JP5242502B2

JP5242502B2 - 最適化Ｆｃ変異体およびそれらの生成方法

Info

Publication number: JP5242502B2
Application number: JP2009141637A
Authority: JP
Inventors: グレゴリー・アラン・ラザー; アーサー・ジェイ・チリノ; ダン・ウェイ; ジョン・ルドルフ・デスジャーレイス; スティーブン・コール・ドーバースタイン; ロバート・ジェイ・ヘイズ; シャー・バハドゥル・カーキ; オミッド・バファ
Original assignee: Xencor Inc
Current assignee: Xencor Inc
Priority date: 2002-09-27
Filing date: 2009-05-25
Publication date: 2013-07-24
Anticipated expiration: 2023-09-26
Also published as: EP1553975B1; DK2364996T3; EP2345671B8; CA2832136A1; EP3502133A1; CA2832136C; CA2499816A1; SI2345671T1; ATE541857T1; ES2562177T3; EP1553975A4; BRPI0314814B8; AU2003279719A1; KR20050071523A; EP2298805A2; AU2003279719B2; EP3321282A1; DK2345671T3; AU2003279719B8; JP4580340B2

Description

本出願は、２００３年６月１２日に出願されたＵＳＳＮ６０／４７７,８３９；２００３年５月２日に出願された６０／４６７,６０６；２００２年９月２７日に出願された６０／４１４,４３３；および２００３年１月２３日に出願された６０／４４２,３０１に対し、３５Ｕ.Ｓ.Ｃ.§１９９（ｅ）の利益を主張する出願であり、これらの出願の全体を出典明示により本明細書の一部とする。

発明の分野
本発明は、新規最適化Ｆｃ変異体、それらの生成のための工学処理方法、および特に治療目的へのそれらの適用に関する。

発明の背景
抗体は、特定の抗原に結合する免疫タンパク質である。ヒトやマウスを含む殆どの哺乳動物において、抗体は、対になった重鎖と軽鎖のポリペプチド鎖から構築される。各々の鎖は、個々の免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインからできており、従って一般用語の免疫グロブリンは、このようなタンパク質に対して使用される。各鎖は、２個の別個の領域からなり、これらは可変および定常領域と呼ばれる。軽鎖と重鎖の可変領域は、抗体間でかなりの配列多様性を示し、標的抗原の結合を担う。定常領域は、乏しい配列多様性を示し、重要な生化学的事象を誘起する数々の天然タンパク質の結合を担う。ヒトでは、５種の異なるクラスの抗体があり、ＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む）、およびＩｇＭが含まれる。これらの抗体クラス間を区別する顕著な特徴は、それらの定常領域であり、一方Ｖ領域には微妙な違いが存在することがある。図１は、本明細書で免疫グロブリンの一般的構造特徴を説明する例として用いられるＩｇＧ１抗体を示す。ＩｇＧ抗体は、２本の重鎖および２本の軽鎖から構成される四量体タンパク質である。ＩｇＧ重鎖は、Ｎ末端からＣ末端へＶ_H−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３（各々、重鎖可変ドメイン、定常ガンマ１ドメイン、定常ガンマ２ドメインおよび定常ガンマ３ドメインを表す）の順に連結された４個の免疫グロブリンドメインから構成される。ＩｇＧ軽鎖は、Ｎ末端からＣ末端へＶ_L−Ｃ_L（各々、軽鎖可変ドメインおよび軽鎖定常ドメインを表す）の順に連結された２個の免疫グロブリンドメインから構成される。

抗体の可変領域は、この分子の抗原結合決定基を含有し、従って、その標的抗原に対する抗体の特異性を決定する。可変領域は、同じクラス内の他の抗体から配列が最も異なっているために、このように名付けられている。配列可変性の大部分は、相補性決定領域（ＣＤＲ）において生じる。重鎖と軽鎖に３個ずつ、全部で６個のＣＤＲがあり、Ｖ_HＣＤＲ１、Ｖ_HＣＤＲ２、Ｖ_HＣＤＲ３、Ｖ_LＣＤＲ１、Ｖ_LＣＤＲ２およびＶ_LＣＤＲ３と呼ばれるＣＤＲの外側の可変領域は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。ＣＤＲほど多様ではないが、配列可変性は、異なる抗体間で、ＦＲ領域において生じる。全体的に、抗体のこの特徴的構造様式が、安定な骨格（ＦＲ領域）をもたらし、その上で実質的な抗原結合多様性（ＣＤＲ）が免疫系により探査され、幅広い抗原群に対する特異性が獲得され得る。様々な生物由来の多様な可変領域フラグメントについて、数々の高解像度構造が入手可能である。未結合のものもあり、抗原と複合体化したものもある。抗体の可変領域の配列および構造的特徴は、十分に特徴解析されており（Morea et al., 1997, Biophys Chem 68:9-16; Morea et al., 2000, Methods 20:267-279）、抗体の保存された特徴は、豊かな抗体工学処理技法の発展を可能にしてきた（Maynard et al., 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-376）。例えば、ある抗体、例えばマウスの抗体からのＣＤＲを、別の抗体、例えばヒトの抗体のフレームワーク領域に移植することが可能である。当分野で「ヒト化」と呼ばれるこのプロセスは、非ヒト抗体からの免疫原性の低い抗体治療剤の生成を可能にする。可変領域を含むフラグメントは、抗体の他の領域の非存在下で存在でき、例えば、Ｖ_H−Ｃγ１およびＶ_H−Ｃ_Lを含む抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）、Ｖ_HおよびＶ_Lを含む可変フラグメント（Ｆｖ）、同じ鎖中で一緒に連結されたＶ_HおよびＶ_Lを含む一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、並びに多様な他の可変領域フラグメントが包含される（Little et al., 2000, Immunol Today 21:364-370）。

抗体のＦｃ領域は、数々のＦｃ受容体およびリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる一群の重要な機能的能力を伝える。ＩｇＧについて、Ｆｃ領域は、図１に示す通り、ＩｇドメインＣγ２およびＣγ３並びにＣγ２に導くＮ末端ヒンジを含む。ＩｇＧクラスに対する重要なＦｃ受容体ファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫系の細胞の武器との間のコミュニケーションを媒介する（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290）。ヒトでは、このタンパク質ファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；そして、アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）が含まれる（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）。これらの受容体は、典型的に、Ｆｃへの結合を媒介する細胞外ドメイン、膜貫通領域、および細胞内でのシグナル伝達事象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγγＴ細胞を含む様々な免疫細胞において発現される。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を結合した抗原の部位に募らせ、典型的に細胞内のシグナル伝達事象およびそれに続く重要な免疫反応、例えば、炎症介在物質の放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、ファゴサイトーシスおよび細胞傷害性攻撃など、をもたらす。細胞傷害およびファゴサイトーシスのエフェクター機能を媒介する能力は、それにより抗体が標的細胞を破壊する潜在能力のあるメカニズムである。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、それに続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞介在反応は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）と呼ばれる（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766; Ravetch et al., 2001, Annu Rev Immunol 19:275-290）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害細胞が標的細胞上の結合した抗体を認識し、それに続いて標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす細胞介在反応は、抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシス（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。数々のヒトＦｃγＲの細胞外ドメインの構造が解明されてきた。これには、ＦｃγＲＩＩａ（ｐｄｂ受託コード１Ｈ９Ｖ）（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749）（ｐｄｂ受託コード１ＦＣＧ）(Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード２ＦＣＢ）（Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095-1103）；およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｊ）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273）が含まれる。全ＦｃγＲ類は、Ｆｃ上の同じ領域に、Ｃγ２ドメインのＮ末端および先行するヒンジで結合する（図２に示す）。この相互作用は、十分に構造解析されており（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749）、ヒトＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃのいくつかの構造（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273）（ｐｄｂ受託コードｓ１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ）（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477）、並びにヒトＩｇＥＦｃ／ＦｃεＲＩα複合体の構造（ｐｄｂ受託コード１Ｆ６Ａ）（Garman et al., 2000, Nature 406:259-266）が解明されてきた。

異なるＩｇＧサブクラスは、ＦｃγＲ類に対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３が、典型的にＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好に受容体に結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）。全ＦｃγＲ類は、ＩｇＧＦｃの同じ領域に、但し異なる親和性で結合する：高い親和性で結合するＦｃγＲＩは、ＩｇＧ１へのＫｄ１０^-8Ｍ^-1を有し、一方、低親和性受容体のＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩは、一般的に各々１０^-6および１０^-5で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは、９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは細胞内シグナル伝達ドメインを持たない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃおよびＦｃγＲＩＩＩａは免疫複合体が引き起こす活性化の正の調節因子であり、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とし、一方、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を有し、従って阻害性である。故に、前者は活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは、阻害性受容体と呼ばれる。これらの受容体は、様々な免疫細胞における発現パターンおよびレベルにおいても異なる。さらに、別のレベルの複雑さは、ヒトのプロテオームにおける数々のＦｃγＲ多型の存在である。特に臨床的に意味のある関連多型は、Ｖ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプよりもＶ１５８アロタイプに高い親和性で結合する。この親和性の差異、および恐らくそのＡＤＣＣおよび／またはＡＤＣＰに対する効果は、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Rituxan^{(登録商標)}、IDEC Pharmaceuticals Corporation の登録商標）の効力の重大な決定因子であることが示された。Ｖ１５８アロタイプの患者は、リツキシマブ処置に好都合に応答する；しかしながら、低親和性のＦ１５８アロタイプの患者は、不十分に応答する（Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758）。ヒトの約１０−２０％はＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合型であり、４５％はＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合型であり、ヒトの３５−４５％はＦ１５８／Ｆ１５８ホモ接合型である（Lehrnbecher et al., 1999, Blood 94:4220-4232; Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758）。従って、ヒトの８０−９０％は不十分な応答者である、即ち、彼らは少なくとも１つのＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ対立遺伝子を有する。

図１に示す、Ｆｃ上の重なり合うが別個の部位は、補体タンパク質Ｃ１ｑへの接点（interface）として働く。Ｆｃ／ＦｃγＲ結合がＡＤＣＣを媒介するのと同じやり方で、Ｆｃ／Ｃ１ｑ結合は、補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）を媒介する。Ｃ１ｑは、セリンプロテアーゼＣ１ｒおよびＣ１ｓと複合体を形成し、Ｃ１複合体を形成する。Ｃ１ｑは、６個の抗体を結合する能力があるが、補体カスケードを活性化するには２個のＩｇＧへの結合で十分である。ＦｃのＦｃγＲ類との相互作用と同様に、異なるＩｇＧサブクラスは、Ｃ１ｑに対して異なる親和性を有し、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は、典型的に、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４よりも実質的に良好にＦｃγＲ類に結合する（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）。Ｆｃ／Ｃ１ｑ複合体の現在入手可能な構造はない；しかしながら、変異誘発研究により、ヒトＩｇＧ上のＣ１ｑの結合部位が、残基Ｄ２７０、Ｋ３２２、Ｋ３２６、Ｐ３２９およびＰ３３１およびＥ３３３を含む領域にマッピングされた（Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575）。

図１に示す、Ｆｃ上のＣγ２およびＣγ３ドメインの間の部位は、新生児の受容体ＦｃＲｎとの相互作用を媒介し、その結合により、エンドサイトーシスされた抗体がエンドソームから血流へ再利用される（Raghavan et al., 1996, Annu Rev Cell Dev Biol 12:181-220; Ghetie et al., 2000, Annu Rev Immunol 18:739-766）。この過程は、完全長分子のサイズが大きいことによる腎臓濾過の除外と対になって、１ないし３週間の範囲に渡る好都合な抗体血清半減期をもたらす。ＦｃのＦｃＲｎへの結合は、また、抗体輸送において鍵となる役割を果たす。Ｆｃ上のＦｃＲｎ結合部位はまた、細菌のプロテインＡおよびＧが結合する部位でもある。これらのタンパク質による密接な結合は、典型的に、タンパク質精製中にプロテインＡまたはプロテインＧ親和性クロマトグラフィーを用いることにより、抗体精製の手段として活用される。従って、Ｆｃ上のこの領域の忠実度は、抗体の臨床的特性およびそれらの精製の両方にとって重要である。ラットＦｃ／ＦｃＲｎ複合体（Martin et al., 2001, Mol Cell 7:867-877）およびＦｃのプロテインＡおよびＧとの複合体（Deisenhofer, 1981, Biochemistry 20:2361-2370; Sauer-Eriksson et al., 1995, Structure 3:265-278; Tashiro et al., 1995, Curr Opin Struct Biol 5:471-481）の入手可能な構造は、Ｆｃのこれらのタンパク質との相互作用への洞察を与える。

Ｆｃ領域の鍵となる特徴は、図１に示す、Ｎ２９７で生じる保存されたＮ連結グリコシレーションである。この炭水化物またはオリゴ糖類（このように呼ばれるときもある）は、抗体にとって決定的な構造的および機能的役割を果たし、哺乳動物発現系を使用して抗体を産生しなければならない根源的理由の１つである。一理論に限定されることを望まないが、この炭水化物の構造的目的は、Ｆｃの安定化または可溶化、Ｃγ３およびＣγ２ドメイン間の特定の角度または可撓性のレベルの決定、２個のＣγ２ドメインを、中心軸を超えて相互に凝集させずにおくこと、またはこれらの組合せであり得ると考えられる。効率的なＦｃγＲおよびＣ１ｑへのＦｃの結合は、この修飾を必要とし、Ｎ２９７の炭水化物の組成の変更またはその除去は、これらのタンパク質への結合に影響を与える（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.; Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147）。この炭水化物は、ＦｃγＲ類との特異的接触をあるとしてもごくわずかにしか成さないが（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477）、このことは、Ｆｃ／ＦｃγＲ結合の媒介におけるＮ２９７炭水化物の機能的役割は、それがＦｃの高次構造の決定において果たす構造的役割を介するものであり得ることを示している。このことは、オリゴ糖組成がＣγ２の高次構造に、そして結果的にＦｃ／ＦｃγＲの接点に衝撃を与えることを示す、４種の異なるＦｃ糖形態の結晶構造を集めることにより支持される（Krapp et al., 2003, J Mol Biol 325:979-989）。

上記で論じた抗体の特徴−標的への特異性、免疫エフェクターメカニズムを媒介する能力、および血清中での長い半減期−は、抗体を強力な治療剤にする。モノクローナル抗体は、癌、炎症および心血管疾患を含む様々な症状の処置のために治療的に使用されている。現在市場に１０種を超える抗体製品があり、数百が開発中である。抗体に加え、研究および治療において拡大中の役割を見出している抗体様タンパク質は、Ｆｃ融合体である（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200）。Ｆｃ融合体は、１個またはそれ以上のポリペプチドが、Ｆｃに機能し得るように連結されたタンパク質である。Ｆｃ融合体は、抗体のＦｃ領域を、従ってその好都合なエフェクター機能および薬物動態を、受容体、リガンドまたはその他のタンパク質またはタンパク質ドメインの標的結合領域と組み合わせる。後者の役割は、標的認識を媒介することであり、従って、それは抗体可変領域と機能的に類似する。Ｆｃ融合体は抗体と構造および機能的に重複するので、本発明における抗体に関する議論は、直接Ｆｃ融合体に及ぶ。

このような広範な用途にも関わらず、抗体は、臨床使用のために最適化されていない。抗体の２つの重大な欠点は、最適には及ばない抗癌能力と、厳しい製造要件である。本発明は、これらの欠点に取り組む。

抗体が腫瘍細胞を破壊する数々の可能なメカニズムがあり、必要な増殖経路の遮断を介する抗増殖、アポトーシスへ導く細胞内シグナリング、受容体の下方調節および／または代謝回転の増強、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび適応免疫反応の促進が含まれる（Cragg et al., 1999, Curr Opin Immunol 11:541-547; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410）。抗腫瘍効力は、これらのメカニズムの組合せによるものであり得、それらの臨床治療における相対的重要性は、癌依存性であると思われる。このように抗腫瘍兵器の兵器庫であるにも関わらず、抗癌剤としての抗体の能力は、特にそれらの高いコストを考えると不満足なものである。患者の腫瘍応答データは、モノクローナル抗体が、通常の単剤の細胞毒性化学療法剤に対して、治療の成功に小さな改善をもたらすにすぎないことを示している。例えば、低悪性度非ホジキンリンパ腫の全再発患者のちょうど半分が、抗ＣＤ２０抗体のリツキシマブに応答する（McLaughlin et al., 1998, J Clin Oncol 16:2825-2833）。臨床患者１６６人の６％が完全な応答を示し、４２％が部分的応答を示し、応答期間の中央値は約１２月であった。転移乳癌処置用の抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体であるトラスツズマブ（Herceptin^{(登録商標)}、Genentechの登録商標）は、もっと低い効力である。総括的応答率は、トラスツズマブを被験患者２２２人に使用して、わずか１５％であり、８人が完全に、２６人が部分的に応答し、応答期間および生存の中央値は９ないし１３月であった（Cobleigh et al., 1999, J Clin Oncol 17:2639-2648）。現在、抗癌療法については、死亡率のいかなる小さな改善であっても、成功と定義される。従って、標的癌細胞を破壊する抗体の能力の増強に対して、重大な要望がある。

抗体の抗腫瘍能力を増強するための有望な手段は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣなどの細胞傷害性エフェクター機能を媒介する能力の増強を介するものである。抗体の抗癌活性のためのＦｃγＲ媒介性エフェクター機能の重要性は、マウスで立証されており（Clynes et al., 1998, Proc Natl Acad Sci U S A 95:652-656; Clynes et al., 2000, Nat Med 6:443-446）、Ｆｃとある種のＦｃγＲ類との間の相互作用の親和性は、細胞をベースとするアッセイにおいて標的細胞傷害と相関する（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740）。さらに、ヒトにおける臨床効力と、彼らのＦｃγＲＩＩＩａの高（Ｖ１５８）または低（Ｆ１５８）親和性多型アロタイプとの間に相関が観察された（Cartron et al., 2002, Blood 99:754-758）。これらのデータを合わせると、ある種のＦｃγＲ類への結合について最適化されたＦｃ領域を有する抗体は、より良好にエフェクター機能を媒介し、それにより患者において癌細胞をより効果的に破壊することが示唆される。活性化受容体と阻害性受容体との間の均衡は、重要な検討事項であり、最適なエフェクター機能は、活性化受容体（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃおよびＦｃγＲＩＩＩａ）に対して増強された親和性を有し、一方阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂには低減された親和性を有するＦｃから生じ得る。さらに、ＦｃγＲ類は、抗原提示細胞による抗原取込およびプロセッシングを媒介できるので、Ｆｃ／ＦｃγＲ親和性の増大は、抗体治療剤の適応免疫反応を誘起する能力も改善し得る。

様々な目標に向けて、Ｆｃの変異誘発研究が実行されてきた。置換は典型的にアラニンにされた（アラニンスキャンと呼ばれる）か、または、配列相同性置換により導かれた（Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）（ＵＳ５,６２４,８２１；ＵＳ５,８８５,５７３；ＰＣＴＷＯ００／４２０７２；ＰＣＴＷＯ９９／５８５７２）。置換の大多数は、ＦｃγＲ類との結合を低減させるか、または失わせる。しかしながら、より高いＦｃγＲ親和性を有するＦｃ変異体の獲得において、いくつかの成果が成された（例えば、ＵＳ５,６２４,８２１およびＰＣＴＷＯ００／４２０７２参照）。例えば、Winter と共同研究者たちは、ヒトの位置２３５のアミノ酸をマウスＩｇＧ２ｂ抗体のものと置換し（グルタミン酸からロイシンへの変異）、それはマウス抗体のヒトＦｃγＲＩへの結合を１００倍まで増加させた（Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564）（ＵＳ５,６２４,８２１）。Shields らは、アラニンスキャン変異誘発を使用し、ＦｃγＲ結合に重要なＦｃ残基をマッピングし、続いて選択残基を非アラニン変異で置換した（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490）（ＰＣＴＷＯ００／４２０７２）。Ｓ２９８Ａ、Ｅ３３３ＡおよびＫ３３４Ａを含む、この研究で開示された数個の変異は、活性化受容体ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増強と、阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの結合の低減を示す。これらの変異は、組み合わされて、結合の相加的改善を示す二重および三重変異の変異体をもたらした。この研究で開示された最良の変異体は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａ三重変異であり、Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合において約１.７倍の増加、ＦｃγＲＩＩｂへの結合において５倍の減少、そしてＡＤＣＣにおいて２.１倍の増強を伴った。

ＦｃのＦｃγＲへの親和性の増強は、工学処理細胞株または変異体細胞株において抗体を発現させることにより生成させた、工学処理された糖形態を使用しても達成された（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473）。このアプローチは、抗体のＦｃγＲＩＩＩａへの結合能力およびＡＤＣＣの媒介能力の実質的な増強を生じさせた。大スケールの産生条件下での発現系統の増殖効率などの実用上の制限はあるものの、Ｆｃ／ＦｃγＲ親和性とエフェクター機能の増強のためのこのアプローチは有望である。実際に、この代替糖形態の技法を本発明のＦｃ変異体と組み合わせることは、最適なエフェクター機能に相加的または共同的な効果をもたらし得る。

より大きいエフェクター機能への要望があるが、いくつかの抗体治療剤のためには、低減された、または除去されたエフェクター機能が求められることがある。これは、その作用メカニズムが遮断または拮抗作用を含むが標的抗原を有する細胞の殺傷を含まない治療用抗体の場合に、よくあることである。これらの場合、標的細胞の枯渇は望ましくなく、副作用と考えることができる。例えば、Ｔ細胞上のＣＤ４受容体を遮断する抗ＣＤ４抗体の能力は、これらを効果的な抗炎症剤にしているが、それらのＦｃγＲ受容体を募らせる能力は、標的細胞に対する免疫攻撃も導き、Ｔ細胞の枯渇をもたらす（Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933）。エフェクター機能は、放射性コンジュゲート（radioconjugate）と呼ばれる放射性標識抗体、および免疫毒と呼ばれる毒素に結合させた抗体についても問題であり得る。これらの薬物は、癌細胞の破壊に使用できるが、ＦｃのＦｃγＲ類との相互作用を介して免疫細胞を募らせることは、致死的荷重（放射能または毒素）の近傍に健康な免疫細胞を運び込み、標的癌細胞と共に正常リンパ組織の枯渇をもたらす（Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; White et al., 2001, Annu Rev Med 52:125-145）。この問題は、補体またはエフェクター細胞を弱く募らせるＩｇＧアイソタイプ、例えばＩｇＧ２およびＩｇＧ４、の使用により、回避できる可能性がある。代替的解決法は、結合を低減させるか、または失わせるＦｃ変異体の開発である（Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604）（ＵＳ６,１９４,５５１；ＵＳ５,８８５,５７３；ＰＣＴＷＯ９９／５８５７２）。エフェクター機能の低減または除去のために重要な検討事項は、他の重要な抗体の特性が乱されないことである。Ｆｃ変異体は、ＦｃγＲ類および／またはＣ１ｑへの結合を失うだけでなく、抗体の安定性、溶解性および構造的完全性（integrity）、並びにＦｃＲｎおよびプロテインＡおよびＧなどの他の重要なＦｃリガンドとの相互作用能を維持するように工学処理されるべきである。

本発明は、抗体のもう１つの主要な短所、即ち、それらの厳しい製造要件を取り扱う（Garber, 2001, Nat Biotechnol 19:184-185; Dove, 2002, Nat Biotechnol 20:777-779）。抗体は哺乳動物細胞で発現させなければならず、現在市販されている抗体は、他の要件が厳しいバイオ治療剤（biotherapeutic）と共に、実質的に全ての利用可能な製造許容量を使い尽くしている。数百の生物剤（biologic）が開発中であり、その大部分が抗体であるので、より効率的かつ安価な製造方法に対する緊急の要望がある。不十分な抗体製造許容量の下流での影響は３倍である。第１に、それは商品のコストを製造者に対して劇的に高め、コストは患者に渡される。第２に、それは承認された抗体製品の産業的製造を妨げ、需要の高い治療剤の患者への入手可能性を制限する。最後に、臨床試験はまだ収益のない大量のタンパク質を必要とするので、不十分な供給は、成長している抗体パイプラインの市場への前進を妨げる。

代替的製造方法が、この問題の解消を試みて探究されてきた。遺伝子組換え植物および動物は、潜在的に安価かつ高許容量の製造システムとして追求されている（Chadd et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:188-194）。しかしながら、そのような発現系は、ヒトの糖タンパク質と有意に異なるグリコシレーションパターンを生じさせ得る。これは、エフェクター機能の低減、あるいは喪失さえもたらし得る。なぜなら、上記で論じたように、炭水化物構造は、ＦｃγＲおよび補体の結合に有意に衝撃を与え得るからである。非ヒト糖形態に伴う可能性のあるより大きい問題は、免疫原性であり得る；炭水化物は、免疫系にとって抗原性の鍵となる供給源であり、非ヒト糖形態の存在は、その治療剤を中和する抗体を誘起する重大な機会を有し、悪くすると有害な免疫反応を引き起こす。従って、遺伝子組換え植物および動物により産生される抗体の効力と安全性は、不確かなままである。細菌発現は、抗体製造問題に対するもう一つの魅力的な解決法である。細菌、例えば大腸菌（E. coli）での発現は、コスト上有効かつ高許容量のタンパク質製造方法を提供する。抗体などの複雑なタンパク質には、細菌発現に対する数々の障害があり、これには、折り畳み、これらの複雑な分子の会合、適正なジスルフィド形成、並びに、細菌で発現されたタンパク質はグリコシレーションされないので、グリコシレーションの非存在下での溶解性、安定性および機能性が含まれる。抗原に結合する完全長非グリコシル化抗体は、大腸菌で成功裏に発現され（Simmons et al., 2002, J Immunol Methods 263:133-147）、従って、真核生物のシャペロン機構がなくても、細菌で発現された抗体の折り畳み、会合および適切なジスルフィド形成は可能である。しかしながら、細菌発現抗体の治療剤としての最終的な利用性は、エフェクター機能の欠如をもたらし、乏しい安定性と溶解性をもたらし得るグリコシレーションの欠如により、妨げられたままである。このことは、臨床使用に求められる長期間用の高濃度の製剤に関して、さらに問題になると思われる。

好都合な溶解特性およびエフェクター機能媒介能力を有する非グリコシル化Ｆｃは、上記の代替的製造方法を大いに可能にするであろう。非グリコシル化Ｆｃの構造的および機能的短所を克服することにより、細菌並びに遺伝子組換え植物および動物において、免疫原性のリスクを低減させて、そして癌などの細胞傷害作用が望まれる臨床適用のためのエフェクター機能をもたせて、抗体を製造することができる。本発明は、エフェクター機能を有する安定な可溶性Ｆｃ変異体を開発するためのタンパク質工学処理方法の利用に関する。現在、そのようなＦｃ変異体は、当分野に存在しない。

まとめると、治療特性が増強された抗体への要望がある。最適化または増強されたＦｃ変異体の工学処理は、この要望をかなえる有望なアプローチである。所望の特性を有するＦｃ変異体の工学処理に対する実質的な障害は、抗体の不十分な産生とスクリーニング方法と共に、膨大な数の可能性からどのアミノ酸修飾が所望の目標を達成するかを予測することの困難さである。先行技術の不完全な成功の根源的理由の１つは、これまでのＦｃ工学処理へのアプローチが、アラニンスキャンや異なる発現系統を使用する糖形成の産生などのいちかばちかの方法を含むことであった。これらの研究では、成されたＦｃ修飾は、好都合な特性を有する変異体を得ることを期待して、完全または部分的にランダムであった。本発明は、様々な工学処理方法を提供する。その多くは、より洗練された効率的な技法であり、所望の特性について最適化されたＦｃ変異体を開発するために、これらの障害を克服するのに使用し得る。記載する工学処理方法は、Ｆｃ修飾を先導する設計戦略、王都合なＦｃ変異体を設計するためのコンピューター処理スクリーニング方法、実験的調査用に有望な変異体を決定するためのライブラリー生成アプローチ、および好都合な特性を有するＦｃ変異体を決定するための一群の実験的産生およびスクリーニング方法を提供する。

本発明は、数々の治療関連特性について最適化されたＦｃ変異体を提供する。

本発明の目的は、そこで最適化Ｆｃ変異体の生成のためにアミノ酸修飾をなし得る、新規Ｆｃ位置を提供することである。当該Ｆｃ位置には、２４０、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６６、２９９、３１３、３２５、３２８および３３２が含まれる。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。本発明は、最適化Ｆｃ変異体を生成させるための、当該新規Ｆｃ位置のいずれかにおける任意のアミノ酸修飾に関する。

本発明のさらなる目的は、コンピューター処理によりスクリーニングされたＦｃ変異体を提供することである。コンピューター処理によりスクリーニングされたＦｃ変異体は、本明細書に記載のコンピューター処理スクリーニング計算により、所望の特性について最適化されている可能性がランダムよりも有意に高いと予想されたものである。このようにして、コンピューター処理スクリーニングは、実験的スクリーニングの前座または代理として役立ち、従って当該コンピューター処理によりスクリーニングされたＦｃ変異体は、新規であると考えられる。

本発明のさらなる目的は、１またはそれ以上の本明細書に記載の実験方法を使用して特徴解析されたＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０および３３２。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される少なくとも１つの置換を含む；Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ｉ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｗ３１３Ｆ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２ＹおよびＩ３３２Ａ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される；Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｗ３１３Ｆ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｔ２９９Ｉ、Ａ３２７Ｎ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｌ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｔ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｉ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｔ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ａ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２Ｙ、Ｉ３３２Ａ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｖ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｉ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｌ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｆ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｑ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｆ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｔ２９９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｎ２９７Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。

本発明のさらなる目的は、１またはそれ以上のＦｃγＲ類により高い親和性で結合するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの１倍より高いＦｃγＲへの親和性を有する。別の実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの５倍より高いＦｃγＲへの親和性を有する。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの５倍ないし３００倍高いＦｃγＲへの親和性を有する。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２３４、２３５、２３９、２４０、２４３、２６４、２６６、３２８、３３０、３３２および３２５。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２ＱおよびＮ３２５Ｔ、ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される；Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｎ３２５Ｔ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。

本発明のさらなる目的は、１：１より大きいＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比を有するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、１１：１より大きいＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比を有する。好ましい実施態様では、１１：１ないし８６：１のＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比を有する。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２３４、２３５、２３９、２４０、２６４、２９６、３３０およびＩ３３２。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｙ、Ｙ２９６Ｑ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２ＤおよびＩ３３２Ｅ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される：Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｉ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。

本発明のさらなる目的は、エフェクター細胞の存在下で、より効果的にエフェクター機能を媒介するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドにより媒介されるものよりも大きいＡＤＣＣを媒介する。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドにより媒介されるものの５倍よりも大きいＡＤＣＣを媒介する。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドにより媒介されるものよりも５倍ないし５０倍大きいＡＤＣＣを媒介する。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２３４、２３５、２３９、２４０、２４３、２６４、２６６、３２８、３３０、３３２および３２５、ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２４０Ｍ、Ｆ２４３Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｙ、Ｖ２６６Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｉ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｄ、Ｌ３２８Ｖ、Ｌ３２８Ｔ、Ａ３３０Ｙ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｉ、Ｉ３３２Ｄ、Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２ＱおよびＮ３２５Ｔ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される：Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６４Ｉ、Ｌ３２８Ｍ、Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｍ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ、Ａ３３０Ｙ、Ｉ３３２Ｄ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２４０Ｉ、Ｖ２６６Ｉ、Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｄ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｄ、Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ２３４Ｅ、Ｌ２３４Ｙ、Ｌ２３４Ｉ、Ｌ２３５Ｄ、Ｌ２３５Ｓ、Ｌ２３５Ｙ、Ｌ２３５Ｉ、Ｓ２３９Ｔ、Ｖ２４０Ｍ、Ｖ２６４Ｙ、Ａ３３０Ｉ、Ｎ３２５Ｔ、Ｌ３２８Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｖ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｔ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｑ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｎ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｖ２６４Ｉ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。

本発明のさらなる目的は、１またはそれ以上のＦｃγＲ類と、より弱い親和性で結合するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０および３３２。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置でアミノ酸置換を含む：Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３ＬＦ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｗ３１３Ｆ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ｌ３２８Ｍ、３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２ＹおよびＩ３３２Ａ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される：Ｖ２６４Ｌ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｗ３１３Ｆ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｔ２９９Ｉ、Ａ３２７Ｎ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｌ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６３Ｉ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ａ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２ＹおよびＩ３３２Ａ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。

本発明のさらなる目的は、エフェクター細胞の存在下で、より低い効力でＡＤＣＣを媒介するＦｃ変異体を提供することである。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２３４、２３５、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２７、３２８、３２９、３３０および３３２。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｅ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｑ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２４０Ｔ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４１Ｒ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４３Ｙ、Ｆ２４３Ｒ、Ｆ２４３Ｑ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｖ２６２Ｉ、Ｖ２６２Ａ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６２Ｅ、Ｖ２６３Ｉ、Ｖ２６３Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｌ、Ｖ２６４Ｉ、Ｖ２６４Ｗ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｒ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｄ２６５Ｑ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｆ、Ｄ２６５Ｖ、Ｄ２６５Ｉ、Ｄ２６５Ｌ、Ｄ２６５Ｈ、Ｄ２６５Ｔ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｓ２６７Ｑ、Ｓ２６７Ｌ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ｙ２９６Ｈ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｅ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｉ、Ｔ２９９Ｌ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｔ２９９Ｈ、Ｔ２９９Ｆ、Ｔ２９９Ｅ、Ｗ３１３Ｆ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ａ３２７Ｎ、Ａ３２７Ｌ、Ｌ３２８Ｍ、３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｎ、Ｌ３２８Ｑ、Ｌ３２８Ｆ、Ｌ３２８Ｈ、Ｌ３２８Ａ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２ＹおよびＩ３３２Ａ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される：Ｖ２６４Ｌ、Ｆ２４１Ｗ、Ｆ２４１Ｌ、Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４３Ｌ、Ｆ２４１Ｌ／Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｉ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ、Ｆ２４１Ｗ／Ｆ２４３Ｗ／Ｖ２６２Ａ／Ｖ２６４Ａ、Ｆ２４１Ｌ／Ｖ２６２Ｉ、Ｆ２４３Ｌ／Ｖ２６２Ｉ／Ｖ２６４Ｗ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｌ３２８Ｍ、Ｌ３２８Ｅ、Ｌ３２８Ｆ、Ｐ２４４Ｈ、Ｐ２４５Ａ、Ｐ２４７Ｖ、Ｗ３１３Ｆ、Ｐ２４４Ｈ／Ｐ２４５Ａ／Ｐ２４７Ｖ、Ｐ２４７Ｇ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ／Ｉ３３２Ｅ、Ｄ２６５Ｇ、Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｇ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｎ、Ｓ２３９Ｅ／Ｄ２６５Ｑ、Ｙ２９６Ｅ、Ｙ２９６Ｑ、Ｔ２９９Ｉ、Ａ３２７Ｎ、Ｓ２６７Ｑ／Ａ３２７Ｓ、Ｓ２６７Ｌ／Ａ３２７Ｓ、Ａ３２７Ｌ、Ｐ３２９Ｆ、Ａ３３０Ｌ、Ｎ２９７Ｓ、Ｎ２９７Ｄ、Ｎ２９７Ｓ／Ｉ３３２Ｅ、Ｉ３３２Ｎ、Ｉ３３２Ｑ、Ｖ２６４Ｆ、Ｖ２６３Ｉ、Ｔ２９９Ａ、Ｔ２９９Ｓ、Ｔ２９９Ｖ、Ｎ３２５Ｑ、Ｎ３２５Ｌ、Ｎ３２５Ｉ、Ｓ２３９Ｎ、Ｓ２３９Ｆ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｎ／Ｉ３３２Ｑ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｎ、Ｓ２３９Ｑ／Ｉ３３２Ｑ、Ｙ２９６Ｄ、Ｙ２９６Ｎ、Ｌ２３４Ｄ、Ｌ２３４Ｎ、Ｌ２３４Ｑ、Ｌ２３４Ｔ、Ｌ２３４Ｈ、Ｌ２３４Ｖ、Ｌ２３４Ｆ、Ｌ２３５Ｎ、Ｌ２３５Ｑ、Ｌ２３５Ｔ、Ｌ２３５Ｈ、Ｌ２３５Ｖ、Ｌ２３５Ｆ、Ｓ２３９Ｈ、Ｓ２３９Ｙ、Ｖ２４０Ａ、Ｖ２６３Ｔ、Ｖ２６３Ｍ、Ｖ２６４Ｍ、Ｖ２６６Ａ、Ｖ２６６Ｔ、Ｖ２６６Ｍ、Ｅ２６９Ｈ、Ｅ２６９Ｙ、Ｅ２６９Ｆ、Ｅ２６９Ｒ、Ｙ２９６Ｓ、Ｙ２９６Ｔ、Ｙ２９６Ｌ、Ｙ２９６Ｉ、Ａ２９８Ｈ、Ｔ２９９Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ａ３３０Ｆ、Ａ３３０Ｒ、Ａ３３０Ｈ、Ｎ３２５Ｄ、Ｎ３２５Ｅ、Ｎ３２５Ａ、Ｎ３２５Ｖ、Ｎ３２５Ｈ、Ｌ３２８Ｅ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｎ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｑ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ｈ／Ｉ３３２Ｅ、Ｌ３２８Ａ、Ｉ３３２Ｔ、Ｉ３３２Ｈ、Ｉ３３２ＹおよびＩ３３２Ａ、ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。

