JP2008539753A - 修飾fc領域およびfc受容体との結合変更を有する抗原結合分子 - Google Patents
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Abstract
本発明は、1つまたは複数のアミノ酸修飾を有するFc領域を含む抗原結合分子、例えば抗体であって、抗原結合分子が修飾(単数または複数)の結果として1つまたは複数のFc受容体との結合変更を示す抗原結合分子に向けられる。本発明はさらに、このような抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドおよびベクターに、それらを含む宿主細胞に、本発明の抗原結合分子の製造方法に、ならびに種々の疾患および障害、例えば癌の治療におけるそれらの使用に向けられる。
Description
本発明の分野
本発明は、1つまたは複数のアミノ酸修飾を有するFc領域を含む抗原結合分子、例えば抗体であって、抗原結合分子が修飾(単数または複数)の結果として1つまたは複数のFc受容体との結合変更を示す抗原結合分子に向けられる。本発明はさらに、このような抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドおよびベクターに、それらを含む宿主細胞に、本発明の抗原結合分子の製造方法に、ならびに種々の疾患および障害、例えば癌の治療におけるそれらの使用に向けられる。
本発明は、1つまたは複数のアミノ酸修飾を有するFc領域を含む抗原結合分子、例えば抗体であって、抗原結合分子が修飾(単数または複数)の結果として1つまたは複数のFc受容体との結合変更を示す抗原結合分子に向けられる。本発明はさらに、このような抗原結合分子をコードするポリヌクレオチドおよびベクターに、それらを含む宿主細胞に、本発明の抗原結合分子の製造方法に、ならびに種々の疾患および障害、例えば癌の治療におけるそれらの使用に向けられる。
本発明の背景
抗体は、体液性および細胞性免疫系間の連結を提供し、IgGが最も豊富な血清免疫グロブリンである。抗体のFab領域は抗原を認識し、一方、Fc部分は、すべての免疫コンピーテント細胞により示差的に発現されるFcγ受容体(FcγR)と結合する。多価抗原/抗体複合体による受容体架橋時に、脱顆粒、標的細胞の細胞溶解または食作用およびサイトカインコード遺伝子の転写的活性化が誘導される(Deo, Y.M. et al., Immunol. Today 18(3): 127-135 (1997))。
抗体は、体液性および細胞性免疫系間の連結を提供し、IgGが最も豊富な血清免疫グロブリンである。抗体のFab領域は抗原を認識し、一方、Fc部分は、すべての免疫コンピーテント細胞により示差的に発現されるFcγ受容体(FcγR)と結合する。多価抗原/抗体複合体による受容体架橋時に、脱顆粒、標的細胞の細胞溶解または食作用およびサイトカインコード遺伝子の転写的活性化が誘導される(Deo, Y.M. et al., Immunol. Today 18(3): 127-135 (1997))。
抗体Fc領域により媒介されるエフェクター機能は、2つの部類に分けられ得る:(1)抗体と抗原の結合後に働くエフェクター機能(これらの機能は、例えば補体カスケードまたはFc受容体(FcR)保有細胞の関与を包含する);ならびに(2)抗原結合と無関係に働くエフェクター機能(これらの機能は、例えば循環の持続性ならびに経細胞輸送により細胞バリアを横断して転移される能力を付与する)。例えば補体のC1構成成分と抗体との結合は、補体系を活性化する。補体の活性化は炎症応答も刺激し、そして自己免疫性過敏症にも関与し得る。さらに抗体はFc領域を介して細胞と結合し、抗体Fc領域上のFc受容体結合部位は細胞上のFc受容体(FcR)と結合する。IgG(ガンマ受容体)、IgE(イプシロン受容体)、IgA(アルファ受容体)およびIgM(ミュー受容体)を含めて、異なるクラスの抗体に特異的な多数のFc受容体が存在する。本発明はいかなる特定のメカニズムにも限定されないが、細胞表面のFc受容体との抗体の結合は、多数の重要な且つ多様な生物学的応答、例えば抗体被覆粒子の飲込みおよび破壊、免疫複合体のクリアランス、キラー細胞による抗体被覆標的細胞(抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性またはADCCとして既知)の溶解、炎症性媒介物質の放出、免疫グロブリン産生の胎盤通過および制御を誘発する。
FcRは、免疫グロブリンアイソタイプに対するそれらの特異性により限定される;IgG抗体に関するFc受容体はFcγRと呼ばれ、IgEに関してはFcεRと、IgAに関してはFcαRと呼ばれる。ヒトFcγRの3つのサブクラスが同定されている:FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)およびFcγRIII(CD16)。
各FcγRサブクラスは2または3つの遺伝子によりコードされ、代替的RNAスプライシングは多数の転写体をもたらすため、FcγRアイソフォームにおける広範な多様性が存在する。FcγRIサブクラスをコードする3つの遺伝子(FcγRIA、FcγRIBおよびFcγRIC)は、第一染色体の長腕の領域1q21.1で一団にされる。これらの異なるFcRサブタイプは、異なる細胞型上で発現される(例えばRavetch, J.V. and Kinet, J.P. Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991)参照)。例えばヒトでは、FcγRIIIBは好中球上にのみ見出されるが、一方、FcγRIIIAはマクロファージ、単球、ナチュラルキラー(NK)細胞上に、ならびにT細胞の亜集団に見出される。注目すべきは、FcγRIIIAは、ADCCに関与する細胞型のうちの1つであるNK細胞上に存在する唯一のFcRである。
FcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIは免疫グロブリンスーパーファミリー(IgSF)受容体である;FcγRIはその細胞外ドメインに3つのIgSFドメインを有し、一方、FcγRIIおよびFcγRIIIはそれらの細胞外ドメインに2つのIgSFドメインを有するだけである。
別の型のFc受容体は、新生児Fc受容体(FcRn)である。FcRnは主要組織適合性複合体(MHC)と構造的に類似し、そしてβ2‐マイクログロブリンに非共有結合的に結合されるα鎖からなる。
近年、腫瘍細胞のin vivo排除のための活性化受容体FcγRIIIaの重要性が発見された。濾胞性非ホジキンリンパ腫患者では、FcγRIIIa遺伝子型とリツキシマブ(血液学的悪性疾患に対して用いられる抗CD20キメラ抗体)に対する臨床的および分子的応答との間に関係が報告された(Cartron, G. et al., Blood 99(3): 754-758 (2002))。リツキシマブの効能は、この位置にフェニルアラニン残基を有する「低親和性」FcγRIIIa(FcγRIIIa[Phe‐158])に関してヘテロ接合的またはホモ接合的な患者におけるよりも、位置158でのバリンにより特性化される「高親和性」FcγRIIIa(FcγRIIIa[Val‐158])に関してホモ接合性の患者2おいてより高い、ということを著者等は実証した。この相違点は、FcγRIIIa陽性免疫細胞により示される抗体に対する有意の異なる親和力を説明すると思われる(Dall’Ozzo, S. et al., Cancer Res. 64 (13): 4664-4669 (2004))。
上記の観察は、腫瘍細胞の排除におけるFcγRIIIaに関する重要な役割を意味し、そしてFcγRIIIaに対する親和力増大を示すモノクローナル抗体(mAb)が改善された生物学的活性を有する、という考え方を支持する。FcγRIIIaに対する親和力を増強するための一経路、そしてその結果としてモノクローナル抗体のエフェクター機能は、それらの炭水化物部分の操作である(Umana, P. et al., Nat. Biotech. 17(2): 176-180 (1999); Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 277 (30): 26733-26740 (2002); Ferrara, C. et al.,投稿)。両Cγ2ドメイン中のAsn‐297でのFcのN‐グリコシル化は、すべてのFcγRに対する親和力のために(Tao, M.H. & Morrison, S.L., J. Immunol. 143(8): 2595-2601 (1989);Mimura, Y., et al., J. Biol. Chem. 276(49): 45539-45547 (2001))、そして適正なエフェクター機能を引き出すために(Wright, A. & Morrison, S.L., J. Exp. Med. 180(3): 1087-1096 (1994); Sarmay, G. et al., Mol. Immunol. 29(5): 633-639 (1992))重要である。それは、フコースの可変的付加ならびに外腕糖を有する保存五糖類構造からなる(Jefferis, R. et al., Immunol. Rev. 163: 59-76 (1998))。mAbのN‐グリコシル化パターンは、天然炭水化物をもたらす酵素活性を用いて産生細胞株のグリコシル化経路を工学処理することにより操作されてきた。その結果生じる糖鎖工学処理(GE)抗体は、高比率の分枝非フコシル化オリゴ糖、FcγRIIIaに対する親和力改善およびADCC増強を特徴づける(Umana, P. et al., Nat. Biotech. 17(2): 176-180 (1999); Ferrara, C. et al.,投稿)。同様の結果は、N結合オリゴ糖にフコース残基を付加することができない産生細胞株を用いて見出される(Sarmay, G. et al., Mol. Immunol. 29(5): 633-639 (1992))。
IgG Fcに関する状況と対比して、受容体活性に及ぼすFcγRIIIaグリコシル化の影響に関する情報はほとんど入手可能でない。hIgG1のFc断片との複合体中の非グリコシル化FcγRIIIの結晶構造は、Asn‐162に潜在的に結合されるFcγRIIIの推定炭水化物部分がFc断片内の中心空洞に向いている、ということを示し(Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 277(3): 26733-26740 (2002))、ここには、IgG‐Asn‐297に結合される強固なコアグリカンも位置する(Huber, R. et al., Nature 264(5585): 415-420 (1976))。この配置は、複合体形成時の両タンパク質の炭水化物部分の考え得るアプローチを示唆する。
分子レベルでのIgG1および可溶性ヒト(sh)FcγRIIIa間の相互作用を詳細に分析するために、表面プラズモン共鳴(SPR)により、そして細胞系において、shFcγRIIIa変異体と異なる抗体糖鎖変異体との結合を評価した。
発明の要約
一実施形態において、本発明は、Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子であって、上記Fc領域が上記糖鎖工学処理の結果としてオリゴ糖構造変更を有し、そして少なくとも1つのアミノ酸修飾を有する分子であり、上記抗原結合分子が上記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体との結合増大を示す分子に向けられる。好ましい実施形態では、糖鎖工学処理抗原結合分子は、ヒトFcγRII受容体、例えばFcγRIIa受容体またはFcγRIIbとの結合増大を示さない。
一実施形態において、本発明は、Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子であって、上記Fc領域が上記糖鎖工学処理の結果としてオリゴ糖構造変更を有し、そして少なくとも1つのアミノ酸修飾を有する分子であり、上記抗原結合分子が上記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体との結合増大を示す分子に向けられる。好ましい実施形態では、糖鎖工学処理抗原結合分子は、ヒトFcγRII受容体、例えばFcγRIIa受容体またはFcγRIIbとの結合増大を示さない。
好ましくは、FcγRIIIは、それがAsn162にN結合オリゴ糖を含むよう、グリコシル化される。一実施形態では、FcγRIII受容体はFcγRIIIaである。別の実施形態では、FcγRIII受容体はFcγRIIIbである。ある種の実施形態では、FcγRIIIa受容体は、位置158にバリン残基を有する。他の実施形態では、FcγRIIIa受容体は、位置158にフェニルアラニン残基を有する。
好ましい一実施形態では、本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、上記修飾を欠く抗原結合分子と比較して非グリコシル化FcγRIII受容体との結合を実質的に増大しない修飾を含有する。一実施形態では、本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、アミノ酸239、241、243、260、262、263、264、265、268、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302または303のうちの1つまたは複数で置換を含む。いくつかの実施形態では、糖鎖工学処理抗原結合分子は、表2および4に列挙された2またはそれ以上の置換を含む。いくつかの実施形態では、糖鎖工学処理抗原結合分子は、表5に列挙された2またはそれ以上の置換を含む。
本発明はさらに、FcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用するアミノ酸残基が天然アミノ酸に取って代わる1つまたは複数の置換を含む糖鎖工学処理抗原結合分子に向けられる。好ましくは、FcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用するアミノ酸残基は、以下の:Trp、His、Tyr、Glu、Arg、Asp、Phe、AsnおよびGlnから成る群から選択される。
好ましい一実施形態では、糖鎖工学処理抗原結合分子は、以下の:Ser239Asp、Ser239Glu、Ser239Trp、Phe243His、Phe243Glu、Thr260His、His268Asp、His268Gluから成る群から選択される置換を含む。代替的にまたは付加的には、本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、表2また4に列挙された1つまたは複数の置換を含有し得る。
好ましい一実施形態では、本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、上記修飾を欠く同一抗原結合分子と比較して少なくとも10%増大された親和力で、少なくとも20%増大された親和力で、少なくとも30%増大された親和力で、少なくとも40%増大された親和力で、少なくとも50%増大された親和力で、少なくとも60%増大された親和力で、少なくとも70%増大された親和力で、少なくとも80%増大された親和力で、少なくとも90%増大された親和力で、または少なくとも100%増大された親和力でFcγRIII受容体と結合する。
本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、好ましくはヒトIgG Fc領域を含む。一実施形態では、抗原結合分子はFc領域を含む抗体または抗体断片である。好ましい一実施形態では、抗体または抗体断片はキメラであるかまたはヒト化される。
ある種の実施形態では、本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、エフェクター機能増大を示す。好ましくはエフェクター機能増大は、抗体依存性細胞傷害性増大または補体依存性細胞傷害性増大である。
本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子中のオリゴ糖構造変更は、好ましくは、非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にフコース残基数の低減を含む。好ましい一実施形態では、Fc領域中の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%またはそれより多くのオリゴ糖が非フコシル化される。
本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子中のオリゴ糖構造変更は、非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合に分枝オリゴ糖数増大も含み得る。分枝オリゴ糖は、ハイブリッド型または複合型のものである。本発明は、上記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にGlcNAc残基対フコース残基比の増大を含む糖鎖工学処理抗原結合分子も包含する。
好ましい一実施形態では、本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、以下の:ヒトCD20抗原、ヒトEGFR抗原、ヒトMCSP抗原、ヒトMUC‐1抗原、ヒトCEA抗原、ヒトHER2抗原およびヒトTAG‐72抗原から成る群から選択される抗原を選択的に結合する。
本発明は、Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子であって、上記Fc領域が上記糖鎖工学処理の結果として糖鎖構造変更を有し、そして少なくとも1つのアミノ酸修飾を有し、そして上記抗原結合分子が上記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体に対する特異性増大を示す糖鎖工学処理抗原結合分子にも向けられる。好ましくは本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、ヒトFcγRII受容体、例えばヒトFcγRIIa受容体またはヒトFcγRIIb受容体に対する特異性増大を示さない。
FcγRIII受容体は、好ましくはグリコシル化される(即ちそれは、Asn162にN結合オリゴ糖を含む)。一実施形態では、FcγRIII受容体はFcγRIIIaである。代替的一実施形態では、FcγRIII受容体はFcγRIIIbである。ある種の実施形態では、FcγRIIIa受容体は位置158にバリン残基を有する。他の実施形態では、FcγRIIIa受容体は位置158にフェニルアラニン残基を有する。
好ましい一実施形態では、抗原結合分子のアミノ酸修飾は、修飾を欠く抗原結合分子と比較して非グリコシル化FcγRIII受容体に対する特異性を実質的に増大しない。
特に好ましい一実施形態では、修飾は、アミノ酸位置239、241、243、260、262、263、264、265、268、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302または303のうちの1つまたは複数でアミノ酸置換を含む。好ましい一実施形態では、置換は、FcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用するアミノ酸残基が天然アミノ酸に取って代わる。一実施形態では、FcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用するアミノ酸残基は、以下の:Trp、His、Tyr、Glu、Arg、Asp、Phe、AsnおよびGlnから成る群から選択される。
一実施形態では、置換は、以下の:Ser239Asp、Ser239Glu、Ser239Trp、Phe243His、Phe243Glu、Thr260His、His268Asp、His268Gluから成る群から選択される。本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、1つまたは複数の表2または5に列挙された置換も含有し得る。
好ましい一実施形態では、本発明は、上記抗原結合分子が上記修飾を欠く同一抗原結合分子と比較して少なくとも10%増大された特異性、少なくとも20%増大された特異性、少なくとも30%増大された特異性、少なくとも40%増大された特異性、少なくとも50%増大された特異性、少なくとも60%増大された特異性、少なくとも70%増大された特異性、少なくとも80%増大された特異性、少なくとも90%増大された特異性または少なくとも100%またはそれ以上増大された特異性でFcγRIII受容体と結合する糖鎖工学処理抗原結合分子を包含する。
好ましくは、特異性増大を示す本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、ヒトIgG Fc領域を含有する。別の好ましい実施形態では、抗原結合分子は、Fc領域を含む抗体または抗体断片である。特に好ましい一実施形態では、抗体または抗体断片はキメラであるかまたはヒト化される。
本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、好ましくは、エフェクター機能増大、例えば抗体依存性細胞傷害性増大または補体依存性細胞傷害性増大を示す。
オリゴ糖構造変更は、非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合、フコース残基数の低減を含み得る。例えば本発明は、Fc領域中の少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%またはそれ以上のオリゴ糖が非フコシル化される糖鎖工学処理抗原結合分子を包含する。
別の実施形態では、オリゴ糖構造変更は、非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合に分枝オリゴ糖数増大を含み得る。分枝オリゴ糖は、ハイブリッド型または複合型のものであり得る。一実施形態では、オリゴ糖構造変更は、非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合、GlcNAc残基対フコース残基比の増大を含む。
好ましい一実施形態では、本発明の糖鎖工学処理抗原結合分子は、以下の:ヒトCD20抗原、ヒトEGFR抗原、ヒトMCSP抗原、ヒトMUC‐1抗原、ヒトCEA抗原、ヒトHER2抗原およびヒトTAG‐72抗原から成る群から選択される抗原を選択的に結合する。
本発明は、抗体Fc領域または抗体Fc領域の断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、上記Fc領域またはその断片が少なくとも1つのアミノ酸修飾を有し、そして上記ポリペプチドが前記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体との結合増大を示すポリヌクレオチドにも向けられる。本発明は、このようなポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドにも向けられる。ポリペプチドは、抗体重鎖であり得る。ポリペプチドは、融合タンパク質でもあり得る。
本発明はさらに、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターおよび宿主細胞に向けられる。
本発明は、Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子の製造方法であって、上記Fc領域が前記糖鎖工学処理の結果として糖鎖構造変更を有し、ならびに少なくとも1つのアミノ酸修飾を有する方法であり、そして上記抗原結合分子が上記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体との結合増大を示す方法であって、以下の:
(i)上記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養し;そして
(ii)培地から上記糖鎖工学処理抗原結合分子を回収する
ことを包含する方法にも向けられる。
(i)上記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養し;そして
(ii)培地から上記糖鎖工学処理抗原結合分子を回収する
ことを包含する方法にも向けられる。
本発明は、Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子の製造方法であって、上記Fc領域が上記糖鎖工学処理の結果として糖鎖構造変更を有し、ならびに少なくとも1つのアミノ酸修飾を有する方法であり、そして上記抗原結合分子が前記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体に対する選択性増大を示す方法であって、以下の:
(i)上記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養し;そして
(ii)培地から上記糖鎖工学処理抗原結合分子を回収する
ことを包含する方法にも向けられる。
(i)上記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で本発明の宿主細胞を培養し;そして
(ii)培地から上記糖鎖工学処理抗原結合分子を回収する
ことを包含する方法にも向けられる。
本発明の詳細な説明
用語は、別記しない限り、以下のように当業界で一般的に用いられているのと同様に本明細書中で用いられる。
用語は、別記しない限り、以下のように当業界で一般的に用いられているのと同様に本明細書中で用いられる。
略語:Ig、免疫グロブリン;ADCC、抗体依存性細胞性細胞傷害;CDC、補体依存性細胞障害性;PBMC、末梢血単核球;GE、糖鎖工学処理化;GlcNAc、N‐アセチルグルコサミン;Man、マンノース;Gal、ガラクトース;Fuc、フコース;NeuAc、N‐アセチルノイラミン酸;GnT‐III、N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII;kon、会合速度定数;koff、解離速度定数。
本明細書中で用いる場合、「抗体」という用語は、全抗体分子、例えばモノクローナル、ポリクローナルおよび多重特異性(二重特異性)抗体、ならびにFc領域を有し、結合特異性を保有する抗体断片、ならびに免疫グロブリンのFc領域と機能的に等価の領域を含む、そして結合特異性および少なくとも1つのエフェクター機能、例えばADCCを保有する抗体断片、そして免疫グロブリンのFc領域と機能的に等価の領域を含み、結合特異性および少なくとも1つのエフェクター機能を保有する融合タンパク質を含むよう意図される。キメラおよびヒト化抗体、ならびにラクダ化および霊長類化抗体も包含される。
本明細書中で用いる場合、「Fc領域」という用語は、IgG重鎖のC末端領域を指すよう意図される。IgG重鎖のFc領域の境界はわずかに変化し得るが、しかしヒトIgG重鎖Fc領域は通常は、位置Cys226のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸びると定義される。
本明細書中で用いる場合、「免疫グロブリンのFc領域と等価の領域」という用語は、免疫グロブリンのFc領域の天然対立遺伝子変異体、ならびに置換、付加または欠失を生じるが、しかしエフェクター機能(例えば抗体依存性細胞性細胞傷害性)を媒介する免疫グロブリンの能力を実質的に低減しない変化を有する変異体を含むよう意図される。例えば1つまたは複数のアミノ酸は、生物学的機能の実質的損失を伴わずに、免疫グロブリンのFc領域のN末端またはC末端から欠失され得る。このような変異体は、活性に及ぼす最小作用を有するよう、当該技術分野で既知の一般原則に従って選択され得る(例えばBowie, J.U. et al., Science 247: 1306-1310 (1990)参照)。
本明細書中で用いる場合、「抗原結合分子またはABM」という用語は、その最も広い意味で、抗原決定基と特異的に結合する分子を指す。好ましくはABMは抗体である;しかしながら1本鎖抗体、1本鎖Fv分子、Fab断片、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ等も本発明により意図される。
「特異的に結合する」または「同一特異性で結合する」とは、本発明の抗原結合分子を説明するために用いられる場合、結合が抗原に関して選択的であることを意味し、そして望ましくないかまたは非特異的な相互作用とは区別され得る。
本明細書中で用いる場合、「融合およびキメラ」という用語は、ABMのようなポリペプチドに関して用いられる場合、異なる種からの抗体の一部のような、2またはそれより多い異種ポリペプチド由来のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。例えばキメラABMに関して、非抗原結合構成成分は、広範な種々の種、例えば霊長類、例えばチンパンジーおよびヒト由来であり得る。キメラABMの定常領域は、最も好ましくは天然ヒト抗体の定常領域と実質的に同一である;キメラ抗体の可変領域は、最も好ましくはネズミ可変領域のアミノ酸配列を有する組換え抗抗体のものと実質的に同一である。ヒト化抗体は、融合またはキメラ抗体の特に好ましい形態である。
本明細書中で用いる場合、例えばGnTIII活性を有するポリペプチドとは、N結合型オリゴ糖のトリマンノシルコアのβ結合型マンノシドへのβ‐1‐4連結中のN‐アセチルグルコサミン(GlcNAc)残基の付加を触媒し得るポリペプチドを指す。これは、特定の生物学的検定(用量依存性を伴ってまたは伴わずに)で測定した場合に、国際生化学分子生物学連合の命名委員会(NC‐IUBMB)によりβ‐1,4‐マンノシル‐糖タンパク質4‐β‐N‐アセチルグルコサミニル‐トランスフェラーゼ(EC 2.4.1.144)としても既知であるβ(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIIIの活性と類似するがしかし必ずしも同一ではない酵素活性を示す融合ポリペプチドを包含する。用量依存性が存在する場合、GnTIIIのものと同一である必要はなく、むしろ、GnT‐IIIと比較した場合、所定の活性における用量依存性と実質的に類似する(即ち、GnT‐IIIに比して、候補ポリペプチドはより大きな活性、または約25分の1以下、好ましくは約10分の1以下の活性、最も好ましくは約3分の1以下の活性を示す)。
本明細書中で用いる場合、「変異体(または類似体)」という用語は、例えば組換えDNA技術を用いて作製されるアミノ酸挿入、欠失および置換による本発明の特定的に列挙されたポリペプチドとは異なるポリペプチドを指す。本発明のABMの変異体としては、抗原結合親和性または抗体エフェクター機能に実質的に影響を及ぼさないような方法で1つまたはいくつかのアミノ酸残基が置換、付加および/または欠失により修飾されるキメラ、霊長類化またはヒト化抗原結合分子が挙げられる。当該活性を無効にすることなくどのアミノ酸残基が取り替えられ、付加され、または欠失され得るかを決定するに際しての指針は、特定ポリペプチドの配列を相同ペプチドの配列と比較し、高相同性の領域(保存領域)中に作られるアミノ酸配列変化の数を最小限にすることにより、あるいはアミノ酸配列をコンセンサス配列と取り替えることにより、見出され得る。
あるいはこれらの同一または類似ポリペプチドをコードする組換え変異体は、遺伝暗号の「冗長性」を用いることにより、合成されるかまたは選択され得る。種々のコドン置換、例えば種々の制限部位を生じるサイレント変化は、プラスミドまたはウイルスベクター中へのクローニングあるいは特定の原核生物または真核生物系中の発現を最適化するために導入され得る。ポリヌクレオチド配列中の突然変異は、ポリペプチドに付加されるポリペプチドまたは他のペプチドのドメインに反映されて、ポリペプチドの任意の部分の特性を修飾し、リガンド結合親和性、鎖間親和性または分解/代謝回転率のような特質を変える。
好ましくはアミノ酸「置換」は、一アミノ酸を、類似の構造的および/または化学的特性を有する別のアミノ酸と取り替えた結果(即ち保存的アミノ酸置換)である。「保存的」アミノ酸置換は、包含される残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性における類似性に基づいて作製され得る。例えば非極性(疎水性)アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられ;極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ;正荷電(塩基性)アミノ酸としては、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられ;そして負荷電(酸性)アミノ酸としてはアスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。「挿入」または「欠失」は好ましくは、約1〜20アミノ酸、さらに好ましくは1〜10アミノ酸の範囲である。可能にされる変異は、組換えDNA技術を用いてポリペプチド分子中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に作製し、そしてその結果生じる組換え変異体を活性に関して検定することにより、実験的に確定され得る。
本明細書中で用いる場合、「ヒト化される」という用語は、親分子の抗原結合特性を保有するかまたは実質的に保有するが、しかしヒトにおいて低免疫原性である非ヒト抗原結合分子由来の抗原結合分子、例えばネズミ抗体を指すために用いられる。これは、以下の:(a)重要フレームワーク残基(例えば良好な抗原結合親和性または抗体機能を保有するために重要であるもの)の保持を伴うかまたは伴わずに、ヒトフレームワークおよび定常領域上に非ヒト相補性決定領域(CDR)のみをグラフトし、あるいは(b)全非ヒト可変ドメインを移植するが、しかし表面残基の置換によりヒト様部分でそれらを「覆う」ことを含めた種々の方法により達成され得る。このような方法は、Jones et al., Nature 321: 6069, 522-525 (1986); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81: 6851-6855 (1984);Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988);Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988);Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991);Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994)(これらの記載内容はすべて、参照により本明細書中で援用される)に開示されている。
抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインの各々に一般的に3つの相補性決定領域またはCDR(CDR1、CDR2およびCDR3)が存在し、これらは、4つのフレームワーク亜領域(即ちFR1、FR2、FR3およびFR4)により隣接される:FR1‐CDR1‐FR2‐CDR2‐FR3‐CDR3‐FR4。ヒト化抗体についての考察は、特に、米国特許第6,632,927号にそして公開済み米国特許出願第2003/0175269号(これらの記載内容はともに参照により本明細書中で援用される)に見出され得る。
同様に、本明細書中で用いる場合、「霊長類化される」という用語は、親分子の抗原結合特性を保有するかまたは実質的に保有するが、しかし霊長類において低免疫原性である非霊長類抗原結合分子由来の抗原結合分子、例えばネズミ抗体を指すために用いられる。
当該技術分野内で用いられるかおよび/または許容される用語の2またはそれより多い定義が存在する場合、本明細書中で用いられるような用語の定義は、明白に別記されない限り、すべてのこのような意味を含むよう意図される。特定の一例は、重鎖および軽鎖ポリペプチドの両方の可変領域内に見出される非連続抗原結合部位を記載するための「相補性決定領域」(「CDR」)という用語の使用である。この特定の領域は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)により、ならびにChothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987)により(これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される)記載されており、この場合、当該定義は、互いに比較した場合、アミノ酸残基の重複またはサブセットを包含する。それにもかかわらず、抗体またはその変異体のCDRに言及するためのいずれかの定義の適用は、本明細書中で定義され、用いられるような用語の範囲内であるよう意図される。上記の引用参考文献の各々により定義されるようなCDRを包含する適切なアミノ酸残基は、比較として表1に以下で記述される。特定CDRを包含する的確な残基数は、CDRの配列およびサイズによって変わる。抗体の可変領域アミノ酸配列を仮定すると、どの残基が特定CDRを含むかを当業者はルーチンに確定し得る。
Kabat等は、任意の抗体に適用可能である可変ドメイン配列に関するナンバリングシステムも定義した。配列それ自体以上に任意の実験データに頼ることなく、任意の可変ドメイン配列に「Kabatナンバリング」のこの系を非多義的に当業者は割り当て得る。本明細書中で用いる場合、「Kabatナンバリング」は、Kabat et al., U.S. Dept. of Health and Human Services, “Sequences of Proteins of Immunological Interest” (1983)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)に記述されたナンバリングシステムを指す。任意の配列表の配列(即ち配列番号1〜配列番号2)は、Kabatナンバリング系に従って番号を付されるわけではない。しかしながら上記のように、そこに提示されるような配列のナンバリングに基づいて配列表中の任意の可変領域配列のKabatナンバリングスキームを確定することは、十分に当業者の範囲内である。
本発明の参照ヌクレオチド配列と例えば少なくとも95%「同一である」か、または95%の「同一性を有する」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の各々100ヌクレオチド当たり5までの点突然変異を含み得る以外は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は参照配列と同一であると意図される。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも95%同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列中のヌクレオチドの5%までが欠失されるかまたは別のヌクレオチドで置換され得るし、あるいは参照配列中の全ヌクレオチドの5%までの数のヌクレオチドが参照配列中に挿入され得る。
実際問題として、任意の特定核酸分子またはポリペプチドが本発明のヌクレオチド配列またはポリペプチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラムを用いて慣用的に確定され得る。クエリ配列(本発明の配列)および対象配列間の最良の全体的整合(全体的配列アラインメントとも呼ばれる)を確定するための好ましい方法は、Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータープログラムを用いて確定され得る。配列アラインメントでは、クエリおよび対象配列はともにDNA配列である。RNA配列は、UをTに転換することにより比較され得る。上記の全体的配列アラインメントの結果は、同一性%である。同一性%を算定するためにDNA配列のFASTDBアラインメントに用いられる好ましいパラメーターを以下に示す:行列=ユニタリ、k-tuple=4、ミスマッチ・ペナルティ=1、連結ペナルティ=30、無作為化群長=0、カットオフ・スコア=1、ギャップ・ペナルティ=5、ギャップサイズ・ペナルティ=0.05、ウインドウサイズ=500または対象ヌクレオチド配列の長さ(いずれか短い方)。
5’または3’欠失のため(内部欠失のためでなく)対象配列がクエリ配列より短い場合、結果に対してマニュアル補正がなされなければならない。これは、同一性%を算定する場合、FASTDBプログラムが対象配列の5’および3’切頭化を説明しないためである。5’または3’末端で切頭化される対象配列に関しては、クエリ配列に比して、同一性%は、クエリ配列の総塩基の%として、整合/整列されない対象配列の5’および3’であるクエリ配列の塩基数を算定することにより補正される。ヌクレオチドが整合/整列されるか否かは、FASTDB配列アラインメントの結果により確定される。次にこのパーセンテージは、特定パラメーターを用いて上記FASTDBプログラムにより算定される同一性%から差し引かれて、最終同一性%スコアに到達する。この補正スコアは、本発明の目的のために用いられるものである。クエリ配列と整合/整列されないFASTDBアラインメントにより表示されるような対象配列の5’および3’塩基の外側の塩基のみが、同一性%スコアをマニュアル調整する目的のために算定される。
