体挿入点、プロモーターの強さおよび時期、ならびに分泌ペプチドの効率における違いは、相手方の鎖の非存在または低下したレベルのために、様々なレベルのそれぞれの鎖が小胞体（ＥＲ）に特定の時期に存在することをもたらし、その結果、抗体の不完全な成熟化または遅れた成熟化をもたらし得る。挿入位置の影響、内因性のプロモーターまたはエンハンサーに近いかどうか、差のあるプロモーター効率、移行効率および翻訳速度論は、異種の系における組換え抗体の異常な蓄積をもたらし得る。１遺伝子・１ポリペプチドの規則は、ウイルスの場合にはよくあるように、効率の理由から、また、より複雑なタンパク質によって要求されるような適正な折り畳みのために、また、そうでなければ、毒性分子または調節分子（例えば、プロタンパク質の形態でのプロホルモンなど）の場合のような時間的な制御のためにはときには破られる。
最近、外来の多量体タンパク質（例えば、抗体など）の遺伝子組換え植物における発現および組立てがＨｅｉｎ他の研究によって明らかにされている（米国特許第６，４１７，４２９号および米国特許出願公開第２００３０１７２４０７号）。しかしながら、図１に描かれるように、この方法は複雑であり、かなりの時間および実験を必要とする。具体的には、図１に示されるように、２つの別個の遺伝子が構築され、それぞれの遺伝子は、第１の遺伝子が、プロモーター（Ｐｒ）と、シグナルペプチド（Ｓｐ）と、重鎖を発現するセグメントとを含み、そして、第２の遺伝子が、プロモーターと、シグナルペプチドと、軽鎖を発現するセグメントとを含むように所望の抗体の一部分をコードする。第１の遺伝子が第１の植物の細胞に挿入され、第２の遺伝子が第２の植物の細胞に挿入される。その後、第１および第２の植物は、第１および第２の両方の遺伝子を願わくは含み、従って、目的とする抗体を形成するために折り畳まれるプロタンパク質の発現を引き起こす子孫を得るために他家受粉される。
Ｈｅｉｎ他の米国特許第６，４１７，４２９号および米国特許出願公開第２００３０１７２４０７号に示された方法論に伴う多くの困難の１つが、かなりの時間が、第１および第２の植物を成長させ、続いて他家受粉させ、子孫を作ることを可能にするために要求され得るということである。さらに、子孫が、軽鎖および重鎖の両方を発現させるための遺伝子の所望の組合せを含まないことがある可能性がある。
ＴＭＶのウイルスベクター植物発現システムでは、内因性および異種のウイルスプロモーターが、外来遺伝子の発現を行わせるために利用される。ベクターは１つだけの外来遺伝子を容易に収容するが、しかし、さらなる遺伝子に関しては、抗体については要求されるようにさらなるポリペプチドを産生させるために要求されるさらなるプロモーターの位置効果と同様に、サイズが問題となるので、より多くの困難を有している。ウイルスベクターの場合、プロモーター／遺伝子のセットがゲノムの３’末端から遠くになるほど、転写活性が低くなる。従って、インサートが大きくなるほど、異種遺伝子の介在配列の結果として、発現が低下する。ヘテロダイマーの場合のように、Ｆａｂについては当てはまるように、重鎖および軽鎖の化学量論的なレベルの同時発現が分泌のためには不可欠である。これは、抗体の成熟化におけるシャペロンＢｉＰの報告された役割からの結果である。ＢｉＰは、対となる鎖が相互作用し、ジスルフィド連結し、続いてＥＲから放出され、分泌流体における抗体の蓄積を生じさせるまで、新生鎖をＥＲの酸化性環境に保持することにおいて役割を有している。重鎖および軽鎖は、得られたヘテロダイマーが１対１の比の重鎖および軽鎖を含有するので、匹敵し得るレベルで発現されなければならない。様々な試みが、１つの鎖を１つのベクターから発現させ、かつ、第２の鎖を第２のベクターから発現させるために行われている（Ｖｅｒｃｈ Ｔ他、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９９８（Ｎｏｖ １）、２２０（１−２）：６９〜７５）。これら２つのベクターは、植物に重複感染させるために使用され、少量の抗体が回収された。この方法は、一方のウイルスを有する感染細胞が第２のウイルスに感染しないように交差保護されるために問題的である。典型的には、感染物の集まりに存在する細胞の単層のみが両方のウイルスに同時に感染すると考えられる。また、ＥＲ保持シグナルが、鎖の保持された同時局在化による会合を促進させるために鎖に置かれた。
真核生物細胞から分泌されることになるタンパク質は、粗面ＥＲ膜に存在する酵素のシグナルペプチダーゼによって切断されるシグナル配列の存在により小胞体に移行することが現在では一般に受け入れられている。タンパク質は、その後、ＥＲからゴルジに輸送され、そして、ゴルジ由来の分泌小胞を介して細胞表面に輸送される（Ｓ．ＰｆｅｆｆｅｒおよびＪ．Ｒｏｔｈｍａｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、５６：２８９〜５２、１９８７）。正しくプロセシングされ、正しく折り畳まれたタンパク質の産生における別の主要な工程は、ゴルジ装置および分泌小胞におけるプロタンパク質の成熟型形態への変換である。プロタンパク質の切断が、いわゆる二塩基性部位（すなわち、少なくとも２つの塩基性アミノ酸からなるモチーフ）において生じる。このプロセシングは、ゴルジ装置に存在する酵素によって、すなわち、いわゆる「二塩基性プロセシングエンドプロテアーゼ」によって触媒される。前駆体のプロセシングに関与する種々の「二塩基性プロセシングエンドプロテアーゼ」が知られている：例えば、哺乳動物プロテアーゼのフリン、ＰＣ２、ＰＣ１およびＰＣ３（Ｂａｒｒ、Ｃｅｌｌ、６６：１〜３、１９９１）、ならびに、酵母ＹＡＰ３遺伝子の産物（Ｅｇｅｌ−Ｍｉｔａｎｉ他、Ｙｅａｓｔ、６：１２７〜１３７、１９９０）および酵母ｙｓｃＦの産物（これはまたＫＥＸ２遺伝子産物として知られている；ＫＥＸ２ｐ）。ＫＥＸ２ｐは酵母接合フェロモンのα−接合因子の成熟化に関与している（Ｊ．ＫｕｒｊａｎおよびＩ．Ｈｅｒｓｈｏｗｉｔｚ、Ｃｅｌｌ、３０：９３３〜９３４、１９８２）。α−接合因子は、細胞表面への輸送の途中でプロセシングされる１６５アミノ酸の前駆体として産生される。最初の工程において、１９アミノ酸のシグナル配列（プレ配列）がシグナルペプチダーゼによって切断される。その後、前駆体はグリコシル化され、ゴルジに移動し、ゴルジにおいて、６６アミノ酸のプロ配列がＫＥＸ２ｐによって切断される。α−接合因子前駆体はまた、α因子「リーダー」配列として知られている。ゴルジ装置における別のプロテアーゼ（すなわち、ＫＥＸ１遺伝子産物）がこのタンパク質の最後の成熟化に関わる。
ＢｉＰは、ｈｓｐ７０ファミリーメンバーのすべてと同様に、折り畳まれていない新生ポリペプチドに結合するが、折り畳まれていないポリペプチドまたは組み立てられていないポリペプチドに露出した疎水性配列を認識することによって、また、分子内または分子間の凝集、その後の折り畳みおよびオリゴマー化のために適した状態にそのようなポリペプチドを維持することを阻害することによって機能すると考えられている（Ｋｎａｒｒ Ｇ他、Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ、１９９５（Ｎｏｖ １７）、２７０（４６）：２７５８９〜９４）。ＢｉＰはヘプタペプチドを認識し、脂肪族残基を有するヘプタペプチドを好む（Ｆｌｙｎｎ ＧＣ他、Ｎａｔｕｒｅ、１９９１（Ｏｃｔ ２４）、３５３（６３４６）：７２６〜３０）。この場合、脂肪族残基は、残基が交互に存在する場合にだけ好まれた。このことは、この配列を含有するタンパク質が延長された場合、これらの疎水性残基はすべてが、同じ方向を向き、おそらくは、ＢｉＰのポリペプチド結合ポケットに収まることを示唆している。
トウゴマの実から得られるリシンなどの植物種子毒では、プレプロタンパク質発現法が、不活性なプロタンパク質を有することによってリシンの毒性効果を和らげるために利用されている。プロリシンはＥＲおよびゴルジ複合体を通って豆のタンパク質貯蔵液胞（ＰＳＶ）に移動する。ＰＳＶに入ると、存在するプロテアーゼにより、タンパク質は成熟化され、ジスルフィド結合により連結されたＡ鎖およびＢ鎖から構成される非常に毒性のヘテロダイマーがもたらされる（Ｖｉｔａｌｅ，ＡおよびＤｅｎｅｃｋｅ，Ｊ、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１９９９（Ａｐｒ）、１１（４）：６１５〜２８）。類似する方法を、その成熟型形態が毒性であるか、または、そうでなければ、宿主にとって有害である組換え多量体タンパク質を発現させるための有用な方法として考えることができる。不可欠な受容体を認識した抗体はそのような分子であり得る。不活性なプロタンパク質前駆体としての多量体タンパク質またはヘテロダイマータンパク質の発現、および、ＰＳＶなどのオルガネラへの未成熟なプロタンパク質の送達、それに続く、抗体または他の分子を活性化するためのプロペプチドのその後の除去は、そのような分子の毒性作用の軽減または除去をもたらす。
ある種のヘテロダイマーのより複雑な折り畳みのための必要条件を解決するために、自然界は、プロペプチドと呼ばれるさらなる折り畳みシャペロンドメインとして作用する折り畳み中間体を取り込むという方法を考案している。プロ配列は、分子シャペロンとして作用し得る任意の配列であり得る：すなわち、シスまたはトランスで、適切な立体配座の形成に影響を及ぼすことができ、しかし、一般には、タンパク質の成熟鋳型形態には存在しないポリペプチド。これらのプロタンパク質は未成熟なタンパク質中間体として折り畳まれ、これにより、ＥＲにおける適切な立体配座およびジスルフィド連結が促進される。安定な中間体の折り畳みが、プロタンパク質全体の一部としてのプロペプチドドメインと一緒に内因性のシャペロンタンパク質の協力によって達成されると、プロペプチドはゴルジにおいてプロタンパク質から切断されて、成熟型の活性なタンパク質がもたらされる。これは、インスリン、サッカロミセス・セレビジアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のキラー毒素ウイルス（ｓｃＶ）ｋ１毒素、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）のプラスミドｋ１毒素、およびトウモロコシ黒穂菌（Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ）ウイルス（ＵｍＶ）のＫＰ６毒素などの多くのタンパク質について当てはまる。インスリンＣ鎖は、新しく形成されたクラスリン被覆の分泌小胞において、成熟型の活性なホルモンを産生するために除かれる。サッカロミセス・セレビジアエのＫ１キラー毒素前駆体は、シグナルペプチド、αサブユニット、プロペプチド（γサブユニット）およびβサブユニットから構成される。分泌された前駆体タンパク質は、αサブユニットおよびβサブユニットに関して形成された鎖間および鎖内のジスルフィド結合を伴って折り畳まれ、γプロペプチドがタンパク質分解により除かれる。成熟型Ｋ１毒素は、ジスルフィド連結されたαサブユニットおよびβサブユニットから構成されるヘテロダイマータンパク質である。同様に、ＫＰ６毒素は２つの別個のポリペプチド（αおよびβ）からなり、しかし、サブユニットが共有結合的に結合せず、６５７塩基対の二本鎖ＲＮＡセグメントによってコードされるという点で異なる。単一の転写物により、２１９アミノ酸のＫＰ６プレプロ毒素がもたらされ、これは、その後、プロセシングされて、７８アミノ酸のαポリペプチドおよび８１アミノ酸のβポリペプチドをもたらす。ウイルス感染したトウモロコシ黒穂菌細胞において、Ｋｅｘ２ｐによるプロ毒素のプロセシングが、２７位においてＰｒｏ−Ａｒｇ残基の後、および、αを生じさせるために１０７位においてＬｙｓ−Ａｒｇ残基の後で、また、βを生じさせるために１３９位においてＬｙｓ−Ａｒｇ残基の後で生じる。
植物細胞における多量体タンパク質の発現では、ポリペプチド鎖をコードする遺伝子が同じ植物細胞に存在することが必要である。本明細書中に開示される手法が現れるまでは、両方の遺伝子が同じ細胞に実際に導入される確率は極めて低かった。多量体タンパク質の組立ておよび著量の多量体タンパク質の発現は、今や、本明細書中に記載される方法および構築物の使用によって実現可能になっている。
本明細書中下記に記載される本発明によれば、２つの別個の遺伝子ではなく、単一の遺伝子を使用して、Ｈｅｉｎ他の米国特許第６，４１７，４２９号および米国特許出願公開第２００３０１７２４０７号に開示された方法に伴う困難のいくつかを回避し、かつ、所望の抗体を製造することが可能である。
（発明の要旨）
従って、活性な生体分子を比較的容易かつ大量に製造する方法が、今回、開示される。また、それにより製造される分子および組成物も同様に開示される。
これらの問題を解決するために、今回、ある種類の新規な人工プレプロタンパク質が設計および操作された。この人工プレプロタンパク質は、プロタンパク質、すなわち、第１のペプチド、第２のペプチドおよびプロペプチドから構成される単一のタンパク質に由来する多量体タンパク質を産生することができるタンパク質アセンブリーを含み、タンパク質アセンブリーにおいて、第１のペプチドおよび第２のペプチドは会合して、プロペプチドを本質的には含まない生物学的に機能的な立体配座を取る。第１のペプチドおよび第２のペプチドの例には、免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖、軽鎖および重鎖免疫グロブリン分子のフラグメント、Ｔ細胞受容体のα鎖およびβ鎖、または、ヘモグロビンのα鎖およびβ鎖がある。プロペプチドの例には、インスリンＣ鎖、サッカロミセス・セレビジアエのＫ１キラー毒素プロペプチド（γサブユニット）、クルイベロミセス・ラクチスのプラスミドｋ１毒素プロペプチド、またはＫＰ６毒素プロペプチド鎖がある。本発明は、プロペプチドを含有する安定な中間体タンパク質を形成するために折り畳まれる人工プロタンパク質（この場合、成熟型多量体タンパク質は、結合性を有するサブユニットを有する）、組換え技術によって調製されるこれらのタンパク質をコードするＤＮＡ、これらのＤＮＡを有する宿主細胞、ならびに、これらのタンパク質およびＤＮＡを製造するための方法を特徴とする。
２つのポリペプチドに対する天然に存在する２つの遺伝子から得られる多量体タンパク質の、１つの遺伝子が２つのポリペプチドをもたらすプロタンパク質への変換。適切に折り畳まれ、適切に会合した多量体タンパク質の蓄積をもたらすプロタンパク質の作製は好都合である。このような人工プロタンパク質は、適切な鎖内および鎖間の相互作用または会合（例えば、共有結合的および非共有結合的な連結など）が形成されるように安定な折り畳み中間体の形成を生じさせるにちがいない。プレペプチドまたはシグナルペプチドは、シグナル認識粒子との相互作用によって新生ポリペプチドをＥＲに向かわせ、シグナルペプチドは続いてシグナルペプチダーゼによってＥＲにおいて切断される。ＥＲに存在する間に、複雑な二次的、三次的および四次的な折り畳みが、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）ファミリー（これには、結合タンパク質（ＢｉＰ）が含まれる）、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）（これはジスルフィド架橋の形成を触媒する）、カルネキシン、カルレチクリンおよびグリコシルトランスフェラーゼ（これらは新生糖タンパク質と特異的に相互作用し、粗面ＥＲにだけ存在する）などの分子シャペロンとして生じるにちがいない。安定な、適正に折り畳まれたジスルフィド連結のプロタンパク質がプロペプチドによって促進されると、プロタンパク質は、さらなるプロセシングのためにゴルジ装置に輸送される。ゴルジにおいて、プロペプチドがタンパク質分解的に除かれ、成熟型抗体をその活性な形態にし、そのとき、成熟型抗体は細胞外に輸送され、植物においては成熟型抗体が細胞外空間またはアポプラストに蓄積する。プロテアーゼによるプロペプチドのアミノ末端およびカルボキシ末端におけるタンパク質分解的切断により、プロペプチドの放出がもたらされる。Ｋｅｘ２様プロテアーゼの認識配列は、Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒ，ＩおよびＢｅｒｇｅｒ，Ａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍ．（１９６７）２７：１５７〜６２の命名法慣例を使用したとき、Ｐ２におけるリシンおよびＰ１におけるアルギニンのアミノ酸残基を有する。プロペプチドの切断は、目的とする第１のペプチドに残留するカルボキシ末端でのＬｙｓ−Ａｒｇのアミノ酸対をもたらす。プロリンまたはアルギニンもまた、Ｐｒｏ−Ａｒｇ対またはＡｒｇ−Ａｒｇ対を作製するためにＰ２位においてリシンの代わりに使用され得る。そのような非天然対は、切断部位を作製するために、１アミノ酸の付加によって創出することができる。本発明の方法によって作製される多量体タンパク質は、第１のペプチドにおけるそのカルボキシ末端でのｌｙｓ−Ａｒｇ、Ｐｒｏ−ＡｒｇまたはＡｒｇ−Ａｒｇによって特徴づけられる。異なる生物には多くの異なるプロテアーゼが存在する。これらのプロテアーゼは異なる特異性を有する。プロペプチドのタンパク質分解的切断から生じる任意のアミノ酸対が本発明によって意図される。Ｌｙｓ−Ａｒｇ対、Ｐｒｏ−Ａｒｇ対またはＡｒｇ−Ａｒｇ対が保持され得るか、または除去され得る。Ｐ１位における１つのＡｒｇはまた、Ｐ２位におけるアミノ酸を除くことなく除去することができる。アミノ酸対の除去によって作製される誘導体タンパク質もまた本発明によって意図される。プロペプチドは、相互作用が、抗体の場合のように共有結合的であるか、あるいは、ヘモグロビンの場合のように非共有結合的、静電力、水素結合、またはファンデルワールス力および疎水性のであるとしても、多量体タンパク質のサブユニット間の相互作用を促進させる。結合性の相互作用が生じると、プロペプチドが除かれて、所望の多量体タンパク質が放出される。
本発明では、ＵｍＶ ＫＰ６毒素のポリペプチドサブユニットが除かれ、免疫グロブリンなどのプロタンパク質として天然には見出されず、免疫グロブリンの軽鎖および重鎖を含有する多量体タンパク質に由来するポリペプチドサブユニットによって置換されるキメラなプロタンパク質の創出が記載され、また、本発明は人工プロタンパク質の合成に関し、この方法では、プロタンパク質が折り畳まれて安定な中間体を形成し、プロペプチドが続いてプロタンパク質から除かれ、これにより、プロペプチドを本質的には含まない成熟型の活性な多量体タンパク質にされる。
本発明の第１の実施形態において、人工プロタンパク質は、３つのペプチド配列、すなわち、第１のペプチド配列と、中間プロペプチドと、第２のペプチド配列とを含む。本発明には、天然の状態においてプロペプチドに結合しているペプチド（例えば、インスリン分子など）は含まれない。本発明は、自然界に見出されないプロタンパク質形態を作製することが可能にする。これらの形態は、多量体タンパク質の製造を、それらを単一遺伝子形態で設置することを可能にすることによって簡略化する。
本発明の別の実施形態において、人工ポリヌクレオチドは４つのヌクレオチド配列を含む。上記の３ペプチド型の形態が、その前方に位置するシグナルペプチドに結合される。
本発明の別の実施形態において、人工ポリヌクレオチドを作製する方法は、目的とする第１のペプチド、中間プロペプチド、および目的とする第２のペプチドをそれぞれコードする第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、および第３のヌクレオチド配列を提供することを含む。目的とする第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、目的とする第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じまたは異なり得る。
本発明の別の実施形態において、人工ポリヌクレオチドを作製する方法は、シグナルペプチド配列、目的とする第１のペプチド、プロペプチド、および目的とする第２のペプチドをそれぞれコードする第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および第４のヌクレオチド配列を提供することを含む。目的とする第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、目的とする第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じまたは異なり得る。
本発明の別の実施形態において、人工プロタンパク質を作製する方法は、プロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチドを作製すること、および、人工ポリヌクレオチドを宿主生物において発現させ、それにより、プロタンパク質が作製されることを含む。
本発明の別の実施形態において、人工プレプロタンパク質を作製する方法は、プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチドを作製すること、および、人工ポリヌクレオチドを宿主生物において発現させることを含む。
本発明の別の実施形態において、多量体タンパク質を作製および単離する方法は、
シグナルペプチド配列、目的とする第１のペプチド、プロペプチド、および目的とする第２のペプチドをそれぞれコードする第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および第４のヌクレオチド配列を提供する工程；
第１のヌクレオチド配列の３’末端を第２のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程；
第２のヌクレオチド配列の３’末端を第３のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程；および
第３のヌクレオチド配列の３’末端を第４のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程、その結果、人工ポリヌクレオチドが生じ、かつ、これら４つのヌクレオチド配列から構成される（この場合、目的とする第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、目的とする第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じまたは異なり得る）；
得られた人工ポリヌクレオチドをトランスフェクションまたは安定的な形質転換によって宿主生物に導入する工程；
人工ポリヌクレオチドを宿主生物において発現させ、それにより、プレプロタンパク質が作製される工程；
プレプロタンパク質を成熟型の多量体タンパク質にプロセシングさせる工程；および
多量体タンパク質を単離する工程
を含む。
多量体タンパク質は、少なくとも２つのペプチド配列を有する任意の多量体タンパク質で、多量体を形成させることが意図され、しかし、異なる遺伝子配列に通常の場合にはコードされないか、または、それらの間にプロペプチド配列を天然の状態では有しない多量体タンパク質であり得る。これらのペプチドは、多量体を形成させるために技術者によって設計される任意のペプチド組であり得る。宿主生物は任意の宿主生物であり得る。一般的な宿主生物は、動物細胞、ヒト細胞、動物組織または完全な動物体、植物細胞、植物組織および完全な植物体である。
本発明の１つの実施形態において、人工プレプロタンパク質をコードするベクターは、ベクターヌクレオチドの複製およびタンパク質のために必要なヌクレオチド配列と、ベクターに挿入された人工ポリヌクレオチドとを含み、この場合、人工ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド配列をコードする第１のヌクレオチド配列と、目的とする第１のペプチドをコードし、第１のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第２のヌクレオチド配列と、プロペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第３のヌクレオチド配列と、目的とする第２のペプチドををコードし、第３のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第４のヌクレオチド配列とを含み、かつ、人工ポリヌクレオチドは、ベクターが再生産され得るように、また、要求される場合には、人工プレプロタンパク質を産生し得るようにベクターに挿入されている。
本発明の別の実施形態において、一過性に形質転換された細胞は、人工プレプロタンパク質をコードするベクターを含む。ベクターヌクレオチドの複製およびタンパク質のために必要なヌクレオチド配列；ベクターに挿入された人工プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド、この場合、人工ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド配列をコードする第１のヌクレオチド配列と、目的とする第１のペプチドをコードし、第１のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第２のヌクレオチド配列と、プロペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第３のヌクレオチド配列と、目的とする第２のペプチドををコードし、第３のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第４のヌクレオチド配列とを含み、かつ、人工ポリヌクレオチドは、ベクターが再生産され得るように、また、要求される場合には、人工プレプロタンパク質を産生し得るようにベクターに挿入されている；人工プレプロタンパク質の発現を行わせることができるプロモーター；および、人工ポリヌクレオチドによってコードされる人工プレプロタンパク質。数種類の異なる多量体タンパク質が下記に記載される。
本発明の別の実施形態において、遺伝子組換え細胞は、
（ａ）染色体に安定的に組み込まれている人工ポリヌクレオチド、この場合、人工ポリヌクレオチドは、
シグナルペプチド配列をコードする第１のヌクレオチド配列、
目的とする第１のペプチドをコードし、第１のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第２のヌクレオチド配列、
プロペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第３のヌクレオチド配列、および、
目的とする第２のペプチドををコードし、第３のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第４のヌクレオチド配列
を含み、
かつ、人工ポリヌクレオチドは、ベクターが再生産され得るように、また、要求される場合には、人工プレプロタンパク質を産生し得るようにベクターに挿入されている；
（ｂ）人工プレプロタンパク質の発現を行わせることができるプロモーター；および
（ｃ）人工ポリヌクレオチドによってコードされる人工プレプロタンパク質
を含む。
本発明の別の実施形態において、遺伝子組換え植物は、ａ）シグナルペプチド配列、ｂ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチド、ｃ）プロペプチド、およびｄ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチドを含む人工プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド配列を含有する植物細胞を含む。この場合、重鎖は、プレプロタンパク質上の位置ｂまたは位置ｄのいずれかにおいて存在させることができ、軽鎖はもう一方の位置に存在し、人工プレプロタンパク質は、前記人工ポリヌクレオチド配列によりコードされる分泌シグナル含有の免疫グロブリン分子を形成するシグナルペプチド配列シグナルペプチド配列を含有し、前記シグナルペプチド配列シグナルペプチド配列はタンパク質分解的プロセシングによって前記人工プレプロタンパク質から切断され、かつ、前記プロペプチドは、残留するポリペプチドの適正な折り畳みの後で重鎖および軽鎖から切断される。免疫グロブリンの例は、遺伝子組換え植物によって作製され得る多量体タンパク質の多くの可能な例の１つである。多量体タンパク質を作製するために必要な任意の他のペプチド組もまた好適である。
本発明の別の実施形態において、免疫グロブリン分子を産生することができる遺伝子組換え植物を作製するための方法は、
（ａ）（ｉ）シグナルペプチド配列、（ｉｉ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチド、（ｉｉｉ）プロペプチド、およびｄ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチドを含み、重鎖がプレプロタンパク質上の位置ｂまたは位置ｄのいずれかにおいて存在させることができ、軽鎖がもう一方の位置に存在するプレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド配列を植物種のメンバーのゲノムに導入すること、および
（ｂ）形質転換体を得るために、安定的な形質転換を生じさせること
を含む。
免疫グロブリンの例は、遺伝子組換え植物によって作製され得る多量体タンパク質の多くの可能な例の１つである。多量体タンパク質を作製するために必要な任意の他のペプチド組もまた好適である。
免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む免疫グロブリン分子または免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを単一宿主細胞において製造するための方法では、
（ａ）少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、プロペプチドと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードする単一ＤＮＡ配列で前記単一宿主細胞を形質転換する工程、および
（ｂ）前記単一ＤＮＡ配列を発現させ、その結果、前記の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖が、前記の形質転換された単一宿主細胞において単一のプロペプチド分子として産生される工程
が含まれる。
本発明の別の実施形態において、ベクターは、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードする単一ＤＮＡ配列を含み、この場合、前記単一ＤＮＡ配列は１カ所の挿入部位においてベクターに存在する。
本発明の別の実施形態において、形質転換された宿主細胞は少なくとも２つのベクターを含み、この場合、前記ベクターの少なくとも１つが、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードする単一ＤＮＡ配列を含む。
本発明の別の実施形態において、１つの方法は、
（ａ）免疫グロブリンの重鎖および軽鎖またはＦａｂ領域からなり、特定の既知の抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンをコードするＤＮＡから本質的にはなるＤＮＡ配列で、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、切断可能なプロペプチドと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとからなるプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を調製すること、
（ｂ）工程ａ）のＤＮＡ配列を、好適なプロモーターに機能的に連結されている複製可能な発現ベクターに挿入すること、
（ｃ）原核生物系または真核生物系の微生物宿主の細胞培養物を工程ｂ）のベクターで形質転換すること、
（ｄ）宿主細胞を培養すること、および
（ｅ）既知の抗原に結合することができる免疫グロブリンを宿主細胞培養物から回収すること
を含む。
本発明の別の実施形態において、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む免疫グロブリン分子または免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを単一宿主細胞において製造するための方法は、
少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードする単一ＤＮＡ配列を発現させ、その結果、前記の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖が、前記単一ＤＮＡ配列で形質転換された単一宿主細胞において単一のロタンパク質分子として産生されることを含む。
別の実施形態において、多量体タンパク質は第１および第２のペプチドによって特徴づけられ、この場合、第１のペプチドはカルボキシ末端のＰ１位およびＰ２位に非天然アミノ酸対を含む。
多量体タンパク質に由来する多量体タンパク質は第１および第２のペプチドによって特徴づけられ、この場合、第１のペプチドはカルボキシ末端のＰ１位およびＰ２位に非天然アミノ酸対を含む。
（一般的な参考文献）
別途示されない限り、本発明の多くの局面の実施では、この技術分野の技術の範囲内にある、分子生物学、組換えＤＮＡ技術および免疫学の従来の技術が用いられる。そのような技術は科学文献においてより詳細に記載されている：例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．他、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、現行巻； Ａｌｂｅｒｓ，Ｂ．他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ、第２版、Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８９）；Ｌｅｗｉｎ，ＢＭ、Ｇｅｎｅｓ ＩＶ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ（１９９０）；Ｗａｔｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．他、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ、第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２；Ｄａｒｎｅｌｌ，ＪＯＥ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｂｏｏｋｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ（１９８６）；Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．他、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第２版、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｅｒｋｅｌｅｙ、ＣＡ（１９８１）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第Ｉ巻＆第ＩＩ巻（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、現行版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、現行版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、現行版）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｂａｌｌ編、１９８７）；Ｈａｒｔｌｏｗ，Ｅ．他、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ＮＹ、１９８８；Ｃｏｌｌｅｇｉａｎ，Ｊ．Ｅ．他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９１。タンパク質の構造および機能が、Ｓｃｈｕｌｚ，ＧＥ他、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９７８）、および、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，ＴＥ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、１９８３）において議論されている。
（発明の詳細な説明）
（定義）
双子葉植物（ｄｉｃｏｔ）；胚が２つの半種子または子葉を有する顕花植物。双子葉植物の例には、タバコ；トマト；アルファルファを含むマメ科植物；オーク；カエデ；バラ；ミント；カボチャ；ヒナギク；クルミ；サボテン；スミレ；およびキンポウゲが挙げられる。
単子葉植物（ｍｏｎｏｃｏｔ）：胚が１つの子葉を有する顕花植物。単子葉植物の例には、ユリ；イネ科植物；トウモロコシ；オートムギ、コムギおよびオオムギを含む穀物植物；ラン；アイリス；タマネギおよびヤシ科植物が挙げられる。
下等植物：任意の非顕花植物であり、シダ、裸子植物、コニファー、トクサ類、ヒゲノカズラ類、タイ（苔）類、マツモ、セン（蘚）類、紅藻類、褐藻類、シダ植物の配偶体、および緑藻類が含まれる。
真核生物ハイブリッドベクター：ポリペプチド（インサート）をコードするＤＮＡを真核生物細胞に導入することができるＤＮＡ。
染色体外リボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）：リボソームＲＮＡをコードする１つまたは複数の遺伝子を有し、（染色体の複製に依存することなく）自律的に複製する、単細胞真核生物において染色体の外に見出されるＤＮＡ。
パリンドロームＤＮＡ：１つまたは複数の対称中心を有するＤＮＡ配列。
Ｔ−ＤＮＡ：転移したＤＮＡのセグメント。
ｒＤＮＡ：リボソームＤＮＡ。
ｒＲＮＡ：リボソームＲＮＡ。
Ｔｉプラスミド：腫瘍誘導プラスミド。
Ｔｉ−ＤＮＡ：Ｔｉプラスミドに由来するＤＮＡセグメント。
インサート：インサートが挿入されようとしているＤＮＡクローンにとって外来であるＤＮＡ配列。
構造遺伝子：ポリペプチドをコードする遺伝子で、好適なプロモーター、終結配列、および場合により他の調節ＤＮＡ配列を備え、かつ正しい読み枠を有する遺伝子。
シグナル配列：ポリペプチドに結合したシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列。
シグナルペプチド：ポリペプチドを小胞体に結合させ、タンパク質の分泌には不可欠である、ポリペプチドに結合した一連のアミノ酸。このシグナルはまた、本明細書中ではプレペプチドとして示されることがある。用語「シグナルペプチ」はまた、タンパク質が粗面小胞体またはフリーのリボソームにおいて形成されるかを決定するアミノ酸配列を示すために使用され得ることがある。
（選択的な）遺伝的マーカー：形質転換された細胞が非形質転換細胞から選択され得る表現型形質をコードするＤＮＡ配列。
プロモーター：発現制御エレメントを遺伝子に提供し、ＲＮＡポリメラーゼが特異的に結合し、その遺伝子のＲＮＡ合成（転写）を開始する、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列あるいは一群のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列における認識部位。
誘導性プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始の速度が外部の刺激によって調節されるプロモーター。そのような刺激には、光、熱、嫌気性ストレス、栄養条件の変化、代謝産物の存在または非存在、リガンドの存在、微生物攻撃、傷害などが含まれる。
ウイルスプロモーター：ウイルス遺伝子の５’末端に見出されるプロモーターと実質的に類似する、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を有するプロモーター。典型的なウイルスプロモーターが、Ｈｕａｎｇ他、Ｃｅｌｌ、２７：２４５（１９８１）によって記載されるＭＭＴＶのｐ２１タンパク質をコードする遺伝子の５’末端に見出される。
合成プロモーター：生物学的に由来するのではなく、化学合成されたプロモーター。通常、人工プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼの開始効率を最適化する配列変化を含む。
構成的プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始の速度がほぼ一定であり、外部の刺激には比較的無関係であるプロモーター。構成的プロモーターの例には、Ｐｏｓｚｋｏｗｓｋｉ他、ＥＭＢＯ Ｊ．、３：２７１９（１９８９）；および、Ｏｄｅｌｌ他、Ｎａｔｕｒｅ、３１３：８１０（１９８５）によって記載されるカリフラワーモザイクウイルスの３５Ｓプロモーターおよび１９Ｓプロモーターが含まれる。
時間的調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始の速度が発達時の特定の時期に調節されるプロモーター。時間的調節プロモーターの様々な例が、Ｃｈｕａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１７４〜１８１（１９８９）に示される。
空間的調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始の速度が生物の特定の構造（例えば、葉、茎または根など）において調節されるプロモーター。空間的調節プロモーターの様々な例が、Ｃｈｕａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１７４〜１８１（１９８９）に示される。
時空的調節プロモーター：ＲＮＡポリメラーゼの結合および開始の速度が生物の特定の構造において発達時の特定の時期に調節されるプロモーター。典型的な時空的調節プロモーターは、Ｃｈｕａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１７４〜１８１（１９８９）によって記載されるＥＰＳＰ合成酵素−３５Ｓプロモーターである。
キレート化剤：金属と結合することができる化学化合物、ペプチドまたはタンパク質。キレート化剤の例には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコール−ビス−（β−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、２，３−ジメルカプトプロパン−１−スルホン酸（ＤＭＰＳ）および２，３−ジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ）などが含まれる。
金属キレート化複合体：キレート化に結合した金属を含有する複合体。
免疫グロブリン産物：免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分を少なくとも含有し、従って、抗原と特異的に結合することができるポリペプチド、タンパク質または多量体タンパク質。例示的な免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリン分子、実質的に完全な免疫グロブリン分子、パラトープを含有する免疫グロブリンの任意の部分（これには、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントおよびＦｖフラグメントとしてこの分野では知られているそのような部分が含まれる）である。
免疫グロブリン分子：相互に会合した免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の免疫学的に活性な部分を含有し、抗原と特異的に結合することができる多量体タンパク質。
Ｆａｂフラグメント（Ｆａｂ）：相互に会合した、Ｆｄと呼ばれる免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分と、免疫グロブリン軽鎖とを含有する免疫グロブリン分子の一部分からなり、抗原と特異的に結合することができる多量体タンパク質。Ｆａｂフラグメントは、典型的には、この分野で広く知られている方法を使用して、パパインを用いた実質的に完全な免疫グロブリン分子のタンパク質分解的消化によって調製される。しかしながら、Ｆａｂフラグメントはまた、この分野で広く知られている方法を使用して、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の所望される部分を好適な宿主細胞において発現させることによって調製され得る。
Ｆａｂ’フラグメント（Ｆａｂ’）：二量体化しているＦａｂまたは二量体Ｆａｂ。
無性繁殖：葉切断片、茎切断片、根切断片、１個の植物細胞（プロトプラスト）およびカルスから完全な植物を再生させることにより子孫を作製すること。
グリコシル化コア部分：すべてのアスパラギン結合型オリゴ糖に共通する五単糖コア。五単糖コアはＭａｎα−１−３（ｍａｎα−１−６）Ｍａｎβ−１−４６ＬｃＮＡｃβ−１−４６ＬｃＮａｃ−（ＡＳＮアミノ酸）の構造を有する。五単糖コアは、典型的には、五単糖コアに連結する２個の外側の枝分かれを有する。
Ｎ−アセチルグルコサミン含有外側枝分かれ：アスパラギン結合型オリゴ糖の五単糖コア（グリコシル化コア部分）に連結しているさらなるオリゴ糖。哺乳動物および植物の両方の糖タンパク質において見出される外側枝分かれは、マンノースのみを含有する酵母の外側枝分かれとは正反対に、Ｎ−アセチルグルコサミンを含有する。哺乳動物の外側枝分かれは、外側枝分かれの末端部分に直接に連結されたシアル酸残基を有する。
グリコポリペプチド多量体：単一の球状タンパク質を形成するために相互に会合したグリコシル化ポリペプチド鎖またはグリコシル化タンパク質鎖および少なくとも１つの他のポリペプチド鎖またはタンパク質鎖を含有する球状タンパク質。ヘテロダイマー糖タンパク質およびホモダイマー糖タンパク質はともに多量体タンパク質である。グリコシル化ポリペプチドおよびグリコシル化タンパク質は、Ｎ−アセチルグルコサミンのＣ（１）がアスパラギンのアミド基に連結されているｎ−グリカンである。
免疫グロブリンスーパーファミリー分子：免疫グロブリンまたは免疫グロブリン関連ドメインと有意に類似しているドメインサイズおよびアミノ酸残基配列を有する分子。類似性の有意性は、Ｄａｙｈｏｆｆ他、Ｍｅｔｈ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、５２４〜５４５（１９８３）によって記載されるＡｌｉｇｎプログラムなどのコンピュータープログラムを使用して統計学的に決定される。３未満の典型的なＡｌｉｇｎスコアにより、調べられている分子が免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーのメンバーであることが示される。
免疫グロブリン遺伝子スーパーファミリーは、表Ａに示され、また、ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙにより、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ（３６１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８９））に記載される分子を含む分子からなる７つの主要なクラスを含有する。
Figure 2006506056
 ＊ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＢａｒｃｌａｙ、Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ、３６１頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、米国保健社会福祉省（１９８７）を参照のこと。
触媒作用部位：反応物と結合し、反応の速度を改善することができる分子の一部分。触媒作用部位は、ポリペプチドまたはタンパク質、酵素、有機物、有機金属化合物および金属などに存在し得る。触媒作用部位は、１つまたは複数のポリペプチド鎖または化合物に存在する別個の部分から構成される場合がある。これらの別個の触媒作用部分は会合して、触媒作用部位のより大きな部分を形成する。触媒作用部位は、金属に結合しているポリペプチドまたはタンパク質によって形成される場合がある。
酵素作用部位：触媒作用部位を含有するタンパク質分子の一部分。ほとんどの酵素作用部位は非常に大きい選択的な基質特異性を示す。酵素作用部位は、同じポリペプチド鎖の異なるセグメントに存在する２つ以上の酵素作用部位部分から構成される場合がある。これらの酵素作用部位部分は会合して、酵素作用部位のより大きな部分を形成する。酵素作用部位の一部分はまた金属である場合がある。
自家受粉：同じ植物における雄花部から雌花部への花粉の移転。このプロセスにより、典型的には種子が作製される。
他家受粉：ある植物の雄花部から別の植物の雌花部への花粉の移転。このプロセスにより、典型的には、生存可能な子孫が成長し得る種子が作製される。
エピトープ：免疫グロブリン産物によって特異的に認識される分子の一部分。エピトープはまた決定基または抗原決定基とも呼ばれる。
アブザイム：酵素または触媒として作用することができる免疫グロブリン分子。
酵素：酵素が多くの場合には特異的である基質における何らかの変化を触媒作用によって促進または生成することができるタンパク質、ポリペプチド、ペプチドＲＮＡ分子または多量体タンパク質。
軽鎖（Ｌｔ）：１つのＶドメインおよび１つのＣドメインからなる、免疫グロブリン単量体における２つのタイプのポリペプチド鎖の２つのうちの小さい方（約２３０００のＭＷ）。κおよびλとして知られている軽鎖の２つのクラスが存在する。
可変（Ｖ）：比較的不変のフレームワーク領域と、超可変領域とを含有する免疫グロブリン単量体のドメイン。フレームワーク領域は、抗原と接触する超可変領域にタンパク質足場を提供する。
定常（Ｃ）：異なる免疫グロブリン分子の間でアミノ酸配列が比較的一定し、特定のエフェクター機能およびタイプ（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭのクラスにそれぞれ対応するα、γ、δ、εおよびμなど）を決定する免疫グロブリン単量体のドメイン。
短い重鎖（Ｆｄ）：免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分を含有し、１つのＶドメインおよび１つのＣドメインからなる重鎖分子の一部分。
より長い重鎖（Ｆｄ’）：免疫グロブリン重鎖の免疫学的に活性な部分と、二量体化ドメインとを含有する重鎖分子のＦｄ部分。二量体化ドメインの１つのタイプがＣドメインである。
重鎖（Ｈｙ）：クラス特異的なポリペプチド免疫グロブリン成分（Ｉｇクラスに依存して、約５００００〜７００００のＭＷ）。重鎖の様々なタイプが、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭのクラスに対応して、それぞれ、α、γ、δ、εおよびμと呼ばれる。
人工（的）：本発明の目的のために、人工（的）は、ドメインの１つがプロペプチドまたはプロペプチドコード配列であるペプチドドメインまたはヌクレオチドドメインの人工的な配置で、類似物が自然界において知られていない配置を意味する。プロペプチドまたはプロペプチドコード配列に結合した２つのドメインは単一のオープンリーディングフレームまたは単一の得られるプロタンパク質において天然には配置されないので、そのような配置は自然界では見出されない。
プロタンパク質をコードする人工ヌクレオチド配列は、ドメインの１つが内部のプロペプチドをコードするオープンリーディングフレームにおけるヌクレオチド配列ドメインの配置で、類似物が自然界において知られていない配置である。人工プロタンパク質配列は、ドメインの１つが内部のプロペプチドであるプロタンパク質におけるペプチド配列ドメインの配置で、類似物が自然界において知られていない配置である。プロタンパク質をコードする人工ヌクレオチド配列の一例が、ドメインの１つが内部のプロペプチドをコードし、それ以外の２つのドメインが抗体またはＦａｂフラグメントの重鎖および軽鎖をそれぞれコードする単一のオープンリーディングフレームにおけるヌクレオチド配列ドメインの配置である。自然界では、２つの別個の遺伝子が抗体の重鎖および軽鎖をそれぞれコードしている。
人工抗体プロタンパク質配列はペプチド配列ドメインの配置である。ドメインの１つが内部のプロペプチドである。内部のプロペプチドの隣には、軽鎖がプロペプチドの一方の側面に存在し、重鎖が反対側に存在する。この配置は自然界では類似物が知られていない。この配置は、折り畳まれ、内部のプロペプチドが切断されたとき、ジスルフィド結合した多量体タンパク質をもたらす。これに対して、インスリンは、本発明による人工プロタンパク質の例ではない。インスリンは、自然界では、単一のオープンリーディングフレームにコードされる多量体である。そのオープンリーディングフレームは、第１のペプチド、プロペプチドおよび第２のペプチドをそれぞれコードする３つのドメインを有する。その結果は、内部のプロペプチドドメインを有するインスリンプロタンパク質である。インスリンムテインは本発明の人工プロタンパク質ではない。しかしながら、１つまたは複数を有する多量体抗体プロタンパク質。