本発明のさらなる目的は、親Ｆｃポリペプチドの非グリコシル化形態と比較して改善された機能および／または溶解特性を有するＦｃ変異体を提供することである。ここで、改善された機能性にはＦｃリガンドへの結合親和性が含まれるが、これに限定されるものではない。ここで、改善された溶解特性には、安定性および溶解性が含まれるが、これらに限定されるものではない。ある実施態様では、当該非グリコシル化Ｆｃ変異体は、グリコシル化親Ｆｃポリペプチドに匹敵するか、またはそれより良好な親和性で、ＦｃγＲに結合する。別の実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドのグリコシル化形態の０.４倍以内の親和性でＦｃγＲに結合する。ある実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される位置で、少なくとも１つのアミノ酸置換を含む：２３９、２４１、２４３、２６２、２６４、２６５、２９６、２９７、３３０および３３２。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択されるアミノ酸置換を含む：Ｓ２３９Ｄ、Ｓ２３９Ｅ、Ｆ２４１Ｙ、Ｆ２４３Ｙ、Ｖ２６２Ｔ、Ｖ２６４Ｔ、Ｖ２６４Ｅ、Ｄ２６５Ｙ、Ｄ２６５Ｈ、Ｙ２９６Ｎ、Ｎ２９７Ｄ、Ａ３３０ＹおよびＩ３３２Ｅ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。最も好ましい実施態様では、当該Ｆｃ変異体は、以下からなる群から選択される：Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｆ２４１Ｙ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｔ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｙ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｄ２６５Ｈ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４Ｅ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｙ２９６Ｎ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＮ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ。ここで、Ｆｃ領域における残基の番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスのものである。

本発明はまた、最適化Ｆｃ変異体の工学処理方法を提供する。本発明の１つの目的は、Ｆｃ最適化を先導するために使用し得る設計戦略を提供することである。本発明のさらなる目的は、Ｆｃ変異体の設計に使用し得るコンピューター処理スクリーニング方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、実験的試験用のライブラリーの生成方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、最適化Ｆｃ変異体を得るための実験的製造およびスクリーニング方法を提供することである。

本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体をコードする単離された核酸を提供する。本発明は、場合により制御配列に機能し得るように連結された当該核酸を含むベクターを提供する。本発明は、このベクターを含有する宿主細胞、およびＦｃ変異体を製造し、場合により回収する方法を提供する。

本発明は、本明細書に開示のＦｃ変異体を含む新規抗体およびＦｃ融合体を提供する。当該新規抗体およびＦｃ融合体は、治療用製品に用途を見出し得る。

本発明は、本明細書に記載のＦｃ変異体を含む抗体およびＦｃ融合体、並びに生理的または医薬的に許容し得る担体または希釈剤を含む組成物を提供する。

本発明は、本明細書に開示のＦｃ変異体を含む抗体およびＦｃ融合体の、治療および診断的使用を企図している。

図面の簡単な説明
図１。抗体の構造および機能。示されているのは、ｐｄｂ受託コード１ＣＥ１(James et al., 1999, J Mol Biol 289:293-301）由来のヒト化Ｆａｂ構造、およびｐｄｂ受託コード１ＤＮ２（DeLano et al., 2000, Science 287:1279-1283）由来のヒトＩｇＧ１Ｆｃ構造を使用してモデル化された、完全長ヒトＩｇＧ１抗体のモデルである。ＦａｂとＦｃ領域を連結する可撓性ヒンジは示していない。ＩｇＧ１は、ヘテロ二量体のホモ二量体であり、２本の軽鎖および２本の重鎖からなる。抗体を構成するＩｇドメインを表示しており、それには軽鎖のＶ_LおよびＣ_L、重鎖のＶ_H、Ｃガンマ１（Ｃγ１）、Ｃガンマ２（Ｃγ２）およびＣガンマ３（Ｃγ３）が含まれる。Ｆｃ領域を表示している。関連タンパク質の結合部位を表示しており、それには可変領域の抗原結合部位、並びにＦｃ領域のＦｃγＲ類、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑおよびプロテインＡおよびＧの結合部位が含まれる。

図２。Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ。Ｆｃを灰色のリボン図として示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色のリボンとして示す。Ｎ２９７炭水化物を黒色の棒として示す。

図３。抗体アレムツズマブ（alemtuzumab）(Campath^{(登録商標)}、Ilex Pharmaceuticals LPの登録商標）重鎖のアミノ酸配列。連続番号を付けた位置（アミノ酸配列の２行上）およびKabat にある通りのＥＵインデックスに従って番号を付けた位置（アミノ酸配列の２行下）を図解している。ＩｇドメインのＶＨ１、Ｃγ１、ヒンジ、Ｃγ２およびＣγ３のおよその始点も、連続番号の上に表示してある。Kabat ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６および３５８を含むがこれらに限定されない数々のＦｃ位置で多型が観察されてきたので、提示した配列と先行技術の配列との間にわずかな差異が存在し得る。

図４。Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ上にマッピングした実験用ライブラリーの残基。Ｆｃを灰色のリボン図として示し、ＦｃγＲＩＩＩｂを黒色のリボンとして示す。実験用ライブラリーの残基を黒色の球形および棒として示す。Ｎ２９７炭水化物を黒色の棒として示す。

図５。Ｆｃ変異体実験用ライブラリーの設計に関連する位置を示すヒトＩｇＧ１のＦｃ配列。配列には、ヒンジ領域、ドメインＣγ２およびドメインＣγ３が含まれる。残基の番号は、Kabat にある通りのＥＵインデックスに従う。実験用ライブラリーに関連する位置に下線を付す。数々のＦｃ位置で多型変異が観察されてきたので、提示した配列と文献中の配列との間にわずかな差異が存在し得る。

図６。２９３Ｔ細胞におけるアレムツズマブのＦｃ変異体および野生型（ＷＴ）タンパク質の発現。アレムツズマブ重鎖遺伝子（ＷＴまたは変異体）を含有するプラスミドを、アレムツズマブ軽鎖遺伝子を含有するプラスミドと共に形質移入した。形質移入５日後に培地を回収した。各形質移入サンプルについて、培地１０ｕｌをウエスタン分析用のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにのせた。ウエスタン用のプローブは、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Jackson Immuno-Research, catalog # 109-035-088）であった。ＷＴ：野生型アレムツズマブ；１−１０：アレムツズマブ変異体。ＨおよびＬは、各々抗体の重鎖および軽鎖を示す。

図７。プロテインＡクロマトグラフィーを使用するアレムツズマブの精製。ＷＴアレムツズマブタンパク質を、２９３Ｔ細胞で発現させ、形質移入５日後に培地を回収した。培地をＰＢＳで１：１に希釈し、プロテインＡ（Pierce, Catalog # 20334）で精製した。Ｏ：精製前の最初のサンプル；ＦＴ：流出物（flow through）；Ｅ：抽出物；Ｃ：濃縮された最終サンプル。左の写真は、単純青色染色（Simple Blue-stained）したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、右は、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用して標識したウエスタンブロットを示す。

図８。脱グリコシル化抗体の精製。アレムツズマブの野生型および変異体を２９３Ｔ細胞で発現させ、プロテインＡクロマトグラフィーで精製した。抗体をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）と共に３７℃で２４時間インキュベートした。各抗体について、偽処理サンプル（−ＰＮＧａｓｅＦ）を平衡して行った。ＷＴ：野生型アレムツズマブ；＃１５、＃１６、＃１７、＃１８、＃２２：各々、アレムツズマブ変異体Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４ＲおよびＩ３３２Ｅ。偽処理サンプルよりも早く泳動するＰＮＧａｓｅＦ処理サンプルは、脱グリコシル化重鎖を表す。

図９。２９３Ｔ細胞から発現されたアレムツズマブは、その抗原に結合する。ＧＳＴに融合させた抗原のＣＤ５２ペプチドを、ＩＰＴＧ誘導下で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に発現させた。非誘導および誘導サンプルの両方をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで流し、ＰＶＤＦ膜に移した。ウエスタン分析のために、Sotec (α-CD52, Sotec）のアレムツズマブ（最終濃度２.５ｎｇ／ｕｌ）または形質移入２９３Ｔ細胞の培地（Campath, Xencor）（最終アレムツズマブ濃度約０.１−０.２ｎｇ／ｕｌ）のいずれかを一次抗体として使用し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧを二次抗体として使用した。Ｍ：予め染色されたマーカー；Ｕ：ＧＳＴ−ＣＤ５２の非誘導サンプル；Ｉ：ＧＳＴ−ＣＤ５２の誘導サンプル。

図１０。ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域の発現と精製。タグを付けたＦｃγＲＩＩＩａを、２９３Ｔ細胞に形質移入し、分泌されたＦｃγＲＩＩＩａを含有する培地を３日後に回収し、親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。１：培地；２：流出物；３：洗浄液；４−８：連続抽出物。単純青色染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびウエスタンの結果を示す。ウエスタンブロットには、膜を抗ＧＳＴ抗体でプローブした。

図１１。実施例２に記載のAlphaScreen^(商標)アッセイにより測定した、実験用ライブラリーから選択されたアレムツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合。競合抗体（Ｆｃ変異体またはＷＴアレムツズマブ）の存在下で、発光シグナルの減少として、特徴的な阻害曲線が観察された。リン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）単独を負の対照として使用した。これらのデータは、競合抗体の低濃度および高濃度で各々もたらされる最大および最小発光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を使用して、一部位競合モデルへのデータのフィット（fit）を表す。これらのフィットは、各抗体のＩＣ５０を提供する。これをＷＴおよびＳ２３９Ｄについて破線で例示説明する。

図１２。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合を示す AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図１３。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶａｌ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図１４。リツキシマブに関して、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図１５。トラスツズマブに関して、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図１６ａ−１６ｂ。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ（図１６ａ）およびヒトＦｃγＲＩＩｂ（図１６ｂ）への結合を比較する AlphaScreen^(商標) アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図１７。トラスツズマブに関して、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定する AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。

図１８。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＲ１３１ＦｃγＲＩＩａへの結合を示す AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。

図１９ａおよび１９ｂ。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図２０。非グリコシル化アレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図２１。グリコシル化（黒色の記号、実線）および脱グリコシル化（白色の記号、破線）状態の選択されたアレムツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの結合を比較する AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。

図２２ａ−２２ｂ。選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８（図２２ａ）およびＦ１５８（図２２ｂ）アロタイプへの結合を示す AlphaScreen^(商標)アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図２３ａ−２３ｄ。図２３ａおよび２３ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ（図２３ａ）およびＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ（図２３ｂ）への結合から、ＳＰＲのＫｄとAlphaScreen^(商標)のＩＣ５０との間の相関を示す。図２３ｃおよび２３ｄは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ（図２３ｃ）およびＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ（図２３ｄ）への結合について、ＷＴに対するＳＰＲおよびAlphaScreen^(商標)の改善倍率間の相関を示す。結合のデータを表６２に提示する。データの間の線は、データの線形フィットを表し、ｒ²値は、これらのフィットの有意さを示す。

図２４ａ−２４ｂ。アレムツズマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。DELFIA^{(登録商標)} EuTDA ベースの細胞傷害作用アッセイ（Perkin Elmer, MA）を使用して、実施例７に記載の通り、ＤｏＨＨ−２リンパ腫標的細胞および５０倍過剰のヒトＰＢＭＣを使用して、ＡＤＣＣを測定した。図２４ａは、１０ｎｇ／ｍｌの明記したアレムツズマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。ＰＢＭＣの棒は、抗体の非存在下における細胞傷害作用の基底レベルを示す。図２４ｂは、明記したアレムツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、各々抗体の低濃度および高濃度でのベースラインによりもたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量反応モデルへのデータのフィットを表す。

図２５ａ−２５ｂ。リツキシマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。DELFIA^{(登録商標)} EuTDA ベースの細胞傷害作用アッセイを使用して、実施例７に記載の通り、ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞および５０倍過剰のヒトＰＢＭＣを使用して、ＡＤＣＣを測定した。図２５ａは、１ｎｇ／ｍｌの明記したリツキシマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。ＰＢＭＣの棒は、抗体の非存在下における細胞傷害作用の基底レベルを示す。図２５ｂは、明記したリツキシマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、各々抗体の低濃度および高濃度でのベースラインによりもたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量応答モデルへのデータのフィットを表す。

図２６ａ−２６ｃ。トラスツズマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイ。DELFIA^{(登録商標)} EuTDA ベースの細胞傷害作用アッセイを使用して、実施例７に記載の通り、ＢＴ４７４およびＳｋ−Ｂｒ−３乳癌腫標的細胞および５０倍過剰のヒトＰＢＭＣを使用して、ＡＤＣＣを測定した。図２６ａは、１ｎｇ／ｍｌの明記したトラスツズマブ抗体について未加工の蛍光データを示す棒グラフである。ＰＢＭＣの棒は、抗体の非存在下における細胞傷害作用の基底レベルを示す。図２６ｂおよび２６ｃは、明記したトラスツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示し、各々抗体の低濃度および高濃度でのベースラインによりもたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量応答モデルへのデータのフィットを表す。

図２７ａ−２７ｂ。選択されたＦｃ変異体が補体の結合および活性化を媒介する能力。図２７ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＣ１ｑへの結合を測定する AlphaScreen^(商標) アッセイを示す。データは、競合抗体の低濃度および高濃度でのベースラインにより各々もたらされる最大および最小発光シグナルに対して標準化した。曲線は、非線形回帰を使用して、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。図２７ｂは、選択されたリツキシマブＦｃ変異体がＣＤＣを媒介する能力を測定する細胞をベースとするアッセイを示す。ＣＤＣアッセイは、Ｆｃ変異体およびＷＴリツキシマブによりオプソニン化されたＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞のヒト血清補体による溶解をモニターするのに、Amar Blue を使用して実施した（Quidel, San Diego, CA）。明記したリツキシマブ抗体について、抗体濃度に対する補体媒介溶解の用量依存が示され、これは抗体の低濃度および高濃度でのベースラインにより各々もたらされる最小および最大蛍光シグナルに対して標準化したものである。曲線は、非線形回帰を使用して、Ｓ字用量反応モデルへのデータのフィットを表す。

図２８。実施例９に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の細菌のプロテインＡへの結合を測定するAlphaScreen^(商標) アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図２９。実施例１０に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩへの結合を測定するAlphaScreen^(商標) アッセイ。データを標準化した。曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図３０。実施例１１に記載の通りの、２９３ＴおよびＣＨＯ細胞で発現させた選択されたトラスツズマブＦｃ変異体による、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定するAlphaScreen^(商標) アッセイ。データを標準化し、曲線は、一部位競合モデルへのデータのフィットを表す。ＰＢＳを負の対照として使用した。

図３１ａ−３１ｃ。改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列。リツキシマブの軽鎖および重鎖の配列を、図３１ａおよび図３１ｂに各々提示する。これらは、ＵＳ５,７３６,１３７の翻訳された配列３から採用した。図３１ｂ中のＳ２３９、Ｖ２４０、Ｖ２６４Ｉ、Ｎ２９７、Ｓ２９８、Ａ３３０およびＩ３３２を含む関連位置を太字にしてある。図３１ｃは、改善された抗ＣＤ２０抗体重鎖の配列を示し、可変位置を、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₅、Ｘ₆およびＺ₁として太字で示してある。配列の下の表は、これらの位置について可能な置換を提供する。改善された抗ＣＤ２０抗体の配列は、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₅およびＸ₆について可能な置換の群から選択される少なくとも１つの非ＷＴアミノ酸を含む。これらの改善された抗ＣＤ２０抗体の配列はまた、置換Ｚ₁を含んでもよい。これらの位置は、Kabat にある通りのＥＵインデックスに従って番号付けしてあり、従て配列の連続的順序に対応しない。

図１は、抗体の構造および機能を示す。図２は、Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳを示す。図３は、抗体アレムツズマブ重鎖のアミノ酸配列を示す。図４は、Ｆｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ複合体構造１ＩＩＳ上にマッピングした実験用ライブラリーの残基を示す。図５は、Ｆｃ変異体実験用ライブラリーの設計に関連する位置を示すヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列を示す。図６は、２９３Ｔ細胞におけるアレムツズマブのＦｃ変異体および野生型（ＷＴ）タンパク質の発現を示す。図７は、プロテインＡクロマトグラフィーを使用するアレムツズマブの精製を示す。図８は、脱グリコシル化抗体の精製を示す。図９は、２９３Ｔ細胞から発現されたアレムツズマブがその抗原に結合することを示す。図１０は、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域の発現と精製を示す。図１１は、実施例２に記載のAlphaScreen^(商標)アッセイにより測定した、実験用ライブラリーから選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す。図１２は、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合を示すAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図１３は、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶａｌ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示すAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図１４は、リツキシマブに関して、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定するAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図１５は、トラスツズマブに関して、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定するAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図１６ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を比較するAlphaScreen^(商標) アッセイを示す。図１６ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合を比較するAlphaScreen^(商標) アッセイを示す。図１７は、トラスツズマブに関して、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定するAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図１８は、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＲ１３１ＦｃγＲＩＩａへの結合を示す AlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図１９ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示すAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図１９ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示すAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図２０は、非グリコシル化アレムツズマブＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示すAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図２１は、グリコシル化（黒色の記号、実線）および脱グリコシル化（白色の記号、破線）状態の選択されたアレムツズマブＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの結合を比較するAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図２２ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８アロタイプへの結合を示すAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図２２ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の、ヒトＦｃγＲＩＩＩａのＦ１５８アロタイプへの結合を示すAlphaScreen^(商標)アッセイを示す。図２３ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合から、ＳＰＲのＫｄとAlphaScreen^(商標)のＩＣ５０との相関を示す。図２３ｂは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合から、ＳＰＲのＫｄとAlphaScreen^(商標)のＩＣ５０との相関を示す。図２３ｃは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合について、ＳＰＲおよびAlphaScreen^(商標)のＷＴに対する改善倍率間の相関を示す。図２３ｄは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合について、ＳＰＲおよびAlphaScreen^(商標)のＷＴに対する改善倍率間の相関を示す。図２４ａは、アレムツズマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。１０ｎｇ／ｍｌの明記したアレムツズマブ抗体についての未加工の蛍光データを示す棒グラフである。図２４ｂは、アレムツズマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。明記したアレムツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。図２５ａは、リツキシマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。１ｎｇ／ｍｌの明記したリツキシマブ抗体についての未加工の蛍光データを示す棒グラフである。図２５ｂは、リツキシマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。明記したリツキシマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。図２６ａは、トラスツズマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。１ｎｇ／ｍｌの明記したトラスツズマブ抗体についての未加工の蛍光データを示す棒グラフである。図２６ｂは、トラスツズマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。明記したトラスツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。図２６ｃは、トラスツズマブに関する、選択されたＦｃ変異体の細胞ベースのＡＤＣＣアッセイを示す。明記したトラスツズマブ抗体について、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存を示す。図２７ａは、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のＣ１ｑへの結合を測定する AlphaScreen^(商標) アッセイを示す。図２７ｂは、選択されたリツキシマブＦｃ変異体がＣＤＣを媒介する能力を測定する細胞をベースとするアッセイを示す。図２８は、実施例９に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体の細菌のプロテインＡへの結合を測定するAlphaScreen^(商標) アッセイを示す。図２９は、実施例１０に記載の通りの、選択されたアレムツズマブＦｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩへの結合を測定するAlphaScreen^(商標) アッセイを示す。図３０は、実施例１１に記載の通りの、２９３ＴおよびＣＨＯ細胞で発現させた選択されたトラスツズマブＦｃ変異体による、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を測定するAlphaScreen^(商標) アッセイを示す。図３１ａは、改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列を示す。図３１ｂは、改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列を示す。図３１ｃは、改善された抗ＣＤ２０抗体を示す配列を示す。

発明の詳細な説明
本発明がより詳細に理解されるように、数個の定義を以下に記載する。かかる定義は、文法的に均等なものを包含することを意図している。

「ＡＤＣＣ」または「抗体依存性細胞介在性細胞傷害作用」は、本明細書で使用されるとき、ＦｃγＲ類を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いてその標的細胞の溶解を引き起こす、細胞介在性反応を意味する。

「ＡＤＣＰ」または抗体依存性細胞介在性ファゴサイトーシスは、本明細書で使用されるとき、ＦｃγＲ類を発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上に結合した抗体を認識し、続いてその標的細胞のファゴサイトーシスを引き起こす、細胞介在性反応を意味する。

「アミノ酸修飾」は、本明細書で、ポリペプチド配列中のアミノ酸の置換、挿入および／または欠失を意味する。本発明で好ましいアミノ酸修飾は、置換である。^**ＴＴ

「抗体」は、本明細書で、認められている免疫グロブリン遺伝子の全部または一部により実質的にコードされる１個またはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。認められている免疫グロブリン遺伝子には、例えば、ヒトでは、カッパ（κ）、ラムダ（λ）および重鎖の遺伝子座が含まれ、それは、無数の可変領域の遺伝子、並びに各々ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥおよびＩｇＡのアイソタイプをコードする定常領域の遺伝子ミュー（μ）、デルタ（δ）、ガンマ（γ）、シグマ（σ）およびアルファ（α）を一緒に含む。本明細書における抗体は、完全長抗体および抗体フラグメントを含むことを意図しており、任意の生物に由来する天然抗体、工学処理された抗体、または、実験、治療もしくは下記でさらに定義されるような他の目的のために組換え的に生成された抗体に言及し得る。従って、「抗体」には、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の両方が含まれる。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の調製および精製方法は、当分野で知られており、例えば Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988）に記載されている。本明細書で概説する通り、「抗体」は、明確に、本明細書に記載のＦｃ変異体、本明細書に記載のＦｃ変異体フラグメントを含む「完全長」抗体、および本明細書に記載の通り他のタンパク質へのＦｃ変異体融合体を含む。

いくつかの実施態様では、抗体は、中和性もしくは阻害性、または刺激性であり得、好ましい実施態様では、本明細書に記載の通り、刺激活性は、親抗体（例えば、非天然産生変異体を本発明のコンピューター処理分析の出発点として使用する場合）または元の野生型抗体のいずれかと比較した、変異体抗体の受容体への親和性の増加により測定される。従って、「中和」「中和する」「中和性」および文法的に均等なものは、本明細書において、ある場合には抗原への結合（例えば、競合的に）および結合の生物学的効果の回避または減少により、または結合の生物学的効果の減少に至る結合により、抗体の生物学的効果を阻害または縮小することを意味する。

用語「抗体」には、当分野で知られているような、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２、Ｆｃｓなどの抗体フラグメント、または一本鎖抗体（例えばＦｖ）、キメラ抗体などの抗体の他の抗原結合下位配列が含まれ、これらは、完全な抗体の修飾により産生されるか、または組換えＤＮＡ技法を使用して新しく合成されるものである。特に好ましいのは、本明細書に記載のＦｃ変異体である。用語「抗体」はさらに、アゴニストまたはアンタゴニスト抗体であり得るポリクローナル抗体およびｍＡｂを含む。

本発明の抗体は、本明細書で概説する通り、Ｆｃ受容体に特異的に結合する。「特異的に結合する」は、本明細書では、ＬＣ抗体が少なくとも１０^-4−１０^-6Ｍ^-1の範囲、好ましくは１０^-7−１０^-9Ｍ^-1の範囲の結合定数を有することを意味する。
好ましい実施態様では、本発明の抗体は、ヒト化されている。現在のモノクローナル抗体技法を使用して、事実上同定可能ないかなる標的抗原に対しても、ヒト化抗体を産生することができる［Stein, Trends Biotechnol. 15:88-90 (1997）］。非ヒト（例えば、マウス）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有する、免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそれらのフラグメント（Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ（ａｂ'）２または他の抗体の抗原結合下位配列など）のキメラ分子である。ヒト化抗体には、レシピエント（recipient）の相補性決定領域（ＣＤＲ）を形成する残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基により置き換えられているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）が含まれる。ある例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基が、対応する非ヒト残基により置き換えられる。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体にも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域の全部または実質的に全部が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全部または実質的に全部のＦＲ領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１個、そして典型的に２個の可変ドメインの実質的に全部を含む。ヒト化抗体はまた、最適には、典型的にヒト免疫グロブリンのものである免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部も含む［Jones et al., Nature 321:522-525 (1986）; Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988）; and Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992）］。非ヒト抗体をヒト化する方法は当分野で周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１個またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば移入残基（import residue）と呼ばれ、それは典型的に移入可変ドメインから取られたものである。ヒト化は、本質的に、Winter および共同研究者の方法［Jones et al., supra; Riechmann et al., supra; and Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988）］に従って、齧歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列を対応するヒト抗体の配列の代わりに置換することにより実施できる。例えば、ヒトタンパク質Ｃ［O'Connor et al., Protein Eng. 11:321-8 (1998）］、インターロイキン２受容体［Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 86:10029-33 (1989）］、およびヒト上皮成長因子受容体２［Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:4285-9 (1992）］に結合する抗体など、さらなるヒト化マウスモノクローナル抗体の例も当分野で知られている。従って、かかるヒト化抗体はキメラ抗体であり（米国特許第４,８１６,５６７号）、そこでは無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ないものが、対応する非ヒト種由来配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的に、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位由来残基により置換されているヒト抗体である。

好ましい実施態様では、本発明の抗体は、ヒト配列に基づき、故にヒト配列は、ラット、マウスおよびサルの配列などの他の配列に対する「基礎」配列として使用される。一次配列または構造に対する相同性を確立するために、前駆体または親Ｆｃのアミノ酸配列を、本明細書で概説するヒトＦｃ配列と直接比較する。本明細書に記載の１またはそれ以上の相同性アラインメントプログラムを使用して（例えば、種間の保存残基を使用して）配列を整列させた後、アラインメントを維持するために必要な挿入または欠失を可能にし（即ち、任意の欠失および挿入による保存残基の除去を回避する）、ヒトＦｃの一次配列中の特定のアミノ酸と等価な残基を定義する。保存残基のアラインメントは、好ましくは、そのような残基の１００％を保存する。しかしながら、７５％より高いか、またはわずか５０％の保存残基のアラインメントも、等価残基を定義するのに適している（本明細書で「対応する残基」と呼ばれることもある）。

等価な残基は、三次構造がＸ線結晶構造解析により決定されているＦｃフラグメントについて、三次構造のレベルでの相同性を決定することによっても定義し得る。等価な残基は、親または前駆体の特定のアミノ酸残基の２個またはそれ以上の主鎖原子の原子座標（Ｎ対Ｎ、ＣＡ対ＣＡ、Ｃ対ＣおよびＯ対Ｏ）が、アラインメント後に０.１３ｎｍ以内、好ましくは０.１ｎｍ以内であるものとして定義される。アラインメントは、最良のモデルが方向付けられ、位置付けられて、Ｆｃ変異体フラグメントの水素ではないタンパク質の原子の原子座標の最大の重複が得られた後に達成される。

「抗体」の定義内に特に含まれるものは、非グリコシル化（aglycosylated）抗体である。「非グリコシル化抗体」は、本明細書で使用されるとき、Ｆｃ領域の位置２９７で結合する炭水化物を欠く抗体を意味する（番号付けは、Kabat にある通りのＥＵシステムによる）。非グリコシル化抗体は、Ｆｃの炭水化物が例えばキメラ的または酵素的に除去された抗体である脱グリコシル化（deglycosylated）抗体であり得る。あるいは、非グリコシル化抗体は、例えば、グリコシレーションパターンをコードする１個または複数の残基の変異により、または、例えば細菌などのタンパク質に炭水化物を結合させない生物での発現により、Ｆｃの炭水化物なしで発現された抗体である、無グリコシル化（nonglycosylated）または未グリコシル化（unglycosylated）抗体であり得る。

「抗体」の定義内に特に含まれるものは、Ｆｃ変異体部分を含有する完全長抗体である。「完全長抗体」は、本明細書では、可変および定常領域を含む抗体の天然の生物学的な形態を構築する構造を意味する。例えば、ヒトやマウスを含む殆どの哺乳動物では、ＩｇＧクラスの完全長抗体は四量体であり、２本の免疫グロブリン鎖の２個の同一の対からなり、各対は、１本の軽鎖および１本の重鎖を有し、各軽鎖は、免疫グロブリンドメインＶ_LおよびＣ_Lを含み、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶ_H、Ｃγ１、Ｃγ２およびＣγ３を含む。いくつかの哺乳動物では、例えばラクダやラマなどでは、ＩｇＧ抗体は、２本の重鎖のみからなることもあり、各重鎖は、Ｆｃ領域に結合した可変ドメインを含む。「ＩｇＧ」は、本明細書で使用されるとき、認められている免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４が含まれる。マウスでは、このクラスにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３が含まれる。

「アミノ酸」および「アミノ酸本体」は、本明細書で使用されるとき、２０個の天然産生アミノ酸または特定の定義された位置に存在し得る任意の非天然類似体の１つを意味する。「タンパク質」は、本明細書では、少なくとも２個の共有結合したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチドおよびペプチドが含まれる。タンパク質は、天然産生アミノ酸およびペプチド結合、または合成偽ペプチド（peptidomimetic）構造、即ちペプトイドなどの「類似体」（Simon et al., PNAS USA 89(20）:9367 (1992）参照）からなり得る（特にＬＣペプチドを患者に投与しようとする場合）。従って、「アミノ酸」または「ペプチド残基」は、本明細書で使用されるとき、天然産生および合成アミノ酸の両方を意味する。例えば、ホモフェニルアラニン、シトルリンおよびノルロイシンは、本発明のためにアミノ酸とみなされる。「アミノ酸」にはまた、プロリンやヒドロキシプロリンなどのイミノ酸残基も含まれる。側鎖は、（Ｒ）または（Ｓ）配置のどちらでもよい。好ましい実施態様では、アミノ酸は、（Ｓ）またはＬ−配置である。非天然産生側鎖を使用する場合、例えば、インビボでの分解を防止するかまたは遅延させるために、アミノ酸ではない置換基を使用してもよい。

「コンピューター処理スクリーニング方法」は、本明細書では、タンパク質に１またはそれ以上の変異を設計するための、コンピューターを利用して、起こり得るアミノ酸側鎖置換同士の、および／またはタンパク質の残りの部分との相互作用のエネルギーを評価する、いかなる方法をも意味する。当業者には分かるように、エネルギーの評価（エネルギー計算と呼ばれる）は、１またはそれ以上のアミノ酸修飾をスコアリングするいくつかの方法を参照する。当該方法は、物理または化学エネルギーの項を含んでもよく、あるいは、知識、統計、配列をベースとするエネルギーの項などを含んでもよい。コンピューター処理スクリーニング方法を構成する計算は、本明細書で「コンピューター処理スクリーニング計算」と呼ばれる。

「エフェクター機能」は、本明細書で使用されるとき、抗体のＦｃ領域とＦｃ受容体またはリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよびＣＤＣが含まれるがこれらに限定されるわけではない。「エフェクター細胞」は、本明細書で使用されるとき、１またはそれ以上のＦｃ受容体を発現し、１またはそれ以上のエフェクター機能を媒介する免疫系の細胞を意味する。エフェクター細胞には、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、およびγγＴ細胞が含まれるがこれらに限定されるわけではなく、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルが含まれるがこれらに限定されるわけではない、いかなる生物に由来してもよい。「ライブラリー」は、本明細書では、核酸またはアミノ酸配列のリスト、可変位置での核酸またはアミノ酸置換のリスト、ライブラリー配列をコードする核酸を含む物理的ライブラリー、または精製もしくは非精製形態のＦｃ変異体タンパク質を含む物理的ライブラリーを含むが、これらに限定されるわけではない、任意の形態のＦｃ変異体のセットを意味する。

「Ｆｃ」、「Ｆｃ領域」、「ＦＣポリペプチド」などは、本明細書で使用されるとき、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含むポリペプチドを含む、本明細書で定義される通りの抗体を意味する。従って、Ｆｃは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２個の定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３個の定常領域免疫グロブリンドメイン、並びにこれらのドメインのＮ末端の可撓性ヒンジを表す。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含み得る。ＩｇＧについて、図１に例示説明する通り、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、並びにＣガンマ１（Ｃγ１）とＣガンマ２（Ｃγ２）との間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、残基Ｃ２２６またはＰ２３０からカルボキシル末端までを含むと定義される（番号付けは、Kabat にある通りのＥＵインデックスに従う）。Ｆｃは、単離されたこの領域、または、抗体、抗体フラグメントもしくはＦｃ融合体の文脈におけるこの領域を表し得る。Ｆｃは、抗体、Ｆｃ融合体またはＦｃを含むタンパク質もしくはタンパク質ドメインであり得る。特に好ましいのは、Ｆｃの非天然産生変異体であるＦｃ変異体である。

「Ｆｃ融合体」は、本明細書で使用されるとき、１またはそれ以上のポリペプチドがＦｃに機能し得るように連結されているタンパク質を意味する。Ｆｃ融合体は、本明細書では、先行技術において使用される通り（Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200）、用語「イムノアドヘシン（immunoadhesin）」、「Ｉｇ融合体」、「Ｉｇキメラ」および「受容体グロブリン」（ダッシュを伴う場合もある）と同義を意味する。Ｆｃ融合体は、免疫グロブリンのＦｃ領域を、融合体パートナーと組み合わせる。融合体パートナーは、一般に、受容体の標的結合領域、接着分子、リガンド、酵素、またはいくつかの他のタンパク質またはタンパク質ドメインを含むがこれらに限定されるわけではない、いかなるタンパク質でもあり得る。Ｆｃ融合体の非Ｆｃ部分の役割は、標的結合を調整することであり、従って、それは抗体の可変領域に機能的に類似している。

「Ｆｃガンマ受容体」または「ＦｃγＲ」は、本明細書で使用されるとき、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合し、実質的にＦｃγＲ遺伝子にコードされるタンパク質のファミリーのいかなるメンバーをも意味する。ヒトでは、このファミリーには、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂおよびＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１およびＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１およびＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）およびＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；およびアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８およびＦ１５８を含む）およびＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１およびＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）、並びにいかなる未発見のヒトＦｃγＲ類またはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるものではない。ＦｃγＲは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むが、これらに限定されるものではない、いかなる生物由来でもよい。マウスＦｃγＲ類には、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩＩＩ−２（ＣＤ１６−２）、並びにいかなる未発見のマウスＦｃγＲ類またはＦｃγＲアイソフォームまたはアロタイプも含まれるが、これらに限定されるわけではない。

「Ｆｃリガンド」は、本明細書で使用されるとき、抗体のＦｃ領域に結合してＦｃ−リガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくはポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ類、ＦｃγＲ類、ＦｃγＲ類、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、スタフィロコッカスのプロテインＡ、スタフィロコッカスのタンパク質ＧおよびウイルスのＦｃγＲが含まれるが、これらに限定されるわけではない。Ｆｃリガンドには、Ｆｃに結合する未発見の分子も含まれ得る。

「ＩｇＧ」は、本明細書で使用されるとき、認められている免疫グロブリンガンマ遺伝子により実質的にコードされる抗体のクラスに属するポリペプチドを意味する。ヒトでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含む。マウスでは、このクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３を含む。「免疫グロブリン（Ｉｇ）」は、本明細書では、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされる１またはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンには、抗体が含まれるがこれに限定されるわけではない。免疫グロブリンは、完全長抗体、抗体フラグメントおよび個々の免疫グロブリンドメインを含むがこれらに限定されるものではない、数々の構造的形態を有し得る。「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」は、本明細書では、タンパク質構造の当業者に確認されるように、別個の構造体として存在する免疫グロブリンの領域を意味する。Ｉｇドメインは、典型的に、特徴的なβ−サンドイッチ折り畳みトポロジーを有する。抗体のＩｇＧクラスにおける既知のＩｇドメインは、Ｖ_H、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、Ｖ_LおよびＣ_Lである。