例えば90塩基対象配列は、同一性%を確定するために、100塩基クエリ配列と整列される。欠失は対象配列の5’末端で起こり、したがってFASTDBアラインメントは、5’末端の最初の10塩基の整合化/アラインメントを示さない。10非対合塩基は10%配列(整合されない5’および3’末端の塩基数/クエリ配列中の塩基の総数)を表わし、そこでFASTDBプログラムにより算定される同一性%スコアから10%が差し引かれる。残りの90塩基が完全に整合された場合、最終同一性%は90%である。別の例では、90塩基対象配列が100塩基クエリ配列と比較される。この時点で、欠失は内部欠失であり、したがってクエリと整合/整列されない対象配列の5’または3’末端上に塩基は存在しない。この場合、FASTDBにより算定される同一性%はマニュアル補正されない。さらにまた、クエリ配列と整合/整列されない対象配列の5’および3’末端上の塩基のみがマニュアル補正される。本発明の目的のためになされる他のマニュアル補正はない。
本発明のクエリアミノ酸配列と例えば少なくとも95%「同一である」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象ポリペプチドのアミノ酸配列がクエリアミノ酸配列の各々100アミノ酸当たり5までのアミノ酸変化を含み得る以外は、対象ポリペプチドのアミノ酸配列はクエリ配列と同一であると意図される。言い換えれば、クエリアミノ酸配列と少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、対象配列中のアミノ酸残基の5%までが別のアミノ酸を挿入され、欠失されるかまたは別のアミノ酸で置換され得る。参照配列のこれらの変化は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端位置で、あるいは参照配列中のあるいは参照配列内の1つまたは複数の連続群中の残基間に独立して差し入れられるそれらの末端位置間の何処かで起こり得る。
実際問題として、任意の特定ポリペプチドが参照ポリペプチドと少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるか否かは、既知のコンピュータープログラムを用いて慣用的に確定され得る。クエリ配列(本発明の配列)および対象配列間の最良の全体的整合(全体的配列アラインメントとも呼ばれる)を確定するための好ましい方法は、Brutlag et al., Comp. App. Biosci. 6: 237-245 (1990)のアルゴリズムに基づいたFASTDBコンピュータープログラムを用いて確定され得る。配列アラインメントでは、クエリおよび対象配列はともにヌクレオチド配列であるか、ともにアミノ酸配列である。上記の全体的配列アラインメントの結果は、同一性%である。FASTDBアミノ酸アラインメントに用いられる好ましいパラメーターを以下に示す:行列=PAM 0、k-tuple=2、ミスマッチ・ペナルティ=1、連結ペナルティ=20、無作為化群長=0、カットオフ・スコア=1、ウインドウサイズ=配列長、ギャップ・ペナルティ=5、ギャップサイズ・ペナルティ=0.05、ウインドウサイズ=500または対象アミノ酸配列の長さ(いずれか短い方)。
N‐またはC‐末端欠失のため(内部欠失のためでなく)対象配列がクエリ配列より短い場合、結果に対してマニュアル補正がなされなければならない。これは、全体的同一性%を算定する場合、FASTDBプログラムが対象配列のN‐およびC‐末端切頭化を説明しないためである。N‐およびC‐末端で切頭化される対象配列に関しては、クエリ配列に比して、同一性%は、クエリ配列の総塩基の%として、対応する対象残基と整合/整列されない対象配列のN‐およびC‐末端であるクエリ配列の残基数を算定することにより補正される。残基が整合/整列されるか否かは、FASTDB配列アラインメントの結果により確定される。次にこのパーセンテージは、特定パラメーターを用いて上記FASTDBプログラムにより算定される同一性%から差し引かれて、最終同一性%スコアに到達する。この最終同一性%スコアは、本発明の目的のために用いられるものである。クエリ配列と整合/整列されない対象配列のN‐およびC‐末端塩基への残基のみが、同一性%スコアをマニュアル調整する目的のために考慮される。即ち、クエリ残基のみが、対象配列の最も遠いN‐およびC‐末端残基の外側に位置する。
例えば90アミノ酸残基対象配列は、同一性%を確定するために、100残基クエリ配列と整列される。欠失は対象配列のN‐末端で起こり、したがってFASTDBアラインメントは、N‐末端の最初の10残基の整合化/アラインメントを示さない。10非対合残基は配列の10%(整合されないN‐およびC‐末端の残基数/クエリ配列中の残基の総数)を表わし、そこでFASTDBプログラムにより算定される同一性%スコアから10%が差し引かれる。残りの90残基が完全に整合された場合、最終同一性%は90%である。別の例では、90残基対象配列が100残基クエリ配列と比較される。この時点で、欠失は内部欠失であり、したがってクエリと整合/整列されない対象配列のN‐またはC‐末端での残基は存在しない。この場合、FASTDBにより算定される同一性%はマニュアル補正されない。さらにまた、クエリ配列と整合/整列されない、FASTDBアラインメントで表示されるような、対象配列のN−およびC‐末端の外側の残基位置のみがマニュアル補正される。本発明の目的のためになされる他のマニュアル補正はない。
本明細書中で用いる場合、本発明の核酸配列と「緊縮条件下でハイブリダイズする」核酸とは、50%ホルムアミド、5×SSC(750 mMNaCl、75 mMクエン酸ナトリウム)、50 mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5×デンハート溶液、10%硫酸デキストランおよび20 μg/ml変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中で42℃で一晩インキュベーションし、その後、約65℃で0.1×SSC中でフィルターを洗浄して、ハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。
本明細書中で用いる場合、「ゴルジ局在化ドメイン」という用語は、ゴルジ複合体内の位置にポリペプチドを固定するのに関与するゴルジ常在性ポリペプチドのアミノ酸配列を指す。一般的に、局在化ドメインは酵素のアミノ末端「尾部」を含む。
本明細書中で用いる場合、エフェクター機能という用語は、抗体のFc領域(ネイティブ配列Fc領域またはアミノ酸配列変異体Fc領域)に起因する生物学的活性を指す。抗体エフェクター機能の例としては、Fc受容体結合親和性、抗体依存性細胞性細胞傷害性(ADCC)、抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込み、細胞表面受容体の下向き調節等が挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書中で用いる場合、「工学処理する」、「工学処理される」、「工学処理」および「糖鎖工学処理する」、「糖鎖工学処理される」、「糖鎖工学処理」および「グリコシル化工学処理」という用語は、天然または組換えポリペプチド、例えば抗原結合分子(ABM)、またはその断片のグリコシル化パターンの任意の操作を含むとみなされる。グリコシル化工学処理としては、細胞のグリコシル化機構の代謝的工学処理、例えば細胞中で発現される糖タンパク質のグリコシル化変更を達成するためのオリゴ糖合成経路の遺伝子操作が挙げられる。さらに、グリコシル化工学処理は、グリコシル化に及ぼす突然変異および細胞環境の影響を包含する。一実施形態では、グリコシル化工学処理は、グリコシルトランスフェラーゼ活性の変更である。特定の一実施形態では、工学処理は、グリコサミニルトランスフェラーゼ活性および/またはフコシルトランスフェラーゼ活性の変更を生じる。
本明細書中で用いる場合、「宿主細胞」という用語は、本発明のポリペプチドおよび抗原結合分子を生成するよう工学処理され得る任意の種類の細胞系を網羅する。一実施形態では、宿主細胞は、修飾化糖鎖を有する抗原結合分子の産生を可能にするよう工学処理される。好ましい実施形態では、抗原結合分子は、抗体、抗体断片または融合タンパク質である。ある種の実施形態では、宿主細胞は、GnTIII活性を有する1つまたは複数のポリペプチドのレベル増大を発現するようさらに操作された。他の実施形態では、宿主細胞は、コアα1,6‐フコシルトランスフェラーゼ活性を排除し、低減し、または阻害するよう工学処理された。「コアα1,6‐フコシルトランスフェラーゼ活性」という用語は、コアα1,6‐フコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現、ならびにコアα1,6‐フコシルトランスフェラーゼ酵素とその基質との相互作用の両方を包含する。宿主細胞としては、少数の例を挙げれば、培養細胞、例えば哺乳類培養細胞、例えばCHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、Y0骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられるが、しかしトランスジェニック動物、トランスジェニック植物または培養植物または動物組織内に含まれる細胞も挙げられる。
本明細書中で用いる場合、「ネイティブ配列Fc領域」という用語は、自然界に一般的に見出されるFc領域のアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を指す。例示的ネイティブ配列ヒトFc領域としては、ネイティブ配列ヒトIgG1 Fc領域(非AおよびAアロタイプ);ネイティブ配列ヒトIgG2 Fc領域;ネイティブ配列ヒトIgG3 Fc領域;およびネイティブ配列ヒトIgG4 Fc領域;ならびにその天然変異体が挙げられる。その他の配列は意図され、そして種々のウエブサイト(例えばNCBIのウエブサイト)から容易に得られる。
「Fc受容体」および「FcR」という用語は、Fc領域の機能的等価物のFc領域(例えば抗体または抗体断片のFc領域)と結合する受容体を説明するために用いられる。Fc受容体の部分は、本発明のいくつかの実施形態において特定的に意図される。好ましい実施形態では、FcRはネイティブ配列ヒトFcRである。他の好ましい実施形態では、FcRはIgG抗体と結合するもの(ガンマ受容体)であり、例としてはFcγRI、FcγRIIおよびFcγRIIIサブクラスの受容体、例えばこれらの受容体の対立遺伝子変異体および代替的スプライス化形態が挙げられる。FcγRII受容体としては、FcγRIIa(「活性化受容体」)およびFcγRIIb(「阻害受容体」)が挙げられ、これらは主にその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化受容体FcγRIIaは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ(ITAM)を含有する。阻害受容体FcγRIIbは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ(ITIM)を含有する。当該用語は、新生児受容体、FcRn(胎児への母体IgGの移動に関与する)も包含する。本発明に包含される一Fc受容体の一例は、低親和性免疫グロブリンガンマFc領域受容体III‐A前駆体(IgG Fc受容体III‐2)(Fc‐ガンマRIII‐アルファ)(Fc‐ガンマRIIIa)(FcRIIIa)(Fc‐ガンマRIII)(FcRIII)(抗原CD16‐A)(FcR‐10)である。その配列[gi:119876]をいかに記述する:
本明細書中で用いる場合、FcR結合親和性またはエフェクター機能(単数または複数)の変更を有するポリペプチド変異体は、親ポリペプチドとまたはネイティブ配列Fc領域を含むポリペプチドと比較して、FcR結合活性および/またはエフェクター機能の増強(即ち増大)または減少(即ち低減)を示すものである。FcRとの結合増大を示すポリペプチド変異体は、親ポリペプチドより良好な親和力で、少なくとも1つのFcRを結合する。FcRとの結合低減を示すポリペプチド変異体は、親ポリペプチドより劣悪な親和力で少なくとも1つのFcRを結合する。FcRに対する結合低減を示すこのような変異体は、FcRとの容易に評価可能な結合をほとんどまたは全く保有せず、例えば親ポリペプチドと比較して、FcRとの0〜20%の結合を保有する。親ポリペプチドと比較して増大された親和力でFcRを結合するポリペプチド変異体は、結合検定におけるポリペプチド変異体および親ポリペプチドの量が本質的に同一であり、そして他の条件がすべて同一である場合、親抗体より高い結合親和力で上で同定されたFcRのうちの任意の1つまたは複数を結合するものである。例えばFcR結合親和力改善を有するポリペプチド変異体は、親ポリペプチドと比較してFcR結合親和力の約1.10倍〜約100倍(さらに典型的には約1.2倍〜約50倍)の改善(即ち増大)を示し得る(この場合、FcR結合親和力は、例えばFACSベースの検定またはSPR分析(Biacore)で確定される)。
本明細書中で用いる場合、「アミノ酸修飾」とは、所定のアミノ酸配列のアミノ酸配列中の変化を指す。例示的修飾としては、アミノ酸の置換、挿入および/または欠失が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、アミノ酸修飾は置換(例えば親ポリペプチドのFc領域における)である。特定位置での(例えばFc領域における)アミノ酸修飾は、特定残基の置換または欠失、あるいは特定残基に隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基の挿入を指す。挿入は、特定残基に対してN‐末端またはC‐末端であり得る。
「結合親和力」という用語は、各Fc受容体‐Fc結合相互作用と関連した平衡解離定数(濃度の単位で表わされる)を指す。結合親和力は、動力学的オフ・レート(一般的に逆時間の単位、例えばsecond.sup.-1で報告される)を動力学的オン・レート(一般的に単位時間あたりの濃度の単位、例えばモル/秒で報告される)で割った比率に直接関連する。概して、これらのパラメーターの各々が実験的に(例えばBIACORE(www.biacore.com参照)またはSAPIDYNE測定により)確定されない限り、平衡解離定数の変化がオン・レート、オフ・レートまたはその両方における差のためであるか否かを明白にのべつことはできない。
本明細書中で用いる場合、「Fc媒介性細胞性細胞傷害性」という用語は、抗体依存性細胞性細胞傷害性、ならびにヒトFc領域を含有する可溶性Fc融合タンパク質により媒介される細胞性細胞障害性を包含する。それは、「ヒト免疫エフェクター細胞」による「抗体標的化細胞」の溶解をもたらす免疫メカニズムである。この場合:
ヒト免疫「エフェクター細胞」は、それらが抗体のFc領域またはFc融合タンパク質と結合するそれらの表面にFc受容体を表示し、そしてエフェクター機能を実施する白血球の集団である。このような集団としては、末梢血単核球(PBMC)および/またはナチュラルキラー(NK)細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
「抗体標的化細胞」は、本発明のABM(例えば抗体またはFc融合タンパク質)により結合される細胞である。概して、抗体またはFc融合タンパク質は、Fc領域に対してN末端のタンパク質部分を介して標的細胞と結合する。
本明細書中で用いる場合、「Fc媒介性細胞性細胞障害性増大」という用語は、上記のFc媒介性細胞性細胞傷害性のメカニズムにより、所定時間で、標的細胞周囲の培地中の抗体のまたはFc融合タンパク質の所定濃度で溶解される「抗体標的化細胞」の数の増大、および/または、Fc媒介性細胞傷害性のメカニズムにより、所定時間に、所定数の「抗体標的化細胞」の溶解を達成するために必要とされる標的細胞周囲の培地中の抗体のまたはFc融合タンパク質の濃度の低減と定義される。Fc媒介性細胞性細胞傷害性の増大は、当業者に既知である同一標準産生、精製、処方および貯蔵方法を用いて、同一型の宿主細胞により産生されるが、しかし本明細書中に記載される方法によりグリコシルトランスフェラーゼGnTIIIを発現するよう工学処理される宿主細胞により産生されなかった同一抗体またはFc融合タンパク質により媒介される細胞性細胞傷害性に関連する。
「抗体依存性細胞性細胞傷害性増大」を示す抗体(ADCC)とは、当該用語が本明細書中で定義される場合、当業者に既知の任意の適切な方法により確定されるようなADCC増大を示す抗体を意味する。一許容in vitroADCC検定を以下に示す:
1)検定は、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することが既知である標的細胞を用いる;
2)検定は、エフェクター細胞として無作為選択される健常ドナーの血液から単離されるヒト末梢血単核球(PBMC)を用いる;
3)検定は、以下のプロトコールに従って実行される:
i)PBMCは標準密度遠心分離手法を用いて単離され、RPMI細胞培地中に5×106細胞/mlで懸濁される;
ii)標的細胞は標準組織培養法により増殖され、90%より高い生存度で指数増殖期から収穫され、RPMI細胞培地中で洗浄され、100マイクロキュリーの51Crで標識され、細胞培地で2回洗浄され、105細胞/mlの密度で細胞培地中に再懸濁される;
iii)上記の100マイクロリットルの最終標的細胞懸濁液を96ウエル微量滴定プレートの各ウエルに移し;
iv)抗体を細胞培地中で4000 ng/mlから0.04 ng/mlまで連続希釈し、その結果生じた抗体溶液50マイクロリットルを96ウエル微量滴定プレート中の標的細胞に付加して、上記の全濃度範囲を網羅する種々の抗体濃度を三重反復実験で試験する;
v)最大放出(MR)制御のために、標識化標的細胞を含有するプレート中の3つの付加的ウエルは、抗体溶液(上記iv時点)の代わりに、非イオン性洗剤(Nonidet, Sigma, St. Louis)の2%(V/V)水溶液50マイクロリットルを入れる;
vi)自発的放出(SR)制御のために、標識化標的細胞を含有するプレート中の3つの付加的ウエルは、抗体溶液(上記iv時点)の代わりに、RPMI細胞培地50マイクロリットルを入れる;
vii)96ウエル微量滴定プレートは次に、50×gで1分間遠心分離され、4℃で1時間インキュベートされる;
viii)PBMC懸濁液(上記i時点)50マイクロリットルは各ウエルに付加されて、25:1のエフェクター:標的細胞比を生じ、そしてプレートは、37℃で4時間、5%CO2大気下でインキュベーター中に置かれる;
ix)各ウエルからの無細胞上清を収穫し、そして実験的に放出される放射能(ER)はガンマ計数器を用いて定量される;
x)特異的溶解のパーセンテージは、式(ER‐MR)/(MR‐SR)×100(式中、ERはその抗体濃度に関して定量される平均放射能であり(上記ix時点参照)、MRはMR対照(上記v時点参照)に関して定量される平均放射能(上記ix時点参照)であり、そしてSRは、SR対照(上記vi時点参照)に関して定量される平均放射能(上記ix時点参照)である)により、各抗体濃度に関して算定される;
4)「ADCC増大」は、上記の試験される抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増大、および/または上記の試験される抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の低減と定義される。ADCCの増大は、当業者に既知であるが、しかしGnTIIIを過剰発現するよう工学処理された宿主細胞により産生されなかった同一標準産生、精製、処方および貯蔵方法を用いて、上記の検定で測定され、同一抗体により媒介され、同一型の宿主細胞により産生されるADCCに比例する。
1)検定は、抗体の抗原結合領域により認識される標的抗原を発現することが既知である標的細胞を用いる;
2)検定は、エフェクター細胞として無作為選択される健常ドナーの血液から単離されるヒト末梢血単核球(PBMC)を用いる;
3)検定は、以下のプロトコールに従って実行される:
i)PBMCは標準密度遠心分離手法を用いて単離され、RPMI細胞培地中に5×106細胞/mlで懸濁される;
ii)標的細胞は標準組織培養法により増殖され、90%より高い生存度で指数増殖期から収穫され、RPMI細胞培地中で洗浄され、100マイクロキュリーの51Crで標識され、細胞培地で2回洗浄され、105細胞/mlの密度で細胞培地中に再懸濁される;
iii)上記の100マイクロリットルの最終標的細胞懸濁液を96ウエル微量滴定プレートの各ウエルに移し;
iv)抗体を細胞培地中で4000 ng/mlから0.04 ng/mlまで連続希釈し、その結果生じた抗体溶液50マイクロリットルを96ウエル微量滴定プレート中の標的細胞に付加して、上記の全濃度範囲を網羅する種々の抗体濃度を三重反復実験で試験する;
v)最大放出(MR)制御のために、標識化標的細胞を含有するプレート中の3つの付加的ウエルは、抗体溶液(上記iv時点)の代わりに、非イオン性洗剤(Nonidet, Sigma, St. Louis)の2%(V/V)水溶液50マイクロリットルを入れる;
vi)自発的放出(SR)制御のために、標識化標的細胞を含有するプレート中の3つの付加的ウエルは、抗体溶液(上記iv時点)の代わりに、RPMI細胞培地50マイクロリットルを入れる;
vii)96ウエル微量滴定プレートは次に、50×gで1分間遠心分離され、4℃で1時間インキュベートされる;
viii)PBMC懸濁液(上記i時点)50マイクロリットルは各ウエルに付加されて、25:1のエフェクター:標的細胞比を生じ、そしてプレートは、37℃で4時間、5%CO2大気下でインキュベーター中に置かれる;
ix)各ウエルからの無細胞上清を収穫し、そして実験的に放出される放射能(ER)はガンマ計数器を用いて定量される;
x)特異的溶解のパーセンテージは、式(ER‐MR)/(MR‐SR)×100(式中、ERはその抗体濃度に関して定量される平均放射能であり(上記ix時点参照)、MRはMR対照(上記v時点参照)に関して定量される平均放射能(上記ix時点参照)であり、そしてSRは、SR対照(上記vi時点参照)に関して定量される平均放射能(上記ix時点参照)である)により、各抗体濃度に関して算定される;
4)「ADCC増大」は、上記の試験される抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの増大、および/または上記の試験される抗体濃度範囲内で観察される特異的溶解の最大パーセンテージの半分を達成するために必要とされる抗体の濃度の低減と定義される。ADCCの増大は、当業者に既知であるが、しかしGnTIIIを過剰発現するよう工学処理された宿主細胞により産生されなかった同一標準産生、精製、処方および貯蔵方法を用いて、上記の検定で測定され、同一抗体により媒介され、同一型の宿主細胞により産生されるADCCに比例する。
変異体Fc領域
本発明は、修飾Fc領域を有するポリペプチド、例えば抗原結合分子、このようなペプチドをコードする核酸配列(例えばベクター)、修飾Fc領域を有するポリペプチドを生成するための方法、ならびに種々の疾患および障害の治療における同一物の使用方法を提供する。好ましくは本発明の修飾Fc領域は、少なくとも1つのアミノ酸修飾により、非修飾親Fc領域と異なる。「親」、「出発」または「非修飾」ポリペプチドは、好ましくは抗体Fc領域の少なくとも一部分を含み、そしてFc領域またはその部分を含むポリペプチドを生成するために当該技術分野で利用可能な技法を用いて調製され得る。好ましい実施形態では、親ポリペプチドは、抗体である。しかしながら親ポリペプチドは、Fc領域の少なくとも一部分を含む任意のその他のポリペプチド(例えば抗原結合分子)であり得る。ある種の実施形態では、修飾Fc領域が生成され(例えば本明細書中に開示された方法に従って)、そして選り抜きの異種ポリペプチド、例えば抗体可変ドメインあるいは受容体またはリガンドの結合ドメインと融合され得る。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、修飾Fc領域を有する軽鎖および重鎖を含む全抗体を含む。
本発明は、修飾Fc領域を有するポリペプチド、例えば抗原結合分子、このようなペプチドをコードする核酸配列(例えばベクター)、修飾Fc領域を有するポリペプチドを生成するための方法、ならびに種々の疾患および障害の治療における同一物の使用方法を提供する。好ましくは本発明の修飾Fc領域は、少なくとも1つのアミノ酸修飾により、非修飾親Fc領域と異なる。「親」、「出発」または「非修飾」ポリペプチドは、好ましくは抗体Fc領域の少なくとも一部分を含み、そしてFc領域またはその部分を含むポリペプチドを生成するために当該技術分野で利用可能な技法を用いて調製され得る。好ましい実施形態では、親ポリペプチドは、抗体である。しかしながら親ポリペプチドは、Fc領域の少なくとも一部分を含む任意のその他のポリペプチド(例えば抗原結合分子)であり得る。ある種の実施形態では、修飾Fc領域が生成され(例えば本明細書中に開示された方法に従って)、そして選り抜きの異種ポリペプチド、例えば抗体可変ドメインあるいは受容体またはリガンドの結合ドメインと融合され得る。好ましい実施形態では、本発明のポリペプチドは、修飾Fc領域を有する軽鎖および重鎖を含む全抗体を含む。
好ましい実施形態では、親ポリペプチドは、Fc領域またはその機能性部分を含む。一般に、親ポリペプチドのFc領域は、ネイティブ配列Fc領域を、好ましくはヒトネイティブ配列Fc領域を含む。しかしながら親ポリペプチドのFc領域は、ネイティブ配列Fc領域からの1つまたは複数の先在アミノ酸配列変更または修飾を有し得る。例えばFc領域のClq結合活性は予め変更されているか、あるいはFc領域のFcγR結合親和力が変更されている可能性がある。さらなる実施形態では、親ポリペプチドFc領域は概念的であり(例えば観念的思考あるいはコンピューターまたは紙上での視覚的表示)、そしてそれは物理学的には存在しないが、抗体エンジニアは、所望の修飾Fc領域アミノ酸配列を決定し、そしてその配列または所望の修飾Fc領域アミノ酸配列をコードするDNAを含むポリペプチドを生成し得る。しかしながら好ましい実施形態では、親ポリペプチドのFc領域をコードする核酸が利用可能であり(例えば市販されており)、そしてこの核酸配列は、修飾Fc領域をコードする変異体核酸配列を生成するよう変更される。
修飾Fc領域を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、特定配列に関する本発明の明細書の手引きを用いて、当該技術分野で既知の方法により調製され得る。これらの方法としては、部位特異的(またはオリゴヌクレオチド媒介性)突然変異誘発、PCR突然変異誘発およびポリペプチドをコードする早期調製核酸のカセット突然変異誘発による調製が挙げられるが、これらに限定されない。部位特異的突然変異誘発は、置換変異体を調製するための好ましい方法である。この技法は、当業界で周知である(例えばCarter et al. Nucleic Acids Res. 13: 4431-4443 (1985)およびKunkel et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488 (1987)(これらの記載内容はともに、参照により本明細書中で援用される)参照)。要するに、DNAの部位特異的突然変異誘発を実行するに際して、先ず、所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドを1本鎖のこのような出発DNAとハイブリダイズすることにより、出発DNAが変更される。ハイブリダイゼーション後、DNAポリメラーゼを用いて、プライマーとしてハイブリダイズオリゴヌクレオチドを用いて、そして鋳型として1本鎖出発DNAを用いて、完全二次鎖を合成する。したがって所望の突然変異をコードするオリゴヌクレオチドは、結果的に生じる二本鎖DNA中に組入れられる。
PCR突然変異誘発も、非修飾出発ポリペプチドのアミノ酸配列変異体を作製するのに適している(例えばVallette et al., Nuc. Acids Res. 17: 723-733 (1989)参照(この記載内容は参照により本明細書中で援用される))。要するに、少量の鋳型DNAがPCRにおける出発物質として用いられる場合、鋳型DNA中の対応する領域と配列がわずかに異なるプライマーを用いて、プライマーが鋳型と異なる位置でのみ鋳型配列と異なる相対的に多量の特定のDNA断片を生成し得る。
変異体を調製するための別の方法、即ちカセット突然変異誘発は、Wells et al., Gene 34: 315-323 (1985)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)により記載された技法に基づいている。出発物質は、修飾されるべき出発ポリペプチドDNAを含むプラスミド(または他のベクター)である。突然変異化されるべき出発DNAにおけるコドン(単数または複数)が同定される。同定突然変異部位(単数または複数)の各側面には独特の制限エンドヌクレアーゼ部位が存在しなければならない。このような制限部位が存在しない場合、それらは上記のオリゴヌクレオチド媒介性突然変異誘発方法を用いて生成されて、出発ポリペプチドDNA中の適切な位置にそれらを導入し得る。プラスミドDNAは、これらの部位で切断されて、それを線状にする。制限部位間のDNAの配列をコードするがしかし所望の突然変異(単数または複数)を含有しない二本鎖オリゴヌクレオチドが標準手法を用いて合成されるが、この場合、オリゴヌクレオチドの2本の鎖は別々に合成され、そして次に標準技法を用いて一緒にハイブリダイズされる。この二本鎖オリゴヌクレオチドは、カセットと呼ばれる。このカセットは、それがプラスミドと直接結紮され得るよう、線状化プラスミドの末端と適合性である5’および3’末端を有するよう意図される。このプラスミドはここで、突然変異化DNA配列を含有する。
代替的または付加的には、ポリペプチド変異体をコードする所望のアミノ酸配列が確定され、そしてこのようなアミノ酸配列変異体をコードする核酸配列が合成的に生成され得る。
in vitroおよび/またはin vivoでの変更されたFc受容体結合親和性または活性を、あるいはin vitroおよび/またはin vivoでの1つまたは複数の変更されたエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性(ADCC)活性を有する変異体Fc領域を生成するために、親ポリペプチドのアミノ酸配列は修飾され得る。変更された補体結合特性および/または循環半減期を有する修飾Fc領域を生成するためにも、親ポリペプチドのアミノ酸配列は修飾され得る。
(a)例えばシートまたはらせん立体配座としての、置換の領域におけるポリペプチド主鎖の構造、(b)標的部位での分子の電荷または疎水性、あるいは(c)大半の側鎖の保持に及ぼすそれらの作用において有意に異なる置換を選択することにより、Fc領域の生物学的特性における実質的修飾が達成され得る。天然残基は、一般的側鎖特性に基づいたクラスに分けられる:
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;ならびに
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
(1)疎水性:ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile;
(2)中性親水性:cys、ser、thr;
(3)酸性:asp、glu;
(4)塩基性:asn、gln、his、lys、arg;
(5)鎖配向に影響を及ぼす残基:gly、pro;ならびに
(6)芳香族:trp、tyr、phe。
非保存的置換には、これらのクラスのうちの1つの一成員を別のクラスの一成員に交換することが必要である。
1つまたは複数のFcRに関する結合親和力変更を有する変異体を産生するようFc領域を工学処理し得る。例えばFcRとの結合を変更(例えば増大または低減)するために、Fc領域の1つまたは複数のアミノ酸残基を修飾し得る。好ましい実施形態では、修飾は、本明細書中で同定される1つまたは複数のFc領域残基を含む(例えば表2参照)。一般的に、このようなFc領域変異体を生成するために、FcR結合に影響を及ぼすとして本明細書中で同定されたFc領域残基の1つまたは複数でアミノ酸置換を作製する。好ましい実施形態では、1以下〜約10のFc領域残基が欠失されるかまたは置換される。1つまたは複数のアミノ酸修飾(例えば置換)を含む本明細書中のFc領域は、好ましくは少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の親Fc領域配列あるいはネイティブ配列ヒトFc領域を保有する。
アミノ酸挿入修飾Fc領域も作製し得るが、この変異体はエフェクター機能変更を有する。例えばFcR結合に強い影響を与えると本明細書中で同定されたFc領域位置のうちの1つまたは複数に隣接する少なくとも1つのアミノ酸残基(例えば1〜2つのアミノ酸残基、一般的には10以下の残基)を導入し得る。隣接するとは、本明細書中で同定されるFc領域残基の1〜2つのアミノ酸残基内であることを意味する。このようなFc領域変異体は、FcR結合および/またはエフェクター機能の増強または減少を表示し得る。このような挿入変異体を生成するために、Fcの結合領域(例えば当該FcRの細胞外ドメイン)ならびにアミノ酸残基(単数または複数)が挿入されるべきものであるFc領域を含むポリペプチドの共結晶を評価し得る(例えばSondermann et al. Nature 406: 267 (2000);Deisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-2370 (1981);およびBurmeister et al., Nature 3442: 379-383, (1994)(これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される)参照)が、これは、例えばFcR結合能力改善を示す修飾Fc領域を合理的に設計するためである。
親Fc領域中に適切なアミノ酸配列修飾を導入することにより、(a)多少なりとも有効にヒトエフェクター細胞の存在下で1つまたは複数のエフェクター機能を媒介し、および/または(b)親ポリペプチドより良好な親和力でFcガンマ受容体(FcガンマR)またはFc新生児受容体(FcRn)を結合する変異体Fc領域を生成し得る。このような修飾Fc領域は一般に、少なくとも1つのアミノ酸修飾をFc領域中に含む。
好ましい実施形態では、親ポリペプチドFc領域は、ヒトFc領域、例えばネイティブヒトIgG(Aおよび非Aアロタイプ)、IgG2、IgG3またはIgG4 Fc領域(既知のまたは発見されたすべてのアロタイプを含む)である。このような領域は、配列番号1〜2で示されるもののような配列を有する。
ある種の実施形態では、親ポリペプチドFc領域は、非ヒトFc領域である。非ヒトFc領域としては、非ヒト種、例えばウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、ならびに鳥類被験者由来のFc領域、例えばネイティブ非ヒトIgG Fc領域(既知のまたは発見されたすべてのサブクラスおよびアロタイプを含む)が挙げられるが、これらに限定されない。
ある種の実施形態では、エフェクター機能(例えばADCC)改善を有する修飾Fc領域を生成するために、親ポリペプチドは好ましくは、先在ADCC活性を有する(例えば親ポリペプチドはヒトIgG1またはヒトIgG3 Fc領域を含む)。いくつかの実施形態では、ADCC改善を示す修飾Fc領域は、ネイティブ配列IgG1またはIgG3 Fc領域を有する抗体より実質的により有効にADCCを媒介する。
好ましい実施形態では、Fcガンマ受容体(FcガンマR)結合親和力または活性変更を有する修飾IgG Fc領域を生成するために、1つまたは複数のアミノ酸修飾(単数または複数)が親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される。
ある種の実施形態では、親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される1つまたは複数のアミノ酸修飾(単数または複数)は、表2に示された位置で起こる。
ある種の実施形態では、親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される1つまたは複数のアミノ酸修飾(単数または複数)は、現存する残基を、以下の:Trp、His、Tyr、Glu、Arg、Asp、Phe、AsnおよびGlnから成る群から選択される基に取り替えることを包含する。
ある種の実施形態では、一位置での修飾が異なる位置に置かれる1つまたは複数の付加的修飾と組合され得るよう、表2に列挙されたような個々の修飾のいずれかを組合せることにより、FcγR結合親和力または活性変更を有する修飾IgG Fc領域を生成するために、1つより多いアミノ酸修飾が親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される。
好ましい実施形態では、1つ以下〜約10のFc領域残基が修飾される。1つまたは複数のアミノ酸修飾(例えば置換)を含む本明細書中のFc領域は、好ましくは少なくとも約80%、好ましくは少なくとも約90%、最も好ましくは少なくとも約95%の親Fc領域配列またはネイティブ配列ヒトFc領域を保有する。
ある種の実施形態では、親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される1つまたは複数のアミノ酸修飾(単数または複数)、例えば表3に列挙された修飾は、修飾Fc領域とFcガンマRIIIaとの結合の有意の低減を生じる。
好ましい実施形態では、親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される1つまたは複数のアミノ酸修飾(単数または複数)、例えば表4に列挙された修飾は、FcガンマRIIIaに対するわずかだけ低減されるか、変更されないかまたは増大された親和力を有する修飾IgG Fc領域を生じる。
ある種の実施形態では、一位置での修飾が異なる位置に置かれた1つまたは複数の付加的修飾と組合されて、表5に列挙される親Fc領域の2またはそれ以上、3またはそれ以上、あるいは4またはそれ以上の修飾のいずれかを産生するよう、表4に列挙されたような個々の修飾のいずれかを組合せることにより、FcガンマR結合親和力または活性変更を有する修飾IgGを生成するために、1つより多いアミノ酸修飾が親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される。
好ましい一実施形態では、親Fc領域のCH2ドメイン中に導入される1つより多いアミノ酸修飾は、表5に列挙されたようなThr260Hisとの任意の組合せを包含する。
修飾Fc蝋域を有する本発明のポリペプチドは、ポリペプチドの所望のまたは意図された使用によって、1つまたは複数のさらなる修飾に付され得る。このような修飾は、例えばアミノ酸配列のさらなる変更(アミノ酸残基の置換、挿入および/または欠失)、異種ポリペプチド(単数または複数)との融合および/または共有的修飾を包含し得る。このようなさらなる修飾は、Fc受容体結合および/またはエフェクター機能の変更を生じる上記のアミノ酸修飾(単数または複数)の前、同時にまたはその後になされ得る。
代替的または付加的には、アミノ酸修飾と、Fc領域のClq結合および/または補体依存性細胞傷害性機能を変更する1つまたは複数のさらなるアミノ酸修飾とを組合せることは有用であり得る。この点で特に興味深い出発ポリペプチドは、Clqと結合し、そして補体依存性細胞障害性(CDC)を示すものである。本明細書中に記載されるアミノ酸置換は、Clqと結合し、その補体依存性細胞傷害性機能を修飾する(例えばこれらのエフェクター機能を低減し、好ましくは無効にする)出発ポリペプチドの能力を変更するのに役立ち得る。しかしながら改善されたClq結合および/または補体依存性細胞傷害性(CDC)機能を有する記載された位置のうちの1つまたは複数に置換を含むポリペプチドが、本明細書中で意図される。例えば出発ポリペプチドは、Clqを結合できないしおよび/またはCDCを媒介できず、そしてそれがこれらのさらなるエフェクター機能を獲得するよう、本明細書中の教示に従って修飾され得る。さらに、先在Clq結合活性を有し、任意にCDCを媒介する能力をさらに有するポリペプチドは、これらの活性の一方または両方が増強されるよう修飾され得る。Clqを変更しおよび/またはその補体依存性細胞傷害性機能を修飾するアミノ酸修飾は、例えばWO00/42072(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)に記載されている。