プロペプチド：プロペプチドは、プロタンパク質において目的とする２つのペプチドの間に存在するペプチドである。プロペプチドは、目的とする２つのペプチドの間における立体配座的および近接的な会合を形成させ、それにより、安定な中間体をもたらすことを助けると考えられる。その後、目的とする２つのペプチドにより、多量体タンパク質が形成される。
プロタンパク質：プロタンパク質は、少なくとも３つのペプチド配列、すなわち、目的とする第１のペプチド配列、目的とする第１のペプチド配列のｃ末端に結合した内部のプロペプチド配列、および、プロペプチド配列のｃ末端に結合した目的とする第２のペプチド配列を含む多量体タンパク質中間体である。プロタンパク質は４つ以上のペプチド配列を含むことができる。天然に存在するプロペプチドまたは天然に存在しないプロペプチドはいずれも本発明に適合する。
プレプロタンパク質：プレプロタンパク質は、配置においてプロタンパク質の前方に存在するシグナルペプチドを有するペプチドの配置である。
多量体タンパク質：個々のポリペプチドまたはタンパク質が相互に会合して、１つのタンパク質を形成する２つ以上のポリペプチドまたはタンパク質を含有するタンパク質。ヘテロダイマータンパク質およびホモダイマータンパク質はともに多量体タンパク質である。
ポリペプチドおよびペプチド：隣接する残基のα−アミノ基とカルボキシ基との間でのペプチド結合によって互いにつながれたアミノ酸残基の線状系列。
タンパク質：ポリペプチドの場合のように互いにつながれた約５０アミノ酸残基以上の線状系列。
ポリペプチドまたはペプチドの「ドメイン」は、一般には、特定の構造および／または生化学的機能を与えるような様式で折り畳まれるポリペプチド鎖の領域を示す（Ｓｃｈｌｚ他、上掲）。ドメインは構造または機能に関して定義され得る。機能的ドメインは、１つだけの構造的ドメインであり得るが、しかし、２つ以上の構造的ドメインを含む場合もある。そのような機能には、酵素触媒活性、リガンド結合、原子のキレート化、または内因性の蛍光が含まれ得る。
「テンプレートＤＮＡ」は、「増幅プライマー対」（増幅反応において使用されるオリゴヌクレオチドプライマーの集団）によって増幅されるＤＮＡを示す。このＤＮＡは生物学的（組換え）手段または人工的（化学的）手段によって作製され得る。さらに、ｍＲＮＡを、増幅反応において使用されるテンプレートＤＮＡを形成させるために逆転写することができる。
「上流側プライマー」は、テンプレートＤＮＡのアンチセンス鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーの混合物である。
「下流側プライマー」は、テンプレートＤＮＡのセンス鎖にアニーリングするオリゴヌクレオチドプライマーまたはオリゴヌクレオチドプライマーの混合物である。
「増幅する／増幅」は、テンプレートＤＮＡ全体またはその一部分が少なくとも１回（好ましくは多数回）複製される反応を示す。
「連結する／連結」は、酵素法および／または化学的方法を使用して２つ以上のＤＮＡ鎖を（３’端から５’端に）共有結合的に結合することを示す。
「非テンプレート化エンドヌクレアーゼ認識部位」は、制限エンドヌクレアーゼによって認識される非テンプレート化配列の内部の配列である。
「ライブラリー」は、記載された方法を使用して作製された核酸分子の集団である。ヌクレオチド配列が異なる集団に含有されるメンバーの数は、供給源材料に含有される配列の数によって決定される。
（発明の概要）
本発明の特徴をより明瞭に理解するために、概要が提供され、図２〜図１１に関して記載される。
本発明者らは、抗体および抗体フラグメントなどの所望される多量体タンパク質を発現させるために、図２および図３に一般的に描かれる構築物などの数多くの構築物を製造している。そのような構築物は、所望される目的のために１つまたは複数の細胞から取り出された軽鎖（Ｌｔ）および重鎖（Ｈｙ）を含む。軽鎖および重鎖は、続いて発現される所望の多量体タンパク質に依存して、同じ細胞、同じタイプの細胞、または完全に異なるタイプの細胞から取り出され得ることを理解しなければならない。様々な知られている技術のいずれかを使用して、軽鎖および重鎖のそれぞれには、図２および図３に描かれるＲ１およびＲ２などの所定のエンドヌクレアーゼ制限部位が配置される。そのような制限部位を遺伝子配列に付加するための様々な方法がこの分野では広く知られている。
所定のプロペプチドが、本明細書中下記においてより詳細に記載される方法に従って構築される（例えば、実施例Ａを参照のこと）。プロペプチドにはさらに、図２および図３に示されるように、ｄｎａフラグメント（軽鎖Ｌｔおよび重鎖Ｈｙ）と融合させるために好適な適合し得る末端または相補的な配列であるＲ１およびＲ２の制限部位が配置される。広く知られているように、ＰＣＲのとき、制限部位は、重鎖Ｈｙ、プロペプチドおよび軽鎖を図２および図３に描かれる配向のいずれかで含む、図２および図３に示される配列の構築を可能にする。次に、Ｈｙ−プロペプチド−Ｌｔの配列が、例えば、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって開発されたＧｅｎｅｗａｒｅＴＭシステムにおいて使用されるウイルスなどのウイルスにクローン化され、これにより、シグナルペプチド（Ｓｐ）およびプロモーター（Ｐｒ）が配列に付加される。ＧｅｎｅｗａｒｅＴＭを使用して構築物を複製した後、最終的な構築物が、下記においてより詳細に記載されるように、様々な所望される発現システムのいずれかにおける使用のために単離される。
本発明の構築物（例えば、図２および図３に一般的に表される構築物など）は、所望されるタンパク質（１つまたは複数）、抗体フラグメントまたは抗体を発現させるために細胞に挿入される。これらの多量体タンパク質は、図４〜図９に関して下記においてより詳細に記載される細胞内の機構によって細胞において発現させることができる。
図４は、プレプロタンパク質をコードする単一遺伝子が細胞（１つまたは複数）に導入される本発明の１つの実施形態を表すブロック図である。この実施形態において、構築物は、プロモーターＰｒ、シグナルペプチドＳｐ、重鎖フラグメントＦｄ、プロペプチドおよび短い鎖Ｌｔを含む。この実施形態において、短い重鎖がシグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入されている。構築物は細胞に導入され、細胞において、発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、折り畳まれたプレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体フラグメントまたはＦａｂがもたらされ、これらは、下記においてより詳細に記載されるように、様々な技術のいずれかによって抽出され得る。
図５は、重鎖フラグメントＦｄおよび軽鎖Ｌｔの位置が逆になり、その結果、構築物が、プロモーターＰｒ、シグナルペプチドＳｐ、短い鎖Ｌｔ、プロペプチドおよび重鎖フラグメントＦｄを含むようになることを除いて、図４と類似するブロック図である。具体的には、軽鎖Ｌｔがシグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入されている。構築物は細胞に導入され、細胞において、発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、折り畳まれたプレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体フラグメントまたはＦａｂがもたらされ、これらは、下記においてより詳細に記載されるように、様々な技術のいずれかによって抽出され得る。
図６は、プレプロタンパク質をコードする単一遺伝子が細胞（１つまたは複数）に導入される本発明の別の実施形態を表すブロック図である。この実施形態において、構築物は、プロモーターＰｒ、シグナルペプチドＳｐ、重鎖フラグメントＦｄ’、プロペプチドおよび短い鎖Ｌｔを含む。具体的には、重鎖フラグメントＦｄ’がシグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入されている。構築物は細胞に導入され、細胞において、発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、折り畳まれたプレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望のＦａｂ’がもたらされ、これは、下記においてより詳細に記載されるように、様々な技術のいずれかによって抽出され得る。
図７は、重鎖フラグメントＦｄ’および軽鎖Ｌｔの位置が逆になり、その結果、構築物が、プロモーターＰｒ、シグナルペプチドＳｐ、短い鎖Ｌｔ、プロペプチドおよび重鎖フラグメントＦｄ’を含むようになることを除いて、図６と類似するブロック図である。具体的には、軽鎖Ｌｔがシグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入されている。構築物は細胞に導入され、細胞において、発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、折り畳まれたプレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望のＦａｂ’がもたらされ、これは、下記においてより詳細に記載されるように、様々な技術のいずれかによって抽出され得る。
図８は、プレプロタンパク質をコードする単一遺伝子が細胞（１つまたは複数）に導入される本発明のさらに別の実施形態を表すブロック図である。この実施形態において、構築物は、プロモーターＰｒ、シグナルペプチドＳｐ、全長の重鎖Ｈｙ、プロペプチドおよび短い鎖Ｌｔを含む。構築物は細胞に導入され、細胞において、発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、折り畳まれたプレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体がもたらされ、これは、下記においてより詳細に記載されるように、様々な技術のいずれかによって抽出され得る。
図９は、重鎖Ｈｙおよび軽鎖Ｌｔの位置が逆になり、その結果、構築物が、プロモーターＰｒ、シグナルペプチドＳｐ、短い鎖Ｌｔ、プロペプチドおよび重鎖Ｈｙを含むようになることを除いて、図８と類似するブロック図である。具体的には、軽鎖Ｌｔがシグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入されている。構築物は細胞に導入され、細胞において、発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、折り畳まれたプレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体がもたらされる。
図１０は、図２に描かれる構築物におけるプレプロタンパク質構築物をコードする単一遺伝子を使用する抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’）または完全な抗体の製造のために利用され得る様々な基盤を示すブロック図である。例えば、図２の構築物は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発されたＧｅｎｅｗａｒｅＴＭにおいて使用される細胞またはベクターなどの哺乳動物細胞、酵母細胞、遺伝子組換え植物細胞、バキュロウイルスベクターまたは植物ウイルスベクターに導入され得る。
図１１は、図３に描かれる構築物におけるプレプロタンパク質構築物をコードする単一遺伝子を使用する抗体フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’）または完全な抗体の製造のために利用され得る様々な基盤を示す。例えば、図３の構築物は、Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎによって開発されたＧｅｎｅｗａｒｅＴＭにおいて使用される細胞またはベクターなどの哺乳動物細胞、酵母細胞、遺伝子組換え植物細胞、バキュロウイルスベクターまたは植物ウイルスベクターに導入され得る。
（単一遺伝子を使用して多量体タンパク質を発現させる方法）
本発明は最初に、下記のより詳細な記載により、その最も広い包括的な局面が記載される。
今回、ある種類の新規な人工プロタンパク質が設計および操作された。このプロタンパク質は、多量体プロタンパク質、すなわち、第１のペプチド、第２のペプチドおよびプロペプチドから構成される単一のタンパク質に由来する多量体タンパク質を産生することができるタンパク質アセンブリーを含み、タンパク質アセンブリーにおいて、第１のペプチドおよび第２のペプチドは会合して、プロペプチドを本質的には含まない生物学的に機能的な立体配座を取る。第１のペプチドおよび第２のペプチドの例には、免疫グロブリン分子の軽鎖および重鎖、軽鎖および重鎖免疫グロブリン分子のフラグメント、Ｔ細胞受容体のα鎖およびβ鎖、または、ヘモグロビンのα鎖およびβ鎖がある。プロペプチドの例には、インスリンＣ鎖、サッカロミセス・セレビジアエのＫ１キラー毒素プロペプチド（γサブユニット）、クルイベロミセス・ラクチスのプラスミドｋ１毒素プロペプチド、およびＫＰ６毒素プロペプチド鎖がある。本発明は、プロペプチドを含有する安定な中間体タンパク質を形成するために折り畳まれる人工プロタンパク質（この場合、成熟型の多量体タンパク質は、結合性を有するサブユニットを有する）、組換え技術によって調製されるこれらのタンパク質をコードＤＮＡ、これらのＤＮＡを有する宿主細胞、ならびに、これらのタンパク質およびＤＮＡを製造するための方法を特徴とする。
人工プロタンパク質の設計は、多量体タンパク質が、多くの場合、その複雑な折り畳みおよび組立ての必要条件を完成させるために折り畳みシャペロンの関与を要求するという観測結果に基づいている。プロタンパク質は、多量体タンパク質の適正な折り畳みを促進させるためにプロペプチドの形態で分子シャペロンを含むように設計される。人工プロタンパク質はさらに、適正に組み立てられた成熟型の活性な多量体の蓄積を増大させるために、（中でも）、シャペロンの利用性、増大した局所的濃度、適正な細胞局在化、タンパク質サブユニットの時間的および化学量論的な発現を増大させるように設計される。プロペプチドは、各サブユニットの相対的なモル濃度が高くなり、それにより、ＢｉＰ、ＰＤＩおよび他の結合力（サブユニット間およびサブユニット内でのジスルフィド連結、静電的および疎水的な相互作用など）によって行われる折り畳みを促進するようにサブユニットを近くに接近させることによって、サブユニットの空間的分布に影響を及ぼす。
多量体の結合性タンパク質の組換え発現は最も低いサブユニットレベルによって制限され、多量体組成物の蓄積は、サブユニット発現レベルが等しくないことによって悪影響を受け得る。サブユニットポリペプチドを、細胞機構によって除去される安定な折り畳み用の立体配座的ポリペプチドに融合することによるプロタンパク質の創出は、成熟型タンパク質に内在することなく、適正なサブユニット相互作用をもたらす。ＫＰ６または他のプロペプチド分子は、上記で記載されたようなシャペロンとして作用し、しかし、さらには、ＢｉＰおよびＰＤＩなどの他のシャペロンを呼び寄せ、導き、その活性を増強または触媒するためにもまた作用し得る。
本発明は、多量体プロタンパク質の組換え製造では、多量体タンパク質を作製するために、安定な中間体を形成し、かつ、さらに成熟化される能力を有することが要求される。この技術が開発され、本明細書中に開示される。本開示を考慮して、組換えＤＮＡ技術、タンパク質設計およびタンパク質化学における当業者は、生物学的に活性な成熟型タンパク質をもたらすそのようなプレプロタンパク質を製造することができる。
別の実施形態において、人工タンパク質は、多量体タンパク質のプレプロタンパク質、すなわち、シグナルペプチド、第１のペプチド、プロペプチドおよび第２のペプチドから構成される単一のタンパク質に由来する多量体タンパク質を産生することができるタンパク質アセンブリーを含み、タンパク質アセンブリーにおいて、第１のペプチドおよび第２のペプチドは会合して、プロペプチドおよびシグナルペプチドを本質的には含まない生物学的に機能的な立体配座を取る。シグナルペプチドの例には、κ軽鎖リーダーまたはαアミラーゼシグナルペプチドがある。
本発明の別の実施形態において、プロタンパク質は部分的には、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖の一部分からなるＦａｂフラグメントに由来する。免疫グロブリン重鎖フラグメントおよび免疫グロブリン軽鎖は互い会合し、所定の抗原または事前に選択された抗原に対する抗原結合部位を有する立体配座を取る。Ｆａｂフラグメント上の抗原結合部位は、免疫グロブリン分子上の抗原結合部位と類似する結合親和力または結合力を有する。
別の実施形態において、プロタンパク質は、免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖から構成される多量体免疫グロブリン分子に由来する。免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖は互い会合し、競合的に阻害されるその能力によって明らかにされるように、事前に選択された抗原または所定の抗原について特異的な抗原結合部位を有する立体配座を取る。
さらなる実施形態において、プロタンパク質は、事前に選択されたリガンドに特異的に結合して、複合体が単離されるために十分に強い結合をリガンドとリガンド結合部位との間に有する複合体を形成するリガンド結合部位を形成するリガンド結合ポリペプチド（受容体）に由来する。
なおさらに別の実施形態において、プロタンパク質は、基質に結合し、基質に由来する生成物の形成を触媒する酵素である多量体タンパク質に由来する。触媒作用を有する多量体タンパク質の基質結合部位（リガンド結合部位）の位相幾何学は、その活性のためには、おそらくは、基質に対するその親和性よりも重要であるが、結合するための必要条件が存在する。
別の実施形態において、新規な多量体またはヘテロダイマーもまた本発明の種類に一致する。自然界に存在しない安定な多量体形態を生じさせるための、ポリペプチドと他のポリペプチドとの相互作用が、本発明の技術を用いてもたらされ得る。これには、２つの異なる生物、オルガネラにおける産生の結果として相互作用しない天然に存在するポリペプチド、あるいは、もう一方の存在下で産生された場合には相互作用する時間的またはそれ以外に隔てられたタンパク質が含まれる。そのような人工的な相互作用の一例が、それぞれのサブユニットが異なる種に由来するＬＩＮ−２，７（Ｌ２７）ヘテロダイマーである。
従って、本発明は、結合性を有する多量体ポリペプチドにプロセシングされる能力をそのすべてが有する、単一ＤＮＡ片から発現される組換え分子のファミリーを提供する。
さらなる実施形態において、抗体または抗体フラグメント（Ｆａｂ）の親和性または活性が、Ｃａｒｔｅｒ他（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８９巻（４２８５〜４２８９）において明らかにされたように、所望される特性を改善するために改変される。抗体（天然型、キメラ型、または、ＣＤＲ交換によるヒト化型であっても）が得られると、可変重鎖および可変軽鎖の遺伝子における様々な位置が、予測された構造および既知の結晶構造の分子モデル化比較によって、抗体の構造および機能または結合に影響を及ぼすとして同定される。
同定または推定される影響誘因位置が、最適な構造的構成のための好ましいアミノ酸、そして同様に、好ましい非免疫原ヒト配列を含有するためにランダム化される。任意の適切なＤＮＡシャフリング法を使用して、変化させたアミノ酸残基を任意の１つの位置に含有する多数の影響誘因位置が、これらの影響誘因部位におけるアミノ酸の異なる組合せを含有する配列の集団を作製するために再分類される。
ＤＮＡシャフリングによって作製された抗体配列の集団が、この分野で知られている制限非依存的付着性末端クローニングまたは別のクローニング方法を使用してウイルスベクターにクローン化されるプレプロタンパク質配列の集団を作製するために、実施例２に記載されるようにクローン化される。
感染性の転写物がインビトロで作製され、次いでカプシド化される。カプシド化された転写物は、植物に感染させるために使用される。発現したタンパク質が続いて間質液または組織ホモジネートから集められる。
抽出物は、ＥＬＩＳＡまたは他の好適なアッセイによって明らかにされるような所望される活性（例えば、抗原結合など）についてアッセイされる。また、活性アッセイが定量的側面を有するならば好ましい。サンプルは、ＥＬＩＳＡによって、または他の好適なアッセイを用いて、存在する抗体の量を測定するためにさらに評価される。
改善された抗体を含有するウイルスベクターは、大量の植物に接種して、精製された抗体を、さらなる特徴づけ、前臨床評価およびプロセス開発のために得るために使用することができる。
同時に、発現システムは、十分に大きな規模の量を製造するためにスケールアップされる。これには、好ましいプロタンパク質または抗体をコードする遺伝子で安定的に形質転換された植物系統を作り出すことが伴い得る。
所望される第１のポリペプチド（サブユニット）をコードする遺伝子を単離するための様々な方法がこの分野では広く知られている。例えば、Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編（１９８７）：および、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照のこと（それらの開示は参考として本明細書中に組み込まれる）。
本発明を実施することにおいて有用である遺伝子には、免疫グロブリン産物に含有されるポリペプチド、免疫グロブリン分子、Ｆａｂフラグメント、酵素、受容体、ケモカイン、サイトカイン、血液産物、診断剤、分析化合物および治療化合物をコードする遺伝子が含まれる。特に好ましいものは、会合して多量体複合体を形成するポリペプチドをコードする遺伝子である。
多量体タンパク質のポリペプチドサブユニットをコードする遺伝子は、そのようなポリペプチドを発現する遺伝子を含有するゲノムＤＮＡ、または、そのようなポリペプチドをコードするメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のどちらからでも単離することができる。ゲノムＤＮＡを使用することにおける困難は、配列がイントロンによって隔てられている場合、ポリペプチドをコードする配列を並置することにおいてである。適切なエキソンを含有するＤＮＡフラグメントを単離し、イントロンを切り出し、かつ、エキソンを適切な順序および向きでつなぎ合わせなければならない。ほとんどの場合、これは困難であり、その結果、ｍＲＮＡを用いる代わりの技術は、配列がポリペプチド全体について（イントロンを含まず）連続しているので優れた方法である。ペプチドまたはタンパク質をコードするｍＲＮＡを単離するための様々な方法がこの分野では広く知られている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、第１５２巻、ＢｅｒｇｅｒおよびＫｉｍｍｅｌ編（１９８７）］；および、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｍａｎｉａｔｉｓ他編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）を参照のこと。
上記で単離されたポリペプチドコード遺伝子はプロタンパク質に組み立てられ、典型的には、発現ベクターに機能的に連結される。宿主細胞と適合し得る発現ベクターが、本発明の遺伝子を発現させるために使用される。様々な宿主において遺伝子を発現させるために有用な典型的な発現ベクターがこの分野では広く知られており、これらには、抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて得られるベクター；抗体コード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＴＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させた植物細胞システム、または抗体コード配列を含有する組換えプラスミド発現システム（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞システム；あるいは、哺乳動物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーター（例えば、アデノウイルスの後期プロモーター；ワクシニアウイルスの７．５Ｋプロモーター）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞システム（例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞、３Ｔ３細胞）が含まれる。
上記で記載された発現ベクターは、プロモーターを含む発現制御エレメントを含有する。ポリペプチドをコードする遺伝子は、プロモーター配列がＲＮＡポリメラーゼの結合および所望されるポリペプチドコード遺伝子の合成を行わせることを可能にするために発現ベクターに機能的に連結される。ポリペプチドコード遺伝子を発現させることにおいて、誘導型、ウイルス性、合成型、構成的、時間調節型、空間調節型および時空調節型であるプロモーターが有用である。どの発現ベクターが機能的に連結されるか、そして究極的には、どのプロモーターにポリペプチドコード遺伝子が機能的に連結されるかの選択は、この分野では広く知られているように、直接的には、所望される機能的性質（例えば、タンパク質発現の場所および時期）、および、形質転換される宿主細胞に依存する。これらは、組換えＤＮＡ分子を構築する技術分野では固有的な制限である。しかしながら、本発明を実施することにおいて有用な発現ベクターは少なくとも、複製が可能であり、そしてまた、好ましくは、発現ベクターが機能的に連結されているＤＮＡセグメントに含まれるポリペプチドコード遺伝子の発現が可能である。
好ましくは、真核生物細胞が、完全な抗体分子を発現させる場合には特に、組換え抗体分子の発現のために使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）など哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルスに由来する主要即時初期遺伝子プロモーターエレメントなどのベクターと併せて、抗体のための効果的な発現システムである（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ他、Ｇｅｎｅ、４５：１０１（１９８６）；Ｃｏｃｋｅｔｔ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、８：２（１９９０））。
哺乳動物宿主細胞においては数多くのウイルス型発現システムを利用することができる。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的とする抗体コード配列をアデノウイルスの転写／翻訳制御複合体（例えば、後期プロモーターおよび三成分リーダー配列）に連結することができる。このようなキメラ遺伝子は、その後、アデノウイルスゲノムにインビトロ組換えまたはインビボ組換えによって挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、Ｅ１領域またはＥ３領域）における挿入は、感染した宿主において存続可能であり、抗体分子を発現させることができる組換えウイルスをもたらす（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：３５５〜３５９（１９８４）を参照のこと）。特異的な開始シグナルもまた、挿入された抗体コード配列の効率的な翻訳のために要求されることがある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、開始コドンは、インサート全体の翻訳を確実にするために、所望されるコード配列の読み枠と相を一致させなければならない。これらの外因性の翻訳制御シグナルおよび開始コドンは様々な起源を有することができ、天然由来および合成由来の両方であり得る。発現効率は、適切な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含むことによって増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒ他、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１〜５４４（１９８７）を参照のこと）。
また、挿入された配列の発現を調節するか、または、所望される特異的な様式で遺伝子産物を修飾およびプロセシングする宿主細胞株を選ぶことができる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、切断）はタンパク質の機能のためには重要であり得る。種々の宿主細胞株が、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾のための特徴的および特異的な機構を有している。適切な細胞株または宿主系を、発現した外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実するために選ぶことができる。この目的のために、一次転写物の適正なプロセシング、グリコシル化、および遺伝子産物のリン酸化のための細胞装置を有する真核生物宿主細胞を使用することができる。そのような哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８、ならびに、特に、乳ガン細胞株、例えば、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄなど、そして、正常な乳腺細胞株、例えば、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔなどが含まれるが、これらに限定されない。
組換えタンパク質の長期間にわたる高収量の製造のためには、安定した発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株を操作することができる。ウイルスの複製起点を含有する発現ベクターを使用するのではなく、むしろ、宿主細胞が、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）および選択マーカーにより制御されるＤＮＡで形質転換され得る。外来ＤＮＡを導入した後、操作された細胞は、１日間〜２日間、富化培地において成長させることができ、その後、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドにおける選択マーカーは、選択に対する耐性が付与され、細胞がプラスミドをその染色体に安定的に組み込み、成長して、その後にクローン化され、かつ細胞株に拡大し得る遺伝子座を形成させることを可能にする。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために都合良く使用することができる。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用である。
数多くの選択システムを使用することができ、これらには、限定されないが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ遺伝子（Ｗｉｇｌｅｒ他、Ｃｅｌｌ、１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ＆Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙ他、Ｃｅｌｌ、２２：８１７（１９８０））が含まれ、これらは、それぞれ、ｔｋ−細胞、ｈｇｐｔ−細胞およびａｐｒｔ−細胞において使用され得る。また、代謝拮抗性の耐性を下記の遺伝子について選択の基礎として使用することができる：ｄｈｆｒ（これはメトトレキサートに対する耐性を付与する）（Ｗｉｇｌｅｒ他、１９８０、Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：１５２７（１９８１））；ｇｐｔ（これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する）（Ｍｕｌｌｉｇａｎ＆Ｂｅｒｇ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７８：２０７２（１９８１））；ｎｅｏ（これはアミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与する）（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ、１２：４８８〜５０５；ＷｕおよびＷｕ、Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ、３：８７〜９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．、３２：５７３〜５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６０：９２６〜９３２（１９９３）；ＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、６２：１９１〜２１７（１９９３）；ＴＩＢ ＴＥＣＨ、１１（５）：１５５〜２１５（Ｍａｙ １９９３））；およびｈｙｇｒｏ（これはヒグロマイシンに対する耐性を付与する）（Ｓａｎｔｅｒｒｅ他、１９８４、Ｇｅｎｅ、３０：１４７）。組換えＤＮＡ技術の分野では一般に知られている使用され得る様々な方法が、Ａｕｓｕｂｅｌ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ、Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９０）に、そして、第１２章および第１３章（Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ他編、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ＮＹ（１９９４））；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ他、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５０：１（１９８１）に記載される（これらはその全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
抗体分子の発現レベルはベクター増幅により増大させることができる（総説については、ＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎおよびＨｅｎｔｓｃｈｅｌ、“Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ”、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、第３巻（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクターシステムにおけるマーカーが増幅可能であるとき、宿主細胞の培養物に存在する阻害剤のレベルの増大はマーカー遺伝子のコピー数を増大させる。増幅された領域は抗体遺伝子と関連づけられているので、抗体の産生もまた増大する（Ｃｒｏｕｓｅ他、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、３：２５７（１９８３））。
所望される多量体タンパク質の発現は、この分野で広く知られているアッセイ方法を使用して生物学的な多量体タンパク質の存在についてアッセイすることによって同定され得る。そのような方法には、生物学的に機能的な多量体タンパク質を検出するために設計されたウエスタンブロッティング、免疫アッセイ、結合アッセイおよび任意のアッセイが含まれる。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ｎｏｎｓｅｌｆ Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ（Ｋｌｅｉｎ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．（１９８２））に記載されるアッセイを参照のこと。
好ましいスクリーニングアッセイは、多量体タンパク質における生物学的に活性な部位が、検出可能なシグナルをもたらすような方法で検出されるアッセイである。このシグナルは直接的または間接的に生じさせることができる。そのようなシグナルには、例えば、複合体の産生、触媒作用反応生成物の形成、エネルギーの放出または取り込みなどが含まれる。例えば、この方法によって産生された抗体分子を含有する宿主は、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８８））に記載される免疫アッセイに類似するＥＬＩＳＡまたは放射免疫アッセイなどの標準的な免疫アッセイにおいて、抗体がその抗原に結合することを可能にするような方法で処理することができる。
本発明のさらなる局面は、第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドと、プロペプチドとから構成されるタンパク質を製造する方法である。一般に、この方法では、本発明の宿主を増殖または培養するという要素、および、所望される多量体タンパク質を製造するために培養された宿主細胞または細胞を集めるという要素が組み合わせられる。
第１のポリペプチドと、第２のポリペプチドと、プロペプチドとから構成される所望される多量体タンパク質前駆体を含有する本発明の宿主が、当業者に広く知られている方法を使用して増殖または培養される。本発明の組換え宿主はどれも、その宿主が含有する所望の多量体タンパク質を単離するために培養または増殖することができる。
培養後、組換え宿主は、産生された多量体タンパク質を回収するために集められる。この収集工程は、全宿主を集めること、あるいは、さらなる精製を容易にする特定のオルガネラまたは抽出物（例えば、培地または分泌された画分など）を単離することからなり得る。
好ましい実施形態において、この収集工程は下記の工程をさらに含む：
（ａ）多量体タンパク質を含有する溶液を得るために宿主からの分泌された画分を集める工程、および
（ｂ）前記溶液から前記多量体タンパク質を単離する工程。
別の実施形態において、この収集工程は下記の工程をさらに含む：
（ａ）宿主の少なくとも一部をホモジネートする工程、
（ｂ）前記ホモジネートから前記多量体タンパク質を抽出して、多量体タンパク質を含有する溶液を得る工程、および
（ｃ）前記溶液から前記多量体タンパク質を単離する工程。
多量体タンパク質は、タンパク質単離の当業者に広く知られている様々な方法を使用して、上記で得られた溶液から単離される。これらの方法には、免疫アフィニティー精製、ならびに、単離される多量体タンパク質の特定のサイズ、電気泳動移動度、生物学的活性および／または正味電荷に基づく精製手法が含まれるが、これらに限定されない。
意図される組換え宿主は多量体タンパク質を含有する。この多量体タンパク質は、上記の免疫グロブリン産物、酵素、特定のリガンドと結合することができる受容体、またはアブザイムであり得る。
本発明の酵素は、少なくとも２つのポリペプチド鎖に由来するプロタンパク質である。このプロタンパク質は、本発明の方法により組換え宿主に導入された遺伝子によってコードされる。有用な酵素には、アスパラギン酸トランスカルバミラーゼなどが含まれる。
別の好ましい実施形態において、プロタンパク質は、特定のリガンドと結合することができる受容体に由来する。典型的には、この受容体は、発明の方法により組換え宿主に導入された遺伝子によってコードされるプロタンパク質から構成される。そのような受容体およびそれらのそれぞれのリガンドの例には、ヘモグロビン、Ｏ２；プロテインキナーゼ、ｃＡＭＰ；およびその他が含まれる。
本発明の別の好ましい実施形態において、存在する免疫グロブリン産物は、免疫グロブリン重鎖およびその関連する可変領域によるか、あるいは、免疫グロブリン分子または免疫グロブリン分子のＦａｂもしくは実質的な部分を形成するために会合する免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖によるかのいずれかにより構成されるアブザイムである。例示的なアブザイムには、Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５６６〜１５７０（１９８６）；Ｐｏｌｌａｃｋ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３４：１５７０〜１５７３（１９８６）；Ｊａｎｄａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４１：１１８８〜１１９１（１９８８）；および、Ｊａｎｄａ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：４３７〜４４０（１９８９）によって記載されるアブザイムが含まれる。
典型的には、本発明のプロタンパク質は、少なくとも２つのポリペプチドと、プロペプチドとを含有する。しかしながら、３つ以上のペプチドもまた存在させることができる。これらのポリペプチドのそれぞれが、それらが折り畳まれ、多量体タンパク質にプロセシングされるようにプロペプチドによって隔てられる。ポリペプチドサブユニットは、ジスルフィド架橋、水素結合または他の機構によって多量体タンパク質を形成するように互いに会合する。
このようにして作製され得る多量体タンパク質の例は数多く存在する。下記の列挙は、プロペプチドを伴って天然の状態では作製されないいくつかの多量体タンパク質を含む。この列挙は例示であることが意図される。プロペプチドを伴って作製されないいくつかの他の多量体タンパク質が存在する。すべてのそのような多量体タンパク質は、これらがプロペプチドを使用して作製されるならば、本発明に一致する。例には、ヘモグロビン（α２β２）、ＩＬ−１２（ｐ３５およびｐ４０）、ＴＣＲ、ＭＨＣクラスＩＩヘテロダイマー（αβ）、ＣＤ８へテロダイマー（αβ）、ＣＤ３（εδ）、ＣＤ３（εγ）、ＣＤ２２（αβ）、ＣＤ４１（ＧＰＩＩｂａ ＣＤ６１）Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）、ＪＡＫおよびＳＴＡＴ（転写のシグナル変換因子および活性化因子）のヘテロダイマー、Ｉ鎖を伴うＩｇＭ重鎖、またはＶｐｒｅＢおよびλ５（Ｉ鎖）、ＩｇβおよびＩｇα、インテグリン類（例えば、Ｔ細胞インテグリンＬＦＡ−１（αＬβ２）など）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＩＬ−２受容体（ヘテロトリマー）ＩＬ−２Ｒ（αβγｃ）、ＩＬ−１５（αβγ）、レマトポイエチン受容体ファミリー（ＩＬ−３Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲ、これらは少数である）、ＴＮＦ−β（ＬＴ−αおよびＬＴ−β）、ＩＬ１２Ｒ（β１β２）、遺伝子組換えＪ鎖を伴うＩｇＭ（Ｈ２Ｌ２）、遺伝子組換えＪ鎖を伴うＩｇＡ（Ｈ２Ｌ２）、ＭＨＣクラスＩ（αおよびβ２−ミクログロブリン）、ＨＬＡ−ＤＭ（αβ）、マウスＨ−２Ｍ（αβ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、インスリン受容体（ＩＲ）（α２β２）、ＩＧＦ−１受容体（α２β２）、Ｇタンパク質ヘテロトリマー（αβγ）（例えば、アドレナリン作動性受容体、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）（αβ）、エストロゲン受容体（αβ）など）、筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）ファミリー（例えば、ｃ−ｆｏｓおよびＪｕｎＤなど）、酵母ＲＮＡＰＩＩ Ｒｐｂ３／Ｒｐｂ１１ヘテロダイマー、カルパイン、インポルチンα２／βヘテロダイマー、ＤＮＡ依存プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃ類、ならびにＫｕ７０およびＫｕ８０）、Ｋｕ７０およびＫｕ８０のヘテロダイマー、ヘパトポイエチン（ＨＰＯ）およびＨＰＯ２３のヘテロダイマー、白血球機能関連抗原−１分子（ＬＦＡ−１）ＣＤ１１ａ（αＬ）およびＣＤ１８（β２）インテグリンサブユニットのヘテロダイマー、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）／レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）ヘテロダイマー、真核生物の染色体構造維持（ＳＭＣ）タンパク質、ヒトのミスマッチ修復（ＭＭＲ）ヘテロダイマー、ｒＢＡＴ−ｂ（０，＋）ＡＴヘテロダイマー、レチノイドＸα（ＲＸＲα）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）のヘテロダイマー、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）／ＲＸＲヘテロダイマー、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体／ＲＸＲ、Ｎｕｒｒ１オーファン核受容体／ＲＸＲヘテロダイマー、カルシニューリン、コラプシン応答媒介因子タンパク質−２およびチューブリンのヘテロダイマー、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロダイマー、ＩｋａｐｐａＢキナーゼ複合体、ヒト免疫不全症ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）ヘテロダイマー、ＣＤ９８複合体、膜結合免疫グロブリン分子（ｍＩｇ）を伴うＢ細胞抗原、およびＩｇ−α／Ｉｇ−βヘテロダイマー、クラスＩＡホスホイノシチド３−キナーゼ、低酸素症誘導因子１、ならびに、当業者には明らかである他のものがある。
活性な部位または抗原結合領域を潜在的には脱安定化するか、あるいは、活性な部位または抗原結合領域を妨害し、かつ、潜在的には有害な免疫原性であり得る外来配列を本質的には含まない成熟型の多量体タンパク質を得るためにプロペプチドを除くことが好ましい。小さい外来領域がプロペプチド配列の除去後に残留し、その結果、これらのさらなる配列が精製のために有用であるか、または、他の生物学的機能（例えば、免疫調節など）を付与することになるようにプロタンパク質を操作することは有益であり得る。多くの場合、少数のアミノ酸のスペーサーがポリペプチドドメイン間に挿入され、あるドメインから別のドメインに移行するように設計される。好ましい実施形態において、ジグリシンスペーサーが、異種ポリペプチドの接合部を緩衝化し、並置されたドメインの適正な折り畳みを促進させ、あるドメインから別のドメインへの移行を最小限にし、また、あるドメインから別のドメインへの移行を増強するように機能する。他のアミノ酸を、プロペプチドの折り畳みおよびシャペロン活性をさらに改善し、これによりプロペプチドの折り畳みをさらに適化するために使用することができる。
結合性を有するポリペプチドサブユニットを有し、しかし、会合することが天然の状態では見出されない新規な多量体タンパク質もまた、本発明の種類に一致する。自然界には存在しない安定な多量体形態を形成するための、タンパク質と他のタンパク質との相互作用が、本発明の技術を用いてもたらされ得る。また、２つの異なる生物、オルガネラにおける産生の結果として相互作用しない天然に存在するタンパク質は、もう一方の存在下で産生された場合には相互作用する時間的またはそれ以外に隔てられたタンパク質である。そのような人工的な相互作用の一例が、それぞれのサブユニットが異なる種に由来するＬＩＮ−２，７（Ｌ２７）ヘテロダイマーである。
（ドメインのクローニング）
ドメインを数多くの技術のいずれかによって単離することができる。一般に、目的とするポリペプチド（またはＲＮＡ）ドメインをコードする核酸配列が、ドメインを表すオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに基づいて、適切なｃＤＮＡライブラリーまたはゲノムＤＮＡライブラリーからクローン化される。
本発明の場合、好ましい核酸およびタンパク質は哺乳動物配列であり、より好ましくはヒト配列である。
あるいは、ＤＮＡが、ＤＮＡテンプレートまたはＲＮＡテンプレートを用いて始まるオリゴヌクレオチドプライマーを使用する増幅技術によって単離される（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｆａｃｈ他、ＰＣＲ Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９９５）を参照のこと）。これらのプライマーは、プローブを構成し得る全長のコード配列または部分配列のいずれか（これは長さがおよそ数千ヌクレオチドまでに及ぶ）を増幅するために使用することができる。得られるプローブ配列は、その後、目的とする全長の核酸について哺乳動物ライブラリーをスクリーニングするために使用される。合成オリゴヌクレオチドプライマーの使用およびＲＮＡテンプレートまたはＤＮＡテンプレートの増幅が、米国特許第４，６８３，１９５号および同第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ他編、１９９０）に記載される。ＰＣＲおよびリガーゼチェーン反応（ＬＣＲ）などの方法を使用して、ｍＲＮＡから、またはｃＤＮＡから、またはゲノムライブラリーもしくはｃＤＮＡライブラリーから直接、ドメインの核酸配列を増幅することができる。縮重オリゴヌクレオチドを、ドメインをコードする既知の配列を使用してドメインホモログを増幅するために設計することができる。制限エンドヌクレアーゼ部位をプライマーに組み込むことができる。ＰＣＲ反応によって増幅された遺伝子はアガロースゲルで精製され、適切なベクターにクローン化され得る。
発現クローニングでは、核酸が、発現したポリペプチドのエピトープについて特異的な抗体（または他の結合パートナー）をプローブとして使用して発現ライブラリーから単離される。ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、クローニング中のドメインの１つまたは複数のペプチドフラグメントを用いた免疫化によって惹起させることができる。
核酸プローブ（好ましくはオリゴヌクレオチド）は、目的とするポリペプチドメインをコードする遺伝子の多型変化体または対立遺伝子を単離するために、好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のもとで使用され、ライブリラリーがスクリーニングされる。あるいは、抗体に基づく発現クローニングは多型変化体もしくは対立遺伝子変化体または種間ホモログのクローニングを可能にする。
ｃＤＮＡライブラリーのための供給源の選択、およびｍＲＮＡからのその作製が、従来の方法（Ｇｕｂｌｅｒ他、Ｇｅｎｅ、２５：２６３〜２６９（１９８３）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ他編、１９９４または最新版）を使用して行われる。
ゲノムＤＮＡライブラリーを調製するための方法はこの分野では通常的である。例えば、組織から抽出されたＤＮＡが、勾配遠心分離によって分離され、適切な発現ベクターに挿入される約１２ｋｂ〜２０ｋｂのフラグメントを得るために機械的に剪断され得るか、または酵素的に消化され得る。これらのベクターはインビトロでファージにパッキングされる。組換えファージがプラークハイブリダイゼーションによって分析される（Ｂｅｎｔｏｎ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、１９６：１８０〜１８２（１９７７））。コロニーハイブリダイゼーションが、例えば、Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、７２：３９６１〜３９６５（１９７５））によって一般的に記載されるように行われる。
合成オリゴヌクレオチドを使用して、プローブとして使用されるための組換え「遺伝子」を構築することができ、または、ドメインポリペプチドを発現させるための組換え「遺伝子」を構築することができる。
様々なオリゴヌクレオチドを、自動された合成機（Ｖａｎ Ｄｅｖａｎｔｅｒ他、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１２：６１５９〜６１６８（１９８４））を使用する固相ホスホルアミダイトトリエステル法（Ｂｅａｕｃａｇｅ他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｓ．、２２：１８５９〜１８６２（１９８１））を使用して化学合成することができる。オリゴヌクレオチドの精製は、典型的には、非変性アクリルアミドゲル電気泳動またはアニオン交換ＨＰＬＣによる（Ｐｅａｒｓｏｎ他、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．、２５５：１３７〜１４９（１９８３））。
