JP6636917B2 - 標的細胞に特異的な標的エピトープの同定のための、標的抗原探索、表現型スクリーニングおよびそれらの使用 - Google Patents
標的細胞に特異的な標的エピトープの同定のための、標的抗原探索、表現型スクリーニングおよびそれらの使用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP6636917B2 JP6636917B2 JP2016523818A JP2016523818A JP6636917B2 JP 6636917 B2 JP6636917 B2 JP 6636917B2 JP 2016523818 A JP2016523818 A JP 2016523818A JP 2016523818 A JP2016523818 A JP 2016523818A JP 6636917 B2 JP6636917 B2 JP 6636917B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- library
- cell
- cell type
- binding polypeptide
- binding
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 47
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 47
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 47
- 238000012216 screening Methods 0.000 title description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 121
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 99
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 73
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 72
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 72
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 claims description 38
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 29
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 21
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 20
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 20
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 5
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 claims description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims 1
- 238000012350 deep sequencing Methods 0.000 description 9
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 6
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 102000014384 Type C Phospholipases Human genes 0.000 description 5
- 108010079194 Type C Phospholipases Proteins 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 101100112922 Candida albicans CDR3 gene Proteins 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 3
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 2
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 2
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000031873 Animal Disease Models Diseases 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108700022150 Designed Ankyrin Repeat Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 1
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000002702 GPI-Linked Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043685 GPI-Linked Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000005744 Glycoside Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108010031186 Glycoside Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 1
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 1
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 238000011558 animal model by disease Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 238000012165 high-throughput sequencing Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000004976 peripheral blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B30/00—Methods of screening libraries
- C40B30/04—Methods of screening libraries by measuring the ability to specifically bind a target molecule, e.g. antibody-antigen binding, receptor-ligand binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in eptitope analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1048—SELEX
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2320/00—Applications; Uses
- C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
