CN101331223A - 细胞展示抗体文库 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码在细胞中表达时展示在细胞膜上的抗体或抗体片段文库的病毒载体。本发明提供了含有病毒载体核酸的细胞和筛选具有所需特性的抗体或抗体片段文库的方法。

Description

细胞展示抗体文库
发明领域
本发明提供了在细胞膜表面上展示抗体或抗体片段的方法；产生在细胞表面上展示的抗体或抗体片段文库的方法；在细胞表面上表达抗体或抗体片段文库的细胞；在细胞膜上表达抗体或抗体片段文库的病毒载体文库；筛选结合于具体抗原的抗体或抗体片段的方法；筛选结合特性改进和/或改变的抗体或抗体片段的方法；筛选在其细胞表面上表达和展示结合于具体抗原的抗体或抗体片段的细胞的方法；筛选在其细胞表面上表达和展示结合特性改进和/或改变的抗体或抗体片段的细胞的方法；和相关试剂盒。本发明还提供了配体结合(如FcγR结合)改变和/或效应物功能(如ADCC活性)改变的Fc变体。
发明背景
抗体是结合特定抗原的免疫蛋白。在大多数哺乳动物，包括人和小鼠中，由成对的重链和轻链多肽构建抗体。各链由两个不同区域组成，称为可变区(Fv)和恒定区(Fc)。轻链和重链Fv区含有该分子的抗原结合决定簇，负责结合靶抗原。Fc区确定了抗体类型(或同种型)(如IgG)，并负责结合许多Fc受体和其它Fc配体，赋予一系列重要功能，称为效应物功能。抗体的几种关键特征包括但不限于：对靶点的特异性、介导免疫效应物机制的能力和长血清半衰期、使抗体具有更好的疗效。开发了用于分离具有所需结合特异性的抗体的重组筛选法。例如，可能用组合的重组DNA技术产生结合分子的大型表达文库。在抗体工程领域尤其如此，在此领域重组抗体文库通常含有超过109个独立克隆。大型结合分子文库的可用性为大多数配体提供了结合物来源。
通过对展示结合分子的生物体(如噬菌体和酵母)进行连续选择(如淘选；综述参见，Trends Biotechnol 9：408-414；Coomber等，2002，Methods MolBiol 178：133-45，Kretzschmar等，2002，Curr Opin Biotechol 13：598-602；Fernandez-Gacio等，2003，Bioorg Med Chem Lett.13：213-216；Lee等，2003，Trends Biotechnol 21：45-52；和Kondo等，2004，Appl MicrobiolBiotechnol 64：28-40)，能够用表面展示文库富集特定结合克隆。具体说，噬菌体展示抗体文库的进展使它们成为筛选常规杂交瘤衍生的单克隆抗体的吸引人的替代技术。由于单个噬菌体展示文库中可含有多种不同多肽(一般超过109种)，所以噬菌体展示文库筛选优于其它一些筛选方法。这便能够在一个筛选步骤中筛选高度复杂的文库。
噬菌体上展示小肽或单链蛋白可能有利，只要不一定需要或不需要胞内加工或翻译后修饰(噬菌体或原核宿主不能进行这些功能)。例如，有效展示异源多肽可能需要各种翻译后修饰、胞内结构、以及将展示多肽适当地运输、糖基化、构型、组装和锚定到宿主细胞表面上所需要的侣伴蛋白和专用酶的一套补充物(complement)；然而，这些过程均无法通过噬菌体或原核细胞过程实现。而且，原核细胞不总是有效地表达功能性真核蛋白。
细菌和噬菌体展示系统也受限于展示系统的小容量，因此，更适合展示小肽，如最近开发的在哺乳动物细胞上进行小肽表面展示的方法(参见例如Wolkowicz等，2005，J.Biol.Chem.，280：15195-15201)。结果是，噬菌体和哺乳动物抗体展示文库和方法需要在表面上只展示抗体片段。如果目的是发现“完整”抗体，那么必须将抗体片段克隆到完整抗体中。这不仅增加了一个额外步骤，而且当转变为完整抗体和这类文库时，许多抗体片段对抗原的亲和力降低。而且，无法使用这类方法检测其它抗体结构域如Fc区与抗体受体(如Fc受体)或其它Fc配体的结合。
已经开发了一些真核细胞如酵母的完整抗体细胞表面展示系统(参见例如Boder和Wittrup，2000，Methods in Enzymology，328：430-444)，但在哺乳动物细胞上进行完整抗体展示的开发滞后。而且，这些系统中可以产生的文库大小有限。因为用所需结合特性从抗体文库中分离抗体的概率与文库的大小和多样性成正比，所以需要一种方法产生大型多样化的文库。如果想要从未免疫的供体建立用于抗体发现的天然抗体文库，这一点特别重要。目前，通过采用常规转染工具如瞬时转染或电穿孔的真核细胞展示技术建立大于108个成员的文库是个挑战。因此，需要用于真核细胞，特别是哺乳动物细胞的抗体细胞表面展示文库和文库筛选方法，该文库能保持大量不同信息，但消除了上述问题。这一系统对于鉴定可变区外区域如Fc区域中的抗体变异特别有用。已证明，Fc区修饰，包括氨基酸缺失、取代和添加能改变Fc区与其配体和/或受体的结合，导致效应物功能伴随性改变(参见例如(Shields等，2001，J Biol Chem276：6591-6604和Presta等，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490和美国专利公开2004/0132101)。因此，可通过修饰Fc区提高含Fc分子的治疗有效性。在哺乳动物细胞上进行完整抗体细胞表面展示的系统能促进快速鉴定含有效应物功能改变的修饰Fc区的抗体。
引用或讨论本文引用的参考文献不应被认为是承认该文献是本发明的现有技术。
发明概述
本发明涉及在细胞膜胞外表面上展示的重组抗体或其片段，本文中称为“本发明抗体”和类似术语。在某些实施方式中，本发明重组抗体包含重链或其片段，和任选的轻链或其片段，其中重链或轻链还包含使抗体或其片段靶向细胞表面的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列的全长重链，其中所述氨基酸序列融合于所述重链的C末端，还可包含全长轻链。在另一实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列的一部分重链，其中所述氨基酸序列融合于所述重链部分的C末端，还可包含轻链或其片段。在一个具体实施方式中，使抗体靶向细胞表面的所述氨基酸序列是跨膜域。在另一实施方式中，使抗体靶向细胞表面的所述氨基酸序列是GPI锚定信号序列。
本发明还涉及包含编码细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的多核苷酸的载体，在本文中称为“本发明载体”。在一个实施方式中，本发明载体是病毒载体。在一个具体实施方式中，本发明载体是腺病毒载体。
本发明也涉及包含在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的文库，在本文中称为“本发明文库”。在一个实施方式中，本发明文库包含重链可变区文库；它还可包含轻链可变区文库；它还可包含变异Fc区的文库。在一个实施方式中，本发明文库是包含编码在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的多核苷酸的细胞文库。
本发明也提供了筛选包含在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的本发明文库的方法。在一个实施方式中，文库筛选方法能够鉴定结合于特定抗原的抗体或其片段。在一个实施方式中，文库筛选方法能够鉴定对特定抗原结合特性改变的抗体或其片段。在一个实施方式中，文库筛选方法能够鉴定与效应物分子(如FcγRs和/或Clq)结合特性改变的抗体或其片段。
本发明提供了与效应物分子(如FcγRs和/或Clq)结合特性改变的变异Fc区。本发明还提供了效应物功能改变的变异Fc区。在一个实施方式中，本发明变异Fc区的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)降低。
附图简要说明
为了说明本发明的示范性实施方式，本文提供了附图。
图1A-C.可用于细胞表面展示抗体或其片段的表达盒(I-VI)的非限制性例子的示意图。
图2.表达含有跨膜域或GPI锚定信号的抗体融合多肽的染色HEK-293T细胞的荧光强度概况。用FITC偶联的抗-人IgG或生物素化EphA2-Fc融合蛋白/FITC偶联的抗生物素抗体对表达含重链的抗EphA2抗体的HEK-293T细胞进行染色，所述重链融合于i)羧基肽酶M的GPI锚定信号(CM GPI)，ii)DAF的移码突变型GPI锚定信号(DAF mutGPI)，iii)DAF的变异GPI锚定信号(DAFvGPI)，或iv)血栓调节蛋白的跨膜域(TM；所分析的两种独立分离的克隆)，然后用流式细胞仪分析。经类似染色(293T+FITC)以及未染色(293T)的HEK-293T细胞用作阴性对照。表达CM GPI、DAF vGPI或TM融合的抗EphA2抗体的细胞荧光强度显著高于对照细胞。表达DAF mutGPI融合的抗EphA2抗体的细胞荧光强度与对照HEK-293T细胞基本相同。
图3.用不同量编码含有DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的质粒DNA转染的HEK-293T细胞经亲和染色后的荧光强度图。用不同量(0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、4和10μg)的质粒DNA转染HEK-293T细胞。转染细胞先接触FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白，然后用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色。随后用流式细胞仪分析细胞。非转染HEK-293T细胞用作阴性对照。所有转染细胞群体的流式细胞图显示出，与对照细胞相比平均荧光强度发生显著改变。
图4.表达含DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的HEK-293T细胞经亲和染色后的荧光强度图。用10μg编码含DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的质粒DNA转染HEK-293T细胞。将转染细胞分成等份，用不同稀释度的FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白(1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000和1∶5000)培育。然后用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色细胞，流式细胞术分析。流式细胞图显示，FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白用量降低时，导致荧光强度降低。
图5.用于分离对FcγRIIIA结合亲和力低的Fc变体的分选参数。用Fc变体插入文库(Fc-IL)瞬时转染HEK-293细胞，并用FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白/FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色。(A)用门R2分离荧光强度低(约为M1标记物总量的10％)的细胞。(B)分离的细胞群体显示出均一的低荧光强度。
图6.表达含有DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的Fc变体的HEK-293细胞经染色的荧光强度图形。用流式细胞术分析表达含有DAF vGPI的抗EphA2融合抗体的野生型(A和D)、K246E Fc变体(B和E)或InR236/237Fc变体(C和F)的HEK-293细胞。细胞用FITC偶联抗人IgG抗体(A-C)或用FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白/FITC偶联抗链霉亲和素抗体染色。各图包含表达抗体(黑线)和对照(灰线)的HEK-293细胞的流式细胞图。用FITC偶联抗人IgG抗体染色的所有三种细胞群体的荧光强度水平相似，与对照细胞的观察值显著不同。用FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白/FITC偶联抗链霉亲和素抗体染色时，只有表达野生型或K246E Fc变体抗体的细胞的荧光强度显著高于对照HEK-293细胞的观察值。
图7.Fc变体InR236/237、InN238/239和InV238/239的基于ELISA的FcγRIIIA结合曲线。用标准ELISA方法建立FcγRIIIA与野生型或Fc变体InR236/237、InN238/239和InV238/239抗EphA2抗体相互作用的结合曲线。抗原特异性相同的IgG4同种型抗体用作阴性对照。结合曲线显示，FcγRIIIA与InR236/237、InN238/239或InV238/239Fc变体之间的相互作用比FcγRIIIA与IgG4阴性对照抗体Fc区之间的相互作用弱。FcγRIIIA能与含有野生型Fc区的阳性对照抗体强烈结合。
图8.Fc变体InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240、InR237/238和K246R/L251E/T260R的基于ELISA的Clq结合曲线。用标准ELISA方法建立Clq与野生型或Fc变体InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240、InR237/238和K246R/L251E/T260R抗EphA2抗体相互作用的结合曲线。抗原特异性相同的IgG4同种型抗体用作阴性对照。与野生型抗体相比，各Fc变体与Clq的结合减少。
图9.Fc变体K246R/L251E/T260R、InR236/237、InN238/239、InV238/239、InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240和InR237/238与THP-1细胞的结合百分数。使表达FcγRI和FcγRII、但不表达FcγRIIIA的THP-1单核细胞接触野生型或Fc变体K246R/L251E/T260R、InR236/237、InN238/239、InV238/239、InG240/241、InR234/235、InL238/239、InE238/239、InS239/240和InR237/238抗EphA2抗体。用FITC偶联抗人IgG Fab进行细胞染色来测定各抗体结合的THP-1单核细胞的百分数，并用流式细胞仪分析。得到的结果显示，与野生型抗体相比，各测试Fc变体与FcγRI和FcγRII的结合降低。
图10.Fc变体InR236/237、InN238/239和InV238/239与NK细胞的结合百分数。使表达FcγRIIIA的NK细胞与野生型或Fc变体InR236/237、InN238/239和InV238/239抗EphA2抗体相接触。通过FITC偶联抗人IgG Fab进行细胞染色来测定各抗体结合的NK细胞的百分数，并用流式细胞仪进行分析。抗原特异性相同的IgG4同种型抗体用作阴性对照。得到的结果显示，与野生型抗体相比，各测试Fc变体与FcγRIIIA的结合降低。
图11.Fc变体InR236/237、InN238/239、InV235/236和InG238/239的基于ELISA的EphA2结合曲线。用标准ELISA方法测定野生型和Fc变体InR236/237、InN238/239、InV235/236和InG238/239抗EphA2抗体与人EphA2的结合。本实验中将维他辛(Vitaxin)
Figure A20068004746300091
(抗-αvβ3整联蛋白抗体)和抗-HMGB1抗体用作阴性对照。结果证明，各测试Fc变体与人EphA2结合的亲和力类似于野生型抗体。
图12.Fc变体InR236/237、InN238/239、InV238/239的体外ADCC活性。用标准方法以50∶1(左图)或25∶1(右图)的效应物∶靶细胞比测定Fc变体InR236/237、InN238/239、InV238/239的ADCC活性。野生型抗EphA2抗体和抗-CD4抗体(R347)分别用作阳性和阴性对照。表达EphA2的A549细胞用作靶点。纯化的人外周血单核细胞用作效应物。在0.1-10000ng/ml的抗体浓度下测定细胞毒性。各测试Fc变体显示的ADCC活性类似于阴性对照抗体。在相同条件下野生型抗EphA2抗体显示出强烈的ADCC活性。
图13.原理选择实验I的证据的流式细胞图。用αVβ3-生物素培育细胞，然后用FITC偶联的抗人IgG-Fc和APC偶联的链霉亲和素染色。展示样品如下：(A)阴性对照293A细胞，(B)用编码在细胞表面展示的3F2抗EphA2抗体的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(C)用编码细胞表面展示的Abegrin抗-αVβ3整联蛋白ScFvFc的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(D)在进行磁珠介导的选择之前用人工文库感染的293A细胞，(E)经过磁珠介导的选择后，用人工文库感染的293A细胞。采用门P6分选双阳性细胞。
图14.原理选择实验II的证据的流式细胞图。用生物素化EphA2培育细胞，然后用FITC偶联的抗人IgG-Fc和APC偶联的链霉亲和素染色。展示样品如下：(A)阴性对照293A细胞，(B)用编码细胞表面展示的Abegrin抗-αVβ3整联蛋白抗体的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(C)用编码细胞表面展示3F2抗-EphA2 ScFvFc的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(D)在进行磁珠介导的选择之前用人工文库感染的293A细胞，(E)经过磁珠介导的选择后，用人工文库感染的293A细胞。采用门P6分选双阳性细胞。图中显示了门P6覆盖的细胞百分数。
图15.原理选择实验III的证据的流式细胞图。用生物素化EphA2培育细胞，然后用FITC偶联的抗人IgG-Fc和APC偶联的链霉亲和素染色。展示样品如下：(A)阴性对照293A细胞，(B)用编码细胞表面展示的抗-PCDGF抗体的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(C)用编码细胞表面展示的10C12抗-EphA2ScFvFc的ts369突变腺病毒感染的293A细胞，(D)在进行磁珠介导的选择之前用人工文库感染的293A细胞，(E)经过磁珠介导的选择后，用人工文库感染的293A细胞。采用门P6分选双阳性细胞。图中显示了门P6覆盖的细胞百分数。
定义
本文所用术语“抗体”指单克隆抗体、多特异性抗体、人抗体、人源化抗体、camelised抗体、嵌合抗体、单链Fv(scFv)、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab’)片段和抗-独特型(抗-Id)抗体(包括例如，本发明抗体的抗Id抗体)和上述抗体的表位结合片段。具体说，抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子，即含有抗原结合位点的分子的免疫活性片段，这些片段可以或可以不融合于另一免疫球蛋白结构域，包括但不限于：Fc区或其片段。本文所用术语“抗体”和“抗体”也包括Fc变体、全长抗体和含有Fc区或其片段的Fc变体融合物。Fc变体-融合物包括但不限于：scFv-Fc融合物、可变区(如VL和VH)-Fc融合物、scFv-scFv-Fc融合物。抗体可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
本文提到的互补决定区(CDR)残基编号是Kabat等(1991，NIH公告(NIHPublication)91-3242，国家技术信息服务中心(National Technical InformationService)，弗吉尼亚州斯普林菲尔德(Springfield，VA))所述的编号。具体说，轻链可变区的残基24-34(CDR1)、50-56(CDR2)和89-97(CDR3)和重链可变区的31-35(CDR1)、50-65(CDR2)和95-102(CDR3)。需要注意，不同抗体之间的CDR明显不同(根据定义与Kabat共有序列没有同源性)。构架残基的最大比对常常需要在编号系统中插入“间隔物”残基，以用于Fv区。应理解，本文中提到的CDR是Kabat等同上所述的CDR。此外，由于种间或等位基因差异，在不同抗体链之间，任何给定的Kabat位点编号上某些单独残基的种类可能不同。
本文所用的“Fc区”包括含有除第一恒定区免疫球蛋白结构域以外的抗体恒定区的多肽。因此，Fc指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域和IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域以及这些结构域N末端方向上的弹性绞链区。就IgA和IgM而言，Fc可包括J链。就IgG而言，Fc包含免疫球蛋白结构域Cγ2和Cγ3以及Cγ1和Cγ2之间的绞链区。虽然Fc区的界限可能不同，但人IgG重链Fc区的羧基端通常会包含残基C226或P230，其中编号方式遵照Kabat等(1991，NIH公告91-3242，国家技术信息服务中心，弗吉尼亚州斯普林菲尔德)所述的EU索引。“如Kabat所述EU索引”指Kabat等同上所述的人IgG1EU抗体的残基编号方法。Fc可能指分离的这一区域，或者在抗体、抗体片段或Fc融合蛋白中的这一区域。Fc变体蛋白可能是抗体、Fc融合物、或者包含Fc区的蛋白质或蛋白质结构域。特别优选包含变异Fc区(非天然产生的Fc区变体)的蛋白质。与野生型氨基酸序列相比，非天然产生的Fc区(本文中也称为“变异Fc区”)的氨基酸序列包括至少一个氨基酸残基的取代、插入和/或缺失。由于插入或取代，变异Fc区序列中任何新出现的氨基酸残基都可称作非天然产生的氨基酸残基。需要注意：已经在许多Fc位置上观察到多态性，包括但不限于Kabat270、272、312、315、356和358，因此所述序列和现有技术中的序列之间可能略有差异。
本文所用术语“跨膜区”指能够跨越细胞质膜的肽、多肽或蛋白质的结构域。可采用这些结构域将抗体锚定在细胞膜上。
“嵌合抗体”是抗体不同部分衍生自不同免疫球蛋白分子的分子，如含有衍生自非人抗体和人免疫球蛋白恒定区的抗体。本领域知道产生嵌合抗体的方法。参见例如，Morrison，1985，Science 229：1202；Oi等，1986，BioTechniques4：214；Gillies等，1989，J.Immunol.Methods 125：191-202；和美国专利号5,807,715、4,816,567和4,816,397，CDR-嫁接(EP 239,400；PCT公开号WO91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶饰或重塑(EP592,106；EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering 7：805；和Roguska等，1994，PNAS91：969)和链改组(美国专利号5,565,332)。
“人源化抗体”是能够结合预定抗原，并且包含基本具有人免疫球蛋白氨基酸序列的框架区和基本具有非人免疫球蛋白氨基酸序列的CDR的抗体或变体或其片段。人源化抗体基本包含所有至少一个、通常两个可变结构域(Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Fv)，其中全部或几乎全部的CDR区对应非人免疫球蛋白(即供体抗体)的部分，并且全部或几乎全部的框架区为人免疫球蛋白的共有序列。在一个实施方式中，人源化抗体也至少包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的一部分，通常为人免疫球蛋白的一部分。通常，抗体包含轻链以及至少重链的可变区。抗体也可包含重链的CH1、绞链区、CH2、CH3和CH4区。人源化抗体可选自任一免疫球蛋白类型，包括但不限于IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，和任一同种型，包括但不限于IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在另一实施方式中，恒定结构域是一个补体结合性恒定结构域，其中期望人源化抗体具有细胞毒活性，一般类型为IgG1。当不需要细胞毒活性时，恒定结构域可为IgG2类型。人源化抗体可包含来自一种以上类型或同种型的序列，并且本领域一般技术人员能够选择特定恒定结构域以优化所需效应物功能。人源化抗体的框架区和CDR区不一定与亲本序列精确对应，如供体CDR或共有框架区可通过取代、插入或删除至少一个残基进行诱变，以使该位点CDR或框架残基不对应共有或引入抗体。然而，此类突变并不广泛存在。在一个实施方式中，至少75％、至少90％或至少95％的人源化抗体残基与亲本框架区(FR)的序列和CDR序列对应。可利用数种本领域熟知技术产生人源化抗体，包括但不限于：CDR-嫁接(欧洲专利号EP 239,400；PCT公开号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089)、镶面或表面重塑(欧洲专利号EP 592,106和EP 519,596；Padlan，1991，Molecular Immunology 28(4/5)：489-498；Studnicka等，1994，Protein Engineering 7(6)：805-814；和Roguska等，1994，PNAS 91：969-973)、链改组(美国专利号5,565,332)以及如美国专利号6,407,213、5,766,886，PCT公开号WO 93/17105，Tan等，2002，J.Immunol.169：1119-25，Caldas等，2000，Protein Eng.13：353-60，Morea等，2000，Methods 20：267-79，Baca等，1997，J.Biol.Chem.272：10678-84，Roguska等，1996，Protein Eng.9：895-904，Couto等，1995，Cancer Res.55(23Supp)：5973s-5977s，Couto等，1995，Cancer Res.55：1717-22，Sandhu，1994，Gene 150：409-10，和Pedersen等，1994，J.Mol.Biol.235：959-73)。通常，框架区的框架残基被来自CDR供体抗体的相应残基取代以改变和/或提高抗原结合。框架取代可通过本领域熟知方法进行鉴定，如通过对CDR和框架残基相互作用进行建模以鉴定抗原结合的重要残基，并且通过序列比较鉴定特定位置的不寻常框架残基(参见例如Queen等，美国专利号5,585,089；和Riechmann等，1988，Nature 332：323)。
本文所用术语″感染复数″(MOI)指每个细胞感染病毒颗粒的数量。
术语″ADCC″(抗体依赖性细胞介导的细胞毒性)指表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞裂解的细胞介导反应。介导ADCC的主要细胞NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC试验(如美国专利5,500,362和美国专利5,821,337)所述。用于这类试验的效应物细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。
″补体依赖性细胞毒性″和″CDC″指在补体存在下裂解靶细胞。补体系统的第一组分(Clq)与分子结合(例如与关联抗原复合的抗体)能启动补体激活途径。为了评估补体激活，可进行如Gazzano-Santoro等，1996，J.Immunol.Methods，202：163所述的CDC实验。
6.发明详述
本发明涉及在细胞膜的胞外表面上展示的重组抗体或其片段，在本文中称为“本发明抗体”和类似名称。
在一个实施方式中，本发明抗体是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在一个实施方式中，本发明抗体是人抗体。
在一个实施方式中，本发明抗体是选自IgA、IgE、IgM、IgD、IgY或IgG的免疫球蛋白类型。
在一个实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列的重链或其片段。在一个实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列的重链或其片段，所述氨基酸序列融合于所述重链或其片段的C末端。
在另一实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列的轻链或其片段。在一个具体实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列的轻链或其片段，所述氨基酸序列融合于所述轻链或其片段的C末端。
在一个实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列的全长重链，其中所述氨基酸序列与所述重链的C末端融合，还可包含全长轻链或其片段。在另一实施方式中，本发明重组抗体包含具有使抗体靶向细胞表面的重链部分，其中所述氨基酸序列与所述重链部分的C末端融合，还可包含轻链或其片段。
在一个具体实施方式中，所述使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列是跨膜区。在另一实施方式中，所述使抗体靶向细胞表面的氨基酸序列是GPI锚定信号序列。
本发明还涉及包含编码细胞膜胞外表面上展示的重组抗体或其片段的多核苷酸的载体，在本文中称为“本发明载体”。在一个实施方式中，本发明载体能够复制。在一个实施方式中，本发明载体是病毒载体。在一个实施方式中，本发明载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体或慢病毒载体。在一个具体实施方式中，本发明载体是腺病毒载体。
本发明也涉及包含细胞膜胞外表面上展示的重组抗体或其片段的文库，在本文中称为“本发明文库”。本发明提供了抗体或抗体片段文库，以及筛选细胞表面上展示抗体和/或抗体片段文库的细胞的方法。这些方法包括使用载体(包括但不限于病毒载体)将抗体文库递送给细胞，其中文库的表达导致在细胞表面上展示抗体。同时，提供了编码和/或展示抗体和/或抗体片段文库的病毒载体和细胞。
在一个实施方式中，本发明文库可包含重链可变区文库；还可包含轻链可变区的文库；还可包含变异Fc区的文库。
在一个实施方式中，本发明文库是包含编码在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的多核苷酸的细胞的文库。在一个实施方式中，哺乳动物细胞包含本发明文库。在一个具体实施方式中，选自NS0细胞、CHO细胞、Vero细胞、Sf-9细胞、COS7细胞或293细胞的细胞包含本发明文库。
本发明还提供了筛选包含细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段的本发明文库的方法。在一个实施方式中，筛选文库的方法能够鉴定结合特定抗原的抗体或其片段。在一个实施方式中，筛选文库的方法能够鉴定对特定抗原结合特性改变的抗体或其片段。在一个实施方式中，筛选文库的方法能够鉴定对效应物分子(如FcγR和/或Clq)的结合特性改变的抗体或其片段。
本发明提供了对效应物分子(如FcγR和/或Clq)的结合特性改变的变异Fc区。本发明还提供了效应物功能改变的变异Fc区。在一个实施方式中，本发明变异Fc区的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)降低。
本发明提供了一种选择表达具有所需结合特性的至少一种抗体或其片段的哺乳动物细胞的方法，其中所述方法包括：a)用表达载体将核酸文库引入哺乳动物细胞中，其中所述核酸编码细胞表面上展示的抗体或抗体片段；b)培养含有该文库的哺乳动物细胞，以便表达和细胞表面递呈各载体编码的多肽；c)使所述细胞与抗原相接触；和d)分离包含结合于该抗原的至少一种细胞表面展示多肽的细胞。本发明还提供了1)由分离的哺乳动物细胞回收核酸；2)由该核酸扩增编码至少一种抗体可变区的核酸；3)将扩增核酸插入第二载体中，其中含有插入核酸的第二载体编码分泌的可溶性抗体和4)用所述第二载体转化宿主细胞。
在某些实施方式中，抗体或其片段包含可靶向细胞表面展示多肽的氨基酸序列(例子包括但不限于：跨膜区序列和GPI锚定信号序列)。在一个实施方式中，抗体重链或其片段包含可靶向细胞表面展示多肽的氨基酸序列。在另一实施方式中，抗体轻链或其片段包含可靶向细胞表面展示多肽的氨基酸序列。
在一个实施方式中，细胞文库中的大多数或所有细胞仅表达一种克隆抗体。在另一实施方式中，细胞文库中的大多数或所有细胞表达至少两种不同抗体。在一个实施方式中，本发明载体编码抗体重链或其片段。在另一实施方式中，本发明载体还编码抗体或抗体片段轻链，其中在转导细胞中表达重链和轻链。在某些实施方式中，本发明载体是病毒载体。
本发明还提供了编码在细胞中表达时展示在细胞膜上的抗体或抗体片段文库的病毒载体。本发明提供了包含病毒载体核酸的细胞和筛选具有所需特性的抗体或抗体片段文库的方法。
本发明还提供了根据抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)作用筛选抗体的方法。在一个实施方式中，病毒载体编码抗体Fc变体的文库。
病毒载体
本发明病毒载体包含编码抗体或抗体片段的重链序列文库的核酸，在细胞中表达时，所述抗体或抗体片段结合于细胞表面。在一个实施方式中，结合于细胞表面时，抗体或抗体片段文库位于细胞膜胞外侧。在一个实施方式中，所述病毒载体文库还编码抗体或抗体片段的轻链序列文库(参见图1A-C的例I-VI)。
病毒载体提供了递送抗体或抗体片段文库的几项优点。制备和筛选抗体文库时，文库的多样性是一个考量因素。噬菌体展示抗体文库一般可含有约109种独特抗体的多样性。在细胞展示抗体文库的情况下，如果各细胞只表达一种独特抗体，则需要利用至少109个，通常为1010个或更多个细胞来实现等效多样性。对筛选而言，这一细胞数量巨大，优选采用较少的细胞，而维持多样性。在本发明中，利用病毒载体递送抗体或抗体片段文库。这能够使得以所选感染复数(MOI)进行感染。可调整MOI，以在每个细胞上展示某一平均数量的独特抗体。例如，可采用MOI 50，这能够在每个细胞上平均表达50种独特抗体。如同其它文库筛选方法那样，本发明方法可包括第一轮筛选/富集。在本发明的一些实施方式中，以至多10-2、10-1、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、50、100、200、500、103、104或105的MOI感染细胞。任选地，可通过筛选编码所选抗体的病毒载体进行进一步筛选。在一个实施方式中，第二轮选择利用的MOI低于第一轮选择。
本发明可利用任何病毒载体。这些病毒载体包括但不限于：逆转录病毒载体、牛痘载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体(如HSV)、杆状病毒载体、巨细胞病毒(CMV)载体、乳头瘤病毒载体、猿病毒(SV40)载体、辛德毕斯病毒载体、塞姆利基森林病毒载体、腺病毒载体和腺伴随病毒(AAV)载体。在一个实施方式中，所述病毒载体是高效价病毒载体。高效价病毒载体是可分离和/或浓缩至效价至少为每毫升109个病毒颗粒的载体。在一个实施方式中，所述病毒载体抗体文库是高效价病毒载体。在一个实施方式中，本发明病毒载体是腺病毒、杆状病毒、AAV或疱疹病毒载体。在一个实施方式中，所述病毒载体不是牛痘载体。