クローン化された遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、遺伝子のセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方を表す、長さが通常的には４０ｂｐ〜１２０ｂｐの一連の重複するオリゴヌクレオチドを使用する鎖停止反応（Ｗａｌｌａｃｅ他、Ｇｅｎｅ、１６：２１〜２６（１９８１））などの従来の方法を使用して確認することができる。
所望されるポリペプチドをコードする核酸は、典型的には、核酸の複製および／または発現のための原核生物細胞または真核生物細胞の形質転換またはトランスフェクションの前に中間ベクターにクローン化される。これらの中間ベクター（例えば、プラスミドまたはシャトルベクター）は、典型的には、原核生物細胞における使用のためのものである。
（多量体タンパク質を発現させるための発現システム）
細菌、昆虫、哺乳動物および植物における数多くの広く知られている異種発現システムが上記で議論されたが、それぞれがその長所および短所を有している。本発明は植物発現に特に適する。
数多くの形質転換方法により、植物における異種タンパク質の発現が可能となっている。いくつかは、目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を植物ゲノムに組み込むことによる遺伝子組換え植物の構築を伴う。遺伝子組換え植物を得るために要する時間は、腫瘍ワクチンポリペプチドなどの特定の実施形態では、迅速な製造のためには長すぎる場合がある。注目される解決策（そのような安定な形質転換に対する代替策）は、発現ベクターを用いた植物の一過性トランスフェクションである。そのような一過性発現を可能にするウイルスベクターおよび非ウイルスベクターの両方を利用することができる（Ｋｕｍａｇａｉ，Ｍ．Ｈ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０；Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ，Ｓ．他（１９９９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５５：３１２〜３２３；Ｔｕｒｐｅｎ，Ｔ．Ｈ．他（１９９５）、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１３：５３〜５７；Ｐｉｅｔｒｚａｋ，Ｍ．他（１９８６）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅ．、１４：５８５７〜５８６８；Ｈｏｏｙｋａａｓ，Ｐ．Ｊ．Ｊ．およびＳｃｈｉｌｐｅｒｏｏｒｔ，Ｒ．Ａ．（１９９２）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９：１５〜３８）。だが、ウイルスベクターの方が、宿主細胞に導入し、感染により拡大して、発現を増幅するために容易であり、従って好ましい。
本発明のキメラな遺伝子、ベクターおよび組換えウイルス核酸は、分子生物学の従来の技術を使用して構築される。異種タンパク質を植物において発現させるウイルスベクターは、好ましくは、（１）ウイルスの天然型サブゲノムプロモーター（Ｄａｗｓｏｎ，Ｗ．Ｏ．他（１９８８）、Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ、７８：７８３〜７８９；および、Ｆｒｅｎｃｈ，Ｒ．他（１９８６）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３１：１２９４〜１２９７）、（２）好ましくは、ウイルスの１つまたは複数の非天然型サブゲノムプロモーター（Ｄｏｎｓｏｎ，Ｊ．他（１９９１）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：７２０４〜７２０８；および、Ｋｕｍａｇａｉ，Ｍ．Ｈ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）、（３）ウイルスコートタンパク質（天然型または非天然型）をコードする配列、および（４）所望される異種タンパク質をコードする核酸を含む。非天然型サブゲノムプロモーターのみを含むベクターもまた使用することができる。本発明のベクターのための最小限の必要条件は、天然型または非天然型のサブゲノムプロモーターにより駆動される、レプリカーゼ遺伝子と、発現されることになるコード配列との組合せである。ウイルスレプリカーゼはウイルスのゲノムから発現され、染色体外で複製するために要求される。サブゲノムプロモーターは、外来または異種のコード配列および任意の他の遺伝子（例えば、ウイルスの複製を促進させるウイルスタンパク質、移動のために要求されるタンパク質、カプシドタンパク質などをコードする遺伝子など）の発現を可能にする。ウイルスベクターは、コードされるウイルスコートタンパク質によってカプシド化され、組換え植物ウイルスを生じさせる。この組換えウイルスは、適切な宿主植物に感染させるために使用される。従って、組換えウイルス核酸は、宿主植物において複製し、全身に拡がり、そしてＲＮＡ合成およびタンパク質合成を行わせて、所望される異種タンパク質を植物において生じさせることができる。また、組換えベクターは、非ウイルスの異種コード配列および制御エレメントを、このコード配列の所望される発現のために十分な期間にわたって維持する。
組換えウイルス核酸は任意の好適な植物ウイルスの核酸から調製される。だが、トバモウイルス科のメンバーが好ましい。天然型のウイルスヌクレオチド配列は、ウイルス核酸の必要な生物学的機能（複製、転写など）が保存されるならば、知られている技術によって改変され得る。記されたように、１つまたは複数のサブゲノムプロモーターを挿入することができる。これらは、感染またはトランスフェクションされた植物宿主における隣接する異種コード配列の発現を調節することができる。天然型のウイルスコートタンパク質はこのようなＲＮＡによってコードされ得るか、または、このコートタンパク質配列は欠失され、異なる植物ウイルスのコートタンパク質をコードする配列（「非天然型」または「外来ウイルス」）によって置換され得る。外来ウイルスコートタンパク質遺伝子は天然型または非天然型のいずれかのサブゲノムプロモーターの制御下に置くことができる。外来ウイルスコートタンパク質は、機能的な感染性のビリオンを生じさせるために、組換えウイルス核酸をカプシド化することができなければならない。好ましい実施形態において、コートタンパク質は、天然型ウイルスプロモーターまたは非天然型サブゲノムプロモーターのいずれかに隣接して設置されている核酸配列によってコードされる外来ウイルスコートタンパク質である。好ましくは、異種タンパク質（例えば、植物において発解される免疫原性ポリペプチド）をコードする核酸は天然型サブゲノムプロモーターの制御下に置かれる。
異種タンパク質の適正な折り畳みおよび多量の産生に部分的に関わる本発明の重要な要素は、新しく合成されたタンパク質を植物の分泌経路に向かわせるシグナルペプチド配列の存在である。シグナルペプチドをコードする配列は、発現されるポリペプチドをコードするＤＮＡと読み枠を一致させて融合される。好ましいシグナルペプチドはα−アミラーゼのシグナルペプチドである。
別の実施形態において、移動タンパク質をコードする配列もまた、移動タンパク質は植物におけるウイルスの細胞から細胞への迅速な移動を促進し、植物全体の全身感染を促進させるので、ウイルスベクターに組み込むことができる。
ＲＮＡ植物ウイルスまたはＤＮＡ植物ウイルスはどちらも、発現ベクターとしての使用について好適である。そのＤＮＡまたはＲＮＡは一本鎖または二本鎖であり得る。一本鎖ＲＮＡウイルスは、好ましくは、プラス鎖を有し得る。だが、マイナス鎖ＲＮＡウイルスもまた意図される。
組換えウイルス核酸は、適切な産生細胞におけるクローニングによって調製される。従来のクローニング技術（ＤＮＡおよびＲＮＡの両方について）が広く知られている。例えば、ＤＮＡウイルスの場合、産生細胞と適合し得る複製起点をウイルスＤＮＡにつなぎ合わせることができる。
ＲＮＡウイルスの場合、ウイルスゲノムの全長のＤＮＡコピーが最初に従来の手法によって調製される：例えば、ウイルスＲＮＡを逆転写して、＋サブゲノムＤＮＡ片を形成させ、これは、ＤＮＡポリメラーゼを使用して二本鎖にされる。このＤＮＡが適切なベクターにクローン化され、産生細胞に挿入される。ＤＮＡ片はマッピングされ、ウイルスゲノムの全長ＤＮＡコピーを作製するために適切な順序で組み合わせられる。サブゲノムプロモーター配列（ＤＮＡ）が、コートタンパク質遺伝子を伴って、または伴うことなく、本明細書中に記載されるように、ウイルス核酸の非必須部位に挿入される。非必須部位は、ウイルス核酸または組み立てられた植物ビリオンの生物学的性質に影響を及ぼさない部位である。ウイルスＲＮＡに対して相補的なｃＤＮＡが好適なプロモーターの制御下に置かれ、その結果、（組換え）ウイルスＤＮＡが産生細胞において産生される。ＲＮＡが感染性のためにキャップ化されなければならない場合、これは従来の技術によって行われる。
好適なプロモーターの例には、ｌａｃプロモーター、ｌａｃｕｖ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロモーター、ｌｐ１プロモーターおよびｏｍｐＦプロモーターが含まれる。好ましいプロモーターはファージのＳＰ６プロモーターまたはＴ７ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターである。
産生細胞は原核生物系または真核生物系であり得る。これらには、大腸菌細胞、酵母細胞、植物細胞および哺乳動物細胞が含まれる。
数多くの植物ウイルスベクターを利用することができ、これらはこの分野では広く知られている（Ｇｒｉｅｒｓｏｎ，Ｄ．他（１９８４）、Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｌａｃｋｉｅ、Ｌｏｎｄｏｎ、１２６頁〜１４６頁；Ｇｌｕｚｍａｎ，Ｙ．他（１９８８）、Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１７２頁〜１８９頁）。ウイルスベクターおよびその制御エレメントは、自明のことではあるが、感染させられる植物宿主との適合性を有しなければならない。好適なウイルスには、
（ａ）タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）群に由来するウイルス、例えば、ＴＭＶ、タバコマイルドグリーンモザイクウイルス（ＴＭＧＭＶ）、カウピーモザイクウイルス（ＣＭＶ）、アルファルファモザイクウイルス（ＡＭＶ）、キュウリ緑斑モザイクウイルス−スイカ株（ＣＧＭＭＶ−Ｗ）、オートモザイクウイルス（ＯＭＶ）など、
（ｂ）ブロムモザイクウイルス（ＢＭＶ）群に由来するウイルス、例えば、ＢＭＶ、ブロードビーン斑点ウイルスおよびカウピークロロティックモットルウイルスなど、
（ｃ）他のウイルス、例えば、イネ壊死ウイルス（ＲＮＶ）、ジェミニウイルス科（例えば、トマトゴールデンモザイクウイルス（ＴＧＭＶ）、キャッサバ潜在ウイルス（ＣＬＶ）およびトウモロコシ条斑ウイルス（ＭＳＶ）など）など
がある。
好ましい宿主はニコチアナ・ベンタミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）である。宿主植物は、この用語が本明細書中で使用される場合、完全な植物、植物細胞、葉、根シュート、花または任意の他の植物部分であり得る。植物または植物細胞は、従来の方法を使用して成長させられる。
Ｎ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａとともに使用される好ましいウイルスベクターは、ＴＭＶおよびトマトモザイクウイルス（ＴｏＭＶ）のハイブリッド融合体を含有する改変されたＴＴＯ１Ａベクターである（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９５）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９２：１６７９〜１６８３）。挿入されているサブゲノムプロモーターはＴＭＶ核酸と適合しなければならなず、かつ、感染させた植物における適正に配置された（例えば、隣接する）核酸配列の転写を行わせることができなければならない。コートタンパク質は、ウイルスが植物宿主に全身感染することを可能にしなければなならない。ＴＭＶのコートタンパク質はＮ．ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの全身感染を促進させる。
組換えウイルスベクターを用いた植物の感染は、感染を促進させるために知られている数多くの従来の技術を使用して達成される。これらには、葉摩擦、溶液中での摩擦、および高粘度水噴霧が含まれるが、これらに限定されない。ウイルスベクターは、手によって、機械によって、または１枚ずつの葉の高圧噴霧によって送達され得る。
タンパク質／ポリペプチド産物の精製
産生された多量体タンパク質は、好ましくは、標準的な技術を使用して回収され、単離される。好適な方法には、植物または産生する植物部分を液体窒素においてホモジネートまたは粉砕し、その後、タンパク質を抽出することが含まれる。何らかの理由のために、植物材料をホモジネートすることが望ましくない場合、ポリペプチドは、真空浸潤および遠心分離、それに続く無菌ろ過によって取り出すことができる。タンパク質収量は任意の受容可能な技術によって推定することができる。ポリペプチドは、サイズ、等電点または他の物理的性質に従って精製される。分泌されたタンパク質の全量を植物材料から単離した後、さらなる精製工程を行うことができる。所望されるポリペプチドのエピトープについて特異的な抗体を用いた免疫学的方法（例えば、免疫沈殿、または、好ましくは、アフィニティークロマトグラフィーなど）を使用することができる。
様々な固体担体を本発明において使用することができる：アガロース（登録商標）、セファデックス（登録商標）、セルロースの誘導体または他のポリマー。例えば、セファロース（登録商標）に固定化されたブドウ球菌プロテインＡ（またはプロテインＬ）を使用して、標的タンパク質を、タンパク質を溶液中で特異的な抗体と最初にインキュベーションし、混合物を、抗体−標的タンパク質の複合体と結合し、この複合体を保持する固定化プロテインＡと接触させることによって単離することができる。
前記の方法または他の広く知られている方法のいずれかを使用して、ポリペプチドは、植物材料から、約５０％を超える純度に、より好ましくは約７５％を超える純度に、さらにより好ましくは約９５％を超える純度に精製される。
（正しい折り畳みの決定）
抗原認識またはリガンド結合などの特定の性質については、溶液中におけるタンパク質の立体配座が非常に重要である。溶液中における多量体タンパク質の関連したドメインの立体配座は、好ましくは、天然タンパク質（１つまたは複数）の立体配座に類似する。ポリペプチドを植物において産生させ、ポリペプチドを植物の分泌経路に標的化することによって、本発明は、ポリペプチドが可溶性の形態で分泌されることを保証する。
適正な折り畳みを決定する際に使用される好ましい試薬は、（１）鎖が正しく折り畳まれたとき、多量体タンパク質が結合し、しかし（２）鎖が変性しているときには結合しない特異的なリガンド（好ましくは抗原）である。抗原が、ドットブロット、ウエスタンブロット、免疫沈殿、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）および酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）を含む数多くの免疫学的アッセイのいずれかにおいて用いられる。好ましい実施形態において、そのような抗原が利用できるときには、ウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡが、植物において産生された多量体ポリペプチドの関連した部分の正しい折り畳みを確認するために用いられる。
（多量体タンパク質のさらなる分析）
プロタンパク質をコードするＤＮＡは配列決定することができ、そのコードされる生成物の推定アミノ酸配列を得ることができる。ＤＮＡ分子がサブクローン化されている場合、そのＤＮＡ分子を、制限酵素を用いてベクターから切り出すことができ、得られたフラグメントを、フラグメントのサイズを決定するためにアガロースゲルで分析することができる。
プロタンパク質をコードするＤＮＡ分子が最初に発現される。所望される場合、ＤＮＡは、適切な宿主またはインビトロ転写／翻訳システムにおける発現を可能にするか、または最適化する配列を含むためにさらに改変することができる。発現されると、多量体ポリペプチドは適切な機能的アッセイ（例えば、（いずれかのドメインの）酵素活性の測定）に供される。また、多量体ポリペプチドの量および物理的性質を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定することができる。ドメインが、上記で記載されているように結合活性または他の機能を有する場合、これもまた、従来の手段によって測定することができる。
プロペプチド活性を計画的に、また、選択的なプロセスによって改善するための他の方法が考えられる。
これまで本発明が一般的に記載されてきたが、本発明は、例示として提供され、かつ、特定されない限り、本発明の限定であることが意図されない下記の実施例を参照することによってより容易に理解される。
下記の実施例は、限定としてではなく、例示としてのみ提供される。当業者は、本質的に類似する結果を得るために変化または改変され得る様々な非臨界的パラメーターを容易に認識する。
（実施例１）
（ＵｍＶ ＫＰ６プロペプチドのクローニング）
アミノ酸１０６〜１３８を含有するＵｍＶ ＫＰ６プロペプチド領域をウイルス発現のためにコドン最適化し、重複する合成オリゴヌクレオチドを使用して組み立てた。３つの重複するオリゴヌクレオチド（１つの上流側ＫＰ６−５’（配列番号３３）、ならびに２つの下流側のＫＰ６−ｃ３’（配列番号３４）およびＫｐ６−３’（配列番号３５））を、各トリプレットコドンについて３番目またはゆらぎの位置に優先的にアデノシンまたはチミジンを有するように設計した。１００μＬのＰＣＲ反応液は、０．２μＭのＫＰ６−５’、０．２μＭのＫＰ６−ｃ３’、０．２μＭのＫｐ６−３’、１Ｘのクローン化Ｐｆｕ緩衝液、０．１ｍＭのｄＡＴＰ、０．１ｍＭのｄＣＴＰ、０．１ｍＭのｄＧＴＰ、０．１ｍＭのｄＴＴＰ、１．２５ユニットのクローン化Ｐｆｕポリメラーゼ酵素を含有した。ＰＣＲ反応液は、９４℃で３０秒間、その後、９４℃で１０秒間、４８℃で１５秒間、７２℃で１５秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。上記反応から得られた生成物は、続いて、５’末端におけるジグリシンスペーサーと、ＫＰ６毒素のアミノ酸１３９〜１４１と、合成ＫＰ６プロペプチド配列の３’末端に対するグリシンスペーサーとからなるコード配列を含む隣接するプライマーを用いて増幅された。１００μＬのＰＣＲ反応液は、１μＭの５２２８（配列番号３６）、１μＭの５２２９（配列番号３７）、０．７５Ｘクローン化Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．２５ユニットのクローン化Ｐｆｕポリメラーゼ、２５μＬの上記ＰＣＲ反応液、および、反応液を１００μＬにするための水を含有した。ＰＣＲ反応液は、９４℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。所望される約１２０ｐのＫＰ６プロペプチドコード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。上記反応から得られたＰＣＲフラグメントを製造者の説明書に従ってｐＣＲ４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＳＢＣ１７３１（配列番号７５）を作製した。簡単に記載すると、１μＭのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液および３μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を氷上に置き、２５μＬの化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞を連結液に加え、混合物を氷上で１０分間インキュベーションした。形質転換反応液を、４２℃で３０秒間インキュベーションすることによって熱ショック処理して、直ちに氷上に置き、２５０μＬのＳＯＣを加えた。形質転換は、２０分間の２００ｒｐｍでの振とうを行いながら３７℃でインキュベーションすることによって回復させられた。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．０ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製した。簡単に記載すると、細胞をプレート遠心分離機において３Ｋｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化した。上清を細胞ペレットから捨て、細胞をボルテックス処理によって２５０μＬのＰ１緩衝液に再懸濁した。２５０μＬのＰ２を細胞に加え、倒置することによって混合し、５分間インキュベーションして細胞を溶解した。３５０μＬのＮ３を細胞溶解物に加え、倒置することによって混合し、Ｔｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒプレートに移した。真空をＴｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒに加え、これにより、サンプルがＱＩＡｐｒｅｐプレートの中にろ過された。その後、サンプルをプレートから抜きながら、真空をＱＩＡｐｒｅｐプレートに加え、プラスミドをプレートのメンブランに結合させた。ＱＩＡｐｒｅｐプレートを、真空力を使用して０．９ｍＬのＰＢで洗浄し、その後、０．９ｍＬのＰＥで２回洗浄し、真空乾燥した。１００μＬのＥＢ緩衝液を精製プラスミドに加え、１分間インキュベーションし、続いて６Ｋｒｐｍで３分間遠心分離して、精製プラスミドを溶出させた。精製されたｐＬＳＢＣ１７３１（配列番号７５）プラスミドは、ＫＰ６プロペプチド配列を確認するために、標準的な方法を使用する核酸配列決定に供された。
（実施例２）
（ヒトＦａｂプレプロタンパク質ライブラリーのクローニングおよび発現分析）
長いポリＡ領域を含有する配列について濃縮されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、ノルウエー）を使用してヒト脾臓の総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から単離した。ＲＮＡを４℃で１５分間の１５Ｋｒｐｍでの遠心分離によってペレット化し、上清を除き、１ｍＬの７０％エタノールを加えた。サンプルを、４℃で１５分間、１５Ｋｒｐｍで遠心分離して、上清を除き、ペレットを１５０μＬのヌクレアーゼ非含有水（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に再懸濁した。上記の調製された総ＲＮＡの５μｇを６５℃で２分インキュベーションし、直ちに氷上に３分間置き、その後、結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中の２０μＬの磁石ビーズに加えた（この場合、ビーズは、５０μＬの結合緩衝液で洗浄することによって準備された）。ＲＮＡおよびビーズの混合物を、絶えず回転させながら５分間インキュベーションした。非結合物を含有する上清を除き、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、その後、４０μＬのヌクレアーゼ非含有水を加えた。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を６０μＬの反応液において合成した。反応液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、２ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、２０ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、０．５ｍＭのｄＣＴＰ、０．５ｍＭのｄＧＴＰ、０．５ｍＭのｄＴＴＰ、および上記から得られたオリゴｄＴ結合ＲＮＡを含有した。このｃＤＮＡ反応液は、絶えず回転させながら４２℃で６０分間インキュベーションされた。別のＰＣＲ反応が、γＶＨ３重鎖Ｆｄ（ＶＨ−ＣＨ１）領域、または、合成されたｃＤＮＡに由来するκリーダーを含むκ１軽鎖（ＶＬ−ＣＬ）を増幅するために下記のように設定された。１００μＬのＰＣＲ反応液は、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＴａｑ反応緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１０ユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、１μＭの上流側プライマー、１μＭの下流側プライマー、および１μＬの調製されたｃＤＮＡを含有した。κ１リーダーおよび軽鎖のｃＤＮＡを増幅するために、反応液は５２３０（配列番号２９）上流側プライマーおよび５２３５下流側プライマーを含有した。５２３０上流側プライマーは、リーダー配列を含む１６個の異なるκ１Ｖ遺伝子セグメントのうちのおよそ１３個を増幅するために設計された。５２３０プライマーは、その後のクローニングのために、翻訳開始部位の上流側にＰａｃＩ部位を含んだ。５２３５下流側プライマーはκＣＬのＯＲＦの３’末端にアニーリングし、これにより終結コドンを除き、また、ＫＰ６プロペプチドコード配列の５’末端に融合されたジグリシンスペーサーに対するコード配列を含む。ＶＨ３重鎖γＣＨ１のｃＤＮＡを増幅するために、反応液は５２３６（配列番号３２）上流側プライマーおよび５２３３（配列番号３０）下流側プライマーを含有した。５２３６上流側プライマーは、リーダー配列を伴わない１８個の異なるＶＨ３Ｖ遺伝子セグメントのうちのおよそ１４個を増幅するために設計された。５２３６プライマーは、ＫＰ６プロペプチドコード配列の３’末端に融合されたジグリシンスペーサーに対するコード配列を含む。５２３３下流側プライマーはγＣＨ１のＯＲＦの３’末端にアニーリングし、終結コドンと、その後のクローニングのための、ターミネーターの下流側におけるＮｏｔＩ部位とを含む。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。所望される約７００ｂｐのκ軽鎖および約７００ｂｐのγＦｄ領域の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６配列を、ＦａｂのクローニングのためにＰＣＲ増幅した。１００μＬのＰＣＲ反応液は、１μＭの５２２８、１μＭの５２２９、１Ｘクローン化Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、５ユニットのクローン化Ｐｆｕポリメラーゼ、および１μＬのｐＬＳＢＣ１７３１プラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。Ｆａｂプレプロタンパク質を組み立てるために、ＫＰ６のＰＣＲフラグメントを配列重複伸張（ＳＯＥ）によって重鎖Ｆｄフラグメントに融合した。７０μＬのＰＣＲ反応液は、上記から得られたｐＬＳＢＣ１７３１ ＰＣＲ産物の０．０１μＬ、上記から得られたＰＣＲ増幅されたヒトＶＨ３重鎖Ｆｄ（ＶＨ−ＣＨ１）領域の１μＬ、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２９ｍＭのｄＡＴＰ、０．２９ｍＭのｄＣＴＰ、０．２９ｍＭのｄＧＴＰ、０．２９ｍＭのｄＴＴＰ、２．６ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素を含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で３０秒間、その後、９４℃で３０秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分間からなる４サイクルで増幅された。４サイクルの後、１０μＬの１０μＭの５２２８上流側プライマー、１０μＬの１０μＭの５６０９（配列番号３８）下流側プライマー、３μＬの１０ＸのＥｘｐａｎｄ緩衝液、および７μＬの水がＰＣＲ反応液を加えて、ＰＣＲ反応液を、９４℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる２５サイクルでサイクル処理し、その後、７２℃で５分、処理した。所望される約０．８ＫｂのＫＰ６コード配列およびＦｄコード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。０．８ＫｂのＰＣＲ増幅フラグメントを、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１．５％アガロースゲルで電気泳動した。フラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロース片から精製した。簡単に記載すると、９００μＬのＱＧ緩衝液をゲルフラグメントに加え、混合物を、時々撹拌しながら６５℃で１０分間インキュベーションした。溶解させたゲル片をＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを７５０μＬのＰＥで洗浄し、精製フラグメントを５０μＬのＥＢにおいて溶出させた。Ｆａｂを組み立てるために、上記から得られたＫＰ６−重鎖ＦｄのＰＣＲフラグメントを、上記から得られた５２３０−５２３５（配列番号３１）プライマー増幅のκリーダー−軽鎖にＳＯＥによって融合した。８０μＬのＰＣＲ反応液は、０．１μＬのＫＰ６−重鎖ＦｄのＰＣＲフラグメント、１μＬのＰＣＲ増幅されたκリーダー−軽鎖、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２５ｍＭのｄＡＴＰ、０．２５ｍＭのｄＣＴＰ、０．２５ｍＭのｄＧＴＰ、０．２５ｍＭのｄＴＴＰ、２．６ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素を含有した。ＰＣＲ反応液は、９４℃で２分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる１０サイクル、そして最後に７２℃で５分間、増幅された。１０サイクルの後、８μＬの１０μＭの５２３０上流側プライマー、８μＬの１０μＭの５６０９下流側プライマー、および２μＬの１０ＸのＥｘｐａｎｄ緩衝液をＰＣＲ反応液に加えて、ＰＣＲ反応液を、９４℃で５分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１．５分間からなる２５サイクルでサイクル処理し、その後、７２℃で７分、処理した。所望される約１．５ＫｂのＦａｂプレプロタンパク質コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを製造者の説明書に従って使用して、その後のクローニングのために精製した。簡単に記載すると、ＰＣＲ反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離し、５００μＬのＰＢで洗浄し、７５０μＬのＰＥで２回洗浄して、スピン乾燥した。精製されたＰＣＲ産物を、５０μＬのＥＢを用いて溶出した。精製された１．５ＫｂのＰＣＲ産物を、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供して、クローニングのための付着性末端を生じさせた。２００μＬの制限消化液は、５０μＬの上記の精製されたＰＣＲ産物、１００ユニットのＰａｃＩ、１００ユニットのＮｏｔＩ、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴを含有した。反応液は３７℃で２時間インキュベーションされ、続いて、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１．５％アガロースゲルで電気泳動された。ＰａｃＩおよびＮｏｔＩによる１．５Ｋｂの消化フラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロース片から精製した。簡単に記載すると、６００μＬのＱＧ緩衝液をゲルフラグメントに加え、混合物を、時々撹拌しながら６５℃で１０分間インキュベーションした。溶解させたゲル片をＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを７５０μＬのＰＥで２回洗浄し、乾燥して、精製フラグメントを５０μＬのＥＢにおいて溶出させた。約１．５Ｋｂの精製されたフラグメントの存在がゲル電気泳動によって確認された。
ｐ５ＰＮＣＡＰプラスミドを、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供して、クローニングのための付着性末端を生じさせた。２００μＬの制限消化液は、２．５μｇのｐ５ＰＮＣＡＰプラスミドＤＮＡ、５０ユニットのＰａｃＩ、５０ユニットのＮｏｔＩ、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴを含有した。消化液を３７℃で３．５時間インキュベーションし、その後、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて０．８％アガロースゲルで電気泳動して、約９．７Ｋｂのフラグメントを０．６Ｋｂのフラグメントから分離した。ＰａｃＩおよびＮｏｔＩによる９．７Ｋｂの消化フラグメントを、外科用メスの刃を使用してゲルにおいて単離した。このフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロースから精製した。簡単に記載すると、１．３２ｍＬのＱＧ緩衝液をゲルフラグメントに加え、混合物を、時々撹拌しながら６５℃で１０分間インキュベーションした。１０μＬの３Ｍ酢酸Ｎａおよび２２０μＬのイソプロパノールを溶解させたゲル片の半分に加え、その後、ＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを５００μＬのＱＢおよび７５０μＬのＰＥで洗浄し、精製フラグメントを５０μＬのＥＢにおいて溶出させた。溶解させたゲル片の残り半分を上記と同じ様式で処理し、溶出物を一緒にした。約９．７Ｋｂの精製されたフラグメントの存在がゲル電気泳動によって確認された。
上記の調製された１．５Ｋｂの、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩで消化されたＦａｂプレプロタンパク質フラグメントを、植物における発現のための調製されたベクターｐ５ＰＮＣＡにクローン化して、クローンＨｕＦａｂ（配列番号８７）を作製した。３０μＬの連結反応液は、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩで調製されたｐ５ＰＮＣＡの１μＬ、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩで調製されたＦａｂプレプロタンパク質フラグメントの５μＬ、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有した。反応液を１６℃で一晩インキュベーションした。細菌の形質転換を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造者の推奨法に従って用いて行った。簡単に記載すると、４０μＬのエレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞を２μＬの連結液と混合して、冷却された０．２ｃｍキュベットに移した。混合物に、２．５ＫＶ、２００オーム、２５μＦＤでパルスを与えた。パルス処理後、１５０μＬのＳＯＣを加え、細胞を、３７℃で２０分間、回復させた。細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製した。簡単に記載すると、細胞をプレート遠心分離機において３Ｋｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化した。上清を細胞ペレットから捨て、細胞をボルテックス処理によって２５０μＬのＰ１緩衝液に再懸濁した。２５０μＬのＰ２を細胞に加え、倒置することによって混合し、５分間インキュベーションして細胞を溶解した。３５０μＬのＮ３を細胞溶解物に加え、倒置することによって混合し、Ｔｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒプレートに移した。真空をＴｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒに加え、これにより、サンプルがＱＩＡｐｒｅｐプレートの中にろ過された。その後、サンプルをプレートから抜きながら、真空をＱＩＡプレートに加え、プラスミドをプレートのメンブランに結合させた。ＱＩＡｐｒｅｐプレートを、真空力を使用して０．９ｍＬのＰＢで洗浄し、その後、０．９ｍＬのＰＥで２回洗浄し、真空乾燥した。１００μＬのＥＢ緩衝液を精製プラスミドに加え、１分間インキュベーションし、続いて６Ｋｒｐｍで３分間遠心分離して、精製プラスミドを溶出した。クローンは、１．５Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＰａｃＩおよびＮｏｔＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。ヒトＦａｂプレプロタンパク質は、適正な組立てを確認し、かつ、可変領域および定常領域の配列を同定するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用してそれぞれのクローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、１μＬの１０Ｘ反応緩衝液、２．５μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、１μＬの酵素ミックス、および３．５μＬのプラスミドを含有する５．５μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する４０μＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。４０μＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、植え付け後２０日目のニコチアナ・ベンタミアナ植物に接種した（Ｄａｗｓｏｎ，ＷＯ他（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：１８３２〜１８３６）。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、Ｆａｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
接種後１２日目に、個々の植物に由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織をＧＦ／Ｂの０．８ｍＬ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）に入れ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に３０秒間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。残留する緩衝液を捨て、組織をプレート遠心分離機における４００ｒｐｍで１０秒間の遠心分離によって乾燥させた。ＩＦ画分が、プレート遠心分離機における３Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって９６ウエルマイクロプレートに回収される。３０μＬの各ＩＦサンプルを、還元性ゲルについては１０％の２−メルカプトエタノールを含有し、非還元性ゲルについては２−メルカプトエタノールを含有しない５μＬの５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製して、混合物を２分間、煮沸した。サンプルは１５％Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。約２５ＫＤａにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、所望される２５ＫＤａ重鎖Ｆｄおよび２５ＫＤａ軽鎖の存在を示している。ＨｕＦａｂ Ａ９、ＨｕＦａｂ Ｄ５およびＨｕＦａｂ Ｈ２（配列番号８８）のサンプルにおいて見られるように、非還元条件のもとでの約５０ＫＤａにおける対応するタンパク質は、重鎖Ｆｄおよびκ軽鎖からなる組み立てられたジスルフィド連結のＦａｂヘテロダイマーの証拠である。サンプルは、重鎖Ｆｄポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの存在を確認するためにウエスタンブロット分析に供された。ＩＦサンプルを、１０％の２−メルカプトエタノールを含有する１Ｘトリス−グリシンサンプル色素で１：１０希釈した。１０μＬの各サンプルを２つの別個のＮｏｖｅｘ１０−２０％トリスグリシンゲルに負荷し、続いて、Ｘｃｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用してニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。一方のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗ヒトκ−ＨＲＰ標識血清で室温において１時間プローブし、２枚目のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗ヒトＩｇＧ−ＨＲＰ標識血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。抗κ血清では、約２５ＫＤａのタンパク質が、ＨｕＦａｂ Ａ９、ＨｕＦａｂ Ｄ５およびＨｕＦａｂ Ｈ２のサンプルにおいて検出され、対応する約２５ＫＤａのタンパク質が抗γ血清により検出された。このことは、重鎖Ｆｄおよびκ軽鎖の両方が発現し、分泌されたことを示している。
（実施例３）
（９Ｅ１０の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子のクローニング）
マウスのハイブリドーマ株Ｍｙｃ１−９Ｅ１０．２は、アミノ酸配列：ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（Ｇ．Ｉ Ｅｖａｎｓら，Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３６１０−３６１６，１９８５）のヒトｃ−ｍｙｃエピトープを認識するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を発現する（Ｇ．Ｉ Ｅｖａｎｓ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：３６１０〜３６１６、１９８５）。細胞はＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１７２９）から得られ、標準的条件のもとで培養された。２ｘ１０６個の培養細胞を遠心分離し、洗浄して、過剰な培養培地を除き、１％の２−メルカプトエタノールを含有する６００μＬのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて溶解した。総ＲＮＡを、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムおよびＲＮＥＡＳＹカラムを製造者の説明書に従って使用して精製した。簡単に記載すると、細胞溶解物をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで２分間、遠心分離機で遠心分離した。流出液を集め、等容量の７０％エタノールで希釈した。混合物をＲＮｅａｓｙカラムに移し、すべてのサンプルがカラムを通過するまで、１０Ｋｒｐｍで１５秒間、遠心分離した。カラムに結合したＲＮＡを７００μＬのＲＷ１で洗浄し、その後、５００μＬのＲＰＥで洗浄し、続いて乾燥した。精製されたＲＮＡを、１０Ｋｒｐｍで１分間の遠心分離によって５０μＬのＲＮＡＳＥ非含有水において溶出させた。第１鎖ｃＤＮＡを、５μＬにおいて、ＳＭＡＲＴ３’ＲＡＣＥキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）を１μＬの３’ＣＤＳプライマーとともに使用して、０．８μｇの総ＲＮＡから合成した。ＲＮＡとプライマーとの混合物を７０℃に２分間加熱して、氷上にさらに２分間置いた。ＲＮＡとプライマーとの混合物を、１Ｘ第１鎖緩衝液、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、１ｍＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、および１μＬのＰｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素を含有する１０μＬにした。反応液を４２℃で９０分間インキュベーションし、その後、１００μＬのトリシン−ＥＤＴＡ緩衝液（１０ｍＭトリシン−ＫＯＨ（ｐＨ８．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）を加え、反応液を７２℃に７分間加熱した。９Ｅ１０のκ軽鎖を５０Ｌの反応液においてＰＣＲ増幅した。反応液は、１ＸのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１ＸのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼミックス、２．５μＬの調製されたｃＤＮＡ、１ＸのＵＰＭ、および０．２μＭの９Ｅ１０ｋｌ５’（配列番号５０）を含有した。９Ｅ１０ｋｌ５’プライマーは、生殖系列配列のＶ−２１Ｃ９．５ＫＢ’ＣＬに由来するマウスκ軽鎖リーダー配列にアニーリングするように設計された。反応液は、９４℃で５秒間、７２℃で３分間で５回、その後、９４℃で５秒間、７０℃で１０秒間、７２℃で３分間の５回、そして、９４℃で５秒間、６７℃で１０秒間、７２℃で３分間の２５サイクルでサイクル処理された。所望される約９００ｂｐフラグメントの増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。９Ｅ１０の重鎖を５０Ｌの反応液においてＰＣＲ増幅した。反応液は、１ＸのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１ＸのＡｄｖａｎｔａｇｅ２ポリメラーゼミックス、２．５μＬの調製されたｃＤＮＡ、１ＸのＵＰＭ、および０．４μＭの９Ｅ１０ｇｆｗ５’（配列番号５１）を含有した。９Ｅ１０ｇｆｗ５’プライマーは、生殖系列配列のｈ７１８３（Ｖｈ６９．１）から同定されたマウス重鎖可変ＦＲ１配列にアニーリングするように設計された。反応液は、９４℃で５秒間、７０℃で３分間で５回、その後、９４℃で５秒間、６８℃で１０秒間、７２℃で３分間の５回、そして、９４℃で５秒間、６４℃で１０秒間、７２℃で３分間の２５サイクルでサイクル処理された。所望される約１．６Ｋｂフラグメントの増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
上記から得られた調製されたＰＣＲフラグメントを、製造者の説明書に従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、ｐ９Ｅ１０Ｈｙ−ＴＯＰＯ（配列番号７７）およびｐ９Ｅ１０Ｌｔ−ＴＯＰＯ（配列番号７９）のプラスミドを作製した。簡単に記載すると、２μＬのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液、および１μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を氷上に置き、２５μＬの化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞をそれぞれの連結液に加え、混合物を氷上で１０分間インキュベーションした。形質転換反応液を、４２℃で３０秒間インキュベーションすることによって熱ショック処理して、直ちに氷上に置き、２５０μＬのＳＯＣを加えた。形質転換は、２０分間の２００ｒｐｍでの振とうを行いながら３７℃でインキュベーションすることによって回復させられた。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．０ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製した。簡単に記載すると、細胞をプレート遠心分離機において３Ｋｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化した。上清を細胞ペレットから捨て、細胞をボルテックス処理によって２５０μＬのＰ１緩衝液に再懸濁した。２５０μＬのＰ２を細胞に加え、倒置することによって混合し、５分間インキュベーションして細胞を溶解した。３５０μＬのＮ３を細胞溶解物に加え、倒置することによって混合し、Ｔｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒプレートに移した。真空をＴｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒに加え、これにより、サンプルがＱＩＡｐｒｅｐプレートの中にろ過された。その後、サンプルをプレートから抜きながら、真空をＱＩＡｐｒｅｐプレートに加え、プラスミドをプレートのメンブランに結合させた。ＱＩＡｐｒｅｐプレートを、真空力を使用して０．９ｍＬのＰＢで洗浄し、その後、０．９ｍＬのＰＥで２回洗浄し、真空乾燥した。１００μＬのＥＢ緩衝液を精製プラスミドに加え、１分間インキュベーションし、続いて６Ｋｒｐｍで３分間遠心分離して、精製プラスミドを溶出させた。ｐ９Ｅ１０Ｈｙ−ＴＯＰＯ（配列番号７７）についての約１．２Ｋｂのインサートの存在、およびｐ９Ｅ１０Ｌｔ−ＴＯＰＯ（配列番号７９）についての約７００ｂｐのインサートの存在が、ＥｃｏＲＩ制限消化およびアガロースゲル電気泳動により確認された。精製されたｐ９Ｅ１０Ｈｙ−ＴＯＰＯプラスミドおよびｐ９Ｅ１０Ｌｔ−ＴＯＰＯプラスミドは、９Ｅ１０の重鎖配列およびκ鎖配列を確認するために、標準的な方法を使用する核酸配列決定に供された。
（実施例４）
（９Ｅ１０Ｆａｂプロタンパク質のクローニングおよび発現分析）
ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６配列を、ＦａｂのクローニングのためにＰＣＲ増幅した。１００μＬのＰＣＲ反応液は、１μＭの５２２８、１μＭの５２２９、１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および１μＬのｐＬＳＢＣ１７３１プラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。Ｆａｂプロタンパク質クローニングのために、９Ｅ１０のκ軽鎖を、プライマー６０５６（配列番号４１）およびプライマー２２２８を用いてｐ９Ｅ１０Ｌｔ−ＴＯＰＯから増幅し、９Ｅ１０の重鎖Ｆｄ（ＶＨＣＨ１）を、２２２５（配列番号３９）および６０５５（配列番号４０）を用いてｐ９Ｅ１０Ｈｙ−ＴＯＰＯから増幅した。それぞれのプライマーセットには、ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６プロペプチドコード配列の末端を５’末端または３’末端のいずれかにおいてコードするさらなる領域、ならびに、適切な発現ベクターへのクローニングのための制限部位（重鎖フラグメントの５’末端におけるＳｐｈＩまたは軽鎖フラグメントの３’末端におけるＡｖｒＩＩのいずれか）が含まれた。１００μＬのＰＣＲ反応液は、１μＭの上流側、１μＭの下流側、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および１μＬのプラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。所望される約７００ｂｐのκ鎖コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。軽鎖フラグメントを配列重複伸張（ＳＯＥ）によってＫＰ６のＰＣＲフラグメントに融合した。８０μＬのＰＣＲ反応液は、上記から得られたｐＬＳＢＣ１７３１のＰＣＲ産物の０．５μＬ、上記から得られたＰＣＲ増幅された９Ｅ１０κ軽鎖（ＶＬＣＬ）領域の０．５μＬ、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素を含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる２５サイクル、そして７２℃で５分、増幅された。２５サイクルの後、１０μＭの５２２８上流側プライマーの９μＬ、１０μＭの２２２８下流側プライマーの９μＬをＰＣＲ反応液に加えて、ＰＣＲ反応液を、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる２５サイクルでサイクル処理し、その後、７２℃で５分、処理した。所望される約０．８ＫｂのＫＰ６コード配列および軽鎖コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。９Ｅ１０Ｆａｂプロタンパク質を組み立てるために、上記から得られたＫＰ６−軽鎖のＰＣＲフラグメントを、上記から得られた増幅された９Ｅ１０重鎖ＦｄにＳＯＥによって融合した。８０μＬのＰＣＲ反応液は、０．５μＬのＫＰ６−軽鎖のＰＣＲフラグメント、０．５μＬのＰＣＲ増幅された重鎖Ｆｄ、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素を含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で２分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる１０サイクル、そして最後に７２℃で５分間、処理された。１０サイクルの後、１０μＭの２２２５上流側プライマーの９μＬ、１０μＭの２２２８下流側プライマーの９μＬをＰＣＲ反応液に加えて、ＰＣＲ反応液を、９７℃で２分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１．５分間からなる１０サイクル、その後、７２℃で５分、サイクル処理した。所望される約１．５Ｋｂの９Ｅ１０Ｆａｂプロタンパク質コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。ＰＣＲ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを製造者の説明書に従って使用して、その後のクローニングのために精製した。簡単に記載すると、ＰＣＲ反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋスピンカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離し、５００μＬのＰＢで洗浄し、７５０μＬのＰＥで２回洗浄して、スピン乾燥した。精製されたＰＣＲ産物を、５０μＬのＥＢを用いて溶出した。精製された１．５ＫｂのＰＣＲ産物を、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供して、クローニングのための付着性末端を生じさせた。５０μＬの制限消化液は、２５μＬの上記の精製されたＰＣＲ産物、８ユニットのＳｐｈＩ、８ユニットのＡｖｒＩＩ、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴを含有した。反応液は３７℃で２時間インキュベーションされ、続いて、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動された。ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによる１．５Ｋｂの消化フラグメントをゲルから切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロース片から精製した。簡単に記載すると、６００μＬのＱＧ緩衝液をゲルフラグメントに加え、混合物を、時々撹拌しながら６５℃で１０分間インキュベーションした。溶解させたゲル片をＱＩＡｑｕｉｃｋカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを７５０μＬのＰＥで２回洗浄し、乾燥して、精製フラグメントを５０μＬのＥＢにおいて溶出させた。約１．５Ｋｂの精製されたフラグメントの存在がゲル電気泳動によって確認された。
ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによる１．５Ｋｂの９Ｅ１０Ｆａｂプロタンパク質を、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐ１３２４−ＭＢＰプラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ１７３６（配列番号８５）を作製した。１０μＬの調製された９Ｅ１０Ｆａｂプロタンパク質、０．４μｇのｐ１３２４−ＭＢＰ、１２００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結物を、３容量のエタノールおよび０．３容量の１０Ｍ酢酸ＮＨ４を用いて沈殿させ、遠心分離して、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを２０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。細菌の形質転換を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造者の推奨法に従って用いて行った。簡単に記載すると、４０μＬのエレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞を４μＬの連結物と混合して、冷却された０．２ｃｍキュベットに移した。混合物に、２．５ＫＶ、２００オーム、２５μＦＤでパルスを与えた。パルス処理後、１２０μＬのＳＯＣを加え、細胞を３７℃で２０分間回復させた。細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、４００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製し、１００μＬのＥＢ緩衝液において溶出させた。ｐＬＳＢＣ１７３６（配列番号８５）クローンは、１．５Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。９Ｅ１０Ｆａｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用してｐＬＳＢＣ１７３６クローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、１μＬの１０Ｘ反応緩衝液、２．５μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、１μＬの酵素ミックス、および３．５μＬのプラスミドを含有する５．５μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する４０μＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。２０μＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、植え付け後１９日目のニコチアナ・ベンタミアナ植物に接種した（Ｄａｗｓｏｎ，ＷＯ他（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：１８３２〜１８３６）。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、Ｆａｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
各植物の感染葉に由来する間質液を接種後８日目に集め、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。個々の植物に由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織をＧＦ／Ｂの０．８ｍＬ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）に入れ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に３０秒間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。残留する緩衝液を捨て、組織をプレート遠心分離機における４００ｒｐｍで３０秒間の遠心分離によって乾燥させた。ＩＦ画分が、プレート遠心分離機における３Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって９６ウエルマイクロプレートに回収される。
２０μＬの各ＩＦサンプルを、還元性ゲルについては１０％の２−メルカプトエタノールを含有し、非還元性ゲルについては２−メルカプトエタノールを含有しない５μＬの５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製して、混合物を２分間、煮沸した。サンプルは１０〜２０％のグラジエントＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。約２５ＫＤａにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、所望される２５ＫＤａ重鎖Ｆｄおよび２５ＫＤａ軽鎖の存在を示している。非還元条件のもとでの約５０ＫＤａにおける対応するタンパク質は、重鎖Ｆｄおよびκ軽鎖からなる組み立てられたジスルフィド連結のＦａｂヘテロダイマーの証拠として認められた。
ウエスタン分析を行うために、２０μＬの還元サンプルおよび非還元サンプルが１０〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎトリスグリシンゲルに負荷され、ニトロセルロースメンブランに転写された。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。一方のメンブランを１：３０００希釈のヤギ抗マウスκ−ＨＲＰ標識血清で室温において１時間プローブし、２枚目のメンブランを１：３０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。抗κ血清では、約２５ＫＤａのタンパク質が還元サンプルについて検出され、約５０ＫＤａのバンドが非還元サンプルについて検出された。このことは、鎖間ジスルフィド架橋および組み立てられた９Ｅ１０Ｆａｂの存在を示している。抗γ血清では、約２５ＫＤａのタンパク質が還元サンプルについて検出され、約５０ＫＤａのバンドが非還元サンプルについて検出された。このことは、鎖間ジスルフィド架橋および組み立てられた９Ｅ１０Ｆａｂの存在を示している。
ｐＬＳＢＣ１７３６由来の組換え抗体９Ｅ１０Ｆａｂタンパク質が抗原ｃ−ｍｙｃを認識する能力がウエスタン分析によって確認された。ウエスタン分析では、ｍｙｃ標識のＧＦＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）がニトロセルロース紙に移され、ｐＬＳＢＣ１７３６を感染させた植物から精製された粗製ＩＦ物でプローブされた。２５０ｎｇのｍｙｃ標識ＧＦＰまたは３０ｎｇのＧＦＰを１ＸのＳＤＳ／ＰＡＧＥ緩衝液に含有するサンプルを煮沸し、１０〜２０％のＣｒｉｔｅｒｉｏｎトリスグリシンゲルで泳動して、ニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。メンブランを１：３０００希釈のヤギ抗マウスκ−ＨＲＰ標識血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。バンドが、５３ＫＤａの予想サイズに対応するｍｙｃ標識ＧＦＰを含有するレーンにおいて可視化された。非標識のＧＦＰコントロールのレーンではタンパク質が検出されなかった。健康な植物から得られたＩＦでプローブされたレーンではバンドが可視化されなかった。９Ｅ１０Ｆａｂを含有するｐＬＳＢＣ１７３６感染ニコチアナ・バンタミアナ植物から得られたＩＦを用いたｍｙｃ標識ＧＦＰタンパク質の特異的な認識は、ジスルフィド連結されたヘテロ多量体タンパク質の然るべき活性を明らかにしている。
（実施例５）
（９Ｅ１０ＭＡＢのクローニングおよび発現）
９Ｅ１０モノクローナル抗体の人工プロタンパク質を、９Ｅ１０のκ軽鎖をｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６プロペプチド領域（これは９Ｅ１０のγ重鎖に融合されている）に融合することによって組み立てた。融合により、第１のドメイン（軽鎖）、第２のドメイン（プロペプチド）、および第３のドメイン（完全な重鎖配列）がもたらされる。９Ｅ１０のκ軽鎖を、プラスミドｐ９Ｅ１０Ｌｔ−ＴＯＰＯから、上流側プライマー２２３０（配列番号４）および下流側プライマー６０５７を用いてＰＣＲ増幅した。９Ｅ１０のγ重鎖を、プラスミドｐ９Ｅ１０Ｈｙ−ＴＯＰＯから、上流側プライマー６０５８（配列番号１４）および下流側プライマー２２２７を用いてＰＣＲ増幅した。１μＭの上流側、１μＭの下流側、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および１μＬのプラスミドテンプレートを含有する別々の１００μＬのＰＣＲ反応液を、９４℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる３０サイクル、そして７２℃で７分の最後の工程で増幅した。
所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列、７００ｂｐの９Ｅ１０κ軽鎖コード配列、および１．３Ｋｂの９Ｅ１０γ重鎖コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。９Ｅ１０ＭＡｂプロタンパク質を組み立てるために、増幅された９Ｅ１０κ軽鎖、ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６のＰＣＲフラグメント、および増幅された９Ｅ１０γ重鎖を配列重複伸張（ＳＯＥ）によって融合した。
０．１μＬのｐＬＳＢＣ１７３１のＰＣＲフラグメント、０．１μＬのＰＣＲ増幅された９Ｅ１０γ重鎖、０．１μＬのＰＣＲ増幅された９Ｅ１０κ軽鎖、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素を含有する２５μＬのＰＣＲ反応液を、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で２分間、７２℃で９０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分の最後の工程で増幅した。ＰＣＲ反応液を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。簡単に記載すると、５容量のＰＢ緩衝液を反応液に加え、混合して、カラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを７５０μＬの緩衝液ＰＥで洗浄して、精製フラグメントを１０μＬのＥＢにおいて溶出させた。５μＬの精製されたＰＣＲ産物、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２０ユニットのＳｐｈＩ、および８ユニットのＡｖｒＩＩを含有する５０μＬの反応液を３７℃で１時間インキュベーションして、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約２．３Ｋｂの９Ｅ１０ＭＡｂプロタンパク質コード配列を分離した。２．３ＫｂのＭＡｂプロタンパク質コード配列を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の推奨法に従って使用して精製し、５０μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。
９Ｅ１０ＭＡｂプロタンパク質コードフラグメントの２．３Ｋｂの、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによる消化フラグメントを、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１３２４プラスミドに連結して、ｐＬＳＢＣ１７９９（配列番号１１５）を作製した。ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによる９Ｅ１０ＭＡｂの調製されたＰＣＲフラグメントの調製物の２３μＬ、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによるｐＬＳＢＣ１３２４フラグメントの０．４μｇ、１２００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する３０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結反応液をエタノール沈殿し、ペレットを１０μＬの水に再懸濁し、２μＬを使用して、エレクトロコンピテントなＪＭ１０９を以前に記載されたように形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製して、プラスミドを、１００μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。クローンは、２．３Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。９Ｅ１０ＭＡｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
（実施例６）
（Ｓ１Ｃ５の重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子のクローニング）
マウスのモノクローナル抗体Ｓ１Ｃ５は、マウスＢ細胞腫瘍３８Ｃ１３の表面免疫グロブリンのイディオトープを認識する（Ｍａｌｏｎｅｙ他、Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ、４：１９１〜２０９、１９８５）。細胞は標準的条件のもとで培養された。重鎖遺伝子およびκ軽鎖遺伝子を、ハイブリドーマのｍＲＮＡから作製されたｃＤＮＡのＰＣＲ増幅によって単離した。簡単に記載すると、１ｘ１０６個の培養細胞を遠心分離し、洗浄して、過剰な培養培地を除き、１％の２−メルカプトエタノールを含有する６００μＬのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて溶解した。総ＲＮＡを、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムおよびＲＮＥＡＳＹカラムを製造者の説明書に従って使用して精製した。簡単に記載すると、細胞溶解物をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムに加え、１５Ｋｒｐｍで２分間、遠心分離機で遠心分離した。流出液を集め、等容量の７０％エタノールで希釈した。混合物をＲＮｅａｓｙカラムに移し、すべてのサンプルがカラムを通過するまで、１０Ｋｒｐｍで１５秒間、遠心分離した。カラムに結合したＲＮＡを７００μＬのＲＷ１で洗浄し、その後、５００μＬのＲＰＥで洗浄し、続いて乾燥した。精製されたＲＮＡを、１０Ｋｒｐｍで１分間の遠心分離によって５０μＬのＲＮＡＳＥ非含有水において溶出させた。５μｇの上記の調製された総ＲＮＡを７０℃で２分間インキュベーションし、その後、結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中の２０μＬの磁石ビーズに加えた（この場合、ビーズは、５０μＬの結合緩衝液で洗浄することによって準備された）。ＲＮＡおよびビーズの混合物を、絶えず回転させながら５分間インキュベーションした。非結合物を含有する上清を除き、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、その後、４０μＬのヌクレアーゼ非含有水を加えた。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、６０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、９０ｍＭのＫＣｌ、４ｍＭのＭｇＣｌ２、１２ｍＭのＤＴＴ、２４０ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、２４００ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、０．６ｍＭのｄＡＴＰ、０．６ｍＭのｄＣＴＰ、０．６ｍＭのｄＧＴＰ、０．６ｍＭのｄＴＴＰ、および上記から得られたオリゴｄＴ結合ＲＮＡを含有する１００μＬの反応液において合成した。反応液は、絶えず回転させながら４２℃で９０分間インキュベーションされた。上清を磁石ビーズから除いた。その後、ビーズを５０ｕｌの５０ｍＭ酢酸カリウム／２０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）／１ｍＭ ＤＴＴ／１０ｍＭ酢酸マグネシウムで洗浄し、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、２．５ｍＭのＣｏＣｌ２、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、および４４ユニットのターミナルトランスフェラーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｍｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む２２０μＬに再懸濁した。反応混合物を３７℃で４０分間インキュベーションした。
Ｓ１Ｃ５のκ軽鎖を、上流側プライマーＣ−アンカー（配列番号１）（これは、ポリＧリーダーにアニーリングする）および下流側プライマー２２２８（配列番号５）（これはκ軽鎖定常部の３’末端にアニーリングし、その後のクローニングのためにＡｖｒＩＩ部位を終結コドンの下流側に含む）を用いてＰＣＲ増幅した。１００μＬのＰＣＲ反応液は、１μＭの上流側、１μＭの下流側、１ＸのＴａｑポリメラーゼ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、２５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および５μＬの調製されたｃＤＮＡを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５０℃で１分間、７２℃で１分間からなる３０サイクル、そして７２℃での最後の７分のインキュベーションで増幅された。ＰＣＲ増幅産物は、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動された。０．７Ｋｂのバンドを切り出し、以前に記載されたようにＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して精製し、５０μＬの溶出緩衝液を用いて溶出した。増幅されたＳ１Ｃ５κ軽鎖フラグメントを製造者の説明書に従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＳＢＣ１７５７を作製した。簡単に記載すると、１μＬのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液、および３μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を氷上に置き、２５μＬの化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞を連結液に加え、混合物を氷上で１０分間インキュベーションした。形質転換反応液を、４２℃で３０秒間インキュベーションすることによって熱ショック処理して、直ちに氷上に置き、２５０μＬのＳＯＣを加えた。形質転換は、２０分間の２００ｒｐｍでの振とうを行いながら３７℃でインキュベーションすることによって回復させられた。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．０ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたようにＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製した。クローンをＥｃｏＲＩで消化し、０．７Ｋｂのインサートバンドの存在についてスクリーニングした。精製されたｐＬＳＢＣ１７５７プラスミドは、標準的な方法を使用する核酸配列決定に供された。
Ｓ１Ｃ５の重鎖を、Ｗａｎｇ他（Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２３３：１６７〜１７７（２０００））によって記載される縮重した上流側プライマーの５’ＭＨ１および５’ＭＨ２と、下流側プライマーの２２２７（配列番号３）（これはγ定常鎖の３’末端にアニーリングし、その後のクローニングのためにＡｖｒＩＩ部位を終結コドンの下流側に含む）とを用いてＰＣＲ増幅した。１００μＬのＰＣＲ反応液は、０．５μＭの５’ＭＨ１、０．５μＭの５’ＭＨ２、１μＭの２２２７、１ＸのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、２５ユニットのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および５μＬの調製されたｃＤＮＡを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で３分間、その後、９４℃で１分間、４５℃で１分間、７２℃で２分間からなる３０サイクル、そして７２℃での最後の１０分のインキュベーションで増幅された。ＰＣＲ増幅産物は、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動された。１．３Ｋｂのバンドを切り出し、以前に記載されたようにＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して精製し、５０μＬの溶出緩衝液を用いて溶出した。増幅されたＳ１Ｃ５重鎖フラグメントを製造者の説明書に従ってｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＳＢＣ２５２３（配列番号１１７）を作製した。簡単に記載すると、１μＬのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液、および３μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を氷上に置き、２５μＬの化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞を連結液に加え、混合物を氷上で１０分間インキュベーションした。形質転換反応液を、４２℃で３０秒間インキュベーションすることによって熱ショック処理して、直ちに氷上に置き、２５０μＬのＳＯＣを加えた。形質転換は、２０分間の２００ｒｐｍでの振とうを行いながら３７℃でインキュベーションすることによって回復させられた。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．０ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたようにＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製した。クローンをＥｃｏＲＩで消化し、１．３Ｋｂのインサートバンドの存在についてスクリーニングした。精製されたｐＬＳＢＣ２５２３プラスミドは、標準的な方法を使用する核酸配列決定に供された。
（ｐＬＳＢＣ１７８６の構築）
ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６配列を、ＦａｂのクローニングのためにＰＣＲ増幅した。１００μＬのＰＣＲ反応液は、１μＭの５２２８、１μＭの５２２９、１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および１μＬのｐＬＳＢＣ１７３１プラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
Ｓ１Ｃ５のκ軽鎖をプラスミドｐＬＳＢＣ１７５７（配列番号１１９）から増幅した。７６５９（配列番号７）上流側プライマーはＳ１Ｃ５のＶＬのＦＲ１領域にアニーリングし、ベクターｐＬＳＢＣ１７６７へのクローニングのために適合し得るＮｇｏＭＩＶ部位を含有する。６０５７（配列番号６）下流側プライマーはκＣＬのＯＲＦの３’末端にアニーリングし、終結コドンを除き、κＣＬのＯＲＦをＫＰ６プロペプチドコード領域の５’末端に読み枠を一致させて融合させる。Ｓ１Ｃ５の重鎖Ｆｄ（ＶＨＣＨ１）領域を、Ｆａｂプロタンパク質のクローニングのために、プライマーの７６６０（配列番号８）および７６６２（配列番号９）を用いてプラスミドｐＬＳＢＣ２５２３から増幅した。７６６０上流側プライマーはＳ１Ｃ５のＶＨ領域の５’末端にアニーリングし、それをＫＰ６プロペプチドコード領域の３’末端に読み枠を一致させて融合させる。７６６２下流側プライマーは、翻訳終結コドンと、その後に、その後のクローニングのためのＡｖｒＩＩ部位とを含むＣＨ１ドメインの３’末端にアニーリングする。別個の１００μＬのＰＣＲ反応液は、１μＭの上流側プライマー、１μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および１μＬのプラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９４℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる３０サイクル、そして７２℃で７分の最後の工程で増幅された。所望される約７００ｂｐのＳ１Ｃ５のκ軽鎖および７００ｂｐのＳ１Ｃ５のＦｄ領域の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。Ｓ１Ｃ５Ｆａｂプロタンパク質を組み立てるために、増幅されたＳ１Ｃ５のκ軽鎖、ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６のＰＣＲフラグメント、および増幅されたＳ１Ｃ５のＦｄフラグメントを配列重複伸張（ＳＯＥ）によって融合した。２５μＬのＰＣＲ反応液は、０．１μＬの上記から得られたｐＬＳＢＣ１７３１のＰＣＲ産物、０．１μＬのＰＣＲ増幅されたＳ１Ｃ５のＦｄ（ＶＬＣＨ１）領域、０．１μＬのＰＣＲ増幅されたＳ１Ｃ５のκ軽鎖領域、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素を含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で２分間、７２℃で９０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分の最後の工程で増幅された。ＰＣＲ増幅産物は、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動された。１．４Ｋｂのバンドを切り出し、以前に記載されたようにＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用して精製し、５０μＬの溶出緩衝液を用いて溶出した。増幅されたＳ１Ｃ５Ｆａｂプロタンパク質コード配列を製造者の説明書に従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＳＢＣ１７８６を作製した。簡単に記載すると、４μＬのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液、および２μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を使用して、以前に記載されたように、化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞を形質転換した。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．０ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたようにＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製した。クローンをＡｖｒＩＩおよびＮｇｏＭＩＶで消化し、１．４Ｋｂのインサートバンドの存在についてスクリーニングした。精製されたｐＬＳＢＣ１７８６プラスミドは、標準的な方法を使用する核酸配列決定に供された。
（ｐＬＳＢＣ１７９２（配列番号１２１）の構築）
プラスミドｐＬＳＢＣ１７８６を、ＮｇｏＭＩＶを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供した。５μＬのプラスミドＤＮＡ、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２０ユニットのＮｇｏＭＩＶを含有する５０μの反応液を、３７℃で２．５時間インキュベーションして、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約３．６ＫｂのＳ１Ｃ５Ｆａｂプロタンパク質コード配列を分離した。３．６ＫｂのＦａｂプロタンパク質コード配列を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の推奨法に従って使用して精製し、５０μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。精製されたフラグメントは、ＡｖｒＩＩを用いた制限エンドヌクレアーゼ消化に供された。５０μＬの精製されたフラグメント、５０ｍＭのＮａＣｌ、１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、１２ユニットのＡｖｒＩＩを含有する６０μの反応液を、３７℃で３５分間インキュベーションして、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約１．５ＫｂのＳ１Ｃ５Ｆａｂプロタンパク質コード配列を分離した。１．５ＫｂのＦａｂプロタンパク質コード配列を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の推奨法に従って使用して精製し、５０μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。ｐＬＳＢＣ１７８６の約１．５Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩでの精製フラグメントの存在がゲル電気泳動によって確認された。
ｐＬＳＢＣ１７８６の１．５Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる消化フラグメントを、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６７プラスミドに連結して、ｐＬＳＢＣ１７９２（配列番号１２１）を作製した。１０μＬの調製されたＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによるｐＬＳＢＣ１８７６フラグメント、０．４μｇのＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによるｐＬＳＢＣ１７６７フラグメント、１２００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた細菌形質転換を製造者の推奨法に従って行った。細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、４００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製し、１００μＬのＥＢ緩衝液において溶出させた。ｐＬＳＢＣ１７９２クローンは、２．７Ｋｂのフラグメントを含有することが、ＫｐｎＩを用いた制限酵素マッピングによって確認された。Ｓ１Ｃ５Ｆａｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
（ｐＬＳＢＣ１７９８の構築）
Ｓ１Ｃ５モノクローナル抗体の人工プロタンパク質を、ｐＬＳＢＣ１７５７のＳ１Ｃ５κ軽鎖をｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６プロペプチド領域（これはｐＬＳＢＣ２５２３のＳ１Ｃ５γ重鎖に融合されている）に融合することによって組み立てた。この融合により、第１のドメイン（軽鎖）、第２のドメイン（プロペプチド）、および第３のドメイン（完全な重鎖配列）がもたらされ、ｐＬＳＢＣ１７９８が作製される。Ｓ１Ｃ５のκ軽鎖を、プラスミドｐＬＳＢＣ１７５７から、上流側プライマー７６５９および下流側プライマー６０５７（配列番号６）を用いてＰＣＲ増幅した。Ｓ１Ｃ５のγ重鎖を、プラスミドｐＬＳＢＣ２５２３から、上流側プライマー７６６０および下流側プライマー２２２７を用いてＰＣＲ増幅した。１μＭの上流側、１μＭの下流側、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ、および１μＬのプラスミドテンプレートを含有する別々の１００μＬのＰＣＲ反応液を、９４℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる３０サイクル、そして７２℃で７分の最後の工程で増幅した。
所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列、７００ｂｐのＳ１Ｃ５のκ軽鎖コード配列、および１．３ＫｂのＳ１Ｃ５のγ重鎖コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。Ｓ１Ｃ５ＭＡｂプロタンパク質を組み立てるために、増幅されたＳ１Ｃ５のκ軽鎖鎖、１７３１のＫＰ６のＰＣＲフラグメント、および増幅されたＳ１Ｃ５のγ重鎖鎖を配列重複伸張（ＳＯＥ）によって融合した。
０．１μＬのｐＬＳＢＣ１７３１のＰＣＲフラグメント、０．１μＬのＰＣＲ増幅されたＳ１Ｃ５のγ重鎖、０．１μＬのＰＣＲ増幅されたＳ１Ｃ５のκ軽鎖、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ酵素を含有する２５μＬのＰＣＲ反応液を、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で２分間、７２℃で９０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃の５分間の最後の工程で増幅した。ＰＣＲ反応液を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。簡単に記載すると、５容量のＰＢ緩衝液を反応液に加え、混合して、カラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを７５０μＬの緩衝液ＰＥで洗浄して、精製フラグメントを１０μＬのＥＢにおいて溶出させた。５μＬの精製されたＰＣＲ産物、５０ｍＭの酢酸カリウム、２０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２０ユニットのＮｇｏＭＩＶ、および８ユニットのＡｖｒＩＩを含有する５０μＬの反応液を３７℃で１時間インキュベーションして、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約２．３ＫｂのＳ１Ｃ５ＭＡｂプロタンパク質コード配列を分離した。２．３ＫｂのＭＡｂプロタンパク質コード配列を、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キット（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の推奨法に従って使用して精製し、５０μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。
Ｓ１Ｃ５ＭＡｂプロタンパク質コードフラグメントの２．３Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる消化フラグメントを、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６７プラスミドに連結して、ｐＬＳＢＣ１７９８を作製した。ＳＮｇｏＭＶＩおよびＡｖｒＩＩによるＳ１Ｃ５ＭＡｂの調製されたＰＣＲフラグメントの調製物の２３μＬ、ＮｇｏＭＶＩおよびＡｖｒＩＩによるｐＬＳＢＣ１７６７フラグメントの０．４μｇ、１２００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する３０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結反応液をエタノール沈殿し、ペレットを１０μＬの水に再懸濁して、２μＬを使用して、以前に記載されたように、エレクトロコンピテントなＪＭ１０９を形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製して、プラスミドを、１００μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。ｐＬＳＢＣ１７９８のクローンは、２．３Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。Ｓ１Ｃ５ＭＡｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
（実施例７）
（９Ｅ１０ＭＡＢおよびＳ１Ｃ５ＭＡＢの精製）
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用してｐＬＳＢＣ１７９９（９Ｅ１０）クローンおよびｐＬＳＢＣ１７９８（Ｓ１Ｃ５）クローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、３２μＬの１０Ｘ反応緩衝液、１６２μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、３２μＬの酵素ミックス、および５μＬのプラスミドを含有する、各プラスミドについて３２４μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する７ｍＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。１８ｍＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより駆動され、ＮＯＳターミネーターを含有するＴＭＶ３０Ｋ移動タンパク質を導入遺伝子として発現する植え付け後２５日目のニコチアナ・ベンタミアナ（これは、標準的な形質転換技術によって作製された）に接種した。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、ＭＡｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後８日目に集めた。感染植物のそれぞれに由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）／５０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡで覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に２分間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。ＩＦ画分を４Ｋｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収した。回収されたＩＦを１ｍＭのＰＭＳＦに調節し、６Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって透明化した。上清をｐＨ７．５および１５０ｍＭのＮａＣｌに調節し、１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）／５０ｍＭ ＮａＣｌで平衡化されたプロテインＡ ＨｉＴｒａｐ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに負荷した。結合したＭＡｂを、１００ｍＭグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を用いて溶出し、ＭＡｂ含有画分をＭｉｃｒｏｃｏｎ−１０（Ａｍｉｃｏｎ）濃縮器で約１０倍に濃縮し、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）を用いて透析した。
（実施例８）
（９Ｅ１０ＦＡＢおよびＳ１Ｃ５ＦＡＢの精製）
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用してｐＬＳＢＣ１７３６（９Ｅ１０）クローンおよびｐＬＳＢＣ１７９２（Ｓ１Ｃ５）クローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、１０μＬの１０Ｘ反応緩衝液、５０μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、１０μＬの酵素ミックス、および１．４μｇのプラスミドを含有する、各プラスミドについて１００μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する２ｍＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。５ｍＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、植え付け後２６日目のニコチアナ・ベンタミアナに接種した。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、ＭＡｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
ｐＬＳＢＣ１７３６の場合、各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後１２日目に集めた。感染植物のそれぞれに由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）／５０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡで覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に２分間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。ＩＦ画分を４Ｋｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収した。回収されたＩＦを１ｍＭのＰＭＳＦに調節し、６Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって透明化した。上清をｐＨ５．２に調節して、１０ｋＤａメンブランを使用して濃縮し、透析し、その後、２５ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化されたＳＰセファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに負荷した。結合したＦａｂタンパク質を、２５ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．０）における２５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線グラジエントを使用して溶出した。溶出画分をプールし、１０ｍのＭＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて透析し、ヒドロキシアパタイト（タイプＩ）樹脂（ＢｉｏＲａｄ）に負荷した。結合したタンパク質を、１０ｍＭ〜２００ｍＭのＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．０）の直線グラジエントを使用して溶出し、精製Ｆａｂを含有する流出画分を一緒にプールして、濃縮し、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に透析した。
ｐＬＳＢＣ１７９２の場合、各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後１２日目に集めた。感染植物のそれぞれに由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織を５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）／５０ｍＭ ＮａＣｌ／２ｍＭ ＥＤＴＡで覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に２分間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。ＩＦ画分を４Ｋｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収した。回収されたＩＦを１ｍＭのＰＭＳＦに調節し、６Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって透明化した。上清をｐＨ５．２に調節して、１０ｋＤａメンブランを使用して濃縮し、透析し、その後、２５ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化されたＳＰセファロースＦＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに負荷した。結合したＦａｂタンパク質を、２５ｍＭイミダゾール緩衝液（ｐＨ６．０）における２５０ｍＭ〜５００ｍＭのＮａＣｌの直線グラジエントを使用して溶出した。溶出画分を２５％硫酸アンモニウムに調節して、フェニルセファロースＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に負荷し、Ｆａｂタンパク質を、２５ｍＭイミダゾール（ｐＨ６．０）における２０％〜０％の（ＮＨ４）２ＳＯ４の直線グラジエントを使用して溶出した。溶出画分をプールし、１０ｍＭのＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて透析し、ヒドロキシアパタイト（タイプＩ）樹脂（ＢｉｏＲａｄ）に負荷した。結合したタンパク質を、１０ｍＭ〜２００ｍＭのＫＰＯ４緩衝液（ｐＨ６．０）の直線グラジエントを使用して溶出し、精製Ｆａｂを含有する流出画分を一緒にプールして、濃縮し、リン酸塩緩衝化生理的食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）に透析した。
（実施例９）
（精製された９Ｅ１０ＭＡＢおよび９Ｅ１０ＦＡＢの分析）
ｐＬＳＢＣ１７９９の精製されたＭＡｂサンプルを、還元性ゲルのために１０％の２−メルカプトエタノールを含有する５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルは１０〜２０％のグラジエントゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。約５０ＫＤａおよび２５ＫＤａにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、所望される５０ＫＤａ重鎖および２５ＫＤａ軽鎖の存在を示している。
精製されたＭＡｂサンプルを、非還元性ゲルのために２−メルカプトエタノールを含まない５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルは６％のグラジエントゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。非還元条件のもとでの約１５０ＫＤａバンドにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、鎖間ジスルフィド架橋を含有する組み立てられた９Ｅ１０ＭＡｂタンパク質の存在を示している。