「親ポリペプチド」または「前駆体ポリペプチド」（Ｆｃの親または前駆体を含む）は、本明細書で使用されるとき、後に修飾されて変異体を生成するポリペプチドを意味する。当該親ポリペプチドは、天然産生ポリペプチド、または天然産生ポリペプチドの変異体もしくは工学処理変形であり得る。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を表し得る。従って、「親Ｆｃポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、修飾されて変異体を生成する非修飾Ｆｃポリペプチドを意味し、「親抗体」は、本明細書で使用されるとき、修飾されて変異体抗体を生成する非修飾抗体を意味する。

上記概説の通り、Ｆｃ分子のある種の位置を変更できる。「位置」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質配列中の場所を意味する。位置は、連続的に、または、例えばKabat にある通りのＥＵインデックスなどの確立された様式に従って、番号付けし得る。例えば、位置２９７は、ヒト抗体ＩｇＧ１中のある位置である。対応する位置は、上記概説の通りに、一般に他の親配列とのアラインメントを通して決定される。

「残基」は、本明細書で使用されるとき、タンパク質中の位置およびその関連するアミノ酸本体を意味する。例えば、ダラギン（Daragine）２９７（Ｎ２９７とも呼ばれる、Ｎ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の残基である。

「標的抗原」は、本明細書で使用されるとき、所定の抗体の可変領域により特異的に結合される分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質または他の化学的化合物であり得る。

「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原を発現する細胞を意味する。

「可変領域」は、本明細書で使用されるとき、各々カッパ、ラムダおよび重鎖免疫グロブリン遺伝子座をなすＶκ、Ｖλおよび／またはＶ_H遺伝子により実質的にコードされる１またはそれ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。

「変異体ポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親ポリペプチド配列と異なるポリペプチド配列を意味する。変異体ポリペプチドは、ポリペプチド自体、ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を表し得る。好ましくは、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較して少なくとも１つのアミノ酸修飾を、例えば、親ポリペプチドと比較して約１ないし約１０個のアミノ酸修飾を、好ましくは約１個ないし約５個のアミノ酸修飾を有する。変異体ポリペプチド配列は、本明細書では、親ポリペプチド配列と、好ましくは少なくとも約８０％の相同性を、最も好ましくは少なくとも約９０％の相同性を、より好ましくは少なくとも約９５％の相同性を有する。従って、「Ｆｃ変異体」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも１つのアミノ酸修飾のために親Ｆｃ配列と異なるＦｃ配列を意味する。Ｆｃ変異体は、１個のＦｃ領域を包含するだけでもよく、または抗体、Ｆｃ融合体または実質的にＦｃにコードされる他のポリペプチドに関して存在してもよい。Ｆｃ変異体は、Ｆｃポリペプチド自体、Ｆｃ変異体ポリペプチドを含む組成物、またはそれをコードするアミノ酸配列を表し得る。

本発明において論じられるすべての位置について、免疫グロブリン重鎖の番号付けは、ＥＵインデックス（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Svice, National Institutes of Health, Bethesda）に従う。「Kabat にある通りのＥＵインデックス」は、このヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基の番号付けを表す。

本発明のＦｃ変異体は、様々な特性について最適化され得る。最適化され得る特性には、増強または低減されたＦｃγＲへの親和性が含まれるがこれに限定されるわけではない。好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、ヒト活性化ＦｃγＲ、好ましくはＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂ、最も好ましくはＦｃγＲＩＩＩａへの増強された親和性を有するように最適化される。別の好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、ヒト阻害性受容体ＦｃγＲＩＩｂへの低減された親和性を有するように最適化される。これらの好ましい実施態様は、増強されたヒトにおける治療特性、例えば、増強されたエフェクター機能およびより高い抗癌能力を有する抗体およびＦｃ融合体をもたらすと期待される。別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩｃ、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂを含むがこれらに限定されるものではないヒトＦｃγＲへの、低減または除去された親和性を有するように最適化される。これらの実施態様は、増強されたヒトにおける治療特性、例えば、低減されたエフェクター機能および低減された毒性を有する抗体およびＦｃ融合体をもたらすと期待される。好ましい実施態様は、ヒトＦｃγＲに対するＦｃ結合の最適化を含むが、しかしながら、別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、マウス、ラット、ウサギおよびサルを含むがこれらに限定されるものではない非ヒト生物由来のＦｃγＲ類に対して、増強または低減された親和性を有する。非ヒトＦｃγＲへの結合について最適化されたＦｃ変異体は、実験に用途を見出し得る。例えば、マウスモデルは様々な疾患について入手可能であり、所定の薬物候補の効力、毒性および薬物動態の試験を可能にする。当分野で知られているように、癌細胞をマウスに移植または注射して、ヒトの癌を模倣することができる（異種移植と呼ばれる方法）。１またはそれ以上のマウスＦｃγＲ類について最適化されたＦｃ変異体を含む抗体またはＦｃ融合体の試験は、抗体またはＦｃ融合体の効力、その作用メカニズムなどに関して、価値ある情報を提供し得る。本発明のＦｃ変異体は、非グリコシル化形態での増強された機能性および／または溶解特性のためにも最適化し得る。好ましい実施態様では、本発明の非グリコシル化Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの非グリコシル化形態よりも高い親和性でＦｃリガンドに結合する。当該Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ類、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎおよびプロテインＡおよびＧが含まれるがこれらに限定されるわけではなく、ヒト、マウス、ラット、ウサギまたはサル、好ましくはヒトを含むがこれらに限定されるものではない、いかなる供給源由来であってもよい。別の好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、親Ｆｃポリペプチドの非グリコシル化形態よりも安定および／または可溶性であるように最適化される。上述の最適化特性のいずれかを発揮するように工学処理された、または予想されたＦｃ変異体は、本明細書で「最適化Ｆｃ変異体」と呼ばれる。

本発明のＦｃ変異体は、それ自体広範囲の供給源に由来する親Ｆｃポリペプチドに由来し得る。親Ｆｃポリペプチドは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、サル、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトおよびマウスを含むがこれらに限定されるものではない、任意の生物由来の１またはそれ以上のＦｃ遺伝子により実質的にコードされ得る。好ましい実施態様では、親Ｆｃポリペプチドは、抗体を構成し、これは親抗体と呼ばれる。親抗体は、完全にヒトのものであってもよく、これは、例えば遺伝子組換えマウス（Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458）、または選択方法と組み合わせてヒト抗体ライブラリー（Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9:102-108）を使用して得られる。親抗体は、天然産生である必要はない。例えば、親抗体は、キメラ抗体およびヒト化抗体（Clark, 2000, Immunol Today 21:397-402）を含むがこれらに限定されるものではない、工学処理された抗体であってもよい。親抗体は、１またはそれ以上の天然抗体遺伝子により実質的にコードされる、工学処理された抗体変異体であり得る。ある実施態様では、親抗体は、当分野で知られているように、親和性成熟化したものである。あるいは、抗体は、例えば２００３年３月３日に出願されたＵＳＳＮ１０／３３９７８８に記載されているように、いくつかの他のやり方で修飾されたものである。

本発明のＦｃ変異体は、抗体クラスのいずれかに属する免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされ得る。好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む抗体のＩｇＧクラスに属する配列を含む抗体またはＦｃ融合体において用途を見出す。別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、抗体のＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１およびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭクラスに属する配列を含む抗体またはＦｃ融合体において用途を見出す。本発明のＦｃ変異体は、１より多いタンパク質鎖を含み得る。つまり、本発明は、モノマーまたはホモもしくはヘテロオリゴマーを含むオリゴマーである抗体またはＦｃ融合体において用途を見出す。

本発明のＦｃ変異体は、エフェクター機能を変更する修飾を含むがこれに限定されるものではない、他のＦｃ修飾と組み合わせてもよい。そのような組合せは、抗体またはＦｃ融合体に、相加的、共同的または新規の特性をもたらし得る。ある実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、他の既知のＦｃ変異体と組み合わせられ得る（Duncan et al., 1988, Nature 332:563-564; Lund et al., 1991, J Immunol 147:2657-2662; Lund et al., 1992, Mol Immunol 29:53-59; Alegre et al., 1994, Transplantation 57:1537-1543; Hutchins et al., 1995, Proc Natl Acad Sci U S A 92:11980-11984; Jefferis et al., 1995, Immunol Lett 44:111-117; Lund et al., 1995, Faseb J 9:115-119; Jefferis et al., 1996, Immunol Lett 54:101-104; Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969; Armour et al., 1999, Eur J Immunol 29:2613-2624; Idusogie et al., 2000, J Immunol 164:4178-4184; Reddy et al., 2000, J Immunol 164:1925-1933; Xu et al., 2000, Cell Immunol 200:16-26; Idusogie et al., 2001, J Immunol 166:2571-2575; Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604; Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65; Presta et al., 2002, Biochem Soc Trans 30:487-490）（ＵＳ５,６２４,８２１；ＵＳ５,８８５,５７３；ＵＳ６,１９４,５５１；ＰＣＴＷＯ００／４２０７２；ＰＣＴＷＯ９９／５８５７２）。別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、１またはそれ以上の工学処理された糖形態を含む抗体またはＦｃ融合体に導入される。「工学処理された糖形態」は、本明細書で使用されるとき、Ｆｃポリペプチドに共有結合している炭水化物組成であって、当該炭水化物組成が親Ｆｃポリペプチドのものと化学的に異なるものを意味する。工学処理された糖形態は、エフェクター機能の増強または低減を含むがこれらに限定されるものではない、様々な目的に有用であり得る。工学処理された糖形態は、任意の方法で、例えば、工学処理または変異体発現系統の使用により、１またはそれ以上の酵素、例えばβ１−４−Ｎ−アセチルグルコサミントランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）との共発現により、Ｆｃポリペプチドを様々な生物または様々な生物由来の細胞株で発現させることにより、またはＦｃポリペプチドが発現された後に炭水化物（複数も可）を修飾することにより、生成させ得る。工学処理された糖形態の生成方法は当分野で知られており、(Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180; Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294; Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740; Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473) ＵＳ６,６０２,６８４；ＵＳＳＮ１０／２７７,３７０；ＵＳＳＮ１０／１１３,９２９；ＰＣＴＷＯ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴＷＯ０１／２９２４６Ａ１；ＰＣＴＷＯ０２／３１１４０Ａ１；ＰＣＴＷＯ０２／３０９５４Ａ１；Potelligent^(商標) 技法 (Biowa, Inc., Princeton, N.J.); GlycoMAb^(商標) グリコシレーション工学処理技法 (GLYCART biotechnology AG, Zuerich, Switzerland)) が含まれるがこれらに限定されるわけではない。工学処理された糖形態は、典型的に、この異なる炭水化物またはオリゴ糖を表す；従って、Ｆｃポリペプチド、例えば抗体またはＦｃ融合体は、工学処理された糖形態を含み得る。あるいは、工学処理された糖形態は、この異なる炭水化物またはオリゴ糖を含むＦｃポリペプチドを表し得る。従って、本発明のＦｃ変異体の他のＦｃ修飾並びに未発見のＦｃ修飾との組合せは、最適化された特性を有する新規抗体またはＦｃ融合体を生成するという目標と共に企図されている。

本発明のＦｃ変異体は、抗体に用途を見出し得る。「本発明の抗体」は、本明細書で使用されるとき、本発明のＦｃ変異体を含む抗体を意味する。本発明は、実際に、Ｆｃを含むいかなるタンパク質にも用途を見出し、従って本発明のＦｃ変異体の適用は抗体に限定されない。本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ融合体に用途を見出し得る。「本発明のＦｃ融合体」は、本明細書で使用されるとき、本発明のＦｃ変異体を含むＦｃ融合体を表す。Ｆｃ融合体は、サイトカイン、可溶性受容体ドメイン、接着分子、リガンド、酵素、ペプチドまたは他のタンパク質もしくはタンパク質ドメインに機能し得るように連結された本発明のＦｃ変異体を含み得、ＵＳ５,８４３,７２５；ＵＳ６,０１８,０２６；ＵＳ６,２９１,２１２；ＵＳ６,２９１,６４６；ＵＳ６,３００,０９９；ＵＳ６,３２３,３２３；ＰＣＴＷＯ００／２４７８２；および (Chamow et al., 1996, Trends Biotechnol 14:52-60; Ashkenazi et al., 1997, Curr Opin Immunol 9:195-200）に記載のＦｃ融合体を含むが、これらに限定されるわけではない。

事実上いかなる抗原も、本発明の抗体および融合体により標的とされ得る。これには、以下のリストのタンパク質、以下のリストのタンパク質に属するサブユニット、ドメイン、モチーフおよびエピトープが含まれるが、これらに限定されるものではない：ＣＤ２；ＣＤ３、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ４、ＣＤ１１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３２、ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ５２、ＣＤ５４、ＣＤ５６、ＣＤ８０、ＣＤ１４７、ＧＤ３、ＩＬ−１、ＩＬ−１Ｒ、ＩＬ−２、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ；ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦベータ２、ＴＮＦｃ、ＴＮＦアルファベータ、ＴＮＦ−ＲＩ、ＴＮＦ−ＲＩＩ、ＦａｓＬ、ＣＤ２７Ｌ、ＣＤ３０Ｌ、４−１ＢＢＬ、ＴＲＡＩＬ、ＲＡＮＫＬ、ＴＷＥＡＫ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＬＩＧＨＴ、ＶＥＧＩ、ＯＸ４０Ｌ、ＴＲＡＩＬ受容体−１、Ａ１アデノシン受容体、リンホトキシンベータ受容体、ＴＡＣＩ、ＢＡＦＦ−Ｒ、ＥＰＯ；ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−３、ＥｐＣＡＭ、インテグリンベータ１、インテグリンベータ２、インテグリンアルファ４／ベータ７、インテグリンアルファ２、インテグリンアルファ３、インテグリンアルファ４、インテグリンアルファ５、インテグリンアルファ６、インテグリンアルファｖ、アルファＶベータ３インテグリン、ＦＧＦＲ−３、ケラチノサイト成長因子、ＶＬＡ−１、ＶＬＡ−４、Ｌ−セレクチン、抗Ｉｄ、Ｅ−セレクチン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、Ｔ細胞受容体、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＶＮＲインテグリン、ＴＧＦベータ１、ＴＧＦベータ２、エオタキシン（eotaxin）１、ＢＬｙＳ（Ｂ−リンパ球刺激因子）、補体Ｃ５、ＩｇＥ、ファクターＶＩＩ、ＣＤ６４、ＣＢＬ、ＮＣＡ９０、ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）、組織因子、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、エンドセリン受容体、ＶＬＡ−４、ハプテンＮＰ−キャップ（cap）またはＮＩＰ−キャップ、Ｔ細胞受容体アルファ／ベータ、Ｅ−セレクチン、ジゴキシン、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＬＡＰ）および精巣ＰＬＡＰ様アルカリホスファターゼ、トランスフェリン受容体、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＨＭＦＧＰＥＭ、ムチンＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ヘパラナーゼ（Heparanase）Ｉ、ヒト心臓ミオシン、腫瘍関連糖タンパク質−７２（ＴＡＧ−７２）、腫瘍関連抗原ＣＡ１２５、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、癌腫関連抗原、グコプロテイン（Gcoprotein）ＩＩｂ／ＩＩＩａ（ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、ルイスＹ関連炭水化物を発現する腫瘍関連抗原、ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）ｇＨエンベロープ糖タンパク質、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＣＭＶ、呼吸器合胞体ウイルスＲＳＶＦ、ＲＳＶＦＦｇｐ、ＶＮＲインテグリン、ＩＬ−８、サイトケラチン腫瘍関連抗原、ＨｅｐＢｇｐ１２０、ＣＭＶ、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ＨＩＶＩＩＩＢｇｐ１２０Ｖ３ループ、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆｇｐ、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ｇＤ糖タンパク質、ＨＳＶｇＢ糖タンパク質、ＨＣＭＶｇＢエンベロープ糖タンパク質およびウェルシュ菌毒素。

当業者は、上述の標的リストが特定のタンパク質や生体分子だけでなく、それらを含む生化学経路または経路群を表すことがわかる。例えば、標的抗原としてＣＴＬＡ−４に言及することは、ＣＴＬＡ−４、Ｂ７−１、Ｂ７−２、ＣＤ２８およびこれらのタンパク質に結合する任意の他の未発見のリガンドまたは受容体を含む、Ｔ細胞共刺激経路を形成するリガンドおよび受容体もまた標的であることを含意する。従って、標的は、本明細書で使用されるとき、特定の生体分子だけでなく、当該標的と相互作用するタンパク質のセットおよび当該標的が属する生化学的経路のメンバーを表す。当業者はさらに、上述の標的抗原、それらに結合するリガンドまたは受容体、またはそれらの対応する生化学経路の他のメンバーはいずれも、Ｆｃ融合体を生成させるために、本発明のＦｃ変異体に機能し得るように連結され得ることがわかる。従って、例えば、ＥＧＦＲを標的とするＦｃ融合体は、Ｆｃ変異体を、ＥＧＦ、ＴＧＦα、またはＥＧＦＲに結合する既発見もしくは未発見の任意の他のリガンドに機能し得るように連結させることにより構築できる。従って、ＥＧＦ、ＴＧＦα、またはＥＧＦＲに結合する既発見もしくは未発見の任意の他のリガンドに結合するＦｃ融合体を生成させるために、本発明のＦｃ変異体をＥＧＦＲに機能し得るように連結させ得る。従って、事実上いかなるポリペプチドも、上述の標的およびそれらの対応する生化学経路を構成するタンパク質を含むがこれらに限定されるものではない、リガンド、受容体または他のタンパク質またはタンパク質ドメインのいずれであっても、Ｆｃ融合体を開発するために本発明のＦｃ変異体に機能し得るように連結させ得る。

治験において使用を承認された、または開発中の数々の抗体およびＦｃ融合体は、本発明のＦｃ変異体から利益を得うる。当該抗体およびＦｃ融合体は、本明細書において、「臨床用製品および候補」と呼ばれる。従って、好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、広範囲の臨床用製品および候補において用途を見出し得る。例えば、数々のＣＤ２０を標的とする抗体は、本発明のＦｃ変異体から利益を得うる。例えば、本発明のＦｃ変異体は、非ホジキンリンパ腫の処置に承認されたキメラ抗ＣＤ２０抗体であるリツキシマブ（Rituxan^{(登録商標)}, IDEC/Genentech/Roche）（例えば、ＵＳ５,７３６,１３７参照）；Genmab により現在開発されている抗ＣＤ２０であるHuMax-CD20、ＵＳ５,５００,３６２に記載の抗ＣＤ２０抗体、AME-133（Applied Molecular Evolution）、hA20（Immunomedics, Inc.）およびHumaLYM（Intracel）に実質的に類似する抗体において、用途を見出し得る。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ−１）、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ（ＥｒｂＢ−２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ−３）、Ｈｅｒ４（ＥｒｂＢ−４）を含む上皮成長因子受容体ファミリーのメンバーを標的とする数々の抗体は、本発明のＦｃ変異体から利益を得うる。例えば、本発明のＦｃ変異体は、トラスツズマブ（Herceptin^{(登録商標)}, Genentech）（例えば、ＵＳ５,６７７,１７１参照）、乳癌の処置に承認されたヒト化抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体；Genentech により現在開発されているペルツズマブ（pertuzumab）（rhuMab-2C4, Omnitarg^(商標)）；ＵＳ４,７５３,８９４に記載の抗Ｈｅｒ２抗体；セツキシマブ（cetuximab）（Erbitux^{(登録商標)}, Imclone）（ＵＳ４,９４３,５３３；ＰＣＴＷＯ９６／４０２１０）、様々な癌のために治験中のキメラ抗ＥＧＦＲ抗体；Abgenix/Immunex/Amgen により現在開発されているABX-EGF（ＵＳ６,２３５,８８３）；Genmab により現在開発されているHuMax-EGFr（ＵＳＳＮ１０／１７２,３１７）；425、EMD55900、EMD62000 および EMD72000（Merck KGaA）（ＵＳ５５５８８６４；Murthy et al. 1987, Arch Biochem Biophys. 252（2）:549-60; Rodeck et al., 1987, J Cell Biochem. 35（4）:315-20; Kettleborough et al., 1991, Protein Eng. 4（7）:773-83）；ICR62（Institute of Cancer Research）（ＰＣＴＷＯ９５／２００４５；Modjtahedi et al., 1993, J. Cell Biophys. 1993, 22（1-3）:129-46; Modjtahedi et al., 1993, Br J Cancer. 1993, 67（2）:247-53; Modjtahedi et al, 1996, Br J Cancer, 73（2）:228-35; Modjtahedi et al, 2003, Int J Cancer, 105（2）:273-80）; TheraCIMhR3（YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba （ＵＳ５,８９１,９９６；ＵＳ６,５０６,８８３；Mateo et al, 1997, Immunotechnology, 3（1）:71-81）；mAb-806（Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering）（Jungbluth et al. 2003, Proc Natl Acad Sci U S A. 100（2）:639-44）；KSB-102（KS Biomedix）；MR1-1（IVAX, National Cancer Institute）（ＰＣＴＷＯ０１６２９３１Ａ２）；およびSC100（Scancell）（ＰＣＴＷＯ０１／８８１３８）に実質的に類似する抗体において、用途を見出し得る。他の好ましい実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、Ｂ−細胞慢性リンパ性白血病の処置に現在承認されているヒト化モノクローナル抗体であるアレムツズマブ（Campath^{(登録商標)}, Millenium）において用途を見出し得る。本発明のＦｃ変異体は、Ortho Biotech/Johnson & Johnson により開発された抗ＣＤ３抗体であるムロモナブ（muromonab）−ＣＤ３（Orthoclone OKT3^{(登録商標)}）、IDEC/Schering AG により開発された抗ＣＤ２０抗体であるイブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetan）（Zevalin^{(登録商標)}）、Celltech/Wyeth により開発された抗ＣＤ３３（ｐ６７タンパク質）抗体であるゲンツズマブオゾガミシン（gemtuzumab ozogamicin）（Mylotarg^{(登録商標)}）、Biogen により開発された抗ＬＦＡ−３Ｆｃ融合体であるアレファセプト（alefacept）（Amevive^{(登録商標)}）、Centocor/Lilly により開発されたアブシキシマブ（ReoPro^{(登録商標)}）、Novartis により開発されたバシリキシマブ（Simulect^{(登録商標)}）、MedImmune により開発されたパリビズマブ（palivizumab）（Synagis^{(登録商標)}）、Centocor により開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるインフリキシマブ（Remicade^{(登録商標)}）、Abbott により開発された抗ＴＮＦアルファ抗体であるアダリムマブ（adalimumab）（Humira^{(登録商標)}）、Celltech により開発された抗ＴＮＦアルファ抗体である Humicade^(商標)、Immunex/Amgen により開発された抗ＴＮＦアルファＦｃ融合体であるエタネルセプト（Enbrel^{(登録商標)}）、Abgenix により開発されている抗ＣＤ１４７抗体であるABX-CBL、Abgenixにより開発されている抗ＩＬ８抗体であるABX-IL8、Abgenix により開発されている抗ＭＵＣ１８抗体であるABX-MA1、Antisoma により開発されている抗ＭＵＣ１であるペンツモマブ（Pemtumomab）（R1549、⁹⁰Y-muHMFG1）、Antisoma により開発されている抗ＭＵＣ１抗体であるTherex （R1550）、Antisoma により開発されている AngioMab（AS1405）、Antisoma により開発されている HuBC-1、Antisoma により開発されているチオプラチン（Thioplatin）（AS1407）、Biogen により開発されている抗アルファ−４−ベータ−１（ＶＬＡ−４）およびアルファ−４−ベータ−７抗体であるAntegren^{(登録商標)}（ナタリズマブ（natalizumab））、Biogen により開発されている抗ＶＬＡ−１インテグリン抗体であるVLA-1 mAb、Biogen により開発されている抗リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）抗体である LTBR mAb、Cambridge Antibody technologyにより開発されている抗ＴＧＦβ２抗体であるCAT-152、Cambridge Antibody technology および Abbott により開発されている抗ＩＬ−１２抗体であるJ695、Cambridge Antibody technology および Genzymeにより開発されている抗ＴＧＦβ１抗体である CAT-192、Cambridge Antibody technology により開発されている抗エオタキシン（Eotaxin）１抗体である CAT-213、Cambridge Antibody technology and Human Genome Sciences Inc. により開発されている抗Ｂｌｙｓ抗体であるLymphoStat-B^(商標)、Cambridge Antibody technology and Human Genome Sciences, Inc. により開発されている抗ＴＲＡＩＬ−Ｒ１抗体であるTRAIL-R1mAb、Genentechにより開発されている抗ＶＥＧＦ抗体であるAvastin^(商標)（ベバシズマブ（bevacizumab）、rhuMAb-VEGF）、Genentechにより開発されている抗ＨＥＲ受容体ファミリー抗体、Genentech により開発されている抗組織因子抗体である抗組織因子（ATF）、Genentech により開発されている抗ＩｇＥ抗体である Xolair^(商標)（オマリズマブ（Omalizumab））、Genentech および Xoma により開発されている抗ＣＤ１１ａ抗体であるRaptiva^(商標) （エファリズマブ（Efalizumab））、Genentech および Millenium Pharmaceuticals により開発されているＭＬＮ−０２抗体（以前はＬＤＰ−０２）、Genmab により開発されている抗ＣＤ４抗体である HuMax CD4、Genmab および Amgen により開発されている抗ＩＬ１５抗体である HuMax-IL15、Genmab および Medarex により開発されている HuMax-Inflam、Genmab および Medarex および Oxford GcoSciences により開発されている抗ヘパラナーゼＩ抗体である HuMax-Cancer、Genmab および Amgenにより開発されている HuMax-Lymphoma、Genmab により開発されている HuMax-TAC、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ４０Ｌ抗体であるIDEC-131、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ４抗体であるIDEC-151（クレノリキシマブ（Clenoliximab））、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ８０抗体であるIDEC-114、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗ＣＤ２３であるIDEC-152、IDEC Pharmaceuticals により開発されている抗マクロファージ遊走因子（ＭＩＦ）抗体、Imclone により開発されている抗イディオタイプ抗体であるBEC2、Imclone により開発されている抗ＫＤＲ抗体である IMC-1C11、Imclone により開発されている抗flk-1抗体であるDC101、Imclone により開発されている抗ＶＥカドへリン抗体、Immunomedicsにより開発されている抗癌胎児抗原（ＣＥＡ）抗体であるCEA-Cide^(商標)（ラベツズマブ（labetuzumab））、Immunomedics により開発されている抗ＣＤ２２抗体である LymphoCide^(商標)（エプラツズマブ（Epratuzumab））、Immunomedics により開発されているAFP-Cide、Immunomedics により開発されている MyelomaCide、Immunomedics により開発されている LkoCide、Immunomedics により開発されている ProstaCide、Medarex により開発されている抗ＣＴＬＡ４抗体であるMDX-010、Medarex により開発されている抗ＣＤ３０抗体であるMDX-060、Medarex により開発されているMDX-070、Medarex により開発されているMDX-018、Medarex および Immuno-Designed Molecules により開発されている抗Ｈｅｒ２抗体である Osidem^(商標)（IDM-1）、Medarex および Genmab により開発されている抗ＣＤ４抗体である HuMax^(商標)-CD4、Medarex および Genmab により開発されている抗ＩＬ１５抗体であるHuMax-IL15、Medarex および Centocor/J&J により開発されている抗ＴＮＦα抗体であるCNTO 148、Centocor/J&J により開発されている抗サイトカイン抗体であるCNTO 1275、MorphoSys により開発されている抗細胞間接着分子−１（ＩＣＡＭ−１）（ＣＤ５４）抗体である MOR101 および MOR102、MorphoSys により開発されている抗線維芽細胞成長因子受容体３（ＦＧＦＲ−３）抗体である MOR201、Protein Design Labs により開発されている抗ＣＤ３抗体である Nuvion^{(登録商標)}（ビシリズマブ（visilizumab））、Protein Design Labs により開発されている抗ガンマインターフェロン抗体である HuZAF^(商標)、Protein Design Labs により開発されている抗α５β１インテグリン、Protein Design Labsにより開発されている抗ＩＬ−１２、Xoma により開発されている抗Ｅｐ−ＣＡＭ抗体である ING-1、並びに Xoma により開発されている抗ベータ２インテグリン抗体である MLN01 を含むがこれらに限定されるものではない、他の臨床用製品および候補に実質的に類似する様々な抗体またはＦｃ融合体において用途を見出し得る。

上述の抗体およびＦｃ融合体の臨床用製品および候補へのＦｃ変異体の適用は、それらの組成そのものに制限されることを意味しない。本発明のＦｃ変異体は、上述の臨床用候補および製品に、またはそれらに実質的に類似する抗体およびＦｃ融合体に組み込まれ得る。本発明のＦｃ変異体は、ヒト化、親和性成熟化、工学処理または他のやり方で修飾された、上述の臨床用候補および製品の変形に組み込まれ得る。さらに、本発明のＦｃ変異体を組み込む新しい抗体またはＦｃ融合体を構築するのに、上述の臨床用製品および候補のポリペプチド全体を使用する必要はない；例えば、臨床用製品または候補抗体の可変領域、実質的に類似する可変領域、またはヒト化、親和性成熟化、工学処理または修飾された変形の可変領域のみを使用し得る。他の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、上述の臨床用製品および候補の１つとして、同じエピトープ、抗原、リガンドまたは受容体に結合する抗体またはＦｃ融合体において用途を見出し得る。

本発明のＦｃ変異体は、広範囲の抗体およびＦｃ融合体製品において用途を見出し得る。ある実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、治療的、診断的、または研究用試薬であり、好ましくは治療的である。あるいは、本発明の抗体およびＦｃ融合体は、農業または産業的用途に使用し得る。別の実施態様では、本発明のＦｃ変異体は、実験的にスクリーニングし得るライブラリーを含む。このライブラリーは、核酸またはアミノ酸配列のリストであり得、または、ライブラリー配列をコードする核酸またはポリペプチドの物理的組成物であり得る。Ｆｃ変異体は、モノクローナルまたはポリクローナルである抗体組成物において用途を見出し得る。好ましい実施態様では、本発明の抗体およびＦｃ融合体は、標的抗原を有する標的細胞、例えば癌細胞、を殺傷するのに使用される。別の実施態様では、本発明の抗体およびＦｃ融合体は、標的抗原を阻害、アンタゴナイズ（angtagonize）、またはアゴナイズ（agonize）するのに、例えば、サイトカインまたはサイトカイン受容体をアンタゴナイズするのに使用される。別の好ましい実施態様では、本発明の抗体およびＦｃ融合体は、標的抗原をブロック、アンタゴナイズ、またはアゴナイズし、そして標的抗原を有する標的細胞を殺傷するのに使用される。

本発明のＦｃ変異体は、様々な治療目的に使用し得る。好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体タンパク質は、抗体関連障害を処置するために患者に投与される。本発明のための「患者」には、ヒトおよび他の動物の両方が含まれ、好ましくは哺乳動物、そして最も好ましくはヒトである。従って、本発明の抗体およびＦｃ融合体には、ヒトの治療および獣医学の両方の適用がある。好ましい実施態様では、患者は哺乳動物であり、最も好ましい実施態様では、患者はヒトである。本発明における用語「処置」は、治療的処置、並びに疾患または障害の予防的または抑制的措置を含む意味である。従って、例えば、疾患の発病に先立ち抗体またはＦｃ融合体を成功裏に投与することは、疾患の処置をもたらす。他の例として、疾患の臨床的顕在化の後に最適化抗体またはＦｃ融合体を成功裏に投与して疾患の症状と闘うことは、疾患の処置を含む。「処置」は、疾患を根絶するために、最適化抗体またはＦｃ融合体タンパク質を疾患の出現後に投与することも包含する。発病後および臨床的症状の進行後に、可能性のある臨床的症状の減退と恐らくは疾患の改善を伴って物質を成功裏に投与することは、疾患の処置を含む。「処置を必要とする」ものには、疾患または障害を既に有する哺乳動物、並びに疾患または障害を有する傾向のあるものが含まれ、疾患または障害を予防すべきものが含まれる。本明細書における「抗体関連障害」または「抗体応答性障害」または「症状」または「疾患」は、本発明の抗体またはＦｃ融合体を含む医薬組成物の投与により改善され得る障害を意味する。抗体関連障害には、自己免疫疾患、免疫性疾患、感染性疾患、炎症性疾患、神経性疾患、並びに癌を含む腫瘍性および新生物性疾患が含まれるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において「癌」および「癌性」は、典型的に調節されていない細胞増殖を特徴とする、哺乳動物の生理的症状を表すか、または記載する。癌の例には、癌腫、リンパ腫、芽腫、肉腫（脂肪肉腫を含む）、神経内分泌系腫瘍、中皮腫、シュワン腫、髄膜腫、腺癌、黒色腫および白血病またはリンパ性悪性疾患が含まれるがこれらに限定されるわけではない。かかる癌のより詳細な例には、扁平上皮細胞癌（例えば、上皮の扁平上皮細胞癌を含む）、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌腫を含む肺癌、腹膜の癌、肝細胞癌、胃腸の癌を含む胃または腹部の癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞腫、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜または子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎臓または腎癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝癌腫、肛門癌腫、陰茎癌腫、精巣癌、食道癌、胆道の腫瘍、並びに頭部および頚部の癌が含まれる。さらに、本発明のＦｃ変異体は、鬱血性心不全（ＣＨＦ）、血管炎、酒さ（rosecea）、アクネ、湿疹、心筋炎および心筋の他の症状、全身性エリテマトーデス、糖尿病、脊椎症、滑膜線維芽細胞（synovial fibroblasts）および骨髄ストロマ；骨減少；パジェット病、骨巨細胞腫；多発性骨髄腫；乳癌；廃用性骨減少症（disuse osteopenia）；栄養失調症、歯周病、ゴーシェ病、ランゲルハンス細胞組織球症、脊髄損傷、急性敗血症性関節炎、骨軟化症、クッシング症候群、単骨性（monoostotic）線維性骨異形成、多骨性（polyostotic）線維性骨異形成、歯周再構成（periodontal reconstruction）および骨折；サルコイドーシス；多発性骨髄腫；溶骨性骨肉腫、乳癌、肺癌、腎臓癌および直腸癌；骨転移、骨痛の管理、および体液性悪性高カルシウム血症、強直性脊椎炎および他の脊椎関節症；移植拒絶、ウイルス感染、血液新形成および新生様症状、例えば、ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫（バーキットリンパ腫、小リンパ球性リンパ腫／慢性リンパ球性白血病、菌状息肉腫、マントル細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型Ｂリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、毛様細胞白血病およびリンパ形質細胞性白血病）、リンパ球前駆細胞の腫瘍（Ｂ細胞急性リンパ芽球白血病／リンパ腫およびＴ細胞急性リンパ芽球白血病／リンパ腫を含む）、胸腺腫、成熟ＴおよびＮＫ細胞の腫瘍（末梢Ｔ細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病／Ｔ細胞リンパ腫および大顆粒リンパ球性白血病を含む）、ランゲルハンス細胞組織球症、骨髄新形成（急性骨髄性白血病（成熟を認めるＡＭＬ、分化していないＡＭＬ、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病および急性単球性白血病を含む）、骨髄異形成症候群、および慢性骨髄増殖性障害（慢性骨髄性白血病を含む）など）、中枢神経系の腫瘍、例えば脳腫瘍（神経膠腫、神経芽細胞腫、星細胞腫、骨髄腫、上衣細胞腫および網膜芽細胞腫）、固形腫瘍（鼻咽頭癌、基底細胞腫、膵癌、胆管の癌、カポジ肉腫、精巣癌、子宮、膣部または子宮頸の癌、卵巣癌、原発性肝癌または子宮体癌）、および血管系の腫瘍（血管肉腫および血管外皮細胞腫）、骨粗鬆症、肝炎、ＨＩＶ、ＡＩＤＳ、脊椎関節炎、リウマチ性関節炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、敗血症および敗血症ショック、クローン病、乾癬、強皮症、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、膵島同種移植拒絶、血液悪性腫瘍（多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形性症候群（ＭＤＳ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）など）、癌に伴う炎症、末梢神経損傷または脱髄性疾患を含むがこれらに限定されるものではない症状の処置に使用し得る。