上記のように、例えばClq結合および/またはFcR結合を修飾し、それによりCDC活性および/またはADCC活性を変えることにより、エフェクター機能変更を有するFc領域またはその一部分を設計し得る。例えばClq結合改善およびFcγRIII結合改善を有する(例えばADCC活性改善およびCDC活性改善の両方を有する)修飾Fc領域を生成し得る。あるいは、エフェクター機能が低減されるかまたは無効にされるのが望ましい場合、CDC活性低減および/またはADCC活性低減を有する修飾Fc領域を工学処理し得る。他の実施形態では、これらの活性のうちの1つだけを増大し、そして任意に他の活性を低減して、例えば改善されたADCC活性を有するがしかしCDC活性低減を示す(その逆も)修飾Fc領域を生成し得る。
別の型のアミノ酸置換は、ポリペプチドのグリコシル化パターンを変更するのに役立つ。これは、例えばポリペプチド中に見出される1つまたは複数の炭水化物部分を欠失し、および/またはポリペプチド中に存在しない1つまたは複数のグリコシル化部位を付加することにより達成され得る。ポリペプチドのグリコシル化は、典型的にはN結合型またはO結合型である。N結合型とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を指す。ペプチド配列アスパラギン‐X‐セリンおよびアスパラギン‐X‐トレオニン(ここで、Xはプロリン以外の任意のアミノ酸である)は、アスパラギン側鎖への炭水化物部分の酵素的結合のための認識配列である。したがってポリペプチド中のこれらのペプチド配列いずれかの存在は、潜在的グリコシル化部位を作製する。O結合型グリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリンまたはトレオニンへの糖N‐アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースのうちの1つの結合を指すが、しかし5‐ヒドロキシプロリンまたは5‐ヒドロキシリシンも用いられ得る。
いくつかの実施形態では、本発明は、Fc領域を有する親ポリペプチドの修飾を含む組成物であって、修飾Fc領域が少なくとも1つの表面残基アミノ酸修飾を含む組成物を提供する(例えばDeisenhofer, Biochemistry 20 (9): 2361-70 (1981)およびWO00/42072(これらの記載内容は参照により本明細書中で援用される)参照)。他の実施形態では、本発明は、Fc領域を有する親ポリペプチドの修飾を含む組成物であって、修飾Fc領域が少なくとも1つの非表面残基アミノ酸修飾を含む組成物を提供する。さらなる実施形態では、本発明は、Fc領域を有する親ポリペプチドの変異体であって、変異体が少なくとも1つの表面アミノ酸修飾および少なくとも1つの非表面アミノ酸修飾を含む変異体を包含する。
修飾Fc領域を有するポリペプチドに関する検定
本発明はさらに、修飾Fc領域を有する本発明のポリペプチドをスクリーニングするための種々の検定を提供する。スクリーニング検定は、有用な修飾Fc領域を見出すかまたは確証するために用いられ得る。例えば修飾Fc領域を有するポリペプチドは、増大されたFcR結合、またはエフェクター機能(単数または複数)、例えばADCC、あるいはCDC活性(例えば増大または低減されたADCCまたはCDC活性)を有する変異体を見つけ出すためにスクリーニングされ得る。さらにまた、非表面残基中にアミノ酸修飾を有する修飾ポリペプチドもスクリーニングされ得る(例えば少なくとも1つの表面アミノ酸修飾および1つの非表面アミノ酸修飾を有する修飾Fc領域がスクリーニングされ得る)。さらにまた、下記のように、本発明の検定を用いて、被験者(例えば抗体またはイムノアドヘシン応答性疾患の症候を有するヒト)における有益な治療活性を有する修飾Fc領域を見出すかまたは確証し得る。種々の検定型を用いて、親ポリペプチドと比較した場合の修飾Fc領域を有するポリペプチドにおける任意の変化を評価し得る(WO00/42072(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)で提供されるスクリーニング検定参照)。さらなる例示的検定を以下に記載する。
本発明はさらに、修飾Fc領域を有する本発明のポリペプチドをスクリーニングするための種々の検定を提供する。スクリーニング検定は、有用な修飾Fc領域を見出すかまたは確証するために用いられ得る。例えば修飾Fc領域を有するポリペプチドは、増大されたFcR結合、またはエフェクター機能(単数または複数)、例えばADCC、あるいはCDC活性(例えば増大または低減されたADCCまたはCDC活性)を有する変異体を見つけ出すためにスクリーニングされ得る。さらにまた、非表面残基中にアミノ酸修飾を有する修飾ポリペプチドもスクリーニングされ得る(例えば少なくとも1つの表面アミノ酸修飾および1つの非表面アミノ酸修飾を有する修飾Fc領域がスクリーニングされ得る)。さらにまた、下記のように、本発明の検定を用いて、被験者(例えば抗体またはイムノアドヘシン応答性疾患の症候を有するヒト)における有益な治療活性を有する修飾Fc領域を見出すかまたは確証し得る。種々の検定型を用いて、親ポリペプチドと比較した場合の修飾Fc領域を有するポリペプチドにおける任意の変化を評価し得る(WO00/42072(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)で提供されるスクリーニング検定参照)。さらなる例示的検定を以下に記載する。
好ましい実施形態では、本発明の修飾Fc領域を有するポリペプチドは、非変異体(親)ポリペプチドと比較して抗原を結合する(非修飾抗原結合領域または修飾抗原結合領域を介して)能力を本質的に保有する抗原結合分子である(例えば結合能力は、好ましくは非変異体ポリペプチドの能力より約20倍以上良好であるかまたは約5倍以上良好である)。抗原へのポリペプチド変異体の結合能力は、例えば蛍光活性化細胞分類(FACS)分析または放射免疫沈降検定(RIA)のような技法を用いて確定され得る。結合事象についてのより詳細な情報のためには、生物学的相互作用分析がSPRを用いて実施され得る。
Fc受容体(FcR)結合検定は、本発明の修飾Fc領域を有するポリペプチドを評価するために用いられ得る。例えばFc受容体、例えばFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII、FcRn等の結合は、修飾ポリペプチドを滴定し、そして標準ELISAフォーマットでポリペプチド変異体と特異的に結合する抗体を用いて結合修飾ポリペプチド変異体を測定することにより測定され得る。例えば本発明の修飾Fc領域を含む抗原結合分子は、FcRとの結合を確定するために標準ELISA検定でスクリーニングされ得る。固体表面は、抗原で被覆され得る。過剰抗原は洗浄され、そして表面は遮断され得る。修飾ポリペプチド(抗体)はこの抗原に特異的であり、したがって抗原被覆表面と結合する。次に標識(例えばビオチン)と接合されたFcRが付加され、そして表面が洗浄される。以下のステップにおいて、FcR上の標識に特異的な分子が付加される(例えば酵素と接合されたアビジン)。その後、修飾Fc領域を有するポリペプチドとのFcRの結合の量を確定するために、基質が付加され得る。この検定の結果は、同一FcRを結合する修飾を欠く親ポリペプチドの能力と比較され得る。好ましい実施形態では、FcRはIgGに関してFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAから選択されるが、それはこれらの受容体(例えば組換え的に発現される)が本発明の修飾Fc領域をスクリーニングするために首尾よく用いられ得るからである。実際、これらの好ましい受容体を用いたこのような結合検定は、予期せぬことに、有用な修飾Fc領域の同定を可能にする。有用な修飾ポリペプチド(例えばADCCまたはCDCのようなより大きなFcR結合またはエフェクター機能(単数または複数))がこのようなやり方で同定される、ということは予期されない。他の好ましい実施形態では、変異体をスクリーニングするためにELISAを実行するための構成成分(例えばIgGに関してはFcγRIIA、FcγRIIBおよびFcγRIIIAを用いて)がキット中に包装される(例えば使用説明書と一緒に)。
このような検定のための有用なエフェクター細胞としては、ナチュラルキラー(NK)細胞、マクロファージおよびその他の末梢血単核球(PBMC)が挙げられるが、これらに限定されない。代替的または付加的には、本発明の修飾Fc領域を有するポリペプチドのADCC活性は、例えばClynes et al. PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)に開示されたもののような動物モデルにおいて、in vivoで査定され得る。
Clqを結合し、補体依存性細胞傷害性(CDC)を媒介する修飾ポリペプチドの能力が査定され得る。例えばClq結合を確定するために、Clq結合ELISAが実施され得る。例示的Clq結合検定を以下に示す。検定プレートは、コーティング緩衝液中の本発明の修飾ポリペプチドまたは親ポリペプチド(対照)を用いて、4℃で一晩、被覆され得る。次にプレートは洗浄され、遮断される。洗浄後、ヒトClqのアリコートが各ウエルに付加され、室温で2時間インキュベートされる。さらなる洗浄後、100 μlのヒツジ抗補体Clqペルオキシダーゼ接合抗体が各ウエルに付加され、室温で1時間インキュベートされる。プレートは洗浄緩衝液で再び洗浄されて、OPD(O‐フェニレンジアミン二塩酸塩(Sigma))を含有する基質緩衝液100 μlが各ウエルに付加され得る。黄色の出現により観察される酸化反応は、最適化時間(2〜60分)の間進行させられ、そして、4.5 NH2SO4 100 μlの付加により停止され得る。次に吸光度が492 nmで読み取られ、そして405 nmでのバックグラウンド吸光度がこの値から差し引かれる。
本発明の修飾Fc領域は、補体活性化に関してもスクリーニングされ得る。補体活性化を査定するために、補体依存性細胞傷害性(CDC)検定が実施され得る(例えばGazzano-Santoro et al., J. Immnol. Methods, 202: 163 (1996)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)参照)。例えば種々の濃度の本発明の修飾ポリペプチドおよびヒト補体が、緩衝液で希釈され得る。ポリペプチド変異体が結合する抗原を発現する細胞は、〜1×106細胞/mlの密度に希釈され得る。ポリペプチド変異体、希釈ヒト補体および抗原を発現する細胞の混合物が、平底組織培養96ウエルプレートに付加され、37℃で5%CO2で2時間インキュベートさせて、補体媒介性細胞溶解を促す。50 μlのアラマーブルー(Accumed International)が次に各ウエルに付加され、37℃で一晩インキュベートされる。励起530 nmおよび放射590 nmで96ウエル蛍光計を用いて、吸光度が測定され得る。結果は、相対蛍光単位(RFU)で表わされ得る。試料濃度は標準曲線からコンピューター計算され、そして非変異体ポリペプチドと比較した場合の活性パーセントが当該ポリペプチド変異体に関して報告され得る。
好ましい実施形態では、修飾ポリペプチドは、親ポリペプチドより高いヒトClqに対する結合親和力を有する。このような変異体は、親ポリペプチドと比較して、例えばヒトClqにおける約2倍またはそれ以上、好ましくは約5倍またはそれ以上の改善を示し得る(例えばこれら2つの分子に関するIC50値で)。例えばヒトClq結合は、親ポリペプチドと比較して、約2倍〜約500倍、好ましくは約2倍または約5倍〜約1000倍改善され得る。
その他の好ましい実施形態では、非修飾IgG1 Fc領域を有する対照(親)抗体と比較して、Clq結合の2倍、25倍、50倍、100倍または1000倍低減を示す変異体が見出される。さらに好ましい実施形態では、修飾Fc領域ポリペプチドはClqを結合しない(例えば10 μg/mlの修飾ポリペプチドは、10 μg/mlの対照抗体と比較して、Clq結合の約100倍またはそれ以上の低減を示す)。
ある種の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは補体を活性化しない。例えば修飾ポリペプチドは、非修飾IgG1 Fc領域を有する対照抗体と比較して、この検定において約0〜10%のCDC活性を示す。好ましくは変異体は、上記のCDC検定において任意のCDC活性(例えばバックグラウンドを上回る)を有するとは思われない。他の実施形態では、本発明の修飾ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して、CDC増強を有することが判明している[例えばIC50値が比較される場合、in vitroまたはin vivoでのCDC活性における約2倍〜約100倍(またはそれ以上)の改善を示す]。
本発明の修飾Fc領域を有するポリペプチドは、in vivoでもスクリーニングされ得る。任意の型のin vivo検定が用いられ得る。ある型の検定の特定の一例が以下に提示される。この例示的検定は、in vivoでの修飾Fc領域の前臨床評価を可能にする。試験されるべき修飾ポリペプチドは、何らかの活性を有することが既知である特定の抗体のFc領域に組み入れられ得る。例えば修飾は、突然変異誘発により抗CD20 IgGのFc領域中に組み入れられ得る。これは、親IgGおよびFc変異体IgGをRITUXAN(腫瘍退縮を促進することが既知である)と直接比較させる。前臨床評価は、2段階(薬物動態的および薬力学的段階)で実行され得る。段階I薬物動態的試験の目標は、Fc変異体IgGと既知のin vivo活性を有する抗体(例えばRITUXAN)との間にクリアランス速度の差が存在するか否かを確定することである。クリアランス速度の差は、血清中のIgGの定常状態レベルの差を生じ得る。このようなものとして、定常状態濃度の差が検出される場合、これらは精確な比較を成させるよう正規化されるべきである。段階II薬力学的試験の目標は、この場合、腫瘍増殖に及ぼすFc突然変異の影響を確定することである。RITUXANを伴う従来の試験は、腫瘍増殖を完全に阻害する1回用量を用いた。これは定量的差を測定させないため、一用量範囲が用いられるべきである。
本発明の修飾Fc領域を有するポリペプチド、非修飾(例えば野生型)親Fc、およびRITUXANの段階I薬物動態的比較は、以下のやり方で実施され得る。先ず、40 μg/動物が静脈内注射されて、IgGの血漿レベルが、0、0.25、0.5、1、24、48、168および336時間に定量され得る。例えばクリアランス速度を得るためにゼロラグ2区画薬物動態モデルを用いて、薬物動態プログラム(WinNonLin)を用いて、データが適合され得る。クリアランス速度を用いて、以下の方程式を有する定常状態血漿レベルを定義し得る:C=用量/(クリアランス速度×T)(式中、Tは用量投与間の間隔であり、そしてCは定常状態での血漿レベルである)。薬物動態実験葉、例えば最小で5匹のマウス/時点で、非腫瘍保有マウスで実施され得る。
動物モデルは、以下のやり方で次の段階のために用いられ得る。CB 17‐SCIDマウスの右脇腹に106 Raji細胞を皮下移植し得る。修飾Fc領域を有するポリペプチド、親(例えば野生型)Fcを有するポリペプチドおよびRITUXANの静脈内ボーラス投与は、移植直後に開始され、そして腫瘍サイズが直径2 cmより大きくなるまで継続され得る。腫瘍容積は、カリパスを用いて腫瘍の長さ、幅および深さを測定する(腫瘍容積=W×L×D)ことにより、月曜日、水曜日および金曜日毎に確定され得る。腫瘍容積対時間のプロットは、薬物動態的計算のための腫瘍増殖速度を示す。最低約10匹/群が用いられる必要がある。
本発明の修飾Fc領域を有するポリペプチド、親(例えば野生型)Fc、およびRITUXANの段階II薬力学的比較は、以下のやり方で実施され得る。公表データに基づいて、毎週10 μg/gでのRITUXANはin vivoでの腫瘍増殖を完全に阻害した(Clynes et al., Nat. Med. 2000 April; 6(4): 443-6, 2000(この記載内容は参照により本明細書中で援用される))。したがって、10 μg/g、5 μg/g、1μg/g、0.5μg/gおよび0μg/gの毎週用量範囲が検査され得る。腫瘍増殖速度が50%阻害される定常状態血漿レベルは、定常状態血漿レベルと有効性との間の関係によりグラフで確定され得る。定常状態血漿レベルは、上記のように算定され得る。必要な場合、したがってTは、RITUXANとして比較可能な定常状態血漿レベルを達成するためのそれらの薬物動態特性によって、各修飾Fc領域ポリペプチドおよびFc野生型に関して調整され得る。親ポリペプチド(例えばFc野生型)およびRITUXANとの比較における修飾ポリペプチドの統計学的に改善された薬力学的値は一般的に、修飾ポリペプチドがin vivoでの活性化以前を付与する、ということを示す。
さらなる実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、少なくとも2つの種において治療的使用のために有用である変異体が同定されるよう、スクリーニングされる。このような変異体は「二重種改善変異体」と呼ばれ、そしてヒトにおいて治療効果がある変異体を同定するために特に有用であり、そしてさらにまた動物モデルにおける効能を実証する(または実証すると思われる)。この点で、動物モデルデータは政府規制機関(例えば米国食品医薬品局)に対して成される任意のヒト試験適用を支持すると思われるため、本発明は、ヒト臨床試験に関して認可されることについての強固な機会を有する変異体を同定するための方法を提供する。
ある種の実施形態では、二重種改善修飾ポリペプチドは、先ずヒトエフェクター細胞を用いてADCC検定を実施して改善された修飾ポリペプチドを見つけ出し、次にマウス、ラットまたは非ヒト霊長類エフェクター細胞を用いて二次ADCC検定を実施して、二重種改良修飾ポリペプチドである改善された修飾ポリペプチドの亜組を同定することにより同定される。いくつかの実施形態では、本発明は、二重種改善修飾ポリペプチドの同定方法であって、以下の:a)i)標的細胞、ii)Fc領域の少なくとも一部を有する親ポリペプチドの候補修飾ポリペプチドを含む組成物であって、候補修飾ポリペプチドがFc領域中に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含み、そして候補修飾ポリペプチドが親ポリペプチドより有効にエフェクター細胞の一次種(例えばヒト)の存在下で標的細胞細胞傷害性を媒介する組成物、ならびにiii)二次種(例えばマウス、ラットまたは非ヒト霊長類)エフェクター細胞を提供し、そしてb)候補修飾ポリペプチドが標的細胞を結合し、それにより候補修飾ポリペプチド結合標的細胞を生成するような条件下で標的細胞とともに組成物をインキュベートし、c)二次種エフェクター細胞を候補修飾ポリペプチド結合標的細胞と混合し、そしてd)候補修飾ポリペプチドにより媒介される標的細胞細胞傷害性を測定することを包含する方法を提供する。ある種の実施形態では、当該方法はさらに、e)候補修飾ポリペプチドが、親ポリペプチドより有効に二次種エフェクター細胞の存在下で標的細胞細胞傷害性を媒介するか否かを確定するステップを包含する。いくつかの実施形態では、当該方法はさらに、f)親ポリペプチドより有効に二次種エフェクター細胞の存在下で標的細胞細胞傷害性を媒介する二重種改善修飾ポリペプチドとして候補修飾ポリペプチドを同定するステップを包含する。好ましい実施形態では、同定された二重種修飾ポリペプチドは次に、1つまたは複数の動物検定においてin vivoでスクリーニングされる。
ある種の実施形態では、ヒト構成成分(例えばヒト細胞、ヒトFc受容体等)を用いて上記の検定のいずれかを実施して、修飾Fc領域を有する改善されたポリペプチドを同定し、そして次に非ヒト動物構成成分(例えばマウス細胞、マウスFc受容体等)を用いて同一検定(または異なる検定)を実行することにより、二重種改善修飾ポリペプチドが同定される。この点で、ヒトベースの検定および二次種ベースの検定の両方において所定の判定基準に従って良好に実施する修飾ポリペプチドの亜組が同定され得る。
本発明の修飾Fc領域を有する二重種改善ポリペプチドを同定するための例示的プロセスを以下に示す。先ず、発現されるアミノ酸配列が少なくとも1つのアミノ酸変化を有し、それにより修飾Fc領域を生成するよう、IgG Fc領域の少なくとも一部をコードする核酸配列が修飾される。この発現IgG変異体は次に、検定プレート上で抗原により捕捉される。次に、捕捉変異体は、ELISAを用いて可溶性ヒトFcγRIII結合に関してスクリーニングされる。変異体が改良されたまたは比較可能な(非突然変異化親Fc領域と比較される)FcγRIII結合を実証する場合には、変異体はELISAを用いてヒトFcγRIII結合に関してスクリーニングされる。次に変異体に関する相対的特異性比が算定され得る。次に、ヒトPBMCまたはサブセット(例えばNK細胞またはマクロファージ)を用いて、変異体に関してADCC検定が実施される。ADCC活性増強が見出された場合には、変異体はマウスまたはラットPBMCを用いて二次ADCC検定でスクリーニングされる。代替的にまたはさらに、クローン化齧歯類受容体または細胞株との結合に関して変異体を用いて検定が実施され得る。最後に、変異体が二次検定で改良されてそれが二重改善変異体になることが見出された場合には、変異体はマウスまたはラットにおいてin vivoでスクリーニングされる。
本発明の修飾Fc領域を含む例示的ポリペプチド
本発明の変異体Fc領域は、大型分子、好ましくは抗原結合分子(ABM)の一部であり得る。大型分子は、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体、イムノアドヘシン等であり得る。このようなものとして、本発明の修飾Fc領域に対して広範囲の用途がある、ということは明白である。
本発明の変異体Fc領域は、大型分子、好ましくは抗原結合分子(ABM)の一部であり得る。大型分子は、例えばモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、二特異性抗体、イムノアドヘシン等であり得る。このようなものとして、本発明の修飾Fc領域に対して広範囲の用途がある、ということは明白である。
本発明において考察されるすべての位置に関して、免疫グロブリン重鎖のナンバリングはEU指数に従う(Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda)。「KabatにおけるようなEU指数」とは、ヒトIgG1 EU抗体の残基ナンバリングを指す。
本発明の修飾Fc領域を含む抗原結合分子は、種々の特性に関して最適化され得る。最適化され得る特性としては、FcガンマRに対する親和力の増強または低減が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、ヒト活性化FcγR、好ましくはFcRI、FcγRIIa、FcγRIIc、FcγRIIIaおよびFcγRIIIb、最も好ましくはFcγRIIIaに対する親和力増大を保有するよう最適化される。代替的に好ましい一実施形態では、修飾Fc領域は、ヒト抑制性受容体FcγRIIbに対する親和力低減を保有するよう最適化される。本発明のABMは、ヒトにおける治療特性増強、例えばエフェクター機能増大およびより大きな抗癌効力を有する抗体およびFc融合体を提供する。代替的一実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、ヒトFcγR、例えばFcγRI、FcγRIIa、FcγRIIbまたはFcγRIIc(これらに限定されない)に対する親和力の低減または除去を示すよう最適化される。本発明のこれらのABMは、ヒトにおける治療特性増強、例えばエフェクター機能低減およびより毒性低減を有する抗体およびFc融合体を提供すると予測される。好ましい実施形態は、ヒトFcγRとのFc結合の最適化を包含する;しかしながら代替的実施形態では、本発明のFc変異体は、非ヒト生物体、例えばマウス、ラット、ウサギおよびサル(これらに限定されない)からのFcγRに対する増強または低減された親和力を保有する。非ヒトFcγRとの結合に関して最適化されるFc変異体は、実験において用途を見出し得る。例えばマウスモデルは、所定の薬剤候補に関する効能、毒性および薬物動態のような特性の試験を可能にする種々の疾患のために利用可能である。当該技術分野で既知であるように、癌細胞はヒト癌を模倣するためにマウス中に移植されるかまたは注射され得る(異種移植と呼ばれるプロセス)。1つまたは複数のマウスFcγRに関して最適化される修飾Fc領域を含む抗体またはFc融合体の試験は、抗体またはFc融合体の効能、その作用メカニズム等に関する有益な情報を提供し得る。
本発明の修飾Fc領域は、広範囲の供給源からのそれら自体である親Fcポリペプチド由来であり得る。親Fcポリペプチドは、任意の生物体例えばヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、サル、好ましくは哺乳類、最も好ましくはヒトおよびマウス(これらに限定されない)からの1つまたは複数のFc遺伝子により実質的にコードされ得る。好ましい一実施形態では、親Fcポリペプチドは、親抗体と呼ばれる抗体を含む。親抗体は、例えばトランスジェニックマウスを用いて得られる完全ヒト(Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8: 455-458)であるか、または選択方法と結び付けられたヒト抗体ライブラリー(Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9: 102-108)であり得る。親抗体は、天然である必要はない。例えば親抗体は、工学処理抗体、例えばキメラ抗体およびヒト化抗体(これらに限定されない)であり得る(Clark, 2000, Immunol Today 21: 397-402)。親抗体は、1つまたは複数の天然抗体遺伝子により実質的にコードされる抗体の工学処理変異体であり得る。一実施形態では、親抗体は、当該技術分野で既知であるように、親和力突然変異化されている。抗体は、例えば米国特許第10/339,788号(2003年3月3日出願)に記載されているように、いくつかの他の方法で修飾されている。
本発明の修飾Fc領域は、抗体クラスのいずれかに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされ得る。好ましい一実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、IgGクラスの抗体、例えばIg1、IgG2、IgG3またはIgG4に属する配列を含む抗体またはFc融合体に用途を見出す。代替的一実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、抗体のIgA(例えばサブクラスIgA1およびIgA2)、IgD、IgE、IgGまたはIgMクラスに属する配列を含む抗体またはFc融合体に用途を見出す。本発明の修飾Fc領域は、1つより多いタンパク質鎖を含み得る。即ち、本発明は、モノマーまたはオリゴマー、例えばホモ‐またはヘテロオリゴマーである抗体またはFc融合体に用途を見出し得る。
本発明の修飾Fc領域は、他のFc修飾、例えばエフェクター機能または1つまたは複数のFcリガンドとの相互作用を変更する修飾(これらに限定されない)と組合され得る。このような組合せは、本発明のABMにおける付加的、相乗的または新規の特性を提供し得る。一実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、その他の既知のFc修飾と組合され得る(Duncan et al., 1988, Nature 332: 563-564;Lund et al., 1991, J. Immunol. 147:2657-2662;Lund et al., 1992, Mol Immunol 29: 53-59;Alegre et al., 1994, Transplantation 57: 1537-1543;Hutchins et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 11980-11984;Jefferis et al., 1995, Immunol Left 44: 111-117;Lund et al., 1995, Faseb J9: 115-119;Jefferis et al., 1996, Immunol Left 54: 101-104;Lund et al., 1996, J Immunol 157: 4963-4969;Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29: 2613-2624;Idusogie et al., 2000, J Immunol 164: 4178-4184;Reddy et al., 2000, J Immunol 164: 1925-1933;Xu et al., 2000, Cell Immunol 200: 16-26;Idusogie et al., 2001, J Immunol 166: 2571-2575;Shields et al., 2001, J Biol Chem 276: 6591-6604;Jefferis et al., 2002, Immunol Left 82: 57-65;Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30: 487-490;Hinton et al., 2004, J Biol Chem 279: 6213-6216)(米国特許第5,624,821号;第5,885,573号;第6,194,551号;PCT WO 00/42072;PCT WO 99/58572;2004/0002587 A1)。したがって本発明の修飾Fc領域と他のFc修飾との、ならびに未発見Fc修飾との組合せは、最適化特性を有する生成中の新規のABM(例えば抗体またはFc融合体)の目的で意図される。
タンパク質の以下の一覧、タンパク質の以下の一覧に属するサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープの以下の一覧(これらに限定されない)を含めた本発明の修飾Fc領域を含むABMにより事実上任意の抗原が標的化され得る:CD2、CD3、CD3E、CD4、CD11、CD11a、CD14、CD16、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33(p67タンパク質)、CD38、CD40、CD40L、CD52、CD54、CD56、CD80、CD147、GD3、IL‐1、IL‐1R、IL‐2、IL‐2R、IL‐4、IL‐5、IL‐6、IL‐6R、IL‐8、IL‐12、IL‐15、IL‐18、IL‐23、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ;TNF‐α、TNFβ2、TNFc、TNFαγ、TNF‐RI、TNF‐RII、FasL、CD27L、CD30L、4‐1BBL、TRAIL、RANKL、TWEAK、APRIL、BAFF、LIGHT、VEGI、OX40L、TRAIL受容体‐1、A1アデノシン受容体、リンフォトキシンベータ受容体、TACI、BAFF‐R、EPO;LFA‐3、ICAM‐1、ICAM‐3、EpCAM、インテグリンα1、インテグリンβ2、インテグリンα4/β7、インテグリンα2、インテグリンα3、インテグリンα4、インテグリンα5、インテグリンα6、インテグリンαv、αVβ3インテグリン、FGFR‐3、ケラチノサイト成長因子、VLA‐1、VLA‐4、L‐セレクチン、抗‐Id、E‐セレクチン、HLA、HLA‐DR、CTLA‐4、T細胞受容体、B7‐1、B7‐2、VNRインテグリン、TGFβ1、TGFβ2、エトタキシン1、BLyS(B‐リンパ球刺激剤)、補体C5、IgE、因子VII、CD64、CBL、NCA90、EGFR(ErbB‐1)、Her2/neu(ErbB‐2)、Her3(ErbB‐3)、Her4(ErbB‐4)、組織因子、VEGF、VEGFR、エンドセリン受容体、VLA‐4、ハプテンNP‐capまたはNIP‐cap、T細胞受容体α/β、E‐セレクチン、ジゴキシン、胎盤アルカリ性ホスファターゼ(PLAP)および精巣PLAP様アルカリ性ホスファターゼ、トランスフェリン受容体、癌胎児性抗原(CEA)、CEACAM5、HMFG PEM、ムチンMUC1、MUC18、ヘパラナーゼI、ヒト心臓ミオシン、腫瘍関連糖タンパク質‐72(TAG‐72)、腫瘍関連抗原CA 125、前立腺特異的膜抗原(PSMA)、高分子量黒色腫関連抗原(HMW‐MAA)、癌関連抗原、Gcoタンパク質IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)、腫瘍関連抗原発現ルイスY関連炭水化物、ヒトサイトメガロウイルス(HCMV)gHエンベロープ糖タンパク質、HIV gp120、HCMV、呼吸器合胞体ウイルスRSVF、RSVF Fgp、VNRインテグリン、IL‐8、サイトケラチン腫瘍関連抗原、Hep B gp120、CMV、gpIIbIIIa、HIV IIIB gp120 V3ループ、呼吸器合胞体ウイルス(RSV)Fgp、単純ヘルペスウイルス(HSV)gD糖タンパク質、HSV gB糖タンパク質、HCMV gBエンベロープ糖タンパク質およびウェルシュ菌毒素。
標的の上記の一覧は特定のタンパク質および生体分子だけでなく、それらを含む単数または複数の生化学的経路も指す、と当業者は理解する。例えば標的抗原としてのCTLA‐4への言及は、T細胞同時刺激経路を形成するリガンドおよび受容体、例えばCTLA‐4、B7‐1、B7‐2、CD28を意味し、そして任意のその他の未発見リガンドまたは受容体も標的である。したがって標的とは、本明細書中で用いる場合、特定の生体分子だけでなく、上記の標的ならびに上記の標的が属する生化学的経路の成員と相互作用するタンパク質組も指す。上記の標的抗原、それらを結合するリガンドまたは受容体、あるいはそれらの対応する生化学的経路のその他の成員のいずれかが、Fc融合体を生じるために、本発明のFc変異体と操作可能的に連結され得る、と当業者はさらに理解する。したがって、例えばEGFRを標的とするFc融合体は、Fc変異体をEGF、TGFαあるいはEGFRを結合する発見されたまたは未発見の任意のその他のリガンドと操作可能的に連結することにより構築され得る。したがって本発明の修飾Fc領域は、EGF、TGFαあるいはEGFRを結合する発見されたまたは未発見の任意のその他のリガンドを結合するFc融合体を生じるために、EGFRと操作可能的に連結され得る。したがって事実上あらゆるポリペプチド(リガンドであれ、受容体であれ、あるいはいくつかのその他のタンパク質またはタンパク質ドメイン、例えばそれらの対応する生化学的経路を構成する上記の標的およびタンパク質(これらに限定されない)であれ)は、本発明のFc変異体と操作可能的に連結されて、Fc融合体を開発し得る。
臨床試験においてまたは開発において用いることを認可される多数の抗体およびFc融合体は、本発明の修飾Fc領域から利益を得る。上記の抗体およびFc融合体は、本明細書中では、「臨床的産物および候補」と呼ばれる。したがって好ましい一実施形態では、本発明のFc変異体は、一連の臨床的産物および候補における用途を見出し得る。例えばCD20を標的にする多数の抗体は、本発明の修飾Fc領域から利益を得る。例えば本発明の修飾Fc領域は、非ホジキンリンパ腫を治療するために認可されたキメラ抗CD20抗体であるリツキシマブ(RituxanTM、IDEC/Genentech/Roche)(例えば米国特許第5,736,137号参照);HuMax‐CD20(一般にGenmabにより開発される抗CD20である);米国特許第5,500,362号に記載された抗CD20抗体;AME‐I33(Applied Molecular Evolution);hA20(Immunomedics, Inc.);およびHumaLYM(Intracel)と実質的に類似する抗体において用途を見出し得る。上皮成長因子受容体のファミリーの成員、例えばEGFR(ErbB‐1)、Her2/neu(ErbB‐2)、Her3(ErbB‐3)、Her4(ErbB‐4)を標的にする多数の抗体は、本発明のFc変異体から利益を得る。例えば本発明のFc変異体は、乳癌を治療するために認可されるヒト化抗Her2/neu抗体であるトラスツズマブ(ハーセプチン(登録商標)、Genentech)(例えば米国特許第5,677,171号参照);Genentechにより目下開発中のペルツズマブ(rhuMab‐2C4、Omnitarg.TM.);米国特許第4,753,894号に記載された抗Her2抗体;種々の癌に関する臨床試験におけるキメラ抗EGFR抗体であるセツキシマブ(エルビツクス(登録商標), Imclone)(米国特許第4,943,533号;PCT WO 96/40210);Abgenix/Immunex/Amgenにより目下開発中であるABX‐EGF(米国特許第6,235,883号);Genmabにより目下開発中のHuMax‐EGFr(米国特許第10/172,317号);425、EMD55900、EMD62000およびEMD72000(Merck KGaA)(米国特許第5,558,864号; Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252(2): 549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35(4): 315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4(7): 773-83);ICR62(Institute of Cancer Research)(PCT WO 95/20045; Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22(1-3): 129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67(2): 247-53; Modjtahedi et al., 1996, Br J Cancer, 73(2): 228-35; Modjtahedi et al., 2003, Int J Cancer, 105(2): 273-80));TheRaCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba(米国特許第5,891,996号;Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3(1): 71-81));mAb‐806(Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth et al. 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100(2): 639-44);KSB‐102(KS Biomedix);MR1‐1(IVAX, National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2);およびSC100(Scancell)(PCT WO01/88138)と実質的に類似する抗体において用途を見出し得る。別の実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、B細胞慢性リンパ性白血病の治療のために目下認可されているヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ(CampathTM、Millenium)に用途を見出し得る。
