CN105659090A - 用于鉴别靶细胞特异性靶表位的靶抗原发现、表型筛选及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本发明的方法一般地包括将结合多肽的多样化核酸展示文库与细胞外表面上展示的细胞表面抗原接触；和从文库分离特异性结合细胞外表面上的细胞表面抗原的至少一个文库成员。

Description

用于鉴别靶细胞特异性靶表位的靶抗原发现、表型筛选及其用途
相关申请
本申请要求涉及2013年6月28日提交的名称为“靶抗原发现和表型筛选”的美国临时申请第61/840,583号的优先权，其内容全文并入本文。
发明背景
结合多肽，例如抗体及其片段，作为治疗和诊断剂在商业上十分重要。筛选结合多肽的传统方法一般采用可溶性抗原。然而，对于某些细胞表面抗原，这些抗原上的构象表位在抗原从质膜溶出(solubilized)时改变，导致不能产生可以识别天然抗原的结合多肽。因此，本领域需要筛选可以特异性结合处于其天然构象的细胞表面抗原的结合多肽的新方法。
发明内容
本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)的方法和组合物。本发明的方法一般地包括将结合多肽的多样化核酸展示文库与细胞外表面上展示的细胞表面抗原接触；和从文库分离特异性结合细胞外表面上的细胞表面抗原的至少一个文库成员。本发明的方法和组合物特别有利的地方在于它们允许快速鉴别结合靶细胞表面抗原的天然形式的结合多肽。这些方法和组合物也允许鉴别新型的、有治疗作用的细胞类型特异性抗原或表位。
附图说明
图1是本发明的示例性DNA展示组合物和筛选方法的示意图。
图2是本发明的示例性DNA展示组合物和筛选方法的示意图。
图3是本发明的方法中采用的示例性靶细胞筛选策略的示意图。
图4是本发明的方法中采用的示例性平行筛选和深度测序策略的示意图。
图5是本发明的方法中采用的示例性平行筛选和深度测序策略的示意图。
图6是本发明的方法中采用的示例性平行筛选和深度测序策略的示意图。
图7是本发明的方法中采用的示例性平行筛选策略结果的示意图。
图8描绘了示出使用本发明的方法选择的高亲和性VH分子的基于FACS结合分析的结果的图。
图9描绘了示出使用本发明的方法选择的VH分子的差异结合的图。
图10描绘了示出使用本发明的方法选择的VH分子的差异结合的图。
详细描述
I.定义
本文所用术语“核酸展示文库”是指任何本领域认可的体外无细胞表型-基因型相联展示，包括，但不限于如例如美国专利第7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258,558；6,261,804；6,429,300；6,489,116；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623,926；6,416,950；6,660,473；6,312,927；5,922,545；和6,348,315号中，以及在WO2010/011944中陈述的那些，其均通过引用全文并入本文。
本文所用术语“抗原”是指被结合多肽识别的分子。
本文所用术语“特异性结合”是指结合分子(例如VH或VL域)以至少约1x10-6M、1x10-7M、1x10-8M、1x10-9M、1x10-10M、1x10-11M、1x10-12M或更高的亲和性结合抗原，和/或以比其对非特异性抗原的亲和性高至少2倍的亲和性结合靶的能力。
本文所用术语“抗体”是指包含四条多肽链的免疫球蛋白分子——通过二硫键相互连接的2条重(H)链和2条轻(L)链——及其多聚体(multimer)(例如，IgM)。每条重链包含重链可变区(缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含3个域，CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含1个域(CL1)。VH和VL区可进一步细分成超变区，称为互补决定区(CDR)，穿插有更保守的称为框架区(FR)的区域。
本文所用术语抗体的“抗原结合部分”包括特异性结合抗原以形成复合体的任何天然存在的、可酶促获得的、合成的或基因工程化的多肽或糖蛋白。使用任何适合的标准技术，例如蛋白水解消化或重组基因工程技术(包括操纵和表达编码抗体可变域和任选地恒定域的DNA)，可以从例如完全抗体分子获得抗体的抗原结合片段。抗原结合部分的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体超变区的氨基酸残基构成的最小识别单元(例如，分离的互补决定区(CDR))。其他工程化分子，例如双体、三体、四体和微型抗体(minibodies)也包含在表述“抗原结合部分”中。
本文所用术语“VH域”和“VL域”分别指单个抗体重链和轻链可变域，包含FR(框架区)1、2、3和4以及CDR(互补决定区)1、2和3(参见Kabat等，(1991)SequencesofProteinsofImmunologicalInterest.(NIHPublicationNo.91-3242,Bethesda))。
II.细胞表面抗原
在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法。