ある実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、タンパク質の不適切な発現に関与する疾患を有する患者に投与される。本発明の範囲内では、これは、例えばタンパク質存在量の変化、変異型タンパク質の存在、または両者に起因する、異常なタンパク質を特徴とする疾患および障害を含む意味である。過剰は、分子レベルでの過剰発現、作用部位での延長された、または蓄積された出現、または正常と比べて増加したタンパク質の活性を含むがこれらに限定されるものではない、いかなる原因によるものでもあり得る。タンパク質の低減を特徴とする疾患および障害は、この定義に含まれる。この低減は、分子レベルでの限定された、または低減された発現、作用部位での短縮された、または低減された出現、タンパク質の変異形、または正常と比べて減少したタンパク質の活性を含むがこれらに限定されるものではない、いかなる原因によるものでもあり得る。このようなタンパク質の過剰または低減は、タンパク質の正常な発現、出現、または活性と比べて測定でき、当該測定は、本発明の抗体およびＦｃ融合体の開発および／または治験において重要な役割を果たし得る。

ある実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、患者に投与される唯一の治療的活性物質である。あるいは、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、細胞傷害性物質、化学療法剤、サイトカイン、増殖阻害剤、抗ホルモン剤、キナーゼ阻害剤、抗血管形成剤、心臓保護剤、または他の治療物質を含むがこれらに限定されるものではない、１またはそれ以上の治療物質と組合せて投与される。このような分子は、企図する目的に有効な量で組合せ中に適切に存在する。熟練した医師は、ここで有用な他の治療物質の適切な用量または複数の用量を経験的に決定できる。本発明の抗体およびＦｃ融合体は、１またはそれ以上の他の治療法と同時に投与し得る。例えば、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、化学療法、放射線療法、または化学療法と放射線療法の両方と共に患者に投与し得る。ある実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、本発明のＦｃ変異体を含んでも含まなくてもよい１またはそれ以上の抗体またはＦｃ融合体と一緒に投与し得る。

ある実施態様では、本発明の抗体およびＦｃ融合体は、化学療法剤と共に投与される。「化学療法剤」は、本明細書で使用されるとき、癌の処置に有用な化学的化合物を意味する。化学療法剤の例には、チオテパおよびシクロスホスファミド（cyclosphosphamido）（CYTOXAN^(商標)）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン（piposulfan）などのアルキルスルホネート類；ベンゾドーパ（benzodopa）、カルボコン、メツレドーパ（meturedopa）およびウレドーパ（uredopa）などのアジリジン類；アルトレトアミン（altretamine）、トリエチレンメルアミン（triethylenemelamine）、トリエチレンホスホルアミド（trietylenephosphoramide）、トリエチレンチオホスホルアミド（triethylenethiophosphaoramide）およびトリメチロールオメラアミン（trimethylolomelamine）を含むエチレンイミン類およびメチルアメルアミン（methylamelamine）類；クロランブシル、クロルナファジン（chlornaphazine）、クロホスファミド（cholophosphamide）、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン（novembichin）、フェネステリン（phenesterine）、プレドニマスチン（prednimustine）、トロフォスファミド（trofosfamide）、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン（carmustine）、クロロゾトシン（chlorozotocin）、フォテムスチン（fotemustine）、ロムスチン（lomustine）、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素類；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アウトラマイシン（authramycin）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン（cactinomycin）、カリケアマイシン（calicheamicin）、カラビシン（carabicin）、カミノマイシン（caminomycin）、カルジノフィリン（carzinophilin）、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン（detorubicin）、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（esorubicin）、イダルビシン、マルセロマイシン（marcellomycin）、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（nogalamycin）、オリボマイシン（olivomycins）、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（potfiromycin）、ピューロマイシン、クエラマイシン（quelamycin）、ロボルビシン（rodorubicin）、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン（tubercidin）、ウベニメクス、ジノスタチン（zinostatin）、ゾルビシン（zorubicin）などの抗生物質；メトトレキセートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝剤；デノプテリン（denopterin）、メトトレキセート、プテロプテリン（pteropterin）、トリメトレキセートなどの葉酸類似体；フルダラビン（fludarabine）、６−メルカプトプリン、チアミプリン（thiamiprine）、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フルオキシウリジン（floxuridine）、５−ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン（calusterone）、ドロモスタノロンプロピオネート、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；フロリン酸（frolinic acid）などの葉酸補充剤（replenisher）；アセグラトン；アルドホルホラミド（aldophosphamide）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル（bestrabucil）；ビサントレン（bisantrene）；エダトラキセート（edatraxate）；デホファミン（defofamine）；デメコルシン（demecolcine）；ジアジクオン（diaziquone）；エルホルミチン（elformithine）；エリプチニウムアセテート（elliptinium acetate）；エトグルシド（etoglucid）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン（lonidamine）；ミトグアゾン（mitoguazone）；ミトキサントロン；モピダモール（mopidamol）；ニトラシン（nitracrine）；ペントスタチン；フェナメット（phenamet）；ピラルビシン；ポドフィリン酸（podophyllinic acid）；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；PSK^{(登録商標)}；ラゾキサン（razoxane）；シゾフラン（sizofuran）；スピロゲルマニウム（spirogermanium）；テヌアゾン酸（tenuazonic acid）；トリアジコン（triaziquone）；２,２',２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノマスチン（mannomustine）；ミトブロニトール；ミトラクトール（mitolactol）；ピポブロマン（pipobroman）；ガシトシン（gacytosine）；アラビノシド（「Ara-C」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキサン類、例えばパクリタキセル（TAXOL^{(登録商標)}, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.）およびドセタキセル（TAXOTERE^{(登録商標)}, Rhne-Poulenc Rorer, Antony, France）；クロランブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン（vinorelbine）；ナベルビン（navelbine）；ノバントロン（novantrone）；テニポシド（teniposide）；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ（xeloda）；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスペラミシン（esperamicins）；カペシタビン（capecitabine）；チミジル酸合成阻害剤（Tomudexなど）；セリコキシブ（celicoxib）（CELEBREX^{(登録商標)}）またはＭＫ−０９６６（VIOXX^{(登録商標)}）などのｃｏｘ−２阻害剤；および上記のいずれかの医薬的に許容し得る塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されるわけではない。この定義には、また、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、これには、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール類、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン（trioxifene）、ケオキシフェン（keoxifene）、LY 117018、オナプリストン（onapristone）およびトレミフェン（Fareston）などのエストロゲン類；およびフルタミド、ニルタミド（nilutamide）、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲン類；および上記のいずれかの医薬的に許容され得る塩、酸または誘導体が含まれる。

化学療法剤または他の細胞傷害性物質は、プロドラッグとして投与し得る。「プロドラッグ」は、本明細書で使用されるとき、腫瘍細胞に対する細胞傷害性が親の薬物と比較して低く、酵素的に活性化されるか、より活性の高い親の形態に変換される能力のある、医薬的に活性な物質の前駆体または誘導体形を意味する。例えば、Wilman, 1986, Biochemical Society Transactions, 615th Meeting Belfast, 14:375-382；and Stella et al., Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery, Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.）: 247-267, Humana Press, 1985 参照。本発明で用途を見出し得るプロドラッグには、より活性の高い細胞傷害性の遊離薬物に変換され得る、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、サルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、ベータ−ラクタム含有プロドラッグ、置換されていることもあるフェノキシアセトアミド含有プロドラッグまたは置換されていることもあるフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、５−フルオロシトシンおよび他の５−フルオロウリジンプロドラッグ類が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の抗体およびＦｃ融合体と共に使用するためにプロドラッグ形態に誘導体化できる細胞傷害性の薬物の例には、上述の化学療法剤のいずれもが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

本発明の抗体およびＦｃ融合体は、他の治療法と組合せてもよい。例えば、ある実施態様では、抗体またはＦｃ融合体で処置されるべき患者は、放射線療法も受け得る。放射線療法は、当分野で一般的に用いられ、当業者に知られているプロトコールに従って施すことができる。かかる治療には、セシウム、イリジウム、ヨウ素またはコバルト放射が含まれるが、これらに限定されるものではない。放射線療法は、全身放射であってもよく、肺、膀胱または前立腺などの体内または体表の特定の部位または組織に局所的に向けてもよい。典型的に、放射線療法は、約１ないし２週間の期間にわたり、パルスで施す。しかしながら、放射線療法は、もっと長い期間施してもよい。例えば、放射線療法は、頭部および頚部の癌を有する患者に、約６ないし約７週間施してもよい。場合により、放射線療法は、単回用量または複数回、連続的用量として施し得る。熟練した医師は、ここで有用な放射線療法の適切な用量または複数の用量を、経験的に決定できる。本発明の他の実施態様によると、本発明の抗体またはＦｃ融合体および１またはそれ以上の他の抗癌療法を、癌細胞をエクスビボで処置するのに用いる。かかるエクスビボ処置は、骨髄移植および特に自家骨髄移植において有用であり得ると企図されている。例えば、抗体またはＦｃ融合体および上記のような１またはそれ以上の他の抗癌治療による細胞または癌細胞を含有する組織（複数も可）の処置は、レシピエントの患者への移植に先立ち、癌細胞を枯渇させるか、または実質的に枯渇させるのに用いることができる。当然、本発明の抗体およびＦｃ融合体は、手術などのもっと他の治療技法と組み合わせて用いることができると企図されている。

別の実施態様では、本発明の抗体およびＦｃ融合体は、サイトカインと共に投与される。「サイトカイン」は、本明細書で使用されるとき、一細胞群から放出され、細胞間媒介物質として他の細胞に作用するタンパク質を表す一般用語を意味する。かかるサイトカインの例は、リンホカイン、モノカインおよび伝統的なポリペプチドホルモンである。ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；リラキシン；プロリラキシン；濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子−アルファおよび−ベータ；ミュラー管阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−ベータなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−アルファおよびＴＧＦ−ベータなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インシュリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導（osteoinductive）因子；インターフェロン−アルファ、ベータおよびガンマなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５などのインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−アルファまたはＴＮＦ−ベータなどの腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキット（kit）リガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子は、サイトカインに含まれる。本明細書で使用されるとき、用語サイトカインには、天然の供給源由来または組換え細胞培養由来のタンパク質、および天然配列のサイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。

様々な他の治療物質が、本発明の抗体およびＦｃ融合体との投与に用途を見出し得る。ある実施態様では、抗体またはＦｃ融合体は、抗血管形成剤と共に投与される。「抗血管形成剤」は、本明細書で使用されるとき、血管の発達を阻害するか、ある程度妨害する化合物を意味する。抗血管形成因子は、例えば、血管形成の促進に関与する成長因子または成長因子受容体に結合するする抗体、Ｆｃ融合体またはサイトカインなどの低分子またはタンパク質であり得る。本発明において好ましい抗血管形成因子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に結合する抗体である。別の実施態様では、抗体またはＦｃ融合体は、適応免疫反応を誘導または増強する治療剤、例えば、ＣＴＬＡ−４を標的とする抗体、と共に投与される。別の実施態様では、抗体またはＦｃ融合体は、チロシンキナーゼ阻害剤と共に投与される。「チロシンキナーゼ阻害剤」は、本明細書で使用されるとき、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ活性をある程度阻害する分子を意味する。そのような阻害剤の例には、ＰＤ１５３０３５、４−（３−クロロアニリノ）キナゾリンなどのキナゾリン類；ピリドピリミジン類；ピリミドピリミジン類；ＣＧＰ５９３２６、ＣＧＰ６０２６１およびＣＧＰ６２７０６などのピロロピリミジン類；ピラゾロピリミジン類、４−（フェニルアミノ）−７Ｈ−ピロロ（２,３−ｄ）ピリミジン類；クルクミン（ジフェルロイルメタン、４,５−ビス（４−フルオロアニリノ）フタルイミド）；ニトロチオフェン部分を含有するチルホスチン（tyrphostine）類；ＰＤ−０１８３８０５（Warner-Lambert）；アンチセンス分子 (例えば、ＥｒｂＢをコードする核酸に結合するもの）；キノキサリン類 (US 5,804,396）；トリホスチン（tryphostin）類 (US 5,804,396）；ZD6474 (Astra Zeneca）；PTK-787 (Novartis/Schering A G）；C1-1033 (Pfizer）などのpan-ErbB 阻害剤；Affinitac (ISIS 3521；Isis/Lilly）；イマチニブメシレート (STI571, Gleevec^{(登録商標)}；Novartis）；PKI 166 (Novartis）；GW2016 (Glaxo SmithKline）；C1-1033 (Pfizer）；EKB-569 (Wyeth）；Semaxinib (Sugen）；ZD6474 (AstraZeneca）；PTK-787 (Novartis/Schering AG）；INC-1C11 (Imclone）；または以下の特許公開のいずれかに記載されている通り: US 5,804,396；PCT WO 99/09016 (American Cyanimid）；PCT WO 98/43960 (American Cyanamid）；PCT WO 97/38983 (Warner-Lambert）；PCT WO 99/06378 (Warner-Lambert）；PCT WO 99/06396 (Warner-Lambert）；PCT WO 96/30347 (Pfizer, Inc）；PCT WO 96/33978 (AstraZeneca）；PCT WO96/3397 (AstraZeneca）；PCT WO 96/33980 (AstraZeneca）、ゲフィチニブ(IRESSA^(商標), ZD1839, AstraZeneca）および OSI-774 (Tarceva^(商標), OSI Pharmaceuticals/Genentech）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

別の実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、他の治療化合物に結合または機能し得るように連結している。治療化合物は、細胞傷害性物質、化学療法剤、毒素、放射性同位元素、サイトカイン、または他の治療的に活性な物質であり得る。抗体またはＦｃ融合体と細胞傷害性物質の結合物は、Ｎ−スクシニミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステル類の二官能性誘導体（ジメチルアジプイミデートＨＣＬなど）、活性エステル類（ジスクシニミジルスベレートなど）、アルデヒド類（グルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（ビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアネート類（トリエン（tolyene）２,６−ジイソシアネートなど）、およびビス−活性フッ素化合物（１,５−ジフルオロ−２,４−ジニトロベンゼンなど）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を使用して作成し得る。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta et al., 1971, Science 238:1098 に記載の通りに製造できる。炭素−１４−標識１−イソチオシアナトベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体に放射線ヌクレオチドを結合させるための例示的キレート剤である。ＰＣＴＷＯ９４／１１０２６参照。リンカーは、細胞中で細胞傷害性の薬物の放出を助長する切断可能リンカーであり得る。例えば、酸で変化しやすい（acid-labile）リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカーまたはジスルフィド含有リンカー (Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131）を使用し得る。あるいは、抗体またはＦｃ融合体は、例えば組換え技法またはペプチド合成により、治療物質に機能し得るように連結される。

本発明の抗体およびＦｃ融合体への結合に有用であり得る化学療法剤は、上記で説明した。別の実施態様では、抗体またはＦｃ融合体は、低分子毒素および細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性な毒素（それらのフラグメントおよび／または変異体を含む）を含むがこれらに限定されるものではない毒素に、結合または機能し得るように連結する。低分子毒素には、カリチェアミシン（calicheamicin）、メイタンシン（maytansine）（ＵＳ５,２０８,０２０）、トリコセン（trichothene）およびＣＣ１０６５が含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明のある実施態様では、抗体またはＦｃ融合体を、１またはそれ以上のメイタンシン分子に結合させる（例えば、抗体分子１個につき約１ないし約１０メイタンシン分子）。メイタンシンを、例えば、Ｍａｙ−ＳＳ−Ｍｅに変換し得、それをＭａｙ−ＳＨ３に還元し、修飾抗体またはＦｃ融合体と反応させ（Chari et al., 1992, Cancer Research 52: 127-131）、メイタンシノイド−抗体またはメイタンシノイド−Ｆｃ融合体結合体を生成させ得る。興味深い他の結合体には、１またはそれ以上のカリチェアミシン分子に結合した抗体またはＦｃ融合体が含まれる。抗生物質のカリチェアミシンファミリーは、ピコモル濃度以下の濃度で二本鎖ＤＮＡの破壊をもたらす能力を有する。使用し得るカリチェアミシン構造類似体には、γ₁ ¹、α₂ ¹、α₃、Ｎ−アセチル−γ₁ ¹、ＰＳＡＧ、およびθ¹ ₁（Hinman et al., 1993, Cancer Research 53:3336-3342；Lode et al., 1998, Cancer Research 58:2925-2928） (US 5,714,586；US 5,712,374；US 5,264,586；US 5,773,001)が含まれるが、これらに限定されるわけではない。アウリスタチン（auristatin）Ｅ（ＡＥ）およびモノメチルアウリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）などのドラスタチン（Dolastatin）１０類似体は、本発明のＦｃ変異体のための結合体として用途を見出し得る（Doronina et al., 2003, Nat Biotechnol 21(7):778-84；Francisco et al., 2003 Blood 102(4):1458-65)。有用な酵素的に活性な毒素には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、菌体外毒素Ａ鎖（緑濃菌由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン（modeccin）Ａ鎖、アルファ−サルシン（sarcin）、オオアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質、ジアンチン（dianthin）タンパク質、ヨウシュヤマゴボウ（Phytolaca americana）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ）、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン（curcin）、クロチン（crotin）、サポナリア（sapaonaria officinalis）阻害剤、ゲロニン（gelonin）、ミトゲリン（mitogellin）、レストリクトシン（restrictocin）、フェノマイシン（phenomycin）、エノマイシン（enomycin）およびトリコテセン（tricothecene）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、ＰＣＴＷＯ９３／２１２３２参照。本発明はさらに、本発明の抗体またはＦｃ融合体と核酸分解活性を有する化合物（例えば、リボヌクレアーゼ、またはデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）などのＤＮＡエンドヌクレアーゼ）との間で形成される結合体または融合体を企図している。

別の実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体は、放射性同位元素に結合または機能し得るように連結し、放射性結合体を形成し得る。放射性結合体の抗体およびＦｃ融合体を産生するために、様々な放射活性同位元素が利用可能である。例には、Ａｔ²¹¹、Ｉ¹³¹、Ｉ¹²⁵、Ｙ⁹⁰、Ｒｅ¹⁸⁶、Ｒｅ¹⁸⁸、Ｓｍ¹⁵³、Ｂｉ²¹²、Ｐ³²およびＬｕの放射性同位元素が含まれるが、これらに限定されるものではない。

さらに他の実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体を、腫瘍の予標的化に利用するために、「受容体」（ストレプトアビジンなど）に結合させ得る。その場合、抗体−受容体またはＦｃ融合体−受容体結合体を患者に投与し、続いて除去剤（clearing agent）を使用して未結合の結合体を循環から除去し、その後、細胞傷害性物質（例えば、放射性ヌクレオチド）に結合した「リガンド」（例えば、アビジン）を投与する。別の実施態様では、抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）を用いるために、抗体またはＦｃ融合体を酵素に結合または機能し得るように連結させる。ＡＤＥＰＴは、抗体またはＦｃ融合体を、プロドラッグ（例えば、ペプチド化学療法剤、ＰＣＴＷＯ８１／０１１４５参照）を活性な抗癌薬に変換するプロドラッグ活性化酵素に、結合または機能し得るように連結させることにより使用し得る。例えば、ＰＣＴＷＯ８８／０７３７８およびＵＳ４,９７５,２７８参照。ＡＤＥＰＴに有用な免疫結合体の酵素成分には、プロドラッグに対して、それをより活性の高い細胞傷害性形態に変換するようなやり方で作用する能力のある、いかなる酵素も含まれる。本発明の方法に有用な酵素には、ホスフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ；サルフェート含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用なアリールサルファターゼ；非毒性の５−フルオロシトシンを抗癌薬の５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシンなどのプロテアーゼ類、カルボキシペプチダーゼ類およびカテプシン類（カテプシンＢおよびＬなど）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ類；グリコシル化プロドラッグを遊離の薬物に変換するのに有用な、ベータ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼ（neuramimidase）などの炭水化物切断酵素；アルファ−ラクタム類で誘導された薬物を遊離の薬物に変換するのに有用なベータ−ラクタマーゼ；および、アミン窒素でフェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基により各々誘導体化された薬物を遊離の薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼ類が含まれるが、これらに限定されるわけではない。あるいは、酵素活性を有する抗体（当分野で「抗体酵素」としても知られる）を、本発明のプロドラッグを遊離の活性な薬物に変換するのに使用できる（例えば、Massey, 1987, Nature 328: 457-458参照）。抗体−抗体酵素およびＦｃ融合体−抗体酵素結合体は、腫瘍細胞群に抗体酵素を送達するために調製できる。本発明の抗体およびＦｃ融合体の他の修飾が、本発明において企図されている。例えば、抗体またはＦｃ融合体を、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、またはポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーなどの、様々な非タンパク質性ポリマーの１つに連結させてもよい。

本発明の抗体またはＦｃ融合体および１またはそれ以上の治療的活性物質を製剤化した医薬組成物が企図されている。本発明の抗体およびＦｃ融合体の製剤は、所望の純度を有する当該抗体またはＦｃ融合体を、任意の医薬的に許容し得る担体、賦形剤または安定化剤（Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.,1980）と混合することにより、凍結乾燥製剤または水性溶液の形態で、保存用に調製する。許容し得る担体、賦形剤または安定化剤は、用いる用量および濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、アセテートおよび他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム；塩化ヘキサメトニウム（methonium）；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン類；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む、単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；甘味料および他の香味料；微結晶セルロース、ラクトース、トウモロコシおよび他のデンプンなどの増量剤；結合剤；添加物；着色料；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／またはTWEEN^(商標)、PLURONICS^(商標)またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。好ましい実施態様では、本発明の抗体またはＦｃ融合体を含む医薬組成物は、医薬的に許容し得る塩（これは、酸および塩基付加塩の両方を含む意味である）として存在するなど、水溶性形態である。「医薬的に許容し得る酸付加塩」は、遊離塩基の生物学的効力を保持する、生物学的または他の点で不都合ではない塩を表し、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、および酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、蓚酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸などの有機酸により形成されたものである。「医薬的に許容し得る塩基付加塩」には、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガン、アルミニウム塩などの、無機塩基から誘導されたものが含まれる。特に好ましいのは、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウムおよびマグネシウム塩である。医薬的に許容し得る有機非毒性塩基から誘導される塩には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミンおよびエタノールアミンなどの、第一級、第二級および第三級アミン類、天然産生置換アミン類を含む置換アミン類、環状アミン類および塩基性イオン交換樹脂が含まれる。インビボ投与に使用される製剤は、好ましくは無菌である。これは、滅菌濾過膜を通す濾過または他の方法により、容易に達成される。

本明細書で開示される抗体およびＦｃ融合体は、免疫リポソームとしても製剤し得る。リポソームは、哺乳動物に治療物質を送達するのに有用な、様々なタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤を含む小胞である。抗体またはＦｃ融合体を含有するリポソームは、Epstein et al., 1985, Proc Natl Acad Sci USA, 82:3688；Hwang et al., 1980, Proc Natl Acad Sci USA, 77:4030；US 4,485,045；US 4,544,545；および PCT WO 97/38731に記載されているような、当分野で知られている方法により製造する。循環時間が延長されたリポソームは、ＵＳ５,０１３,５５６に開示されている。リポソームの成分は、生体膜の脂質配置と同様に、一般に二層形態で配置される。特に有用なリポソームは、逆相蒸発法により、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成を用いて生成させることができる。所望の直径を有するリポソームを得るために、リポソームを所定の孔サイズのフィルターを通して押し出す。化学療法剤または他の治療的に活性な物質を、場合によりリポソームに含有させる（Gabizon et al., 1989, J National Cancer Inst 81:1484）。

抗体、Ｆｃ融合体および他の治療的に活性な物質は、コアセルべーション技法、界面重合（例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル、またはポリ−（メチルメトアシレート（methylmethacylate））マイクロカプセルを使用する）、コロイド性薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）およびマクロエマルジョンを含むがこれらに限定されない方法により調製されるマイクロカプセルに封入してもよい。かかる技法は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed., 1980 に開示されている。持続放出製剤を調製してもよい。適する持続放出製剤の例には、固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスが含まれ、そのマトリックスは、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態である。持続放出マトリックスの例には、ポリエステル類、ヒドロゲル類（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリ乳酸（ＵＳ３,７７３,９１９）、Ｌ−グルタミン酸とガンマエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー、分解不能なエチレン−ビニルアセテート、LUPRON DEPOT^(商標)（これは、乳酸−グリコール酸コポリマーおよびロイプロリドアセテートで構成される注射可能ミクロスフェアである）などの分解可能な乳酸−グリコール酸コポリマー、ポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸およびProLease^{(登録商標)} (Alkermesから販売されている）（これは、ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド（ＰＬＧ）のマトリックスに組み込まれた所望の生体活性分子で構成されるミクロスフェアベースの送達系である）が含まれる。

製剤中の治療的に活性な本発明の抗体またはＦｃ融合体の濃度は、約０.１ないし１００重量％で変動し得る。好ましい実施態様では、抗体またはＦｃ融合体の濃度は、０.００３ないし１.０モル濃度の範囲にある。患者を処置するために、治療的有効量の本発明の抗体またはＦｃ融合体を投与し得る。「治療的有効量」は、本明細書では、それが投与される目的である効果を奏する用量を意味する。正確な用量は処置目的に依存し、既知の技法を使用して当業者により確認可能である。投薬量は、０.０１ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲で変動し得、例えば、０.１、１、１０または５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、１ないし１０ｍｇ／ｋｇが好ましい。当分野で知られているように、抗体またはＦｃ融合体の分解、全身対局所の送達、および新規プロテアーゼ合成の速度、並びに年齢、体重、全般的健康、性別、食事、投与時間、薬物の相互作用および症状の重篤さのために補正が必要なことがあり、当業者により日常的な実験で確認可能である。

好ましくは滅菌水性溶液の形態で本発明の抗体またはＦｃ融合体を含む医薬組成物の投与は、経口、皮下、静脈内、鼻腔内、耳内（intraotically）、経皮、局所（例えば、ゲル、膏薬、ローション、クリームなど）、腹腔内、筋肉内、肺内（例えば、Aradigmから販売されているAERx^{(登録商標)} 吸入技法、またはInhale Therapeuticsから販売されているInhance^(商標) 肺送達系）、膣内、非経腸、直腸または眼内を含むがこれらに限定されるわけではない、様々な方法で行い得る。いくつかの例では、例えば、創傷、炎症などの処置のために、抗体またはＦｃ融合体を、液剤またはスプレーとして直接適用し得る。当分野で知られているように、医薬組成物は、導入様式に応じてしかるべく製剤し得る。

工学処理方法
本発明は、Ｆｃ変異体を生成させるのに使用し得る工学処理方法を提供する。過去のＦｃ工学処理の試みを妨げてきた主な障害は、部分的には、不十分な工学処理戦略および方法のために、そして抗体産生およびスクリーニングが低処理量である性質のために、修飾におけるランダムな試みしか可能ではなかったことである。本発明は、これらの短所を克服する工学処理方法に関する。様々な設計戦略、コンピューター処理スクリーニング方法、ライブラリー生成方法並びに実験的産生およびスクリーニング方法が企図されている。これらの戦略、アプローチ、技法および方法は、個別に、または様々な組合せで、最適化Ｆｃ変異体を工学処理するのに適用し得る。

設計戦略
所望の特性について最適化されたＦｃ変異体を生成させるための最も効率的なアプローチは、その目標に対して工学処理の努力を向けることである。従って、本発明は、最適化Ｆｃ変異体を工学処理するのに使用し得る設計戦略を教示する。設計戦略の使用は、Ｆｃ工学処理を先導することを意味するが、Ｆｃ変異体を工学処理に使用した設計戦略に基づく特定の最適化特性に制限することを意味しない。一見するとこれは直感に反すると思われるかもしれない；しかしながら、その妥当性は、タンパク質およびタンパク質−タンパク質複合体の構造、安定性、溶解性および機能を決定する微妙な相互作用の膨大な複雑さから演繹される。どのタンパク質の位置、残基、相互作用などが設計目標のために重要であるかを予想する努力をすることはできるが、しばしば決定的なものは予想できない。タンパク質の構造、安定性、溶解性および機能に対する効果は、好都合であろうと不都合であろうと、しばしば予見できない。そのうえ、タンパク質に不利益または有害な無数のアミノ酸修飾がある。従って、しばしば、工学処理への最良のアプローチは、概して設計目標に対して焦点を向けているが不利益な結果を引き起こさないタンパク質の生成によりもたらされる。このように、設計戦略の主な目的は、品質の多様性の生成であり得る。極度に単純化されたレベルでは、これは勝ち目の積み重ねとみなすことができる。例として、下記のようなＦｃの炭水化物または特定のドメイン−ドメイン角の動揺は、どのように炭水化物およびドメイン−ドメイン角がＦｃの特性を決定しているかは、よくわかっていないにも関わらず、最適化Ｆｃ変異体を生成させるための妥当な設計戦略である。スクリーニングされる不利益なアミノ酸修飾の数を減らすことにより、即ち、品質多様性をスクリーニングすることにより、これらの設計戦略は実用的になる。従って、本発明で考えられている設計戦略の真の価値は、工学処理の努力を価値あるＦｃ変異体の生成に向かわせる能力である。任意の得られる変異体の特異的価値は、実験後に決定される。

Ｆｃ変異体の工学処理のためのある設計戦略を提供する。そこでは、ＦｃといくつかのＦｃリガンドとの相互作用が、Ｆｃと当該Ｆｃリガンドとの接点でアミノ酸修飾を工学処理することにより、変更される。ここで、Ｆｃリガンドには、ＦｃγＲ類、Ｃ１ｑ、ＦｃＲｎ、プロテインＡまたはＧなどが含まれるが、これらに限定されるわけではない。結合点に衝撃を与えるＦｃ位置でエネルギー的に好都合な置換を探査することにより、新しい接点の高次構造を標本抽出する変異体を工学処理できる。そのいくつかはＦｃリガンドへの結合を改善し得、いくつかはＦｃリガンド結合を低減させ得、そしていくつかは他の好都合な特性を有し得る。このような新しい接点の高次構造は、例えば、接点を形成するＦｃリガンド残基との直接的相互作用、または側鎖もしくは骨格高次構造の動揺などのアミノ酸修飾に起因する間接的効果の結果であり得る。可変位置は、接点の高次構造の決定に重要な役割を果たすと考えられる任意の位置として選択し得る。例えば、可変位置は、Ｆｃリガンドと直接接触する任意の残基から、ある距離内、例えば５オングストローム（Å）、好ましくは１ないし１０Å、にある残基のセットとして選択し得る。

Ｆｃ変異体の生成のためのさらなる設計戦略を提供する。そこでは、Ｎ２９７のＦｃの炭水化物の高次構造を最適化する。最適化は、この文脈で使用されるとき、所望の特性、例えば増大または低減されたＦｃγＲ親和性をもたらす、Ｎ２９７炭水化物における高次構造的変化および組成的変化を含む意味である。そのような戦略は、炭水化物の構造および高次構造が劇的にＦｃ／ＦｃγＲおよびＦｃ／Ｃ１ｑ結合に影響するという観察により支持される（Umana et al., 1999, Nat Biotechnol 17:176-180；Davies et al., 2001, Biotechnol Bioeng 74:288-294；Mimura et al., 2001, J Biol Chem 276:45539-45547.；Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483；Shields et al., 2002, J Biol Chem 277:26733-26740；Shinkawa et al., 2003, J Biol Chem 278:3466-3473）。しかしながら、炭水化物は、ＦｃγＲ類と全く特異的に接触しない。炭水化物と相互作用する位置でエネルギー的に好都合な置換を探査することにより、新しい炭水化物高次構造を標本抽出する変異体の品質多様性を工学処理できる。そのいくつかは１またはそれ以上のＦｃリガンド類への結合を改善し得、いくつかは低減させ得る。Ｆｃ／炭水化物接点に近い変異の大部分が炭水化物高次構造を変化させるように見えるが、いくつかの変異は、グリコシレーションの組成を変化させると示された（Lund et al., 1996, J Immunol 157:4963-4969；Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65）。

Ｆｃ変異体の生成のための他の設計戦略を提供する。そこでは、Ｃγ２とＣγ３のドメイン間の角を最適化する。最適化は、この文脈で使用されるとき、所望の特性、例えば増大または低減されたＦｃγＲ親和性をもたらす、Ｃγ２−Ｃγ３ドメイン角における高次構造的変化を記述する意味である。この角は、Ｆｃ／ＦｃγＲ親和性の重要な決定要因であり（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483）、Ｆｃ／ＦｃγＲ接点から遠位の数々の変異が、恐らくそれを調整することにより結合に影響を与える（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604）。Ｃγ２−Ｃγ３角および相互に対するドメインの可撓性の決定に重要な役割を果たすと思われる位置でエネルギー的に好都合な置換を探査することにより、新しい角および可撓性レベルを標本抽出する変異体の品質多様性を設計できる。そのいくつかは、所望のＦｃ特性について最適化されている。

Ｆｃ変異体の生成のための他の設計戦略を提供する。そこでは、Ｆｃを再工学処理して、グリコシレーションへの構造および機能的依存を排除する。この設計戦略は、Ｎ２９７炭水化物の非存在下での、Ｆｃの構造、安定性、溶解性および／またはＦｃの機能（例えば、１またはそれ以上のＦｃリガンド類に対するＦｃの親和性）の最適化に関与する。あるアプローチでは、グリコシレーションの非存在下で溶媒に露出する位置を、それらが安定し、構造的にＦｃ構造と一致し、凝集する傾向のないように工学処理する。Ｃγ２は、抗体中で唯一の対にならないＩｇドメインである（図１参照）。従って、Ｎ２９７炭水化物は、通常なら他のＩｇドメインとのタンパク質−タンパク質相互作用の接点であったであろう露出した疎水性区画を覆い、Ｆｃの安定性および構造的完全性を維持し、Ｃγ２ドメインが中心軸を超えて凝集しないようにしている。非グリコシル化Ｆｃを最適化するためのアプローチは、Ｃγ２−Ｃγ２二量体軸の内側を向く極性および／または荷電残基を取り込むことにより、および非グリコシル化Ｆｃ／ＦｃγＲ接点または非グリコシル化Ｆｃといくつかの他のＦｃリガンドとの接点を直接増強するアミノ酸修飾を設計することにより、非グリコシル化Ｆｃの安定性および／または溶解性を増強するアミノ酸修飾を設計することに関与し得るが、これらに限定されるものではない。

Ｆｃ変異体を工学処理するためのさらなる設計戦略を提供する。そこでは、Ｃγ２ドメインの高次構造を最適化する。最適化は、この文脈で使用されるとき、所望の特性、例えば増大または低減されたＦｃγＲ親和性をもたらす、Ｃγ２ドメイン角の高次構造の変化を記述する意味である。Ｃγ２高次構造に衝撃を与えるＣγ２位置でエネルギー的に好都合な置換を探査することにより、新しいＣγ２高次構造を標本抽出する変異体の品質多様性を工学処理できる。そのいくつかは、設計目標を達成し得る。そのような新しいＣγ２高次構造は、例えば、変異体により標本抽出される代替的主鎖高次構造の結果であり得る。可変位置は、Ｃγ２の構造、安定性、溶解性、可撓性、機能などに重要な役割を果たすと考えられる任意の位置として選択され得る。例えば、溶媒から部分的または完全に隔離されているＣγ２残基であるＣγ２の疎水性コア残基を、再工学処理し得る。あるいは、非コア残基、または主鎖の構造、安定性または可撓性に重要と思われる残基を考慮し得る。

Ｆｃ最適化のためのさらなる設計戦略を提供する。そこでは、ＦｃγＲ、補体、またはいくつかの他のＦｃリガンドへの結合を、Ｆｃと当該Ｆｃリガンドとの間の静電気的相互作用を調整する修飾により変化させる。そのような修飾は、Ｆｃの大域的静電気的特徴の最適化と見なしてもよく、荷電アミノ酸による中性アミノ酸の置換、中性アミノ酸による荷電アミノ酸の置換、または反対の荷電のアミノ酸による荷電アミノ酸の置換（即ち、荷電の逆転）を含む。そのような修飾は、Ｆｃと１またはそれ以上のＦｃリガンド類、例えばＦｃγＲ類との結合親和性の変化を実行するために使用し得る。好ましい実施態様では、静電気的電位を計算するための様々な周知方法の１つを使用して、静電気的置換が結合に影響し得る位置を選択する。最も簡潔な実施態様では、クーロンの法則を使用して、タンパク質中の位置の関数として静電気的電位を生成させる。さらなる実施態様は、イオン強度の効果を計上するために Debye-Huckel のスケーリングの使用を含み、より洗練された実施態様は、Poisson-Boltzmann 計算などを含む。そのような静電気的計算は、位置を強調し、設計目標を達成するための特異的アミノ酸修飾を示唆し得る。いくつかの場合では、これらの置換は、例えば、活性化ＦｃγＲ類への結合を増強し、一方で阻害性ＦｃγＲ類への結合親和性を減少させるというように、異なるＦｃリガンド類への結合に変化して影響し得ると予想され得る。