在一个实施方式中，所述病毒载体是AAV载体。在一个实施方式中，所述AAV载体编码抗体重链和轻链文库。关于编码抗体的AAV载体的例子和进一步描述参见US2005003482、US20040265955和Fang等，Nat Biotechnol.2005年5月；23(5)：584-90。本发明通过与本文所述的抗体重链框内克隆GPI锚定或跨膜编码序列利用这些载体。
在一个实施方式中，所述病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体可以是衍生自腺病毒的任何载体，其中病毒载体核酸可包装到腺病毒衣壳蛋白中。腺病毒载体可衍生自任何腺病毒血清型，或者甚至可以是含有衍生自至少两种不同腺病毒血清型的不同部分的嵌合腺病毒载体。腺病毒载体可衍生自人或另一种动物腺病毒。在一个实施方式中，所述腺病毒载体衍生自人腺病毒血清型2、3、5、12、35或40。所述腺病毒载体可以是在感染细胞中能够或不能够复制的。在一个实施方式中，所述腺病毒载体是在感染细胞中能够复制的。例如，腺病毒载体可包含E1区缺失，用这种载体感染反式表达E1基因的293细胞，从而复制腺病毒载体。本领域已知许多其它腺病毒载体基因缺失和对应的互补细胞系组合。在一个实施方式中，腺病毒载体可能是在感染细胞中不能复制的。例如，利用E1缺失腺病毒载体感染A549细胞。在一个实施方式中，用辅助病毒(如表达E1蛋白)拯救不能复制的腺病毒载体。在一个实施方式中，1)用不能复制的腺病毒病毒感染细胞，该病毒编码能在细胞表面上展示的抗体；2)筛选和分选展示具有所需结合特性的抗体的细胞；3)用辅助病毒感染阳性分选细胞，以拯救病毒载体。辅助病毒可以是表达腺病毒载体的至少一种互补基因产物(如E1缺失腺病毒的E1蛋白)的任何病毒。在一个实施方式中，所述辅助病毒是腺病毒。在一个实施方式中，所述腺病毒载体可能由于携带温度敏感型突变而成为不能复制的。例如，40℃培养时，包含ts369突变的腺病毒载体(Hasson，T.B.等，J Virol 63(9)：3612-21(1989))是不能复制的，但可通过低温培养拯救。在一个实施方式中，1)在非允许温度下用编码在细胞表面上展示的抗体的温度敏感型腺病毒载体感染细胞；2)选择展示具有所需结合特性的抗体的细胞；3)通过在病毒复制的允许温度下培养所述细胞，拯救所选细胞中的病毒。
在一个实施方式中，病毒载体编码抗体重链或其片段。在另一实施方式中，所述病毒载体还编码抗体轻链或其片段，因此能够表达重链和轻链抗体多肽。在此实施方式中，重链和轻链在细胞表面上一起展示。在一个实施方式中，重链和轻链在细胞表面上展示为完整抗体。在另一实施方式中，重链和轻链在细胞表面上展示为抗体片段。在一个实施方式中，轻链位于重链编码序列的5’侧(上游)。不希望受理论局限，这可避免产生过量有毒的游离重链(Proudfoot，1986，Nature，322：562-565；和Kohler，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：2197)。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
在一个实施方式中，病毒载体核酸还包含选择性标记的编码区。可采用许多选择系统/标记，包括但不限于：单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell11：223(1977))、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(Szybalski和Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等，Cell22：817(1980))基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。同时，抗代谢剂抗性可用作选择以下基因的基础：dhfr，产生甲氨蝶呤抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；OHare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，产生霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA78：2072(1981))；neo，产生氨基糖苷G-418抗性(Clinical Pharmacy12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；T1B TECH11：155-215(May 1993))；和hygro，产生潮霉素抗性(Santerre等，Gene30：147(1984))。通常，可应用重组DNA技术领域熟悉的方法来选择所需重组克隆，这类方法参见例如，Sambrook等(编)，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，冷泉港实验室出版社(Cold Spring HarborLaboratory Press)，纽约，(2001)；Ausubel等(编)，Current Protocols inMolecular Biology(新编分子生物学方法)，约翰韦利出版社(John Wiley&Sons)，纽约(1998)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual(基因转移和表达，实验室手册)，Stockton Press(斯托克顿出版社)，纽约(1990)；和Dracopoli等(编)，Current Protocols in人Genetics(新编人类基因组方法)第12和13章，约翰韦利出版社，纽约(1999)；Colberre-Garapin等，1981，J.Mol.Biol.150：1。
如本文所述，在一个实施方式中，表达整个重组抗体分子。在另一实施方式中，表达免疫球蛋白分子的片段(如Fab片段、F(ab’)片段和表位结合片段)。
6.2核酸
表达编码抗体或抗体片段的序列文库时，抗体或抗体片段结合于细胞表面。为了达到这一目的，病毒载体文库的核酸包含至少两个操作性连接的编码区，参见例如图1。第一个编码区编码抗体链(如重链)文库。第二个编码区编码锚定和/或结合于细胞膜的氨基酸序列。第一和第二编码区在框内并且操作性连接，以在翻译期间形成一条多肽。这产生包含抗体重链或抗体片段以及锚定和/或结合细胞膜的氨基酸序列的融合蛋白。在一个实施方式中，第一和第二编码区可直接连接/相邻。在另一实施方式中，至少一个密码子位于第一和第二编码区之间或分隔开第一和第二编码区。在一个实施方式中，至少一个密码子在抗体链(如重链)和膜锚定/结合域之间提供接头或间隔序列。在一个实施方式中，第二编码区编码锚定和/或结合于细胞膜的氨基酸序列，或者编码跨膜区或GPI锚定物。
提到病毒载体文库时，所述文库的第一编码区是各自编码抗体重链或抗体片段的遗传上多样化的一套(repertoire)核酸序列的库。在一个实施方式中，在整个文库中第二编码区相同(如衰变加速因子(DAF)的GPI锚定域)。
在一个实施方式中，所述第一编码区操作性连接于启动子。在一个实施方式中，所述启动子与病毒载体异源。例如，该异源启动子不衍生自产生病毒载体的同一种病毒。在另一实施方式中，该启动子不是异源的。例如，该启动子衍生自产生病毒载体的同一种病毒。
该启动子基本上可以是在所选细胞中有活性或可诱导产生活性的任何启动子。虽然，病毒载体类型可影响启动子的选择。例如，需要避免使用可能干扰特定病毒载体的启动子。例如，腺病毒载体中同一启动子的拷贝可导致载体复制过程中发生同源重组(参见例如Stecher等，2003，Methods Mol Med.76：135-52；Carlson等，2002，Methods Enzymol.346：277-92)。反言之，也需要避免使用具体病毒载体可能对其产生干扰的启动子(参见例如Grave等，2000，J Gene Med.2：433-43)。
可用于控制编码抗体重链或片段的第一编码区表达的启动子包括但不限于：SV40早期启动子区(Bernoist和Chambon，1981，Nature 290：304-310)、CMV启动子、劳氏肉瘤病毒的3’长末端重复中所含的启动子(Yamamoto等，1980，Cell 22：787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78：1441-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等，1982，Nature296：39-42)、四环素(Tet)启动子(Gossen等，1995，Proc.Nat.Acad.Sci.USA89：5547-5551)；ADC(醇脱氢酶)启动子、PGK(磷酸甘油激酶)启动子、碱性磷酸酶启动子、在淋巴细胞中有活性的免疫球蛋白基因控制区(Grosschedl等，1984，Cell 38：647-658；Adames等，1985，Nature 318：533-538；Alexander等，1987，Mol.Cell.Biol.7：1436-1444)、在睾丸、乳腺、淋巴和肥大细胞中有活性的小鼠乳房肿瘤病毒控制区(Leder等，1986，Cell 45：485-495)、在肝中有活性的清蛋白基因控制区(Pinkert等，1987，Genes and Devel.1：268-276)、在肝中有活性的甲胎蛋白基因控制区(Krumlauf等，1985，Mol.Cell.Biol.5：1639-1648；Hammer等，1987，Science 235：53-58；在肝中有活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区(Kelsey等，1987，Genes and Devel.1：161-171)、在骨髓细胞中有活性的β-珠蛋白基因控制区(Mogram等，1985，Nature 315：338-340；Kollias等，1986，Cell 46：89-94；在脑的少突胶质细胞细胞中有活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区(Readhead等，1987，Cell 48：703-712)；在骨骼肌中有活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区(Sani，1985，Nature 314：283-286)；在神经元细胞中有活性的神经元特异性烯醇酶(NSE)(Morelli等，1999，Gen.Virol.80：571-83)；在神经元细胞中有活性的脑产生的神经营养因子(BDNF)基因控制区(Tabuchi等，1998，Biochem.Biophysic.Res.Com.253：818-823)；在星形细胞中有活性的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)启动子(Gomes等，1999，Braz J MedBiol Res 32(5)：619-631；Morelli等，1999，Gen.Virol.80：571-83)和在下丘脑中有活性的促性腺释放激素基因控制区(Mason等，1986，Science234：1372-1378)。
在一个实施方式中，聚腺苷酸化信号位于第二编码区的3’侧并与其操作性相连接。基本上，可利用含有该核酸的特定细胞类型中有活性的任何聚腺苷酸化信号。虽然病毒载体类型可能影响聚腺苷酸化信号的选择。可用于本发明的聚腺苷酸化信号包括但不限于：来自SV40和牛生长激素基因的聚腺苷酸化信号。
在一个实施方式中，该核酸还包含位于第一编码区上游(5’)且操作性连接于第一编码区的氨基端信号肽序列的编码区。不希望受理论束缚，该信号肽指导蛋白质最初转移到内质网(ER)上。在一个实施方式中，在蛋白质的翻译后加工过程中切割蛋白质氨基末端的信号序列。在一个实施方式中，保留了天然信号序列。在另一实施方式中，删除天然信号序列，并用异源信号序列代替。选择的异源信号序列应该是特定宿主细胞识别和任选加工(即用信号肽酶切割)的信号序列。
在一个实施方式中，该病毒载体核酸还包含抗体轻链或抗体轻链片段的编码序列。如图1C和1E所示，轻链编码序列可操作性连接于与操作性连接于重链编码序列的启动子不同的启动子。换言之，轻链的表达不直接与重链表达相关联。在另一实施方式中，如图1的实施例IV和VI所示，通过内部核糖体进入位点(IRES)或自身加工切割序列将轻链编码序列操作性连接于与重链编码序列相同的启动子。
图1A-C的例I-VI所述的载体描述了本发明病毒载体构建物的非限制性例子。
6.3病毒载体文库构建
可通过本领域技术人员已知的许多方法构建本发明的病毒载体文库。基本上，可将任何抗体文库克隆到病毒载体中，按照本发明使用。简要说，分离编码多样化的一套核酸序列的核酸文库，所述核酸序列各自编码抗体重链或抗体片段。例如，可由(但不限于)抗体cDNA文库、由分离自表达抗体的组织或细胞的核酸(如聚A+RNA)产生的cDNA文库，分离编码抗体重链的核酸序列库。然后，可通过(例如)PCR扩增编码序列库，并用本领域已知的标准方法克隆到病毒载体(如可复制病毒载体)中。还可购得抗体编码序列的文库。在一个实施方式中，用人抗体的编码区构建该文库。在一些实施方式中，该文库表达至少100、103、104、105、106、5×106、107、5×107、108、5×108、109、5×109、1010、5×1010、1011、5×1011或1012种不同抗体。
一旦获得了编码抗体重链的核酸文库后，便将其克隆到病毒载体中。基本上可利用已知将核酸克隆到病毒载体的任何方法。这些方法包括但不限于：限制性酶消化和连接、pcr SOE(Horton等，1989，Gene，77，61-68)或重组。在一个实施方式中，所述病毒载体是腺病毒载体，所述克隆方法是重组。可通过本领域已知的任何方法进行重组。在一个实施方式中，利用BJ5183重组方法/系统(参见例如PCT专利公开号WO 02/067861和WO 96/17070)。简要说，将编码区文库克隆到质粒中，导致编码区侧接于与腺病毒载体插入区同源的序列。将质粒文库共同转化到含有相容性腺病毒载体质粒的BJ5183细胞中。分离含有该插入物的全长腺病毒载体质粒，并转染到哺乳动物细胞中产生腺病毒载体文库。
构建腺病毒载体文库的另一种重组方法利用英杰公司(Invitrogen，加利福尼亚州卡尔斯巴德)的Gateway
Figure A20068004746300231
系统，例如利用ViraPowerTM腺病毒Gateway
Figure A20068004746300232
载体。该系统利用了含有腺病毒载体的完整DNA序列的质粒。所述腺病毒载体的E1和E3编码区中有缺失。可在表达E1蛋白的293A细胞(英杰公司，CA)中增殖该腺病毒载体。E3是腺病毒体外复制的非必需区。
可由英杰公司(Invitrogen)获得将核酸克隆到此系统中的方法。简要举例来说，用此系统构建腺病毒载体文库的方法如下。将核酸文库克隆到进入载体中，产生进入克隆。进入载体包括但不限于：pENTRTM/D-TOPO
Figure A20068004746300233
；pENTRTM/SD/D-TOPO
Figure A20068004746300234
；pENTRTM/TEV/D-TOPO
Figure A20068004746300235
；pENTRTM1A；pENTRTM2B；pENTRTM3C；pENTRTM4；和pENTRTM11(均获自英杰公司，CA)。这些载体含有侧接于重组位点(如attR1和attR2)的多克隆位点(MCS)。将核酸文库克隆到MCS中，产生侧接于重组位点的单个文库序列。下一个步骤是将进入载体的文库克隆到腺病毒载体质粒(如pAd/PL-DESTTM或pAd/CMV/V5-PL-DESTTM(均获自英杰公司))中。这一克隆步骤利用进入载体的重组位点和腺病毒载体质粒的重组位点之间的重组，产生腺病毒载体质粒文库。为了产生病毒载体颗粒，用PacI消化重组的腺病毒载体质粒文库，并转染到293A细胞中。然后扩增和任选纯化该病毒，产生腺病毒载体文库母液。其它细节参见以下英杰(Invitrogen)TM使用指南：pAd/CMV/V5-PL-DEST TM和pAd/PL-DESTTM Gateway
Figure A20068004746300236
载体，版本D，2005年9月28日；ViraPowerTM腺病毒表达系统，版本B，2005年7月11日。
本文所述筛选细胞展示抗体的方法可与其它抗体筛选方法和/或系统联用。例如，本发明一个实施方式利用细胞表面上表达抗体文库的哺乳动物细胞。这一文库可来自任何来源。它可以是分离自人细胞的大文库，基本上代表了来自对象的整个人抗体可变区库。在另一实施方式中，可由感兴趣抗原免疫的小鼠(如表达人抗体的小鼠)分离该文库。因此，该文库富含结合感兴趣抗原的抗体。在另一实施方式中，用感兴趣抗原筛选噬菌体展示抗体文库。然后，由表达结合感兴趣抗原的抗体的噬菌体产生本发明抗体文库。同样，该文库富含结合感兴趣抗原的抗体。在另一实施方式中，由人源化抗体片段文库产生本发明抗体文库。可通过本领域技术人员已知的任何方法产生人源化抗体片段，包括但不限于：框架改组(如PCT公开WO 05/042743)和低同源性人源化(如PCT公开WO 05/035575)。在另一实施方式中，该文库是衍生自结合感兴趣抗原的抗体的突变CDR文库。突变CDR文库是编码母体抗体CDR序列发生CDR突变的抗体的文库。突变CDR包括但不限于：通过突变经结晶图象研究确定为完整残基的CDR氨基酸产生的文库(如Dall’Acqua等，1996 Biochemistry35：9667-76)；通过保留一个天然CDR和与CDR文库合并(代替另外5个CDR)产生的文库(如认为具有最高结合效率的文库)(如Rader等，1998，PNAS95：8910-15)；通过“CDR步行”建立的文库(如Yang等，1995，J Mol Biol254：392-403)；和通过分别突变母体抗体各个CDR的方法产生的文库(如Wu等，1998，PNAS 95：6037-42)。因此，本发明可使用任何抗体文库，以便在细胞膜上表达文库。在一个实施方式中，该文库是衍生自母体抗体的亲和力成熟文库。
在一个实施方式中，用感兴趣抗原筛选噬菌体展示抗体文库。然后由表达结合感兴趣抗原的抗体的噬菌体产生本发明抗体文库。在一个实施方式中，将各个所选噬菌体的重链和轻链可变区克隆到病毒载体(如腺病毒载体)中，其中各病毒载体编码重链和轻链。因此，维持同一重链和轻链组合。在另一实施方式中，分离重链和轻链可变区，以随机方式组合。因此，理论上，该文库包括各预选重链可变序列与各预选轻链序列的每一种组合。例如，如果初始噬菌体筛选产生1,000种独特的噬菌体和抗体序列，那么由各预选重链可变序列与各预选轻链序列的每一种组合组成的文库可能产生可克隆到本发明病毒载体中的106种独特抗体序列。这种方法产生的文库多样性显著高于初始噬菌体文库。此外，噬菌体展示法仅限于某些抗体片段，而这种方法能够在抗体片段噬斑上进行初始选择性筛选，随后筛选(例如)由噬斑选择步骤分离的可变区序列产生的完整抗体。可用于制备本发明抗体文库的噬菌体展示法的例子包括Brinkman等，1995，J.Immunol.Methods 182：41-50；Ames等，1995，J.Immunol.Methods184：177-186；Kettleborough等，1994，Eur.J.Immunol.24：952-958；Persic等，1997，Gene 187：9-18；Burton等，1994，Advances in Immunology 57：191-280；PCT公开号WO 90/02809、WO 91/10737、WO 92/01047、WO 92/18619、WO93/11236、WO 95/15982、WO 95/20401和WO97/13844；和美国专利号5,698,426、5,223,409、5,403,484、5,580,717、5,427,908、5,750,753、5,821,047、5,571,698、5,427,908、5,516,637、5,780,225、5,658,727、5,733,743和5,969,108所述的方法。
用于克隆抗体文库的其它细节和方法参见例如，PCT专利公开号WO2005/063817；WO 95/15393；和Higuchi等，1997 J Immunological Methods202：193-204。
选择方案和方法
一旦构建病毒载体抗体文库后，可用至少一种感兴趣抗原筛选它。本领域技术人员应理解，可以在不背离本文所述的本发明的情况下对筛选过程作出许多改变。
通常，用病毒载体抗体文库感染细胞。可根据几项因素使用合适MOI，这些因素包括但不限于：可用细胞数；可以或需要筛选的细胞数；病毒载体的效价，病毒载体对细胞的感染性；和病毒载体感染对细胞的毒性。通常，在筛选文库之前要优化感染方法(包括MOI)。
感染后，培养细胞以便表达该抗体文库，其在细胞表面上展示。然后筛选表达结合感兴趣抗原或具有所需特性(如与Fc受体结合)的抗体的细胞。可通过本文所述方法和本领域技术人员已知的方法筛选细胞。将表达具有所需特性的抗体的细胞与其它细胞分离开。
这时候，可分离编码阳性抗体的核酸并用于表达相应抗体以便进行进一步鉴定。或者，可分离表达所需抗体的病毒载体，并进行另一轮筛选。在第二轮筛选中，可使用相同或不同的MOI。在一个实施方式中，第二轮筛选和后续筛选轮次利用低于初始感染的MOI。在一个实施方式中，在各轮筛选中，依次降低MOI。虽然申请人不希望受限于机械理论，但在初始筛选方法中只选择了初始文库中少量独特的个体成员。初始感染的初始MOI越高，选择的无关抗体数量越大。这是因为用高MOI进行初始感染可能导致各细胞中发生多病毒载体感染和抗体表达。因此，所选细胞仅需表达结合所选抗原的一种抗体，但同一细胞中表达无关抗体的任何其它病毒载体也将被选择。因此，在大多数情况下，需要用较低的MOI至少进行第二轮选择。在本发明的一些实施方式中，第二个选择步骤利用至多为：10-6、10-5、10-4、10-3、0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1或10的MOI。采用较低MOI可基本保证各细胞被1个或更少的病毒载体感染。这清除了“流传(carry-over)”序列或病毒载体。
一旦鉴定到编码具有所需特性的抗体的病毒载体后，可将这些抗体的编码区克隆到其它表达载体/系统中，以便进一步评估和/或生产该抗体。也可通过本领域已知方法和本文所述方法修饰所选抗体。
一旦构建了细胞表面上表达抗体的细胞文库后，下一个步骤是筛选和选择表达结合所需抗原的抗体的细胞或选择具有所需特性(如对Fc受体的结合亲和力改变)的抗体。可采用本领域已知的各种技术(包括本文所述方法)进行这个筛选和选择的步骤。例如，可标记(如荧光标记)感兴趣抗原，并用于结合细胞表面上的抗体；从而标记表达结合于该抗原的抗体的细胞。许多荧光标签是本领域已知的并可购得(参见例如，Molecular Probes：Handbook of Fluorescent Probesand Research Chemicals(分子探针：荧光探针和研究化学品的手册)，R.P.Haugland，第9版，分子探针公司(Molecular Probes)(OR，2004))。
在一个实施方式中，该抗原是生物素标记的。该细胞结合该抗原，用偶联于链霉亲和素的标签标记结合于该抗原的细胞。在一个实施方式中，采用PE偶联的链霉亲和素。在一个实施方式中，该抗原包含链霉亲和素，标记的生物素用作检测试剂。可采用本领域已知技术鉴定和分离这些标记细胞。例如在荧光标记的抗原的情况下，可通过(例如)流式细胞仪根据荧光分离/分选细胞。例如，参见PCT公开号WO 04/014292、WO 03/094859、WO 04/069264、WO04/028551、WO 03/004057、WO 03/040304、WO 00/78815、WO 02/070007和WO 03/075957，美国专利号5,795,734、6,248,326和6,472,403，Pecheur等，2002，FASEB J.16：1266-1268；Almed等，2002，J.Histochemistry andCytochemistry 50：1371-1379。在另一实施方式中，用荧光显微镜观察荧光细胞，可用标准显微操作技术如细玻璃吸移管、显微吸移管或显微操纵器直接分离。在另一实施方式中，可用珠子(如磁珠；参见Chestnut等，1996，J ImmunologicalMethods 193：17-27)分选/分离细胞。例如，抗原可以是生物素化的，可用链霉亲和素包被珠分离表达结合该抗原的抗体的细胞。
在一个实施方式中，该抗原是荧光标记的。在一个实施方式中，荧光标签选自Aqua、德克萨斯红、FITC、罗丹明、罗丹明衍生物、荧光素、荧光素衍生物、级联蓝(cascade blue)、Cy5、藻红蛋白、GFP或GFP衍生物如EGFP。
在一个实施方式中，通过重组方法产生抗原，并掺入肽标签，如FLAG、HIS标签。肽标签抗体可用于检测和分选/选择或排除结合具体抗原的细胞。
在选择步骤中可利用一种以上抗原，例如，如果筛选结合第一抗原而非第二抗原的抗体。在这种情况下，可通过分选表达不结合第二抗原的抗体的细胞进行负选择步骤，然后进行分选结合第一抗原的抗体的正选择步骤。在一个实施方式中，在进行负选择步骤之前进行正选择步骤。在一个实施方式中，正和负选择步骤基本同时进行。例如，用不同荧光分子标记第一和第二抗原。这两种抗原与展示该抗体的细胞一起培育。可根据这个实施方式优化抗体的浓度。然后，同时分选结合第一抗原、而不结合第二抗原的细胞(如双色FACS分析)。根据本文内容，本领域技术人员可通过采用连续筛选/选择步骤和多色FACS分析负和/或正筛选与多种抗原的结合。
在一些实施方式中，可选择结合特定细胞类型(靶细胞)的抗体。关于噬菌体展示抗体的这类选择参见例如Huts等，2001，Cancer Immunol.Immunother.50：163-171。可以固定或不固定靶细胞，它可以(例如)提供选择结合于固定改变的细胞表面抗原的抗体的机会。在此过程中，可参照准备筛选/选择的生物功能来选择特定细胞类型。合适细胞类型是预计具有所需生物功能的抗体能结合的细胞类型。例如，如果需要分离能够抑制癌细胞增殖的抗体，那么预计这类抗体可结合于癌细胞。因此，宜最初选择可结合于癌细胞的抗体。为了选择结合于细胞的抗体，可采用有助于结合的条件筛选结合靶细胞的细胞展示抗体。例如，结合靶细胞、而非抗体表达细胞的生物素-偶联抗体可结合于链霉亲和素-包被的磁珠。然后用这些珠子固定靶细胞。表达抗体的细胞可与固定细胞混合，可分离结合磁珠的细胞。选择结合细胞、而非特异性已知抗原的抗体的优点是，可能选择结合细胞表面上展示的未知抗原的抗体。这类抗原不一定是蛋白质，可包含一个以上细胞表面分子。选择结合于所选细胞种类或特定分子的步骤可重复一次或多次，例如，至少约2、3、4、5、6或7次。如果需要，可以同时或依次进行两种或多种不同的预选择步骤。例如，可选择结合于两种不同类型的癌细胞的抗体。
任选地，可通过一个或多个负选择步骤实现进一步精炼，这一步骤可以在正选择步骤之前或之后进行。例如，如果选择结合癌细胞的抗体，可允许展示抗体的细胞结合非癌细胞(如上所述)，可保留不结合这些细胞的抗体进行进一步检测。这一负选择可消除非特异性结合于非靶细胞的至少一些抗体。或者，将非靶蛋白(如与靶抗原无关或相似的抗原)固定在固体支持物上，并用于负选择步骤，以清除结合非靶蛋白的抗体表达细胞。在另一个例子中，可能需要分离某种受体的抗体，其中这一受体是具有紧密相关结构的受体家族的一部分。为了提高分离此种特定受体的特异性抗体的概率，可采用来自该家族的一种、一些或所有其它受体进行负选择步骤。在负选择步骤中，可保留表达不结合非靶抗原的抗体的细胞进行进一步检测。这一选择可消除非特异性结合于固体支持物或非靶蛋白的至少一些抗体。相似地，如果选择展示结合特定蛋白的抗体的细胞，可将该细胞与无关或相似蛋白质混合，以竞争结合靶蛋白。
本发明筛选方法可采用1、2、3、4、5、6、7、8或更多选择步骤。用于进行第二次筛选的方法可取决于所用的病毒载体。例如，使用腺病毒载体时，可直接分离该病毒载体用于后续的筛选/选择轮次。例如，最初用病毒载体文库感染细胞(如293基细胞)，然后选择表达结合感兴趣抗原的抗体的细胞。然后裂解该细胞，以释放包装的病毒载体。可通过不消除病毒载体感染性的许多方法(如冻融细胞一次或多次)裂解该细胞。该细胞裂解物可直接用于下一个筛选/选择循环进行感染，或者可以先纯化病毒载体。
在腺病毒载体的情况下，可能需要考虑感染的MOI、筛选/分选时间和分离病毒载体的时间。例如，如果MOI太高，该细胞可以在筛选/分选方法前裂解。此外，如果感染后立即进行筛选/分选步骤，那么该抗体可能尚未展示在细胞表面上或尚未展示充分的量。如果筛选步骤进行得太晚，该细胞可能由于病毒载体的毒性(如复制)而裂解。如果过早尝试分离载体，可能没有足够包装的病毒载体。腺病毒载体已经用于基因表达数十年，优化这些参数的方法是本领域技术人员熟知的。
本领域技术人员不难鉴定可用于本发明的细胞。可用于表达细胞展示抗体的细胞包括但不限于：CHO、BHK、HeLa、COS、COS7、MDCK、TM4、CV1、VERO、BRL3A、HepG2；MMT060562；TRI；MRC5；FS4；NIH3T3、WI38、NS0、SP/20和其它淋巴细胞和人细胞如PERC6、HEK293、293A、乳腺癌细胞系如BT483、Hs578T、HTB2、BT20和T47D以及正常乳腺细胞系如CRL7030和HsS78Bst。在一个实施方式中，所述细胞是293衍生物。在一个实施方式中，所述细胞表达至少一种E1腺病毒蛋白，E1编码区整合在细胞基因组中。
在前述步骤中鉴定表达具有所需特性的抗体的细胞和/或病毒载体时，可分离和重新测试编码它们的核酸，以保证它们编码具有所需生物学特性的抗体。如果分离单独的转化子或转化子库，可获得这些转化子的重组核酸用于重新测试。例如，如果分离了单独的转化子，可纯化编码抗体的核酸，并用于转染哺乳动物细胞，然后可根据它们对抗原的结合特性进行鉴定。如果已经分离了转化子库，测试阳性的库中抗体的编码核酸可用于转化细胞，以产生表达一种抗体的单独转化子。
编码单个转化子的抗体的核酸可用于转化细胞，可表达、分离抗体并测定其功能，从而鉴定具有所需功能的蛋白质或抗体。如果没有分离单独转化子或转化子库，则可由测试阳性的转化子或转化子库获得编码蛋白质或至少编码抗体可变区的核酸，例如，通过PCR扩增表达的抗体可变区编码序列。然后，还可将通过PCR扩增的这些序列重新插入合适载体中，用于产生单个转化子。这些转化子的重组DNA可用于转染哺乳动物细胞，以表达该抗体和重新检测其功能。
6.5根据Fc受体/配体结合特征和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)进行筛选
抗体Fc区与许多配体，包括Fc受体和其它配体相互作用，赋予一系列重要功能，这称为效应物功能。IgG类型的Fc受体的重要家族是Fcγ受体(FcγR)。这类受体介导抗体和免疫系统细胞臂之间的通信(Raghavan等，1996，Annu RevCell Dev Biol 12：181-220；Ravetch等，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290)。在人中，这一蛋白质家族包括FcγRI(CID64)，包括同种型FcγRIA、FcγRIB和FcγRIC；FcγRII(CD32)，包括同种型FcγRIIA、FcγRIIB和FcγRIIC；和FcγRIII(CID 16)，包括同种型FcγRIIIA和FcγRIIB(Jefferis等，2002，Immunol Lett82：57-65)。这些受体一般含有介导结合Fc的胞外结构域、跨膜区和可介导胞内信号转导事件的胞内结构域。在不同细胞类型上表达不同FcγR亚型(综述参见Ravetch等，1991，Annu Rev Immunol 9：457-492)。例如，在人中，只在中性粒细胞上发现FcγRIIIB，而在巨噬细胞、单核细胞、天然杀伤(NK)细胞和T细胞亚群上发现FcγRIIIA。
Fc/FcγR复合物的形成将效应细胞征集到结合抗原的位点上，一般导致细胞内的信号转导和重要的后续免疫应答如释放炎症介导物、B细胞激活、胞吞作用、吞噬作用和细胞毒性攻击。介导细胞毒性和吞噬作用效应物功能的能力是抗体破坏靶细胞的可能机制。表达FcγR的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体，随后引起靶细胞裂解的细胞介导反应称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)(Raghavan等，1996，Annu Rev Cell Dev Biol12：181-220；Ghetie等，2000，Annu Rev Immunol 18：739-766；Ravetch等，2001，Annu Rev Immunol 19：275-290)。值得注意的是，介导ADCC的原代细胞NK细胞，只表达FcγRIIIA，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII(Ravetch等，1991，同上)。
另一种重要的Fc配体是补体蛋白Clq。结合Clq的Fc介导称为补体依赖性细胞毒作用(CDC)的过程(综述见Ward等，1995，Ther Immunol 2：77-94)。Clq能够结合六种抗体，但结合于两种IgG足以激活补体级联反应。Clq与Clr和Cls丝氨酸蛋白酶形成复合物，形成补体途径的Cl复合物。
所有FcγR均结合IgG亚类Fc上的同一区域，但亲和力不同(如FcγRI是高亲和力结合剂，而FcγRII和FcγRIII是低亲和力结合剂)。FcγR之间的其它差异是机械性的。例如，FcγRI、FcγRIIA/C和FcγRIIIA是免疫复合物引发的活化的正调节物，其特征是含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(ITAM)，而FcγRIIB含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(ITIM)，因此为抑制性。因此，激活和抑制受体之间的平衡是重要的考量因素。例如，提高Fc与正调节物(如FcγRIIIA)的结合，同时不改变、或者甚至降低Fc与负调节物FcγRIIB的结合可能导致效应物功能优化，如提高ADCC介导的肿瘤细胞破坏作用。另一种考量因素是应工程改造Fc变体，以便以所需方式调节与FcγRs和/或Clq的结合，使它们维持其稳定性、溶解度、结构完整性以及它们与其它重要Fc配体如FcRn及蛋白A和G相互作用的能力。
抗体可用于许多应用，包括治疗应用。根据应用，抗体的所需ADCC和/或CDC特性可改变。例如，在诊断应用(如ELISA、Western印迹等)中，抗体的ADCC和/或CDC活性通常不相关，对诊断应用的影响很小。在采用抗-肿瘤抗原抗体的情况下，可能需要提高ADCC和/或CDC来提高体内或体外的细胞毒性，从而提高抗体杀伤肿瘤细胞的功效。例如，在应用中，当抗体用作体内拮抗剂或激动剂时，可能需要使用降低、低或无CDC和/或ADCC活性的抗体。如果Fc/FcγR介导的效应物功能使健康的免疫细胞到达致死荷载(deadlypayload)附近，导致耗尽正常淋巴组织与靶细胞，对设计将药物(如毒素和同位素)递送给靶细胞的抗体而言尤其如此(Hutchins等，1995，PNAS USA92：11980-11984；White等，2001，Annu Rev Med 52：125-145)。在这些情况下，使用很少征集补体或效应物细胞的Fc变体将大有裨益(参见例如，Wu等，2000，Cell Immunol 200：16-26；Shields等，2001，J.Biol Chem 276：6591-6604；美国专利6,194,551；美国专利5,885,573和PCT专利公开号WO 04/029207)。因此，本发明还提供了根据Fc受体(如FcγR)和/或Fc配体(如Clq)结合和/或效应物功能(如ADCC活性)筛选抗体文库的方法。可利用本发明筛选具有这些特征或其组合的抗体和/或抗体变体。