任何能够在细胞表面上展示的抗原都可用于本发明的方法中，包括但不限于，蛋白质、聚糖和/或脂质抗原。在某些实施方式中，抗原是天然存在的分子。天然存在的抗原的适合的非限制性实例包括跨膜蛋白(例如，G蛋白偶联受体)和GPI锚定蛋白。在某些实施方式中，抗原是非天然存在的重组或合成抗原。天然存在的抗原的适合的非限制性实例包括包含来自不同抗原分子的部分的嵌合抗原。在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前已知抗原的身份。在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前未知抗原的身份。
本发明的方法中采用的细胞表面抗原可以在任何细胞或细胞样颗粒(例如，脂质囊泡)上展示。在某些实施方式中，细胞是天然表达细胞表面抗原的细胞类型。在某些实施方式中，细胞是工程化以异源性表达细胞表面抗原的重组细胞。在某些实施方式中，细胞是正常细胞的疾病相关变异体(例如，肿瘤细胞)。
III.结合多肽
在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法。
任何类型的结合多肽都可用于本发明的方法中，包括但不限于，抗体或其片段及免疫球蛋白样结构域。适合的免疫球蛋白样结构域包括但不限于纤连蛋白结构域(参见，例如，Koide等,(2007),MethodsMol.Biol.352:95–109,其通过引用全文并入本文)、DARPin(参见，例如，Stumpp等(2008)DrugDiscov.Today13(15–16):695–701,其通过引用全文并入本文)、蛋白质A的Z结构域(参见，Nygren等(2008)FEBSJ.275(11):2668–76,其通过引用全文并入本文)、脂质运载蛋白(参见，例如，Skerra等(2008)FEBSJ.275(11):2677–83,其通过引用全文并入本文)、Affilins(参见，例如，Ebersbach等(2007)J.Mol.Biol.372(1):172–85,其通过引用全文并入本文)、Affitins(参见，例如，Krehenbrink等(2008).J.Mol.Biol.383(5):1058–68,其通过引用全文并入本文)、Avimers(参见，例如，Silverman等(2005)Nat.Biotechnol.23(12):1556–61,其通过引用全文并入本文)、Fynomers(参见，例如，Grabulovski等(2007)JBiolChem282(5):3196–3204,其通过引用全文并入本文)和Kunitz结构域肽(参见，例如，Nixon等(2006)CurrOpinDrugDiscovDevel9(2):261-8,其通过引用全文并入本文)。在某些实施方式中，结合多肽是抗体VH或VL域。
IV.细胞表面展示方法
在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，该方法包括：(a)将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型外表面上展示的细胞表面抗原接触；和(b)从文库分离特异性结合第一细胞类型外表面上的细胞表面抗原的至少一个文库成员，由此识别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽。在某些实施方式中，在步骤(a)之前，结合多肽的多样化核酸展示文库与不展示在外表面上展示的抗原的第二细胞类型接触，以预清理不特异性结合抗原的结合多肽的文库。
在某些方面，本发明提供了鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，该方法包括：(a)将结合多肽的多样化核酸展示文库与表达细胞表面抗原的第一细胞类型接触，并从文库分离特异性结合第一细胞类型的至少一个文库成员；(b)将结合多肽的多样化核酸展示文库与不表达该细胞表面抗原的第二细胞类型接触，并从文库分离特异性结合第二细胞类型的至少一个文库成员；和(c)选择特异性结合第一细胞类型但不特异性结合第二细胞类型的文库成员，由此鉴别特异性结合该细胞表面抗原的结合多肽。
适用于本发明的方法的核酸展示文库在例如美国专利第7,195,880；6,951,725；7,078,197；7,022,479；6,518,018；7,125,669；6,846,655；6,281,344；6,207,446；6,214,553；6,258,558；6,261,804；6,429,300；6,489,116；6,436,665；6,537,749；6,602,685；6,623,926；6,416,950；6,660,473；6,312,927；5,922,545；和6,348,315号中，以及在WO2010/011944中陈述，其均通过引用全文并入本文。在某些实施方式中，多样化核酸展示文库是DNA展示文库。在一种实施方式中，核酸展示文库是本文所述的或WO2010/011944中的DNA展示文库，其通过引用全文并入本文。
在某些实施方式中，DNA展示文库的每个成员包含结合多肽，该结合多肽通过插入式DNA接头(interveningDNAlinker)连接到编码该结合多肽的DNA编码序列，其中DNA接头包含限制性核酸内切酶位点(参见，例如，图1)。可以采用任意限制性核酸内切酶位点。在一种特定实施方式中，限制性核酸内切酶位点不存在于DNA展示文库的成员的DNA编码序列中，由此避免在限制性核酸内切酶消化文库成员时裂解DNA编码序列。在一种特定实施方式中，限制性核酸内切酶位点是Not1位点。