コンピューター処理スクリーニング
価値あるＦｃ変異体を得るための主な障害は、膨大な数の可能性から、どのアミノ酸修飾が所望の目標を達成するかを予期することの難しさである。実際に、過去のＦｃ工学処理の試みが有意な臨床的価値のあるＦｃ変異体を産生するのに失敗してきた主な理由の一つは、Ｆｃ工学処理へのアプローチが今までは行き当たりばったりのアプローチを含んだことである。本発明は、定量的かつ系統的なＦｃ変異体の工学処理を可能にするコンピューター処理スクリーニング方法を提供する。これらの方法は、典型的に、原子レベルのスコアリング（scoring）関数、側鎖回転異性体サンプリング（sampling）、およびタンパク質の配列、構造および機能の間の関係を正確に捉える進歩した最適化方法を使用する。コンピューター処理スクリーニングは、生じる膨大な多様性のフィルタリング（filtering）により、標的位置での可能性のある配列空間全体の探査を可能にする。コンピューター処理によりスクリーニングされる変異体ライブラリーは、安定な、正しく折り畳まれた、機能的な配列を効果的に増やされており、所望の目標のための有効なＦｃの最適化を可能にする。タンパク質の構造、安定性、溶解性および機能に対する重複配列の制限のために、ライブラリー中の多数の候補は、「無駄な」配列空間を占める。例えば、配列空間の大部分が、折り畳まれない、誤って折り畳まれた、不完全に折り畳まれた、部分的に折り畳まれた、または凝集したタンパク質をコードする。これは、Ｆｃ工学処理に特に該当する。なぜなら、Ｉｇドメインは小さいベータシート構造であり、その工学処理は、極度に要求が厳しいと証明されたからである（Quinn et al., 1994, Proc Natl Acad Sci U S A 91:8747-8751；Richardson et al., 2002, Proc Natl Acad Sci U S A 99:2754-2759）。ベータシートの表面上の無害に見える置換でさえ、激しいパッキング（packing）の矛盾をもたらすことができ、折り畳みの平衡を劇的に動揺させる（Smith et al., 1995, Science 270:980-982）；ちなみに、アラニンは最悪のベータシート形成物の一つである (Minor et al., 1994, Nature 371:264-267）。ベータシートの安定性および特異性の決定要因は、極度に多数の微妙な相互作用間の繊細なバランスである。コンピューター処理スクリーニングは、主として生産的な配列空間からなるライブラリーの生成を可能にし、結果的に所望の目標のために最適化されたタンパク質を同定する機会を増加させる。事実上、コンピューター処理スクリーニングは、当たりの割合を高め、それにより実験的にスクリーニングしなければならない変異体の数を減らす。Ｆｃ工学処理へのさらなる障害は、相関または共役する変異を有効に設計する必要性である。例えば、今までに観察された最大のＦｃ／ＦｃγＲ親和性増強は、アラニンスキャンで別々に得られた３つの良好な結合物を組合せて得られたＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａである（Shields et al., 2001, J Biol Chem 276:6591-6604）。コンピューター処理スクリーニングは、このような３倍の変異体を、３回の別々の実験ではなく１回の実験で生成させる能力があり、さらにそれらの位置で、アラニンだけではなく２０個全部のアミノ酸の官能基を試験することができる。コンピューター処理スクリーニングは、組合せの問題を実験的に扱いやすいサイズに縮小することにより、このような複雑さに対処する。

コンピューター処理スクリーニングには、概観すると、４つの段階がある：１）タンパク質鋳型構造または複数の構造の選択と調製、２）可変位置、これらの位置で考慮されるべきアミノ酸の選択、および／または考慮されるアミノ酸をモデル化する回転異性体の選択、３）エネルギー計算、および４）組合せの最適化。より詳しくは、コンピューター処理スクリーニングのプロセスは、以下の通りに記述できる。タンパク質の三次元構造を出発点として使用する。最適化すべき位置を同定する。それは、タンパク質配列であっても、そのサブセット（複数も可）であってもよい。各位置で考慮されるであろうアミノ酸を選択する。好ましい実施態様では、各々の考慮されるアミノ酸は、回転異性体と呼ばれる許される高次構造の独立したセットにより表され得る。各々の考慮されるアミノ酸および各々の他の考慮されるアミノ酸、およびタンパク質主鎖と不変残基を含むタンパク質の残りの部分の間で、相互作用エネルギーを計算する。好ましい実施態様では、各々の考慮されるアミノ酸側鎖回転異性体および各々の他の考慮されるアミノ酸側鎖回転異性体、およびタンパク質主鎖と不変残基を含むタンパク質の残りの部分の間で相互作用エネルギーを計算する。次いで、１またはそれ以上の組合せ検索アルゴリズムを使用して、最低エネルギー配列および／または低エネルギー配列を同定する。

好ましい実施態様では、使用するコンピューター処理スクリーニング方法は、実質的に Protein Design Automation^{(登録商標)} (PDA^{(登録商標)}）技法に類似する。それは、ＵＳ６,１８８,９６５；ＵＳ６,２６９,３１２；ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ９８／０７２５４；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に記載の通りである。他の好ましい実施態様では、実質的に Sequence Prediction Algorithm^(商標) (SPA^(商標)）技法に類似するコンピューター処理スクリーニング方法を使用する。それは、(Raha et al., 2000, Protein Sci 9:1106-1119）、ＵＳＳＮ０９／８７７,６９５およびＵＳＳＮ１０／０７１,８５９に記載の通りである。他の好ましい実施態様では、２００３年３月３日に出願された、「抗体最適化」と題するＵＳＳＮ１０／３３９７８８に記載のコンピューター処理スクリーニング方法を使用する。いくつかの実施態様では、ＰＤＡ^{(登録商標)}技法とＳＰＡ^(商標)技法の組合せ、並びに他の設計手段と組み合わせたこれらのコンピューター処理方法の組合せを含む、異なるコンピューター処理スクリーニング方法の組合せを使用する。同様に、これらのコンピューター処理方法は、同時または連続的に、いかなる順序でも使用できる。

コンピューター処理スクリーニング計算へのインプット（input）として、鋳型構造を使用する。「鋳型構造」は、本明細書において、最適化すべきタンパク質の一部または全部の構造座標を意味する。鋳型構造は、三次元構造（つまり、タンパク質の原子のセットの三次元座標）が知られているか、または計算、評価、モデル化、生成もしくは決定し得るいかなるタンパク質でもあり得る。タンパク質の三次元構造は、Ｘ線結晶構造解析技法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）技法、新規モデリングおよび相同性モデリングを含むがこれらに限定されるものではない方法を使用して決定し得る。構造が実験的に解明されていないタンパク質について最適化が望まれる場合、コンピューター処理スクリーニング計算の鋳型として役立ち得る適当な構造モデルを生成させてもよい。タンパク質の相同性モデルの生成方法は、当分野で知られており、これらの方法は、本発明において用途を見出す。例えば、Luo, et al. 2002, Protein Sci 11: 1218-1226, Lehmann & Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12(4）:371-5.；Lehmann et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1543(2）:408-415；Rath & Davidson, 2000, Protein Sci, 9(12）:2457-69；Lehmann et al., 2000, Protein Eng 13(1）:49-57；Desjarlais & Berg, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90(6）:2256-60；Desjarlais & Berg, 1992, Proteins 12(2）:101-4；Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54:73-97；Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243(4）:574-8；Morea et al., 2000, Methods 20:267-269 参照。タンパク質／タンパク質複合体は、ドッキング（docking）方法を使用しても得られる。鋳型構造として役立ち得るタンパク質構造には、the Research Collaboratory for Structural Bioinformatics (RCSB, 以前は the Brookhaven National Lab）により編集および提供される the Protein Data Base に見出されるもの全てが含まれるが、これらに限定されるものではない。

鋳型構造は、天然にあるか、または工学処理されたタンパク質のものであり得る。鋳型構造は、任意の生物に由来するタンパク質により実質的にコードされるタンパク質のものであり得、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルが好ましい。鋳型構造は、何個のタンパク質構造形態を含んでもよい。好ましい実施態様では、鋳型構造は、Ｆｃ領域またはＦｃのドメインもしくはフラグメントを含む。別の好ましい実施態様では、鋳型構造は、１またはそれ以上のＦｃリガンドに結合したＦｃまたはＦｃのドメインもしくはフラグメントを含み、Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体が好ましい。鋳型構造中のＦｃは、グリコシル化されていてもグリコシル化されていなくてもよい。鋳型構造は、１本以上のタンパク質鎖を含み得る。鋳型構造は、低分子、基質、補因子、金属、水分子、補欠分子族、ポリマーおよび炭水化物を含むがこれらに限定されるものではない、非タンパク質成分をさらに含んでもよい。好ましい実施態様では、鋳型構造は、複数またはセットの鋳型タンパク質、例えば、ＮＭＲから得られたものなどの構造の集合である。あるいは、関連タンパク質または構造のセット、または人工的に創生された集合から、鋳型構造のセットを生成させる。鋳型構造の組成および供給源は、工学処理の目標に依存する。例えば、ヒトＦｃ／ＦｃγＲ親和性の増強のために、ヒトＦｃ／ＦｃγＲ複合体構造またはその派生物を鋳型構造として使用し得る。あるいは、複合体化していないＦｃ構造を鋳型構造として使用し得る。目標がヒトＦｃのマウスＦｃγＲへの親和性を増強することであれば、鋳型構造は、マウスＦｃγＲに結合したヒトＦｃの構造またはモデルであり得る。

鋳型構造は、設計計算に先立ち修飾または変更し得る。様々な鋳型構造調製方法が、ＵＳ６,１８８,９６５；ＵＳ６,２６９,３１２；ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ０９／８７７,６９５；ＵＳＳＮ１０／０７１,８５９,ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ９８／０７２５４；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に記載されている。例えば、好ましい実施態様では、明らかな水素が構造内に含まれていなければ、加えてもよい。別の実施態様では、構造のエネルギー最小化を行って、ファンデルワールスの不調和、不都合な結合角、および不都合な結合の長さに起因するひずみを含むひずみを緩和する。あるいは、方向付けられた、またはランダムな動揺を含む他の方法を使用して、例えば手動で、鋳型構造を変更する。エネルギー計算および組合せの最適化を含むコンピューター処理スクリーニングの後の段階の間に、鋳型構造を修飾することも可能である。別の実施態様では、コンピューター処理スクリーニング計算の前または間に鋳型構造を修飾しない。

一度鋳型構造を得たら、可変位置を選択する。「可変位置」は、本明細書では、アミノ酸本体がコンピューター処理スクリーニング計算において変更を許される位置を意味する。当分野で知られているように、ある可変位置でのみ考慮されるべきアミノ酸修飾を許可することは、計算の複雑さを低下させ、コンピューター処理スクリーニングをより直接的に設計目標に合わせることを可能にする。１またはそれ以上の残基が、コンピューター処理スクリーニング計算において可変位置であり得る。可変位置として選択される位置は、最適化しようとするタンパク質の特性、例えば、ＦｃのＦｃγＲへの親和性、Ｆｃの安定性、Ｆｃの溶解性など、に寄与するか、寄与すると仮定されるものであり得る。可変位置の残基は、特定のタンパク質特性に好都合または不都合に寄与し得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ接点の残基は結合の媒介に関与し得、従って、この位置は、Ｆｃ／ＦｃγＲ親和性の改善を目的とする設計計算において変動させ得る。他の例として、露出した疎水性側鎖を有する残基は、不都合な凝集を引き起こす原因となり得るので、この位置は、溶解性の改善を目的とする設計計算において変動させ得る。可変位置は、特定のタンパク質特性の決定要因である相互作用に直接関与する位置であり得る。例えば、ＦｃのＦｃγＲ結合部位は、その特定のＦγｃＲに接触する全残基を含むと定義し得る。「接触」は、本明細書では、少なくともＦｃ残基の１原子と、少なくとも結合したＦｃγＲの１原子との間の、いくらかの化学的相互作用を意味し、化学的相互作用には、ファンデルワールス相互作用、水素結合相互作用、静電気的相互作用および疎水性相互作用が含まれるがこれらに限定されるわけではない。別の実施態様では、可変位置は、タンパク質の特性に間接的に関与する位置を含み得る。即ち、そのような位置は、Ｆｃの特性に寄与すると知られているかまたは仮定される残基の近傍にあり得る。例えば、ＦｃのＦｃγＲ結合部位は、ＦｃγＲとファンデルワールス接触にある任意のＦｃ残基から一定の距離、例えば４−１０Åにある、全Ｆｃ残基を含むと定義し得る。従って、この場合の可変位置は、ＦｃγＲと直接接触する残基としてだけでなく、ＦｃγＲと接触する残基に接触し、故に間接的に結合に影響を及ぼすものとしても選択し得る。選択される特定の位置は、採用されている設計戦略に依存する。

可変ではない鋳型構造中の１またはそれ以上の位置を、浮動させ得る。「浮動位置」は、本明細書では、コンピューター処理スクリーニング計算において、アミノ酸高次構造の変動を許されるが、アミノ酸本体の変動を許されない位置を意味する。ある実施態様では、浮動位置は、親のアミノ酸本体を有する。例えば、浮動位置は、可変位置残基の近距離、例えば５Åの内にある位置であり得る。別の実施態様では、浮動位置は、親のアミノ酸本体ではないものを有し得る。そのような実施態様は、本発明において、例えば、目標が特定の変異のエネルギーまたは構造的成果を評価することであるときに、用途を見出し得る。

可変でも浮動でもない位置は、固定される。「固定位置」は、本明細書では、アミノ酸本体および高次構造がコンピューター処理スクリーニング計算において一定に保持される位置を意味する。固定し得る位置には、最適化しようとする特性に関与しないと知られているか、または仮定されている残基が含まれる。この場合、これらの位置を変動させることにより、殆どまたは全く得るものがないと仮定している。固定される位置には、その残基が正しい折り畳み、構造、安定性、溶解性および／または生物学的機能の維持に重要であると知られているか、または仮定されている位置も含まれる。例えば、Ｆｃリガンドへの結合および正しいグリコシレーションが確実に乱されないようにするために、各々、特定のＦｃリガンドと相互作用する残基、またはグリコシレーション部位をコードする残基について、位置を固定し得る。同様に、安定性が最適化されているならば、結合が乱されないように、Ｆｃリガンド、例えばＦｃγＲ、と直接または間接的に相互作用する位置を固定するのが有利であり得る。固定位置には、ジスルフィド架橋に関与するシステインなどの構造的に重要な残基、プロリンまたはグリシンなどの主鎖高次構造の決定に不可欠な残基、不可欠な水素結合残基および好都合なパッキング相互作用を形成する残基も含まれ得る。

コンピューター処理スクリーニングの次の段階は、各々の特定の可変位置で考慮される可能なアミノ酸本体のセットを選択することである。この可能なアミノ酸のセットを、本明細書では、可変位置で「考慮されるアミノ酸」と呼ぶ。「アミノ酸」は、ここで使用されるとき、天然の２０個のアミノ酸および任意の非天然または合成類似体のセットを表す。ある実施態様では、２０個の天然アミノ酸全部が考慮される。あるいは、アミノ酸のサブセット、または１つだけのアミノ酸を所定の可変位置で考慮する。当業者にわかるように、検索の組合せの複雑さを減ずるので、ある一定のアミノ酸本体のみを可変位置で考慮することにコンピューター処理上の利益がある。さらに、ある一定のアミノ酸本体のみを可変位置で考慮することは、計算を特定の設計戦略の目標に合わせるために使用し得る。例えば、非グリコシル化Ｆｃの溶解性の最適化のために、炭水化物の非存在下で溶媒に露出する非極性Ｆｃ残基で極性アミノ酸のみを考慮するようにすることは、有利であろう。合成アミノ酸および天然アミノ酸の類似体を含む非天然アミノ酸も、考慮されるアミノ酸であり得る。例えば、Chin et al., 2003, Science, 301(5635）:964-7；and Chin et al., 2003, Chem Biol.10(6）:511-9 参照。

どのアミノ酸が各位置で考慮されるかを選択するのに、広く様々な方法を単独でまたは組み合わせて使用し得る。例えば、所定の可変位置で考慮されるアミノ酸のセットを、溶媒への露出度に基づいて選択し得る。疎水性または非極性アミノ酸は、典型的に、溶媒に接近不可能であるかまたは殆ど接近不可能であるタンパク質の内側またはコアに存在する。従って、可変コア位置では、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンなどの非極性アミノ酸のみを、またはこれらを主として考慮するのが有利であり得る。親水性または極性アミノ酸は、典型的に、かなりの度合いの溶媒接近可能性を有するタンパク質の外側または表面に存在する。従って、可変表面位置では、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジンなどの極性アミノ酸のみを、またはこれらを主として考慮するのが有利であり得る。いくつかの位置は、部分的に露出しかつ部分的に埋まっており、明確にタンパク質コアまたは表面の位置ではなく、ある意味ではコアと表面の残基間の境界残基としてはたらく。従って、そのような可変境界位置では、アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニンなどの、非極性および極性のアミノ酸の両方を考慮するのが有利であり得る。可変位置での溶媒露出度の判定は、タンパク質構造生物学の当業者による鋳型構造の主観的評価または視覚的検査によってもよく、または当分野で知られる様々なアルゴリズムの使用によってもよい。可変位置で考慮されるべきアミノ酸タイプの選択は、ＵＳ６,１８８,９６５；６,２６９,３１２；ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ９８／０７２５４；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に概説されているように、溶媒接近可能領域の計算などのコンピューター処理方法により、または溶媒接近可能表面に対するＣα−Ｃβベクトルの向きを評定するアルゴリズムを使用して、補助するか、または全面的に決定し得る。ある実施態様では、コア、表面または境界位置、またはコア、表面または境界と実質的に類似する分類として、各可変位置を明確に分類し得る。

別の実施態様では、可変位置で許されるアミノ酸のセットの選択は、仮説由来であり得る。どのアミノ酸タイプを可変位置で考慮すべきかについての仮説は、タンパク質構造生物学の当業者による鋳型構造の主観的評価または視覚的検査により導かれ得る。例えば、水素結合相互作用がある可変位置で好都合であると推測されたら、たとえその位置がコアにあっても、水素結合を形成する能力のある極性残基を考慮し得る。同様に、疎水性パッキング相互作用がある可変位置で好都合であると推測されたら、たとえその位置が表面にあっても、好都合なパッキング相互作用を形成する能力のある非極性残基を考慮し得る。仮説由来アプローチの他の例は、主鎖の可撓性またはタンパク質の折り畳みの問題に関与し得る。当分野で知られているように、ある種の残基、例えば、プロリン、グリシンおよびシステインは、タンパク質の構造と安定性に重要な役割を果たす。グリシンは、他の全アミノ酸よりも高い主鎖可撓性を可能にし、プロリンは他の全アミノ酸よりも主鎖を制限し、システインは、ジスルフィド結合を形成し得る。従って、所望の設計目標を達成するために、１またはそれ以上のこれらのアミノ酸タイプを含めることは有利であり得る。あるいは、１またはそれ以上のこれらのアミノ酸タイプを考慮されるアミノ酸のリストから排除するのが有利であり得る。

別の実施態様では、保護範囲（coverage）を最大にするためにアミノ酸のサブセットを選択し得る。この場合、鋳型構造のものと類似の特性を有するさらなるアミノ酸を可変位置で考慮し得る。例えば、鋳型構造中の可変位置の残基が大型疎水性残基であるならば、さらなる大型疎水性アミノ酸をその位置で考慮し得る。あるいは、多様性を最大にするためにアミノ酸のサブセットを選択し得る。この場合、鋳型構造のものと類似しない特性を有するさらなるアミノ酸を可変位置で考慮し得る。例えば、鋳型中の可変位置の残基が大型疎水性残基であるならば、小型、極性などのアミノ酸を考慮し得る。

当分野で知られているように、いくつかのコンピューター処理スクリーニング方法は、考慮されるアミノ酸本体のみが設計計算中に決定されることを必要とする。つまり、アミノ酸側鎖の高次構造または可能な高次構造に関する情報は必要とされない。他の好ましい方法は、回転異性体と呼ばれる、独立した側鎖高次構造のセットを利用し、それは各アミノ酸について考慮される。従って、回転異性体のセットを各可変または浮動位置で考慮し得る。回転異性体は、発表されている回転異性体ライブラリーから得られる（例えば、Lovel et al., 2000, Proteins: Structure Function and Genetics 40:389-408；Dunbrack & Cohen, 1997, Protein Science 6:1661-1681；DeMaeyer et al., 1997, Folding and Design 2:53-66；Tuffery et al., 1991, J Biomol Struct Dyn 8:1267-1289, Ponder & Richards, 1987, J Mol Biol 193:775-791 参照）。当分野で知られているように、回転異性体ライブラリーは、主鎖非依存性または主鎖依存性であり得る。回転異性体は、分子メカニズムから、または非経験的（ab initio）計算から、そして他の方法を使用して、入手してもよい。好ましい実施態様では、可撓性回転異性体モデルを使用する（Mendes et al., 1999, Proteins: Structure, Function, and Genetics 37:530-543参照）。同様に、人工的に生成させた回転異性体を使用し得るか、またはそれにより各アミノ酸および／または可変位置について選択されたセットを拡大し得る。ある実施態様では、現在低エネルギーである少なくとも１つの高次構造を、回転異性体のリストに含める。別の実施態様では、鋳型構造中の可変位置残基の回転異性体を、その可変位置に許される回転異性体のリストに含める。別の実施態様では、可変位置で考慮される各アミノ酸本体のみを与え、各アミノ酸の特定の高次構造状態を設計計算中に使用しない。つまり、回転異性体の使用は、コンピューター処理スクリーニングに必須ではない。

可変位置の選択および／または可変位置で考慮されるアミノ酸の選択を先導するために、実験的情報を使用し得る。当分野で知られているように、タンパク質の構造および機能におけるある一定の残基の役割、例えば、どのタンパク質残基が安定性の決定に役割を果たすか、またはどの残基がタンパク質−タンパク質相互作用の接点を形成するか、を決定するために、変異誘発実験がしばしば実行される。このような実験から得られるデータは、本発明で有用である。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ親和性増強のための可変位置は、変異により結合に影響することが示された全ての位置の変動に関与し得る。同様に、そのような実験の結果を、可変位置で許されるアミノ酸タイプの選択を先導するのに使用し得る。例えば、ある種のタイプのアミノ酸置換が好都合であると判明したら、これらのアミノ酸と同様のタイプを考慮し得る。ある実施態様では、好都合であると実験的に判明したものと類似の特性を有するさらなるアミノ酸を可変位置で考慮し得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ接点における可変位置での大型疎水性残基への実験的変異が好都合であると判明したなら、使用者はコンピューター処理スクリーニングにおいてその位置でさらなる大型疎水性アミノ酸を含めることを選択し得る。当分野で知られているように、ディスプレイおよび他の選択技法をランダムな変異誘発と組合せて、選択された特性に好都合なアミノ酸置換のリストまたは複数のリストを生成させ得る。このような実験作業から得られたかかるリストまたは複数のリストは、本発明に用途を見出す。例えば、そのような実験で可変ではないと判明した位置を、コンピューター処理スクリーニング計算における可変位置として除外し得、一方、より変異を許容しやすいか、または変異に好都合に応答すると判明した位置を、可変位置として選択し得る。同様に、そのような実験の結果を、可変位置で許されるアミノ酸タイプの選択を先導するのに使用し得る。例えば、ある種のタイプのアミノ酸が実験的選択においてより頻繁に現れるならば、それらのアミノ酸と同様のタイプを考慮し得る。ある実施態様では、好都合であると実験的に判明したものに類似する特性を有するさらなるアミノ酸を、可変位置で考慮し得る。例えば、Ｆｃ／ＦｃγＲ接点に存在する可変位置で選択された変異が非荷電極性アミノ酸であると判明したら、使用者は、さらなる非荷電極性アミノ酸、または恐らく荷電極性アミノ酸を、その位置で含めることを選択し得る。

可変位置の選択および／または可変位置で考慮されるアミノ酸の選択を先導するために、配列情報も使用し得る。当分野で知られているように、いくつかのタンパク質は、共通の構造骨格を共有し、配列において相同である。この情報は、タンパク質ファミリーにおける特定の位置への洞察を得るのに使用し得る。当分野で知られているように、どのタンパク質残基が保存され、どれが保存されてないかを決定するために、しばしば配列アラインメントが実行される。言い換えれば、タンパク質配列のアラインメントを比較または対比することにより、ある位置での可変性の度合いを観察し得、各位置で天然に生じるアミノ酸のタイプを観察し得る。かかる分析から得られるデータは、本発明で有用である。可変位置および可変位置で考慮されるアミノ酸の選択に配列情報を使用する有利さは、数倍である。可変位置の選択のために配列情報を使用する主たる利点は、どの位置が変異により寛容であり、どれがあまり寛容ではないかに対して洞察を獲得し得ることである。従って、配列情報は、品質多様性、即ち、タンパク質の構造、安定性などに有害ではない変異が、コンピューター処理的に確実に標本抽出されることを補助し得る。同じ利点が、可変位置で考慮されるアミノ酸タイプを選択するための配列情報の使用に適用される。つまり、タンパク質配列アラインメント中で生じるアミノ酸のセットは、進化により予めスクリーニングされて、タンパク質の構造、安定性、溶解性、機能などに合致する機会をランダムよりも多く有すると見なし得る。従って、より高い品質多様性がコンピューター処理的に標本抽出される。可変位置で考慮されるアミノ酸タイプの選択に配列情報を使用する第２の利益は、ある種のアラインメントがランダム配列よりも低免疫原性であり得る配列を表し得ることである。例えば、所定の可変位置で考慮されるアミノ酸が、ヒトタンパク質配列のアラインメントにおいてその位置で生じるアミノ酸のセットであるならば、それらのアミノ酸は、最適化タンパク質がヒトの治療剤として使用される場合、免疫反応を起こさないか、または低い免疫反応を起こすように、自然により予めスクリーニングされていると見なし得る。

配列の供給源は、広範囲にわたってよく、１またはそれ以上の既知のデータベースを含み得る。それには、the Kabat データベース (Johnson & Wu, 2001, Nucleic Acids Res 29:205-206；Johnson & Wu, 2000, Nucleic Acids Res 28:214-218）、the IMGT データベース（IMGT, the international ImMunoGeneTics information system^{(登録商標)}；Lefranc et al., 1999, Nucleic Acids Res 27:209-212；Ruiz et al., 2000 Nucleic Acids Re. 28:219-221；Lefranc et al., 2001, Nucleic Acids Res 29:207-209；Lefranc et al., 2003, Nucleic Acids Res 31:307-310）、および VBASE、SwissProt、GenBank および Entrez、およびEMBL Nucleotide Sequence Database が含まれる。哺乳動物を含むがこれに限定されない任意の生物に由来する天然産生タンパク質の配列アラインメントから、タンパク質配列情報を入手、編集および／または生成できる。私的に編集されたデータベースからタンパク質配列情報を得ることができる。膨大な配列をベースとするアラインメントプログラムおよび方法が当分野で知られており、これらの全ては、ＦｃおよびＦｃリガンド類を含むタンパク質の配列アラインメントの生成のために、本発明において用途を見出す。

一度アラインメントを作成したら、可変位置の選択を先導するために配列情報を使用できる。そのような配列情報は、所定の位置の可変性（天然であろうとそれ以外であろうと）に関連付けることができる。ここで、可変性は、可変位置とは区別されるべきである。可変性は、配列アラインメント中の所定の位置が、そこで生じるアミノ酸のタイプの変動を示す度合いを表す。繰り返しになるが、可変位置は、コンピューター処理スクリーニング計算においてアミノ酸本体を変化させるように使用者により選択される位置である。可変性は、生物情報学の当業者により定性的に決定され得る。当分野で知られる可変性を定量的に決定する方法もあり、それは本発明で用途を見出し得る。最も好ましい実施態様は、情報エントロピー（Information Entropy）またはシャロンエントロピー（Shannon Entropy）を測定する。可変位置は、密接に関連するタンパク質配列またはあまり密接に関連しない配列から得られる配列情報に基づいて選択できる。

可変位置を選択するための配列情報の使用は、本発明において広範な用途を見出す。例えば、鋳型構造中のＦｃ／ＦｃγＲ接点の位置がトリプトファンであり、トリプトファンがアラインメント中で配列の９０％より多くその位置で観察されるならば、その位置を固定しておくのが有利であり得る。対照的に、他の接点位置がより高いレベルの可変性を有すると判明したら、例えば、５個の異なるアミノ酸が各々約２０％の頻度でその位置で観察されたら、その位置は可変位置として選択し得る。他の実施態様では、整列させたタンパク質配列の視覚的検査は、タンパク質構造の視覚的検査に代わり得るか、またはそれを補助し得る。配列情報は、可変位置で考慮されるアミノ酸の選択を先導するのにも使用できる。そのような配列情報は、所定の位置でどれくらい頻繁にアミノ酸、複数のアミノ酸またはアミノ酸のタイプ（例えば、極性または非極性、荷電または非荷電）が、天然またはそれ以外に生じるかに関連付けることができる。ある実施態様では、可変位置で考慮されるアミノ酸のセットは、アラインメントにおいてその位置で観察されるアミノ酸のセットを含み得る。従って、位置特異的アラインメント情報を、コンピューター処理スクリーニング計算において可変位置で考慮されるアミノ酸のリストの生成に直接使用する。そのような戦略は当分野で周知である；例えば、Lehmann & Wyss, 2001, Curr Opin Biotechnol 12(4）:371-5；Lehmann et al., 2000, Biochim Biophys Acta 1543(2）:408-415；Rath & Davidson, 2000, Protein Sci, 9(12）:2457-69；Lehmann et al., 2000, Protein Eng 13(1）:49-57；Desjarlais & Berg, 1993, Proc Natl Acad Sci USA 90(6）:2256-60；Desjarlais & Berg, 1992, Protein s 12(2）:101-4；Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54:73-97；Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243(4）:574-8 参照。別の実施態様では、可変位置または複数の位置で考慮されるアミノ酸のセットは、アラインメント中で最も頻繁に観察されるアミノ酸のセットを含み得る。従って、そのアミノ酸またはアミノ酸タイプの頻度が、それを可変位置で考慮されるアミノ酸のセットに含めることを正当化するか否かを決定するのに、ある一定の基準が適用される。当分野で知られているように、アラインメント中の任意の位置の配列多様性およびある位置での各アミノ酸の存在頻度または確率を計算する統計的方法を使用して、配列アラインメントを分析し得る。次いで、そのようなデータを、どのアミノ酸タイプを考慮するかを決定するのに使用し得る。最も簡潔な実施態様では、これらの存在頻度は、あるアラインメント位置であるアミノ酸が観察される回数を計数し、次いでアラインメント中の配列の総数で割ることにより計算される。他の実施態様では、計数手法に対する各配列、位置またはアミノ酸の寄与に、様々な可能なメカニズムにより重みを付ける。好ましい実施態様では、頻度の統計への各整列配列の寄与に、アラインメント中の他の配列と比較した多様性の重みに従って重みを付ける。これを達成するための一般的な戦略は、Henikoff および Henikoff により推奨される配列重み付けシステムである（Henikoff & Henikoff, 2000, Adv Protein Chem 54:73-97；Henikoff & Henikoff, 1994, J Mol Biol 243:574-8）。好ましい実施態様では、統計への各配列の寄与は、その標的配列、即ち、使用される鋳型構造、への類似性の程度に依存し、標的配列に高い類似性を有する配列は、より高く重みを付けられるようにする。類似性測定の例には、配列同一性、ＢＬＯＳＵＭ類似性スコア、ＰＡＭマトリックス類似性スコア、およびＢＬＡＳＴスコアが含まれるが、これらに限定されるものではない。別の実施態様では、統計への各配列の寄与は、その既知の物理的または機能的特性に依存する。これらの特性には、熱的および化学的安定性、活性への寄与および溶解性が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、非グリコシル化Ｆｃを溶解性について最適化するとき、最も安定であると知られているアラインメント中の配列（例えば、Ewert et al., 2003, J Mol Biol 325:531-553 参照）は、計算される頻度により重く寄与するであろう。

可変位置で考慮されるべき配列アラインメント中のアミノ酸のセットの選択にどのような基準を適用するかに関わらず、考慮されるアミノ酸の選択に配列情報を使用することは、本発明において広範な用途を見出す。例えば、露出した非極性表面残基を置き換えることによりＦｃ溶解性を最適化するために、考慮されるアミノ酸は、タンパク質配列のアラインメントにおいてその位置で観察されるアミノ酸のセット、またはいくつかの基準に合うそれらのアミノ酸のサブセットとして選択し得る。他の例として、保護範囲を最大にするために、配列アラインメントから導かれたアミノ酸のリストに、１またはそれ以上のアミノ酸を主観的に加えるか、または除外し得る。例えば、配列アラインメント中に見出されるものと類似の特性を有するさらなるアミノ酸を、可変位置で考慮し得る。例えば、ＦｃγＲに結合すると知られているか、または仮定されるＦｃ位置が、配列アラインメント中で非荷電極性アミノ酸を有すると観察されたら、使用者は、コンピューター処理スクリーニング計算において、その位置でさらなる非荷電極性アミノ酸、または恐らく荷電極性アミノ酸を含めることを選択し得る。

ある実施態様では、配列アラインメント情報を、後で論ずるエネルギー計算と組み合わせる。例えば、偽のエネルギーを配列情報から導き、スコアリング関数を生成させる。配列をベースとするスコアリング関数の使用は、計算の複雑さをかなり低減させるのを助け得る。しかしながら、当業者にはわかるように、配列情報は、実際は構造的に矛盾していることがある変異間の相関への誤指示をしばしば示すので、配列をベースとするスコアリング関数単独の使用は、不適切なことがある。従って、好ましい実施態様では、構造をベースとするエネルギー計算方法を、単独でまたは配列をベースとするスコアリング関数と組み合わせて使用する。つまり、好ましい実施態様は、分析段階として配列アラインメント情報単独を当てにしない。

エネルギー計算は、アミノ酸修飾をスコアリングするプロセスを表す。相互作用のエネルギーは、１またはそれ以上のスコアリング関数により測定される。様々なスコアリング関数が、エネルギー計算のために本発明において用途を見出す。スコアリング関数は、ファンデルワールスポテンシャル、水素結合ポテンシャル、原子溶媒和ポテンシャルまたは他の溶媒和モデル、二次構造性向ポテンシャル、静電気的ポテンシャル、ねじれポテンシャルおよびエントロピーポテンシャルを含むがこれらに限定されるものではない何個のポテンシャル（スコアリング関数のエネルギー項として本明細書において言及される）を含んでもよい。少なくとも１つのエネルギー項を使用して各可変または浮動位置をスコアリングするが、エネルギー項は、位置、考慮されるアミノ酸および他の検討事項に応じて異なり得る。ある実施態様では、１つのエネルギー項を使用するスコアリング関数を使用する。最も好ましい実施態様では、１より多いエネルギー項を含むスコアリング関数を使用して、例えば、ファンデルワールス、溶媒和、静電気および水素結合相互作用、およびこれらの組合せを記述して、エネルギーを計算する。さらなる実施態様では、さらなるエネルギー項には、エントロピー項、ねじれエネルギーおよび知識をベースとするエネルギーが含まれるが、これらに限定されるわけではない。

様々なスコアリング関数が、ＵＳ６,１８８,９６５；ＵＳ６,２６９,３１２；ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ０９／８７７,６９５；ＵＳＳＮ１０／０７１,８５９,ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ９８／０７２５４；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に記載されている。当業者にはわかるように、スコアリング関数は、物理化学的エネルギーの項に限定される必要はない。例えば、知識をベースとするポテンシャルは、本発明のコンピューター処理スクリーニング方法論において用途を見出し得る。そのような知識をベースとするポテンシャルは、スレッディング（threading）ポテンシャル、参照エネルギー、偽エネルギー、相同性をベースとするエネルギーおよび配列アラインメントから導かれた配列の偏重を含むがこれらに限定されるものではない、タンパク質配列および／または構造の統計から導かれ得る。好ましい実施態様では、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）へのペプチドの結合に関するデータから導かれた関数などの、免疫原性のモデルを含むようにスコアリング関数を修飾し、それを免疫原性の可能性のある配列の同定に使用し得る（例えば、ＵＳＳＮ０９／９０３,３７８；ＵＳＳＮ１０／０３９,１７０；ＵＳＳＮ６０／２２２,６９７；ＵＳＳＮ１０／３３９７８８；ＰＣＴＷＯ０１／２１８２３；およびＰＣＴＷＯ０２／００１６５参照）。ある実施態様では、アミノ酸置換をスコアリングするのに、配列アラインメント情報を使用できる。例えば、タンパク質配列の比較は、当該タンパク質の供給源がヒト、サル、マウスまたは他のもののいずれであっても、本発明のコンピューター処理スクリーニング方法論においてアミノ酸変異を示唆またはスコアリングするのに使用し得る。ある実施態様では、当分野で知られているように、１またはそれ以上のスコアリング関数を、コンピューター処理分析中に最適化または「錬成」し、その後最適化システムを使用して分析を再実行し得る。そのような変更されたスコアリング関数は、例えば、実験データを使用してスコアリング関数を錬成することにより得られる。当業者にはわかるように、１またはそれ以上のエネルギー項からなる数々の力場は、スコアリング関数として役立ち得る。力場には、非経験的または量子力学の力場、半経験的力場および分子力学の力場が含まれるが、これらに限定されるわけではない。知識をベースとするか、または統計的方法を使用するスコアリング関数は、本発明において用途を見出し得る。これらの方法は、配列と三次元タンパク質構造との適合を評定するのに使用し得、故にタンパク質構造への忠実度についてアミノ酸置換をスコアリングするのに使用し得る。ある実施態様では、変異配列スコアを個別に計算することによりコンピューター処理的に配列をスクリーニングするために、分子力学計算を使用し得る。