在Fc结构域上进行各种诱变研究(参见例如，Duncan等，1988，Nature332：563-564；Lund等，1995，Faseb J 9：115-119；Lund等，1996，J Immunol157：4963-4969；Armour等，1999，Eur J Immunol 29：2613-2624；Shields等，2001，J Biol Chem 276：6591-6604；Jefferis等，2002，Immunol Lett 82：57-65；Presta等，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490；美国专利5,624,821，5,885,573和PCT专利公开号WO 00/42072、WO 99/58572和WO 04/029207)。虽然Fc结构域中的大多数氨基酸取代降低或消除了FcγR结合，但一些取代导致对FcγR的亲和力更高。Fc结构域中的特定修饰/取代和/或新氨基酸的例子参见Ghetie等，1997，Nat Biotech.15：637-40；Duncan等，1988，Nature 332：563-564；Lund等，1991，J.Immunol 147：2657-2662；Lund等，1992，Mol Immunol29：53-59；Alegre等，1994，Transplantation 57：1537-1543；Hutchins等，1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：11980-11984；Jefferis等，1995，Immunol Lett.44：1111-117；Lund等，1995，Faseb J 9：115-119；Jefferis等，1996，Immunol Lett54：101-104；Lund等，1996，J Immunol 157：4963-4969；Armour等，1999，EurJ Immunol 29：2613-2624；Idusogie等，2000，J Immunol 164：4178-4184；Reddy等，2000，J Immunol 164：1925-1933；Xu等，2000，Cell Immunol200：16-26；Idusogie等，2001，J Immunol 166：2571-2575；Shields等，2001，J Biol Chem276：6591-6604；Jefferis等，2002，Immunol Lett 82：57-65；Presta等，2002，Biochem Soc Trans 30：487-490)；美国专利号5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利申请号10/370,749；11/203,253；11/203,251和PCT公开WO 94/2935；WO 99/58572；WO 00/42072；WO01/58957；WO 02/060919，WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217。
在本文中，将Fc区内任何位置上引入了至少一个氨基酸取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失或插入的Fc区称为“变异Fc区”。在本文中，通常将含有变异Fc区(如抗体或Fc融合蛋白)的多肽称为“Fc变体”，或者更具体称为“Fc变体抗体”和“Fc变体融合蛋白”。考虑到，本文所述的细胞表面展示法可用于表达和筛选含有变异Fc区的抗体文库。
可按照本发明筛选包含具有变异Fc区的抗体的文库(在本文中也称为“Fc变体文库”)中具有所需Fc相关功能或缺少所述功能的抗体。在一个实施方式中，Fc变体文库包括含有相同可变区或Fab区的抗体。在一些实施方式中，该文库含有绞链区、CH3区、CH2区或其任何组合的变体。
本领域了解构建Fc变体和Fc变体抗体文库的方法。例如，参见专利公开号WO 05/0037000；WO 06/023420；和WO 06/023403。应考虑，Fc变体文库包含在Fc区内任何位置上引入至少一个氨基酸取代、缺失或插入的Fc区。也考虑到，Fc变体文库还可包含Fc区以外一个或多个位置上的其它氨基酸残基取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失或插入。在某些实施方式中，Fc变体文库包含Fc区内任何位置上含有至少一个非天然产生的氨基酸残基的Fc区。在特定实施方式中，Fc变体文库包含Fc区内一个或多个位置上分别含有19个非天然产生的氨基酸残基的Fc区。在其它具体实施方式中，Fc变体文库包含Fc区内一个或多个位置上含有非天然产生的氨基酸残基亚组的Fc区。在其它实施方式中，Fc变体文库包含在一个或多个位置上插入一个或多个氨基酸残基的Fc区。
不希望受任何具体理论的束缚，本发明的氨基酸取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失和/或插入能通过改变影响下游效应物功能的一种或多种因子来调节抗体的ADCC和/或CDC活性，包括因子但不限于：抗体与其FcγR和/或Clq的亲和力、介导细胞毒性效应物和/或补体级联反应功能的能力、蛋白质稳定性，抗体半衰期和效应物细胞和/或分子的征集。
在一个实施方式中，该文库包含在选自下组的氨基酸残基位置上含有至少一个氨基酸残基取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失或插入的Fc变体：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346、347和348，其中编号系统是Kabat等(1991，NIH公告91-3242，国家技术信息服务中心，弗吉尼亚州斯普林菲尔德)所述的EU索引的编号系统。
在本发明的另一实施方式中，该Fc变体文库包含在以下位置的一个或多个氨基酸残基上分别含有非天然产生的氨基酸残基的Fc变体：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346和348，其中编号系统是Kabat等所述EU索引的编号系统。
在一个实施方式中，该文库的Fc变体在选自下组的位置上包含至少一个氨基酸取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失或插入：206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、239、240、242、246、250、251、257、259、260、261、265、269、273、274、275、277、281、282、284、287、291、298、300、302、304、306、308、310、314、316、318、319、321、323、327、328、329、330、332和336，其中Fc区中的残基编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。在一个实施方式中，该文库包括Fc区中含有至少2个、或至少3个、或至少4个、或至少5个、或至少6个、或至少7个、或至少8个、或至少9个、或至少10个、或至少20个、或至少30个、或至少40个、或至少50个、或至少60个、或至少70个、或至少80个、或至少90个、或至少100个、或至少200个氨基酸残基的Fc变体。
在一个实施方式中，该文库的Fc变体在选自下组的氨基酸残基位置之后包含至少一个插入：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346和348，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。可以插入任何氨基酸残基。在某些实施方式中，本发明Fc变体可包括在所选位置后插入一个以上氨基酸残基。在某些其它实施方式中，本发明Fc变体可在多个位置后插入一个或多个氨基酸残基。
在一个具体实施方式中，该文库的Fc变体在选自以下氨基酸残基的位置后包含至少一个插入：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和240，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。可以插入任何氨基酸残基。在某些实施方式中，本发明Fc变体可在所选位置后插入一个以上氨基酸残基。在某些其它实施方式中，本发明Fc变体可在多个位置后插入一个或多个氨基酸残基。
在其它实施方式中，该文库的Fc变体包含取代和插入的组合。在其它实施方式中，该文库的Fc变体包含一个或多个取代和一个或多个插入的组合。
本发明还提供了在选自下组的氨基酸残基位置上含有至少一个氨基酸残基取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失或插入的Fc变体：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346和348，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。
在某些实施方式中，本发明Fc变体包含选自下组的至少一个非天然产生的氨基酸残基：231L、231I、231V、231N、231Q、231T、231S、232K、232R、234K、234R、235V、235I、235A、235G、236K、236R、236L、236I、236V、236A、237R、237K、238N、238Q、238V、238L、238I、238E、238D、238A、238G、238M、238C、239D、240G、240A、240H、240D、240E、246R、246E、246D、246W、246F、246M、246C、250S、250V、250I、250L、251A、251G、251E、251D、251V、251I、256R、256K、260R、260K、260E、260D、261S、261T、266A、266G、274R、277V、277I、277L、277S、277T、281S、281T、282F、282W、346R、346K、348G和348A，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。
在一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含选自下组的至少一个非天然产生的氨基酸残基：231L、231N、231T、232K、234R、235V、235A、235I、236R、236V、236A、237R、237G、238N、238V、238E、238L、238G、238M、238Q、239D、240G、240H、240E、246R、246E、246W、246M、250S、250V、251A、251E、251I、256R、260R、260E、261S、265、266A、274R、277V、277T、281S、282F、346R和348A，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。
在另一具体实施方式中，本发明Fc变体包含选自下组的至少一个非天然产生的氨基酸残基：198T、234R、236R、236A、237R、238L、238E、238N、238V、238Q、240E、240G、248E、251A、251E、266A、277T。在另一具体实施方式中，本发明Fc变体包含非天然产生的氨基酸残基的至少一种组合，选自：246R/251E/260R、240G/198T、237R/236A。
在某些实施方式中，本发明Fc变体在选自下组的氨基酸残基位置之后包含至少一个插入：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346和348，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。可以插入任何氨基酸残基。在本文中，具体插入可表示为“In”后接插入氨基酸残基的单字母代码和恰好侧接该插入物的残基位置。例如，“InG231/232”指在残基231和232之间插入甘氨酸的Fc变体。在某些实施方式中，本发明Fc变体在所选位置后插入一个以上氨基酸残基。在某些其它实施方式中，本发明Fc变体可在多个位置后插入一个或多个氨基酸残基。
在一个具体实施方式中，本发明Fc变体在选自下组的氨基酸残基位置后包含插入物：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和240，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。可以插入任何氨基酸残基。在某些实施方式中，本发明Fc变体在所选位置后插入一个以上氨基酸残基。在某些其它实施方式中，本发明Fc变体可在多个位置后插入一个或多个氨基酸残基。
在另一具体实施方式中，本发明Fc变体包含至少一个以下插入物：InR234/235；InV235/236；InR236/237；InR237/238；InV238/239；InN238/239；InL238/239；InE238/239；InG238/239；InS239/240；InG240/241和InE240/241。
在某些实施方式中，本发明Fc变体可包含取代和插入的组合。在其它实施方式中，本发明Fc变体可包含一个或多个取代和一个或多个插入的组合(如本文所述)。在一个具体实施方式中，本发明Fc变体包含至少一个以下插入和取代的组合：InG240/241/I198T、InL238/239/P238Q、InE238/239/V348A、InS239/240/V266A和InR237/238/G236A。
在一个实施方式中，本发明Fc变体可能与其它已知Fc变体组合，如美国专利号5,624,821；5,885,573；5,677,425；6,165,745；6,277,375；5,869,046；6,121,022；5,624,821；5,648,260；6,194,551；6,737,056；6,821,505；6,277,375；美国专利申请号10/370,749；11/203,253；11/203,251和PCT公开WO 94/2935；WO 99/58572；WO 00/42072；WO 01/58957；WO 02/060919，WO 04/016750；WO 04/029207；WO 04/035752和WO 05/040217所述的Fc变体。
本领域技术人员应理解，除了上述具体氨基酸残基，可在绞链区插入、缺失和/或取代许多其它氨基酸残基，以改变绞链区特性。本领域定义了具有相似特性的氨基酸残基的家族，几个例子见表1。
表1.氨基酸残基特性
家族                    氨基酸
非极性(疏水)            Trp、Phe、Met、Leu、Ile、Val、
                        Ala、Pro、Gly，
不带电极性(亲水)        Ser、Thr、Asn、Gln、Tyr、Cys
酸性/带负电             Asp、Glu
碱性/带正电             Arg、Lys、His
β-分支                 Thr、Val、Ile
影响链取向的残基        Gly、Pro
芳香性                  Trp、Tyr、Phe、His
特别考虑到，可通过保守性氨基酸取代来修饰所述绞链区，如上所述。本领域熟知，“保守氨基酸取代”指取代功能等同氨基酸的氨基酸取代。保守氨基酸改变产生的肽的氨基酸序列中发生沉默改变。例如，极性相似的一个或多个氨基酸用作功能等同物，导致肽的氨基酸序列内发生沉默改变。即使残基属于不同类型，电中性和用较小残基取代残基的取代也可称为″保守取代″(例如用较小的异亮氨酸取代苯丙氨酸)。本领域定义了侧链相似的氨基酸残基家族。保守性氨基酸取代的几个家族见表1。(同上)。
术语“保守氨基酸取代”也指使用氨基酸类似物或变体。Bowie等，“Deciphering the Message in Protein Sequence：Tolerance to Amino AcidSubstitutions”(解码蛋白质序列信息：耐受氨基酸取代)(1990，Science247：1306-1310)提供了关于如何制备表型沉默的氨基酸取代的指南。
本发明还包括在绞链区修饰中掺入非天然氨基酸，以产生本发明Fc变体。本领域技术人员已知这类方法，例如采用天然生物合成机器将非天然氨基酸掺入蛋白质的方法，参见例如，Wang等，2002Chem.Comm.1：1-11；Wang等，2001，Science，292：498-500；van Hest等，2001.Chem.Comm.19：1897-1904。其它方案集中于负责生物合成氨基酰基-tRNA的酶，参见例如，Tang等，2001，J.Am.Chem.123(44)：11089-11090；Kiick等，2001，FEBS Lett.505(3)：465。
本领域技术人员应理解，可筛选Fc变体文库中FcγR和/或Clq结合特性(结合特性的例子包括但不限于结合特异性、平衡解离常数(KD)、解离和结合速率(分别是Koff和Kon)、结合亲和力和/或亲合力)改变的Fc变体，相对抗体应用而言，更需要或更不需要某些改变。本领域众所周知，平衡解离常数(KD)定义为koff/kon。通常理解，相对高KD的结合分子(如抗体)而言，优选低KD的结合分子(如抗体)。然而，在某些情况下，kon或koff的值可能比KD值更相关。本领域技术人员可确定对给定的抗体应用而言哪一种动力学参数最重要。例如，能提高Fc与一种或多种正调节物(如FcγRIIIA)的结合，同时不改变、或者甚至降低Fc与负调节物FcγRIIB的结合的修饰应该与ADCC活性提高相关联。或者，使得与一种或多种正调节物的结合降低和/或与FcγRIIB结合提高的修饰应该与ADCC活性降低相关联。因此，结合亲和力的比率(如平衡解离常数(KD))可以说明Fc变体的ADCC活性提高或降低。例如，FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)比率降低应该与ADCC活性提高相关联，而该比率升高应该与ADCC活性降低相关联。此外，提高与Clq的结合活性的修饰应该与CDC活性提高相关联，而降低与Clq的结合活性的修饰应该与CDC活性降低或消除相关联。
在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中相对于氨基酸序列与该Fc变体相同、但含有未修饰Fc区的多肽(在本文中称为“相当分子”)，对至少一种Fc受体/配体(如FcγRIIIA、FcγRIIB、Clq等)结合亲和力改变的多肽。因此，本发明也提供了相对于相当分子对至少一种Fc受体/配体(如FcγRIIIA、FcγRIIB、Clq等)结合亲和力改变的Fc变体(本文中也称为“本发明Fc变体”)。
本领域已知各种方法可用于筛选改变的FcγR和/或Clq结合特性。在一个实施方式中，采用(例如)本领域熟知技术荧光标记用于筛选的FcγR(如FcγRIIIA和/或FcγRIIB)和/或Clq，包括但不限于本文所述技术(参见例如，下文中题为“实施例”的部分)。在一个实施方式中，用于筛选的FcγR(如FcγRIIIA和/或FcγRIIB)和/或Clq是与链霉亲和素的融合物，用标记的生物素标记表达Fc的细胞。可以如本文所述检测该标记。在一个实施方式中，用流式细胞术分选/选择具有所需特性的抗体Fc区。例如，可采用荧光标记的FcγRIIIA筛选结合亲和力改变的抗体Fc区。例如，可根据平均荧光分选细胞，将平均荧光值高或提高的细胞分选为可能提高结合亲和力，或将平均荧光值低或降低的细胞分选为可能降低结合亲和力。在一个实施方式中，也可采用结合所有变异Fc抗体(如抗人IgG抗体)的另一种标记抗体标准化细胞表面上展示的全部抗体Fc。例如，先分选抗人IgG抗体结合的细胞，然后分选结合(正选择)或不结合(负选择)FcγRIIIA的细胞。在一个实施方式中，可以先分选结合(正选择)或不结合(负选择)FcγRIIIA的细胞，然后分选结合抗人IgG抗体的细胞。在另一实施方式中，用第一荧光分子标记结合FcγRIIIA的细胞，用第二荧光抗体标记结合抗人IgG抗体的细胞，其中同时分选能结合FcγRIIIA和抗人IgG抗体的细胞。在另一实施方式中，同时分选不能结合FcγRIIIA(或结合亲和力低)且能够结合抗人IgG抗体的细胞。
在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中FcγRIIIA结合亲和力升高或高的Fc变体。在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中FcγRIIIA结合亲和力降低或低的Fc变体。在一个实施方式中，筛选本发明Fc变体文库中对FcγRIIIA亲和力提高或高以及对FcγRIIB的亲和力未改变、降低或提高的Fc变体。在一个实施方式中，筛选本发明Fc变体文库中1)对FcγRIIIA亲和力提高或高的Fc变体；2)对FcγRIIB的亲和力未改变、降低或提高的Fc变体和3)对Clq的亲和力未改变、降低或提高的Fc变体。在另一实施方式中，筛选本发明Fc变体文库中1)对FcγRIIIA亲和力降低的Fc变体；和2)对FcγRIIB亲和力提高的Fc变体。
在一个实施方式中，筛选本发明Fc变体文库中FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)比值提高或高的Fc变体。在另一实施方式中，筛选本发明Fc变体文库中FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)比值降低或低的Fc变体。在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中FcγRIIB结合力提高或高的Fc变体。在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中FcγRIIB结合力降低或低的Fc变体。在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中Clq结合亲和力降低或低的Fc变体。在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中Clq结合亲和力提高或高的Fc变体。
在一个实施方式中，本发明Fc变体与FcγRIIIA的结合亲和力提高或高。在本发明的另一实施方式中，本发明Fc变体与FcγRIIIA的结合亲和力降低或低。在另一实施方式中，本发明Fc变体与FcγRIIIA的亲和力提高或高，与FcγRIIB的亲和力未改变、降低或提高。在又一实施方式中，本发明Fc变体1)与FcγRIIIA的亲和力提高或高；2)与FcγRIIB的亲和力未改变、降低或提高和3)与Clq的亲和力未改变、降低或提高。在另一实施方式中，本发明Fc变体1)与FcγRIIIA的亲和力降低；和2)与FcγRIIB的亲和力提高。在某些实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与FcγRIIIA和/或FcγRIIB和/或Clq的结合亲和力提高或降低。
在一个实施方式中，本发明Fc变体的FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)比值提高或高。在另一实施方式中，本发明Fc变体的FcγRIIIA/FcγRIIB平衡解离常数(KD)比值降低或低。在本发明的另一实施方式中，本发明Fc变体与FcγRIIB的结合提高或高。在本发明的一个实施方式中，本发明Fc变体与FcγRIIB的结合降低或低。在本发明的其它实施方式中，本发明Fc变体与Clq的结合亲和力降低或低。在本发明的其它实施方式中，本发明Fc变体与Clq的结合亲和力提高或高。在某些实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与FcγRIIIA和/或FcγRIIB和/或Clq的结合亲和力提高或降低。
在一个具体实施方式中，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的亲和力比相当分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在其它实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的亲和力提高至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在一个具体实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的平衡解离常数(KD)降低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少400倍、或至少600倍。在另一具体实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的平衡解离常数(KD)降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在一个具体实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的亲和力降低至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍，或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍。在其它实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的亲和力降低至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在一个具体实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的平衡解离常数(KD)提高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少7倍、或至少10倍、或至少20倍、或至少30倍、或至少40倍、或至少50倍、或至少60倍、或至少70倍、或至少80倍、或至少90倍、或至少100倍、或至少200倍、或至少400倍、或至少600倍。在另一具体实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体与Fc受体和/或配体(如FcγRIIIA、Clq)的平衡解离常数(KD)提高至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在一些实施方式中，筛选Fc变体抗体文库中相对于相当分子ADCC和/或CDC提高或降低的Fc变体。因此，本发明还提供相对于相当分子ADCC和/或CDC提高或降低的Fc变体。
在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中ADCC活性高、低、提高、降低或基本未改变的Fc变体。在一个具体实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中ADCC活性高或提高的Fc变体。在另一具体实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中ADCC活性低或降低的Fc变体。在另一具体实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中ADCC活性未改变的Fc变体。在本发明的一个实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中CDC活性高、低、提高、降低或基本未改变的Fc变体。在一个具体实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中CDC活性高或提高的Fc变体。在另一具体实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中CDC活性低或降低的Fc变体。在另一具体实施方式中，筛选细胞展示的Fc变体文库中CDC活性未改变的Fc变体。
在一个实施方式中，本发明Fc变体的ADCC活性高或提高。在另一实施方式中，本发明Fc变体的ADCC活性低或降低。在另一实施方式中，本发明Fc变体的ADCC活性未改变。在其它实施方式中，本发明Fc变体的CDC活性高或提高。在其它实施方式中，本发明Fc变体的CDC活性低或降低。在另一实施方式中，本发明Fc变体的CDC活性未改变。在某些实施方式中，相对于相当分子本发明Fc变体的ADCC和/或CDC提高、降低或未改变。
在一个具体实施方式中，本发明Fc变体的ADCC和/或CDC活性比相当分子高至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在又一实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体的ADCC和/或CDC活性提高了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
在另一具体实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体的ADCC和/或CDC活性降低了至少2倍、或至少3倍、或至少5倍、或至少10倍、或至少50倍、或至少100倍。在又一实施方式中，相对于相当分子，本发明Fc变体的ADCC和/或CDC活性降低了至少10％、或至少20％、或至少30％、或至少40％、或至少50％、或至少60％、或至少70％、或至少80％、或至少90％、或至少100％、或至少150％、或至少200％。
本发明Fc变体包含取代、缺失或插入至少一个氨基酸的Fc区，在本文中称为“本发明变异Fc区”。考虑可将本发明变异Fc区掺入其它分子，如Fc融合蛋白或其它抗体，以调节Fc受体(如FcγR)和/或Fc配体(如Clq)的结合和/或效应物功能(如ADCC活性)。可通过合并异源分子与本发明变异Fc区“从头”达到这一目的。或者，或任选地，可通过修饰含Fc区多肽的Fc区使其包含本发明变异Fc区中存在的相同氨基酸取代、缺失或插入，从而达到这一目的。因此，本发明提供了调节Fc受体(如FcγR)和/或Fc配体(如Clq)结合和/或效应物功能(如ADCC活性)的方法，该方法包括将本发明变异Fc区引入含Fc的多肽中。产生融合蛋白和引入氨基酸取代、缺失或插入的方法是本领域熟知的，包括化学合成和重组表达技术。(参见例如，Current Protocols in MolecularBiology(新编分子生物学方法)，F.M.Ausubel等编，约翰韦利出版社(John Wiley&Sons)(纽约，1998)；Molecular Cloning：A Laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)，第3版，J.Sambrook等编，冷泉港实验室出版社(纽约，2001))。
在一个实施方式中，本发明提供了产生Fc受体(如FcγR)和/或Fc配体(如Clq)结合和/或效应物功能(如ADCC活性)改变的Fc变体的方法，所述方法包括在选自下组的氨基酸残基位置上引入至少一个氨基酸残基取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失或插入：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346、347和348，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。
在一个实施方式中，本发明提供了产生Fc受体(如FcγR)和/或Fc配体(如Clq)结合和/或效应物功能(如ADCC活性)改变的Fc变体的方法，所述方法包括在选自下组的氨基酸残基位置上引入至少一个氨基酸残基取代(即非天然产生的氨基酸残基)、缺失或插入：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346和348，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。
在另一实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括引入选自下组的至少一个非天然产生的氨基酸残基：231L、231I、231V、231N、231Q、231T、231S、232K、232R、234K、234R、235V、235I、235A、235G、236K、236R、236L、236I、236V、236A、237R、237K、238N、238Q、238V、238L、238I、238E、238D、238A、238G、238M、238C、239D、240G、240A、240H、240D、240E、246R、246E、246D、246W、246F、246M、246C、250S、250V、250I、250L、251A、251G、251E、251D、251V、251I、256R、256K、260R、260K、260E、260D、261S、261T、266A、266G、274R、277V、277I、277L、277S、277T、281S、281T、282F、282W、346R、346K、348G和348A，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。
在一个具体实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括引入选自下组的至少一个非天然产生的氨基酸残基：231L、231N、231T、232K、234R、235V、235A、235I、236R、236V、236A、237R、237G238N、238V、238E、238L、238G、238M、238Q、239D、240G、240H、240E、246R、246E、246W、246M、250S、250V、251A、251E、251I、256R、260R、260E、261S、265、266A、274R、277V、277T、281S、282F、346R和348A，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。
在另一具体实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括引入选自下组的至少一个非天然产生的氨基酸残基：198T、234R、236R、236A、237R、238L、238E、238N、238V、238Q、240E、240G、248E、251A、251E、266A、277T。在另一具体实施方式中，本发明Fc变体包含非天然产生的氨基酸残基的至少一种组合，选自：246R/251E/260R、240G/198T、237R/236A。