在某些实施方式中，期望物理分离所分离的文库成员的DNA编码序列和连接的结合多肽。可以采用任何物理分离方法。在分离的文库成员包含含有限制性核酸内切酶位点的DNA接头的情况下(参见，例如，图1)，可以通过限制性核酸内切酶消化分离的文库成员来实现物理分离。所得的释放出的DNA编码序列可以通过任何本领域认可的方法(例如离心)与细胞/结合多肽复合体进一步分离。
在某些实施方式中，期望的是物理分离完整的分离的文库成员与第一和/或第二细胞类型。可以采用任何物理分离方法。在某些实施方式中，分离的文库成员通过酶裂解细胞表面抗原与第一或第二细胞类型分离。可以采用任何酶裂解抗原的方法，例如蛋白酶、脂质和/或糖苷酶酶促裂解。在某些实施方式中，在细胞表面抗原通过糖脂锚连接到细胞表面的情况下，分离的文库成员通过磷脂酶裂解糖脂锚而与第一或第二细胞类型分离。所得的释放出的分离的文库成员可以通过任何本领域认可的方法(例如离心)与第一或第二细胞类型进一步分离。
一旦分离出特异性结合第一和/或第二细胞类型的文库成员，可以测定这些分子的DNA编码序列。因此，在某些实施方式中，本发明的方法还包括测定分离的文库成员的至少一部分的DNA编码序列的步骤。可以采用任何本领域认可的DNA序列测定方法。在一种特定实施方式中，通过单分子深度测序技术(例如，焦磷酸测序)测定DNA编码序列。单分子深度测序技术在本领域中广为人知(参见，例如，US6,210,891中所述的那些，其通过引用全文并入本文)。在某些实施方式中，在结合多肽是抗体或其抗原结合片段的情况下，测定CDR3区的DNA编码序列。在某些实施方式中，测定结合第一和第二细胞类型的文库成员的DNA编码序列。特异性结合第一细胞类型但不特异性结合第二细胞类型的文库成员被认为包含特异性结合对第一细胞类型特异性的抗原的结合多肽。
一旦鉴别出特异性结合细胞表面抗原的结合多肽，其可以在体外(例如，在细胞中或在无细胞表达系统中)或体内(例如，在转基因动物中)异源表达。因此，在某些实施方式中，本发明的方法还包括体外(例如，在细胞中或在无细胞表达系统中)或体内(例如，在转基因动物中)异源表达所鉴别的结合多肽的步骤。
在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前已知抗原的身份。然而，并非必须知晓抗原的身份。实际上，在某些实施方式中，在实施本发明的方法之前未知抗原的身份。因此，在后一情形中，本发明的方法允许鉴别存在于感兴趣的细胞类型(例如，肿瘤细胞)表面上的新抗原和表位。
在某些实施方式中，本文公开的方法包括选择能够在结合到细胞表面抗原时功能性内化的结合多肽。这种结合多肽在药物偶联物的生产中特别有用，因为它们使得能够将细胞毒性药物递送到靶细胞内部。可以采用任何筛选功能内化的方法。例如，结合多肽的多样化核酸展示文库可以在允许结合多肽内化的条件(例如，37℃下约1-2小时)下与靶细胞接触。然后洗涤细胞并在蛋白酶抑制剂的存在下用细胞裂解缓冲液裂解。然后乙醇沉淀内化的文库成员，并通过PCR扩增富集DNA编码序列。
本文公开的方法可以应用于任何靶表位发现方法。例如，靶表位可包括：炎症的归巢(homing)域；来自对治疗具有或不具有耐受性的原发肿瘤、肿瘤细胞系和携带可以导致新表位的任何突变的肿瘤的肿瘤特异性靶表位；和介导疾病特异性功能障碍并作为生物疗法的靶标的其他疾病特异性表位。
本文公开的方法也可应用于生物标志物的发现，以监测特定细胞表面表位在患者药物治疗的过程中的存在或不存在。从生物标志物发现获得的抗体也可用作生物标志物检测的工具。
另外地或替代性地，本文公开的方法可以应用于其他物种中的靶或表位发现，例如转基因动物和动物疾病模型中。
V.示例
A.概要
构建从人供体的骨髓、外周血和脾细胞获得的完全人抗体VH文库，并使用dsDNA展示技术鉴别对于多种靶的高亲和性和特异性的众多VH结合剂。使用人VH文库和dsDNA展示技术，通过活细胞选择和深度测序分析鉴别靶细胞特异性表位。在这些方法中应用平行的差异选择和靶细胞选择性选择的策略(参见图4、5、6)。来自所有轮次的所有池的深度测序的CDR频率的制表预测VH克隆的选择性。鉴别选择性结合靶细胞和相关细胞类型的高亲和性VH。
B.活细胞表位发现的文库工程化和选择方法
开发了两种方法来有效回收结合活细胞的文库成员。
第一种方法涉及通过限制性消化与结合的抗体融合的DNA来从活细胞剥离结合剂。该方法使得能够完全回收结合到细胞上的所有表位的VH。VHDNA文库的C端经工程化以携带NotI限制性位点(参见图1)。天然VH框架中没有NotI位点，且因此只有全长VH结合剂从细胞洗脱以进行后续扩增。在活细胞上测试NotI限制性消化缓冲液，并且通过在37℃下最多2小时的孵育，细胞是有活力的。NotI消化效率高。文库在4℃下结合细胞1小时后，洗涤细胞并用NotI缓冲液在37℃下消化1小时，然后旋降细胞，收集上清液(含有结合的VHDNA)以进行PCR扩增(图1)。
第二种方法是使用磷脂酶C(PLC)消化从活细胞剪切掉VH结合剂。该方法使得能够洗脱结合到任意GPI锚定膜蛋白的表位(即，表位亚集)的VH。如使用对照分子在FACS上所验证的，PLC剪切效率高。在文库与细胞在4℃下孵育1小时后，洗涤细胞并用PLC在37℃下孵育15分钟。随后旋降细胞，并PCR扩增含有与GPI锚定膜蛋白的细胞外域复合的融合VH的上清液(参见图2)。
C.对靶和相关/不期望细胞类型的平行选择、差异选择和靶细胞 选择性选择