これらのサンプルは、組み立てられたジスルフィド連結の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの存在を確認するためにウエスタンブロット分析に供された。精製されたＭＡｂサンプルを、還元性ゲルのために１０％の２−メルカプトエタノールを含有する５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルを２つの別個のＮｏｖｅｘ６％トリス−グリシンゲルに負荷し、続いて、Ｘｃｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用してニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。第１のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗マウスκ−ＨＲＰ標識血清で室温において１時間プローブし、第２のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。抗κ血清では、約１５０ＫＤａのバンドが非還元条件のもとで検出された。このことは、鎖間ジスルフィド架橋を含有する組み立てられた９Ｅ１０ＭＡｂタンパク質の存在を示している。抗γ血清では、約１５０ＫＤａのバンドが非還元条件のもとで検出された。このことは、鎖間ジスルフィド架橋を含有する組み立てられた９Ｅ１０ＭＡｂタンパク質の存在を示している。
ｐＬＳＢＣ１７９９産生のＭＡｂおよびｐＬＳＢＣ１７３６のＦａｂがｃ−ｍｙｃペプチドを認識する能力を確認するために、精製された、植物により産生されたＭＡｂおよびＦａｂを使用して、ｍｙｃ標識のタンパク質をＥＬＩＳＡによって検出した。コントロールの９Ｅ１０ＭＡｂをマウスハイブリドーマ細胞株のＭｙｃ１−９Ｅ１０．２（ＡＴＣＣ（ＣＲＬ−１７２９））から精製した。細胞は標準的条件のもとで培養され、抗体が、ＩｇＧプロテインＡ精製キット（Ｐｉｅｒｃｅ）を製造者の説明書に従って使用して９０ｍＬの培地から精製された。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）における５ｕｇ／ｍｌの抗原で一晩、４℃で被覆した。抗原はｐＬＳＢＣ２２６８（配列番号９５）由来の融合タンパク質であった（これは、ＴＭＶ−Ｕ１コートタンパク質のアミノ末端に融合されたｃ−ｍｙｃエピトープを含有する）。プレートを、１Ｘ ＴＢＳＴ緩衝液における２．５％ＢＳＡで、室温において１時間ブロッキング処理した。二連のサンプルがＭＡｂ希釈物およびＦａｂ希釈物について試験された。これらをプレートに加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、結合した抗体を、ヤギ抗マウスκＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出した。サンプルは、Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ，１−ＳＴＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出され、反応が、製造者の説明書に従って１ＮのＨ２ＳＯ４を添加することによって停止させられた。プレートは吸光度プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって４５０ｎｍで読み取られ、データを、ＳｏｆｔＭａｘソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて分析した。サンプルのデータはバックグラウンドが差し引かれている。ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＬＳＢＣ１７３６のＦａｂおよびＬＳＢＣ１７９９のＭＡｂがｃ−ｍｙｃ抗原を認識し、これに結合することが明らかにされる。この活性は、ハイブリドーマにより産生されたコントロールＭＡｂに匹敵し得る。
Figure 2006506056
 （実施例１０）
（精製されたＳ１Ｃ５ＭＡＢおよびＳ１Ｃ５ＦＡＢの分析）
ｐＬＳＢＣ１７９８の精製されたＭＡｂサンプルを、還元性ゲルのために１０％の２−メルカプトエタノールを含有する５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルは１０〜２０％のグラジエントゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。約５０ＫＤａおよび２５ＫＤａにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、所望される５０ＫＤａ重鎖および２５ＫＤａ軽鎖の存在を示している。
これらのサンプルは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの存在を確認するためにウエスタンブロット分析に供された。精製されたＭＡｂサンプルを、還元性ゲルのために１０％の２−メルカプトエタノールを含有する５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルを２つの別個のＮｏｖｅｘ １０〜２０％トリス−グリシンゲルに負荷し、続いて、Ｘｃｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用してニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。第１のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗マウスκ−ＨＲＰ標識血清で室温において１時間プローブし、第２のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。抗κ血清では、約２５ＫＤａのタンパク質が検出され、また、対応する約５０ＫＤａのタンパク質が、抗γ血清を用いて検出された。このことは、κ軽鎖およびγ重鎖の両方が発現し、プロセシングされ、分泌されたことを示している。
精製されたＭＡｂサンプルを、非還元性ゲルのために２−メルカプトエタノールを含まない５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルは６％のグラジエントゲル（Ｎｏｖｅｘ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。非還元条件のもとでの約１５０ＫＤａバンドにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、鎖間ジスルフィド架橋を含有する組み立てられたＳ１Ｃ５ＭＡｂタンパク質の存在を示している。
これらのサンプルは、組み立てられたジスルフィド連結の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの存在を確認するためにウエスタンブロット分析に供された。精製されたＭＡｂサンプルを、還元性ゲルのために１０％の２−メルカプトエタノールを含有する５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルを２つの別個のＮｏｖｅｘ ６％トリス−グリシンゲルに負荷し、続いて、Ｘｃｅｌｌ ＩＩ Ｂｌｏｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を製造者の説明書に従って使用してニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。第１のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗マウスκ−ＨＲＰ標識血清で室温において１時間プローブし、第２のメンブランを１：４０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。抗κ血清では、約１５０ＫＤａのバンドが非還元条件のもとで検出され、このことは、鎖間ジスルフィド架橋を含有する組み立てられたＳ１Ｃ５ＭＡｂタンパク質の存在を示している。抗γ血清では、約１５０ＫＤａのバンドが非還元条件のもとで検出され、このことは、鎖間ジスルフィド架橋を含有する組み立てられたＳ１Ｃ５ＭＡｂタンパク質の存在を示している。
ｐＬＳＢＣ１７９８産生のＭＡｂおよびｐＬＳＢＣ１７９２の産生Ｆａｂが３８Ｃ１３抗原（ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ他（１９９９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９６：７０３〜７０８）を認識する能力を確認するために、精製された、植物により産生されたＭＡｂおよびＦａｂを使用して、３８Ｃ１３のｓｃＦｖタンパク質をＥＬＩＳＡによって検出した。コントロールのＳ１Ｃ５ＭＡｂは、標準的な技術を使用して作製されたマウス腹水に由来し、コントロールのＳ１Ｃ５Ｆａｂは、ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ Ｆａｂキット（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用してマウス腹水ＭＡｂから作製された。Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）を、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）における５ｕｇ／ｍｌの３８Ｃ１３のｓｃＦｖで、一晩、４℃で被覆した。プレートを、１Ｘ ＴＢＳＴ緩衝液における２．５％ＢＳＡで、室温において１時間ブロッキング処理した。二連のサンプルがＭＡｂ希釈物およびＦａｂ希釈物について試験された。これらをプレートに加え、室温で１時間インキュベーションした。プレートをＴＢＳＴで洗浄し、結合した抗体を、ヤギ抗マウスκＨＲＰ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて検出した。サンプルは、Ｔｕｒｂｏ−ＴＭＢ ＥＬＩＳＡ，１−ＳＴＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出され、反応が、製造者の説明書に従って１ＮのＨ２ＳＯ４を添加することによって停止させられた。プレートは吸光度プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって４５０ｎｍで読み取られ、データを、ＳｏｆｔＭａｘソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて分析した。サンプルのデータはバックグラウンドが差し引かれている。ＥＬＩＳＡアッセイにより、ＬＳＢＣ１７９２のＦａｂおよびＬＳＢＣ１７９８のＭＡｂが３８Ｃ１３抗原を認識し、これに結合することが明らかにされる。この活性は、腹水により産生されたコントロールのＦａｂおよびＭＡｂに匹敵し得る。
Figure 2006506056
 （実施例１１）
（４ｄ５重鎖ｆｄ遺伝子および４ｄ５軽鎖遺伝子のクローニング）
マウスモノクローナル抗体ｍｕｍＡｂ４Ｄ５は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子産物ｐ１８５ＨＥＲ２の細胞以外ドメインに向けられており、６日間の培養で乳ガン細胞株ＳＫ−ＢＲ−３（ＡＴＣＣ ＨＴＢ３０）の細胞成長を阻害する。そのような処理はこれらの細胞を化学療法剤に対して感受性にする（米国特許第５，６７７，１７１号）。実施例４のプロセスが、ｍｕｍＡｂ４Ｄ５のＩｇ重鎖Ｆｄ領域および軽鎖を使用して繰り返される。免疫グロブリンをコードする配列の可変遺伝子配列が、Ｃａｒｔｅｒ他、ＰＮＡＳ、８９：４２８５〜４２８９（１９９２）に記載される。
ヒトＨＥＲ−２受容体の細胞外ドメインを認識する、Ｆｅｎｄｌｙ他、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、５０：１５５０〜１５５８（１９９０）に記載されるマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）を発現するマウスハイブリドーマ株Ａ−ＨＥＲ２をＡＴＣＣから得た。細胞は、細胞株と一緒に提供された説明書に従って培養された。重鎖Ｆｄ領域およびκ軽鎖の遺伝子を、ハイブリドーマから得られたｍＲＮＡのＰＣＲ増幅によって単離した。簡単に記載すると、１ｘ１０７個の培養細胞を遠心分離し、洗浄して、過剰な培養培地を除き、１％の２−メルカプトエタノールを含有する６００μＬのＲＬＴ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を用いて溶解した。総ＲＮＡを、ＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムおよびＲＮＥＡＳＹカラムを製造者の説明書に従って使用して精製した。簡単に記載すると、細胞溶解物をＱＩＡｓｈｒｅｄｄｅｒカラムに加え、１４Ｋｒｐｍで２分間、遠心分離機で遠心分離した。流出液を集め、等容量の７０％エタノールで希釈した。混合物をＲＮｅａｓｙカラムに移し、すべてのサンプルがカラムを通過するまで、１０Ｋｒｐｍで１５秒間、遠心分離した。カラムに結合したＲＮＡを７００μＬのＲＷ１で洗浄し、その後、５００μＬのＲＰＥで洗浄し、続いて乾燥した。精製されたＲＮＡを、１０Ｋｒｐｍで１分間の遠心分離によって５０μＬのＲＮＡＳＥ非含有水において溶出させた。４μｇの上記の調製された総ＲＮＡを６５℃で２分間インキュベーションし、直ちに氷上に３分間置き、その後、結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中の２０μＬの磁石ビーズに加えた（この場合、ビーズは、５０μＬの結合緩衝液で洗浄することによって準備された）。ＲＮＡおよびビーズの混合物を、絶えず回転させながら５分インキュベーションした。非結合物を含有する上清を除き、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄し、その後、４０μＬのヌクレアーゼ非含有水を加えた。ｃＤＮＡを６０μＬの反応液において合成した。反応液は５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、２ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、２０ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、０．５ＭのｄＣＴＰ、０．５ｍＭのｄＧＴＰ、０．５ｍＭのｄＴＴＰ、および上記から得られたオリゴｄＴ結合ＲＮＡを含有した。ｃＤＮＡ反応液は、絶えず回転させながら４２℃で６０分間インキュベーションされた。
重鎖Ｆｄ遺伝子を、重鎖遺伝子のフレームワーク１領域（ＦＲ１）の５’末端にアニーリングする遺伝子特異的な上流側プライマー４Ｄ５ＨｙＳｐｈ５’（配列番号４２）と、ＣＨ１特異的な３’下流側プライマー４Ｄ５ＨｙＡｖｒ３’（配列番号５２）とを使用してＰＣＲ増幅した。κ軽鎖遺伝子を、κ軽鎖遺伝子のフレームワーク１領域（ＦＲ１）の５’末端にアニーリングする遺伝子特異的な上流側プライマー４Ｄ５ＬｔＳｐｈ５’（配列番号４３）と、ＣＬ特異的な３’下流側プライマー４Ｄ５ＬｔＡｖｒ３’（配列番号５３）とを用いて別個の反応でＰＣＲ増幅した。５０μＬのＰＣＲ反応液は、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、０．４μＭの上流側プライマー、０．４μＭの下流側プライマー、および２μＬの調製されたｃＤＮＡを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる３０サイクル、そして７２℃で５分、増幅された。所望される約７００ｂｐのκ軽鎖および約７００ｂｐのγＦｄ領域の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。上記のＰＣＲ反応液を、３容量のエタノールおよび０．３容量の１０Ｍ酢酸ＮＨ４を用いて沈殿し、遠心分離して、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを２０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
上記からの調製されたＰＣＲフラグメントを製造者の説明書に従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、ｐ４Ｄ５Ｈｙ−ＴＯＰＯ（配列番号８１）およびｐ４Ｄ５Ｌｔ−ＴＯＰＯ（配列番号８３）のプラスミドを作製した。簡単に記載すると、２μＬのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液、および１μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を氷上に置き、２５μＬの化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞をそれぞれの連結液に加え、混合物を氷上で１０分間インキュベーションした。形質転換反応液を、４２℃で３０秒間インキュベーションすることによって熱ショック処理して、直ちに氷上に置き、２５０μＬのＳＯＣを加えた。形質転換は、２０分間の２００ｒｐｍでの振とうを行いながら３７℃でインキュベーションすることによって回復させられた。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１．０ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製した。簡単に記載すると、細胞をプレート遠心分離機において３Ｋｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化した。上清を細胞ペレットから捨て、細胞をボルテックス処理によって２５０μＬのＰ１緩衝液に再懸濁した。２５０μＬのＰ２を細胞に加え、倒置することによって混合し、５分間インキュベーションして細胞を溶解した。３５０μＬのＮ３を細胞溶解物に加え、倒置することによって混合し、Ｔｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒプレートに移した。真空をＴｕｒｂｏ Ｆｉｌｔｅｒに加え、これにより、サンプルがＱＩＡｐｒｅｐプレートの中にろ過された。その後、サンプルをプレートから抜きながら、真空をＱＩＡｐｒｅｐプレートに加え、プラスミドをプレートのメンブランに結合させた。ＱＩＡｐｒｅｐプレートを、真空力を使用して０．９ｍＬのＰＢで洗浄し、その後、０．９ｍＬのＰＥで２回洗浄し、真空乾燥した。１００μＬのＥＢ緩衝液を精製プラスミドに加え、１分間インキュベーションし、続いて６Ｋｒｐｍで３分間遠心分離して、精製プラスミドを溶出させた。それぞれのプラスミドについて約７００ｂｐのインサートの存在が、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによる制限消化、ならびにアガロースゲル電気泳動により確認された。精製されたｐ４Ｄ５Ｈｙ−ＴＯＰＯ（配列番号８１）およびｐ４Ｄ５Ｌｔ−ＴＯＰＯ（配列番号８３）のプラスミドは、ｍｕｍ４Ｄ５のＦｄ配列およびκ軽鎖配列を確認するために、標準的な方法を使用する、Ｍ１３フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いた核酸配列決定に供された。
（実施例１２）
（４Ｄ５Ｆａｂ重鎖および軽鎖のプロタンパク質のクローニングおよび発現分析）
ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６配列を、ＦａｂのクローニングのためにＰＣＲ増幅した。２５μＬのＰＣＲ反応液は、０．８μＭの５２２８、０．８μＭの５２２９、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０３μＬのｐＬＳＢＣ１７３１プラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分、増幅された。所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。４Ｄ５のＦｄ領域（ＶＨＣＨ１）を、α−アミラーゼのシグナルペプチドを含有するベクターｐ１３２４−ＭＢＰへのクローニングのために適合し得るＳｐｈＩ部位を含有する上流側プライマー４Ｄ５ＨｙＳｐｈ５’と、ｐＬＳＢＣ１７３１から増幅されたＫＰ６プロペプチド配列の５’末端に融合されたＣＨ１の３’末端をコードする配列を含有する下流側プライマー４Ｄ５ＨｙＫｐ６３’（配列番号４４）とを用いてプラスミドｐ４Ｄ５ＨｙＦｄからＰＣＲ増幅した。ｐ１３２４−ＭＢＰは、改変された３０Ｂベクター（Ｓｈｉｖｐｒａｓａｄ，Ｓ．他（１９９９）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５５：３１２〜３２３）であり、イネα−アミラーゼのシグナルペプチドだけでなく、ＴＭＶおよびＴＭＧＭＶ−Ｕ５のハイブリッド融合体を、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩのインサートクローン化部位とともに含有する。このベクターにおいて、ＴＭＶのコートタンパク質サブゲノムプロモーターが４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質配列の挿入部位の上流側に存在する。感染後、このＴＭＶコートタンパク質サブゲノムプロモーターは、転写開始点（「ｔｓｐ」）で植物細胞内における４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質のＲＮＡ合成の開始を行わせる。イネα−アミラーゼのシグナルペプチド（Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，ＳＤ他（１９９０）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．、２２１：２３５〜２４４）が４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質配列に読み枠を一致させて融合されており、このシグナルペプチドは、タンパク質を分泌経路に標的化し（Ｆｉｒｅｋ，Ｓ．他（１９９４）、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｒｅｓ．、３：３２６〜３３１）、続いて、シグナルペプチドのＣ末端Ｇｙｌと、発現した４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質のＮ末端Ｍｅｔとの間で切断される３１残基のポリペプチドをコードする。４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質をコードする配列が、３０Ｋ移動タンパク質遺伝子と、ＴＭＧＭＶ−Ｕ５コートタンパク質（Ｔｃｐ）遺伝子との間に導入される。Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼプロモーターがウイルスｃＤＮＡの上流側に導入されており、感染性のゲノムプラス鎖ＲＮＡの転写を可能にしている。ＳｐｈＩ部位は、シグナルペプチドをＦｄの４Ｄ５可変領域のＦＲ１に連結し、ＥＲへの人工プロタンパク質の分泌を行わせる。４Ｄ５軽鎖（ＶＬＣＬ）を、下流側プライマー４Ｄ５Ｌａｖｓｔｐ３’（配列番号４９）（これは、ＣＬコード配列の３’末端における翻訳終結コドン、および、その後に続く、ベクターｐ１３２４−ＭＢＰへのクローニングのために適合し得るＡｖｒＩＩ部位を含有する）と、上流側プライマー４Ｄ５ＬｔＫｐ６５’（配列番号４５）（これは、ＶＬコード配列のＦＲ１領域の５’末端に融合された、ｐＬＳＢＣ１７３１から増幅されたＫＰ６プロペプチド配列の３’末端をコードする配列を含有する）とを用いてプラスミドｐ４Ｄ５ＬｔからＰＣＲ増幅した。４Ｄ５のＦｄ領域および軽鎖領域を別々の２５μＬのＰＣＲ反応液においてＰＣＲ増幅した。反応液は、０．８μＭの上流側プライマー、０．８μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０３μＬのプラスミドテンプレートを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分、増幅された。所望される約７００ｂｐのＦｄフラグメントおよび軽鎖フラグメントの増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質を組み立てるために、ＫＰ６のＰＣＲフラグメントを、増幅されたＦｄフラグメントおよび増幅された軽鎖フラグメントに配列重複伸張（ＳＯＥ）によって融合した。４Ｄ５プロタンパク質を組み立てるために、２５μＬのＰＣＲ反応液は、０．０３μＬの上記から得られたｐＬＳＢＣ１７３１のＰＣＲ産物、０．０３μＬの上記から得られたｐ４Ｄ５ＬｔのＰＣＲ産物、０．０３μＬの上記から得られたｐ４Ｄ５ＨｙＦｄのＰＣＲ産物、０．８μＭの４Ｄ５ＨｙＳｐｈ５’上流側プライマー、０．８μＭの４Ｄ５Ｌａｖｓｔｐ３’下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で２分間、７２℃で３０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分、増幅された。所望される約１．４Ｋｂの４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
一連のフェノール・クロロホルム抽出が、制限消化の前に熱安定性のポリメラーゼを除くために、ＰＣＲ増幅産物に対して行われた。５μＬの調製されたフラグメントが、２．５ユニットのＳｐｈＩ、２ユニットのＡｖｒＩＩ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴを含有する２５μＬの反応液において、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩにより消化された。消化液は３７℃で２時間インキュベーションされ、１．０％アガロースゲルで電気泳動され、約１．４Ｋｂのフラグメントを分離した。核酸を、ＧｅｌＳｔａｒ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色し、約１．４Ｋｂのフラグメントを単離した。フラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロースから精製した。ＳｐｈＩ／ＡｖｒＩＩ消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによる１．４Ｋｂの４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質を、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＩ３２４−ＭＢＰプラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ１７４０（配列番号７１）を作製した。１０μＬの調製された４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質、０．４μｇのｐＩ３２４−ＭＢＰ、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結物を、３容量のエタノールおよび０．３容量の１０Ｍ酢酸ＮＨ４を用いて沈殿させ、遠心分離して、７０％エタノールで洗浄した。ペレットを６μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。細菌の形質転換を、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造者の推奨法に従って用いて行った。簡単に記載すると、４０μＬのエレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞を２μＬの連結物と混合して、冷却された０．２ｃｍキュベットに移した。混合物に、２．５ＫＶ、２００オーム、２５μＦＤでパルスを与えた。パルス処理後、２００μＬのＳＯＣを加え、細胞を３７℃で２０分間回復させた。細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製し、１００μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。クローンは、１．４Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用してｐＬＳＢＣ１７４０（配列番号７１）クローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、１μＬの１０Ｘ反応緩衝液、２．５μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、１μＬの酵素ミックス、および３．５μＬのプラスミドを含有する５．５μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する４０μＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。４０μＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、植え付け後１９日目のニコチアナ・ベンタミアナ植物に接種した（Ｄａｗｓｏｎ，ＷＯ他（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：１８３２〜１８３６）。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、Ｆａｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後９日目に集め、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。個々の植物に由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織をＧＦ／Ｂの０．８ｍＬ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）に入れ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に３０秒間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。残留する緩衝液を捨て、組織をプレート遠心分離機における４００ｒｐｍで３０秒間の遠心分離によって乾燥させた。ＩＦ画分が、プレート遠心分離機における３Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって９６ウエルマイクロプレートに回収される。各サンプルは三連でＥＬＩＳＡによって分析された。６μＬのＩＦを１００μＬにおいて５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３に調節し、９６ウエルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）に加え、４℃で一晩インキュベーションした。プレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳの２００μＬで、３７℃で３０分間ブロッキング処理し、その後、１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で４回洗浄した。プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンンジュゲート化されたヤギ抗マウスκ血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＰＢＳにおける１：４０００希釈物の１００μＬとインキュベーションし、室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢ，１−ＳＴＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と室温で２０分間インキュベーションした。反応が、５０μＬの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止させられ、吸光度プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって４５０ｎｍで読み取られ、データを、ＳｏｆｔＭａｘソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて分析した。０．１３よりも大きい読み取りを有するサンプルをさらに分析した。
ｐＬＳＢＣ１７４０クローンをＰａｃＩおよびＫｐｎＩで消化して、２．７Ｋｂのα−アミラーゼシグナルペプチド／４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質（ウイルスの３’末端を含む）を単離した。５０μＬの反応液は、２μＬのプラスミド、１０ユニットのＰａｃＩ、１０ユニットのＫｐｎＩ、１０ｍＭのビス−トリスプロパン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴを含有した。消化液を３７℃で２時間インキュベーションして、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約２．７Ｋｂのフラグメントを分離した。核酸を、ＧｅｌＳｔａｒ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて染色し、約２．７Ｋｂのフラグメントを単離した。フラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロースから精製した。ＰａｃＩ／ＫｐｎＩ消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。ｐＬＳＢＣ１７４０の２．７Ｋｂの、ＰａｃＩおよびＫｐｎＩによるフラグメントを、ＰａｃＩおよびＫｐｎＩにより調製されたｐ１１７７ＭＰ５プラスミドの８．０Ｋｂフラグメントにクローン化して、ｐＬＳＢＣ１７６６（配列番号８９）を作製した。ｐＬＳＢＣ１７４０のＰａｃＩ／ＫｐｎＩフラグメントの１０μＬ、０．４μｇのｐ１１７７ＭＰ５、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結物を以前に記載されたようにエタノール沈殿した。ペレットを１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。細菌の形質転換を、以前に記載されたように、４０μＬのエレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞を用いて、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造者の推奨法に従って用いて行った。細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製し、プラスミドを、１００μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。１．４Ｋｂのインサートの存在が、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して、１１μＬの反応液において３００ｎｇのテンプレートプラスミドからインビトロで合成した。転写物を、上記のように、製Ｕ１コートタンパク質を用いてカプシド化した。転写物を使用して、２０日目ニコチアナ・ベンタミアナ植物に接種し、全身感染させた。ＩＦタンパク質画分を、以前に記載されたように、真空浸潤および遠心分離によって接種後の８日目および１１日目に単離した。２０μＬの各ＩＦサンプルを、還元性ゲルについては２−メルカプトエタノールを含有し、非還元性ゲルについては２−メルカプトエタノールを含有しない５μＬの５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、混合物を２分間、煮沸した。サンプルは１０〜２０％のグラジエントＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。約２５ＫＤａにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、所望される２５ＫＤａ重鎖Ｆｄおよび２５ＫＤａ軽鎖の存在を示している。非還元条件のもとでの約５０ＫＤａにおける対応するタンパク質は、重鎖Ｆｄおよびκ軽鎖からなる組み立てられたジスルフィド連結のＦａｂヘテロダイマーの証拠として認められる。
（実施例１３）
（４Ｄ５Ｆａｂ軽鎖および重鎖のプロタンパク質のクローニングおよび発現分析）
ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６配列を、ＦａｂのクローニングのためにＰＣＲ増幅した。２５μＬのＰＣＲ反応液は、０．８μＭの５２２８、０．８μＭの５２２９、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０３μＬのｐＬＳＢＣ１７３１プラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分間、増幅された。所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。４Ｄ５の軽鎖（ＶＬＣＬ）を、上流側プライマー４Ｄ５ＬｔＳｐｈＩ５’（これは、α−アミラーゼのシグナルペプチドを含有するベクターｐ１３２４−ＭＢＰへのクローニングのために適合し得るＳｐｈＩ部位を含有する）と、下流側プライマー４Ｄ５ＬｔＫｐ６３’（配列番号４６）（これは、ｐＬＳＢＣ１７３１から増幅されたＫＰ６プロペプチド配列の５’末端に融合されたＣＬの３’末端をコードする配列を含有する）とを用いてプラスミドｐ４Ｄ５ＬｔからＰＣＲ増幅した。ＳｐｈＩ部位は、シグナルペプチドを軽鎖の４Ｄ５可変領域のＦＲ１に連結し、ＥＲへの人工プロタンパク質の分泌を行わせる。４Ｄ５のＦｄ重鎖（ＶＨＣＨ１）を、下流側プライマー４Ｄ５Ｈａｖｓｔｐ３’（これは、ＣＨ１コード配列の３’末端における翻訳終結コドン、および、その後に続く、ベクターｐ１３２４−ＭＢＰへのクローニングのために適合し得るＡｖｒＩＩ部位を含有する）と、上流側プライマー４Ｄ５ＨｙＫｐ６５’（配列番号４７）（これは、ＶＨコード配列のＦＲ１領域の５’末端に融合された、ｐＬＳＢＣ１７３１から増幅されたＫＰ６プロペプチド配列の３’末端をコードする配列を含有する）とを用いてプラスミドｐ４Ｄ５ＨｙＦｄからＰＣＲ増幅した。４Ｄ５のＦｄ領域および軽鎖領域を別々の２５μＬのＰＣＲ反応液においてＰＣＲ増幅した。反応液は、０．８μＭの上流側プライマー、０．８μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０３μＬのプラスミドテンプレートを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分、増幅された。所望される約７００ｂｐのＦｄフラグメントおよび軽鎖フラグメントの増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質を組み立てるために、ＫＰ６のＰＣＲフラグメントを、増幅されたＦｄフラグメントおよび増幅された軽鎖フラグメントに配列重複伸張（ＳＯＥ）によって融合した。４Ｄ５プロタンパク質を組み立てるために、２５μＬのＰＣＲ反応液は、０．０３μＬの上記から得られたｐＬＳＢＣ１７３１のＰＣＲ産物、０．０３μＬの上記から得られたｐ４Ｄ５ＬｔのＰＣＲ産物、０．０３μＬの上記から得られたｐ４Ｄ５ＨｙＦｄのＰＣＲ産物、０．８μＭの４Ｄ５ＬｔＳｐｈＩ５’上流側プライマー、０．８μＭの４Ｄ５Ｈａｖｓｔｐ３’（配列番号４８）下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で２分間、７２℃で３０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分、増幅された。所望される約１．４Ｋｂの４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
一連のフェノール・クロロホルム抽出が、制限消化の前に熱安定性のポリメラーゼを除くために、ＰＣＲ増幅産物に対して行われた。５μＬの調製されたフラグメントが、２．５ユニットのＳｐｈＩ、２ユニットのＡｖｒＩＩ、５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．９）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴを含有する２５μＬの反応液において、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩにより消化された。消化液は３７℃で２時間インキュベーションされ、１．０％アガロースゲルで電気泳動され、約１．４Ｋｂのフラグメントを分離した。核酸を、ＧｅｌＳｔａｒ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）用いて染色し、約１．４Ｋｂのフラグメントを単離した。フラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロースから精製した。ＳｐｈＩ／ＡｖｒＩＩ消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩによる１．４Ｋｂの４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質を、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＩ３２４−ＭＢＰプラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ１７４１（配列番号７３）を作製した。１０μＬの調製された４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質、０．４μｇのｐＩ３２４−ＭＢＰ、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結物を以前に記載されたようにエタノール沈殿した。ペレットを６μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。細菌の形質転換を、以前に記載されたように、４０μＬのエレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞を用いて、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を製造者の推奨法に従って用いて行った。細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製し、プラスミドを、１００μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。クローンは、１．４Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用してｐＬＳＢＣ１７４１クローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、１μＬの１０Ｘ反応緩衝液、２．５μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、１μＬの酵素ミックス、および３．５μＬのプラスミドを含有する５．５μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する４０μＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。４０μＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、植え付け後１９日目のニコチアナ・ベンタミアナ植物に接種した（Ｄａｗｓｏｎ，ＷＯ他（１９８６）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８３：１８３２〜１８３６）。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、Ｆａｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後９日目に集め、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。個々の植物に由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織をＧＦ／Ｂの０．８ｍＬ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）に入れ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に３０秒間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。残留する緩衝液を捨て、組織をプレート遠心分離機における４００ｒｐｍで３０秒間の遠心分離によって乾燥させた。ＩＦ画分が、プレート遠心分離機における３Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって９６ウエルマイクロプレートに回収された。各サンプルは三連でＥＬＩＳＡによって分析された。６μＬのＩＦを１００μＬにおいて５０ｍＭのＮａ２ＣＯ３（ｐＨ９．６）に調節し、９６ウエルプレート（Ｍａｘｉｓｏｒｂ、Ｎｕｎｃ）に加え、４℃で一晩インキュベーションした。プレートを、１％ＢＳＡを含むＰＢＳの２００μＬで、３７℃で３０分間ブロッキング処理し、その後、１５０ｍＭ ＮａＣｌ／０．０５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００で４回洗浄した。プレートを、西洋ワサビペルオキシダーゼとコンンジュゲート化されたヤギ抗マウスκ血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＰＢＳにおける１：４０００希釈物の１００μＬとインキュベーションし、室温で１時間インキュベーションした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、１００μＬのＴｕｒｂｏ−ＴＭＢ，１−ＳＴＥＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）と室温で２０分間インキュベーションした。反応が、５０μＬの１Ｎ Ｈ２ＳＯ４の添加によって停止させられ、吸光度プレート読み取り装置（Ｍｏｌｅｃｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）によって４５０ｎｍで読み取られ、データを、ＳｏｆｔＭａｘソフトウエア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を用いて分析した。０．１３よりも大きい読み取りを有するサンプルをさらに分析した。
ｐＬＳＢＣ１７４１クローンをＰａｃＩおよびＫｐｎＩで消化して、２．７Ｋｂのα−アミラーゼシグナルペプチド／４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質（ウイルスの３’末端を含む）を単離した。５０μＬの反応液は、２μＬのプラスミド、１０ユニットのＰａｃＩ、１０ユニットのＫｐｎＩ、１０ｍＭのビス−トリスプロパン−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴを含有した。消化液を３７℃で２時間インキュベーションして、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約２．７Ｋｂのフラグメントを分離した。核酸を、ＧｅｌＳｔａｒ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いてで染色し、約２．７Ｋｂのフラグメントを単離した。フラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロースから精製した。ＰａｃＩおよびＫｐｎＩによる消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。ｐＬＳＢＣ１７４１の２．７Ｋｂの、ＰａｃＩおよびＫｐｎＩによるフラグメントを、ＰａｃＩおよびＫｐｎＩにより調製されたｐ１１７７ＭＰ５プラスミドの８．０Ｋｂフラグメントにクローン化して、ｐＬＳＢＣ１７６７（配列番号９１）を作製した。ｐＬＳＢＣ１７４１の調製物の１０μＬ、０．４μｇのｐ１１７７ＭＰ５、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結物をエタノール沈殿し、これを使用して、エレクトロコンピテントなＪＭ１０９を以前に記載されたように形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。上記のように、アンピシリン耐性のコロニーをブロックにおいて培養し、プラスミドを、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して精製した。１．４Ｋｂのインサートの存在が、ＳｐｈＩおよびＡｖｒＩＩを用いた制限マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を使用して、１１μＬの反応液において３００ｎｇのテンプレートプラスミドからインビトロで合成した。転写物を、上記のように精製Ｕ１コートタンパク質を用いてカプシド化した。転写物を使用して、２０日目のニコチアナ・ベンタミアナ植物に接種し、全身感染させた。ＩＦタンパク質画分を、以前に記載されたように、真空浸潤および遠心分離によって接種後の８日目および１１日目に単離した。２０μＬの各ＩＦサンプルを、還元性ゲルについては１０％の２−メルカプトエタノールを含有し、非還元性ゲルについては２−メルカプトエタノールを含有しない５μＬの５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、混合物を２分間、煮沸した。サンプルは１０〜２０％のグラジエントＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。約２５ＫＤａにおける還元性ゲルでのタンパク質結合は、所望される２５ＫＤａ重鎖Ｆｄおよび２５ＫＤａ軽鎖の存在を示している。非還元条件のもとでの約５０ＫＤａにおける対応するタンパク質は、重鎖Ｆｄおよびκ軽鎖からなる組み立てられたジスルフィド連結のＦａｂヘテロダイマーの証拠として認められる。
（実施例１４）
（４Ｄ５モノクローナル抗体プロタンパク質のクローニングおよび発現分析）