効率的なエネルギー計算を可能にするためにアミノ酸を表すのに、様々なやり方がある。好ましい実施態様では、考慮されるアミノ酸を、前記したように回転異性体として表し、各可変および浮動位置で可能な各々の回転異性体と、他の可変および浮動回転異性体、固定位置残基、主鎖構造、および任意の非タンパク質原子との相互作用のエネルギー（またはスコア）を計算する。好ましい実施態様では、あらゆる可変および浮動位置で各側鎖回転異性体につき、２セットの相互作用エネルギーを計算する：回転異性体と固定原子との相互作用エネルギー（「シングル」エネルギー）、および可変および浮動位置の回転異性体と、あらゆる他の可変および浮動位置での他の可能な全回転異性体との相互作用エネルギー（「ダブル」エネルギー）。別の実施態様では、シングルおよびダブルエネルギーを、固定位置並びに可変および浮動位置について計算する。別の実施態様では、考慮されるアミノ酸は、回転異性体として表されない。

コンピューター処理スクリーニングの重要な成分は、好都合なスコアを有する、即ち低エネルギーである、１またはそれ以上の配列の同定である。極度に多数の可能性から低エネルギー配列のセットを決定することは、些細なことではなく、この問題を解決するために組合せの最適化アルゴリズムを用いる。組合せの最適化アルゴリズムの必要性は、典型的なコンピューター処理スクリーニング計算において考慮される可能性の数を調べることにより例示説明される。回転異性体セットの独立性は、所定の設計問題についての可能な回転異性体配列数の単純計算を可能にする。ｍ個の可能な回転異性体を位置毎に有する長さｎの主鎖は、ｍⁿ個の可能な回転異性体配列を有し、数は配列の長さに伴い指数関数的に増大する。非常に単純な計算のためには、最適配列および／または１またはそれ以上の好都合な配列を同定するために、各々の可能な配列を調べることが可能である。しかしながら、典型的な設計の問題のためには、可能な配列の数（１０⁸⁰またはそれ以上まで）は、大きすぎて各々の可能な配列を調べることは手に負えない。最適配列および／または１またはそれ以上の好都合な配列を同定するために、様々な組合せの最適化アルゴリズムを使用し得る。組合せの最適化アルゴリズムは、２つのクラスに分けられ得る：（１）それらが収束するならば、大域的最小エネルギー配置（global minimum energy configuration ）を出すことを保証するもの、および（２）大域的最小エネルギー配置を出すことを保証しないが、常にある解答を出すもの。第１のクラスのアルゴリズムの例には、Dead-End Elimination (DEE）および Branch & Bound (B&B） (Branch and Terminate を含む） (Gordon & Mayo, 1999, Structure Fold Des 7:1089-98）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。第２のクラスのアルゴリズムの例には、Monte Carlo (MC）、自己無撞着性平均力場（ＳＣＭＦ）、Boltzmann サンプリング (Metropolis et al., 1953, J Chem Phys 21:1087）、模擬アニーリング (Kirkpatrick et al., 1983, Science, 220:671-680）、遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）および Fast and Accurate Side-Chain Topology and Energy Refinement (FASTER） (Desmet, et al., 2002, Proteins, 48:31-43）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。組合せの最適化アルゴリズムは、単独で、または他の組合せの最適化アルゴリズムと共に使用し得る。

本発明のある実施態様では、組合せの最適化アルゴリズムを適用する戦略は、大域的最小エネルギー配置を見出すためのものである。別の実施態様では、その戦略は、１またはそれ以上の低エネルギーのまたは好都合な配列を見出すためのものである。別の実施態様では、その戦略は、大域的最小エネルギー配置を見出し、次いで１またはそれ以上の低エネルギーのまたは好都合な配列を見出すためのものである。例えば、ＵＳＳＮ６,２６９,３１２に概説されているように、好ましい実施態様は、Dead End Elimination (DEE）段階および Monte Carlo 段階を利用する。他の実施態様では、他の検索方法の中でも、タブー検索アルゴリズムを使用するか、またはDEE および／または Monte Carlo と組み合わせる（Modern Heuristic Search Methods, edited by V.J. Rayward-Smith et al., 1996, John Wiley & Sons Ltd.；USSN 10/218,102；and PCT WO 02/25588 参照）。他の好ましい実施態様では、遺伝的アルゴリズムを使用し得る；例えば、ＵＳＳＮ０９／８７７,６９５およびＵＳＳＮ１０／０７１,８５９参照。他の例として、ＵＳ６,１８８,９６５；ＵＳ６,２６９,３１２；ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ９８／０７２５４；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８により詳細に記載されているように、大域的最適に到達してもよく、次いでさらなる最適化配列を生成させるコンピューター処理プロセッシングをさらに行ってもよい。最も簡潔な実施態様では、設計計算は組合せのものではない。つまり、エネルギー計算を使用して、単一の可変位置でアミノ酸置換を個別に評価する。他の計算には、１より多い可変位置でアミノ酸置換を評価するのが好ましい。好ましい実施態様では、組合せの最適化に先立ち、可能な全相互作用エネルギーを計算する。別の好ましい実施態様では、組合せの最適化中に随時エネルギーを計算してもよい。

ライブラリー生成
本発明は、最適化Ｆｃ変異体を選抜するために後に実験的にスクリーニングし得るライブラリーの生成方法を提供する。「ライブラリー」は、本明細書で使用されるとき、１またはそれ以上のＦｃ変異体のセットを意味する。ライブラリーは、いかなる形態の変異体のセットを表してもよい。ある実施態様では、ライブラリーは、核酸またはアミノ酸配列のリスト、可変位置での核酸またはアミノ酸置換のリストである。例えば、下記で本発明を例示説明するために使用される実施例は、可変位置でのアミノ酸置換としてライブラリーを提供する。ある実施態様では、ライブラリーは、所望の特性について最適化されたＦｃ変異体である少なくとも１つの配列のリストである。例えば、Filikov et al., 2002, Protein Sci 11:1452-1461 および Luo et al., 2002, Protein Sci 11:1218-1226 参照。別の実施態様では、ライブラリーは、組合せのリストとして定義され得る。これは、各可変位置についてアミノ酸置換のリストを生成させることを意味し、各置換は他の全可変位置で他の全ての設計された置換と組み合わされるものであることを暗示する。この場合、全可変位置での全可能性の組合せの拡大は、大きい明確に定義されたライブラリーをもたらす。ライブラリーは、Ｆｃ領域またはＦｃ領域のいくつかのドメインまたはフラグメントを含むポリペプチドの物理的組成物を表してもよい。従って、ライブラリーは、精製または未精製形態のどちらでも、抗体またはＦｃ融合体の物理的組成物を表し得る。ライブラリーは、ライブラリー配列をコードする核酸の物理的組成物を表し得る。当該核酸は、ライブラリーのメンバーをコードする遺伝子、ライブラリーのメンバーを任意の機能し得るように連結された核酸と共にコードする遺伝子、またはライブラリーのメンバーを機能し得るように連結された調節配列、選択マーカー、融合体コンストラクトおよび／または他のエレメントと共にコードする発現ベクターであってもよい。例えば、ライブラリーは、Ｆｃライブラリーのメンバーをコードする哺乳動物発現ベクター、後に実験的に発現、精製およびスクリーニングされ得るそのタンパク質産物のセットであり得る。他の例として、ライブラリーは、ディスプレイライブラリーであり得る。そのようなライブラリーは、例えば、ファージディスプレイ、リボソームディスプレイ、酵母ディスプレイ、細菌表面ディスプレイなどを可能にするいくつかの融合体パートナーに機能し得るように連結されたライブラリーのメンバーをコードする発現ベクターのセットを含み得る。

コンピューター処理スクリーニングのアウトプット配列または複数の配列を使用して、ライブラリーを生成させ得る。上記で論じたとおり、コンピューター処理的に生成されたライブラリーは、ランダムに生成されたライブラリーと比較して、安定性、正しい折り畳み、および機能的配列に有意に富む。結果的に、コンピューター処理スクリーニングは、設計目標について最適化されたタンパク質を同定する機会を増やす。ライブラリー中の配列のセットは、一般的に、しかし常にではなく、親配列と有意に異なるが、ライブラリーが好ましくは親配列を含有する場合もある。当分野で知られているように、コンピューター処理スクリーニング計算のアウトプットからライブラリーを導き得る様々なやり方がある。例えば、ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に記載されたライブラリー生成方法は、本発明において用途を見出す。ある実施態様では、大域的最適配列のある一定の範囲内をスコアリングする配列は、ライブラリーに含まれ得る。例えば、最低エネルギー配列の１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内にある全配列を、ライブラリーとして使用し得る。別の実施態様では、１またはそれ以上の局所的最小配列のある一定の範囲内をスコアリングする配列を使用し得る。好ましい実施態様では、フィルタリングされたセットからライブラリー配列を得る。そのようなリストまたはセットは、当分野で知られているように、様々な方法で、例えば、Monte Carlo、B&BまたはSCMFなどのアルゴリズムを使用して、生成させ得る。例えば、フィルタリングされたセット中の上位の１０³または上位の１０⁵の配列が、ライブラリーを構成し得る。あるいは、全変異の組合せにより定義される配列総数を、ライブラリーのカットオフ基準として使用し得る。組換え配列の総数に好ましい値は、１０ないし１０²⁰の範囲にあり、特に好ましい値は、１００ないし１０⁹の範囲にある。あるいは、カットオフは、位置毎に予め定めた変異の数に到達したら強制され得る。いくつかの実施態様では、カットオフに合わない配列がライブラリーに含まれる。このことは、例えば、ライブラリー生成へのアプローチの評価、対照または比較対象の提供、または付加的配列空間の標本抽出などの、いくつかの状況で望ましい。例えば、親配列は、カットオフに合わなくても、ライブラリーに含まれ得る。

集束化アルゴリズムは、コンピューター処理スクリーニング方法により導かれた配列を代表的なグループに分類するのに有用であり得る。例えば、ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に記載されている集束化方法およびそれらの応用は、本発明において用途を見出す。代表的なグループは、例えば類似性により、定義し得る。類似性の測定には、配列類似性およびエネルギー的類似性が含まれるが、これらに限定されるものではない。従って、コンピューター処理スクリーニングからのアウトプット配列を、局所的最小の周囲に集束化し得、これは本明細書において配列の集束化セットと呼ばれる。例えば、配列空間中で近い配列のセットを、他のセットから区別し得る。ある実施態様では、１またはそれ以上の配列の集束化セットを形成するいくつかの、殆どの、または全ての配列をライブラリーに含めることにより、集束化セットの１つまたはサブセット内の保護範囲を最大化し得る。例えば、これらのセット内の配列の大部分をライブラリーに含めることにより、１つ、２つまたは３つの最低エネルギー集束化セット内の保護範囲を最大化するのが有利であり得る。別の実施態様では、ライブラリー内に各集束化セット内の配列のサブセットのみを含めることにより、配列の集束化セット間の多様性を標本抽出し得る。例えば、ライブラリーに各集束化セットからの最低エネルギー配列を含めることにより、全てまたは殆どの集束化セットを広くサンプリングし得る。

ライブラリー生成用のコンピューター処理スクリーニングの結果を先導またはフィルタリングするのに、配列情報を使用し得る。論じたように、タンパク質配列のアラインメントを比較または対比することにより、ある位置での可変性の度合いおよびその位置で天然に生じるアミノ酸のタイプを観察し得る。かかる分析から得られるデータは、本発明で有用である。配列情報を使用する利益は論じたが、それらの利益は、ライブラリー生成を先導するための配列情報の使用に同等に適用される。タンパク質配列アラインメント中で生じるアミノ酸のセットは、進化により予めスクリーニングされて、タンパク質の構造、安定性、溶解性、機能および免疫原性に合致する機会をランダムよりも多く有すると見なし得る。様々な配列供給源、並びに配列アラインメントの生成方法を論じたが、これらはライブラリー生成の先導への配列情報の適用に用途を見出す。同様に、上記で論じたように、アラインメント中のある残基の重要性または重みの決定に様々な基準を適用し得る。これらの方法も、ライブラリー生成の先導への配列情報の適用に用途を見出す。コンピューター処理スクリーニングの結果からのライブラリー生成を先導するのに配列情報を使用することは、本発明において広範な用途を見出す。ある実施態様では、配列情報を使用して、コンピューター処理スクリーニングのアウトプットに由来する配列をフィルタリングする。言い換えると、コンピューター処理のアウトプットからいくつかの置換を差し引いてライブラリーを生成させる。例えば、生じるコンピューター処理スクリーニング計算または複数の計算のアウトプットを、ライブラリーが、いくつかの基準に合うアミノ酸またはアミノ酸のサブセット、例えば、その位置で配列のアラインメント中に観察されるもの、のみを含むようにフィルタリングし得る。別の実施態様では、配列情報を使用してコンピューター処理スクリーニングのアウトプットに配列を追加する。言い換えれば、コンピューター処理のアウトプットに追加するさらなるアミノ酸の選択の先導に配列情報を使用して、ライブラリーを生成させる。例えば、コンピューター処理スクリーニング計算からの所定の位置のアミノ酸のセットのアウトプットを、タンパク質配列のアラインメントにおいてその位置で観察される１またはそれ以上のアミノ酸を含めるように増やし得る。別の実施態様では、配列アラインメント情報に基づき、保護範囲または多様性を最大にするために、１またはそれ以上のアミノ酸をコンピューター処理スクリーニング配列のアウトプットに追加するか、またはそこから差し引く。例えば、配列アラインメントに見出されるものと類似の特性を有するさらなるアミノ酸を、ライブラリーに追加し得る。例えば、ある位置が配列アラインメント中で非荷電極性アミノ酸を有すると観察されたら、さらなる非荷電極性アミノ酸をその位置でライブラリー中に含めてもよい。

後続ライブラリーの生成のために、ライブラリーをさらに加工し得る。このように、コンピューター処理スクリーニング計算または複数の計算のアウトプットを、一次ライブラリーと見なし得る。この一次ライブラリーは、後続ライブラリー、本明細書では二次ライブラリーと呼ぶ、の生成のために、他の計算または他のライブラリーに由来する他の一次ライブラリーと組み合わせたり、後続する計算、配列情報または他の分析を使用して加工したり、実験的に加工したりし得る。この記載からわかるように、上記で論じたようなライブラリーを先導またはフィルタリングするための配列情報の使用は、それ自体、一次ライブラリーから二次ライブラリーを生成するための１つの方法である。二次ライブラリーの生成は、使用者にライブラリー内のより多くのパラメーターの制御をもたらす。このことは、より効率的な実験的スクリーニングを可能にし、実験結果からのフィードバックをより容易に解釈することを可能にし、より効率的な設計／実験サイクルをもたらし得る。

一次ライブラリーから二次ライブラリーを生成させる様々な方法がある。例えば、ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８は、本発明に用途を見出す二次ライブラリーの生成方法を記載している。典型的に、一次ライブラリーが何らかのやり方で加工されるいくつかの選択段階が生じる。例えば、ある実施態様では、いくつかの一次配列のセットを選択し、二次ライブラリーを形成する選択段階が生じる。別の実施態様では、選択段階はコンピューター処理段階であり、再度、いくつかの一次ライブラリーのサブセットを選択し、次いでさらなるコンピューター処理的分析に付す選択段階を一般的に含む。これはさらなるコンピューター処理スクリーニング並びに「インシリコ（in silico）」シャフリング（shuffling）または組換えなどの技法の両方を含む（例えば、ＵＳ５,８３０,７２１；ＵＳ５,８１１,２３８；ＵＳ５,６０５,７９３；およびＵＳ５,８３７,４５８、例えば修飾ヌクレオチドを使用する、誤りがちなＰＣＲ；マルチカセットの使用を含む既知の変異誘発技法；およびＤＮＡシャフリング（Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291；Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354-9；Coco et al., 2002, Nat Biotechnol, 20:1246-50）、異種ＤＮＡサンプル (US 5,939,250）；ITCHY (Ostermeier et al., 1999, Nat Biotechnol 17:1205-1209）；StEP (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261）、GSSM (US 6,171,820 および US 5,965,408）；インビボ相同組換え、リガーゼ補助遺伝子集合、末端相補的ＰＣＲ、プロフュージョン（profusion）(Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302）；酵母／細菌表面ディスプレイ (Lu et al., 1995, Biotechnology 13:366-372）；Seed & Aruffo, 1987, Proc Natl Acad Sci USA 84(10）:3365-3369；Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557）。別の実施態様では、実験段階、例えば、下記のライブラリースクリーニング段階のいずれか、である選択段階が生じ、一次ライブラリーのいくつかのサブセットが選択され、例えば、以下で論ずる定方向進化方法の１つを使用して実験的に組換えられ、二次ライブラリーを形成する。好ましい実施態様では、ＵＳ６,４０３,３１２に概説のように一次ライブラリーを生成させ、加工する。

二次および後続ライブラリーの生成は、本発明において広範な用途を見出す。ある実施態様では、異なる一次ライブラリーを組み合わせて二次または後続ライブラリーを生成させ得る。他の実施態様では、二次ライブラリーは、変異性が高いかまたは保存性が高い位置で配列多様性を標本抽出することにより生成させ得る。一次ライブラリーを分析して、鋳型タンパク質中のどのアミノ酸位置が高い変異頻度を有するか、そしてどの位置が低い変異頻度を有するかを判定し得る。例えば、コンピューター処理スクリーニングにおいてかなりの変異多様性を示すタンパク質中の位置を、設計計算の後続ラウンドにおいて固定し得る。最初のものと同じサイズのフィルタリングされたセットは、最初のライブラリー中で大概保存されていた位置で、多様性を示すであろう。あるいは、変異数の高い位置でアミノ酸を変化させ、ある一定の頻度を超える変異を有さない位置を一定に保つことにより、二次ライブラリーを生成させ得る。

この議論は、ライブラリーの生成を、一次ライブラリー、二次ライブラリーと続くものに制限することを意味しない。理解されるように、一次および二次ライブラリーをさらに加工して、三次ライブラリー、４次ライブラリーなどを生成させ得る。このように、ライブラリー生成は、反復的プロセスである。例えば、１またはそれ以上の二次ライブラリーに適用される様々な付加的段階を使用して、三次ライブラリーを構築し得る；例えば、さらなるコンピューター処理的加工を行ってもよく、二次ライブラリーを再度組み合わせてもよく、異なる二次ライブラリーのサブセットを組み合わせてもよい。好ましい実施態様では、三次ライブラリーは、二次ライブラリーを組み合わせることにより生成させ得る。例えば、タンパク質の異なる部分を分析した一次および／または二次ライブラリーを組合せ、組み合わせたタンパク質の部分を扱う三次ライブラリーを生成させ得る。別の実施態様では、一次ライブラリー由来の変異体を別の一次ライブラリー由来の変異体と組合せ、非常に長いフィルタリングされたセットを創生するよりも低いコンピューター処理のコストで、組み合わされた三次ライブラリーを提供し得る。これらの組合せを使用して、例えば、大型タンパク質、特に大型マルチドメインタンパク質（Ｆｃはその例である）を分析し得る。このように、上記の二次ライブラリー生成の記載は、一次ライブラリーに後続する任意のライブラリーの生成に適用され、最終結果は、設計目標について最適化されたタンパク質変異体を得るために実験的にスクリーニングされ得る最終ライブラリーである。これらの例は、二次ライブラリーの生成をいかなる特定の適用または本発明の操作理論に制限することも意味しない。むしろ、これらの例は、二次ライブラリーおよび三次ライブラリーなどの後続ライブラリーの生成が、ライブラリー生成のためのコンピューター処理スクリーニング方法論に幅広く有用であることを例示説明する意味である。

実験的産生およびスクリーニング
本発明は、Ｆｃ変異体ライブラリーの産生およびスクリーニングの方法を提供する。記載した方法は、本発明をいかなる特定の適用または操作理論にも制限することを意味しない。むしろ、提供される方法は、１またはそれ以上のＦｃ変異体または１またはそれ以上のＦｃ変異体ライブラリーを実験的に産生およびスクリーニングし、最適化Ｆｃ変異体を入手し得ることを一般的に例示説明する意味である。Ｆｃ変異体は、本明細書で厳密に定義した通りのＦｃ領域、そのドメインまたはフラグメント、または抗体またはＦｃ融合体などのＦｃを含む大きいポリペプチドとしてなど、いかなる文脈で産生およびスクリーニングしてもよい。抗体の分子生物学、発現、生成およびスクリーニングのための一般方法は、Antibody Engineering, edited by Duebel & Kontermann, Springer-Verlag, Heidelberg, 2001；および Hayhurst & Georgiou, 2001, Curr Opin Chem Biol 5:683-689；Maynard & Georgiou, 2000, Annu Rev Biomed Eng 2:339-76 に記載されている。

本発明のある実施態様では、ライブラリー配列を使用して、そのメンバーの配列をコートする核酸を創生する。それは、次いで、所望により宿主細胞にクローニングされ、発現され、アッセイされ得る。このように、各メンバーのタンパク質配列をコードする核酸、そして特にＤＮＡを作成し得る。これらの実践は周知手法を使用して実行される。例えば、本発明で用途を見出し得る様々な方法が、Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3^rd Ed. (Maniatis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001）および Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons）に記載されている。当業者にはわかるように、多数の配列を含むライブラリーの配列そのものの生成は、潜在的に高価であり時間がかかる。従って、本発明のライブラリーを効率的に生成させるのに使用し得る様々な技法がある。本発明で用途を見出し得るそのような方法は、ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に記載または参照されている。そのような方法には、遺伝子集合方法、ＰＣＲをベースとする方法およびＰＣＲの変形を使用する方法、リガーゼ連鎖反応をベースとする方法、合成的混合、誤りがちな増幅方法およびランダムな変異を有するオリゴを使用する方法で用いられるもののような集積オリゴ（pooled oligo）方法、古典的部位特異的変異誘発方法、カセット変異誘発、および他の増幅および遺伝子合成方法が含まれるが、これらに限定されるわけではない。当分野で知られているように、遺伝子集合、変異誘発、ベクターのサブクローニングなどのための様々な市販のキットおよび方法がある。そのような市販品は、ライブラリーのＦｃ変異体メンバーをコードする核酸を生成させるために、本発明に用途を見出す。

本発明のＦｃ変異体は、Ｆｃ変異体をコードする核酸を含有する核酸、好ましくは発現ベクターを形質移入された宿主細胞を、タンパク質の発現を誘導するかまたは引き起こすのに適切な条件下で培養することにより産生させ得る。発現に適する条件は、発現ベクターおよび宿主細胞の選択によって変動し、日常的な実験を通して容易に当業者に確認されるであろう。幅広い様々な適する宿主細胞を使用し得、それには哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞および酵母が含まれるが、これらに限定されるものではない。例えば、本発明において用途を見出し得る様々な細胞株が、the American Type Culture Collection から入手可能な ATCC^{(登録商標)}細胞株カタログに記載されている。

好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体は、哺乳動物発現系で発現される。これには、レトロウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスを使用して発現コンストラクトが哺乳動物細胞に導入されるシステムが含まれる。いかなる哺乳動物細胞を使用してもよく、ヒト、マウス、ラット、ハムスターおよび霊長類の細胞が特に好ましい。適する細胞には、Jurkat T 細胞、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＣＯＳおよび２９３細胞を含むがこれらに限定されるものではない、既知の研究用細胞も含まれる。別の好ましい実施態様では、ライブラリーのタンパク質は、細菌細胞で発現される。細菌発現系は当分野で周知であり、大腸菌 (E. coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、ストレプトコッカス・クレモリス（Streptococcus cremoris）およびストレプトコッカス・リビダンス（Streptococcus lividans）が含まれる。別の実施態様では、Ｆｃ変異体は、昆虫細胞または酵母細胞で産生される。別の実施態様では、Ｆｃ変異体は、無細胞翻訳系を使用してインビトロで発現される。原核生物 (例えば、E. coli）および真核生物 (例えば、麦芽、ウサギの網状赤血球）細胞の両方に由来するインビトロ翻訳系が入手可能であり、関心のあるタンパク質の発現レベルおよび機能的特性に基づいて選択し得る。例えば、当業者にはわかるように、インビトロ翻訳は、例えばリボソームディスプレイなどのいくつかのディスプレイ技法に必要とされる。加えて、Ｆｃ変異体は、化学合成方法により産生してもよい。

本発明のＦｃ変異体をコードする核酸は、タンパク質を発現するために発現ベクターに導入され得る。様々な発現ベクターをタンパク質発現のために利用し得る。発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込む自己複製用染色体外ベクターまたは複数のベクターを含んでもよい。発現ベクターは、宿主の細胞タイプに適合するように構築される。従って、本発明において用途を見出す発現ベクターには、哺乳動物細胞、細菌、昆虫細胞、酵母およびインビトロ系でタンパク質発現を可能にするものが含まれるがこれらに限定されるわけではない。当分野で知られているように、Ｆｃ変異体タンパク質の発現のために本発明において用途を見出し得る様々な発現ベクターが、商業的にまたは他の手段で入手可能である。

発現ベクターは、典型的に、制御または調節配列、選択可能マーカー、任意の融合体パートナーおよび／または付加的エレメントに機能し得るように連結されたタンパク質を含む。「機能し得るように連結された」は、本明細書において、核酸が他の核酸配列と機能的関係に置かれていることを意味する。一般に、これらの発現ベクターは、Ｆｃ変異体をコードする核酸に機能し得るように連結された転写および翻訳調節核酸を含み、典型的にタンパク質の発現に使用される宿主細胞に適するものである。一般に、転写および翻訳調節配列には、プロモーター配列、リボソーム結合部位、転写開始および停止配列、翻訳開始および停止配列、およびエンハンサーまたは活性化配列が含まれ得る。当分野でまた知られている通り、発現ベクターは、発現ベクターを含有する形質移入された宿主細胞の選択を可能にする選択遺伝子またはマーカーを典型的に含有する。選択遺伝子は、当分野で周知であり、使用される宿主細胞とともに変動する。

Ｆｃ変異体は、発現されたタンパク質の標的化、精製、スクリーニング、ディスプレイなどを可能にする融合体パートナーに機能し得るように連結されていてもよい。融合体パートナーは、リンカー配列を介してＦｃ変異体配列に連結していてもよい。リンカー配列は、一般的に、典型的に１０個より少ない、少数のアミノ酸を含むが、もっと長いリンカーも使用し得る。典型的に、リンカー配列は、可撓性かつ分解耐性であるように選択される。当業者にはわかるように、幅広く様々な配列のいずれも、リンカーとして使用し得る。例えば、一般的なリンカー配列は、アミノ酸配列ＧＧＧＧＳを含む。融合体パートナーは、Ｆｃ変異体タンパク質および任意の付随する融合体パートナーを、所望の細胞内場所または細胞外培地に導く標的化またはシグナル配列であり得る。当分野で知られているように、ある一定のシグナル配列は、増殖培地に分泌されるか、細胞膜周辺腔に分泌されるか、細胞の内膜と外膜の間に局在するかのいずれかに、タンパク質を標的化し得る。融合体パートナーは、精製および／またはスクリーニングを可能にするペプチドまたはタンパク質をコードする配列であってもよい。そのような融合体パートナーには、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ−タグ）（例えばＨ₆およびＨ₁₀または固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）系（例えば、Ｎｉ⁺²親和性カラム）と共に使用するための他のタグ）、ＧＳＴ融合体、ＭＢＰ融合体、ストレプ−タグ、細菌酵素ＢｉｒＡのＢＳＰビオチン化標的配列、および抗体により標的化されるエピトープタグ（例えばｃ−ｍｙｃタグ、ｆｌａｇ−タグなど）が含まれるがこれらに限定されるわけではない。当業者にはわかるように、このようなタグは、精製、スクリーニングまたはその両方に有用であり得る。例えば、Ｆｃ変異体は、Ｈｉｓ−タグを使用して、それをＮｉ⁺²親和性カラムに固定化することにより精製し得、精製後、同じＨｉｓ−タグを、抗体をＮｉ⁺²被覆プレートに固定化してＥＬＩＳＡまたは他の結合アッセイを実施するのに使用し得る（下記の通り）。融合体パートナーは、Ｆｃ変異体をスクリーニングするための選択方法の使用を可能にし得る（下記参照）。融合体パートナーは、当分野で周知であり全て本発明において用途を見出す様々な選択方法を可能にする。例えば、Ｆｃ変異体ライブラリーのメンバーを遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合させることにより、ファージディスプレイを用いることができる（Kay et al., Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Academic Press, San Diego, CA, 1996；Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838；Smith, 1985, Science 228:1315-1317）。融合体パートナーは、Ｆｃ変異体の標識化を可能にし得る。あるいは、融合体パートナーは、発現ベクター上の特異的配列に結合し、融合体パートナーおよび付随するＦｃ変異体が、それらをコードする核酸と共有結合的または非共有結合的に連結することを可能にする。例えば、ＵＳＳＮ０９／６４２,５７４；ＵＳＳＮ１０／０８０,３７６；ＵＳＳＮ０９／７９２,６３０；ＵＳＳＮ１０／０２３,２０８；ＵＳＳＮ０９／７９２,６２６；ＵＳＳＮ１０／０８２,６７１；ＵＳＳＮ０９／９５３,３５１；ＵＳＳＮ１０／０９７,１００；ＵＳＳＮ６０／３６６,６５８；ＰＣＴＷＯ００／２２９０６；ＰＣＴＷＯ０１／４９０５８；ＰＣＴＷＯ０２／０４８５２；ＰＣＴＷＯ０２／０４８５３；ＰＣＴＷＯ０２／０８０２３；ＰＣＴＷＯ０１／２８７０２；およびＰＣＴＷＯ０２／０７４６６は、本発明において用途を見出し得るそのような融合体パートナーおよび技法を記載している。

外来核酸を宿主細胞に導入する方法は、当分野で周知であり、使用する宿主細胞によって変化する。技法には、デキストラン介在形質移入、カルシウムホスフェート沈殿、塩化カルシウム処理、ポリブレン介在形質移入、プロトプラスト融合体、エレクトロポレーション、ウイルスまたはファージ感染、ポリヌクレオチド（複数も可）のリポソーム内カプセル化、およびＤＮＡの核への直接的マイクロインジェクションが含まれるが、これらに限定されるわけではない。哺乳動物細胞の場合、形質移入は、一過的であっても安定であってもよい。

好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体タンパク質は、発現後に精製または単離される。タンパク質は、当業者に周知の様々なやり方で単離または精製し得る。標準的な精製方法には、イオン交換、疎水性相互作用、親和性、サイズまたはゲル濾過、および逆相を含むクロマトグラフィー技法が含まれ、大気圧または高圧でＦＰＬＣやＨＰＬＣなどの系を使用して実行される。精製方法には、また、電気泳動、免疫学、沈殿、透析および等電点電気泳動の技法も含まれる。タンパク質濃縮と共に限外濾過およびダイアフィルトレーション技法も有用である。当分野で周知の通り、様々な天然タンパク質がＦｃおよび抗体に結合し、これらのタンパク質は、本発明においてＦｃ変異体精製のために用途を見出し得る。例えば、細菌のプロテインＡおよびＧは、Ｆｃ領域に結合する。同様に、細菌のプロテインＬは、いくつかの抗体のＦａｂ領域に結合し、抗体の標的抗原は当然結合する。精製は、しばしば特定の融合体パートナーにより可能にすることができる。例えば、Ｆｃ変異体タンパク質は、ＧＳＴ融合体が用いられているならばグルタチオン樹脂を、Ｈｉｓ−タグが用いられているならばＮｉ⁺²親和性クロマトグラフィーを、ｆｌａｇ−タグが使用されているならば固定化抗ｆｌａｇ抗体を使用して、精製し得る。適する精製技法の一般的手引きには、Protein Purification: Principles and Practice, 3^rd Ed., Scopes, Springer-Verlag, NY, 1994 を参照。必要な精製度は、Ｆｃ変異体のスクリーニングまたは用途に依存して変動する。いくつかの例では、精製は必要ない。例えば、ある実施態様では、Ｆｃ変異体が分泌される場合、スクリーニングは培地から直接行い得る。当分野で周知の通り、タンパク質の精製を含まない精製方法もある。このように、例えば、Ｆｃ変異体ライブラリーをファージディスプレイライブラリーにする場合、タンパク質精製を実施しなくてもよい。

Ｆｃ変異体は、インビトロアッセイ、インビボおよび細胞をベースとするアッセイ、並びに選択技法を使用するものを含むが、これらに限定されるものではない様々な方法を使用して、スクリーニングし得る。スクリーニングの手順において、自動化および高処理量スクリーニング技法を利用し得る。スクリーニングは、融合体パートナーまたは標識を使用してもよい。融合体パートナーは、上記で論じた。「標識化」は、本明細書において、本発明のＦｃ変異体が、スクリーニングにおける検出を可能にするために取り付けられた１またはそれ以上のエレメント、同位元素または化学的化合物を有することを意味する。一般に、標識は、３つのクラスに分類される：ａ）免疫標識、これは、融合体パートナーとして組み込まれたエピトープであり得、抗体により認識される、ｂ）同位元素標識、これは、放射性または重同位元素であり得る、およびｃ）低分子標識、これは、蛍光もしくは比色染料、または他の標識方法を可能にするビオチンなどの分子を含み得る。標識は、任意の位置で化合物に組み込み得、タンパク質発現の間にインビトロまたはインビボで組み込んでもよい。

好ましい実施態様では、Ｆｃ変異体の機能的および／または生物物理的特性を、インビトロアッセイにおいてスクリーニングする。インビトロアッセイは、幅広い動的な範囲の関心のある特性のスクリーニングを可能にし得る。スクリーニングされ得るＦｃ変異体の特性には、安定性、溶解性およびＦｃリガンド、例えばＦｃγＲ、に対する親和性が含まれるが、これらに限定されるわけではない。多数の特性を同時または個別にスクリーニングし得る。タンパク質は、アッセイの要件に応じて、精製されてもされなくてもよい。ある実施態様では、スクリーニングは、Ｆｃ変異体に結合すると知られているか、または考えられているタンパク質または非タンパク質分子に対する、Ｆｃ変異体の定性的または定量的結合アッセイである。好ましい実施態様では、スクリーニングは、抗体またはＦｃ融合体の標的抗原に対する結合を測定するための結合アッセイである。別の好ましい実施態様では、スクリーニングは、ＦｃγＲ類のファミリー、新生児受容体ＦｃＲｎ、補体タンパク質Ｃ１ｑおよび細菌タンパク質ＡおよびＧを含むがこれらに限定されるものではないＦｃリガンドに対するＦｃ変異体の結合についてのアッセイである。当該Ｆｃリガンドはいかなる生物に由来してもよく、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサルが好ましい。結合アッセイは、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー転移）およびＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー転移）をベースとするアッセイ、AlphaScreen^(商標)（発光増幅近接均質化アッセイ（Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay））、シンチレーション近接アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＳＰＲ（表面プラズモン共鳴、ＢＩＡＣＯＲＥ^{(登録商標)}としても知られる）、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、ゲル電気泳動およびゲル濾過を含むクロマトグラフィーを含むがこれらに限定されるものではない、当分野で知られている様々な方法を使用して実行できる。これらおよびその他の方法は、いくつかのＦｃ変異体の融合体パートナーまたは標識を利用し得る。アッセイは、色素生産性、蛍光、発光または同位元素標識を含むがこれらに限定されるものではない、様々な検出方法を用いてもよい。