- C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
- G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
本出願は、2013年6月28日に出願された、米国仮特許出願第61/840,583号、発明の名称“標的抗原探索および表現型スクリーニング”に基づく優先権を主張し、その内容全体は引用により本明細書中に包含させる。
抗体およびそのフラグメントのような結合性ポリペプチドは、療法剤および診断剤として商業的に重要である。結合性ポリペプチドをスクリーニングするための従来の方法は、一般的に、可溶性抗原を用いる。しかしながら、任意の細胞表面抗原に関して、これらの抗原上の立体構造的エピトープ(conformational epitope)は、該抗原が細胞膜から可溶化されたときに変化するため、天然の抗原を認識することのできる結合性ポリペプチドを作製できなかった。従って、当技術分野において、それらの天然の立体構造の細胞表面抗原に特異的に結合できる結合性ポリペプチドをスクリーニングするための新規方法が必要とされていた。
本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチド(例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント)を同定するための方法および組成物を提供する。本発明の方法は、一般的に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の(variegated)核酸ディスプレイライブラリと細胞の外表面上に提示される細胞表面抗原を接触させ、そして該ライブラリから、該細胞の外表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも1個のライブラリメンバーを単離する工程を含む。本発明の方法および組成物は、標的細胞表面抗原の天然の形態に結合する結合性ポリペプチドの迅速な同定を可能にするという点で、特に有用である。これらの方法および組成物はまた、新規の治療的に有用な細胞タイプ特異的抗原またはエピトープの同定を可能にする。
I.定義
本明細書で用いる用語“核酸ディスプレイライブラリ”とは、例えば、米国特許第7,195,880号;同第6,951,725号;同第7,078,197号;同第7,022,479号;同第6,518,018号;同第7,125,669号;同第6,846,655号;同第6,281,344号;同第6,207,446号;同第6,214,553号;同第6,258,558号;同第6,261,804号;同第6,429,300号;同第6,489,116号;同第6,436,665号;同第6,537,749号;同第6,602,685号;同第6,623,926号;同第6,416,950号;同第6,660,473号;同第6,312,927号;同第5,922,545号;および、同第6,348,315号、ならびにWO2010/011944(それらは全て、引用によりその全体を本明細書中に包含させる。)に記載されたものを、それらに限定されることなく含む、全ての当技術分野で認識されるインビトロ無細胞表現型−遺伝子型関連ディスプレイを意味する。
ある局面において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法を提供する。
ある局面において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法を提供する。
ある局面において、本発明は、細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、(a)結合性ポリペプチドの多様な改変体の(variegated)核酸ディスプレイライブラリと第一の細胞タイプの外表面上に提示されたある細胞表面抗原を接触させ、そして(b)該ライブラリから、第一の細胞タイプの外表面上の該細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリメンバーを単離して、該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する工程を含む方法を提供する。ある態様において、工程(a)の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、抗原に特異的に結合しない結合性ポリペプチドのライブラリを事前に明らかにするために、外表面上に提示される抗原を提示しない第二の細胞タイプと接触させる。
本願発明の好ましい態様を次に示す:
[項1]
細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
a.結合性ポリペプチドの多様な改変体の(variegated)核酸ディスプレイライブラリを第一の細胞タイプの外表面に提示されたある細胞表面抗原と接触させ、そして、
b.該ライブラリから、第一の細胞タイプの外表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも1つのライブラリメンバーを単離して、該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程を含む、方法。
[項2]
工程(a)の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、外表面上に提示された抗原を提示しない第二の細胞タイプと接触させる、上記項1に記載の方法。
[項3]
細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
a.結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、ある細胞表面抗原を発現する第一の細胞タイプと接触させて、該ライブラリから第一の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも1個のライブラリメンバーを単離し、
b.結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、該細胞表面抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該ライブラリから第二の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも1個のライブラリメンバーを単離し、そして
c.第一の細胞タイプに特異的に結合するが、第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーを選択して該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程を含む、方法。
[項4]
多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリがDNAディスプレイライブラリである、上記項1、2または3に記載の方法。
[項5]
DNAディスプレイライブラリの各メンバーが、結合性ポリペプチドをコード化するDNAコーディング配列に、介在するDNAリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該DNAリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、上記項4に記載の方法。
[項6]
制限エンドヌクレアーゼ部位が、DNAディスプレイライブラリのメンバーのコーディング配列中に存在しない、上記項5に記載の方法。
[項7]
該方法がさらに、DNAコーディング配列と、単離されたライブラリメンバーの連結された結合性ポリペプチドを物理的に分離することを含む、上記項5または6に記載の方法。
[項8]