４Ｄ５モノクローナル抗体の人工プロタンパク質を、ｐＬＳＢＣ１７６７の４Ｄ５Ｆａｂプロタンパク質をマウスγ１免疫グロブリン定常ドメインのＣＨ２およびＣＨ３に融合することによって組み立てた。この融合により、第１のドメイン（軽鎖）、第２のドメイン（プロペプチド）、および第３のドメイン（完全な重鎖配列）がもたらされる。クローン化されたマウスＩｇＧ１重鎖配列は、以前に記載されたｐ９Ｅ１０Ｈｙ−ＴＯＰＯクローンに由来した。マウスＩｇＧ１定常ドメインの遺伝子は、同じイソタイプの重鎖遺伝子内では保存されており、従って、９Ｅ１０のＣＨ２およびＣＨ３は、それらがともにマウスＩｇＧ１であるので、４Ｄ５抗体および９Ｅ１０抗体の場合と同じであることが予想される。プライマーが、ベクター配列にアニーリングする５６９６ｓ（配列番号５４）上流側プライマーと、ｐＬＳＢＣ１７６７のＣＨ１領域にアニーリングし、翻訳終結シグナルを除く４Ｄ５ｆＡｂ３’下流側プライマー（配列番号５５）とを使用してｐＬＳＢＣ１７６７フラグメントを増幅するために設計された。４Ｄ５ｆＡｂ３’下流側プライマーは、ｐＬＳＢＣ１７６７のＣＨ１領域の３’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＧＧ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンである）が生じるように設計されている。ｐ９Ｅ１０Ｈｙ−ＴＯＰＯクローンのＣＨ２配列およびＣＨ３配列を増幅するために、９Ｅ１０Ｆｃ５’（配列番号５６）上流側プライマーが設計されたが、これはＣＨ２ドメインの５’末端にアニーリングし、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＣ」の５’伸張（式中、「Ｃ」はシトシンである）が生じるようにされている。９Ｅ１０Ｈａｖｒ３’下流側プライマーは、翻訳終結コドン、および、それに続く、その後のクローニングのためのＡｖｒＩＩ部位を含むＣＨ３ドメインの３’末端にアニーリングする。別々の２５μＬのＰＣＲ反応液を、４Ｄ５のＦａｂおよび９Ｅ１０のＣＨ２ＣＨ３ドメインを増幅するために組み立てた。このＰＣＲ反応液は、０．８μＭの５’プライマー、０．８μＭの３’プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．１６ｍＭのｄＡＴＰ、０．１６ｍＭのｄＣＴＰ、０．１６ｍＭのｄＧＴＰ、０．１６ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０３μＬのプラスミドテンプレートを含有した。ＰＣＲ反応液は、９５℃で２分間、その後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる１５サイクル、そして７２℃で７分、増幅された。所望される約１．６Ｋｐの４Ｄ５配列および約５００ｂｐの９Ｅ１０のＣＨ２ＣＨ３の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。ＰＣＲ増幅された１．６Ｋｂの４Ｄ５配列および５００ｂｐの９Ｅ１０のＣＨ２ＣＨ３をＤｐｎＩで消化した。５ユニットのＤｐｎＩを各ＰＣＲ反応液に加え、３７℃で１時間インキュベーションし、その後、８０℃で２０分間インキュベーションした。一連のフェノール・クロロホルム抽出が、熱安定性のポリメラーゼを除くために、ＰＣＲ増幅産物に対して行われ、フラグメントを以前に記載のようにエタノール沈殿して、２０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）に再懸濁した。精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを、６μＬの４Ｄ５ＦａｂのＰＣＲフラグメント、２μＬの９Ｅ１０のＣＨ２ＣＨ３のＰＣＲフラグメント、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、１．２ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する３０μＬの連結反応液において連結した。反応液を２３℃で１時間インキュベーションし、その後、７５℃で１５分間、熱不活性化した。反応液をフェノール・クロロホルム抽出して、酵素を除き、フラグメントを以前に記載されたようにエタノール沈殿し、そして、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ユニットのＮｇｏＭＩＶおよび４ユニットのＡｖｒＩＩからなる２５μＬに再懸濁した。この制限消化により、４Ｄ５ＭＡｂプロタンパク質をｐＬＳＢＣ１７６７にクローン化するための適合性末端がもたらされる。反応液を３７℃で２時間インキュベーションし、２．１Ｋｂのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを以前に記載されたように使用してゲル単離した。ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる約９．７Ｋｂの消化ｐＬＳＢＣ１７６７フラグメントを上記と同じようにして調製し、９．７Ｋｂのフラグメントをゲル電気泳動によって確認した。ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる２．１Ｋｂの４Ｄ５ＭＡｂプロタンパク質を、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６７プラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ１７７３（配列番号９３）を作製した。１０μＬの調製された４Ｄ５プロタンパク質、１５μＬのｐＬＳＢＣ１７６７ベクター、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結物をエタノール沈殿し、これを使用して、エレクトロコンピテントなＪＭ１０９を以前に記載されたように形質転換した。細胞を、５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを選び、これを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、５００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製して、プラスミドを、１００μＬのＥＢ緩衝液を用いて溶出した。クローンは、２．１Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。４Ｄ５ＭＡｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用してｐＬＳＢＣ１７４１クローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、１μＬの１０Ｘ反応緩衝液、２．５μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、１μＬの酵素ミックス、および３．５μＬのプラスミドを含有する５．５μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する４０μＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。４０μＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより駆動され、ＮＯＳターミネーターを含有するＴＭＶ３０Ｋ移動タンパク質を導入遺伝子として発現する植え付け後２６日目〜２７日目のニコチアナ・ベンタミアナ（これは、標準的な形質転換技術によって作製された）に接種した。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、ＭＡｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後６日目に集め、ウエスタンブロット分析によってスクリーニングした。個々の植物に由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織をＧＦ／Ｂの０．８ｍＬ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）に入れ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に３０秒間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。残留する緩衝液を捨て、組織をプレート遠心分離機における４００ｒｐｍで３０秒間の遠心分離によって乾燥させた。ＩＦ画分が、プレート遠心分離機における３Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって９６ウエルマイクロプレートに回収される。サンプルを、４Ｄ５の重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの存在を確認するためにウエスタンブロット分析に供し、また、予想される鎖間ジスルフィド結合の存在を明らかにするために還元条件下および非還元条件下で泳動した。２０μＬのＩＦサンプルを、１０％の２−メルカプトエタノールを含む１Ｘトリス−グリシンサンプル色素、および、２−メルカプトエタノールを含まない１Ｘトリス−グリシンサンプル色素に調節した。２０μＬの各サンプルを２つの別個のＮｏｖｅｘ １０−２０％トリスグリシンゲルに負荷し、続いて、ニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＰＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。一方のメンブランを１：３０００希釈のヤギ抗マウスκ−ＨＲＰ標識血清で室温において１時間プローブし、２枚目のメンブランを１：３０００希釈のヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ標識血清（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＰＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。抗κ血清では、約２５ＫＤａのタンパク質が還元サンプルについて検出され、約１５０ＫＤａのバンドが非還元サンプルについて検出された。このことは、鎖間ジスルフィド架橋および組み立てられた４Ｄ５モノクローナル抗体の存在を示している。抗γ血清では、約５０ＫＤａのタンパク質が還元サンプルについて検出され、約１５０ＫＤａのバンドが非還元サンプルについて検出された。このことは、鎖間ジスルフィド架橋および組み立てられた４Ｄ５モノクローナル抗体の存在を示している。γ重鎖およびκ軽鎖からなるジスルフィド連結された４Ｄ５ＭＡｂヘテロダイマーの存在が明らかにされた。
（実施例１５）
（キメラなマウス−ヒト９ｅ１０ＦＡＢのクローニング）
長いポリＡ領域を含有する配列について濃縮されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）２５（Ｄｙｎａｌ、Ｏｓｌｏ、ノルウエー）を使用してヒト脾臓の総ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）から単離した。ＲＮＡを４℃で１５分間の１５Ｋｒｐｍでの遠心分離によってペレット化し、上清を除き、１ｍＬの７０％エタノールを加えた。サンプルを、４℃で１５分間、１５Ｋｒｐｍで遠心分離して、上清を除き、ペレットを１μｇ／ｍＬの濃度でヌクレアーゼ非含有水（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）に再懸濁した。上記の調製された総ＲＮＡの４μｇをヌクレアーゼ非含有水で２０μＬに調節し、６５℃で２分インキュベーションし、直ちに結合緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１．０Ｍ ＬｉＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ）中の２０μＬの磁石ビーズに加えた。ＲＮＡおよびビーズの混合物を、絶えず回転させながら５分インキュベーションした。非結合物を含有する上清を除き、ビーズを１００μＬの洗浄緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．１５Ｍ ＬｉＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で洗浄した。相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を４０μＬの反応液において合成した。反応液は、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、７５ｍＭのＫＣｌ、３ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＤＴＴ、２ユニットのＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）、２０ユニットのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、０．５ｍＭのｄＡＴＰ、０．５ｍＭのｄＣＴＰ、０．５ｍＭのｄＧＴＰ、０．５ｍＭのｄＴＴＰ、および上記から得られたオリゴｄＴ結合ＲＮＡを含有した。ｃＤＮＡ反応液は、絶えず回転させながら４２℃で６０分間インキュベーションされた。ヒト重鎖γ定常領域（ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３）を、上流側プライマーｈＣＨ１５’ｓｒ（配列番号１９）（これはγ定常鎖の５’末端にアニーリングし、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＧＣ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるようにされている）と、下流側プライマーｈＣＨ３ａｖｒ３’（配列番号２０）（これはγ定常鎖の３’末端にアニーリングし、その後のクローニングのために終結コドンの下流側にＡｖｒＩＩ部位を含む）とを用いてＰＣＲ増幅した。５０μＬのＰＣＲ反応液は、０．４μＭのｈＣＨ１５’ｓｒ、０．４μＭのｈＣＨ３ａｖｒ３’、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および２μＬの調製されたｃＤＮＡを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、４８℃で３０秒間、７２℃で４５秒間からなる３０サイクル、そして７２℃で５分のインキュベーションで増幅された。所望される約１．０Ｋｂのフラグメントの増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。増幅されたヒト重鎖定常ドメインを製造者の説明書に従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐｈＣＨＴＯＰＯ（配列番号５７）を作製した。簡単に記載すると、１μＬのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液、および２μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を氷上に置き、２５μＬの化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞を連結液に加え、混合物を氷上で１０分間インキュベーションした。形質転換反応液を、４２℃で３０秒間インキュベーションすることによって熱ショック処理して、直ちに氷上に置き、２５０μＬのＳＯＣを加えた。形質転換は、２０分間の２００ｒｐｍでの振とうを行いながら３７℃でインキュベーションすることによって回復させられた。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、１４ｍＬの培養チューブにおいて、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する４．０ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）に接種し、３７℃および３００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、ＱＩＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製した。簡単に記載すると、細胞をプレート遠心分離機において３Ｋｒｐｍで１５分間の遠心分離によってペレット化した。上清を細胞ペレットから捨て、細胞をボルテックス処理によって２５０μＬのＰ１緩衝液に再懸濁した。２５０μＬのＰ２を細胞に加え、倒置することによって混合し、５分間インキュベーションして細胞を溶解した。３５０μＬのＮ３を細胞溶解物に加え、倒置することによって混合し、遠心分離機で、１５Ｋｒｐｍで１０分間、遠心分離した。上清をＱＩＡｓｐｉｎカラムに移し、遠心分離機で、１４Ｋｒｐｍで１分間、遠心分離した。カラムを０．７５ｍＬのＰＢで洗浄し、その後、０．７５ｍＬのＰＥで２回洗浄し、乾燥した。１００μＬのＥＢ緩衝液を精製プラスミドに加え、１分間インキュベーションし、続いて、１５Ｋｒｐｍで１分間、遠心分離して、精製プラスミドを溶出した。精製されたｐｈＣＨＴＯＰＯプラスミドは、ヒトγＩｇＧ１重鎖定常配列を確認するために、標準的な方法を使用する核酸決定に供された。
ＫＰ６プロペプチドコード配列を、上流側プライマーＫＰ６ｖ１５’ｓｒ（これは、ＫＰ６プロペプチドコード配列の５’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＧＣＧ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計された）と、下流側プライマーＫＰ６ｖ１３’ｓｒ（配列番号２４）（これは、ＫＰ６プロペプチドコード配列の３’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＣ」の５’伸張（式中、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計された）とを用いてプラスミドｐＬＳＢＣ１７３１からＰＣＲ増幅した。あるいは、ＫＰ６プロペプチドコード配列を、上流側プライマーＫＰ６ｖ１５’ｓｒと、下流側プライマーＫＰ６ｖ２３’ｓｒ（配列番号１５）（これは、ＫＰ６プロペプチドコード配列の３’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＣ」の５’伸張（式中、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計された）とを用いてプラスミドｐＬＳＢＣ１７３１からＰＣＲ増幅した。ヒトκ軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を、上流側プライマーＨｕＣＬ５’ｓｒ（配列番号２１）（これは（ＣＬ）ドメインの５’末端にアニーリングし、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＧ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるようにされている）と、下流側プライマーＨｕＣＬ３’ｓｒ（配列番号２２）（これは、（ＣＬ）ドメインの３’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＧＣ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計されている）とを用いてプラスミドｈｕｓｃＦａｂｍ１Ａ６（配列番号５９）からＰＣＲ増幅した。あるいは、ヒトκ軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）を、上流側プライマーＨｕＣＬ５’ｓｒと、下流側プライマーＨｕＣＬｖ２３’ｓｒ（配列番号１６）（これは、（ＣＬ）ドメインの３’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＧＣ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計されている）とを用いてプラスミドｈｕｓｃＦａｂｍ１Ａ６（配列番号５９）からＰＣＲ増幅した。別個の５０μＬのＰＣＲ反応液は、０．４μＭの上流側プライマー、０．４μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０１μＬのテンプレートプラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で２０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で２分、増幅された。所望される約１２０ｂｐのＫＰ６プロペプチドコード配列および３００ｂｐのヒトκＣＬ配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
９Ｅ１０の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を、上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’（配列番号１０）（これは、α−アミラーゼのシグナルペプチドを含有するベクターｐＬＳＢＣ１７６７へのクローニングのために適合し得るＮｇｏＭＩＶ部位を含有する）と、下流側プライマー９Ｅ１０Ｌ３’ｓｒ（配列番号１１）（これは、（ＶＬ）ドメインの３’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＧＣ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計されている）とを用いてプラスミドｐＬＳＢＣ１７３６からＰＣＲ増幅した。ＮｇｏＭＩＶ部位はシグナルペプチドを軽鎖の９Ｅ１０可変領域のＦＲ１に連結して、ＥＲへの人工プロタンパク質の分泌を行わせる。９Ｅ１０の重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を、上流側プライマー９Ｅ１０Ｈ５’ｓｒｓ（配列番号１２）（これはＣ配列の５’末端にアニーリングし、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＧＧ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンである）が生じるようにされている）と、下流側プライマー９Ｅ１０Ｈ３’ｓｒ（配列番号１３）（これはＶＨコード配列の３’末端にアニーリングし、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＧ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるようにされている）とを用いてプラスミドｐＬＳＢＣ１７３６からＰＣＲ増幅した。
ヒト重鎖γ定常領域（ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３）を、上流側プライマーｈＣＨ１５’ｓｒと、下流側プライマーｈＣＨ３ａｖｒ３’とを用いてプラスミドｐｈＣＨＴＯＰＯからＰＣＲ増幅した。別個の５０μＬのＰＣＲ反応液を、９Ｅ１０のＶＬ、９Ｅ１０のＶＨｃ、およびｐｈＣＨＴＯＰＯのγ定常ドメインを増幅するために組み立てた。反応液は、０．４μＭの上流側プライマー、０．４μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０１μＬのテンプレートプラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で２０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で２分、増幅された。所望される約３５０ｂｐの９Ｅ１０ＶＬ配列、３８０ｂｐの９Ｅ１０ＶＨ配列、および１．０Ｋｂのヒトγ定常配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
増幅されたＫＰ６プロペプチドコード配列、ヒトκＣＬ配列、９Ｅ１０ＶＬ配列、９Ｅ１０ＶＨ配列およびヒトγ定常配列を、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐ ＰＣＲ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造者の推奨法に従って使用して精製した。簡単に記載すると、等容量のＤＮＡ結合溶液をＰＣＲ産物に加え、混合して、スピンカラムに移した。カラムを、１４Ｋｒｐｍで３０秒間、遠心分離した。カラムを７５０μＬの洗浄緩衝液で２回洗浄し、３０秒間、遠心分離して、乾燥させた。５０μＬの溶出緩衝液をカラムに加え、ＰＣＲフラグメントを１４Ｋｒｐｍで３０秒間の遠心分離によって溶出させた。
精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを別々の２０μＬの連結反応において連結した。第１の反応液は、０．３μＬの９Ｅ１０ＶＬのＰＣＲフラグメント、ＨｕＣＬ３’ｓｒで開始されたヒトκＣＬのＰＣＲフラグメントの１μＬ、ＫＰ６ｖ１３’ｓｒで開始されたＫＰ６プロペプチドのＰＣＲフラグメントの１μＬ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含有した。第２の反応液は、０．３μＬの９Ｅ１０ＶＬのＰＣＲフラグメント、ＨｕＣＬｖ２３’ｓｒで開始されたヒトκＣＬのＰＣＲフラグメントの１μＬ、ＫＰ６ｖ２３’ｓｒで開始されたＫＰ６プロペプチドのＰＣＲフラグメントの１μＬ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含有した。反応液は室温で１時間インキュベーションされた。第１の反応液は上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’および下流側プライマーＫＰ６ｖ１３’ｓｒを用いてＰＣＲ増幅され、第２の反応液は上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’および下流側プライマーＫＰ６ｖ２３’ｓｒを用いてＰＣＲ増幅された。これらは、０．４μＭの上流側プライマー、０．４μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および１μＬのテンプレートプラスミドを含有する５０μＬのＰＣＲ反応液において行われた。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で２０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で２分の最後の工程で増幅された。反応液を、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動した。８００ｂｐのＰＣＲ増幅された９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６フラグメントをゲルから切り出し、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロース片から精製した。簡単に記載すると、３容量のＱＧ緩衝液をゲルフラグメントのそれぞれに加え、混合物を、時々撹拌しながら５０℃で１０分間インキュベーションした。ゲル片の体積に等しい体積のイソプロパノールを、溶解されたゲル片に加え、混合して、カラムに加え、１４Ｋｒｐｍで１分間遠心分離した。カラムを５００μＬの緩衝液ＱＢで洗浄し、その後、７５０μＬのＰＥで洗浄し、精製フラグメントを１０μＬのＥＢにおいて溶出させた。１μＬの９Ｅ１０ＶＨのＰＣＲフラグメント、１μＬのヒトγ重鎖定常ＰＣＲフラグメント、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含有する別個の２０μＬの連結反応液を室温で１時間インキュベーションした。連結液を、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動した。１．４Ｋｂｐの連結された９Ｅ１０ＶＨ−ヒトγ定常フラグメントをゲルから切り出し、以前に記載されたように、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロース片から精製し、精製フラグメントを１０μＬのＥＢにおいて溶出させた。
精製された９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６の９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’−ＫＰ６ｖ１３’ｓｒによる増幅フラグメントと、９Ｅ１０ＶＨ−ヒトγ定常フラグメントとを、９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６の９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’−ＫＰ６ｖ１３’ｓｒによる増幅フラグメントの７μＬ、６μＬの９Ｅ１０ＶＨ−ヒトγ定常フラグメント、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの連結反応液において連結した。別個の反応において、精製された９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６の９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’−ＫＰ６ｖ２３’ｓｒによる増幅フラグメントと、９Ｅ１０ＶＨ−ヒトγ定常フラグメントとを、９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６の９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’およびＫＰ６ｖ２３’ｓｒによる増幅フラグメントの７μＬ、６μＬの９Ｅ１０ＶＨ−ヒトγ定常フラグメント、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの連結反応液において連結した。反応液は室温で１時間インキュベーションされた。反応液は、上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’および下流側プライマーｈＣＨ３ａｖｒ３’を用いて別個の５０μＬの反応液においてＰＣＲ増幅され、０．４μＭの上流側プライマー、０．４μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および１μＬのテンプレートプラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で６０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で２分の最後の工程で増幅された。所望される約２．１Ｋｂの連結生成物の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。ＰＣＲ増幅産物を、以前に記載されたように、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐ ＰＣＲ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の推奨法に従って使用して精製し、３０μＬの水において溶出させた。９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６の９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’−ＫＰ６ｖ１３’ｓｒによる増幅フラグメントと、９Ｅ１０ＶＨ−ヒトγ定常フラグメントとの連結から得られたＰＣＲ増幅産物を、製造者の説明書に従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ１−１（配列番号６１）を作製した。別個の反応において、９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６の９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’−ＫＰ６ｖ２３’ｓｒによる増幅フラグメントと、９Ｅ１０ＶＨ−ヒトγ定常フラグメントとの連結から得られたＰＣＲ増幅産物を、製造者の説明書に従ってｐＣＲ４−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１（配列番号６３）を作製した。簡単に記載すると、０．５μＬのＰＣＲ産物、１μＬのベクター、１μＬの塩溶液、および２．５μＬの水を混合して、室温で５分間インキュベーションした。連結液を氷上に置き、２５μＬの化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞を連結液に加え、混合物を氷上で１０分間インキュベーションした。形質転換反応液を、４２℃で３０秒間インキュベーションすることによって熱ショック処理して、直ちに氷上に置き、２５０μＬのＳＯＣを加えた。形質転換は、２０分間の２００ｒｐｍでの振とうを行いながら３７℃でインキュベーションすることによって回復させられた。形質転換液を、アンピシリンを含有するＬＢ平板に置床して、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、１４ｍＬの培養チューブにおいて、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する４．０ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）に接種し、３７℃および３００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製し、５０μＬのＥＢにおいて溶出させた。精製されたｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ１−１プラスミドおよびｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１プラスミドは、標準的な方法を使用する核酸決定に供された。
キメラな９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６−９Ｅ１０ＶＨをコードする配列を、プラスミドｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ１−１およびプラスミドｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１から、上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’および下流側プライマー９Ｅ１０Ｈ３’ｓｒを用いた別々の反応液においてＰＣＲ増幅した。ヒト重鎖γ定常領域（ＣＨ１ＣＨ２ＣＨ３）を、上流側プライマーｈＣＨ１５’ｓｒおよび下流側プライマーｈＣＨ３ａｖｒ３’を用いてプラスミドｐｈＣＨＴＯＰＯからＰＣＲ増幅した。別々の５０μＬのＰＣＲ反応液は、０．４μＭの上流側プライマー、０．４μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．５μＬのテンプレートプラスミドを含有した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で４０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で２分間の最後の工程で増幅された。所望される約１．１Ｋｂの９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６−９Ｅ１０ＶＨコード配列および１．０Ｋｂのヒトγ定常配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。ＰＣＲ増幅産物を、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動した。１．１Ｋｂの９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６−９Ｅ１０ＶＨコード配列および１．０Ｋｂのヒトγ定常配列をゲルから切り出し、以前に記載されたように、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロース片から精製し、精製フラグメントを１０μＬのＥＢにおいて溶出させた。プラスミドｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ１−１から増幅され、精製された１．１Ｋｂの９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６−９Ｅ１０ＶＨコード配列と、精製された１．０Ｋｂのヒトγ定常配列フラグメントとを、１．５μＬの各フラグメント、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの連結反応液において連結した。反応液は室温で２時間インキュベーションされた。別個の反応において、プラスミドｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１から増幅され、精製された１．１Ｋｂの９Ｅ１０ＶＬ−ヒトＣＬ−ＫＰ６−９Ｅ１０ＶＨコード配列と、精製された１．０Ｋｂのヒトγ定常配列フラグメントとを、１．５μＬの各フラグメント、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのポリヌクレオチドキナーゼを含有する２０μＬの連結反応液において連結した。反応液は室温で２時間インキュベーションされた。反応液を７５℃で１５分間インキュベーションして、酵素を不活性化した。２０μＬの連結反応液を、５０ｍＭ酢酸ナトリウム、２０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ酢酸マグネシウムに調節し、続いて、１０ユニットのＮｇｏＭＩＶ、４ユニットのＡｖｒＩＩおよび１０ユニットのＤｐｎＩを用いて３７℃で２時間、消化した。この制限消化により、９Ｅ１０キメラＭＡｂプロタンパク質をｐＬＳＢＣ１７６７にクローン化するための適合性末端が作製される。反応物を、以前に記載されたように、ＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを使用してゲル単離した。ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。ｐＬＳＢＣ１７６７から得られる約２．１Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる消化フラグメントを上記と同様にして調製し、２．１Ｋｂのフラグメントをアガロースゲル電気泳動によって確認した。
ｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ１−１に由来する２．１Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる９Ｅ１０キメラＭＡｂプロタンパク質を、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６７プラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ２５００を作製した。ｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１に由来する２．１Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる９Ｅ１０キメラＭＡｂプロタンパク質を、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６７プラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ２５０２を作製した。６μＬの調製されたインサート、２μＬのｐＬＳＢＣ１７６７ベクター、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する別々の３０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。エレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞への細菌形質転換を、以前に記載されたようにＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製し、５０μＬの緩衝液ＥＢを用いて溶出した。クローンは、２．１Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。ｐＳＬＢＣ２５００およびｐＳＬＢＣ２５０２における９Ｅ１０キメラＭＡｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
（ｐＳＬＢＣ２５０５の構築）
９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質をコードする配列を、上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’および下流側プライマーｈＣＨＣ２ａｖｒ３’（配列番号２５）（これはＣＨ１コード配列の３’末端にアニーリングし、終結コドン、および、その後に、ベクターｐＬＳＢＣ１７６７へのクローニングのために適合し得るＡｖｒＩＩ部位を含む）を用いてプラスミドｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１からＰＣＲ増幅した。ｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１に由来する９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質コード配列を５０μＬの反応液においてＰＣＲ増幅した。反応液は、０．８μＭの上流側プライマー、０．８μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０５μＬのテンプレートプラスミドを含有する。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で１５秒間、７２℃で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で２分の最後の工程で増幅された。所望される約１．４Ｋｂの９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。ＰＣＲ増幅産物を、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動し、増幅された１．４Ｋｂの９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質コード配列を、以前に記載されたように、Ｓｔｒａｔａｐｒｅｐ ＰＣＲ精製キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を製造者の推奨法に従って使用して精製した。調製されたＰＣＲ増幅産物はそれぞれがＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩで消化された。３μＬの調製されたＰＣＲフラグメント、１０ユニットのＮｇｏＭＩＶ、４ユニットのＡｖｒＩＩ、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴを含有する２０ｕＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。消化生成物を、ＴＡＥおよび０．５μｇ／ｍＬの臭化エチジウムを用いて１％アガロースゲルで電気泳動した。１．４Ｋｂの９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質コード配列をゲルから切り出し、以前に記載されたようにＭｉｎＥｌｕｔｅゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロース片から精製し、精製フラグメントを１０μＬのＥＢにおいて溶出させた。
ｐ９Ｅ１０ｃｈｉｍｅｒｉｃｖ２−１に由来する、９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’プライマーおよびｈＣＨＣ２ａｖｒ３’プライマーにより増幅された１．４Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩのＰＣＲ増幅９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質を、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６７プラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ２５０５を作製した。４μＬの調製されたインサート、２μＬのｐＬＳＢＣ１７６７ベクター、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する３０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。エレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞への細菌形質転換を、以前に記載されたようにＧｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行った。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製し、５０μＬの緩衝液ＥＢを用いて溶出した。クローンは、１．４Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。ｐＳＬＢＣ２５０５における９Ｅ１０キメラＭＡｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
（実施例１６）
（プロペプチド配列変化体を含有するＦＡＢのクローニングおよび発現分析）
（ｐＬＳＢＣ２５１１（配列番号６５）およびｐＬＳＢＣ２５１２（配列番号６７）の構築）
９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質をコードする配列を、上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’および下流側プライマーｃｈ１Ｃｔａｖｒ３’（配列番号１８）（これはＣＨ１コード配列の３’末端にアニーリングし、終結コドン、および、その後に、ベクターｐＬＳＢＣ１７６６（配列番号８９）へのクローニングのためのＡｖｒＩＩ部位を含む）を用いてプラスミドｐＬＳＢＣ２５００からＰＣＲ増幅した。あるいは、９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質をコードする配列を、上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’および下流側プライマーｃｈ１Ｃｔａｖｒ３’を用いてプラスミドｐＬＳＢＣ２５０５からＰＣＲ増幅した。ｐＬＳＢＣ２５００およびｐＬＳＢＣ２５０５から得られる９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質コード配列を、０．８μＭの上流側プライマー、０．８μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０３μＬのテンプレートプラスミドを含有する別個の反応液においてＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で１分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる１５サイクル、そして７２℃で５分の最後の工程で増幅された。ｐＬＳＢＣ２５００およびｐＬＳＢＣ２５０５の所望される約１．４Ｋｂの９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質コード配列の増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。一連のフェノール・クロロホルム抽出およびエタノール沈殿が、以前に記載されたように、ＰＣＲ増幅産物に対して行われた。ｐＬＳＢＣ２５００およびｐＬＳＢＣ２５０５の調製されたＰＣＲ増幅産物はそれぞれがＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩで消化された。１０μＬの調製されたＰＣＲフラグメント、１０ユニットのＮｇｏＭＩＶ、４ユニットのＡｖｒＩＩ、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴを含有する別個の２５ｕＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションして、１．０％アガロースゲルで電気泳動した。ゲルを、ＧｅｌＳｔａｒ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造者の説明書に従って用いて染色した。約１．４Ｋｂのフラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロースから単離した。ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩによる消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。
ｐＬＳＢＣ２５００に由来する１．４Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製された９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質を、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６６プラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ２５１１（配列番号６５）を作製した。ｐＬＳＢＣ２５０５に由来する１．４Ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製された９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質を、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６６プラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ２５１２（配列番号６７）を作製した。ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製された９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質インサートの１０μＬ、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６６の０．４μｇ、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する別個の５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結反応液を、４容量のエタノールおよび０．６７容量の５Ｍ酢酸ＮＨ４を用いてエタノール沈殿し、遠心分離によってペレット化し、７０％エタノールで洗浄した。洗浄されたペレットを６μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
（ｐＬＳＢＣ２５１４（配列番号６９）の構築）
ＫＰ６プロペプチドコード配列を、上流側プライマーＫＰ６ｖ１５’ｓｒ（配列番号２３）と、下流側プライマーｎａｔＫｐ６Ｃｔ３’（配列番号２８）（これは、ＫＰ６プロペプチドコード配列の３’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＧＣＣ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計された）とを用いてプラスミドｐＬＳＢＣ２５００からＰＣＲ増幅した。９Ｅ１０キメラ軽鎖を、上流側プライマー９Ｅ１０Ｌｎｇｏ５’と、下流側プライマーＮａｔＫｐ６Ｎｔ３’（配列番号２６）（これは、ＫＰ６プロペプチドコード配列の５’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＧＣ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計された）とを用いてプラスミドｐＬＳＢＣ２５００からＰＣＲ増幅した。ＮｇｏＭＩＶ部位はシグナルペプチドを９Ｅ１０可変軽鎖領域のＦＲ１に連結し、ＥＲへの人工プロタンパク質の分泌を行わせる。９Ｅ１０キメラＦｄ重鎖（ＶＨＣＨ１）を、下流側プライマーｃｈ１Ｃｔａｖｒ３’と、上流側プライマーＮａｔＫｐ６Ｃｔ５’（配列番号２７）（これは、ＫＰ６プロペプチドコード配列の５’末端にアニーリングして、その結果、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼの３’から５’へのエキソヌクレアーゼ活性による処理により、「ＣＧＧ」の５’伸張（式中、「Ｇ」はグアニンであり、「Ｃ」はシトシンである）が生じるように設計された）とを用いてプラスミドｐＬＳＢＣ２５００からＰＣＲ増幅した。ＫＰ６プロペプチドコード配列、９Ｅ１０キメラＦｄ重鎖配列、および９Ｅ１０キメラκ軽鎖配列を、０．８μＭの上流側プライマー、０．８μＭの下流側プライマー、ＭｇＣｌ２を伴う１ＸのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、１．８ユニットのＥｘｐａｎｄ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙポリメラーゼ、および０．０３μＬのテンプレートプラスミドを含有する別個の２５μＬのＰＣＲ反応液において増幅した。ＰＣＲ反応液は、９７℃で２分間、その後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で１分間からなる１５サイクル、そして７２℃で２分の最後の工程で増幅された。所望される約１００ｂｐのＫＰ６プロペプチドフラグメント、７００ｂｐの９Ｅ１０キメラＦｄフラグメント、および７００ｂｐの９Ｅ１０キメラ軽鎖フラグメントの増幅がアガロースゲル電気泳動によって確認された。
ＰＣＲ増幅されたＫＰ６プロペプチドコードフラグメント、９Ｅ１０キメラ重鎖Ｆｄフラグメント、および９Ｅ１０キメラκ軽鎖フラグメントをＤｐｎＩで消化した。５ユニットのＤｐｎＩを各ＰＣＲ反応液に加え、３７℃で１時間インキュベーションし、その後、８０℃で２０分間インキュベーションした。ＤｐｎＩ消化されたＰＣＲフラグメントをフェノール・クロロホルム抽出し、その後、エタノール沈殿した。ペレットを２０μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