Ｆｃ変異体タンパク質の生物物理的特性、例えば、安定性や溶解性、を当分野で知られている様々な方法を使用してスクリーニングし得る。タンパク質の安定性は、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態との間の熱力学的平衡を測定することにより決定し得る。例えば、本発明のＦｃ変異体タンパク質は、化学変性剤、熱またはｐＨを使用して折り畳まれていなくすることができ、この転移を、円二色性分光法、蛍光分光法、吸光分光法、ＮＭＲ分光法、熱量測定法およびタンパク質分解を含むがこれらに限定されるものではない方法を使用して、モニタリングし得る。当業者にはわかるように、折り畳まれたものおよび折り畳まれていないものへの転移の動力学的パラメーターも、これらおよび他の技法を使用してモニタリングし得る。Ｆｃ変異体タンパク質の溶解性および全体構造的完全性は、当分野で知られている広範囲の方法を使用して定量的または定性的に測定し得る。Ｆｃ変異体タンパク質の生物物理学的特性の特徴分析のために本発明において用途を見出し得る方法には、ゲル電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィーや逆相高速液体クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィー、質量分析、紫外吸光分光法、蛍光分光法、円二色分光法、等温滴定熱量測定、示差走査熱量測定、分析的超遠心分離、動的光散乱法、タンパク質分解およびクロスリンク、濁度測定、フィルター遅延アッセイ、免疫学的アッセイ、蛍光染料結合アッセイ、タンパク質染色アッセイ、顕微鏡およびＥＬＩＳＡまたは他のアッセイによる凝集体の検出が含まれる。Ｘ線結晶構造解析技法およびＮＭＲ分光法を用いる構造分析も、用途を見出し得る。ある実施態様では、何らかの決められた期間後にタンパク質溶液の量を測定することにより、安定性および／または溶解性を測定し得る。このアッセイでは、タンパク質は、例えば高温、低ｐＨまたは変性剤の存在などの極端な条件に曝されていてもいなくてもよい。典型的に、機能は、安定な、可溶の、および／または良好に折り畳まれた／構造化されたタンパク質を要するので、後述の機能および結合アッセイも、そのような測定の実施方法を提供する。例えば、Ｆｃ変異体を含む溶液を、その標的抗原に結合する能力についてアッセイし、次いで１またはそれ以上の決められた期間にわたって高温に曝し、次いで抗原結合について再度アッセイできる。折り畳まれていない凝集したタンパク質は、抗原を結合できないと予期されるので、残っている活性の量は、Ｆｃ変異体の安定性および溶解性の測定を提供する。

好ましい実施態様では、１またはそれ以上の細胞をベースとする、即ちインビボのアッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングする。そのようなアッセイのために、典型的に、細胞がライブラリーに属する個々の変異体または変異体の集積物に曝されるように、精製または未精製のＦｃ変異体タンパク質を外来的に添加する。これらのアッセイは、典型的に、しかし常にではないが、Ｆｃ変異体を含む抗体またはＦｃ融合体の機能をベースとする；つまり、抗体またはＦｃ融合体の、標的抗原に結合し、何らかの生物化学的事象、例えばエフェクター機能、リガンド／受容体結合阻害、アポトーシスなどを媒介する能力をベースとする。そのようなアッセイは、しばしば、例えば、細胞の生存、細胞の死、細胞形態の変化、細胞の天然遺伝子またはレポーター遺伝子の発現などの転写活性化などの、抗体またはＦｃ融合体に対する細胞の反応をモニタリングすることを含む。例えば、そのようなアッセイは、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰまたはＣＤＣを誘起するＦｃ変異体の能力を測定し得る。いくつかのアッセイには、標的細胞に加えて、付加的細胞または成分、例えば、血清の補体または末梢血単球（ＰＢＭＣ）、ＮＫ細胞、マクロファージなどのエフェクター細胞を添加する必要があり得る。かかる付加的細胞は、いかなる生物由来でもよく、好ましくは、ヒト、マウス、ラット、ウサギおよびサル由来である。抗体およびＦｃ融合体は、抗体の標的抗原を発現しているある一定の細胞株のアポトーシスを引き起こし得、または、それらは、アッセイに添加された免疫細胞による標的細胞への攻撃を媒介し得る。細胞の死亡または生存度をモニタリングする方法は当分野で知られており、染料、免疫化学、細胞化学および放射活性試薬の使用を含む。例えば、カスパーゼ染色アッセイは、アポトーシスの測定を可能にし得、放射活性基質またはアラマーブルー（alamar blue）などの蛍光染料の取込または放出は、細胞増殖または活性化のモニタリングを可能にし得る。好ましい実施態様では、DELFIA^{(登録商標)} EuTDAをベースとする細胞傷害アッセイ (Perkin Elmer, MA）を使用する。あるいは、死亡した、または損傷した標的細胞は、例えば乳酸デヒドロゲナーゼなどの１またはそれ以上の天然細胞内タンパク質の放出を測定することによりモニタリングし得る。転写活性化も、細胞をベースとするアッセイにおいて機能をアッセイする方法として役立ち得る。この場合、上方調節され得る天然遺伝子またはタンパク質をアッセイすることにより反応をモニタリングし得、例えば、ある種のインターロイキンの放出を測定し得、あるいは、読出しはレポーターコンストラクトによってもよい。細胞ベースのアッセイは、Ｆｃ変異体の存在に対する反応として、細胞の形態変化の測定も含み得る。このようなアッセイのための細胞タイプは、原核でも真核でもよく、当分野で知られている様々な細胞株を用い得る。

あるいは、Ｆｃ変異体をコードする核酸で形質転換または形質移入された細胞を使用して、細胞をベースとするスクリーニングを実施する。つまり、Ｆｃ変異体タンパク質は細胞に外来的に添加されない。例えば、ある実施態様では、細胞をベースとするスクリーニングは、細胞表面ディスプレイを利用する。細胞表面上でのＦｃ変異体のディスプレイを可能にする融合体パートナーを用いることができる（Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399）。本発明で用途を見出し得る細胞表面ディスプレイ法には、細菌 (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34；Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10；Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648；Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80）、酵母 (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44；Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557）および哺乳動物細胞 (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219）上でのディスプレイが含まれるが、これらに限定されるわけではない。別の実施態様では、Ｆｃ変異体タンパク質は、細胞表面上にディスプレイされず、むしろ細胞内または他の細胞区画内でスクリーニングされる。例えば、周辺質発現および細胞測定スクリーニング（Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19: 537-542）、タンパク質フラグメント相補性アッセイ (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344.；Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146）および酵母二重ハイブリッドスクリーニング (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246）は、本発明で用途を見出し得る。あるいは、Ｆｃ変異体を含むポリペプチド、例えば抗体またはＦｃ融合体が、細胞に何らかの選択可能な増殖上の利点を与えるならば、この特性を使用してＦｃ変異体をスクリーニングまたは選択し得る。

当分野で知られているように、スクリーニング方法のサブセットは、好都合なライブラリーのメンバーを選択するものである。当該方法は、本明細書において、「選択方法」と呼ばれ、これらの方法は、本発明においてＦｃ変異体ライブラリーのスクリーニングのために用途を見出す。ライブラリーが選択方法を使用してスクリーニングされる場合、好都合である、つまり何らかの選択基準に合うライブラリーのメンバーのみが、増殖、単離および／または観察される。理解されるように、最も適合する変異体のみが観察されるので、そのような方法は、ライブラリーのメンバーの適合性を個別にアッセイする方法によりスクリーニングできるものより大きいライブラリーのスクリーニングを可能にする。選択は、Ｆｃ変異体の表現型をその遺伝子型に、つまり、Ｆｃ変異体の機能をそれをコードする核酸に共有結合的または非共有結合的に連結させる、いかなる方法、技法または融合体パートナーによっても可能である。例えば、選択方法としてのファージディスプレイの使用は、ライブラリーのメンバーの遺伝子ＩＩＩタンパク質への融合により可能になる。このように、例えばＦｃγＲへの結合親和性などの何らかの基準に合う変異体タンパク質の選択または単離は、それをコードする核酸も選択または単離する。一度単離したら、Ｆｃ変異体をコードする遺伝子または複数の遺伝子を増幅させ得る。このパニング（panning）と呼ばれる単離と増幅のプロセスは、繰り返してもよく、好都合なＦｃ変異体をライブラリー中で増やすことが可能になる。最終的に、結合した核酸の配列解読により、遺伝子の同定が可能になる。

本発明でＦｃ変異体ライブラリーのスクリーニングに用途を見出し得る様々な選択方法が当分野で知られている。これらには、ファージディスプレイ (Phage display of peptides and proteins: a laboratory manual, Kay et al., 1996, Academic Press, San Diego, CA, 1996；Lowman et al., 1991, Biochemistry 30:10832-10838；Smith, 1985, Science 228:1315-1317）並びに選択的ファージ感染 (Malmborg et al., 1997, J Mol Biol 273:544-551）、選択的感染性ファージ (Krebber et al., 1997, J Mol Biol 268:619-630）および遅延感染力パニング (Benhar et al., 2000, J Mol Biol 301:893-904）などの派生物、細菌 (Georgiou et al., 1997, Nat Biotechnol 15:29-34；Georgiou et al., 1993, Trends Biotechnol 11:6-10；Lee et al., 2000, Nat Biotechnol 18:645-648；Jun et al., 1998, Nat Biotechnol 16:576-80）、酵母 (Boder & Wittrup, 2000, Methods Enzymol 328:430-44；Boder & Wittrup, 1997, Nat Biotechnol 15:553-557）、および哺乳動物細胞 (Whitehorn et al., 1995, Bio/technology 13:1215-1219）上でのディスプレイなどの細胞表面ディスプレイ (Witrrup, 2001, Curr Opin Biotechnol, 12:395-399）、並びにポリソームディスプレイ (Mattheakis et al., 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:9022-9026）、リボソームディスプレイ (Hanes et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:4937-4942）、ｍＲＮＡディスプレイ (Roberts & Szostak, 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:12297-12302；Nemoto et al., 1997, FEBS Lett 414:405-408）、およびリボソーム不活性化ディスプレイ系（Zhou et al., 2002, J Am Chem Soc 124, 538-543）などのインビトロディスプレイ技法 (Amstutz et al., 2001, Curr Opin Biotechnol 12:400-405）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。

本発明において用途を見出し得る他の選択方法には、周辺質発現および細胞測定スクリーニング (Chen et al., 2001, Nat Biotechnol 19:537-542）、タンパク質フラグメント相補性アッセイ (Johnsson & Varshavsky, 1994, Proc Natl Acad Sci USA 91:10340-10344；Pelletier et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:12141-12146）、および選択モード（Visintin et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96:11723-11728）で使用する酵母二重ハイブリッドスクリーニング (Fields & Song, 1989, Nature 340:245-246）を含むがこれらに限定されるものではないインビボの方法などの、ディスプレイに頼らない方法が含まれる。別の実施態様では、選択は、発現ベクターの特異的配列に結合し、従って融合体パートナーおよび付随するＦｃ変異体ライブラリーのメンバーを、それらをコードする核酸と共有結合的または非共有結合的に連結させる融合体パートナーにより可能になる。例えば、ＵＳＳＮ０９／６４２,５７４；ＵＳＳＮ１０／０８０,３７６；ＵＳＳＮ０９／７９２,６３０；ＵＳＳＮ１０／０２３,２０８；ＵＳＳＮ０９／７９２,６２６；ＵＳＳＮ１０／０８２,６７１；ＵＳＳＮ０９／９５３,３５１；ＵＳＳＮ１０／０９７,１００；ＵＳＳＮ６０／３６６,６５８；ＰＣＴＷＯ００／２２９０６；ＰＣＴＷＯ０１／４９０５８；ＰＣＴＷＯ０２／０４８５２；ＰＣＴＷＯ０２／０４８５３；ＰＣＴＷＯ０２／０８０２３；ＰＣＴＷＯ０１／２８７０２；およびＰＣＴＷＯ０２／０７４６６は、本発明で用途を見出し得るそのような融合体パートナーおよび技法を記載している。別の実施態様では、抗体またはＦｃ融合体などのＦｃ変異体を含むポリペプチドの発現が、何らかの増殖、複製、生存的利点を細胞に与えるならば、インビボ選択を行うことができる。

「定方向進化」法と呼ばれる選択方法のサブセットは、時には新しい変異の組込みによる、選択における好都合な配列の接合または交配を含むものである。当業者にはわかるように、定方向進化法は、ライブラリー中の最も好都合な配列の同定を促進でき、スクリーニングされる配列の多様性を高めることができる。本発明においてＦｃ変異体ライブラリーのスクリーニングのために用途を見出し得る様々な定方向進化法が当分野で知られており、ＤＮＡシャフリング (PCT WO 00/42561 A3；PCT WO 01/70947 A3）、エクソンシャフリング (US 6,365,377；Kolkman & Stemmer, 2001, Nat Biotechnol 19:423-428）、ファミリーシャフリング（Crameri et al., 1998, Nature 391:288-291；US 6,376,246）、RACHITT^(商標) (Coco et al., 2001, Nat Biotechnol 19:354- 359；PCT WO 02/06469）、STEP およびインビトロ組換えのランダムプライミング（priming） (Zhao et al., 1998, Nat Biotechnol 16:258-261；Shao et al., 1998, Nucleic acids Res 26:681-683）、エキソヌクレーゼ媒介遺伝子集合（US 6,352,842；US 6,361,974）、Gene Site Saturation Mutagenesis^(商標)（US 6,358,709）、Gene Reassembly^(商標) (US 6,358,709）、SCRATCHY (Lutz et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98:11248-11253）、ＤＮＡフラグメント化法 (Kikuchi et al., Gene 236:159-167）、一本鎖ＤＮＡシャフリング (Kikuchi et al., 2000, Gene 243:133-137）および AMEsystem^(商標)定方向進化タンパク質工学処理技法 (Applied Molecular Evolution）(US US 5,824,514；US 5,817,483；US 5,814,476；US 5,763,192；US 5,723,323）が含まれるが、これらに限定されるものではない。

本発明のＦｃ変異体を含む抗体およびＦｃ融合体の生物学的特性は、細胞、組織および生物全体での実験で特徴分析し得る。当分野で知られているように、薬物は、しばしば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタおよびサルを含むがこれらに限定されない動物で、疾患または疾患モデルの処置に関する薬物の効力を測定するために、または薬物の薬物動力学、毒性および他の特性を測定するために試験される。当該動物は、疾患モデルと呼ばれることがある。治療薬は、しばしば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよび遺伝子組換えマウス（ノックインおよびノックアウトを含む）を含むがこれらに限定されるものではないマウスで試験される。例えば、抗癌治療薬として企図される本発明の抗体またはＦｃ融合体は、例えば異種移植マウスなどのマウス癌モデルで試験し得る。この方法では、腫瘍または腫瘍細胞株をマウスに移植または注射し、その後マウスを治療薬で処置して、抗体またはＦｃ融合体の癌増殖を低減または阻害する能力を測定する。そのような実験は、治療薬として使用しようとする当該抗体またはＦｃ融合体の潜在能力の判定のために、意味のあるデータを提供し得る。任意の生物、好ましくは哺乳動物を、試験に使用し得る。例えばそのヒトとの遺伝的類似性のために、サルは、適する治療モデルであり得、従って本発明の抗体およびＦｃ融合体の効力、毒性、薬物動態または他の特性の試験に使用し得る。薬物としての承認にはヒトにおける本発明の抗体およびＦｃ融合体の試験が最終的に必要とされ、従って、当然これらの実験が企図される。従って、本発明の抗体およびＦｃ融合体を、ヒトで試験して、それらの治療効力、毒性、薬物動態および／または他の臨床的特性について判定し得る。

実施例
本発明を例示説明するために、下記の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明をいかなる特定の適用または操作理論に制限することも意味しない。

本発明で論じる全位置について、番号付けはKabat にある通りのＥＵインデックスに従う（Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed., United States Public Health Svice, National Institutes of Health, Bethesda）。抗体の分野の当業者は、この慣習が免疫グロブリン配列の特定領域における非連続的番号付けからなり、免疫グロブリンファミリー中で保存された位置への標準化された参照を可能にすることがわかる。従って、ＥＵインデックスにより定義される任意の所定の免疫グロブリンの位置は、必ずしもその連続的配列に対応しない。図３は、この原理をより明確に例示説明するために、抗体アレムツズマブの連続およびＥＵインデックスの番号付けスキームを示す。Kabat ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６および３５８を含むがこれらに限定されるものではない数々のＦｃ位置で多型が観察されており、提示した配列と科学文献中の配列との間に僅かな差異が存在し得ることにも留意すべきである。

実施例１．コンピューター処理スクリーニングおよびＦｃライブラリーの設計
最適化Ｆｃ変異体を設計するために、コンピューター処理スクリーニング計算を実行した。数回のコンピューター処理／実験のサイクルにわたり、Ｆｃ変異体をコンピューター処理的にスクリーニングし、構築し、そして実験的に調べた。各々の連続サイクルについて、実験データは次セットのコンピューター処理スクリーニング計算およびライブラリー設計にフィードバックを与えた。全コンピューター処理スクリーニング計算およびライブラリー設計を実施例１に提示する。各セットの計算につき、結果を提示し関連情報およびパラメーターを提供する表を提供する。

ＦｃγＲ類の細胞外ドメインに結合したＦｃのいくつかの異なる構造を、コンピューター処理スクリーニング計算の鋳型構造として供した。公に入手可能なＦｃ／ＦｃγＲ複合体構造には、ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｋ（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273.）およびｐｄｂ受託コード１ＩＩＳおよび１ＩＩＸ（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16469-16477）が含まれる。ＦｃγＲＩＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩａの細胞外領域は、９６％同一であり、従ってＦｃ／ＦｃγＲＩＩＩｂ構造の使用は、ＦｃγＲＩＩＩａの使用と本質的に均等である。それでもやはり、いくつかの計算には、１ＩＩＳおよび１Ｅ４Ｋ構造中にＤ１２９Ｇ変異をモデル化することにより、より正確なＦｃ／ＦｃγＲＩＩＩａ鋳型構造（Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳおよびＤ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造と呼ぶ）を構築した。加えて、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａおよびマウスＦｃγＲＩＩＩの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃの構造を、標準的方法、入手可能なＦｃγＲ配列情報、上述のＦｃ／ＦｃγＲ構造、並びに非結合複合体（ｐｄｂ受託コード１Ｈ９Ｖ）（Sondermann et al., 2001, J Mol Biol 309:737-749）（ｐｄｂ受託コード１ＦＣＧ）（Maxwell et al., 1999, Nat Struct Biol 6:437-442）、ＦｃγＲＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード２ＦＣＢ）(Sondermann et al., 1999, Embo J 18:1095-1103)およびＦｃγＲＩＩＩｂ（ｐｄｂ受託コード１Ｅ４Ｊ）（Sondermann et al., 2000, Nature 406:267-273.）の構造情報を使用してモデル化した。

可変位置およびこれらの位置で考慮されるべきアミノ酸を、上述のＦｃ／ＦｃγＲおよびＦｃγＲ構造の視覚的検査により、そして溶媒接近可能情報および配列情報を使用して選択した。Ｆｃ類およびＦｃγＲ類の配列情報は、置換が活性化と阻害性の受容体の間を区別する親和性を提供し得る可変位置の決定に特に有用であった。事実上全てのＣγ２位置をコンピューター処理的にスクリーニングした。Ｆｃ構造は、各々ヒンジおよびＣγ２−Ｃγ３ドメイン（図２に示す）を含む２本の重鎖（１ＩＩＳ、１ＩＩＸおよび１Ｅ４Ｋ構造中の標識鎖ＡおよびＢ）のホモ二量体である。ＦｃγＲ（１ＩＩＳ、１ＩＩＸおよび１Ｅ４Ｋ構造中の標識鎖Ｃ）が非対称的にＦｃホモ二量体に結合するので、各鎖は、しばしば設計計算において別々に考慮した。いくつかの計算には、可変位置残基に近接するＦｃおよび／またはＦｃγＲの残基を浮動させた。つまり、タンパク質設計計算においてアミノ酸高次構造を変動させたが、アミノ酸本体は変動させず、高次構造の調整を可能にした。これらは、関連する場合、各セットの計算について下記表に示す。断りの無い限り、考慮されるアミノ酸は、コア、コアＸＭ、表面、境界、境界ＸＭ、または全２０の分類のいずれかに属した。これらの分類は、以下の通りに定義される：コア＝アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニン；コアＸＭ＝アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；表面＝アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジンおよびヒスチジン；境界＝アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびメチオニン；境界ＸＭ＝境界＝アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、アルギニン、リジン、ヒスチジン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン；全２０＝全２０個の天然産生アミノ酸。

計算の大部分は、２つの一般的なタイプのコンピューター処理スクリーニング方法の一方に従った。１つの方法では、可変位置でのアミノ酸の高次構造を、Dunbrack & Cohenの回転異性体ライブラリー（Dunbrack et al., 1997, Protein Sci 6:1661-1681）から導かれる主鎖非依存性側鎖回転異性体のセットとして表した。選択された可変位置で考慮されるアミノ酸の全ての可能な組合せのエネルギーを、ファンデルワールス、溶媒和、静電気および水素結合相互作用の項を含む力場を使用して計算し、Dead End Elimination (DEE）アルゴリズムを使用して最適（基底状態）配列を決定した。当業者にはわかるように、予想された最低エネルギー配列は、主としてスコアリング関数の誤りのために、そして僅かなタンパク質の高次構造の差異が安定性の劇的な差異に至り得るという事実と相まって、必ずしも真の最低エネルギー配列ではない。しかしながら、予想された基底状態配列は真の基底状態に近いように思われ、従って、配列空間中で近い配列のエネルギーおよび予想される基底状態周辺のエネルギーを評価することにより、さらなる好都合な多様性を探査できる。このことを達成するために、並びにライブラリー用の配列多様性を発生させるために、Monte Carlo (MC）アルゴリズムを使用して、予想される基底状態周辺の１０００個の類似配列のエネルギーを評価した。１０００個の配列セット中、その可変位置でそのアミノ酸を含む配列の数を、その置換の占有率と呼び、この値は、その置換がどれくらい好都合であるかを反映し得る。このコンピューター処理スクリーニング方法は、ＵＳ６,１８８,９６５；ＵＳ６,２６９,３１２；ＵＳ６,４０３,３１２；ＵＳＳＮ０９／７８２,００４；ＵＳＳＮ０９／９２７,７９０；ＵＳＳＮ１０／２１８,１０２；ＰＣＴＷＯ９８／０７２５４；ＰＣＴＷＯ０１／４００９１；およびＰＣＴＷＯ０２／２５５８８に記載されている通りのProtein Design Automation^{(登録商標)} (PDA^{(登録商標)}）技法（記載を簡単にするために、実施例中でＰＤＡ^{(登録商標)}技法と呼ぶ）に実質的に類似する。これらの計算の結果を提示する表は、明示した鎖上の各可変位置（列１）について、各可変位置で考慮されるアミノ酸（列２）、各可変位置でのＷＴのＦｃアミノ酸本体（列３）、各可変位置でのＤＥＥ基底状態配列のアミノ酸本体（列４）並びにMonte Carlo アウトプットにおいて観察されるアミノ酸のセットおよび対応する占有率（列５）を提供する。

他の計算は、低エネルギー配列をスクリーニングするのに遺伝的アルゴリズム（ＧＡ）を利用し、「進化」の各ラウンドの間に標本抽出されているそれらの配列のエネルギーを計算した。可変および浮動位置でのアミノ酸の高次構造を、可撓性回転異性体モデルを使用して主鎖非依存性回転異性体ライブラリーから導かれた側鎖回転異性体のセットとして表した（Mendes et al., 1999, Proteins 37:530-543）。ファンデルワールス、溶媒和、静電気および水素結合相互作用を記述する項を含む力場を使用してエネルギーを計算した。この計算により、低エネルギーであると予想される３００個の配列のリストが生成された。結果の分析とライブラリー生成を促進するために、配列を類似性スコアに基づいて関連グループに割り当てる最短距離単連結（nearest neighbor single linkage）階層的集束化アルゴリズムを使用して、３００個のアウトプット配列をコンピューター処理的に１０個の類似配列のグループに集束させた（Diamond, 1995, Acta Cryst D51:127-135）。つまり、グループ内の全配列は、同じグループ内の全ての他の配列に最も類似し、他グループの配列にはあまり似ていない。これら１０個のクラスターの各々からの最低エネルギー配列を、各グループの代表として使用し、結果として提示する。このコンピューター処理スクリーニング方法は、（Raha et al., 2000, Protein Sci 9:1106-1119）；ＵＳＳＮ０９／８７７,６９５；およびＵＳＳＮ１０／０７１,８５９に記載されているSequence Prediction Algorithm^(商標) (SPA^(商標)）技法（記載を簡単にするために、実施例中でSPA^(商標)技法と呼ぶ）に実質的に類似している。

ＦｃγＲとの結合を媒介するかまたは媒介する可能性のある可変位置の基でコンピューター処理スクリーニングを適用して、Ｆｃ／ＦｃγＲ接点でのエネルギー的に好都合な相互作用を設計した。結合の接点は、２本の異なる鎖上の多数のＦｃ残基を含むので、そしてＦｃγＲ類は非対称的にＦｃに結合するので、残基を異なる相互作用する可変位置のセットにグループ化し、別個の計算のセットにおいて設計した。多くの場合、これらのセットは、共役する、つまり、１またはそれ以上の残基のエネルギーが１またはそれ以上の他の残基の本体に依存すると思われる残基のグループとして選択された。様々な鋳型構造を使用し、そして多くの場合、計算は両方の鎖上の置換を探査した。可変位置セットの多くに、記載したＰＤＡ^{(登録商標)}およびＳＰＡ^(商標)の両技法のコンピューター処理スクリーニング方法を使用して計算を実行した。これらの計算の結果並びに関連パラメーターおよび情報を、下記表１−３０に提示する。

これらの計算の結果を提示する表は、明示した鎖上の各可変位置（列１）について、各可変位置で考慮されるアミノ酸（列２）、各可変位置でのＷＴのＦｃアミノ酸本体（列３）、および各クラスターグループからの最低エネルギー配列の可変位置のアミノ酸本体（列４−１３）を提供する。表１−５９は、下記に記す通り、ＰＤＡ^{(登録商標)}およびＳＰＡ^(商標)技法の２セットに分解される。ＰＤＡ^{(登録商標)}の表の列４は、そのＰＤＡ^{(登録商標)}ランの間に上位１０００配列中に生じる各残基の頻度を示す。従って、表１の第１行では、位置３２８で境界アミノ酸をその位置の可変残基のセットとして使用するランの場合、上位１０００配列中にＬは３３０回、Ｍは３０２回生じる、などである。

加えて、本発明の組成物には、列挙した位置で、列挙したアミノ酸残基のいずれかを、単独でまたは任意の組合せ中に有する抗体が含まれる（好ましい組合せは、特許請求の範囲、要約および図面に列挙されていることに留意されたい）。ある好ましい組合せは、基底状態（本明細書では、野生型と区別して、「大域的解答」と呼ぶことがある）中の列挙された位置における列挙されたアミノ酸残基である。同様に、残基位置およびそれらの残基位置の特定のアミノ酸を、表の間で組み合わせてもよい。

表４などのＳＰＡ^(商標)技法の表について、列４は、６個の列挙した位置で６個の列挙したアミノ酸を有するタンパク質をもたらすＳＰＡ^(商標)ランである（例えば、列４は、２３９Ｅ、２６５Ｇ、２６７Ｓ、２６９Ｙ、２７０Ｔおよび２９９Ｓ以外は野生型の配列を有する単一のタンパク質である）。従って、これらの個々のタンパク質の各々は、本発明に含まれる。加えて、表内および表間のＳＰＡ^(商標)タンパク質間の組合せも含まれる。

加えて、各表は、炭水化物の有無を示すが、逆の配列も明確に含まれる；例えば、表１は非グリコシル化変異体について列挙するが、これらの同じアミノ酸変化を、グリコシル化変異体で行うことができる。

さらに、各表は、使用した鋳型構造並びに「浮動」残基を列挙する；例えば、表２は、Ｃ１２０、Ｃ１３２およびＣ１３４を浮動させるＰＤＡ^{(登録商標)}ランを使用した。

表１

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法、１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物

表２

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；１２０Ｃ、１３２Ｃ、１３４Ｃを浮動

表３

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１３３Ｃ、１３４Ｃを浮動

表４

ＳＰＡ^(商標)技法；１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１３３Ｃ、１３４Ｃを浮動

表５

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１１９Ｃ、１２８Ｃ、１５７Ｃを浮動

表６

ＳＰＡ^(商標)技法；１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；１１９Ｃ、１２８Ｃ、１５７Ｃを浮動

表７

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；８８Ｃ、９０Ｃ、１１３Ｃ、１１４Ｃ、１１６Ｃ、１６０Ｃ、１６１Ｃを浮動

表８

ＳＰＡ^(商標)技法；１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；８８Ｃ、９０Ｃ、１１３Ｃ、１１４Ｃ、１１６Ｃ、１６０Ｃ、１６１Ｃを浮動

表９

ＳＰＡ^(商標)技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２０Ｃ、１３２Ｃ、１３４Ｃを浮動

表１０

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；１１３Ｃ、１１６Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃ、１５７Ｃを浮動

表１１

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；＋炭水化物；１１３Ｃ、１１６Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃ、１５７Ｃを浮動

表１２

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２０Ｃを浮動

表１３

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；１２０Ｃを浮動

表１４

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；９０Ｃ、１６０Ｃ、１６１Ｃを浮動

表１５

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；９０Ｃ、１６０Ｃ、１６１Ｃを浮動

表１６

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；１１７Ｃを浮動

表１７

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；＋炭水化物；１１７Ｃを浮動

表１８

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；８７Ｃ、１５７Ｃ、１５８Ｃを浮動

表１９

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；＋炭水化物原子；８７Ｃ、１５７Ｃ、１５８Ｃを浮動

表２０

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；２７３Ａ、２７５Ａ、３０２Ａ、３２３Ａ、１３４Ｃを浮動

表２１

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；２７３Ａ、２７５Ａ、３０２Ａ、３２３Ａ、１３４Ｃを浮動

表２２

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；２７３Ｂ、２７５Ｂ、３０２Ｂ、３２３Ｂ、１６１Ｃを浮動

表２３

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物；２７３Ｂ、２７５Ｂ、３０２Ｂ、３２３Ｂ、１６１Ｃを浮動

表２４

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；２７３Ｂ、２７５Ｂ、３０２Ｂ、３２３Ｂ、１３１Ｃを浮動

表２５

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；＋炭水化物；２７３Ｂ、２７５Ｂ、３０２Ｂ、３２３Ｂ、１３１Ｃを浮動

表２６

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；２７３Ａ、２７５Ａ、３０２Ａ、３２３Ａ、１５８Ｃを浮動

表２７

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；＋炭水化物；２７３Ａ、２７５Ａ、３０２Ａ、３２３Ａ、１５８Ｃを浮動

コンピューター処理スクリーニング計算は、Ｆｃ変異体の設計においてＮ２９７炭水化物およびＣγ２ドメインの立体構造を最適化することを目指した。炭水化物と相互作用する位置でエネルギー的に好都合な置換を探査することにより、新しい好都合な可能性のある炭水化物立体構造を標本抽出する変異体を工学処理できる。Ｆｃの残基Ｆ２４１、Ｆ２４３、Ｖ２６２およびＶ２６４はＦｃ／炭水化物相互作用を媒介するので、標的位置である。これらの設計計算の結果を表２８に提示する。

表２８

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法、１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物

コンピューター処理スクリーニング計算は、Ｆｃ変異体の設計においてＣγ３とＣγ２のドメイン間の角を最適化することを目指した。Ｃγ２／Ｃγ３接点に存在する残基Ｐ２４４、Ｐ２４５、Ｐ２４７およびＷ３１３は、Ｃγ２−Ｃγ３角および相互に対する各ドメインの可撓性の決定の鍵となる役割を果たすと思われる。これらの位置でエネルギー的に好都合な置換を探査することにより、新しい好都合な可能性のある角および可撓性レベルを標本抽出する変異体を設計できる。これらの設計計算の結果を表２９に提示する。

表２９

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物

ＰＤＡ^{(登録商標)}およびＳＰＡ^(商標)コンピューター処理スクリーニング方法を使用する上記の計算に加えて、静電気ポテンシャルを単独で使用するさらなる計算を使用してＦｃ変異体をコンピューター処理的にスクリーニングした。クーロンの法則およびDebye-Huckelのスケーリングを用いる計算は、１またはそれ以上のＦｃγＲ類への結合に好都合に影響するであろうアミノ酸置換のためのＦｃ中の数々の位置を強調し、これには、中性アミノ酸の負荷電アミノ酸による置き換えがＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増強し得る位置、および正荷電アミノ酸の中性または負荷電アミノ酸による置き換えがＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増強し得る位置が含まれる。これらの結果を表３０に提示する。

表３０

クーロンの法則および Debye-Huckel のスケーリング；１ＩＩＳ鋳型構造；＋炭水化物

非グリコシル化Ｆｃを最適化するために、つまり、Ｎ２９７炭水化物の非存在下で、Ｆｃの構造、安定性、溶解性およびＦｃ／ＦｃγＲ親和性を最適化するために、コンピューター処理スクリーニング計算を実行した。設計計算は、非グリコシル化Ｆｃ鋳型構造に関して、残基２９７、それに近接する残基、Ｆｃ／ＦｃγＲ接点の残基、Ｆｃ／炭水化物接点の残基で好都合な置換を設計することを目指した。可変位置を別々の相互作用する可変位置のセットにグループ化し、別個の計算のセットで設計し、そして様々な鋳型構造を使用した。可変位置のセットの多くに、ＰＤＡ^{(登録商標)}およびＳＰＡ^(商標)の両コンピューター処理スクリーニング方法を使用して計算を実行した。これらの計算の結果および関連情報を、下記表３１−５３に提示する。

表３１

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２２Ｃ、１２９Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表３２

ＳＰＡ^(商標)技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２２Ｃ、１２９Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表３３

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２０Ｃ、１２２Ｃ、１２８Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表３４

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２０Ｃ、１２２Ｃ、１２８Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表３５

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２５Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

表３６

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２５Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

表３７

表３８

表３９

表４０

表４１

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表４２

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表４３

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

表４４

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

表４５

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；２９９Ａ、１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表４６

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；２９９Ａ、１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表４７

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；２９９Ｂ、１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

表４８

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；２９９Ｂ、１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

表４９

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；２３９Ａ、２６５Ａ、１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表５０

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物；２３９Ａ、２６５Ａ、１２０Ｃ、１２２Ｃ、１３２Ｃ、１５５Ｃを浮動

表５１

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；２３９Ｂ、２６５Ｂ、１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

表５２

ＳＰＡ^(商標)技法；Ｄ１２９Ｇ１Ｅ４Ｋ鋳型構造；−炭水化物；２３９Ｂ、２６５Ｂ、１１７Ｃ、１１９Ｃ、１２９Ｃ、１５２Ｃを浮動

非グリコシル化Ｆｃを最適化するために、グリコシレーションの非存在下で溶媒に露出する位置で、それらが安定し、Ｆｃ構造を維持し、凝集する傾向のないように、好都合な置換を設計することにより、コンピューター処理スクリーニング計算を実行した。Ｎ２９７炭水化物は、通常なら他のＩｇドメインとのタンパク質−タンパク質相互作用の接点であったであろう露出した疎水性区画を覆い、Ｆｃの安定性および構造的完全性を維持し、Ｃγ２ドメインが中心軸を超えて凝集しないようにしている。設計の鍵となる残基は、Ｃγ２上で炭水化物の陰にあるＦ２４１、Ｆ２４３、Ｖ２６２およびＶ２６４、並びに、向かい合うＣγ２ドメインに向かって内側に面する露出した非極性残基であるＬ３２８、Ｉ３３２およびＩ３３６などの残基であり、これは、以前に提示した計算において考慮された。これらのＣγ２残基の重要性は、配列アラインメントにより対応するＣγ３ドメイン中の残基が、２個のＣγ３ドメイン間の非極性相互作用を媒介しているか、またはＣγ３コアに埋もれているかのいずれかであることに留意することにより支持される。これらの設計計算の結果を表５３に提示する。