該方法がさらに、第一または第二の細胞タイプから無傷の単離されたライブラリメンバーを分離することを含む、上記項1から7のいずれか一項に記載の方法。
[項9]
単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから細胞表面抗原の酵素的切断によって分離される、上記項8に記載の方法。
[項10]
細胞表面抗原が糖脂質アンカーにより細胞表面に結合し、単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから、糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断により分離される、上記項9に記載の方法。
[項11]
該方法がさらに、単離されたライブラリメンバーの少なくとも一部のDNAコーディング配列を決定することを含む、上記項1から10のいずれか一項に記載の方法。
[項12]
DNAコーディング配列が、ピロシーケンスにより決定される、上記項11に記載の方法。
[項13]
抗原が天然に存在するタンパク質、グリカンまたは脂質である、上記項1から12のいずれか一項に記載の方法。
[項14]
抗原が、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型タンパク質である、上記項1から13のいずれか一項に記載の方法。
[項15]
抗原が組み換え抗原である、上記項1から14のいずれか一項に記載の方法。
[項16]
抗原がキメラ抗原である、上記項1から15のいずれか一項に記載の方法。
[項17]
第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を天然で発現する細胞である、上記項1から16のいずれか一項に記載の方法。
[項18]
第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を異種発現するように作製されている組み換え細胞である、上記項1から17のいずれか一項に記載の方法。
[項19]
第一の細胞タイプが、正常細胞の疾患に関連する変異体である、上記項1から18のいずれか一項に記載の方法。
[項20]
第一の細胞タイプが腫瘍細胞である、上記項1から19のいずれか一項に記載の方法。
[項21]
結合性ポリペプチドがそのフラグメントの抗体である、上記項1から20のいずれか一項に記載の方法。
[項22]
結合性ポリペプチドが抗体VHまたはVLドメインである、上記項1から21のいずれか一項に記載の方法。
A.概要
ヒトドナーの骨髄、末梢血および脾臓細胞から得られた完全ヒト抗体VHライブラリを構築し、複数の標的に対する多数の高親和性の、および特異的なVH結合性ポリペプチドを、dsDNAディスプレイ技術を用いて同定した。標的細胞特異的エピトープを、ヒトVHライブラリおよびdsDNAディスプレイ技術を用いて、生細胞の選択およびディープシークエンシング分析により同定した。並列の分別選択および標的細胞選択の戦略を、これらの方法に適用した(図4、5、6参照)。全ての段階の全ての集合体(pool)のディープシークエンシングからのCDR3頻度の集計により、VHクローンの選択性が予測された。標的細胞および関連する細胞タイプに選択的に結合する高親和性VHを同定した。
2つの方法が、生細胞に結合したライブラリメンバーを効果的に回収するために開発された。
マスター天然融合ライブラリを、WO2010/011944(引用によりその内容全体が本明細書中に包含させる)に記載のプロトコルにより製造した。選択の第一段階で、全ての選択肢について同じ多様性を担持するように、精製した融合ライブラリを複数のライブラリ中に均等に分配した(図5参照)。
選択の各段階後、結合プールをPCR増幅させた。各結合プールのHCDR3を、VHフラグメントのフレームワーク3のC末端およびフレームワーク4のN末端にプライミングするオリゴを用いてPCRにより増幅させた。その後、個々の選択段階および選択肢からのこれらのHCDR3フラグメントを、PCRによりイルミナシークエンサーに使用される特定のDNAバーコードでタグ付けした。タグ付けされたHCDR3を集め、Hi Seq技術を用いるハイスループットシークエンシングのために送付した。標的細胞由来の段階4結合プールもまたDNAバーコードでタグ付けし、完全長VH配列を得るために、454のシークエンシングのために提出した。
その後、結合プールおよび合成VHを、pET22b発現ベクター中にサブクローニングした。VHは、BL−21大腸菌細胞中で産生され、C末端Hisタグにより標準的なプロトコルを用いて精製された。FACSアッセイを行い、異なる細胞タイプに対するVHの結合および選択性ならびに結合性ポリペプチドのEC50を評価した。高親和性および選択性VH結合性ポリペプチドを、生細胞選択過程により同定した(図8、9および10参照)。
Claims (13)
- 細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
(a)結合性ポリペプチドの多様な改変体の(variegated)核酸ディスプレイライブラリを第一の細胞タイプの外表面に天然に発現されたある細胞表面抗原と接触させ、ここで、前記の多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリがDNAディスプレイライブラリであり、該DNAディスプレイライブラリの各メンバーが、結合性ポリペプチドをコード化するDNAコーディング配列に、介在するDNAリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該DNAリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、制限エンドヌクレアーゼ部位は、DNAディスプレイライブラリのメンバーのコーディング配列中に存在せず、
(b)前記第一の細胞タイプから、未結合のライブラリメンバーを洗浄により除去し、
(c)前記第一の細胞タイプに結合しているライブラリメンバーから、DNAコーディング配列を、適当な制限エンドヌクレアーゼによる前記制限エンドヌクレアーゼ部位の切断によって酵素的に分離し、そして、
(d)DNAコーディング配列が分離された少なくとも1つのライブラリメンバーの結合性ポリペプチドを、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドとして同定する
工程を含む方法。 - 工程(a)の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリの未選別前駆ライブラリを、前記外表面上に提示された抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該第二の細胞タイプに結合するライブラリメンバーを該未選別前駆ライブラリから単離および除去して、工程(a)で使用する多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを得る、請求項1に記載の方法。
- (e)前記の結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、前記細胞表面抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該ライブラリから該第二の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも1つのライブラリメンバーを単離し、そして、
(f)前記第一の細胞タイプに特異的に結合するが、前記第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーを選択して、前記細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程をさらに含む、請求項1に記載の方法。 - 該方法がさらに、少なくとも一部の単離されたライブラリメンバーのDNAコーディング配列を決定することを含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- DNAコーディング配列が、ピロシーケンスにより決定される、請求項4に記載の方法。