修飾Fc領域は、その他の臨床的産物および候補、例えばOrtho Biotech/Johnson & Johnsonにより開発された抗CD3抗体であるムロモナブ‐CD3(Orthoclone, OKT3(登録商標));IDEC/Schering AGにより開発された抗CD20抗体であるイブリツモマブ チウキセタン(ゼバリン(登録商標));Celltech/Wyethにより開発された抗CD33(p67タンパク質)抗体であるゲムツズマブ オゾガミシン(ミロターグTM);Biogenにより開発された抗LFA‐3 Fc融合体であるアレファセプト(アメビブ(登録商標));Centocor/Lillyにより開発されたアブシキシマブ(レオプロ(登録商標));Novartisにより開発されたバシリキシマブ(シムレクト(登録商標));MedImmuneにより開発されたパリビズマブ(シナジス(登録商標));Centocorにより開発された抗TNFアルファ抗体であるインフリキシマブ(レミカデ(登録商標));Abbottにより開発された抗TNFアルファ抗体であるアダリムマブ(フミラ(登録商標));Celltechにより開発された抗TNFアルファ抗体であるフミカデ(登録商標);Immunex/Amgenにより開発された抗TNFアルファFc融合体であるエタネルセプト(エンブレル(登録商標));Abgenixにより開発中の抗CD147抗体であるABX‐CBL;Abgenixにより開発中の抗IL8抗体であるABX‐IL8;Abgenixにより開発中の抗MUC18抗体であるABX‐MA1;Antisomaにより開発中の抗MUC1であるペムツモマブ(R1549、.sup.90Y-muHMFG1);Antisomaにより開発中の抗MUC1であるTherex(R1550);Antisomaにより開発中のアンギオマブ(AS1405);Antisomaにより開発中のHuBC‐1;Antisomaにより開発中のチオプラチン(AS1407);Biogenにより開発中の抗アルファ‐4‐ベータ‐1(VLA‐4)およびアルファ‐4‐ベータ‐7抗体であるアンテグレン(登録商標)(ナタリツマブ);Biogenにより開発中の抗VLA‐1インテグリン抗体であるVLA‐1;Biogenにより開発中の抗リンフォトキシンベータ受容体(LTBR)抗体であるLTBR mAb;Cambridge Antibody Technologyにより開発中の抗TGF.2抗体であるCAT‐152;Cambridge Antibody TechnologyおよびAbbottにより開発中の抗IL‐12抗体であるJ695;Cambridge Antibody TechnologyおよびGenzymeにより開発中の抗TGF.ベータ1抗体であるCAT‐192;Cambridge Antibody Technologyにより開発中の抗エトタキシン1抗体であるCAT‐213;Cambridge Antibody TechnologyおよびHuman Genome Sciences Inc.により開発中の抗Blys抗体であるリンフォスタット‐B.TM;Cambridge Antibody TechnologyおよびHuman Genome Sciences Inc.により開発中の抗TRAIL‐R1抗体であるTRAIL‐R1mAb;Genentechにより開発中の抗VEGF抗体であるアバスチン(登録商標)(ベバシズマブ、rhuMAb‐VEGF);Genentechにより開発中の抗HER受容体ファミリー抗体;Genentechにより開発中の抗組織因子抗体である抗組織因子(ATF);Genentechにより開発中の抗IgE抗体であるゾレア(登録商標)(オマリズマブ);GenentechおよびXomaにより開発中の抗CD11a抗体であるラプティバ(登録商標)(エファリズマブ);GenentechおよびMillenium Pharmaceuticalsにより開発中のMLN‐02抗体(以前はLDP‐02);Genmabにより開発中の抗CD4抗体であるフマックスCD4;GenmabおよびAmgenにより開発中の抗IL15抗体であるフマックスIL‐15;
GenmabおよびMedarexにより開発中のフマックス‐インフラム;GenmabおよびMedarexおよびOxford GcoSciencesにより開発中の抗ヘパラナーゼI抗体であるフマックス‐キャンサー;GenmabおよびAmgenにより開発中のフマックス‐リンフォーマ;Genmabにより開発中のフマックス‐TAC;IDEC Pharmaceuticalsにより開発中の抗CD40L抗体であるIDEC‐131;IDEC Pharmaceuticalsにより開発中の抗CD4抗体であるIDEC‐151(クレノリキシマブ);IDEC Pharmaceuticalsにより開発中の抗CD80抗体であるIDEC‐114;IDEC Pharmaceuticalsにより開発中の抗CD23であるIDEC‐152;IDEC Pharmaceuticalsにより開発中の抗マクロファージ移動因子(MIF)抗体;Imcloneにより開発中の抗イディオタイプ抗体であるBEC2;Imcloneにより開発中の抗KDR抗体であるIMC‐1 C11;Imcloneにより開発中の抗flk‐1抗体であるDC101;Imcloneにより開発中の抗VEカドヘリン抗体;
Immunodedicsにより開発中の抗癌胎児性抗原(CEA)抗体であるCEA‐Cide(登録商標)(ラベツズマブ);Immunodedicsにより開発中の抗CD22抗体であるリンフォCide(登録商標)(エプラツズマブ);Immunodedicsにより開発中のAFP‐Cide;Immunodedicsにより開発中のミエローマCide;Immunodedicsにより開発中のLkoCide;Immunodedicsにより開発中のプロスタCide;Medarexにより開発中の抗CTLA4抗体であるMDX‐010;Medarexにより開発中の抗CD30抗体であるMDX‐060;Medarexにより開発中であるMDX‐070;Medarexにより開発中であるMDX‐018;MedarexおよびImmuno Designed Moleculesにより開発中の抗Her2抗体であるオシデム(登録商標)(IDM‐1);MedarexおよびGenmabにより開発中の抗CD4抗体であるフマックス(登録商標)CD4;MedarexおよびGenmabにより開発中の抗IL15抗体であるフマックス‐IL15;MedarexおよびCentocor/J&Jにより開発中の抗TNFα抗体であるCNTO 148;Centocor/J&Jにより開発中の抗サイトカイン抗体であるCNTO 1275;MorphoSysにより開発中の抗細胞間接着分子‐1(ICAM‐1)(CD54)抗体であるMOR101およびMOR102;MorphoSysにより開発中の抗繊維芽細胞増殖因子受容体3(FGFR‐3)抗体であるMOR201;Protein Design Labsにより開発中の抗CD3抗体であるヌビオン(登録商標)(ビシリズマブ);Protein Design Labsにより開発中の抗ガンマインターフェロン抗体であるHuZAF(登録商標);Protein Design Labsにより開発中の抗.quadrature.5.quadrature.1インテグリン;Protein Design Labsにより開発中の抗IL‐12;Xomaにより開発中の抗Ep‐CAM抗体であるING‐1;ならびに;Xomaにより開発中の抗ベータ2インテグリン抗体であるMLN01(これらに限定されない)と実質的に類似する種々の抗体またはFc融合体に用途を見出し得る。
上記の抗体およびFc融合臨床産物および候補への修飾Fcの適用は、それらの正確な組成を強いられるものではない。本発明の修飾Fc領域は、上記の臨床候補および産物中に、あるいはそれらと実質的に類似する抗体およびFc融合体中に組入れられ得る。本発明の修飾Fc領域は、何らかのその他の方法でヒト化、親和力成熟化、工学処理化または修飾化される上記の臨床候補および産物のバージョン中に組入れられ得る。さらに、本発明の修飾Fc領域を組入れる新規の抗体またはFc融合体を構築するために、上記の臨床産物および候補の全ポリペプチドが用いられる必要はない;例えば臨床産物または候補抗体の可変領域、実質的に類似の可変領域、あるいは可変領域のヒト化、親和力成熟化、工学処理化または修飾化バージョンが用いられ得る。別の実施形態では、本発明の修飾Fc領域は、上記の臨床産物および候補のうちの1つと同一のエピトープ、抗原、リガンドまたは受容体と結合する抗体またはFc融合体に用途を見出し得る。
本発明の修飾Fc領域は、広範囲の抗体およびFc融合産物において用途を見出し得る。一実施形態では、本発明のABMは、治療薬、診断薬または研究試薬、好ましくは治療薬である。
本発明のABMにより治療されるかまたは改善され得る疾患および傷害としては、自己免疫疾患、免疫学的疾患、感染性疾患、炎症性疾患、神経学的疾患および腫瘍学的および新生物疾患、例えば癌が挙げられるが、これらに限定されない。「癌」および「癌性」とは、本明細書中では、典型的には非調節性細胞増殖により特性化される哺乳類における生理学的状態を指すかまたは説明する。癌の例としては、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫(例えば脂肪肉腫)、神経内分泌性腫瘍、中皮腫、シュワン細胞腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫および白血病またはリンパ系悪性疾患が挙げられるが、これらに限定されない。このような癌のさらに特定の例としては、扁平上皮細胞癌(例えば上皮性扁平細胞癌)、肺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮細胞癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃癌、例えば消化器癌、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、結腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌、肛門癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、ならびに頭部および頚部癌が挙げられる。さらに、本発明のFc変異体は、うっ血性心不全(CHF)、血管炎、赤ら顔、アクネ、湿疹、心筋炎および心筋のその他の症状、全身性紅斑性狼瘡、糖尿病、脊椎症、滑膜繊維芽細胞および骨髄間質細胞;骨損失;パジェット病、破骨細胞腫;多発性骨髄腫;乳癌;廃用性骨減少症;栄養失調、歯周病、ゴシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性繊維性異形成、多骨性繊維性異形成、歯周組織再構築および骨折;類肉腫症;多発性骨髄腫;骨溶解性骨癌、乳癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌;骨転移、骨疼痛処置、および体液性悪性過カルシウム血症、強直性脊椎炎およびその他の脊椎関節症;移植拒絶、ウイルス感染、血液学的新生物および新生物様症状、例えばホジキンリンパ腫;非ホジキンリンパ腫(バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫/慢性リンパ球性白血病、菌状息肉症、外套細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、瀰漫性大型B細胞リンパ腫、周縁帯リンパ腫、毛様細胞性白血病およびリンパ形質細胞性白血病)、リンパ球前駆細胞の腫瘍、例えばB細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、ならびにT細胞急性リンパ芽球性白血病/リンパ腫、胸腺腫、成熟TおよびNK細胞の腫瘍、例えば末梢性T細胞白血病、成人性T細胞白血病/T細胞リンパ腫、および大型顆粒リンパ球性白血病、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄様新生物、例えば急性骨髄性白血病、例えば成熟を伴うAML、分化を伴わないAML、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄性単球性白血病および急性単球性白血病、脊髄形成異常性症候群、および慢性骨髄増殖性障害、例えば慢性骨髄性白血病、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍(神経膠腫、神経芽細胞腫、星状細胞腫、髄芽細胞腫、上衣細胞腫および網膜芽細胞腫)、固形腫瘍(鼻咽頭癌、基底細胞癌、膵臓癌、胆道の癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮、膣または子宮頚部癌、卵巣癌、原発性肝臓癌または子宮内膜癌)、ならびに血管系の腫瘍(血管肉腫および血管周囲細胞腫)、骨粗鬆症、肝炎、HIV、AIDS、脊椎関節炎、慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患(IBD)、敗血症および敗血症性ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主疾患(GVHD)、同種異系島移植片拒絶、血液学的悪性疾患、例えば多発性骨髄腫(MM)、脊髄形成異常症候群(MDS)および急性骨髄性白血病(AML)、腫瘍と関連する炎症、末梢神経損傷または脱髄性疾患を含めた症状(これらに限定されない)を治療するために用いられ得る。
一実施形態では、本発明の修飾Fc領域を含むABMは、タンパク質の不適切発現を包含する疾患を有する患者に投与される。本発明の範囲内では、これは、例えば存在するタンパク質の量の変化、突然変異体タンパク質の存在またはその両方のために、異所性タンパク質により特性化される疾患および障害を含むよう意図される。過多は、分子レベルでの過剰発現、作用部位での出現の延長または蓄積、あるいは正常に比したタンパク質の活性増大(これらに限定されない)を含めた任意の原因のためであり得る。この低減は、任意の原因、例えば分子レベルでの発現低減、作用部位での出現の短縮または低減、突然変異体形態のタンパク質、あるいは正常に比したタンパク質の活性低減(これらに限定されない)のためであり得る。タンパク質のこのような過多または低減は、タンパク質の正常の発現、出現または活性と比較して測定され得るし、上記の測定値は、本発明のABMの開発および/または臨床試験において重要な役割を演じ得る。
工学処理方法
本発明は、Fc変異体を生成するために用いられ得る工学処理方法を提供する。Fc工学処理での従来の試みを妨げた主な障害物は、一部は工学処理戦略および方法の非効率性のため、そして抗体産生およびスクリーニングの低処理量性のために、修飾での無作為の試みだけが実行可能であったという点である。本発明は、これらの欠点を克服する工学処理方法を記載する。種々の設計戦略、コンピューター処理スクリーニング方法、ライブラリー生成方法、ならびに実験的産生およびスクリーニング方法が意図される。これらの戦略、アプローチ、技術および方法は、独立して、あるいは種々の組合せで適用されて、最適化Fc変異体を工学処理し得る。
本発明は、Fc変異体を生成するために用いられ得る工学処理方法を提供する。Fc工学処理での従来の試みを妨げた主な障害物は、一部は工学処理戦略および方法の非効率性のため、そして抗体産生およびスクリーニングの低処理量性のために、修飾での無作為の試みだけが実行可能であったという点である。本発明は、これらの欠点を克服する工学処理方法を記載する。種々の設計戦略、コンピューター処理スクリーニング方法、ライブラリー生成方法、ならびに実験的産生およびスクリーニング方法が意図される。これらの戦略、アプローチ、技術および方法は、独立して、あるいは種々の組合せで適用されて、最適化Fc変異体を工学処理し得る。
設計戦略
Fcと何らかのFcリガンドとの相互作用がFcおよび上記Fcリガンド間の界面でアミノ酸修飾を工学処理することにより変更されるFc変異体を工学処理するための一設計戦略が提供される。本明細書中のFcリガンドとしては、FcγR、C1q、FcRn、プロテインAまたはG等が挙げられるが、これらに限定されない。結合界面に強い影響を及ぼすFc位置での好ましい置換を精力的に探究することにより、新規の界面立体配座の見本となる変異体が工学処理され、そのうちのいくつかはFcリガンドとの結合を改善し、そのうちのいくつかはFcリガンド結合を低減し、そしてそのうちのいくつかは他の好ましい特性を有し得る。このような新規の界面立体配座は、例えば界面を形成するFcリガンド残基との直接的相互作用、あるいはアミノ酸修飾、例えば側鎖または主鎖立体配座の摂動により引き起こされる間接的作用の結果であり得る。可変的位置は、界面の立体配座の確定に重要な役割を演じると考えられる任意の位置として選択され得る。例えば可変的位置は、Fcリガンドとの直接的接触を成す任意の残基の一定距離内、例えば5オングストローム以内、好ましくは1〜10オングストロームにある残基組として選択され得る。
Fcと何らかのFcリガンドとの相互作用がFcおよび上記Fcリガンド間の界面でアミノ酸修飾を工学処理することにより変更されるFc変異体を工学処理するための一設計戦略が提供される。本明細書中のFcリガンドとしては、FcγR、C1q、FcRn、プロテインAまたはG等が挙げられるが、これらに限定されない。結合界面に強い影響を及ぼすFc位置での好ましい置換を精力的に探究することにより、新規の界面立体配座の見本となる変異体が工学処理され、そのうちのいくつかはFcリガンドとの結合を改善し、そのうちのいくつかはFcリガンド結合を低減し、そしてそのうちのいくつかは他の好ましい特性を有し得る。このような新規の界面立体配座は、例えば界面を形成するFcリガンド残基との直接的相互作用、あるいはアミノ酸修飾、例えば側鎖または主鎖立体配座の摂動により引き起こされる間接的作用の結果であり得る。可変的位置は、界面の立体配座の確定に重要な役割を演じると考えられる任意の位置として選択され得る。例えば可変的位置は、Fcリガンドとの直接的接触を成す任意の残基の一定距離内、例えば5オングストローム以内、好ましくは1〜10オングストロームにある残基組として選択され得る。
N297でのFc炭水化物の立体配座が最適化されるFc変異体を生成するための付加的設計戦略が提供される。この状況で用いられるような最適化は、所望の特性、例えばFcγRに対する親和力の増大または低減を生じるN297炭水化物における立体配座的および組成的変化を含むよう意図される。このような戦略は、炭水化物構造および立体配座がFc/FcγRおよびFc/C1q結合に劇的に作用する、という観察により支持される(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17: 176-180;Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74: 288-294;Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276: 45539-45547;Radaev et al., 2001, 276 J Biol Chem: 16478-16483;Shields et al., 2002, J Biol Chem 277: 26733-26740;Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278: 3466-3473)。炭水化物と相互作用する位置での好ましい置換を精力的に探究することにより、新規の炭水化物立体配座の見本となる変異体の質の多様性が工学処理され、そのうちのいくつかは1つまたは複数のFcリガンドとの結合を改善し、そのうちのいくつかは低減し得る。Fc/炭水化物界面近くの突然変異の大多数は炭水化物立体配座を変更すると思われるが、一方、いくつかの突然変異はグリコシル化組成を変更することが示されている(Lund et al., 1996, J Immunol 157: 4963-4969;Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82: 57-65)。
Cγ2およびCγ3ドメイン間の角度が最適化されるFc変異体を生成するための別の設計戦略が提供される。この状況で用いられるような最適化は、所望の特性、例えばFcγRに対する親和力の増大または低減を生じるCγ2‐Cγ3ドメインにおける立体配座変化を説明するよう意図され(Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276: 16478-16483)、そしてFc/FcγR界面から遠位の多数の突然変異は、それを調整することにより潜在的に結合に影響を及ぼす(Shields et al., J Biol Chem 276: 6591-6604 (2001))。Cγ2‐Cγ3角度および互いに対するドメインの柔軟性を確定するのに重要な役割を演じると思われる好ましい置換位置を精力的に探究することにより、新規の角度および柔軟性レベルの見本となる変異体の質の多様性が設計され、そのうちのいくつかは所望のFc特性に関して最適化され得る。
グリコシル化への構造的および機能的依存性を排除するために、Fcが再工学処理されるFc変異体を生成するための別の設計戦略が提供される。この設計戦略は、N297炭水化物の非存在下でのFcの構造、安定性、溶解性および/またはFc機能(例えば1つまたは複数のFcリガンドに対するFcの親和力)の最適化を包含する。一アプローチでは、グリコシル化の非存在下で溶媒に曝露される位置は、それらが安定で、Fc構造と構造的に一致し、そして集合傾向を有さないよう、工学処理される。Cγ2は、抗体中の唯一の非対合Igドメインである。したがってN297炭水化物は、普通は別のIgドメインとのタンパク質‐タンパク質相互作用のための界面である曝露疎水性パッチを覆い隠して、Fcの安定性および構造的全体性を保持し、中心軸を横切って集合することからCγ2ドメインを守る。アグリコシル化Fcを最適化するためのアプローチは、Cγ2‐Cγ2二量体軸方向に内側に面する極性および/または荷電残基を組入れることにより、そしてアグリコシル化Fc/FcγR界面またはアグリコシル化Fcと何らかの他のFcリガンドとの界面を直接的に増強するアミノ酸修飾を設計することにより、アグリコシル化Fc安定性および/または溶解性を増強するアミノ酸修飾を設計することを包含するが、これに限定されない。
Cγ2ドメインの立体配座が最適化されるFc変異体を工学処理するための付加的設計戦略が提供される。この状況で用いられるような最適化は、所望の特性、例えばFcγRに対する親和力の増大または低減を生じるCγ2ドメインにおける立体配座変化を説明するよう意図される。Cγ2立体配座に影響を及ぼすCγ2位置での好ましい置換位置を精力的に探究することにより、新規のCγ2立体配座の見本となる変異体の質の多様性が設計され、そのうちのいくつかが設計目標を達成し得る。このような新規のCγ2立体配座は、例えば当該変異体により見本とされる代替主鎖立体配座の結果であり得る。可変位置は、Cγ2構造、安定性、溶解性、柔軟性、機能等を確定するに際して重要な役割を演じると考えられる任意の位置として選択され得る。例えばCγ2疎水性コア残基、即ち溶媒から一部または全部封鎖されるCγ2残基が再工学処理され得る。代替的には、非コア残基、あるいは主鎖構造、安定性または柔軟性を確定するために重要であると思われる残基が考慮され得る。
Fcおよび何らかのその他のFcリガンド間の静電相互作用を調整する修飾により、FcγR、補体または上記のFcリガンドとの結合が変更されるF好ましい最適化のための付加的設計戦略が提供される。このような修飾はFcの全体的静電特質の最適化として考えられ、例としては、中性アミノ酸が荷電アミノ酸に取って代わること、荷電アミノ酸が中性アミノ酸に取って代わること、あるいは荷電アミノ酸が反対電荷のアミノ酸に取って代わる(即ち電荷逆転)ことが挙げられる。このような修飾は、Fcと1つまたは複数のFcリガンド、例えばFc.ガンマ.Rとの間の結合親和力における変化を達成するために用いられ得る。好ましい一実施形態では、静電置換が結合に作用する位置は、静電位の算定のための種々の周知の方法のうちの1つを用いて選択される。最も簡単な実施形態では、タンパク質における位置の一関数として静電位を生成するためにクーロンの法則が用いられる。付加的実施形態は、イオン強度作用を説明するためのデバイ・ヒュッケルのスケーリングの、そしてさらに洗練された実施形態、例えばポアソン・ボルツマン計算の使用を包含する。このような静電計算は位置を強調し、そして特定アミノ酸修飾を示唆して、設計目標を達成し得る。いくつかの場合、これらの置換は、例えば抑制性FcγRに対する結合親和力を低減しながら活性化FcγRとの結合を増強するために、異なるFcリガンドとの結合に可変的に作用すると予測され得る。
キメラマウス/ヒト抗体が記載されている。例えばMorrison, S.L. et al., PNAS 11: 6851-6854 (1984);欧州特許公告第173494号;Boulianna, G.L., et al., Nature 312: 642 (1984);Neubeiger, M.S. et al., Nature 314: 268 (1985);欧州特許公告第125023号;Tan et al., J. Immunol. 135: 8564 (1985);Sun, L.K. et al., Hybridoma 5(1): 517 (1986);Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986)を参照されたい。一般的にはMuron, Nature 312: 597 (1984);Dickson, Genetic Engineering News 5(3)(1985);Marx, Science 229: 455 (1985);およびMorrison, Science 229: 1202-1207 (1985)を参照。
特に好ましい一実施形態では、本発明のキメラABMはヒト化抗体である。非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該技術分野で既知である。例えば本発明のヒト化ABMは、米国特許第5,225,539号(Winter);米国特許第6,180,370号(Queen等);米国特許第6,632,927号(Adair等);米国特許出願第2003/0039649号(Foote);米国特許出願第2004/0044187号(Sato等);または米国特許出願第2005/0033028号(Leung等)(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)の方法に従って調製され得る。好ましくは、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される1つまたは複数のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と呼ばれ、これは典型的には「輸入」可変ドメインから得られる。ヒト化は、本質的には、Winterおよび共同研究者(Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986);Riechman et al., Nature, 332: 323-327 (1988);Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))の方法に従って、超可変領域配列をヒト抗体の対応する配列を代わりに置換することにより実施され得る。したがってこのような「ヒト化」抗体は、実質的に無傷とは言えないヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列により置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの超可変領域残基ならびにおそらくはいくつかのFR残基が齧歯類抗体中の類似部位からの残基により置換されるヒト抗体である。本発明のヒト化抗体は、一般的に、IgG1のようなヒト免疫グロブリンの定常領域を含む。
ヒト化抗体を作製するのに用いられるべき軽鎖および重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低減するために非常に重要である。いわゆる「ベスト・フィット」方法に従って、齧歯類抗体の可変ドメインの配列は、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。齧歯類の配列に最も近いヒト配列が次に、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク領域(FR)として受容される(Sims et al., J. Immunol., 151: 2296 (1993);Chothia et al., J. Mol. Biol., 196: 901 (1987))。ヒトフレームワーク配列を選択する別の方法は、全齧歯類フレームワークの個々の亜領域(即ちFR1、FR2、FR3およびFR4)の各々の配列または個々の亜領域の何らかの組合せ(例えばFR1とFR2)を、そのフレームワーク亜領域に対応する既知のヒト可変領域配列のライブラリーに対して比較し、そして齧歯類の配列に最も近い各亜領域または組合せに関するヒト配列を選択することである(米国特許出願第2003/0040606A1号(Leung)(2003年2月27日公開))(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群の全ヒト抗体の定常配列由来の特定のフレームワーク領域を用いる。同一フレームワークは、いくつかの異なるヒト化抗体に関して用いられ得る(Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992);Presta et al., J. Immunol., 151: 2623 (1993))(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)。
さらに、抗原に対する高親和性およびその他の好ましい生物学的特性の保持を伴って抗体がヒト化される、ということは重要である。この目標を達成するために、好ましい方法に従って、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いて、親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析プロセルにより、ヒト化抗体が調製される。三次元免疫グロブリンモデルは、当業者に周知のコンピュータープログラムを用いて生成され得る(例えばInsightII, accelrys inc(以前はMSI)、またはSchwede et al., Nucleic Acids Res. 2003 (13): 3381-3385に記載されたhttp://swissmodel.expasy.org/で)。これらのモデルの検査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基の有望な役割の分析、即ちその抗原を結合する候補免疫グロブリンの能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。このようにして、FR残基は選択され、レシピエントおよび輸入配列から併合され、したがって所望の抗体特質、例えば標的抗原(単数または複数)に対する親和性保持が達成される。概して、超可変領域残基は、直接的に、そして最も実質的には抗原結合に影響を及ぼすのに関与する。
一実施形態では、本発明のABMは修飾ヒトFc領域を含む。特定の一実施形態では、ヒト定常領域は、配列番号1および2で記述されるようにIgG1であり、それを以下に示す:
しかしながらネイティブヒトFc領域の変異体およびアイソフォームも、本発明に包含される。例えば本発明に用いるのに適した変異体Fc領域は、米国特許第6,737,056号(Presta)(1つまたは複数のアミノ酸修飾のためにエフェクター機能変更を有するFc領域変異体)に;あるいは米国特許出願第60/439,498号;第60/456,041号;第60/514,549号またはWO 2004/063351(アミノ酸修飾のために結合親和力増大を有する変異体Fc領域)に;あるいは米国特許第10/672,280号またはWO 2004/099249(アミノ酸修飾のためにFcγRとの結合変更を有するFc変異体)に教示された方法に従って産生され得る(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)。
別の実施形態では、本発明の抗原結合分子は、例えば米国特許出願第2004/0132066号(Balint等)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)に開示された方法に従って、結合親和力増強を示すよう工学処理される。
一実施形態では、本発明の抗原結合分子は、付加的部分、例えば放射性標識または毒素と接合される。このような接合ABMは、当該技術分野で周知である多数の方法により産生され得る。
種々の放射性核種は本発明に適用可能であり、そして当業者は、どの放射性核種が種々の状況下で最も適切であるかを容易に確定する能力を与えられる。例えば131ヨウ素は、標的免疫療法のために用いられる周知の放射性核種である。しかしながら131ヨウ素の臨床的有用性は、いくつかの因子、例えば:物理学的半減期8日;血液中および腫瘍部位でのヨウ素化抗体の脱ハロゲン化;ならびに腫瘍中の線量沈着局在化に関して次善のものであり得る放射特質(例えば大型ガンマ成分)により限定され得る。優れたキレート化剤の出現に伴って、タンパク質に金属キレート化群を結合するための機会は、その他の放射性核種、例えば111インジウムおよび90イットリウムを利用する機会を増大した。90イットリウムは、放射免疫療法適用における利用のためのいくつかの利益を提供する:90イットリウムの64時間の半減期は、腫瘍による抗体蓄積を可能にするのに十分に長く、そして131ヨウ素と異なり、90イットリウムは、100〜1000細胞直径という組織中範囲を有し、その崩壊において随伴ガンマ放射線を伴わない高エネルギーの純ベータ放射体である。さらに最小量の透過放射線は、90イットリウム標識抗体の外来患者投与を可能にする。付加的に、標識抗体のインターナライゼーションは細胞殺害のために必要とされず、そしてイオン化放射線の局所放射は、標的抗原を欠く隣接腫瘍細胞にとって致死的であるべきである。
放射能標識抗体に関して、それを伴う治療は、1回治療処置を用いて、または多数回処置を用いても生じ得る。放射性核種成分のため、処置前に、末梢幹細胞(「PSC」)または骨髄(「BM」)が、放射線に起因する潜在的胎児骨髄毒性を経験している患者に関して「収穫される」、というのが好ましい。BMおよび/またはPSCは、標準技法を用いて収穫され、次にパージされ、そして考え得る再注入のために凍結される。付加的には、処置前に、診断用標識抗体を用いて(例えば111インジウムを用いて)、診断的線量測定が患者に実行されるのが最も好ましいが、この目的は、治療用標識抗体(例えば90イットリウム使用)が任意の正常器官または組織中で必ずしも「濃縮される」ようになるわけではない、ということを保証することである。
好ましい一実施形態では、本発明は、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む単離ポリヌクレオチドに向けられる。本発明はさらに、本発明のヌクレオチド配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一である配列を含む単離核酸に向けられる。別の実施形態では、本発明は、本発明のアミノ酸配列と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸に向けられる。本発明は、1つまたは複数の保存的アミノ酸置換を有する本発明のポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸も包含する。
別の実施形態では、本発明は、本発明の1つまたは複数の単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターおよび/または宿主細胞に向けられる。
一般的に、任意の型の培養細胞株を用いて、本発明のABMを発現し得る。好ましい一実施形態では、HEK293‐EBNA細胞、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、その他の哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞がバックグラウンド細胞株として用いられて、本発明の工学処理宿主細胞を生成する。
本発明のABMの治療効能は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに発現する宿主細胞中でそれらを産生することにより増強され得る。好ましい一実施形態では、ポリペプチドは、以下の:β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチド;α‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチド、ならびにβ‐(1,4)‐ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドから成る群から選択される。一実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドを発現する。別の実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドならびにα‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチド、α‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチド、およびβ‐(1,4)‐ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。ポリペプチドは、ABMのFc領域中のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現される。あるいは宿主細胞は、グリコシルトランスフェラーゼ、例えばα(1,6)‐フコシルトランスフェラーゼの発現低減を示すよう工学処理され得る。好ましい一実施形態では、GnT‐III活性を有するポリペプチドは、ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドである。別の好ましい実施形態では、GnT‐III活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する宿主細胞中の本発明のABMの発現は、Fc受容体結合親和力増大およびエフェクター機能増大を有するABMを生じる。したがって、一実施形態において本発明は、(a)GnT‐III活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む単離核酸;ならびに(b)本発明のABM、例えばキメラ、霊長類化またはヒト化抗体をコードする単離ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に向けられる。好ましい一実施形態では、GnT‐III活性を有するポリペプチドは、GnT‐IIIの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドであり、そして、ゴルジ局在ドメインはマンノシダーゼIIの局在ドメインである。このようなポリペプチドを生成するための、そしてエフェクター機能増大を有する抗体を産生するためにそれらを用いるための方法は、米国特許出願第60/495,142号および米国特許出願第2004/0241817A1号(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)に開示されている。特に好ましい一実施形態では、キメラ抗体は、ヒトFcを含む。別の好ましい実施形態では、抗体は霊長類化またはヒト化される。
代替的一実施形態では、本発明のABMは、少なくとも1つのフコシルトランスフェラーゼ、例えばα1,6‐コアフコシルトランスフェラーゼ活性の低減、抑制または排除を示すよう工学処理された宿主細胞中でそれらを産生することにより、増強され得る。
一実施形態では、本発明のABMをコードする1または数個のポリヌクレオチドは、構成性プロモーターあるいは調節性発現系の制御下で発現され得る。適切な調節性発現系としては、テトラサイクリン調節発現系、エクジソン誘導性発現系、lac‐スイッチ発現系、糖質コルチコイド誘導性発現系、温度誘導性プロモーター系およびメタロチオネイン金属誘導性発現系が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のABMをコードするいくつかの異なる核酸が宿主細胞系内に含まれる場合、それらのいくつかは構成性プロモーターの制御下で発現される、一方、他のもの調節性プロモーターの制御下で発現される。最大発現レベルは、細胞増殖速度に及ぼす有意の悪作用を有さない安定ポリペプチド発現の考え得る最高レベルであると考えられ、そしてルーチン実験を用いて確定される。発現レベルは、当該技術分野で一般的に既知の方法、例えばABMに特異的な抗体またはABMと融合されるペプチドタグに特異的な抗体を用いるウエスタンブロット分析;ならびにノーザンブロット分析により確定される。さらなる代替的実施形態では、ポリヌクレオチドはレポーター遺伝子に操作可能的に連結され得る;本発明のABMの発現レベルは、レポーター遺伝子の発現レベルと相関するシグナルを測定することにより確定される。レポーター遺伝子は、単一mRNA分子として上記の融合ポリペプチドをコードする核酸(単数または複数)と一緒に転写され得る;それらのそれぞれのコード配列は、内部リボソーム進入部位(IRES)により、あるいはキャップ非依存性翻訳エンハンサー(CITE)により、連結され得る。レポーター遺伝子は、単一ポリペプチド鎖が形成されるよう、キメラABMをコードする少なくとも1つの核酸と一緒に翻訳され得る。2つの別個のメッセンジャーRNA(mRNA)分子に代替的にスプライスされるRNA分子(その結果生じるmRNAの一方は上記のレポータータンパク質に翻訳され、そして他方は上記の融合ポリペプチドに翻訳される)に融合ポリペプチドおよびレポーター遺伝子をコードする核酸が転写されるよう、本発明のABMをコードする核酸は、単一プロモーターの制御下でレポーター遺伝子に操作可能的に連結され得る。
当業者に周知である方法を用いて、適切な転写/翻訳制御シグナルとともに本発明のABMのコード配列を含有する発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、in vitro組換えDNA技法、合成技法、ならびにin vivo組換え/遺伝子組換えが挙げられる(例えばManiatis et al., MOLECULAR CLONING A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)およびAusubel et al., CURRENT MANUALS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1989)に記載された技法を参照)。