在某些实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括在选自下组的氨基酸残基位置后引入至少一个插入：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、242、246、250、251、256、257、259、260、261、265、266、269、273、274、275、277、281、282、298、327、328、329、330、332、346和348，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。可以插入任何氨基酸残基。在本文中，具体插入可表示为“In”后接插入氨基酸残基的单字母代码和恰好侧接该插入物的残基位置。例如，“InG231/232”指在残基231和232之间插入甘氨酸的Fc变体。在某些实施方式中，本发明Fc变体在所选位置后插入一个以上氨基酸残基。在某些其它实施方式中，本发明Fc变体可在多个位置后插入一个或多个氨基酸残基。
在一个具体实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括在选自下组的氨基酸残基位置后引入至少一个插入：230、231、232、233、234、235、236、237、238、239和240，其中编号系统是Kabat所述EU索引的编号系统。可以插入任何氨基酸残基。在某些实施方式中，本发明Fc变体在所选位置后插入一个以上氨基酸残基。在某些其它实施方式中，本发明Fc变体可在多个位置后插入一个或多个氨基酸残基。
在另一具体实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括引入选自下组的至少一个插入：InR234/235；InV235/236；InR236/237；InR237/238；InV238/239；InN238/239；InL238/239；InE238/239；InG238/239；InS239/240；InG240/241和InE240/241。
在某些实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括引入取代和插入的组合。在其它实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括引入一个或多个取代和一个或多个插入的组合(如本文所述)。在一个具体实施方式中，本发明提供了产生Fc受体和/或Fc配体结合和/或效应物功能改变的Fc变体的方法，所述方法包括引入插入和取代的至少一种组合，选自：InG240/241/I198T、InL238/239/P238Q、InE238/239/V348A、InS239/240/V266A和InR237/238/G236A。
6.6抗体
基本上所有抗体类型均可用于本发明。这些抗体类型包括但不限于：合成抗体、单克隆抗体、重组产生的抗体、细胞内抗体、多特异性抗体、双抗体、双特异性抗体、人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、合成抗体、单链Fvs(scFv)、Fab片段、F(ab’)片段、二硫键连接的Fv(sdFv)和抗-独特型(抗-Id)抗体和任何上述抗体的表位结合片段。用于本发明方法的抗体包括免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分。本发明免疫球蛋白分子可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类的免疫球蛋白分子。
抗体或抗体片段可以来自任何动物来源，包括鸟和哺乳动物(如人、鼠、驴、绵羊、兔、山羊、豚鼠、骆驼、马或鸡)。在一个实施方式中，该抗体是人或人源化单克隆抗体。本文所用的“人”抗体包括含有人免疫球蛋白氨基酸序列的抗体，并且包括由人免疫球蛋白文库或表达人基因抗体的小鼠分离的抗体。本发明所用的抗体或抗体片段可以是单特异性、双特异性、三特异性或更多特异性的抗体。多特异性抗体可特异性结合于所需靶分子的不同表位，或者可特异性结合于靶分子和异源表位，如异源多肽或固体支持物。参见例如，PCT公开号WO 93/17715、WO 92/08802、WO 91/00360和WO 92/05793；Tutt等，1991，J.Immunol.147：60-69；美国专利号4,474,893、4,714,681、4,925,648、5,573,920和5,601,819；和Kostelny等，1992，J.Immunol.148：1547-1553。也可用单结构域抗体，包括camelized单结构域抗体实施本发明(参见例如，Muyldermans等，2001，Trends Biochem.Sci.26：230；Nuttall等，2000，Cur.Pharm.Biotech.1：253；Reichmann和Muyldermans，1999，J.Immunol.Meth.231：25；PCT公开号WO 94/04678和WO 94/25591；美国专利号6,005,079)。
本发明实施方式包括结合于任何靶点的抗体。抗体可来自任何物种，是嵌合抗体或人源化抗体。在一个实施方式中，抗体是人抗体。在一个实施方式中，抗体是人源化抗体。
也考虑Fc变体文库可由本发明变异Fc区产生，或者可将本发明变异Fc区引入本领域描述过的抗体内，这些抗体包括但不限于抗-荧光素单克隆抗体4-4-20(Kranz等，1982 J.Biol.Chem.257(12)：6987-6995)、人源化抗-TAG72抗体(CC49)(Sha等，1994Cancer Biother.9(4)：341-9)、特异性结合Eph受体的抗体(包括但不限于PCT公开号WO 04/014292、WO 03/094859和美国专利申请序列号10/863,729所述的抗体)、特异性结合整联蛋白αVβ3的抗体(包括但不限于LM609(Scripps)、鼠单克隆LM609(PCT公开WO 89/015155和美国专利号5,753,230))；人源化单克隆抗体MEDI-522(a.k.a.维他辛(VITAXIN)
Figure A20068004746300461
，米迪缪尼公司(MedImmune，Inc.)，马里兰州盖瑟斯堡(Gaithersburg，MD)；Wu等，1998，PNAS USA 95(11)：6037-6042；PCT公开WO 90/33919和WO00/78815)、如WO/2005/05059106所述干扰素α的抗体、如WO/2006/059106所述干扰素受体1的抗体、艾比特斯(Erbitux)TM(也称为IMC-C225)(因克隆系统公司(ImClone Systems Inc.))、EGFR的嵌合单克隆抗体；用于治疗转移性乳腺癌患者的人源化抗-HER2单克隆抗体贺赛汀
Figure A20068004746300462
(曲妥珠单抗)(基因泰克公司(Genentech)，CA)；用于防止血块形成的血小板上糖蛋白IIb/IIIa受体的抗体REOPRO(阿昔单抗)(森拓科公司(Centocor))；免疫抑制剂ZENAPAX
Figure A20068004746300472
(达力组单抗(daclizumab))(罗氏制药公司(Roche Pharmaceuticals)，瑞士)、用于预防急性肾脏同种异体移植排斥的人源化抗-CD25单克隆抗体。其它例子是人源化抗-CD18F(ab’)2(基因泰克公司)；人源化抗-CD18F(ab’)2CDP860(赛尔泰克公司(Celltech)，英国)；与CD4融合的抗-HIV gp120抗体PRO542(普洛基尼公司(Progenics)/基甾转基因技术公司(Genzyme Transgenics))；抗-CD14抗体C14(ICOS制药公司(ICOS Pharm))；人源化抗-VEGF IgG1抗体(基因泰克公司)；鼠抗-CA125抗体OVAREXTM(奥特来克司公司(Altarex))；鼠抗-17-IA细胞表面抗原IgG2a抗体PANOREXTM(葛兰素卫康公司(Glaxo Wellcome)/森拓科公司)；嵌合抗-EGFR IgG抗体IMC-C225(因克隆系统公司)；人源化抗-αVβ3整联蛋白抗体维他辛TM(应用分子演化公司(Applied Molecular Evolution)/米迪缪尼公司)；人源化抗CD52IgG1抗体坎帕斯(Campath)1H/LDP-03(留科司特公司(Leukosite))；人源化抗-CD33IgG抗体Smart M195(蛋白质设计实验室(ProteinDesign Lab)/钟纺制药公司(Kanebo))；嵌合抗-CD20 IgG1抗体利妥昔TM(IDEC制药公司(IDEC Pharm)/基因泰克公司，罗氏公司/泽田役公司(Zettyaku))；人源化抗-CD22IgG抗体LYMPHOCIDETM(因缪麦迪公司(Immunomedics))；人源化抗-HLA抗体Smart ID10(蛋白质设计实验室)；ONCOLYMTM(Lym-1)是放射性标记的鼠抗-HLA DR抗体(特尼克隆公司(Techniclone))；抗-CD11a是人源化IgG1抗体(基因泰克公司/索马公司(Xoma))；ICM3是人源化抗-ICAM3抗体(ICOS制药公司(ICOS Pharm))；IDEC-114是灵长化的抗-CD80抗体(IDEC制药公司/三菱公司)；ZEVALINTM是放射性标记的鼠抗-CD20抗体(IDEC/舍林公司(Schering AG))；IDEC-131是人源化抗CD40L抗体(IDEC/卫材公司(Eisai))；IDEC-151是灵长化的抗-CD4抗体(IDEC)；IDEC-152是灵长化的抗-CD23抗体(IDEC/生化学公司(Seikagaku))；SMART抗-CD3是人源化抗-CD3IgG(蛋白质设计实验室)；5G1.1是人源化抗-补体因子5(C5)抗体(阿来克申制药公司(Alexion Pharm))；IDEC-151是灵长化的抗-CD4IgG1抗体(IDEC制药公司/史克必清公司(SmithKline Beecham))；MDX-CD4是人抗-CD4 IgG抗体(麦得莱克斯/卫材/基麦公司(Medarex/Eisai/Genmab))；CDP571是人源化抗-TNF-αIgG4抗体(赛尔泰克公司)；LDP-02是人源化抗-α4β7抗体(留科司特公司/基因泰克公司)；OrthoClone OKT4A是人源化抗-CD4IgG抗体(奥索生物科技公司(Ortho Biotech))；ANTOVATM是人源化抗CD40L IgG抗体(百济公司(Biogen))；ANTEGRENTM是人源化抗-VLA-4IgG抗体(艾兰公司(Elan))；MDX-33是人抗-CD64(Fc γR)抗体(麦得莱克斯/森特昂公司(Medarex/Centeon))；rhuMab-E25是人源化抗-IgE IgG1抗体(基因泰克公司/诺华公司(Norvartis)/坦诺斯生物系统公司(Tanox Biosystems))；IDEC-152是灵长化的抗-CD23抗体(IDEC Pharm)；ABX-CBL是鼠抗CD-147 IgM抗体(阿布吉尼公司(Abgenix))；BTI-322是大鼠抗-CD2 IgG抗体(米迪缪尼公司/生物移植物公司(Bio Transplant))；Orthoclone/OKT3是鼠抗-CD3IgG2a抗体(奥索生物科技公司)；SIMULECTTM是嵌合抗-CD25 IgG1抗体(诺华制药公司)；LDP-01是人源化抗β2-整联蛋白IgG抗体(留科司特公司)；抗-LFA-1是鼠抗CD18F(ab’)2(巴斯得-美林公司(Pasteur-Merieux)/因缪泰科公司(Immunotech))；CAT-152是人抗-TGF-β2抗体(剑桥抗体科技公司(Cambridge Ab Tech))；Corsevin M是嵌合抗-因子VII抗体(森拓科公司)。
可用于本发明的其它抗体可特异性结合癌症或肿瘤抗原，(例如)包括但不限于：KS 1/4泛癌抗原(Perez和Walker，1990，J.Immunol.142：3662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)：407-415)、卵巢癌抗原(CA125)(Yu等，1991，Cancer Res.51(2)：468-475)、前列腺酸磷酸(Tailor等，1990，Nucl.Acids Res.18(16)：4928)、前列腺特异性抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)：903-910；Israeli等，1993，Cancer Res.53：227-230)、黑色素瘤相关抗原p97(Estin等，1989，J.Natl.Cancer Instit.81(6)：445-446)、黑色素瘤抗原gp75(Vijayasardahl等，1990，J.Exp.Med.171(4)：1375-1380)、高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)(Natali等，1987，Cancer 59：55-63；Mittelman等，1990，J.Clin.Invest.86：2136-2144)、前列腺特异性膜抗原、癌胚抗原(CEA)(Foon等，1994，Proc.Am.Soc.Clin.Oncol.13：294)、多态性上皮粘蛋白抗原、人乳脂肪球抗原、结直肠肿瘤相关抗原如CEA、TAG-72(Yokata等，1992，CancerRes.52：3402-3408)、CO17-1A(Ragnhammar等，1993，Int.J.Cancer 53：751-758)；GICA 19-9(Herlyn等，1982，J.Clin.Immunol.2：135)、CTA-1和LEA、伯基特淋巴瘤抗原-38.13、CD19(Ghetie等，1994，Blood83：1329-1336)、人B-淋巴瘤抗原-CD20(Reff等，1994，Blood 83：435-445)、CD33(Sgouros等，1993，J.Nucl.Med.34：422-430)、黑色素瘤特异性抗原如神经节苷脂GD2(Saleh等，1993，J.Immunol.，151，3390-3398)、神经节苷脂GD3(Shitara等，1993，Cancer Immunol.Immunother.36：373-380)、神经节苷脂GM2(Livingston等，1994，J.Clin.Oncol.12：1036-1044)、神经节苷脂GM3(Hoon等，1993，Cancer Res.53：5244-5250)、细胞表面抗原的肿瘤特异性移植类型(TSTA)如病毒诱导的肿瘤抗原，包括DNA肿瘤病毒的T-抗原和RNA肿瘤病毒的包膜抗原、癌胚抗原-甲胎蛋白如结肠肿瘤CEA、膀胱肿瘤癌胚抗原(Hellstrom等，1985，Cancer.Res.45：2210-2188)，分化抗原如人肺癌抗原L6、L20(Hellstrom等，1986，CancerRes.46：3917-3923)，纤维肉瘤抗原，人白血病T细胞抗原-Gp37(Bhattacharya-Chatterjee等，1988，J.of Immun.141：1398-1403)，新糖蛋白，鞘脂，乳腺癌抗原如EGFR(表皮生长因子受体)，HER2抗原(p185HER2)，多态性上皮粘蛋白(PEM)(Hilkens等，1992，Trends inBio.Chem.Sci.17：359)，恶性人淋巴细胞抗原-APO-1(Bernhard等，1989，Science 245：301-304)，分化抗原(Feizi，1985，Nature 314：53-57)如胎红细胞中的I抗原、成人红细胞中的原代内胚层I抗原、植入前胚胎、胃腺癌中的I(Ma)，乳腺上皮中的M18、M39，骨髓细胞中的SSEA-1，VEP8，VEP9，Myl，VIM-D5，结直肠癌中的D156-22，TRA-1-85(血型H)，结肠腺癌中的C14，肺腺癌中的F3，胃癌中的AH6，Y半抗原，胚胎癌细胞中的Ley，TL5(血型A)，A431细胞中的EGF受体，胰腺癌中的E1系列(血型B)，胚胎癌细胞中的FC10.2，胃腺癌抗原，腺癌中的CO-514(血型Lea)，腺癌中的NS-10，CO-43(血型Leb)，A431细胞EGF受体中的G49，结肠腺癌中的MH2(血型ALeb/Ley)，结肠癌中的19.9，胃癌粘蛋白，骨髓细胞中的T5A7，黑色素瘤中的R24，胚胎癌细胞中的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8，4-8细胞阶段胚胎中的SSEA-3和SSEA-4。在一个实施方式中，抗原是皮肤T细胞淋巴瘤中的T细胞受体衍生肽(参见Edelson，1998，The Cancer Journal 4：62)。
本发明的特异性抗原和融合伙伴
如上所述，本发明方法可用于任何抗体。例如，Fc变体文库可能由本发明变异Fc区产生，或者可将本发明变异Fc区引入任何抗体中。而且，可利用本发明变异Fc区产生Fc融合蛋白。因此，基本上可将任何分子靶向和/或掺入可用于本发明的抗体和/或Fc融合蛋白，包括但不限于：以下蛋白质列表，以及属于以下蛋白质列表的亚基、结构域、基序和表位：肾素；生长激素，包括人生长激素和牛生长激素；生长激素释放因子；甲状旁腺激素；促甲状腺激素；脂蛋白；α-1-抗胰蛋白酶；胰岛素α链；胰岛素β链；胰岛素原；促卵泡激素；降钙素；黄体生成素；胰高血糖素；凝血因子如因子VII、因子VIIIC、因子IX、组织因子(TF)和冯·威利布兰德因子；抗-凝血因子如蛋白C；心房钠元素；肺表面活性剂；纤溶酶原激活物，如尿激酶或人尿或组织类型纤溶酶原激活物(t-PA)；铃蟾肽；凝血酶；造血生长因子；肿瘤坏死因子-α和-β；脑啡肽酶；RANTES(调节通常T细胞表达和分泌的激活)；人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)；血清白蛋白如人血清白蛋白；苗勒管-抑制剂；松弛素α-链；松弛素β-链；松弛素原；小鼠促性腺素相关肽；微生物蛋白如β-内酰胺酶；DNA酶；IgE；细胞毒性T-淋巴细胞相关抗原(CTLA)如CTLA-4；抑制素；活化素；血管内皮生长因子(VEGF)；激素或生长因子受体如EGFR、VEGFR；干扰素如α干扰素(α-IFN)、β干扰素(β-IFN)和γ干扰素(γ-IFN)；干扰素受体组分如干扰素受体1；蛋白A或D；类风湿性因子；神经营养因子如骨衍生的神经营养因子(BDNF)，神经营养因子-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)，或者神经生长因子；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子如αFGF和βFGF；表皮生长因子(EGF)；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β，包括TGF-1、TGF-2、TGF-3、TGF-4或TGF-5；胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)；des(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)，胰岛素样生长因子结合蛋白；CD蛋白如CD2、CD3、CD4、CD8、CD11a、CD14、CD18、CD19、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD34、CD40、CD40L、CD52、CD63、CD64、CD80和CD147；红细胞生成素；成骨诱导因子；免疫毒素；骨形态发生蛋白(BMP)；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如M-CSF、GM-CSF和G-CSF；白介素(IL)，如IL-1～IL-13；TNFα、HMGB1；HMGB2；超氧化物歧化酶；T细胞受体；表面膜蛋白；衰变加速因子；病毒抗原如AIDS包膜的一部分，如gp120；转运蛋白；寻靶受体；地址素；调控蛋白；细胞粘着分子如LFA-1、Macl、p150.95、VLA-4、ICAM-1、ICAM-3和VCAM，a4/p7整联蛋白和(Xv/p3整联蛋白，包括他的一个或多个亚基，整联蛋白α亚基如CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、α7、α8、α9、αD、CD11a、CD11b、CD51、CD11c、CD41、αIIb、αIELb；整联蛋白β亚基如、CD29、CD18、CD61、CD104、β5、β6、β7和β8；整联蛋白亚基组合包括但不限于：αVβ3、αVβ5和α4β7；凋亡途径成员；IgE；血型抗原；flk2/flt3受体；肥胖(OB)受体；mpl受体；CTLA-4；蛋白C；壳多糖酶或壳多糖酶样分子如YKL-40和AMC酶；Eph受体如EphA2、EphA4、EphB2等；人白细胞抗原(HLA)如HLA-DR；补体蛋白如补体受体CR1、C 1Rq和其它补体因子如C3和C5；糖蛋白受体如GpIbα、GPIIb/IIIa和CD200；
此外，可用于本发明的分子是特异性结合癌抗原的分子，包括但不限于：ALK受体(多效营养因子受体)、多效营养因子、KS 1/4泛癌抗原；卵巢癌抗原(CA125)；前列腺酸磷酸；前列腺特异性抗原(PSA)；黑色素瘤相关抗原p97；黑色素瘤抗原gp75；高分子量黑色素瘤抗原(HMW-MAA)；前列腺特异性膜抗原；癌胚抗原(CEA)；多态性上皮粘蛋白抗原；人乳脂肪球抗原；结直肠肿瘤相关抗原如：CEA、TAG-72、CO17-1A、GICA19-9、CTA-1和LEA；伯基特淋巴瘤抗原-38.13；CD19；人B-淋巴瘤抗原-CD20；CD33；黑色素瘤特异性抗原如神经节苷脂GD2、神经节苷脂GD3、神经节苷脂GM2和神经节苷脂GM3；肿瘤特异性移植类型细胞表面抗原(TSTA)；病毒诱导的肿瘤抗原，包括T-抗原、DNA肿瘤病毒和RNA肿瘤病毒的包膜抗原；癌胚抗原-甲胎蛋白如结肠肿瘤CEA、5T4癌胚滋养层糖蛋白和膀胱肿瘤癌胚抗原；分化抗原如人肺癌抗原L6和L20；纤维肉瘤抗原；人白血病T细胞抗原-Gp37；新糖蛋白；鞘脂；乳腺癌抗原如EGFR(表皮生长因子受体)；NY-BR-16；NY-BR-16和HER2抗原(p185HER2)；多态性上皮粘蛋白(PEM)；恶性人淋巴细胞抗原-APO-1；分化抗原如胎红细胞中的I抗原；成人红细胞中的原代内胚层I抗原；植入前胚胎；胃腺癌中的I(Ma)；乳腺上皮中的M18、M39；骨髓细胞中的 SEA-1；VEP8；VEP9；Myl；VIM-D5；结直肠癌中的D156-22；TRA-1-85(血型H)；睾丸和卵巢癌中的SCP-1；结肠腺癌中的C14；肺腺癌中的F3；胃癌中的AH6；Y半抗原；胚胎癌细胞中的Ley；TL5(血型A)；A431细胞中的EGF受体；胰腺癌中的E1系列(血型B)；胚胎癌细胞中的FC10.2；胃腺癌抗原；腺癌中的CO-514(血型Lea)；腺癌中的NS-10；CO-43(血型Leb)；A431细胞的EGF受体中的G49；结肠腺癌中的MH2(血型ALeb/Ley)；结肠癌中的19.9；胃癌粘蛋白；骨髓细胞中的T5A7；黑色素瘤中的R24；胚胎癌细胞中的4.2、GD3、D1.1、OFA-1、GM2、OFA-2、GD2和M1:22:25:8以及4-8细胞阶段胚胎中的SSEA-3和SSEA-4；皮肤T细胞淋巴瘤抗原；MART-1抗原；唾液酸Tn(STn)抗原；结肠癌抗原NY-CO-45；肺癌抗原NY-LU-12变体A；腺癌抗原ART1；副肿瘤相关性脑-睾丸-癌抗原(癌神经元抗原MA2；副肿瘤性神经元抗原)；神经-肿瘤腹抗原2(NOVA2)；肝细胞癌抗原基因520；肿瘤相关抗原CO-029；肿瘤相关抗原MAGE-C1(癌症/睾丸抗原CT7)、MAGE-B1(MAGE-XP抗原)、MAGE-B2(DAM6)、MAGE-2、MAGE-4a、MAGE-4b和MAGE-X2；癌症-睾丸抗原(NY-EOS-1)；YKL-40和任何上述多肽的片段。
下游工程改造
考虑到，可以进一步修饰用本发明筛选法分离的一种或多种多肽。例如，可修饰按照本发明分离的抗体(即共价连接任何类型的分子与抗体)。例如，但不限于，该抗体衍生物包括通过(例如)糖基化、乙酰基化、PEG化、磷酸化、酰胺化、用已知保护基/封端基衍生化、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白等修饰的抗体。可以通过已知技术进行许多化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰基化、甲酰基化等。在某些实施方式中，将按照本发明分离的抗体或其片段融合于生物活性分子，包括但不限于肽、多肽、蛋白质、小分子、模拟物、合成药物、无机分子和有机分子。在其它实施方式中，将按照本发明分离的抗体或其片段偶联于诊断性、可检测的或治疗性物质。这类物质和偶联方法是本领域技术人员熟知的，参见许多来源(参见例如，Arnon等，“Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy(癌症治疗中用于药物免疫靶向的单克隆抗体)”，刊于Monoclonal Antibodies AndCancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Reisfeld等(编)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.1985)；Hellstrom等，“Antibodies For Drug Delivery”(用于药物递送的抗体)，刊于Controlled Drug Delivery(控制药物递送)(第2版)，Robinson等(编)，第623-53页(马-德公司(Marcel Dekker，Inc).1987)；Thorpe，“AntibodyCarriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy：A Review”(癌症治疗中细胞毒剂的抗体载体：综述)，刊于Monoclonal Antibodies‘84：Biological And ClinicalApplications(单克隆抗体‘84：生物和临床应用)，Pinchera等(编)，第475-506页(1985)；“Analysis，Results and Future Prospective Of The Therapeutic Use OfRadiolabeled Antibody In Cancer Therapy”(放射性标记抗体在癌症治疗中的治疗应用的分析、结果和前景展望)，刊于Monoclonal Antibodies For CancerDetection And Therapy(用于癌症检测和治疗的单克隆抗体)，Baldwin等(编)，第303-16页(学术出版社(Academic Press)，1985)和Thorpe等，1982，Immunol.Rev.62：119；国际公开号WO 93/15199；WO 93/15200；WO 97/33899；WO97/34911；WO 01/77137；WO 03/075957；美国专利公开号2006/0040325)。
或者或任选地，可将按照本发明分离的抗体或其片段融合于多肽部分。本领域知道将抗体融合或偶联于多肽部分的方法。参见例如，美国专利5,336,603；5,622,929；5,359,046；5,349,053；5,447,851和5,112,946；EP 307,434；EP 367,166；PCT公开WO 96/04388和WO 91/06570；Ashkenazi等，1991，PNAS USA88：10535；Zheng等，1995，J Immunol 154：5590；和Vil等，1992，PNAS USA89：11337；将其全文各自纳入本文作参考。抗体或其片段与部分的融合不一定需要是直接融合，可通过接头序列融合。这类接头分子是本领域熟知的，参见Denardo等，1998，Clin Cancer Res 4：2483；Peterson等，1999，Bioconjug Chem10：553；Zimmerman等，1999，Nucl Med Biol 26：943；Garnett，2002，Adv DrugDeliv Rev 53：171。
在一个实施方式中，将按照本发明分离的抗体或其片段重组融合或化学偶联(包括共价和非共价偶联)于异源蛋白或多肽(或其片段，优选至少10、至少20、至少30、至少40、至少50、至少60、至少70、至少80、至少90或至少100个氨基酸的多肽)，以产生融合蛋白。或者或任选地，在体外或体内可通过将抗体融合或偶联于特定细胞表面受体的特异性抗体，采用抗体或其片段将异源多肽靶向特定细胞类型。或者，抗体可偶联于第二抗体，形成抗体异源偶联物，如Segal在美国专利号4,676,980中所述。
跨膜区
在本发明中，跨膜区的编码序列位于第一编码区下游，并与其操作性相连(图1)。因此，表达能够定位到细胞膜上的融合蛋白，在细胞膜上可采用本领域熟知技术检测它。
蛋白质跨膜区是高度疏水或亲脂的结构域，它的大小适合跨越细胞膜的脂质双层，从而将蛋白质、肽或受体锚定在细胞膜中。它们一般(但不一定)包含15-30个氨基酸。参见Chou等(1999 Biotechnology and Bioengineering65(2)：160-169)，它描述采用来自不同来源蛋白的数种跨膜区在细胞膜上表达不同蛋白。本领域技术人员可调整Chou等进行的方法，以优化或筛选用于本发明的不同跨膜区和/或GPI锚定结构域。
跨膜蛋白可含有一个或多个跨膜区。例如，受体酪氨酸激酶、某些细胞因子受体、受体鸟苷酰环化酶和受体丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶含有一个跨膜区。然而，各种其它蛋白质(包括通道和腺苷酰环化酶)含有若干个跨膜区。
将许多细胞表面受体分类为″七次跨膜″蛋白，因为它们含有跨膜区。跨膜蛋白受体包括但不限于：胰岛素受体、胰岛素样生长因子受体、人生长激素受体、葡萄糖转运蛋白、转铁蛋白受体、表皮生长因子受体、低密度脂蛋白受体、表皮生长因子受体、瘦激素受体、白介素受体，如IL-1受体、IL-2受体等。
用于真核系统的各种方法通过产生含有感兴趣多肽和另一蛋白跨膜区的融合蛋白将融合蛋白锚定于细胞膜，从而实现表面展示。不希望受理论束缚，在真核细胞中，在翻译的同时，大多数分泌蛋白和膜结合蛋白跨内质网膜运输(Wicker和Lodish，Science 230：400(1985)；Verner和Schatz，Science241：1307(1988)；Hartmann等，Proc.Nat′lAcad.Sci.USA 86：5786(1989)；Matlack等，Cell 92：381(1998))。在这一共同运输过程的第一个步骤中，称为″信号序列″的新生多肽的N末端疏水节段由信号识别颗粒识别，并通过信号识别颗粒和膜受体之间的相互作用靶向内质网膜。该信号序列进入内质网膜，接下来出生多肽链开始通过内质网膜中的运输机器。分泌蛋白或I型膜蛋白的信号序列被内质网膜腔侧上的信号肽酶切割，从运输链上切下。将其余的分泌蛋白链释放到内质网内腔中。I型膜蛋白通过第二疏水节段锚定在膜中，所述第二疏水节段通常称为″跨膜区″。I型膜蛋白的C末端位于细胞胞浆内，而N末端展示在细胞表面上。
本文所用术语″II型信号锚定结构域″或″II型跨膜区″指真核II型整合膜蛋白中的疏水氨基酸序列，在翻译期间，它能以II型取向将多肽靶向和锚定到内质网膜中。术语″II型取向″指N末端位于胞质中而C末端位于内质网腔内或胞外细胞表面上的蛋白拓扑结构。
相反，某些蛋白质含有不切割的信号序列，即用作跨膜节段的″信号锚定序列″。信号锚定I型蛋白的C末端位于胞浆中，这类似于I型膜蛋白，而信号锚定II型蛋白的N末端位于胞浆中。II型信号锚定蛋白的例子参见例如，Yokoyarna-Kobayashi等，Gene 228：161(1999)。
在一个实施方式中，跨膜区来自I型膜蛋白。
本文描述了跨膜区的例子，但本发明融合蛋白的跨膜区可以是跨越浆细胞膜并可将其它结构域锚定在膜中的任何氨基酸序列。跨膜区的特征通常包括连续疏水性氨基酸，后接带电氨基酸。因此，分析特定蛋白的氨基酸序列后，本领域技术人员可预测蛋白质内跨膜区的定位和数量。跨膜区可包含疏水区和两性区。疏水区含有疏水性氨基酸，包括但不限于：苯丙氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、色氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸和丝氨酸，包括疏水性α-螺旋。
两性区可含有疏水性和亲水性氨基酸和部分，包括两性α-螺旋。亲水性氨基酸包括但不限于：精氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷胺酰胺、组氨酸、酪氨酸和脯氨酸。本领域曾经描述过形成稳定α螺旋的跨膜区。
基本上任何跨膜区均与本发明相容。跨膜区包括但不限于：来自肿瘤坏死因子受体超家族成员、CD30、血小板衍生生长因子受体(PDGFR，如人PDGFR的氨基酸514-562；Chestnut等，1996 J Immunological Methods 193：17-27；也参见Gronwald等，1988PNAS 85：3435)；神经生长因子受体、鼠B7-1(Freeman等，1991 J Exp Med 174：625-631)、去唾液酸糖蛋白受体H1亚基(ASGPR；Speiss等，1985 J Biol Chem 260：1979-1982)、CD27、CD40、CD120a、CD120b、CD80(Freeman等1989 J Immunol 143：2714-22)淋巴毒素β受体、半乳糖基转移酶(如GenBank登录号AF155582)、唾液酸转移酶(如GenBank登录号NM-003032)、天冬氨酰转移酶1(Asp1；如GenBank登录号AF200342)、天冬氨酰转移酶2(Asp2；如GenBank登录号NM-012104)、突触融合蛋白6(如GenBank登录号NM-005819)、泛素、多巴胺受体、胰岛素B链、乙酰基葡糖胺基转移酶(如GenBank登录号NM-002406)、APP(如GenBank登录号A33292)、G-蛋白偶联受体、血栓调节蛋白(Suzuki等1987EMBO J 6，1891)和TRAIL受体的跨膜区。在一个实施方式中，该跨膜区来自人蛋白质。出于本发明目的，可利用蛋白质的所有或部分跨膜区。在特定实施方式中，该跨膜区是Asp2的残基454-477、APP(如APP 695)的残基598-661、半乳糖基转移酶的残基4-27、Asp1的残基470-492、唾液酸转移酶的残基10-33、乙酰基葡糖胺基转移酶的残基7-29或突触融合蛋白6的残基261-298。跨膜区的例子也参见专利公开号WO 03/104415和US20040126859。在一个实施方式中，该跨膜区衍生自人蛋白质，如本文所述。
在一个实施方式中，细胞表面展示的本发明抗体或其片段包含血栓调节蛋白的跨膜区，它含有以下氨基酸序列LLIGISIASLCLVVALLALLCHLRKKQ(SEQ ID NO：109)。
在一个实施方式中，在一个克隆步骤中使用英杰公司的pDisplayTM载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德；目录号V660-20)构建病毒载体。pDisplayTM载体是经设计使重组蛋白靶向哺乳动物细胞表面的哺乳动物表达载体。通过与载体的N-末端分泌信号和血小板衍生生长因子受体(PDGFR)的C末端跨膜锚定结构域一起框内克隆感兴趣基因，将感兴趣的蛋白质靶向且锚定于细胞表面。进一步的详情参见英杰公司题为“pDisplayTM Vector for expression of proteins on thesurface of mammalian cells”(用于在哺乳动物细胞表面上表达蛋白质的pDisplayTM载体)的产品说明书(版本C)。