- 抗原が天然に存在するタンパク質、グリカンまたは脂質である、請求項1から5のいずれか一項に記載の方法。
- 抗原が、グリコホスファチジルイノシトール(GPI)アンカー型タンパク質である、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の細胞タイプが、疾患特異的エピトープを発現する、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の細胞タイプが腫瘍細胞である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 結合性ポリペプチドが抗体またはその結合性フラグメントである、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 結合性ポリペプチドが抗体VHまたはVLドメインである、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の細胞タイプが生細胞である、請求項1に記載の方法。
- 第一および第二の細胞タイプが生細胞である、請求項3に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201361840583P | 2013-06-28 | 2013-06-28 | |
US61/840,583 | 2013-06-28 | ||
PCT/US2014/043454 WO2014209801A1 (en) | 2013-06-28 | 2014-06-20 | Target antigen discovery, phenotypic screens and use thereof for identification of target cell specific target epitopes |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016529884A JP2016529884A (ja) | 2016-09-29 |
JP2016529884A5 JP2016529884A5 (ja) | 2018-12-06 |
JP6636917B2 true JP6636917B2 (ja) | 2020-01-29 |
Family
ID=52142578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2016523818A Active JP6636917B2 (ja) | 2013-06-28 | 2014-06-20 | 標的細胞に特異的な標的エピトープの同定のための、標的抗原探索、表現型スクリーニングおよびそれらの使用 |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US10370651B2 (ja) |
EP (2) | EP3739336B1 (ja) |
JP (1) | JP6636917B2 (ja) |
KR (2) | KR102163529B1 (ja) |
CN (1) | CN105659090B (ja) |
AU (3) | AU2014302811B2 (ja) |
CA (1) | CA2916576C (ja) |
ES (2) | ES2920601T3 (ja) |
HK (1) | HK1218779A1 (ja) |
IL (4) | IL243391B (ja) |
MX (1) | MX2015017714A (ja) |
MY (1) | MY191368A (ja) |
NZ (1) | NZ716126A (ja) |
PH (1) | PH12015502807B1 (ja) |
RU (1) | RU2678421C2 (ja) |
SA (1) | SA515370328B1 (ja) |
SG (2) | SG10201806428YA (ja) |
WO (1) | WO2014209801A1 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP3049811B1 (en) | 2013-09-23 | 2020-09-09 | X-Body, Inc. | Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens |
US11851679B2 (en) | 2017-11-01 | 2023-12-26 | Juno Therapeutics, Inc. | Method of assessing activity of recombinant antigen receptors |
Family Cites Families (41)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5922545A (en) | 1993-10-29 | 1999-07-13 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
GB9620209D0 (en) | 1996-09-27 | 1996-11-13 | Cemu Bioteknik Ab | Method of sequencing DNA |
US5876925A (en) | 1996-10-11 | 1999-03-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Magnetically activated cell sorting for production of proteins |
US6261804B1 (en) | 1997-01-21 | 2001-07-17 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
RU2233878C2 (ru) | 1997-01-21 | 2004-08-10 | Дзе Дженерал Хоспитал Корпорейшн | Способ отбора желательного белка и нуклеиновой кислоты, средства для его осуществления |
JP4086325B2 (ja) | 1997-04-23 | 2008-05-14 | プリュックテュン,アンドレアス | 標的分子と相互作用する(ポリ)ペプチドをコードする核酸分子の同定方法 |
WO1999051773A1 (en) | 1998-04-03 | 1999-10-14 | Phylos, Inc. | Addressable protein arrays |
US6794128B2 (en) | 1998-04-24 | 2004-09-21 | The Regents Of The University Of California | Methods of selecting internalizing antibodies |
US6846655B1 (en) | 1998-06-29 | 2005-01-25 | Phylos, Inc. | Methods for generating highly diverse libraries |
US6602685B1 (en) | 1998-08-17 | 2003-08-05 | Phylos, Inc. | Identification of compound-protein interactions using libraries of protein-nucleic acid fusion molecules |