種々の宿主発現ベクター系は、本発明のABMのコード配列を発現するために利用され得る。好ましくは哺乳類細胞は、当該タンパク質のコード配列および融合ポリペプチドのコード配列を含有する組換えプラスミドDNAまたはコスミドDNA発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞系として用いられる。最も好ましくは、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、YO骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、その他の哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞が宿主細胞系として用いられる。発現系および選択方法のいくつかの例は、以下の参考文献および本明細書中の参考文献に記載されている:Borth et al., Biotechnol. Bioen. 71(4): 266-73 (2000-2001);Werner et al., Arzneimittelforschung/Drug Res. 48(8): 870-80 (1998);Andersen and Krummen, Curr. Op. Biotechnol. 13: 117-123 (2002);Chadd and Chamow, Curr. Op. Biotechnol. 12: 188-194 (2001)およびGiddings, Curr. Op. Biotechnol. 12: 450-454 (2001)。代替的実施形態では、他の真核生物宿主細胞系、例えば本発明のABMのコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞、例えば米国特許出願第60/344,169号およびWO 03/056914(非ヒト真核生物宿主細胞におけるヒト様糖タンパク質の産生方法)(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)で教示された発現系;本発明のキメラABMのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)に感染した昆虫細胞系;本発明のABMのコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルス、CaMV;タバコモザイクウイルス、TMV)に感染したまたは組換えプラスミド発現ベクター(例えばTiプラスミド)で形質転換された植物細胞系、例えば米国特許第6,815,184号(遺伝子工学処理ウキクサからの生物学的活性ポリペプチドの発現および分泌方法);WO 2004/057002(グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の導入による蘚苔植物細胞中のグリコシル化タンパク質の産生)およびWO 2004/024927(コケ原形質体における細胞外異種非植物タンパク質の生成方法);ならびに米国特許出願第60/365,769号、第60/368,047号およびWO 2003/078614(機能性哺乳類GnTIII酵素を含むトランスジェニック植物における糖タンパク質プロセシング)(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)に教示された発現系;あるいは組換えウイルス発現ベクター(例えばアデノウイルス、ワクシニアウイルス)、例えば本発明のキメラABMをコードするDNAの多コピーを含有するよう工学処理された細胞株に感染した、あるいは二重微小染色体中で安定的に増幅された(CHO/dhfr)または不安定的に増幅された(例えばネズミ細胞株)動物細胞系が用いられ得る。一実施形態では、本発明のABMをコードするポリヌクレオチド(単数または複数)を含むベクターは、多シストロン性である。さらにまた一実施形態では、上記のABMは、抗体またはその断片である。好ましい一実施形態では、ABMはヒト化抗体である。
本発明の方法に関して、安定発現は一般に、それが典型的にはより再現可能な結果を達成し、そしてさらにまた大規模生産になじみやすいために、一過性発現より好ましいが、しかし一過性発現も本発明に包含される。ウイルス複製起点を含有する発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞は、適切な発現制御素子(例えばプロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位等)および選択マーカーにより制御されるそれぞれのコード核酸で形質転換され得る。外来DNAの導入後、工学処理細胞は濃化培地中で1〜2日間増殖させられて、次に選択培地に切り換えられる。組換えプラスミド中の選択マーカーは、選択に対する耐性を付与し、そしてそれらの染色体中にプラスミドを安定的に組込んだ、そして増殖して病巣を形成し、これが次に細胞株中でクローン化され、拡張され得る細胞の選択を可能にする。
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler et al., Cell 11: 223 (1977))、ヒポキサンチン‐グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 2026 (1962))およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(Lowy et al., Cell 22:817 (1980))遺伝子(これらはそれぞれtk−、hgprt−またはaprt−細胞中で用いられ得る)を含めた(これらに限定されない)多数の選択系が用いられ得る。さらにまた抗代謝産物耐性は、dhfr(これはメトトレキセートに対する耐性を付与する)(Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77: 3567 (1989);O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1527 (1981));gpt(これはミコフェノール酸に対する耐性を付与する)(Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072 (1981));neo(これはアミノグリコシドG‐418に対する耐性を付与する)(Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1 (1981));およびhygro(これはヒグロマイシンに対する耐性を付与する)(Santerre et al., Gene 30: 147 (1984))遺伝子に関する選択の基礎として用いられ得る。付加的選択遺伝子、即ちtrpB(トリプトファンの代わりにインドールを細胞に利用させる);hisD(ヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞に利用させる)(Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8047 (1988));グルタミンシンターゼ系;およびODC(オルニチンデカルボキシラーゼ)(これはオルニチンデカルボキシラーゼ阻害剤2‐(ジフルオロメチル)‐DL‐オルニチン、DFMOに対する耐性を付与する)(McConlogue, in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed. (1987))が記載されている。
本発明はさらに、宿主細胞により産生される本発明のABMのグリコシルプロフィールの修飾方法であって、本発明のABMをコードする核酸およびグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする核酸、あるいはこのような核酸を含むベクターを上記宿主細胞中で発現することを包含する方法に向けられる。好ましい一実施形態では、ポリペプチドは、以下の:β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチド;α‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチド、ならびにβ‐(1,4)‐ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドから成る群から選択される。一実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドを発現する。別の実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドならびにα‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチド、α‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチド、およびβ‐(1,4)‐ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。好ましくは修飾ポリペプチドは、Fc領域を含むIgまたはその断片である。特に好ましい一実施形態では、ABMはヒト化抗体またはその断片である。代替的には、またはさらに、このような宿主細胞は、少なくとも1つのフコシルトランスフェラーゼの活性の低減、抑制または排除を示すよう工学処理され得る。別の実施形態では、宿主細胞は、本発明のABM、GnT‐IIIおよびマンノシダーゼII(ManII)を同時発現するよう工学処理される。
本発明の宿主細胞により産生される修飾ABMは、修飾の結果として、Fc受容体結合親和力増大および/またはエフェクター機能増大を示す。特に好ましい一実施形態では、ABMはFc領域を含有するヒト化抗体またはその断片である。好ましくはFc受容体結合親和力増大は、Fcγ活性化受容体、例えばFcγRIIIa受容体との結合増大である。エフェクター機能増大は、好ましくは以下のうちの1つまたは複数における増大である:抗体依存性細胞性細胞傷害性増大、抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)増大、サイトカイン分泌増大、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込み増大、Fc媒介性細胞性細胞傷害性増大、NK細胞との結合増大、マクロファージとの結合増大、多形核細胞(PMN)との結合増大、単球との結合増大、標的結合抗体の架橋増大、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシス増大、樹状細胞成熟増大、またはT細胞初回刺激増大。
本発明は、宿主細胞における修飾オリゴ糖を有する本発明のABMの産生方法であって、(a)本発明に従ってABMの産生を可能にする条件下でグリコシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を発現するよう工学処理された宿主細胞を培養するステップ(この場合、グリコシルトランスフェラーゼ活性を有する上記ポリペプチドは上記宿主細胞により産生される上記ABMのFc領域中のオリゴ糖を修飾するのに十分な量で発現される);そして(b)上記ABMを単離するステップを包含する方法にも向けられる。好ましい一実施形態では、ポリペプチドは、以下の:β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチド;α‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチド、ならびにβ‐(1,4)‐ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドから成る群から選択される。一実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドを発現する。別の実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチドならびにα‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチドを発現する。さらに別の実施形態では、宿主細胞は、β(1,4)‐N‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII活性を有するポリペプチド、α‐マンノシダーゼII活性を有するポリペプチド、およびβ‐(1,4)‐ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドを発現する。好ましい一実施形態では、GnT‐III活性を有するポリペプチドは、GnT‐IIIの触媒ドメインを含む融合ポリペプチドである。特に好ましい一実施形態では、融合ポリペプチドはさらに、ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む。
好ましくはゴルジ局在ドメインは、マンノシダーゼIIまたはGnT‐Iの局在ドメインである。あるいはゴルジ局在ドメインは、以下の:マンノシダーゼIの局在ドメイン、GnT‐IIの局在ドメインおよびα1‐6コアフコシルトランスフェラーゼの局在ドメインから成る群から選択される。本発明の方法により産生されるABMは、Fc受容体結合親和力増大および/またはエフェクター機能増大を示す。好ましくはエフェクター機能増大は、以下のうちの1つまたは複数である:Fc媒介性細胞性細胞傷害性増大(例えば抗体依存性細胞性細胞傷害性増大)、抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)増大、サイトカイン分泌増大、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込み増大、NK細胞との結合増大、マクロファージとの結合増大、単球との結合増大、多形核細胞との結合増大、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシス増大、標的結合抗体の架橋増大、樹状細胞成熟増大、またはT細胞初回刺激増大。Fc受容体結合親和力増大は、好ましくはFc活性化受容体、例えばFcγRIIIaとの結合増大である。特に好ましい一実施形態では、ABMはヒト化抗体またはその断片である。
別の実施形態では、本発明は、修飾Fc領域を有するキメラABMであって、上記ポリペプチドのFc領域中の分枝オリゴ糖の比率増大を示すキメラABMに向けられる。このようなABMはFc領域を含む抗体およびその断片を包含する、ということが意図される。好ましい一実施形態では、ABMはヒト化抗体である。一実施形態では、ABMのFc領域中の分枝オリゴ糖のパーセンテージは、総オリゴ糖の少なくとも50%、さらに好ましくは少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%または少なくとも90%、最も好ましくは少なくとも90〜95%である。さらに別の実施形態では、本発明の方法により産生されるABMは、本発明の方法によるそのオリゴ糖の修飾の結果として、Fc領域中の非フコシル化オリゴ糖の比率増大を示す。一実施形態では、非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、少なくとも50%、好ましくは少なくとも60%〜70%、最も好ましくは少なくとも75%である。非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合体型のものであり得る。特に好ましい一実施形態では、本発明の宿主細胞および方法により産生されるABMは、Fc領域中の分枝非フコシル化オリゴ糖の比率増大を示す。分枝非フコシル化オリゴ糖は、ハイブリッドまたは複合体であり得る。特定的には、本発明の方法は、ABMのFc領域中のオリゴ糖の少なくとも15%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも25%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも35%が分枝非フコシル化されるABMを産生するために用いられ得る。本発明の方法は、ポリペプチドのFc領域中のオリゴ糖の少なくとも15%、さらに好ましくは少なくとも20%、さらに好ましくは少なくとも25%、さらに好ましくは少なくとも30%、さらに好ましくは少なくとも35%が分枝ハイブリッド非フコシル化されるポリペプチドを産生するためにも用いられ得る。
別の実施形態では、本発明は、修飾Fc領域を有し、そしてエフェクター機能増大および/またはFc受容体結合親和力増大を示すよう工学処理される、本発明の方法により産生されるキメラABMに向けられる。好ましくはエフェクター機能増大は、以下のうちの1つまたは複数のである:Fc媒介性細胞性細胞傷害性増大(例えば抗体依存性細胞性細胞傷害性増大)、抗体依存性細胞性貪食作用(ADCP)増大、サイトカイン分泌増大、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取込み増大、NK細胞との結合増大、マクロファージとの結合増大、単球との結合増大、多形核細胞との結合増大、直接的シグナル伝達誘導性アポトーシス増大、標的結合抗体の架橋増大、樹状細胞成熟増大、またはT細胞初回刺激増大。好ましい一実施形態では、Fc受容体結合親和力増大は、Fc活性化受容体、もっとも好ましくはFcγRIIIaとの結合増大である。一実施形態では、ABMはFc領域を含有する抗体または抗体断片、あるいは免疫グロブリンのFc領域と等価の領域を含む融合タンパク質である。特に好ましい一実施形態では、ABMはヒト化抗体である。
本発明はさらに、本発明のABMおよび製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物に向けられる。
本発明はさらに、癌の治療方法におけるこのような製剤組成物の使用に向けられる。特定的には、本発明は、癌の治療または予防のための方法であって、治療的有効量の本発明の製剤組成物を投与することを包含する方法に向けられる。
本発明はさらに、前癌性状態または病変の治療方法におけるこのような製剤組成物の使用に向けられる。特定的には、本発明は、前癌性状態または病変の治療または予防のための方法であって、治療的有効量の本発明の製剤組成物を投与することを包含する方法に向けられる。
本発明はさらに、Fc受容体結合親和力増大、好ましくはFc活性化受容体との結合増大を示すおよび/またはエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞性細胞傷害性増大を示す本発明のABMのグリコフォームの産生のための宿主細胞系の生成および使用のための方法を提供する。本発明のABMとともに用いられ得る糖鎖工学処理方法は、米国特許第6,602,684号、米国特許出願第2004/0241817 A1号、米国特許出願第2003/0175884 A1号、米国特許仮出願第60/441,307号およびWO 2004/065540(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)により詳細に記載されている。本発明のABMは、代替的には、米国特許出願第2003/0157108(Genentech)号に、または欧州特許第1 176 195 A1号、WO 03/084570、WO 03/085119および米国特許出願第2003/0115614号、第2004/093621号、第2004/110282号、第2004/110704号、第2004/132140号(すべてKyowa Hakko Kogyo Ltd.)に開示された技法に従って、Fc領域中のフコース残基低減を示すよう糖鎖工学処理され得る。これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される。本発明の糖鎖工学処理ABMは、例えば米国特許出願第60/344,169号およびWO 03/056914(GlycoFi, Inc.)に、またはWO 2004/057002およびWO 2004/024927(Greenovation)(これらの記載内容は各々、参照により本明細書中で援用される)に教示されたもののような修飾糖タンパク質を産生する発現系においても産生され得る。
グリコシル化パターンを有するタンパク質の産生のための細胞株の生成
本発明は、修飾Fc領域および修飾Fcグリコシル化パターンを有する本発明のABMの生成のための宿主細胞発現系を提供する。特に本発明は、治療的価値の改善を示す本発明のABMのグリコフォームの生成のための宿主細胞系を提供する。したがって本発明は、GnT‐III活性を有するポリペプチドを発現するよう選択されるかまたは工学処理される宿主細胞発現系を提供する。一実施形態では、GnT‐III活性を有するポリペプチドは、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドである。特定的には、このような宿主細胞発現系は、構成性または調節性プロモーター系と操作可能的に連結される、GnT‐IIIを有するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含むよう工学処理され得る。
本発明は、修飾Fc領域および修飾Fcグリコシル化パターンを有する本発明のABMの生成のための宿主細胞発現系を提供する。特に本発明は、治療的価値の改善を示す本発明のABMのグリコフォームの生成のための宿主細胞系を提供する。したがって本発明は、GnT‐III活性を有するポリペプチドを発現するよう選択されるかまたは工学処理される宿主細胞発現系を提供する。一実施形態では、GnT‐III活性を有するポリペプチドは、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドである。特定的には、このような宿主細胞発現系は、構成性または調節性プロモーター系と操作可能的に連結される、GnT‐IIIを有するポリペプチドをコードする組換え核酸分子を含むよう工学処理され得る。
特定の一実施形態では、本発明は、GnT‐III活性を有し、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの核酸を発現するよう工学処理された宿主細胞を提供する。一態様では、宿主細胞は、GnT‐III活性を有し、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドをコードする少なくとも1つの遺伝子を含む核酸分子を用いて工学処理される。
一般的に、任意の型の培養細胞株、例えば上記の細胞株は、本発明の宿主細胞株を工学処理するためのバックグラウンドとして用いられ得る。好ましい一実施形態では、CHO細胞、BHK細胞、NS0細胞、SP2/0細胞、Y0骨髄腫細胞、P3X63マウス骨髄腫細胞、PER細胞、PER.C6細胞またはハイブリドーマ細胞、その他の哺乳類細胞、酵母細胞、昆虫細胞または植物細胞が、本発明の工学処理宿主細胞を生成するためのバックグラウンド細胞株として用いられる。
本発明は、GnT‐III活性を有するポリペプチド、例えば本明細書中に記載咲いたような異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドを発現する任意の工学処理宿主細胞を包含するよう意図される。
GnT‐III活性を有するポリペプチドをコードする1つまたは数個の核酸は、構成性プロモーター、あるいは調節性発現系の制御下で発現され得る。このような系は当該技術分野で周知であり、そして上記の系を含む。GnT‐III活性を有し、異種ゴルジ常在性ポリペプチドのゴルジ局在ドメインを含む融合ポリペプチドをコードするいくつかの異なる核酸は、宿主細胞系内に含まれ、それらのいくつかは構成性プロモーターの制御下で発現され得るが、一方、他のものは調節性プロモーターの制御下で発現される。GnT‐III活性を有する融合ポリペプチドの発現レベルは、当該技術分野で一般的に既知の方法、例えばウエスタンブロット分析、ノーザンブロット分析、レポーター遺伝子発現分析、またはGnT‐III活性の測定により確定される。あるいは、GnT‐IIIの生合成産物と結合するレクチン、例えばE4‐PHAが用いられ得る。あるいは、GnT‐III活性を有するポリペプチドをコードする核酸で工学処理された細胞により産生される抗体により媒介されるFc受容体結合増大またはエフェクター機能増大を測定する機能的検定が用いられ得る。
修飾グリコシル化パターンを有するタンパク質を発現するトランスフェクト体または形質転換体の同定
キメラABMのコード配列を含有し、生物学的活性遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一般アプローチにより同定され得る:(a)DNA‐DNAまたはDNA‐RNAハイブリダイゼーション;(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在;(c)宿主細胞中のそれぞれのmRNA転写体の発現により測定されるような転写レベルの査定;ならびに(d)イムノアッセイによりまたはその生物学的活性により測定されるような遺伝子産物の検出。
キメラABMのコード配列を含有し、生物学的活性遺伝子産物を発現する宿主細胞は、少なくとも4つの一般アプローチにより同定され得る:(a)DNA‐DNAまたはDNA‐RNAハイブリダイゼーション;(b)「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在;(c)宿主細胞中のそれぞれのmRNA転写体の発現により測定されるような転写レベルの査定;ならびに(d)イムノアッセイによりまたはその生物学的活性により測定されるような遺伝子産物の検出。
第一のアプローチでは、本発明のキメラABMのコード配列ならびにGnT‐III活性を有するポリペプチドのコード配列の存在は、それぞれのコード配列とそれぞれ相同であるヌクレオチド配列あるいはその一部または誘導体を含むプローブを用いるDNA‐DNAまたはDNA‐RNAハイブリダイゼーションにより検出され得る。
第二のアプローチでは、組換え発現ベクター/宿主系は、ある種の「マーカー」遺伝子機能(例えばチミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、メトトレキセートに対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体系性等)の存在または非存在に基づいて同定され、選択され得る。例えば本発明のABMのコード配列またはその断片、ならびにGnT‐III活性を有するポリペプチドのコード配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、それぞれのコード配列を含有する組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。あるいはマーカー遺伝子は、コード配列の配列を制御するために用いられる同一のまたは異なるプロモーターの制御下でコード配列と縦一列に配置され得る。誘導または選択に応答するマーカーの発現は、本発明のABMのコード配列ならびにGnT‐III活性を有するポリペプチドのコード配列の発現を示す。
第三のアプローチでは、本発明のABMのコード領域またはその断片、ならびにGnT‐III活性を有するポリペプチドのコード配列に関する転写活性は、ハイブリダイゼーション検定により査定され得る。例えば本発明のABMのコード配列またはその断片およびGnT‐III活性を有するポリペプチドのコード配列またはその特定部分と相同であるプローブを用いてノーザンブロットにより、RNAが単離され、分析され得る。あるいは宿主細胞の総核酸が抽出され、そしてこのようなプローブとのハイブリダイゼーションに関して検定され得る。
第四のアプローチでは、タンパク質産物の発現は、例えばウエスタンブロット、イムノアッセイ、例えば放射免疫沈降、酵素結合イムノアッセイ等により、免疫学的に査定され得る。しかしながら発現系の成功についての最終的試験は、生物学的活性遺伝子産物の検出を包含する。
抗体依存性細胞性細胞傷害性を含めたエフェクター機能増大を示すABMの生成および使用
好ましい実施形態では、本発明は、修飾Fc領域を有し、そして抗体依存性細胞性細胞傷害性を含めたエフェクター機能増大を示すキメラABMのグリコフォームを提供する。抗体のグリコシル化工学処理は、これまでに記載されている(例えば米国特許第6,602,684号(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)参照)。
好ましい実施形態では、本発明は、修飾Fc領域を有し、そして抗体依存性細胞性細胞傷害性を含めたエフェクター機能増大を示すキメラABMのグリコフォームを提供する。抗体のグリコシル化工学処理は、これまでに記載されている(例えば米国特許第6,602,684号(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)参照)。
いくつかの型の癌の治療のための非接合型モノクローナル抗体(mAb)の臨床試験は、近年、希望的結果を生じた(Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997);Deo et al., Immunology Today 18: 127 (1997))。キメラ非接合型IgG1は、軽度のまたは濾胞性B細胞非ホジキンリンパ腫に関して認可されている(Dillman, Cancer Biother. & Radiopharm. 12: 223-25 (1997))が、一方、別の非接合型mAb(ヒト化IgG1標的固形乳房腫瘍)も、III期臨床試験において見込みのある結果を示している(Deo et al., Immunology Today 18: 127 (1997))。これら2つのmAbの抗原はそれらのそれぞれの腫瘍細胞中で高度に発現され、そして抗体はin vitroおよびin vivoでのエフェクター細胞による強力な腫瘍破壊を媒介する。これに対比して、精密な腫瘍特異性を有する多数のその他の非接合型mAbは、臨床的に有用であるのに十分な効能を有するエフェクター機能を誘発し得ない(Frost et al., Cancer 80: 317-33 (1997);Surfus et al., J. Immunother. 19: 184-91 (1996))。これらの弱いmAbのいくつかに関しては、補助剤サイトカイン両方が一般に試験されている。サイトカインの付加は、循環リンパ球の活性および数を増大することにより、抗体依存性細胞性細胞傷害性(ADCC)を刺激し得る(Frost et al., Cancer 80: 317-33 (1997);Surfus et al., J. Immunother. 19: 184-91 (1996))。ADCC(抗体標的化細胞に及ぼす溶解性襲撃)は、抗体の定常領域(Fc)との白血球受容体の結合時に誘発される(Deo et al., Immunology Today 18: 127 (1997))。
非接合型IgG1のADCC活性を増大するための、異なるがしかし補足的なアプローチは、抗体のFc領域を工学処理することである。タンパク質工学処理試験は、FcγRが主にIgG分子のヒンジ領域と相互作用する、ということを示している(Lund et al., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996))。しかしながらFcγR結合も、CH2領域中の保存Asn297で共有結合されるオリゴ糖の存在を必要とするが(Lund et al., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996);Wright and Morrison, Trends Biotech. 15: 26-31 (1997))、これは、いずれかのオリゴ糖およびポリペプチドがともに相互作用部位に直接的に寄与するということを、あるいは活性CH2ポリペプチド立体配座を保持するためにはオリゴ糖が必要とされる、ということを示唆する。したがってオリゴ糖構造の修飾は、相互作用の親和力を増大するための一手段として探究され得る。
IgG分子は、そのFc領域(各重鎖上に1つ)に2つのN結合型オリゴ糖を保有する。任意の糖タンパク質と同様、抗体は、同一ポリペプチド主鎖を共有するがしかしグリコシル化部位に結合される異なるオリゴ糖を有するグリコフォームの一集団として産生される。血清IgGのFc領域に普通に見出されるオリゴ糖は、複雑なバイアンテナ型(Wormald et al., Biochemistry 36: 130-38 (1997))のものであって、低レベルの末端シアル酸および分枝N‐アセチルグルコサミン(GlcNAc)、ならびに可変程度の末端ガラクトシル化およびコアフコシル化を伴う。FcγR結合のために必要とされる最小炭水化物構造がオリゴ糖コア内に存在する、ということを示唆する試験もある(Lund et al., J. Immunol. 157: 4963-69 (1996))。
非接合型治療用mAbの産生のために産業界および学界で用いられるマウス‐またはハムスター由来細胞株は、普通は必要とされるオリゴ糖決定因子をFc部位に結合する。しかしながらこれらの細胞株中で発現されるIgは、血清IgG中に少量で見出される分枝GlcNAcを欠く(Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995))。これに対比して、ラット骨髄腫産生ヒト化IgG1(CAMPATH‐1H)は、そのグリコフォームのいくつかにおいて分枝GlcNAcを保有する、ということが観察された(Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995))。ラット細胞由来抗体は、標準細胞株中で産生されるCAMPATH‐1H抗体として、しかし有意に低い抗体濃度で、類似の最大in vitroADCC活性に達する。
CAMPATH抗原は、普通はリンパ腫細胞上に高レベルで存在し、そしてこのキメラmAbは分枝GlcNAcの非存在下で高ADCC活性を有する(Lifely et al., Glycobiology 318: 813-22 (1995))。N結合型グリコシル化経路では、分枝GlcNAcはGnT‐IIIにより付加される(Schachter, Biochem. Cell Biol. 64: 163-81 (1986))。
従来の試験は、外部調節方式で、異なるレベルのクローン化GnT‐III遺伝子酵素を発現するよう予め工学処理された単一抗体産生CHO細胞株を用いた(Umana, P., et al., Nature Biotechnol. 17: 176-180 (1999))。このアプローチは、GnT‐IIIの発現と修飾抗体のADCC活性との間の相関を始めて確立した。したがって本発明は、1つまたは複数のアミノ酸修飾からの修飾Fc領域を有し、そしてGnT‐III活性増大に起因するグリコシル化変更を示す組換えキメラまたはヒト化ABM(例えば抗体)またはその断片を意図する。GnT‐III活性増大は、ABMのFc領域における分枝オリゴ糖のパーセンテージ増大、ならびにフコース残基のパーセンテージの低減を生じる。この抗体またはその断片は、Fc受容体結合親和力増大およびエフェクター機能増大を有する。さらに本発明は、免疫グロブリンのFc領域と等価である領域を含む抗体断片および融合タンパク質に向けられる。
本発明の方法により産生されるABMの治療用途
最も広範な意味で、本発明のABMは、所望の抗原を発現するin vivoまたはin vitroの細胞を標的化するために用いられ得る。所望の抗原を発現する細胞は、診断または治療目的のために標的化され得る。一態様では、本発明のABMは、試料中の抗原の存在を検出するために用いられ得る。別の態様では、本発明のABMは、例えば同定またはターゲッティングのために、in vitroまたはin vivoでの抗原発現細胞を結合するために用いられ得る。さらに特定的には、本発明のABMは、抗原リガンドと結合する抗原を遮断するかまたは抑制するために、あるいは破壊のために抗原発現細胞を標的化するために用いられ得る。
最も広範な意味で、本発明のABMは、所望の抗原を発現するin vivoまたはin vitroの細胞を標的化するために用いられ得る。所望の抗原を発現する細胞は、診断または治療目的のために標的化され得る。一態様では、本発明のABMは、試料中の抗原の存在を検出するために用いられ得る。別の態様では、本発明のABMは、例えば同定またはターゲッティングのために、in vitroまたはin vivoでの抗原発現細胞を結合するために用いられ得る。さらに特定的には、本発明のABMは、抗原リガンドと結合する抗原を遮断するかまたは抑制するために、あるいは破壊のために抗原発現細胞を標的化するために用いられ得る。
本発明のABMは、in vivoで腫瘍細胞を標的化し、殺害するために、単独で用いられ得る。ABMはまた、ヒト癌腫を治療するために、適切な治療薬とともに用いられ得る。例えばABMは、標準的または慣用的治療方法、例えば化学療法、放射線療法と組合せて用いられ得るし、あるいは癌腫の部位への治療薬の送達のために、治療薬または毒素と、ならびにリンフォカインまたは腫瘍抑制性増殖因子と接合または連結され得る。最も重要である本発明のABMの接合体は、(1)免疫毒素(ABMと細胞傷害性部分との接合体)、ならびに(2)標識ABMを含む免疫複合体を同定するための一手段を標識が提供する標識(例えば放射能標識、酵素標識または蛍光色素標識)ABMである。ABMは、天然補体プロセスにより溶解を誘導するために、そして普通に存在する抗体依存性細胞傷害性細胞と相互作用するためにも用いられ得る。
免疫毒素の細胞傷害性部分は、細菌または植物起源の細胞傷害性薬または酵素的に活性な毒素、またはこのような毒素の酵素的活性断片(「A鎖」)であり得る。用いられる酵素的活性毒素およびその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、外毒素A鎖(緑膿菌から)、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデッシンA鎖、アルファ‐サルシン、Aleurites fordiiタンパク質、ジアンチンdianthinタンパク質、ヨウシュヤマゴボウタンパク質(PAPI、PAPIIおよびPAPIII)、ニガウリ阻害薬、クルシン、クロチン、サポナリア・オフィシナリス阻害薬、ゲロニン、ミトゲリン、レストリクトシン、フェノマイシンおよびエノマイシンである。別の実施形態では、ABMは、小分子抗癌薬と接合される。ABMおよびこのような細胞傷害性部分の接合体は、種々の二機能性タンパク質カップリング剤を用いて作製される。このような試薬の例は、SPDP、IT、イミドエステルの二機能性誘導体、例えばジメチルアジピミデートHCl、活性エステル、例えばジスクシニミジルスベレート、アルデヒド、例えばグルタルアルデヒド、ビス‐アジド化合物、例えばビス(p‐アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン、ビス‐ジアゾニウム誘導体、例えばビス‐(p‐ジアゾニウムベンゾイル)‐エチレンジアミン、ジイソシアネート、例えばトリレン2,6‐ジイソシアネートおよびビス活性フッ素化合物、例えば1,5‐ジフルオロ‐2,4‐ジニトロベンゼンである。毒素の溶解性部分は、ABMのFab断片とつながれ得る。付加的な適切な毒素は、例えば公開済み米国特許出願第2002/0128448号(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)で明示された用に、当該技術分野で既知である。
一実施形態では、本発明のキメラ糖鎖工学処理ABMは、リシンA鎖と接合される。最も有益には、リシンA鎖は脱グリコシル化され、組換え手段により産生される。リシン免疫毒素を製造するための有益な方法は、Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)に記載されている。
診断目的のためにin vitroでヒト癌細胞を殺害するために用いられる場合、接合体は典型的には少なくとも約10 nMの濃度で細胞培地に付加される。in vitro使用のための処方物および投与方法は、重要ではない。培地または還流媒質と相溶性である水性処方物が、普通は用いられ得る。細胞傷害性は、慣用的技法により読み取られて、癌の存在または程度を確定し得る。
上記のように、癌を治療するための細胞傷害性放射性医薬品は、ネズミモノクローナル抗体の同一結合特異性を実質的に有するキメラ糖鎖工学処理ABMと放射性同位体(例えばI、Y、Pr)を接合することにより製造され得る。「細胞傷害性部分」という用語は、本明細書中で用いる場合、このような同位体を含むよう意図される。
別の実施形態では、リポソームは細胞傷害性薬剤で充填され、そしてリポソームは本発明のABMで被覆される。