精製されたＰＣＲ増幅フラグメントを２０μＬの連結反応液において連結した。反応液は、１８ｎｇのＫＰ６プロペプチドフラグメント、１２６ｎｇの９Ｅ１０キメラＦｄフラグメント、１２６ｎｇの９Ｅ１０キメラ軽鎖フラグメント、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのＡＴＰ、０．６ユニットのＴ４ＤＮＡポリメラーゼ、１．２ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および１．２ユニットのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを含有した。反応液を２３℃で１．５時間インキュベーションし、その後、７５℃で１５分間、熱不活性化した。所望される約１．４Ｋｂの９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質フラグメントの連結がアガロースゲル電気泳動によって確認された。一連のフェノール・クロロホルム抽出を、連結生成物に対して行い、その後、エタノール沈殿した。ペレットを、１０ユニットのＮｇｏＭＩＶ、４ユニットのＡｖｒＩＩ、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１ｍＭのＤＴＴを含有する２５μＬの反応液において消化した。消化液を３７℃で２時間インキュベーションして、１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約１．４Ｋｂのフラグメントを分離した。ゲルはＧｅｌＳｔａｒ（Ｃａｍｂｒｅｘ Ｂｉｏ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で染色され、約１．４Ｋｂのフラグメントを単離した。フラグメントを、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを製造者の説明書に従って使用してアガロースから精製した。ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩによる消化フラグメントの回収がゲル電気泳動によって確認された。ｐＬＳＢＣ２５００から得られる調製された１．４ｋｂの、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製された９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質を、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６６プラスミドにクローン化して、ｐＬＳＢＣ２５１４（配列番号６９）を作製した。ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製された９Ｅ１０−ＨｕｍキメラＦａｂフラグメントの１５μＬ、ＮｇｏＭＩＶ／ＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６６の０．４μｇ、８００ユニットのＴ４ＤＮＡリガーゼ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２５μｇ／ｍＬのＢＳＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭのＡＴＰを含有する５０μＬの連結反応液を１４℃で一晩インキュベーションした。連結反応液をエタノール沈殿し、ペレットを６μＬの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ８．０）に再懸濁した。
（ｐＬＳＢＣ２５１１、ｐＬＳＢＣ２５１２およびｐＬＳＢＣ２５１４）
ｐＬＳＢＣ２５１１、ｐＬＳＢＣ２５１２およびｐＬＳＢＣ２５１４の各連結物を別々の反応液において使用して、エレクトロコンピテントなＪＭ１０９細胞を形質転換した。形質転換は、以前に記載されたように、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒエレクトロポレーター（ＢｉｏＲａｄ）を用いて行われた。個々のコロニーを選び、これを使用して、１４ｍＬチューブにおいて、２００μｇ／ｍＬのカルベニシリンを含有する４ｍＬのＬＢに接種し、３７℃および３００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたように、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製して、５０μＬの緩衝液ＥＢを用いて溶出した。クローンは、１．４Ｋｂのインサートフラグメントおよび９．７Ｋｂのベクターフラグメントを含有することが、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩを用いた制限酵素マッピング、その後のアガロースゲル電気泳動によって確認された。９Ｅ１０キメラＦａｂプロタンパク質は、配列を確認するために、標準的な方法を使用して配列決定された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用して、ｐＬＳＢＣ２５１１クローン、ｐＬＳＢＣ２５１２クローンおよびｐＬＳＢＣ２５１４クローンからインビトロで合成した。簡単に記載すると、２μＬの１０Ｘ反応緩衝液、１０μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、２μＬの酵素ミックス、および４μＬのプラスミドを含有する２０μＬの反応液を３７℃で１時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する２００μＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。２００μＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターにより駆動され、ＮＯＳターミネーターを含有するＴＭＶ３０Ｋ移動タンパク質を導入遺伝子として発現する植え付け後２２日目の４つのニコチアナ・ベンタミアナ（これは、標準的な形質転換技術によって作製された）に接種した。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、Ｆａｂタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後７日目に集め、クーマシー染色されたタンパク質ゲルによってスクリーニングした。４つの個々の植物のそれぞれに由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織をＧＦ／Ｂの０．８ｍＬ Ｕｎｉｆｉｌｔｅｒ（Ｗｈａｔｍａｎ、Ｃｌｉｆｔｏｎ、ＮＪ）に入れ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）で覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に３０秒間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。残留する緩衝液を捨て、組織をプレート遠心分離機における４００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって乾燥させた。ＩＦ画分が、プレート遠心分離機における３Ｋｒｐｍで１０分間の遠心分離によって９６ウエルマイクロプレートに回収された。２０μＬの各ＩＦサンプルを、還元性ゲルについては１０％の２−メルカプトエタノールを含有する５μＬの５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、その後、２分間、煮沸した。サンプルは１０〜２０％のグラジエントＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離され、タンパク質をクーマシーＲ−２５０ブリリアントブルー染色によって検出した。約２５ＫＤａおよび２７ＫＤａにおける還元性ゲルのタンパク質結合は、所望される２５ＫＤａ重鎖Ｆｄおよび２７ＫＤａ軽鎖の存在を示している。
（実施例１７）
（アグロインフィルトレーション（ａｇｒｏｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）による植物細胞における９Ｅ１０ＦＡｂのプレプロタンパク質発現）
ｐＬＳＢＣ１７３６から得られる９Ｅ１０のＦＡｂ構築物が、ＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩの制限酵素を使用して、ｐＢＩ１２１由来のＴ−ＤＮＡベクター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．他、ＥＭＢＯ Ｊ、６（１９８７）、３９０１〜３９０７）に導入される。この場合、発現が３５Ｓプロモーターによって駆動されるように、ＧＵＳ遺伝子がＦＡｂ配列によって置換される。Ｔ−ＤＮＡ構築物は、ｐＣＨ３２（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｍ．他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３（１９９６）、９９７５〜９）を保有するアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｃ５８Ｃ１株にエレクトロポレーションによって形質転換される。アグロバクテリウムは培養で成長させられ、ニコチアナ・ベンタミアナの葉をアグロインフィルトレーションするために使用される（Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｒ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４（１９９６）、２０６３〜５；Ｔａｎｇ，Ｘ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４（１９９６）、２０６０〜３；Ｂｅｎｄａｌｍａｎｅ，Ａ．他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１１（１９９９）、７８１〜７９１）。２日後、タンパク質が葉から抽出され、得られた抽出物は、所望される遺伝子産物の発現を分析するために、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、あるいは逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。
（実施例１８）
（遺伝子組換え植物における植物細胞での９Ｅ１０ＦＡｂのプレプロタンパク質発現）
実施例１７から得られるＴ−ＤＮＡ構築物を保有するアグロバクテリウム株を使用して、ニコチアナ・ベンタミアナの葉ディスクが形質転換され、遺伝子組換え植物が再生させられる（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７（１９８５）、１２２９〜１２３１）。遺伝子組換え植物から得られる葉は、ＦＡｂを得るために抽出される。得られた抽出物は、所望される遺伝子産物の発現を分析するために、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、あるいは逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。
（実施例１９）
（アグロインフィルトレーションによる植物細胞における４Ｄ５モノクローナル抗体のプレプロタンパク質発現）
ｐＬＳＢＣ１７７３から得られる４Ｄ５のＭＡｂ構築物が、ＰａｃＩおよびＡｖｒＩＩの制限酵素を使用して、ｐＢＩ１２１由来のＴ−ＤＮＡベクター（Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ，Ｒ．Ａ．他、ＥＭＢＯ Ｊ、６（１９８７）、３９０１〜３９０７）に導入される。この場合、発現が３５Ｓプロモーターによって駆動されるように、ＧＵＳ遺伝子がＦＡｂ配列によって置換される。Ｔ−ＤＮＡ構築物は、ｐＣＨ３２（Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｃ．Ｍ．他、Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ、９３（１９９６）、９９７５〜９）を保有するアグロバクテリウムＣ５８Ｃ１株にエレクトロポレーションによって形質転換される。アグロバクテリウムは培養で成長させられ、ニコチアナ・ベンタミアナの葉をアグロインフィルトレーションするために使用される（Ｓｃｏｆｉｅｌｄ，Ｓ．Ｒ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４（１９９６）、２０６３〜５；Ｔａｎｇ，Ｘ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７４（１９９６）、２０６０〜３；Ｂｅｎｄａｌｍａｎｅ，Ａ．他、Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ、１１（１９９９）、７８１〜７９１）。２日後、タンパク質が葉から抽出され、得られた抽出物は、所望される遺伝子産物の発現を分析するために、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、あるいは逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。
（実施例２０）
（遺伝子組換え植物における植物細胞での４Ｄ５モノクローナル抗体のプレプロタンパク質発現）
実施例１９から得られるＴ−ＤＮＡ構築物を保有するアグロバクテリウム株を使用して、ニコチアナ・ベンタミアナの葉ディスクが形質転換され、遺伝子組換え植物が再生させられる（Ｈｏｒｓｃｈ，Ｒ．Ｂ．他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２２７（１９８５）、１２２９〜１２３１）。遺伝子組換え植物から得られる葉は、ＦＡｂを得るために抽出される。得られた抽出物は、所望される遺伝子産物の発現を分析するために、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、あるいは逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。
（実施例２１）
（４Ｄ５ＭＡｂで形質転換されたＣＨＯ細胞のプレプロタンパク質発現）
ベクターｐＣ４が、４Ｄ５ＭＡｂプレプロタンパク質を発現させるために使用される。プラスミドｐＣ４はプラスミドｐＳＶ２−ｄｈｆｒ（ＡＴＣＣアクセション番号３７１４６）の誘導体である。このプラスミドはマウスのＤＨＦＲ遺伝子をＳＶ４０初期プロモーターの制御下に含有する。これらのプラスミドでトランスフェクションされている、ジヒドロ葉酸活性を有しないチャイニーズハムスター卵巣細胞または他の細胞を、化学療法剤メトトレキサートが補充された選択培地（α−ＭＥＭ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で細胞を成長させることによって選択することができる。メトトレキサート（ＭＴＸ）に対して耐性の細胞におけるＤＨＦＲ遺伝子の増幅が広く報告されている（例えば、Ａｌｔ，Ｆ．Ｗ．、Ｋｅｌｌｅｍｓ，Ｒ．Ｍ．、Ｂｅｒｔｉｎｏ，Ｊ．Ｒ．およびＳｃｈｉｍｋｅ，Ｒ．Ｔ．、Ｊ Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３：１３５７〜１３７０（１９７８）；Ｈａｍｌｉｎ，Ｊ．Ｌ．およびＭａ，Ｃ．、Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ、１０９７：１０７〜１４３（１９９０）；Ｐａｇｅ，Ｍ．Ｊ．およびＳｙｄｅｎｈａｍ，Ｍ．Ａ．、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：６４〜６８）（１９９１）を参照のこと）。ＭＴＸの濃度を増大させた際に成長する細胞は、ＤＨＦＲ遺伝子の増幅の結果として標的酵素（ＤＨＦＲ）を過剰産生することによって薬物に対する耐性を発達させる。第２の遺伝子がＤＨＦＲ遺伝子に関連づけられている場合、第２の遺伝子は、通常、同時に増幅され、かつ過剰発現する。この方法を使用して、１，０００コピーを超える増幅された遺伝子を保有する細胞株を開発され得ることがこの分野では知られている。その後、メトトレキサートが取り去られたとき、宿主細胞の１つまたは複数の染色体に組み込まれている増幅された遺伝子を含有する細胞株が得られる。
プラスミドｐＣ４は、目的とする遺伝子を発現させるために、ラウス肉腫ウイルスの長末端反復（ＬＴＲ）の強いプロモーター（Ｃｕｌｌｅｎ他、Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．、５：４３８〜４４７（１９８５））、および、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の即時初期遺伝子のエンハンサーから単離されたフラグメント（Ｂｏｓｈａｒｔ他、Ｃｅｌｌ、４１：５２１〜５３０（１９８５））を含有する。プロモーターの下流側には、遺伝子の組み込みを可能にする、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩおよびＡｓｐ７１８の制限酵素切断部位が存在する。これらのクローニング部位の後には、プラスミドは、ラットインスリン遺伝子の３’イントロンおよびポリアデニル化部位を含有する。他の高効率プロモーターもまた、発現のために使用することができる：例えば、ヒトβ−アクチンプロモーター、ＳＶ４０の初期プロモーターもしくは後期プロモーター、または他のレトロウイルス（例えば、ＨＩＶおよびＨＴＬ ＶＩ）から得られる長末端反復。Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社のＴｅｔ−ＯｆｆおよびＴｅｔ−Ｏｎの遺伝子発現システム、ならびに類似するシステムを、哺乳動物細胞において、調節された様式で４Ｄ５ＭＡｂプレプロタンパク質を発現させるために使用することができる（Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．＆Ｂｕｊａｒｄ，Ｈ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９：５５４７〜５５５１（１９９２））。ｍＲＮＡのポリアデニル化のために、例えば、ヒトの成長ホルモン遺伝子またはグロビン遺伝子に由来する他のシグナルも同様に使用することができる。染色体に組み込まれた目的とする遺伝子を保有する安定な細胞株もまた、ｇｐｔ、Ｇ４１８またはヒグロマイシンなどの選択マーカーを用いた同時トランスフェクションのときに選択することができる。開始時に２つ以上の選択マーカー（例えば、Ｇ４１８＋メトトレキサート）を使用することは好都合である。
プラスミドｐＣ４は制限酵素のＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化され、次いで、この分野で知られている手法によって子ウシ小腸ホスファターゼを使用して脱リン酸化される。その後、ベクターが１％アガロースゲルから単離される。
そのリーダー配列を含む完全な４Ｄ５ＭＡｂプレプロタンパク質遺伝子をコードするＤＮＡ配列が、遺伝子の５’配列および３’配列に対応するＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーを使用して増幅される。５’プライマーは、ＢａｍＨＩ制限酵素部位、および、その後に、Ｋｏｚａｋ，Ｍ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１９６：９４７〜９５０（１９８７））によって記載されるような、真核生物における翻訳開始のための効率的なシグナル、および、４Ｄ５ＭＡｂプレプロタンパク質の配列の１７塩基を含有する配列を有する。３’プライマーは、Ａｓｐ７１８Ｉ制限部位、および、その後に、４Ｄ５ＭＡｂプレプロタンパク質遺伝子の３’末端に対して相補的なヌクレオチドを含有する配列を有する。
増幅されたフラグメントは制限酵素のＢａｍＨＩおよびＡｓｐ７１８Ｉで消化され、１％アガロースゲルで精製される。その後、単離されたフラグメントおよび脱リン酸化されたベクターが、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結される。その後、大腸菌のＨＢ１０１細胞またはＸＬ−１Ｂｌｕｅ細胞が形質転換され、プラスミドｐＣ４に挿入されたフラグメントを含有する細菌が、例えば、制限酵素分析を使用して同定される。
活性なＤＨＦＲ遺伝子を有しないチャイニーズハムスター卵巣細胞がトランスフェクションのために使用される。５．ｍｕ．ｇの発現プラスミドｐＣ４が、リポフェクションを使用して０．５．ｍｕ．ｇのプラスミドｐＳＶ２−ｎｅｏと同時トランスフェクションされる（Ｆｅｌｇｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８４：７４１３〜７４１７（１９８７））。プラスミドｐＳＶ２ｎｅｏは優勢な選択マーカー（Ｇ４１８を含む一群の抗生物質に対する耐性を付与する酵素をコードするＴｎ５由来のｎｅｏ遺伝子）を含有する。細胞は、１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されたα−ＭＥＭに播種される。２日後、細胞はトリプシン処理され、１０ｎｇ／ｍｌ、２５ｎｇ／ｍｌまたは５０ｎｇ／ｍｌのメトトレキサート＋１ｍｇ／ｍｌのＧ４１８が補充されたα−ＭＥＭにおいてハイブリドーマクローニングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、ドイツ）に播種される。約１０日後〜１４日後、単一コロニーがトリプシン処理され、その後、異なる濃度のメトトレキサート（５０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、４００ｎＭ、８００ｎＭ）を使用する６ウエルのペトリディッシュまたは１０ｍｌのフラスコに播種される。最大濃度のメトトレキサートで成長するクローンが、その後、さらにより高い濃度のメトトレキサート（１．ｍｕ．Ｍ、２．ｍｕ．Ｍ、５．ｍｕ．Ｍ、１０．ｍｕ．Ｍ、２０．ｍｕ．Ｍ）を含有する新しい６ウエルプレートに移される。同じ手順が、１００．ｍｕ．Ｍ〜２００．ｍｕ．Ｍの濃度で成長するクローンが得られるまで繰り返される。所望される遺伝子産物の発現が、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣ分析によって分析される。
Figure 2006506056
Figure 2006506056
 （実施例２２）
（植物における抗体の最適化、スクリーニングおよび産生）
抗体または抗体フラグメント（Ｆａｂ）の親和性または活性が、Ｃａｒｔｅｒ他（１９９２）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、第８９巻（４２８５〜４２８９）において明らかにされるように、所望される特性（例えば、親和性など）を改善するために改変される。抗体（天然型、キメラ型、または、ＣＤＲ交換によるヒト化型であっても）が得られると、可変重鎖および可変軽鎖の遺伝子における様々な位置が、予測された構造および既知の結晶構造の分子モデル化比較によって、抗体の構造および機能または結合に影響を及ぼすとして同定される。
同定または推定される影響誘因位置が、最適な構造的構成のための好ましいアミノ酸、そして同様に、好ましい非免疫原ヒト配列を含有するためにランダム化される。ＤＮＡシャフリング法を使用して、変化させたアミノ酸残基を任意の１つの位置に含有する多数の影響誘因位置が、これらの影響誘因部位におけるアミノ酸のすべての組合せまたは多くの組合せを含有する配列の集団を作製するために再分類される。
ＤＮＡシャフリングによって作製された抗体配列の集団が、制限非依存的付着性末端クローニングを使用してＧＥＮＥＷＡＲＥ発現ベクターにクローン化されるプレプロタンパク質配列の集団を作製するために、実施例２に記載されるようにクローン化される。
一連のコンピューター制御ロボット、データに基づく追跡、および情報管理システムが、ハイスループット（ＨＴＰ）プロセスにおいて、コロニーを選び、プラスミドクローンを調製し、配列決定し、転写し、かつ感染性の転写物をキャプシド化するために使用される。キャプシド化された転写物は、植物に感染させるために使用され、植物は続いて収穫され、葉穿孔、それに続くＨＴＰでのＩＦ抽出または組織ホモジネート化などのＨＴＰ様式で抽出される。
抽出物は、ＥＬＩＳＡまたは他の好適なアッセイによって測定されるような抗原結合などの好ましい活性についてＨＴＰ様式でアッセイされる。また、活性アッセイが定量的側面を有する場合が好ましい。サンプルは、存在する抗体の量を明らかにするためにさらに評価される。これは、完全な抗体を検出するためのＥＬＩＳＡを用いて、または他の好適なアッセイを用いて行うことができる。
同定された標的は、より多量の植物に接種して、さらなる特徴付け、前臨床評価およびプロセス開発のための精製抗体を得るために直ちに使用することができる。
同時に、発現システムは、製造のための十分に大きい規模での量を産生させるためにスケールアップされる。これには、好ましいプロタンパク質または抗体をコードする遺伝子で安定的に形質転換された植物系統を作り出すことが伴い得る。プラスミド、ウイルスおよび種子が、製造プロセスの要求を受け入れるために大規模で作製される。
（実施例２３）
（濾胞刺激ホルモンプロタンパク質のクローニングおよび発現分析）
ヒト濾胞刺激ホルモンは、糖タンパク質ホルモンαサブユニットおよび濾胞刺激ホルモンβサブユニットを含有するジスルフィド連結のヘテロダイマータンパク質である。濾胞刺激ホルモンβサブユニットが、５０μＬのＰＣＲ反応液において、重複する合成オリゴヌクレオチドから組み立てられた。このＰＣＲ反応液は、０．１μＭのＫＰ５０９（配列番号９８）、０．１μＭのＫＰ５１０（配列番号９９）、０．１μＭのＫＰ５１１（配列番号１００）、０．１μＭのＫＰ５１２（配列番号１０１）、０．１μＭのＫＰ５１３（配列番号１０２）、０．１μＭのＫＰ５１４（配列番号１０３）、０．１μＭのＫＰ５１７（配列番号１０６）、０．１μＭのＫＰ５１８（配列番号１０７）、０．１μＭのＫＰ５１９（配列番号１０８）、０．１μＭのＫＰ５２０（配列番号１０９）、０．１μＭのＫＰ５２１（配列番号１１０）、１ＸのＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有し、９８℃で３分間、その後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７４℃で３０秒間からなる２０サイクル、そして７４℃で５分間の最後の工程で増幅された。上記のＰＣＲ産物は、０．５μＭのＫＰ５１５（配列番号１０４）、０．５μＭのＫＰ５２２（配列番号１１１）、１μＬのＰＣＲ産物、１ＸのＰｆｕ緩衝液、１ｍＭのｄＡＴＰ、１ｍＭのｄＣＴＰ、１ｍＭのｄＧＴＰ、１ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する５０μＬのＰＣＲ反応液において再び増幅された。ＰＣＲ反応液は、９８℃で３分間、その後、９５℃で３０秒間、５０℃で３０秒間、７４℃で３０秒間からなる２０サイクル、そして７４℃で７分間の最後の工程で増幅された。ＰＣＲ産物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。上記の反応から得られたＰＣＲフラグメントを製造者の説明書に従ってｐＣＲＩＩＢｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＳＢ２６２２を作製した。糖タンパク質ホルモンαサブユニットを、ヒトｍＲＮＡに由来するヒトｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅した。０．５μＭのＫＰ５１６（配列番号１０５）、０．５μＭのＫＰ５２３（配列番号１１２）、０．３μＬのプラスミドテンプレート、１ＸのＰｆｕ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する５０μＬのＰＣＲ反応液が、９４℃で２分間、その後、９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分間の最後の工程で増幅された。ＰＣＲ反応液を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。上記の反応から得られたＰＣＲフラグメントを製造者の説明書に従ってｐＣＲＩＩＢｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローン化して、プラスミドｐＬＳＢ２６２０を作製した。ｐＬＳＢ２６２２およびｐＬＳＢ２６２０の各連結物を使用して、化学的にコンピテントなＴｏｐ１０細胞を製造者の説明書に従って形質転換した。形質転換液を、抗生物質を含有するＬＢ平板に置床し、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、抗生物質を含有する１．０ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたようにＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して混濁培養物から精製した。精製されたｐＬＳＢ２６２２プラスミドおよびｐＬＳＢ２６２０プラスミドは、標準的な方法を使用する核酸配列決定に供された。
濾胞刺激ホルモンプロタンパク質をコードする配列を組み立てるために、ｐＬＳＢ２６２２に由来するβサブユニットを、上流側プライマーＫＰ５１５（これはβサブユニット成熟型タンパク質の５’末端にアニーリングし、ベクター（ｐＬＳＢＣ１７６７）へのクローニングのために適合し得るＮｇｏＭＩＶ部位を含有する）と、ＫＰ５５２下流側プライマー（これはβサブユニットの３’末端にアニーリングし、終結コドンを除き、βサブユニットをＫＰ６プロペプチドコード配列の５’末端に読み枠を一致させて融合させる）とを用いて増幅した。０．５μＭのＫＰ５１５、０．５μＭのＫＰ５５２、０．２μＬのプラスミドテンプレート、１ＸのＰｆｕ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＰｆｕ Ｕｌｔｒａ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含有する５０μＬのＰＣＲ反応液が、９８℃で３分間、その後、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７４℃で３０秒間からなる２０サイクル、そして７４℃で７分間の最後の工程で増幅された。ＰＣＲ反応液を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。糖タンパク質ホルモンαサブユニットをプラスミドｐＬＳＢ２６２０から増幅し、これは、上流側プライマーＫＰ５５１（これはαサブユニットの５’末端にアニーリングし、αサブユニットをＫＰ６プロペプチドコード配列の３’末端に読み枠を一致させて融合させる）と、ＫＰ５２３下流側プライマー（これは、翻訳終結コドン、および、その後に、その後のクローニングのためのＡｖｒＩＩ部位を含むαサブユニットの３’末端にアニーリングする）とを用いて増幅された。０．５μＭのＫＰ５５１、０．５μＭのＫＰ５２３、０．３μＬのプラスミドテンプレート、１ＸのＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する５０μＬのＰＣＲ反応液が、９４℃で２分間、その後、９４で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分間の最後の工程で増幅された。ＰＣＲ反応液を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。ｐＬＳＢ２６２０およびｐＬＳＢ２６２２から得られる上記の増幅フラグメントを配列重複伸張（ＳＯＥ）によって融合した。０．５μＭのＫＰ５１５、０．５μＭのＫＰ５２３、０．１μＬのｐＬＳＢ２６２０のＰＣＲ産物、０．１μＬのｐＬＳＢ２６２２のＰＣＲ産物、１ＸのＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ緩衝液、０．２ｍＭのｄＡＴＰ、０．２ｍＭのｄＣＴＰ、０．２ｍＭのｄＧＴＰ、０．２ｍＭのｄＴＴＰ、３．５ユニットのＴｈｅｒｍａｌＡｃｅ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する５０μＬのＰＣＲ反応液が、９４℃で２分間、その後、９４で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２で３０秒間からなる２５サイクル、そして７２℃で７分間の最後の工程で増幅された。ＰＣＲ反応液を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。１０μＬの精製されたＰＣＲ産物、５０ｍＭ酢酸カリウム、２０ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ７．９）、１ｍＭのＤＴＴ、１０ｍＭ酢酸マグネシウム、１０ユニットのＮｇｏＭＩＶ、および４ユニットのＡｖｒＩＩを含有する５０μＬの反応液を３７℃で３時間インキュベーションし、反応液を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者の説明書に従って使用して精製した。ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより消化された０．７Ｋｂの濾胞刺激ホルモンプロタンパク質コード配列をｐＬＳＢＣ１７６７に連結して、ｐＬＳＢ２６３４（配列番号９６）を作製した。ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩにより調製されたｐＬＳＢＣ１７６７の５０ｎｇ、ＮｇｏＭＩＶおよびＡｖｒＩＩによる消化ＰＣＲフラグメントの精製物の０．２μＬ、１ＸのＱｕｉｃｋ連結緩衝液（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）、および１μＬのＱｕｉｃｋ Ｔ４ＤＮＡリガーゼを含有する２１μＬの連結反応液を２５℃で５分間インキュベーションした。ＤＨ５αコンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた細菌形質転換を製造者の推奨法に従って行った。細胞を、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ平板に置床し、３７℃で一晩、成長させた。個々のコロニーを使用して、９６ウエルの２．０ｍＬ平底ブロックにおいて、８００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１ｍＬのＳｕｐｅｒ Ｂｒｏｔｈ（ＳＢ）に接種し、３７℃および４００ｒｐｍで一晩、成長させた。プラスミドを、以前に記載されたようにＱＩＡｐｒｅｐ９６Ｔｕｒｂｏ Ｍｉｎｉｐｒｅｐキット（ＱＩＡＧＥＮ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）を使用して混濁培養物から精製し、１００μＬのＥＢ緩衝液において溶出させた。ｐＬＳＢ２６３４（配列番号９６）クローンは、０．７Ｋｂのフラグメントを含有することが、標準的な方法を使用して配列決定することによって確認された。
感染性の転写物を、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用して、ｐＬＳＢ２６３４からインビトロで合成した。簡単に記載すると、１μＬの１０Ｘ反応緩衝液、５μＬの２Ｘ ＮＴＰ／ＣＡＰミックス、１μＬの酵素ミックス、および０．５μｇのプラスミドを含有する、それぞれのプラスミドについて１０μＬの反応液を３７℃で２時間インキュベーションした。合成された転写物を、０．１ＭのＮａ２ＨＰＯ４−ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．０）、０．５ｍｇ／ｍＬの精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を含有する５０μＬの反応液においてカプシド化した。反応液は室温で一晩インキュベーションされた。０．１ｍＬのＦＥＳ（０．１Ｍのグリシン、６０ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、２２ｍＭのＮａ２Ｐ２Ｏ７、１０ｇ／Ｌのベントナイト、１０ｇ／Ｌのセライト５４５）をそれぞれのカプシド化された転写物に加えた。それぞれの個々のクローンから得られたカプシド化転写物を使用して、植え付け後２３日目のニコチアナ・ベンタミアナに接種した。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、濾胞刺激ホルモンタンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
各植物の感染した葉に由来する間質液を接種後８日目に集めた。感染植物のそれぞれに由来する全身感染した上部の葉を集めた。分泌タンパク質の画分、すなわち、間質液（ＩＦ）を抽出し、組換えタンパク質の存在について分析した。葉組織を、５０ｍＭ酢酸塩（ｐＨ５．０）／４００ｍＭ ＮａＣｌ／０．０４％メタ重亜硫酸ナトリウムで覆い、７６０ｍｍＨｇの真空に２分間にわたって供した。真空を解き、そして、組織に緩衝液を完全に浸潤させるために３回、真空を再び加えた。ＩＦ画分が、４Ｋｒｐｍで２０分間の遠心分離によって回収された。
１０μＬの各ＩＦサンプルを、１０％の２−メルカプトエタノールを含有する５μＬの５Ｘトリス−グリシンサンプル色素の添加によってＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析のために調製し、混合物を２分間、煮沸した。サンプルは１０〜２０％のグラジエントＣｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で分離され、タンパク質をウエスタンブロットのためにニトロセルロースメンブランに転写した。メンブランを、２．５％粉末スキムミルクおよび２．５％ＢＳＡを含有するＴＢＳＴにおいて一晩ブロッキング処理した。メンブランを１：２０００希釈のウサギ抗ヒト濾胞刺激ホルモンポリクローナル血清（ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、１：２０００希釈のヤギ抗ウサギ−ＨＲＰ標識ポリクローナル血清で室温において１時間プローブした。ブロットをＴＢＳＴにおいて３回洗浄し、標識されたタンパク質を、ＥＣＬ＋ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）を用いて検出した。抗濾胞刺激ホルモン血清により、約１７ＫＤａのβタンパク質および１５ＫＤａのαタンパク質が検出された。このことは、αサブユニットおよびβサブユニットの両方が発現し、プロセシングされ、分泌されたことを示している。
（実施例２４）
（ＩＬ−１２プロタンパク質のクローニングおよび発現分析）
ＩＬ−１２は、３５ＫＤａのサブユニット（ｐ３５）および４０ＫＤａのサブユニット（ｐ４０）から構成されるジスルフィド連結のヘテロダイマータンパク質であり、ＮＫ細胞の細胞傷害性を増強し、また、ＰＢＬを誘導して、インターフェロン−γを産生させ、また、ＰＢＬの増殖を刺激する（Ｗｏｌｆ他、Ｊ．ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９１）、１４６（９）：３０７４〜８１）。ＩＬ−１２プロタンパク質発現アセンブリーの構築が、本質的には実施例４に記載されるように行われる。ＩＬ−１２のｐ３５サブユニットが、ｐＬＳＢＣ１７６７のαアミラーゼシグナルペプチドとの読み枠を一致させたクローニングのために好適な成熟型タンパク質コード配列との読み枠が一致するＮｇｏＭＩＶ部位を含有する上流側プライマーと、下流側プライマー（これは、ｐ３５の翻訳終結コドンを除き、かつ、ｐ３５配列の３’末端を、ｐＬＳＢＣ１７３１から増幅されるＫＰ６プロペプチド配列の５’末端に融合させる）とを用いてｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅される。ＩＬ−１２のｐ４０サブユニットが、上流側プライマー（これは、ＫＰ６プロペプチド配列の３’末端を、成熟型ｐ４０コード配列の５’末端との読み枠を一致させて融合する）と、下流側プライマー（これは、ｐ４０コード配列の３’末端にアニーリングし、かつ、ｐＬＳＢＣ１７６７へのクローニングのために好適なＡｖｒＩＩ部位を翻訳終結コドンの後に導入する）とを用いてｃＤＮＡクローンからＰＣＲ増幅される。ＰＣＲ増幅されたｐ３５サブユニット、ｐＬＳＢＣ１７３１のＫＰ６プロペプチドコード配列、およびｐ４０サブユニットが、配列重複伸張（ＳＯＥ）によってＩＬ−１２プロタンパク質コード配列を作製するために組み立てられる。得られたフラグメントを制限酵素で消化し、調製されたｐＬＳＢＣ１７６７ベクターにクローン化する。連結物を使用して、コンピテントな大腸菌細胞を形質転換し、形質転換体を成長させ、プラスミドＤＮＡを、標準的な技術を使用して精製する。ウイルスベクターにおける得られたＩＬ−１２プロタンパク質アセンブリーが、ｍＭｅｓｓａｇｅ ｍＭａｃｈｉｎｅ Ｔ７キット（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）を製造者の説明書に従って使用して感染性の転写物をインビトロで合成するために使用される。合成された転写物を、精製Ｕ１コートタンパク質（ＬＳＢＣ、Ｖａｃａｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いてカプシド化し、ＦＥＳと混合する。それぞれの個々のクローンから得られるキャプシド化された転写物を使用して、ニコチアナ・ベンタミアナに接種した。高レベルのサブゲノムＲＮＡ種がウイルス感染植物細胞において合成された（Ｋｕｍａｇａｉ，ＭＨ．他（１９９３）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：４２７〜４３０）。これは、ＩＬ−１２タンパク質の翻訳および続く蓄積のためのテンプレートとして使用される。
感染植物の組織が集められ、タンパク質が抽出され、得られた抽出物は、ＩＬ−１２遺伝子産物の発現を分析するために、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロットによって、または逆相ＨＰＬＣによって分析される。
（実施例２５）
（患者特異的な免疫治療におけるモノクローナル抗体およびＦａｂ）
ガンおよび感染性疾患の処置におけるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）およびポリクローナル抗体の使用は広く確立されている。これらの製造物は、悪性細胞または病原体細胞の表面における特定の標的に結合して、免疫認識および破壊のためにこれらの病原性細胞に印を付けることによってそれらの有益な作用を発揮する。標的に結合することに加えて、抗体の定常領域はまた、免疫応答のタイプ、大きさおよび持続期間を調節することを助けるエフェクター機能を果たし得る。
抗体はまた、望ましくない細胞に対する治療作用を増大させることを目的に、遺伝子レベルまたは翻訳後でのいずれかで、毒素または放射性同位体などのさらなる分子に融合することができる。従って、そのような二機能性の免疫治療剤は、抗体によってもたらされる標的化成分と、望ましくない標的細胞を破壊することにおいて大きな役割を果たし得る、毒素、酵素または放射性同位体によってもたらされる毒性負荷物とからなる。
いくつかの適用においては、完全な抗体分子を使用しないことが望ましい。標的を発見し、これと結合するその途中で微細な毛細血管床および組織を通過する免疫タンパク質の浸透は、抗体が天然に産生された天然型タンパク質のフラグメントまたはサブユニットであるならば、最も良く達成され得る。このカテゴリーにおける抗体フラグメントには、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ジアボディー、テトラボディーなどが含まれ、これらはそれぞれが異なる立体配座および結合機能性を有する。
生物医学的治療において使用されるほぼすべての抗体および抗体フラグメントは、病原体細胞または標的細胞における共通する標的に結合するように設計されている。投与されたとき、抗体は、細胞集団における共通する細胞マーカーに向かって進む。これらの適用における疾患に対する特異性、すなわち、治療指数は、従って、大部分が、抗体が結合するために選択された標的細胞におけるタンパク質または構造によって決定される。例えば、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））などの製造物は、細胞マーカーＣＤ２０をその表面に発現するすべての細胞を標的化する：例えば、この場合には免疫系のＢ細胞を標的化する。この製造物は、そのような共通するマーカーを標的化することによってすべてのＢ細胞を除去し得る。この製造物は、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）を治療するために使用され、リツキシマブは、悪性Ｂ細胞ならびに非悪性Ｂ細胞を患者から除去することによって十分な効果をもたらす。Ｂ細胞ＮＨＬはクローン性疾患であるので、患者の悪性Ｂ細胞クローンが一時的に抑制される一方で、患者の免疫系の健全なＢ細胞部門もまた、その結果として破壊され、これにより、患者は、患者の骨髄が新しいＢ細胞を生じさせることができるまで一時的に免疫低下状態にされる。
免疫タンパク質はまた、標的細胞における一部の部分集団だけの表面における個々の標的タンパク質または構造を標的化するために使用することができる。例えば、抗体が悪性細胞における腫瘍特異的なマーカーに対して作製され得る場合、その細胞集団が標的化され、同じ系譜の健康な細胞は見逃される。これは、汎反応性の細胞タイプ抗原が標的化されるリツキシマブについての例と比較される高選択性の免疫治療の一例である。腫瘍または病原体に特異的な抗体は、全長サイズのＭＡｂもしくはポリクローナル抗体、または抗体フラグメント（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）、および、この分野で記載される他の組成物であり得る。
標的化された免疫治療の具体的な一例が、使用される薬物が一人の患者にだけ作用するように選択的である患者特異的な免疫治療である。ＮＨＬの例を使用すると、抗体または抗体フラグメントが、ＮＨＬなどのクローン性腫瘍におけるマーカーを標的化するために選択され得る。すべてのＢ細胞は、ＩｇＭなどの免疫グロブリン分子をその表面に突き出している。それぞれのＢ細胞系統またはクローンは特有の抗体を産生するので、その抗体配列を、ＮＨＬにおける悪性Ｂ細胞クローンの腫瘍特異的なマーカーとして使用することができる。抗体または抗体フラグメントが、悪性Ｂ細胞腫瘍の表面における特有の免疫グロブリン配列に結合するために標的化された場合、そのような抗体または抗体フラグメントは、Ｂ細胞の悪性クローンのみに結合し、これを破壊し、その一方で、他のＢ細胞クローンのすべてを無視し、従って、患者の免疫系の健康なＢ細胞部門を見逃すことを助けることが期待され得る。そのような選択性は、体液性の免疫抑制が全くまたは最小限でしか予想されないので、リツキシマブの場合に観測されるような免疫系のＢ細胞部門の全面的な除去を上回る明らかな利点を有する。そのような腫瘍特異的マーカーはその患者の特定のＢ細胞に対して個別的であるので、投与される治療抗体は、その患者においてだけ効力を示すことが予想され、従って、この治療は患者特異的な免疫治療であると考えられる。
患者のＢ細胞ＮＨＬ生検試料が得られ、露出したＩｇＭ（または任意の他の腫瘍特異的な抗原）が、その抗原に対して特異的に結合する全長サイズの抗体またはそのような抗体のフラグメントのいずれかを作製するために使用される。高親和性の抗体または抗体フラグメントの作製は、当業者に知られている方法によって達成することができ、そのような方法には、動物の免疫化、ファージディスプレーライブラリーのパンニングなどが含まれる。ヒト治療の場合、製造物の長期間にわたる使用に伴う免疫原性に関する潜在的な問題を防止するために、完全なヒト抗体もしくは抗体フラグメント、またはヒト化された動物由来の抗体もしくは抗体フラグメントのいずれかを使用することが好ましい。
抗体または抗体フラグメントをコードする人工的なオープンリーディングフレームを構築することができ、また、抗体または抗体フラグメントを、前記の実施例において示された方法によって作製および単離することができる。そのような患者特異的免疫治療において使用される抗体または抗体フラグメントは、そのまま使用することができ、または、より効果的な毒性負荷物を付与するために、毒素、酵素または放射性同位体のいずれかに連結された抗体媒介の標的化末端からなる二機能性薬剤の構成成分として使用することができる。毒素コンジュゲート化抗体からなる二機能性の免疫治療剤を構築するために、遺伝子レベルで、抗体または抗体フラグメントをコードする遺伝子配列を、毒素または酵素をコードする遺伝子に融合することができる。翻訳されたタンパク質は、標的に結合するＩｇ重鎖可変領域およびＩｇ軽鎖可変領域と、毒素または酵素に連結された抗体定常領域とからなる。抗体媒介の反応による結合成分の非常に特異的な標的化が確立されると、毒素または酵素は、その特性および作用様式に依存して、標的細胞の表面で作用するか、または、内部から細胞を破壊するために内在化される。このような治療様式で使用され得る毒素には、コレラ、ジフテリア、リシンなどが含まれる。あるいは、Ｉｇ合成後、放射性同位体または毒素または酵素をＩｇに化学的にコンジュゲート化して、本質的に同じ二機能性薬剤を製造することができる。このような治療において使用され得る放射性同位体には、ヨウ素、イットリウムなどが含まれる。医学的有用性を有し、かつ、規制当局により使用について承認されている毒素および放射性同位体はともに、当業者には知られている。いずれの場合でも、そのままのＩｇまたは二機能性のＩｇまたはＩｇフラグメントが、病気が明らかにされた患者に、おそらくは静脈内注入によって投与され、その結果、薬物は、病原体または悪性細胞の集団のみを非常に特異的に標的化し、これを破壊することができ、その一方で、非標的または健康な細胞および組織を見逃することができる。
より小さい抗体フラグメントは、浸透および透過性において、完全なＩｇタンパク質を上回る利点を有するが、それらの短所の１つが、抗体フラグメントは循環からより迅速に除去されるということである。標的を見出し、その標的に結合する抗体の能力は、用量、循環における時間、およびその標的に対するＩｇの結合親和性の関数であるので、より長い滞留時間が、より少ない用量（より少ないコスト、より低い潜在的毒性）およびより大きい効力を達成するためには望ましい。様々な配合、変化および改変が、Ｉｇの循環半減期を増大させるために使用され得る。例えば、ポリエチレングリコールが、治療タンパク質の半減期を延ばすために使用されている：例えば、インターフェロン（インターフェロン−α２ａ、例えば、ＰＥＧ−イントロン［Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ］、Ｐｅｇａｓｙｓ［Ｒｏｃｈｅ］）、酵素（Ｌ−アスパラギナーゼ、例えば、ＯＮＣＡＳＰＡＲ；アデノシンデアミナーゼ、例えば、ＡＤＡＧＥＮ［Ｅｎｚｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ］）、ならびに合成薬物など。ＰＥＧは不活性な外皮として作用して、薬物（特にタンパク質）を免疫媒介の除去機構および他の天然の除去機構から保護する。患者特異的な抗体フラグメントのＦａｂ形態およびｓｃＦｖ形態を同様にＰＥＧ化して、より長い循環半減期をもたらすことができ、これにより、おそらくは必要量を少なくし（潜在的には、治療コストを下げ）、かつ、投与をより少ない頻度にすることができ、その一方では、完全なＩｇと比較してフラグメントのより低いＭＷおよびより小さいサイズによって可能になるＩｇ薬物の毛細血管浸透および組織浸透の利点を維持することができる。ＰＥＧ化は、様々なＭＷのＰＥＧ鎖（これは線状または分枝状、永続的または放出可能である）を、Ｉｇ、Ｉｇフラグメント、またはＩｇフラグメントの二機能性コンジュゲートに化学的につなぐことによって達成される。ＰＥＧ化を行うための化学反応が記載されており、これもまた当業者には広く知られている。
（結論）
下記には、本発明により表される構成および方法が示される。
１．下記の４つのペプチド配列：
（ａ）シグナルペプチド配列、
（ｂ）シグナルペプチド配列のｃ末端に結合した目的とする第１のペプチド配列、
（ｃ）第１のペプチド配列のｃ末端に結合したプロペプチド配列、および
（ｄ）プロペプチド配列のｃ末端に結合した目的とする第２のペプチド配列
を含み、プロペプチド配列が、目的とする第１のペプチド配列または第２のペプチド配列のいずれとも天然の状態では結合していない人工プレプロタンパク質。
２．抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論１の人工プレプロタンパク質。
３．抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかである、結論１の人工プレプロタンパク質。
４．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに重鎖ペプチドである、結論３の人工プレプロタンパク質。
５．第１のペプチドが抗体の軽鎖である、結論３の人工プレプロタンパク質。