根据WO2010/011944(其通过引用全文并入本文)中所述方案产生主天然融合文库。对于第一轮选择，纯化的融合文库均等地分割成对于所有选择分支具有相同多样性的多个文库(参见图5)。
依照标准细胞生物学方案，从正常供体或患者获得的原代细胞新鲜解冻或从细胞培养瓶分离。然后细胞在37℃下在完全培养基中恢复1小时，接着在冰上在选择缓冲液中封闭30分钟。所有选择都在冰上进行以防止抗体和靶内化。
对于平行选择，文库在室温下使用200ul预封闭链霉抗生物素蛋白珠和200ul预封闭hIgG-环氧化物珠按顺序预清理30分钟以除去任何错误折叠和粘性的文库成员。预清理的文库然后在冰上冷冻并经受预封闭细胞，并在冰上孵育1小时。
对于靶细胞选择性选择，在冰上对不期望且紧密相关的细胞类型进行1小时预清理以除去任何非选择性的结合剂，然后经受靶细胞处理。
在第4轮选择，对靶细胞(对细胞进行或未进行预清理)的选择分支应用差异选择方法。在该轮中，文库分割到多个管中并平行地结合各个细胞类型和来自疾病不同阶段的患者细胞。该策略使得能够通过深度测序分析和鉴别识别疾病进展产生的不同表位的结合剂而直接比较靶细胞与其他细胞类型。
对于所有选择分支，在结合后，细胞用10mL结合缓冲液洗涤，并经历NotI限制性消化以回收所有的膜蛋白结合剂或经历PLC剪切以回收GPI锚定膜蛋白的结合剂，如上所述。
D.深度测序分析以预测靶细胞的选择性结合剂
在每轮选择后，结合池进行PCR扩增。通过使用引发VH片段的框架3的C端和框架4的N端的寡聚物进行PCR来增加每个结合池的HCDR3。然后使用用于通过PCR进行Illumina测序的特定DNA条形码标记从单独选择轮次和分支获得的这些HCDR3片段。标记的HCDR3合并，并发送用于使用HiSeq技术的高通量测序。靶细胞的第4轮结合池也用DNA条形码标记并经受454测序以获得全长VH序列。
序列在测序后基于DNA条形码去卷积(deconvolute)。通过比较存在于不同轮次和选择分支的特定CDR3序列的频率将从每个选择轮和选择分支获得的数百万序列制表。用于鉴别选择性结合剂的标准是：1)从较早的轮次到较后的轮次对靶细胞而非对照或紧密相关细胞类型上的CDR3序列特异性富集；2)在差异选择轮次靶特异性细胞类型上的较高频率和对照或紧密相关细胞类型上的较低频率(参见图7)；和3)不存在于来自数据库中其他程序的其他靶或细胞选择中的序列。然后基于454全长序列信息合成通过Illumina测序鉴别的选择性克隆。
E.产生、纯化和FACS结合分析
然后将结合池和合成的VH亚克隆到pET22b表达载体中。VH在BL-21E.coli细胞中产生，并使用标准方案通过C端His标签纯化。进行FACS分析以评估VH对不同细胞类型的结合和选择性，以及结合剂的EC50。通过活细胞选择方法鉴别高亲和性和选择性VH结合剂(参见图8、9和10)。

Claims (22)

1.一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，所述方法包括：
a.将结合多肽的多样化核酸展示文库与第一细胞类型的外表面上展示的细胞表面抗原接触；和
b.从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型外表面上的所述细胞表面抗原的至少一个文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。
2.权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)之前，所述结合多肽的多样化核酸展示文库与第二细胞类型接触，所述第二细胞类型不展示在所述外表面上展示的所述抗原。
3.一种鉴别特异性结合细胞表面抗原的结合多肽的方法，所述方法包括：
a.将结合多肽的多样化核酸展示文库与表达细胞表面抗原的第一细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第一细胞类型的至少一个文库成员；
b.将所述结合多肽的多样化核酸展示文库与不表达所述细胞表面抗原的第二细胞类型接触，并从所述文库分离特异性结合所述第二细胞类型的至少一个文库成员；和
c.选择特异性结合所述第一细胞类型但不特异性结合所述第二细胞类型的文库成员，由此鉴别特异性结合所述细胞表面抗原的结合多肽。
4.权利要求1、2或3所述的方法，其中所述多样化核酸展示文库是DNA展示文库。
5.权利要求4所述的方法，其中所述DNA展示文库的每个成员包含结合多肽，所述结合多肽通过插入式DNA接头连接到编码所述结合多肽的DNA编码序列，其中所述DNA接头包含限制性核酸内切酶位点。
6.权利要求5所述的方法，其中所述限制性核酸内切酶位点不存在于所述DNA展示文库的成员的编码序列中。
7.权利要求5或6所述的方法，其中所述方法还包括物理分离所述分离的文库成员的所述DNA编码序列和连接的结合多肽。
8.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将完整的所述分离的文库成员与所述第一或第二细胞类型分离。
9.权利要求8所述的方法，其中所述分离的文库成员通过酶裂解所述细胞表面抗原与所述第一或第二细胞类型分离。
10.权利要求9所述的方法，其中所述细胞表面抗原通过糖脂锚连接到所述细胞表面，并且所述分离的文库成员通过磷脂酶裂解所述糖脂锚与所述第一或第二细胞类型分离。
11.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述方法还包括测定所述分离的文库成员的至少一部分的所述DNA编码序列。