表５３

ＰＤＡ^{(登録商標)}技法；１ＩＩＳ鋳型構造；−炭水化物

計算の最終セットでは、ＳＰＡ^(商標)コンピューター処理スクリーニング法を適用し、全ての選択された可変位置の全２０個のアミノ酸による置き換えを評価した。全２０個のアミノ酸の最低エネルギーの回転異性体の立体構造を決定し、このエネルギーをその可変位置でのそのアミノ酸の置換のエネルギーとして定義した。従って、これらの計算は、各可変位置で２０アミノ酸の各々について置換のエネルギーをもたらした。これらのデータは、Ｆｃ／ＦｃγＲの親和性、Ｆｃの安定性、Ｆｃの溶解性、炭水化物の立体構造およびヒンジの立体構造の最適化を含む、グリコシル化および非グリコシル化の両方のＦｃを目指す様々な設計目標に有用であった。さらに、これらの計算は好都合と不都合の両方の置換についてエネルギーを提供するので、それらは、活性化対阻害性ＦｃγＲ類への異なる結合を可能にし得る置換を先導する。様々な鋳型構造を使用した。計算は両鎖上の置換を探査した。これらの計算の結果並びに関連パラメーターおよび情報を、下記表５４−５９に提示する。列１は、１ＩＩＳ鋳型構造の鎖ＡおよびＢ上の可変位置を列挙する。列２は、各可変位置の野生型アミノ酸本体を列挙する。残りの２０列は、天然の２０個のアミノ酸（最上行に示す）の各々のエネルギーを提供する。全置換を、０エネルギーに設定した最低エネルギー置換に関して標準化した。例えば、表５４中、鎖ＡのＬ２３５について、セリンが最低エネルギー置換であり、Ｌ２３５ＡはＬ２３５Ｓよりも０.９ｋｃａｌ／ｍｏｌ安定性が低い。極度に高いエネルギーは、２０ないし５０ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギーについて２０ｋｃａｌ／ｍｏｌ、そして５０ｋｃａｌ／ｍｏｌより高いエネルギーについて５０ｋｃａｌ／ｍｏｌに設定した。好都合な置換は、各位置についての最低エネルギーの置換、および最低エネルギー置換とのエネルギー差が小さい置換、例えば１−２、１−３、１−５または１−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内の置換であると考えることができる。

上記表１−５９で提示した設計計算の結果を使用して、実験的産生およびスクリーニング用の一連のＦｃ変異体ライブラリーを構築した。実験用ライブラリーは、コンピューター処理および実験的スクリーニングの連続ラウンドで設計した。後のＦｃライブラリーの設計は、先行ライブラリーのフィードバックから利益を得、従って典型的に以前のスクリーニングで好都合な特性を示したＦｃ変異体の組合せを含んだ。構築され、実験的に試験されたＦｃ変異体の全セットを、表６０に示す。この表では、行１は、可変位置を列挙し、続く行は、ＷＴおよびＦｃ変異体について、それらの可変位置のアミノ酸を示す。例えば、変異体１８は、以下の４つの変異を有する：Ｆ２４１Ｅ、Ｆ２４３Ｙ、Ｖ２６２ＴおよびＶ２６４Ｒ。このセットのＦｃ変異体を構成する可変位置の残基を図３に構造的に図解し、ヒトＩｇＧ１Ｆｃ配列に関して図４に提示する。

実施例２：Ｆｃライブラリーの実験的産生およびスクリーニング
Ｆｃ変異体の実験法の大部分は、抗癌抗体アレムツズマブ（Campath^{(登録商標)}、Ilex Pharmaceuticals LPの登録商標）に関して実行した。アレムツズマブは、その標的抗原であるＣＤ５２中の短い線状のエピトープに結合する（Hale et al., 1990, Tissue Antigens 35:118-127; Hale, 1995, Immunotechnology 1:175-187）。アレムツズマブは、その効力が一部にはそのエフェクター細胞を募らせる能力によるので（Dyer et al., 1989, Blood 73:1431-1439; Friend et al., 1991, Transplant Proc 23:2253-2254; Hale et al., 1998, Blood 92:4581-4590; Glennie et al., 2000, Immunol Today 21:403-410）、そして結合アッセイにおけるその抗原の産生と使用が比較的簡単であるので、主たる工学処理の鋳型として選択された。他の抗体に関して本発明の最適化Ｆｃ変異体を評価するために、選択されたＦｃ変異体を抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Rituxan^{(登録商標)}、IDEC Pharmaceuticals Corporation の登録商標）および抗Ｈｅｒ２抗体トラスツズマブ（Herceptin^{(登録商標)}、Genentechの登録商標）で評価した。スクリーニング目的でのアレムツズマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブの使用は、本発明をいかなる特定の抗体にも制限することを意味しない。

アレムツズマブ、リツキシマブおよびトラスツズマブについて、ＩｇＧ１の完全長の軽鎖（Ｖ_L−Ｃ_L）および重鎖（Ｖ_H−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３）の抗体の遺伝子を、サブクローニングを補助するための便利な末端制限部位と共に構築した。これらの遺伝子を哺乳動物発現ベクターであるｐｃＤＮＡ３.１Ｚｅｏ（Invitrogen）にライゲーションした。ｐｃＤＮＡ３.１ｚｅｏ中のこのＶ_H−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３クローンを、Ｆｃ領域の変異誘発の鋳型として使用した。このクローンに、ＰＣＲをベースとする変異誘発技法を使用して変異を導入した。Ｆｃ変異体を配列解読し、配列の忠実度を確認した。重鎖遺伝子（Ｖ_H−Ｃγ１−Ｃγ２−Ｃγ３）（野生型または変異体）を含有するプラスミドを、軽鎖遺伝子（Ｖ_L−Ｃ_L）を含有するプラスミドと共に２９３Ｔ細胞に形質移入した。形質移入の５日後に培地を回収した。ペルオキシダーゼ結合ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Jackson ImmunoResearch, catalog # 109-035-088）を使用するウエスタンで形質移入体の培養上清をスクリーニングすることにより、免疫グロブリンの発現をモニタリングした。図６は、野生型アレムツズマブおよび変異体１ないし１０の２９３Ｔ細胞における発現を示す。プロテインＡ親和性クロマトグラフィー（Pierce, Catalog # 20334）を使用して上清から抗体を精製した。図７は、ＷＴアレムツズマブについて、タンパク質精製の結果を示す。抗体のＦｃ変異体は、ＷＴと類似の発現および精製結果を示した。炭水化物の非存在下でのそれらの溶解性と機能的特性を測定するために、いくつかのＦｃ変異体を脱グリコシル化した。脱グリコシル化抗体を得るために、精製したアレムツズマブ抗体をペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ）と３７℃で２４時間インキュベートした。図８は、いくつかのＦｃ変異体およびＷＴアレムツズマブの脱グリコシル化を確認するＳＤＳＰＡＧＥのゲルを提示する。

これらの条件下で産生されたアレムツズマブの機能的忠実度を確認するために、ＧＳＴに融合させた抗原性ＣＤ５２ペプチドを、ＩＰＴＧ誘導下、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）で発現させた。非誘導および誘導サンプルの両方を、ＳＤＳＰＡＧＥゲルで流し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ウエスタン分析のために、Sotec由来のアレムツズマブ（最終濃度２.５ｎｇ／ｕｌ）または形質移入２９３Ｔ細胞の培地（最終アレムツズマブ濃度約０.１−０.２ｎｇ／ｕｌ）を一次抗体として使用し、ペルオキシダーゼ結合ヤギ−抗ヒトＩｇＧを二次抗体として使用した。図９は、これらの結果を提示する。標的抗原に結合する能力は、発現されたアレムツズマブの構造および機能的忠実度を確認するものである。ＷＴアレムツズマブと同じ可変領域を有するＦｃ変異体は、匹敵する抗原への結合親和性を維持すると予想される。

Ｆｃ／ＦｃγＲ結合をスクリーニングするために、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ、ヒトＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ、ヒトＦｃγＲＩＩｂ、ヒトＦｃγＲＩＩａおよびマウスＦｃγＲＩＩＩの細胞外領域を発現させ、精製した。図１０は、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの発現と精製の結果を示すＳＤＳＰＡＧＥゲルを提示する。この受容体の細胞外領域は、Mammalian Gene Collection (MGC:22630)から得られたクローンからのＰＣＲにより入手した。受容体をグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）と融合させ、スクリーニングを可能にした。タグ付きＦｃγＲＩＩＩａを２９３Ｔ細胞に形質移入し、分泌されたＦｃγＲＩＩＩａを含有する培地を３日後に回収し、精製した。ウエスタン分析のために、膜を抗ＧＳＴ抗体でプローブした。

全ての設計したＦｃ変異体について、ビーズをベースとする非放射性発光近接アッセイである AlphaScreen^(商標) アッセイ (Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay (ALPHA), PerkinElmer, Wellesley, MA)を使用して、ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂへの結合親和性を測定した。ドナービーズのレーザー励起が酸素を励起し、それがアクセプタービーズに十分近ければ、化学発光事象のカスケードを生成させ、最終的に５２０−６２０ｎｍでの蛍光放射を導く。AlphaScreen^(商標)アッセイを、Ｆｃ変異体をスクリーニングするための競合アッセイとして適用した。ストレプトアビジンのドナービーズに取り付けるためにＷＴアレムツズマブ抗体を標準的方法でビオチン化し、ＧＳＴタグ付きＦｃγＲをグルタチオンキレートアクセプタービーズに結合させた。競合するＦｃ変異体の非存在下では、ＷＴ抗体とＦｃγＲは相互作用し、５２０−６２０ｎｍのシグナルを奏する。タグのないＦｃ変異体の添加はＷＴＦｃ／ＦｃγＲ相互作用と競合し、蛍光を定量的に減少させ、相対的結合親和性の測定を可能にする。全Ｆｃ変異体を、AlphaScreen^(商標)アッセイを使用してＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ結合についてスクリーニングした。選択されたＦｃ変異体を、その後ＦｃγＲＩＩｂ並びに他のＦｃγＲ類およびＦｃリガンド類への結合についてスクリーニングした。

図１１は、選択されたＦｃ変異体によるヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａの結合について、AlphaScreen^(商標)のデータを示す。低濃度および高濃度の競合抗体でのベースラインにより各々与えられる最大および最小発光シグナルに対して結合データを標準化した。非線形回帰を使用してデータを一部位競合モデルにフィットさせた。これらのフィットは図中で曲線により表す。これらのフィットは、各抗体について阻害濃度５０％（ＩＣ５０）（即ち、５０％阻害に必要とされる濃度）をもたらし（図１１中、破線で図解）、故にＦｃ変異体の相対的結合親和性を定量的に決定することを可能にする。ここで、ＷＴアレムツズマブは（４.６３ｘ１０^-9）ｘ（２）＝９.２ｎＭのＩＣ５０を有し、一方Ｓ２３９Ｄは（３.９８ｘ１０^-10）ｘ（２）＝０.８ｎＭのＩＣ５０を有する。従って、Ｓ２３９Ｄアレムツズマブは、ＷＴアレムツズマブよりも９.２ｎＭ／０.８ｎＭ＝１１.６４倍緊密にヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに結合する。同様の計算を全Ｆｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合について実施した。選択されたＦｃ変異体を、ヒトＦｃγＲＩＩｂへの結合についてもスクリーニングした。これらのAlphaScreen^(商標) 結合データを図１２に示す。表６１は、AlphaScreen^(商標)アッセイにより測定したＦｃ変異体のヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ（列３）およびヒトＦｃγＲＩＩｂ（列４）に対する結合について、親抗体と比較した増強倍率または低減倍率を提示する。これらのデータについて、１より大きい倍率は、結合親和性の増強を示し、１より低い倍率は、ＷＴＦｃと比較した結合親和性の低減を示す。トラスツズマブに関して試験したアスタリスク（＊）で示したものを除き、全データはアレムツズマブに関して得られた。

表６１

実施例３：ＦｃγＲ類への結合の選択的増強
ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂのスクリーニングから、最適化特性を有する数々の有望なＦｃ変異体を得た。表６１は、ＦｃγＲＩＩＩａにより緊密に結合し、従って抗体およびＦｃ融合体のエフェクター機能改良のための候補であるＦｃ変異体を提供する。これらには、２３９、２６４、３３０および３３２で置換を含む数々の変異体が含まれる。図１３は、これらのＦｃ変異体のいくつかについて、AlphaScreen^(商標)結合データを示す。これらのＦｃ変異体の大部分は、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａよりも実質的に大きいＦｃγＲＩＩＩａ結合増強を提供する。

Ｆｃ変異体の大部分を抗体アレムツズマブに関してスクリーニングしたが、選択されたＦｃ変異体は、リツキシマブおよびトラスツズマブに関してもスクリーニングした。選択されたＦｃ変異体の、リツキシマブおよびトラスツズマブに関するヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合のAlphaScreen^(商標)データを、図１４および１５に各々示す。結果は、抗体に関係なく、Ｆｃ変異体が一貫した結合の増強を発揮し、従って本発明のＦｃ変異体が抗体およびＦｃ融合体に広く適用可能であることを示す。

ＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩｂに対して異なって増強された結合を示すＦｃ変異体が得られた。論じたように、最適なエフェクター機能は、活性化ＦｃγＲ類への親和性が阻害性ＦｃγＲＩＩｂへの親和性より大きいＦｃ変異体から生じ得る。この特異的プロフィールを有する２つのＦｃ変異体について、ＦｃγＲＩＩＩａとＦｃγＲＩＩｂへの結合を直接比較するAlphaScreen^(商標)データを、図１６ａおよび１６ｂに示す。この概念は、活性化ＦγＲの増強または低減倍率（表６１、列３）を、阻害性ＦｃγＲの増強または低減倍率（表６１、列４）で割ることにより定量的に定義でき、本明細書ではＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比と呼ぶ。この値を表６１の列５に提供する。表６１は、Ｆｃ変異体が、最高で８６：１のＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比で、この特異的プロフィールを提供することを示す。

エフェクター機能の増強について最も有望ないくつかの本発明のＦｃ変異体は、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性の実質的な増加および好都合なＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率の比の両方を有する。これらには、例えば、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝５６、ＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率＝３）、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝１３０）、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝１３９、ＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率＝１８）およびＳ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ（ＦｃγＲＩＩＩａ倍率＝２９５、ＦｃγＲＩＩＩａ倍率：ＦｃγＲＩＩｂ倍率＝４８）が含まれる。図１７は、これらおよび他のＦｃ変異体について、ヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに対するAlphaScreen^(商標) 結合データを示す。

エフェクター機能に寄与する数々のＦｃγＲ類があるので、Ｆｃ変異体を他の受容体に対してさらにスクリーニングする価値があり得る。図１８は、選択されたＦｃ変異体のヒトＲ１３１ＦｃγＲＩＩａに対する結合のAlphaScreen^(商標)データを示す。見られるように、好都合な結合増強および特異的プロフィールを有するこれらの上述の変異体は、この活性化受容体についても結合の増強を示す。ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩｃのスクリーニングへの使用は、実験的試験をこれらの特定のＦｃγＲ類に制限することを意味しない；以前に説明したように、ヒト、マウス、ラット、サルなどに由来する無数のＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩのアイソフォームおよびアロタイプを含むがこれらに限定されるものではない他のＦｃγＲ類が、スクリーニングに企図されている。

図１１−１８および表６１に提供されるＦｃγＲ結合データは、全部合わせて、位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４３、２６４、２６６、３２５、３２８、３３０および３３２における数々の置換が、抗体およびＦｃ融合体のエフェクター機能の改善のために有望な候補であることを示す。これらの置換のいくつかの組合せは典型的に相加的または共同的な結合の改善をもたらしたので、まだ探査されていない表６１に提供されるＦｃ変異体の組合せも、好都合な結果を提供すると予想される。従って、表６１中の全てのＦｃ変異体の組合せが企図されている。同様に、表６１のＦｃ変異体のいずれかと、既発見または未発見のＦｃ変異体との組合せも、好ましい特性を提供し得、これらの組合せも企図されている。されに、これらの結果から、位置２３４、２３５、２３９、２４０、２４３、２６４、２６６、３２５、３２８、３３０および３３２での他の置換も、好都合な結合増強および特異性を提供し得、従って、表６１に提示したもの以外のこれらの位置での置換も企図されている。

実施例４：ＦｃγＲ類への結合の低減
論じたように、より高いエフェクター機能への要望があるが、いくつかの抗体治療には、低減または排除されたエフェクター機能が望ましいことがある。表６１中のいくつかのＦｃ変異体は、実質的にＦｃγＲ結合を低減または除去し、従ってエフェクター機能が望ましくない抗体およびＦｃ融合体において用途を見出し得る。そのような変異体のいくつかの例について、AlphaScreen^(商標)結合データを図１９ａおよび１９ｂに示す。これらのＦｃ変異体並びにそれらの組み合わせた使用は、望ましい場合に、例えばその作用メカニズムが阻害または拮抗作用を含むが標的抗原を有する細胞の殺傷を含まない抗体およびＦｃ融合体において、エフェクター機能を除去するのに用途を見出し得る。

実施例５：非グリコシル化Ｆｃ変異体
論じたように、本実験の１つの目標は、最適化非グリコシル化Ｆｃ変異体を得ることであった。いくつかのＦｃ変異体は、この目標に対して有意な進歩を提供する。グリコシレーション部位であるので、Ｎ２９７での置換は、非グリコシル化Ｆｃをもたらす。Ｎ２９７での置換を有する他の全てのＦｃ変異体は完全にＦｃγＲ結合を除去するが、一方Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２Ｅは、表６１に示し、図２０に図解するように、有意なＦｃγＲＩＩＩａへの結合親和性を有する。この結果の正確な理由はこの変異体の高解像度の構造がないので不確かであるが、コンピューター処理スクリーニング予想は、これは新しい好都合なＦｃ／ＦｃγＲ相互作用と好都合な静電気的特性の組合せによる可能性があることを示唆する。実際に、他の静電気的置換が、さらなる非グリコシル化Ｆｃの最適化のために構想されている。表６１は、Ｓ２３９Ｄ／Ｎ２９７Ｄ／Ｉ３３２ＥおよびＮ２９７Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２Ｅなどの他の非グリコシル化Ｆｃ変異体が、ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性をグリコシル化ＷＴアレムツズマブの各々０.２８−および０.４３倍にする結合の増強をもたらすことを示す。これらの変異体の他のＦｃγＲ結合を増強するＦｃ変異体との組合せが企図されており、グリコシル化親Ｆｃとほぼ同等かまたはより良好な親和性を有する１またはそれ以上のＦｃγＲ類に結合する非グリコシル化Ｆｃ変異体を得ることを目標としている。さらなる有望なＦｃ変異体のセットは、炭水化物の非存在下で安定性と溶解性の増強をもたらす。ＦγＲ結合を媒介しないが炭水化物とＦｃとの間の接点を決定する位置である位置２４１、２４３、２６２および２６４で置換を含むＦｃ変異体は、恐らくそれらが炭水化物の立体構造を乱すので、ＦγＲ結合を除去する。しかしながら、脱グリコシル化形態では、Ｆｃ変異体Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｒ／Ｖ２６２Ｅ／Ｖ２６４Ｒ、Ｆ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｅ、Ｆ２４１Ｒ／Ｆ２４３Ｑ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４ＲおよびＦ２４１Ｅ／Ｆ２４３Ｙ／Ｖ２６２Ｔ／Ｖ２６４Ｒは、図２１のAlphaScreen^(商標)データで示すように、グリコシル化形態よりも強いＦｃγＲＩＩＩａへの結合を示す。この結果は、これらが非グリコシル化Ｆｃの構造、安定性、溶解性および機能の最適化の鍵となる位置であることを示す。これらの結果は共に、タンパク質工学処理を使用して、炭水化物の非存在下で、抗体およびＦｃ融合体の好都合な機能および溶解特性を回復でき、これらおよび他のＦｃ位置で置換を含む好都合な溶解特性および十分な機能性を有する非グリコシル化抗体およびＦｃ融合体への道を開くことができることを示唆する。

実施例６．多型のＦｃγＲＩＩＩａに対するＦｃ変異体の親和性
上記で論じた通り、Ｆｃ−媒介エフェクター機能の重要なパラメーターは、ＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８とＦ１５８の両多型に対するＦｃの親和性である。選択された変異体の２つの受容体アロタイプへの結合を比較するAlphaScreen^(商標)データを、図２２ａ（Ｖ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ）および図２２ｂ（Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａ）に示す。見られるように、全変異体は、両ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプへの結合を改善する。これらのデータは、エフェクター機能が増強された本発明のこれらのＦｃ変異体が全患者群に広く適用可能であり、臨床効力への増強は、それを最も必要とする低応答患者群に対して潜在的に最大であることを示す。

これらのＦｃ変異体のＦｃγＲ結合親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Biacore, Uppsala, Sweden）を使用してさらに調べた。ＳＰＲは、タンパク質−タンパク質相互作用の結合親和性の測定を可能にする鋭敏かつ極度に定量的な方法であり、Ｆｃ／ＦｃγＲ結合を有効に測定するために使用されてきた（Radaev et al., 2001, J Biol Chem 276:16478-16483)。従って、ＳＰＲは、AlphaScreen^(商標)アッセイに優れた補足的結合アッセイを提供する。Ｈｉｓ−タグ付きＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａをＳＰＲチップに固定し、ＷＴおよびＦｃ変異体のアレムツズマブ抗体を広範囲の濃度でチップ上に流した。標準的な曲線フィット法を使用してデータをフィットさせることにより結合定数を得た。表６２は、ＳＰＲを使用して得られた選択されたＦｃ変異体のＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合についての解離定数（Ｋｄ）を提示し、これらをAlphaScreen^(商標)アッセイから得られたＩＣ５０と比較する。各変異体のＫｄおよびＩＣ５０をＷＴアレムツズマブのそれで割ることにより、ＷＴに対する改善倍率（倍率）を得る。

表６２

ＳＰＲデータは、AlphaScreen^(商標)アッセイで観察されたＦｃγＲＩＩＩａ親和性の改善を補強する。表６２はさらに、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥおよびＩ３３２ＥがＳ２９８ＡおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａよりも優位であることを示す；Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４ＡはＶ１５８およびＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへのＦｃ結合を各々１.７倍および４.７倍改善するが、一方Ｉ３３２Ｅは、各々２.２倍および１０.１倍の結合の増強を示し、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅは、各々４.０倍および１４倍の結合の増強を示す。Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥのＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに対する親和性（５２ｎＭ）が、ＷＴのＶ１５８アロタイプに対するそれ（６８ｎＭ）より良好であることも留意に値する。これは、このＦｃ変異体並びにさらに大きい結合の改善を伴うものは、低応答患者群のための抗体の臨床的効力が高応答者のために現在可能なものを達成することを可能にする。ＳＰＲとAlphaScreen^(商標)の結合測定の相関を図ｓ２３ａ−２３ｄに示す。図２３ａおよび２３ｂは、各々Ｖ１５８ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合についてＫｄ−ＩＣ５０の相関を示し、図２３ｃおよび２３ｄは、各々Ｖ１５８ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合についての倍率−改善の相関を示す。これらのデータの直線への良好なフィット（ｒ²＝０.９、ｒ²＝０.８４、ｒ²＝０.９８およびｒ²＝０.９０）は、AlphaScreen^(商標)測定の正確さを支持し、Ｆｃ変異体の相対的ＦｃγＲ結合親和性の測定のためのその使用の妥当性を立証する。

実施例７．Ｆｃ変異体のＡＤＣＣ
エフェクター機能に対する効果を測定するために、選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＡＤＣＣアッセイを実施した。精製ヒト末梢血単球（ＰＢＭＣ）をエフェクター細胞として用いるＤＥＬＦＩＡ^{(登録商標)}ＥｕＴＤＡベースの細胞傷害作用アッセイ（Perkin Elmer, MA）を使用して、ＡＤＣＣを測定した。標的細胞にＢＡＴＤＡを１ｘ１０⁶細胞／ｍｌで載せ、４回洗浄し、９６ウェルプレートに１０,０００細胞／ウェルで播いた。次いで、明記した最終濃度でＦｃ変異体またはＷＴの抗体を使用して、標的細胞をオプソニン化した。ヒトＰＢＭＣを指示された過剰倍率の標的細胞で添加し、プレートを３７℃で４時間インキュベートした。一緒に培養した細胞を５００ｘｇで遠心分離し、上清を別のプレートに移し、Ｅｕ溶液とインキュベートし、Packard Fusion^(商標) リーダー（Packard Biosciences, IL）を使用して相対的蛍光ユニットを測定した。サンプルを３重（triplicate）とし、誤差評価を得た（ｎ＝３、＋／−Ｓ.Ｄ.）。ＰＣＲを使用して、ＰＢＭＣをＶ１５８またはＦ１５８ＦｃγＲＩＩＩａアロタイプについてアロタイプ分析した。

ＤｏＨＨ−２リンパ腫標的細胞を使用して、Ｆｃ変異体およびＷＴアレムツズマブのＡＤＣＣアッセイを行った。図２４ａは、これらのタンパク質の１０ｎｇ／ｍｌ抗体でのＡＤＣＣを示す棒グラフである。結果は、アレムツズマブＦｃ変異体Ｉ３３２Ｅ、Ｖ２６４ＩおよびＩ３３２Ｅ／Ｖ２６４ＩがＷＴアレムツズマブと比較して実質的に増強されたＡＤＣＣを有することを示し、相対的ＡＤＣＣ増強は、AlphaScreen^(商標)アッセイおよびＳＰＲで示されたそれらのＦｃγＲＩＩＩａへの結合の改善に比例する。ＡＤＣＣの抗体濃度に対する用量依存性を図２４ｂに示す。これらのデータは、抗体の低濃度および高濃度でベースラインにより各々もたらされる最小および最大発光シグナルに対して標準化した。非線形回帰を使用して、データをＳ字型用量反応モデルにフィットさせた。これは、図中の曲線で表される。このフィットは、各Ｆｃ変異体について相対的なＡＤＣＣの増強を提供する５０％有効濃度（ＥＣ５０）（即ち、５０％の効力に必要とされる濃度）の決定を可能にする。これらの結合データのＥＣ５０は、AlphaScreen^(商標)競合データから得られたＩＣ５０に類似し、従って、これらの値の派生物は、実施例２および図１１に記載したものと類似する。図２４ｂ中、ＷＴ、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅアレムツズマブのデータへのフィットから得られるｌｏｇ（ＥＣ５０）は、各々０.９９、０.６０および０.４９であり、従って、それらの各々のＥＣ５０は、９.９、４.０および３.０である。故に、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｅ／Ｉ３３２Ｅは、ヘテロ接合性Ｖ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａを発現しているＰＢＭＣを使用して、ＷＴアレムツズマブの各々２.５倍および３.３倍のＡＤＣＣ増強をもたらす。これらのデータを下記表６３にまとめる。

表６３

これらのＡＤＣＣ増強が抗体に広く適用可能であるか否かを判定するために、選択されたＦｃ変異体をリツキシマブおよびトラスツズマブに関して評価した。ＷＩＬ２−Ｓリンパ腫標的細胞を使用して、ＡＤＣＣアッセイをＶ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅ、ＷＴおよびＳ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａリツキシマブに行った。図２５ａは、これらのタンパク質の１ｎｇ／ｍｌ抗体でのＡＤＣＣを示す棒グラフを提示する。結果は、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２ＥリツキシマブがＷＴリツキシマブと比較して実質的に増強されたＡＤＣＣ、並びにＳ２９８Ａ／Ｄ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａより優れたＡＤＣＣをもたらすことを示し、これはAlphaScreen^(商標)アッセイおよびＳＰＲで観察されたＦｃγＲＩＩＩａ結合の改善と一致する。図２５ｂは、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存性を示す。これらのデータのフィットから得られるＥＣ５０およびＡＤＣＣの相対的改善倍率を下記表６４に提供する。見られるように、Ｖ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅリツキシマブは、ホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａを発現しているＰＢＭＣについて、ＷＴの１１.３倍のＥＣ５０の増強をもたらす。リツキシマブについて観察されたアレムツズマブに対して高い改善は、恐らくヘテロ接合性Ｖ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａのＰＢＭＣではなくホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａを使用したためであり、また異なる抗体および標的細胞株を使用したためである可能性もある。

表６４

２つの乳癌腫標的細胞株ＢＴ４７４およびＳｋ−Ｂｒ−３を使用して、Ｆｃ変異体およびＷＴのトラスツズマブにＡＤＣＣアッセイを行った。図２６は、１ｎｇ／ｍｌ抗体でのＡＤＣＣを図解する棒グラフを示す。結果は、Ｖ２６４ＩおよびＶ２６４Ｉ／Ｉ３３２Ｅトラスツズマブが、ＷＴトラスツズマブと比較して実質的に増強されたＡＤＣＣをもたらし、相対的なＡＤＣＣ増強は、AlphaScreen^(商標)アッセイおよびＳＰＲにより示されたＦｃγＲＩＩＩａへの結合の改善に比例することを示す。図２６ｂは、抗体濃度に対するＡＤＣＣの用量依存性を示す。これらのデータのフィットから得られるＥＣ５０およびＡＤＣＣの相対的改善倍率を下記表６５に提供する。Ｉ３３２Ｅトラスツズマブについて、Ａ３３０ＬおよびＡ３３０Ｙと組み合わせた場合に、有意なＡＤＣＣの改善が観察される。

表６５

図２６ｃは、トラスツズマブ変異体について、様々な抗体濃度での用量反応ＡＤＣＣデータをもう１セット示す。これらのデータのフィットから得られるＥＣ５０およびＡＤＣＣの相対的改善倍率を下記表６６に提供する。結果は、トラスツズマブＦｃ変異体Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ｓ２９８Ａ／Ｉ３３２Ｅ、Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｙ／Ｉ３３２ＥおよびＳ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅが、ＷＴトラスツズマブおよびＳ２９８Ａ／Ｅ３３３Ａ／Ｋ３３４Ａと比較して実質的なＡＤＣＣ増強をもたらすことを示し、これはAlphaScreen^(商標)アッセイおよびＳＰＲで観察されたＦｃγＲ結合データと一致する。Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅトラスツズマブは、これまでに観察された最大のエフェクター機能の増加を示し、ホモ接合性Ｆ１５８／Ｆ１５８ＦｃγＲＩＩＩａを発現しているＰＢＭＣにＷＴの約５０倍のＥＣ５０の増強をもたらす。

表６６

実施例８．Ｆｃ変異体による補体結合および活性化
補体タンパク質Ｃ１ｑは、Ｆｃ上のＦｃγＲ結合部位に近接する部位に結合し、従って、Ｆｃ変異体が補体を募り活性化するそれらの能力を維持するか否かを判定することが賢明であった。AlphaScreen^(商標)アッセイを使用して、選択されたＦｃ変異体の補体タンパク質Ｃ１ｑへの結合を測定した。実施例２に記載のようにストレプトアビジンドナービーズに付着したビオチン化ＷＴアレムツズマブ抗体を用いて、そしてアクセプタービーズに直接結合させたＣ１ｑを使用して、アッセイを実行した。図２７ａに示す選択されたＦｃ変異体の結合データは、Ｃ１ｑ結合が損なわれていないことを示す。選択されたＦｃ変異体の細胞をベースとするＣＤＣアッセイも実施し、Ｆｃ変異体が補体を活性化する能力を維持するか否かを調べた。Amar Blue を使用して、Ｆｃ変異体およびＷＴのリツキシマブでオプソニン化されたＷＩＬ２−Ｓリンパ腫細胞のヒト血清補体（Quidel, San Diego, CA）による溶解をモニタリングした。図２７ｂに示す選択されたＦｃ変異体についての結果は、ＣＤＣが損なわれていないことを示す。

実施例９．Ｆｃ変異体によるプロテインＡの結合
論じたように、細菌のプロテインＡは、Ｃγ２とＣγ３のドメインの間のＦｃ領域に結合し、抗体の精製に頻繁に用いられる。AlphaScreen^(商標)アッセイを使用して、実施例２に記載のようにストレプトアビジンドナービーズに付着したビオチン化ＷＴアレムツズマブ抗体を使用して、そしてアクセプタービーズに直接結合させたプロテインＡを使用して、選択されたＦｃ変異体のプロテインＡへの結合を測定した。図２８に示す選択されたＦｃ変異体についての結合データは、Ｆｃ変異体のプロテインＡに結合する能力が損なわれていないことを示す。これらの結果は、新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎやタンパク質Ｇなどの、プロテインＡと同じＦｃの部位に結合する他のＦｃリガンドに対するＦｃ変異体の親和性も影響されないことを示唆する。

実施例１０．Ｆｃ変異体のマウスＦｃγＲに結合する能力
非ヒトＦｃγＲ類のＦｃ最適化は、動物モデルでＦｃ変異体を実験的に試験するのに有用であり得る。例えば、マウス（例えば、ヌードマウス、ＳＣＩＤマウス、異種移植マウスおよび／または遺伝子組換えマウス）で試験する場合、１またはそれ以上のマウスＦｃγＲについて最適化されたＦｃ変異体を含む抗体およびＦｃ融合体は、効力、作用メカニズムなどに関して価値ある情報を提供し得る。本発明のＦｃ変異体がそのような実験に有用であり得るか否かを評価するために、選択されたＦｃ変異体のマウスＦｃγＲＩＩＩに対する親和性を、AlphaScreen^(商標)アッセイを使用して測定した。実施例２に記載のようにストレプトアビジンドナービーズに付着したビオチン化ＷＴアレムツズマブ、および実施例２に記載の通り発現および精製した、グルタチオンキレートアクセプタービーズに結合したＧＳＴタグ付きマウスＦｃγＲＩＩＩを使用して、AlphaScreen^(商標) アッセイを実行した。これらの結合データを図２９に示す。結果は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａへの結合を増強するいくつかのＦｃ変異体は、マウスＦｃγＲＩＩＩへの結合も増強することを示す。この結果は、本発明のＦｃ変異体または非ヒトＦｃγＲ類について最適化された他のＦｃ変異体が、動物モデルを使用する実験において用途を見出し得ることを示す。

実施例１１．ＣＨＯ細胞で発現されたＦｃ変異体の妥当性
本発明のＦｃ変異体をスクリーニングの目的で２９３Ｔ細胞に発現させたが、大スケールでの抗体の産生は、典型的にチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株での発現により実行される。ＣＨＯで発現されたＦｃ変異体の特性を評価するために、選択されたＦｃ変異体およびＷＴのアレムツズマブを、実施例２に記載の通りにＣＨＯ細胞で発現させ、精製した。図３０は、ＣＨＯおよび２９３Ｔで発現させたＦｃ変異体およびＷＴのアレムツズマブのヒトＶ１５８ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を比較するAlphaScreen^(商標)データを示す。結果は、２９３ＴまたはＣＨＯのどちらで発現されても、本発明のＦｃ変異体が同等のＦｃγＲ結合の増強を示すことを示す。

実施例１２．Ｆｃ変異体の治療適用
本発明について記載された数々のＦｃ変異体は、抗癌抗体の治療効力の改善に有意な潜在能力を有する。例示説明のために、数々の本発明のＦｃ変異体を抗体リツキシマブの配列に組み込んだ。ＵＳ５,７３６,１３７に記載されたＷＴリツキシマブの軽鎖および重鎖を図３１ａおよび３２ｂに提供する。改善された抗ＣＤ２０抗体の配列を図３１ｃに提供する。改善された抗ＣＤ２０抗体の配列は、Ｘ₁、Ｘ₂、Ｘ₃、Ｘ₄、Ｘ₅およびＸ₆からなる群から選択される非ＷＴアミノ酸を少なくとも含む。これらの改善された抗ＣＤ２０抗体の配列は、置換Ｚ₁も含み得る。ここでのリツキシマブの使用は、単なる例示であり、Ｆｃ変異体の適用をこの抗体または何らかの他の特定の抗体またはＦｃ融合体に制限することを意味しない。

全参考文献は、出典明示により本明細書の一部とする。

例示説明のために本発明の特定の実施態様を上に記載したが、添付の特許請求の範囲に記載した本発明から逸脱せずに、膨大な詳細の変形をなし得ることが当業者に理解される。

Claims

ヒトの親ＩｇＧ１ポリペプチドのＦｃ変異体を含むポリペプチドであって、当該Ｆｃ変異体が、当該親ポリペプチドのＦｃ領域において位置３２８で３２８Ｍ、３２８Ｅ、３２８Ｆおよび３２８Ａからなる群から選択されるアミノ酸置換を含み、かつ、親ポリペプチドと比較して減少したＦｃγＲＩＩＩａへの結合性を示し、ここで番号付けはＥＵインデックスに従う、ポリペプチド。
当該ＦｃγＲＩＩＩａが、ＦｃγＲＩＩＩａのＶ１５８またはＦ１５８アロタイプである、請求項１に記載のポリペプチド。
当該ポリペプチドが抗体または融合体である、請求項１に記載のポリペプチド。
当該抗体が工学処理された糖形態をさらに含む、請求項３に記載のポリペプチド。
当該ポリペプチドが、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ５２、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＭＵＣ１、ＧＤ３、ＣＥＡ、ＣＡ１２５、ＨＬＡ−ＤＲ、ＴＮＦαおよびＶＥＧＦからなる群から選択される標的抗原に特異性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
当該Ｆｃ変異体が３２８Ｆの置換を含む、請求項１に記載のポリペプチド。