このような治療薬を抗体と接合するための技法は、周知である(例えばAmon et al., ”Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243 56(Alan R. Liss, Inc. 1985);Hellstrom et al., ”Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623 53 (Marcel Dekker, Inm. 1987);Thorpe, ”Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies ‘84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985);およびThorpe et al., ”The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody Toxin Conjugates”, Immunol. Rev. 62: 119 58 (1982)参照)。
本発明のABMに関するさらにその他の治療用途としては、細胞傷害性薬剤にプロドラッグを転化し得る酵素との、例えば組換えDNA技法による、接合または連結、そして腫瘍部位で細胞傷害薬にプロドラッグを転化するためにプロドラッグと組合せた抗体酵素接合体の使用が挙げられる(例えばSenter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4842-46 (1988);Senter et al., Cancer Research 49: 5789-5792 (1989);およびSenter, FASEB J. 4: 188 193 (1990)参照)。
本発明のABMに関するさらに別の治療的使用は、癌患者の骨髄から腫瘍細胞を除去するために、非接合型の、補体の存在下での、あるいは抗体薬剤または抗体毒素接合体の一部としての使用を包含する。このアプローチによれば、自己由来骨髄は、患者に注入し戻される抗体および骨髄を用いた処置によりex-vivoでパージされ得る(例えばRamsay et al., J. Clin. Immunol., 8(2): 81 88 (1988)参照)。
同様に、抗腫瘍活性を有する二次タンパク質、例えばリンフォカインまたはオンコスタチンの少なくとも機能的活性部分に連結される本発明のABMの少なくとも抗原結合領域を含む融合タンパク質は、in vivoでヒト癌腫を治療するために用いられ得る。
本発明は、標的抗原を発現する腫瘍細胞を選択的に殺害するための方法を提供する。この方法は、本発明の免疫接合体(例えば免疫毒素)を上記の腫瘍細胞と反応させることを包含する。これらの腫瘍細胞は、ヒト癌腫からであり得る。
付加的には、本発明は、in vivoで癌腫(例えばヒト癌腫)を治療する方法を提供する。この方法は、本発明の免疫接合体(例えば免疫毒素)のうちの少なくとも1つを含有する薬学的有効量の組成物を被験者に投与することを包含する。
さらなる一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原が発現される、特に上記腫瘍関連抗原が異常に発現される(例えば過剰発現される)細胞増殖障害の改良型治療方法であって、それを必要とするヒト被験者に治療的有効量の本発明のABMを投与することを包含する方法に向けられる。
同様に、本発明のABMによりその他の細胞増殖障害も治療され得る。このような細胞増殖障害の例としては、高ガンマグロブリン血症、リンパ球増殖性障害、異常タンパク質血症、紫斑病、サルコイドーシス、セザリー症候群、ワルデンストロン・マクログロブリン血症、ゴーシェ病、組織球増殖症、および任意のその他の細胞増殖疾患、ならびに新生物(上記器官系中に位置する)が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の実施に従って、被験者はヒト、ウマ、ブタ、ウシ、ネズミ、イヌ、ネコおよびトリ被験者であり得る。その他の温血動物も本発明に含まれる。
本発明はさらに、ヒト腫瘍細胞の増殖を抑制し、被験者における腫瘍を治療し、そして被験者における増殖型疾患を治療するための方法を提供する。これらの方法は、有効量の本発明のABM組成物を被験者に投与することを包含する。
したがって、本発明は、癌の治療または予防のための、あるいは前癌状態または病変の治療または予防において用いるための製剤組成物、組合せおよび方法を包含する、ということは明らかである。本発明は、ヒト悪性疾患、例えば骨髄腫、ならびに膀胱、脳、頭部および頚部、膵臓、肺、乳房、卵巣、結腸、前立腺および腎臓の癌の治療または予防に用いるための製剤組成物を包含する。例えば本発明は、癌、例えばヒト悪性疾患の治療または予防に用いるための、あるいは前癌状態または病変の治療または予防に用いるための、薬学的有効量の本発明の抗原結合分子および製薬上許容可能な担体を含む製剤組成物を包含する。癌は、例えば肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頚部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、上皮小体の癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系(CNS)の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫、例えば上記癌のいずれかの難治性バージョン、あるいは上記癌のうちの1つまたは複数の組合せであり得る。前癌性状態または病変としては、例えば口腔白斑症、光線性角化症(日光性角化症)、結腸または直腸の前癌性ポリープ、胃上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリープ性結腸癌症候群(HNPCC)、バレット食道、膀胱異形成および前癌性子宮頚部症状から成る群が挙げられる。
好ましくは上記癌は、乳癌、膀胱癌、頭部&頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌および脳癌から成る群から選択される。
「製薬上許容可能な」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的利益/危険比に相応する過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、あるいはその他の問題または合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触して用いるのに適している化合物、物質、組成物および/または剤形を指すために本明細書中で用いられる。任意の慣用的担体物質が利用され得る。担体物質は、経腸、経皮または非傾向投与に適した有機または無機のものであり得る。適切な担体としては、水、ゼラチン、アラビアゴム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、タルク、植物油、ポリアルキレン‐グリコール、石油ゼリー等が挙げられる。さらに、製剤は、その他の薬学的活性物質を含有し得る。付加的添加剤、例えば風味剤、安定剤、乳化剤、緩衝剤等が、製剤調合の容認された実施に従って付加され得る。
さらに別の実施形態では、本発明は、薬剤として用いるための、特に癌の治療または予防に用いるための、あるいは前癌状態または病変の治療または予防に用いるための本発明のABMに関する。癌は、例えば肺癌、非小細胞肺(NSCL)癌、細気管支肺胞細胞肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頚部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、胃癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、ファロピウス管の癌腫、子宮内膜の癌腫、子宮頚部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、上皮小体の癌、副腎の癌、柔組織の肉腫、尿道の癌、陰茎の癌、前立腺癌、膀胱の癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂の癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性または急性白血病、リンパ球性リンパ腫、中枢神経系(CNS)の新生物、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、未分化星状細胞腫、星状細胞腫、シュワン細胞腫、上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫、例えば上記癌のいずれかの難治性バージョン、あるいは上記癌のうちの1つまたは複数の組合せであり得る。前癌性状態または病変としては、例えば口腔白斑症、光線性角化症(日光性角化症)、結腸または直腸の前癌性ポリープ、胃上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリープ性結腸癌症候群(HNPCC)、バレット食道、膀胱異形成および前癌性子宮頚部症状から成る群が挙げられる。
好ましくは上記癌は、乳癌、膀胱癌、頭部&頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌および脳癌から成る群から選択される。
さらに別の実施形態は、癌の治療または予防のための薬剤の製造のための本発明によるABMの使用である。癌は上記と同様である。
好ましくは上記癌は、乳癌、膀胱癌、頭部&頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌および脳癌から成る群から選択される。
さらにまた好ましくは、上記抗原結合分子は、約1.0 mg/kg〜約15 mg/kgの治療的有効量で用いられる。
さらに好ましくは、上記抗原結合分子は、約1.5 mg/kg〜約12 mg/kgの治療的有効量で用いられる。
さらに好ましくは、上記抗原結合分子は、約1.5 mg/kg〜約4.5 mg/kgの治療的有効量で用いられる。
さらに好ましくは、上記抗原結合分子は、約4.5 mg/kg〜約12 mg/kgの治療的有効量で用いられる。
最も好ましくは、上記抗原結合分子は、約1.5 mg/kgの治療的有効量で用いられる。
さらにまた最も好ましくは、上記抗原結合分子は、約4.5 mg/kgの治療的有効量で用いられる。
さらにまた最も好ましくは、上記抗原結合分子は、約12mg/kgの治療的有効量で用いられる。
本発明のABM組成物は、慣用的投与方式、例えば静脈内、腹腔内、経口、リンパ内、または腫瘍への直接投与(これらに限定されない)を用いて投与され得る。静脈内投与が好ましい。
本発明の一態様では、本発明のABMを含有する治療用処方物は、凍結乾燥処方物または水性溶液の形態で、所望の純度を有する抗体を任意の製薬上許容可能な担体、賦形剤または安定剤と混合することにより(Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))、貯蔵のために調製される。許容可能な担体、賦形剤または安定剤は、用いられる投与量およびの独活でレシピエントに対して非毒性であり、例としては緩衝剤、例えばリン酸塩、クエン酸塩およびその他の有機酸;酸化防止剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン;防腐剤(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンズアルコニウムクロリド;ベンズエトニウムクロリド;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;アルキルパラベン、例えばメチルまたはプロピルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3‐ペンタノール;およびm‐クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン;親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドン;アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリシン;単糖、二糖およびその他の炭水化物、例えばグルコース、マンノースまたはデキストリン;キレート化剤、例えばEDTA;糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール;塩形成対イオン、例えばナトリウム;金属錯体(例えばZn‐タンパク質錯体);および/または非イオン性界面活性剤、例えばトゥイーンTM、プルロニックTM、またはポリエチレングリコール(PEG)が挙げられる。
本発明のABMは、異常標的抗原活性により特性化される疾患または障害、例えば腫瘍を治療するために、単独で、あるいは例えば化学療法薬を用いる療法および/または放射線療法と組合せて、被験者に投与され得る。適切な化学療法薬としては、シスプラチン、ドキソルビシン、トポテカン、パクリタキセル、ビンブラスチン、カルボプラチンおよびエトポシドが挙げられる。
さらに本発明のABMは、IVIG療法の代替物として用いられ得る。低ガンマグロブリン血症の治療のために先ず導入されたが、しかしIVIGはそれ以来、感染性および炎症性疾患の治療における広範な治療用途を有することが示されてきた(Dwyer, J.M., New England J. Med. 326: 107 (1992))。これらの調製物に見出されるポリクローナル特異性は、IVIGの生物学的作用のいくつかに関与することが実証された。例えばIVIGは、感染性作因に対する予防法として、そして壊死性皮膚炎の治療に用いられてきた(Viard, I. et al., Science 282: 490 (1998))。これらの抗原特異的作用と関係なく、IVIGは、一般的に免疫グロブリンG(IgG)Fcドメインに関与する、十分に認識された抗炎症活性を有する。免疫血小板減少症(ITP)の治療のために最初に適用されたこれらの活性(Imbach, P. et al., Lancet 1228 (1981);Blanchette, V. et al., Lancet 344: 703 (1994))は、種々の免疫媒介性炎症性障害、例えば自己免疫血球減少症、ギラン・バレ症候群、重症筋無力症、抗因子VIII自己免疫疾患、皮膚筋炎、血管炎およびブドウ膜炎の治療に拡大されてきた(van der Meche, F.G. et al., New Engl. J. Med. 326: 1123 (1992);Gajdos, P. et al., Lancet 406 (1984);Sultan, Y. et al., Lancet 765 (1984);Dalakas, M.C. et al., New Engl. J. Med. 329: 1993 (1993);Jayne, R. et al., Lancet 337: 1137 (1991);LeHoang, P. et al., Ocul. Immunol. Inflamm. 8: 49 (2000))。これらの活性、例えばFc受容体遮断、補体媒介性組織損害の減弱、イディオタイプに対する抗体による自己抗体の中和、超抗原の中和、サイトカイン産生の調整、ならびにB細胞応答の下向き調節を説明するために、種々の解釈が提出されてきた(Ballow, M., J. Allergy Clin. Immunol. 100: 151 (1997);Debre, M. et al., Lancet 342: 945 (1993);Soubrane, C. et al., Blood 81: 15 (1993);Clarkson, S.B. et al., N. Engl. J. Med. 314: 1236 (1986))。
皮下投与のために適合される凍結乾燥処方物は、WO97/04801に記載されている。このような凍結乾燥処方物は、高タンパク質濃度に対して適切な希釈剤により再構成され、そして再構成処方物は、本明細書中で治療されるべき哺乳類に皮下投与され得る。
本明細書中の処方物は、治療されている特定の適応症のために必要な場合、1つより多い活性化合物、好ましくは互いに悪作用しない補足的活性を有するものも含有し得る。例えば細胞傷害薬、化学療法薬、サイトカインまたは免疫抑制薬(例えばT細胞に作用するもの、例えばシクロスポリン、またはT細胞を結合する抗体、例えばLFA‐1を結合するもの)をさらに提供することが望ましい。このようなその他の作用物質の有効量は、処方物中に存在するアンタゴニストの量、疾患または障害あるいは治療の種類、ならびに上記のその他の因子によっている。これらは一般に、本明細書中で前記したのと同一投与量でそして投与経路で、あるいは今まで用いられた投与量の約1〜99%で用いられる。
活性成分は、例えばコアセルベーション技法により、あるいは界面重合、例えばコロイド薬剤送達系(例えばリポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル)における、またはマクロエマルションにおける、それぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチンマイクロカプセルおよびポリ‐(メチルメタクリレート)マイクロカプセルによってもエントラップされ得る。このような技法は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
徐放性製剤が調製され得る。徐放性製剤の適切な例としては、アンタゴニストを含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが挙げられるが、このマトリックスは造形品の形態、例えばフィルムまたはマイクロカプセルである。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(2‐ヒドロキシエチル‐メタクリレート)またはポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L‐グルタミン酸とγエチル‐L‐グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン‐酢酸ビニル、分解性乳酸‐グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOTTM(乳酸‐グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドから成る注射用マイクロスフェア)およびポリ‐D‐(−)‐3‐ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
in vivo投与のために用いられるべき処方物は、滅菌性でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通した濾過により容易に達成される。
本発明の組成物は種々の剤形であり、例としては溶液または懸濁液、錠剤、ピル、粉薬、座薬、高分子マイクロカプセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、ならびに注射または注入溶液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい形態は、投与方式および治療用途によっている。
本発明の組成物は、好ましくは当該技術分野で既知の慣用的製薬上許容可能な担体およびアジュバント、例えばヒト血清アルブミン、イオン交換剤、アルミナ、レシチン、緩衝剤物質、例えばリン酸塩、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、ならびに塩または電解質、例えば硫酸プロタミンも含む。
本発明の製剤組成物のための最も有効な投与方式および投与量レジメンは、疾患の重症度および経過、患者の健康状態および治療に対する応答、ならびに治療医の判断によっている。したがって組成物の投与量は、個々の患者に対して滴定されるべきである。それにもかかわらず、本発明の組成物の有効用量は一般に、約0.01〜約2000 mg/kgの範囲である。
本明細書中に記載される抗原結合分子は種々の剤形であり、例としては、液体溶液または懸濁液、錠剤、ピル、粉薬、座薬、高分子マイクロカプセルまたはマイクロベシクル、リポソーム、ならびに注射または注入溶液が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい形態は、投与方式および治療用途によっている。
本発明のABMを含む組成物は、良好な医療業務と一致する様式で処方され、服薬され、投与される。この状況での考慮因子としては、治療されている特定の疾患または障害、治療されている特定の哺乳類、個々の患者の臨床状態、疾患または疾病の原因、作用物質の送達部位、投与方法、投与スケジュール、ならびに医療従事者に既知のその他の因子が挙げられる。投与されるべきアンタゴニストの治療的有効量は、このような考慮により支配される。
一般的提案として、1回当たりの非経口投与される抗体の治療的有効量は、約0.1〜20 mg/患者の体重1 kg/日の範囲であり、用いられるアンタゴニストの典型的初期範囲は、約2〜10 mg/kgの範囲である。
好ましい一実施形態では、ABMは抗体、好ましくはヒト化抗体である。このような非接合型抗体のための適切な投与量は、例えば約20 mg/m2〜約1000 mg/m2の範囲である。例えば実質的に375 mg/m2未満のうちの1つまたは複数の用量の抗体を患者に投与し得るが、例えばこの場合、用量は約約20 mg/m2〜約250 mg/m2、例えば約50 mg/m2〜約200 mg/m2の範囲である。
さらに、1つまたは複数の初期用量(単数または複数)の抗体を、その後、1つまたは複数のその後の用量(単数または複数)を投与し得るが、この場合、その後の用量(単数または複数)における抗体の用量mg/m2は、初期用量(単数または複数)での抗体の用量mg/m2を超える。例えば初期用量は、約20 mg/m2〜約250 mg/m2の範囲(例えば約50 mg/m2〜約200 mg/m2)であり、その後の用量は250 mg/m2〜約1000 mg/m2の範囲である。
しかしながら、上記のように、ABMのこれらの示唆量は、多くの治療的自由裁量に付される。適切な用量および予定作成を選択するのに重要な因子は、上記のように、得られた結果である。例えば相対的に高い用量は、進行中のおよび急性の疾患の治療のために最初に必要であり得る。最も有効な結果を得るために、疾患または障害によって、疾患または障害の最初の徴候、診断、出現または発生にできるだけ近く、あるいは疾患または障害の寛解中、アンタゴニストが投与される。
腫瘍を治療するために用いられる本発明のABMの場合、最適治療結果は一般に、標的細胞上の当該抗原を完全に飽和するのに十分である用量で達成される。飽和を達成するために必要な用量は、腫瘍細胞当たりで発現される抗原分枝の数によっている(これは異なる腫瘍型間で有意に変わり得る)。30 nMという低い血清濃度が、他の腫瘍で最適治療効果を達成するために必要であり得る。所定の腫瘍に関して飽和を達成するために必要な用量は、ラジオイムノアッセイまたは免疫沈降法によりin vitroで容易に確定され得る。
概して、放射線との組合せ療法に関しては、適切な一治療レジメンは、100〜500 mg/m2の初回負荷用量とその後の100〜250 mg/m2での維持用量での本発明のABMの8週間毎注入、ならびに1日2.0 Gyの線量での70.0 Gyの量の放射線を包含する。化学療法との組合せ療法に関しては、適切な一治療レジメンは、3日毎に100 mg/m2の用量でのシスプラチンと組合せた100/100 mg/m2、400/250 mg/m2または500/250 mg/m2の毎週の初回負荷/維持用量を包含する。代替的には、ゲムシタビンまたはイリノテカンがシスプラチンの代わりに用いられ得る。
本発明のABMは、任意の適切な手段により、例えば非経口的、皮下、腹腔内、肺内および鼻内、そして局所免疫抑制処置のために望ましい場合は、病変内投与により投与される。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、関節内、腹腔内または皮下投与が挙げられる。さらに、アンタゴニストは、パルス注入により、例えば漸減用量のアンタゴニストを用いて、適切に投与され得る。好ましくは用量投与は、注射により、最も好ましくは、一部は投与が短期であるか長期であるかによって、静脈内または皮下注射により投与される。
他の化合物、例えば細胞傷害薬、化学療法薬、免疫抑制薬および/またはサイトカインを、本明細書中のアンタゴニストとともに投与し得る。組合せ投与は、別個の処方物または単一製剤処方物を用いる同時投与、ならびにいずれかの順序での連続投与(この場合、好ましくは両方(またはすべて)の活性作用物質が同時にそれらの生物学的活性を発揮する間に時間が存在する)を包含する。
治癒を達成するために必要とされる本発明の組成物の用量は予定最適化でさらに低減され得る、ということは明白である。
本発明の実施に従って、製剤担体は脂質担体であり得る。脂質担体は、リン脂質であり得る。さらに脂質担体は、脂肪酸であり得る。さらにまた脂質担体は、界面活性剤であり得る。本明細書中で用いる場合、界面活性剤は液体の表面張力を変える、一般的にはそれを下げる任意の物質である。
本発明の一例では、界面活性剤は非イオン性界面活性剤であり得る。非イオン性界面活性剤の例としては、ポリソルベート80(トゥイーン80またはポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートとしても既知)、Brijおよび鳥トン(例えばトリトンWR1339およびトリトンA20)が挙げられるが、これらに限定されない。
代替的には、界面活性剤は、イオン性界面活性剤であり得る。イオン性界面活性剤の一例としては、アルキルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられるが、これに限定されない。
付加的には、本発明に従って、脂質担体はリポソームであり得る。本出願で用いる場合、「リポソーム」は、本発明の任意の分枝またはその組合せを含有する任意の膜結合小胞である。
製品
本発明の別の実施形態では、上記の障害の治療のために有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器ならびに容器上のまたはそれに関連したラベルまたは包装挿入物を含む。適切な容器としては、例えば瓶、バイアル、注射器等が挙げられる。容器は、種々の物質、例えばガラスまたはプラスチックから構成される。容器は、症状を治療するために有効である組成物を保持し、そして滅菌入り口を有し得る(例えば容器は、皮下注射針により貫通可能な栓を有する静脈内溶液嚢またはバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は、本発明のABMである。ラベルまたは包装挿入物は、組成物が選択した症状、例えば非悪性疾患または障害、例えば良性過増殖性疾患または障害を治療するために用いられる、ということを示す。さらに製品は、(a)その中に含入される組成物を有する第一容器(組成物は、標的抗原を結合し、そしてその抗原を過剰発現する細胞の増殖を抑制する一次ABMを含む);ならびに(b)その中に含入される組成物を有する第二容器(組成物は、抗原を結合し、そして抗原受容体のリガンド活性化を遮断する二次抗体を含む)を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、一次および二次抗体組成物が上の定義の節におけるこのような疾患または障害の一覧からの非悪性疾患または障害を治療するために用いられ得る、ということを示す包装挿入物をさらに含む。さらに、包装挿入物は、抗体による両方と、前節に記載された補助療法(例えば化学療法薬、抗原標的化薬、抗新血管形成薬、免疫抑制薬、チロシンキナーゼ阻害薬、抗ホルモン化合物、心臓保護薬および/またはサイトカイン)のいずれかを組合せることを、組成物(標的抗原を結合し、標的抗原受容体のリガンド活性化を遮断する抗体を含む)の使用者に指示し得る。代替的または付加的には、製品は、製薬上許容可能な緩衝剤、例えば注射用の静菌性水(BWFI)、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二(または第三)容器をさらに含み得る。それはさらに、商業的および使用者見地から望ましいその他の物質、例えばその他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針および注射器を含み得る。
本発明の別の実施形態では、上記の障害の治療のために有用な物質を含有する製品が提供される。製品は、容器ならびに容器上のまたはそれに関連したラベルまたは包装挿入物を含む。適切な容器としては、例えば瓶、バイアル、注射器等が挙げられる。容器は、種々の物質、例えばガラスまたはプラスチックから構成される。容器は、症状を治療するために有効である組成物を保持し、そして滅菌入り口を有し得る(例えば容器は、皮下注射針により貫通可能な栓を有する静脈内溶液嚢またはバイアルであり得る)。組成物中の少なくとも1つの活性作用物質は、本発明のABMである。ラベルまたは包装挿入物は、組成物が選択した症状、例えば非悪性疾患または障害、例えば良性過増殖性疾患または障害を治療するために用いられる、ということを示す。さらに製品は、(a)その中に含入される組成物を有する第一容器(組成物は、標的抗原を結合し、そしてその抗原を過剰発現する細胞の増殖を抑制する一次ABMを含む);ならびに(b)その中に含入される組成物を有する第二容器(組成物は、抗原を結合し、そして抗原受容体のリガンド活性化を遮断する二次抗体を含む)を含み得る。本発明のこの実施形態における製品は、一次および二次抗体組成物が上の定義の節におけるこのような疾患または障害の一覧からの非悪性疾患または障害を治療するために用いられ得る、ということを示す包装挿入物をさらに含む。さらに、包装挿入物は、抗体による両方と、前節に記載された補助療法(例えば化学療法薬、抗原標的化薬、抗新血管形成薬、免疫抑制薬、チロシンキナーゼ阻害薬、抗ホルモン化合物、心臓保護薬および/またはサイトカイン)のいずれかを組合せることを、組成物(標的抗原を結合し、標的抗原受容体のリガンド活性化を遮断する抗体を含む)の使用者に指示し得る。代替的または付加的には、製品は、製薬上許容可能な緩衝剤、例えば注射用の静菌性水(BWFI)、リン酸塩緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液を含む第二(または第三)容器をさらに含み得る。それはさらに、商業的および使用者見地から望ましいその他の物質、例えばその他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針および注射器を含み得る。
以下の実施例は、本発明をさらに詳細に説明する。以下の調製物および実施例は、当業者により明確に理解させるために、そして本発明を実施するために提示される。しかしながら本発明は、例示的実施形態により範囲を限定されるというわけではなく、それらは単に本発明の一態様の例証に過ぎず、機能的に等価の方法は本発明の範囲内である。実際、前記の説明および添付の図面から、本明細書中に記載されたもののほかに、本発明の種々の修正が当業者に明らかになる。このような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内であるよう意図される。
この出願中で引用される特許、出願および出版物はすべて、それらの記載内容が参照により本明細書中で援用される。
実施例
別記しない限り、以下の実施例における特定のアミノ酸残基のナンバリングに対する参照は、Kabatナンバリング系によっている。別記しない限り、これらの実施例中の抗原結合分子を製造するために用いられる材料および方法は、米国特許出願第10/981,738号(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)の実施例に記載されたものに従う。
別記しない限り、以下の実施例における特定のアミノ酸残基のナンバリングに対する参照は、Kabatナンバリング系によっている。別記しない限り、これらの実施例中の抗原結合分子を製造するために用いられる材料および方法は、米国特許出願第10/981,738号(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)の実施例に記載されたものに従う。
実施例1
材料および方法
細胞株、発現ベクターおよび抗体
HEK293‐EBNA細胞は、Rene Fischer氏(ETH Zurich)のご厚意により提供されたものであった。この試験に用いた付加的細胞株は、ジャーカット細胞(ヒトリンパ芽球性T細胞、ATCC番号TIB‐152)、あるいは以前記載された(Ferrara, C. et al., Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006))のと同様に作製したFcγRIIIa[Val‐158]‐ならびにFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]‐発現ジャーカット細胞株であった。供給元の使用説明書に従って、細胞を培養した。shFcγRIIIa[Val‐158]およびshFcγRIIIa[Phe‐158]をコードするDNAをPCRにより生成し(Ferrara, C. et al., J. Biol. Chem. 281(8): 5032-5036 (2006))、そしてヘキサヒスチジンタグと融合して、残基191(NH2‐MRTEDL・・・GYQG(H6)‐COOH、ナンバリングは成熟タンパク質を基礎にする)後に成熟タンパク質末端を生じた(Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604 (2001)に記載)。shFcγRIIIa[Val‐158]のAsn‐162を、PCRによりGlnと交換した。発現ベクターはすべて、HEK293‐EBNA細胞中での発現のために、エプスタイン・バーウイルスからの複製の基点OriPを含有した。GEおよびネイティブ抗CD20抗体をHEK‐293 EBNA細胞中で産生し、そして標準方法により特性化した。抗体に関する中性オリゴ糖プロフィールを、陽イオン方式(Papac, D.I. et al., Glycobiol. 8(5): 445-454 (1998))で、質量分析により分析した(Autoflex, Bruker Daltonics GmbH, Faellanden/Switzerland)。
材料および方法
細胞株、発現ベクターおよび抗体
HEK293‐EBNA細胞は、Rene Fischer氏(ETH Zurich)のご厚意により提供されたものであった。この試験に用いた付加的細胞株は、ジャーカット細胞(ヒトリンパ芽球性T細胞、ATCC番号TIB‐152)、あるいは以前記載された(Ferrara, C. et al., Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006))のと同様に作製したFcγRIIIa[Val‐158]‐ならびにFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]‐発現ジャーカット細胞株であった。供給元の使用説明書に従って、細胞を培養した。shFcγRIIIa[Val‐158]およびshFcγRIIIa[Phe‐158]をコードするDNAをPCRにより生成し(Ferrara, C. et al., J. Biol. Chem. 281(8): 5032-5036 (2006))、そしてヘキサヒスチジンタグと融合して、残基191(NH2‐MRTEDL・・・GYQG(H6)‐COOH、ナンバリングは成熟タンパク質を基礎にする)後に成熟タンパク質末端を生じた(Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604 (2001)に記載)。shFcγRIIIa[Val‐158]のAsn‐162を、PCRによりGlnと交換した。発現ベクターはすべて、HEK293‐EBNA細胞中での発現のために、エプスタイン・バーウイルスからの複製の基点OriPを含有した。GEおよびネイティブ抗CD20抗体をHEK‐293 EBNA細胞中で産生し、そして標準方法により特性化した。抗体に関する中性オリゴ糖プロフィールを、陽イオン方式(Papac, D.I. et al., Glycobiol. 8(5): 445-454 (1998))で、質量分析により分析した(Autoflex, Bruker Daltonics GmbH, Faellanden/Switzerland)。
組換えshFcγRIIIa受容体の産生および精製
shFcγRIIIa変異体を、HEK‐293‐EBNA細胞中での一過性発現により産生し(Jordan, M. et al., Nucl. Acids. Res. 24: 596-601 (1996))、そしてHiTraPキレート化HP(Amersham Biosciences, Otelfingen/Switzerland)ならびにHSP‐EB緩衝液(0.01 M HEPES、pH7.4、 0.15 M NaCl、3 mMEDTA、0.005%トゥイーン20)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを用いて、ヘキサヒスチジンタグを利用することにより精製した。ヒトsFcγRIIbおよびマウス(m)sFcγRIIbを上記のように産生し、精製した(Sondermann, P. & Jacob., U., Biol. Chem. 380(6): 717-721 (1999))。すべての使用タンパク質の濃度を、記載されたとおりに確定した(Gill, S.C. & von Hippel, P.H., Anal. Biochem. 182(2): 319-326 (1989))。
shFcγRIIIa変異体を、HEK‐293‐EBNA細胞中での一過性発現により産生し(Jordan, M. et al., Nucl. Acids. Res. 24: 596-601 (1996))、そしてHiTraPキレート化HP(Amersham Biosciences, Otelfingen/Switzerland)ならびにHSP‐EB緩衝液(0.01 M HEPES、pH7.4、 0.15 M NaCl、3 mMEDTA、0.005%トゥイーン20)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを用いて、ヘキサヒスチジンタグを利用することにより精製した。ヒトsFcγRIIbおよびマウス(m)sFcγRIIbを上記のように産生し、精製した(Sondermann, P. & Jacob., U., Biol. Chem. 380(6): 717-721 (1999))。すべての使用タンパク質の濃度を、記載されたとおりに確定した(Gill, S.C. & von Hippel, P.H., Anal. Biochem. 182(2): 319-326 (1989))。
表面プラズモン共鳴(SPR)
実行緩衝液としてHBS‐EPを用いてBiacore3000(Biacore, Freiburg/Germany)で、SPR実験を実施した。標準アミンカップリングキット(Biacore, Freiburg/Germany)を用いてCM5チップで、ヒトIgG糖鎖変異体の約1,000共鳴単位(RU)の直接カップリングを実施した。異なる濃度の可溶性FcγRを、10 μl/分の流量で、フローセルに通した。BSA結合表面上の流動に関して得られた応答を差し引くことにより、大きな屈折率差を補正した。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線のあてはめにより、解離定数KDを得た。BIA評価プログラム曲線のあてはめ設備(v3.0, Biacore, Freiburg/Germany)を用いて速度定数を得て、数値積分により、1:1ラングミュア結合に関する速度方程式を適合した。
実行緩衝液としてHBS‐EPを用いてBiacore3000(Biacore, Freiburg/Germany)で、SPR実験を実施した。標準アミンカップリングキット(Biacore, Freiburg/Germany)を用いてCM5チップで、ヒトIgG糖鎖変異体の約1,000共鳴単位(RU)の直接カップリングを実施した。異なる濃度の可溶性FcγRを、10 μl/分の流量で、フローセルに通した。BSA結合表面上の流動に関して得られた応答を差し引くことにより、大きな屈折率差を補正した。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線のあてはめにより、解離定数KDを得た。BIA評価プログラム曲線のあてはめ設備(v3.0, Biacore, Freiburg/Germany)を用いて速度定数を得て、数値積分により、1:1ラングミュア結合に関する速度方程式を適合した。
IgGとFcγRIIIa発現細胞との結合
以前記載されたのと同様に(Ferrara, C. et al., Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006))、実験を実行した。要するに、hFcγRIIIa発現ジャーカット細胞を、PBS、0.1%BSA中でIgG変異体とともにインキュベートした。PBS、0.1%BSAで1または2回洗浄後、1:200FITC接合F(ab‘)2ヤギ抗ヒト、F(ab’)2特異的IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA/USA)とともにインキュベートすることにより、抗体結合を検出した(Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604 (2001))。結合抗体変異体を指示する蛍光強度を、FACS Calibur(BD Biosciences, Allschwil/Switzerland)で確定した。