12.权利要求11所述的方法，其中所述DNA编码序列通过焦磷酸测序测定。
13.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是天然存在的蛋白质、聚糖或脂质。
14.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定的蛋白。
15.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是重组抗原。
16.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述抗原是嵌合抗原。
17.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是天然表达所述细胞表面抗原的细胞。
18.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是经工程化以异源性表达所述细胞表面抗原的重组细胞。
19.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是正常细胞的疾病相关变异体。
20.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一细胞类型是肿瘤细胞。
21.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体或其片段。
22.前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述结合多肽是抗体VH或VL域。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105705947A (zh) * 2013-09-23 2016-06-22 X博迪公司 用于生成对抗细胞表面抗原的结合剂的方法和组合物

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11851679B2 (en) 2017-11-01 2023-12-26 Juno Therapeutics, Inc. Method of assessing activity of recombinant antigen receptors

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1763082A (zh) * 2005-09-27 2006-04-26 南开大学 与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽的筛选及鉴定
CN1777684A (zh) * 2003-04-18 2006-05-24 贝克曼考尔特公司 用于多元结合分析的寡核苷酸对
WO2012125733A2 (en) * 2011-03-15 2012-09-20 X-Body, Inc. Antibody screening methods

Family Cites Families (38)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5922545A (en) 1993-10-29 1999-07-13 Affymax Technologies N.V. In vitro peptide and antibody display libraries
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US5876925A (en) * 1996-10-11 1999-03-02 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Magnetically activated cell sorting for production of proteins
EP0971946B1 (en) 1997-01-21 2006-07-05 The General Hospital Corporation Selection of proteins using rna-protein fusions
US6261804B1 (en) 1997-01-21 2001-07-17 The General Hospital Corporation Selection of proteins using RNA-protein fusions
WO1998048008A1 (en) 1997-04-23 1998-10-29 Plueckthun Andreas Methods for identifying nucleic acid molecules encoding (poly)peptides that interact with target molecules
IL138668A0 (en) 1998-04-03 2001-10-31 Phylos Inc Addressable protein arrays
US6794128B2 (en) 1998-04-24 2004-09-21 The Regents Of The University Of California Methods of selecting internalizing antibodies
