JP2016529884A5 - - Google Patents

Description

ある態様において、第一および／または第二の細胞タイプから、無傷の単離されたライブラリメンバーを物理的に分離することが望ましい。物理的分離のいずれかの方法を用いることができる。ある態様において、単離されたライブラリメンバーは、細胞表面抗原の酵素的切断によって第一または第二の細胞タイプから分離される。抗原の酵素的切断の何れかの方法、例えば、プロテアーゼ、脂質、および／またはグリコシダーゼ酵素的切断を用いることができる。ある態様において、細胞表面抗原が糖脂質アンカーにより細胞表面に結合しているとき、単離されたライブラリメンバーは、第一または第二の細胞タイプから糖脂質アンカー型ホスホリパーゼ切断によって分離される。その結果、遊離した単離されたライブラリメンバーは、何れかの当技術分野で認識されている方法、例えば、遠心分離により、第一または第二の細胞タイプからさらに分離され得る。

さらに、またはあるいは、本明細書に記載の方法は、トランスジェニック動物および動物疾患モデルにおけるような他の種における標的またはエピトープの発見にも適用され得る。
本願発明の好ましい態様を次に示す：
［項１］
細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の（variegated）核酸ディスプレイライブラリを第一の細胞タイプの外表面に提示されたある細胞表面抗原と接触させ、そして、
ｂ．該ライブラリから、第一の細胞タイプの外表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリメンバーを単離して、該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程を含む、方法。
［項２］
工程（ａ）の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、外表面上に提示された抗原を提示しない第二の細胞タイプと接触させる、上記項１に記載の方法。
［項３］
細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
ａ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、ある細胞表面抗原を発現する第一の細胞タイプと接触させて、該ライブラリから第一の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１個のライブラリメンバーを単離し、
ｂ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、該細胞表面抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該ライブラリから第二の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１個のライブラリメンバーを単離し、そして
ｃ．第一の細胞タイプに特異的に結合するが、第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーを選択して該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
工程を含む、方法。
［項４］
多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリがＤＮＡディスプレイライブラリである、上記項１、２または３に記載の方法。
［項５］
ＤＮＡディスプレイライブラリの各メンバーが、結合性ポリペプチドをコード化するＤＮＡコーディング配列に、介在するＤＮＡリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該ＤＮＡリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、上記項４に記載の方法。
［項６］
制限エンドヌクレアーゼ部位が、ＤＮＡディスプレイライブラリのメンバーのコーディング配列中に存在しない、上記項５に記載の方法。
［項７］
該方法がさらに、ＤＮＡコーディング配列と、単離されたライブラリメンバーの連結された結合性ポリペプチドを物理的に分離することを含む、上記項５または６に記載の方法。
［項８］
該方法がさらに、第一または第二の細胞タイプから無傷の単離されたライブラリメンバーを分離することを含む、上記項１から７のいずれか一項に記載の方法。
［項９］
単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから細胞表面抗原の酵素的切断によって分離される、上記項８に記載の方法。
［項１０］
細胞表面抗原が糖脂質アンカーにより細胞表面に結合し、単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから、糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断により分離される、上記項９に記載の方法。
［項１１］
該方法がさらに、単離されたライブラリメンバーの少なくとも一部のＤＮＡコーディング配列を決定することを含む、上記項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
［項１２］
ＤＮＡコーディング配列が、ピロシーケンスにより決定される、上記項１１に記載の方法。
［項１３］
抗原が天然に存在するタンパク質、グリカンまたは脂質である、上記項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
［項１４］
抗原が、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質である、上記項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
［項１５］
抗原が組み換え抗原である、上記項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
［項１６］
抗原がキメラ抗原である、上記項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
［項１７］
第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を天然で発現する細胞である、上記項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
［項１８］
第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を異種発現するように作製されている組み換え細胞である、上記項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
［項１９］
第一の細胞タイプが、正常細胞の疾患に関連する変異体である、上記項１から１８のいずれか一項に記載の方法。
［項２０］
第一の細胞タイプが腫瘍細胞である、上記項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
［項２１］
結合性ポリペプチドがそのフラグメントの抗体である、上記項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
［項２２］
結合性ポリペプチドが抗体ＶＨまたはＶＬドメインである、上記項１から２１のいずれか一項に記載の方法。