6.10GPI锚定信号序列
通过GPI锚定物将各种细胞表面蛋白，包括酶、包被蛋白、表面抗原和粘着分子连接于质膜(Burikofer等，2002FASEB J 15：545)。GPI是翻译后加入的脂质锚定物；因此，不像含有不同跨膜区并连接于特异性胞质延伸物的常规多肽锚定物那样，GPI锚定物采用常见的脂质结构连接于膜，这与连接的蛋白质无关(Englund等，AnnulRev.Biochem.62：121(1993))。鉴定了许多蛋白质的GPI锚定信号序列(参见例如，Cares等，Science 243：1196(1989))。已经将GPI锚定信号成功地工程改造到其它非GPI锚定蛋白的C末端上，这些GPI锚定蛋白包被在细胞表面上，且有功能。(Anderson等，P.N.A.S.93：5894(1996)；Brunschwig等，J.Immunother.22：390(1999))。GPI锚定物应该在蛋白质靶向、跨膜信号转导和小分子摄取(胞吞作用)中有功能。质膜蛋白的GPI锚定物存在于真核生物中，从原生动物和真菌到脊椎动物。可用于本发明的GPI锚定结构域的例子参见Doering，T.L.等(1990)J.Biol.Chem.265：611-614；McConville，M.J.等(1993)，Biochem.J.294：305-324；和PCT公开WO03/017944)。
不希望受理论的束缚，蛋白质合成后，立即通过长度约为15-20个氨基酸的疏水性序列将含有GPI修饰信号的蛋白质锚定于ER腔。Alberts等，MolecularBiology Of The Cell(细胞的分子生物学)，第3版，第591页(1994)。GPI锚定物是在ER中预先组装的，然后进行GPI连接，修饰蛋白是糖基化的，并且穿梭到质膜外表面。粗面ER中的酶能催化将GPI锚定物共价连接于肽C末端的过程。ER的酶能切割原始的膜锚定物序列，然后将新的羧基末端连接于乙醇胺的氨基。锚定物一般包含磷酸乙醇胺(EthN-P)，连接于肌醇磷脂的几种糖，包括N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)和甘露糖(Ikezawa 2002 Biol Pharm Bull 25：409-417)。而且，肌醇磷脂一般含有1-烷基，2-酰基甘油。然而，锚定物中的肌醇磷脂可改变。例如，红细胞上表达的蛋白质的肌醇磷脂含有其它连接肌醇的脂肪酸，它能提供其它连接于质膜的连接点。这类锚定物被称为″双脚″锚定物。因此，本发明的GPI锚定物可以是“单脚”、“双脚”或“三脚”锚定物。
产生合成GPI锚定序列有一些要求。该分子的C末端(10-20个氨基酸)上有一个疏水区，后面没有碱性残基簇，疏水区前面是7-10个残基的“间隔结构域”，间隔区后面是小氨基酸，在这里切割前体和连接锚定物。预先组装GPI锚定物，并在内质网(ER)中加入新生蛋白。伴随着这一步骤，去除了初始C-末端肽，以使GPI锚定物共价连接于蛋白质上的新C-末端氨基酸。
本发明利用GPI锚定信号序列，在本文所述的细胞膜上表达抗体。GPI锚定信号序列编码区位于第一编码区下游并与其操作性连接。因此，表达能够定位于细胞膜上的融合蛋白，在细胞膜上可用本领域熟知技术对其进行检测(图1)。
应理解，GPI锚定蛋白也利用将蛋白质导向ER的N末端信号序列。可通过本领域常用方法将这一信号工程改造到编码区中。
基本上任何GPI-锚定信号序列均可用于本发明。本领域已知GPI-锚定信号序列和/或可采用本领域已知方法进行检测，例如利用获自http://mendel.imp.univie.ac.at/gpi/gpi server.html以及如Eisenhaber等1999 J MolBiol 292：741-758；Eisenhaber等2003 Nucleic Acids Research 31：3631-3634；Eisenhaber等，Protein Engineering 14：17-25；Eisenhaber等2000 TIBS 25：340-341；和Eisenhaber等1998 Protein Engineering 11：1155-1161所述Big-P预计分析进行检测。
在一个实施方式中，GPI-锚定信号序列选自真核动物、哺乳动物、灵长动物或人蛋白质的GPI-锚定信号。GPI-锚定信号序列包括但不限于：衰变加速因子(DAF；Caras等1987Science 238：1280-83)；尿调节素，碱性磷酸酶，BP-3，二肽基肽酶，布氏锥虫(Trypanosoma brucei)变体表面蛋白(VSG；Doering等JBio Chem.1990256：611-614)；C8结合蛋白(Doering等，1990)；碱性磷酸酶；乙酰基胆碱酯酶；59-核苷酸酶；碱性磷酸二酯酶I；海藻糖酶；利什曼原虫表面蛋白酶PSP(gp63)；肾二肽酶(MDP)；氨基肽酶P；NAD 1糖水解酶；羧基肽酶M；碳酸酐酶IV；蚕氨基肽酶N；ADP-核糖基转移酶；酵母天冬氨酰蛋白酶；小球藻硝酸还原酶；原质团转铁蛋白受体；CD14；CD16；CD48；叶酸结合蛋白；脲激酶受体；CNTF受体；锥虫VSG和PARP(贝前列腺素(procyclin))；弓形体表面抗原(P22；P30和P43)；贾第鞭毛虫GP49；草履虫表面抗原；Thy-1；CD55(DAF)；Ly6家族(CD59；Ly6A/E)；癌胚抗原(CEA)；Qa-2；CD24，朊病毒(PrP C；PrP Sc)；乌贼Sgp-1和Sgp-2；NCAM-120(最短的CD56)；CD58(LFA-3；Seed等，1987Nature 329：840-842)；网柄菌(Dictyostelium)完整位点A；小鼠F3；鸡F11；鸡axonin-1；珠灰霉(Polysphondylium)GP64；蚱蜢REGA-1；5NTD_BOVIN；5NTD_DISOM；5NTD_HUMAN；5NTD_RAT；ACES_TORCA；ACES_TORMA；AMPM_HELVI；AMPM_MANSE；AXO1_HUMAN；BCM1_HUMAN；BCM1_MOUSE；BCM1_RAT；BM86_BOOMI；BST1_HUMAN；BST1_MOUSE；BST1_RAT；CADD_CHICK；CADD_HUMAN；CAH4_HUMAN；CD24_HUMAN；CD24_MOU SE；CD24_RAT；CD48_HUMAN；CD48_MOUSE；CD48_RAT；CD52_HUMAN；CD52_MACFA；CD59_AOTTR；CD59_CALSQ；CD59_CERAE；CD59_HSVSA；CD59_HUMAN；CD59_PAPSP；CD59_PIG；CD59_RAT；CD59_SAISC；CEPU_CHICK；CGM6_HUMAN；CNTR_CHICK；CNTR_HUMAN；CNTR_RAT；CONN _DROME；CSA_DICDI；CWP1_YEAST；CWP2_YEAST；DAF_HUMAN；DAF_PONPY；DAF1_MOUSE；FOL1_HUMAN；FOL1_MOUSE；FOL2_HUMAN；FOL2_MOUSE；G13A_DICDI；G13B_DICDI；GAS1_YEAST；GLYP_HUMAN；GLYP_RAT；GP46_LEIAM；GP63_LEICH；GP63_LEIDO；GP63_LEIGU；GP63_LEIMA；GP85_TRYCR；GPCK_MOUSE；HYA1_CAVPO；HYA1_HUMAN；HYA1_MACFA；HYR1_CANAL；LACH_DROME；LACH _SCHAM；LAMP_HUMAN；LAMP_RAT；LY6A_MOUSE；LY6C_MOUSE；LY6E_MOUSE；LY6F_MOUSE；LY6G_MOUSE；MDP1_HUMAN；MDP1_MOUSE；MDP1_PIG；MDP1_RABIT；MDP1_RAT；MDP1_SHEEP；MKC7_YEAST；MSA1_SARMU；NAR3_HUMAN；NART_MOUSE；NCA _HUMAN；NRT1_RAT；NRT2_RAT；NRTR_CHICK；NRTR_HUMAN；NRTR_MOUSE；NTRI_RAT；OPCM_BOVIN；OPCM_HUMAN  ；OPCM_RAT；PAG1_TRYBB；PARA_TRYBB；PARB_TRYBB；PARC_TRYBB；PONA_DICDI；PPB1_HUMAN；PPB2_HUMAN；PPB3_HUMAN；PPBE_MOUSE；PPBI_BOVIN；PPBI_HUMAN；PPBI_RAT；PPBJ_RAT；PRIO_ATEGE；PRIO_ATEPA；PRIO_CALJA；PRIO_CEBAP；PRIO_CERAE；PRIO_CERAT；PRIO_CERMO；PRIO_CERNE；PRIO_CERPA；PRIO_CERTO；PRIO_COLGU；PRIO _CRIGR；PRIO_CRIMI；PRIO_GORGO；PRIO_HUMAN；PRIO_MACFA；PRIO_MACSY；PRIO_MANSP；PRIO_MESAU；PRIO_MOUSE；PRIO_PANTR；PRIO_PONPY；PRIO_PREFR；PRIO_RAT；PSA_DICDI；SP63_STRPU；THY1_CHICK；THY1_HUMAN；THY1_MACMU；THY1_MOUSE；THY1_RAT；TIP1_YEAST；TIR1_YEAST；TREA_HUMAN；TREA_RABIT；UPAR _BOVIN；UPAR_HUMAN；UPAR_MOUSE；UPAR_RAT；VCA1_MOUSE；VSA1_TRYBB；VSA8_TRYBB；VSAC_TRYBB；VSE2_TRYBR；VSG2_TRYEQ；VSG4_TRYBR；VSG7_TRYBR；VSI1_TRYBB；VSI2TRYBB；VSI3_TRYBB；VSI4_TRYBB；VSI5_TRYBB；VSI6_TRYBB；VSIB_TRYBB；VSM0_TRYBB；VSM1_TRYBB；VSM2_TRYBB；VSM4_TRYBB；VSM5_TRYBB；VSM5_TRYBR；VSM6_TRYBB；VSWA_TRYBR；VSWB_TRYBR；VSY1_TRYCO；YAP3_YEAST；YJ9O_YEAST；和YJ9P_YEAST。在一个实施方式中，GPI-锚定信号序列是DAF的C-末端37个氨基酸。GPI锚定信号序列的其它例子参见美国专利号5,968,742和Doering等1990，同上。特异性GPI锚定信号的例子包括但不限于：表2所列例子。
表2.用于GPI锚定的信号肽的例子
  氨基酸序列  SEQ ID NO
  DKLVKCGGISLLVQNTSWMLLLLLSLSLLQALDFISL  56
  PSPTPTETATPSPTPKPTSTPEETEAPSSATTLISPLSLIVIFISFVLLI  57
  LVPRGSIEGRGTSITAYNSEGESAEFFFLLILLLLLVLV  58
  TSITAYKSEGESAEFFFLLILLLLLVLV  59
  SNKGSGTTSGTARLLSGHTCFTLTGLLGTLVIMGLLT  60
  PNKGSGTTSGTTRLLSGHTCFTLTGLLGTLVTMGLLT  61
  PDHSAATKPSLFLFLVSLLHIFFK  62
6.11内部核糖体进入位点
用IRES由一种载体表达两种或多种蛋白。通常采用IRES序列驱动第二、第三、第四编码序列等的表达。
IRES元件最初发现于微小核糖核酸病毒mRNA(Jackson等，1990，Trends Biochem Sci 15：477-S3；Jackson等，1995，RNA 1：985-1000)。可用于本发明的IRES的例子包括但不限于来自或衍生自以下物质的IRES：微小核糖核酸病毒如HAV(Glass等，1993，Virol193：842-852)、脑心肌炎病毒(EMCV)(如购自诺基公司(Novagen))(Duke等，1992，J.Virol 66：1602-9；Jang和Wimmer，1990，Gene Dev 4：1560-1572)和脊髓灰质炎病毒(Borman等，1994，EMBO J 13：3149-3157)；HCV(Tsukiyama-Kohara等，1992，J Virol66：1476-1483)、BVDV(Frolov I等，1998，RNA.4：1418-1435)；利什曼病毒如LRV-1(Maga等，1995，Mol Cell Biol 15：4884-4889)；逆转录病毒如MoMLV(Torrent等，1996，Hum Gene Ther 7：603-612)、VL30(哈维鼠肉瘤病毒)、REV(Lopez-Lastra等，1997，Hum Gene Ther 8：1855-1865)；和真核mRNA如免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak和Sarnow，1991，Nature 353：90-94)、触角基因mRNA(Oh等，1992，Gene and Dev 6：1643-1653)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)(Vagner等，1995，Mol Cell Biol 15：35-44)、PDGF-β(Bernstein等，1997，J Biol Chem 272：9356-9362)、IGFII(Teerink等，1995，Biochim Biophys Acta 1264：403-408)、翻译启动因子elF4G(Gan和Rhoads，1996，J Biol Chem 271：623-626)、胰岛素样生长因子(IGFU)、酵母转录因子TFIID和HAP4以及血管内皮生长因子(VEGF)(Stein等，1998，MolCell Biol 18：3112-3119；Huez等，1998，Mol Cell Biol 18：6178-6190)，以及美国专利6,692,736所述的因子。也报道了不同病毒如心脏病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、HCV、弗里德小鼠白血病病毒(FrMLV)和莫洛尼小鼠I型白血病病毒(MoMLV)中存在IRES。本文所用术语“IRES”包括IRES序列的功能性变异，只要该变异能够促进核糖体直接进入下游顺反子的起始密码子中，导致帽-非依赖性翻译。本发明所用的IRES可以来自哺乳动物、病毒或原生动物。
因此，下游顺反子的产物可由双顺反子(或多顺反子)mRNA表达，而不需要切割多蛋白质或产生单顺反子mRNA。常用的内部核糖体进入位点的长度约为450个核苷酸，特征是适度保留了一级序列和大量保持了二级结构。IRES最显著的一级序列特征是富含嘧啶的位点，其起始点位于IRES 3′端上游约25个核苷酸的地方。参见Jackson等，1990(Trends Biochem Sci，15(12)：477-83)。
已经鉴定和表征了微小核糖核酸病毒IRES的三种主要类型：(1)心脏病毒和口蹄疫病毒类(例如，脑心肌炎病毒，Jang等，1990，Gene Dev4：1560-1572)；(2)肠-和鼻病毒类(例如，脊髓灰质炎病毒，Borman等，1994，EMBO J.13：314903157)；和(3)甲型肝炎病毒(HAY)类，Glass等，1993，Virol193：842-852)。在前两种类型中，应用两种基本原理。首先，大多数约450个核苷酸序列的IRES用于维持特定的二级和三级结构，有助于结合核糖体和启动翻译。其次，核糖体进入位点是位于IRES 3′末端，保守寡聚嘧啶处下游约25个核苷酸处的AUG三联体。可以在核糖体进入位点(心脏病毒)或下游的下一个AUG(肠/鼻病毒类)上启动翻译。在口蹄疫病毒中两个位点上启动翻译。
HCV和瘟病毒如牛病毒性腹泻病毒(BVDV)或；经典的猪发热病毒(CSFV)的5′-UTR长度分别为341nt和370nt。这些5′-UTR片段形成相似的RNA二级结构，可能具有中等有效的IRES功能(Tsukiyama-Kohara等，1992，J.Virol.66：1476-1483；Frolov I等，1998，RNA 4：1418-1435)。近来的研究表明，弗里德小鼠白血病病毒(MLV)5′-UTR和大鼠反转录转座子病毒样30S(VL30)序列含有逆转录病毒来源的IRES结构(Torrent等，1996，Hum Gene Ther 7：603-612)。
在真核细胞中，通常是在启动因子的控制下，核糖体由加帽mRNA 5′端开始扫描，从而启动翻译。然而，已发现数种细胞mRNA含有IRES结构，以介导帽-非依赖性翻译(van derVelde，等，1999，Int J Biochem Cell Biol.31：87-106)。非限制性例子是：免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等，1991，Nature353：90-94)、果蝇的触角基因mRNA(Oh等，1992，Gene and Dev 6：1643-1653)、成纤维细胞生长因子2(FGF-2)(Vagner等，1995，Mol Cell Biol 15：35-44)、血小板衍生生长因子B(PDGF-B)(Bernstein等，1997，J Biol Chem 272：9356-9362)、胰岛素样生长因子II(Teerink等，1995，Biochim Biophys Acta 1264：403-408)、翻译启动因子eIF4G(Gan和Rhoads，1996，J Biol Chem 271：623-626)和血管内皮生长因子(VEGF)(Stein等，1998，Mol Cell Biol 18：3112-3119；Huez等，1998，Mol Cell Biol 18：6178-6190)。
可采用本领域已知的标准重组和合成方法制备IRES。为了方便克隆，可将限制性位点工程改造到IRES片段末端中待用。
6.12.自身加工切割位点或序列
虽然其机制不是本发明的一部分，但自身加工切割位点、自身加工切割序列或2A样序列的活性可包括核糖体在密码子间跳跃，以防止形成肽键(deFelipe等，2000，Human Gene Therapy 11：1921-1931；Donnelly等，2001，J.Gen.Virol.82：1013-1025)，但认为该结构域的功能更类似于自溶酶(Ryan等，1989，Virol.173.35-45)。
″自身加工切割位点″或″自身加工切割序列″指DNA或氨基酸序列，翻译后，分子内(顺式)快速切割含有自身加工切割位点的多肽，表达独立的成熟蛋白或多肽产物。同时，“自身加工切割位点”或“自身加工切割序列”指DNA或氨基酸序列，其中在翻译后，该序列导致“核糖体跳跃”，如本领域已知和本文所述。“自身加工切割位点”也可称为翻译后或同时翻译的加工切割位点，例如2A位点、序列或结构域。已报道，2A位点、序列或结构域具有通过修饰核糖体活性来促进酯键水解的翻译作用，从而由翻译复合物释放多肽，以便合成独立的下游翻译产物(Donnelly等，2001，J Gen Virol.82：1013-25)。或者，“自身加工的切割位点”、“自身加工的切割序列”或2A序列或结构域能够通过顺式切割其自身的C末端发生“自身蛋白酶解”或“切割”，以产生初级切割产物(Furler；Palmenberg，1990，Ann.Rev.Microbiol.44：603-623)。
虽然其机制不时本发明的一部分，但2A-样序列或自身加工的切割位点的活性可包括核糖体在密码子间跳跃，以防止形成肽键(de Felipe等，2000，Human Gene Therapy 11：1921-1931；Donnelly等，2001，J.Gen.Virol.82：1013-1025)，但认为该结构域的功能更类似于自溶酶(Ryan等，Virol.173.35-45(1989)。
已证明口蹄疫病毒2A寡肽能通过核糖体跳跃机制介导翻译两种连续的蛋白质(Donnelly等，2001，J Gen Virol.82：1013-25；Szymczak等，2004，NatBiotechnol.5：589-94.；Klump等，2001，Gene Ther.10：811-7；De Felipe等，2000，Hum Gene Ther.11：1921-31；Halpin等，1999，Plant J.17：453-9；Mattion等，1996，J Virol.70：8124-7；和de Felipe P.等，1999，Gene Ther.6：198-208)。将多种蛋白质编码为一个开放阅读框(ORF)。在双顺反子系统中翻译时，上游基因的3’端地存在FMDV 2A序列使得不与下游顺反子形成肽键，导致″核糖体跳跃″和翻译的FMDV 2A寡肽与上游蛋白的连接(Donnelly等，2001，J Gen Virol.82(Pt 5)：1013-25)。以化学计量方式进行加工，估计高达90-99％，导致这两种蛋白质的摩尔量几乎相等(Donnelly等，2001，J Gen Virol.82(Pt 5)：1027-41)。而且，通过检测分析，氨基酸序列依赖性加工活性定位于FMDV 2A寡肽C末端的一小部分(Ryan等，1994，EMBO J.13：928-33)。微小核糖核酸病毒家族(FMDV所属的家族)的大多数成员采用共同翻译加工的机制，产生单独的蛋白质(Donnelly等，2001，J Gen Virol.82(Pt 5)：1027-41)。实际上，发表物已证明，小至13个氨基酸的片段可引起核糖体跳跃(Ryan等，1994，EMBO J.13：928-33)。在双顺反子载体系统中掺入截短肽证明，非病毒载体系统中几乎保留了全部加工活性(Donnelly等，2001，J Gen Virol.82(Pt5)：1027-41)。通过战略性安置这些元件类型，在一个启动子下有效表达了至少四种编码序列(Szymczak等，2004，Nat Biotechnol.22：589-94)。因此，本发明可采用自身加工的切割位点如FMDV 2A寡肽，以便将重链和轻链编码区的表达联系起来。
出于本发明目的，编码自身加工切割位点的DNA序列的例子是衍生自微小核糖核酸病毒的病毒序列，这些病毒包括但不限于肠、鼻、心脏、口蹄疫病毒(FMDV)。在一个实施方式中，自身加工的切割位点编码序列衍生自FMDV。
据报道，FMDV 2A结构域的长度一般约为19个氨基酸(如LLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：56)；TLNFDLLKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：57)，Ryan等，J.Gen.Virol.72.2727-2732(1991))，然而，少至13个氨基酸残基的寡肽(如LKLAGDVESNPGP(SEQ ID NO：58))也能够介导在2A C末端上切割，切割方式类似于它在天然FMDV多蛋白加工中的作用。或者，本发明载体可编码其它2A-类似区域的氨基酸残基，如Donnelly等，2001，J.Gen.Virol.82：1027-1041所述，包括但不限于来自微小核糖核酸病毒、昆虫病毒、C型轮状病毒、锥虫重复序列或细菌海栖热袍菌(Thermatogamaritime)的2A样结构域。
已经研究了2A序列变异介导多蛋白的有效加工的能力(Donnelly等，2001)。特别考虑了这类变体，它们属于本发明范围。在一个实施方式中，2A序列是变异2A序列。
自身加工的切割位点和其编码载体的其它例子和描述参见US20050042721和US2005003482。
具体实施方式
本发明的其它实施方式见表3。
表3.具体实施方式.
  1  一种在细胞膜胞外表面上展示的重组抗体或其片段。
  2  如实施方式1所述的抗体或其片段，其包含使所述抗体靶向细胞表面的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列融合于所述抗体的重链或轻链。
  3  如实施方式2所述的抗体或其片段，其中所述氨基酸序列融合于所述抗体的重链或轻链C-末端。
  4  如实施方式2所述的抗体或其片段，其中所述氨基酸序列包含跨膜区或GPI锚定信号序列。
  5  如实施方式4所述的抗体或其片段，其中所述跨膜区衍生自血栓调节蛋白。
  6  如实施方式5所述的抗体或其片段，其中所述跨膜区包含SEQ ID NO：109。
  7  如实施方式4所述的抗体或其片段，其中所述GPI锚定物结构域衍生自DAF。
  8  如实施方式7所述的抗体或其片段，其中所述GPI锚定物结构域包含SEQ ID NO：60或61。
  9  如实施方式1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段来自选自下组的免疫球蛋白类型：IgA、IgE、IgM、IgD、IgY和IgG。
  10  如实施方式1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
  11  如实施方式1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段是人抗体。
  12  如实施方式1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含Fc区。
  13  如实施方式1所述的抗体或其片段，其中所述抗体或其片段包含重链可变区、轻链可变区，或重链和轻链可变区。
  14  一种多核苷酸，其编码实施方式1-13中任一项所述的抗体或其片段。
  15  一种载体，其包含实施方式14所述的多核苷酸序列。
  16  如实施方式15所述的载体，还包含聚腺苷酸化信号序列。
  17  如实施方式16所述的载体，其中所述聚腺苷酸化信号序列选自牛生长激素聚A信号序列或SV40聚A信号序列。
  18  如实施方式15所述的载体，还包含启动子。
  19  如实施方式18所述的载体，其中所述启动子是CMV或RSV启动子。
  20  如实施方式15所述的载体，还包含IRES或自身加工切割位点。
  21  如实施方式15所述的载体，其中所述载体能够复制。
  22  如实施方式21所述的载体，其中所述载体是病毒载体。
  23  如实施方式22所述的载体，其中所述病毒载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体或慢病毒载体。
  24  如实施方式22所述的载体，其中所述载体是腺病毒载体。
  25   一种细胞，其包含实施方式14所述的载体。
  26   如实施方式25所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
  27   如实施方式26所述的细胞，其中所述细胞选自NS0细胞、CHO细胞、Vero细胞、Sf-9细胞、COS7细胞或293细胞。
  28   如实施方式25所述的细胞，其中所述细胞是人细胞。
  29   一种含多核苷酸的载体的文库，所述多核苷酸编码在细胞膜胞外表面上展示的重组抗体或其片段。
  30   如实施方式29所述的文库，其中所述抗体或其片段包含Fc区变体。
  31   如实施方式29所述的文库，其中所述抗体或其片段包含轻链可变区序列的文库。
  32   如实施方式29所述的文库，其中所述抗体或其片段包含重链可变区序列的文库。
  33   如实施方式29所述的文库，其中所述抗体或其片段包含轻链可变区序列的文库和重链可变区序列的文库。
  34   如实施方式29、30、31、32或33所述的文库，其中所述抗体或其片段包含使所述抗体靶向细胞表面的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列融合于所述抗体的重链或轻链。
  35   如实施方式34所述的文库，其中所述氨基酸序列融合于所述抗体的重链或轻链的C-末端。
  36   如实施方式34所述的文库，其中所述氨基酸序列包含跨膜区或GPI锚定信号序列。
  37   如实施方式36所述的文库，其中所述跨膜区衍生自血栓调节蛋白。
  38   如实施方式37所述的文库，其中所述跨膜区包含SEQ ID NO：109。
  39   如实施方式36所述的文库，其中所述GPI锚定物结构域衍生自DAF。
  40   如实施方式39所述的文库，其中所述GPI锚定物结构域包含SEQ IDNO：60或61。
  41   如实施方式34所述的文库，其中所述载体能够复制。
  42   如实施方式41所述的文库，其中所述载体是病毒载体。
  43   如实施方式41所述的文库，其中所述病毒载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体或慢病毒载体。
  44   如实施方式42所述的文库，其中所述载体是腺病毒载体。
  45   一种细胞群体，其包含实施方式34所述的文库。
  46   如实施方式45所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
  47   如实施方式46所述的细胞，其中所述细胞选自NS0细胞、CHO细胞、Vero细胞、Sf-9细胞、COS7细胞或293细胞。
  48   一种分离具有所需特性的抗体或其片段的方法，所述方法包括：a)在能够在细胞表面上表达所述抗体的条件下培养实施方式45所述的细胞群体；b)对所述细胞群体进行选择，从而分离表达具有所需特性的抗体或
  其片段的至少一种细胞。
  49   如实施方式48所述的方法，还包括由所选细胞分离多核苷酸的步骤，其中所述多核苷酸编码具有所需特性的抗体或其片段。
  50   如实施方式48所述的方法，其中所述所需特性是与特定抗原结合。
  51   如实施方式48所述的方法，其中所述所需特性是与特定抗原的结合水平提高。
  52   如实施方式48所述的方法，其中所述所需特性是与特定抗原的结合水平降低。
  53   如实施方式48所述的方法，其中所述所需特性是与效应物分子结合。
  54   如实施方式48所述的方法，其中所述所需特性是与效应物分子结合水平降低。
  55   如实施方式48所述的方法，其中所述所需特性是与效应物分子结合水平提高。
  56   如实施方式53-55中任一项所述的方法，其中所述效应物分子选自Clq、FcγRI、FcγRII或FcγRIIIA。
  57   如实施方式48所述的方法，其中用标记试剂培育所述细胞并根据所述试剂与细胞的结合分选所述细胞，从而进行选择。
  58   一种产生在细胞表面上展示抗体或抗体片段的细胞文库的方法，所述方法包括：a)用含多核苷酸载体的文库感染细胞群体，所述多核苷酸编码在细胞膜外表面上展示的重组抗体或其片段；和b)在能够在细胞表面上表达抗体的条件下培养所述细胞群体。
  59   一种含有变异Fc区的抗体或其片段，其中所述抗体与效应物分子的亲和力降低。
  60   如实施方式59所述的抗体或其片段，其中所述效应物分子是FcγRIIIA。
  61   如实施方式59所述的抗体或其片段，其中所述抗体的效应物功能降低。
  62   如实施方式61所述的抗体或其片段，其中所述效应物功能是DCC。
  63   如实施方式59或61所述的抗体或其片段，其中所述变异Fc区包含至少一个氨基酸取代、插入或其组合，选自：W277T；K246R/L251E/T260R；InR234/235；InV235/236；InR236/237；InR237/238；InV238/239；InN238/239；InL238/239；InE238/239；InG238/239；InS239/240；InG240/241；InE240/241；InG240/241/I198T；InL238/239/P238Q；InE238/239/V348A；InS239/240/V266A；InR237/238/G236A。
  64   一种试剂盒，其包含：i)实施方式34所述的文库。
  65   如实施方式64所述的试剂盒，还包含细胞。
  66   如实施方式65所述的试剂盒，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
  67   如实施方式66所述的试剂盒，其中所述细胞选自NS0、CHO、Vero、Sf-9、COS7、293或其衍生物。
7.实施例
现在，参照以下实施例描述本发明。提供这些实施例的目的只是为了说明，本发明不应受限于这些实施例。
7.1实施例1.在哺乳动物细胞表面展示抗体
以下章节描述了在哺乳动物细胞表面上有效展示的抗体融合多肽的产生和鉴定。
用PCR产生编码含有跨膜区和/或GPI锚定信号的免疫球蛋白重链融合多肽的多核苷酸。除非另有说明，本文所述实验使用抗EphA2抗体12G3H11的重链作为例子。GPI锚定信号融合伙伴的代表性例子见表2。将编码各种融合蛋白的多核苷酸克隆到pABHL中，pABHL是包含具有以下操作性连接的序列元件的表达盒的抗体表达载体：5’端-CMV立即早期启动子-编码轻链信号肽的多核苷酸-编码轻链可变区的多核苷酸-编码κ轻链恒定区的多核苷酸-ECMVIRES-编码重链前导肽的多核苷酸(该序列包含独特的XbaI限制性核酸内切酶识别元件)-编码重链可变区的多核苷酸-编码IgG1重链恒定区的多核苷酸-独特的NotI限制性核酸内切酶识别元件-Mo-MuLV IRES-编码新霉素抗性多肽的多核苷酸-SV40聚A-3’端。pAB展示(pABDisplay)是pABHL的衍生物，它还包含操作性连接于重链恒定区基因3’端的编码DAF变异GPI锚定信号的多核苷酸；pAB展示载体编码免疫球蛋白重链-DAF vGPI锚定信号融合多肽。
用PCR由编码12G3H11抗EphA2抗体重链基因的质粒产生编码重链融合多肽的多核苷酸。PCR反应混合物含有一种正向引物UniXbaI(SEQ ID NO：)和多种反向引物。UniXbaI引物包含帮助克隆的XbaI限制性核酸内切酶的识别序列。设计融合伙伴特异性反向引物组，使其包含编码与重链位于同一阅读框中的融合伙伴(如跨膜区)的核苷酸残基，各组包括多种部分重叠的约有70个核苷酸的反向引物。各组的第一个反向引物的3’端包含约20个核苷酸残基，其退火到编码重链和融合伙伴之间的连接的重链部分的DNA序列上。第二和随后的反向引物3’端所含的约20个残基与前一反向引物5’端的约20个残基相同。最后一个反向引物包含编码融合伙伴C末端的核苷酸残基和NotI限制性核酸内切酶的识别序列(用于随后的克隆步骤)。用于产生编码抗-Eph2重链的多核苷酸序列的三种反向引物序列见表4，其中所述抗-Eph2重链与衰变加速因子的变异GPI锚定信号(DAF vGPI)融合，这是上述引物设计原理的例子。
表4：产生细胞表面展示融合蛋白的引物
Figure A20068004746300691
用XbaI和Not I消化预期大小的PCR产物，并连接到用相似方法消化的pABHL载体中，以便在哺乳动物细胞中表达。按照生产商方案用该连接产物转化DH10B感受态大肠杆菌(E.coli)细胞。可采用本领域已知的各种方法(如DNA制剂的限制性消化、测试序列的诊断性PCR扩增)鉴定含有正确插入物的pABHL集落；还可采用双脱氧测序反应(如BigDye
Figure A20068004746300692
Terminator v3.0循环测序即用型反应试剂盒，ABI)测序，从而进一步确认其身份。按照生产商的方案用凯杰(QIAGEN)质粒小抽和大抽试剂盒由所选克隆制备质粒DNA。
用编码经测试的抗EphA2抗体融合多肽的载体瞬时转染HEK-293T细胞。培养转染细胞约24-48小时，以便表达抗体。
用FITC偶联的抗人IgG抗体对转染细胞染色，并按照标准方法用流式细胞仪分析，以检测抗EphA2融合抗体的细胞表面展示。图2(左侧)显示了用表达DAF vGPI、CM GPI或血栓调节蛋白TM融合的抗EphA2抗体的细胞获得的流式细胞图。