US6846655B1 (en) 1998-06-29 2005-01-25 Phylos, Inc. Methods for generating highly diverse libraries
ATE437844T1 (de) 1998-08-17 2009-08-15 Bristol Myers Squibb Co Identifizierung von verbindung-protein wechselwirkungen mit bibliotheken von gekoppelten protein-nukleinsäure-molekülen
US6312927B1 (en) 1998-08-17 2001-11-06 Phylos, Inc. Methods for producing nucleic acids lacking 3'-untranslated regions and optimizing cellular RNA-protein fusion formation
US6416950B1 (en) 1998-12-02 2002-07-09 Phylos, Inc. DNA-protein fusions and uses thereof
WO2000072869A1 (en) 1999-06-01 2000-12-07 Phylos, Inc. Methods for producing 5'-nucleic acid-protein conjugates
WO2001004265A2 (en) 1999-07-12 2001-01-18 Phylos, Inc. C-terminal protein tagging
DE60034566T2 (de) 1999-07-27 2008-01-03 Adnexus Therapeutics, Inc., Waltham Peptidakzeptor ligationsverfahren
CA2382545C (en) 1999-08-27 2013-08-13 Phylos, Inc. Methods for encoding and sorting in vitro translated proteins
ATE322558T1 (de) 2000-01-24 2006-04-15 Compound Therapeutics Inc Sensible und multiplexe diagnostische tests zur proteinanalyse
US7022479B2 (en) 2000-01-24 2006-04-04 Compound Therapeutics, Inc. Sensitive, multiplexed diagnostic assays for protein analysis
AU2002310502A1 (en) 2001-06-21 2003-01-08 Phylos, Inc. In vitro protein interaction detection systems
US7125669B2 (en) 2001-11-27 2006-10-24 Compound Therapeutics, Inc. Solid-phase immobilization of proteins and peptides
WO2003074678A2 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Dyax Corp. Modular recombinatorial display libraries
RU2346004C2 (ru) * 2002-11-09 2009-02-10 Эвидекс Лимитед Экспонирование т-клеточных рецепторов
WO2005026379A2 (en) * 2003-09-08 2005-03-24 Ramot At Tel Aviv University The mapping and reconstitution of a conformational discontinuous binding surface
EP1761561B1 (en) 2004-01-20 2015-08-26 KaloBios Pharmaceuticals, Inc. Antibody specificity transfer using minimal essential binding determinants
AU2006304387A1 (en) 2005-10-14 2007-04-26 Medimmune, Llc Cell display of antibody libraries
ES2625798T3 (es) 2006-10-02 2017-07-20 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Anticuerpos humanos que se unen a CXCR4 y usos de los mismos
WO2008070367A2 (en) 2006-11-01 2008-06-12 Facet Biotech Corporation Mammalian cell-based immunoglobulin display libraries