以前記載されたのと同様に(Ferrara, C. et al., Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006))、実験を実行した。要するに、hFcγRIIIa発現ジャーカット細胞を、PBS、0.1%BSA中でIgG変異体とともにインキュベートした。PBS、0.1%BSAで1または2回洗浄後、1:200FITC接合F(ab‘)2ヤギ抗ヒト、F(ab’)2特異的IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA/USA)とともにインキュベートすることにより、抗体結合を検出した(Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 276(9): 6591-6604 (2001))。結合抗体変異体を指示する蛍光強度を、FACS Calibur(BD Biosciences, Allschwil/Switzerland)で確定した。
モデリング
ネイティブIgG(PDBコード le4k)由来のFc断片との複合体中のFcγRIIIの結晶構造に基づいて、モデリングを実施した。この目的のために、FcのAsn‐297に結合した炭水化物部分の座標を二重にして、そしてグリカンのうちの1つは、Fc Asn‐297オリゴ糖のFUC残基が存在する位置に向いている五糖コアを有するFcγRIIIのAsn‐162に剛体として手動で調整した。モデルはエネルギー最小化されず、提案された結合方式を可視化するために作製されたに過ぎない。
ネイティブIgG(PDBコード le4k)由来のFc断片との複合体中のFcγRIIIの結晶構造に基づいて、モデリングを実施した。この目的のために、FcのAsn‐297に結合した炭水化物部分の座標を二重にして、そしてグリカンのうちの1つは、Fc Asn‐297オリゴ糖のFUC残基が存在する位置に向いている五糖コアを有するFcγRIIIのAsn‐162に剛体として手動で調整した。モデルはエネルギー最小化されず、提案された結合方式を可視化するために作製されたに過ぎない。
結果
可溶性FcγRIIIa受容体および抗体糖鎖変異体の生化学的特性化
shFcγRIIIa[Val‐158]、shFcγRIIIa[Phe‐158]およびshFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]をHEK293‐EBNA細胞中で発現指せて、均質に精製した。精製shFcγRIIIa‐[Val‐158]および‐[Phe‐158]は、漸減SDS‐PAGEに付した場合、広い帯域として移動し、突然変異体shFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]に関するよりわずかに低い40〜50 kDaの見かけの分子量を有した(データは示されていない)。これは、Asn‐162に連結された炭水化物の排除により説明され得る。酵素的N‐脱グリコシル化時に、3つの受容体変異体はすべて、25〜30 kDaの見かけの分子量範囲で同一に移動し、そして膜結合hFcγRIIIに関して前に観察されたように3つの帯域を特徴づける(Edberg, J.C. & Kimberly, R.P., J. Immunol. 158(8): 3849-3857 (1997);Ravetch, J.V. & Perussia, B., J. Exp. Med. 170(2): 481-497 (1989))。この不均質パターンは、O結合型炭水化物の存在に起因し得る。
可溶性FcγRIIIa受容体および抗体糖鎖変異体の生化学的特性化
shFcγRIIIa[Val‐158]、shFcγRIIIa[Phe‐158]およびshFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]をHEK293‐EBNA細胞中で発現指せて、均質に精製した。精製shFcγRIIIa‐[Val‐158]および‐[Phe‐158]は、漸減SDS‐PAGEに付した場合、広い帯域として移動し、突然変異体shFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]に関するよりわずかに低い40〜50 kDaの見かけの分子量を有した(データは示されていない)。これは、Asn‐162に連結された炭水化物の排除により説明され得る。酵素的N‐脱グリコシル化時に、3つの受容体変異体はすべて、25〜30 kDaの見かけの分子量範囲で同一に移動し、そして膜結合hFcγRIIIに関して前に観察されたように3つの帯域を特徴づける(Edberg, J.C. & Kimberly, R.P., J. Immunol. 158(8): 3849-3857 (1997);Ravetch, J.V. & Perussia, B., J. Exp. Med. 170(2): 481-497 (1989))。この不均質パターンは、O結合型炭水化物の存在に起因し得る。
末端ガラクトース含量に関して異種であるバイアンテナ型フコシル化複合体オリゴ糖(図1b、c)により特性化される。コアのβ‐マンノースへの分枝GlcNAc(図1a)の付加を触媒する酵素であるN‐アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnT‐III)を過剰発現する細胞株中で、GE抗体を産生した。2つの異なるGE抗体変異体を生成し、Glyco‐1をGnT‐III単独の過剰発現により産生し、そしてGlyco‐2をGnT‐IIIおよび組換えMan‐IIの同時発現により産生した(Ferrara, C. et al., Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006)、図1b)。Glyco‐1およびGlyco‐2は、高比率の分枝非フコシル化オリゴ糖(それぞれ88%ハイブリッド型および90%複合型、図1c)により特性化される。両形態は、ネイティブ抗体に比して、FcγRIIIaに対する親和力の類似の増大を、そしてADCC増大を示すが、しかしCDC検定におけるそれらの反応性は異なる、ということをわれわれは以前示した(Ferrara, C. et al., Biotechnol. Bioeng. 93(5): 851-861 (2006))。IgG‐オリゴ糖修飾は、shFcγRIIIaに対する親和力増大を有する抗体をもたらす。
抗体糖鎖変異体と、shFcγRIIIa変異体([Val‐158]、[Phe‐158]および[Val‐158/Gln‐162])、shFcγRIIbおよびsmFcγRIIbとの相互作用を、SPRにより分析した。shFcγRIIIa[Val‐158]とGE抗体との結合は、ネイティブ抗体との結合より50倍まで強力であった(KD(Glyco-2)0.015 μM対KD(ネイティブ)0.75 μM、表6)。「低親和性」多型形態の受容体shFcγRIIIa[Phe‐158]も、ネイティブ抗体より有意に高い親和力でGE抗体と結合した(KD(Glyco-1)0.27 μM(18倍)、KD(Glyco-2)0.18 μM(27倍)、KD(ネイティブ)5 μM、表6)、ということは重要である。ネイティブIgGからの両受容体変異体の解離は、速過ぎて、これらの相互作用に関する速度定数の直接確定ができなかった。受容体とネイティブAbとの結合に関する速度パラメーターを得ることはできなかったが、しかし実験データのオーバーレイは、抗体の糖鎖工学処理の主な作用は受容体の解離低減である、ということを明らかに示す(図2a)。ネイティブIgGからの解離速度を概算するために、実験データを、異なる解離速度定数をシミュレートする曲線にオーバーレイした(示されていない)。これは、糖鎖工学処理時の親和力における全増大がkオフ低減により説明され得る、ということを示した。GE抗体に関するshFcγRIIIaの2つの多型形態の解離速度定数(kオン)は類似したが、しかしsFcγRIIIa[Phe‐158]の解離速度は有意に速く、この受容体の低親和力をおおむね説明する(表6)。
ヒトおよびネズミFcγRIIbに対する抗体の親和力も測定した。GEおよびネイティブIgGはともに、KD=1.55〜2.40μMの範囲の類似の親和力でヒト抑制性受容体shFcγRIIbを結合した(表6)。この受容体のネズミバージョンに関しては、ヒトIgG1に対する親和力は糖鎖工学処理によっても変更されなかったが、しかし意外にも、ヒトFcγRIIb受容体の3.4〜5.5倍であった(表6)。ネイティブ抗体とsh/mFcγRIIbとの相互作用に関する解離定数(KD)は、動力学的評価に関して平衡があまりにも早く到達された(図2a)ため、定常状態分析によって確定され得ただけであった(表6)。
FcγRIIIa‐グリコシル化は抗体糖鎖変異体との結合を調節する
Asn162でグリコシル化されないhFcγRIIIaの突然変異体形態(shFcガンマRIIIa[Val‐158/Gln‐162])を用いて、受容体中のこの位置でのオリゴ糖とIgGとの間の潜在的炭水化物媒介性相互作用の影響を分析した。興味深いことに、Asn162の除去時に、ネイティブIgGは、受容体に対する親和力の閾値増大(KD=0.24μM対0.75μM)を示したが、一方、GE抗体は13倍を上回る親和力低減を示した(表6)。GE抗体との結合に関しては、受容体グリコシル化部位の除去はkオンにおけるほぼ2倍の増大を生じたが、しかしkオフは14倍以上増大した(表6)。定常状態および動態的測定KDは、shFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]の結合に関して1.6〜2.2倍異なった。この不一致はほぼ間違いなく、観察された非常に早い解離を適合するに際しての高誤差に起因するものと思われる。
Asn162でグリコシル化されないhFcγRIIIaの突然変異体形態(shFcガンマRIIIa[Val‐158/Gln‐162])を用いて、受容体中のこの位置でのオリゴ糖とIgGとの間の潜在的炭水化物媒介性相互作用の影響を分析した。興味深いことに、Asn162の除去時に、ネイティブIgGは、受容体に対する親和力の閾値増大(KD=0.24μM対0.75μM)を示したが、一方、GE抗体は13倍を上回る親和力低減を示した(表6)。GE抗体との結合に関しては、受容体グリコシル化部位の除去はkオンにおけるほぼ2倍の増大を生じたが、しかしkオフは14倍以上増大した(表6)。定常状態および動態的測定KDは、shFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]の結合に関して1.6〜2.2倍異なった。この不一致はほぼ間違いなく、観察された非常に早い解離を適合するに際しての高誤差に起因するものと思われる。
FcγRIIIaを発現するジャーカット細胞を用いた細胞系で、SPRベースの結果を確証した。ジャーカット細胞(ヒトT細胞株)は、FcγRIIIa発現に関する天然環境を表わす(Edberg, J.C. & Kimberly, R.P., J. Immunol. 158(8): 3849-3857 (1997))。FcγRIIIa[Val‐158]およびFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]間を区別しない抗FcγRIIImAb 3G8(Drescher, B. et al., Immunology 110(3): 335-340 (2003))を用いて、これらの細胞株中でのFcγRIII発現をモニタリングした。この実験では、GE抗体は、ネイティブ抗体より良好にFcγRIIIa[Val‐158]を結合した(図3)。しかしながらFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]との結合は、ネイティブIgGを含めてすべてのIgG変異体に関してほとんど検出可能でなかった(図3c)。3つのIgG変異体すべてとのFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]の結合に関するSPR実験で見出された非常に速い解離速度定数は、細胞検定におけるこの極わずかな結合を説明し得た。
考察
FcγIIIa/IgG相互作用の動力学分析
われわれの測定KDは全体的に、Okazaki等が以前に発表したものと一致する(Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336(5): 1239-1249 (2004))。非フコシル化(GE)抗体の親和力増大はkオンの増大により主に引き起こされると、これらの著者等は結論づけた。これに対比して、反応が高速であるために、ネイティブIgGとの結合に関するkオンおよびkオフをわれわれは定量し得なかったが、しかしGE抗体を含むものと比較した場合のこれらの結合事象の定性分析は、ネイティブIgGからの受容体変異体の有意に速い解離を明らかに示す(図2a)。したがって、結合パートナー間の新規の相互作用が形成され、あるは現行のものが改善される、と結論づけ得る。
FcγIIIa/IgG相互作用の動力学分析
われわれの測定KDは全体的に、Okazaki等が以前に発表したものと一致する(Okazaki, A. et al., J. Mol. Biol. 336(5): 1239-1249 (2004))。非フコシル化(GE)抗体の親和力増大はkオンの増大により主に引き起こされると、これらの著者等は結論づけた。これに対比して、反応が高速であるために、ネイティブIgGとの結合に関するkオンおよびkオフをわれわれは定量し得なかったが、しかしGE抗体を含むものと比較した場合のこれらの結合事象の定性分析は、ネイティブIgGからの受容体変異体の有意に速い解離を明らかに示す(図2a)。したがって、結合パートナー間の新規の相互作用が形成され、あるは現行のものが改善される、と結論づけ得る。
Asn162でのFcγRIIIaのグリコシル化は抗体との結合を調節する
哺乳類起源のFcγRIIIaは、5つのN結合型グリコシル化部位を有する高度グリコシル化タンパク質である。FcγRIII/IgG1‐Fc複合体の結晶構造(Sondermann, P. et al., Nature 406: 267-273 (2003))(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)から仮説を立てた場合、Asn162でのグリコシル化の排除は、おそらくはFcとのhFcγRIIIa[Asn162]炭水化物の立体衝突の排除により、ネイティブIgG1に対する親和力増強を生じる(Drescher, B. et al., Immunology 110(3): 335-340 (2003))。他の4つのN‐グリコシル化部位での炭水化物の除去は、ネイティブIgGに対する親和力に作用しない(Drescher, B. et al., Immunology 110(3): 335-340 (2003))。
哺乳類起源のFcγRIIIaは、5つのN結合型グリコシル化部位を有する高度グリコシル化タンパク質である。FcγRIII/IgG1‐Fc複合体の結晶構造(Sondermann, P. et al., Nature 406: 267-273 (2003))(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)から仮説を立てた場合、Asn162でのグリコシル化の排除は、おそらくはFcとのhFcγRIIIa[Asn162]炭水化物の立体衝突の排除により、ネイティブIgG1に対する親和力増強を生じる(Drescher, B. et al., Immunology 110(3): 335-340 (2003))。他の4つのN‐グリコシル化部位での炭水化物の除去は、ネイティブIgGに対する親和力に作用しない(Drescher, B. et al., Immunology 110(3): 335-340 (2003))。
位置162でグリコシル化されない高親和力受容体の突然変異体バージョン(shFcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162])を構築して、それらの相互作用にとってのIgGおよびFcγRIIIaのグリコシル化の重要性をさらに調べた。予測どおり、ネイティブ抗体およびAsn162‐グリコシル化欠失FcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]間の相互作用に関して親和力の増大を見出した(3倍、表6)。しかしながらGE抗体は、ネイティブ、グリコシル化受容体shFcγRIIIa[Val‐158]とよりも突然変異体受容体と10倍以上弱く結合した(表6)が、これは、hFcγRIIIaのAsn162に結合したオリゴ糖がIgG1とこのFc受容体との間の相互作用の方を選ぶ、ということを示す。このデータは、GE抗体が、FcγRIIIa[Val‐158/Gln‐162]発現細胞とよりもFcγRIIIa[Val‐158]発現細胞と有意に良好に結合した細胞検定系で確証された(図3c)。別の実験組では、フコース含量のかなりの低減を示しそして分枝GlcNAcを欠く(Fuc −)抗体(Y0骨髄腫細胞中での発現により生成される)(Lifely, M.R. et al., Glycobiol. 5(8): 813-822 (1995))の結合行動は、GE抗体のものと非常によく似ている(即ち、脱グリコシル化受容体に対する親和力はネイティブ受容体に対するよりも低い)、ということを本発明人等は実証した。したがってGEおよびFuc−抗体中のフコース残基の非存在は、これらの抗体に対するグリコシル化形態の受容体の親和力増強に主に関与すると思われる(例えばShinkawa, T. et al., J. Biol. Chem. 278(5): 3466-73 (2003);Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 277(30): 26733-26740 (2002)参照)。
要するに、GE抗体とFcγRIIIaとの相互作用改善は、両結合パートナーの炭水化物部分により調整される。IgG‐Fc断片の結晶構造から、炭水化物とタンパク質との相互作用は、疎水性の、好ましくは芳香族残基により主に安定化される、ということが既知である(Huber, R. et al., Nature 264(5585): 415-420 (1976))。特にわれわれの結果と関連するのは、FcのTyr296とFcのフコースとの間の強い接触である。GE抗体はこのフコースを含有せず、そしてFcγRIIIaとの複合体形成時に、Asn162に結合された受容体炭水化物はGE Fcとの密接な好ましい接触を形成し、それによりこの相互作用の高親和力を説明する、とわれわれは仮定する。
提案された相互作用のモデルは、FcγRIIIaのAsn162に連結されたオリゴ糖の五糖コアの3つのマンノース残基がIgG Fc Tyr296に到達する(図4)、ということを実証する。このような結合方式は、FcγRIIIa炭水化物とFcのTyr‐296との相互作用を選択し、これも、IgGのタンパク質部分との炭水化物の非常に密接な接触を伴う。このモデルを用いて、FcγRIII炭水化物との接触をさらに強化するFc表面のアミノ酸置換を同定し得る。近年の研究において、Okazaki等は、FcのTyr‐296とFcγRIIIaのLys‐128との間の新規に形成された結合の結果として、非フコシル化抗体がFcγRIIIaを結合する、ということを示唆した(Huber, R. et al., Nature 264(5585): 415-420 (1976))。しかしながら、非フコシル化抗体の親和力増大が受容体のグリコシル化によっている、ということがここで判明した。受容体グリコシル化のこのような作用は、Fc‐Tyr296/Lys128‐FcγRIIIa結合がGE抗体およびFcγRIIIa間の親和力にとって重要でない、ということを示す。
FcγRIII aおよびb形態は、IgGとの結合領域内のN‐グリコシル化部位を保有するヒトFcγRの唯一の形態である。したがって、IgGに対する親和力はこれら2つのFcガンマRに関してのみ、受容体グリコシル化により影響される、とわれわれは結論づけた。他の種からのFcγRIIIのアミノ酸配列の比較は、N‐グリコシル化部位Asn162が、マカク属サル、ネコ、ウシおよびブタからのFcγRIIIにより共有されるが、一方、それは既知のラットおよびマウスFcγRIIIでは欠けている、ということを示す。近年、ヒトFcγRIIIと高相同性を有し、そしてAsn162グリコシル化部位を含有するタンパク質をコードするマウスおよびラット遺伝子が同定された(それぞれCD16‐2およびタンパク質データバンク番号NP_997486)(Huber, R. et al., Nature 264(5585): 415-420 (1976))が、しかしタンパク質の機能性発現は依然として実証されていない。
Asn162‐FcγRIIIaグリコシル化部位の存在は、示差的FcγRIIIグリコシル化により(Edberg, J.C. & Kimberly, R.P., J. Immunol. 158(8): 3849-3857 (1997))、またはIgGのフコース含量の調整により、FcγRIIIに対する親和力を免疫系に調整させると思われる。
活性化および抑制性FcγR間の免疫学的平衡
活性化および抑制性シグナル間の比率の改善は治療用抗体の効能を増強する、ということが提案されている(Clynes, R.A. et al., Nat. Med. 6(4): 443-446 (2000);Stefanescu, R.N. et al., J. Clin. Immunol. 24(4): 315-326 (July 2004))。近年の研究では、抑制性shFcγRIIb受容体はネイティブおよびGE抗体に対して同様の親和力を有することが判明したが、一方、両活性化受容体変異体はネイティブ抗体より高い親和力でGE抗体と結合した(表6)。これは、GE交代のオリゴ糖修飾が専ら活性化受容体に対する親和力を増大することを示し、そしてこれらのGE抗体が治療効能増強を示すことを示す。
活性化および抑制性シグナル間の比率の改善は治療用抗体の効能を増強する、ということが提案されている(Clynes, R.A. et al., Nat. Med. 6(4): 443-446 (2000);Stefanescu, R.N. et al., J. Clin. Immunol. 24(4): 315-326 (July 2004))。近年の研究では、抑制性shFcγRIIb受容体はネイティブおよびGE抗体に対して同様の親和力を有することが判明したが、一方、両活性化受容体変異体はネイティブ抗体より高い親和力でGE抗体と結合した(表6)。これは、GE交代のオリゴ糖修飾が専ら活性化受容体に対する親和力を増大することを示し、そしてこれらのGE抗体が治療効能増強を示すことを示す。
マウスおよびヒトからの抑制性受容体sFcγRIIbは、Asn162でグリコシルかされない。これらの両受容体により表示されるGE抗体に関する区別の欠如は、非フコシル化IgGとの結合増大に不可欠であるAsn162でのFcγRのグリコシル化と一致する。
ネズミFcγRIIが抗体に対してヒトFcγRIIbより有意に高い親和力を有するという知見は、マウスモデルを用いるin vivo実験の正しい解釈のために重要であり得る。マウスモデルにおける抑制性受容体との結合増強は、ヒトの場合とは異なる免疫応答閾値を生じ得る。
結論
これらの研究は、それらの相互作用に関するFcγRIIIaおよびIgGの両方の炭水化物部分の重要性を実証する。データは複合体形成へのさらなる洞察を提供し、そして分子レベルでのFcγRIIIaのグリカンと非フコシル化IgG糖形態のFcとの間の重要な異なる相互作用を同定する。この知見は、FcγRIIIaの炭水化物との更なる創造的相互作用を作り上げる新規の抗体変異体の設計のための基礎を提供し、これは、モノクローナル抗体を用いた治療に関する重要な含意を有する。
これらの研究は、それらの相互作用に関するFcγRIIIaおよびIgGの両方の炭水化物部分の重要性を実証する。データは複合体形成へのさらなる洞察を提供し、そして分子レベルでのFcγRIIIaのグリカンと非フコシル化IgG糖形態のFcとの間の重要な異なる相互作用を同定する。この知見は、FcγRIIIaの炭水化物との更なる創造的相互作用を作り上げる新規の抗体変異体の設計のための基礎を提供し、これは、モノクローナル抗体を用いた治療に関する重要な含意を有する。
実施例2
抗体突然変異体の生成
標準分子生物学的方法(例えば突然変異誘発性PCR、Dulau L., et al., Nucleic Acids Res. 11; 17(7): 2873 (1989)参照)を用いて、CD20またはEGFRに対する特異性を有する鋳型としてヒト化IgG1を用いて、抗体突然変異体を生成した。DNAをコードするその結果生じた抗体突然変異をその後、プラスミドを含有するOriP中にクローン化して、前に記載されたように(Jordan, M., et al., Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996))、HEK293‐EBNA細胞(Invitrogen, Switzerland)の一過性トランスフェクションのために用いた。それぞれ4:1の比で抗体およびキメラGnT‐IIIをコードする2つのプラスミドを用いた細胞の同時トランスフェクトにより糖鎖工学処理抗体を産生したが、一方、非修飾抗体に関しては炭水化物修飾酵素をコードするプラスミドを省いた。トランスフェクションの5日後に、上清を収穫した。実験のいくつかに関しては、記載されたような2つの連続クロマトグラフィーステップ(Umana, P., et al., Nat. Biotechnol. 17, 176-180 (1999))と、その後のサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、上清から抗体を精製した。単量体抗体を含有するピーク分画をプールし、濃縮した。
抗体突然変異体の生成
標準分子生物学的方法(例えば突然変異誘発性PCR、Dulau L., et al., Nucleic Acids Res. 11; 17(7): 2873 (1989)参照)を用いて、CD20またはEGFRに対する特異性を有する鋳型としてヒト化IgG1を用いて、抗体突然変異体を生成した。DNAをコードするその結果生じた抗体突然変異をその後、プラスミドを含有するOriP中にクローン化して、前に記載されたように(Jordan, M., et al., Nucleic Acids Res. 24, 596-601 (1996))、HEK293‐EBNA細胞(Invitrogen, Switzerland)の一過性トランスフェクションのために用いた。それぞれ4:1の比で抗体およびキメラGnT‐IIIをコードする2つのプラスミドを用いた細胞の同時トランスフェクトにより糖鎖工学処理抗体を産生したが、一方、非修飾抗体に関しては炭水化物修飾酵素をコードするプラスミドを省いた。トランスフェクションの5日後に、上清を収穫した。実験のいくつかに関しては、記載されたような2つの連続クロマトグラフィーステップ(Umana, P., et al., Nat. Biotechnol. 17, 176-180 (1999))と、その後のサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、上清から抗体を精製した。単量体抗体を含有するピーク分画をプールし、濃縮した。
培養上清中の抗体の定量
トランスフェクト化EBNA細胞の上清中に存在する抗体の直接定量を、プロテインAクロマトグラフィーを用いて実施した。その目的のために、100 μlの上清を、樹脂に固定されたプロテインAを充填したカラムに適用した。洗浄ステップによる非結合タンパク質の除去後、pH3の緩衝液を用いて結合抗体を溶離した。溶離抗体により引き起こされる280 nmの波長での吸光度を積分し、既知の濃度の抗体標準と組合せて、その定量のために用いた。
トランスフェクト化EBNA細胞の上清中に存在する抗体の直接定量を、プロテインAクロマトグラフィーを用いて実施した。その目的のために、100 μlの上清を、樹脂に固定されたプロテインAを充填したカラムに適用した。洗浄ステップによる非結合タンパク質の除去後、pH3の緩衝液を用いて結合抗体を溶離した。溶離抗体により引き起こされる280 nmの波長での吸光度を積分し、既知の濃度の抗体標準と組合せて、その定量のために用いた。
炭水化物分析
抗体または精製抗体を含有するHPLC分画を2 mMトリス、pH7.0に緩衝液交換して、20 μlに濃縮した。37℃で3時間、2 mMトリス、pH7中の0.05 mU/μgタンパク質でのN‐グリコシダーゼ消化(PNGアーゼF、EC 3.5.1.52, QA-Bio, San Mateo, CA, USA)により、抗体からオリゴ糖を酵素的に放出させた。その後、0.8 mU/μgタンパク質でエンドグリコシダーゼH(EndoH、EC 3.2.1.96, Roche, Basel/Switzerland)で、PNGアーゼF処理試料を消化して、複合体およびハイブリッド炭水化物間を区別し、37℃で3時間インキュベートした。放出オリゴ糖を150 mM酢酸に調整した後、記載(Papac, D.I., Briggs, J.B., Chin, E.T., and Jones, A.J. (1998) Glycobiology 8, 445-454)されたように、マイクロ‐バイオ‐スピンクロマトグラフィーカラム(BioRad, Reinach/Switzerland)中に詰め込まれた陽イオン交換樹脂(AG50W‐X8樹脂、水素形態、100〜200メッシュ、BioRad, Reinach/Switzerland)を通して精製した。
抗体または精製抗体を含有するHPLC分画を2 mMトリス、pH7.0に緩衝液交換して、20 μlに濃縮した。37℃で3時間、2 mMトリス、pH7中の0.05 mU/μgタンパク質でのN‐グリコシダーゼ消化(PNGアーゼF、EC 3.5.1.52, QA-Bio, San Mateo, CA, USA)により、抗体からオリゴ糖を酵素的に放出させた。その後、0.8 mU/μgタンパク質でエンドグリコシダーゼH(EndoH、EC 3.2.1.96, Roche, Basel/Switzerland)で、PNGアーゼF処理試料を消化して、複合体およびハイブリッド炭水化物間を区別し、37℃で3時間インキュベートした。放出オリゴ糖を150 mM酢酸に調整した後、記載(Papac, D.I., Briggs, J.B., Chin, E.T., and Jones, A.J. (1998) Glycobiology 8, 445-454)されたように、マイクロ‐バイオ‐スピンクロマトグラフィーカラム(BioRad, Reinach/Switzerland)中に詰め込まれた陽イオン交換樹脂(AG50W‐X8樹脂、水素形態、100〜200メッシュ、BioRad, Reinach/Switzerland)を通して精製した。
1 μlの試料をエッペンドルフ管中で1 μlの新たに調製したマトリックス(4 mgの2,5‐ジヒドロキシ安息香酸および0.2 mgの5‐メトキシサリチル酸を1 mlのエタノール/10 mM塩化ナトリウム水溶液1:1(v/v)中に溶解することにより調製)と混合した。次に1 μlのこの混合物を標的プレートに移した。試料を乾燥させた後、陽イオン方式で操作するAutoflexMALDI/TOF(Bruker Daltonics, Faellanden/Switzerland)を用いて測定した。
FcγRIIIa結合検定
ジャーカット(DSMZ番号 ACC‐282)またはCHO細胞(ECACC番号 94060607)を、γ鎖と組合せたhFcγRIIIaをコードするプラスミドでトランスフェクトし、既知の濃度のIg突然変異体とともにPBSおよび0.1%BSA中で4℃で30分間インキュベートした。数回洗浄後、1:200のFITC接合F(ab‘)2ヤギ抗ヒトF(ab’)2特異的IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)とともに4℃で30分間のインキュベーションにより、抗体結合を検出した。結合抗体変異体に対応する10000細胞の蛍光強度を、FACS Calibur(BD Biosciences, Allschwil, Switzerland)で確定した。
ジャーカット(DSMZ番号 ACC‐282)またはCHO細胞(ECACC番号 94060607)を、γ鎖と組合せたhFcγRIIIaをコードするプラスミドでトランスフェクトし、既知の濃度のIg突然変異体とともにPBSおよび0.1%BSA中で4℃で30分間インキュベートした。数回洗浄後、1:200のFITC接合F(ab‘)2ヤギ抗ヒトF(ab’)2特異的IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)とともに4℃で30分間のインキュベーションにより、抗体結合を検出した。結合抗体変異体に対応する10000細胞の蛍光強度を、FACS Calibur(BD Biosciences, Allschwil, Switzerland)で確定した。
同様にして、この残基をグルタミンに交換することにより位置Asn162でグリコシル化されないhFcγRIIIaを発現する細胞株(FcγRIIIa‐Q162)を生成した。この細胞株を用いて、上記のように結合検定を実施した。
これらの方法を用いて、非フコシル化を非修飾(フコシル化)突然変異体抗体と比較した場合に、hFcγRIIIaとの結合増大を示すIgG突然変異体を検出し得る。さらにこのような同定IgG突然変異体は、好ましくはFcγRIIIaに対する親和力増大を示すがしかし非グリコシル化FcγRIIIa‐Q162に対してはそれを示さない。
FcγRIIb結合検定
CHO細胞(ECACC番号94060607)をhFcγRIIbをコードするプラスミドでトランスフェクトして、その表面発現をもたらした。試験抗体突然変異体がEGFRに対して向けられる場合には、Raji細胞をこの検定のために同様に用い得る。細胞を既知の濃度のIgG突然変異体とともにPBSおよび0.1%BSA中で4℃で30分間インキュベートした。数回洗浄後、1:200のFITC接合F(ab’)2ヤギ抗ヒトF(ab’)2特異的IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)とともに4℃で30分間のインキュベーションにより、抗体結合を検出した。結合抗体変異体に対応する10000細胞の蛍光強度を、FACS Calibur(BD Biosciences, Allschwil, Switzerland)で確定した。
CHO細胞(ECACC番号94060607)をhFcγRIIbをコードするプラスミドでトランスフェクトして、その表面発現をもたらした。試験抗体突然変異体がEGFRに対して向けられる場合には、Raji細胞をこの検定のために同様に用い得る。細胞を既知の濃度のIgG突然変異体とともにPBSおよび0.1%BSA中で4℃で30分間インキュベートした。数回洗浄後、1:200のFITC接合F(ab’)2ヤギ抗ヒトF(ab’)2特異的IgG(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)とともに4℃で30分間のインキュベーションにより、抗体結合を検出した。結合抗体変異体に対応する10000細胞の蛍光強度を、FACS Calibur(BD Biosciences, Allschwil, Switzerland)で確定した。
上記の方法を用いて、好ましくは非修飾抗体と比較してhFcγRIIbとの結合変更を示さないIgG突然変異体を同定し得る。本発明の別の好ましい実施形態では、抑制性受容体FcγRIIbと比較してFcγRIIIと好ましくは結合する分子が特許請求される。これはその結果として、FcγRIIIと結合するが、しかしFcガンマRIIbとはほとんど結合しない中間体(即ち野生型抗体と糖鎖工学処理抗体との間)を示す突然変異体も包含する。このような特許請求抗体突然変異体は、1を上回る「特異性度」を有する。「特異性度」とは、別のヒトFcγ受容体に対する結合親和力の比率としてのヒトFcγRIII受容体に対する特異性を意味する。
ADCC検定
EGFR陽性A431細胞(ATCC番号 CRL‐1555)またはCD20陽性Raji細胞(ATCC番号 CRL‐86)を、精製抗体突然変異体またはそれらを含有する培養上清(Invitrogen, AG, Basel, Switzerland)とともに10分間インキュベートし、AIM‐V培地(Invitrogen, Switzerland)で連続希釈した。FcγRIIIa‐Val/Phe158に関して異型接合性でありそしてFcγRIIc発現を欠くドナーからの新たに調製した末梢血単核球(PBMC)を、エフェクター対標的比25:1でウエルに付加した。代替的には、hFcγRIIIaおよびγ鎖でトランスフェクトしたNK‐92細胞(DSMZ番号 ACC‐488)を、PBMCの代わりに用いた。37℃で4時間のインキュベーション後、メーカーのプロトコールに従って、細胞傷害性検出キット(Roche, Basel, Switzerland)を用いて、溶解細胞により放出されるLDHの検出のために100 μlの無細胞上清を新しいプレートに移した。
EGFR陽性A431細胞(ATCC番号 CRL‐1555)またはCD20陽性Raji細胞(ATCC番号 CRL‐86)を、精製抗体突然変異体またはそれらを含有する培養上清(Invitrogen, AG, Basel, Switzerland)とともに10分間インキュベートし、AIM‐V培地(Invitrogen, Switzerland)で連続希釈した。FcγRIIIa‐Val/Phe158に関して異型接合性でありそしてFcγRIIc発現を欠くドナーからの新たに調製した末梢血単核球(PBMC)を、エフェクター対標的比25:1でウエルに付加した。代替的には、hFcγRIIIaおよびγ鎖でトランスフェクトしたNK‐92細胞(DSMZ番号 ACC‐488)を、PBMCの代わりに用いた。37℃で4時間のインキュベーション後、メーカーのプロトコールに従って、細胞傷害性検出キット(Roche, Basel, Switzerland)を用いて、溶解細胞により放出されるLDHの検出のために100 μlの無細胞上清を新しいプレートに移した。
モデリング
ネイティブIgG(PDBコード le4k)由来のFc断片との複合体中のFcγRIIIの結晶構造に基づいて、モデリングを実施した。その目的のために、FcのAsn‐297に結合した炭水化物部分の座標を二重にして、そしてグリカンのうちの1つは、FUC残基が存在する位置に向く五糖コアを有するFcγRIIIのAsn‐162に剛体として手動で調整した。モデルは最小化されず、提案された結合方式を可視化するために作製されたに過ぎない。
ネイティブIgG(PDBコード le4k)由来のFc断片との複合体中のFcγRIIIの結晶構造に基づいて、モデリングを実施した。その目的のために、FcのAsn‐297に結合した炭水化物部分の座標を二重にして、そしてグリカンのうちの1つは、FUC残基が存在する位置に向く五糖コアを有するFcγRIIIのAsn‐162に剛体として手動で調整した。モデルは最小化されず、提案された結合方式を可視化するために作製されたに過ぎない。
実施例3
材料および方法
Hek293EBNA細胞中での抗体突然変異体の発現
前に記載されたように(Jordan, M., et al., Nucleic Acids Res. 24: 596-601 (1996))、部位特異的突然変異誘発により抗体突然変異体を生成し、その結果生じたDNAをプラスミドを含有するOriP中でクローン化して、HEK293‐EBNA細胞(Invitrogen, Switzerland)の一過性トランスフェクションのために用いた。キメラGnT‐III(G1、主にハイブリッド非フコシル化分枝炭水化物により特性化される)を用いた、あるいはキメラGnT‐IIIおよびManII(G2、高比率の複合体非フコシル化分枝炭水化物により特性かされる)を用いた抗体コードプラスミドの同時トランスフェクションにより、これらの抗体のいくつかの糖形態を調製した。
材料および方法
Hek293EBNA細胞中での抗体突然変異体の発現
前に記載されたように(Jordan, M., et al., Nucleic Acids Res. 24: 596-601 (1996))、部位特異的突然変異誘発により抗体突然変異体を生成し、その結果生じたDNAをプラスミドを含有するOriP中でクローン化して、HEK293‐EBNA細胞(Invitrogen, Switzerland)の一過性トランスフェクションのために用いた。キメラGnT‐III(G1、主にハイブリッド非フコシル化分枝炭水化物により特性化される)を用いた、あるいはキメラGnT‐IIIおよびManII(G2、高比率の複合体非フコシル化分枝炭水化物により特性かされる)を用いた抗体コードプラスミドの同時トランスフェクションにより、これらの抗体のいくつかの糖形態を調製した。
炭水化物分析および表面プラズモン共鳴のための培養上清中の抗体の定量および精製