用生物素化EphA2-Fc融合多肽培育细胞，以确定细胞表面展示的抗-EphA2融合抗体的抗原结合特性。用FITC偶联的抗-生物素抗体进一步染色细胞，并按照标准方法用流式细胞仪分析，以便观察结合于细胞表面的EphA2-Fc融合蛋白。图2(右侧)显示了用表达融合于抗EphA2抗体重链C末端的DAF vGPI、CM GPI或血栓调节蛋白TM的细胞获得的流式细胞图。
实施例2.Fc变体文库构建
以下实施例描述了产生含有融合于DAF vGPI的抗EphA2抗体的Fc变体的文库。构建了两种不同文库：Fc取代文库(SL-Fc)和Fc插入文库(IL-Fc)。
19种其它天然产生的氨基酸中的任何一种取代A231、P232、E233、L242、K246、T250、L251、P257、V259、T260、C261、V273、K274、F275、W277、G281或V282的氨基酸。例如，所述取代文库包含的Fc区中用选自G、L、M、F、W、K、Q、E、S、P、V、I、C、Y、H、R、N、D或T的氨基酸残基取代位置231上的A残基。用标准命名法标示单个取代。例如，在残基231上用甘氨酸(G)取代丙氨酸(A)的Fc变体标为A231G。
用简并引物通过PCR反应产生含有SL-Fc文库的Fc变体。产生SL-Fc的引物见表5。用不同的PCR反应组产生编码代表Fc取代文库中各靶定氨基酸残基的所有可能取代的重链的多核苷酸。例如，用以下三个PCR反应产生编码残基A231的取代突变体的多核苷酸：1)利用231A残基特异性引物和MDAD-20通用引物扩增DAF vGPI融合的抗-EphA2重链的Fc区。2)用UniXbaI通用和231A/232P/233Erev残基特异性引物扩增DAF vGPI融合的抗EphA2重链的Fd区。3)采用通用引物UniXbaI和MDAD-20通过重叠PCR连接前两个反应产生的PCR片段。由反应3分离代表残基A231的所有可能取代突变的正确大小的PCR片段，用XbaI和NotI限制性核酸内切酶消化并定量。通过混合等摩尔量的代表各靶定残基的PCR片段和将该混合物连接到含有12G3H11抗EphA2抗体轻链的pAB展示载体中产生SL-Fc文库。
表5.用于产生Fc取代文库的引物
  UniXbaI.   GCT TGA GGT CTA GAC ATA TAT ATG GGTGAC AAT GAC ATC CAC TTT GCC TTT CTCTCC ACA GGT GTC CAC TCC(SEQ ID NO：10)
  MDAD-20   AAC CTC TAC AAA TGT GGT ATG GCT(SEQ IDNO：11)
  231Afor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA NNS CCT GAACTC CTG GGG GGA(SEQ ID NO：12)
  232Pfor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA NNS GAACTC CTG GGG GGACCG(SEQ ID NO：13)
  233Efor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT NNSCTC CTG GGG GGA CCG TCA(SEQ ID NO：14)
  231A/232P/233Erev   TGG GCA CGG TGG GCA TGT(SEQ ID NO：15)
  242Lfor   GGG GGA CCG TCA GTC TTC NNS TTC CCCCCA AAA CCC AAG(SEQ ID NO：16)
  246Kfor   GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC CCCCCA NNS CCC AAG GAC ACC CTC ATG(SEQID NO：17)
  2421/246Krev   GAA GAC TGA CGG TCC CCC(SEQ ID NO：18)
  250Tfor   CCC CCA AAA CCC AAG GAC NNS CTC ATG
  ATC TCC CGG ACC(SEQ ID NO：19)
  251Lfor   CCC CCA AAA CCC AAG GAC ACC NNS ATGATC TCC CGG ACC CCT(SEQ ID NO：20)
  250T/251Lrev   GTC CTT GGG TTT TGG GGG(SEQ ID NO：21)
  257Pfor   CTC ATG ATC TCC CGG ACC NNS GAG GTCACA TGC GTG GTG(SEQ ID NO：22)
  259Vfor   CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG NNSACA TGC GTG GTG GTG GAC(SEQ ID NO：23)
  260Tfor   CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTCNNS TGC GTG GTG GTG GAC GTG(SEQ IDNO：24)
  261Cfor   CTC ATG ATC TCC CGG ACC CCT GAG GTCACA NNS GTG GTG GTG GAC GTG AGC(SEQID NO：25)
  257P/259V/260T/261Crev   GGT CCG GGA GAT CAT GAG(SEQ ID NO：26)
  273Vfor   AGC CAC GAA GAC CCT GAG NNS AAG TTCAAC TGG TAC GTG(SEQ ID NO：27)
  274Kfor   AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC NNS TTCAAC TGG TAC GTG GAC(SEQ ID NO：28)
  275Ffor   AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG NNSAAC TGG TAC GTG GAC GGC(SEQ ID NO：29)
  277Wfor   AGC CAC GAA GAC CCT GAG GTC AAG TTCAAC NNS TAC GTG GAC GGC GTG GAG(SEQID NO：30)
  273V/274K/275F/277Wrev   CTC AGG GTC TTC GTG GCT(SEQ ID NO：31)
  281Gfor   TTC AAC TGG TAC GTG GAC NNS GTG GAGGTG CAT AAT GCC(SEQ ID NO：32)
  282Vfor   TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC NNS GAGGTG CAT AAT GCC AAG(SEQ ID NO：33)
  284Vfor   TTC AAC TGG TAC GTG GAC GGC GTG GAGNNS CAT AAT GCC AAG ACA AAG(SEQ IDNO：34)
  281G/282V/284Vrev   GTC CAC GTA CCA GTT GAA(SEQ ID NO：35)
Fc插入文库(IL-Fc)包含在氨基酸残基230和231、231和232、232和233、233和234、234和235、235和236、236和237、237和238、238和239、239和240或240和241之间插入一个氨基酸残基的变异Fc区，其中插入残基可包含二十种天然产生氨基酸中的任何一种。在本文中，单个插入可表示为“In”后接插入氨基酸残基的单字母代码和恰好侧接该插入物的残基位置。例如，“InG231/232”指在残基231和232之间插入甘氨酸的变体Fc。
用简并引物通过PCR反应产生含有IL-Fc文库的Fc变体。产生IL-Fc的引物见表6。用不同的PCR反应组产生编码代表Fc插入文库中各靶定位置上所有可能的氨基酸插入的重链的多核苷酸。例如，用以下三个PCR反应产生编码位置230/231的插入突变体的多核苷酸：1)利用位置特异性引物230/231Infor和通用引物MDAD-20扩增DAF vGPI融合的抗-EphA2重链的Fc区。2)利用通用引物UniXbaI和Inrev扩增DAF vGPI融合的抗-EphA2重链的Fd区。3)利用通用引物UniXbaI和MDAD-20通过重叠PCR连接前两个反应产生的PCR片段。从反应3中分离代表位置230/231上所有可能插入突变的正确大小的PCR片段，用XbaI和NotI限制性核酸内切酶消化并定量。通过混合等摩尔量的代表各靶定位置的PCR片段和将该混合物连接到含有12G3H11抗EphA2抗体轻链的pAB展示载体中产生IL-Fc文库。
表6.用于产生Fc插入文库的引物
  230/231Infor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA NNS GCA CCT GAA CTCCTG GGG(SEQ ID NO：36)
  231/232Infor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA NNS CCT GAA CTCCTG GGG GGA(SEQ ID NO：37)
  232/233Infor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT NNS GAA CTCCTG GGG GGA CCG(SEQ ID NO：38)
  233/234Infor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA NNS CTCCTG GGG GGA CCG TCA(SEQ ID NO：39)
  234/235Infor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC NNSCTG GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC(SEQ ID NO：40)
  235/236Infor   ACA TGC CCA CCG TGC CCA GCA CCT GAA CTC CTGNNS GGG GGA CCG TCA GTC TTC CTC TTC(SEQ IDNO：41)
  236/237Infor   GCA CCT GAA CTC CTG GGG NNS GGA CCG TCA GTCTTC CTC(SEQ ID NO：42)
  237/238Infor   GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA NNS CCG TCA GTCTTC CTC TTC(SEQ ID NO：43)
  238/239Infor   GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG NNS TCA GTCTTC CTC TTC CCC(SEQ ID NO：44)
  239/240Infor   GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA NNS GTCTTC CTC TTC CCC CCA(SEQ ID NO：45)
  240/241Infor   GCA CCT GAA CTC CTG GGG GGA CCG TCA GTC NNSTTC CTC TTC CCC CCA AAA(SEQ ID NO：46)
  Inrev   CCC CAG GAG TTC AGG TGC(SEQ ID NO：47)
7.3实施例3.链霉亲和素融合的FcγRIIIA试剂
采用引物对SA1/SA2(见表7)由阿维丁链霉菌(Streptomyces avedinii)模板基因组DNA PCR扩增编码链霉亲和素的多核苷酸S。采用引物对A1/A2(见表7)由人骨髓cDNA文库(克隆泰克公司(Clontech))模板PCR扩增编码FcγRIIIA胞外结构域的多核苷酸F。利用引物A2和SA1的部分序列互补性的重叠PCR产生编码FcγRIIIA-链霉亲和素融合多肽的多核苷酸FA。将NcoI/NheI消化的多核苷酸FA克隆到pET-28a(诺基公司)表达载体中，按照生产商说明书在细菌中表达FcγRIIIA-链霉亲和素融合多肽。回收包含体中的重组FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白，如Gao等(1997，Proc Natl Acad Sci USA.94：11777-82)所述再折叠。接着，按照生产商说明书在免疫生物素柱(皮尔斯公司(PIERCE))上纯化再折叠的融合蛋白。FcγRIIIA-链霉亲和素制剂的终浓度约为2.4mg/ml。
表7.用于扩增链霉亲和素和FcγRIIIA胞外结构域的PCR引物
 A1引物  AAGCTTCGGTCCGCCACCATGGCAACTGAAGATCTCCCAAAG(SEQ ID NO：51)
 A2引物  GTCTGCCGAACCGCTGCCTGCCAAACCTTGAGTGATGGT(SEQ ID NO：52)
 SA1引物  GGCAGCGGTTCGGCAGACCCCTCCAAGGAC(SEQ ID NO：53)
 SA2引物  CAGGGGCTAGCTTACTGCTGAACGGCGTC GAGCGG(SEQ ID NO：54)
7.4实施例4.选择FcγRIIIA结合特性改变的Fc变体
进行对照实验，以优化用LipofectamineTM 2000(英杰公司(Invitrogen))进行瞬时转染的条件。用不同量(如0.05、0.1、0.5、1.0、2.0、4和10μg)的表达融合于DAF vGPI信号序列的抗EphA2抗体的pAB展示载体转染HEK-293细胞。通过以下方法确定抗EphA2抗体-DAF vGPI融合多肽的表达水平，使转染细胞接触FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白，然后用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色。随后用流式细胞仪分析细胞。在每一种载体检测量上，都观察到可重现的荧光强度改变。质粒量为4μg以上时观察到最大改变值。图3显示了代表性流式细胞图。
进行对照实验，以优化细胞表面FcγRIIIA结合试验的条件。用10μg表达DAF GPI信号融合的抗EphA2抗体的pAB展示载体转染HEK-293细胞。使不同的转染细胞等份接触1∶500、1∶1000、1∶2000、1∶3000、1∶4000或1∶5000倍稀释的FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白，然后用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色。随后用流式细胞仪分析细胞。虽然所用的每一种FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白浓度均导致荧光强度改变，但FcγRIIIA-SA稀释度超过1∶1000时这种改变较不显著。代表性流式细胞图见图4。
瞬时转染Fc变体文库：在转染前一天将12ml生长培养基中的HEK-293细胞(6×106细胞)接种于100×20mm组织培养板。在转染当天，在OPTI-MEM培养基中将0.5-10μg Fc突变文库质粒与30μl Lipofectamine 2000混合，并加入HEK-293细胞的培养基中。转染后37℃培育48小时后，采用AccutaseTM酶细胞脱附培养基(开米康公司(Chemicon))使转染细胞脱附，用冰冷的FACS缓冲液(PBS/10％FBS)洗涤。将细胞重悬于200μl含有1∶500-1∶5000稀释的重组FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白的FACS缓冲液，室温培育20分钟。再次用FACS缓冲液洗涤细胞，并按照标准方法用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体在室温下染色20分钟。洗涤细胞，以去除任何未结合的抗链霉亲和素抗体，并以2×106/ml的密度重悬。
分离表达对FcγRIIIA亲和力改变的Fc变体的细胞：用流式细胞仪分析重悬细胞。荧光染色图的代表性例子见图5A。可通过FACS分离荧光强度非常低或非常高的细胞。适用于分选染色水平很低的细胞的门的例子见图5A。用流式细胞仪再次分析分离细胞，以检查分选质量(图5B)。
回收瞬时转染的文库DNA：离心收集分选细胞，重悬于0.4ml细胞裂解溶液(0.6％SDS和10mM EDTA)。室温培育20分钟后，将100μl 5M NaCl加入细胞裂解物中。离心澄清细胞裂解物，用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取上清液。用乙醇沉淀水性组分中的DNA。用一半回收的DNA进行电穿孔，从而转化DH10B大肠杆菌(E.coli)细胞，然后接种到含有100μg/ml羧苄西林的LB琼脂平板上。过夜培养后，从琼脂平板上刮下所有细菌细胞，用于提取质粒DNA。
额外选择轮次：可以再对回收的质粒DNA进行其它轮次的上述选择方法(如总计三轮)，以便进一步富集编码FcγRIIIA结合亲和力改变的Fc变体的克隆。
7.5实施例5.分离的Fc变体的初始鉴定
最初，如下所述鉴定采用实施例4所述选择方法分离的Fc变体。约3轮选择后，用由分选细胞群体回收的DNA转化DH10B大肠杆菌(E.coli)细胞，选择单个细菌克隆，按照标准方法分离质粒DNA。
用分离的质粒DNA转染HEK-293细胞。用FITC偶联的抗人IgG(H+L)抗体染色转染细胞的等份，并用流式细胞仪分析以确定Fc变体在细胞表面的表达水平。染色图的例子见图6A、B和C。
也测定了分离的Fc变体的FcγRIIIA结合亲和力。将单独的转染细胞等份与重组FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白一起培育，然后用FITC偶联的抗链霉亲和素抗体染色，如实施例3所述。用流式细胞仪确定细胞的染色图。染色图的例子见图6D、E和F。
选择染色图表明细胞表面高表达和FcγRIIIA亲和力低的Fc变体克隆进行进一步鉴定。这类克隆的一个例子是图6C和F所示的Fc变体InR236/237。
7.6实施例6.可溶性Fc变体的哺乳动物表达
为了表达可溶性Fc变体，采用UniXbaI和BackNotI(BackNotI：TCAATGAATTCGCGGCCGCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGC(SEQID NO：55))引物通过PCR产生编码不含DAF vGPI信号序列的Fc变体的寡核苷酸。用XbaI和Not I限制性核酸内切酶消化预期大小的PCR产物，并将其连接到XbaI NotI切割的pABHL表达载体中，该载体含有12G3H11抗EphA2抗体轻链。可以采用本领域已知的各种方法(如载体DNA制剂的限制性消化、载体序列的诊断性PCR扩增)鉴定含有正确表达构建物的细菌克隆。还可采用双脱氧测序反应(如BigDye
Figure A20068004746300751
Terminator v3.0循环测序即用型反应试剂盒，ABI)测序，从而进一步确认其身份。按照生产商的方案用凯杰(QIAGEN)质粒小抽和大抽试剂盒由所选克隆制备质粒DNA。
采用LipofectamineTM 2000(英杰公司)转染试剂用含有编码可溶性Fc变体的多核苷酸的pABHL载体转染HEK-293细胞。培育转染细胞9天，以产生Fc变体。在培育期的第3、6和9天收集条件培养基。用预制蛋白A柱(GE健康护理公司(GE Healthcare))纯化Fc变体。用低pH缓冲液洗脱柱上结合的Fc变体，中和，并用PBS透析。通过280nm处的溶液光密度计算纯化Fc变体的浓度。
7.6实施例7.Fc结合试验
用ELISA实验测定上述方法分离的Fc变体与一种或多种分离Fc受体和/或Fc配体(如FcγRIIIA、Clq)的结合亲和力。按照标准方法进行ELISA实验。按照生产商说明书使用市售试剂。
用蛋白A/G(皮尔斯公司)溶液(0.25μg/ml)包被微量滴定板，4℃培育过夜。用PBS缓冲液配制的4％脱脂奶(封闭缓冲液)37℃封闭其余结合位点1小时。将约25-50μl的对照、野生型或Fc变异突变抗体溶液加入各孔中，37℃培育1小时。洗涤各孔后，加入FcγRIIIA-链霉亲和素融合蛋白(用1％BSA以1∶1000稀释)。37℃培育1小时，然后洗涤，并用生物素偶联的HRP培育30分钟。加入30μl四甲基联苯胺(TMB)底物(皮尔斯公司)，然后用30μl 0.2M H2SO4中和，从而进行检测。读出450nm吸光度。可测定IC50值，并标准化至同时(如同一微量滴定板中)测定的野生型抗体对照的测定值。野生型和数种Fc变体的结合曲线的例子见图7。
4℃培育用蛋白A/G(皮尔斯公司)溶液(0.25μg/ml)包被的微量滴定板过夜。用封闭缓冲液于37℃封闭其余结合位点1小时37℃。将约25-50μl/孔的野生型或Fc变异突变体抗体溶液加入各孔，37℃培育1小时。洗涤各孔后，加入约100μl 2μg/ml人Clq(奎德公司(Quidel)，CA)，37℃培育1小时。洗涤各孔后，用绵羊抗人Clq抗体(BioDesign)37℃培育它们1小时。再次洗涤后，用辣根过氧化物酶偶联的驴抗-绵羊IgG(斯罗泰公司(Serotec)，NC)室温培育各孔1小时。用TMB底物(KPL，MD)检测辣根过氧化物酶活性。用0.2M H2SO4终止该反应。读出450nm的吸光度。测定IC50值，并可标准化至同时(如同一微量滴定板中)测定的野生型抗体对照的测定值。野生型和数种Fc变体的结合曲线的例子见图8。
数种Fc变体与FcγRIIIA-链霉亲和素和Clq的代表性结合曲线分别参见图7和8。在进行的各个实验中，抗-EphA2野生型抗体和IgG4同种型对照抗体分别用作阳性和阴性对照。与野生型抗体相比，测定的各Fc变体与FcγRIIIA和Clq的结合水平降低。表8小结了这些和其它Fc变体的数据。
实施例8.细胞表面受体结合试验
测定上述方法分离的可溶性Fc变体与表达一种或多种Fc受体(如FcγRIIIA、FcγRII)的细胞表面的结合亲和力。
利用两种细胞类型，细胞表面主要表达FcγRII并少量表达FcγRI的THP-1细胞，和几乎只表达FcγRIIIA的NK细胞。采用早期传代的THP-1细胞，用米拜公司(Miltenyi Biotec)的NK细胞分离试剂盒分离健康供体的NK细胞。在Fc变体结合于人NK细胞表面时(FcγRIIIA)，将不同浓度(如10μg/ml-1μg/ml)的～10μl Fc变体加入细胞中，4℃培育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，然后用FITC偶联的山羊抗人IgG(H+L)Fab(皮尔斯公司)4℃染色30分钟。然后洗涤细胞，用Guava EasyCyte细胞仪分析。Fc变体结合于THP-1细胞表面时(FcγRI和FcγRII)，将不同浓度(如10μg/ml-1μg/ml)的～10μl Fc变体加入细胞中，4℃培育30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞，然后用FITC偶联的山羊抗人IgG(H+L)Fab(皮尔斯公司)4℃染色30分钟。然后洗涤细胞，用GuavaEasyCyte细胞仪分析。
数种Fc变体结合的THP-1和NK细胞的百分数分别参见图9和10。在进行的各个实验中，抗-EphA2野生型抗体和IgG4同种型对照抗体分别用作阳性和阴性对照。与野生型抗体相比，测定的各Fc变体与THP-1和NK细胞上存在的细胞表面受体的结合水平降低。表8小结了这些和其它Fc变体的数据。
实施例9：抗原结合
可采用本领域熟知方法测定抗原结合水平。例如，可按照标准方法采用基于ELISA的实验。简要说，用蛋白A/G(皮尔斯公司)溶液(0.25μg/ml)包被微量滴定板，4℃培育过夜。然后用PBS/0.1％吐温-20洗涤该平板，用封闭缓冲液封闭其余结合位点。将50μl浓度为～5000ng/ml至～5ng/ml的测试抗体加入各孔中，37℃培育～60分钟。将～50μl适当稀释的生物素偶联EphA2蛋白(如Dall’Acqua，F.M.等，J Immunol，177：1129-1138(2006)所述的EphA2-Fc融合物)加入各孔中，37℃培育～60分钟，然后洗涤。将辣根过氧化物酶偶联的链霉亲和素加入各孔中，按照生产商说明书37℃培育30分钟。加入30μl四甲基联苯胺(TMB)底物(皮尔斯公司)，然后用30μl 0.2M H2SO4中和，从而进行检测。读出450nm吸光度。
用ELISA检测Fc受体结合和/或ADCC活性降低的数种Fc变体的配体结合活性。在各个实验中，野生型抗EphA2抗体和两种特异性不相关的抗体(维他辛(Vitaxin)和抗-HMBG1)分别用作阳性和阴性对照。通过ELISA实验用生物素化的人EphA2蛋白检测抗体。所有检测的Fc变体与人EphA2的结合亲和力均类似于野生型抗体；标出了IC50值(图11)。
实施例10.抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)实验
用4小时非放射性乳酸脱氢酶(LDH)释放试验(普洛麦格公司(PromegaCorporation)，威斯康星州麦迪逊)测定抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。简要说，将表达EphA2的A549靶细胞分配到96孔U形底平板中(1×104/50μl)，用连续稀释的抗体(50μl)37℃预培育20分钟。然后加入人效应物细胞(100μl)，效应物细胞与靶细胞的比例为50∶1和25∶1。采用淋巴细胞分离培养基(MP生物医学公司(MP Biomedicals)，加利福尼亚州欧文(Irvine，CA))纯化健康人供体的外周血单核细胞(PBMC)，重悬于培养基(RPMI-1640 10％ FBS-2mM L-Glu-Pen/Strep，5ng/ml IL-2)，37℃培育过夜，将其用作效应物细胞。37℃培育4小时后，离心平板，用30分钟偶联的酶实验测定释放到细胞上清液中的LDH，以便分析细胞死亡情况。按照下式计算特异性裂解的百分数：％特异性裂解＝100×(EX-ESpon-TSpon)/(Tmax-Tspon)，其中EX代表实验孔的释放值，Espon是单独效应物细胞的自发性释放值，Tspon是单独靶细胞的自发性释放值，Tmax是裂解靶细胞的最大释放值。
图12显示了用数种分离Fc变体进行的代表性ADCC实验的细胞毒曲线。该实验中也包括阳性对照野生型抗EphA2抗体和阴性对照抗-CD4抗体(R347)。表达EphA2、但不表达CD4的A549细胞用作靶标。由健康人供体纯化效应物细胞。采用两种不同的靶细胞与效应物细胞之比(50∶1和25∶1)和0.1-10000ng/孔的抗体浓度进行这些实验。在这两种靶细胞与效应物之比的情况下，各Fc变体和阴性对照相对于背景活性很低或无活性，而野生型抗体能介导靶细胞的有效裂解。表8小结了许多Fc变体的结果8。
表8.Fc变体的结合亲和力和ADCC活性
Fc突变体            FcγRIIIA    Clq结合  FcγRI&II  ADCC活性
                    结合                  结合
野生型              0.15μg/ml
W277T               0.5μg/ml    ND       ND         ND
K246R/L251E/T260R   ＞20μg/ml   低2倍    低9倍      未诱导
InR236/237          ＞20μg/ml   低2倍    低20倍     未诱导
InN238/239          ＞20μg/ml   低5倍    低20倍     未诱导
InE240/241          4.927μg/ml  ND       ND
InV238/239          ＞20μg/ml   低2倍    低5倍      未诱导
InG240/241+I198T    ＞20μg/ml   低4倍    低20倍     未诱导
InR234/235          ＞20μg/ml   低3倍    低20倍     未诱导
InL238/239+P238Q    ＞20μg/ml   低4倍    低9倍      未诱导
InE238/239+V348A    ＞20μg/ml   低6倍    低6倍      未诱导
InS239/240+V266A    ＞20μg/ml   低3倍    低27倍     未诱导
InR237/238+G236A    ＞20μg/ml   低5倍    低27倍     未诱导
实施例11：cDNA文库合成：
首先，由12位健康供体的外周血单核细胞(PBMC)分离总RNA，例如采用凯杰(QIAgen)Rneasy试剂盒分离。此外，通过合并数种来源(生物科学公司(Bioscience)，目录号636170，BD生物科学公司(BD Bioscience)目录号6594-1，奥利基技术和生物链研究公司(Origene technologies and BiochainInstitute，Inc)，目录号M1234246)的材料获得mRNA库。按照生产商说明书采用Superscript III RT试剂盒(英杰公司)合成人cDNA文库。
实施例12：pENAB展示载体构建：
用XbaI和SfoI消化pENTRTM2B(英杰公司)，以去除ccdB基因。将含有抗体表达盒的SpeI和BSTZ17I消化的12G3H11 pAB展示载体较大片段克隆到XbaI SfoI消化的pENTRTM2B载体中。得到的载体(称为pENPAB展示)包含侧接attL1和attL2重组信号的12G3H11抗-EphA2-DAF vGPI融合抗体表达盒。
实施例13：pENAB展示重链文库构建：
通过PCR由人cDNA文库扩增重排的VH节段(参见实施例11)。所用引物见表9。按照生产商说明，在含有40ng pENAB展示载体、10pmol Hcldf-正向引物和84830-D10-反向引物以及Pfu超级Taq聚合酶(司查塔基公司(Stratagene)，目录号600380)的100μl体系中进行扩增编码信号序列的多核苷酸的PCR反应。首先将该PCR反应加热到95℃5分钟，接着进行25个下述循环：95℃30秒、55℃30秒、68℃45秒，68℃保温7分钟。利用凯杰(QIAgen)PCR纯化试剂盒(目录号28106)纯化PCR产物。按照生产商说明书用Taq DNA聚合酶(英杰公司，目录号18038-018)、50pmol Medieu-VH1-15以及50pmol合并的(pooled)反向-Medieu-JH1、JH2和JH3引物，由cDNA文库分别扩增重链可变区。变性5分钟后，用8个下述循环扩增模板：95℃30秒、52℃60秒和72℃60秒；用32个下述循环进一步扩增模板：95℃30秒、62℃30秒、72℃60秒，72℃保温7分钟。用琼脂糖凝胶纯化VH片段，采用正向-HcldF和合并的反向-medieu-JH1、JH2和JH3引物混合物对VH片段和信号序列进行重叠PCR；用Taq DNA聚合酶、20ng各模板和50pmol引物进行PCR反应。变性5分钟后，在不使用引物的情况下以8个下述循环扩增模板：95℃30秒、55℃ 45秒和68℃ 60秒；在使用引物的情况下以25个下述循环进一步扩增模板：95℃ 30秒、55℃ 30秒、68℃ 60秒，72℃保温7分钟。如前所述凝胶纯化PCR产物。混合等量的各个产物，并用XbaI和SalI限制性核酸内切酶(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs))消化，克隆到pENPAB展示载体中产生重链(IgG1)文库。对96个克隆测序，以确定该文库的多样性程度。
表9.用于产生人天然抗体文库的引物
人V重链特异性正向引物
Medieu-VH1  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGGTKCAGCTGGTGCAGTCTGG(
            SEQ ID NO：63)
Medieu-VH2  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGG(
            SEQ ID NO：64)
Medieu-VH3  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCSAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGG(
            SEQ ID NO：65)
Medieu-VH4  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCARATGCAGCTGGTGCAGTCTGG(
            SEQ ID NO：66)
Medieu-VH5  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG(
            SEQ ID NO：67)
Medieu-VH6  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG(
            SEQ ID NO：68)
Medieu-VH7  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGARGTGCAGCTGGTGGAGTCT(SE
            Q ID NO：69)
Medieu-VH8  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG(
            SEQ ID NO：70)
Medieu-VH9  GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGG(
            SEQ ID NO：71)
Medieu-VH10 GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGWCYGG
            (SEQ ID NO：72)
Medieu-VH11 GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGSTGCAGCTGCAGGAGTCSGG(
            SEQ ID NO：73)
Medieu-VH12 GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG(
            SEQ ID NO：74)
Medieu-VH13 GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCGARGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG(
            SEQ ID NO：75)
Medieu-VH14 GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG(