CA2334946A1 (en) | 1998-08-17 | 2000-02-24 | Phylos, Inc. | Methods for producing nucleic acids lacking 3'-untranslated regions and optimizing cellular rna-protein fusion formation |
US6416950B1 (en) | 1998-12-02 | 2002-07-09 | Phylos, Inc. | DNA-protein fusions and uses thereof |
US6623926B1 (en) | 1999-06-01 | 2003-09-23 | Phylos, Inc. | Methods for producing 5′-nucleic acid-protein conjugates |
IL146451A0 (en) | 1999-07-12 | 2002-07-25 | Phylos Inc | C-terminal protein tagging |
ES2383332T3 (es) | 1999-07-27 | 2012-06-20 | Bristol-Myers Squibb Company | Procedimiento de ligación de aceptores de péptidos |
EP1212452B1 (en) | 1999-08-27 | 2013-07-17 | Bristol-Myers Squibb Company | Methods for encoding and sorting in vitro translated proteins |
EP1250463B1 (en) | 2000-01-24 | 2006-04-05 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
US7022479B2 (en) | 2000-01-24 | 2006-04-04 | Compound Therapeutics, Inc. | Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis |
US6951725B2 (en) | 2001-06-21 | 2005-10-04 | Compound Therapeutics, Inc. | In vitro protein interaction detection systems |
WO2003045975A2 (en) | 2001-11-27 | 2003-06-05 | Compound Therapeutics, Inc. | Solid-phase immobilization of proteins and peptides |
US20030186223A1 (en) * | 2002-03-01 | 2003-10-02 | Dyax Corp. | Modular recombinatorial display libraries |
RU2346004C2 (ru) | 2002-11-09 | 2009-02-10 | Эвидекс Лимитед | Экспонирование т-клеточных рецепторов |
US7195875B2 (en) | 2003-04-18 | 2007-03-27 | Beckman Coulter, Inc. | Oligonucleotide pairs for multiplexed binding assays |
WO2005026379A2 (en) * | 2003-09-08 | 2005-03-24 | Ramot At Tel Aviv University | The mapping and reconstitution of a conformational discontinuous binding surface |
JP4782700B2 (ja) * | 2004-01-20 | 2011-09-28 | カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | 最低限必須な結合決定基を用いた抗体特異性の移入 |
CN100486991C (zh) | 2005-09-27 | 2009-05-13 | 南开大学 | 与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽及其应用 |
JP2009511067A (ja) | 2005-10-14 | 2009-03-19 | メディミューン,エルエルシー | 抗体ライブラリーの細胞提示 |
PT2486941T (pt) | 2006-10-02 | 2017-05-30 | Squibb & Sons Llc | Anticorpos humanos que ligam a cxcr4 e utilizações dos mesmos |
US7732195B2 (en) | 2006-11-01 | 2010-06-08 | Facet Biotech Corporation | Tethered vectors for cell surface immunoglobulin display |
EP2068914A4 (en) * | 2007-02-09 | 2011-07-20 | Medimmune Llc | PRESENTATION OF ANTIBODY BANK BY PLASMA MEMBRANES OF YEAST CELLS |
WO2009039192A2 (en) | 2007-09-17 | 2009-03-26 | The Regents Of The University Of Californina | Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ |
EP3629022A1 (en) | 2008-07-25 | 2020-04-01 | Richard W. Wagner | Protein screening methods |
CN102227638B (zh) | 2008-09-30 | 2015-05-20 | Abbvie公司 | Rna展示的改良方法 |
WO2010094027A1 (en) | 2009-02-13 | 2010-08-19 | X-Body, Inc. | Identification of nucleic acid delivery vehicles using dna display |
JP5764071B2 (ja) * | 2009-02-24 | 2015-08-12 | エスバテック − ア ノバルティスカンパニー エルエルシー | 細胞表面抗原のイムノバインダーを同定するための方法 |
CN102482350B (zh) | 2009-09-08 | 2015-08-05 | 株式会社新药 | 作用于胰高血糖素受体的抗体及其应用 |
CA2778673A1 (en) | 2009-10-27 | 2011-05-05 | Karen Margrete Miller | Function modifying nav 1.7 antibodies |
GB201014715D0 (en) | 2010-09-06 | 2010-10-20 | Vib Vzw | Nanobodies stabilizing functional conformational states of GPCRS |
ES2926988T3 (es) | 2011-03-15 | 2022-10-31 | X Body Inc | Métodos de cribado de anticuerpos |
CN103890245B (zh) | 2011-05-20 | 2020-11-17 | 富鲁达公司 | 核酸编码反应 |
WO2013080055A2 (en) | 2011-09-27 | 2013-06-06 | The Governing Council Of The University Of Toronto | Molecular display method |