６．Ｆａｂフラグメント軽鎖ペプチドおよびＦａｂフラグメント重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論１の人工プレプロタンパク質。
７．Ｆａｂフラグメント軽鎖ペプチドおよびＦａｂフラグメント重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかである、結論１の人工プレプロタンパク質。
８．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに重鎖ペプチドである、結論７の人工プレプロタンパク質。
９．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに軽鎖ペプチドである、結論７の人工プレプロタンパク質。
１０．Ｆａｂフラグメント誘導体または抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドがＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドがＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論１の人工プレプロタンパク質。
１１．Ｆａｂフラグメント誘導体または抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドがＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドがＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかである、結論１の人工プレプロタンパク質。
１２．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに重鎖ペプチドである、結論１１の人工プレプロタンパク質。
１３．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに軽鎖ペプチドである、結論１１の人工プレプロタンパク質。
１４．下記の４つのヌクレオチド配列：
シグナルペプチド配列をコードする第１のヌクレオチド配列、
目的とする第１のペプチド配列をコードし、第１のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第２のヌクレオチド配列、
プロペプチド配列をコードし、第２のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第３のヌクレオチド配列、および
目的とする第２のペプチド配列をコードし、第３のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第４のヌクレオチド配列
を含む人工ポリヌクレオチド。
１５．抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第１のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論１４の人工ポリヌクレオチド。
１６．抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第１のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかである、結論１４の人工ポリヌクレオチド。
１７．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに重鎖ペプチドである、結論１６の人工ポリヌクレオチド。
１８．第１のペプチドが抗体の軽鎖である、結論１６の人工ポリヌクレオチド。
１９．Ｆａｂフラグメント軽鎖ペプチドおよびＦａｂフラグメント重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第１のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論１４の人工ポリヌクレオチド。
２０．Ｆａｂフラグメント軽鎖ペプチドおよびＦａｂフラグメント重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第１のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドがＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかである、結論１４の人工ポリヌクレオチド。
２１．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに重鎖ペプチドである、結論２０の人工ポリヌクレオチド。
２２．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに軽鎖ペプチドである、結論２０の人工ポリヌクレオチド。
２３．Ｆａｂフラグメント誘導体または抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第１のペプチドがＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドがＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論１４の人工ポリヌクレオチド。
２４．Ｆａｂフラグメント誘導体または抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第１のペプチドがＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかである、結論１４の人工ポリヌクレオチド。
２５．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに重鎖ペプチドである、結論２４の人工ポリヌクレオチド。
２６．第１のペプチドおよび第２のペプチドがともに軽鎖ペプチドである、結論２４の人工ポリヌクレオチド。
２７．結論１４の人工ポリヌクレオチドを作製する方法であって、
シグナルペプチド配列、目的とする第１のペプチド、プロペプチド、および目的とする第２のペプチドをそれぞれコードする第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および第４のヌクレオチド配列を提供すること、
第１のヌクレオチド配列の３’末端を第２のヌクレオチド配列の５’末端に結合すること、
第２のヌクレオチド配列の３’末端を第３のヌクレオチド配列の５’末端に結合すること、および
第３のヌクレオチド配列の３’末端を第４のヌクレオチド配列の５’末端に結合すること
を含み、目的とする第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列が、目的とする第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じまたは異なり得る、方法。
２８．人工ポリヌクレオチドが、抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列が抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかをコードし、かつ、第４のヌクレオチド配列が抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかをコードし、しかし、第２のヌクレオチド配列は第４のヌクレオチド配列とは異なる、結論２７の方法。
２９．人工ポリヌクレオチドが、抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列が抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかをコードし、かつ、第４のヌクレオチド配列が抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかをコードする、結論２７の方法。
３０．第２のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列がともに重鎖ポリペプチドをコードする、結論２９の方法。
３１．第２のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列がともに軽鎖ポリペプチドをコードする、結論２９の方法。
３２．人工ポリヌクレオチドが、Ｆａｂ軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかをコードし、かつ、第４のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかをコードし、しかし、第２のヌクレオチド配列は第４のヌクレオチド配列とは異なる、結論２７の方法。
３３．人工ポリヌクレオチドが、Ｆａｂ軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかをコードし、かつ、第４のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメントの重鎖またはＦａｂフラグメントの軽鎖のいずれかをコードする、結論２７の方法。
３４．第２のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列がともに重鎖ポリペプチドをコードする、結論３３の方法。
３５．第２のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列がともに軽鎖ポリペプチドをコードする、結論３３の方法。
３６．人工ポリヌクレオチドが、Ｆａｂフラグメント誘導体または抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかをコードし、かつ、第４のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかをコードし、しかし、第２のヌクレオチド配列は第４のヌクレオチド配列とは異なる、結論２７の方法。
３７．人工ポリヌクレオチドが、Ｆａｂフラグメント誘導体または抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、第２のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかをコードし、かつ、第４のヌクレオチド配列がＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖またはＦａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかをコードする、結論２７の方法。
３８．第２のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列がともに、重鎖ペプチドをコードするヌクレオチド配列に由来する、結論３７の方法。
３９．第２のヌクレオチド配列および第４のヌクレオチド配列がともに、軽鎖ペプチドをコードするヌクレオチド配列に由来する、結論３７の方法。
４０．人工プレプロタンパク質を作製する方法であって、
プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチドを作製すること、および
人工ポリヌクレオチドを宿主生物において発現させ、それにより、人工プレプロタンパク質が作製されること
を含む方法。
４１．多量体タンパク質を作製する方法であって、
シグナルペプチド配列、目的とする第１のペプチド、プロペプチド、および目的とする第２のペプチドをそれぞれコードする第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および第４のヌクレオチド配列を提供すること、
第１のヌクレオチド配列の３’末端を第２のヌクレオチド配列の５’末端に結合すること、
第２のヌクレオチド配列の３’末端を第３のヌクレオチド配列の５’末端に結合すること、および
第３のヌクレオチド配列の３’末端を第４のヌクレオチド配列の５’末端に結合すること
その結果、人工ポリヌクレオチドが生じ、かつ、これら４つのヌクレオチド配列から構成される（この場合、目的とする第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、目的とする第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じまたは異なり得る）；
得られた人工ポリヌクレオチドをトランスフェクションまたは安定的な形質転換によって宿主生物に導入すること、
人工ポリヌクレオチドを宿主生物において発現させ、それにより、人工プレプロタンパク質が作製されること、
プレプロタンパク質を成熟型ポリペプチドにプロセシングさせること
を含む方法。
４２．２コピーの成熟型ポリペプチドを結合させて、成熟型多量体タンパク質を形成させることをさらに含む、結論４１の方法。
４３．多量体タンパク質が、抗体、またはＦａｂフラグメント、または、抗体もしくはＦａｂフラグメントのいずれかの誘導体である、結論４１の方法。
４４．人工プレプロタンパク質をコードするベクターであって、
ベクターヌクレオチドの複製およびタンパク質のために必要なヌクレオチド配列、および
ベクターに挿入された結論１４の人工ポリヌクレオチド
を含むベクター。
４５．プラスミドまたはウイルスベクターである結論４４のベクター。
４６．微生物において増殖することができる結論４４のベクター。
４７．ベクターヌクレオチドの複製およびタンパク質の発現のために必要なヌクレオチド配列、
ベクターに挿入された請求項１４に記載の人工プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド、
人工プレプロタンパク質の発現を行わせることができるプロモーター、および
人工ポリヌクレオチドによりコードされる人工プレプロタンパク質
を含む人工プレプロタンパク質をコードするベクター
を含む一過性に形質転換された細胞。
４８．人工プレプロタンパク質が抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論４７の細胞。
４９．２コピーの人工プレプロタンパク質から構成される成熟型の多量体タンパク質をさらに含む、結論４７の細胞。
５０．結論４７による複数の細胞を含む生物。
５１．植物、動物、菌類または藻類である結論４９または５０による植物生物、動物生物、菌類生物または藻類生物。
５２．結論４７による植物細胞、動物細胞、菌類細胞、藻類細胞または単細胞型生物。
５３．多量体タンパク質が生物の間質空間または間質液に分泌される、結論４７による少なくとも１つの細胞を含む生物。
５４．多量体タンパク質が生物の循環系または排出系に分泌される、結論４９による生物。
５５．（ａ）染色体に安定的に取り込まれている結論１４の人工ポリヌクレオチド、
（ｂ）場合により、人工プレプロタンパク質の発現を行わせることができるプロモーター、および
（ｃ）人工ポリヌクレオチドによりコードされる人工プレプロタンパク質
を含む遺伝子組換え細胞。
５６．人工プレプロタンパク質が抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含み、第１のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、第２のペプチドが抗体の重鎖または抗体の軽鎖のいずれかであり、しかし、第１のペプチドは第２のペプチドとは異なる、結論５５の細胞。
５７．２コピーの人工プレプロタンパク質から構成される成熟型の多量体タンパク質をさらに含む、結論５５の細胞を含む生物。
５８．結論５７による複数の細胞を含む生物。
５９．植物、動物、菌類または藻類である結論５７または５８による植物生物、動物生物、菌類生物または藻類生物。
６０．結論５５による植物細胞、動物細胞、菌類細胞、藻類細胞または単細胞型生物。
６１．多量体タンパク質が生物の間質空間または体液に分泌される、結論５５による少なくとも１つの細胞を含む生物。
６２．多量体タンパク質が生物の循環系または排出系に分泌される、結論４９による生物。
６３．結論１の人工プレプロタンパク質を含有または組み込む遺伝子組換えまたは一過性形質転換された生物。
６４．（ａ）人工プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド配列を含有する植物細胞（この場合、人工プレプロタンパク質は、ａ）シグナルペプチド配列、ｂ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチド、ｃ）プロペプチド、およびｄ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチドを含み、重鎖がプレプロタンパク質上の位置ｂまたは位置ｄのいずれかにおいて存在することができ、軽鎖がもう一方の位置に存在し、また、人工プレプロタンパク質は、分泌シグナルを形成するシグナルペプチド配列シグナルペプチド配列を含有する）
を含み、かつ
（ｂ）前記人工ポリヌクレオチド配列によりコードされる免疫グロブリン分子を含有し、
前記シグナルペプチド配列シグナルペプチド配列はタンパク質分解プロセシングによって前記人工プレプロタンパク質から切断され、かつ、前記プロペプチドは、残ったポリペプチドの適正な折り畳みの後、重鎖および軽鎖から切断される、遺伝子組換えまたは一過性形質転換された植物。
６５．シグナルペプチド配列が異種のシグナルペプチド配列である、結論６４の植物。
６６．ポリヌクレオチド配列が哺乳動物の免疫グロブリンをコードする、結論６４の植物。
６７．免疫グロブリンが免疫グロブリンスーパーファミリーの分子である、結論６４の植物。
６８．双子葉植物である結論６４の植物。
６９．単子葉植物（トウモロコシなど）である結論６４の植物。
７０．ニコチアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）属の植物である結論６４の植物。
７１．プレプロタンパク質をコードする前記ポリヌクレオチド配列が単一のベクターに存在する、結論６４の植物。
７２．免疫グロブリン分子を産生することができる遺伝子組換え植物を作製するための方法であって、
（ａ）（ｉ）シグナルペプチド配列、（ｉｉ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチド、（ｉｉｉ）プロペプチド、および（ｉｖ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチドを含み、重鎖がプレプロタンパク質上の位置ｂまたは位置ｄのいずれかにおいて存在することができ、軽鎖がもう一方の位置に存在するプレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド配列を植物種のメンバーのゲノムに導入すること、および
（ｂ）形質転換体を得るために、安定的な形質転換を生じさせること
を含む方法。
７３．シグナルペプチド配列が異種のシグナルペプチド配列である、結論７２の方法。
７４．第１および第２のヌクレオチド配列が同じベクターにより導入される、結論７２の方法。
７５．前記免疫グロブリン分子の少なくとも一部が前記植物細胞の細胞壁の内部に存在する、結論６４の植物。
７６．前記免疫グロブリン分子は前記植物細胞のゴルジを介して輸送される、結論６４の植物。
７７．前記免疫グロブリン分子は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭのイソタイプからなる群から選択される、結論６４の植物。
７８．前記免疫グロブリン分子はＩｇＧイソタイプを含む、結論６４の植物。
７９．前記免疫グロブリン分子はＩｇＡイソタイプを含む、結論６４の植物。
８０．人工プレプロタンパク質は、前記人工ポリヌクレオチドの発現を行わせるプロモーターをさらに含む、結論６４の遺伝子組換え植物。
８１．重鎖ペプチドおよび軽鎖ペプチドの実質的にすべてが、前記植物細胞の内部で免疫グロブリン分子を形成するために組み立てられる、結論６４の植物。
８２．プロモーターが構成的プロモーターである、結論８０の遺伝子組換え植物。
８３．下記の３つのペプチド配列：
（ａ）目的とする第１のペプチド配列、
（ｂ）第１のペプチド配列のｃ末端に結合したプロペプチド配列、および
（ｃ）プロペプチド配列のｃ末端に結合した目的とする第２のペプチド配列
を含むプレプロタンパク質。
８４．目的とする第１のペプチド配列のＮ末端に結合したシグナルペプチド配列をさらに含む、結論８３の人工プロタンパク質。
８５．免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変領域を少なくとも含む免疫グロブリン分子または免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを単一の宿主細胞において製造するための方法であって、
（ａ）少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、プロペプチドと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードする単一ＤＮＡ配列で前記宿主細胞を形質転換する工程、および
（ｂ）前記単一ＤＮＡ配列を発現させ、その結果、前記の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖が、前記の形質転換された単一宿主細胞において単一のプロペプチド分子として産生される、方法。
８６．前記単一ＤＮＡ配列が異なるベクターに存在する、結論８５による方法。
８７．前記単一ＤＮＡ配列が単一のベクターに存在する、結論８５による方法。
８８．ベクターがプラスミドである、結論８７による方法。
８９．プラスミドがｐＢＲ３２２またはその誘導体である、結論８８による方法。
９０．宿主細胞が細菌または酵母である、結論８５による方法。
９１．宿主細胞が大腸菌またはＳ，ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、結論９０による方法。
９２．免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖が宿主細胞において発現し、かつ、免疫学的に機能的な免疫グロブリン分子または免疫グロブリンフラグメントとして宿主細胞から分泌される、結論８５による方法。
９３．免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖が不溶性形態で産生され、可溶化され、かつ、免疫学的に機能的な免疫グロブリン分子または免疫グロブリンフラグメントを形成させるために溶液中で折り畳むことが可能である、結論８５による方法。
９４．ＤＮＡ配列が完全な免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖をコードする、結論８５による方法。
９５．前記単一ＤＮＡ配列は、定常ドメインが結合する可変ドメインと同じ供給源に由来する少なくとも１つの定常ドメインをさらにコードする、結論８５による方法。
９６．前記単一ＤＮＡ配列は、定常ドメインが結合する可変ドメインが由来する種またはクラスとは異なる種またはクラスに由来する少なくとも１つの定常ドメインをさらにコードする、結論８５による方法。
９７．前記単一ＤＮＡ配列は２つ以上のモノクローナル抗体産生ハイブリドーマに由来する、結論８５による方法。
９８．少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインおよび少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインをコードする単一ＤＮＡ配列を含むベクターであって、前記単一ＤＮＡ配列が１カ所の挿入部位において該ベクターに存在する、ベクター。
９９．プラスミドである結論９８によるベクター。
１００．結論９８によるベクターで形質転換された宿主細胞。
１０１．少なくとも２つのベクターを含む形質転換された宿主細胞であって、前記ベクターの少なくとも１つが、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインおよび少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインをコードする単一ＤＮＡ配列を含む、形質転換された宿主細胞。
１０２．宿主細胞が哺乳動物細胞である、結論８５による方法。
１０３．宿主細胞が哺乳動物細胞である、結論１０１による形質転換された宿主細胞。
１０４．（ａ）免疫グロブリンの重鎖および軽鎖またはＦａｂ領域からなり、特定の既知の抗原に対する特異性を有する免疫グロブリンをコードするＤＮＡから本質的にはなるＤＮＡ配列で、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、切断可能なプロペプチドと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとからなるプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチドを含むＤＮＡ配列を調製すること、
（ｂ）工程ａ）のＤＮＡ配列を、好適なプロモーターに機能的に連結されている複製可能な発現ベクターに挿入すること、
（ｃ）原核生物系または真核生物系の微生物宿主の細胞培養物を工程（ｂ）のベクターで形質転換すること、
（ｄ）宿主細胞を培養すること、および
（ｅ）既知の抗原に結合することができる免疫グロブリンを宿主細胞培養物から回収すること
を含む方法。
１０５．重鎖および軽鎖が抗ＣＥＡ抗体の重鎖および軽鎖である、結論１０４の方法。
１０６．重鎖がγファミリーである、結論１０４の方法。
１０７．重鎖がκファミリーである、結論１０４の方法。
１０８．ベクターが、重鎖および軽鎖の両方をコードするＤＮＡを含有する、結論１０４の方法。
１０９．宿主細胞が大腸菌または酵母である、結論１０４の方法。
１１０．重鎖および軽鎖またはＦａｂ領域が不溶性粒子として細胞内に堆積する、結論１０９の方法。
１１１．プロタンパク質が不溶性粒子として細胞内に堆積する、結論１０９の方法。
１１２．プロタンパク質が、細胞溶解、それに続く、変性剤における可溶化によって粒子から回収される、結論１１０の方法。
１１３．プロタンパク質が培地に分泌される、結論１０４の方法。
１１４．宿主細胞がグラム陰性細菌であり、プロタンパク質が宿主細胞細菌のペリプラスム空間に分泌される、結論１０４の方法。
１１５．重鎖および軽鎖の両方を回収し、軽鎖および重鎖を再構成して、特定の既知の抗原に対する特異的な親和性を有する免疫グロブリンを形成させることをさらに含む、結論１０４の方法。
１１６．結論１１０の方法によって産生される、重鎖および軽鎖またはＦａｂ領域の不溶性粒子。
１１７．免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む免疫グロブリン分子または免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを単一宿主細胞において製造するための方法であって、
（ａ）少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードする単一ＤＮＡ配列を発現させ、その結果、前記の免疫グロブリン重鎖および免疫グロブリン軽鎖が、前記単一ＤＮＡ配列で形質転換された前記単一宿主細胞において単一のプロタンパク質分子として産生される、方法。
１１８．免疫グロブリン分子または免疫グロブリンフラグメントを標識または薬物に結合する工程をさらに含む、結論９２の方法。
１１９．免疫グロブリン分子または免疫グロブリンフラグメントを標識または薬物に結合する工程をさらに含む、結論９３の方法。
１２０．免疫グロブリン分子または免疫グロブリンフラグメントを標識または薬物に結合する工程をさらに含む、結論１１７の方法。
１２１．ヘモグロビン（α２β２）、ＩＬ−１２、ＴＣＲ、ＭＨＣクラスＩＩヘテロダイマー（αβ）、ＣＤ８ヘテロダイマー（αβ）、ＣＤ３（εδ）、ＣＤ３（εγ）、ＣＤ２２（αβ）、ＣＤ４１（ＧＰＩＩｂａ ＣＤ６１）Ｊａｎｕｓキナーゼ（ＪＡＫ）、ＪＡＫおよびＳＴＡＴ（転写のシグナル変換因子および活性化因子）のヘテロダイマー、Ｉ鎖を伴うＩｇＭ重鎖、または、ＶｐｒｅＢおよびλ５（Ｉ鎖）、ＩｇβおよびＩｇα、インテグリン類、Ｔ細胞インテグリンＬＦＡ−１（αＬβ２）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＩＬ−２受容体（ヘテロトリマー）ＩＬ−２Ｒ（αβγｃ）、ＩＬ−１５（αβγ）、レマトポイエチン受容体ファミリー（ＩＬ−３Ｒ、ＧＭ−ＣＳＦＲは少数である）、ＴＮＦ−β（ＬＴ−αおよびＬＴ−β）、ＩＬ１２Ｒ（β１β２）、遺伝子組換えＪ鎖を伴うＩｇＭ（Ｈ２Ｌ２）、遺伝子組換えＪ鎖を伴うＩｇＡ（Ｈ２Ｌ２）、ＭＨＣクラスＩ（αおよびβ２−ミクログロブリン）、ＨＬＡ−ＤＭ（αβ）、Ｈ−２Ｍ（αβ）、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ、インスリン受容体（ＩＲ）（α２β２）、ＩＧＦ−１受容体（α２β２）、Ｇタンパク質ヘテロトリマー（αβγ）、アドレナリン作動性受容体、レチノイン酸受容体（ＲＡＲ）（αβ）、エストロゲン受容体（αβ）、筋細胞エンハンサー因子２（ＭＥＦ２）ファミリー、ｃ−ｆｏｓおよびＪｕｎＤ、酵母ＲＮＡＰＩＩ Ｒｐｂ３／Ｒｐｂ１１ヘテロダイマー、カルパイン、インポルチンα２／βヘテロダイマー、ＤＮＡ依存プロテインキナーゼ（ＤＮＡ−ＰＫｃ類、ならびにＫｕ７０およびＫｕ８０）、Ｋｕ７０およびＫｕ８０のヘテロダイマー、ヘパトポイエチン（ＨＰＯ）およびＨＰＯ２３のヘテロダイマー、白血球機能関連抗原−１分子（ＬＦＡ−１）ＣＤ１１ａ（αＬ）およびＣＤ１８（β２）インテグリンサブユニットのヘテロダイマー、肝臓Ｘ受容体（ＬＸＲ）／レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）ヘテロダイマー、真核生物の染色体構造維持（ＳＭＣ）タンパク質、ヒトのミスマッチ修復（ＭＭＲ）ヘテロダイマー、ｒＢＡＴ−ｂ（０，＋）ＡＴヘテロダイマー、レチノイドＸα（ＲＸＲα）およびペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（ＰＰＡＲα）のヘテロダイマー、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）／ＲＸＲヘテロダイマー、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体／ＲＸＲ、Ｎｕｒｒ１オーファン核受容体／ＲＸＲヘテロダイマー、カルシニューリン、コラプシン応答媒介因子タンパク質−２およびチューブリンのヘテロダイマー、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａヘテロダイマー、ＩｋａｐｐａＢキナーゼ複合体、ヒト免疫不全症ウイルスの逆転写酵素（ＲＴ）ヘテロダイマー、ＣＤ９８複合体、膜結合免疫グロブリン分子（ｍＩｇ）を伴うＢ細胞抗原受容体およびＩｇ−α／Ｉｇ−βヘテロダイマー、クラスＩＡホスホイノシチド３−キナーゼ、低酸素症誘導因子１からなる群から選択される、結論１４による人工ポリヌクレオチドによりコードされる多量体タンパク質。
１２２．プロモーターが誘導性プロモーターである、結論８０の遺伝子組換え植物。
１２３．第１および第２のペプチドを含み、第１のペプチドがカルボキシ末端のＰ１位およびＰ２位において非天然アミノ酸対を含む多量体タンパク質。
１２４．Ｐ２位が、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇによって占められる、結論１による多量体タンパク質。
１２５．Ｐ１位が、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇによって占められる、結論１による多量体タンパク質。
１２６．第１および第２のペプチドを含み、第１のペプチドがカルボキシ末端のＰ１位およびＰ２位において非天然アミノ酸対を含む、多量体タンパク質に由来する多量体タンパク質。
（寄託情報）
ｃＤＮＡは、その後、下記に示されるように、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（１０８０１ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｌｖｄ．、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖａ．２０１１０−２２０９、米国）（ＡＴＣＣ）にブダペスト条約の条項に従って寄託された。
プラスミドＤＮＡ：ｐ５ＰＮＣＡＰは特許受託ＰＴＡ−４７４２（２００２年１０月３日受託）である。
プラスミドＤＮＡ：ｐ１１７７ＭＰ５は特許受託ＰＴＡ−４７４３（２００２年１０月３日受託）である。
プラスミドＤＮＡ：ｐ１３２４−ＭＢＰは特許受託ＰＴＡ−４７４４（２００２年１０月３日受託）である。
プラスミドＤＮＡ：ｐＬＳＢＣ１７９８は特許受託＿＿＿＿＿＿＿（２００３年１０月２日受託）である。
プラスミドＤＮＡ：ｐＬＳＢＣ２６３４は特許受託＿＿＿＿＿＿＿（２００３年１０月２日受託）である。
プラスミドＤＮＡ：Ｈｕ Ｆａｂ Ａ９は特許受託＿＿＿＿＿＿＿（２００３年１０月２日受託）である。
プラスミドＤＮＡ：Ｈｕ Ｆａｂ Ｄ５は特許受託＿＿＿＿＿＿＿（２００３年１０月２日受託）である。
これらの寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約およびそれに基づく規則（ブダペスト条約）の規定に従ってなされた。これにより、受託日から３０年間または最後の要求の後の５年間（いずれか遅い方）について寄託物の生存可能な培養物の維持が保証される。本出願の譲受人は、寄託されている寄託物の培養物が生存可能でないこと、または失われていること、または死滅していることが見出されたならば、通知により寄託物を当該寄託物の別の培養物と遅滞なく取り替えることに同意している。寄託物が入手可能であることは、いずれかの政府の当局によってその特許法令に従って付与された権利に違反して本発明を実施するための許諾として、または、寄託物を研究のために使用するための許諾として解釈してはならない。
従って、本発明は、本発明の好ましい実施形態に関してある程度の詳細度で記載されている。だが、本発明は、先行技術分野に照らして解釈される下記の請求項によって定義され、その結果、様々な改変または変化が、本明細書中に含まれる発明概念から逸脱することなく、本発明の好ましい実施形態に対してなされ得ることを理解しなければならない。
図１は、抗体を植物において発現させるための先行技術の方法を示すブロック図である。この方法では、２つの遺伝子が２つの別個の植物において最初に用いられ、続いて、これら２つの植物が、所望のタンパク質を小胞体において産生し得る子孫を得るために他家受粉させられる。 図２は、本発明に従って、プロモーター配列、シグナルペプチド、軽鎖配列、プロペプチドおよび重鎖配列をこの順に含む構築物を作製するための基本的な工程を一般的に示す流れ図である。 図３は、本発明に従って、プロモーター配列、シグナルペプチド、重鎖配列、プロペプチドおよび軽鎖配列をこの順に含む構築物を作製するための基本的な工程を一般的に示す流れ図である。 図４は、プレプロタンパク質をコードするための、図３に示される構築物と類似する構築物が細胞に導入される本発明の１つの実施形態を表すブロック図である。この実施形態において、構築物は、シグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入された短い重鎖を含む。発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、プレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体フラグメントまたはＦａｂがもたらされる。 図５は、プレプロタンパク質をコードする構築物が細胞に導入される本発明の別の実施形態を表すブロック図である。この実施形態において、構築物は、図２に示される構築物と類似しており、シグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入された軽鎖を含む。発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、プレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体フラグメントまたはＦａｂがもたらされる。 図６は、プレプロタンパク質をコードする単一構築物が細胞に導入される本発明のさらに別の実施形態を表すブロック図である。この実施形態において、より長い重鎖をコードするための配列がシグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入される。発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、プレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望のＦａｂ’がもたらされる。 図７は、プレプロタンパク質をコードする単一構築物が細胞に導入される本発明のさらなる実施形態を表すブロック図である。この場合、構築物は、シグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入された軽鎖を含み、より長い重鎖がプロペプチドの反対側の端部に結合している。発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、プレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望のＦａｂ’がもたらされる。 図８は、プレプロタンパク質をコードする単一構築物が細胞に導入される本発明のさらに別の実施形態を表すブロック図である。この場合、構築物は、シグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入された完全な重鎖を含む。発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、プレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体がもたらされる。 図９は、プレプロタンパク質をコードする単一構築物が細胞に導入される本発明のなおさらに別の実施形態を表すブロック図である。この実施形態において、構築物は、シグナルペプチド（Ｓｐ）とプロペプチドとの間に挿入された軽鎖を含み、完全な重鎖がプロペプチドの反対側の端部に結合している。発現後、シグナルペプチド（Ｓｐ）が小胞体内で除かれて、プレプロタンパク質がもたらされる。細胞のゴルジにおけるその後の成熟化により、プロペプチドが除かれ、それにより、折り畳まれた所望の抗体がもたらされる。 図１０は、本発明によるプレプロタンパク質構築物をコードする単一構築物を使用してポリペプチドを製造するために利用され得る様々な基盤を示すブロック図である。この場合、プレプロタンパク質は、シグナルペプチド（Ｓｐ）、シグナルペプチドに結合した軽鎖、軽鎖に結合したプロタンパク質、および、プロタンパク質に結合した重鎖を含む。 図１１は、本発明によるプレプロタンパク質構築物をコードする単一遺伝子を使用してポリペプチドを製造するために利用され得る様々な基盤を示す、図１０と類似するブロック図である。この場合、プレプロタンパク質は、シグナルペプチド（Ｓｐ）、シグナルペプチドに結合した重鎖、重鎖に結合したプロタンパク質、および、プロタンパク質に結合した軽鎖を含む。
【配列表】
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Claims (26)

  1. 人工プロタンパク質であって、以下の３つのペプチド配列：
    （ａ）目的とする第１のペプチド配列、
    （ｂ）該目的とする第１のペプチド配列のＣ末端に結合したプロペプチド配列、および
    （ｃ）該プロペプチド配列のＣ末端に結合した目的とする第２のペプチド配列
    を含む人工プロタンパク質。
  2. 前記目的とする第１のペプチド配列のＮ末端に結合したシグナルペプチド配列をさらに含む、請求項１に記載の人工プロタンパク質。
  3. 抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含み、前記第１のペプチドが該抗体の重鎖または該抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、前記第２のペプチドが該抗体の重鎖または該抗体の軽鎖のいずれかである、請求項１に記載の人工プロタンパク質。
  4. 抗体軽鎖ペプチドおよびＦｄ重鎖ペプチドを含み、前記第１のペプチドが重鎖または抗体軽鎖のいずれかであり、かつ、前記第２のペプチドがＦｄまたは抗体軽鎖のいずれかである、請求項１に記載の人工プロタンパク質。
  5. Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含み、前記第１のペプチドが該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖または該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかであり、かつ、前記第２のペプチドが該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖または該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかである、請求項１に記載の人工プロタンパク質。
  6. 人工ポリヌクレオチドであって、以下の４つのヌクレオチド配列：
    （ａ）シグナルペプチド配列をコードする第１のヌクレオチド配列、
    （ｂ）目的とする第１のペプチドをコードし、該第１のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第２のヌクレオチド配列、
    （ｃ）プロペプチドをコードし、該第２のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第３のヌクレオチド配列、および
    （ｄ）目的とする第２のペプチドをコードし、該第３のヌクレオチド配列の３’末端に結合している第４のヌクレオチド配列
    を含む人工ポリヌクレオチド。
  7. 抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、前記第１のペプチドが該抗体の重鎖または該抗体の軽鎖のいずれかであり、かつ、前記第２のペプチドが該抗体の重鎖または該抗体の軽鎖のいずれかである、請求項６に記載の人工ポリヌクレオチド。
  8. Ｆａｂフラグメント軽鎖ペプチドおよびＦａｂフラグメント重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、前記第１のペプチドが該Ｆａｂフラグメントの重鎖または該Ｆａｂフラグメントの軽鎖のいずれかであり、かつ、前記第２のペプチドが該Ｆａｂフラグメントの重鎖または該Ｆａｂフラグメントの軽鎖のいずれかである、請求項６に記載の人工ポリヌクレオチド。
  9. Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、前記第１のペプチドが該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖または該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかである、請求項６に記載の人工ポリヌクレオチド。
  10. 請求項６に記載の人工ポリヌクレオチドを作製する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）シグナルペプチド配列、目的とする第１のペプチド、プロペプチド、および目的とする第２のペプチドをそれぞれコードする第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および第４のヌクレオチド配列を提供する工程、
    （ｂ）該第１のヌクレオチド配列の３’末端を該第２のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程、
    （ｃ）該第２のヌクレオチド配列の３’末端を該第３のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程、および
    （ｄ）該第３のヌクレオチド配列の３’末端を該第４のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程
    を包含し、該目的とする第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列が、該目的とする第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じであっても異なってもよい、方法。
  11. 前記人工ポリヌクレオチドが、抗体軽鎖ペプチドおよび抗体重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、前記第２のヌクレオチド配列が該抗体の重鎖または該抗体の軽鎖のいずれかをコードし、かつ、前記第４のヌクレオチド配列が該抗体の重鎖または該抗体の軽鎖のいずれかをコードする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記人工ポリヌクレオチドが、Ｆａｂ軽鎖ペプチドおよびＦａｂ重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、前記第２のヌクレオチド配列が該Ｆａｂフラグメントの重鎖または該Ｆａｂフラグメントの軽鎖のいずれかをコードし、かつ、前記第４のヌクレオチド配列が該Ｆａｂフラグメントの重鎖または該Ｆａｂフラグメントの軽鎖のいずれかをコードする、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記人工ポリヌクレオチドが、Ｆａｂフラグメント誘導体または抗体誘導体の軽鎖ペプチドおよび重鎖ペプチドを含むポリペプチドをコードし、前記第２のヌクレオチド配列が該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖または該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかをコードし、かつ、前記第４のヌクレオチド配列が該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の重鎖または該Ｆａｂフラグメント誘導体もしくは抗体誘導体の軽鎖のいずれかをコードする、請求項１０に記載の方法。
  14. 人工プレプロタンパク質を作製する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）該プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチドを作製する工程、および
    （ｂ）該人工ポリヌクレオチドを宿主生物において発現させ、それにより、該プレプロタンパク質が作製される、工程
    を包含する方法。
  15. 多量体タンパク質を作製する方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）シグナルペプチド配列、目的とする第１のペプチド、プロペプチド、および目的とする第２のペプチドをそれぞれコードする第１のヌクレオチド配列、第２のヌクレオチド配列、第３のヌクレオチド配列、および第４のヌクレオチド配列を提供する工程、
    （ｂ）該第１のヌクレオチド配列の３’末端を該第２のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程、
    （ｃ）該第２のヌクレオチド配列の３’末端を該第３のヌクレオチド配列の５’末端に結合する工程、および
    （ｄ）該第３のヌクレオチド配列の３’末端を該第４のヌクレオチド配列の５’末端に結合し、その結果、人工ポリヌクレオチドが生じ、そして、該人工ポリヌクレオチドは４つの該ヌクレオチド配列から構成され、ここで、該目的とする第１のペプチドをコードするヌクレオチド配列は、該目的とする第２のペプチドをコードするヌクレオチド配列と同じであっても異なってもよい工程、
    （ｉ）該生じた人工ポリヌクレオチドをトランスフェクションまたは安定的な形質転換によって宿主生物に導入する工程、
    （ｉｉ）該人工ポリヌクレオチドを該宿主生物において発現させ、それにより、プレプロタンパク質が作製される工程、
    （ｉｉｉ）該プレプロタンパク質を成熟型ポリペプチドにプロセシングさせる工程
    を包含する、方法。
  16. ２コピーの該成熟型ポリペプチドを結合させて、成熟型多量体タンパク質を形成させる工程をさらに包含する、請求項１５に記載の方法。
  17. 前記多量体タンパク質が、抗体もしくはＦａｂフラグメント、または、該抗体もしくは該Ｆａｂフラグメントのいずれかの誘導体である、請求項１５に記載の方法。
  18. 人工プレプロタンパク質をコードするベクターであって、以下：
    （ａ）該ベクターのヌクレオチドおよびタンパク質の複製のために必要なヌクレオチド配列、および
    （ｂ）該ベクターに挿入された請求項６に記載の人工ポリヌクレオチド
    を含む、ベクター。
  19. 免疫グロブリン分子を産生可能なトランスジェニック植物を作製するための方法であって、該方法は、以下：
    （ａ）プレプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチド配列を植物種のメンバーのゲノムに導入する工程であって、該プレプロタンパク質は、ａ）シグナルペプチド配列、ｂ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチド、ｃ）プロペプチド、およびｄ）免疫グロブリンの重鎖ペプチドまたは軽鎖ペプチドを含み、該重鎖が該プレプロタンパク質上の位置ｂまたは位置ｄのいずれかにおいて存在し得、該軽鎖がもう一方の位置に存在する、工程、および
    （ｂ）形質転換体を産生させるために、安定的な形質転換を生じさせる工程
    を包含する方法。
  20. 単一ＤＮＡ配列を含むベクターであって、該単一ＤＮＡ配列は、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードし、ここで該単一ＤＮＡ配列は、１カ所の挿入部位において該ベクター内に存在する、ベクター。
  21. （ａ）免疫グロブリンの重鎖および軽鎖またはＦａｂ領域からなる免疫グロブリンをコードするＤＮＡから本質的になるＤＮＡ配列を調製する工程であって、該免疫グロブリンは、特定の既知の抗原に対する特異性を有し、ここで、該ＤＮＡ配列は、少なくとも免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、切断可能なプロペプチドと、少なくとも免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとからなるプロタンパク質をコードする人工ポリヌクレオチドを組み込む、工程、
    （ｂ）工程ａ）のＤＮＡ配列を、好適なプロモーターに作動可能に連結されている複製可能な発現ベクター内に挿入する工程、
    （ｃ）原核生物微生物宿主または真核生物微生物宿主の細胞培養物を工程ｂ）のベクターで形質転換する工程、
    （ｄ）該宿主細胞を培養する工程、および
    （ｅ）該免疫グロブリンを該宿主細胞培養物から回収する工程であって、該免疫グロブリンは、既知の抗原に結合可能である工程、
    を包含する方法。
  22. 免疫グロブリン分子、または該免疫グロブリンの重鎖および軽鎖の可変ドメインを少なくとも含む免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントを、単一宿主細胞において製造するためのプロセスであって、該プロセスは、以下：
    少なくとも該免疫グロブリン重鎖の可変ドメインと、少なくとも該免疫グロブリン軽鎖の可変ドメインとをコードする単一ＤＮＡ配列を発現させ、その結果、該免疫グロブリン重鎖および該免疫グロブリン軽鎖が、該単一ＤＮＡ配列で形質転換された該単一宿主細胞において単一のプロタンパク質分子として産生される工程を包含する、プロセス。
  23. 第１および第２のペプチドを含む多量体タンパク質であって、該第１のペプチドがカルボキシ末端のＰ１位およびＰ２位において非天然アミノ酸対を含む、多量体タンパク質。
  24. 前記Ｐ２位が、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇによって占められる、請求項２３に記載の多量体タンパク質。
  25. 前記Ｐ１位が、Ｌｙｓ、ＰｒｏまたはＡｒｇによって占められる、請求項２３に記載の多量体タンパク質。
  26. 請求項２３に記載の多量体タンパク質に由来する多量体タンパク質であって、第１および第２のペプチドを含み、該第１のペプチドがカルボキシ末端のＰ１位およびＰ２位において非天然アミノ酸対を含む、多量体タンパク質。
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