US20110076752A1 (en) * 2007-02-09 2011-03-31 Medimmune, Llc Antibody library display by yeast cell plasma membrane
CA2699394C (en) 2007-09-17 2020-03-24 The Regents Of The University Of California Internalizing human monoclonal antibodies targeting prostate cancer cells in situ
EP3629022A1 (en) 2008-07-25 2020-04-01 Richard W. Wagner Protein screening methods
CN102227638B (zh) 2008-09-30 2015-05-20 Abbvie公司 Rna展示的改良方法
AU2010213497A1 (en) 2009-02-13 2011-08-25 X-Body, Inc. Identification of nucleic acid delivery vehicles using DNA display
CA2744103C (en) * 2009-02-24 2018-01-02 Esbatech, An Alcon Biomedical Research Unit Llc Methods for identifying immunobinders of cell-surface antigens
NZ598670A (en) 2009-09-08 2014-05-30 Neopharm Co Ltd Antibodies against glucagon receptor and their use
JP6095368B2 (ja) 2009-10-27 2017-03-15 ユセベ ファルマ ソシエテ アノニム 機能改変するＮａｖ１．７抗体
GB201014715D0 (en) 2010-09-06 2010-10-20 Vib Vzw Nanobodies stabilizing functional conformational states of GPCRS
SG10201605049QA (en) 2011-05-20 2016-07-28 Fluidigm Corp Nucleic acid encoding reactions
EP2761064B1 (en) 2011-09-27 2021-04-28 The Governing Council Of The University Of Toronto Molecular display method

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1777684A (zh) * 2003-04-18 2006-05-24 贝克曼考尔特公司 用于多元结合分析的寡核苷酸对
CN1763082A (zh) * 2005-09-27 2006-04-26 南开大学 与肿瘤转移细胞特异性结合的多肽的筛选及鉴定
WO2012125733A2 (en) * 2011-03-15 2012-09-20 X-Body, Inc. Antibody screening methods

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAO,H等: "Screening and identification of polypeptides specifically binding to hepatoma carcinoma cells", 《JOURNAL OF ANIMAL AND VETERINARY ADVANCES》 *
潘雪刁等: "肺癌特异性结合多肽的体外筛选和鉴定", 《中国药理学通报》 *

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105705947A (zh) * 2013-09-23 2016-06-22 X博迪公司 用于生成对抗细胞表面抗原的结合剂的方法和组合物
CN105705947B (zh) * 2013-09-23 2019-04-02 X博迪公司 用于生成对抗细胞表面抗原的结合剂的方法和组合物
CN110058023A (zh) * 2013-09-23 2019-07-26 X博迪公司 用于生成对抗细胞表面抗原的结合剂的方法和组合物
US10519436B2 (en) 2013-09-23 2019-12-31 X-Body, Inc. Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens
US11339388B2 (en) 2013-09-23 2022-05-24 X-Body, Inc. Methods and compositions for generation of binding agents against cell surface antigens
CN110058023B (zh) * 2013-09-23 2022-10-14 X博迪公司 用于生成对抗细胞表面抗原的结合剂的方法和组合物

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