            SEQ ID NO：76)
Medieu-VH15 GCCTTTCTCTCCACAGGTGTACACTCCCAGGTGCAGCTGGTGCAATCTGG(
            SEQ ID NO：77)
人V重链特异性反向引物
Medieu-JH1  GAAGACGGATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACRGTGACCAGGGT(S
            EQ ID NO：78)
Medieu-JH2  GAAGACGGATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACCATTGT(S
            EQ ID NO：79)
Medieu-JH3  GAAGACGGATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAGGAGACGGTGACCGTGGT(S
            EQ ID NO：80)
人Vκ特异性正向引物
Medieu-VK1  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTRACATCCAGATGACCCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：81)
Medieu-VK2  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGMCATCCRGWTGACCCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：82)
Medieu-VK3  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGTCATCTGGATGACCCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：83)
Medieu-VK4  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGATATTGTGATGACCCAGACTCC(SEQ
            ID NO：84)
Medieu-VK5  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGATRTTGTGATGACWCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：85)
Medieu-VK6  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGAAATTGTGTTGACRCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：86)
Medieu-VK7  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGAAATAGTGATGACGCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：87)
Medieu-VK8  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGAAATTGTAATGACACAGTCTCC(SEQ
            ID NO：88)
Medieu-VK9  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGACATCGTGATGACCCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：89)
Medieu-VK10 CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGAAACGACACTCACGCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：90)
Medieu-VK11 CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC(SEQ
            ID NO：91)
人Vκ特异性反向引物
Cκ         GCATGCTCGACATCGATTCACTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTC(SEQ ID
            NO：92)
人Vλ特异性正向引物
Medieu-V？1   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTCAGTCTGTGCTGACTCAGCCACC(SEQ
              ID NO：93)
Medieu-V？2   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTCAGTCTGTGYTGACGCAGCCGCC(SEQ
              ID NO：94)
Medieu-V？3   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTCAGTCTGCCCTGACTCAGCCT(SEQ ID
              NO：95)
Medieu-V？4   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTTCCTATGWGCTGACWCAGCCA(SEQ
              ID NO：96)
Medieu-V？5   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTTCCTATGAGCTGACACAGCTACC(SEQ
              ID NO：97)
Medieu-V？6   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTTCTTCTGAGCTGACTCAGGACC(SEQ
              ID NO：98)
Medieu-V？7   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTTCCTATGAGCTGATGCAGCCAC(SEQ
              ID NO：99)
Medieu-V？8   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTCAGCYTGTGCTGACTCAATC(SEQ ID
              NO：100)
Medieu-V？9   CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTCWGSCTGTGCTGACTCAGCC(SEQ ID
              NO：101)
Medieu-V？10  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCCA(SEQ
              ID NO：102)
Medieu-V？11  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTCAGRCTGTGGTGACYCAGGAGCC(SEQ
              ID NO：103)
Medieu-V？12  CTCTGGCTCCCCGGGGCGCGCTGTCAGGCAGGGCTGACTCAGCCACC(SEQ
              ID NO：104)
人Vλ特异性反向引物
Cλ1    GCATGCTCGACATCGATTCACTATGAACATTCTGTAGGGGCCACTG(SEQ
        ID NO：105)
Cλ2    GCATGCTCGACATCGATTCACTAAGAGCATTCTGCAGGGGCCACTG(SEQ
        ID NO：106)
V重链信号序列特异性引物
HcldF        CCATGGGATGGAGCTGTATCA(SEQ ID NO：107)
84830-D10    GGAGTGTACACCTGTGGAGAGAAAGGC(SEQ ID NO：108)
实施例14：pENAB展示轻链文库构建：
通过PCR由人cDNA文库扩增重排的抗体κ和λ轻链节段(参见实施例11)。所用引物见表9。使12种VHλ正向引物与两种λ反向引物配对，以扩增抗体λ轻链可变区和恒定区。相似地，使11种VHκ正向引物与κ反向引物配对，以扩增抗体κ轻链可变区和恒定区。采用Pfu Ultra(司查塔基公司)且按照生产商说明书，利用10pmol各引物分别进行各反应。最初变性3分钟后，用30个下述循环的PCR反应进行扩增：95℃30秒、52℃30秒、68℃90秒，68℃保温10分钟。收集PCR产物，用琼脂糖凝胶纯化，用BssHII和ClaI限制性核酸内切酶进行消化。用相似方法消化的pENAB展示载体，对产物进行T4DNA连接、酚-氯仿提取、沉淀、并转化到DH10B电感受态细胞中。对96个克隆测序，以确定该文库的多样性程度。
实施例15：pENAB展示重链-轻链文库的构建
为了分别将重链和轻链文库中的多种抗体重链和轻链合并到一个重链-轻链文库中，用Xba I和Not I限制性核酸内切酶消化pENPAB展示轻链文库。用相似方法消化pENPAB展示重链文库，以释放不同的重链编码片段，然后用琼脂糖凝胶对其进行纯化，并连接到XbaI NotI消化的pENAB展示轻链文库中。
实施例16：腺病毒表达载体的构建
采用Gateway
Figure A20068004746300831
系统，按照生产商说明书通过LR反应将pENAB展示VH-VL文库的抗体表达盒重组到pAd/PL-DEST(英杰公司，目录号V494-20)载体中。对该反应进行酚-氯仿提取、沉淀，并转化到DH10B电感受态细胞中。对得到的pAd/PL-VH-VL表达载体进行质粒DNA分离后，用Pac I进行消化，以暴露左侧和右侧病毒ITR并去除细菌序列。对ITR片段进行酚-氯仿提取、沉淀，并用Lipofectamine 2000(英杰公司)转染到HEK-293A细胞中。观察到细胞病理效应后收获该病毒。用BD AdenoX快速效价试剂盒(贝克顿迪金森公司(Becton Dickinson)，CA)测定病毒效价。
pAd/PL-DEST基于一种无法复制、仅可在反式提供E1蛋白的细胞系(如293A细胞)中增殖的腺病毒。上述基于pAd/PL-DEST的文库非常适合采用条件性表达E1蛋白、因此条件性支持病毒复制的细胞系进行筛选。可通过用包含诱导性哺乳动物启动子(如克隆泰克公司的四环素诱导性启动子)的E1蛋白表达构建物稳定转染合适的细胞来产生这类细胞系。可以如下述实施例所述，进行筛选方法本身。在1)文库感染、2)培育感染细胞以便在细胞表面展示文库编码的抗体、3)选择表达具有所需特性的抗体的细胞的过程中，应该防止E1蛋白表达。应在含有编码具有所需特性的抗体的腺病毒的所选细胞中诱导E1蛋白表达，以促进病毒复制，从而有助于病毒回收。
或者，可将pENAB展示重链-轻链文库重组到含有ts369突变的修饰的pAd/PL-DEST载体中(Hasson，T.B.等，J Virol 63(9)：3612-21(1989))。下面描述了产生含有ts369突变的pAd/PL-DEST载体的方法。可采用实施例17所述的方法筛选文库。
实施例17.原理证据：筛选人工腺病毒文库
用含有ts369突变的片段取代含有野生型序列的pAd/PL-DEST载体的RsrII片段(位置9666-17373)，从而产生含有ts369突变的pAd/PL-DEST载体(Hasson，T.B.等，J Virol 63(9)：3612-21(1989))。简要说，利用含有两个RsrII位点的改变的多克隆位点将pAd/PL-DEST的RsrII片段(位置9666-17373)克隆到pUC18载体中。按照生产商说明书采用QuickChange试剂盒(司查塔基公司)以寡核苷酸TS369F和TS369R(分别是SEQ ID NO：110和111)将对应于ts369的碱基对取代引入野生型片段。将含有ts369的RsrII片段插入RsrII切割的pAd/PL-DEST中，产生pAd/PL-DEST/ts369。用标准实验室方法进行所有这些克隆步骤。
用标准克隆方法产生含有10C2抗EphA2抗体、3F2抗EphA2抗体、Abegrin抗-αvβ3整联蛋白抗体、抗-PCDGF抗体、3F2抗-EphA2ScFvFc(单链Fv-Fc融合物)和Abegrin抗-αvβ3整联蛋白ScFvFc的pENPAB展示表达构建物。按照生产商推荐方案，用Gateway
Figure A20068004746300851
(英杰公司)系统的LR反应将这些表达构建物传递到pAd/PL-DEST/ts369载体中。LR反应是酚-氯仿提取、沉淀和转化到DH10B电感受态细胞中。对得到的pAd/PL/ts369表达载体进行质粒DNA分离后，用Pac I进行消化，以暴露左侧和右侧的病毒ITR，去除细菌序列。对ITR片段进行酚-氯仿提取、沉淀，并用Lipofectamine 2000(英杰公司)转染到HEK-293A细胞中。观察到细胞病理效应后收获该病毒。用Quick TiterTM腺病毒定量试剂盒(细胞生物实验室公司(Cell Biolabs，Inc))测定表示为病毒颗粒/ml(VP/ml)的病毒效价。根据VP/ml效价计算感染复数(MOI)。
通过混合以下等份制备人工文库：a)Abegrin抗-αvβ3整联蛋白抗体和3F2抗-EphA2ScFvFc表达病毒，b)抗-PCDGF抗体和10C2抗EphA2抗体表达病毒和c)3F2抗EphA2抗体和Abegrin抗-αvβ3整联蛋白ScFvFc表达病毒，以使病毒颗粒的比例最终达到100∶1。
可按照标准方法通过重叠PCR产生编码由人EphA2胞外结构域与人IgG1的Fc融合组成的人EphA2-Fc融合蛋白的多核苷酸(SEQ ID NO：112)。市售人cDNA可用作PCR反应的模板(如安毕昂公司(Ambion)的FirstChoice
Figure A20068004746300852
PCR-即用型cDNA和RACE-即用型cDNA)。可以在人胚肾(HEK)293细胞中表达人EphA2-Fc融合蛋白，并用标准方法以蛋白A亲和层析纯化。可以按照生产商说明书采用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(皮尔斯公司，伊利诺斯州洛克福特(Rockford，IL))使人EphA2-Fc生物素化。
按照生产商方案用EZ-Link Sulfo-NHS-LC-生物素化试剂盒(皮尔斯公司，伊利诺斯州洛克福特)使人αvβ3整联蛋白(开米康公司，#CC1018)生物素化。
进行对照实验，以优化检测含有αVβ3-生物素的细胞表面展示抗体的条件。以MOI＝2.5用编码Abegrin抗-αvβ3整联蛋白ScFvFc或3F2抗-EphA2ScFvFc的腺病毒感染293A细胞。40℃培育感染细胞24小时。收获细胞，以4×106个细胞/ml的密度重悬，在4％牛奶中室温(RT)培育20分钟。使不同的感染细胞等份接触10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1μg/ml或0.5μg/ml 4％牛奶配制的αVβ3-生物素，室温培育30分钟，再在冰上放置10分钟。洗涤细胞以去除未结合的sαVβ3-生物素，按照生产商推荐方法用FITC偶联的抗人IgG-Fc(皮尔斯公司)或APC偶联的链霉亲和素(皮尔斯公司)染色。以相同方式加工未感染的293A细胞用作阴性对照。在流式细胞仪上分析荧光染色细胞。表10中小结了获得的数据。
表10.Abegrin抗-αvβ3整联蛋白ScFvFc(α-αVβ3)或3F2抗-EphA2
ScFvFc(α-EphA2)展示细胞的αVβ3-生物素染色的滴定结果
Figure A20068004746300861
a)Fc第二次染色指FITC偶联的抗人IgG-Fc
b)Str第二次染色指APC偶联的链霉亲和素
原理选择的证据.实验I：在感染前一天将30ml生长培养基中的293A细胞(15×106细胞)接种到T-175组织培养瓶中，37℃培育过夜。用含有表达3F2抗EphA2抗体和Abegrin抗-αvβ3整联蛋白ScFvFc的病毒(100∶1)的混合物的文库感染细胞。用标准方法以MOI 1-2.5感染细胞。40℃培育24小时后，限制ts369突变腺病毒的生长温度，收获感染细胞，以4×106个细胞/毫升的密度重悬，在4％牛奶中室温(RT)培育20分钟。然后使细胞接触0.5-1μg/ml 4％牛奶配制的αVβ3-生物素，室温培育30分钟，再在冰上放置10分钟。洗涤细胞以去除未结合的αVβ3-生物素。按照生产商说明书用磁珠偶联的抗-生物素抗体(米氏生物技术公司(Miltenyi Biotech))正选择表面结合αVβ3-生物素的细胞。按照生产商推荐方法，用FITC偶联的抗人IgG-Fc(皮尔斯公司)和APC偶联的链霉亲和素(皮尔斯公司)对分离细胞进行双染。在流式细胞仪上检测染色细胞，用FACS机器分离同时被FITC和APC染色的细胞。图13显示了代表各种选择阶段的细胞的流式细胞图，以及确定分选双阳性细胞的选择标准的门。在37℃的允许温度下培育一半分离的双阳性细胞，以回收腺病毒。对回收病毒进行第二轮选择。另一半细胞用裂解缓冲液(10mM EDTA和0.6％SDS)裂解，酚-氯仿提取，乙醇沉淀，以回收病毒DNA。PCR扩增分离DNA中病毒编码的抗体序列，用标准方法进行克隆。对足够大量的克隆进行测序，以确定选择过程的效率。如图13所示，选择实验中86％的克隆含有Abegrin抗-αvβ3整联蛋白ScFvFc特异性序列；在选择前，Abegrin抗-αvβ3整联蛋白ScFvFc占初始人工文库的1％。
原理选择的证据.实验II：所用人工文库中所含的编码Abegrin抗-αvβ3整联蛋白抗体和3F2抗-EphA2ScFvFc的病毒比例为100∶1。用生物素化EphA2配体检测细胞表面展示的3F2抗-EphA2ScFvFc。如前一自然段所述进行实验。如图14所示，选择实验分离细胞产生的34％克隆含有3F2抗-EphA2ScFvFc特异性序列；在选择前，3F2抗-EphA2ScFvFc占初始人工文库的1％。
原理选择实验III的证据：所用人工文库中所含的编码抗-PCDGF全长抗体和10C2抗-EphA2全长抗体的病毒比例为100∶1。用生物素化EphA2配体检测细胞表面展示的10C2抗EphA2抗体。如前一自然段所述进行实验。如图15所示，选择实验分离细胞产生的87％克隆含有10C2抗EphA2抗体特异性序列；在选择前，10C2抗EphA2抗体占初始人工文库的1％。
尽管出于描述目的，以上描述了本发明具体实施方式，但本领域技术人员应理解，可以在不背离所附权利要求书所述的本发明的情况下对其中的细节进行多种改变。
将本说明书中提及的所有发表物、专利和专利申请纳入本说明书作参考，就好像特别将单独的发表物、专利或专利申请各自纳入本文作参考那样。此外，将2005年10月14日提交的美国临时申请号60/726,161全文纳入本文作参考，用于所有目的。
序列表
<110>米迪缪尼股份有限公司(MedImmune，Inc.)
<120>细胞展示抗体文库
<130>AE710PCT
<150>US 60/726,161
<151>2005-10-14
<160>112
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>19
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒A
<400>1
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1               5                   10                  15
Pro Gly Pro
<210>2
<211>19
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒A
<400>2
Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn
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Pro Gly Pro
<210>3
<211>13
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒A
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Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
1               5                   10
<210>4
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<212>PRT
<213>口蹄疫病毒A
<400>4
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1               5                   10                  15
Pro
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒A
<400>5
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Asn Pro Gly Pro
            20
<210>6
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<212>PRT
<213>口蹄疫病毒O
<400>6
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1               5                   10                  15
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
            20
<210>7
<211>58
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒O
<400>7
Val Thr Glu Leu Leu Tyr Arg Met Lys Arg Ala Glu Thr Tyr Cys Pro
1               5                   10                  15
Arg Pro Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys
            20                  25                  30
Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu
        35                  40                  45
Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
    50                  55
<210>8
<211>40
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒O
<400>8
Leu Leu Ala Ile His Pro Thr Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val
1               5                   10                  15
Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly
            20                  25                  30
Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro
        35                  40
<210>9
<211>33
<212>PRT
<213>口蹄疫病毒O
<400>9
Glu Ala Arg His Lys Gln Lys Ile Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu
1               5                   10                  15
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
            20                  25                  30
Pro
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<220>
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ggtgtccact cc                                                        72
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<223>n是a、c、g或t
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<222>(25)..(26)
<223>n是a、c、g或t
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acatgcccac cgtgcccagc acctnnsgaa ctcctggggg gaccg                45
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<220>
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<222>(28)..(29)
<223>n是a、c、g或t
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<222>(31)..(32)
<223>n是a、c、g或t
<400>40
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc nnsctggggg gaccgtcagt cttcctc   57
<210>41
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(34)..(35)
<223>n是a、c、g或t
<400>41
acatgcccac cgtgcccagc acctgaactc ctgnnsgggg gaccgtcagt cttcctcttc    60
<210>42
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(19)..(20)
<223>n是a、c、g或t
<400>42
gcacctgaac tcctggggnn sggaccgtca gtcttcctc                           39
<210>43
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(22)..(23)
<223>n是a、c、g或t
<400>43
gcacctgaac tcctgggggg annsccgtca gtcttcctct tc                       42
<210>44
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(25)..(26)
<223>n是a、c、g或t
<400>44
gcacctgaac tcctgggggg accgnnstca gtcttcctct tcccc                    45
<210>45
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(28)..(29)
<223>n是a、c、g或t
<400>45
gcacctgaac tcctgggggg accgtcanns gtcttcctct tcccccca                 48
<210>46
<211>51
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<220>
<221>misc_feature
<222>(31)..(32)
<223>n是a、c、g或t
<400>46
gcacctgaac tcctgggggg accgtcagtc nnsttcctct tccccccaaa a             51
<210>47
<211>18
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>47
ccccaggagt tcaggtgc                                                  18
<210>48
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>48
acgggtagta cctgaagtgg ttccacttcc tttatttggt ttacccggag acagggagag    60
<210>49
<211>60
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>49
caaacctgtc aacgtgaaac acgtgtgccc agatagaaga cgggtagtac ctgaagtggt    60
<210>50
<211>72
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>50
tgaattcgcg gccgctcaag tcagcaagcc catggttact agcgtcccaa gcaaacctgt    60
caacgtgaaa ca                                                        72
<210>51
<211>42
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>51
aagcttcggt ccgccaccat ggcaactgaa gatctcccaa ag                       42
<210>52
<211>39
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>52
gtctgccgaa ccgctgcctg ccaaaccttg agtgatggt                           39
<210>53
<211>30
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>53
ggcagcggtt cggcagaccc ctccaaggac                                     30
<210>54
<211>35
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>54
caggggctag cttactgctg aacggcgtcg agcgg                               35
<210>55
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>55
tcaatgaatt cgcggccgct catttacccg gagacaggga gaggc                    45
<210>56
<211>37
<212>PRT
<213>小鼠(Mus musculus)
<400>56
Asp Lys Leu Val Lys Cys Gly Gly Ile Ser Leu Leu Val Gln Asn Thr
1               5                   10                  15
Ser Trp Met Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Ser Leu Leu Gln Ala Leu
            20                  25                  30
Asp Phe Ile Ser Leu
        35
<210>57
<211>50
<212>PRT
<213>盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)
<400>57
Pro Ser Pro Thr Pro Thr Glu Thr Ala Thr Pro Ser Pro Thr Pro Lys
1               5                   10                  15
Pro Thr Ser Thr Pro Glu Glu Thr Glu Ala Pro Ser Ser Ala Thr Thr
            20                  25                  30
Leu Ile Ser Pro Leu Ser Leu Ile Val Ile Phe Ile Ser Phe Val Leu
        35                  40                  45
Leu Ile
    50
<210>58
<211>39
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>连接GPI的信号序列
<400>58
Leu Val Pro Arg Gly Ser Ile Glu Gly Arg Gly Thr Ser Ile Thr Ala
1               5                   10                  15
Tyr Asn Ser Glu Gly Glu Ser Ala Glu Phe Phe Phe Leu Leu Ile Leu
            20                  25                  30
Leu Leu Leu Leu Val Leu Val
        35
<210>59
<211>28
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>连接GPI的信号序列
<400>59