Claims (23)

1. 細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
   ａ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の（variegated）核酸ディスプレイライブラリを第一の細胞タイプの外表面に提示されたある細胞表面抗原と接触させ、そして、
   ｂ．該ライブラリから、第一の細胞タイプの外表面上の細胞表面抗原に特異的に結合する少なくとも１つのライブラリメンバーを単離して、該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
   工程を含み、
   前記の多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリがＤＮＡディスプレイライブラリであり、該ＤＮＡディスプレイライブラリの各メンバーが、結合性ポリペプチドをコード化するＤＮＡコーディング配列に、介在するＤＮＡリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該ＤＮＡリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、
   方法。
2. 工程（ａ）の前に、結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、外表面上に提示された抗原を提示しない第二の細胞タイプと接触させる、請求項１に記載の方法。
3. 細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する方法であって、
   ａ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、ある細胞表面抗原を発現する第一の細胞タイプと接触させて、該ライブラリから第一の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１個のライブラリメンバーを単離し、
   ｂ．結合性ポリペプチドの多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリを、該細胞表面抗原を発現しない第二の細胞タイプと接触させ、該ライブラリから第二の細胞タイプに特異的に結合する少なくとも１個のライブラリメンバーを単離し、そして
   ｃ．第一の細胞タイプに特異的に結合するが、第二の細胞タイプに結合しないライブラリメンバーを選択して該細胞表面抗原に特異的に結合する結合性ポリペプチドを同定する
   工程を含み、
   前記の多様な改変体の核酸ディスプレイライブラリがＤＮＡディスプレイライブラリであり、該ＤＮＡディスプレイライブラリの各メンバーが、結合性ポリペプチドをコード化するＤＮＡコーディング配列に、介在するＤＮＡリンカーを介して結合している結合性ポリペプチドを含み、ここで、該ＤＮＡリンカーは制限エンドヌクレアーゼ部位を含む、
   方法。
4. 制限エンドヌクレアーゼ部位が、ＤＮＡディスプレイライブラリのメンバーのコーディング配列中に存在しない、請求項１または３に記載の方法。
5. 該方法がさらに、ＤＮＡコーディング配列と、単離されたライブラリメンバーの連結された結合性ポリペプチドを物理的に分離することを含む、請求項４に記載の方法。
6. 該方法がさらに、第一または第二の細胞タイプから無傷の単離されたライブラリメンバーを分離することを含む、請求項３に記載の方法。
7. 単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから細胞表面抗原の酵素的切断によって分離される、請求項６に記載の方法。
8. 細胞表面抗原が糖脂質アンカーにより細胞表面に結合し、単離されたライブラリメンバーが、第一または第二の細胞タイプから、糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断により分離される、請求項７に記載の方法。
9. 該方法がさらに、第一の細胞タイプから無傷の単離されたライブラリメンバーを分離することを含む、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
10. 単離されたライブラリメンバーが、第一の細胞タイプから細胞表面抗原の酵素的切断によって分離される、請求項９に記載の方法。
11. 細胞表面抗原が糖脂質アンカーにより細胞表面に結合し、単離されたライブラリメンバーが、第一の細胞タイプから、糖脂質アンカーのホスホリパーゼ切断により分離される、請求項１０に記載の方法。
12. 該方法がさらに、単離されたライブラリメンバーの少なくとも一部のＤＮＡコーディング配列を決定することを含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. ＤＮＡコーディング配列が、ピロシーケンスにより決定される、請求項１２に記載の方法。
14. 抗原が天然に存在するタンパク質、グリカンまたは脂質である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 抗原が、グリコホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 抗原が組み換え抗原である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
17. 抗原がキメラ抗原である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
18. 第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を天然で発現する細胞である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
19. 第一の細胞タイプが、細胞表面抗原を異種発現するように作製されている組み換え細胞である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
20. 第一の細胞タイプが、疾患特異的エピトープを発現する、請求項１から１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 第一の細胞タイプが腫瘍細胞である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. 結合性ポリペプチドが抗体またはその結合性フラグメントである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 結合性ポリペプチドが抗体ＶＨまたはＶＬドメインである、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。