トランスフェクト化EBNA細胞の上清中に存在する抗体の直接定量を、プロテインAクロマトグラフィーを用いて実施した。その目的のために、100 μlの上清を、樹脂に固定されたプロテインAを充填したカラムに適用した。洗浄ステップによる非結合タンパク質の除去後、pH3の緩衝液を用いて結合抗体を溶離した。溶離抗体により引き起こされる280 nmの波長での吸光度を積分し、既知の濃度の抗体標準と組合せて、その定量のために用いた。溶離試料を、炭水化物分析のために用いた。
トランスフェクト化EBNA細胞の上清中に存在する抗体の直接定量を、プロテインAクロマトグラフィーを用いて実施した。その目的のために、100 μlの上清を、樹脂に固定されたプロテインAを充填したカラムに適用した。洗浄ステップによる非結合タンパク質の除去後、pH3の緩衝液を用いて結合抗体を溶離した。溶離抗体により引き起こされる280 nmの波長での吸光度を積分し、既知の濃度の抗体標準と組合せて、その定量のために用いた。溶離試料を、炭水化物分析のために用いた。
表面プラズモン共鳴用途のために、5 mlの上清を、20 μlのプロテインAセファロースビーズ(rmp プロテインAセファロースFast Flow, Amersham Biosciences, Otelfingen, Switzerland)とともに、室温で一晩、end-over-endでインキュベートした。試料を空のマイクロスピンカラム(BioRad, Reinach, Switzerland)に移し、1000×gで1分間遠心分離した。保持ビーズを10 mMトリス、50 mMグリシン、100 mM塩化ナトリウム、pH8.0で1回洗浄した。120 μlの10 mMトリス、50 mMグリシン、100 mM塩化ナトリウム、pH3.0とともに5分間インキュベートし、その後、中和のために6 μlの2 Mトリス、pH8.0を含有するエッペンドルフ管中で2分間、1000×gで遠心分離することにより、溶離を実施した。
炭水化物分析
精製抗体を2 mMトリス、pH7.0に緩衝液交換して、20 μlに濃縮した。37℃で3時間、2 mMトリス、pH7中の0.05 mU/μgタンパク質でのN‐グリコシダーゼ消化(PNGアーゼF、EC 3.5.1.52, QA-Bio, San Mateo, CA, USA)により、抗体からオリゴ糖を酵素的に放出させた。放出オリゴ糖を150 mM酢酸に調整した後、記載(Papac, D.I., et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998))されたように、マイクロ‐バイオ‐スピンクロマトグラフィーカラム(BioRad, Reinach, Switzerland)中に詰め込まれた陽イオン交換樹脂(AG50W‐X8樹脂、水素形態、100〜200メッシュ、BioRad, Reinach, Switzerland)を通して精製した。
精製抗体を2 mMトリス、pH7.0に緩衝液交換して、20 μlに濃縮した。37℃で3時間、2 mMトリス、pH7中の0.05 mU/μgタンパク質でのN‐グリコシダーゼ消化(PNGアーゼF、EC 3.5.1.52, QA-Bio, San Mateo, CA, USA)により、抗体からオリゴ糖を酵素的に放出させた。放出オリゴ糖を150 mM酢酸に調整した後、記載(Papac, D.I., et al., Glycobiology 8, 445-454 (1998))されたように、マイクロ‐バイオ‐スピンクロマトグラフィーカラム(BioRad, Reinach, Switzerland)中に詰め込まれた陽イオン交換樹脂(AG50W‐X8樹脂、水素形態、100〜200メッシュ、BioRad, Reinach, Switzerland)を通して精製した。
1 μlの試料をエッペンドルフ管中で1 μlの新たに調製したマトリックス(4 mgの2,5‐ジヒドロキシ安息香酸および0.2 mgの5‐メトキシサリチル酸を1 mlのエタノール/10 mM塩化ナトリウム水溶液1:1(v/v)中に溶解することにより調製)と混合した。次に1 μlのこの混合物を標的プレートに移した。試料を乾燥させた後、陽イオン方式で操作するAutoflexMALDI/TOF(Bruker Daltonics, Faellanden/Switzerland)を用いて測定した。
サイズ排除クロマトグラフィー
SPR試験のために、Tricon Superdex 200 10/300 GLカラム(Amersham Biosciences, Otelfingen, Switzerland)およびHSP‐EB緩衝液(0.01 M HEPES、pH7.4、 0.15 M NaCl、3 mMEDTA、0.005%トゥイーン20)を実行溶液として用いて、自動試料採取器およびMADユニットを有するAgilent 1100系でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、プロテインA濃化試料(100 μl)を精製した。溶離抗体により引き起こされる280 nmの波長での吸光度を積分し、既知の濃度の抗体標準と組合せて、その定量のために用いた。
SPR試験のために、Tricon Superdex 200 10/300 GLカラム(Amersham Biosciences, Otelfingen, Switzerland)およびHSP‐EB緩衝液(0.01 M HEPES、pH7.4、 0.15 M NaCl、3 mMEDTA、0.005%トゥイーン20)を実行溶液として用いて、自動試料採取器およびMADユニットを有するAgilent 1100系でのサイズ排除クロマトグラフィーにより、プロテインA濃化試料(100 μl)を精製した。溶離抗体により引き起こされる280 nmの波長での吸光度を積分し、既知の濃度の抗体標準と組合せて、その定量のために用いた。
可溶性shFcγRIIIa‐His 6 およびshFcγRIIb‐His 6 の発現
shFcγRIIIa‐His6およびshFcγRIIb‐His6を、HEK293‐EBNA細胞中での一過性発現により産生し(Jordan, M. et al., Nucl. Acids. Res. 24: 596-601 (1996))、そしてHiTraPキレート化HP(Amersham Biosciences, Otelfingen, Switzerland)ならびにHSP‐EB緩衝液(0.01 M HEPES、pH7.4、 0.15 M NaCl、3 mMEDTA、0.005%トゥイーン20)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを用いて、ヘキサヒスチジンタグを利用することにより均質に精製した。タンパク質の濃度を、記載されたとおりに確定した(Gill, S.C. & von Hippel, P.H., Anal. Biochem. 182(2): 319-326 (1989))。
shFcγRIIIa‐His6およびshFcγRIIb‐His6を、HEK293‐EBNA細胞中での一過性発現により産生し(Jordan, M. et al., Nucl. Acids. Res. 24: 596-601 (1996))、そしてHiTraPキレート化HP(Amersham Biosciences, Otelfingen, Switzerland)ならびにHSP‐EB緩衝液(0.01 M HEPES、pH7.4、 0.15 M NaCl、3 mMEDTA、0.005%トゥイーン20)を用いるサイズ排除クロマトグラフィーステップを用いて、ヘキサヒスチジンタグを利用することにより均質に精製した。タンパク質の濃度を、記載されたとおりに確定した(Gill, S.C. & von Hippel, P.H., Anal. Biochem. 182(2): 319-326 (1989))。
表面プラズモン共鳴
実行緩衝液としてHBS‐EPを用いてBiacore3000(Biacore, Freiburg, Germany)で、SPR実験を実施した。標準アミンカップリングキット(Biacore, Freiburg, Germany)を用いてCM5チップで、ヒトFcγ受容体の約200〜500共鳴単位(RU)の直接カップリングを実施した。IgG突然変異体の濃度組を、30 μl/分の流量で、フローセルに通した。固定されたタンパク質を有さない参照表面上の流動に関して得られた応答を差し引くことにより、大きな屈折率差を補正した。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線のあてはめにより、解離定数KDを得た。BIA評価プログラム曲線のあてはめ設備を用いて速度定数を得て、数値積分により、1:1ラングミュア結合に関する速度方程式を適合した。
実行緩衝液としてHBS‐EPを用いてBiacore3000(Biacore, Freiburg, Germany)で、SPR実験を実施した。標準アミンカップリングキット(Biacore, Freiburg, Germany)を用いてCM5チップで、ヒトFcγ受容体の約200〜500共鳴単位(RU)の直接カップリングを実施した。IgG突然変異体の濃度組を、30 μl/分の流量で、フローセルに通した。固定されたタンパク質を有さない参照表面上の流動に関して得られた応答を差し引くことにより、大きな屈折率差を補正した。定常状態応答を用いて、ラングミュア結合等温線の非線形曲線のあてはめにより、解離定数KDを得た。BIA評価プログラム曲線のあてはめ設備を用いて速度定数を得て、数値積分により、1:1ラングミュア結合に関する速度方程式を適合した。
結果
抗体をHBS‐EP中で希釈し、固定化受容体を有する表面上を通過させた。記載された方法を用いると、非糖鎖工学処理バージョンを用いた場合に同定され得ないアミノ酸突然変異体を個々で同定し得る。例えば抗体突然変異体S239WおよびF243Eは、糖鎖工学処理されない(非GE)がしかし糖鎖工学処理(GE)された場合の対照抗体と比較してほとんど同一のKDを有する場合、FcγRIIIaに対する親和力低減を示す。
抗体をHBS‐EP中で希釈し、固定化受容体を有する表面上を通過させた。記載された方法を用いると、非糖鎖工学処理バージョンを用いた場合に同定され得ないアミノ酸突然変異体を個々で同定し得る。例えば抗体突然変異体S239WおよびF243Eは、糖鎖工学処理されない(非GE)がしかし糖鎖工学処理(GE)された場合の対照抗体と比較してほとんど同一のKDを有する場合、FcγRIIIaに対する親和力低減を示す。
記載された原理によれば、上首尾の突然変異体は以下の特質のうちのいずれか1つを特徴とすべきである:
A. GE IgG‐突然変異体は、アミノ酸修飾を欠くGE IgGと比較して、FcγRIIIaに対する親和力増大を示す。
B. GE IgG‐突然変異体は、FcγRIIIaの炭水化物部分により媒介されるFcγRIIIaに対する親和力増大を示す。これらの突然変異体は、位置162でのグリコシル化を欠くFcγRIIIa(FcγRIIIa‐Q162)と結合することにより同定され得る。
C. 突然変異体は、GE対照抗体と比較して、kオン増大またはkオフ低減を示す。
A. GE IgG‐突然変異体は、アミノ酸修飾を欠くGE IgGと比較して、FcγRIIIaに対する親和力増大を示す。
B. GE IgG‐突然変異体は、FcγRIIIaの炭水化物部分により媒介されるFcγRIIIaに対する親和力増大を示す。これらの突然変異体は、位置162でのグリコシル化を欠くFcγRIIIa(FcγRIIIa‐Q162)と結合することにより同定され得る。
C. 突然変異体は、GE対照抗体と比較して、kオン増大またはkオフ低減を示す。
上記の特質にしたがって、以下の3つのグループを限定した:
以下のIgG突然変異体を選択した:
考察
選択されたIgG突然変異体を、表7に記載したように3つのグループに分割した。
選択されたIgG突然変異体を、表7に記載したように3つのグループに分割した。
グループ1 ‐ S239W、F243E、F243H
これらの抗体突然変異体は、それらの糖鎖工学処理形態で、対照糖鎖工学処理抗体と比較した場合、shFcγRIIIa‐H6とのそれらの相互作用に関して非常によく似たKD値を有するが、しかし解離速度定数低減(4倍低減kオフ)を特徴とする。位置Q162でのグリコシル化を欠くshFcγRIIIaに対する親和力は、対照抗体に関してそれぞれの糖形態により表示される親和力と比較した場合、糖鎖工学処理および非糖鎖工学処理糖形態の両方で、これらの突然変異体に関して低減される。これは、kオフ改善が炭水化物部分に起因し、アミノ酸突然変異に起因しない、ということを示す。
これらの抗体突然変異体は、それらの糖鎖工学処理形態で、対照糖鎖工学処理抗体と比較した場合、shFcγRIIIa‐H6とのそれらの相互作用に関して非常によく似たKD値を有するが、しかし解離速度定数低減(4倍低減kオフ)を特徴とする。位置Q162でのグリコシル化を欠くshFcγRIIIaに対する親和力は、対照抗体に関してそれぞれの糖形態により表示される親和力と比較した場合、糖鎖工学処理および非糖鎖工学処理糖形態の両方で、これらの突然変異体に関して低減される。これは、kオフ改善が炭水化物部分に起因し、アミノ酸突然変異に起因しない、ということを示す。
グループ2 ‐ H268D、H268E、S239E
これらの抗体突然変異体は、それぞれの糖形態での対照抗体と比較して、shFcγRIIIa‐H6に関する糖鎖工学処理および非糖鎖工学処理糖形態の両方で、KD低減を有する。糖鎖工学処理形態に関しては、これは解離速度定数低減(4倍〜2倍低減kオフ)の結果である。グループ1の突然変異体に対比して、これらの抗体も、糖鎖工学処理および非糖鎖工学処理糖形態の両方で、対照抗体のそれぞれの糖形態により表示される親和力と比較した場合、位置Q162でのグリコシル化を欠くshFcγRIIIaに対する親和力増大を示し、これは、親和力改善におけるアミノ酸突然変異の影響を示す。
これらの抗体突然変異体は、それぞれの糖形態での対照抗体と比較して、shFcγRIIIa‐H6に関する糖鎖工学処理および非糖鎖工学処理糖形態の両方で、KD低減を有する。糖鎖工学処理形態に関しては、これは解離速度定数低減(4倍〜2倍低減kオフ)の結果である。グループ1の突然変異体に対比して、これらの抗体も、糖鎖工学処理および非糖鎖工学処理糖形態の両方で、対照抗体のそれぞれの糖形態により表示される親和力と比較した場合、位置Q162でのグリコシル化を欠くshFcγRIIIaに対する親和力増大を示し、これは、親和力改善におけるアミノ酸突然変異の影響を示す。
グループ3 ‐ T260H
糖鎖工学処理形態のこの突然変異体は、糖鎖工学処理対照抗体と比較した場合、sFcγRIIIaに関してKD低減を示すが、これは糖鎖工学処理突然変異体に関するkオンのほぼ3倍増大の結果である。この突然変異体の非糖鎖工学処理糖形態は、非糖鎖工学処理対照抗体と比較した場合、sFcγRIIIaに関する類似の親和力を有する。位置Q162でのグリコシル化を欠くshFcγRIIIaとの結合は、非糖鎖工学処理対照抗体と比較した場合、非糖鎖工学処理糖形態のこの突然変異体に関してわずかに低減されるが、一方、糖鎖工学処理突然変異体に関する結合は糖鎖工学処理対照抗体の場合と類似する。
糖鎖工学処理形態のこの突然変異体は、糖鎖工学処理対照抗体と比較した場合、sFcγRIIIaに関してKD低減を示すが、これは糖鎖工学処理突然変異体に関するkオンのほぼ3倍増大の結果である。この突然変異体の非糖鎖工学処理糖形態は、非糖鎖工学処理対照抗体と比較した場合、sFcγRIIIaに関する類似の親和力を有する。位置Q162でのグリコシル化を欠くshFcγRIIIaとの結合は、非糖鎖工学処理対照抗体と比較した場合、非糖鎖工学処理糖形態のこの突然変異体に関してわずかに低減されるが、一方、糖鎖工学処理突然変異体に関する結合は糖鎖工学処理対照抗体の場合と類似する。
ほとんどの選択された突然変異体の炭水化物プロフィールを分析すると、対照抗体と比較して非常によく似たオリゴ糖パターンを示す。
結論
非修飾(フコシル化)抗体と比較して、非フコシルかされた場合にhFcγRIIIaとの結合増大を示すIgG突然変異体を同定した。さらに、いくつかの同定されたIgG突然変異体は、好ましくはFcγRIIIaに対する親和力増大を示すが、しかしFcγRIIIa‐Q162(位置162でのグリコシル化を欠く)に関しては示さないと同定され得る。さらに記載された方法は、異なる特質、例えばkオフ低減またはkオン増大を示すIgG突然変異体の選択を可能にする。
非修飾(フコシル化)抗体と比較して、非フコシルかされた場合にhFcγRIIIaとの結合増大を示すIgG突然変異体を同定した。さらに、いくつかの同定されたIgG突然変異体は、好ましくはFcγRIIIaに対する親和力増大を示すが、しかしFcγRIIIa‐Q162(位置162でのグリコシル化を欠く)に関しては示さないと同定され得る。さらに記載された方法は、異なる特質、例えばkオフ低減またはkオン増大を示すIgG突然変異体の選択を可能にする。
Claims (111)
- Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子であって、前記Fc領域が前記糖鎖工学処理の結果としてオリゴ糖構造変更を有し、そして少なくとも1つのアミノ酸修飾を有する分子であり、前記抗原結合分子が前記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体との結合増大を示す分子。
- 前記抗原結合分子がヒトFcγRII受容体との結合増大を示さない、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記ヒトFcγRII受容体がヒトFcγRIIa受容体である、請求項2記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記ヒトFcγRII受容体がヒトFcγRIIb受容体である、請求項2記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIII受容体がグリコシル化される、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記グリコシル化受容体がAsn162にN結合オリゴ糖を含む、請求項5記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIII受容体がFcγRIIIaである、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIII受容体がFcγRIIIbである、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIIIa受容体が位置158にバリン残基を有する、請求項7記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIIIa受容体が位置158にフェニルアラニン残基を有する、請求項7記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記修飾が前記修飾を欠く抗原結合分子と比較して非グリコシル化FcγRIII受容体との結合を実質的に増大しない、請求項5記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がアミノ酸239、241、243、260、262、263、264、265、268、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302または303のうちの1つまたは複数で置換を含む、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がアミノ酸239、241、243、260、262、263、264、265、268、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302または303のうちの1つまたは複数でさらなる置換を含む、請求項12記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がアミノ酸239、243、260または268のうちの1つまたは複数で置換を含む、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記置換がFcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用するアミノ酸残基が天然アミノ酸に取って代わる、請求項11〜14のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- FcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用する前記アミノ酸残基が以下の:Trp、His、Tyr、Glu、Arg、Asp、Phe、AsnおよびGlnから成る群から選択される、請求項15記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 1つまたは複数のアミノ酸での前記置換が以下の:Ser239Asp、Ser239Glu、Ser239Trp、Phe243His、Phe243Glu、Thr260His、His268AspまたはHis268Gluから成る群から選択される、請求項14記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 1つより多いアミノ酸での前記置換が表5に列挙された置換から選択される、請求項17記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記置換が表2に列挙された置換から選択される、請求項12記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子が前記修飾を欠く同一抗原結合分子と比較して少なくとも10%増大された親和力で前記FcγRIII受容体と結合する、請求項5記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がヒトIgG Fc領域である、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子がFc領域を含む抗体または抗体断片である、請求項1〜21のいずれか1項に記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗体または抗体断片がキメラである、請求項22記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗体または抗体断片がヒト化される、請求項22記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子がエフェクター機能増大を示す、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記エフェクター機能増大が抗体依存性細胞傷害性増大または補体依存性細胞傷害性増大である、請求項25記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にフコース残基数の低減を含む、請求項1〜26のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも20%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項27記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも50%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項27記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも70%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項27記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも80%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項27記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合に分枝オリゴ糖数増大を含む、請求項1〜26のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記分枝オリゴ糖の大多数がハイブリッド型のものである、請求項32記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記分枝オリゴ糖の大多数が複合型のものである、請求項32記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にハイブリッドオリゴ糖数増大を含む、請求項1〜26のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合に複合オリゴ糖数増大を含む、請求項1〜26のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にGlcNAc残基対フコース残基比の増大を含む、請求項1〜26のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子が以下の:ヒトCD20抗原、ヒトEGFR抗原、ヒトMCSP抗原、ヒトMUC‐1抗原、ヒトCEA抗原、ヒトHER2抗原およびヒトTAG‐72抗原から成る群から選択される抗原を選択的に結合する、請求項1記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子であって、前記Fc領域が前記糖鎖工学処理の結果として糖鎖構造変更を有し、そして少なくとも1つのアミノ酸修飾を有し、そして前記抗原結合分子が前記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体に対する特異性増大を示す糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子がヒトFcγRII受容体との結合増大を示さない、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記ヒトFcγRII受容体がヒトFcγRIIa受容体である、請求項40記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記ヒトFcγRII受容体がヒトFcγRIIb受容体である、請求項40記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIII受容体がグリコシル化される、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記グリコシル化受容体がAsn162にN結合オリゴ糖を含む、請求項43記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIII受容体がFcγRIIIaである、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIII受容体がFcγRIIIbである、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIIIa受容体が位置158にバリン残基を有する、請求項45記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記FcγRIIIa受容体が位置158にフェニルアラニン残基を有する、請求項45記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記修飾が前記修飾を欠く抗原結合分子と比較して非グリコシル化FcγRIII受容体との結合を実質的に増大しない、請求項43記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がアミノ酸239、241、243、260、262、263、264、265、268、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302または303のうちの1つまたは複数で置換を含む、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がアミノ酸239、241、243、260、262、263、264、265、268、290、292、293、294、295、296、297、298、299、300、301、302または303のうちの1つまたは複数でさらなる置換を含む、請求項50記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がアミノ酸239、243、260または268のうちの1つまたは複数で置換を含む、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記置換がFcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用するアミノ酸残基が天然アミノ酸に取って代わる、請求項50〜52のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- FcγRIII受容体のAsn162に結合される炭水化物と相互作用する前記アミノ酸残基が以下の:Trp、His、Tyr、Glu、Arg、Asp、Phe、AsnおよびGlnから成る群から選択される、請求項53記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 1つまたは複数のアミノ酸での前記置換が以下の:Ser239Asp、Ser239Glu、Ser239Trp、Phe243His、Phe243Glu、Thr260His、His268AspまたはHis268Gluから成る群から選択される、請求項52記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 1つより多いアミノ酸での前記置換が表5に列挙された置換から選択される、請求項55記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記置換が表2に列挙された置換である、請求項50記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子が前記修飾を欠く同一抗原結合分子と比較して少なくとも10%増大された特異性で前記FcγRIII受容体と結合する、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記Fc領域がヒトIgG Fc領域である、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子がFc領域を含む抗体または抗体断片である、請求項39〜59のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗体または抗体断片がキメラである、請求項60記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗体または抗体断片がヒト化される、請求項60記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子がエフェクター機能増大を示す、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記エフェクター機能増大が抗体依存性細胞傷害性増大または補体依存性細胞傷害性増大である、請求項63記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にフコース残基数の低減を含む、請求項39〜64のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも20%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項65記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも50%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項65記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも70%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項65記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- Fc領域中の少なくとも80%のオリゴ糖が非フコシル化される、請求項65記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合に分枝オリゴ糖数増大を含む、請求項39〜64のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記分枝オリゴ糖の大多数がハイブリッド型のものである、請求項70記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記分枝オリゴ糖の大多数が複合型のものである、請求項70記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にハイブリッドオリゴ糖数増大を含む、請求項39〜64のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合に複合オリゴ糖数増大を含む、請求項39〜64のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記オリゴ糖構造変更が非糖鎖工学処理抗原結合分子と比較した場合にGlcNAc残基対フコース残基比の増大を含む、請求項39〜64のいずれかに記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 前記抗原結合分子が以下の:ヒトCD20抗原、ヒトEGFR抗原、ヒトMCSP抗原、ヒトMUC‐1抗原、ヒトCEA抗原、ヒトHER2抗原およびヒトTAG‐72抗原から成る群から選択される抗原を選択的に結合する、請求項39記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 抗体Fc領域または抗体Fc領域の断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記Fc領域またはその断片が少なくとも1つのアミノ酸修飾を有し、そして前記ポリペプチドが前記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体との結合増大を示すポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドが抗体重鎖である、請求項77記載のポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項77記載のポリヌクレオチド。
- 請求項77記載のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが抗体重鎖である、請求項80記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが融合タンパク質である、請求項80記載のポリペプチド。
- 請求項80〜82のいずれかに記載のポリペプチドを含む抗原結合分子。
- 請求項77〜79のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項84記載のベクターを含む宿主細胞。
- Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子の製造方法であって、前記Fc領域が前記糖鎖工学処理の結果として糖鎖構造変更を有し、ならびに少なくとも1つのアミノ酸修飾を有する方法であり、そして前記抗原結合分子が前記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体との結合増大を示す方法であって、以下の:
(a)前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で請求項85記載の宿主細胞を培養し;そして
(b)培地から前記糖鎖工学処理抗原結合分子を回収する
ことを包含する方法。 - Fc領域を含む糖鎖工学処理抗原結合分子の製造方法であって、前記Fc領域が前記糖鎖工学処理の結果として糖鎖構造変更を有し、ならびに少なくとも1つのアミノ酸修飾を有する方法であり、そして前記抗原結合分子が前記修飾を欠く抗原結合分子と比較してヒトFcγRIII受容体に対する特異性増大を示す方法であって、以下の:
(a)前記ポリヌクレオチドの発現を可能にする条件下で請求項85記載の宿主細胞を培養し;そして
(b)培地から前記糖鎖工学処理抗原結合分子を回収する
ことを包含する方法。 - 前記抗体または抗体断片が完全にヒトである、請求項22または請求項60記載の糖鎖工学処理抗原結合分子。
- 抗体Fこしい領域または抗体Fこしい領域の断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、前記Fc領域またはその断片が少なくとも1つのアミノ酸修飾を有し、そして前記ポリペプチドが請求項1〜76のいずれかに記載の抗原結合分子であるポリヌクレオチド。
- 癌の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項1〜76、83または88のいずれかに記載の抗原結合分子の使用。
- 前記癌が乳癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌および脳癌から成る群から選択される、請求項90記載の使用。
- 前癌性症状または病変の治療または予防のための薬剤の製造のための、請求項1〜76、83または88のいずれかに記載の抗原結合分子の使用。
- 前記前癌性症状または病変が口腔白斑症、光線性角化症(日光性角化症)、結腸または直腸の前癌性ポリープ、胃上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリープ性結腸癌症候群(HNPCC)、バレット食道、膀胱異形成および前癌性子宮頚部症状から成る群から選択される、請求項92記載の使用。
- 前記抗原結合分子が約1.0 mg/kg〜約15 mg/kgの治療的有効量で用いられる、請求項90〜93のいずれか一項に記載の使用。
- 前記治療的有効量が約1.5 mg/kg〜約12 mg/kgである、請求項90〜94のいずれか一項に記載の使用。
- 前記治療的有効量が約1.5 mg/kg〜約4.5 mg/kgである、請求項90〜95のいずれか一項に記載の使用。
- 前記治療的有効量が約4.5 mg/kg〜約12 mg/kgである、請求項90〜96のいずれか一項に記載の使用。
- 前記治療的有効量が約1.5 mg/kgである、請求項90〜97のいずれか一項に記載の使用。
- 前記治療的有効量が約4.5 mg/kgである、請求項90〜98のいずれか一項に記載の使用。
- 前記治療的有効量が約12 mg/kgである、請求項90〜99のいずれか一項に記載の使用。
- 本明細書中に記載されるような新規の化合物、プロセス、製剤組成物、方法および使用。
- 請求項1〜76、83または88のいずれかに記載の抗原結合分子を含む製剤組成物ならびに製薬上許容可能な担体。
- 請求項102記載の治療的有効量の製剤をそれを必要とする患者に投与することを包含する癌の治療または予防のための方法。
- 前記癌が乳癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌および脳癌から成る群から選択される、請求項103記載の方法。
- 請求項102記載の治療的有効量の製剤組成物をそれを必要とする患者に投与することを包含する前癌性症状または病変の治療または予防のための方法。
- 前記前癌性症状または病変が口腔白斑症、光線性角化症(日光性角化症)、結腸または直腸の前癌性ポリープ、胃上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリープ性結腸癌症候群(HNPCC)、バレット食道、膀胱異形成および前癌性子宮頚部症状から成る群から選択される、請求項106記載の方法。
- 癌の治療または予防における使用のための、請求項1〜76、83または88のいずれかに記載の抗原結合分子。
- 前記癌が乳癌、膀胱癌、頭部および頚部癌、皮膚癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、結腸癌、前立腺癌、腎臓癌および脳癌から成る群から選択される、請求項107記載の抗原結合分子。
- 前癌性症状または病変の治療または予防における使用のための、請求項1〜76、83または88のいずれかに記載の抗原結合分子。
- 前記前癌性症状または病変が口腔白斑症、光線性角化症(日光性角化症)、結腸または直腸の前癌性ポリープ、胃上皮異形成、腺腫性異形成、遺伝性非ポリープ性結腸癌症候群(HNPCC)、バレット食道、膀胱異形成および前癌性子宮頚部症状から成る群から選択される、請求項109記載の抗原結合分子。
- 治療における使用のための、請求項1〜76、83または88に記載の抗原結合分子。
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