Thr Ser Ile Thr Ala Tyr Lys Ser Glu Gly Glu Ser Ala Glu Phe Phe
1               5                   10                  15
Phe Leu Leu Ile Leu Leu Leu Leu Leu Val Leu Val
            20                  25
<210>60
<211>37
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>60
Ser Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Ala Arg Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Ile
            20                  25                  30
Met Gly Leu Leu Thr
        35
<210>61
<211>37
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>61
Pro Asn Lys Gly Ser Gly Thr Thr Ser Gly Thr Thr Arg Leu Leu Ser
1               5                   10                  15
Gly His Thr Cys Phe Thr Leu Thr Gly Leu Leu Gly Thr Leu Val Thr
            20                  25                  30
Met Gly Leu Leu Thr
        35
<210>62
<211>24
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>62
Pro Asp His Ser Ala Ala Thr Lys Pro Ser Leu Phe Leu Phe Leu Val
1               5                   10                  15
Ser Leu Leu His Ile Phe Phe Lys
            20
<210>63
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>63
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag gtkcagctgg tgcagtctgg    50
<210>64
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>64
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag gtccagcttg tgcagtctgg    50
<210>65
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>65
gcctttctct ccacaggtgt acactccsag gtccagctgg tacagtctgg    50
<210>66
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>66
gcctttctct ccacaggtgt acactcccar atgcagctgg tgcagtctgg    50
<210>67
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>67
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag atcaccttga aggagtctgg    50
<210>68
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>68
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag gtcaccttga aggagtctgg    50
<210>69
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>69
gcctttctct ccacaggtgt acactccgar gtgcagctgg tggagtct    48
<210>70
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>70
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag gtgcagctgg tggagtctgg    50
<210>71
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>71
gcctttctct ccacaggtgt acactccgag gtgcagctgt tggagtctgg    50
<210>72
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>72
gcctttctct ccacaggtgt acactccgag gtgcagctgg tgcagwcygg    50
<210>73
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>73
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag stgcagctgc aggagtcsgg    50
<210>74
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>74
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag gtgcagctac agcagtgggg    50
<210>75
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>75
gcctttctct ccacaggtgt acactccgar gtgcagctgg tgcagtctgg    50
<210>76
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>76
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag gtacagctgc agcagtcagg    50
<210>77
<211>50
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>77
gcctttctct ccacaggtgt acactcccag gtgcagctgg tgcaatctgg    50
<210>78
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>78
gaagacggat gggcccttgg tcgacgctga ggagacrgtg accagggt    48
<210>79
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>79
gaagacggat gggcccttgg tcgacgctga agagacggtg accattgt    48
<210>80
<211>48
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>80
gaagacggat gggcccttgg tcgacgctga ggagacggtg accgtggt    48
<210>81
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>81
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtracatc cagatgaccc agtctcc    47
<210>82
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>82
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgmcatc crgwtgaccc agtctcc    47
<210>83
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>83
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgtcatc tggatgaccc agtctcc    47
<210>84
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>84
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgatatt gtgatgaccc agactcc    47
<210>85
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>85
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgatrtt gtgatgacwc agtctcc    47
<210>86
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>86
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgaaatt gtgttgacrc agtctcc    47
<210>87
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>87
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgaaata gtgatgacgc agtctcc    47
<210>88
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>88
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgaaatt gtaatgacac agtctcc    47
<210>89
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>89
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgacatc gtgatgaccc agtctcc    47
<210>90
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>90
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgaaacg acactcacgc agtctcc    47
<210>91
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>91
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtgaaatt gtgctgactc agtctcc    47
<210>92
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>92
gcatgctcga catcgattca ctaacactct cccctgttga agctc      45
<210>93
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>93
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtcagtct gtgctgactc agccacc    47
<210>94
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>94
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtcagtct gtgytgacgc agccgcc    47
<210>95
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>95
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtcagtct gccctgactc agcct      45
<210>96
<211>45
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>96
ctctggctcc ccggggcgcg ctgttcctat gwgctgacwc agcca      45
<210>97
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>97
ctctggctcc ccggggcgcg ctgttcctat gagctgacac agctacc    47
<210>98
<211>46
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>98
ctctggctcc ccggggcgcg ctgttcttct gagctgactc aggacc     46
<210>99
<211>46
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>99
ctctggctcc ccggggcgcg ctgttcctat gagctgatgc agccac     46
<210>100
<211>44
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>100
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtcagcyt gtgctgactc aatc       44
<210>101
<211>44
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>101
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtcwgsct gtgctgactc agcc       44
<210>102
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>102
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtaatttt atgctgactc agcccca    47
<210>103
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>103
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtcagrct gtggtgacyc aggagcc    47
<210>104
<211>47
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>104
ctctggctcc ccggggcgcg ctgtcaggca gggctgactc agccacc    47
<210>105
<211>46
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>105
gcatgctcga catcgattca ctatgaacat tctgtagggg ccactg     46
<210>106
<211>46
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>106
gcatgctcga catcgattca ctaagagcat tctgcagggg ccactg     46
<210>107
<211>21
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>107
ccatgggatg gagctgtatc a                                21
<210>108
<211>27
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>PCR引物
<400>108
ggagtgtaca cctgtggaga gaaaggc                          27
<210>109
<211>27
<212>PRT
<213>智人(Homo sapiens)
<400>109
Leu Leu Ile Gly Ile Ser Ile Ala Ser Leu Cys Leu Val Val Ala Leu
1               5                   10                  15
Leu Ala Leu Leu Cys His Leu Arg Lys Lys Gln
            20                  25
<210>110
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>定位诱变的寡核苷酸
<400>110
gagccggcgg cgcgggccca gcgaccgcga gc                    32
<210>111
<211>32
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>定位诱变的寡核苷酸
<400>111
gctcgcggtc gctgggcccg cgccgccggc tc                    32
<210>112
<211>742
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>融合于IgG1 Fc区的EphA2胞外域
<400>112
Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu
1              5                   10                  15
Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln
            20                  25                  30
Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val
        35                  40                  45
Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg
    50                  55                  60
Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp
65                  70                  75                  80
Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn
                85                  90                  95
Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys
            100                 105                 110
Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val
        115                 120                 125
Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg
    130                 135                 140
Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp
145                 150                 155                 160
Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys
                165                 170                 175
Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala
            180                 185                 190
Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp
        195                 200                 205
His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala
    210                 215                 220
Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala
225                 230                 235                 240
Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe
                245                 250                 255
Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His
            260                 265                 270
Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala Thr Ser Cys Glu Cys Glu Glu Gly
        275                 280                 285
Phe Phe Arg Ala Pro Gln Asp Pro Ala Ser Met Pro Cys Thr Arg Pro
    290                 295                 300
Pro Ser Ala Pro His Tyr Leu Thr Ala Val Gly Met Gly Ala Lys Val
305                 310                 315                 320
Glu Leu Arg Trp Thr Pro Pro Gln Asp Ser Gly Gly Arg Glu Asp Ile
                325                 330                 335
Val Tyr Ser Val Thr Cys Glu Gln Cys Trp Pro Glu Ser Gly Glu Cys
            340                 345                 350
Gly Pro Cys Glu Ala Ser Val Arg Tyr Ser Glu Pro Pro His Gly Leu
        355                 360                 365
Thr Arg Thr Ser Val Thr Val Ser Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tyr
    370                 375                 380
Thr Phe Thr Val Glu Ala Arg Asn Gly Val Ser Gly Leu Val Thr Ser
385                 390                 395                 400
Arg Ser Phe Arg Thr Ala Ser Val Ser Ile Asn Gln Thr Glu Pro Pro
                405                 410                 415
Lys Val Arg Leu Glu Gly Arg Ser Thr Thr Ser Leu Ser Val Ser Trp
            420                 425                 430
Ser Ile Pro Pro Pro Gln Gln Ser Arg Val Trp Lys Tyr Glu Val Thr
        435                 440                 445
Tyr Arg Lys Lys Gly Asp Ser Asn Ser Tyr Asn Val Arg Arg Thr Glu
    450                 455                 460
Gly Phe Ser Val Thr Leu Asp Asp Leu Ala Pro Asp Thr Thr Tyr Leu
465                 470                 475                 480
Val Gln Val Gln Ala Leu Thr Gln Glu Gly Gln Gly Ala Gly Ser Lys
                485                 490                 495
Val His Glu Phe Gln Thr Leu Ser Pro Glu Gly Ser Gly Asn Glu Pro
            500                 505                 510
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
        515                 520                 525
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
    530                 535                 540
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
545                 550                 555                 560
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
                565                 570                 575
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
            580                 585                 590
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
        595                 600                 605
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
    610                 615                 620
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
625                 630                 635                 640
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
                645                 650                 655
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
            660                 665                 670
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
        675                 680                 685
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
    690                 695                 700
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
705                 710                 715                 720
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
                725                 730                 735
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
            740

Claims (20)

1.一种产生在细胞表面上展示抗体或抗体片段的细胞文库的方法，所述方法包括：
a.用含多核苷酸载体的文库感染细胞群体，所述多核苷酸编码在细胞膜胞外表面上展示的重组抗体或其片段；和
b.在能够在细胞表面上表达抗体或其片段的条件下培养所述细胞群体。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体或其片段包含使所述抗体靶向细胞表面的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列融合于所述抗体的重链或轻链的C-末端。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述氨基酸序列包含跨膜区或GPI锚定信号序列。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体是病毒载体。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述载体是腺病毒载体、杆状病毒载体、腺伴随病毒载体、疱疹病毒载体或慢病毒载体。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体或其片段是选自IgA、IgE、IgM、IgD、IgY或IgG的免疫球蛋白类型。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体或其片段是鼠抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体或其片段包括Fc区，其中所述Fc区是天然产生的Fc区，或者所述Fc区包含至少一个氨基酸取代、插入或其组合。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗体或其片段包含重链可变区、轻链可变区，或重链和轻链可变区。
10.一种分离具有所需特性的抗体或其片段的方法，所述方法包括：
对权利要求1所述方法产生的细胞文库进行选择，从而分离表达具有所需特性的抗体或其片段的至少一种细胞。
11.如权利要求10所述的方法，还包括由所述分离细胞分离多核苷酸的步骤。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，用标记试剂培育所述细胞文库并根据所述标记试剂与细胞文库的结合分选所述细胞文库，从而进行选择。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述标记试剂是抗原或效应物分子。
14.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述所需特性是与特定抗原结合。
15.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述所需特性是与效应物分子结合。
16.一种在细胞表面上展示抗体或其片段的方法，所述方法包括：
a.用含有编码重组抗体或其片段的多核苷酸的载体感染细胞，其中所述抗体或其片段包含使所述抗体靶向细胞表面的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列融合于所述抗体的重链或轻链的C-末端；和
b.在能够在细胞表面上表达抗体或其片段的条件下培养所述细胞群体。
17.一种对效应物分子亲和力降低的含有变异Fc区的抗体或其片段，其中所述变异Fc区包含选自下组的至少一个氨基酸取代、插入或其组合：W277T；K246R/L251E/T260R；InR234/235；InV235/236；InR236/237；InR237/238；InV238/239；InN238/239；InL238/239；InE238/239；InG238/239；InS239/240；InG240/241；InE240/241；InG240/241/I198T；InL238/239/P238Q；InE238/239/V348A；InS239/240/V266A；InR237/238/G236A。
18.如权利要求17所述的抗体或其片段，其特征在于，所述效应物分子选自C1q、FcγRIIIA。
19.如权利要求17所述的抗体或其片段，其特征在于，所述抗体的效应物功能降低。
20.如权利要求19所述的抗体或其片段，其特征在于，所述效应物功能是ADCC。
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