-
2014
- 2014-06-20 SG SG10201806428YA patent/SG10201806428YA/en unknown
- 2014-06-20 NZ NZ716126A patent/NZ716126A/en unknown
- 2014-06-20 KR KR1020167001215A patent/KR102163529B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-20 MX MX2015017714A patent/MX2015017714A/es active IP Right Grant
- 2014-06-20 CA CA2916576A patent/CA2916576C/en active Active
- 2014-06-20 EP EP20163403.7A patent/EP3739336B1/en active Active
- 2014-06-20 MY MYPI2015002986A patent/MY191368A/en unknown
- 2014-06-20 JP JP2016523818A patent/JP6636917B2/ja active Active
- 2014-06-20 ES ES20163403T patent/ES2920601T3/es active Active
- 2014-06-20 EP EP14816936.0A patent/EP3014271B1/en active Active
- 2014-06-20 KR KR1020207028257A patent/KR102309517B1/ko active IP Right Grant
- 2014-06-20 WO PCT/US2014/043454 patent/WO2014209801A1/en active Application Filing
- 2014-06-20 ES ES14816936T patent/ES2791068T3/es active Active
- 2014-06-20 RU RU2016102589A patent/RU2678421C2/ru active
- 2014-06-20 SG SG11201510312RA patent/SG11201510312RA/en unknown
- 2014-06-20 US US14/897,892 patent/US10370651B2/en active Active
- 2014-06-20 CN CN201480042778.7A patent/CN105659090B/zh active Active
- 2014-06-20 AU AU2014302811A patent/AU2014302811B2/en active Active
-
2015
- 2015-12-17 PH PH12015502807A patent/PH12015502807B1/en unknown
- 2015-12-28 IL IL243391A patent/IL243391B/en active IP Right Grant
- 2015-12-28 SA SA515370328A patent/SA515370328B1/ar unknown
-
2016
- 2016-06-13 HK HK16106763.4A patent/HK1218779A1/zh unknown
-
2019
- 2019-06-21 US US16/448,567 patent/US11414784B2/en active Active
-
2020
- 2020-01-16 AU AU2020200325A patent/AU2020200325B2/en active Active
- 2020-01-16 IL IL272091A patent/IL272091B/en active IP Right Grant
-
2021
- 2021-02-21 IL IL281005A patent/IL281005B/en unknown
-
2022
- 2022-03-13 IL IL291326A patent/IL291326A/en unknown
- 2022-03-25 AU AU2022202076A patent/AU2022202076A1/en active Pending
- 2022-07-29 US US17/816,017 patent/US20230074705A1/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20230074705A1 (en) | Target antigen discovery, phenotypic screens and use thereof for identification of target cell specific target epitopes | |
US20170212130A1 (en) | Compositions and methods for rapid production of versatile nanobody repertoires | |
RU2777769C2 (ru) | Обнаружение антигена-мишени, фенотипический скрининг и его применение для идентификации специфичных эпитопов-мишеней клеток-мишеней | |
AU2020202428B2 (en) | Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens | |
BR112015032557B1 (pt) | Método de identificação de um polipeptídeo de ligação que se liga especificamente a um antígeno da superfície celular |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20170524 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20180330 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20180424 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20180723 |
|
A524 | Written submission of copy of amendment under article 19 pct |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524 Effective date: 20181023 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190326 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190625 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190823 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20191203 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20191219 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6636917 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |